Metabolic Engineering

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BRAIN special: Coping with complexity in metabolic engineering
Über den Umgang Coping with
mit Komplexität complexity
beim „Metabolic in metabolic
Engineering“ engineering
„Metabolic Engineering“ kontrolliert die Komplexität mikrobieller Systeme, um nachhaltige
und wirtschaftliche Produktionswege für hochwertige Chemikalien zu entwickeln. • Metabolic engineering aims to control the complexity of microbial systems in order to
­establish sustainable and economically viable production routes for valuable chemicals.
TEXT: Dr. Jörg Mampel1,
Dr. Jörg Büscher 1,
Dr. Guido Meurer 1,
Dr. Jürgen Eck1
Illustration: Tilman
Zitzmann
I
m letzten Jahrzehnt hat die Systembiologie eine große metabolische (Stoffwechsel-)
und regulatorische Komplexität selbst in den scheinbar einfachen mikrobiellen Systemen
aufgedeckt. „Metabolic Engineering“ zielt auf die Kontrolle dieser Komplexität ab, um
nachhaltige und ökonomisch tragbare Produktionswege für hochwertige Chemikalien
zu etablieren. Die Fortschritte bei der Erhebung von „Systems Level“-Daten und bei
n the past decade, systems biology has revealed­ der Modellierung des zellulären Stoffwechgreat metabolic and regulatory complexity­ sels und seiner Regulation zusammen mit
even in seemingly simple microbial systems. enormen Fortschritten in der synthetischen
Metabolic­engineering aims to control this com- Biologie sind die Voraussetzungen dafür,
plexity in order to establish sustainable and eco- die Biotechnologie einen großen Schritt vonomically viable production routes for valuable ranzubringen.
Großes Potenzial liegt dabei in der Rechemicals. Recent advances in systems-level data
generation and modeling of cellular metabolism­ duktion der zellulären Komplexität durch
and regulation together with tremendous pro- Orthogonalisierung der metabolischen
gress in synthetic biology will provide the tools Module. Nachfolgend werden die aktuelto put biotechnologists on the fast-track for im- len Fortschritte zusammengefasst, die es
dem „Metabolic Engineer“ ermöglichen,
plementing novel production processes.
I
1
BRAIN
Dieser Artikel erschien in
einer Fachzeitschrift und
wurde für die Verwendung
in ­BLICKWINKEL gekürzt.
Auf die genaue Angabe der
Literaturstellen wurde
hier verzichtet­. · This
article appeared in a jounal
and was adapted for use
in BLICKWINKEL. The exact
references have been
omitted­ here.
BRAIN speZial: Über den Umgang mit Komplexität beim „Metabolic Engineering“
BRAIN special: Coping with complexity in metabolic engineering
bei vermindertem Zeit- und Arbeitsaufwand rationalisierte mikrobiologische Zellfabriken
zu berechnen, zu gestalten und zu bauen.
Die Komplexität in Angriff nehmen
„Systems Level“-Daten
Betrachtung der Daten auf
der Ebene eines gesamten
Systems – im Gegensatz zur
Detailbetrachtung
Transkriptom
Gesamtheit der abgelesenen­
Gene (mRNA) in einer
Zelle zu einem bestimmten
Zeitpunkt
Nach Jahrzehnten der überwiegend
reduktionistischen biologischen Forschung,
die auf einzelne Gene oder Proteine fokussiert war, macht sich die Systembiologie
daran, diese Einzelteile zu einem ganzheitlichen Bild zusammenzusetzen. Dies wird
vor allem durch technologische Fortschritte­
auf zwei Gebieten ermöglicht: (i) analytische Techniken, um DNA, RNA, Proteine
oder Metabolite zu quantifizieren und zu
charakterisieren, die nunmehr sensitiv und
umfassend genug sind, um aussagekräftige
Momentaufnahmen mikrobieller Zellen zu
liefern; (ii) mathematische Darstellungen
biologischen Wissens und statistische Datenanalysen, die eine Bearbeitung stetig steigender Datenmengen ermöglichen.
Bedeutende Meilensteine bei der Erstellung von „Systems Level“-Daten sind
z. B. die Sequenzierung eines Escherichiacoli-Isolats in nur 62 Stunden, die detaillierte Charakterisierung des Transkriptoms
durch RNA-Sequenzierung und die Abdeckung des gesamten dynamischen Bereichs
vollständiger Proteome. Da Phänotypen
auf dem Zusammenspiel einzelner zellulärer Komponenten beruhen, bietet die parallele Analyse dieser Komponenten zusätzliche Einblicke. Zum Beispiel ermöglichte
die Kombination von Transcriptomics, Proteomics und Metabolomics die Identifizierung eines allgemeinen Mechanismus für
die metabolische Homöostase. Die nächste
Stufe der Datenkomplexität wurde mit der
zeitaufgelösten Datenerhebung in Multiomics-Experimenten erreicht, wodurch die
Identifizierung der entscheidenden Regulationsereignisse während dynamischer
Anpassungsprozesse ermöglicht wurde.
Stöchiometrische Modellierungen erleichtern das quantitative Verständnis des Stoffwechsels auf Genomebene und die Verknüpfung von Genotypen und Phänotypen
Great potential lies in the reduction of cellular­
complexity by orthogonalization of metabolic
modules. Here, we review recent advances that
will eventually enable metabolic engineers to predict, design and build streamlined microbial cell
factories with reduced time and effort.
Confronting complexity
After decades of mostly reductionistic biological research that focused on single genes or
proteins, systems biology is on its way to assemble
these pieces of information into one holistic picture. These efforts build heavily on two types of
technological advances: (i) analytical techniques to
quantify and characterize DNA, RNA, proteins, or
metabolites which are now sensitive and comprehensive enough to produce meaningful snapshots
of microbial cells; (ii) mathematical representa-
# 512 2 ^ 9 = 2 x 2 x 2 x 2 x 2 x 2 x 2 x 2 x 2 = 512 dots, arranged in cubes. 2 x 2 dots arranged in cubes,
tions of biological knowledge and statistical data
arranged in 2 x 2 meta-cubes, arranged in 2 x 2 meta-cubes.
analysis that enable the analysis of ever increasing
amount of data.
Recent milestones in systems level data generation include the sequencing of an Escherichia
coli isolate in just 62 hours, the in-depth characterization of transcriptomes by RNA-sequencing, and
the coverage of the full dynamic range of complete proteomes. Because phenotypes are generated by the interplay of all cellular components,
Systems level data
Analysis of the data of an
entire system — as opposed
to detailed analysis
Transcriptome
Total reading of all genes
(mRNA) in a cell at a given
time
the parallel analysis of these components offers
additional insight. For instance, the combination
of transcriptomics, proteomics, and metabolomics
identified a general mechanism for metabolic homeostasis. The next level of data complexity was
reached by generating multi-omics data in a time
resolved manner, thus enabling the identification
of the pivotal regulatory events during dynamic
adaptation processes. Constraint based modelling
greatly eases the quantitative understanding of
metabolism on a genome scale and facilitates linking genotypes to phenotypes. Recently, a single
whole-cell in silico model described the dynamic
interplay of all cellular components of the near
BLICKWINKEL • KOMPLEXITÄT complexity
„Metabolic Engineering“
Machining process to opti­
mise the data, cells and
metabolic pathways (data /
cell /pathway engineering)
erheblich. Unlängst konnte ein umfassendes In-silico-Modell einer einzelnen Zelle das
dynamische Zusammenspiel aller zellulären Komponenten des Modellbakteriums Mycoplasma genitalium in bislang unerreichter Detailtiefe beschreiben. Durch die Strukturie­
rung zellulärer Funktionen in Modulen und das iterative Modellieren der Interaktionen
zwischen diesen Modulen konnten nicht
minimal-genome model bacterium Mycoplasma offensichtliche Verknüpfungen zwischen
genitalium. Modularization of cellular functions zellulären Systemen aufgedeckt werden,
and iterative modelling of the interactions among beispielsweise die Kontrolle des Zellzyklus
modules establishes non-obvious links across cel- durch Metabolitkonzentrationen. Wir erlular systems such as the control of cell cycle by warten, dass eine weitere Verfeinerung
metabolite concentrations. We expect that further dieses Ansatzes und seine Ausweitung auf
refinement of this approach and its extension to komplexere Organismen zukünftig verbesmore complex organisms will enable improved serte Vorhersagen von Phänotypen basiepredictions of phenotypes from genotypes in the rend auf den Genotypen ermöglichen.
Die allerersten industriellen Produktifuture.
The very first production strains that were onsstämme, die durch Zufallsmutagenese
derived from natural isolates by random muta­ aus Isolaten aus der Natur hervorgingen,
genesis were treated as “black boxes” with little wurden als Blackbox betrachtet, da nur
knowledge of their intracellular processes. Meta- wenig über ihre intrazellulären Prozesse
bolic engineering has come a long way, but for bekannt war. Obwohl schon seit ­mehreren
09
BRAIN speZial: Über den Umgang mit Komplexität beim „Metabolic Engineering“
11
BRAIN special: Coping with complexity in metabolic engineering
Handhabung der Komplexität durch „Systems Level Engineering“
# 497 Four touching spheres form a tetrahedron
„Metabolic Engineering“
Bearbeitungsvorgang zur
Optimierung von Daten,
Zellen und Stoffwechselwegen (data /cell /pathway
engineering)
Jahrzehnten „Metabolic Engineering“ betrieben wird, konnte diese Blackbox immer
noch nicht vollständig geöffnet werden, und so müssen sich „Metabolic Engineering“Experten damit abfinden, dass es in ihren vertrauten mikrobiellen Arbeitstieren noch
ungeklärte Komplexität gibt. Erschwerend kommt hinzu, dass aufgrund sozio-ökonomischer Sachzwänge künftige biotechnologische Produktionsprozesse die zusätz- the time being, metabolic engineers must still acliche Herausforderung meistern müssen, cept much unaccounted complexity inherent to
komplexere Nährstoffe wie Lignin oder their standard microbial workhorses when develAbfallströme anstelle definierter Kohlen­ oping biotechnological processes. Due to sociostoffquellen zu verwenden, um noch economic implications, future biotechnological
höherwertige Mono- oder Polymere auf production processes will face the additional chalbiologischer Grundlage zu produzieren. lenge on using more complex feedstocks such as
In diesem Artikel fassen wir die Konzepte lignin or waste streams instead of defined carbon
zusammen, die sich mit diesen Komplexi- sources to produce even more advanced bio-based­
täts-Herausforderungen befassen. Wir fo- monomers or polymers. In this article, we review
kussieren uns auf die Anstrengungen, die concepts confronting this complexity challenge.
unternommen werden, um die Kontrolle We focus on efforts to gain control over the simüber die einfachsten biotechnologischen plest biotechnological production facilities: the
Produktionseinheiten zu erlangen: die prokaryotes.
Prokaryoten.
BLICKWINKEL • KOMPLEXITÄT complexity
Eine fundamentale Erkenntnis, die aus der systemweiten Analyse der einfachsten mikrobiellen Zellen gewonnen werden kann, ist, dass der Großteil der biologischen Diversität von prokaryotischen Lebensarten ausgemacht wird. Sackgassen beim klassischen
Managing complexity by systems level
(d. h. nicht modellbasierten), gezielten
engineering
„Metabolic Engineering“ entstehen häufig
A fundamental lesson that can be learned durch die Diskrepanz zwischen dem von
from system-wide analyses of even simple microbi- einer Vielzahl von Genen geprägten geal cells is the large diversity in prokaryotic lifestyles. wünschten Phänotyp einerseits und unseDead-end roads in classical (i. e. not model-based) rem immer noch rudimentären Verständnis
targeted metabolic engineering are often caused der Komplexität der Zelle andererseits. Im
by the multigenic nature of the desired phenotype Folgenden zeigen wir aktuelle Ansätze auf,
combined with our still rudimentary understand- um entweder durch Verringerung der Koming of the cell’s complexity. Here, we spotlight plexität oder durch Inkaufnahme eines nur
recent approaches to gain control over a micro- teilweisen Verständnisses des vorliegenden
organism either by reducing the complexity or by biologischen Systems die Kontrolle über
coping with only a partial understanding of the einen Mikroorganismus zu erlangen. Bei
biological system at hand. In the latter case, tar- Letzterem baut das zielgerichtete „Systems
geted systems level engineering builds upon a ge- Level Engineering“ auf einem genombanome scale model prediction and implements the sierten Vorhersagemodell auf und wendet
required molecular modifications in a host strain die notwendigen molekularen Modifikatioof choice. The alternative approach of non-target- nen im jeweils gewählten Wirtsorganismus
ed systems level engineering randomly introduces an. Im alternativen Ansatz des nicht zielgegenome-wide modifications to the transcriptome richteten „Systems Level Engineering“ werden im gesamten Genom zufällige Modifiand selects the most favourable mutant.
kationen eingeführt und die vorteilhafteste
Mutante ausgewählt.
Targeted Systems Level Engineering
Targeted systems level engineering is highly
rational and generates fully characterized strains
Zielgerichtetes „Systems Level
Engineering”
via precise genetic modifications. Many studies
Zielgerichtetes „Systems Level Engin­
eering“ ist hochgradig rational und schafft
of this design principle were established for amino vollständig charakterisierte Stämme durch
acid biosynthesis in E. coli and C. glutamicum with präzise genetische Modifikationen. Bei
final­yields about 50 % of the theoretical maximum, vielen Untersuchungen wird allerdings nur
comparing well to industrial producer strains. The ein begrenztes Set systemweiter Analysen
current cost of system-level data in terms of time, angewendet, um nachfolgend Angriffsmanpower, and expertise might have impeded punkte für das „Metabolic Engineering“
comprehensive systems biology approaches in zu identifizieren. Die derzeitigen Kosten
applied biotechnology so far. However, recent ap- der Generierung systemweiter Datenproaches enable systems metabolic engineering sätzen hinsichtlich Zeit, Arbeitskraft und
Expertise haben die flächendeckende Anbased on less-than-comprehensive data sets.
With a better understanding of regulatory wendung von Systembiologie-Ansätzen in
networks, regulatory modifications could be used der angewandten Biotechnologie bisher
in a targeted way to enter the next level of en- verhindert. Jedoch erlauben die neueren
use a limited set of system-level analyses to iden-
tify targets for metabolic engineering. Prototypes
BRAIN speZial: Über den Umgang mit Komplexität beim „Metabolic Engineering“
Ansätze die Anwendung des „Systems Metabolic Engineering“ basierend auf weniger
umfänglichen Datensätzen.
Durch ein besseres Verständnis der Regulationsnetzwerke könnten Modifikationen
der Regulatoren gezielt eingesetzt werden, um die nächste Stufe der Optimierung von
Produktionsstämmen zu erreichen.
Hybridmodelle, die sowohl metaboli- gineering production strains. Hybrid models that
sche Reaktionen als auch ihre Regulation include both metabolic reactions and their regulaumfassen, sind bereits für kleine Systeme, tion are already available for small systems such as
wie eine osmotische Schockreaktion in He- the osmotic shock response in yeast and in a simfen, und in einer vereinfachten Form auch plified form at genome scale. A first application is
auf Genomebene verfügbar. Eine erste An- the production of reduced products in arcA delewendung ist die Herstellung reduzierter tion mutants of E. coli. Functional units in prokaryStoffwechselprodukte in arcA-Deletions- otes are already organized in co-regulated modmutanten von E. coli. Funktionelle meta- ules such as operons and regulons that affect all
bolische Einheiten werden in Prokaryon- involved pathways in a synchronized and balanced
ten bereits in koregulierten Modulen wie way. Eventually, engineering these modules can
Operons und Regulons organisiert, die alle complement or even replace engineering single
beteiligten Stoffwechselwege auf synchro- genes to further increase the yield of engineered
nisierte und ausbalancierte Art und Weise productions strains.
beinhalten. Das Engineering dieser Module kann das Optimieren einzelner Gene
Non-targeted Systems Level Engineering
ergänzen oder sogar ersetzen, um so die
Ausbeute veränderter Produktionsstämme
Non-targeted systems level engineering
weiter zu verbessern.
requires less prior knowledge than targeted en-
Nicht zielgerichtetes „Systems
Level Engineering“
wiegend nachvollziehbar. Engineering auf Genomebene umfasst Technologien wie das
Engineering des globalen Transkriptionsapparats, bei dem Mutationen in definierten Bestandteilen des Transkriptionsapparats eingeführt werden, oder Genomeditierung, die
bei vielfältigen genomischen Targets parallel durch Transformation der Zellen mit einer
Bibliothek aus Transkriptions-Regulationsis fulfilled, we expect this approach to become Oligonukleotiden ansetzt. Die wichtigste
more widely used as the cost for oligonucleotide Voraussetzung für die erfolgreiche Anwendung von nicht zielgerichtetem „Systems
synthesis decreases.
Level Engineering“ ist die Verfügbarkeit
eines zuverlässigen Screening-Assays für
Reduced complexity by minimal genomes
die Selektion eines gewünschten Klons. In
Current knowledge for even the best studied Fällen, bei denen diese Voraussetzung erfree-living prokaryotes such as E. coli and Bacillus füllt ist, erwarten wir, dass dieser Ansatz
subtilis, does not provide a truly predictive under- breiter angewendet wird, wenn die Kosstanding of cellular responses to genetic and envi- ten für die Oligonukleotidsynthese sinken.
ronmental perturbations. As a consequence, synthetic biologists strive to build biological systems
based solely on the essential parts that constitute
comprehensive and predictive modelling, thereby
improving speed and precision of the strain engineering process. Two alternative approaches
currently compete for the creation of the smallest
self-replicating cell: (i) de novo synthesis of a mini-
gineering and is thus more widely applicable.
mal genome or (ii) the stepwise defined reduction
Global changes in gene expression generate phe-
of a complex genome.
notypes that are subsequently screened for the
The minimal genome by reduction
„Deep“-Sequenzierung
Sequenziertechnologien
der neuesten Generation­
lesen jedes einzelne
Nukleotid eines Gens
oder Genoms bis zu
mehreren Hundert Malen
(Sequenzier­tiefe). Dadurch
wird die Präzision der
ermittelten Gensequenz
stark verbessert­.
on chemical mutagens or ultraviolet light routinely generates multiple DNA-modifications at once.
Although deep-sequencing allows for identification of all resulting mutations, this is often uninformative concerning the genotype-phenotype
relationship. Thus, the exact basis for the respective phenotype often remains elusive. In contrast,
mutations introduced by genome-scale engineering are widely traceable. Genome-scale engineer-
Reduzierte Komplexität durch
Minimalgenome
a living system. Reducing the complexity facilitates
desired properties. Random mutagenesis based
Nicht zielgerichtetes „Systems Level Engineering“ setzt weniger Vorwissen voraus
als zielgerichtetes Engineering und ist daher
breiter anwendbar. Durch globale Veränderungen in der Genexpression wurden Genotypen geschaffen, die anschließend auf
gewünschte Eigenschaften durchmustert
werden. Mittels Zufallsmutagenese basierend auf chemischen Mutagenen oder ultraviolettem Licht werden in der Routine
vielfache DNA-Modifikationen auf einmal
eingeführt. Obwohl „Deep“-Sequenzierung­
die Identifizierung aller entstandenen Mutationen erlaubt, können dabei nur selten
die für den Phänotyp wesentlichen Mutationen identifiziert werden. Daher bleibt
die exakte Basis des jeweiligen Phänotyps
oftmals unklar. Im Gegensatz dazu sind
Mutationen, die durch Engineering auf
Genomebene eingeführt wurden, über-
13
BRAIN special: Coping with complexity in metabolic engineering
The genome size of typical biotechnological
Deep-sequencing
The next generation of
­s equencing technology
that reads every single
nucleotide of a gene or
genome up to several
hundred. As a result, the
accuracy of the calcu­lated gene sequence is
greatly improved.
workhorses like E. coli or B. subtilis is in the range
of 4 Mbp encoding some 4000 genes, whereas
the common amino acid producer C. glutamicum
only possesses 3.3 Mbp. The smallest genomes of
natural self-replicating prokaryotic cells encode as
few as 500 genes. Global transposon mutagenesis has revealed the putatively minimal set of 387
ing includes technologies like global transcription
genes indispensible for life of Mycoplasma geni-
machinery engineering and genome editing us-
talium; but the minimal number might be smaller,
ing oligonucleotides, e. g. Multiplex Automated
implying that the cell’s vital functions can be en-
Genome Engineering (MAGE), or trackable mul-
coded by a surprisingly small set of genes. Mo-
tiplex recombineering (TRMR), currently culmi-
lecular biologists try to take advantage of these
nating in more than 80 genome edits within a
calculations by stepwise reduction of genome
single E. coli cell. The most important prerequisite
sizes. A rich toolbox of “molecular-surgery” tech-
for the successful application of non-targeted
nologies enables sophisticated strategies for ge-
systems level engineering is the availability of a
nome reduction.
reliable screening assay for the selection of a desired clone. In cases for which this prerequisite
BLICKWINKEL • KOMPLEXITÄT complexity
Das derzeitige Wissen selbst über den
am gründlichsten untersuchten einzelligen
Prokaryoten wie E. coli oder B. subtilis führt
nicht zu einem wirklich vorhersagekräftigen Verständnis der zellulären Antworten
der genetischen und von der Umwelt beeinflussten Störeinflüsse. Als Folge davon
streben die Experten der synthetischen
Biologie danach, biologische Systeme aufzubauen, die nur auf den wesentlichen Teilen eines lebenden Systems basieren. Die
Reduzierung der Komplexität erleichtert
das Erstellen umfassender und vorhersagekräftiger Modelle, wodurch die Geschwindigkeit und die Präzision des Prozesses der
Stammoptimierung verbessert werden.
Zwei alternative Ansätze kompetieren derzeit um die Erschaffung der kleinsten selbstreplizierenden Zelle: (i) De-novo-Synthese
eines Minimalgenoms oder (ii) die schrittweise definierte Reduktion eines komplexen Genoms.
Das Minimalgenom durch Reduzierung
Die Genomgröße typischer biotechnologischer Arbeitspferde wie E. coli oder
B. subtilis liegt im Bereich von 4 Megabasenpaaren (Mbp), die für etwa 4000 Gene
BRAIN speZial: Über den Umgang mit Komplexität beim „Metabolic Engineering“
15
BRAIN special: Coping with complexity in metabolic engineering
[Die Tür für die Konstruktion durch
„Engineering“ verbesserter, schlanker
und daher weniger komplexer Genome
und Organismen ist nun offen.]
[The door to the construction of truly engineered, streamlined and thus less complex
genomes and organisms is now open.]
The minimal genome by de novo synthesis
The first genome assembly independent of
a biological template was demonstrated by the
chemical synthesis of a 7.5 kb poliovirus genome.
After 15 years of work, the chemically synthesized
genome of Mycoplasma mycoides (1.08 Mbp)
was successfully introduced into M. capricolum
recipient shell to give M. mycoides JCVI, a selfreplicating organism with a de novo synthesized,
codieren, während der weitverbreitete
Aminosäurenproduzent C. glutamicum nur
3,3 Mbp aufweist.
Die kleinsten Genome der natürlichen
selbstreplizierenden prokaryotischen Zellen codieren für nur 500 Gene. Durch umfassende Transposon-Mutagenese wurde
ein Minimalset von 387 Genen bestimmt,
das Bedingung für das Überleben von Mycoplasma genitalium ist; die Minimalzahl
könnte jedoch geringer sein, was impliziert, dass die Lebensfunktionen der Zelle
durch ein überraschend kleines Set von Genen codiert sein können.
Molekularbiologen versuchen, diese
schrittweise Reduzierung der Genomgrö­
ßen auszunutzen. Ein reichhaltiger Werkzeugkasten von Technologien für „molekulare Chirurgie“ ermöglicht ausgeklügelte
Strategien für die Genomreduktion.
Das Minimalgenom durch De-novoSynthese
yet copied genome. Lessons learned from these
pioneering works will facilitate and accelerate
future de novo genome syntheses. However, genome transplantation protocols will most likely
have to be adapted for each organism individually,
Chassis organism
A host organism used as
a shell with (minimal) basic
metabolic equipment for
the introduction of elements
of a new metabolic
pathway — in other words,
pathway engineering.
probably restricting this approach to a few chassis
organisms. Nevertheless, the door to the construction of truly engineered, streamlined and thus less
complex genomes and organisms is now open.
Orthogonalization to reduce complexity
The term orthogonal is routinely used in math-
# 272 Unexpected relations
ematics and engineering sciences (Figure 1). It describes independence of co-existing subsystems that
together build an entity. The term is closely linked
to the concept of modularity. In a simplified view, a
naturally evolved microbial cell is a fully integrated
entity without subsystems. Orthogonal production
pathways (e. g. for valuable chemicals) rely on the
host strain only for enzyme synthesis and operate
independently of the host’s metabolism. Consequently, the unit that needs to be engineered (and
thus to be understood) is significantly less complex
than a whole self-replicating cell.
BLICKWINKEL • KOMPLEXITÄT complexity
Der erste Zusammenbau eines Genoms­
unabhängig von einer biologischen Matrize konnte durch die chemische Synthese
eines 7,5-kb-Poliovirus-Genoms gezeigt
werden. Nach 15 Jahren Arbeit wurde das
chemisch synthetisierte Genom von Mycoplasma mycoides (1,08 Mbp) erfolgreich
in M. capricolum als Hülle eingeführt, sodass M. mycoides JCVI erhalten wurde, ein
selbstreplizierender Organismus mit einem de-novo-synthetisierten, wenn auch
kopierten Genom. Die Lehre aus diesen Pionierarbeiten wird zukünftig De-novo-Genomsynthesen erleichtern und beschleunigen. Protokolle zur Genomtransplantation
müssen jedoch höchstwahrscheinlich für
jeden Organismus individuell angepasst
werden, was diesen Ansatz vermutlich auf
wenige „Chassis”-Organismen begrenzen
wird. Dennoch ist nunmehr die Tür für die
Konstruktion tatsächlich durch „Engineering“ verbesserter, schlanker und daher
weniger komplexer Genome und Organismen offen.
Chassis-Organismus
Ein Wirtsorganismus, der
als Hülle mit einer (mini­
malen) metabolischen
Grundausstattung für das
Einbringen von Elementen
eines neuen Stoffwechsel­
wegs – also für das Pathway-Egineering – dient.
BRAIN speZial: Über den Umgang mit Komplexität beim „Metabolic Engineering“
17
BRAIN special: Coping with complexity in metabolic engineering
Box 1
Ein Schlaglicht auf die Xenobiologie
Orthogonalisierung zur Komplexitätsverminderung
Abb. 1
Geometrisch betrachtet
stehen zwei orthogonale
Vektoren rechtwinklig­zueinander. In den Ingenieurswissenschaften bedeutet
Orthogonalität, dass kleine
Untersysteme­, die eigenständig entworfen wurden
und unabhängig voneinander funktionieren, zusammen
als Ganzes funktionieren
können. Typischerweise sind
orthogonale Systeme in
Modulen organisiert, so wie
z. B. ein PC aus wesentlichen Untersystemen besteht
(z. B. Tastatur, Monitor,
Rechner), die selbst wieder
aus Modulen zusammengesetzt sind, (z. B. Festplattenlaufwerk, Grafikkarte,
Multiprozessor und RAMEinheiten).
Der Begriff „orthogonal” wird routinemäßig in der Mathematik und in den Inge­
nieurswissenschaften verwendet (Abb. 1). Er beschreibt die Unabhängigkeit koexistierender Untersysteme, die zusammen eine Einheit bilden. Der Begriff ist eng verknüpft
Synthetic biology, especially synthetic xenomit dem Konzept der Modularität. In biology, offers a variety of potentially useful oreiner vereinfachten Darstellung ist eine thogonal modules (Box 1). Precise and predictable
natürlich entstandene mikrobielle Zelle regulation is key to control engineered parts or
eine voll integrierte Einheit ohne Unter- pathways in natural hosts but is notoriously prone
systeme. Orthogonale Produktionswege to cross-talk. Molecular biologists succeeded in
(z. B. für werthaltige Chemikalien) nutzen the isolation of synthetic control elements from
den Wirtsstamm nur für
the cell’s regulatory network.
die Enzymsynthese und
funktionieren unabhän­
Orthogonal metabolism
gig vom Metabolismus
des Wirts. Folglich ist die
The holy grail in metaEinheit, die bearbeitet
bolic engineering is the intro(und damit verstanden)
duction of heterologous meta­
werden muss, deutlich
bolism decoupled from the
weniger komplex als eine
host-cell’s metabolic network.
ganze selbstreplizierende
This avoids unproductive crossZelle. Die synthetische Biotalk of life-sustaining and
logie, insbesondere die synthetische Xeno- product-forming biochemical reactions. In the case
biologie, bietet eine Vielzahl von potenzi­ of one single product-forming reaction this is called
ell nützlichen orthogonalen Modulen (Box 1). whole-cell biotransformation and separation from
Eine präzise und vorhersagbare Regulati- cellular metabolism occurs by using non-natural
on ist der Schlüssel zur Kontrolle von Tei- substrates and products. Biodiversity provides a
len oder Stoffwechselwegen in natürlichen rich toolbox of biocatalysts assembled in operons
Wirten. Diese eingebrachten Teile sind je- or regulons that enable bacteria to degrade or syndoch Wechselwirkungen mit den Kompo- thesize a broad variety of even highly toxic and/or
nenten der Wirtszelle unterworfen. Daher xenobiotic small molecules like dioxins or nitroarohaben Molekularbiologen die eingebrach- matic compounds. Intermediates of those pathways
ten Teile durch synthetische Kontrollele- are mostly xenobiotic and thus do not interfere with
mente vom regulatorischen Netzwerks der the host cell’s core metabolic or regulatory network.
Zelle entkoppelt.
Consequently even multi-step whole-cell biotrans-
Orthogonaler Metabolismus
„Cross-Talk”
Überlagerung bzw. gemeinsame Nutzung von Signalund Stoffwechselwegen
Der heilige Gral beim „Metabolic Engineering” ist die Einführung eines heterologen Metabolismus, der vom metabolischen
Netzwerk der Wirtszelle abgekoppelt ist.
Dadurch kann unproduktiver „Cross-Talk”
zwischen lebenserhaltenden und produktbildenden biochemischen Reaktionen vermieden werden. Im Fall einer einzelnen,
Co-Faktor-unabhängigen produktbildenden
Fig. 1
In mathematics, change
of the magnitude of vector
“a” has no influence on
the magnitude of vector
“b” if both vectors are
orthogonal. In engineering
sciences, orthogonality
refers to building complex
products from smaller
subsystems that can be
designed independently
but function together as a
whole. Typically, orthogonal subsystems are organiz­
ed as modules, such as
e.g. a personal computer
is composed of major
subsystems (e.g. keyboard,
monitor, computer) which
by themselves are composed of modules (e.g. the
hard disk drive, graphics
card, multiprocessor- and
RAM-units).
formations can operate orthogonally.
Spatial orthogonality by engineering
­bacterial microcompartments
Eukaryotic metabolism is a prime example
for partial orthogonalization by spatial separation of major cellular processes like protein degradation (lysosomes), RNA synthesis (nucleus), or
energy production (mitochondria). The prototype
textbook prokaryotic cell has no subcellular compartments. However, bacteria of the ubiquitous
BLICKWINKEL • KOMPLEXITÄT complexity
Die Idee der Synthetischen Biologie wird durch die Xenobiologie auf die Spitze getrieben. Ihr Ziel
ist es, lebende Systeme aufzubauen, die zwar von biologischen Blaupausen abgeleitet sind, aber unabhängig von standardisierten biologischen Bausteinen und Bedingungen funktionieren. Daher wird die
Xenobiologie durch die beiden fundamentalsten Fragen der Naturwissenschaften inspiriert: Was macht
ein lebendes System aus und kann es de novo geschaffen werden?
Die Xenobiologie wird durch unabhängige Forschung zum Ursprung des Lebens (Protozellen), die
Exobiologie (Astrobiologie) und die Systemchemie angetrieben. Die bedeutendsten Projekte in dieser
Richtung sind die Forschungen auf dem Gebiet der DNA-Modifizierung oder zum Ersatz von DNA zur Informationsspeicherung. Beispiele für DNA-Modifizierungen sind vergrößerte DNA-Moleküle (xDNA /
A spotlight on Xenobiology
yDNA), die durch Benzo-Homologation oder BenzoXenobiology is one extreme discipline within the broad Fusion generiert werden; das „Engineering“ von
field of synthetic biology. Xenobiology aims to build living Polymerasen dahingehend, dass sie Xeno-Nukleo­
systems guided by biological blueprints but ideally inde- tide akzeptieren, um XNA (Xeno Nucleic Acids,
pendent of standard biological building blocks and con- Desoxyribose ist durch alternative Kohlenhydrate
straints. Hence, Xenobiology is energized by two of the most ersetzt) zu synthetisieren; oder das genetische Alfundamental questions in life sciences: what makes up a liv- phabet auf einen Sechs-Basen-Code zu erweitern.
Eine extreme theoretische Spielart der Xenoing system and can it be created de novo? Concepts within
xenobiology are fuelled by rather independent research on biologie wurde von George Church vorgeschlagen,
the origin of life (protocells), exobiology (astrobiology), and der den Begriff des gespiegelten Lebens eingeführt
systems chemistry. The most distinguished projects within hat. Dies bedeutet, dass Proteine, die normalerthe field comprise research to modify or replace DNA for weise aus linksorientierten Aminosäuren bestehen,
information storage. Examples include size expanded DNAs stattdessen rechtsorientierte Aminosäuren ent(xDNA / yDNA) obtained by a process called benzo-homolo- halten. Wenn man diesen Gedanken weiterdenkt,
gation or benzo-fusion, engineering polymerases to accept könnten diese Proteine die Grundlage einer neuXNA-nucleotides to synthesize and amplify XNA (Xeno Nu- en und daher vollständig orthogonalen Biochemie
cleic Acids, desoxyribose replaced by alternative carbohy- sein. Weniger herausragend, aber immerhin bereits
drates) or vice versa, or extending the genetic alphabet to a real, sind die Bemühungen, den genetischen Standard-Code entweder durch Umcodierung eines
six-base code.
One extreme theoretical embodiment of xenobiology bestimmten Stopcodons („amber“) in Aminosäurewas put forward by George Church introducing the mirror- codierende Codons oder sogar durch Änderungen
life concept in which proteins that would normally be made des Codes mittels Einführung eines Vierer-Codons
of left-handed amino acids would instead contain right- zu erweitern. Die Decodierung des geänderten
handed amino acids. Extending on this line of speculation, Codes wurde ebenfalls angegangen und konnte
these proteins would give rise to a novel, thus fully orthogo- durch erfolgreiches erneutes „Engineering“ der orthogonalen mRNA-Ribosomenpaare (ribo-X, ribonal biochemistry.
Less distinguished but already real are efforts to ex- Q1) gezeigt werden.
Die griechische Vorsilbe „xenos“ bedeutet
pand the standard genetic code by either recoding amber
codons or even altering the code by the introduction of a fremd, daher wird das Konzept der Xenobiologie
quadruplet codon. Decoding of the altered code was also auch als Gelegenheit angesehen, einen genetiaddressed and demonstrated by successful reengineering of schen Schutzwall zu installieren, um den Austausch
mit existierenden „natürlichen“ biologischen Sysorthogonal mRNA-ribosome pairs (ribo-X, ribo-Q1).
The Greek prefix “xenos” means foreign, so the con- temen zu verhindern, solange die Bausteine limicept of xenobiology is also seen as an opportunity to install tiert sind. Die Module, aus denen die Xenobioloa genetic firewall to prevent exchange with existing “nat­ gie besteht, sind noch in den Kinderschuhen, noch
ural” biological systems as long as building blocks are re- nicht in operative (Unter-) Systeme integriert und
stricted. The modules constituting xenobiology are still in für einen Paradigmenwechsel fehlen auch noch die
their infancy, not yet integrated in operative (sub-) systems Fallstudien, die die Machbarkeit der Xenobiologie
and far from demonstrating paradigm-shifting case-studies. belegen. Die einzelnen Module scheinen jedoch
However, individual modules appear ideally suited to fill the ideal zum Auffüllen des Werkzeugkastens der Orthogonalität geeignet zu sein.
orthogonality toolbox.
BRAIN speZial: Über den Umgang mit Komplexität beim „Metabolic Engineering“
Reaktion wird dies Ganzzell-Biotransformation genannt. Die Trennung vom zellulären
Metabolismus erfolgt dabei unter Verwendung nicht natürlicher Substrate und Produkte. Die Biodiversität hält einen mit Biokatalysatoren prall gefüllten Werkzeugkasten bereit, organisiert als Operons oder Regulons, die es den Bakterien ermöglichen, eine breite
Vielfalt sogar hochtoxischer und/oder xeno­biotischer kleiner Moleküle wie Dioxine phylum Planctomycetes challenge this concept;
oder nitroaromatischer Verbindungen ab- additional evidence comes from observations
zubauen oder zu synthetisieren. Solche of numerous intracellular structures in bacteria
Moleküle sind dem Organismus fremd und and archaea. Among those structures, bacterial
interferieren dadurch nicht mit dem natür- microcompartments (BMC) are distinguished as
lichen metabolischen oder regulatorischen protein polyhedral inclusions (Figure 2). The protoNetzwerk.
type was shown to contain the CO2-fixing enzyme
Räumliche Orthogonalität durch
Engineering bakterieller Mikro­
kompartimente
Abb. 2
Die Reprogrammierung
bakterieller Mikrokompartimente (BMC) ist gegen­
wärtig auf die Änderung der
Zusammensetzung der
Enzyme (orange Punkte)
beschränkt, die in einer
Proteinhülle verkapselt sind
(rote und graue Punkte);
1,2-PDO, 1,2-Propandiol.
Der eukaryotische Metabolismus ist
ein erstklassiges Beispiel für die teilweise Orthogonalisierung durch räumliche
Trennung wesentlicher zellulärer Prozesse wie Proteindegradation (Lysosomen),
RNA-Synthese (Zellkern)
oder Energieproduktion­
(Mitochondrien). Die prototypische, schulbuchmäßige prokaryotische­
Zelle besitzt keine subzellulären Kompartimente.
Die Bakterien des ubiqui­
tären Stammes der Planctomycetes stellen dieses
Konzept jedoch infrage.
Zusätzliche Anhaltspunk­te stammen aus Beobachtungen von vielfältigen intrazellulären Strukturen in Bakterien und Archaeen. Innerhalb dieser
Strukturvielfalt werden bakterielle Mikro­kompartimente (BMC) als Proteineinschlüsse in Polyederform beschrieben (Abb. 2).
Für den Prototyp konnte gezeigt werden,
dass das CO2-fixierende Enzym RUBISCO­
zusammen mit der Carboanhydrase enthalten ist, um die CO 2-Fixierung unter
niedrigen Konzentrationen anorganischen
Kohlenstoffs zu verbessern. Natürliche
BMCs können umprogrammiert werden.
Um ihr gesamtes biotechnologisches Po-
tenzial auszuschöpfen, muss man die Transportmechanismen von Metaboliten über die
proteinogene Barriere der BMC im Detail verstehen.
to scaffolds thereby forming metabolic pipelines.
cessfully recruited as scaffolds: proteins, RNA and
DNA. The bacterial cytoskeleton offers further options for spatial organization of proteins; however,
due to advances in DNA-synthesis technologies
and prediction of 3D-structures of RNA, these two
polymers promise ease in designing and repro-
der to facilitate CO2-fixation under conditions of
gramming scaffolds. Synthetic enzyme scaffolds
low concentrations of inorganic carbon. Further
have broad potential to sufficiently isolate meta-
examples include BMCs for the degradation of
bolic modules or pathways from the host’s intrinsic
ethanolamine and 1,2-propanediol in Salmonella
metabolic and regulatory network, thus introduc-
and Citrobacter. BMCs are widespread in bacte-
ing orthogonal metabolism
ria and are involved in different metabolic path-
Perspective: next generation’s metabolic
engineering
ways to protect cells from cytotoxic intermediates
or to prevent loss of volatile hydrocarbons. Thus,
the protein shells insulate catalysis and represent
simple metabolic organelles
In this review, we
(metabolosomes).
partments is independent of
the internalized proteins and
even the outer surface of
MCPs might be decorated
with heterologous proteins.
BMCs might be rationally engineered to function as insu-
present alternative apFig. 2
Reprogramming of
bacterial microcompartments (BMC) is currently
restricted to alter the
composition­ of the enzymes (orange balls)
encapsulated by the proteinogenous shell (red
and grey balls); 1,2-PDO,
1,2-propanediol.
lated intracellular bioreactors
thus conferring orthogonality
to otherwise interconnected metabolic pathways.
Spatial orthogonality by synthetic
­scaffolding of pathways
Inspired by natural blueprints like tryptophan
synthase, polyketide synthases, or purinosomes,
the concept of metabolic channeling was adopted
by engineers to optimize metabolic fluxes, e.g. for
mevalonate or glucaric acid biosynthesis. Gener-
Räumliche Orthogonalität durch
synthetisches „Scaffolding“ der
Stoffwechselwege
All major intracellular polymers have been suc-
RUBISCO together with carbonic anhydrase in or-
Assembly of microcom-
19
BRAIN special: Coping with complexity in metabolic engineering
Purinosome
Purin-forming system
­c omposed of many
different­proteins that
form a functional unit
ally, a scaffold is designed that determines the spatial organization of sequential enzymatic reactions
(Figure 3). By means of short peptide ligands, the
enzymes constituting the (artificial) pathway dock
BLICKWINKEL • KOMPLEXITÄT complexity
Fig. 3
Spatial orthogonalization
is achieved by localization
of the enzymes involved
in the productive pathway
to increase and optimize
flux through the enzymatic
pipeline so that diffusion
of intermediates is absent.
Optimal scaffold design
might be guided by the
kinetic parameters of the
enzymes or explored
randomly. The scaffold on
which pathways enzymes
(E1, E2, E3) are lined up via
ligands (grey, red, orange)
is provided by intracellular
polymers such as DNA
(or XNA), RNA (5’- 3’) or proteins (N’- C’); in vitro synthesis of DNA allows to program the polymer com­
position following virtually
any design.
proaches that a metabolic engineer might use to
gain control over bacterial metabolism. Systems
level engineers accept
the complexity of naturally evolved host strains.
Based on the available
observations and knowledge, they simulate a biological unit of interest to
obtain predictions for the modifications required
to reach a desired outcome. After the implementation of these modifications, deviations from the
desired outcome are generally attributed to insufficiently detailed models and insufficient knowledge. This can lead to iterative cycles of molecular
modifications, analyses of the resulting phenotype,
and refinement of the model. An increasing un-
Das Konzept der metabolischen Kanalisierung, inspiriert durch natürliche
Blaupausen wie Tryptophansynthase, Poly­
ketidsynthase oder Purinosomen, wurde
von den „Engineers“ übernommen, um
metabolische Flüsse zu optimieren, z. B.
für die Biosynthese von Mevalonat oder
Glucarsäure. Im Allgemeinen wird ein Gerüst („Scaffold“) so entworfen, dass es die
räumliche Organisation aufeinanderfolgender enzymatischer Reaktionen festlegt
(Abb. 3). Durch kurze Peptidliganden binden
die Enzyme, die Bestandteil des (künstlichen) Stoffwechselwegs sind, an das Gerüst, sodass metabolische Fließbänder gebildet werden. Alle
wesentlichen intrazellulären Polymere
wurden erfolgreich
als Gerüstbestandteile verwendet: Proteine, RNA und DNA.
Das bakterielle Cytoskelett bietet weitere Optionen für die
räumliche Organisation von Proteinen. Durch die Fortschritte
bei den DNA-Synthesetechnologien und
der Vorhersage von 3D-Strukturen von
RNA versprechen diese beiden Polymere
eine Erleichterung beim Design und der
Reprogrammierung von Gerüsten.
Ausblick: Die nächste Generation
des „Metabolic Engineering”
derstanding of the regulatory modules present in
In diesem Übersichtsartikel präsentieren wir alternative Ansätze, die ein „Meneering process further.
tabolic Engineer” nutzen kann, um die
In order to become predictive at high levels Kontrolle über den bakteriellen Metabolisof accuracy, scientists need to understand the mo- mus zu erhalten. „Systems Level Engineers”
cells, and engineering of these modules — rather
than of single enzymes — will facilitate the engi-
Purinosome
Purin bildendes System
bestehend aus vielen unterschiedlichen Proteinen,
die eine funktionelle Einheit
bilden
Abb. 3
Die räumliche Orthogonalisierung wird durch die
Lokalisierung derjenigen
Enzyme erreicht, die im produktiven Stoffwechselweg
involviert sind, um den Fluss
durch das enzymatische
Fließband zu erhöhen und
zu optimieren, sodass
keine Diffusion der Intermediate auftritt. Optimales
Scaffold-Design kann zu­
fällig erkundet oder
mittels kinetischer Parameter der Enzyme vorhergesagt werden. Das Rückgrat,
auf dem die Stoffwechsel­
enzyme (E1, E2, E3) mittels
Liganden aufgereiht sind
(grau, rot, orange), wird
durch intrazelluläre Polymere wie DNA (oder XNA),
RNA (5’- 3’) oder Proteine
(N’- C’) gebildet. In-vitroSynthese von DNA erlaubt
die Programmierung der Polymerzusammensetzung
nach praktisch jedem beliebigen Design.
BRAIN speZial: Über den Umgang mit Komplexität beim „Metabolic Engineering“
Abb. 4a
Aus der Sicht des „Engineerings” ist eine natürlich
entwickelte Zelle eine voll
integrierte Einheit ohne orthogonale Untersysteme. Alle
zellulären Aktivitäten sind
miteinander verbunden,
dieses Zusammenspiel nennt
man auch Interactom
(Gesamtheit der Wechsel­
wirkungen). In einem
heterotrophen Organismus
kann eine einzige Zuckersorte als ausschließliche Quelle
für Kohlenstoff und Ener­gie dienen und muss dafür
in verschiedene metabolische Fließbänder kanalisiert
werden, um das Überleben
zu ermöglichen. Der Katabolismus (schwarze Pfeile)
regeneriert die Energieträger
der Zelle und generiert
kleine Moleküle als univer­
selle Zwischenprodukte.
Mehrere dieser Abbauprodukte können auch regulatorisch wirken (rote Linien).
Der native oder heterologe
Stoffwechselweg zu dem
gewünschten Produkt ist
jenen intrinsischen Wechselwirkungen unterworfen,
die das Interactom (und
damit die Komplexität) erweitern.
Abb. 4b
Ein echter orthogonaler­
Metabolismus des produktspezifischen „Substrats 2“ (orange Pfeile)
tritt nicht mit dem natür­
lichen Interactom der
Wirtszelle in Wechselwirkung.
Daher kann er nach
grundlegenden Prinzipien
des „Engineerings“ mit
hoher Vorhersagepräzision
gestaltet werden.
akzeptieren die Komplexität natürlich entstandener Wirtsstämme. Basierend auf den
Beobachtungen und dem Wissen, das zur Zeit verfügbar ist, simulieren sie das jeweilige
biologische System, um Vorhersagen für die Modifikationen treffen zu können, die notwendig sind, um zum gewünschten Ergebnis zu kommen. Nachdem diese Modifikationen
implementiert wurden, sind etwaige Abweichungen vom gewünschten Ergebnis im lecular principles of living systems — a challengAllgemeinen auf ein unzureichend detail- ing task. However, meaningful predictions even
getreues Modell und unzulängliches Wissen with incomplete data can be obtained if the dezurückzuführen. Dem wird mit mehreren sign principles that are implemented in naturally
Zyklen bestehend aus dem Einführen wei- evolved cells are known. For instance, flux balance
terer molekularer Modifikationen, der Ana- analysis can predict biomass yield, which results
lyse des resultierenden Phänotyps und der from complex interactions of many cellular comentsprechenden Verfeinponents, based solely on
erung des Modells bethe known stoichiometry
gegnet. Ein verbessertes
of the metabolic network
Verständnis der in den
and simple objective funcZellen vorhandenen re­tions such as maximization
gulatorischen Module
of growth. Recently, more
und ein „Engineering“
generally applicable objecdieser Module – ansteltive functions have been
le einzelner Enzyme –
identified that still await
werden den „Engineerpredictive applications.
ing“-Prozess weiter erShortcomings in unleichtern.
derstanding the molecular
Um auf einem hoprinciples of life currently
hen Präzisionsniveau
restrict a truly successful de
vorhersagekräftig zu werden, müssen Wis- novo design of complex microbial cell factories. To
senschaftler die molekularen Prinzipien date, scientists succeeded in chemically copying
lebender Systeme verstehen – eine Her- natural blueprints and modeling of a near-minimal
ausforderung. Aussagekräftige Vorhersa- genome organism — milestones of synthetic and
gen, auch mit unvollständigen Datensät- systems biology. However, a microbial cell dezen, können bereits dann erhalten werden, signed and synthesized independent of blueprints
wenn nur die Grundprinzipien des Designs, will be the ultimate test for our insight into those
die in natürlich entwickelten Zellen ange- principles. Joint efforts by systems and synthetic
wendet werden, bekannt sind.
biologists might decipher those principles in the
Zum Beispiel kann mittels einer future.
Gleichgewichtsflussanalyse die Ausbeute
Given the enormous efforts necessary to
der Biomasse vorhergesagt werden, die model a minimal genome organism, the introducdas Resultat aus komplexen Wechselwir- tion of orthogonal metabolic modules within an
kungen vieler zellulärer Komponenten existing cell is presently the most efficient way to
ist, basierend lediglich auf der bekannten obtain control over engineered microbial producStöchiometrie des metabolischen Netz- tion processes. Not interfering with the yet unrewerks und einfachen Zielvorgaben wie z. B. solved interconnectivity of the different endogWachstumsmaximierung. Unlängst wur- enous cellular networks, orthogonal metabolism
den Zielvorgaben formuliert, die allgemei- enables production of valuable products at high
ner anwendbar sind, jedoch noch in vor- yields. Recent success in introducing or reprogramhersagekräftige Anwendungen überführt ming spatial segregation of pathways will extend
werden müssen.
orthogonalization to endogenous pathways of the
Fig. 4a
From an engineering
perspective, a naturally
evolved microbial cell
is a fully integrated entity
and orthogonal subsystems are absent. The
different layers of cellular
activity are connected
by various nodes building
a network, the interactome.
In a heterotrophic organism, a single carbohydrate­
substrate can serve as
sole source for carbon and
energy and thus has to
be channelled in several
metabolic pipelines in
order to sustain life. Catabolism (black arrows)
alters levels of co-factors
and generates small
molecule intermediates
that interact with various
targets, e.g. by introducing feed-back loops (red
lines). The native or hete­
rologous pathway towards
the desired product is
subject to those intrinsic
interactions expanding
the interactome (and thus
complexity).
Fig. 4b
True orthogonal meta­
bolism of product specific
“Substrate 2” (orange
arrows) does not interfere
with the host cell’s native
interactome. Hence, it can
be designed following
simple forward engineering principles with high
accuracy of prediction.
BLICKWINKEL • KOMPLEXITÄT complexity
BRAIN special: Coping with complexity in metabolic engineering
# 486 Plot points
Defizite im Verständnis molekularer Prinzipien des Lebens schränken im Moment
ein wirklich erfolgreiches De-novo-Design komplexer mikrobieller Zellfabriken ein. Bislang gelang es Wissenschaftlern, natürliche Blaupausen chemisch zu kopieren oder einen
Organismus mit nahezu minimalem Genom zu modellieren – Meilensteine der synthetischen Biologie und der Systembiologie.
host. However, truly orthogonal metabolism will Eine Mikrobenzelle, die unabhängig von
have to operate independently of cofactor regen- Blaupausen entworfen und synthetisiert
eration by the host cell. We have already seen the wurde, wird jedoch die ultimative Prüfung
für unser Verständnis dieser Prinzipien sein.
first studies addressing this issue.
As rather limited protein engineering ef- Durch gemeinsame Anstrengungen seitens
forts are required to alter co-factor specificity of der System- und der synthetischen Biologie
enzymes and genome-editing technologies are könnten solche Prinzipien in Zukunft entavailable, we expect to see examples of multi-step schlüsselt werden.
Bedenkt man den enormen Aufwand,
pathways physically decoupled from the host cell’s
der notwendig ist, um einen Organismus
cofactor-pool in the near future.
From the viewpoint of an industrial metabolic mit einem Minimalgenom zu modellieren,
engineer, time-to-market aspects are paramount. so erscheint die Einführung orthogonaler
Therefore, generation of orthogonal systems based metabolischer Module in eine existierenon standard production organisms might be the de Zelle gegenwärtig als der effizienteste
21
BRAIN speZial: Über den Umgang mit Komplexität beim „Metabolic Engineering“
Weg, die Kontrolle über durch „Engineering“ gestaltete mikrobielle Produktionsprozesse zu bekommen.
Durch die Vermeidung des Eingriffs in die bislang unverstandene Interaktion verschiedener zellulärer Netzwerke, ermöglicht der orthogonale Metabolismus die Produktion
wertvoller Produkte mit hohen Ausbeuten.
Die aktuellen Erfolge bei der Einführung oder Umprogrammierung der räumlichen Trennung von Stoffwechselwegen
lassen hoffen, dass die Orthogonalisierung
auf endogene Stoffwechselwege des Wirts
ausgeweitet werden kann.
Da ein vergleichsweise geringer Arbeitsaufwand für das Protein-Engineering
bei der Änderung der Kofaktor-Spezifität
von Enzymen notwendig ist und Technologien zur Genom-Editierung verfügbar sind,
erwarten wir, in der nahen Zukunft Beispiele für mehrstufige Stoffwechselwege
zu sehen, die physikalisch vom KofaktorPool der Wirtszelle entkoppelt sind.
Aus der Sicht eines industriellen „Me- direction in the short term because introduction of
tabolic Engineers” sind Aspekte, die die heterologous pathways is state of the art and not
Produkteinführungszeit betreffen, vorran- too far off from true orthogonality. In the near fugig. Daher könnte die Schaffung orthogo- ture however, fast-track development of orthogonal
naler Systeme basierend auf den üblichen systems will be assisted by minimal chassis organProduktionsorganismen zeitnah greifbare isms, as modeling of these systems is more simple
Ergebnisse liefern, da die Einführung hete- and interaction with their metabolism is minimized
rologer Stoffwechselwege Stand der Tech- allowing precise “first-time-right” predictions.
nik und nicht weit von echter Orthogonalität entfernt ist. In der nahen Zukunft wird The authors thank John T. Sauls for carefully reading
jedoch die beschleunigte Entwicklung the original english manuscript.
orthogonaler Systeme durch minimale
„Chassis“-Organismen unterstützt werden,
da die Modellierung dieser Systeme einfacher und die Wechselwirkung mit ihrem Metabolismus minimiert ist, was präzise, beim
ersten Mal richtige Vorhersagen erlaubt­.
[Aus der Sicht eines industriellen
„­Metabolic Engineers” sind
Aspekte­, die die Produkteinführungszeit betreffen,­vorrangig.]
[From the viewpoint of an industrial
­metabolic engineer, time-to-market
aspects are paramount.]
BRAIN special: Coping with complexity in metabolic engineering
Personalie:
23
Dr. Jörg Mampel
Jörg Mampel studierte von 1991 bis 1996 Biologie an der Universität Konstanz. Seine Diplomarbeit und die
anschließende Promotion am Lehrstuhl für mikrobielle Ökologie (Uni Konstanz, Prof. Cook) untersuchten die
molekularen Grundlagen mikrobieller Abbauleistungen von Fremdstoffen (Xenobiotika). Nach der Promotion
im Jahr 2000 wechselte er als Postdoc an das Institut für Biotechnologie der ETH Zürich. Dort war er in der
Gruppe von Prof. Sauer mit dem „metabolic engineering“ von Corynebacterium glutamicum befasst. Im Jahr
2003 wechselte er zur Gruppe von Prof. Hilbi (Institut für Mikrobiologie, ETH Zürich), um die Biofilmbildung
mit Legionella pneumophila zu untersuchen. Seit 2005 ist Jörg Mampel als Projektleiter bei BRAIN in der Unit
Stammentwicklung und Screening tätig. Im Jahr 2012 hat er zusätzlich die Funktion des Plattformkoordinators
für den Bereich „genetic engineering“ übernommen, um molekulare Techniken und Konzepte v. a. aus dem
Bereich der synthetischen Biologie zu etablieren bzw. weiterzuentwickeln.
About the person:
Dr Jörg Mampel
Jörg Mampel studied Biology at the University of Konstanz between 1991 and 1993. His thesis and subsequent
doctorate at the Department of Microbial Ecology (University of Konstanz, Prof. Cook), investigated the molecular foundations of the microbial degradation capacities of foreign substances (xenobiotics). After receiving
his PhD in 2000, he was a postdoctoral researcher at the Institute of Biotechnology at ETH Zurich. There, he
was part of a group led by Prof. Sauer that was studying the metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum. In 2003 he joined a group led by Prof. Hilbi (Institute of Microbiology, ETH Zurich), to investigate the
biofilm formation of Legionella pneumophila. Since 2005, Jörg Mampel has been project manager of the strain
development and screening unit at BRAIN. In 2012, he took the additional role of platform coordinator for the
genetic engineering unit in order to establish and, more specifically, further develop molecular techniques and
concepts, especially in the field of synthetic biology.
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