Entwicklung und Erprobung nicht- invasiver Biomarker

Transcription

Entwicklung und Erprobung nichtinvasiver Biomarker-Techniken für funktionelle Assays: Erfassung molekularer
Parameter der Karzinogenese
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena
von
Dipl. troph. Kerstin Oßwald
geboren am 7. März 1973 in Jena
Dekanin:
Prof. Dr. Gabriele Diekert
1. Gutachter:
Prof. Dr. Beatrice L. Pool-Zobel
2. Gutachter:
Prof. Dr. Gerhard Jahreis
3. Gutachter:
Prof. Dr. Gerhard Eisenbrand
Datum der Disputation:
11.11.2003
Es gibt keinen Ausdruck für diese Liebe – man kann sie nur leben.
gewidmet den wundervollsten Kindern
- Marie-Magdalen und Tetje-Tristan -
und meiner Mutti
ABSTRACT
I
ABSTRACT
Biomarker-techniques to determine functional effects in humans allow the detection of risks and protection by
nutrition in dietary intervention studies. Fecal water more or less causes the effects (e.g. of nutritional factors) in
model systems and thus could be the basis for valuable biomarker approaches. Targeting the association between nutrition and cancer exfoliated cells are suitable to measure the impact of diet in target tissues of cancer.
Cells of the colon, of the urinary bladder and of the oral cavity could be utilised for development of biomarker
approaches. The aims of this work were the validation of fecal water analysis, refinement of techniques to
obtain exfoliated cells and the development of new biomarkers by characterization of novel parameters of
molecular toxicology in nutritional trials. The first investigations were aimed at determining geno- and cytotoxicity of faecal water in a human colon cell line and lymphocytes in vitro. Faecal water was isolated by centrifugation and added to the cells (10% in cell suspension). Cytotoxicity was measured by trypan blue exclusion. For
the detection of inducible DNA damages the single cell microgelelectrophoresis assay (Comet-Assay) was
used. The majority of the fecal waters obtained from subjects of a pilot trial induced DNA damage and oxidised
DNA bases in HT 29 clone 19A cells (0.9 – 9.14 fold and 1.7 – 4.9 fold, respectively in comparison with the
NaCl controls). Intra- and interexperimental coefficient of variation was in a similar range. In contrast both intraand interindividual variability were considerably higher. Interestingly, these interindividual values were not
lowered when subjects consumed identical diets. However, following intervention with certain protective
dietary regimens (e.g. lignan containing bread) significant reduction of faecal water-induced genotoxicity was
observed. A second aim of this work was the refinement of isolation methods of cells from feces, urine and
mouthwashes. The immunomagnetic isolation of epithelial cells and leukocytes from feces did not succeed.
Exfoliated fecal cells were detectable, but the obtained cells were not viable and neither quantitative nor qualitative recovery was reproducible. Supplementation experiments with HT 29 clone 19A cells (as models for
epithelial cells) and peripheral lymphocytes (as model for primary mucosal lymphocytes) showed that the
immunomagnetic separation technique was sufficiently successful, but both fecal and urinary matrices were
highly cytotoxic causing a rapid degradation of the cells. In contrast, it was possible to obtain buccal cells from
the oral cavity. The cell separation with the leukocyte-specific antibody CD45 yielded 37% leukocytes, with a
purity of 95% and viability of 65%. Filtering the mouthwash through a 10µm filter yielded 57% leukocytes,
with 86% purity and 94% viability. Using density gradient centrifugation for separation, the recovery of leukocytes was low (22%), but good results were scored for purity (95%) and cell viability (88%). Yield, viability and
celltypes in mouthwashes were determined before the separation step. Repetitive determinations of 4 individuals yielded 3.5±1.4x106 epithelial cells per mouthwash and 4.7±3.9x106 leukocytes with viabilities of 8% and
94%, respectively. The isolation of leukocytes by density gradient centrifugation and a micro-scale comet assay
modification was used for determination of baseline levels of genotoxicity. It was found that buccal leukocytes
obtained from smokers had more DNA damage than cells from non-smokers. Oral leukocytes are sufficiently
viable for measuring parameters of cytotoxicity and genotoxicity or for studying modulation of gene expression.
The cells are useful targets of a non-invasive biomarker, which could be incorporated as a tool in many types of
intervention studies.
INHALTSVERZEICHNIS
II
INHALTSVERZEICHNIS
ABSTRACT .............................................................................................................................. I
INHALTSVERZEICHN IS ..........................................................................................................II
ABKÜRZUNGS - UND S YMBOLVERZEICHNIS ........................................................................ VI
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ...................................................................................................X
TAB ELLENVERZEICHNIS .................................................................................................. XIII
1
EINLEITUNG................................................................................................................1
1.1
Theoretischer Hintergrund ..........................................................................................1
1.1.1
Karzinogenese .....................................................................................................1
1.1.1.1
Kolonkarzinogenese............................................................................................2
1.1.1.2
Karzinogenese des Harnblasenkarzinoms ...........................................................3
1.1.1.3
Karzinogenese der Oralmukosa ..........................................................................5
1.1.2
Exogene Einflussfaktoren auf die Karzinogenese...............................................6
1.1.2.1
Exogene Einflussfaktoren auf die Kolonkarzinogenese......................................7
1.1.2.2
Exogene Einflussfaktoren auf das Harnblasenkarzinom.....................................9
1.1.2.3
Exogene Einflussfaktoren auf die Karzinogenese der Oralmukosa..................11
1.1.3
Biomarker ..........................................................................................................12
1.1.3.1
Biomarker zur Beurteilung des Risikos für Kolorektaltumore .........................14
1.1.3.2
Biomarker zur Beurteilung des Risikos für Tumore des Urothels ....................16
1.1.3.3
Biomarker zur Beurteilung des Risikos für Tumore der Oralmukosa ..............17
1.1.3.4
Perspektiven für neue Biomarker ......................................................................18
2
PROBLEM- UND ZIELSTELLUNG...............................................................................20
3
M ATERIAL UND M ETHODEN .....................................................................................23
3.1
Material.....................................................................................................................23
3.1.1
Zellen.................................................................................................................23
3.1.2
Geräte ................................................................................................................23
3.1.3
Arbeitsmittel......................................................................................................24
3.1.4
Computerprogramme ........................................................................................24
3.1.5
Chemikalien, Reagenzien, Standards, Antikörper.............................................25
3.1.6
Medien, Lösungen, Puffer.................................................................................27
3.2
Methoden ..................................................................................................................30
3.2.1
Fezeswassergewinnung, Steril?ltration, Lagerung ...........................................30
3.2.2
Zellmaterial .......................................................................................................30
3.2.2.1
Zellen aus Fezes ................................................................................................30
3.2.2.2
Zellen aus Urin ..................................................................................................30
3.2.2.3
Zellen aus Mundspülproben..............................................................................30
3.2.2.4
Isolation von peripheren Lymphozyten aus Blut ...............................................31
3.2.2.5
Zellkultur der HT 29 clone 19A-Zellen ............................................................31
3.2.3
Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung ..................................................................32
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.2.4
3.2.4.1
3.2.4.2
3.2.4.3
3.2.4.4
3.2.5
3.2.5.1
3.2.5.1.1
3.2.5.1.1.1
3.2.5.1.1.2
Comet-Assay.....................................................................................................32
Vorbereitung: Objektträgerbeschichtung...........................................................32
Comet-Assay im alkalischen Milieu.................................................................32
Comet-Assay nach Inkubation mit Fezeswasser ...............................................33
Comet-Assay mit oralen Leukozyten auf Objektträgern von Trevigen ............34
Zellisolierung aus humanen Proben..................................................................34
Immunomagnetische Isolation von Zellen aus humanem Probenmaterial........34
Immunomagnetische Isolation im Dynal-System .............................................34
Waschen und Koppeln der Antikörper und Beads.............................................34
Inkubation humaner Proben mit Bead-gekoppelten Antikörpern des
Dynal-Systems ..................................................................................................35
3.2.5.1.2 Inkubation humaner Proben mit Bead-gekoppelten Antikörpern des
Macs-Systems ....................................................................................................36
3.2.5.2
Immunomagnetische Zellisolierung aus Fezes .................................................36
3.2.5.3
Immunomagnetische Zellisolierung aus Urin, Blut, Zellvollmedium...............38
3.2.5.4
Zellisolierung aus Urin durch Zentrifugation....................................................38
3.2.5.5
Zellisolierung aus Mundspülproben..................................................................38
3.2.5.5.1 Filtration über 10µm-Filcons ............................................................................38
3.2.5.5.2 Leukozytenisolation durch Dichtegradientenzentrifugation.............................38
3.2.5.5.2.1 Leukozytenisolation durch klassische Dichtegradientenzentrifugation............38
3.2.5.5.2.2 Leukozytenisolation durch Dichtegradientenzentrifugation mittels
Leucosept-Kit ....................................................................................................38
3.2.5.5.3 Immunomagnetische Separation.......................................................................39
3.2.6
Zellanfärbung und Präparation für die mikroskopische Betrachtung ...............39
3.2.7
Bestimmung des Histonacetylierungsstatus in oralen Zellen............................40
3.2.8
Probanden und Studiendesign ...........................................................................41
3.2.8.1
Probanden außerhalb der Ernährungsinterventionsstudien...............................41
3.2.8.2
Probanden und Design der Ernährungsinterventionsstudien ............................41
3.2.8.2.1 Studie mit probiotischer Wurst .........................................................................42
3.2.8.2.2 Leinsaatstudie ....................................................................................................42
3.2.8.2.3 Phosphatstudie I und II......................................................................................42
3.2.8.2.4 Brotstudie ..........................................................................................................43
3.2.9
Statistische Auswertung ....................................................................................43
4
ERGEBNISSE..............................................................................................................44
4.1
Fezeswasser als Biomarker des Effekts ....................................................................44
4.1.1
Bestimmung der Zytotoxizität und Genotoxizität von Fezeswasser ohne
Ernährungsintervention.....................................................................................44
4.1.2
Bestimmung der Zytotoxizität und Genotoxizität von Fezeswasser aus
Ernährungsinterventionsstudien als Biomarker des Effekts nach
definierter Ernährungsexposition......................................................................46
4.1.2.1
Studie mit probiotischer Wurst .........................................................................46
4.1.2.2
Leinsaatstudie ....................................................................................................48
4.1.3
Intra- und interexperimentelle sowie - individuelle Variation der
Genotoxizität von Fezeswasser .........................................................................49
4.1.3.1
Intra- und interexperimentelle Variation...........................................................49
4.1.3.2
Intra- und interindividuelle Variationsbreite im Vergleich mit der
interexperimentellen Variation..........................................................................51
4.1.3.3
Intra- und interindividuelle Variation in Abhängigkeit von der Diät................52
4.1.3.4
Zusammenfassende Darstellung........................................................................53
4.2
Abgeschilferte humane Zellen als Quelle für Biomarkeruntersuchungen................53
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.1
4.2.1.1
4.2.1.2
4.2.1.3
4.2.2
4.2.3
4.2.3.1
4.2.3.2
4.2.3.2.1
4.2.3.2.2
4.2.3.2.3
4.2.3.2.4
4.2.3.3
4.2.3.3.1
4.2.3.3.2
4.2.3.4
5
IV
Zellisolierung aus Fezes....................................................................................54
Zellwiederfindungsraten aus Fezes ...................................................................55
Zellwiederfindungsraten aus Zellvollmedium, Urin, Vollblut..........................57
Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der
Zellisolationsversuche aus Fezes, Zellvollmedium, Urin, Vollblut ..................60
Abgeschilferte Urothelzellen aus Urin..............................................................60
Abgeschilferte orale Zellen aus Mundspülproben ............................................61
Art, Ausbeute und Vitalität der oralen Zellen...................................................61
Auftrennung der Zellfraktionen der Mundspülproben......................................64
Immunomagnetische Separation oraler Zellen..................................................64
Separation oraler Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation.......................65
Separation oraler Zellen durch Filtration..........................................................66
Vergleich der Isolationsmethoden zur Separation oraler Zellen.......................66
Orale Leukozyten als Biomarker genotoxischer Wirkungen –
Ergebnisse der Brotstudie ..................................................................................67
Ausbeute und Vitalität oraler Zellen.................................................................67
Ergebnisse des Comet-Assays ...........................................................................68
Histonacetylierungsstatus in oralen Zellen .......................................................70
DISKUSSION ..............................................................................................................72
5.1
Fezeswasser als nicht- invasiver Biomarker des Effekts ...........................................72
5.1.1
Genotoxizität des Fezeswassers als funktioneller Biomarker des Effekts ........73
5.1.1.1
Beeinflussung der Genotoxizität von Fezeswasser durch
Ernährungsintervention.....................................................................................75
5.1.1.1.1 Studie mit probiotischer Wurst und Leinsaatstudie ..........................................75
5.1.1.2
Intra- und interexperimentelle und - individuelle Variation der
Fezeswassergenotoxizität..................................................................................78
5.1.1.2.1 Intra- und interindividuelle Variation der Genotoxizität der Fezeswässer
in Abhängigkeit vom Ernährungsstatus ............................................................79
5.2
Abgeschilferte Zellen - nicht- invasiv gewinnbare humane Zellen...........................81
5.2.1
Abgeschilferte Zellen aus Fezes........................................................................81
5.2.2
Wiederfindung applizierter Zellen aus Fezes, Zellvollmedium, Urin,
Blut ....................................................................................................................82
5.2.3
Abgeschilferte Urothelzellen.............................................................................83
5.2.4
Orale Zellen.......................................................................................................84
5.2.4.1
Ausbeute und Vitalität oraler Zellen aus Mundspülungen................................85
5.2.4.2
Separation oraler Zellen....................................................................................86
5.2.4.2.1 Immunomagnetische Separation.......................................................................86
5.2.4.2.2 Isolation durch Dichtegradientenzentrifugation................................................87
5.2.4.2.3 Vergleichende Diskussion der Isolationsmethoden ..........................................88
5.2.4.3
Orale Zellen als Biomarker des Effekts - Genotoxizitätsuntersuchungen
im Rahmen der Brotstudie .................................................................................89
5.2.4.4
Status der Histonacetylierung in oralen Zellen als Marker der
Modulation der Genexpression .........................................................................92
6
SCHLUSSFOLGERUNGEN ...........................................................................................94
7
ZUSAMMENFASSUNG.................................................................................................97
8
Q UELLENVERZEICHNIS .......................................................................................... XV
INHALTSVERZEICHNIS
V
ANHANG ......................................................................................................................XXXIII
A1 -Studie mit probiotischer Wurst- ........................................................................... XXXIII
A2 -Leinsaatstudie- ..................................................................................................... XXXVI
A3 -Phosphatstudie I und II- .....................................................................................XXXVIII
A4 -Brotstudie-....................................................................................................................XL
A5 -GST-Aktivität- .........................................................................................................XLIV
DANKSAGUNG ..................................................................................................................XLV
SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG............................................................................... XLVI
CURRICULUM VITAE .....................................................................................................XLVII
ABKÜRZUNGS - UND SYMBOLVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS
Abb.
Abbildung
abs.
absolut
AK
Antikörper
AP-1
Aktivator-Protein-1
APC
Adenomatöse Polyposis Coli
APS
Ammoniumpersulfat
BIAS
Bioimpedanzanalyse
BLEO
Bleomycin
BMI
Body Mass Index
BSA
Bovine Serum Albumine
bzw.
beziehungsweise
CA
Comet-Assay
CEA
Human Carcinoembryonic Antigen
CEA-d
Human Carcinoembryonic Antigen clone 85A12,
Medac GmbH, Deutschland
(an Dynabeads M450 im Labor gekoppelt)
CD45
Human Common Leukocyte Specific Antigen CD45
CD45-d
Human Common Leukocyte Specific Antigen CD45,
clone 2B11+PD7/26, Dako Diagnostika GmbH, Hamburg
CD45-d*
Dynal Biotech GmbH, Hamburg
(an Dynabeads M450 vom Hersteller gekoppelt)
CD45-m
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach
(vom Hersteller an Beads gekoppelt)
CV
Coefficient of Variation
CYP
Cytochrom-P450
d
Tag
DAPI
4´,6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride
DCC
Deleted in Colon Carcinoma
DG
Dichtegradientenzentrifugation
ddH2 O
doppelt destilliertes Wasser
DMEM
Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonucleinsäure
VI
Dynal
Isolationssystem von Dynal Biotech GmbH, Hamburg
DTT
Dithiothreitol
EA
Human Epithelial Antigen
EA-d
Human Epithelial Antigen clone Ber-EP4,
Dako Diagnostika GmbH, Hamburg
EA-d*
EA-d280
EDTA
Ethylendinitrilotetraessigsäure-Dinatriumsalz
EGF
Epidermal Growth Factor
EGF-R
Epidermal Growth Factor Receptor
EMA
Human Epithelial Membrane Antigen
EMA-d
Human Epithelial Membrane Antigen clone E29,
Endo III
Endonuclease III
EP
Ernährungsprotokoll
ESA
Human Epithelial Specific Antigen
ESA-d
Human Epithelial Specific Antigen clone VU-1D9,
Medac GmbH, Deutschland
FA
Human Fibroblast Specific Antigen clone AS02,
Dianova, Hamburg
FAP
Familiäre Adenomatöse Polyposis
FCS
Fetal Calf Serum
FW
Fezeswasser, -wässer
FPG
Formamidopyrimidine Glycosylase
g
Erdbeschleunigung
GST
Glutathion-S-Transferase
GTP
Guanosin-Triphosphat
h
Stunde
H4
Histon H4
HBSS
Hanks Buffered Sodium Saline
HEA
Human Epithelial Ant igen
HEA- m
Human Epithelial Ant igen HEA125,
VII
(vom Hersteller an Beads gekoppelt)
HNPCC
Hereditary Non Polyposis Colon Cancer
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
HPV
Human Papilloma Virus
HT29c
Zelllinie HT29 clone 19A
HT29 stamm
Zelllinie HT29 stamm
KBE
Koloniebildende Einheiten
KZ
Keimzahl
LAB
Lactic Acid Bacteria
Leu
Leucosept Separation Kit, Greiner Bio-One, Frickenhausen
LMA
Low Melting Agarose
LOH
Loss of Heterozygosity
Ly
Lymphozyten
M
Molar
Macs
Isolationssystem von Miltenyi Biotec GmbH,
Bergisch Gladbach
MGE
Micro Gel Elektrophoresis
min
Minute
MPC
Magnetic Particle Concentrator
MW
Mittelwert
n
Anzahl der Wiederholungen, Probanden
NAT
N-Acetyltransferase
NMA
Normal Melting Agarose
NR
Nichtraucher
OT
Objektträger
p
Signifikanzniveau
PBS
Phosphate Buffered Saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
PKC
Protein-Kinase C
PRÄ-AOX-Brot
Brot mit antioxidativen und präbiotischen Inhaltsstoffen
PRÄ-Brot
Brot mit präbiotischen Inhaltsstoffen
R
Raucher
Rb
Retinoblastoma-Gen
rel.
relativ
RPMI
Roswell Park Memorial Institute (Flüssigmedium)
RT
Raumtemperatur
VIII
SB
Strand Breaks
SD
Standardabweichung
SE
Standard Error of Means
Tab.
Tabelle
TEMED
Tetramethylendiamin
TI
Tail intensity
TS
Objektträger (Slids) von Trevigen, Gaithersburg
Tris
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
ÜP
Übergangsphase
u. a.
unter anderem
u. v. m.
und vieles mehr
U/min
Umdrehungen pro Minute
v. a.
vor allem
Wo
Woche
*
Signifikanzniveau p<0,05
**
***
(w)
zweiseitig ungepaarter t-Test mit Korrektur nach Welch
a, b, c, d,
gleiche Buchstaben deuten auf gleiches Signifikanzniveau
IX
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
X
Abbildung 1:
Sequenz genetischer Veränderungen, die zu kanzerogenen
Entartungen im humanen Kolon führen [FEARON und VOGELSTEIN 1990] ...............3
Abbildung 2
Einflussfaktoren der Krebsentstehung [modifiziert nach DOLL und PETO
1981] .....................................................................................................................6
Abbildung 3:
Arten von Biomarkern zur Erfassung von Risikofaktoren bzw.
protektiven Faktoren [nach KLINDER und POOL-ZOBEL 2001] ..................................13
Abbildung 4:
Schema des Parallelogramm-Verfahrens zur Charakterisierung von
toxischen bzw. präventiven Substanzen im Tier- und Humanversuch
in vivo und in vitro [modifiziert nach EISENBRAND et al. 2002] ..................................14
Abbildung 5:
Präventive Strategien im Prozess der Tumorformation [modifiziert nach
JOHNSON et al. 1997] ...............................................................................................19
Abbildung 6:
Zellisolation mittels magnetisch gekoppelter Antikörper .................................35
Abbildung 7:
Schematische Darstellung der Zellisolierung aus Fezes ...................................37
Abbildung 8:
Genotoxische Effekte von 6 Fezeswässern von verschiedenen
Personen (Nr. 1-6) an HT29 clone 19A-Zellen und Lymphozyten
[Fezeswasser 1-3 weibliche, Fezeswasser 4-6 männliche Probanden, jedes
Fezeswasser dreifach in 4 unabhängigen Versuchen getestet, MW±SD, zweiseitig
ungepaarter t-Test] .................................................................................................45
Abbildung 9:
Genotoxische Effekte der Fezeswässer von Probanden aus der
Leinsaatstudie [jedes Fezeswasser dreifach in einem Versuch getestet, MW±SD,
n = 6, zweiseitig ungepaarter t-Test] ..........................................................................49
Abbildung 10: Intraexperimentelle Variation der Objektträger im Comet-Assay nach
Inkubatio n der Lymphozyten und HT29 clone 19A-Zellen mit NaCl
bzw. Fezeswasser sechs unterschiedlicher Personen [jedes Fezeswasser
dreifach in 5 (Lymphozyten) bzw. 4 (HT29 clone 19A-Zellen) unabhängigen
Versuchen getestet, Werte NaCl aus Dreifachbestimmung in 3 unabhängigen
Versuchen getestet] ................................................................................................50
Abbildung 11: Interexperimentelle Variation der Objektträger im Comet-Assay nach
Inkubation der Lymphozyten und HT29 clone 19A-Zellen mit NaCl
bzw. Fezeswasser 6 verschiedener Personen [jedes Fezeswasser dreifach in
5 (Lymphozyten) bzw. 4 (HT29 clone 19A-Zellen) unabhängigen Versuchen
getestet, Werte NaCl aus Dreifachbestimmung in 5 bzw. 4 unabhängigen Versuchen
getestet]................................................................................................................50
Abbildung 12: Intraexperimentelle, interexperimentelle und interindividuelle
Variation von NaCl und Fezeswasser bei Lymphozyten und HT29
clone 19A-Zellen [zweiseitig ungepaarter t-Test]....................................................51
Abbildung 13: Interexperimentelle und intraindividuelle Variation von 6 FW einer
weiblichen (weibl.) und einer männlichen (männl.) Person [zweiseitig
Abbildung 14: Einfluss der Ernährung auf den Grad der intraindividuellen Variation
[zweiseitig ungepaarter t-Test] ..................................................................................53
Abbildung 15: Fezesabdruck mit DAPI-Färbung vom 04.02.1999 [400xVergrößerung] ..............55
XI
Abbildung 16: Aus Fezes zurückisolierte HT29 clone 19A-Zellen vom 26.02.1999 ...............56
Abbildung 17: Wiederfindung von Lymphozyten und HT29 clone 19A- Zellen aus
Zellvollmedium und Vollblut [zweiseitig ungepaarter t-Test]..................................57
Abbildung 18: Wiederfindungsrate von HT29 clone 19A-Zellen und Lymphozyten
nach immunomagnetischer Separation aus Urin [zweiseitig ungepaarter tTest] ....................................................................................................................58
Abbildung 19: Wiederfindung von Lymphozyten und HT29 clone 19A- Zellen nach
immunomagnetischer Selektion nach Tod- bzw. Lebendfärbung
Abbildung 20 :
Ausbeute von isolierten Urothelzellen aus Urin von 5 weiblichen und 6
männlichen Probanden .........................................................................................61
Abbildung 21: Abgeschilferte Urothelzellen vom 11.01.2000 .................................................61
Abbildung 22: Abgeschilferte orale Zellen vom 10.10.2001 und 30.10.2001 ..........................62
Abbildung 23: Gehalt an oralen Epithelzellen und Leukozyten in Mundspülungen
von 4 Probanden [zweiseitig ungepaarter t-Test]......................................................63
Abbildung 24: Vitalität oraler Epithelzellen und Leukozyten von 4 Probanden
Abbildung 25: Anteil oraler Epithelzellen und Leukozyten nach klassischer
Dichtegradientenzentrifugation und Dichtegradientenzentrifugation
mittels Leucosept-Kit [zweiseitig ungepaarter t-Test] ..............................................66
Abbildung 26: DNA oraler Zellen nach durchgeführtem Comet-Assay mit
Fluoreszenzfärbung..............................................................................................70
Abbildung 27: Säure-Harnstoff- Gel zur Auftrennung von Histon-Proben von
Mundschleimhautzellen und HT29 clone 19A- Zellen......................................71
XII
Abbildungen -AnhangAbbildung A1: Versuchsschema der Interventionsstudie mit probiotischer Wurst..........XXXIV
Abbildung A2: Genotoxische Effekte der Fezeswässer der männlichen und weiblichen
Probanden an HT29 clone 19A-Zellen unter Berücksichtigung des
unterschiedlichen Keimzahl-Status der Fezes nach dem Verzehr der
probiotischer Wurst [jedes Fezeswasser dreifach in einem Versuch
getestet, weibliche Probanden: für jeden Keimzahlstatus n=1,
männlich Probanden: sehr guter und befriedigender Keimzahlstatus
n=2, guter Keimzahlstatus n=1, MW±SD] ............................................... XXXV
Abbildung A3: Genotoxische Effekte der Fezeswässer der männlichen und weiblichen
Probanden an HT29 clone 19A-Zellen nach Endonuclease IIIInkubation unter Berücksichtigung des unterschiedlichen KeimzahlStatus der Fezes nach dem Verzehr probiotischer Wurst [jedes
Fezeswasser dreifach in einem Versuch getestet, weibliche Probanden:
für jeden Keimzahlstatus n=1, männlich Probanden: sehr guter und
befriedigender Keimzahlstatus n=2, guter Keimzahlstatus n=1,
MW±SD] ................................................................................................... XXXV
Abbildung A4: Versuchsschema der Phosphatstudie I und II...........................................XXXIX
Abbildung A5: GST-Aktivität oraler Zellen von 7 gesunden Probanden [5-10-mal je
Proband und 6-mal für HT29 clone 19A-Zellen sowie Lymphozyten reproduziert]........ XLIV
TABELLENVERZEICHNIS
XIII
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1:
Grad der Evidenz für die Assoziation zwischen Ernährung und
Kolonkrebs [modifiziert nach WCRF 1997] ...............................................................9
Tabelle 2:
Harnblasenkarzinomen [modifiziert nach WCRF 1997] ..........................................11
Tabelle 3:
Oropharyngealkarzinomen [mo difiziert nach WCRF 1997] .....................................12
Tabelle 4:
Genotoxische Effekte von 6 verschiedenen Fezeswässern einer
männlichen und einer weiblichen Person an HT29 clone 19A-Zellen
[jedes Fezeswasser dreifach in 4 unabhängigen Versuchen getestet, zweiseitig
Tabelle 5:
Genotoxische Effekte zwei verschiedener Fezeswässer einer Person an
HT29 clone 19A-Zellen nach Inkubation mit Endonuclease III [jedes
Fezeswasser dreifach in 4 unabhängigen Versuchen getestet, zweiseitig ungepaarter
t-Test] ..................................................................................................................46
Tabelle 6:
Vitalität der HT29 clone 19A- Zellen nach Inkubation mit Fezeswasser
aus der Interventionsstudie mit probiotischer Wurst (6 männliche und
8 weibliche Probanden) und genotoxische Effekte der Fezeswässer mit
und ohne Inkubation mit Endonuclease III [jedes Fezeswasser dreifach in
einem Versuch getestet]...........................................................................................47
Tabelle 7:
Genotoxische Effekte der Fezeswässer von männlichen und
weiblichen Probanden aus der Studie mit probiotischer Wurst an
HT29 clone 19A-Zellen mit und ohne Endonuclease III-Inkubation
[jedes Fezeswasser dreifach in einem Versuch getestet] .................................................47
Tabelle 8:
Wiederfindungsrate zugesetzter HT29 clone 19A-Zellen und
Lymphozyten nach der Zellisolierung aus Fezes [zweiseitig ungepaarter tTest] ....................................................................................................................56
Tabelle 9:
Anteil oraler Epithelzellen und Leukozyten von 4 Probanden [zweiseitig
Tabelle 10:
Wiederfindung oraler Epithelzellen, Leukozyten und HT29 clone
19A-Zellen mit Bead-gekoppelten Antikörpern [zweiseitig ungepaarter tTest] ....................................................................................................................65
Tabelle 11:
Wiederfindung, Prozentsatz und Vitalität oraler Leukozyten nach
Isolation durch unterschiedliche Separationsmethoden [zweiseitig
Tabelle 12:
Ausbeute und Vitalität oraler Leukozyten und Epithelzellen aus der
Brotstudie [zweiseitig ungepaarter t-Test] ................................................................68
Tabelle 13:
Anteil der Fluoreszenz im Schweif nach erfolgtem Comet-Assay mit
oralen Leukozyten aus der Brot-Studie [zweiseitig ungepaarter t-Test]...................69
TABELLENVERZEICHNIS
XIV
Tabellen -Anhang Tabelle A1:
Zusammensetzung des Leinsamenbrotes .................................................XXXVI
Tabelle A2:
Lignan- bzw. Isoflavonoidgehalte des Leinsamenbrotes ........................XXXVII
Tabelle A3:
Genotoxische Effekte der Fezeswässer der Phosphatstudie I und II an
HT29 clone 19A-Zellen ...........................................................................XXXIX
Tabelle A4:
Zusammensetzung der verschiedenen Brote aus der
Interventionsstudie ...........................................................................................XL
Tabelle A5:
Studiendesign der Brotstudie ......................................................................... XLI
EINLEITUNG
1
1
EINLEITUNG
In den westlichen Industrieländern stehen die Krebserkrankungen nach den Herz-KreislaufErkrankungen an zweiter Stelle der Todesursachen. Diese hohe Inzidenz steht in engem Zusammenhang mit der Ernährung (ELMADFA und LEITZMANN1998). Die Faktoren, die die Tumorentstehung
fördern oder auch hemmen können, werden zunächst mit epidemiologischen Studien identifiziert.
Weitere experimentelle Arbeiten sind aber notwendig, um nähere Kenntnisse im Detail zu erhalten.
Mittels Ernährungsinterventionsstudien und Messungen geeigneter biologischer Parameter (Biomarker) ist es möglich, die Rolle einzelner Faktoren als potentiell krebsreduzierend zu charakterisieren,
effektive Konzentrationen zu erkennen und Wechselwirkungen mit anderen Bestandteilen aus Lebensmitteln zu untersuchen. Es besteht für dieses relativ junge Arbeitsgebiet eine hohe Notwendigkeit, geeignete Biomarker zu entwickeln, die möglichst prädiktiv, nicht-invasiv, methodisch reproduzierbar und aussagefähig sind. Die vorliegende Arbeit verfolgt das Ziel, neue Techniken zur Untersuchung molekularer und zellulärer Zusammenhänge zwischen der Ernährung und der Kanzerogenese
zu erforschen. Dabei liegt der Fokus auf Methoden, die die Wirkungen in Geweben untersuchen, die
im engen Kontakt mit nutritiven Inhaltsstoffen stehen. Hierzu zählen zum einen die Epithelien des
Verdauungstraktes und zum anderen die der harnabführenden Organe. Dabei kommen der Mundhöhle als Ort der Nahrungsaufnahme, dem Gastro-Intestinaltrakt als Ort der Nährstoffresorption, metabolisation und –ausscheidung sowie dem Urothel als Ort der Rückresorption, Metabolisation
und Ausscheidung wasserlöslicher Nahrungsinhaltsstoffe besondere Bedeutung zu. Um protektiv
wirkende Ernährungsfaktoren zu identifizieren, ist es möglich, unterschiedliche Parameter zu erfassen, die zeigen, dass (1) Risikofaktoren in ihrer Wirkung gehemmt werden, oder (2) dass die molekularen Mechanismen der Krebsentstehung verlangsamt werden. Aus diesem Grund orientiert sich die
Entwicklung von neuen Biomarkern zunächst stark an dem Kenntnisstand über die Prozesse der
Karzinogenese.
1.1
Theoretischer Hintergrund
1.1.1
Karzinogenese
Die Karzinogenese stellt einen multifaktoriellen Prozess dar, der mit der Induktion genetischer Veränderungen, wie Mutationen, Amplifikationen oder Rekombinationen in Protoonkogenen, Tumorsuppressorgenen und DNA-Reparaturgenen einhergeht (FEARON und VOGELSTEIN 1990). Ein Tumor
kann aus einer einzigen sich teilenden Zelle, die eine DNA-Veränderung vollzogen hat, entstehen. Im
Gegensatz dazu ist er aber in den meisten Zellen nicht auf ein einziges Ereignis zurückführbar. Durch
EINLEITUNG
2
Akkumulation genetischer Veränderungen entstehen Zellen mit einem äußerst aggressiven und
invasiven Wachstumspotential. Nach dem Prozess der Initiation finden in den Nachkommen mutierter Zellen weitere Mutationen statt. Dieser Mechanismus wird als Tumorprogression bezeichnet und
spiegelt einen Evolutionsprozess unter den mutierten somatischen Zellen wider. Beschleunigt werden
kann dieses Fortschreiten durch Tumorinitiatoren (mutagene Agenzien) sowie durch Tumorpromotoren (nicht mutagene Agenzien, die die Genexpression beeinflussen, die Zellteilung anregen und das
ökologische Gleichgewicht zwischen mutierten und nicht-mutierten Zellen stören). Die Fähigkeit der
entstandenen Tumorzellen, Basalmembranen zu durchdringen, kennzeichnet die Invasivität und
damit den Prozess der Metastasierung der Tumore (ALBERTS et al. 1995).
1.1.1.1
Kolonkarzinogenese
Unter den ernährungsbedingten Krebsarten stellt Kolonkrebs bei beiden Geschlechtern die häufigste
Todesursache dar. Altersstandardisiert beträgt die Mortalität in Europa 21,5/100.000 für Männer und
14,3/100.000 für Frauen mit einer Inzidenz von 11,9 bzw. 11,3% (alle Tumore betrachtend) (LEVI et
al. 1994, LEVI et al. 1995, WCRF 1997). Das adenomatöse polypöse Karzinom (APC), das erbliche
nicht polypöse Kolonkarzinom (HNPCC), das rektale Adenokarzinom sowie das epidermoide Analkarzinom sind die hauptsächlich auftretenden Arten des Kolonkarzinoms (KURODA ET AL. 1990).
Mutationen von Genen, die mit dem Kolonkarzinom in Verbindung gebracht werden, betreffen unter
anderem das k-ras (12p), das APC (5q), das MCC, das DCC (18q) und das TP53 (17p) (BRANCA et
al. 2001). Neben den erblichen genetischen Veränderungen der familiären Syndrome wie der familiären adenomatösen Polyposis (FAP) mit der Keimzellenmutation im APC (5q21) (SORAVIC et al.
1997), dem HNPCC mit Mutationen im MSH2 (2p16), MLH1 (3p21), PMS1 (2q32) und PMS2
(7p22), die zur Mikrosatelliteninstabilität und einer Störung im DNA-Mismatch-Reparatur-System
führen (WHITEHOUSE et al. 1998), und Prädispositionen bei entzündlichen Darmerkrankungen, treten
70 bis 75% der registrierten Kolontumore sporadisch, ohne wesentliche Frühsymptome auf.
Der durch Mutationen in beiden Kopien des APC-Gens, einem Tumorsuppressorgen, einhergehende
Verlust der Heterozygotie (LOH) stellt eine wesentliche Voraussetzung für die Entstehung von
Dickdarmkrebs dar. Mutationen im APC-Gen sind nicht nur bedeutsam bei den erblich bedingten
(FAP) Kolontumoren, sondern auch bei der Mehrzahl der sporadisch entstehenden. Eine Inaktivierung des APC wird für die Entstehung der meisten Tumore des Kolons verantwortlich gemacht
(FODDE 2002, FODDE et al. 2001). Wirkungen dieser Mutation, die schon in kleinen gutartigen Polypen nachgewiesen werden können, sind neben dem veränderten Einfluss auf die Differenzierung der
Zellen und des Gewebeaufbaus eine Erhöhung der Zellvermehrungsrate im Verhältnis zum Zellverlust. Wenig später treten aktivierende Veränderungen am k-ras, einem Protoonkogen, auf, was Stö-
EINLEITUNG
3
rungen in der Differenzierung und Histologie des Kolonepithels zur Folge hat. Ähnlich wie das k-ras
findet man im Gewebe von Kolontumoren auch eine erhöhte Kopienanzahl der myc-Protoonkogene
(ALBERTS et al. 1995). Spätere Mutationen finden in den Tumorsuppressorgenen TP53 und DCC
(SMAD2/SMAD4) statt, die selten in Polypen, aber häufig in bösartigen Tumoren nachgewiesen
werden. Durch den Verlust der Aktivität des TP53-Gens gehen in mutierten Zellen weitere regulative
Mechanismen verloren, worauf ein ungebremstes Wachstum sowie eine Akkumulation weiterer
Mutationen folgt. Das durch das TP53-Gen kodierte Protein fungiert als Transkriptionsfaktor, der in
der späten G1-Phase des Mitosezyklus den Zellzyklus blockiert, so dass genetische Läsionen mit
karzinogenem Potential in dieser Phase vor dem Wiedereintritt in den Mitosezyklus korrigiert werden
können. Darüber hinaus ist TP53 in den Prozess der Apoptose involviert (BRAUERS und JAKSE
1997). Über diesen sich schrittweise vollziehenden Mechanismus ist die Entartung des gesunden
Kolonepithels über den polypösen und adenomatösen Zustand bis hin zum metastasierenden Adenom erklärbar (Abb. 1) (ALBERTS et al. 1995, FEARON und VOGELSTEIN 1990).
Abbildung 1:
Sequenz genetischer Veränderungen, die zu kanzerogenen Entartungen im humanen Kolon führen
[FEARON und VOGELSTEIN 1990]
1.1.1.2
Karzinogenese des Harnblasenkarzinoms
Das Harnblasenkarzinom repräsentiert die häufigste Lokalisation von malignen Neoplasien im Übergangsepithel des Harntraktes. Während bei Männern das Blasenkarzinom mit 9% aller Malignome
der vierthäufigste benigne Tumor ist, verkörpert es bei Frauen die fünfthäufigste Krebsart (BRAUERS
und JAKSE 1997). BORING (1993) schätzt die Zahl der blasenkarzinomassoziierten Todesfälle jährlich
auf 10.000. Somit stellt diese Tumorart bei Männern die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache
weltweit dar.
Zu Beginn kanzerogener Prozesse der Harnblase stehen meist diskrete strukturelle chromosomale
Aberrationen. Diese betreffen bei Urothelkarzinomen hauptsächlich die Chromosomen 3, 5, 7, 8 9,
11 und 17. Deletionen am Chromosom 9 stellen die häufigste strukturell-chromosomale Aberration
bei Blasenkarzinomen dar und wurden bei mehr als 60% der Blasenkarzinome aller histopathologischer Stadien und Differenzierungsgrade festgestellt (CAIRNS et al. 1991, TSAI et al. 1990). Dabei
EINLEITUNG
4
treten die Deletionen am häufigsten am langen Arm des Chromosoms 9 auf und betreffen relativ
große Bereiche, die zwischen den Chromosomenabschnitten 9q13-9q33 lokalisiert sind, was zu der
Annahme führt, dass mehrere Tumorsuppressorgene durch diese Veränderung betroffen sind
(RUPPERT et al. 1993). Ein deletiertes Allel am kurzen Arm des Chromosoms 9 in der Region 9p21
betrifft das Gen CDKN2, welches als Inhibitor der Cyclin-abhängigen Kinasen 4 und 6 fungiert und
die Progression der Zelle in die G1-Phase des Zellzyklus hemmt (NOBORI et al. 1994, SERRANO et al.
1993). Während strukturelle Veränderungen am Chromosom 9 nicht als Kennzeichen einer Tumorprogression anzusehen sind, sondern eher einen Initiationseffekt verkörpern, treten Veränderungen
am Chromosom 11, die bei ca. 40% der Harnblasenkarzinome diagnostiziert wurden, häufig erst im
manifesten entdifferenzierten Tumor auf (OLUMI et al. 1990, TSAI et al. 1990). Ein mögliches Zielgen
für Deletionen ist das Tumorsuppressorgen WT1 (11p13) (SHAW und KNOWLES 1995). Als weitere
Mutationen, neben denen im TP53-Gen (OLUMI et al. 1990), die in die Genese von Urothelkarzinomen involviert sind, wurden Mutationen im Retinoblastoma (Rb)-Gen beschrieben. Für das auf dem
Chromosom 13 lokalisierte Rb-Gen, dessen Genprodukt p110 die Inhibition von Transkriptionsfaktoren vermittelt (JACKS et al. 1992), konnte in 30% aller Urothelkarzinome der LOH festgestellt werden
(HOROWITZ et al. 1990).
Neben häufigen numerischen Aberrationen der Chromosomen 7 und 8 tritt die Monosomie des
Chromosoms 9, die ebenfalls als sehr frühes Ereignis bei der Tumorentstehung angesehen wird, in
bis zu 50 % aller Urothelkarzinome auf (HOPMAN et al. 1988, SANDBERG und BERGER 1994).
Von den 3 bekannten Protoonkogenen der ras-Familie (h-ras, k-ras, n-ras) ist vor allem das c-h-ras
bei Urothelkarzinomen alteriert. Die ras-Onkogene kodieren 21kDa-Proteine mit GTPase-Aktivität,
die für die intrazelluläre Signaltransduktion essentiell sind. Ihre Aktivierung erfolgt über singuläre
Aminosäuresubstitutionen, denen Missense-Mutationen auf der Ebene der Nukleinsäuren zugrunde
liegen. Bei Urothelkarzinomen sind in vivo 3 Punktmutationen von c-h-ras in den Codons 12, 13 und
61 bekannt sowie ein Fall einer verstärkten Genamplifikation und Punktmutation im Codon 13 von
c-k-ras (BRAUERS und JAKSE 1997). Im entdifferenzierten und fortgeschrittenen histopathologischen
Stadium von Urothelkarzinomen ist das c-erbB-1-Gen, das den EGF-Rezeptor kodiert, überexpremiert. Autophosphorylierungen des EGF-Rezeptors führen zu weiteren Phosphorylierungen von
intrazellulären Zielproteinen, die die intrazelluläre Signaltransduktion vermitteln. Strukturell veränderte Rezeptoren können ein Dauersignal produzieren, das mit einer verstärkten Kinaseaktivität
verbunden ist und zu einer akzellerierten Zellproliferation führen kann (BRAUERS und JAKSE 1997).
Formalpathogenetisch entwickeln sich Harnblasenkarzinome über Vorstufen aus dem Übergangsepithel. Das Auftreten von atypischen Übergangsepithelhyperplasien und Epitheldysplasien ist ein
Indikator für ein gestörtes Proliferationsverhalten der Harnblasenschleimhaut. Unmittelbare Vorstu-
EINLEITUNG
5
fen zum invasiven Karzinom sind die Carcinomata in situ sowie die papillären nicht-invasiven
Karzinome (WITTEKIND und NENNING 1997). Aufgrund der Heterogenität des Urothelkarzinoms ist
ein lineares Tumorprogressionsmodell, wie es von FEARON und VOGELSTEIN (1990) für das kolorektale Karzinom vorgeschlagen wurde, nicht existent. Ziel epidemiologischer und molekularbiologischer Forschungen ist es daher, die Subpopulationen der Urothelkarzinome zu identifizieren und
anhand valider Parameter zu charakterisieren.
1.1.1.3
Karzinogenese der Oralmukosa
Mit einer Häufigkeit von 3% bei den Männern und 2% bei den Frauen (in den USA), alle Malignome betrachtend, stellen Oropharyngealkarzinome die fünfthäufigste Krebsart weltweit dar, wobei
große Variationen zwischen den einzelnen Ländern und Bevölkerungsgruppen existieren (NEVILLE
und DAY 2002). In ca. 90% der Fälle treten die malignen Veränderungen als squamöse Plattenepithelkarzinome im Bereich der Zunge und des Mundbodens bei Personen ab mittlerem Alter auf.
Neben Leukoplakie und Erythroplakie, als Vorstufen squamöser oraler Entartungen, erhöhen u. a.
submukosale Fibrose und Lichen Planus das Risiko, einen Oraltumor zu entwickeln. Entsprechend
dem schichtweisen Aufbau der Mundschleimhaut und ihrer angrenzenden Strukturen entwickeln sich
aus dem jeweiligen Ursprungsgewebe verschiedenartigste benigne Neoplasien, so dass, ähnlich wie
für die Urothelkarzinome, kein generelles Tumorprogressionsmodell existiert. Wie auch beim Kolonund Blasenkarzinom spielt das Tumorsuppressorgen TP53 bei Oraltumoren eine zentrale Rolle. In
11-80% der Fälle konnte eine erhöhte Expression von mutierten TP53 ausgemacht werden
(RANASINGHE et al. 1993, WARNAKULASURIYA und JOHNSON 1993), wobei die Untersuchungsergebnisse verschiedener Forschergruppen teilweise differieren (JOHNSON et al. 1996). In 46% der
Patienten mit Oraltumoren stellten SARANATH et al. (1997) und SARANATH et al. (1999) eine Inaktivierung des Tumorsuppressorgens TP53 fest. CHEN et al. (1994) beschrieben den Verlust der Funktionalität von TP53 durch Gendeletion oder durch Nonsens- bzw. Leseraster-Mutationen. In 25-73%
der Oraltumore (in USA und Japan), die mit dem Konsum von Tabak und Alkohol assoziiert waren,
konnte ein LOH des APC-Genes festgestellt werden (LARGEY et al. 1994, UZAWA et al. 1994).
TANDLE et al. (2000) beschrieben den LOH von APC als sehr frühes Ereignis in der Karzinogenese
von Oraltumoren.
In Bezug auf genetische Veränderungen des ras-Protoonkogens berichteten WARNAKULASURIYA et
al. (1992) von einer geringeren Mutationsrate in westlichen Industrienationen im Vergleich zu Indien.
SARANATH et al. (1989) und SARANATH et al. (1992) detektierten eine Amplifikation der Protoonkogene c-myc, N-myc, K-ras, N-ras, und des EGF-R in 20-35% der oralen Tumore. Neben einer verstärkten Expression der Gene Hst-1, Int-2 und ems-1 konnte in Patienten mit squamösen Tumoren
EINLEITUNG
6
eine Amplifikation des Cyclin-D/Prad-1-Gens (11q13) beobachtet werden, was mit einem erhöhten
Risiko für Lymphknotenmetastasen einher ging (JOHNSON et al. 1996, MULLER et al. 1994, PATEL et
al. 1994, RUBIN et al. 1995).
Histopathologisch sind benigne Veränderungen der Oralmukosa durch differente Keratinisierung,
nukleäre und zelluläre Polymorphismen, veränderte mitotische Aktivität, abnorme fibrilläre und
mukosale Struktur und unterschiedliche Muster bezüglich der Infiltration durch entzündliche
Prozesse charakterisierbar. Insofern kommt es während der Karzinogenese im oralen Bereich auch zu
einer Fehlregulation der Keratinexpression (JOHNSON et al. 1996).
1.1.2
Exogene Einflussfaktoren auf die Karzinogenese
Die Akkumulation genetischer Veränderungen (Mutation, Amplifikation, Rekombination) in Protoonkogenen, Tumorsuppressorgenen oder in DNA-Reparaturgenen führt zu einer klonalen Selektion von Zellen mit aggressiven und invasiven Wachstumseigenschaften, wobei etwa nur 1% aller
Tumore auf vererbbaren genetischen Modifikationen beruhen (FEARON 1997). Die meisten anderen
Tumore tragen multiple Mutationen, die im Laufe des Lebens in dem entsprechenden somatischen
Gewebe angesammelt werden. Wie die Abb. 2 verdeutlicht, erweist sich die Ernährung mit ca. 35%
als wichtigste Krebsursache. Das Rauchen ist verantwortlich für weitere 30% (DOLL 1996, DOLL und
PETO 1981).
Ernährung
Tabak
Infektion
Geschlecht
Beruf
Alkohol
geophysikalische Faktoren
Medikamente
Umweltverschmutzung
synthetische Schadstoffe
Zusatzstoffe
unbekannt
0
5
10
15
20
25
30
35
Anteil an der Krebsentstehung (%)
Abbildung 2
Einflussfaktoren der Krebsentstehung
[modifiziert nach DOLL und PETO 1981]
40
EINLEITUNG
1.1.2.1
7
Exogene Einflussfaktoren auf die Kolonkarzinogenese
Neben ionisierender Strahlung als exogene Noxe begünstigen ungesunde Ernährungsgewohnheiten
zu mehr als einem Drittel die Kolonkarzionogenese. Als krebsauslösende Stoffe werden neben
Benzpyrene aus dem Rauch oder Schwarzgeräucherten, Aflatoxine in verschimmelten Lebensmitteln
sowie Krebspromotoren, z. B. Alkohol, diskutiert (DGE E.V. 2001, MCKEOWN-EYSSEN und BRIGHTSEE 1984). Generell ist ein hoher Obst- und Gemüseverzehr mit einem abnehmenden Risiko (BLOCK
et al. 1992, KEY et al. 1996) und ein reichhaltiger Verzehr an Fleisch und Fett mit einem zunehmenden Risiko assoziiert (WILLETT et al. 1990). Kohorten-Studien an Vegetariern zeigten, dass die
Krebsinzidenz bei Personen mit einer vegetarischen Ernährung geringer ist als bei der omnivoren
Allgemeinbevölkerung (FRENTZEL-BEYME und CHANG-CLAUDE 1994, JENSON 1983, THOROGOOD et
al. 1994).
KEKU et al. (1998) konnten an entnommenen Biopsieproben nachweisen, dass der BMI und die
Kalorienaufnahme signifikant mit der Mukosaproliferation korrelierte. Das aufgenommene Nahrungsfett korrelierte bei der nicht adenomatösen Kontrollgruppe mit der Proliferationsrate der Biopsieproben. RYDER et al. (1998) wiesen einen signifikanten Anstieg der Proliferation der Rektalmukosa nach dem Verzehr von Erdnüssen nach.
Die Aufnahme von Nitrat und rotem Fleisch begünstigt die Entstehung von N-Nitrosoverbindungen,
die mit einem ansteigenden Kolonkarzinomrisiko verbunden sind (KNEKT et al. 1999). Neben der
endogenen Entstehung von N-Nitrosoverbindungen durch bakterielle Katalyse wird ein Großteil
exogen über die Aufnahme von, mit Nitrit konservierten, Fleischprodukten zugeführt (ROWLAND et
al. 1991). SILVESTER et al. (1997) bestimmten eine ansteigende Konzentration von DNAschädigenden N-Nitrosoverbindungen in der Fezes bei einer fleischreichen Ernährung. PARNAUD et
al. (2000) wiesen keine induzierende Wirkung auf abnorme Krypten von N-Nitrosoverbindungen bei
Ratten nach.
Erhöhte Eisenaufnahmen durch die Nahrung, die meist unabsorbiert den Darm erreichen und damit
die Harber-Weiss- und Fenton-Reaktion im Kolon begünstigen, tragen zu einer Erhöhung des Levels
an freien Radikalen bei. Die entstehenden Hydrogenperoxide und Hydroxylradikale können die
Mukosamembran der Kolonozyten und die Membran der anliegenden Immunzellen permeieren und
infolge der Schädigung von Proteinen, Lipiden und der DNA somatische Mutationen vermitteln
(LUND et al. 1999, WURZELMANN et al. 1996). Das Braten und Grillen von Fleisch ist Ursache für die
Entstehung weiterer Mutagene bzw. Karzinogene, u. a. der heterozyklischen Amine und der polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (AUGUSTSSON et al. 1999).
Wie schon erwähnt, wird einer pflanzenreichen Ernährungsweise, die reichhaltig an Obst und Gemüse ist, eine protektive Wirkung zugeschrieben. BRANCA et al. (2001) geben eine Übersicht über
EINLEITUNG
8
retrospektive Fall-Kontroll-Studien mit pflanzenreicher Kost und deren Einfluss auf das Kolorektalkarzinomrisiko, wobei die Beweislage für die protektive Wirkung einer derartigen Ernährung nicht
eindeutig ist (WCRF 1997, WINJNANDS et al. 1999). SCHATZKIN et al. (2000) und ALBERTS et al.
(2000) konnten durch einen Wechsel zu einer faserreichen Ernährung bzw. durch die Verabreichung
eines faserreichen Supplements keinen Effekt auf die Rekurrens von Kolorektaladenomen feststellen.
Langzeitstudien in den USA, Finnland und Schweden wiesen ebenfalls keine protektive Wirkung
einer pflanzen- und ballaststoffreichen Ernährungsweise nach (FUCHS et al. 1999, PIETINEN et al.
1999, TERRY et al. 2001). BINGHAM et al. (2003) verwiesen auf eine inverse Beziehung zwischen der
totalen nutritiven Faseraufnahme und dem Risiko der Entstehung von Kolorektaltumoren. Eine hohe
Stärke- und Faseraufnahme war in den Versuchen von REDDY et al. (1998) negativ assoziiert mit der
fäkalen Konzentration an Lithocholin- und Deoxycholinsäure. Eine faserreiche Ernährung beeinflusst
über eine pH-Wert-Absenkung die Inhibierung des Abbaus der fäkalen Steroide und führt damit zur
Abnahme der fäkalen Gallensäurekonzentration, was wahrscheinlich gegen die Entartung des Kolorektalepithels wirkt.
Bei der Betrachtung der Mikronährstoffe sind neben den krebsfördernden Eigenschaften des Eisens,
vor allem Kalzium und Vitamin D, die antioxidativ wirkenden Vitamine sowie das Folat von besonderem Interesse. Über die proliferationshemmende Wirkung des Kalziums (LIPKIN und NEWMARK
1985) hinaus, führt eine gesteigerte Kalzium- und Vitamin D-Zufuhr zu einer Verseifungsreaktion
mit den Fett- und Gallensäuren aus der Nahrung. Dadurch werden diese unlöslich, können ausgeschieden werden und verlieren so ihr kolonschädigendes Potential (SORENSON et al. 1988). Daneben
fördern Kalzium und Vitamin D die Induktion des Gens WAF-1, das als mögliches Tumorsuppressorgen eine zellzyklushemmende und antiproliferative Wirkung hat (EDITORIAL COMMENTS 1997).
Eine differente Assoziation zwischen k-ras-Mutationen im Codon 12 und 13 zeigten KAMPMAN et al.
(2000) in Abhängigkeit von einer Diät, die reich an Protein, Kalzium und Geflügelfleisch war. Eine
inverse Beziehung wurde bei Tumoren mit k-ras-Mutationen im Codon 13 detektiert.
Die protektive Wirkung der antioxidativ wirksamen Vitamine C und E sowie der Karotinoide konnte
in mehreren Studien nachgewiesen werden (LA VECCIA et al. 1997). Die schützende Wirkung des
Folats beruht auf der Funktion als Co-Faktor bei Methylierungsreaktionen (FREUDENHEIM et al.
1991) sowie auf der Produktion von S-Adenosylmethionin als primärer Methyl-Donor im Körper
(COOPER 1983).
Die ca. 400-500 Spezies zählende Darmflora beeinflusst zahlreiche metabolische und immunologische Funktionen im Darm und stellt zudem eine natürliche Barriere gegen pathogene Keime dar.
Zahlreiche Untersuchungen belegen, dass die gesundheitsfördernden milchsäurebildenden Bakterien
(LAB) über die Aufnahme von Prä- und Probiotika in ihrer Zahl und Stoffwechselaktivität beein-
EINLEITUNG
9
flusst werden können. Eine Verringerung der Tumorinitiation wiesen verschiedene Autoren mit
unterschiedlichen LAB nach (GOLDIN und GORBACH 1984, KULKARNI und REDDY 1994, REDDY
und RIVENSON 1993, SINGH et al. 1997). Als protektive Wirkmechanismen der Pro- und Präbionten
im Prozess der Kolonkarzinogenese werden neben der Ansäuerung des Kolonmilieus, die Bildung
kurzkettiger Fettsäuren (Ethan-, Propion-, Butansäure, Milchsäure) (HAGUE et al. 1993, KAAS 1996),
die Modulierbarkeit von Detoxifizierungsreaktionen durch Absenkung des Sauerstoffpartialdruckes
(WAHLERS 1993) sowie die Beeinflussung karzinogenbildender Enzyme, wie z. B. der βGlucuronidase, Azoreduktase, Nitroreduktase (GOLDIN und GORBACH 1977), der 7α-Dehydroxylase
und der 7α-Dehydrogenase (MITAL und GARG 1995) und eine gesteigerte Darmmobilität durch ein
erhöhtes Fezesvolumen (GIBSON und ROBERFROID 1995) diskutiert. Die Mehrzahl der Untersuchungen zu protektiven Wirkmechanismen der Pro- und Präbiotika wurden jedoch in Tierversuchen
angestellt (JI 1997), so dass ein direkter Beweis über die Wirkungen beim Menschen derzeit fehlt.
Eine zusammenfassende Darstellung über weltweit durchgeführte Ernährungsinterventionsstudien
und deren Auswirkungen auf ein kolorektales Karzinomrisiko gibt KAAS (1996). Eine zusammenfassende Übersicht des WCRF (1997) zeigt, dass die Beweislage für viele nahrungsrelevanten Inhaltsstoffe und deren Einfluss auf die Kolonkanzerogenese derzeit noch nicht gesichert ist (Tab. 1).
Tabelle 1:
Grad der Evidenz für die Assoziation zwischen Ernährung und Kolonkrebs
[modifiziert nach WCRF 1997]
Grad der Evidenz
Risiko
vermindert
erhöht
kein Effekt
1.1.2.2
gesichert
wahrscheinlich
körperliche
Aktivität,
Gemüseverzehr
Verzehr von
rotem Fleisch,
Alkohol
möglich
unzureichend
Nicht-Stärke-Poly- Resistente Stärke,
saccharide, Ballast- Vitamin C, E, D,
stoffe, Stärke, KarotiFolat, Kaffee,
noide
Methionin,
Getreideprodukte
>BMI, Zucker, totale
Eisen
Fettzufuhr, gesättigte
Fettsäuren, tierisches
Fett, Fleisch, Eier
Kalzium, Selen, Fisch
Exogene Einflussfaktoren auf das Harnblasenkarzinom
Die Wirkung chemischer Kanzerogene auf das Übergangsepithel der Harnblase ist schon seit langem
bekannt. So beobachtete Rehn 1895 (in WITTEKIND und NENNING 1997) ein gehäuftes Auftreten von
Harnblasenkarzinomen bei Anilinarbeitern. Bis in die jüngste Zeit wurden weitere chemische Verbindungen gefunden, die das Übergangsepithel schädigen können. Dazu zählen neben Phenacetin
EINLEITUNG
10
und Cyclophosphamid insbesondere Amine und Benzolverbindungen (MURPHY 1989, PEDERSENBJEREGARD et al. 1988). Beruflicher Kontakt mit derartigen kanzerogenen bzw. kokanzerogenen
Stoffen erhöht das Risiko, ein Harnblasenkarzinom zu entwickeln. Davon sind v. a. Beschäftigte der
gummi-, farben-, metall-, leder-, textil-, treibstoff-, erdölverarbeitenden und der chemischen Industrie
sowie Personen mit Kontakt zu Ruß, Pech und Steinkohlenteer betroffen (BRODSKY 1992, NOMURA
et al. 1989).
Als unumstritten gilt, dass inhalativer Zigarettenkonsum Auslöser maligner Tumore der Harnblase
ist. Durch das Rauchen erhöht sich das Risiko auf das Dreifache (NOMURA et al. 1989). Verantwortlich dafür gemacht werden u. a. Nitrosamine und aromatische Amine, die bei der Tabakverbrennung
entstehen. Kontrovers wird eine Korrelation zwischen dem Konsum von Koffein und Süßstoffen und
Harnblasentumoren diskutiert, wobei sichere Erkenntnisse hierzu nicht vorliegen (WITTEKIND und
NENNING 1997).
Schistosoma haematobium als Erreger der vesikulären Bilharziose wirkt als begünstigender Faktor
für das Plattenepithelkarzinom der Harnblase (HELPAP 1989, KOSS 1979). Als Ursache für die hohe
Inzidenz von Harnblasenkarzinomen in einigen Ländern Nord- und Zentralafrikas, insbesondere
Ägypten, wird die hohe Durchseuchung der Bevölkerung mit diesem Erreger angesehen (MURPHY
1989). Neben mechanisch-entzündlichen Irritationen der Schleimhaut werden von den Parasiten
gebildete Nitrat- und Nitritverbindungen für die maligne Entartung verantwortlich gemacht
(OBAFUNWA 1991). Chronische Urozystis, wie bei Dauerkatheterträgern und bei Zystolithiasis, sind
ebenfalls mit einem erhöhten Blasenkrebsrisiko verbunden. Der Einfluss viraler Infektionen, u. a. mit
dem Human Papilloma Virus (HPV), wird eher als gering eingeschätzt (CHETSANGA et al. 1992).
Aufgrund großer topographischer Häufigkeitsunterschiede für das Auftreten benigner Veränderungen kommt der Verweildauer der krebsauslösenden Agenzien am Epithel eine wichtige Bedeutung
zu. Während nur ca. 6% aller Übergangsepithelkarzinome in den Nierenbecken und 2% in den
Uretern lokalisiert sind, bildet die Harnblase aufgrund ihrer Reservoirfunktion mit 92% den Hauptlokalisationsort (WITTEKIND und NENNING 1997).
Epidemiologische Daten zeigen zwischen der Ernährung und dem Harnblasenkarzinom keine eindeutigen gesicherten Assoziationen. In der Diskussion steht, dass ein hoher Obst- und Gemüseverzehr sich protektiv auf kanzerogene Prozesse auswirkt (Tab. 2).
EINLEITUNG
Tabelle 2:
11
Grad der Evidenz für die Assoziation zwischen Ernährung und Harnblasenkarzinomen
Grad der Evidenz gesichert wahrscheinlich möglich
Risiko
vermindert
Gemüse, Obst
1
Kaffee
erhöht
kein Effekt
unzureichend
Vitamin C, Retinol
Karotinoide
Totale Fettzufuhr,
chlorierte Kohlenwasserstoffe,gebratene Lebensmittel
Schwarztee
Eier,
Saccharin
Cyclamate
1
Das Risiko scheint erst bei mehr als 5 Tassen pro Tag erhöht.
1.1.2.3
Alkohol
Exogene Einflussfaktoren auf die Karzinogenese der Oralmukosa
Epidemiologische Studien beweisen die strenge Assoziation zwischen dem Konsum von Tabak und
der Inzidenz für benigne orale Entartungen. Tabakprodukte in gerauchter, gekauter oder geschnupfter
Form enthalten toxische und karzinogene Substanzen. Vor allem die tabakspezifischen NNitrosamine müssen als die wichtigsten Karzinogene betrachtet werden. Raucher (R) haben gegenüber Nichtrauchern (NR) ein 5-9-fach erhöhtes Risiko, Mundhöhlenkarzinome zu entwickeln. Bei
einem extrem hohen Tabakkonsum von mehr als 80 Zigaretten pro Tag steigt das Risiko um das
Siebzehnfache an (NEVILLE und DAY 2002). Die unterschiedlichen Gewohnheiten beim Tabakkonsum sind verantwortlich für geographische Differenzen in der molekularen Pathologie oraler Karzinome (FIELD et al. 1989, PATERSON et al. 1996, SARANATH et al. 1989, SARANATH et al. 1991,
SARANATH et al. 1993). Der rauchlose Konsum von Tabak ist mit einem etwas geringeren Risiko
assoziiert (NEVILLE und DAY 2002). Neben Tabak als Risikofaktor scheint der Konsum von Marihuana ebenfalls orale benigne Entartungen zu begünstigen (ZHANG et al. 1999).
Chronischer Alkoholabusus wird als zweitwichtigster Faktor der oralen Karzinogenese angesehen
und ist mit einem 3- 9-fach gesteigerten Risiko verbunden (LEWIN et al. 1998, MORENO-LOPEZ et al.
2000, NEVILLE und DAY 2002). Tabak und Alkohol in Kombination führen im Vergleich zu Nichtrauchern und Nichttrinkern zu einem 6-15-mal höheren Risiko, ein Mundhöhlenkarzinom zu entwickeln (VAN DER WAAL 1998). Darüber hinaus besteht eine deutliche Dosisabhängigkeit. In SüdostAsien und Indien ist das Kauen von Pflanzenteilen der Betelpalme (Areca catechu) streng mit der
Entstehung oraler Malignome assoziiert (MURTI et al. 1995, NEVILLE und DAY 2002).
Neben Infektionen mit HPV (MORK et al. 2001) und Candida albicans gelten immunologische
Störungen, Eisenmangelanämien, schlechte Mundhygiene sowie eine obst- und gemüsearme Ernäh-
EINLEITUNG
12
rungsweise als weitere Risikofaktoren für die Entartung der Oralmukosa (Tab. 3) (NEVILLE und DAY
2002).
Tabelle 3:
Grad der Evidenz für die Assoziation zwischen Ernährung und Oropharyngealkarzinomen
Grad der Evidenz:
gesichert
wahrscheinlich möglich
Risiko
vermindert
Gemüse, Obst
Vitamin C
erhöht
Alkohol
Maté
kein Effekt
Rauchen und Kauen von Tabak und Betelnuss erhöht das Risiko.
1.1.3
unzureichend
Biomarker
Aus den oben dargestellten Stand der aktuellen Forschung hinsichtlich möglicher Zusammenhänge
zwischen exogenen Faktoren und Tumorrisiken geht eindeutig hervor, dass wichtige Erkenntnisse
über die Rolle der Ernährung vorliegen, wobei noch viele offene Fragen vorhanden sind. Diese
betreffen zum einen die Sicherung der Erkenntnisse, die nur wahrscheinlich, möglich oder gar unzureichend sind. Zum anderen bedarf es noch der Klärung der Zusammenhänge über die Rolle individueller Empfindlichkeiten, über Dosis-Wirkungsbeziehungen, Kombinationswirkungen u. v. m.
Neben experimentellen Studien in vitro und Tierexperimenten können auch Untersuchungen direkt
am Menschen vorgenommen werden. Wenn protektive Wirkmechanismen erfasst werden sollen,
dürfte es wenige ethische Bedenken gegen die Durchführung von Ernährungsinterventionsstudien
mit gesunden Lebensmitteln geben. Mit dem Kenntnisgewinn über die Bedeutung der Ernährung für
die Krebsprävention wurden deshalb auch in jüngster Zeit im Rahmen von Ernährungsinterventionsuntersuchungen zunehmend biologische Parameter gemessen, die auf ein mögliches geringeres
Risiko hinweisen. In vielen Fällen stammten die Parameter und Messmethoden aus der Toxikologie,
wo sie für die Erfassung von Risiken bei Arbeitsplatz- oder Umweltexpositionen eingesetzt und
entwickelt wurden (ASHBY 1988, ALBERTINI et al. 2000). Für die Untersuchung von protektiven
Faktoren können deren Reduktion ein verringertes Risiko anzeigen (BUB et al. 2003, COLLINS et al.
1996, POOL-ZOBEL et al. 1997a). Selbstevident ist aber, dass zusätzlich neue Techniken, gezielter
eingesetzt, einen weiteren Kenntnisgewinn bringen können (JOHNSON et al. 1994, PERERA und
WEINSTEIN 1982). Es besteht demnach ein enormer Forschungsbedarf, prädiktive Biomarker zu
entwickeln und zu validieren, um Ernährungsfaktoren zu identifizieren, die ein Karzinomrisiko
verringern könnten.
Biomarker, als biologische Antwort eines Individuums bzw. einer „biologischen Einheit“ auf Ein-
EINLEITUNG
13
flüsse aus deren nächster Umwelt bzw. deren Abweichung vom normalen Status (SYNGAL et al.
2000), stellen das Bindeglied zwischen einem bestehenden Risiko und dem Auftreten bzw. der
Protektion benigner Entartungen dar. BOTRILL (1998) beschreibt Biomarker als Parameter, die quantitativ, semiquantitativ oder qualitativ bestimmt werden können und Informationen zur Exposition
gegenüber einem Xenobiotikum oder zu tatsächlichen oder möglichen Effekten dieser Exposition auf
ein Individuum oder eine Gruppe liefern. Demgegenüber erfordert die Definition von Biomarkern im
Kontext von Ernährung und Tumorgenese eine Erweiterung, bei dem nicht nur die Exposition gegenüber Xenobiotika, sondern auch die Exposition gegenüber chemopräventiven Verbindungen von
Bedeutung ist, da die Balance zwischen schädigenden und protektiven Faktoren entscheidend für
Risiken und Nutzen der Ernährung ist. Zur Erfassung der Wirkungsweise pharmakologischer bzw.
diätetischer Interventionen werden Biomarker, die Effekte widerspiegeln, Biomarker, die Expositionsparameter durch endogene und exogene Faktoren bestimmen und Biomarker, die verschiedene
Arten von Eigenschaften bezüglich der Empfindlichkeit determinieren, benötigt (Abb. 3) (KLINDER
und POOL-ZOBEL 2001).
Erfassung von Risikofaktoren und protektiven Faktoren
Biomarker der Empfindlichkeit
Alter, Geschlecht, genetische Prädispositionen
Biomarker der Exposition
Biomarker des Effekts
Erhöhung von protektiven Faktoren Ve rringerung
von Risikofaktoren
Reduktion der Schädigung
Induktion protektiver Prozesse
Biomark er
Abbildung 3:
Arten von Biomarkern zur Erfassung von Risikofaktoren bzw. protektiven Faktoren
[nach KLINDER und POOL-ZOBEL 2001]
Für die Erkennung und Entwicklung von Biomarkern bzw. Biomarkertechniken können Ergebnisse,
die in Tier(modell)- bzw. Human(modell)versuchen in vivo und in vitro gewonnen wurden, zueinander in Beziehung gesetzt werden, um ein bestehendes Risiko bzw. eine mögliche Protektion für den
Menschen abzuschätzen (BLAAUBOER et al. 1990). Das sogenannte Parallelogramm-Verfahren (Abb.
4) veranschaulicht die Vorgehensweise.
EINLEITUNG
14
in vivo
Charakterisierung toxischer bzw.
präventiver Effekte im Tierversuch
Abschätzung des Risikos bzw. der Protektion für den Mensch
Applikation der in vitro Ergebnisse auf die Konst itution in vivo
in vitro
Untersuchung der Testsubstanzen an
sensitiven Tierzellen bzw. –geweben
Abbildung 4:
speziesübergreifend
in vitro
Untersuchung der Testsubstanzen an
sensitiven humanen Zellen oder Geweben
Schema des Parallelogramm-Verfahrens zur Charakterisierung von toxischen bzw.
präventiven Substanzen im Tier- und Humanversuch in vivo und in vitro
[modifiziert nach EISENBRAND et al. 2002]
Ziel der Erforschung und Erkennung von Biomarkern ist die Charakterisierung und Identifizierung
von Stoffen bzw. Prozessen, die in die Kanzerogenese involviert sind, sowie die Klärung von Zusammenhängen, um mögliche Risiken zu einem frühest möglichen Zeitpunkt zu erkennen bzw.
chemoprotektiv der Entstehung maligner Entartungen entgegenzuwirken. Biomarker, die Parameter
der Karzinogenese charakterisieren, sind insofern für die Präventivforschung von Bedeutung, als das
über eine Reduktion bzw. Hemmung dieser, eine Verringerung des Krebsrisikos möglich sein sollte.
In diesem Kontext sind sowohl Biomarker, die für einen Großteil der Tumore gültige Merkmale
widerspiegeln, als auch Biomarker, die für einzelne Tumorarten spezifisch sind, von Interesse
(K LINDER und POOL-ZOBEL 2001).
1.1.3.1
Biomarker zur Beurteilung des Risikos für Kolore ktaltumore
Für die Untersuchung von Parametern, die im Zusammenhang mit der Kolorektalkarzinogenese
stehen, können humane Proben sowohl invasiv als auch nicht-invasiv gewonnen werden.
invasiv:
→ Gewebe- bzw. Biopsie-Proben
→ endoskopische Darmflüssigkeit
→ Darmspülungen (moderat invasiv)
nicht-invasiv: → Fezesproben
- Test auf „verstecktes Blut“
- zur Untersuchung fäkaler Inhaltsstoffe und deren Wirkung
[Extrakte der Fezes, Fezeswasser (FW)]
→ Fezes als Quelle für abgeschilferte Zellen
Ziel bei der Erforschung schutzgebender Wirkungen exogener bzw. endogen gebildeter Substanzen
ist die Verhinderung benigner Entartungen. Dafür gewinnt die Untersuchung von Wirkmechanismen
bzw. deren Modulation an gesundem Probandenmaterial zunehmend an Bedeutung. Für diese Analysen besteht ein enormer Bedarf an nicht-invasiv gewonnenen Proben. Die Fezes repräsentiert eine
EINLEITUNG
15
ideale Möglichkeit, derartige Untersuchungen anzustellen. Die Modulation der Zusammensetzung
der Fezes mit dem Ziel der Reduktion der Exposition der Kolonozyten mit karzinogenen Agenzien
kann das Risiko der Karzinogenese verringern. Die Detektion von Gallensäuren (BREUER et al. 1985,
SCHIFFMAN 1987), kurzkettigen Fettsäuren (CUMMINGS et al. 1996, MCINTYRE et al. 1993), aromatischen Aminen (HAYATSU et al. 1985), der Zusammensetzung der Darmflora (GIBSON und
ROBERFROID 1995), ernährungsrelevanter Mutagene und Oxidantien (JOHANSON et al. 1992,
MACFARLANE et al. 1986), N-Nitrosoverbindungen (BINGHAM et al. 1996, ROWLAND et al. 1991,
SILVESTER et al. 1997), die Messung bakterieller Enzymaktivitäten (u. a. β-Glucuronisidase,
β-Glucosidase, Azedoreduktase, Nitroreduktase) (MALLET und ROWLAND 1990) sowie die Modulation des oxidativen Stresses (OWEN et al. 1996) geben einen Einblick in die spezifische Situation des
Kolons. Mit der Beeinflussung dieser Parameter können protektive Effekte für die Enterozyten erzielt
werden (vergleichende Betrachtung: Abschnitt 1.1.2.1).
Neben der Fezes stellen Kolonbiopsieproben, aus denen Makromoleküle (u. a. DNA, Proteine,
Lipide), Einzelzellsuspensionen, Krypten und ganze Gewebespezies untersucht werden können, eine
weitere Quelle dar, um Biomarker (des Effekts) der kolorektalen Karzinogenese zu bestimmen
(BRANCA et al. 2001). So wurden in Kolonbiopsieproben die Proliferationsaktivität (LIPKIN 1987),
immunohistologisch veränderte DNA (ALBAUGH et al. 1992), die Aktivität von Glutathion-STransferasen (GST) (NIJHOFF et al. 1995) und Cytochrom P450 (CYP) 1A2 (SINHA et al. 1994), die
Apoptose-Rate, Mikrosateliten-Instabilitäten der DNA (ANKER et al. 1997, LOEB 1994), TP53Deletionen (NELSON 1997), k-ras-Amplifikationen und -Mutationen (BURMER et al. 1991) detektiert.
Sporadische somatische Mutationen im k-ras-2-Gen wurden in Biopsie-Proben, Fezes und Blut
detektiert (MAO et al. 1994, NELSON 1997, PRETLOW et al. 1993). Diese Biomarker-Untersuchungen
dienten ebenfalls der Bestimmung der Modulierbarkeit einzelner Parameter, die in den Prozess der
Karzinogenese involviert sind (vergleichende Betrachtung: Abschnitt: 1.1.1.1). Die Grenzen dieser
Analysen liegen zum einen in der Invasivität der Gewinnung des Probenmaterials und zum anderen
in der Verwendung von meist benignen Ausgangsmaterials.
Die Untersuchung abgeschilferter Zellen als nicht-invasiv gewonnene Biomarker-Zellen wird in der
Zukunft an Bedeutung gewinnen. VILLA et al. (1996) bestimmten in abgeschilferten Kolonozyten kras-Mutationen und LOKTIONOV et al. (1998) den DNA-Gehalt. Die Betrachtung der Untersuchungen mit abgeschilferten Zellen lässt erkennen, dass auf diesem Gebiet großer Forschungsbedarf
besteht. Für die Diskussion und den Vergleich der Ergebnisse unter den einzelnen Autoren ist eine
vorherige Charakterisierung der Zellen, die in die einzelnen Biomarker-Testsysteme eingebracht
werden bzw. wurden, unabdingbar.
EINLEITUNG
16
Genetische Prädispositionen und Polymorphismen bezüglich des Xenobiotika-Metabolismus sind als
Biomarker, die die Empfindlichkeit bzw. Anfälligkeit berücksichtigen, neben dem Geschlecht besonders bedeutsam (BRANCA et al. 2001). Eine Interaktion zwischen GST-Polymorphismen und dem
Risiko für kolorektale Malignome wurde durch verschiedene Fall-Kontroll-Studien nachgewiesen.
Signifikante Zusammenhänge zwischen Null-Polymorphismen, z. B. für GSTM1*0 (LIN et al. 1995),
GSTT1*0 (CHENEVIX-TRENCH et al. 1995), und einem zunehmenden Risiko für Kolonkrebs konnten
gezeigt werden. Modifikationen an Phase-I-Genen, deren Produkte in der Phase-I-MetabolisierungsReaktion aktiv sind, wie CYP1A1-MSP1, CYP1A2 und N-Acetyltransferase (NAT), üben aufgrund
differenter Kapazitäten in der Aktivierung z. B. karzinogener heterozyklischer Amine ebenfalls einen
Einfluss auf die Kanzerogenese im Kolon aus (BROCKTON et al. 2000, SIVARAMAN et al. 1994). Die
Modulation der Enzymaktivitäten der Histondeacetylasen bzw. der Acetyltransferasen beeinflusst
über Modifikationen des Acetylierungsstatus der Histone, Strukturproteine der Nukleosomen, die
Regulation der Genexpression und damit kanzerogene Prozesse (GRUNSTEIN 1997; MARKS et al.
2000). Die Acetylierung (bzw. Methylierung, Phosphorylierung) führt zur Konformationsänderung
im Histonoktamer, wodurch die Modulation der Transkription verschiedener Gene beeinflusst wird,
die auf der DNA in diesem Abschnitt liegen. Butyrat und Trichostatin A sind in diesem Kontext als
Modulatoren des Zellwachstums, der Differenzierung und Apoptose näher erforscht (WU et al.
2001). Die Untersuchung des Acetylierungsstatus der Histone stellt damit eine Möglichkeit dar, die
Beeinflussung der Genregulation durch exogene Faktoren zu determinieren.
1.1.3.2
Biomarker zur Beurteilung des Risikos für Tumore des Urothels
Biomarker, die spezifische Hinweise auf mögliche pathogenetische Veränderungen der Harnblase
bzw. auf deren Protektion geben, können zumeist in nicht-invasiv gewonnenem Probenmaterial
bestimmt werden. Der Urin verkörpert ein ideales Medium, um Biomarker der Exposition nachzuweisen. Hoch spezifisch ist z. B. die Messung von DNA-Addukten nach der Aflatoxin-B1Exposition (STRICKLAND und GROOPMAN 1995). Über die Determination der Mutagenität des Urins
lassen sich Aussagen über Lifestyle-Faktoren und Umweltexpositionen treffen. So konnte eine
urinäre Mutagenität unter Rauchern (YAMASAKI und AMES 1977), nach Medikamentenexposition
(FRACASSO 1993), nach dem Verzehr von gebratenem Fleisch (DOOLITTLE et al. 1989), aufgrund von
Umweltbelastungen (CHOI et al. 1995) und bei Arbeitern verschiedener Industriezweige, u. a. der
Gummi- (BOS et al. 1989) und Textilindustrie (SINUES et al. 1992) nachgewiesen werden, wobei
diese Methodik nicht spezifisch ist und nicht einzelne Mutagene betrachtet bzw. identifiziert (MARINI
et al. 1997). Im Urin können sowohl karzinogene bzw. mutagene Agenzien als auch deren Metabolite detektiert werden (AHLBORG et al. 1988, BARTSCH et al. 1990 ROTHMANN et al. 1996). Die Be-
EINLEITUNG
17
stimmung von DNA-Addukten in abgeschilferten Urothelzellen (ROTHMANN et al. 1996, TALASKA
et al. 1991, VINEIS et al. 1996) reflektiert eine Biomarker-Technik, die Aussagen über die Exposition
bzw. über Effekte der Exposition gestattet. Als weitere nützliche Biomarker-Methoden haben sich
der Mikrokern-Test (LEHUCHER-MICHEL et al. 1995, MOORE et al. 1997) sowie die Einzelzellmikrogelelektrophorese (MGE) (GONTIJO et al. 2001, MCKELVEY-MARTIN et al. 1997) erwiesen, bei
denen Effekte nach verschiedenen Expositionen an einzelnen Zellen detektiert werden. Eine genaue
Charakterisierung der eingesetzten Zellen im Vorfeld der Einbringung in diese Testsysteme wurde
jedoch größtenteils nicht angestrebt. HOPMAN et al. (1991) und MOORE et al. (1993) wandten die
Fluoreszenz in situ Hybridisierung zur Detektion von Aneuploidien in Urothelzellen an. Der Nachweis von mutiertem TP53 verkörpert einen Biomarker, der einen Hinweis auf ein fortgeschrittenes
Stadium der Tumorgenese gibt (OKUNO et al. 1996, UCHIDA et al. 1995, NELSON 1997). Die Bestimmung von Veränderungen anderer Tumorsuppressor- und Protoonkogene bzw. deren Produkte,
die in den Prozess der Karzinogenese des Urothels involviert sind, stellt eine weitere Möglichkeiten
dar, als Biomarker-Techniken Anwendung zu finden. Modifikationen im ras-Gen, als Marker früher
bzw. intermediärer Stadien der Tumorgenese, wurden von NELSON (1997) detektiert. Als potentielle
Marker der Empfindlichkeit, die das Risiko für Urothelkarzinome erhöhen, wurden Polymorphismen
der GST-M1, GST-T1, Epoxidhydrosylase, CYP und NAT2 näher untersucht (BELL et al. 1993,
BROCKMÖLLER et al. 1996, DÈRRICO et al. 1996, RISCH et al. 1995, ZHONG et al. 1993).
1.1.3.3
Biomarker zur Beurteilung des Risikos für Tumore der Oralmukosa
Proben zur Untersuchung molekularer und genetischer Modifikationen, die in den Prozess der oralen
Kanzerogenese involviert sind, lassen sich zu einem Großteil nicht-invasiv, über Mundspülungen,
-abdrücke, -abschabungen bzw. -bürstungen gewinnen (FEIGELSON 2001, HARTY et al. 2000a,
HARTY et al. 2000b, HEATH et al. 2001). Aus dem Gewebe der Oralmukosa sind in einer ausreichenden Quantität und unter definierten standardisierten Isolationsmethoden in einer hinreichenden Qualität DNA, RNA und Proteine isolierbar (SCHWARTZ 2000). Als Biomarker der Exposition gegenüber
exogenen Noxen im Rauch von Tabak bestimmten ZHANG et al. (2002) DNA-Addukte (Malondialdehyd, einem Hauptprodukt der Lipidperoxidation) immunohistochemisch in oralen Mukosazellen.
Den Einfluss des Rauchens auf den Gehalt an Folat und Vitamin B12 in buccalen Zellen und damit
eine mögliche Beeinflussung der Rate an Mikrokernen sowie die Modulierbarkeit bzw. einen möglichen protektiven Effekt von den im Speichel enthaltenen Vitaminen E und C auf die Mikrokernrate
untersuchten PIYATILAKE et al. (1995). Dabei wiesen Raucher geringere Gehalte an Vitamin B12 und
Folat und eine höhere Rate an Mikrokernen auf. Während PENG und PENG (1992) ebenfalls die
Modulierbarkeit antioxidativ wirksamer Vitamine in buccalen Zellen untersuchten, determinierten
EINLEITUNG
18
CROWELL et al. (2001) die Beeinflussung der Oltipraz-Konzentration nach Supplementierung in
oralen Mukosazellen.
Die Quantifizierung von Mikrokernen stellt einen vielfach angewandten Endpunkt-Biomarker in der
Diagnostik modulierbarer chromosomaler Veränderungen in buccalen Zellen dar (DITTBERNER et al.
1997, PASTOR et al. 2001). Signifikante Effekte konnten mit dieser Methodik sowohl bei Rauchern
im Vergleich zu Nichtrauchern (DESAI et al. 1996) als auch durch den Konsum arsenhaltigen Trinkwassers (TIAN et al. 2001) nachgewiesen werden. Der Comet-Assay (CA) repräsentiert ebenfalls ein
Test-System, mit dem endpunktbezogene Effekte charakterisiert werden können. EREN et al. (2002)
verglichen orale Zellen mit peripheren Blutlymphozyten nach Exposition mit Chlorhexidindiglukonat, wobei die oralen Zellen empfindlicher reagierten. ROJAS et al. (1996) detektierten signifikant
höhere Raten der DNA-Schweiflänge bei Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern. Wie bei den
urinären Zellen schon erwähnt, wurde von den Autoren auch bei den buccalen Zellen auf eine nähere
Charakterisierung im Vorfeld verzichtet.
SARANATH et al. (1993) untersuchten Modifikationen in den Genen myc, ras und dem EGFRezeptor-Gen als involvierte Onkogene in der oralen Karzinogenese. Der LOH von TP53 als Tumorsuppressorgen und der LOH des APC-Tumorsuppressorgens als frühes Ereignis im Prozess der
oralen Tumorgenese wurde von TANDLE et al. (2000) nachgewiesen. Biomarker, die eine differente
Empfindlichkeit gegenüber Karzinogenen bzw. Chemoprotektanten näher charakterisieren, sind, wie
bei den vorher diskutierten Krebsarten, genotypische Polymorphismen der GST (u. a. GST-M1) und
der CYP (u. a. CYP-A1) (SCHWARTZ 2000).
1.1.3.4
Perspektiven für neue Biomarker
Biomarker können in Form genetischer bzw. molekularer Indikatoren Hinweise auf ein mögliches
Risiko geben, ein Karzinom zu entwickeln, bzw. die Funktionalität von chemopräventiv wirksamen
Agenzien im Prozess der Kanzerogenese charakterisieren. Einige Interventionsstudien mit spezifischen Lebensmitteln wurden durchgeführt, bei denen durch Biomarker die epidemiologisch nachgewiesenen Zusammenhänge zwischen Ernährung und Krebs mehr oder weniger bestätigt wurden. Bei
anderen Untersuchungen wiesen die Parameter eine geringere Effektivität auf, so dass die epidemiologischen Assoziationen nicht abschätzbar waren (KLINDER und POOL-ZOBEL 2001). Ziel zukünftiger
Arbeiten, so auch dieser, ist die Etablierung biologischer und analytischer Techniken, die die Beweiskraft für die Assoziation zwischen exogenen Expositionsfaktoren, molekularen Parametern und
dem Risiko für kanzerogene Entartung bzw. der Prävention erhöhen. Weisen derzeit viele Biomarker
auf ein mögliches oder bestehendes Karzinomrisiko hin, gewinnt die Suche nach Strategien, die
präventive Mechanismen aufzeigen, in Zukunft an Bedeutung. Die Abb. 5 schematisiert, wie durch
EINLEITUNG
19
spezifische Einflussnahme auf den Prozess der kanzerogenen Entartung der Tumorformation und –
manifestation entgegengewirkt werden kann. Dabei kommt im Rahmen der Primär- und Sekundärprävention den Prozessen und Substanzen (Substanzen mit verhindernder und unterdrückender
Wirkung→ „blocking agent-activity“ und „supressing agent-activity“) besondere Bedeutung, die
verhindern, dass normale Zellen bzw. initiierte Zellen weitere kanzerogene Veränderungen durchlaufen.
Primärprävention
Sekundärprävention
Therapie
Membranrezeptoren
Transportsysteme
Signaltransduktion
DNA-Reparatur
normale
Zelle
Innun- modulation
Primärtumor
initiierte
Zelle
Sekundärtumor
- antioxidative Effekte
Induktion der
Entgi ftung
Reduktion der
Karzinogene,
reaktive Sauerstoffspezies
Ko-Karzinogene
Peroxide
Abbildung 5:
Hemmung der
Proliferation
Giftungsreaktionen
Abfangen intermediärer Metabolite
- antioxidat ive Effekte
Hemmung der
Metastasierung
- Modulation der
Differenzierung
- Induktion der Apoptose
Prävention n
der Bildung reaktiver
Verbindungen
Substanzen mit
„verhindernder
Wirkung“
Substanzen mit
„unterdrücke nder
Wirkung“
„
-mit
Substanzen
„chemo therapeutischer
Wirkung“
Präventive Strategien im Prozess der Tumorformation
[modifiziert nach JOHNSON et al. 1997]
Biomarker, die das ganze Spektrum der kanzerogenen Pathogenese von der Exposition bis zur
Krankheit reflektieren, sind wichtige Parameter bei epidemiologischen Krebsstudien und beim Monitoring von großen Populationen. Neben der Detektion von Endpunkt-Biomarkern der Karzinogenese
ist die Entwicklung von molekularen Biomarker-Techniken, die Aussagen über die Beeinflussung
kanzerogener Mechanismen vor der Entstehung benigner Entartungen gestatten, bedeutsam, um
Risikopersonen vor der Manifestierung eines Karzinoms bzw. kanzeroprotektiv wirksame Substanzen zu identifizieren. Im Vordergrund zukünftiger Forschungsarbeiten steht die Entwicklung von
Biomarkern, die nicht-kanzerogene Endpunkte widerspiegeln. Dabei gewinnen „substituierte Endpunkte“ an Bedeutung, die zu einem viel früheren Zeitpunkt als der „Krebs“ detektiert werden können. Ziel ist dabei die Erforschung der molekularen Mechanismen, wobei durch die substituierten
Endpunkte eine Bewertung des Risikos bzw. der Protektion erfolgen soll. Eine wichtige Voraussetzung für die perspektivische Anwendung solcher Biomarker in Ernährungsinterventionsstudien ist
die mögliche Modifizierbarkeit dieser durch verschiedene chemopräventive, ernährungsrelevante
Agenzien.
PROBLEM- UND ZIELSTELLUNG
20
2 PROBLEM- UND ZIELSTELLUNG
Trotz der Vielfalt der detektierbaren Risikoparameter existiert derzeit kein Marker, der eine zuverlässige Vorhersage auf zukünftige Tumorformationen treffen kann. Epidemiologische Studien
weisen auf einen Zusammenhang zwischen der Ernährung und dem Karzinomrisiko hin, wobei
die derzeitige Beweislage nicht eindeutig und teilweise kontrovers ist. Das begründet sich zum
einen durch die Vielzahl der angewandten Methoden in unterschiedlichen Bevölkerungspopulationen, die mehrheitlich nicht validiert sind. Mit Hinblick auf die Prävention vor kanzerogener
Entartung fehlen validierte Techniken, die es erlauben, Aussagen über schützende Wirkmechanismen protektiver, nutritiver Einflussfaktoren zu treffen. Zum anderen erfolgt die Mehrzahl der
Untersuchung auf zellulärer Ebene (in vivo) an invasiv gewonnenem Probenmaterial. Das hat zur
Folge, dass es sich dabei größtenteils um Proben handelt, die aufgrund medizinischer Indikationen
von den Probanden gewonnen wurden. Aus ethischen Gründen steht humanes Untersuchungsmaterial von gesunden Probanden nicht in beliebiger Menge zu Forschungszwecken zur Verfügung.
Intensiv wird nach nicht-invasiven Biomarker-Techniken gesucht, die sicher und reproduzierbar
auf ein mögliches Karzinomrisiko bzw. dessen Protektion hinweisen und zusätzlich durch eine
geringe Kostenintensität und eine einfache Durchführbarkeit als Screening-Methode für große
Bevölkerungsgruppen praktizierbar sind. Eine Klärung des Einflusses der einzelnen Wirkprinzipien auf den komplexen Prozess der Karzinogenese bzw. deren Protektion, die durch die gemessenen Biomarker vermutet bzw. bestätigt werden, muss in der Zukunft erfolgen. Von großer
Bedeutung ist es, standardisierte Basisdaten über die detektierten Marker zu erlangen. Eine grundlegende Vorraussetzung dafür ist eine gute Reproduzierbarkeit der jeweiligen Methode mit einer
geringen interexperimentellen Variation.
Ziel der Promotion ist es daher, nicht-invasive Biomarker-Techniken zu entwickeln und zu etablieren, um molekulare Parameter der Karzinogenese zu determinieren und zu modifizieren. Dabei
steht die Entwicklung neuer funktioneller Biomarker, die Risiken bzw. präventive Mechanismen
ernährungsrelevanter Inhaltsstoffe identifizieren und kennzeichnen und so Hinweise auf die
Protektion eines möglichen kanzerogenen Risikos geben, im Vordergrund.
In diesem Zusammenhang wurde das Ziel verfolgt, Biomarker auf dieser Ebene weiterzuentwickeln, zu validieren und hinsichtlich ihrer Aussagekraft näher zu erforschen.
21
1. Bestimmung der Genotoxitziät von FW an humanen Zellen als Biomarker für Kolonkrebsrisiken
FW repräsentiert eine ideale nicht-invasive Möglichkeit, den Einfluss der Exposition exogen
zugeführter bzw. endogen metabolisierter Substanzen auf die Dickdarmmukosa zu untersuchen.
Das Ausmaß der genotoxischen Wirkung ist eine Reflektion der Belastung mit genotoxischen
Substanzen im Darmlumen. In Bezug auf die mögliche genotoxische Aktivität von FW fehlen
derzeit Basisdaten, um eine Modulation der FW-Genotoxizität zu eruieren.
In dieser Arbeit sollte daher:
⇒ die Bestimmung der Fähigkeit des FW zur Induktion von DNA-Strangbrüchen und
oxidierten Purin- und Pyrimidinbasen an primären humanen Zellen und einer Kolontumorzelllinie erfolgen.
⇒ die Variationsbreite der genotoxischen Aktivität von FW bestimmt werden.
⇒ die Bestimmung einer möglichen Modulation der FW-Genotoxizität durch die Ernährung untersucht werden.
2.. Isolierung abgeschilferter humaner Zellen als Zielzellen von BiomarkerBestimmungen
Abgeschilferte primäre Zellen stellen eine ideale Möglichkeit dar, um nicht-invasiv humane
Zellen zu gewinnen. Bei der Betrachtung von Untersuchungsergebnissen mit abgeschilferten
Zellen aus der Literatur fällt auf, dass eine nähere Charakterisierung der verwendeten Zellen fehlt.
Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit:
⇒ die Möglichkeit der Isolation von abgeschilferten humane Zellen aus Fezes, Urin und
Mundspülproben eruiert werden.
⇒ Nach der Isolation der abgeschilferten Zellen sollten Basisdaten bestimmt werden, wie
→ Quantität
→ Qualität (Vitalität, Enzymparameter)
→ grundlegende Charakteristika (Zellart, Zusammensetzung gemischter
Zellpopulationen)
→ Reproduzierbarkeit der Isolierungstechniken
⇒ Weiterhin sollte untersucht werden, ob und inwiefern in den abgeschilferten Zellen
molekularbiologische Parameter bestimmt werden können, die dann zur Erkennung
von Faktoren der Risikoreduktion eingesetzt werden sollten.
→ genetische Schäden
22
→ Protein-Marker
3.
Anwendung der etablierten Biomarker-Techniken im Rahmen von Ernährungsinterventionsstudien
Die Effektivität und Funktionalität der neu etablierten Biomarker-Techniken erweist sich erst
dann, wenn diese in praxisrelevanten Versuchsansätzen Anwendung finden, um die Modulierbarkeit der detektierten Parameter zu eruieren. Ernährungsinterventionsstudien bieten eine ideale
Möglichkeit, den Einfluss ernährungsrelevanter Inhaltsstoffe auf die Biomarker in ihrer gesamten
Komplexität in dem „in vivo-System Mensch“ zu bestimmen. Aufgrund dessen war ein weiterer
Schwerpunkt der Arbeit folgender Ansatz:
⇒ Messung der Genotoxizität von Fezeswasser vor und nach Intervention mit Ernährungsfaktoren
⇒ Einsatz der abgeschilferten Zellen in die etablierten Biomarker-Techniken und Messung
der Parameter vor und nach der Intervention mit Ernährungsfaktoren
Aus den gewonnenen Ergebnissen sollte eine Auswahl an validierten bzw. neu etablierten Untersuchungsmethoden zur Verfügung stehen, die zur Erfassung von Expositionen bzw. von zellulären Effekten infolge der Exposition im Hinblick einer ernährungsbedingten Risikoreduktion im
Rahmen von Interventionsstudien eingesetzt werden können.
MATERIAL UND METHODEN
23
3
3.1
Material
3.1.1
Zellen
Die Untersuchung der Genotoxizität von Fezeswasser (FW) sowie die Versuche zur Zellisolation
erfolgten mit Zellen der humanen Tumorzelllinie HT29 clone 19A (HT29c). HT29c-Zellen sind
permanente, adhärente Zellen, die durch die Behandlung mit Butyrat aus der HT29 Stamm-Zelllinie
rückdifferenziert wurden (AUGERON und LABOISSE 1984). Die Zelllinie HT29 Stamm wurde aus
einem primären Tumor eines adenokarzinomatösen Kolongewebes etabliert (FOGH und TREMPE
1964).
Die Isolation von Urothelzellen erfolgte aus Urin. Orale Zellen wurden aus Mundspülproben gewonnen.
3.1.2
Geräte
Analysenwaage
Sartorius AG, Göttingen
Brutschrank (Steri-Cult 200)
Forma Scienti?c Inc., Marietta
Dynal MPC®-1
Dynal MPC®-E/E-1
Elektrophoreseeinheit (Power Pack P25)
Biometra, Göttingen
Elektrophoresekammer (Agagel G45/1)
Biometra, Göttingen
Elektrophorese-Vorrichtung
Renner GmbH, Dannstadt
Gelgießstand
CTI GmbH, Idstein
Geldokumentationssystem
BioRadLaboratories GmbH, München
Konfokales Mikroskop (Axiovert M 100)
Carl Zeiss Jena GmbH, Jena
Laborbrenner (Gaspro?)
Wartewig Labor- und Dentaltechnik, Göttingen
Mikroskop (Axiovert 25)
Carl Zeiss Jena GmbH, Jena
Mikrowelle (HMT 700B)
Robert Bosch Hausgeräte GmbH, Gerlingen
Minischüttler (MS 1)
Ika, Staufen
Photometer
Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Köln
Sterile Werkbank (Herasafe H12)
Heraeus Instruments GmbH, Hanau
Thermomixer (compact)
Tischzentrifuge (CR 4.22)
Juoan GmbH, Hanau
24
Wärmeplatte (HP 9060)
Labotect GmbH, Göttingen
Wasserbad
Memert GmbH & Co. KG, Schwabach
Ultraschall-Homogenisator
Fisher Scienti?c, Schwerte
Ultrazentrifuge
Beckmann, München
Wasserstrahlpumpe
Zentrifuge (Biofuge pico)
Heraeus Instruments GmbH, Hanau
Zellzählkammer nach Neubauer, geeicht
3.1.3
Arbeitsmittel
Einwegküvetten
Filcons (30µm, 10µm)
Becton Dickinson GmbH, Heidelberg
Leucosept-Kit
Greiner Bio-One, Frickenhausen
Lyseküvetten
Metallbox (für Eiskühlung)
Mikroskopische Deckgläser (24 x 24 mm)
Menzel, Braunschweig
Mikrotiterplatten
Objektträger (geschliffen, 26 x 76 mm)
Objektträger (rau, 26 x 76 mm)
Pipetten (Research)
Pipettenspitzen
Pipettierhilfe (Accu-jet)
Brand GmbH & Co, Wertheim
Reaktionsgefäße (1,5ml und 2ml)
Brand GmbH & Co, Wertheim
Reaktionsgefäße (15ml und 50ml)
Greiner Bio-One, Frickenhausen
Steril?lter (Celtron 30/0,2)
Schleicher & Schuell, Dassel
Stuhlprobensammelboxen
Rubbermaid Kunststoff GmbH, Dreieich
Trevigen-Slides
Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH, Eching
Zellkultur?aschen
Becton Dickison Labware, Heidelberg
3.1.4
Computerprogramme
COMET-BILDAUSWERTUNG
PERSPECTIVE INSTRUMENTS, SUFFOLK
EXCEL 7.0
MICROSOFT CORPORATION, VERL
GRAPH PAD PRISM 2.0
GRAPHPAD SOFTWARE, SAN DIEGO
META MORPH IMAGING SYSTEM
UNIVERSAL IMAGING CORP., PUCHHEIM
25
POWER POINT 7.0
QUANTITY ONE 3.1
BIORAD, MÜNCHEN
WORD 8.0
3.1.5
Chemikalien, Reagenzien, Standards, Antikörper
Alle Chemikalien wurden im höchsten kommerziell erhältlichen Reinheitsgrad verwendet.
Ammoniumperoxidsulfat
Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Anti-Human Leucoyte Common Antigen
DAKO Diaknostik a GmbH, Hamburg
(CD45-d)
(CD45-d*)
(CD45-m)
Anti-Human Epithelial Antigen
DAKO, Diaknostika GmbH, Hamburg
(EA -d)
(EA -d*)
(HEA -m)
Anti-Human Membrane Antigen
(EMA-d)
Anti-Human Epithelial Speci?c Antigen
Medac GmbH, Wedel
(ESA-d)
Anti-Human Carcinoembryonic Antigen
(CEA -d)
Agarose, SEAKEM HGT - low melting-
Biozym Diagnostics, Hameln
Agarose, SEAKEM HGT -normal melting- Biozym Diagnostics, Hameln
Amphotericin B
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
Borsäure
Bleomycin (BLEO)
Heinrich Mack Nachf., Illertissn
Calcein, AM
Molecular Probes, Göttingen.
Chlorsäure
Coomassie Blue G250
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Dithiothreitol (DTT)
Dynabeads M450
(Rat anti-Mouse IgG1)
Dynabeads M280
26
(Rat anti-Mouse IgG1)
Dynabeads M450
(anti-Epithelial Cell)
Essigsäure
Endonuclease III (Endo III)
Rowette Research Institute, Aberdeen
Ethanol (absolut)
Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Ethidiumbromid
Ethylendinitrilotetraessigsäure-Dinatrium- Fulka Chemie AG, Ulm
salz (EDTA)
Formamidopyrimidinglykosylase (FPG)
Rowette Research Institute, Aberdeen
Gentamycin
Life Technologies GmbH, Karlsruhe
Glycerol
Sigma Diagnostics, St. Louis (USA)
Guajacol
Merck Schuchardt, Hohenbrunn
Harnstoff
Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Hepes
Carl Ro th GmbH, Karlsruhe
Histon-Mix-Standard
Biomol GmbH, Hamburg
Histopaque-1077
Kaliumchlorid
Kaliumhydrogensulfat
Kaliumhydroxid
Kalziumchlorid
Magnesiumchlorid
Mercaptoethylamin
ICN Biomedicals GmbH, Eschwege
Methanol
Calbiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden
Methylgrün
N-Acetylcystein
Natriumbutyrat
Merck EuroLab GmbH, Darmstadt
Natriumchlorid
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Natriumhydrogensulfat
Natriumhydroxid
Natriumsulfat
Merck EuroLab GmbH, Darmstadt
Pefabloc
Saccharose
SYBR-Green
Tetramethylendiamin (TEMED)
27
Tris-Base
Tris-HCl
Triton X
Trypanblau (0,4 %)
Trypsin
Life Technologies, Karlsruhe
Versene (1:5000)
Life Technologies, Karlsruhe
3.1.6
Medien, Lösungen, Puffer
Dulbecco's Modi?ed Eagle Medium
(DMEM)
Fötales Kälberserum (FCS)
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)
Rinderserum- Albumin (BSA)
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
RPMI 1640
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Trypsin-Versene-Lösung
Calcein- Gebrauchslösung:
1mM
Calcein AM in DMSO
DAPI- Gebrauchslösung:
3mM
DAPI in Methanol bzw. PBS
Fezesspülmedium:
500ml
400U
400µg
1µg
50µg
1mM
3mM
5g
1g
DMEM
Penicillin
Streptomycin
Amphotericin B
Gentamycin
N-Acetylcystein (frisch dazu geben)
Natriumbutyrat
BSA
Guajacol (in Alkohol, 1g/10 ml )
HBSS-Gebrauchslösung:
8g
NaCl
0,4g
KCl
0,06g
NaHPO4 x2H2 O
1g
Glucose
0,35g
NaHCO3
4,8g
20mM Hepes
Die Chemikalien mit ddH2 O auf 1l auffüllen und mit 1N NaOH oder 1N HCl auf pH 7,4
einstellen und steril ?ltrieren.
PBS-Gebrauchslösung:
8,0g/l
0,2g/l
1,44g/l
0,2g/l
NaCl
KCl
NaHPO4 x2H2 O
KH2 PO4
PBS (+Ca/+Mg)
0,1g/l
0,1g/l
MgCl2 x 6 H2 O
CaCl2 x 2 H2 O
28
PBS (+ 0,1 % BSA)
25mg
BSA
Die Chemikalien mit ddH2 O auf 1l auffüllen und mit 1N NaOH oder 1N HCl auf pH 7,4
einstellen und steril ?ltrieren.
Einfriermedium:
90%
10%
FCS
DMSO
Agarosegel (0,5%):
0,5g
Normal Melting Agarose in 100ml PBS
Agarosegel (0,7%):
0,7g
Low Melting Agarose in 100ml PBS
Lyse-Stammlösung:
146g
37,2g
1,2g
1l
8g
10g
Lyse-Gebrauchslösung:
89%
1%
10%
Elektrophoresepuffer:
(CA)
60ml
10ml
1930ml
Neutralisationspuffer:
48,5g
1l
2,5M NaCl
100M Na2 EDTA
10mM Tris-Base
ddH2 O
1N NaOH (auf pH 10 einstellen)
Na-Lauroylsarcosinat
Stammlösung
Triton X-100
DMSO
10M NaOH
200mM Na2 EDTA
ddH2 O
0,4M Tris-Base
ddH2 O
Mit HCl auf pH 7,5 einstellen.
Endonucleasepuffer:
0,2g/l
0,14615g/l
9,532g/l
7,456g/l
1l
Alles mit KOH auf pH 8,0 einstellen.
BSA
EDTA
Hepes
KCl
ddH2 O
Ethidiumbromid-Stammlösung:
10 ml
50 ml
Ethidiumbromid-Gebrauchslösung:
1:10
TE-Puffer:
10mM
1mM
Ethidiumbromid
ddH2 O
Verdünnung der Stammlösung mit ddH2O
Tris-HCl
EDTA
SYBR-Green-Gebrauchslösung: 2,5g
1,4-Diazabicyc lo[2.2.2]octane
50ml
TE-Puffer
50ml
Glycerol
SYBR-Green wird in diesen Antifade-Puffer 1:1000 verdünnt, aliquotiert und bis zum
Gebrauch eingefroren.
29
Lyselösung (Histone):
0,0605g
Tris-HCl
0,26g
Na2 SO4
0,5ml
Triton X
0,1202g
MgCl2 x6H2 O
4,3g
Saccha rose
0,11975g
Pefabloc
Auf 50ml mit ddH2 O auffüllen, mit HCl oder NaOH auf pH 6,5 einstellen und vor
Gebrauch 1mM DTT dazugeben.
Säure- Extraktionslösung (Histone):
0,0242g
Tris HCl
0,0967g
EDTA
0,016765g
Pefabloc
Auf 7ml mit ddH2 O auffüllen, mit HCl oder NaOH auf pH 7,4 einstellen und vor Gebrauch
1mM DTT dazugeben.
Probenpuffer (Histone):
3,6g
Harnstoff
2ml
Glycerol
1ml
Essigsäure
Auf 10ml mit ddH2 O auffüllen, 2ml Aliquote bei -20°C aufbewahren und vor Gebrauch
1mM DTT dazugeben.
Scavenge-Puffer:
50µl
Essigsäure
0,36g
Harnstoff
0,68g
Mercaptoethylamine
100µl
Glycerol
Kleine Menge an Methylgrün dazugeben, auf 1ml mit ddH2 O auffüllen und bei -20°C
aufbewahren.
Ammoniumpersulfat-Stammlösung:
0,5g
Ammoniumpersulfat
Auf 5ml mit ddH2 O auffüllen.
Säure-Harnstoff- Bisacrylamid-Gel:
3,42g Harnstoff
43,33ml Bisacrylamid
4ml Essigsäure
Auf 65ml mit ddH2 O auffüllen und unter Erwärmung lösen. Entgasen und vor Gebrauch
0,65ml Ammoniumpersulfat-Stammlösung und 0,325ml TEMED dazugeben und über
Nacht polymerisieren lassen.
Elektrophoresepuffer (Histone): 50ml
950ml
Essigsäure
ddH2 O
Coomassie-Färbelösung:
0,05g
22,5ml
22,5ml
4,5ml
Coomassie Blue
Methanol
ddH2 O
Essigsäure
Gel-Entfärbelösung:
200ml
700ml
100ml
Methanol
ddH2 O
Glycerol
3.2
Methoden
3.2.1
Fezeswassergewinnung, Steril?ltration, Lagerung
30
Die frisch in Plastikbehälter gewonnene Fezes wurde gewogen und anschließend in Ultrazentrifugenröhrchen portioniert. Im Anschluss daran erfolgte die Zentrifugation der Stuhlproben bei 4°C für 2h
bei 25000xg. Der Überstand wurde abpipettiert, portioniert (>75µl) und nicht frisch verwendetes FW
bei -18°C gelagert.
Da die Steril?ltration des FW in Vorversuchen zu keiner Veränderung der Vitalität und Genotoxizität
im CA führte, wurde darauf in allen Versuchsdurchführungen verzichtet.
3.2.2
Zellmaterial
3.2.2.1
Zellen aus Fezes
Die Versuche zur Zellisolation aus Fezes erfolgten an frisch gewonnenem Probenmaterial. Einzelheiten zur Isolationstechnik sind im Abschnitt 3.2.5.2 erläutert.
3.2.2.2
Zellen aus Urin
Frischer Urin wurde bei 380xg, 10min bei 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet
in 5ml PBS(+ BSA) resuspendiert. Nach der Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung mittels TrypanblauAusschlusstest (Abschnitt 3.2.3) wurden die Zellen auf Eis bis zur Weiterverwendung aufbewahrt.
3.2.2.3
Zellen aus Mundspülproben
Die Probanden wurden angehalten, ihren Mund für 1min mit HBSS zu spülen, die Probe in ein 50mlRöhrchen zu geben und ihre Wangeninnenseiten mit einem Zellspatel für 1min zu stimulieren. Anschließend spülten die Probanden nochmals ihre Mundhöhle für 1min mit HBSS und vereinigten die
zweite Spülung mit der ersten. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (400xg, 8 min, 4°C) konzentriert, mit HBSS gewaschen und anschließend in 5ml HBSS aufgenommen. Die Zellzahl und Vitalität
wurde, wie im Abschnitt 3.2.3 beschrieben, mittels Trypanblau-Ausschlusstest bestimmt.
Zur Vereinzelung der oralen Zellen, vor allem der Epithelzellen, wurden die Mundspülproben über
ein 30µm-Filcon pipettiert, der Überstand verworfen und das Eluat bis zur Weiterverwendung auf Eis
gehalten.
3.2.2.4
31
Isolation von peripheren Lymphozyten aus Blut
Die Lymphozyten wurden durch klassische Dichtegradientenzentrifugation (DG) aus Vollblut eines
Probanden gewonnen. Dazu wurde das Blut mit gleichem Volumen PBS gemischt und geschwenkt
und auf das gleiche Volumen Histopaque-1077 überschichtet. Im Anschluss wurde dieses Gemisch
30min bei 480xg bei RT ohne Bremse zentrifugiert. Die lymphozytenenthaltende Bande (über den
Erythrozyten und dem Histopaque) wurde mittels Pasteurpipette abgezogen, mit PBS auf 20ml
aufgefüllt, leicht durchmischt und 10min bei 290xg bei RT zentrifugiert. Die im Pellet sedimentierten
Lymphozyten wurden in 5ml PBS resuspendiert und die Vitalität und Zellzahl bestimmt.
Nicht sofort benötigte Zellen wurden bei < -120°C zur mittelfristigen Aufbewahrung in frisch hergestelltem Einfriermedium eingefroren. Die Gefrierprozedur erfolgte mit einer Temperaturabsenkung
von 1°C/min in Nalgane Cryo-Gefriercontainern.
Bei Bedarf wurden die Lymphozyten schnell im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut, bei 320xg für 8min
bei RT abzentrifugiert und in PBS resuspendiert.
3.2.2.5
Zellkultur der HT 29 clone 19A-Zellen
Die Zellkultur der HT29c-Zelllinie wurde in 75cm2 Zellkulturflaschen in DMEM mit einem Zusatz
von 10% fötalem Kälberserum (FCS), 50U/ml Penicillin G und 50 µg/ml Streptomycin (Pen/Strep)
durchgeführt. Die Inkubation der Zellen erfolgte unter sterilen Bedingungen in einem Brutschrank
bei einer Temperatur von 37°C, einer Luftfeuchtigkeit von 95% und einem CO2-Gehalt von 5%.
Unter den genannten Bedingungen waren die Kulturflaschen alle 3 bis 4 Tage subkonfluent mit den
Zellen bewachsen, so dass diese passagiert bzw. geerntet werden konnten. Hierzu wurde das Medium
vollständig mit einer Pasteurpipette aus der Zellkulturflasche entfernt, die Zellen mit 4ml TrypsinVersene-Lösung bedeckt und bei 37°C inkubiert. Nach 4min waren die Zellen in der Regel abgekugelt, jedoch noch adhärent. Nach dem Absaugen der Trypsin-Versene-Lösung wurde die Zellen bis
zum vollständigen Ablösen ohne Lösung 4min weiter inkubiert und anschließend in Medium resuspendiert. Die Passage der Zellen erfolgte nach einer 1:4-Verdünnung der Zellen mit Medium. Alle
Zellsuspensionen wurden in einem Gesamtvolumen von 15ml DMEM kultiviert. Bei Kultivierung
der Zellen in 25cm2 Zellkulturflaschen wurde mit 3ml Trypsin-Versene-Lösung inkubiert und auf ein
Gesamtvolumen von 5ml mit DMEM aufgefüllt. Die für die Experimente verwendeten Zellen befanden sich in der 17. bis 50. Passage. Alle genannten Arbeitsschritte erfolgten unter sterilen Arbeitsbedingungen in einer Sterilbank auf einer Wärmeplatte mit einer Arbeitstemperatur von 37°C. Die
verwendeten Lösungen und Medien wurden ebenfalls auf 37°C temperiert.
3.2.3
32
Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung
Die Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung erfolgte mit dem Trypanblau-Ausschlusstest [SANDSTRÖM
1965), bei dem nur invitale Zellen mit Membranschäden den Farbstoff aufnehmen. Dazu wurde eine
1:2-Verdünnung der Zellsuspension mit Trypanblau hergestellt und einige Tropfen dieser auf eine
mit 70%igem Ethanol gereinigte geeichte Neubauer-Zählkammer gegeben. Die Bestimmung der
Anzahl vitaler (ungefärbter) und toter (durch das Eindringen des Farbstoffes blaugefärbter) Zellen
erfolgte mit dem Mikroskop Axiovert 25 bei 400-facher Vergrößerung. Die Zellzahl bzw. Vitalität
der Zellen errechnete sich nach folgenden Gleichungen:
Zellzahl/ml
=
gezählte Zellen x104 x2
Vitalität der Zellen
=
(Anzahl vitale Zellen/Gesamtzellzahl)x100
3.2.4
Comet-Assay
3.2.4.1
Vorbereitung: Objektträgerbeschichtung
In Vorbereitung des CA ist es notwendig, die benötigten Objektträger (OT) mit Agarose vorzubeschichten. Dazu wurden die sauberen und trockenen OT mit 50µl Normal Melting Agarose (0,5%
NMA) überzogen und bei 60°C auf einer Wärmeplatte getrocknet. Anschließend wurden die OT
nochmals mit 85µl NMA versehen, mit einem Deckgläschen schnell abgedeckt und 10min bei 4°C
gekühlt. Die Aufbewahrung der vorbeschichteten OT erfolgte in angefeuchteten Boxen bei 4°C.
3.2.4.2
Comet-Assay im alkalischen Milieu
Der CA, auch MGE genannt, stellt eine Methode dar, die Genotoxizität verschiedener exogener
Faktoren aufgrund der Migration der DNA einzelner Zellen in einem elektrischen Feld zu bestimmen. Sie wurde von ÖSTLING und JOHANSON (1984) entwickelt, von SINGH et al. (1988) variiert und
wird heute in verschiedenen Modifikationen angewandt (COLLINS et al. 1995a, COLLINS und
DOBSON 1993, KASAMATSU et al. 1996, MCKELVEY-MARTIN et al. 1993, MONTEITH und VANSTONE
1995,POOL-ZOBEL et al. 1997b, TICE 1995).
Die für diese Arbeit durchgeführten Versuche wurden entweder mit aufgetauten humanen peripheren
Blutlymphozyten, oralen Leukozyten oder mit HT29c-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden in
RPMI auf eine Zellzahl von 2x106 Zellen/ml eingestellt und in Abhängigkeit von der spezifischen
Fragestellung inkubiert. Von jedem Versuchsansatz wurden drei 100µl Aliquote erstellt, deren Überstand bei 320xg für 8min bei RT abzentrifugiert und verworfen wurde. Das Zellpellet wurde in 75µl
0,7%iger Low Melting Agarose (LMA) resuspendiert, sofort auf einen vorbeschichteten OT aufpi-
33
pettiert, mit einem Deckglas luftblasenfrei abgedeckt und auf einer vorgekühlten, mit Eis gefüllten
Metallbox zum Erstarren der Agarose abgelegt. Parallel dazu wurde die Vitalität jedes Versuchsansatzes mittels Trypanblau-Ausschlusstest bestimmt. Nach dem Erstarren der Agarose wurden die
Deckgläschen entfernt, nochmals 75µl 0,7%ige LMA auf die OT pipettiert, mit einem Deckgläschen
luftblasenfrei abgedeckt und auf der gekühlten Metallbox zum Erstarren niedergelegt. Nach 10min
wurde das Deckglas entfernt, und die OT wurden in einer vorbereiteten 200ml Küvette mit Lyselösung für >1h bei 4°C inkubiert. Sah der Versuchsansatz eine Inkubation mit Endonuclease III (Endo
III), ein Enzym, dass aus Escherichia coli isoliert wurde und die DNA spezifisch an oxidierten Pyrimidinbasen schneidet (COLLINS et al. 1995a, COLLINS et al. 1995b, VENTURI et al. 1997), bzw. mit
Formamidopyrimidine Glycosylase (FPG), die die DNA an oxidierten Purinbasen schneidet, vor, so
wurden die betreffenden OT nach frühestens einer Stunde aus dem Lysebad entnommen und dreimal
für 5min mit Endonucleasepuffer gespült. Anschließend wurden 50µl des entsprechenden Enzyms
auf die OT pipettiert, mit einem Deckglas luftblasenfrei abgedeckt und für 45min bei 37°C in einer
feuchten Kammer inkubiert. Im Anschluss wurden alle OT in die Elektrophoresekammer platziert
und mit Elektrophoresepuffer vollständig bedeckt. Nach 20-minütiger Einwirkung des Puffers zur
vollständigen Denaturierung und Entwindung der DNA („Unwinding“ der DNA) wurde die Elektrophorese bei 25V und 300mA für 20min durchgeführt. Danach wurden die OT in eine Färbewanne
überführt, dreimal mit Neutralisationspuffer gewaschen und mit 100µl einer 1:10-Verdünnung der
Ethidiumbromid-Stammlösung bzw. mit 30µl der SYBR-Green-Gebrauchslösung gefärbt. Bis zur
fluoreszenzmikroskopischen Auswertung wurden die OT in einer feuchten Kammer bei 4°C gelagert. Die Auswertung der OT erfolgte mittels einem elektronischen Bildauswertungssystems. Dazu
wurden pro OT 50 Spots gemessen. Die beobachteten genotoxischen Veränderungen in den Zellen
wurden als Anteil Fluoreszenz im Schweif „Tailintensity“ (TI) dargestellt und ausgewertet. Ab einer
TI von >6% wurde in dieser Arbeit die Wirkung einer Substanz als genotoxisch bezeichnet.
3.2.4.3
Comet-Assay nach Inkubation mit Fezeswasser
Für die Inkubation der Zellen mit FW wurden die entsprechenden FW-Proben aufgetaut, bis zur
Inkubation der Zellen auf Eis gekühlt und anschließend in einer Konzentration von 1:10 zu der
Zellsuspension gegeben. Die Zellen wurden bei 37°C für 30min inkubiert. Die Inkubation wurde auf
Eis gestoppt, die Versuchsansätze aliquotiert und der Überstand bei 320xg für 8min abzentrifugiert
und verworfen. Danach wurde der CA, wie im Abschnitt 3.2.4.2 erwähnt, fortgeführt. Als Kontrolle
wurde bei jedem Versuch ein Ansatz mit physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von
1:10 mitgeführt.
3.2.4.4
34
Comet-Assay mit oralen Leukozyten auf Objektträgern von Trevigen
Die Prozedur des CA mit OT von Trevigen (TS) (Gaithersburg, USA) ist ähnlich der herkömmlichen, in Abschnitt 3.2.4.2 beschrieben, Methode. Die Fixierung der Zellen sowie die weitere Inkubation verlangt viel Erfahrung und stellt den kritischen Punkt beim Umgang mit diesen OT dar. Etwa
5.000-9.000 Zellen wurden in Agarose aufgenommen und vorsichtig auf die OT aufgetragen. Anschließend wurde die Agaroseschicht 20min gekühlt, bis die OT in das Lysebad platziert wurden. Im
Anschluss an die Lyse, die Inkubation mit Endo III bzw. FPG und die elektrophoretische Auftrennung wurde die zellenthaltende Agaroseschicht für 5min in Alkohol fixiert, über Nacht bei RT getrocknet und vor der fluoreszenzmikroskopischen Auswertung mit Ethidiumbromid gefärbt. Als
interner Standard wurden bei der Untersuchung der Proben aus der Brotstudie (Abschnitt 3.2.8.2.4)
HT29c-Zellen mitgeführt, die 30min (37°C) mit Bleomycin (BLEO) (2mg/ml) bzw. mit physiologischer Kochsalzlösung inkubiert und anschließend aliquotiert eingefroren wurden.
3.2.5
Zellisolierung aus humanen Proben
3.2.5.1
Immunomagnetische Isolation von Zellen aus humanem Probenmaterial
3.2.5.1.1
Immunomagnetische Isolation im Dynal-System
3.2.5.1.1.1 Waschen und Koppeln der Antikörper und Beads
Als Dynabeads bezeichnete Beads sind supramagnetische Polystyren-Perlen mit einem Durchmesser
von 2,8 bzw. 4,5µm (Dynabeads M 280 bzw. M 450) der Firma Dynal Biotech GmbH, Hamburg,
die über eine Antigen-Antikörper-Bindung an spezifische Antikörper (AK) gebunden sind. Dabei
unterscheidet man Dynabeads, die schon mit dem Ziel-AK gekoppelt sind und solche, bei denen die
Kopplung noch initiiert werden muss. Bei den schon gekoppelten Dynabeads entnimmt man die
nach Herstellerangaben empfohlene Menge Dynabeads, wäscht diese laut Gebrauchsanweisung mit
PBS(+ BSA) mittels Magnetic Particle Concentrator (MPC), resuspendiert sie abschließend in der
ursprünglich entnommenen Menge mit PBS(+ BSA) und bewahrt sie bis zur Verwendung im Kühlschrank oder auf Eis auf.
Für die Kopplung der Dynabeads mit dem jeweiligen primären AK wurden ebenfalls die laut Herstellerangaben empfohlenen Mengen Dynabeads entnommen, im MPC mit PBS(+ BSA) gewaschen
und im Anschluss mit den empfohlenen Mengen des primären AK versetzt. Es folgte eine 30minütige leicht schüttelnde Inkubation auf Eis. Anschließend wurden die gekoppelten AK zweimal
mit PBS(+ BSA) gewaschen und zur Aufbewahrung auf Eis oder in den Kühlschrank gestellt. Die Abb.
35
6 stellt die positive und negative Isolation von Zellen mittels magnetisch gekoppelter AK graphisch
dar.
In dieser Arbeit kamen folgende AK (mouse-anti-human) zur Anwendung:
epitheliale AK:
• human epithelial antigen clone Ber-EP4
EA-d*
(an Dynabeads M450 im Labor eigens gekoppelt)
EA-d
EA-d280
• human epithelial membrane antigen clone E29
EMA-d
• human epithelial specific antigen clone VU-1D9
ESA-d
•
human carcinoembryonic antigen clone 85A12
CEA-d
leukozytenspezifische AK: • CD45 clone 2B11+PD7/26
CD45-d
• CD45 clone
CD45-d*
Abbildung 6:
Zellisolation mittels magnetisch gekoppelter Antikörper
3.2.5.1.1.2 Inkubation humaner Proben mit Bead-gekoppelten Antikörpern des Dynal-Systems
Humane Proben aus Blut, Fezes, Urin und Mundspülungen wurden mit Bead-gekoppelten AK des
Dynal-Systems (Dynal Biotech GmbH, Hamburg) inkubiert. Die spezifische Vorgehensweise zur
Isolation der Zellen aus den unterschiedlichen humanen Medien ist in den jeweiligen Abschnitten
(3.2.5.2, 3.2.5.3 und 3.2.5.5.3) näher beschrieben. Die betreffenden Proben wurden jeweils für 30 bis
40min mit den entsprechenden AK schüttelnd auf Eis inkubiert, anschließend mehrmals mittels
MPC-Vorrichtung gewaschen und bis zu den nachfolgenden Untersuchungen auf Eis gehalten.
3.2.5.1.2
36
Inkubation humaner Proben mit Bead-gekoppelten Antikörpern des
Macs -Systems
Die Verwendung des Macs-Systems (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach) erfolgte nur für
die Zellauftrennung der Mundspülproben.
Dabei kamen folgende, Bead-gekoppelte AK zum Einsatz:
• human epithelial antigen HEA125
HEA-m
• human common leukocyte specific antigen CD45
CD45-m
Die oralen Zellen wurden, wie im Abschnitt 3.2.2.3 beschrieben, vorbereitet und anschließend 80µl
PBS(+ BSA) aufgenommen. Auf die Versuchsansätze zur Separation mit CD45-m wurden 20µl der
Bead-gekoppelten AK gegeben und 15min bei 4°C inkubiert. Die Zellsuspension zur Separation mit
HEA-m wurde mit 20µl eines Blocking-Puffers (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach) versetzt und mit 20µl Bead-gekoppelten AK für 30min bei 4°C inkubiert. Überschüssige Beads wurden
danach durch Waschen mit 10ml PBS(+ BSA) und anschließender Zentrifugation (400xg, 8min, RT)
entfernt. Das Pellet wurde in 500µl PBS(+ BSA) aufgenommen. Die Separationssäulen wurden in der
Magnetvorrichtung platziert und mit 1ml PBS(+ BSA) gespült. Im Anschluss wurden die Proben über
die Säulen geleitet, wobei der Durchfluss nochmals auf die selbe Säule aufgetragen wurde. Die an die
Beads gekoppelten Zellen verblieben in der Säule. Die Separationssäule wurde dreimal mit 0,5ml
PBS(+ BSA) gespült, aus der Magnetvorrichtung entnommen und mit 1ml PBS(+ BSA) nachgespült.
Dabei eluierten die an die Beads gekoppelten Zellen.
3.2.5.2
Immunomagnetische Zellisolierung aus Fezes
Die Grundlage für die Methodik zur Isolation abgeschilferter Zellen aus der Fezes stammt von
O‘N EILL und LOKTIONOV (1997). Die frisch in Plastikbeuteln gewonnenen Fezes wurden sofort auf
Eis gestellt und gekühlt. 50g des Stuhls wurden portioniert und für 30min auf 0°C bis -1°C in einem
Eisbad mit NaCl gekühlt. Auf die gefrorenen Fezesproben wurden 50ml Fezesspülmedium aufpipettiert und 15min vorsichtig im Eisbad geschüttelt. Darauffolgend wurde der Überstand abdekantiert,
mit 5g Eis versetzt, auf den verbleibenden Stuhl nochmals 50ml Fezesspülmedium gegeben und
15min im Eisbad vorsichtig geschwenkt. Der Überstand wurde mit dem vorhergehenden vereinigt,
5g Eis hinzugefügt und bei 500xg, 10min bei 0°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert,
das Pellet in 15ml Fezesspülmedium resuspendiert und aliquotiert. Je nach Versuchsansatz wurden
anschließend 10g fein gemörserte Borsäure hinzugefügt. Bei den Versuchsansätzen mit Borsäure
wurde nach vorsichtigem Schwenken der Überstand abdekantiert und von der Borsäure getrennt.
Durch die Borsäure sollten schwerere Schwebebestandteile schneller sedimentieren, um so eine
37
reinere Fezeswaschlösung mit isolierten Zellen zu erhalten. Alle Aliquote wurden nochmals bei
500xg für 10min bei 0°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 10ml
Fezesspülmedium resuspendiert. Anschließend wurden die Proben auf Eis gestellt und mit der entsprechenden Menge Bead-gekoppelter AK (EA-d280 und EA-d*) versetzt, die sich aus der in der
Literatur angegebenen Zahl der zu erwartenden isolierten Zellen [1x106 Zellen/10g Fezes (O’N EILL,
LOKTIONOV 1997)] sowie den Herstellerangaben (Dako Diagnostika GnmH, Hamburg; Dynal
Biotech GmbH, Hamburg) errechnete. Die Versuchsansätze wurden 15min auf Eis schüttelnd in
vertikaler Lage inkubiert und anschließend für 15min in einer auf Eis belassenen schüttelnden MPCVorrichtung platziert. Das die Verunreinigungen enthaltende Pellet wurde abpipettiert, der zellenthaltende Rest mit 5ml Fezesspülmedium versetzt und für 10min auf Eis schüttelnd inkubiert. Anschließend wurden die Versuchsansätze wieder in der MPC-Vorrichtung platziert, der Überstand dekantiert
und das an der Seite haftende Pellet in 2ml PBS(+ BSA) aufgenommen. Dieser Waschschritt wurde
noch zweimal wiederholt. Zum Abschluss wurde der Überstand in 500 µl PBS(+ BSA) aufgenommen
und bis zur Durchführung weiterer Versuche auf Eis aufbewahrt.
Für die in dieser Arbeit beschriebenen Zellwiederfindungsexperimente wurden 1-2x106 HT29cZellen bzw. humane periphere Lymphozyten mit der ersten Zugabe des Fezesspülmediums zu den
Fezesproben pipettiert. Nach Abschluss der Separation wurde die Wiederfindungsrate bestimmt. Die
Abb. 7 zeigt den chronologischen Ablauf der Zellisolierung aus Fezes.
Fezesgewinnung, Kühlung
Fezes mit Fezesspülmedium waschen
• für Quantifizierung der Zell-Wiederfindungsrate definierte Anzahl an
Zellen zur Fezesspülung hinzufügen
Zentrifugation der Fezesüberstände
Bead-gekoppelte AK mit Fezesspülung vereinigen und inkubieren
Fezesspülung in MPC platzieren und Überstand dekantieren,
Waschschritt 2-3 -mal wiederholen
Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung
• Wiederfindungsrate der zugegebenen Zellen bestimmen
Einbringung der isolierten Zelle n in nachfolgende
Testsysteme (z. B. CA)
Abbildung 7:
Schematische Darstellung der Zellisolierung aus Fezes
3.2.5.3
38
Immunomagnetische Zellisolierung aus Urin, Blut, Zellvollmedium
Die gleiche Vorgehensweise der immunomagnetischen Zellseparation wie aus Fezes wurde ebenfalls
für die Medien Urin, Blut und Zellvollmedium angewandt.
3.2.5.4
Zellisolierung aus Urin durch Zentrifugation
Der frisch gewonnen Urin wurde bei 400xg, 8min bei RT zentrifugiert, der Überstand abdekantiert
und das Pellet in 2ml PBS resuspendiert. Nach zweimaligem Wiederholen dieses Waschschrittes
wurde das Zellpellet in 1ml PBS aufgenommen, auf Eis platziert und die Zellzahl und Vitalität bestimmt.
3.2.5.5
Zellisolierung aus Mundspülproben
3.2.5.5.1
Filtration über 10µm-Filcons
Zur Separation oraler Leukozyten wurden die Mundspülproben nach der Filtration über 30µmFilcons auf 10µm-Filcons pipettiert, das Eluat auf Eis platziert und die Zellzahl, Vitalität sowie der
Anteil der verschiedenen Zellfraktionen mikroskopisch bestimmt.
3.2.5.5.2
Leukozytenisolation durch Dichtegradientenzentrifugation
3.2.5.5.2.1 Leukozytenisolation durch klassische Dichtegradientenzentrifugation
Die Isolation der oralen Leukozyten verlief ähnlich wie die Isolation der peripheren Blutlymphozyten. Nach der Gewinnung der Mundspülproben wurden diese zweimal in HBSS gewaschen und bei
400xg für 5min zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in 5ml Zellkulturmedium RPMI 1640
resuspendiert und 5ml Histopaque 1077 mit der Suspension überschichtet. Die nachfolgenden Schritte waren mit denen aus dem Abschnitt 3.2.2.4 identisch.
3.2.5.5.2.2 Leukozytenisolation durch Dichtegradientenzentrifugation mittels Leucosept-Kit
3ml Histopaque 1077 wurden in 15ml-Leucosept-Röhrchen (Greiner Bio-One, Frickenhausen)
pipettiert und bei RT für 30sec bei 1000xg zentrifugiert. 5ml der Mundspülprobe wurden auf die in
dem Röhrchen enthaltene Filterscheibe gegeben und 10min bei 100xg bei RT zentrifugiert. Anschließend wurden die separierten Zellen oberhalb der Filterscheibe mittels Pasteurpipette entnommen und mit PBS gewaschen (siehe Abschnitt 3.2.2.4 ).
3.2.5.5.3
39
Immunomagnetische Separation
Für die Separation oraler Epithelzellen wurden im Dynal-System die Bead-gekoppelten AK EA-d*,
EMA-d, ESA-d, CEA-d und im Macs-System der Bead-gekoppelte AK HEA-m angewandt. Die
Separation oraler Leukozyten erfolgte mittels CD45-d und CD45-d* im Dynal-System und durch
CD45-m im Macs-System. Die Vorbereitung der oralen Zellgemische erfolgte wie im Abschnitt
3.2.2.3 beschrieben. Die eingesetzte Menge an oralem Zellgemisch richtete sich nach der ursprünglichen, durch Mundspülung erhaltenen Zellmenge und differierte von Probe zu Probe. Ziel war es
jedoch, ca. 1x106 Zellen des Zielzelltyps einzusetzen. Die nachfolgend zugegebene Menge an AK
bzw. Beads wurde auf die jeweils eingesetzte Zellmenge berechnet. Die schon gekoppelten AK (EAd*, CD45-d*, HEA-m, CD45-m) wurden laut Produktbeschreibung mit PBS gewaschen und, wie in
den Abschnitten 3.2.5.1.1, 3.2.5.1.1.2 und 3.2.5.1.2 erläutert, angewandt. Die noch nicht gekoppelten
primären AK (EMA, ESA, CEA und CD45) wurden ohne vorherige Kopplung an die Beads zu der
Zellsuspension gegeben. Die eingesetzten Mengen an AK richteten sich nach den Angaben der
Hersteller. Falls keine Angaben vorlagen, wurden die primären AK in der Verdünnung 1:50 eingesetzt. Die Inkubationszeit betrug für den epithelialen AK im Macs-System 30min und für den leukozyten-spezifischen AK 15min. Bei der Verwendung des Dynal-Systems wurden die primären AK
20min mit der Zellsuspension inkubiert, bevor die gewaschenen Beads zugegeben wurden. Die
Inkubationszeit der addierten Beads betrug 20min. Die gekoppelten AK (EA-d* und CD45-d*)
verblieben 30min auf dem oralen Zellgemisch. Die gesamte Inkubation wurde bei 4°C im Kühlschrank oder auf Eis durchgeführt. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Zellsuspensionen
mittels MPC (Dynal) oder über Säulen (Macs) aufgetrennt. Die Zellzahl, die Vitalität, der Anteil der
verschiedenen Zellfraktionen sowie die Wiederfindungsraten wurden mittels TrypanblauAusschlusstest mikroskopisch bestimmt. Bis zur Durchführung sich anschließender Untersuchungen
wurden die Zellen auf Eis aufbewahrt.
3.2.6
Zellanfärbung und Präparation für die mikroskopische Betrachtung
Für die Fluoreszenzfärbung der Zellen wurde eine 1:1000-Verdünnung von Calcein AM in PBS,
eine 1:1000-Verdünnung von DAPI in PBS und eine 1:1000-Verdünnung von DAPI in Methanol
hergestellt. Die Anfärbung der Zellen mit Calcein stellt eine Lebendfärbung dar. Calcein ist ein
Acetoxymethylesterderivat (C46H46N2O23), das als ungeladenes Molekül die Zellmembran permeieren kann und in der Zelle von unspezifischen Esterasen an lipophilen Gruppen metabolisiert wird.
Dabei entsteht ein geladener Metabolit, der die Zellmembran weitaus langsamer verlassen kann und
unter UV-Anregung (Extinktion/Emission: 493/514nm) grün fluoresziert (PRODUKTBESCHREIBUNG
40
MOLECULAR PROBES 1996). DAPI, Diamidino 2-phenylindol, permeiert durch die Membran abgetöteter Zellen und reagiert danach mit der Zellkern-DNA. Am Fluoreszenzmikroskop sind dann unter
UV-Anregung (Extinktion/Emission: 345/455nm) blaue Kerne der toten Zellen sichtbar. Die Verdünnung von DAPI in Methanol dient dazu, lebende Zellen abzutöten, wohingegen mit einer Calcein/DAPI-Verdünnung in PBS lebende Zellen von toten nach der Zellisolierung unterschieden
werden können. Die Zellen wurden 1:2 mit der 1:1000-Verdünnung der Fluoreszenzfarbstoffe gemischt und für 15min im Kühlschrank inkubiert. Danach wurden von jedem Ansatz 50µl auf einen
OT pipettiert, mit einem Deckgläschen abgedeckt und mit Nagellack luftdicht verschlossen. Bis zur
fluoreszenzmikroskopischen Auswertung (AXIOLAB, Zeiss) wurden die OT kühl und dunkel
gelagert
3.2.7
Bestimmung des Histonacetylierungsstatus in oralen Zellen
Die Methode der Analyse der Histonacetylierung durch eine Säure-Harnstoff-Gel-Elektrophorese
(WU et al. 2001, YOSHIDA et al. 1990) wurde von Dipl. troph. JEANNETTE KIEFER etabliert.
In dieser Arbeit wurde die Detektion des Acetylierungsstatus des Nukleosomen-Histons H4 verfolgt.
Nicht acetyliertes H4 wurde mit H4/0 bezeichnet. Je nach Acetylierungsgrad wurden die Histone
H4/1 (einfach acetyliert) bis H4/4 (vierfach acetyliert) unterschieden, wobei höher acetyliertes H4
aufgrund seines höheren Molekulargewichtes langsamer als nicht acetyliertes H4 während der elektrophoretischen Auftrennung läuft.
Für die Bestimmung des Acetylierungsstatus des H4 wurden Mundspülproben verwendet, die, wie
im Abschnitt 3.2.2.3 beschrieben, gewonnen wurden. Eine Auftrennung der einzelnen Zellfraktionen
erfolgte nicht. Als Kontrollen wurden HT29c-Zellen mitgeführt.
Histone wurden durch Säurefällung aus dem Kern der buccalen Zellen isoliert. Dazu wurden die
Zellen in 1ml Lysepuffer aufgenommen, anschließend gestößelt, mittels Ultraschall homogenisiert
und für mindestens 1h bei 4°C lysiert. Im Anschluss wurden die Zellkerne bei 1000xg (10 min, 4°C)
abzentrifugiert und für mindestens 1h der Extraktion der säurelöslichen Proteine durch Zugabe der
Säure-Extraktionslösung unterzogen. Das Gemisch wurde bei 11000xg (10min, 4°C) abzentrifugiert,
der Überstand dekantiert, mit 1ml Aceton vereinigt und über Nacht bei -18°C inkubiert. Im Anschluss daran wurden die Proben nochmals bei 11000xg (10min, 4°C) zentrifugiert, der Überstand
verworfen, das Pellet bei RT getrocknet und eingefroren.
Vor dem Auftragen auf das Säure-Harnstoff-Gel wurden die Proben 5min bei 95°C denaturiert, in
100µl Probenpuffer gelöst und der Proteingehalt durch photometrische Detektion in Einwegküvetten
bestimmt.
41
Für die elektrophoretische Auftrennung wurde ein 20%iges Säure-Harnstoff- BisacrylamidGel (20x20/1,5mm) mit 20 Auftragtaschen gegossen, welches mindestens 45min polymerisiert wurde. Das Gel wurde in die Elektrophoresekammer eingebaut, Elektrophoresepuffer
aufgefüllt, die Gelkämme vorsichtig entfernt und die Auftragtaschen mit Elektrophoresepuffer gespült. Es erfolgte ein Vorlauf der Elektrophorese (>2h, 400V) unter Wasserkühlung. Die Auftragtaschen wurden abermals mit Elektrophoresepuffer gespült, 30µl Scavenge-Puffer je Tasche aufgetragen und >2h bei 400V elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurden die Taschen mit Elektrophoresepuffer gespült, der Elektrophoresepuffer
gewechselt und in jede Tasche 50µl Probenansatz mit ca. 12g Protein aufgetragen. Zur
Identifizierung wurde ein Histon-Standard mitgeführt, der Probenpuffer und ddH2 O in der
selben Konzentration wie die Proben enthielt. Eine kleine Menge Methylgrün wurde als
Farbmarker in jede Probe gegeben. Die Elektrophorese erfolgte bei 400V über 24h unter
Wasserkühlung mit umgekehrter Polung („Kathodische Page“).
Nach erfolgter Elektrophorese wurde das Gel aus der Vorrichtung entnommen, dreimal 5min mit
ddH2O gespült und >30min in Coomassie-Blue-Färbelösung leicht schüttelnd bei RT inkubiert. Die
Färbelösung wurde dekantiert, das Gel zweimal in ddH2O gespült und anschließend für 30min in der
Gel-Entfärbelösung schüttelnd platziert. Zum Schluss wurde das Gel 3-5-mal in leicht köchelndem
ddH2O in der Mikrowelle (600W, 4-5min) gespült. Die Detektion der Banden erfolgte colourimetrisch mittels Bildauswertungs-Software Quantity One.
3.2.8
Probanden und Studiendesign
3.2.8.1
Probanden außerhalb der Ernährungsinterventionsstudien
Für die Etablierung der angeführten Techniken sowie die Untersuchungen außerhalb der Ernährungsinterventionsstudien wurden Proben freiwilliger gesunder Probanden aus der Arbeitsgruppe des
Lehrstuhls „Ernährungstoxikologie“ der Friedrich-Schiller-Universität Jena verwendet.
3.2.8.2
Probanden und Design der Ernährungsinterventionsstudien
Die Ernährungsinterventionsstudie mit probiotischer Wurst, die Leinsaatstudie, die Phosphatstudie I
und II sowie die Brotstudie wurden am Lehrstuhl „Ernährungsphysiologie“ der Friedrich-SchillerUniversität Jena unter Leitung von Prof. Dr. Jahreis durchgeführt. Alle Studien wurden vor dem
Beginn von der Ethikkommission der Friedrich-Schiller-Universität geprüft und genehmigt.
3.2.8.2.1
42
Studie mit probiotischer Wurst
In die Ernährungsinterventionsstudie mit probiotischer Wurst wurden 10 männliche und 10 weibliche
gesunde freiwillige Probanden einbezogen. Alle Probanden durchliefen zwei Versuchsperioden,
wobei in der ersten 50g einer konventionellen Wurst und in der zweiten 50g einer probiotischen
Wurst mit vergleichbaren Basisdiäten aufgenommen wurden. Von 6 weiblichen und 8 männlichen
Probanden wurde das genotoxische Potential der FW untersucht. Nähere Informationen zu dieser
Studie sind im Anhang (A1 -Studie mit probiotischer Wurst-) dargestellt.
Die Isolation der FW aus dieser Studie, bei denen die zytotoxische und genotoxische Aktivität bestimmt wurde, erfolgte von Mitarbeitern des Lehrstuhls „Ernährungsphysiologie“ der FriedrichSchiller-Universität Jena.
Nach dem Verzehr der speziellen Wurst wurde die Fezes auf den Gehalt an Lactobacillus casei
untersucht. Die Klassifizierung der Fezesproben hinsichtlich der Keimzahl (KZ) erfolgte nach folgenden Kriterien:
Klassifizierung:
KZ sehr gut
KZ gut
KZ befriedigend
Keimzahl (KBE je g Fezes):
ca. 107
ca. 106
ca. 106, hohe Varianz
Detaillierte Informationen über die Keimzahlbestimmung der einzelnen Probanden unterhält der
Lehrstuhl „Ernährungsphysiologie“ unter Leitung von Prof. Dr. Jahreis.
3.2.8.2.2
Leinsaatstudie
Die Leinsaatstudie wurde konzipiert, um den Einfluss des Verzehrs von Leinsamen auf den Blutfettspiegel zu analysieren. Dazu verzehrten 8 hypercholesterämische Männer über vier Wochen täglich
200g Leinsaatbrot, das 40g Leinkuchen enthielt. Die FW-Genotoxizität wurde von 6 Probanden
dieser Studie detektiert. Weiterführende Angaben zu dieser Studie sowie Inhaltsangaben zu dem
eingesetzten Brot sind im Anhang (A2 -Leinsaatstudie-) aufgeführt.
3.2.8.2.3
Phosphatstudie I und II
An der Phosphatstudie I nahmen 10 gesunde Frauen und an der Phosphatstudie II 9 gesunde Männer
teil. In der Zulagenperiode wurden die Probanden mit ca. 1600mg Phosphor pro Tag über sechs
Wochen supplementiert. Genauere Angaben über das Studiendesign sowie die Zusammensetzung
der Supplemente werden im Anhang (A3 -Phospatstudie I und II-) erörtert.
43
Die Isolation der FW von den Probanden dieser Studien sowie die Bestimmung der Zyto- und Genotoxizität der FW erfolgte von MANUELA GRIMM im Rahmen ihrer Dissertation (GRIMM 2000).
3.2.8.2.4
Brotstudie
Ziel dieser Interventionsstudie war die Untersuchung von gesundheitsfördernden Wirkungen präbiotischer und antioxidativ wirksamer Nahrungsbestandteile an Rauchern und Nichtrauchern. Zu diesem
Zweck wurden zum einen präbiotische (PRÄ-Brot) und zum anderen präbiotische und antioxidativ
(PRÄ-AOX-Brot) wirksame Substanzen einem Brot zugemischt (Tab. A4, Anhang). Als Vergleich
diente ein Kontrollbrot ohne die spezifische Anreicherung. An den Untersuchungen der Mundschleimhautzellen beteiligten sich 9 Nichtraucher und 14 Raucher. In der Zulagenperiode erhielten 8
Raucher und 4 Nichtraucher das PRÄ-AOX-Brot und 6 Raucher und 5 Nichtraucher das PRÄ-Brot.
Detailliertere Ausführungen zum Studienverlauf und den Inhaltsangaben des Brotes werden im
Anhang (A4 -Brotstudie-) beschrieben.
3.2.9
Statistische Auswertung
Die Datenerfassung erfolgte mit dem Programm Microsoft Excel 7.0. Die Datenanalyse und die
statistische Auswertung wurden mit dem Programm Graph Pad Prism durchgeführt. Mit Ausnahme
der Messergebnisse aus den Ernährungsinterventionsstudien wurde jede Messung in mehreren unabhängigen Versuchen wiederholt. Aus den Werten für jeden Messansatz wurden die Mittelwerte
(MW) und Standardabweichungen (SD) berechnet und mit dem Programm Graph Pad Prism auf
statistisch signifikante Unterschiede mittels zweiseitig ungepaarten t-Test untersucht, soweit die
Daten den Voraussetzungen der t-Teststatistik (Normalverteilung, Gleichheit der Varianzen) genügten. Bei unterschiedlichen Varianzen wurde der t-Test mit der Korrektur nach Welch [(w) ] durchgeführt, der das unterschiedliche Varianzniveau der Versuchsreihen berücksichtigt (USER GUIDE
GRAPH PAD PRISM 1995). Als Signifikanzschwelle zwischen den Mittelwerten wurde p<0,05 unterstellt. Im Text wird das entsprechende Signifikanzniveau: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 angegeben. Die Analyse der Variationsbreite der Untersuchungen erfolgte mittels der Berechnung des
Variationskoeffizienten, der die prozentuale Abweichung der Ergebnisse vom Mittelwert verkörpert
(RAMM und HOFMANN 1987) und seinerseits und mittels t- Test auf statistische Signifikanz geprüft
wurde.
ERGEBNISSE
4
ERGEBNISSE
4.1
Fezeswasser als Biomarker des Effekts
4.1.1
Bestimmung der Zytotoxizität und Genotoxizität von
Fezeswasser ohne Ernährungsintervention
44
Die Bestimmung der Zytotoxizität und Genotoxizität von FW wurde an zwei unterschiedlichen
Zelltypen durchgeführt. Zum einen wurde die differenzierte Tumorzelllinie HT29c als Modell für
humane Dickdarmzellen ausgewählt und zum anderen isolierte periphere Lymphozyten als Modell
für primäre Zellen.
Alle 6 getesteten FW (viermal reproduziert), die jeweils von einer Entnahme pro Proband stammten,
erwiesen sich als nicht zytotoxisch. Somit wurde die Vitalität der HT29c-Zellen sowie der Lymphozyten durch die FW-Inkubation nicht beeinträchtigt und betrug 97,19±0,02% bzw. 96,89±0,02%.
Bei 5 der 6 FW wurde mittels CA eine Induktion von DNA-Strangbrüchen im Vergleich zur NaClKontrolle detektiert. Die Höhe der TI als Maß für die Genotoxizität war bei den unterschiedlichen
Versuchsteilnehmern sehr variabel und betrug im Mittel 8,77±1,80% bei den HT29c-Zellen und
10,37±3,43% bei den Lymphozyten.
Signifikante Unterschiede zwischen den Lymphozyten und den HT29c-Zellen konnten nicht beobachtet werden (Abb. 8).
Alle folgenden Versuche wurden ausschließlich an HT29c-Zellen durchgeführt, da keine Unterschiede zwischen diesen und den Lymphozyten beobachtet wurden. HT29c-Zellen als ursprüngliche
Kolonzellen haben für die zu untersuchenden Fragestellungen eine höhere Relevanz und sind in ihrer
Handhabung besser zu standardisieren.
Nachdem die Induktion von DNA-SB durch FW verschiedener Personen untersucht worden war und
erste Anhaltspunkte über die experimentelle Variationsbreite sowie die Sensitivität der HT29c-Zellen
als „Indikatororganismus“ in diesem Testsystem vorlagen, war es für die weitere Charakterisierung
des Biomarkers wichtig, die individuelle Variationsbreite zu bestimmen. Hierfür wurde das genotoxische Potential von FW, das über mehrere Tage von einer Person gesammelt wurde, bestimmt. Dazu
wurden FW-Proben über 6 Wochen hinweg (eine Probennahme wöchentlich) von einer männlichen
und einer weiblichen Person im CA auf die Fähigkeit, DNA-SB zu induzieren, untersucht.
Zytotoxische Effekte konnten auch bei diesem Versuchsansatz nicht detektiert werden. Die Vitalität
der Zellen nach der FW-Inkubation lag zwischen 92-98%.
ERGEBNISSE
45
Wie die Tab. 4 verdeutlicht, variierte der Grad der Genotoxizität in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der
Probennahme. Sowohl genotoxische als auch nicht genotoxische FW-Proben wurden von beiden
Geschlechtern isoliert und getestet.
20
TI (%)
15
10
5
0
FW 1
FW 2
FW 3
FW 4
FW 5
FW 6
Lymphozyten
HT29c-Zellen
Inkubation mit FW / NaCl
Abbildung 8:
NaCl
Genotoxische Effekte von 6 Fezeswässern von verschiedenen Personen (Nr. 1-6)
an HT29 clone 19A-Zellen und Lymphozyten
[Fezeswasser 1-3 we ibliche, Fezeswasser 4-6 männliche Probanden, jedes Fezeswasser
dreifach in 4 unabhängigen Versuchen getestet, MW±SD]
Tabelle 4:
Genotoxische Effekte von 6 verschiedenen Fezeswässern einer männlichen und
einer weiblichen Person an HT29 clone 19A-Zellen
[jedes Fezeswasser dreifach in 4 unabhängigen Versuchen getestet]
FW 1
FW 2
FW 3
FW 4
FW 5
FW 6
Wochenmittel
NaCl
TI (%) SB
männlich
TI (%) SB
weiblich
MW±SD, n=4
MW±SD, n=4
7,71±1,11
17,09±1,66
32,04±2,72
19,72±3,27
4,06±1,02
13,54±2,20
15,69±9,03
3,65±1,04
8,99±1,78
23,49±2,11
17,89±1,33
24,10±4,25
25,16±1,72
28,80±2,22
21,40±6,42
3,15±0,14
Die Inkubation der lysierten Zellen mit Endo III stellt eine Modifikation des CA zur Detektion oxidierter Pyrimidinbasen dar. Die Tab. 5 charakterisiert die genotoxischen Effekte zwei verschiedener
FW einer Person nach 45-minütiger Endo III-Inkubation. Das FW1 wirkte genotoxisch und der
Gehalt an oxidierten Pyrimidinbasen war signifikant höher als in der NaCl-Kontrolle. Demgegenüber
ERGEBNISSE
46
führte das FW2 zu keiner signifikanten Veränderung der DNA-SB und oxidierten Pyrimidinbasen.
Das verdeutlicht, dass nicht nur intraindividuelle Unterschiede hinsichtlich der DNA-SB-Raten,
sondern auch bezüglich des Levels an induzierbaren oxidierten Pyrimidinbasen durch FWInkubation detektierbar waren.
Tabelle 5:
Genotoxische Effekte zwei verschiedener Fezeswässer einer Person an HT29 clone
19A-Zellen nach Inkubation mit Endonuclease III
[jedes Fezeswasser dreifach in 4 unabhängigen Versuchen getestet, zweiseitig ungepaarter
t-Test]
FW 1
FW 2
NaCl
TI (%), SB
ohne Endo III-Inkubation
TI (%), SB
mit Endo III-Inkubation
MW±SD, n=4
MW±SD, n=4
17,04 ± 3,08
3,27±0,58
3,02±0,53
23,71±9,67 a
8,63±2,76
5,69±4,26 a
Mit Abschluss dieser ersten Versuche wurde davon ausgegangen, dass der CA mit der Inkubation
von FW als Testsystem zur Bestimmung des genotoxischen Potentials von FW geeignet ist. Damit
waren die Vorraussetzungen erarbeitet, diese Biomarker-Technik einzusetzen, um den Einfluss
verschiedener Ernährungsinterventionen auf das genotoxische Potential von FW zu überprüfen.
4.1.2
Bestimmung der Zytotoxizität und Genotoxizität von Fezeswasser aus Ernährungsinterventionsstudien als Biomarker des Effekts nach definierter Ernährungsexposition
Die Studie mit probiotischer Wurst und die Leinsaatstudie wurden vom Lehrstuhl
„Ernährungsphysiologie“ der Friedrich-Schiller-Universität Jena für spezifische Fragestellungen
konzipiert, die nicht vorrangig das Ziel hatten, die fäkale Genotoxizität zu modulieren. Für diese
Arbeit gewinnen die Untersuchungen aus den Studien aber insofern an Bedeutung, als dass unter
standardisierten Studienbedingungen die FW-Gewinnung möglich war.
4.1.2.1
Studie mit probiotischer Wurst
Exogene Ernährungsfaktoren modulieren die Fezesinhaltsstoffe, was zu einer Erhöhung oder Verminderung von toxischen oder kanzerogenen Risikofaktoren im FW führen kann. Die Versuche zur
Bestimmung des anti- bzw. genotoxischen Potentials des FW aus der Studie mit probiotischer Wurst
wurden ausschließlich an HT29c-Zellen durchgeführt. Die Vitalitäten der HT29c-Zellen wiesen
sowohl für die gesamte Probandengruppe als auch geschlechtsspezifisch keine signifikanten Unterschiede vor und nach der Inkubation mit FW auf. Zwischen den einzelnen Versuchsperioden waren
ERGEBNISSE
47
ebenfalls keine Unterschiede erkennbar. Die Vitalität betrug durchschnittlich >95% (Tab. 6). Durch
die Intervention mit probiotischer Wust wurde, das gesamte Probandenkollektiv betrachtend, keine
signifikante Modifikation der genotoxischen Wirkung der FW nachgewiesen. Weder die SB-Raten
noch der Anteil an oxidierten Pyrimidinbasen der DNA wurden durch den Verzehr probiotischer
Wurst beeinflusst (Tab. 6).
Tabelle 6:
Vitalität der HT29 clone 19A-Zellen nach Inkubation mit Fezeswasser aus der
Interventionsstudie mit probiotischer Wurst (6 männliche und 8 weibliche Probanden) und genotoxische Effekte der Fezeswässer mit und ohne Inkubation mit Endonuclease III
[jedes Fezeswasser dreifach in einem Versuch getestet]
Versuchsphase
vor Inkubation
ohne probiotische Wurst, 3. Tag
ohne probiotische Wurst, 9. Tag
mit probiotischer Wurst, 3. Tag
mit probiotischer Wurst, 9. Tag
NaCl-Kontrolle
TI (%), SB
Vitalität (%)
MW±SD, n=14
MW±SD,
ohne Endo III- mit Endo IIIn=14
Inkubation
Inkubation
95,60±0,02
96,78±0,02
9,21±8,22
20,34±11,01
96,85±0,00
8,58±6,83
23,66±20,78
96,98±0,01 12,68±13,67
21,65±15,20
96,84±0,02 13,00±15,78
22,97±16,80
96,34±0,02
5,13±0,86
11,80±2,26
Bedingt durch die großen Standardabweichungen bestanden keine signifikanten Unterschiede in der
genotoxische Wirkung der FW zwischen Männern und Frauen. Der Vergleich der verschiedenen
Interventionsphasen lässt erkennen, dass weder bei den weiblichen noch bei den männlichen Probanden die genotoxischen Wirkungen der FW auf die HT29c-Zellen durch den Verzehr von probiotischer Wurst signifikant beeinflusst wurden (Tab. 7).
Tabelle 7:
Genotoxische Effekte der Fezeswässer von männlichen und weiblichen Probanden
aus der Studie mit probiotischer Wurst an HT29 clone 19A-Zellen mit und ohne
Endonuclease III-Inkubation
[jedes Fezeswasser dreifach in einem Versuch getestet]
TI (%), SB
Versuchsphase
weiblich
MW±SD,
n=6
ohne probiotische Wurst, 3. Tag 11,10±11,48
ohne probiotische Wurst, 9. Tag 10,77±9,56
mit probiotischer Wurst, 3. Tag 16,84±17,09
mit probiotischer Wurst, 9. Tag 21,42±21,35
Kontrolle
4,88±0,98
männlich
MW±SD,
n=8
7,80±3,83
6,92±2,62
9,56±9,33
6,69±1,16
5,32±0,71
TI (%), SB
nach Endo III-Inkubation
weiblich
männlich
MW±SD,
MW±SD,
n=6
n=8
23,99±13,32 17,61±7,85
23,56±17,60 22,87±23,74
27,64±15,67 17,16±13,16
33,84±19,49 14,81±7,32
12,56±2,75 11,23±1,58
ERGEBNISSE
48
Die Abb. A2 und A3 (Anhang) stellen die Ergebnisse aus dem CA mit den FW der Probanden dar,
bei denen nach dem Verzehr der probiotischen Wurst >106KBE Lactobacillus casei je g Fezes
nachgewiesen wurden. Die bakteriologischen Untersuchungen der Fezes zeigten, daß nicht bei allen
Probanden probiotische Keime nach dem Verzehr der speziellen Wurst detektierbar waren. Eine
signifikante Veränderung der FW-Genotoxizität war auch bei Probanden mit >106KBE
Lactobacillus casei je g Fezes nicht zu beobachten.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der Verzehr von Wurst, welche mit dem Keim Lactobacillus casei angereichert war, zu keiner signifikanten Beeinflussung des genotoxischen Potentials
der FW führte.
Im Hinblick, dass von den Probanden während der Studie identische bzw. standardisierte Diäten
verkonsumiert wurden, gewinnen die Daten der Genotoxizitätsuntersuchungen der FW besondere
Bedeutung. Sie gehen in die Analyse der Untersuchung zur intraund interindividuellen Variationsbreite in Abhängigkeit von der Diät (Abschnitt 4.1.3.3) ein.
4.1.2.2
Leinsaatstudie
Die Genotoxizität der FW aus der Leinsaatstudie wurde ebenfalls an HT29c-Zellen untersucht. Die
30-minütige Inkubation mit FW beeinflusste die Vitalität der Zellen nicht. Sie betrug vor der Inkubation 96,06±0,01% (n=6) und nach der Inkubation mit FW 96.07±0,02% (n=6). Auch der Vergleich
der Vitalität der HT29c-Zellen nach der Inkubation mit FW aus den unterschiedlichen Versuchsphasen (vor Intervention: 95,68±0,02%; während Intervention: 96,48±0,02%; nach Intervention:
96,06±0,01%; jeweils n=6) ließ keine signifikanten Unterschiede erkennen.
Bei der Betrachtung der Genotoxizität der FW ist festzustellen, dass im Mittel alle FW ein höheres
Potential aufwiesen, DNA-SB zu induzieren, als die NaCl-Kontrolle. Sowohl während der Intervention mit Leinsaatbrot als auch nach dem Leinsaatbrotkonsum konnte eine signifikante Reduktion der
SB-Rate verzeichnet werden (Abb. 9). Das verdeutlicht, dass eine Modulation der FW-Genotoxizität
möglich war.
Die zusätzliche Inkubation der Zellen mit Endo III zeigte, dass die FW im Vergleich zur NaClKontrolle signifikant höhere Raten an oxidierten Pyrimidinbasen induzierten. Unterschiede zwischen
den Interventionsphasen wurden nicht beobachtet (Abb. 9).
Da die Probanden während der Studie ihre Verzehrsgewohnheiten beibehielten, gehen die Daten der
Untersuchungen in die Analyse der intraund interindividuellen Variationsbreite in Abhängigkeit
von der Diät (Abschnitt 4.1.3.3) ein .
ERGEBNISSE
49
80
a(*)
60
TI (%)
a, b
b(*)
40
20
0
vor Leinsaat
während Leinsaat
nach Leinsaat
Kontrolle
SB
FW aus unterschiedlichen Interventionsphasen
SB+oxidierte
Pyrimidinbasen
Abbildung 9:
Genotoxische Effekte der Fezeswässer von Probanden aus der Leinsaatstudie
[jedes Fezeswasser dreifach in einem Versuch getestet, MW±SD, n = 6, zweiseitig ungepaarter t-Test]
4.1.3
Intra- und interexperimentelle sowie -individuelle Variation der
Genotoxizität von Fezeswasser
Für die Vergleiche der intraund interexperimentellen sowie der intraund interindividuellen Variationsbreite der Genotoxizität von FW dienten die im Abschnitt 4.1.1 vorgestellten Ergebnisse. Folgendend wird die Versuchsgruppe, die aus 6 freiwilligen Probanden des Lehrstuhls „Ernährungstoxikologie“ bestand, als Laborgruppe bezeichnet. Für die Determination des Einflusses unterschiedlicher
Ernährungsweisen auf die Variation des genotoxischen Potentials von FW wurden die Ergebnisse
des Abschnitts 4.1.2 verarbeitet. In diese Darstellungen flossen die Resultate der Genotoxizitätsuntersuchungen der FW aus der Phosphatstudie I und II (Tab. A3, Anhang) mit ein, die von MANUELA
GRIMM im Rahmen ihrer Dissertation (GRIMM 2000) erzielt wurden.
4.1.3.1
Intra- und interexperimentelle Variation
Die Bestimmung der experimentellen Variationsbreite erfolgte aus den Absolutwerten TI (%) der
NaCl-Kontrolle und der sechs FW der Laborgruppe, wobei die intraexperimentelle Variationsbreite
sowohl für die Experimente mit Lymphozyten als auch für die mit HT29c-Zellen ermittelt wurde.
Die Abb. 10 charakterisiert die Variation von OT zu OT, wobei ein Punkt den Variationskoeffizient
von drei OT gleicher Behandlung eines Versuches symbolisiert. Der CA mit den Lymphozyten
wurde fünfmal, der mit den HT29c-Zellen viermal für jedes FW reproduziert. Es zeigte sich, dass die
intraexperimentelle Variationsbreite bei den Kulturzellen in der Tendenz geringer ist, was sich auf die
größere Homogenität der Zellen zurückführen lässt. Dieser Unterschied erwies sich jedoch als nicht
signifikant.
50
FW6
FW5
FW4
FW3
FW2
25
0
FW6
FW5
FW4
FW3
FW2
0
FW1
25
Intraexperimentelle Variation
HT29c-Zellen
FW1
50
75
NaCl
Intraexperimentelle Variation
Lymphozyten
Variationskoeffizient (%)
50
75
NaCl
ERGEBNISSE
Abbildung 10: Intraexperimentelle Variation der Objektträger im Comet-Assay nach Inkubation
der Lymphozyten und HT29 clone 19A-Zellen mit NaCl bzw. Fezeswasser sechs
unterschiedlicher Personen
[jedes Fezeswasser dreifach in 5 (Lymphozyten) bzw. 4 (HT29 clone 19A-Zellen) unabhängigen Versuchen getestet, Werte NaCl aus Dreifachbestimmung in 3 unabhängigen Ve rsuchen getestet]
Interexperimentelle Variation
75
50
6 FW/Ly:
FW/HT:
NaCl/Ly:
NaCl/HT:
6 verschiedene FW an Lymphozyten getestet
6 verschiedene FW an HT29c-Zellen getestet
NaCl an Lymphozyten getestet
NaCl an HT29c-Zellen getestet
25
0
6 FW/Ly
6 FW/HT
NaCl/Ly
NaCl/HT
Abbildung 11: Interexperimentelle Variation der Objektträger im Comet-Assay nach Inkubation
der Lymphozyten und HT29 clone 19A-Zellen mit NaCl bzw. Fezeswasser 6 ve rschiedener Personen
[jedes Fezeswasser dreifach in 5 (Lymphozyten) bzw. 4 (HT29 clone 19A-Zellen) unabhängigen Versuchen getestet, Werte NaCl aus Dreifachbestimmung in 5 bzw. 4 unabhängigen Versuchen getestet]
Die interexperimentelle Variation gibt an, inwieweit die Ergebnisse eines FW, das in mehreren
MGEs getestet wurde, untereinander differieren. Wie die Abb. 11 verdeutlicht, ist die interexperimentelle Variationsbreite im CA mit FW bei Lymphozyten und HT29c-Zellen ähnlich und liegt im Mittel
unter 20%. Vergleicht man die Variation innerhalb der NaCl-Kontrollen so stellt man fest, dass diese
sowohl bei den Lymphozyten als auch den Kulturzellen höher ist als bei der FW-Inkubation.
ERGEBNISSE
51
Der Vergleich der intraexperimentellen mit der interexperimentellen Variation verdeutlicht, dass sie
sich in ihrem Niveau nicht unterscheiden. Das ist von Bedeutung, wenn man aus einer Aufgabenstellung mehrere FW im CA testet, aber die Kapazität der Elektrophoreseeinheit die Durchführung
mehrerer MGE´s notwendig macht. Die Vergleichbarkeit der Effekte der FW ist dennoch gegeben.
4.1.3.2
Intra- und interindividuelle Variationsbreite im Vergleich mit der interexperimentellen Variation
Zur Bestimmung der interindividuellen Variationsbreite wurde der Variationskoeffizient von 6 FW
im CA in 5-facher Wiederholung mit Lymphozyten und 4-facher Wiederholung mit den Kulturzellen
berechnet. Jedes FW wurde in jeder Reproduktion dreifach getestet. Es zeigte sich, dass die interindi-
*
NaCl
0
intraexperimentelle Variation
interindividuelle Variation
Abbildung 12:
50
a(***)
a
25
0
FW
25
FW
a
HT29c-Zellen
FW
a(***)
50
75
NaCl
Lymphozyten
Variationskoenffizient (%)
75
FW
viduelle Variation signifikant größer ist als die interexperimentelle (Abb. 12).
interexperimentelle Variation
Intraexperimentelle, interexperimentelle und interindividuelle Variation von
NaCl und Fezeswasser bei Lymphozyten und HT29 clone 19A-Zellen
[zweiseitig ungepaarter t-Test]
Die Abb. 13 fasst die interexperimentelle Variationsbreite von 6 FW einer weiblichen und 6 FW
einer männlichen Person von 4 unabhängigen Versuchen mit HT29c-Zellen zusammen (Ergebnisse
Tab. 4). Die intraindividuelle Variation stellt die Variationsbreite der FW der jeweiligen Person über
die sechs Wochen der Probennahme dar. Wie die Tab. 4 erkennen lässt, variierte der Grad der Genotoxizität der 6 FW der zwei Probanden von stark genotoxisch [TI (%): >30 bei der männlichen Person, >25 bei der weiblichen Person] bis kaum genotoxisch [TI (%): <10]. Die Abb. 13 verdeutlicht
die Höhe dieser Variationsbreite quantitativ und vergleicht diesen mit der interexperimentellen Variation. Die experimentelle Variation ist in beiden Versuchsansätzen sehr gering, wohingegen die
intraindividuelle Variation signifikant höher ist. Die intraindividuelle Variation der Genotoxizität der
FW der weiblichen Person war signifikant geringer als die der männlichen Person.
ERGEBNISSE
52
100
intraindivduelle Variation
b, a(***)
75
intraindivduelle Variation
50
b(***)
a
25
b
0
männl.
männl.
weibl.
weibl.
Abbildung 13: Interexperimentelle und intraindividuelle Variation von 6 FW einer weiblichen
(weibl.) und einer männlichen (männl.) Person
4.1.3.3
Intra- und interindividuelle Variation in Abhängigkeit von der Diät
Um die intraund interindividuellen Unterschiede des genotoxischen Potentials von FW zu untersuchen, wurden vier verschiedene Probandengruppen miteinander verglichen. Zwei Probandengruppen, die Laborgruppe sowie die Probanden der Leinsaatstudie, behielten während der Versuchsdurchführung ihre gewöhnlichen Verzehrsgewohnheiten bei. Die Probanden der Phosphatstudie I
und II sowie die Versuchspersonen der Studie mit probiotischer Wurst konsumierten während des
Versuches gleiche Diäten, die nur mittels Kohlenhydrateinheiten in der Energiebilanz variiert wurden.
Der Verzehr standardisierter Diäten konnte den Variationskoeffizient der FW-Genotoxizität nicht
signifikant reduzieren. Alle Versuchsteilnehmer der Gruppen mit identischer bzw. unterschiedlicher
Diät betrachtend, wurde eine intraindividuelle Variation von 25,43±18,07% bzw. 36,04±22,05%
beobachtet [standardisierte Diät (n=23) versus unterschiedliche Diäten (n=8)].
Vergleicht man das Mittel der interindividuellen Variation der Probanden der Phosphatstudie I und II
mit dem Mittel der Laborgruppe bzw. dem der Probanden der Leinsaatstudie, lassen sich keine
Unterschiede feststellen (Abb. 14).
Der größte Grad der interindividuellen Variation wurde bei den Probanden der Studie mit probiotischer Wurst erzielt, wobei der Unterschied zu allen anderen Versuchsgruppen, außer zu der Phosphatstudie II, signifikant war. Wie die Abb. 14 zeigt, scheint die Ernährung unter den getesteten
Voraussetzungen keinen Einfluss auf die interindividuelle Variationsbreite der Genotoxizität von FW
eines Probandenkollektivs auszuüben.
ERGEBNISSE
53
Laborgruppe
Phosphatstudie I
Phosphatstudie II
Studie mit probiotische Wurst
Leinsaatstudie
150
a(*)
125
100
a
75
a
a
50
25
0
verschieden
gleich
gleich
gleich
verschieden
Diät
Abbildung 14: Einfluss der Ernährung auf den Grad der intraindividuellen Variation
4.1.3.4
Zusammenfassende Darstellung
Anhand der Ergebnisse aus den Abschnitten 4.1.3.1 bis 4.1.3.3 kann folgendes festgestellt werden:
⇒
intraexperimentelle Variation
=
⇒
<
intraindividuelle Variation
⇒
intraindividuelle Variation
=
⇒
ohne standardisierte Diät
=
mit standardisierter Diät
Die Ergebnisse der intraexperimentellen und interexperimentellen Variation verdeutlichen die gute
Reproduzierbarkeit der Genotoxizitätsuntersuchungen von FW im CA.
4.2
Abgeschilferte humane Zellen als Quelle für Biomarkeruntersuchungen
Für humane Interventionsstudien ist es sinnvoll, über Techniken zu verfügen, die es erlauben, an
Zielzellen der Karzinogenese die Modulation molekularer Mechanismen zu untersuchen. Eine Möglichkeit hierfür besteht in der Verwendung abgestoßener Primärzellen aus verschiedenen Geweben,
wie Harnblase, Dickdarm oder Mundhöhle.
ERGEBNISSE
4.2.1
54
Zellisolierung aus Fezes
Die Isolation der Kolonozyten und Leukozyten aus Fezes sollte mit magnetisch gekoppelten AK
erfolgen (O’N EILL und LOKTIONOV 1997), die humane epitheliale bzw. leukozyten-spezifische
Antigene auf der Zelloberfläche erkennen.
Die Zellisolationsversuche aus Fezes erfolgten mit der im Abschnitt 3.2.5.2 dargestellten Isolationstechnik. Falls nicht auf anderes verwiesen, wurde in allen nachfolgenden Versuchen für die Isolation
der Epithelzellen der AK EA-d* und für die Isolation der Lymphozyten der AK CD45-d* verwendet.
In allen Versuchen, die jeweils dreimal reproduziert wurden, konnten keine epithelialen und auch
keine leukozytären Zellen quantitativ nachgewiesen werden. Daraufhin wurde die Versuchsdurchführung mehrmals variiert und optimiert. Modifikationen der immunomagnetischen Zellseparation
aus Fezes waren:
⇒ Versuchsdurchführung mit und ohne Borsäure
⇒ Einsatz von Dithiothreitol
⇒ Zugabe von Guajacol und N-Acetycystein zum Fezesspülmedium
⇒ Verwendung von Fezes älterer Probanden
⇒ Verwendung von Fezes fester Konsistenz
⇒ Verlängerung der Kühlung der Fezes
⇒ Verlängerung der Spülzeit der Fezes
Borsäure sollte in dem System dazu dienen, schwerere und größere Fezesschwebeteilchen, die durch
die Waschprozedur mit in das Fezesspülmedium gelangten, fester im Pellet zu halten als die Zellen.
Eine Variation der Menge an Borsäure führte aber zu keiner Verbesserung der Ausbeute an primären
Zellen. Auch der Einsatz von Dithiothreitol (C4 H10O2S2) zum Schutz oxidationsempfindlicher Proteine und zur Reduktion von Disulfidverbindungen und die Anwendung von Guajacol, bekannt als
Expektorantium, erhöhte die Zellausbeute nicht. Nach mündlicher Mitteilung von ROISIN HUGHES
(1999) (ehemalige Mitarbeiterin der Arbeitsgruppe von O’N EILL und LOKTIONOV) wurde die Isolierungstechnik nochmals in einigen Details verändert. So wurde auf Fezes älterer Probanden (>58
Jahre) zurückgegriffen, bei denen die Abschilferungsrate an Zellen höher sein soll. Es wurde nur
noch Fezes mit einer festeren Konsistenz und intakten Oberfläche verwendet. Die Transitzeiten vom
Probanden zum Labor wurden bestmöglich verkürzt, um die Fezes so frisch wie möglich zu untersuchen. Die Variation der Kühl- und Spülzeiten der Fezes erbrachte ebenfalls keinen Erfolg. Bestenfalls
konnten unspezifische Schleimkonglomerate isoliert und fluoreszenzmikroskopisch betrachtet werden. Ein qualitativer Zellnachweis mit der DAPI-Kernfärbung gelang nicht.
ERGEBNISSE
55
Um das Vorhandensein intakter Zellstrukturen nachzuweisen, wurden mehrfach vor der Zellisolation
Fezesabdrücke auf angeraute OT getätigt, die anschließend mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI
gefärbt und ausgewertet wurden. Nicht auf jedem Abdruck wurden Zellen nachgewiesen. Der optische Eindruck der geringen bzw. vereinzelten Zellausbeute nach dem Fezesabdruck machte es zwingend, nicht nur einen Abdruck zu erstellen, sondern die Fezesoberfläche abzukratzen und diesen
Schab auf die OT aufzubringen und zu analysieren. Dabei wurden Zellen eindeutig qualitativ nachgewiesen. Die Abb. 15 zeigt einen solchen Abdruck bzw. Abschab einer Fezesoberfläche, der anschließend mit DAPI angefärbt wurde.
Abbildung 15: Fezesabdruck mit DAPI-Färbung vom 04.02.1999 [400xVergrößerung]
4.2.1.1
Zellwiederfindungsraten aus Fezes
Die erzielten Ergebnisse erforderten eine grundlegende Klärung der Möglichkeit der Isolation von
Zellen aus Fezes. Durch Zugabe von HT29c-Zellen und Lymphozyten sollte eruiert werden, ob die
Antigen-AK-Reaktion durch die Anwesenheit von Fezes beeinflusst bzw. gestört wird. Der Einfluss
unterschiedlicher Medien (Fezesspülmedium, Zellmedium, Urin, Blut) auf die Antigen-AK-Reaktion
und damit auf die immunomagnetische Zellseparation sowie die Empfindlichkeit der zwei verschiedenen Zelltypen (HT29c-Zellen und Lymphozyten) wurde ebenfalls mit den nachfolgenden Versuchsdurchführungen untersucht. Die Beeinflussung der Zellrückgewinnung durch die Zugabe bzw.
den Verzicht auf Borsäure während der Isolation wurde ebenfalls determiniert.
In vierfach reproduzierten Versuchen wurden Parallelansätze mit der Zugabe von 1x106 Lymphozyten und HT29c-Zellen mitgeführt und die Zellwiederfindung nach der Isolationsprozedur quantifiziert. Die Abb. 16 zeigt HT29c-Zellen, die nach der Fezeswäsche mittels Bead-gekoppelter AK
zurückgewonnen wurden.
ERGEBNISSE
56
DAPI
400xVergrößerung
DAPI
1000xVergrößerung
Durchlicht / DAPI
1000xVergrößerung
Abbildung 16: Aus Fezes zurückisolierte HT29 clone 19A-Zellen vom 26.02.1999
Die Untersuchungen, welche in Tab. 8 detailliert aufgeführt sind, zeigten, dass mit dieser Technik
qualitativ und quantitativ weder abgeschilferten Kolonozyten noch Lymphozyten nachweisbar
waren.
In den Untersuchungen wurde deutlich, dass mit dem Zusatz von Borsäure die Wiederfindung der
Zellen sank (von 20,63±3,12% auf 2,96±3,16% bei HT29c-Zellen, von 1,35±1,26% auf 0,15±0,30%
bei aufgetauten Lymphozyten und von 3,51±1,68% auf 0,00% bei frisch isolierten Lymphozyten).
Frisch isolierte Lymphozyten wurden als Vergleichsmodell eingesetzt, um schädigende Einflüsse der
Lagerungs- bzw. Auftauprozedur auf die Antigenoberfläche der Zellen auszuschließen. Doch auch
der Einsatz frisch isolierter Lymphozyten konnte die Wiederfindungsrate nicht erhöhen. Die
Wiederfindungsrate der Lymphozyten war signifikant geringer als die der HT29c-Zellen. Die
eingesetzten Beads wurden zu 60,03±8,37% wiedergefunden.
Tabelle 8:
Wiederfindungsrate zugesetzter HT29 clone 19A-Zellen und Lymphozyten nach
der Zellisolierung aus Fezes
Fezeswäsche mit bzw. ohne Zugabe von:
n
HT29c-Zellen+Borsäure
aufgetauten Lymphozyten+Borsäure
frisch isolierten Lymphozyten+Borsäure
HT29c-Zellen
aufgetauten Lymphozyten
frisch isolierten Lymphozyten
keine Zellzugabe/reine Fezeswäsche
Wiederfindungsrate Beads
4
4
4
4
4
4
12
12
Wiederfindungsrate
MW
SD
2,96
3,16
0,15
0,30
0,00
0,00
20,63
3,12
1,35
1,21
3,51
1,68
0,00
0,00
60,03
8,37
p
a
a(**), b, c
b(***)
c(***)
ERGEBNISSE
57
Aufgrund der vorliegenden Datenlage war es für weiterführende Untersuchungen wichtig, den
Einfluss des Isolationsmilieus, also des Mediums in dem die Antigen-AK-Reaktion stattfindet, auf
die Wiederfindungsraten der Zellen zu bestimmen.
4.2.1.2
Zellwiederfindungsraten aus Zellvollmedium, Urin, Vollblut
Der Vermutung nachgehend, dass das Fezesspülmedium nach der Fezeswäsche toxische Substanzen
enthält, die die Bindungseigenschaften der Oberflächenproteine an die AK beeinflussen, wurden die
folgenden Versuche zur immunomagnetischen Zellseparation in den Medien Blut, Urin und Zellvollmedium durchgeführt.
Um den Einfluss der Lagerung und des Auftauens der Lymphozyten zu untersuchen, wurden einerseits aufgetaute und andererseits frisch isolierte Lymphozyten eingesetzt. Bei aufgetauten Lymphozyten betrug die Rückgewinnungsrate mittels Bead-gekoppelter AK aus Zellvollmedium
10,08±11,24%. Eine deutliche Erhöhung der zurückgewonnen Zellen wurde durch den Einsatz von
frisch isolierten Lymphozyten erzielt, bei denen die Rückgewinnungsrate über 50% betrug (Abb. 17).
Eine signifikant höhere Isolationsrate an Lymphozyten von 70,81±5,02% wurde beobachtet, wenn
die adäquate Menge an Bead-gekoppelten AK direkt in die Blutprobe, die die gleiche Anzahl an
Lymphozyten enthielt, wie dem Medium zugesetzt wurde, pipettiert wurde. Die Zellisolationsrate lag
bei dieser Methodik über der Rückgewinnungsrate der HT29c-Zellen aus Medium (61,39±7,39%),
wobei der Unterschied nicht signifikant war (Abb. 17).
[f.Ly]:
[a.Ly]:
[f.Ly/Vbl]:
[HT]:
100
90
Wiederfindung
Wiederfindung
Wiederfindung
Wiederfindung
frisch isolierter Blut-Lymphozyten aus Medium mit CD45-d*
aufgetauter Blut-Lymphozyten aus Medium mit CD45-d*
von frischen Blut-Lymphozyten aus Vollblut mit CD45-d*
von HT29c-Zellen aus Medium mit EA-d*
a(**)
Wiederfindung (%)
80
70
a,b
60
50
40
b(***)
30
20
10
0
[f.Ly]
[a.Ly]
[f.Ly/Vbl]
[HT29c]
Zelltyp
Abbildung 17: Wiederfindung von Lymphozyten und HT29 clone 19A-Zellen aus Zellvollmedium
und Vollblut
ERGEBNISSE
58
Bei der Betrachtung der Wiederfindungsraten der zugesetzten Lymphozyten und HT29c-Zellen aus
Urin (Abb. 18) stellt man fest, dass die Lymphozyten weitaus schwerer an die AK binden als die
Kulturzellen. Dieser Unterschied war signifikant. Die Vitalität sank bei beiden Zellpopulationen unter
40% und war damit nach der Isolation signifikant geringer als vor der Isolation.
Ein deutlicher Effekt zeigt sich beim Vergleich der Rückgewinnungsraten der HT29c-Zellen aus
Zellvollmedium (Abb. 17) und Urin (Abb. 18). Aus Urin waren deutlich weniger Kulturzellen
(28,93±15,16%, n=4) zurückgewinnbar als aus Zellvollmedium (61,39±7,39%, n=4). Die Vitalität
der zugesetzten HT29c-Zellen sank während der Isolation aus Urin von 93,50±5,14% (n=4) auf
27,71±25,74% (n=4). Dieser Unterschied war signifikant (p<0,05, zweiseitig ungepaarter t-Test). Die
Vitalität der Lymphozyten reduzierte sich ebenfalls signifikant (p<0,05, zweiseitig ungepaarter tTest) von 95,42±1,25% (n=4) auf 24,36±27,74% (n=4). Dieses Resultate verweisen darauf, dass das
verwendete Medium, in dem die Zellisolation stattfindet, einen Einfluss auf den Erfolg der immunomagnetischen Zellisolation ausübt.
50
Wiederfindung (%)
a(*)
[HT29c]: HT29 clone 19A-Zellen
[Ly]:
aufgetaute Lymphozyten
40
30
20
a
10
0
[HT29c]
[Ly]
Zelltyp
Abbildung 18: Wiederfindungsrate von HT29 clone 19A-Zellen und Lymphozyten nach immunomagnetischer Separation aus Urin
Die Abb. 19 fasst die Ergebnisse zurückgewonnener Zellen aus Medium zusammen, wobei die
Zellen vorher einer Lebendfärbung mit CalceinPBS bzw. einer Todfärbung mit DAPIMethanol unterzogen wurden, um den Einfluss der Vitalität der Zellen zu untersuchen. Bei beiden Zelltypen wurden
nach der Lebendfärbung und anschließender immunomagnetischer Separation signifikant höhere
Wiederfindungsraten erzielt, als nach der Todfärbung der Zellen. Die Wiederfindungsrate der
ERGEBNISSE
59
HT29c-Zellen nach der Lebendfärbung war signifikant höher als bei den Lymphozyten nach der
Lebendfärbung.
b, c(**)
100
a, b(*)
c
75
Wiederfindung (%)
a(***)
50
[Ly/DAPI]: Todfärbung der Lymphozyten
mit DAPI+Methanol
[Ly/Calc]: Lebendfärbung der Lymphozyten
mit Calcein+PBS
[HT/Calc]: Lebendfärbung der HT29 clone 19A-Zellen
mit Calcein+PBS
[HT/DAPI]: Todfärbung der HT29 clone 19A-Zellen
mit DAPI+Methanol
25
0
[Ly/DAPI]
[Ly/Calc]
[HT29c/Calc] [HT29c/DAPI]
Zelltypen / Fluoreszenzfärbung
Abbildung 19: Wiederfindung von Lymphozyten und HT29 clone 19A-Zellen nach immunomagnetischer Selektion nach Tod- bzw. Lebendfärbung
In einem letzten Versuchsansatz zu dieser Fragestellung sollte geprüft werden, wie die Zellrückgewinnungsrate moduliert wird, wenn die Selektion der Zellen positiv (durch Bindung der Zellen an die
Bead-gekoppelten AK) bzw. negativ (durch Depletion der anderen Zellpopulation mittels Beadgekoppelter AK) erfolgt. Dazu wurde Zellvollmedium mit jeweils 1x106 HT29c-Zellen und Lymphozyten versetzt. Die HT29c-Zellen wurden dabei mittels EA-d* und EA-d280 isoliert, um in diesem
letzten Versuch einen AK einer anderen Firma zu testen.
Bei beiden Zellpopulationen wurden durch die jeweilige negative Selektion nicht signifikant höhere
Wiederfindungsraten erzielt (HT29c: 71,18±24,59% (n=3) mit EA-d* und 74,798±25,96% (n=3) mit
EA-d280 versus 86,18±10,76% (n=3) durch negative Selektion, Lymphozyten: 60,85±19,846% (n=3)
mit CD45-d* versus 81,88±10,85% (n=6) durch negative Selektion). Der Einsatz der unterschiedlichen AK bei den HT29c-Zellen zeigte im Hinblick auf die Rückgewinnungsraten keinen Effekt.
ERGEBNISSE
4.2.1.3
60
Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der Zellisolationsvers uche
aus Fezes, Zellvollmedium, Urin, Vollblut
Aus den in den Abschnitten 4.2.1, 4.2.1.1 und 4.2.1.2 ermittelten Daten lassen folgende Aussagen
treffen:
1. Aus Fezes konnten mittels bead-gekoppelter AK keine primären Zellen isoliert werden.
2. Im Fezes waren intakte abgeschilferte Zellen vorhanden, deren Quantität durch Fezesabdrücke
als gering eingeschätzt wurde.
3. Dem Fezes zugesetzte Zellen wurden erfolgreich zurückisoliert.
4. Das Medium für die Isolation sowie die Zellpopulation spielten eine bedeutende Rolle für die
Bindung der AK an die Zelloberfläche.
5. Im Zellvollmedium konnten die höchsten Zellwiederfindungsraten registriert werden, wohingegen sie im Urin und Fezes am niedrigsten ausfielen.
6. Lymphozyten reagierten in diesem Versuchssystem empfindlicher als HT29c-Zellen.
7. Unterschiedliche AK brachten keine nennenswerte Erfolgssteigerung hinsichtlich der Rückgewinnungsrate.
8. Die Vitalität der Zellen hatte einen Einfluss auf die Wiederfindungsraten der Zellen.
4.2.2
Abgeschilferte Urothelzellen aus Urin
Aus frischem Urin waren durch Zentrifugation mit anschließender mikroskopischer Zellzählung durchschnittlich 0,31±0,034x105 Zellen von 5 weiblichen Probanden und
0,045±0,004x105 Zellen von 6 männlichen Probanden je ml Urin isolierbar (Abb. 20). Die
Vitalität der Zellen betrug bei den weiblichen Probanden 32,50±13,17% und 71,38±4,86%
bei den männlichen Probanden. Der Unterschied in der Vitalität der Zellen zwischen beiden Geschlechtern war signifikant (p<0,01(w) , zweiseitig ungepaarter t- Test). Aus Urin
ließen sich durch Zentrifugation abgeschilferte Urothelzellen isolieren (Abb. 21), deren
Quantität und Qualität aber individuell sehr heterogen waren. Im Gegensatz dazu konnten
keine urothelialen Zellen durch Bead-gekoppelte epitheliale und leukozyten-spezifische
AK aus Urin isoliert werden.
ERGEBNISSE
61
1000000
Proband 1-5:
Proband 6-11:
weiblich
männlich
Zellen / ml Urin
100000
10000
1000
100
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Probanden
Abbildung 20:
Ausbeute von isolierten Urothelzellen aus Urin von 5 weiblichen und 6 männlichen
Probanden
Durchlicht/DAPI,
1000xVergrößerung,
Durchlicht/DAPI,
Durchlicht/DAPI,
männlicher Proband
männlicher Proband
weiblicher Proband
Durchlicht/DAPI,
400xVergrößerung,
weiblicher Proband
Abbildung 21: Abgeschilferte Urothelzellen vom 11.01.2000
4.2.3
Abgeschilferte orale Zellen aus Mundspülproben
4.2.3.1
Art, Ausbeute und Vitalität der oralen Zellen
Ziel dieser Untersuchungen war es, die inter- und intraindividuellen Unterschiede der einzelnen
Zellpopulationen in Mundspülungen zu bestimmen.
Sowohl Erythrozyten als auch Fibroblasten konnten in Mundspülungen mit Stimulation der Wangeninnenseiten nachgewiesen werden, wobei sich ihr Vorkommen als extrem selten und nur bei sehr
ERGEBNISSE
62
eruptiven Isolationstechniken erwies. Erythrozyten wurden anhand der charakteristischen Morphologie während der Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung identifiziert. Die Fibroblasten wurden mit dem
spezifischen Fibroblasten-AK clone AS02 determiniert. Ein Nachweis mit anschließender Fluoreszenzfärbung mit Red Orange CyTM3 gelang nicht. Lediglich durch die Kopplung des primären AK an
paramagnetische Beads konnten in einigen wenigen Proben Fibroblasten identifiziert werden (Abb.
22), wobei der Prozentsatz <1% betrug. Der Prozentsatz an Erythrozyten lag bei einer sanften Stimulation der Oralmukosa ebenfalls unter 1%.
Abgeschilferte Epithelzellen und Leukozyten (Abb. 22) stellten die dominanten Zellfraktionen in
Mundspülproben dar.
Kern einer
Epithelze lle
Leukozyt
Erythrozyt
400xVergrößerung
Durchlicht/DAPI,
Bead-gekoppelter oraler Fibroblast
400xVergrößerung,
Durchlicht,
verschiedene orale Zelltypen
Abbildung 22: Abgeschilferte orale Zellen vom 10.10.2001 und 30.10.2001
Die intraund interindividuelle Variationsbreite der Anzahl an Epithelzellen und Leukozyten differierte erheblich. Die Abb. 23 illustriert den Gehalt an abgeschilferten Zellen in Mundspülungen von 4
verschiedenen Probanden. Mit Ausnahme von Proband 4 lag der durchschnittliche Gehalt an Epithelzellen und Leukozyten bei weniger als 5x106 Zellen. Im Mittel wurden 3,45±1,47x106 Epithelzellen und 3,74±2,66x106 Leukozyten (MW±SD, n=29) aus Mundspülungen isoliert.
Der Koeffizient der intraund interindividuellen Variation der Ausbeute der abgeschilferten oralen
Zellen wies keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Zelltypen auf. Der intraindividuelle Variationskoeffizient betrug 36,57±24,40% bei den Epithelzellen und 30,10±15,44% bei den
Leukozyten (MW±SD, n=4). Der interindividuelle Variationskoeffizient belief sich auf
28,43±16,86% bei den Epithelzellen und 50,56±33,25% bei den Leukozyten (MW±SD, n=12).
ERGEBNISSE
63
15
Epithelzellen
6
Zellzahl (x10 )
Leukozyten
10
5
0
1
2
Probanden
4
3
Abbildung 23: Gehalt an oralen Epithelzellen und Leukozyten in Mundspülungen von 4 Probanden
Tabelle 9:
Anteil oraler Epithelzellen und Leukozyten von 4 Probanden
Probanden
1
2
3
4
Epithelzellen (%)
MW±SD; (n)
49,84±7,60; (11)
51,35±13,83; (11)
47,95±10,64; (2)
35,32±2,72; (3) a(***)
Leukozyten (%)
MW±SD; (n)
50,16±7,60; (11)
48,63±13,81; (11)
52,15±10,77; (2)
64,68±2,72; (3) a
Der durchschnittliche Anteil an Epithelzellen und Leukozyten variierte und betrug ca. 50%
(Tab. 9), mit Ausnahme von Proband 4.
Die Vitalität der Epithelzellen der 4 Probanden lag im Durchschnitt unter 7% (mit Ausnahme des
Probanden 3 mit 13,5%). Die durchschnittliche Vitalität der oralen Leukozyten belief sich auf >90%
(Abb. 24).
ERGEBNISSE
64
Epithelzellen
Leukozyten
a(***)
b(***)
d(***)
c(***)
100
Vitalität [%]
75
50
25
a
c
b
d
0
2
1
3
4
Probanden
Abbildung 24: Vitalität oraler Epithelzellen und Leukozyten von 4 Probanden
4.2.3.2
Auftrennung der Zellfraktionen der Mundspülproben
Im Vorfeld der Versuche zur Separation der einzelnen Zellfraktionen aus Mundspülproben wurden
die ursprünglichen Gehalte an Epithelzellen und Leukozyten bestimmt. Die Wiederfindungsrate der
Zellen wurde durch Zellzählung nach Beendigung der Isolation bestimmt.
4.2.3.2.1
Immunomagnetische Separation oraler Zellen
Die positive Selektion abgeschilferter oraler Epithelzellen mittels spezifischer epithelialer AK gelang
weder mit dem Isolationssystem von Dynal noch mit dem von Macs. Die Tab. 10 fasst zusammen,
dass keiner der applizierten epithelialen AK (EA-d, HEA-m, EMA-d, CEA-d, ESA-d) spezifisch an
orale Epithelzellen gebunden hat. Die sehr geringen Wiederfindungsraten beim Einsatz der AK
EMA-d und ESA-d beruhen auf einer unspezifischen Trennung, bei der die Zellen nicht spezifisch an
Beads gebunden waren. HT29c-Zellen wurden als Kontrolle in allen Isolationssystemen mit epithelialen AK mitgeführt. Sie wurden spezifisch durch die AK HEA-m, EA-d, CEA-d und ESA-d separiert. Die Wiederfindungsraten (MW±SD, n=1; 4; 3; 3) betrugen 49,89% mit HEA-m,
55,25±13,83% mit EA-d, 1,87±1,83% mit CEA-d und 42,53±20,94% mit ESA-d (Tab. 10).
Die Isolation oraler Leukozyten aus Mundspülproben durch den leukozytenspezifischen AK CD45
wurde erfolgreich praktiziert (Tab. 10). Die Wiederfindungsraten betrugen (MW±SD, n=16; 6; 13)
37,23±13,33% bei der Separation mit CD45-d*, 20,51±3,53% mit CD45-d (beides Dynal-System)
und 35,44±16,90% mit CD45-m (Macs-System). Die Wiederfindung der Epithelzellen (unspezifisch
in der Leukozytenfraktion) betrug mit CD45-d* 2,73±3,02%, mit CD45-d 0,0% und mit CD45-m
ERGEBNISSE
65
24,31±14,50%. Damit wurde durch die Verwendung des Dynal-Systems die höchste Homogenität
der Zellisolate erzielt.
Tabelle 10:
Wiederfindung oraler Epithelzellen, Leukozyten und HT29 clone 19A-Zellen mit
Bead-gekoppelten Antikörpern
Separation mit
eingesetzte
epithelialen AK
Epithelzelle HT29c-Zellen
(%)
(%)
MW±SD; (n) MW±SD; (n)
HEA-m
EA-d
EMA-d
CEA-d
ESA-d
CD45-d*
CD45-d
CD45-m
4.2.3.2.2
0,14±0,20; (2)
0,12±0,28; (6)
1,63±2,52; (8)
0,28±0,45; (6)
1,46±1,35; (6)
Separation mit
Leukozyten-AK
Leukozyten
Epithelzellen
(%)
(unspezifisch)
(%)
MW±SD; (n)
MW±SD; (n)
49,89±0,00; (1)
55,25±13,87; (4)
0,25±0,50; (4)
1,87±1,80; (3)
42,56±20,94; (3)
37,23±13,33; (16)
20,51±3,53; (6)
35,44±16,90; (13)
2,73±3,02; (16)
0,00±0,00; (6)
24,131±14,50; (18)
Separation oraler Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation
Neben der antikörpervermittelten Zellisolierung stellt die DG eine geeignete Methode dar, Zellen
unterschiedlicher Dichte voneinander zu trennen. In den angeführten Untersuchungen wurde neben
der klassischen DG auch die DG mittels Leucosept-Kit (Leu) praktiziert. Die Anwendung dieses
speziellen Kits sollte der Vereinfachung des Isolationsverfahrens dienen.
Durch die klassische DG wurden 0,86±1,61x106 (Minimum: 0,05x106; Maximum 7,2x106;
MW±SD, n=24) Leukozyten isoliert. Die Wiederfindungsrate der Leukozyten betrug 21,50±16.54%,
die der Epithelzellen 1,68±1,60% (MW±SD, n=24) (Tab. 11).
Durch die Verwendung des Leukosept-Kits zur Zellseparation erfolgte keine Anreicherung der
Leukozytenfraktion (Abb. 25). Im Gegensatz zu der klassischen DG wurde keine Depletion der
Epithelzellen durch diese Isolationstechnik erreicht. Mit 49,99±9,66% Epithelzellen und
48,84±0,69% Leukozyten (MW±SD, n=3) war das Verhältnis im Isolat nahezu gleich zum Ausgangsniveau. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate (MW±SD, n=3) betrug für Epithelzellen
61,56±33,97% und für die Leukozyten 36,57±10,76%.
ERGEBNISSE
66
Durch die klassische DG wurde der Prozentsatz an Leukozyten signifikant auf 94,42±4,32% gegenüber den Epithelzellen (5,51±4,36 %) (MW±SD, n=24) erhöht (Abb. 25).
a, b
100
90
(e)Di:
Epithelzellen nach DG
(l)Di:
Leukozyten nach DG
(e)Leu:
Epithelzellen nach DG mit Leu
(l)Leu:
Leukozyten nach DG mit Leu
80
Zellanteil (%)
70
w
( w)
c (*( ) )
b( * )
60
50
40
30
a(***), c
20
10
0
(e)DG
(l)DG
(l)Leu
(e)Leu
Zelltyp / Isolationsmethode
Abbildung 25: Anteil oraler Epithelzellen und Leukozyten nach klassischer Dichtegradientenzentrifugation und Dichtegradientenzentrifugation mittels Leucosept-Kit
4.2.3.2.3
Separation oraler Zellen durch Filtration
Eine einfache und unkomplizierte Auftrennung der einzelnen Zellfraktionen war durch die Filtration
der Mundspülproben über ein 10µm Filcon möglich. Die Tab. 11 zeigt, dass die Wiederfindungsrate
der Leukozyten 56,83±14,91% betrug, wobei sich der Prozentsatz an Leukozyten auf 85,86±8,25%
belief (MW±SD, n=13).
4.2.3.2.4
Vergleich der Isolationsmethoden zur Separation oraler Zellen
Beim Vergleich der Wiederfindungsraten erwies sich die einfache Filtration durch ein 10µm Filcon
als effektivste Methode (Tab. 11). Die Methoden mit den geringsten Wiederfindungsraten [AKvermittelte Separation (Dynal) (MW±SD, n=6; 16) 20,51±3,53% und 37,23±13,33% und klassische
DG (MW±SD, n=24) 21,50±16,54%] wiesen aber die höchste Reinheit der isolierten Zellfraktion
auf. Während nach der Filtration über 10µm Filcons 85,86±8.25% Leukozyten im Isolat bestimmt
ERGEBNISSE
67
wurden, konnten mittels AK-vermittelter Separation 94,14±2,03% und 94,87±2,13% Leukozyten im
Eluat (MW±SD, n=6; 16; 24) ermittelt werden.
Mit Ausnahme der AK-vermittelten Isolation (Dynal, vom Hersteller gekoppelt) wiesen die Leukozyten nach allen Isolationsmethoden eine Vitalität von über 85% auf. Damit sind diese Zellen zur
Einbringung in nachfolgende Untersuchungssysteme geeignet.
Tabelle 11:
Wiederfindung, Prozentsatz und Vitalität oraler Leukozyten nach Isolation durch
unterschiedliche Separationsmethoden
orale Leukozyten
Separations- Wiederfindung (%) Prozentsatz (%)
Vitalität (%)
Methode
MW±SD; (n)
MW±SD; (n)
MW±SD; (n)
CD45-d
20,51±3,53; (6)
94,14±2,03; (6) 86,79±7,57; (6)
a
CD45-d*
37,23±13,33; (16)
94,87±2,13; (16) 65,42±13,02; (16)
b(***); a(**)
CD45-m
38,23±14,67; (21)
67,90±6,18; (21)
85,99±9,07; (21)
b
DG
21,50±16,54; (24)
94, 18±4,23; (24)
88,28±12,36; (24)
b,
Leu
36,57±10,79; (3)
48,84±10,69; (3)
94,97±7,01; (3)
a
10 µm-Filcon 56,83±14,91; (13)
85,86±8,25; (13)
94,37±4,57; (13)
Aufgrunddessen dass der leukozytenspezifische AK CD45 mit allen hämopoetischen Zellen (außer
Erythrozyten) reagiert, durch die Filtration keine Auftrennung der Leukozytenfarktion erfolgt und
nach der DG auch degranulierte Granulozyten in der „Lymphozytenfraktion“ mikroskopisch durch
Essigsäure (1:6 mit Wasser verdünnt) beobachtet wurden, wird in den nachfolgenden Ausführungen
von oralen Leukozyten gesprochen. Eine spezifischere Auftrennung (z.B. in Lymphozyten und
Granulozyten) war durch die angewandten Isolationstechniken nicht möglich.
4.2.3.3
Orale Leukozyten als Biomarker genotoxischer Wirkungen –
Ergebnisse der Brotstudie
4.2.3.3.1
Ausbeute und Vitalität oraler Zellen
Im Rahmen der Interventionsstudie mit Brot mit präbiotischen und antioxidativen Zusatzstoffen
konnten zwischen Rauchern und Nichtrauchern keine signifikanten Unterschiede in der Ausbeute
und Vitalität an oralen Epithelzellen und Leukozyten beobachtet werden (Tab. 12). Die Interventionsphasen betrachtend, wurden ebenfalls keine signifikanten Unterschiede in der Ausbeute und
ERGEBNISSE
68
Vitalität der Epithelzellen und Leukozyten detektiert. Die Tab. A6 und A7 (Anhang) präsentieren die
Ausbeute und Vitalität der Epithelzellen und Leukozyten aus Mundspülproben aller Probanden der
einzelnen Interventionsgruppen.
Tabelle 12:
Ausbeute und Vitalität oraler Leukozyten und Epithelzellen aus der Brotstudie
Ausbeute
Epithelzellen
Ausbeute
Leukozyten
Vitalität
Epithelze llen
Vitalität
Leukozyten
4.2.3.3.2
Phase
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
n
14
14
14
8
14
14
14
8
14
14
14
8
14
14
14
8
Ausbeute (x 106) und Vitalität (%)
R
NR
n MW ± SD
MW±SD
∑±SD
∑±SD
9
3,89±2,56
5,24±8,22
3,29±2,10 9
3,64±5,03
3,48±1,30
3,75±4,10
9
3,19±2,94
2,37±1,03
5
3,31±1,50
2,55±1,83
9
1,36±0,83
4,60±8,84
1,71±1,37 9
3,16±5,64
1,59±1,61
3,12±5,38
9
1,26±0,83
2,46±2,24
5
3,14±1,50
1,52±0,78
9
7,26±7,60
8,86±9,41
12,67±14,00
9 11,24±11,77 12,80±13,38
12,06±11,20
9 23,73±16,38
24,72±17,24
5
2,10±1,62
3,81±2,34
9
87,07± 6,36
83,1±9,62
89,79±7,15 90,36±7,58 9 91,30±5,00 90,72±8,67
9 98,28±3,09
95,69±5,72
5 91,29±7,02
87,77±9,17
Ergebnisse des Comet-Assays
Für die Untersuchungen der Modulation der Genotoxizität an oralen Leukozyten nach der Intervention mit zwei unterschiedlichen Brotsorten, deren Isolation durch DG erfolgte, wurde für die Vergleichbarkeit der einzelnen Proben untereinander eine interne Kontrolle mitgeführt. Als interner
Standard dienten HT29c-Zellen, die mit NaCl oder BLEO inkubiert wurden. Über die 25 durchgeführten MGEs ergab sich für die mit NaCl behandelten Zellen eine TI von 10,90±2,00% und
27,81±4,19% für die mit BLEO geschädigten Zellen (MW±SD; n=25). Die einzelnen Versuchsphasen (I, II, III, IV) betrachtend, ließen sich keine signifikanten Unterschiede bei den internen Standards
detektieren, weder für die mit NaCl noch für die mit BLEO inkubierten Zellen (NaCl: 9,67±2,48%;
10,09±0,84%; 12,60±1,37%; 10,86±1,25%; BLEO: 28,16±6,00%; 26,76±3,90%; 29,63±2,97%;
25,15±1,32%; MW±SD; n=7; 6; 8; 4). Diese Ergebnisse lassen somit einen Vergleich der einzelnen
MGEs untereinander zu.
ERGEBNISSE
Tabelle 13:
69
Anteil der Fluoreszenz im Schweif nach erfolgtem Comet-Assay mit oralen Leukozyten aus der Brot-Studie
Probanden
R/
NR
Phase
R
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
alle
Probanden
NR
R
PRÄAOXBrot
NR
R
PRÄ-Brot
NR
MW
8,10
14,36
16,91
16,27
8,69
7,91
12,14
11,34
8,61
15,15
17,83
17,08
7,97
7,015
13,30
11,42
7,41
13,32
15,68
13,83
9,27
8,62
11,21
11,29
SB
SD
2,30
3,36
6,15
4,25
3,20
1,53
4,28
2,46
2,47
3,87
5,99
4,40
1,45
0,87
6,35
4,76
2,05
2,46
6,70
3,75
4,24
1,63
1,98
0,85
n
14
14
14
8
9
9
9
5
8
8
8
6
4
4
4
2
6
6
6
2
5
5
5
3
p
a(*** w)
d(*)
a
d
g(*** w)
g
e(**)
e
TI (%)
nach Inkubation mit
Endo III
FPG
MW SD n p MW SD
16,90 4,83 14
13,69 4,41
b(**)
20,62 3,55 14
18,19 3,79
22,23 4,26 14
24,01 6,06
c(**)
24,36 3,14 8
24,92 5,02
16,42 4,53 9
20,88 10,20
b
15,21 3,77 9
19,70 6,08
19,00 3,94 9
20,50 3,97
c
18,39 2,89 5
21,07 4,90
17,87 5,14 8
14,44 5,13
h(*)
21,34 4,34 8
17,21 4,49
22,56 4,82 8
22,74 8,17
24,36 3,33 6
23,77 5,23
13,56 2,33 4
h
14,58 4,69 4
19,71 5,15 4
18,41 5,78 2
15,60 4,48 6
13,09 4,26
f(*)
19,67 2,11 6
18,97 3,46
21,80 3,78 6
25,02 4,52
24,37 3,69 2
26,64 6,02
18,71 4,72 5
20,88 10,20
f
15,71 3,36 5
19,70 6,08
18,43 3,20 5
20,50 3,97
18,37 0,15 3
21,07 4,90
n
9
9
9
5
4
4
4
2
4
4
4
3
5
5
5
2
4
4
4
2
Mit Ausnahme der ersten Versuchsphase wiesen die Raucher einen größeren Anteil an Fluoreszenz
im Schweif auf als die Nichtraucher, sowohl bei den SB-Raten als auch bei den oxidierten Purinbasen und Pyrimidinbasen (Tab. 13). Diese Unterschiede waren teilweise signifikant
Der Verzehr von Brot mit antioxidativen und präbiotischen bzw. präbiotischen Inhaltsstoffen
(Versuchsphase III) führte zu keiner Verringerung oder Erhöhung der TI in den Zellen. Weder die
SB-Rate noch der Anteil an oxidierten Purin- bzw. Pyrimidinbasen wurde durch den Verzehr der
zwei Brotsorten signifikant beeinflusst.
ERGEBNISSE
70
Die Abb. 26 zeigt die gefärbte DNA oraler Leukozyten und Epithelzellen (aufgrund der nicht totalen
Homogenität der Leukozytenfraktion nach DG) nach erfolgtem CA.
400xVergrößerung, Syber-Green,
orale Zellen nach MGE und Sybr-Green-Färbung
Abbildung 26: DNA oraler Zellen nach durchgeführtem Comet-Assay mit Fluoreszenzfärbung
4.2.3.4
Histonacetylierungsstatus in oralen Zellen
Von den bekannten Histonen H1 und H5 als Linker-Histone sowie H2A, H2B , H3 und H4 als
Nucleosomen-Histone wurde der Acetylierungsstatus des H4 an oralen Zellen aus Mundspülproben
untersucht. In Anbetracht der geringen Zellmenge nach der Auftrennung der Mundspülproben wurden zur Analyse des Acetylierungsstatus des H4 die gesamten Zellen einer Mundspülung verwendet.
Die Abb. 27 zeigt Gele, auf denen aus Mundschleimhautzellen im Gegensatz zu HT29c-Zellen keine
Banden erkennbar waren. In Auswertung zahlreicher weitere Gele wurden bei Mundschleimhautzellen keine scharfen H4-Banden nachgewiesen. Experimentelle Fehler konnten durch die Positivkontrolle der Histon-Proben aus HT29c-Zellen weitestgehend ausgeschlossen werden.
In Zusammenfassung der durchgeführten Versuche ließen sich folgende Erkenntnisse gewinnen:
1.
Vereinzelt waren bei sehr hohen Proteinkonzentrationen in oralen Zellen H4-Banden nachweisbar, die eine nicht quantifizierbare Qualität aufwiesen.
2.
Der Einsatz hoher Proteinmengen (mindestens 30µg Protein) bei nur 40µl Taschenvolumen auf
dem Gel bedeutete, dass bei einer notwendigen Verdünnung mit Probenpuffer und ddH2O eine
Ausgangsproteinkonzentration von 1500µg/ml in 50µl Histonprobe vorliegen musste. Diese hohen Proteinkonzentrationen ließen sich in der Praxis nur vereinzelt bei hohen Zellzahlen realisieren. Limitierend für die Aufkonzentration der Probe war die Löslichkeit der Histone.
3.
Die Ultraschallhomogenisierung zur Zerstörung der Zellstruktur erbrachte keine Verbesserung
der Proteinausbeute und keine Verbesserung der H4-Banden.
4.
Die Verwendung unterschiedlich konzentrierter Puffer bzw. von ddH2O als Lösungsmedium für
die Histone hatte keinen verbessernden Effekt auf die H4-Banden.
ERGEBNISSE
5.
71
Eine veränderte Gelzusammensetzung sowie die durchgängige Kühlung während der Elektrophorese mittels Kühlaggregat erzielte keinen Effekt.
6.
Die Bestimmung des H4-Acetylierungsstatus in oralen Zellen ist in dieser Form nicht als Biomarker-Methode geeignet, um Hinweise auf eine Modulation der Genexpression zu erlangen.
.
1
2
3
4
5
6
7
* °
*
8
9
10
°
H4/4
H4/3
H4/2
H4/1
H4/0
1: orale Zellen Proband 1 (35,82µg Protein);
6:
°HT29c -Zellen (tote Zellen) (12µg Protein);
2: orale Zellen Proband 1 (12µg Protein);
7:
* Histon-Mix (15µg Protein);
3: orale Zellen Proband 2 (22,75µg Protein);
8:
orale Zellen Proband 3 (21µg Protein);
4: orale Zellen Proband 2 (12µg Protein);
9:
orale Zellen Proband 3 (12µg Protein);
5: *Histon-Mix (20µg Protein);
10:
°HT29c -Zellen (vitale Zellen) (12µg Protein)
Abbildung 27: Säure-Harnstoff-Gel zur Auftrennung von Histon-Proben von Mundschleimhautzellen und HT29 clone 19A-Zellen
DISKUSSION
5
72
DISKUSSION
In der vorliegenden Arbeit wurden neue funktionelle nicht-invasive Biomarker-Techniken etabliert
und angewandt, die Hinweise auf eine Modulation zellulärer Parameter geben, die in den Prozess der
kanzerogenen Entartung des Verdauungstraktes involviert sind. Dabei liefert die Untersuchung des
genotoxischen Potentials von FW als potentielles Bindeglied zwischen ernährungsrelevanten Genotoxinen bzw. präventiven Faktoren und deren Wirkungen auf die Kolorektalmukosa bzw. Modellzellen wichtige Hinweise auf mögliche Risiken oder Protektanten. Durch die Verwendung primärer
abgeschilferter Zellen des Verdauungstraktes zur Untersuchung zellulärer und molekularer Parameter
können an den Zielzellen der kanzerogenen Entartung direkt Wirkungen schützender oder schädigender Faktoren gemessen werden. Durch die Untersuchung von FW zum einen und von primären
humanen Zellen des Verdauungstraktes zum anderen stehen zwei Techniken zur Verfügung, die es
erlauben, den Einfluss nutritiver Expositionsfaktoren im Prozess der kanzerogenen Entartung näher
zu charakterisieren.
5.1
Fezeswasser als nicht-invasiver Biomarker des Effekts
Ernährungsgewohnheiten bzw. Nahrungsinhaltsstoffe und deren Metabolite sind in den Prozess
kanzerogener Entartungen, vor allem des Gastrointestinaltraktes, involviert (WCRF 1997). Die
flüssige Phase der Fezes stellt eine ideale Möglichkeit dar, nicht-invasiv an humanes Probenmaterial
zu gelangen, um die Auswirkungen der Exposition exogen zugeführter bzw. endogen metabolisierter
Substanzen auf die Dickdarmmukosa zu bestimmen. Anfänglich stand für die Untersuchung der
ernährungsabhängigen Beeinflussung der fäkalen Mutagenität das Testsystem mit Salmonella
thyphimurium für viele Versuchsanordnungen im Vordergrund. Dabei wurden vor allem Extrakte
aus der Fezes auf verschiedenste Art und Weise gewonnen, die sich in ihrer toxischen und mutagenen Wirkung voneinander unterschieden (SCHIFFMAN 1987). Untersuchungen der letzten Jahre
zeigen, dass die wässrige Phase der Fezes, das FW, als effektiveres Testsystem in Modellversuchen
eingesetzt werden kann, um molekulare Parameter kanzerogener Prozesse zu bestimmen. Im Gegensatz zu Fezesextrakten spiegelt das FW die Bedingungen, wie sie im distalen Bereich des Kolons und
Rektums vorherrschen, am besten wider. Während zahlreiche Untersuchungen über die Mutagenität
und Toxizität von Fezesextrakten vorliegen, ist die Existenz von Studien über toxische Effekte von
FW eher rar (LARPE und VAN DER MEER 1992, RAFTER et al. 1987).
Die Gewinnung der flüssigen Phase der Fezes kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen.
Neben der in der vorliegenden Arbeit angewandten Methodik der einfachen Ultrazentrifugation
besteht unter anderem die Möglichkeit, die Fezes im Vorfeld mit unterschiedlichen Lösungsmedien
DISKUSSION
73
aufzuschlämmen. KLINDER und GIETL (2002) zeigten eine höhere Genotoxizität der wässrigen Phase
der Fezes, wenn diese vorher im Verhältnis 1:2 mit PBS aufgeschlemmt wurden. Aufgrund der
veränderten Lösungskapazität werden mehr wasserlösliche Toxine aus der festen Phase der Fezes im
wässrigen Fezesextrakt erfasst, woraus die gesteigerte Genotoxizität resultieren kann. Die Schwierigkeit bei dieser Methodik besteht in der hypothetischen Einschätzung der intraluminellen Bedingungen im Kolon, die die Wechselwirkungen der Fezestoxine bzw. der protektiven Fezesinhaltsstoffe
mit den Kolonozyten beeinflusst. Die Problematik besteht in der Abschätzung des Maßes der Aufschlämmung, um ideale intraluminelle Gegebenheiten widerzuspiegeln, so dass weder eine Aufkonzentration über die im Kolon wirkenden Konzentrationen noch eine Verdünnung erfolgt. Unter
Berücksichtigung dieser Überlegungen wurde sich in der vorliegenden Arbeit für die einfache Ultrazentrifugation der Fezes zur FW-Gewinnung entschieden.
5.1.1
Genotoxizität des Fezeswassers als funktioneller Biomarker des
Effekts
Zur Beurteilung der Toxizität der Fezes liefern Untersuchungen zur FW-Genotoxizität
Hinweise, die auf die Fähigkeit des FW schließen lassen, Veränderungen an der DNA der
Zellen zu induzieren. Während bei zahlreichen Testsystemen die Toxizität von FW an
bakterieller DNA untersucht wurde, existieren wenig Daten über Untersuchungen an Säuger-DNA und noch weniger auf Basis humaner DNA (VENTURI et al. 1997). Mit dem CA
als Methode zur Detektion genotoxischer Wirkungen, werden induzierte DNA-Läsionen an
einzelnen Zellen gemessen, die zu genetischen Instabilitäten gegenüber definierten Expositionsfaktoren führen können (GONTIJO et al. 2001).
VENTURI et al. (1997) wandten als erste die Methode des CA zur Detektion des genotoxischen Potentials von FW an der humanen Adenocarzinom-Zelllinie Caco-2 an. Dabei beobachteten die Autoren
dosisabhängige Effekte, wobei in 10%igen Versuchsansätzen deutlichere DNA-Schädigungen
nachgewiesen wurden als beim Einsatz von 4% FW im Versuchsansatz. Signifikante Korrelationen
zwischen FW-Menge und Genotoxizität bestanden nicht. 10% FW in der Zellsuspension erwiesen
sich auch bei den in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen als effektiv, um genotoxische
Wirkungen an der DNA von HT29c-Zellen und Lymphozyten zu determinieren. Für die Etablierung
eines Biomarkers ist die Bestimmung des normalen Status bzw. der Basisdaten der erste und überaus
bedeutende Schritt. Ohne Intervention wird der sogenannte Hintergrund des Biomarkers bestimmt
(ALBERTINI 1999). 5 der 6 getesteten FW der Laborgruppe, die zur Bestimmung der Basisdaten der
Genotoxizität im CA dienten, waren in der Lage, DNA-Schäden an HT29c-Zellen und Lymphozyten
zu induzieren. Das genotoxische Potential der FW erwies sich als sehr unterschiedlich. 2 der 6 Proben
DISKUSSION
74
waren hoch genotoxisch, während sich 3 Proben als moderat erwiesen und eine Probe keine Genotoxizität zeigte. Die gesamten Ergebnisse der Interventionsstudien (Phosphatstudie I und II, Leinsaatstudie und Studie mit probiotischer Wurst) betrachtend, induzierten 11 FW hohe, 9 FW intermediäre
und 19 FW keine DNA-Schäden. Ähnlich variable Werte der FW-Genotoxizität konnten neben den
erwähnten Untersuchungen von VENTURI et al. (1997) (von 21 FW wiesen 57% keine, 30% eine
mittlere und 13% eine hohe genotoxische Aktivität auf) auch RAFTER et al. (1987) an zwei unterschiedlichen Testsystemen nachweisen. Neben dem Erythrozytenlyse-Test, der ein Membranmodell
zur Beurteilung der toxischen Wirkung von FW auf die Kolonozytenmembran darstellt, wurde
gezeigt, dass FW, welches sehr lytisch auf Erythrozyten wirkt, mehr mukosale Schäden am Mäusekolon erzeugt, als FW, das mittelmäßig lytisch wirkt.
In den durchgeführten Genotoxizitätsuntersuchungen mit FW von 6 verschiedenen Probanden (Laborgruppe) konnte kein signifikanter Unterschied zwischen HT29c-Zellen und Lymphozyten nachgewiesen werden. Der Vergleich der beiden Zelltypen war dahingehend von großer Bedeutung, als
dass Kolonozyten die Zielzellen von kolorektalkarzinomatösen Entartungsprozessen darstellen, sie
aber als Primärzellen nicht in ausreichender Quantität und Qualität als nicht-invasiv gewinnbare
Biomarker-Zellen zur Verfügung stehen. HT29c-Zellen, als Zellen epithelialen Ursprungs, dienten
als Modell für humane Dickdarmzellen. Die Lymphozyten repräsentieren in dieser Arbeit den primären, nicht durch kanzerogene Prozesse veränderten Zelltyp. Aufgrund der höheren Relevanz für die
zu untersuchenden Fragestellungen und die bessere Handhabung und Homogenität der Kulturzellen
wurden alle nachfolgenden Versuche mit HT29c-Zellen durchgeführt.
Eine indirekte Toxizitätswirkung kann als Ursache der DNA-Schäden insofern ausgeschlossen
werden, als dass keine Zytotoxizität im Trypanblau-Ausschlusstest detektiert wurde. Alle FW, die in
dieser Arbeit untersucht wurden, ließen nach 30-minütiger Inkubation weder bei den isolierten peripheren Blutlymphozyten noch bei den HT29c-Zellen zytotoxische Effekte erkennen. In allen Versuchsansätzen betrug die Vitalität beider Zelltypen über 90%. Die Vitalität der Zellen wurde auch
durch die durchgeführten Ernährungsinterventionen mit probiotischer Wurst und Leinsaatbrot nicht
beeinflusst. Diese Ergebnisse bestätigten auch VENTURI et al. (1997), die keine zytotoxischen Effekte
von FW mittels Trypanblau-Ausschlusstest nachwiesen. VAN MUNSTER et al. (1994) zeigten mit
unterschiedlichen Testsystemen an verschiedenen Zelltypen eine differenzierte Sensitivität gegenüber
zytotoxischen Effekten. GLINGHAMMAR et al. (1997) konnten mittels spektrometrischer Detektion
(HT29-Zell-Lyse-Test) modulierbare zytotoxische Effekte von allen FW nachweisen, die im Rahmen einer Ernährungsinterventionsstudie getestet wurden. RAFTER et al. (1987) und GELTNER-
DISKUSSION
75
ALLINGER et al. (1989) detektierten mittels Erythrozytenlysetest ebenfalls eine ernährungsabhängige
Modulation der zytotoxischen Wirkung von FW.
Eine spezifische Modifikation des CA erlaubt die Detektion oxidierter Pyrimidinbasen, wie z. B.
Thyminglycol. Durch die zusätzliche Inkubation der lysierten Zellen mit dem Reparaturenzym Endo
III werden oxidierte DNA-Abschnitte spezifisch an diesen Stellen geschnitten, wodurch DNAStrangbrüche entstehen, die als zusätzliche „Fragmente“ in stärkeren Kometen detektiert werden
können (COLLINS et al. 1995b, POOL-ZOBEL et al. 1997b). Für die Bestimmung oxidierter Pyrimidinbasen wurde ein FW mit einer genotoxischen Aktivität und eins ohne genotoxische Aktivität von
einer Person ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten, dass das FW mit einem genotoxischen Potential
auch signifikant mehr oxidierte Pyrimidinbasen im Vergleich zur Kontrolle initiiert als das FW ohne
genotoxische Aktivität. Dieses Resultat veranschaulicht, dass neben der DNA-SB-Rate auch eine
Variabilität hinsichtlich der Rate an oxidierten Pyrimidinbasen besteht. An der Zelllinie Caco-2
konnten VENTURI et al. (1997) ähnliche Beobachtungen machen. Sie detektierten oxidierte Pyrimidinbasen nur nach Inkubation der Zellen mit FW, das SB induzierte, nicht aber nach der Inkubation
der Zellen mit FW ohne DNA-SB-Induktion.
5.1.1.1
Beeinflussung der Genotoxizität von Fezeswasser durch Ernährungsintervention
Viele DNA-schädigende bzw. –schützende Substanzen in der Nahrung sind derzeit in der Diskussion, wobei wenig über genaue molekulare Mechanismen bekannt ist. Immer wieder ist die Rede von
kanzerogenen und antikanzerogenen Inhaltsstoffen in bestimmten Lebensmitteln, Ernährungsformen
und Supplementen. Die Betrachtung eines bestimmten Inhaltsstoffes bzw. einer Substanzgruppe führt
dabei immer zu dem Verlust der Komplexität bzw. der komplexen Wirkung, mit der ein Lebensmittel in dem in vivo-System „Mensch“ wirkt. Mit der Durchführung von Ernährungsinterventionsstudien kann gezielt untersucht werden, welchen Effekt eine definierte alimentäre Exposition auf intestinale Prozesse ausübt. Mit sich anschließenden spezifische Toxizitätsuntersuchungen können mögliche Effekte der Intervention bestimmt werden.
5.1.1.1.1
Studie mit probiotischer Wurst und Leinsaatstudie
Die Interventionsstudie mit probiotischer Wurst und die Leinsaatstudie wurden vom Lehrbereich
„Ernährungsphysiologie“ zur Klärung spezifischer Fragestellungen durchgeführt, die nicht unbedingt
den Anspruch hatten, die Genotoxizität des FW zu modulieren. Für die vorliegende Arbeit sind sie
aber insofern bedeutsam, als das unter Studienbedingungen eine FW-Gewinnung unter standardisier-
DISKUSSION
76
ten Bedingungen möglich war. Dabei war es von besonderem Interesse, FW von Personen zu gewinnen, die eine kontrollierte Diät verzehrten.
In dem humanen Kolon, als komplexes mikrobielles Ökosystem betrachtet, leben Mikroben in
Symbiose mit den Enterozyten. Einigen Spezies werden aufgrund ihrer Stoffwechselaktivitäten
antimutagene und antikanzerogene Wirkungen auf den humanen Organismus zugeschrieben. Über
die spezifische Supplementation dieser Mikroben mit dem Ziel der Ansiedlung der Bakterien im
Kolon sollte die Beeinflussung der protektiven Wirkung im Hinblick auf kanzerogene Prozesse
möglich sein. So wiesen verschiedene Autoren mit unterschiedlichen LAB eine Verringerung der
Tumorinitiation nach (GOLDIN und GORBACH 1984, KULKARNI und REDDY 1994, REDDY und
RIVENSON 1993, SINGH et al. 1997). Während viele Studien über protektive Wirkmechanismen im
Tiermodell existieren (POOL-ZOBEL et al. 1993, POOL-ZOBEL et al. 1996, WOLLOWSKI et al. 1999),
fehlt derzeit noch ein direkter Beweis für die Hemmung kanzerogener Prozesse durch LAB beim
Mensch. Im Gegensatz zu herkömmlichen Alternativen der alimentären Aufnahme der Probionten
[Tabletten, Kapseln, Milch(produkte)] (RAFTER 1995) wurde in der in dieser Arbeit verwendeten
Studie Wurst mit 5x109 KBE des Keims Lactobacillus casei angereichert.
Der Verzehr der probiotischen Wurst hatte keinen signifikanten Effekt auf das genotoxische Potential
des FW, weder bei den weiblichen noch bei den männlichen Probanden. Im Gegensatz zu diesen
Ergebnissen erzielten OBERREUTHER et al. (1998) eine Reduktion der SB-Rate im CA mit FW nach
Supplementation der Probanden mit Lactobacillus acidophilus 145 und Bifidobacterium longum 913
angereichertem Joghurt. Die Effektivität der probiotischen Kulturen hängt im hohen Maße von der
applizierten Dosis, der Vitalität der Bakterien, der Fähigkeit dieser zur Kolonisation im Kolon sowie
der Dauer der Verabreichung ab (BARTRAM et al. 1994, HOSODA et al. 1996, POOl-ZOBEL et al. 1996,
Pool-Zobel et al. 1993, SHORTT 1997). Die geringe Überlebensfähigkeit der Lactobacillus caseiKulturen in der Wurst sowie die Überlebensfähigkeit der Bakterien während der Passage des
Gastrointestinaltraktes erschien das Hauptproblem der gesamten Studie. So konnte eine Keimkonzentration von 5x109 KBE je 50g Wurst nicht in jedem Fall gewährleistet werden. Die Vitalität der
Bakterien vor dem Verzehr wurde nicht bestimmt, so dass eine Betrachtung des Probandenkollektivs
mit ausreichender Aufnahme lebender Kulturen nicht eruiert wurde. Bei der Betrachtung der Probanden, bei denen >1x106KBE Lactobacillus casei je g Fezes nach dem Wurstverzehr nachgewiesen
wurden, waren ebenfalls keine signifikanten Effekte in der FW-Genotoxizität erkennbar.
Die Daten der Genotoxizitätsuntersuchungen aus dieser Studie gewinnen insofern für die vorliegende
Arbeit an Bedeutung, als dass alle Probanden die gleiche standardisierte Diät konsumierten. Damit
wird ein Vergleich der intraund interindividuellen Variationsbreite der Genotoxizität der FW zwi-
DISKUSSION
77
schen Probandenkollektiven mit standardisierter und heterogener Ernährungsweise möglich. Die
Diskussion der interindividuellen Variationsbreite erfolgt nachfolgend im Abschnitt 5.1.1.2.
Inhaltsstoffe, die Lein bzw. Flachs (Linum usitatissimum L.) als potentiell funktionelles Lebensmittel
interessant machen, sind neben den Ballaststoffen und der α-Linolensäure, die Lignane, die strukturelle Ähnlichkeit mit den Östrogenen aufweisen. Lignane, bei denen Secoisolariciresinol und Matairesinol mengenmäßig den größten Anteil in Pflanzen ausmachen, werden zu den Phytoöstrogenen
gezählt, die in der Diskussion stehen, kanzeroprotektiv zu wirken (WISKER et al. 1999, POOL-ZOBEL
et al. 2000). In vitro Versuche mit HT29c-Zellen zeigten, dass Enterolacton und Enterodiol in einer
Konzentrationen von 100µM endogene oxidative DNA-Schäden reduzierten (POOL-ZOBEL et al.
2000). MOUSAVI und ADLERCREUTZ (1993) wiesen eine Beeinflussung der Proliferationsrate an
MCF-7-Brustkrebszellen durch Estradiol und Enterolacton nach.
Die Intervention mit 200g Leinsaatbrot mit ca. 575µg Secoisolariciresinol und Matairesinol führte zu
einer Reduktion der genotoxischen Aktivität der FW im CA, die sich als signifikant im Vergleich zu
dem Status vor der Intervention erwies. Eine Reduktion des Levels an oxidierten Pyrimidinbasen
wurde nicht nachgewiesen. Ob der Effekt der Reduktion der Genotoxizität der FW der Leinsaatstudie
auf den Mehrverzehr an Brot oder tatsächlich auf die Inhaltsstoffe des Brotes zurückzuführen war,
konnte nicht eindeutig geklärt werden. Bis auf den vorgeschriebenen Konsum des Leinsaatbrotes
haben die Probanden ihren herkömmlichen Ernährungshabitus beibehalten. Genaue Bilanzierungsuntersuchungen wurden nicht angestrebt. Inwieweit das Leinsaatbrot zusätzlich zu anderem Brot konsumiert oder gegen andere Sorten substituiert wurde, ist nicht erfasst worden. Ein verändertes Stuhlgewicht bzw. ein veränderter FW-Anteil der Fezesproben, die vor, während bzw. nach der Intervention gewonnen wurden, bestand nicht. Daraus ergab sich unter Umständen der Hinweis, dass außer
der Supplementation des Leinsaatbrotes keine veränderten Verzehrsgewohnheiten der Probanden für
die Reduktion der fäkalen Genotoxizität verantwortlich waren. Das unveränderte Verhältnis des FW
zum Fezesgewicht in der Studie deutete darauf hin, dass die Verringerung der Genotoxizität nicht auf
einem Verdünnungseffekt des FW durch erhöhte Wasserbindung der Fezes infolge veränderter
Verzehrsgewohnheiten beruhen konnte.
Die Ergebnisse der Untersuchung der Modulation der FW-Genotoxizität aus dieser Studie sind für
die nachfolgende Diskussion der intraund interindividuellen Variationsbreite der fäkalen Genotoxizität im Hinblick auf den Ernährungsstatus bedeutsam. Die Probanden der Leinsaatstudie repräsentieren neben der Laborgruppe ein Probandenkollektiv ohne standardisierte Diät.
DISKUSSION
5.1.1.2
78
Intra- und interexperimentelle und -individuelle Variation der Fezeswa ssergenotoxizität
Im Abschnitt 5.1.1 wurde bereits darauf verwiesen, dass die Genotoxizität der FW verschiedener
Probanden erheblichen interindividuellen Schwankungen unterliegt. Der interindividuelle Variationskoeffizient der FW-Genotoxizität betrug 42,11% für die Versuche mit Lymphozyten und 25,13%
für die mit HT29c-Zellen. KEKU et al. (1998) bestimmten in Abhängigkeit von der jeweils angewandten Detektionstechnik zur Messung der kolorektalen Mukosaproliferation ähnliche interindividuelle Variationskoeffizienten (61% bzw. 39%).
Um neben der interindividuellen Variationsbreite der FW-Genotoxizität auch ein Maß für die intraindividuelle Variabilität zu bestimmen, wurde von einem männlichen und einem weiblichen Probanden aus der Laborgruppe über 6 Wochen hinweg, einmal wöchentlich zum gleichen Zeitpunkt, FW
gewonnen. Abhängig vom Zeitpunkt der Probennahme konnten bei beiden Geschlechtern eine
starke, mittlere und geringe genotoxische Aktivität der FW ermittelt werden. Lediglich ein FW des
männlichen Probanden zeigte keine höhere Genotoxizität im Vergleich zur NaCl-Kontrolle. Der
intraindividuelle Variationskoeffizient betrug 63,95% bei dem männlichen Proband und bei 33,85%
bei dem weiblichen. Signifikante Unterschiede zwischen der intraund interindividuellen Variation
waren nicht zu beobachten. Auf ebenfalls erhebliche intraindividuelle Variationsbreiten der Toxizität
der Fezes verwiesen BRUCE et al. (1977), SCHIFFMAN (1987) und STICH und KUHNLEIN (1979).
STICH und KUHNLEIN (1979) stellten intraindividuelle Unterschiede der Toxizität von Fezesextrakten
im Test auf Chromosomenbrüche fest. BRUCE et al. (1977) detektierten ebenfalls erhebliche
Unterschiede in der toxischen Aktivität von Fezesextrakten eines einzelnen Individuums. Die
Mutationsrückfallrate nach Diethyletherextraktion der Fezesproben von 4 Probanden, die an 8
verschiedenen Tagen entnommen wurden, variierte innerhalb eines Probanden zwischen 24-213%.
Ein ähnlicher intraindividueller Variationskoeffizient von 60-110% konnte hinsichtlich der
Fecapentaenextraktion bei 3 Probanden über 30-45 Tage gemessen werden. Derartige intraindividuelle Variationsbreiten reflektieren unter anderem die Variation der täglichen Kost (BEATON et al.
1983), wobei weitere Ursachen eine differente Lebensweise und eine unterschiedliche individuelle
Konstitution sein können. Aufgrund der Datenlage kamen die Autoren zu dem Entschluss, dass,
bevor die fäkale GT zwischen Individuen oder Gruppen verglichen wird, das genotoxische Potential
eines einzelnen Individuums analysiert werden muss.
Für die Erhebungen der Basisdaten war neben der Bestimmung der intraund interindividuellen
Variationsbreite auch die Bestimmung der inter- und intraexperimentellen Variation von Bedeutung.
Sowohl bei den Versuchen mit Lymphozyten als auch mit HT29c-Zellen wurde ein durchschnittli-
DISKUSSION
79
cher intraexperimenteller Variationskoeffizient von <25% errechnet. Zwischen Lymphozyten und
HT29c-Zellen konnten keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass innerhalb der Elektrophorese keine Unterschiede bestehen, die sich eventuell auf die
Lage der OT in der Elektrophoresevorrichtung begründen. Die interexperimentelle Variationsbreite
ist insofern bedeutsam, als dass nicht alle Proben an einem Tag in einem Versuch detektiert werden
können. Durch die Bestimmung der interexperimentellen Variabilität an Lymphozyten (15,75%) und
HT29c-Zellen (14,15%) konnte eine hervorragende Reproduzierbarkeit der Bestimmung der FWGenotoxizität mittels CA erzielt werden. Der Durchschnitt des interexperimentellen Variationskoeffizienten war bei den OT, die mit FW inkubiert wurden, geringer als bei den Kontroll-OT. Der Zeitpunkt der Durchführung der MGE hatte somit keinen Einfluss auf die Ergebnisse.
Signifikante Unterschiede zwischen der intraund interexperimentellen Variation waren in den
dargelegten Versuchen nicht erkennbar, wohingegen die interindividuelle Variation der FWGenotoxizität sowohl bei den Lymphozyten als auch bei den HT29c-Zellen signifikant höher war als
die interexperimentelle Variation. Die intraindividuelle Variation der Genotoxizität der FW erwies
sich ebenfalls als signifikant höher als die interexperimentelle Variation. Der Grad der intraund
interindividuellen Variation war in allen Versuchsansätzen in etwa auf dem gleichen Niveau. Die
Variabilität der Fezes zwischen den einzelnen Individuen sowie die Variabilität der Fezes eines
einzelnen Individuums hat einen größeren Einfluss auf die Ergebnisse als die Versuchsdurchführung
an sich.
5.1.1.2.1
Intra- und interindividuelle Variation der Genotoxizität der Fezeswässer
in Abhängigkeit vom Ernährungsstatus
Der Vergleich der Variationsbreite des genotoxischen Potentials der FW von Probanden, die eine
identische Kost verzehrten, mit denen, die ihre gewöhnliche Ernährung beibehielten, ist von großer
Bedeutung für die Beurteilung von Interventionsstudien, die mit bzw. ohne standardisierte Diät
durchgeführt werden, da der Ernährungsstatus an sich eine hoch komplexe Exposition darstellt. Die
Annahme, dass durch eine standardisierte Diät die Variabilität der FW-Genotoxizität geringer wird,
wurde nicht bestätigt. In den verwendeten Untersuchungen konnte durch die Standardisierung der
Diät keine signifikante Verringerung der intraund interindividuellen Variationsbreite der FWGenotoxizität erzielt werden. Die interindividuelle Variation der FW-Genotoxizität aus der Studie mit
probiotischer Wurst erwies sich gegenüber allen anderen Studien, mit Ausnahme der Phosphatstudie
II, als signifikant höher. Mögliche Ursachen könnten in der Isolationstechnik und Lagerung des FW
begründet sein, welche im Gegensatz zur Studie mit dem Laborpersonal sowie zur Leinsaatstudie
nicht von dem Verfasser dieser Arbeit praktiziert wurden. Zum einen wurde von dem Verfasser der
Arbeit auf die Homogenisation der Fezes vor der FW-Gewinnung besonderen Wert gelegt, da das
DISKUSSION
80
FW nicht aus der gesamten Probe gewonnen wurde. Zum anderen erfolgte die Isolation des FW von
den Probanden der Laborgruppe sofort nach der Gewinnung der Fezes, so dass kaum eine zeitliche
Verzögerung auftrat. Die Fezesproben der Probanden der Leinsaatstudie wurden von den Testpersonen persönlich abgeholt, so dass auch hier die Transportzeiten bestmöglichst verkürzt wurden, um
Lagerungseffekte auszuschließen. Im Rahmen von großen Interventionsstudie ist es infolge der
komplexeren Logistik möglich, dass längere Lagerzeiten auftreten, was Ursache veränderter FWEigenschaften sein könnte.
Eine Erklärung für die unveränderte interindividuelle Variabilität der Genotoxizität der FW könnte in
der Betrachtung der Zeitspanne der Intervention und damit in der Zeitspanne der Verabreichung
gleicher Diäten begründet sein.
KUHNLEIN und KUHNLEIN (1980) bestimmten die inter- und intraindividuelle Variation der fäkalen
Mutagenität im Rahmen einer Studie mit identischer Formuladiät. Bei konstant gehaltener Diät
konnten keine signifikanten Unterschiede in der intraindividuellen Variationsbreite beobachtet werden, wohingegen die interindividuelle Variation nach 72-tägiger Diät-Standardisierung signifikante
Unterschiede aufwies. SILVESTER et al. (1997) berechneten bei der Messung der Ausscheidung
fäkaler N-Nitrosoverbindungen eine diätbezogene Variabilität von 25%. Die Variabilität zwischen
den einzelnen Probanden differierte über das 100-fache, während die subjektbezogene totale Variabilität 45% betrug.
Trotz der hohen intraund interindividuellen Variation der Genotoxizität von FW im CA, auch nach
dem Verzehr gleicher Diäten, kann diese Methode zur Bestimmung von Einflussfaktoren aus der
Ernährung auf die Toxizität von Fezes angewandt werden. Wenn jeder Proband seine eigene Kontrolle darstellt, können ernährungsinduzierte Veränderungen detektiert werden. Auch andere Autoren
konnten auf diese Weise eine Einflussnahme auf das genotoxische Potential von FW durch die
Ernährung nachweisen (RIEGER et al. 1999).
Die Bestimmung der Variabilität einer Biomarker-Methodik ist die Voraussetzung, um für geplante
bevorstehende Interventionsversuche die Anzahl benötigter Probanden zu ermitteln, um signifikante
Aussagen über den Einfluss der Interventionsmaßnahme auf die Untersuchungsparameter treffen zu
können. Die Variabilität angewandter Biomarker-Detektionsmethoden sollte an dem Biomarker
selbst liegen und nicht an der Methodik (ALBERTINI 1999). Die angeführten Untersuchungen zeigten,
dass sich die experimentelle Variation als geringer erwies als die individuelle Variation. Diese Ergebnisse sind die Voraussetzung, um den CA als Testsystem zur Bestimmung der Genotoxizität von FW
als Biomarker-Methodik einzusetzen. Durch die Bestimmung der Variationsbreite der erzielten
Ergebnisse werden diese transparenter, besser einschätzbar und vergleichbarer.
DISKUSSION
5.2
81
Abgeschilferte Zellen - nicht-invasiv gewinnbare humane Zellen
Neben Fezeswasser repräsentieren abgeschilferte humane Zellen eine ideale Möglichkeit, um nichtinvasiv an humanes Probenmaterial zu gelangen. Nach erfolgreicher Isolation der Zellen ständen
diese dann der Einbringung in verschiedene Biomarker-Testsysteme zur Verfügung, um sowohl
Biomarker der Exposition, des Effekts als auch der Empfindlichkeit zu bestimmen.
5.2.1
Abgeschilferte Zellen aus Fezes
Das Kolon Erwachsener ist mehrere Meter lang und einige Millimeter dick. Es wird angenommen,
dass es etwa 5x1010 epitheliale Zellen enthält. 1/6 bis 1/3 dieser Zellen werden in 24 Stunden abgeschilfert (SIDRANSKY et al. 1992). Diese ca. 1x1010 Zellen werden über die Fezes ausgeschieden und
ständen damit als Quelle primärer humaner Zellen, die nicht-invasiv gewonnen werden könnten, zur
Verfügung.
In den angeführten Untersuchungen wurde der frisch gewonnene Stuhl nach der Methode von
O‘N EILL und LOKTIONOV (1997) gewaschen und mit magnetisch gekoppelten AK (EA und CD45)
inkubiert. Jede Zelloberfläche ist gekennzeichnet durch eine spezifische Antigenstruktur, die durch
AK erkannt werden kann. Der monoklonale AK EA des Typs Maus-IgG1 (clone Ber-EP4) reagiert
spezifisch mit 34 und 39kDa Glycopolypeptiden, welche als Antigene auf den meisten normalen und
neoplastischen humanen Epithelzellen exprimiert sind (LATZA et al. 1990). Glycoproteine der Größe
von 180, 190, 205, 220kDa sind auf der Oberfläche der meisten humanen Leukozyten exprimiert
(DALCHAU et al. 1980, STREULI et al. 1988). Das Gemisch der Monoklonaalen AK CD45 clone
2B11 und PD7/26 zeigt eine hohe Reaktivität mit den genannten Epitopen.
In vierfach wiederholten Versuchen konnten aus Fezes weder abgeschilferte Kolonozyten noch
Leukozyten durch AK-vermittelte Isolation gewonnen werden. Weder eine Veränderung des
Waschvorgangs hinsichtlich der Zeit und der Temperatur noch die Zugabe verschiedener kombinierter Schleimlöser (Guajacol, N-Acetylcystein) ins Stuhlwaschmedium steigerte die Zellausbeute. In
Anlehnung an persönliche Hinweise der ehemaligen Mitarbeiterin ROISIN HUGHES (1999) der Arbeitsgruppe von O’N EILL und LOKTIONOV wurde ausschließlich mit Fezes fester Konsistenz und
älterer Probanden gearbeitet, da die Zellabschilferungsrate bei diesen Personen höher zu seien
scheint.
O‘N EILL und LOKTIONOV (1997) und LOKTIONOV et al. (1998) gaben in ihren Arbeiten keine Auskünfte über die Quantität und Qualität (z. B. Vitalität) der gewonnen Zellen. Größtenteils wurde mit
der DNA der Zellen weitergearbeitet. Nach LOKTIONOV et al. (1998) ließen sich ca. 700ng DNA/g
Fezes isolieren, was in etwa einer Zellmenge von 1x106 Zellen/10g Fezes entspricht. Krebspatienten
und ältere Probanden wiesen höhere Zellabschilferungsraten auf. HOCHSTRASSER et al. (1998) isolier-
DISKUSSION
82
ten mit der selben Methodik mit dem gleichen AK Epithelzellen aus Kolonkrypten. Die Vitalität der
Zellen betrug über 90% und durch die Bestimmung im Zellsortierer wurden über 90% Epithelzellen
detektiert. CROIX et al. (2000) benutzen ebenfalls den epithelialen AK (EA clone Ber-EP4), um
Epithelzellen von Endothelzellen zu trennen. ALBAUGHT et al. (1992) und IYENGAR et al. (1991)
isolierten Zellen aus Fezes mittels Percoll-DG und Gegenstromzentrifugation und determinierten
verschiedene zelluläre Marker. WHARF et al. (1997) isolierten nach der Methode von ALBAUGHT et
al. (1992) 2x106 Zellen aus 5-10g Fezes und etwa 4µgDNA/g Fezes, wobei davon ausgegangen
wurde, dass die DNA größtenteils Bakterien-DNA darstellt und der Anteil an Kolonozyten-DNA
sehr gering ist. Die humane DNA erwies sich als hochgradig degeneriert.
Wiederholte Abdrücke von der Fezesoberfläche, die anschließend mikroskopisch ausgewertet wurden, zeigten, dass an der oberen Fezesschicht wenige intakte Zellen vorhanden waren. Lediglich
durch ein Abkratzen der Fezesoberfläche konnten abgeschilferte Zellen mikroskopisch nachgewiesen
werden. In Auswertung der erzielten Ergebnisse wurde davon ausgegangen, dass die Möglichkeit
einer immunomagnetischen Separation intakter vitaler humaner Zellen aus Fezes begrenzt ist.
5.2.2
Wiederfindung applizierter Zellen aus Fezes, Zellvollmedium,
Urin, Blut
In Anlehnung an die Diskussion der bisher erzielten Untersuchungsergebnisse wurde eine grundlegende Klärung der Möglichkeit der immunomagnetischen Zellseparation aus Fezes erforderlich.
Durch Zugabe von HT29c-Zellen und Lymphozyten während der Isolation sollte eruiert werden, ob
die Antigen-AK-Reaktion durch die Anwesenheit von Fezes beeinflusst bzw. gestört wird und ob
zellspezifische Differenzen erkennbar sind. Über 20% der zugesetzten HT29c-Zellen konnten zurückisoliert werden, wohingegen die Wiederfindungsrate der Lymphozyten unter 10% lag. Die
Änderung der Methode von O‘N EILL und LOKTIONOV (1997), mit einem Verzicht auf Borsäure nach
der Fezeswäsche, erbrachte höhere Zellwiederfindungsraten. Die Verwendung von frisch isolierten
Blut-Lymphozyten, um degenerative Veränderungen an der Zelloberfläche durch Einfrieren und
Auftauen der Zellen auszuschließen, führte im Vergleich zu den tiefgefrorenen zu keiner signifikanten Steigerung der Wiederfindungsrate.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Isolation von Zellen aus Fezes mittels magnetisch gekoppelter AK
prinzipiell praktizierbar ist. Es scheint aber, dass das Milieu der Fezes entweder die Epitope auf der
Zelloberfläche oder den AK selbst verändert, so dass die Antigen-AK-Reaktion behindert bzw.
verhindert wird. CROIX et al. (2000) verwiesen bei ihren Untersuchungen darauf, dass die Reinigungsprozedur so zu optimieren ist, dass die Oberflächenproteine der Zellen intakt blieben. Gestützt
wird diese Vermutung durch die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse insofern, als das aus reinem
DISKUSSION
83
Stuhlwaschmedium ohne Fezeszugabe die Rückgewinnungsrate von HT29c-Zellen über 60% und
die der Lymphozyten über 40% (nicht dargestellte Ergebnisse) betrug, während sie in Versuchen mit
Fezes bei 20% bzw. unter 5% lag. IYENGAR et al. (1991) optimierten ihre Isolationstechnik hinsichtlich der prozentualen Menge an zugesetzter Fezes. Eine 4%ige Konzentration von Fezes in PercollPuck´s-Medium erwies sich am effektivsten, wobei darin ca. 50% der radioaktiv-markierten LS-180Zellen zurückgewonnen werden konnten.
Um den Einfluss der Medien auf die immunomagnetische Zellseparation zu bestimmen, wurden
Urin und Zellvollmedium HT29c-Zellen und Lymphozyten zugesetzt. Die besten Wiederfindungsraten konnten aus Zellvollmedium erzielt werden (aufgetaute Lymphozyten: 10,08%, HT29c-Zellen:
61,39%) Durch Isolation frisch isolierter Blut-Lymphozyten aus Medium wurde eine signifikant
höhere Wiederfindungsrate im Vergleich zu den aufgetauten Lymphozyten erzielt. Beim Zusatz der
adäquaten Menge an Bead-gekoppelten AK zu Vollblut mit einer definierten Anzahl an Leukozyten
konnten 70,81% der Zellen wiedergefunden werden, wobei anzufügen ist, dass diese Zellfraktion
auch Granulozyten enthält, die durch die DG weitestgehend eliminiert werden.
Aus Urin belief sich die Wiederfindungsrate in den angeführten Untersuchungen auf 28,93% bzw.
7,87% (HT29c-Zellen und Lymphozyten). Die Vitalität der Zellen sank bei beiden Zelltypen während der Inkubationszeit im Urin signifikant auf unter 40%.
Die vorliegenden Ergebnisse suggerieren, dass Lymphozyten in diesem Isolationssystem empfindlicher reagieren als die Kulturzellen. Aufgrund der bestehenden Datenlage kann davon ausgegangen
werden, dass eine erfolgreiche immunomagnetische Isolation dieses Zelltyps aus Fezes eher unwahrscheinlich ist. Der Literatur konnten keine Angaben über eine erfolgreiche Isolation von Leukozyten
aus Fezes entnommen werden. Die von HANDY et al. (1995) isolierten permeierten Leukozyten
wurden mittels DG aus Darmspülproben separiert.
Die angeführten Ergebnisse legen nahe, dass vitale und stoffwechselaktive Zellen aus Fezes nur
schwer bzw. nicht isolierbar sind. Grenzen der Nutzung dieser abgeschilferten Zellen sind unter
anderem die metabolische und zellzytokinetische Aktivität, die größtenteils unbekannt bzw. ungenügend untersucht sind. Als limitierend für die Verwendung abgeschilferter Zellen muss angemerkt
werden, dass die Oberflächenschicht meist die Umbruchstelle für abgestoßene tote Zellen widerspiegelt und diese Zellen eine geringere Stoffwechselaktivität aufweisen (SALAMA et al. 1999).
5.2.3
Abgeschilferte Urothelzellen
Urin repräsentiert eine weitere Quelle, aus der nicht-invasiv humane Zellen gewonnen werden können. Bei der Untersuchung von urothelialen Zellen in Biomarker-Testsystemen steht die Beeinflus-
DISKUSSION
84
sung molekularer bzw. zellulärer Prozesse und Parameter durch die Exposition des humanen Organismus mit wasserlöslichen Agenzien bzw. deren Metabolite, die über den Urin ausgeschieden
werden, im Vordergrund.
Immunomagnetisch (EA-d*, CD45-d*) konnten keine Zellen aus Urin separiert werden. Durch
einfache Zentrifugation wurden durchschnittlich 0,31x105 Zellen/ml Urin bei weiblichen Probanden
und 0,045x105 Zellen/ml Urin bei männlichen Probanden isoliert. Die Vitalität der Zellen betrug
32,50% bei den weiblichen und 71,38% bei den männlichen Probanden. Dieser Unterschied resultierte wahrscheinlich aus der Differenziertheit der isolierten Zellpopulationen. Im Harnsediment
finden sich Zellen aus den harnableitenden Wegen, den Nieren, dem Blut sowie kristallin ausgefallene Harnsalze und Ausgüsse der Nierenkanälchen. Bei 400-facher Vergrößerung gelten 0-2 Erythrozyten pro Gesichtsfeld im Mikroskop und 0-5 Leukozyten als normal, wobei bei Männern im allgemeinen 0-1Leukozyt als normal angesehen wird. Das entspricht in etwa 2000-3000 Erythrozyten und
4000-6000 Leukozyten je ml Harn. Auch Zellen aus dem äußeren Genitalbereich und Spermatozoen
können im Harnsediment vorliegen. (HEINTZ und ALTHOF 1975).
Aufgrund der Komplexität und gleichzeitigen Heterogenität des Zellsediments aus Urin ist eine
nähere Charakterisierung und Separierung der einzelnen Zelltypen unabdingbar, um diese in nachfolgende Testsysteme zur Detektion modulierbarer (durch ernährungsrelevante Faktoren) molekularer Parameter einzubringen. Für die Erzielung vergleichbarer und reproduzierbarer Ergebnisse ist es
notwendig, ein weitgehend einheitliches charakterisiertes Zellmaterial einzusetzen. Urothelzellen sind
weitverbreitete nicht-invasiv gewonnene Untersuchungsobjekte, wobei meist eine nähere Charakterisierung der Zellen fehlt. So stellen der Mikrokerntest (HOLLAND et al. 2001, MOORE et al. 1997,
MURRAY und EDWARDS 1999), die Detektion von DNA-Addukten (DEMARINI et al. 1997) und der
CA (GONTIJO et al. 2001) bewährte Test-Systeme dar, um den Einfluss wasserlöslicher Expositionsfaktoren auf Urothelzellen zu untersuchen.
Für nachfolgende Forschungsarbeiten wäre der Einsatz spezieller urothelialer AK zu erwägen, um
Urothelzellen spezifisch aus dem Urin zu isolieren. Sollten sich diese Versuche als erfolgreich erweisen, stände ein nicht-invasiv gewonnener Biomarker zur Verfügung. Für wasserlösliche Phytoprotektanten bzw. deren Metabolite oder auch andere wasserlösliche Inhaltsstoffe in der Ernährung würde
die Bestimmung verschiedener Parameter an Urothelzellen einen ebenso wertvollen Hinweis liefern
wie die Analyse von abgeschilferten Kolonzellen.
5.2.4
Orale Zellen
Neben abgeschilferten Kolonozyten und Urothelzellen verkörpern orale Zellen der Mundschleimhaut
eine ideale Möglichkeit in humanem Probenmaterial ernährungsabhängigen Effekte zu erfassen. Die
DISKUSSION
85
Verwendung abgeschilferter Zellen aus der Mundhöhle ist eine sehr effektive Methode, die zur
Etablierung von nicht-invasiven Biomarker-Techniken geeignet ist. Besonderen Vorteil bietet sie bei
der Weigerung der Probanden zur Blutabgabe bzw. bei einer eigenständigen Probennahme seitens
der Testpersonen (GRACIA-CLOSAS et. al 2001). Die Isolierung von Mundschleimhautzellen ist in der
genetischen Toxikologie, bzw. im Bereich des Biomonitorings durchaus eine Methode zur
Expositionserfassung bzw. zur Detektion von Effekten einer spezifischen Exposition. Bei der
Mehrzahl der in der Literatur aufgeführten Untersuchungen wird jedoch nicht auf die Qualität der
gewonnenen Zellen eingegangen. So sind keine Angaben über eine Auftrennung der einzelnen
Zelltypen zu finden. In den meisten Fällen wird davon ausgegangen, dass die isolierte DNA
(FEIGELSON et al. 2001, HARTY et al. 2000a, HARTY et al. 2000b, SATIA et al. 2002, ZHENG et al.
2001) bzw. die eingesetzten Zellen (HOLLAND et al. 2001) buccalen Ursprungs sind. Für die
Biomarker-Anwendung und deren Bewertung ist es jedoch von Bedeutung, genauer zu
determinieren, welche Qualität das primäre humane Probenmaterial aufweist.
5.2.4.1
Ausbeute und Vitalität oraler Zellen aus Mundspülungen
Neben Epithelzellen und Leukozyten kommen in Abhängigkeit von der jeweiligen Isolationsmethodik in Mundspülproben auch Erythrozyten und Fibroblasten vor. In den dargestellten Ergebnissen
betrug der Anteil an Erythrozyten und Fibroblasten weniger als 1%. Diese Zellen sind eher bei sehr
eruptiver Stimulation der Oralmukosa zu beobachten. Der immunochemische Nachweis mit
fibroblasten-spezifischen AK mit anschließender Fluoreszenzfärbung gelang nicht, wohingegen
durch immunomagnetische Separation in einigen wenigen Fällen Fibroblasten nachweisbar waren.
Grund dafür könnte der konzentrierende Effekt der AK-vermittelten Isolation sein. Während beim
immunochemischen Nachweis Teile des gesamten Zellsediments mikroskopisch ausgewertet wurden, erfolgte durch die Bead-gekoppelten AK eine Selektion bzw. Aufkonzentration der Fibroblasten
aus dem Zellsediment.
Den Hauptanteil an Zellen in Mundspülproben bilden mit jeweils ca. 50% Leukozyten und
Epithelzellen, deren Menge inter- and intraindividuell stark variiert und von der Isolationstechnik und
dem physiologischen Status der Probanden abhängt. Schon in älteren Arbeiten wurde darauf
verwiesen, dass mehrere Millionen Leukozyten aus der Mundhöhle innerhalb von wenigen Minuten
isolierbar sind, deren Anzahl bzw. Anteil je ml Speichel sich jedoch nicht exakt bestimmen lässt
(KLINKHAMER 1963). LEE et al. (1994) isolierten 6,5-20,6x106 Epithelzellen pro Mundspülung.
BINDARA (2000) kam zu ähnlichen Ergebnissen und stellte fest, dass es Probanden mit einem
permanent hohen Gehalt an Leukozyten in Mundabstrichen gab, während andere ständig geringere
Mengen an oralen Leukozyten in Abstrichen der Oralmukosa aufwiesen. Nähere Untersuchungen
DISKUSSION
86
zeigten, dass in den Abstrichen von Rauchern durchschnittlich weniger Leukozyten nachweisbar
waren als bei Nichtrauchern. Frauen mit oraler Kontrazeption wiesen nach dem 14. Tag der
Einnahme höhere Leukozytenzahlen auf. Die Anzahl der Zahnfüllungen hatte keinen Einfluss auf die
Quantität der Leukozyten. ENDLER et al. (1999) untersuchten abgeschilferten buccale Zellen in
Mundspülproben nach erfolgter Knochenmarktransplantation. Sie bestimmten 75% Epithelzellen,
deren Ursprung wahrscheinlich beim Empfänger lag, und 25% Leukozyten, deren Ursprung
vermutlich beim Spender zu suchen war. Die Vitalität der Epithelzellen betrug 6,10% und die der
Leukozyten 92,80%, was mit den in dieser Arbeit aufgezeigten Ergebnissen kongruiert. Die Vitalität
der oralen Leukozyten ist abhängig vom Mucus der intrinsischen Drüsen, der eine Schutzfunktion
auf diese Zellen ausübt (KLINKHAMER 1963).
5.2.4.2
Separation oraler Zellen
Die Trennung der verschiedenen Zelltypen ist für nachfolgende Analysen und deren vergleichende
Diskussion notwendig. Es ist von Bedeutung zu wissen, ob ein Parameter an einer Zellpopulation
gemessen wird, die eher lokale bzw. systemische Effekte widerspiegelt, die aufgrund von Kurzzeitbzw. Langzeitexpositionen auftreten. Epithelzellen werden eher als kurzlebige Zellen betrachtet, die
dem Prozess der ständigen Erneuerung unterliegen (EREN et al. 2002), während Lymphozyten eher
als langlebige Zellen gelten, die die Schleimhaut penetrieren können. Die Lebensdauer von Lymphozyten reicht von einigen Stunden bis hin zu Jahren, mit einer durchschnittlichen Lebensdauer von 312 Monaten (STEVEN und DOUGLAS1980).
5.2.4.2.1
Immunomagnetische Separation
Die positive immunomagnetische Selektion von Epithelzellen aus Mundspülungen gelang nicht.
Keiner der eingesetzten epithelialen AK konnte spezifisch an die oralen Epithelzellen binden. Vermeintliche Wiederfindungsraten der >15µm großen Epithelzellen bzw. einzelner Zellverbände waren
eher zufällig und sind durch die Bewegung der Beads zum Magnet zu erklären. Eine spezifische
Bindung an die Bead-gekoppelten AK konnte dabei nicht beobachtet werden. Demgegenüber konnten HT29c-Zellen, die als Kontrollen mitgeführt wurden, positiv durch EA-d, HEA-m, CEA-d und
ESA-d isoliert werden. EMA-d hat nicht spezifisch an die Kontrollzellen gebunden. Durch die Isolation der Kontrollzellen aus Mundspülungen wurden experimentelle bzw. verfahrenstechnische Fehler
nahezu ausgeschlossen. Die abgeschilferten oralen Epithelzellen wiesen eine geringe Vitalität auf,
was auf degenerative Prozesse, auch an der Zelloberfläche, schließen lässt, die zu einer gestörten
Antigen-AK-Reaktion führen können. Des weiteren stellen orale Epithelzellen hoch ausdifferenzierte
Zellen dar, für die es schwierig ist, einen spezifischen AK anzuwenden.
DISKUSSION
87
Die positive Isolation von Epithelzellen verschiedener Gewebe durch EA gelang LATZA et al. (1990).
Sie und andere Autoren (HARDINGHAM et al. 1993, MOMBURG et al. 1987) konnten zeigen, dass das
EA Ber-EP4-Antigen auf der Membran der meisten Epithelzellen exprimiert ist und ähnliche Bindungseigenschaften wie HEA aufweist. EA zeigte in den Versuchen eine hohe Spezifität und Sensitivität, wobei die Reaktion mit buccalen Zellen nicht getestet wurde. CEA wurde eher als unstetiger
Marker (nicht nur maligner Epithelzellen) hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität beschrieben
(BENCHIMOL et al. 1989, DAVIDSON et al. 1999). EMA bindet an verschiedene normale and neoplastische Epithelzellen, wobei die stärkste Reaktion bei Epithelien der Mamma und glandulären Zellen
zu beobachten war (CORDELL et al. 1985). DAVIDSON et al. (1988) dokumentierten eine geringere
Reaktion von EMA mit Kolonepithelien im Vergleich zu CEA (12% versus 71%).
Die Isolation von Leukozyten mittels immunomagnetischer Separation gelang durch den leukozytenspezifischen AK CD45. CD45 ist mit Ausnahme der Erythrozyten auf allen hämopoetischen Zellen
exprimiert (PULIDO et al. 1988). In den in dieser Arbeit angeführten Untersuchungen erwies sich das
System von Dynal im Vergleich zu dem von Macs als effektiver. Nach der Isolation mittels MacsSystem waren im Isolat ein hoher Anteil an Epithelzellen detektierbar. Ursache hierfür könnte in der
Säulentechnik begründet sein. Die >15µm großen Epithelzellen bleiben während der Isolation zwischen den Magnetkugeln der Säule hängen und werden durch den sich anschließenden Spülvorgang
mit in das Eluat überführt. Eine unspezifische Bindung der AK an die toten Zellen wurde ebenfalls
diskutiert. Dem widersprechen jedoch die homogenen Ergebnisse, die mittels Dynal-System gewonnen wurden.
5.2.4.2.2
Isolation durch Dichtegra dientenzentrifugation
Die DG ist eine allgemein bekannte Methode zur Isolation von Lymphozyten aus dem Blut (BOYUM
1968). Auch für die Isolation von Leukozyten aus Mundspülungen konnte die DG erfolgreich angewandt werden, wobei die Wiederfindungsrate an Leukozyten sehr gering ausfiel. Die Zellzählung vor
der Isolation beinhaltete in der Leukozytenfraktion Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten.
Monozyten, T-Zellen and B-Zellen haben dieselbe Dichte wie Histopaque (1,07g/ml) und können
nach der Zentrifugation isoliert werden. Nicht degranulierte Granulozyten mit einer Dichte von
1,08g/ml akkumulieren sich im Sediment, wobei einzelne degranulierte Granulozyten in der lymphozyten-enthaltenden Schicht vorkommen können (WEGENER und MUELLER-ECKHARD 1998). Die
Gewinnung der Mundspül-Proben an sich (physiologische, chemische und mechanische Stimuli)
können Ursache für eine Degranulation sein. Im Sediment wurden nach der DG Epithelzellen, Erythrozyten sowie granulierte und degranulierte Granulozyten beobachtet. Trotzdem konnten in dem
Isolat nach der DG mit Essigsäure (1:6 verdünnt mit Wasser) wenige Granulozyten (ca. 15µm,
DISKUSSION
88
deutlich erkennbarer segmentierter Nukleus, Granula und ein hoher Anteil an Zytoplasma) nachgewiesen werden. Monozyten und Lymphozyten [9-12µm (Monozyten etwas größer), größerer Nukleus, weniger Zytoplasma] wurden ebenfalls mikroskopisch analysiert werden. Die geringere Wiederfindung von Leukozyten im Vergleich zur immunomagnetischen Separation ist mit dem Verlust
der Granulozyten nach der DG zu erklären.
Durch die Anwendung eines speziellen Kits (Leu) zur Erleichterung der DG konnte keine Separation
der Leukozyten von den Epithelzellen erzielt werden. Der Anteil an Epithelzellen und Leukozyten
nach der Auftrennung war annähernd gleich dem Ausgangsniveau. Die Epithelzellen bzw. –verbände
sind zu groß, um die Öffnung der Filterscheibe zu passieren.
5.2.4.2.3
Vergleichende Diskussion der Isolationsmethoden
Der Vergleich der immunomagnetischen Separation mit der DG zeigt ähnliche Wiederfindungsraten
an Leukozyten. Der AK CD45 reagiert mit Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten, wohingegen bei der DG die Mehrheit an Granulozyten ausgeschlossen wird. Aus Blut können ca. 1x106
Leukozyten je ml isoliert werden (WEGENER und MUELLER-ECKHARD 1998). In den angeführten
Untersuchungen konnten durchschnittlich (absolut) 0,29x106 Leukozyten immunomagnetisch und
0,86x106 durch DG aus Mundspülungen isoliert werden.
Unter Berücksichtigung aller angewandten Separationsmethoden erwies sich die Filtration über ein
10µm-Filcon hinsichtlich der Wiederfindungsrate an Leukozyten am effektivsten, wobei im Eluat ein
höherer Anteil an Epithelzellen bestimmt wurde als bei der DG und der immunomagnetischen Separation. Die Kontamination des Eluats mit Epithelzellen nach der Filtration sinkt mit ansteigender
Größe der Zellen. Die Membran der Epithelzelle ist sehr flexibel, so dass diese auch ohne Druck die
10µm-Filtermembran passieren können. ASHEKENAZI und DENNISON (1989) separierten Leukozyten
aus Mundspülungen durch Filtration durch 20µm- und 10µm-Filter und detektierten Leukozyten und
Epithelzellen in einem Verhältnis von 97,7:2,3. Nach 20-minütiger Mundspülung konnten sie 430x106 polymorphkernige Leukozyten isolieren. Nach der DG beobachteten die Autoren eine höhere
Kontamination der Leukozytenfraktion mit Bakterien und Epithelzellen. YAMAMOTO et al. (1991)
filtrierten Mundspülungen durch ein „300-maschiges Nylonsieb“ und bestimmten über 90% polymorphkernige Leukozyten im Eluat.
Signifikant geringere Vitalitäten der Leukozyten wurden nach immunomagnetischer Separation
(CD45-d*) festgestellt, während bei den anderen Isolationstechniken die Vitalität über 75% betrug.
ASHEKENAZI and DENNISON (1989) und YAMAMOTO et al. (1991) beobachteten ähnliche Zellvitalitäten (≈85% und >90%). Die Ursache für die geringe Vitalität der Zellen nach immunomagnetischer
Separation könnte in den angewandten Inkubationsbedingungen (RT, 20min) begründet sein. Die
DISKUSSION
89
Auswirkung der Temperaturänderung auf die Vitalität der Zellen wäre in nachfolgenden Versuchen
zu untersuchen. Eigene unveröffentlichte Voruntersuchungen haben gezeigt, dass die DNA immunomagnetisch-gekoppelter Leukozyten stärker geschädigt war (nach CA) als nach den anderen
angewandten Isolationstechniken. Dieser Effekt könnte Ursache der beeinträchtigten Vitalität sein.
In Auswertung der erzielten Ergebnisse sollte die Wahl der Isolationsmethodik in Abhängigkeit der
nachfolgenden angewandten Untersuchungsmethoden erfolgen. Die Filtration über 10µm-Filcons ist
preiswert, einfach, schnell und garantiert hohe Wiederfindungsraten, wobei jedoch die Kontamination des Isolats mit Epithelzellen höher war als bei der immunomagnetischen Separation und DG. Der
Vorteil der AK-vermittelten Isolation besteht in der Spezifität der Auftrennung, je nach Wahl des
AK. Eine Kombination der aufgeführten Separationstechniken wäre denkbar, um eine spezifische
Zellpopulation zu erhalten. Für die Entscheidung über die angewandte Isolationstechnik von Zellen
aus Mundspülungen im Rahmen von Interventionsstudien muss die Durchführbarkeit ebenfalls
berücksichtigt werden.
Die Verwendung von oralen Schleimhautzellen ist relativ weit verbreitet in der Expositionserfassung,
weil sie eine nicht-invasive Methode der Probengewinnung repräsentiert. Die Untersuchungen, die
hier beschrieben sind, zeigen, welche Zellen im heterogenen Mundspülungsgemisch vorhanden sind
und wie die inter- und intraindividuelle Ausbeute und Vitalität der Zelltypen zu beurteilen ist. Durch
die Ergebnisse kann die eindeutige Aussage gemacht werden, dass die sogenannten oralen bzw.
buccalen Zellen, mit denen cytogenetische Endpunkte bestimmt werden (EREN et al. 2002, ROJAS
et al. 1996, VALVERDE et al. 1997), zur Hälfte aus vitalen Leukozyten und zur anderen Hälfte aus
toten Epithelzellen bestehen. Die vitalen Leukozyten lassen sich für die Messung von neuen
funktionellen Parametern einsetzen, die gerade für die zukünftige Untersuchung von protektiven
Wirkungen durch Ernährungsfaktoren von besonderem Wert sein werden.
5.2.4.3
Orale Zellen als Biomarker des Effekts - Genotoxizitätsunters uchungen im
Rahmen der Brotstudie
Die Ausbeute und das Verhältnis von Leukozyten zu Epithelzellen in Mundspülproben ist abhängig
von der Art der Isolationsmethode und dem physiologischen Status der Individuen. Sie unterliegen
großen inter- und intraindividuellen Schwankungen.
Die Untersuchungen von Mundspülungen von Rauchern und Nichtrauchern in den unterschiedlichen
Interventionsphasen der Brotstudie zeigten keine signifikanten Veränderungen in der Ausbeute, dem
Verhältnis und der Vitalität der oralen Zellen. Ebenfalls keine signifikanten Veränderungen dieser
Parameter waren beim Vergleich zwischen Rauchern und Nichtrauchern feststellbar.
DISKUSSION
90
Aufgrund des günstigeren Verhältnisses von Leukozyten zu Epithelzellen mit moderaten Wiederfindungsraten und guten Vitalitäten der Zellen nach der Separation wurde für weiterführende Arbeiten
die Isolation der Leukozyten mittels DG verwendet. Dabei garantierte ein möglichst hoher Anteil an
Zielzellen auf den OT eine präzisere Detektion der DNA-Signale im CA und erleichterte zudem die
Auswertung.
Die Untersuchung der isolierten oralen Leukozyten von 23 Probanden der Brotstudie im CA erbrachte keine Veränderung der SB-Raten der DNA sowie der oxidierten Purin- und Pyrimidinbasen durch
den Verzehr des speziellen Brotes (PRÄ-AOX-Brot und PRÄ-Brot).
Mit Ausnahme der ersten Versuchsphase wiesen Raucher eine höhere Rate an DNA-SB auf. Darüber
hinaus waren die oxidierten Purin- bzw. Pyrimidinbasen bei den Rauchern teilweise höher als bei den
Nichtrauchern. Nach Kenntnis der Autorin wurden mit dieser Versuchsdurchführung zum ersten Mal
orale Leukozyten dem CA unterzogen, um die DNA der Zellen auf mögliche Unterschiede in ihrer
Integrität zu untersuchen.
Parallel zu den Untersuchungen der oralen Leukozyten untersuchte NINA HABERMANN
(HABERMANN 2003, persönliche Mitteilung) periphere Blutlymphozyten von Probanden der Brotstudie im CA. Unter Berücksichtigung der gleichen Probanden führte der Verzehr des speziellen Brotes
zu keiner signifikanten Veränderung der DNA-SB-Rate und der Rate an oxidierten Purin- und Pyrimidinbasen bei den peripheren Blutlymphozyten. Zwischen Rauchern und Nichtrauchern wurde ein
signifikanter Unterschied in der Rate an oxidierten Pyrimidinbasen in der Phase III bei den Probanden festgestellt, die das PRÄ-Brot konsumiert hatten. Ansonsten konnten zwischen Rauchern und
Nichtrauchern keine signifikanten Unterschiede in der DNA-Integrität der peripheren Blutlymphozyten festgestellt werden.
Alle Interventionsphasen zusammengefasst, getrennt nach Rauchern und Nichtraucher, ergaben sich
für die peripheren Blutlymphozyten und oralen Leukozyten folgende Werte für die TI:
⇒ periphere Lymphozyten von Rauchern [SB, oxidierte Purin- und Pyrimidinbasen, MW±SD (n)]:
9,08±3,20% (13); 2,54±3,31% (13); 1,70±3,35% (13)
⇒ periphere Lymphozyten von Nichtrauchern [SB, oxidierte Purin- und Pyrimidinbasen, MW±SD (n)]:
9,75±2,83% (8); 1,66±2,63% (8); 2,84±3,77% (8)
⇒ orale Leukozyten von Rauchern [SB, oxidierte Purin- und Pyrimidinbasen, MW±SD (n)]:
13,63±5,43% (14); 7,00±4,40% (14); 6,05±4,80% (9)
⇒ orale Leukozyten von Nichtrauchern [SB, oxidierte Purin- und Pyrimidinbasen, MW±SD (n)]:
9,86±3,37% (9); 7,06±3,12% (9); 10,19±4,42% (4)
DISKUSSION
91
Das gesamte Probandenkollektiv, getrennt nach Rauchern und Nichtrauchern, betrachtend, war der
Unterschied in der TI zwischen oralen Leukozyten und den peripheren Blutlymphozyten mit
Ausnahme der SB-Rate der Nichtraucher signifikant.
Ebenfalls einen Vergleich der Sensitivität von buccalen Zellen und Blutlymphozyten im CA nach
oraler Exposition von Chlorohexidin-Digluconat führten EREN et al. (2002) durch. Dabei stellten sie
einen höheren Grad der DNA-Schädigung der buccalen Zellen im Vergleich zu den Blutlymphozyten fest, den sie auf eine zu geringe Konzentration von Chlorohexidin-Digluconat und der damit
verbundenen minimalen Absorption zurückführten. Eine nähere Charakterisierung der Zellen wurde
jedoch nicht angestrebt. VRZOC und PETRAS (1997) unterzogen Lymphozyten aus der Milz und dem
Blut dem CA und stellten hinsichtlich der Basisdaten keine signifikanten Unterschiede fest. Signifikant höher fiel der Prozentsatz geschädigter Zellen 48h nach der Injektion von Methansulfonat bei
den Milz-Lymphozyten aus. Dieser Unterschied könnte aus dem differenten Verhältnis an B- und TLymphozyten in beiden Quellen resultieren. VALVERDE et al. (1997) konnten mittels CA an Zellen
der Wangenschleimhaut keine signifikanten Veränderungen durch umweltrelevanter Expositionsfaktoren feststellen.
In Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus der durchgeführten Brotstudie mit Rauchern und
Nichtrauchern, wurde der schädigende Einfluss des Rauchens auf zelluläre Parameter an verschiedenen Zelltypen ebenfalls nachgewiesen. So bestimmten ROJAS et al. (1996) eine signifikant höhere
DNA-Schädigung von buccalen Zellen im CA in der Gruppe der Raucher und GONTIJO et al. (2001)
an primären Urothelzellen. BETTI et al. (1995), BETTI et al. (1994) und DHAWAN et al. (2001) beschrieben eine signifikante Erhöhung der DNA-Migration in Blutlymphozyten bei Rauchern. Die
Tatsache, dass Rauchen kanzerogene Prozesse fördert, ist bekannt und bewiesen. Durch die Verbrennung von Tabak entstehen neben aromatischen Aminen und tabakspezifischen Nitrosaminen auch
polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, deren Metabolite genotoxische und karzinogene
Effekte an der DNA bewirken können. Der Tabakrauch enthält weiterhin Verbindungen, die zu
oxidativen DNA-Veränderungen führen können (HECHT 1999). Inhaltsstoffe der Nahrung können
durch Abfangen der freien Radikale bzw. durch Störung der Bindung der Karzinogene an die DNA
den Verlauf der Karzinogenese beeinflussen (ROGERS und LONGNECKER 1988). Dazu wurden in den
letzten Jahren zahlreiche Untersuchungen mit antioxidativ wirkenden Nahrungsinhaltsstoffen, u. a.
mit antioxidativ wirkenden Vitaminen, durchgeführt (JACOBSEN et al. 2000, PORRINI et al. 2002,
THOMPSON et al. 1999, TSUDA et al. 2000). In der durchgeführten Brotstudie führte der Verzehr von
Brot mit antioxidativen Inhaltsstoffen zu keiner Beeinflussung der DNA-Integrität. JACOBSEN et al.
(2000) erreichten durch eine Supplementation mit antioxidativen Vitamine eine Reduktion der DNA-
DISKUSSION
92
Schädigung bei Rauchern. PORRINI et al. (2002) konnten durch Supplementierung von Spinat und
Tomatenpüree ebenfalls einen erhöhten Schutz der DNA gegenüber H2O2 erzielen. Die Untersuchung von Präbiotika auf mögliche positive Effekte auf Parameter, die hinweisgebend auf Prozesse
kanzerogener Entartung sind, erfolgte bisher mehrheitlich in Tierversuchen (GRIZARD und
BARTHOMEUF 1999). REDDY et al. (1997) und ROWLAND et al. (1998) wiesen eine Reduktion des
Risikos von Kolonkrebs durch die Hemmung der Entwicklung abnormer Krypten im Kolongewebe
nach Verabreichung von Präbiotika nach. In den Untersuchungen im Rahmen der Brotstudie konnte
keine Modulation der DNA-Integrität an oralen Leukozyten durch den Verzehr von Brot beobachtet
werden, das mit präbiotischen Zusatzstoffen supplementiert war.
Mit der Durchführung dieser Studie wurden erstmals gezielt isolierte orale Leukozyten dem CA, als
Biomarker-Testsystem für Genotoxizitätsuntersuchungen, unterzogen. Durch die selektive Isolation
dieser Zellen stehen für nachfolgende Versuchsanordnungen und Interventionsstudien exzellent
charakterisierte, nicht-invasiv gewonnene Zellen zur Einbringung in sich anschließende Versuchsdurchführungen zur Verfügung, um exogene Einflüsse auf molekulare Parameter zu bestimmen.
5.2.4.4
Status der Histonacetylierung in oralen Zellen als Marker der Modulation
der Genexpression
Das Altern der Zelle infolge des Regulationsverlustes, Transkriptionsanomalien und kanzerogener
Entartung sind Prozesse, die mit lokaler Hypo- und Hyperacetylierung in Zusammenhang stehen. Als
Mechanismen der Modulation der Histonacetylierung sind die Hemmung der HistonAcetyltransferasen (durch virale Onkoproteine, Mutationen der Gene der Histon-Acetyltransferasen,
exogene Noxen wie z. B. Ni2+) und die Aktivitätssteigerung der Histon-Deacetylasen (anormale
Bindungseigenschaften durch veränderte zelleigene Proteine) bekannt (ARCHER und HODIN 1999,
GRUNSTEIN 1997, STRUHL 1998, WEIDLE und GROSSMANN 2000, WU et al. 2001). In der vorgelegten Arbeit wurde der Acetylierungsstatus des H4 in oralen Zellen (als Mischpopulation eingesetzt)
durch elektrophoretisch Auftrennung dieser in einem Säure-Harnstoff-Gel untersucht. Im Rahmen
zahlreicher Untersuchungen konnten keine scharfen Banden der H4-Histone erzeugt werden. Die
Proben der primären Mundschleimhautzellen stellten sich auf den Gelen zumeist als Schleier dar.
Sehr hohe Proteinkonzentrationen, bei denen über 40µg Protein aufgetragen wurden, ließen leichte
Banden erkennen. Diese Menge konnte nur dann aufgetragen werden, wenn die Ausgangskonzentration nach der Histonisolierung ausreichend hoch war. Die Aufkonzentration der Proben wurde durch
die Löslichkeit der Histone begrenzt, so dass ein Poolen der Proben nicht durchgeführt wurde. Die
Veränderung der Isolationsprozedur durch verlängertes Stößeln der Zellen, Zerstörung der Zellen
durch Ultraschall und Veränderung der Konzentration der Histonaufnahmepuffer hatte keinen positi-
DISKUSSION
93
ven Effekt. Bei den als Kontrolle mitgeführten HT29c-Zellen konnten demgegenüber in allen Versuchen H4-Banden detektiert werden. Auch ein vorheriges Abtöten der Kontrollzellen, was den Zustand der relativ invitalen Epithelzellen simulieren sollte, beeinflusste die Banden des H4 nicht. WU et
al. (2001) konnten in HT29-Zellen durch TrichostatinA und Butyrat eine Hemmung der Histonacetylase, verbunden mit der Hyperacetylierung des H4, nachweisen. Ähnliche Ergebnisse erzielten
YOSHIDA et al. (1996) an HL-60-Zellen.
Nach gegenwärtigem Kenntnisstand ist die Bestimmung des Acetylierungsstatus mittels elektrophoretischer Auftrennung in einem Säure-Harnstoff-Gel für orale Zellen auf diese Weise nicht geeignet.
Der Einsatz einer isolierten reinen Zellpopulation aus den Mundspülproben gestaltet sich als nicht
perspektivisch, da die Zellzahlen und damit verbunden die Proteinkonzentrationen zu gering sind, um
acetylierte Histone derartig nachzuweisen. Lediglich ein Poolen der Proben nach der Zellseparation
wäre denkbar und könnte Ziel nachfolgender Untersuchungen sein. Auch mit anderen primären
humanen Zellen (Lymphozyten) gestaltete sich der Nachweis des acetylierten H4-Statuses bisher
schwierig (KIEFER 2001, persönliche Mitteilung). Als ein alternatives Nachweisverfahren der Modulation der Histonacetylierung wäre für nachstehende Versuchsansätze die Detektion der Aktivitäten
der Histondeacetylasen bzw. der Acetyltransferasen naheliegend (GRUNSTEIN 1997, MARKS et al.
2000, WEIDLE und GROSSMANN 2000).
Die in Zusammenarbeit mit ANGELA MITTAS (2002) durchgeführten Untersuchungen zur Bestimmung der GST-Aktivität in oralen Zellen (als Mischpopulation eingesetzt) zeigten, dass Enzymaktiviäten oraler Zellen von 7 gesunden Probanden nachweisbar waren. Die GST-Aktivität der oralen
Zellen war geringer als die der HT29c-Zellen und peripherer Blutlymphozyten (Abb. A5, Anhang)
und betrug durchschnittlich 0,24±0,14 nmol/min per µg Protein.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
94
6 SCHLUSSFOLGERUNGEN
Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen dienten der Etablierung neuer, nicht-invasiver,
funktioneller Biomarker-Techniken zur Erfassung molekularer Schutzparameter der Karzinogenese.
Im ersten Teil der Untersuchungen wurde die Erfassung der genotoxischen Belastung im
Darmlumen durch Bestimmung der genotoxischen Wirkung von FW an humanen Zellen unter
Verwendung des CA etabliert. Es wurden erstmalig die Basisdaten für das Ausmaß der intraund
interexperimentellen sowie –individuellen Variationsbreiten bestimmt. Die Überprüfung der
Abhängigkeit von Ernährungsfaktoren auf die genotoxischen Wirkungen des FW wurde im Rahmen
von Ernährungsinterventionsstudien weiter untersucht.
⇒ Aufgrund der geringen intraund interexperimentellen Variationsbreite bei der
Durchführung des CA mit FW steht ein geeignetes Testsystem zur Detektion genotoxischer Wirkungen mit einer exzellenten Reproduzierbarkeit zur Verfügung. Die geringe interexperimentelle Variation erlaubt den Vergleich der Daten aus unterschiedlichen Versuchen.
⇒ Der Verzehr identischer Diäten führte zu keiner signifikanten Verringerung der intraund interindividuellen Variabilität der Genotoxizität von FW. Unter Berücksichtigung der Daten aus der Literatur scheinen v a. die Dauer des Verzehrs identischer
Diäten sowie die individuell unterschiedliche physiologische Konstitution einen Einfluss auf die Variabilität der Genotoxizität der FW auszuüben.
⇒ Der Einfluss exogener Expositionen, z. B. durch nutritive Faktoren, konnte trotz der
relativ großen intraund interindividuellen Variationsbreiten der genotoxischen Aktivität der FW bestimmt werden. Wenn jeder Proband seine eigene Kontrolle ist,
können signifikante Effekte ermittelt werden.
⇒ Die FW-Genotoxizität konnte durch eine alimentäre Intervention beeinflusst werden.
Eine Modulation dieses „Biomarkers“ ist damit möglich.
⇒ Die grundsätzliche genotoxische Wirkung von FW ist als Risiko zu bewerten. Die
Möglichkeit durch die Ernährung (lebenslang vorhandene Exposition), die Genotoxizität zu verringern, ist hinsichtlich einer anzustrebenden Krebsprophylaxe durch die
Ernährung als sehr wichtig zu beurteilen.
Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Gewinnung abgeschilferter Zellen aus
humanen Probenmaterial, die anschließend in Biomarker-Testsystemen eingebracht wurden.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
95
⇒ Aus Fezes ließen sich immunomagnetisch keine intakten vitalen Zellen isolieren. Die
Untersuchung der Fezesoberfläche verdeutlichte, dass nur wenige intakte abgeschilferte Zellen auf der Oberfläche nachweisbar waren, was die Möglichkeit der Isolation begrenzt.
⇒ Der Vergleich der Zellrückgewinnung aus verschiedenen Medien zeigte, dass die
immunomagnetische Zellseparation prinzipiell möglich ist. Für den Erfolg der Isolation scheinen intakte Zelloberflächenproteine, die die Antigen-AK-Reaktion vermitteln, von herausragender Bedeutung zu sein. Sowohl das Medium, in dem die Separation erfolgt, als auch der Zelltyp beeinflussen die antikörpervermittelte Zellisolation. Lymphozyten repräsentieren den empfindlicheren Zelltyp. Die geringsten Zellisolationsraten wurden aus Fezesspülungen und Urin determiniert.
⇒ Die Zellisolation aus Urin mittels Zentrifugation war effektiver als die immunomagnetische Separation. Aufgrund der Komplexität und Heterogenität des Zellsediments ist eine nähere Charakterisierung und Separierung der einzelnen Zelltypen unabdingbar, um aussagekräftige Ergebnisse aus nachfolgenden Untersuchungen zu erzielen.
⇒ Mundspülproben repräsentieren eine ideale Möglichkeit, um nicht- invasiv an humanes Probenmaterial in Form von Zellen zu gelangen. Die Untersuchungen zeigten,
dass die sogenannten buccalen Zellen, die in der Literatur als vielfach eingesetzte
Zellen zur Charakterisierung zytogenetischer Endpunkte beschrieben wurden, zu ca.
50% aus invitalen Epithelzellen und ca. 50% vitalen Leukozyten bestehen. Die Le ukozyten weisen dabei eine Vitalität von durchschnittlich über 75% auf und sind geeignete Zielzellen für sich anschließende Untersuchungen zur Detektion zellulärer
Parameter.
⇒ Orale Leukozyten sind im Gegensatz zu Epithelzellen durch immunomagnetische
Separation, Dichtegradientenzentrifugation und Filtration separierbar. Die Wahl der
jeweiligen Separationsmethode sollte in Abhängigkeit der sich anschließenden Versuchsdurchführung erfolgen.
⇒ Im Rahmen einer Ernährungsinterventionsstudie konnten separierte orale Leukozyten
erfolgreich auf deren DNA-Integrität im CA untersucht werden. Raucher wiesen höhere DNA-Schäden als Nichtraucher auf. Damit eignen sich diese Zellen, um eine
genotoxische Modulation durch exogene Expositionsfaktoren anzuzeigen.
⇒
Die vitalen Leukozyten lassen sich für die Messung von neuen funktionellen Parametern einsetzen, die gerade für die zukünftige Untersuchung von protektiven Wirkun-
SCHLUSSFOLGERUNGEN
96
gen durch Ernährungsfaktoren von besonderem Wert sein werden. Hierzu gehören
die Bestimmung der Genexpression und der Genotoxizität, wobei in der vorliegenden
Arbeit ge zeigt wurde, dass der Nachweis des letzteren Parameters mit dem CA effizient gelingen kann.
Die in dieser Arbeit etablierten Biomarker-Techniken ermöglichen gerade auf dem Gebiet der Chemoprävention zelluläre Parameter zu bestimmen, die mit kanzerogenen Prozessen assoziiert sind. Der
Vorteil der dargestellten Techniken ergibt sich aus der nicht-invasiven Gewinnung des humanen
primären Probenmaterials. In nachfolgenden Untersuchungen ist die Eignung der angeführten Methoden für großangelegte Interventionsstudien zu ergründen, wobei den oralen Leukozyten besonderes Interesse gelten sollte.
ZUSAMMENFASSUNG
7
97
ZUSAMMENFASSUNG
EINLEITUNG: Epidemiologische Erhebungen weisen einen engen Zusammenhang zwischen den
Lebensgewohnheiten und kanzerogenen Entartungen der verschiedenen Gewebe auf. Ungünstige
Ernährungsgewohnheiten sind ursächlich mit ca. einem Drittel an der Entstehung bösartiger Tumore,
v. a. des Verdauungstraktes, beteiligt. Im Gegensatz dazu wirken einige Pflanzeninhaltsstoffe bzw.
deren Metabolite kanzeroprotektiv. Epidemiologische Untersuchungen zeigen aber teilweise kontroverse Ergebnisse. Biomarker in Form experimenteller molekularer Parameter können Hinweise auf
ein mögliches Risiko bzw. auf protektive Effekte geben. Derzeit existieren keine validierten Biomarker-Techniken, die die Zusammenhänge an gesunden Humanproben eindeutig widerspiegeln. Daher
ist es derzeit von Bedeutung, neuartige, funktionelle Biomarker-Techniken zu etablieren. Die Möglichkeit der nicht-invasiven Probengewinnung ist Vorraussetzung, um protektive bzw. schädigende
Effekte an gesunden humanen Proben zu untersuchen.
ZIEL: Die Zielstellung der Arbeit war daher:
1. Untersuchung der Genotoxitziät von FW an humanen Zellen: Bestimmung von Basisdaten,
Variationsbreiten und Modulation des Parameters
2. Nutzung von abgeschilferten humanen Zellen als Biomarker-Zielzellen: Verbesserung der
Isolierungsmethoden, Bestimmung von Basisdaten (Quantität, Qualität und Ausbeute, Charakterisierung der aus Fezes, Urin und Mundschleimhaut isolierten Zellen) und der Reproduzierbarkeit der Isolierung, Findung neuer molekularbiologischer Marker mit diesen Zellen
und Untersuchung der Modulierbarkeit der Parameter
METHODEN: Zu 1.: Nach der Isolation des FW, der flüssigen Phase der Fezes, durch Ultrazentrifugation (25000xg) aus frisch gewonnener Fezes wurde die genotoxische Aktivität im CA bestimmt,
indem FW in einer Konzentration von 10% einer Zellsuspension (HT29c-Zellen und Lymphozyten)
zugesetzt wurde. Nach Beendigung der Inkubation (30min, 37°C) wurde die Zytotoxizität (Trypanblau-Ausschlusstest) bestimmt, die Zellen auf vorbeschichtete OT aufgetragen und lysiert (>1h,
4°C). Die Detektion oxidierter DNA-Basen erfolgte durch zusätzliche Inkubation der Zellen mit
Endo III und FPG (45min, 37°C) vor der elektrophoretischen Auftrennung (300mA, 25V, 20min).
Nach Abschluss der MGE wurden die OT mit Ethidiumbromid angefärbt und fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet. Als Basisdaten wurden die intraund interexperimentelle sowie -individuelle
Variation der FW-Genotoxizität aus verschiedenen Probandengruppen untersucht. Im Gegensatz zu
den Probanden der Laborgruppe und der Leinsaatstudie verzehrten die Probanden der Phosphatstudie
I und II eine standardisierte Diät. Das ermöglichte den Vergleich der intraund interindividuellen
ZUSAMMENFASSUNG
98
Variationsbreite der FW-Genotoxizität in Abhängigkeit von der Diät. Die Ernährungsinterventionsstudien wurden vom Lehrbereich „Ernährungsphysiologie“ konzipiert.
Zu 2.: Die Zellseparation aus Fezes erfolgte immunomagnetisch durch Bead-gekoppelte epitheliale
(EA, HEA) und leukozytenspezifische (CD45) AK. Aus Urin wurden die Zellen neben der immunomagnetischen Separation durch einfache Zentrifugation (400xg, 8min) isoliert. Um die Technik
der immunomagnetischen Zellseparation zu charakterisieren, wurden die Wiederfindungsraten und
Vitalität applizierter HT29c-Zellen und Lymphozyten aus den Medien Urin, Fezes, Blut Zellvollmedium bestimmt. Orale Zellen wurden durch Mundspülung gewonnen und deren Zellzahl, Vitalität
und Anteil durch Trypanblau-Ausschlusstest bestimmt. Die Separation der oralen Zellen erfolgte
immunomagnetisch (HEA, EA, ESA, EMA, CEA, CD45), durch zwei Varianten der DG und durch
Filtration über 10µm-Filcons. Die DNA-Integrität isolierter oraler Leukozyten von Probanden der
Brotstudie wurde mittels CA bestimmt. Als weitere Endpunkte möglicher Biomarker-Entwicklungen
wurde der Acetylierungsstatus des Histons H4 (Marker für modulierte Genexpression) bestimmt.
Dazu wurden die Histone durch Kernlyse mit anschließender Säureextraktion isoliert, elektrophoretisch (umgekehrter Polung, 400V, 24h) auf einem Säure-Harnstoff-Gel aufgetrennt und nach Coomassie-Blue-Färbung colourimetrisch ausgewertet.
ERGEBNISSE: ZU 1.: Die untersuchten FW wirkten weder an HT29c-Zellen noch an primären
Lymphozyten zytotoxisch. Die Inkubation der beiden Zellarten mit FW von 6 verschiedenen Probanden zeigte, dass 5 der 6 FW DNA-Schäden induzierten. Signifikante Unterschiede in der Empfindlichkeit von Lymphozyten (TI: 10,37±3,43%) und HT29c-Zellen (TI: 8,77±1,80%) wurden nicht
festgestellt. Aufgrund der für die Fragestellung höheren Relevanz der Kolonzellen, HT29c-Zellen,
und deren besseren Handhabung wurden ausschließlich diese für die nachfolgenden Untersuchungen
verwendet. Die zur Detektion der intraindividuellen Variationsbreite isolierten FW (von 2 Probanden
über 6 Wochen) zeigten ein sehr unterschiedliches genotoxisches Potential. In Bezug auf die intraund interexperimentelle und –individuelle Variabilität der Genotoxizität der FW im CA ließ sich
folgendes feststellen: Die intraexperimentelle (HT29c-Zellen: 3,54-30,77%) Variation entspricht in
etwa der interexperimentellen Variationsbreite (HT29c-Zellen: 9,53-19,16%). Der Grad der interexperimentellen Variation ist geringer als der der intraindividuellen Variation. Die intraindividuelle
Variationsbreite (29,76-76,63%) liegt auf einem ähnlichen Niveau wie die interindividuelle Variation
(21,30-64,00%). Der Verzehr definierter Diäten hatte keinen Einfluss auf die intraund interindividuelle Variation der Genotoxizität von FW.
Durch den Verzehr von Rohwurst, die mit 5x109KBE von Lactobacillus casei angereichert war,
wurden keine Veränderung der Zytotoxizität und Genotoxizität von FW im CA beobachtet.
ZUSAMMENFASSUNG
99
Eine Intervention mit 200g Leinsaatbrot pro Tag führte zu einer signifikanten Reduktion der Genotoxizität der FW. Die Zytotoxizität wurde nicht beeinflusst.
Zu 2.: Eine Isolation abgeschilferter humaner Enterozyten und Leukozyten aus Fezes durch immunomagnetische Separation gelang nicht. Obwohl auf der Fezesoberfläche intakte abgeschilferte
Zellen nachgewiesen werden konnten, wurde die Quantität der Zellen als gering eingeschätzt. Der
Fezes zugesetzte HT29c-Zellen und Leukozyten wurden erfolgreich zurückisoliert. Aus Zellvollmedium (61,39±7,39% für HT29c-Zellen und 10,08±11,24% für Lymphozyten) konnten die höchsten
Zellwiederfindungsraten registriert werden, wohingegen sie aus Urin (28,93±15,16% für HT29cZellen und 7,88±6,18% für Lymphozyten) und Fezes (20,63±3,12% für HT29c-Zellen und
1,35±1,21% für Lymphozyten) am niedrigsten ausfielen. Die Wiederfindungsraten der Lymphozyten
waren in allen Medien geringer als die der HT29c-Zellen.
Urotheliale Zellen konnten immunomagnetisch mittels epithelialer und leukozyten-spezifischer AK
aus dem Urin nicht isoliert werden. Durch Zentrifugation waren 0,031±0,0034x106 Zellen bei weiblichen und 0,0045±0,0004x106 Zellen bei männlichen Probanden je ml Urin isolierbar. Die Vitalität
der Zelle war bei den männlichen Probanden signifikant höher.
Mit großer intraund interindividuellen Variationsbreite konnten aus den mischzelligen Suspensionen von Mundspülungen durchschnittlich 3,74±2,66x106 Leukozyten und 3,45±1,47x106 Epithelzellen detektiert werden. Damit stellen diese beiden Zellpopulationen neben Erythrozyten und
Fibroblasten (<1%) die Hauptzellfraktionen in Mundspülproben dar. Die Vitalität der Epithelzellen
lag im Durchschnitt unter 7%, die der oralen Leukozyten über 90%. Die immunomagnetische Separation oraler Epithelzellen durch epitheliale AK (EA, HEA, EMA, CEA, ESA) gelang nicht. Orale
Leukozyten konnten dagegen durch DG, immunomagnetische Separation (CD45) und Filtration über
10µm-Filcons erfolgreich isoliert werden. Immunomagnetisch wurden Wiederfindungsraten von
37,23±13,33% im Dynal- und 35,44±16,90% im Macs-System erreicht. Mit einem Anteil von
2,73±3,02% Epithelzellen erwies sich das System von Dynal im Vergleich zu dem von Macs
(24,31±14,50%) als effektiver im Hinblick auf die Reinheit der isolierten Leukozyten. Die Wiederfindungsrate an Leukozyten durch klassische DG betrug 21,50±16.54%, wobei ein Zellanteil von
94,42±4,32% im Isolat zu finden war. Eine einfache und unkomplizierte Auftrennung der einzelnen
Zellfraktionen war durch die Filtration der Mundspülproben über 10µm Filcons möglich, mit der die
Wiederfindungsrate der Leukozyten 56,83±14,91% betrug, wobei der Prozentsatz an Leukozyten bei
85,86±8,25% lag. Mit Ausnahme der AK-vermittelten Isolation wiesen die Leukozyten nach allen
Isolationsmethoden eine Vitalität von über 85% auf und stehen somit für anschließende Testsysteme
zur Verfügung.
ZUSAMMENFASSUNG
100
Die Auswertung zahlreicher Gele zur Detektion des H4-Acetylierungsstatus von Mundschleimhautzellen erbrachte keine scharfen H4-Banden. Bei sehr hohen Proteinausgangskonzentrationen, waren
vereinzelt H4-Banden erkennbar, die eine nicht quantifizierbare Qualität aufwiesen.
Im Rahmen der Brotstudie wurden erstmalig nicht-invasiv gewonnene orale Leukozyten auf deren
DNA-Integrität im CA untersucht. Zwischen Rauchern und Nichtrauchern und zwischen den einzelnen Versuchsphasen wurden keine signifikanten Unterschiede in der Ausbeute und dem Verhältnis
der Epithelzellen : Leukozyten in Mundspülungen beobachtet. Signifikante höhere Werte der DNASchädigung waren an oralen Leukozyten von Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern zu beobachten, wobei der Verzehr des speziellen Brotes keinen Einfluss hatte.
SCHLUSSFOLGERUNGEN: Zu 1.: Aufgrund der geringen intraund interexperimentellen
Variation des CA steht ein Biomarker-Testsystem mit einer sehr guten Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zur Verfügung. Die hohe intraund interindividuelle Variation der genotoxischen Aktivität
der FW ist der biologischen Probe Fezes zuzuschreiben, die interessanterweise nach dem Verzehr
definierter Diäten nicht geringer wird. Trotz der Variabilität kann der Einfluss einer Intervention mit
spezifischen Lebensmitteln nachgewiesen werden, wenn jeder Proband seine eigene Kontrolle ist.
Zu 2.: Fezes enthält nur wenige intakte Zellen, so dass eine immunomagnetische Separation problematisch ist. Der Vergleich der Zellrückgewinnung aus verschiedenen Medien zeigte, dass
die immunomagnetische Zellseparation grundsätzlich möglich war. Für den Erfolg der
Isolation scheinen intakte Zelloberflächenproteine, die die Antigen-AK-Reaktion vermitteln, von herausragender Bedeutung zu sein. Sowohl das Medium, in dem die Separation
erfolgt, als auch der Zelltyp beeinflussen die antikörpervermittelte Zellisolation.
Die Untersuchungen zeigten, dass die sogenannten oralen bzw. buccalen Zellen zur Hälfte
aus vitalen Leukozyten und zur anderen Hälfte aus toten Ep ithelzellen bestehen. Orale
Leukozyten lassen sich in ausreichender Quantität und Qualität aus oralen Mundspülproben isolieren und stehen damit der Einbringung in sich anschließender BiomarkerTestsysteme zur Verfügung. Eine exogene Beeinflussung der DNA-Integrität oraler Le ukozyten ist mit dem CA messbar. Für zukünftige Untersuchung zur Detektion neuer funktioneller Parameter im Hinblick auf protektive Wirkungen durch Ernährungsfaktoren erlangen sie als nicht- invasiv gewinnbare Zellen an Bedeutung. Hierzu gehören die Bestimmung der Genexpression und der Genotoxizität, wobei in der vorliegenden Arbeit gut
gezeigt wurde, dass der Nachweis des letzten Parameters mit dem CA effizient gelingen
kann.
QUELLENVERZEICHNIS
XV
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ANHANG
XXXIII
ANHANG
A1 -Studie mit probiotischer WurstDie Ernährungsinterventionsstudie fand von September bis Dezember 1998 mit 10 männlichen und
10 weiblichen gesunden freiwilligen Probanden im Alter zwischen 22 und 55 Jahren statt. Die erste
Versuchsphase (Vorperiode) gliederte sich in eine vierwöchige Adaptionsphase, eine zweitägige
Ausschleusphase und eine siebentägige Sammelphase. Während der Ausschleusphase und der Sammelphase wurde eine vorgegebene Diät konsumiert. Der Verzehr von 50g nicht-probiotischer Wurst
erfolgte in den letzten zwei Wochen der Vorperiode. Die zweite Versuchsperiode (Zulageperiode)
gliederte sich ebenfalls in eine vierwöchige Adaptionsphase, eine zweitägige Ausschleusphase und
eine siebentägige Sammelphase. Während der Ausschleusphase und der Sammelphase wurde wiederum eine vorgegebene Diät verzehrt. Über den gesamten Zeitraum der Zulageperiode wurde von
den Probanden 50g einer probiotischen Wurst konsumiert. Die Ausschleusphase (ersten zwei Tage
mit definierter Diät) diente dem Ausschluss von Überlagerungseffekten durch die Ernährung vorangegangener Tage sowie der Schaffung gleicher Voraussetzungen für alle Probanden. Im Anschluss
an die Sammelphase der Zulageperiode erfolgte eine siebentägige Nachperiode.
Während der Ausschleus-/Sammelphase wurde ausschließlich eine vollständig vorgegebene Diät mit
50g Rohwurst verzehrt, die auf Grundlage der von jedem Probanden vor Versuchsbeginn geführten
siebentägigen Ernährungsprotokolle bilanziert wurde. Der Verzehr von 50g probiotischer Rohwurst,
die von der Firma Gewürzmüller zur Verfügung gestellt wurde, sollte eine Aufnahme von
5x109KBE von Lactobacillus casei garantieren. Die Aufnahme von Alkohol war in der Ausschleus/Sammelphase in jeder Darreichungsform verboten.
Die für diese Arbeit relevanten Stuhlproben wurden am 3. und 9. Tag jeder Ausschleus/Sammelphase gewonnen, mit deren Hilfe die Keimzahl und genotoxische bzw. antigenotoxische
Effekte im FW bestimmt wurden.
Für die genotoxischen Untersuchungen stand das, wie im Abschnitt 3.2.1 beschrieben, gewonnene
FW der Probanden 3, 4, 5, 6, 7, 10 (weibliche Probanden) und 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20
(männliche Probanden) zur Verfügung. Die Isolation der FW erfolgte von Mitarbeitern des
Lehrstuhls „Ernährungsphysiologie“ der Friedrich-Schiller-Universität Jena. Die Quantität der FW
der nicht aufgeführten Probanden war für diese Bestimmungen nicht ausreichend. Abb. A1 gibt eine
zusammenfassende Darstellung des Studiendesigns.
ANHANG
XXXIV
1. Periode (Vorperiode)
2. Periode (Vorperiode)
Verzehr nicht-probiotischer Wurst
Verzehr probiotischer Wurst
in den letzten 2 Wochen
während der gesamten Periode
Adaptations-
Ausschleus-
Sammel-
Adaptations-
Ausschleus-
Nachperiode
übliche Diät
Sammel-
phase
phase
phase
phase
phase
phase
(4 Wo)
(2d)
(7d)
(4 Wo)
(2d)
(7d)
definierte Diät
(7d)
definierte Diät
Stuhlprobengewinnung für Bestimmung des genotoxischen bzw. antigenotoxischen Potentials
Abbildung A1: Versuchsschema der Interventionsstudie mit probiotischer Wurst
Die Abb. A2 und A3 stellen die Ergebnisse zur Genotoxizität von FW ausgewählter Probanden dar, bei denen nach dem Verzehr der probiotischen Wurst >106 KBE Lactobacillus
casei je g Fezes nachgewiesen wurden. Die Klassifizierung des Keimzahlstatus ist im
Abschnitt 3.2.8.2.1 erläutert. Von den 6 weiblichen Fezesproben wurden zwei mit -sehr
gut-, eine mit -gut- und eine mit -befriedigend- und von den 8 männlichen zwei mit -sehr
gut-, eine mit -gut- und zwei mit -befriedigend- bewertet.
ANHANG
XXXV
60
50
TI (%)
40
30
20
10
ohne probiot. Wurst 3. Tag
0
sehr gut
gut
befriedigend
weibliche Probanden
sehr gut
gut
befriedigend
mit probiot. Wurst 3. Tag
männliche Probanden
NaCl-Kontrolle
Keimzahlstatus der FW
Abbildung A2:
Genotoxische Effekte der Fezeswässer der männlichen und weiblichen Probanden
an HT29 clone 19A-Zellen unter Berücksichtigung des unterschiedlichen Keimzahl-Status der Fezes nach dem Verzehr der probiotischer Wurst
[jedes Fezeswasser dreifach in einem Versuch getestet, weibliche Probanden: für jeden
Keimzahlstatus n=1, männlich Probanden: sehr guter und befriedigender Keimzahlstatus
n=2, guter Keimzahlstatus n=1, MW±SD]
100
TI (%)
80
60
40
20
0
sehr gut
gut
befriedigend
weibliche Probanden
sehr gut
gut
befriedigend
NaCl-Kontrolle
Keimzahlstatus der FW
Abbildung A3: Genotoxische Effekte der Fezeswässer der männlichen und weiblichen Probanden
an HT29 clone 19A-Zellen nach Endonuclease III-Inkubation unter Berücksichtigung des unterschiedlichen Keimzahl-Status der Fezes nach dem Verzehr probiotischer Wurst
[jedes Fezeswasser dreifach in einem Versuch getestet, weibliche Probanden: für
jeden Keimzahlstatus n=1, männlich Probanden: sehr guter und befriedigender
Keimzahlstatus n=2, guter Keimzahlstatus n=1, MW±SD]
ANHANG
XXXVI
A2 -LeinsaatstudieDie Leinsaatstudie fand in der letzten Triade des Jahres 1999 statt. Acht aus Jena bzw. der näheren
Umgebung von Jena stammende Männer mit einem durchschnittlichen Alter von 51,8±9,1 Jahren
wurden angehalten, täglich 200g Leinsaatbrot, das 40g Leinkuchen enthielt, über vier Wochen zu
verzehren. Die sonstige Diät war nicht definiert und frei wählbar. Zu Beginn, in der Mitte und am
Ende der Leinsaatbrotintervention wurden Blutproben entnommen sowie die Fezes gesammelt. Die
Gewinnung der FW erfolgte unmittelbar. 6 der 8 teilnehmenden Probanden waren bereit, Fezes für
die Untersuchungen zum genotoxischen bzw. antigenotoxischen Potential von FW zu sammeln.
Das für diese Studie verwendete Brot enthielt entölten, gemahlenen Leinsamen (Presskuchen) mit
einem Restfettanteil von 8%. Die übrige Zusammensetzung des Leinsamenbrotes stellt die Tab. A1
dar.
Tabelle A1:
Zusammensetzung des Leinsamenbrotes
Zutat
Menge
Flüssigkeit: Wasser
300ml
Essig
1Esslöffel
Leinkuchen
200g
Weizenmehl Type 405
450g
Treibmittel: Sauerteig oder Frischhefe
75ml/25g
Salz
1Teelöffel
Gewürze: Kümmel, Gemüsebrühe, Curcuma,
Anis oder Zimt und Rosinen
1Teelöffel
Melasse
2Esslöffel
Das Brot (1kg) wurde von Mitarbeitern des Lehrstuhls „Ernährungsphysiologie“ der FriedrichSchiller-Universität Jena in einem Backautomaten (Backmeister Unhold Electro 8631) gebacken
(2,55h) und nach dem Abkühlen in 200g Portionen bei -18°C bis zum Verzehr eingefroren.
Eine am Folkhälsan Research Center in Helsinki / Finnland durchgeführte Analyse mittels Gaschromatographie-Massenspektroskopie ergab die in der Tab. A2 aufgeführten Lignan- und Isoflavonoidgehalte.
ANHANG
Tabelle A2:
XXXVII
Lignan- bzw. Isoflavonoidgehalte des Leinsamenbrotes
Phytoöstrogene
µg/100g
nmol/g
Secoisolariciresinol
165,335
4,806
Matairesinol
122,6
3,4
Genistein
26,3
1,0
Daidzein
17,2
0,7
ANHANG
XXXVIII
A3 -Phosphatstudie I und IIAn der Phosphatstudie I nahmen 10 gesunde Frauen im Alter zwischen 25±2 Jahren und an der
Phosphatstudie II 10 gesunde Männer im Alter zwischen 26±5 Jahren teil. Ein Versuchsteilnehmer
musste wegen Versuchsabbruch aus der Auswertung der Phosphatstudie II ausgeschlossen werden.
Beide Studien umfassten eine vierwöchige Vorperiode (Kontrollperiode I), eine sechswöchige Zulageperiode und eine abschließende vierwöchige Nachperiode (Kontrollperiode II). Zur quantitativen
Beurteilung der Energieaufnahme führte jeder Studienteilnehmer zu Beginn der vierwöchigen Kontrollperiode I ein vierzehntägiges Ernährungsprotokoll, mit dessen Hilfe die Energieaufnahme bilanziert und eine kalorienadaptierte Diät zusammengestellt wurde. Die Probanden erhielten die Diät am
Ende jeder Periode über einen Zeitraum von 9 Tagen. Der Genuss von Alkohol war während der
gesamten Studiendauer verboten. Im Anschluss an die Kontrollperiode I begann die Zulageperiode,
in der die Supplementation mit Phosphor in Höhe von ca. 1600mg Phosphor pro Tag über 6 Wochen
erfolgte.
Zusammensetzung der Supplemente:
Phosphatstudie I:
Orangensaft (750ml/d)
2,0g Tricalciumphosphat (17,9% Phosphor; 37,9% Calcium) in 750ml
Tablette (4 Stück/d)
2,4g Mononatriumphosphat (19,2% Natrium; 25,8% Phosphor)
Phosphatstudie II: Tablette (12 Stück/d)
46,5% Dinatriumphosphat (32,3% Natrium; 21,8% Phosphor)
26,7% Mononatriumphosphat (19,2% Natrium; 25,8% Phosphor)
23,8%Tricalciumnatriumphosphat (37,7% Calcium; 17,5% Phosphor)
3% Tablettierzusatz
Nach Beendigung der Zulageperiode folgte die Auswaschperiode (Kontrollperiode II), deren Ziel die
Umstellung des mit Phosphat belasteten Organismus und eventuell veränderter Stoffwechselparameter auf die Ausgangswerte vor der Zulageperiode war. Abb. A4 verdeutlicht das Studiendesign.
Die Gewinnung der FW sowie die Bestimmung der Genotoxizität (Tab. A3) erfolgte von MANUELA
GRIMM im Rahmen ihrer Dissertation (GRIMM 2000)
ANHANG
XXXIX
1. Periode (Kontrollperiode I)
Adaptations-
Ausschleus-
2. Periode (Zulagenperiode)
3. Periode
Verzehr der Phosphorsupplemente
(Kontroll-
während der gesamten Periode
periode II)
Sammel-
Adaptations-
Ausschleus-
Sammel-
siehe
phase
phase
phase
phase
phase
phase
Kontroll-
(3 Wo)
(2d)
(7d)
(5 Wo)
(2d)
(7d)
periode I
definierte Diät
definierte Diät
Stuhlprobengewinnung für Bestimmung des genotoxischen bzw. antigenotoxischen Potentials
Abbildung A4: Versuchsschema der Phosphatstudie I und II
Tabelle A3:
Genotoxische Effekte der Fezeswässer der Phosphatstudie I und II an HT29
clone 19A-Zellen
TI [%]
weibliche Probanden
MW±SD (n=10)
MW±SD (n=9)
vor Phosphatsupplementation
7,04±5,95
13,51±7,71
mit Phosphatsupplementation
5,50±2,51
16,85±15,21
nach Phosphatsupplementation
4,85±2,22
9,73±2,76
Versuchsphase
ANHANG
XL
A4 -BrotstudieIm Zeitraum April bis Oktober 2002 führte das Institut für Ernährungswissenschaften diese Interventionsstudie durch, um die gesundheitsfördernden Wirkungen präbiotischer und antioxidativ wirksamer Nahrungsbestandteile an Rauchern und Nichtrauchern zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden zum einen präbiotische (PRÄ-Brot) und zum anderen präbiotische und antioxidativ (PRÄ-AOXBrot) wirksame Substanzen einem Brot zusätzlich zugesetzt. Als Vergleich diente ein Kontrollbrot,
dass keine zusätzlichen präbiotischen und antioxidativ wirksamen Nahrungsbestandteile enthielt. Die
genaue Zusammensetzung ist in der Tab. A4 dargestellt.
Tabelle A4:
Zusammensetzung der verschiedenen Brote aus der Interventionsstudie
Zutat [%]
Grüner Tee
Backgewürz
Backtomate
Backweizen
Backsoja
Backinulin
Backleinsaat
Apfelfaser
Sauerteig
Malzmehl
Sonnenblumenkerne
Weizenmehl
Roggenschrot
Salz
Weizenkleber
Kontrollbrot
2,00
3,00
0,80
10,00
66,90
15,00
2,30
-
PRÄ-AOX-Brot
0,50
0,75
0,50
1,00
6,00
4,00
4,00
2,00
3,00
0,80
10,00
50,90
15,00
2,30
2,00
RRÄ-Brot
6,00
4,00
4,00
2,00
3,00
0,80
10,00
48,15
15,00
2,30
2,00
Der Verlauf der Interventionsstudie erstreckte sich über 4 Perioden, eine Vorperiode, eine Zulagenperiode 1, eine Zulagenperiode 2, und eine Nachperiode. Das genaue Studiendesign zeigt die Tab. A5.
An den Untersuchungen der Mundschleimhautzellen nahmen 9 Nichtraucher und 14 Raucher teil. In
der Zulagenperiode verkonsumierten 8 Raucher und 4 Nichtraucher das PRÄ-AOX-Brot und 6
Raucher und 5 Nichtraucher das PRÄ-Brot. Am Ende jeder Periode wurden die Probanden angehalten, für die Genotoxizitätsuntersuchungen Mundspülproben zur Verfügung zu stellen, um daraus
Leukozyten zu isolieren. Im Anschluss an die Isolation wurde der CA mit TS praktiziert.
ANHANG
Tabelle A5:
XLI
Studiendesign der Brotstudie
Vorperiode
Phase I
Zulagenperiode 1
Phase II
Zulagenperiode 2
Phase III
Nachperiode
Phase IV
Diät
freie Diät
freie Diät
2Wo
4Wo
definierte Diät
freie Diät
definierte Diät
freie Diät
Dauer
2d
4d
ÜP
Sammlung
4Wo
2d
4d
ÜP
Sammlung
nach >8Wo
Zweck
Randomisierung
Messung: BIAs
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
5d
5d
5d
X
5d
5d
5d
X
Erhebung: 7-d-EP
X
Probennahme:
Blut
Mundschleimhaut
Urin
Stuhl
Gruppen
(Anzahl)
1 (n=11)
Normalkost
Kontrollbrot
PRÄ-Brot
Normalkost
Normalkost
Kontrollbrot
PRÄ+AOX-Brot
Normalkost
2 (n=12)
XLII
Tabelle A6:
Ausbeute, Vitalität und Anteil oraler Zellen in Mundspülproben von Probanden der Brotstudie (Phase II und II)
Phase
ANHANG
Nr.
Brot
I
I
I
I
I
I
I
I
II
II
II
II
II
II
II
II
R/
Epithelz.
Vital-
Leuko.
Vital-
Ges.
Vital-
%-
%-
Epithelz.
Vital-
Leuko.
Vital-
Ges.
Vital-
%-
%-
NR
Zellzahl
x10 6
ität
Zellzahl
x106
ität
Zellzahl
x10 6
ität
Zellzahl
x106
ität
Zellzahl
x10 6
ität
Zellzahl
x10 6
ität
Epithz.
Leuko
%
%
Epithz. Leuko
%
%
%
%
4
AOX
NR
2,12
0,00
1,76
90,89
3,84 41,23
55,21
45,83
2,13
1,56
0,33
90,00
2,47 13,51
86,49
13,51
22
AOX
NR
1,20 23,33
1,68
61,90
2,88 45,83
41,67
58,33
2,43
2,74
0,63
84,21
3,07 19,57
79,35
20,65
24
AOX
NR
2,04
0,00
0,36
77,78
2,40 11,67
85,00
15,00
3,00
1,67
0,80
87,50
3,80 19,74
78,95
21,05
21
AOX
NR
28,42 28,17
29,56
89,31
57,96 59,35
49,00
51,00
14,45 32,53
16,50
97,58
30,95 67,21
46,69
53,31
25
AOX
NR
4,00
7,00
1,92
81,25
5,92 31,08
67,57
32,43
3,40 14,71
0,90
88,89
4,30 30,23
79,07
20,93
29 PRÄ-AOX NR
3,16
8,86
2,12
84,91
5,28 39,39
59,85
40,15
0,70
39 PRÄ-AOX NR
4,10
3,66
0,35
85,71
4,45 10,11
92,13
7,87
32 PRÄ-AOX NR
3,80
6,58
4,35
89,66
8,15 50,92
46,63
53,37
33 PRÄ-AOX NR
2,60
5,77
1,20
75,00
3,80 27,63
68,42
40 PRÄ-AOX NR
0,95
5,26
2,80
94,64
3,75 72,00
25,33
34
AOX
R
2,60
1,92
1,25
88,00
3,85 29,87
31
AOX
R
3,70 12,60
0,75
86,67
7
AOX
R
1,97
5,08
2,80
10
AOX
R
2,13
6,25
27
AOX
R
3,67 26,60
28
AOX
R
30
AOX
26
AOX
0,00
0,65
92,31
1,35 44,44
51,85
48,15
2,75 27,27
0,80
87,50
3,55 40,85
77,46
22,54
31,58
2,95 10,17
0,90
94,44
3,85 29,87
76,62
23,38
74,67
1,90 10,53
6,55
99,24
8,45 79,29
22,49
77,51
67,53
32,47
3,50 31,43
1,50 100,00
5,00 52,00
70,00
30,00
4,45 24,72
83,15
16,85
3,90 14,10
0,60 100,00
4,50 25,56
86,67
13,33
94,05
4,77 57,34
41,26
58,74
5,60
3,57
2,25
84,44
7,85 26,75
71,34
28,66
1,77
92,45
3,90 45,30
54,70
45,30
3,10
3,23
1,20
80,56
4,30 24,81
72,09
27,91
0,48
91,67
4,24 33,95
88,68
11,32
4,90
3,06
0,55
90,91
5,45 11,93
89,91
10,09
1,84 18,84
0,27
90,00
2,11 27,85
87,34
12,66
2,35
8,51
0,90
88,89
3,25 30,77
72,31
27,69
R
4,08
1,96
1,40
85,71
5,48 23,36
74,45
25,55
4,70
2,13
0,40
75,00
5,10
7,84
92,16
7,84
R
3,04
1,32
1,20
76,67
4,24 22,64
71,70
28,30
4,40
6,82
6,75
86,67
11,15 55,16
39,46
60,54
23 PRÄ-AOX
R
4,40
7,27
3,08
92,21
7,48 42,25
58,82
41,18
4,00 11,25
2,35
93,62
6,35 41,73
62,99
37,01
3
PRÄ-AOX
R
2,76
2,91
1,44
80,58
4,20 29,54
65,71
34,29
2,65
3,77
1,20
87,50
3,85 29,87
71,34
28,66
37 PRÄ-AOX
R
1,18
0,00
0,46
73,91
1,64 20,73
71,95
28,05
1,30 34,62
0,70
92,86
2,00 55,00
65,00
35,00
35 PRÄ-AOX
R
1,71
3,51
1,08
91,67
2,79 37,63
61,29
38,71
2,35 17,02
1,80
94,44
4,15 50,60
56,63
43,37
36 PRÄ-AOX
R
1,42
2,82
1,06
83,02
2,48 37,10
57,26
42,74
1,60
3,13
0,70
85,71
2,30 28,26
69,57
30,43
40 PRÄ-AOX
R
10,20 10,59
1,95
92,31
12,15 23,70
83,95
16,05
4,40 26,14
1,40
96,43
5,80 43,10
75,86
24,14
Leuko: Leukozyten, Epithelz.: Epithelzellen, Ges.zellzahl: Gesamtzellzahl
XLIII
Tabelle A7:
Ausbeute, Vitalität und Anteil oraler Zellen in Mundspülproben von Probanden
der Brotstudie (Phase III und IV)
Phase
ANHANG
Nr.
Brot
III
III
III
III
R/
Epithelz.
NR
Zellzahl
6
x10
Vital-
Leuko.
ität
Zellzahl
6
x10
%
III
III
Vital-
Ges.
Vital-
ität
Zellzahl
6
x10
ität
%
III
III
IV
IV
%-
%-
Epithelz.
Epithz.
Leuko
Zellzahl
6
x10
%
IV
IV
Vital-
Leuko.
ität
Zellzahl
6
x10
%
IV
IV
Vital-
Ges.
Vital-
ität
Zellzahl
6
x10
ität
%
IV
IV
%-
%-
Epithz. Leuko
%
4
AOX
NR
3,75
22,67
2,10
100,00
5,85
50,43
64,10
35,90
22
AOX
NR
2,65
16,98
5,40
100,00
8,05
72,67
32,92
67,08
24
AOX
NR
1,20
8,33
0,60
91,67
1,80
36,11
66,67
33,33
1,13
5,88
0,50
86,67
1,63 30,61
69,39
30,61
21
AOX
NR
3,90
21,79
4,45
100,00
8,35
63,47
46,71
53,29
1,47
4,55
2,27
82,35
3,73 51,79
39,29
60,71
25
AOX
NR
3,00
15,00
0,90
94,44
3,90
33,33
76,92
23,08
5,50
0,00
1,20
91,67
6,70 16,42
82,09
17,91
29
PRÄ-AOX N R
1,97
42,37
1,73
100,00
3,70
69,37
53,15
46,85
39
PRÄ-AOX N R
1,20
8,33
0,30
100,00
1,50
26,67
80,00
20,00
32
PRÄ-AOX N R
33
PRÄ-AOX N R
1,50
20,00
0,78
100,00
2,28
47,37
65,79
34,21
3,13
5,32
1,27
100,00
4,40 32,58
71,21
28,79
40
PRÄ-AOX N R
2,15
58,14
6,15
98,37
8,30
87,95
25,90
74,1
1,50
3,33
2,35
95,74
3,85 59,74
38,96
61,04
34
AOX
R
3,15
73,02
2,65
100,00
5,80
85,34
54,31
45,69
2,75
1,82
3,00
88,30
5,75 46,96
47,83
52,17
31
AOX
R
3,50
31,43
1,15
95,65
4,65
47,31
75,27
24,73
3,45
0,00
0,65
69,23
4,10 10,98
84,15
15,85
7
AOX
R
2,80
5,36
2,60
92,31
5,40
47,22
51,85
48,15
4,45
3,37
2,80
85,71
7,25 35,17
61,38
38,62
10
AOX
R
1,85
18,92
0,65
100,00
2,50
40,00
74,00
26,00
2,10
4,76
0,45
88,89
2,55 19,61
82,35
17,65
27
AOX
R
1,95
12,82
0,30
100,00
2,25
24,44
86,67
13,33
28
AOX
R
2,64
9,09
0,40
80,00
3,04
18,42
86,84
13,16
30
AOX
R
2,57
31,17
1,27
94,74
3,83
52,17
66,96
33,04
4,00
2,50
0,80
93,75
4,80 17,71
83,33
16,67
26
AOX
R
0,91
15,38
0,49
100,00
1,40
45,00
65,00
35,00
1,23
2,70
0,17
100,00
1,40 14,29
88,10
11,90
23
PRÄ-AOX
R
2,85
26,32
0,85
94,12
3,70
41,89
77,03
22,97
2,53
0,00
1,57
82,98
4,10 31,71
61,79
38,21
6,00
1,67
0,75
93,33
6,75 11,85
88,89
11,11
3
PRÄ-AOX
R
2,70
18,52
1,20
95,83
3,90
42,31
69,23
30,77
37
PRÄ-AOX
R
1,65
45,45
1,00
100,00
2,65
66,04
62,26
37,74
35
PRÄ-AOX
R
4,15
16,87
1,00
100,00
5,15
33,01
80,58
19,42
36
PRÄ-AOX
R
1,00
20,00
2,75
98,18
3,75
77,33
26,67
73,33
40
PRÄ-AOX
R
12,90
21,71
1,35
88,89
14,25
28,07
90,53
9,47
Leuko: Leukozyten, Epithelz.: Epithelzellen, Ges.zellzahl: Gesamtzellzahl
ANHANG
XLIV
A5 -GST-AktivitätIm Rahmen eines vom Verfasser dieser Arbeit betreuten Forschungspraktikums von ANGELA
MITTAS (2002) wurde die GST-Aktivität nach der Methode von HABIG et al. (1974) an oralen Mundschleimhautzellen 7 gesunder Probanden bestimmt.
Abbildung A5: GST-Aktivität oraler Zellen von 7 gesunden Probanden
GST-Aktivität je µg Protein
(nmol/min)
[5-10-mal je Proband und 6-mal für HT29 clone 19A-Zellen sowie Lymphozyten reproduziert]
0.6
HT: HT29c-Zellen
Ly: Blutlymphozyten
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
1
2
3
4
5
6
Probanden
7
Ly
HT
DANKSAGUNG
XLV
DANKSAGUNG
An dieser Stelle möchte ich mich bei all denen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Mein besonderer Dank gebührt dabei Frau Prof. Dr. Beatrice L. Pool-Zobel für die Überlassung des Themas
und die wissenschaftliche Betreuung der Dissertation. Ich danke ihr herzlichst für ihre konstruktiven Diskussionen, ihre Anregungen, ihre unermüdliche Motivation und Hartnäckigkeit sowie für ihr Verständnis und ihre
Geduld, die die Fertigstellung dieser Arbeit ermöglichten und mich in meiner wissenschaftlichen Persönlichkeit
geprägt haben.
Der Deutschen Krebshilfe (Projekt-Nr.: 70-2165-Po2) und dem Freistaat Thüringen danke ich für die finanzielle Unterstützung.
Die Kraft und Energie, die für diese Arbeit nötig waren, haben mir hauptsächlich meine Tochter MarieMagdalen und mein Sohn Tetje -Tristan gegeben. Für euch beide lohnt sich die größte Anstrengung und jede
Mühe.
Mutti, dir danke ich dafür, dass du jederzeit an mich geglaubt hast. Tausend Dank für deine liebevolle Unterstützung zu Hause.
Kalle, du kamst gerade zur richtigen Zeit, um den Wert meiner Arbeit zu schätzen und mich als Frau.
Meinen vielen Probanden danke ich auf das Herzlichste. Ohne ihre Bereitschaft, mir humanes Untersuchungsmaterial zur Verfügung zu stellen, wäre diese Arbeit nicht entstanden. Stellvertretend danke ich besonders Edda
Lösch und Dr. Michael Glei, die jederzeit bereit waren, meine Arbeit durch ihre Probenabgabe zu unterstützen.
Bei Dr. Thomas Becker möchte ich mich für die wissenschaftlich Betreuung der Arbeit in den ersten zwei
Jahren bedanken.
Für das Korrekturlesen meiner Dissertationsschrift danke ich Steffi Klenow, Yvonne Knöbel, Dr. Michael Glei,
Britta und Kalle von ganzem Herzen. Ich weiß es zu schätzen, dass Kalle und Britta die Mühe auf sich genommen haben, sich trotz des geringen inhaltlichen Verständnisses durch die Flut an Blättern zu arbeiten.
Thomas Rieger sei herzlichst gedrückt und tausend Dank für die vielen Stunden, die du für die Formatierung
dieser Arbeit aufgewandt hast.
Den Großeltern meiner Kinder, Prof. Dr. Peter Langbein und seiner Frau Ingrid, danke ich für die technische
Unterstützung beim Schreiben dieser Arbeit.
Allen Mitarbeitern des Lehrstuhls „Ernährungstoxikologie“ gilt Dank für das gute Arbeitsklima, die Hilfsbereitschaft, die stets gewährte Unterstützung und das Verständnis für meine familiäre Situation. Claudi, Dankeschön
für deine Hilfe in bürotechnischen Belangen. Esther, Edda und Eva, euch danke ich für die Unterstützung im
Labor, vor allem in den ersten zwei Jahren.
Vati, auch wenn du es nicht mehr erlebst, aber ich weiß, dass es dich mit Stolz erfüllt hätte. Allein das gab Kraft
und Mut.
SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG
XLVI
SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG
Hiermit versichere ich, die vorliegende Arbeit selbstständig, ohne unzulässige Hilfe Dritter, sowie
ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt zu haben. Die aus
anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der
Quellen gekennzeichnet.
Die Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form bisher keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Jena, den 04.07.2003
Kerstin Oßwald
CURRICULUM VITAE
XLVII
CURRICULUM VITAE
Kerstin Oßwald
Diplom- Trophologin
geb. 07.03.1973 in Jena
Oßmaritz Nr. 10
07751 Bucha
Familienstand:
ledig, 2 Kinder
Staatsbürgerschaft:
deutsch
Schulbildung
09/79-06/89
Polytechnische Oberschule Milda
09/89-06/91
Erweiterte Oberschule Jena
Abschluss: mittlere Reife
Hochschulbildung
10/91-03/98
Studium an der Friedrich-Schiller-Universität Jena
Fach: Ernährungswissenschaften
Diplomarbeit: Untersuchungen zum Einsatz von Antikörpern in der
Kälberaufzuchtfütterung
Abschluss:
Diplom- Trophologe
Berufstätigkeit
04/98-05/03
Wissenschaftliche Mitarbeiterin der Friedrich-Schiller-Universität
Jena am Lehrstuhl „Ernä hrungstoxikologie“
06/00-06/01
Erziehungsurlaub
07/00-05/03
Stipendiatin des Freistaates Thüringen
Jena, 03.07.2003

Entwicklung und Erprobung nicht- invasiver Biomarker

Transcription

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