Biochip-Technologie

LABORWELT
III/2002
Das Themenheft von
Special
Custom Chips &
Oligo-Service
Marktübersicht
MicroarrayReader
Biochip-Technologie
Ultrasensitive
Protein- und
DNA-Chips
Komplexe
Peptidarrays auf
Computerchips
Nanopumpen
für schnellere
MicroarrayInkubation
Chipanalyse
zellulärer
Ionenkanäle
BIOCOM AG
Bildmaterial: MWG Biotech; Fotomontage: Heiko Fritz
Vorschau:
die neue
MatriXarrayPlattform von
Roche
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Zum Thema
Microarrays: höher,
schneller, weiter…
Nach den DNA-Chips sind jetzt die Protein- und Antikörper-Arrays an der Reihe. Die US-Unternehmensberatung Frost & Sullivan
prognostiziert in ihrer jüngsten Studie „Proteinarrays vor dem
Boom“, daß binnen nur fünf Jahren der noch junge Markt für die
Analyse-Chips von derzeit 41,2 Mio. US-$ auf mehr als 665 Mio.
US-$ „explodieren“ wird.
Die Technologieanbieter nehmen mit neuen Produkten schon jetzt
den jungen Markttrend spürbar auf. Und auch in der Wissenschaft
regt sich einiges: Seit Juni etwa liegt in Brüssel ein Wunschzettel
deutscher Proteomforscher, die den Aufbau der bislang umfassendsten Sammlung menschlicher Proteine und Antikörper gerne zur
Hälfte aus dem 6. EU-Forschungsrahmenprogramm finanziert hätten – die Sammlung dieser „European Protein Initiative“ (EPI)
könnte zum Beispiel die Diagnose und Erkennung krankheitsassoziierter Muster mit Antikörper-Chips voranbringen.
Mit der vorliegenden Ausgabe versuchen wir, den neuen Trend mit
aktuellen Beiträgen aus Wissenschaft und Unternehmen aufzugreifen und – in Ausschnitten – abzubilden (s. Seiten 20, 24, 30 und 44).
Doch auch auf anderen Feldern der Chiptechnologie geht es voran.
Wissenschaftler vom Center for Nano Science der LMU München
etwa stellten diesen Sommer eine Chiptechnologie vor, mit der zelluläre Ionenkanäle untersucht werden können (siehe S. 16). Eine
Gruppe um die DKFZ-Forscherin Annemarie Poustka hat ein neues
Verfahren entwickelt, um in Feststoffe eingebettete aktivierte Aminosäuren auf Arrays zu bringen – und zwecks Vermarktung des
flüssigkeitsfreien Verfahrens eine Firma gegründet (siehe S. 4). Und
Diagnostik-Gigant Roche Diagnostics gewährt bereits in dieser
Ausgabe erste Einblicke in seine neue Microarray-Plattform (siehe
S. 8), bevor die Vermarktung im nächsten Jahr startet.
Inhalt
BLITZLICHT
4 Hochkomplexe Peptidarrays auf Computerchips
ANNEMARIE POUSTKA ET AL., DKFZ HEIDELBERG
BLITZLICHT
The matriXarray platform –
a novel and flexible approach
for gene analysis
HORST DONNER ET AL.,
ROCHE DIAGNOSTICS, PENZBERG
8
BLITZLICHT
12 Nanopumpen verbessern die
Microarray-Inkubation
JÜRGEN SCRIBA ET AL.,
ADVALYTIX, BRUNNTHAL
BLITZLICHT
16 Biochip für die Untersuchung
zellulärer Ionenkanäle
NIELS FERTIG, JAN C. BEHRENS ET AL.
NANION TECHNOLOGIES, CENS,
MÜNCHEN
BLITZLICHT
Neue Protein-Arrays und
20
Zytokin-Detektions-Chips
JENS BEATOR, SCHLEICHER&SCHUELL,
DASSEL
REPORT
24 Proteinarrays – Tools für Proteomics und Diagnostik
Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter
www.biocom.de oder auf dem beiliegenden Fax-Formular
Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer
ankreuzen, Name und Adresse angeben und faxen/mailen –
Sie erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.
THOMAS JOOS ET AL., NMI, REUTLINGEN
BLITZLICHT
30 Protein Chip® System
ANDREAS WIESNER ET AL.,
CHIPERGEN, GÖTTINGEN
MARKTÜBERSICHT
Trotz aller Begeisterung für die Parallelisierung und den hohen
Durchsatz, der mit „Bio-Chips“ machbar ist, hat die noch junge
Technologie natürlich auch ihre grundsätzlichen (in vitro-Technik!)
und spezielleren Probleme. Eines davon lautet Standardisierung
(siehe S. 35) der mit den unterschiedlichen Auslesegeräten (Marktübersicht S. 32) gewonnenen Daten, ein anderes ist die Frage, ob
man selbst teuere Geräte kaufen soll oder andere die Chips herstellen läßt. Lesen Sie dazu ein kleines Special Oligonukleotid-Service
und Custom-Arrays (siehe die Beiträge auf S. 38 ff. und 41ff.).
Am Ende noch eine Vorab-Information in eigener Sache: Mit der
nächsten Ausgabe wechselt die Chefredaktion der Zeitschrift
LABORWELT. Künftig wird Frau Andrea Schneider, bestens bekannt durch ihre langjährige Arbeit für ein rennomiertes Life-Sciences-Magazin, von Martinsried aus die Entwicklung von LABORWELT steuern. Wir freuen uns über die Verstärkung unseres Teams.
Viel Spaß beim Lesen wünscht Ihnen
32 Microarray-Reader
BLITZLICHT
35 Standardisierung von Microarray-Experimenten
KARIN ADELHELM, EUGEN EHRMANNTRAUT, CLONDIAG CT, JENA
SPECIAL
Custom-Chips &
38, 41
Oligonukleotid-Service
MICHAEL GISMANN ET AL.,
GENESCAN GRUPPE, FREIBURG;
LUTZ WEHMEIER ET AL.,
MWG BIOTECH, EBERSBERG
BLITZLICHT
43 Hochdurchsatz-PCR: vom Genom zum Expressionsprofil
PATRICIA LANGER ET AL., GATC, KONSTANZ
REPORT
Ihr LABORWELT-Team
44 Ultrasensitive DNA- und Proteinarrays
MICHAEL PAWLAK ET AL., ZEPTOSENS, WITTERSWIL, CH
Information ordern? Kennziffer 11 LW 03 / www.biocom.de
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49 Produktwelt, Impressum
Nr. III/2002 | 3
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Proteomics
Dr. Frank Breitling1, Dipl.-Ing. Frieder Breitling2, Dr. Thomas Felgenhauer3, Dr. Simon Fernandez1,
Dipl.-Ing. Klaus Leibe3, Dipl.-Chem. Mario Beyer1, Dr. Volker Stadler1, PD Dr. F. Ralf Bischoff3,
Prof. Dr. Annemarie Poustka1
Deutsches Krebsforschungszentrum,1Abteilung Molekulare Genomanalyse, 2PEPperPRINT GmbH,
3
Abteilung Molekulare Biologie der Mitose
Ziel unserer Forschungsarbeiten ist die Entwicklung hochkomplexer Peptidarrays für die biomedizinische Forschung. Die Grundlage dafür bildet ein Verfahren zur kombinatorischen Peptidsynthese
auf einem Computerchip, der die Erzeugung unterschiedlicher Ladungsmuster auf der Oberfläche
ermöglicht. Dazu werden die 20 verschiedenen biogenen Aminosäuren jeweils in unterschiedliche
Partikel eingeschlossen und durch elektrostatische Kräfte nacheinander an die Syntheseorte auf dem
Chip angelagert. Die Partikel bestehen aus einem bei Raumtemperatur festen Lösungsmittel (z.B.
Diphenylformamid), in das die Fmoc-Aminosäuren eingebettet sind.
Durch Erwärmung schmelzen die Partikel auf dem Chip und die eingeschlossenen Aminosäuren
werden für die Kopplung freigesetzt. Durch wiederholtes Anlagern und Koppeln der Aminosäuren
kann eine große Zahl unterschiedlicher Peptide simultan auf dem Chip synthetisiert werden.
Viele Infektionskrankheiten (z.B. Borreliose, Tuberkulose) zeigen je nach Patient einen sehr unterschiedlichen Verlauf. Während in einigen Fällen nicht einmal bemerkt
wird, daß eine Infektion stattgefunden hat,
können in anderen Fällen schwerste Komplikationen auftreten. Ein vieldiskutierter
Einflußfaktor dabei ist der sogenannte Immunstatus des Patienten. Aus diesem GrundeAerscheint es interessant, die Antikörperprofile von Patientengruppen mit unterschiedlicher Ausprägung der Krankheit zu
vergleichen. Mit sogenannten Peptidomarrays® könnte die Gesamtheit aller Proteine
(z.B. von Borrelia burgdorferi) in Form überlappender Peptide auf einem einzigen Peptidarray repräsentiert werden. Der dafür
benötigte Array mit etwa 150.000 Peptiden
des Erregers (die überlappenden Peptide
sind dabei jeweils um fünf Aminosäuren
gegeneinander versetzt) könnte einen
möglichst umfassenden Nachweis von Borrelia burgdorferi-spezifischen Antikörpern
Abb. 1: Kombinatorische Peptidsynthese mit
Hilfe von Aminosäure-Partikeln
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Kennziffer 12 LW 03 Info ordern? Hochkomplexe Peptidarrays
auf Computerchips
Analyse des Immunstatus durch
Peptidom-Arrays
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im Blut infizierter Patienten ermöglichen.
Derartige Antikörperprofile eröffnen die
Differentialdiagnose von Krankheitsbildern. Ähnliches gilt für Peptidomarrays anderer Spezies, wie Mycobacter tuberculosum
(ca. 200.000 Peptide benötigt) oder Plasmodium falciparum (ca. 500.000 Peptide benötigt).
Verfügbare Peptidarrays
Die Pionierarbeit auf dem Gebiet der Peptidarrays kann Prof. Dr. Ronald Frank (GBF
Braunschweig) zugeschrieben werden 1,2.
Trotz großer Anstrengungen in den letzten
Jahren weisen die derzeit verfügbaren Peptidarrays aber noch wesentlich weniger Oligomere pro Flächeneinheit auf als die Standardprodukte im Bereich der hochkomplexen Oligonukleotid-Arrays. Mit den zur Zeit
verfügbaren Techniken können zwischen
10.000 und 50.000 unterschiedliche Peptide
auf einem Träger von ca. 20 cm x 20 cm
hergestellt werden 3,4.
Eine Hauptschwierigkeit aller Spot-Techniken – nur diese liefern derzeit brauchbare
Resultate – ist die Handhabung winzigster
Flüssigkeitsmengen. Die auf den Träger aufgebrachten Tröpfchen variieren in ihrer Größe und das Lösungsmittel verdunstet oder
verbreitet sich auf dem Träger. Darüber
hinaus sind uneinheitliche Kopplungsbedingungen ein Problem, da die zuerst aufgebrachten Monomere bereits an den Träger koppeln, während an anderer Stelle noch
gedruckt wird. Um wesentlich komplexere
Peptidarrays herstellen zu können, ist es
daher erforderlich, ein neues Verfahren zu
entwickeln.
Kombinatorische Peptidsynthese
mit einem Laserdrucker
Diese Probleme können mit trockenen Aminosäure-Partikeln umgangen werden, die den
Kern des hier vorgestellten, neuen Verfahrens
bilden. In die Matrixsubstanz dieser Partikel
(z.B. Diphenylformamid, Diphenylsulfoxid)
1
2
3
Abb. 2: Blaue Bereiche weisen durch Bromphenolblau gefärbte freie Aminogruppen von gekoppeltem Alanin nach. Individuell nachweisbar
sind 18 (1), 46 (2) und 184 (3) Spots/cm2 .
Zunächst wurden die Fmoc-Alanin-Partikel mit
Hilfe eines Laserdruckers positioniert, anschließend das darin eingeschlossene Fmoc-Alanin
an den Träger gekoppelt und freie Aminogruppen durch Essigsäureanhydrid blockiert. Nach
der Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurden
die neuentstandenen, freien Aminogruppen mit
Bromphenolblau nachgewiesen.
sind die Monomere (z.B. Fmoc-geschützte
Aminosäurecarboxyanhydride) eingeschlossen (Abb. 1.1). Die Matrixsubstanz der Partikel
ist bei Raumtemperatur fest, so daß sie sich
wie normale Tonerpartikel mit einem Farblaserdrucker an exakt definierbare Orte auf einem zweidimensionalen Träger drucken lassen.
Jeweils nach dem Aufbringen einer vollständigen Druckschicht von unterschiedlichen
Aminosäuren-Tonerpartikel werden die in
diesen Partikeln immobilisierten Monomere
durch einen wärmeinduzierten Phasenwechsel von fest nach flüssig aus den Tonerpartikeln freigesetzt (Abb. 1.2). Unter diesen Bedingungen erfolgt die Kopplung der Monomere an den Träger oder an die bereits synthetisierten Oligomerketten. Danach werden
ungebundene Monomere weggewaschen
(Abb. 1.3) und anschließend die Fmoc-Schutzgruppe abgespalten.
Erste Ergebnisse sind in Abbildung 2 (siehe
Seite 6) gezeigt. Zu sehen ist ein Ausschnitt
von 18 cm–2 (oben), 46 cm–2 (links) bzw. 184
cm–2 (Mitte) blau angefärbter, optisch auflösbarer Aminosäure-Spots. Die Aminosäuren
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Abb. 3: Vergleich von normalem Hewlett Packard Farbtoner (blau; ca. 5 µm) mit Aminosäure-Partikeln, die mit einer Luftstrahlmühle hergestellt wurden.
wurden mit Hilfe eines Laserdruckers auf
dem Träger positioniert und gekoppelt. Abbildung 3 zeigt die dafür verwendeten Aminosäuren-Partikel im Vergleich zu handelsüblichem Farbtoner.
Ein Laserdrucker, der in der Lage ist, mehrere Schichten exakt übereinander zu drucken
und damit den Aufbau von Peptiden aus
einzelnen Aminosäuren erlaubt, wird zur
Zeit am Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung in Stuttgart konstruiert und steht voraussichtlich
Anfang 2003 zur Verfügung.
Das entscheidend neue an diesem Verfahren
sind die Aminosäure-Partikel, deren Matrixmaterial zum Lösungsmittel für eine chemische Synthese umgewandelt werden kann.
Bei allen bisher bekannten Methoden zur
Herstellung von Arrays werden die Monomere in Flüssigkeiten auf den Träger aufgebracht. Bei dem hier beschriebenen Verfahren geschieht dies in Form der beschriebenen trockenen Aminosäuren-Tonerpartikel5 .
Abbildung 4 zeigt den Vergleich zwischen
der von Frank et al. entwickelten SPOT-Synthese2 und der Verwendung trockener Aminosäuren-Partikel. Beide Verfahren beruhen
im Prinzip auf dem seit fast 40 Jahren bewährten Peptidsyntheseverfahren nach Merrifield6 mit dem Unterschied, daß bei den
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PEPperPRINT
Dieser einfache Ansatz wird aller Voraussicht nach zu einem Patent führen, das ein
neuartiges Verfahren zur Array-Herstellung
breit abdeckt5. Auf der Grundlage dieser Patentanmeldung wurde im März vorigen Jahres die PEPperPRINT GmbH aus dem DKFZ
ausgegründet. Das junge Unternehmen sucht
derzeit nach Investoren. Die PEPperPRINTTechnologie zählte im vergangen Jahr zu den
Gewinnern des Businessplanwettbewerbs
„Genius Biotech Award“ und des Innovationswettbewerbs zur Förderung der Medizintechnik. Letzterer wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung „für
besonders innovative und originelle Forschungsideen im Bereich der Medizintechnik“ vergeben.
Aminosäure-Tonerpartikeln statt Dimethylformamid das chemisch sehr ähnliche Diphenylformamid verwendet wird.
PEPperChip
Beim PEPperChip soll anstelle eines Laserdruckers ein weitestgehend handelsüblicher Computerchip mit derzeit mehr als
100 Millionen individuell ansteuerbaren
Orten (pro cm2) zum Positionieren der Partikel verwendet werden. Auf diesem Chip
kann direkt ein Muster elektrostatischer
Ladungen erzeugt werden, wodurch gleichartig geladene Partikel an die ungeladenen
Orte durch Induktion einer Bildladung binden können (Abb. 5). Diese Anlagerung –
verbunden mit einem kurzen Anschmelzen
– kann für jede Art von Partikel nacheinander ausgeführt werden, ohne daß eine chemische Reaktion eingeleitet werden muß.
Erst nachdem alle Partikelsorten positioniert sind, erfolgt die gleichzeitige Kopplung aller Aminosäuren (z.B. durch vollständiges Schmelzen und Aktivierung einer in den Partikeln zusätzlich eingeschlossenen Photobase). Daher erwarten wir, daß
mit Hilfe dieser Technik in absehbarer Zeit
hochkomplexe und vergleichsweise kostengünstige Peptidarrays zur Verfügung stehen werden.
Abb. 5: Beladung des Chips mit AminosäurePartikeln durch selektive elektrische Aufladung
Literatur
1. Frank R (1992) An easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a
membrane support. Tetrahedron 48, 9217-9232
2. Frank R, Overwin H (1996) SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol 66,
149-169
3. Chan WC, White PD (Editoren) (2000) Fmoc Solid
Phase Peptide Synthesis; Kapitel 14. 346 Seiten. Oxford University Press, ISBN 0-19-963 724 5
4. www.jerini.de
5. Breitling, F., Poustka, A., Groß, K.H., Dübel, S. und
Saffrich, R. (1999). Verfahren und Vorrichtungen zum
Aufbringen von Substanzen auf einen Träger, insbesondere von Monomeren für die kombinatorische
Synthese von Molekülbibliotheken. Deutsche Patentanmeldung DE19960346, europäische Patentanmeldung EP1140977A2, amerikanische Patentanmeldung
US880688.
6. Merrifield RB, Stewart JM (1965) Automated peptide synthesis. Nature 207, 522-523
Korrespondenzadresse
Abb. 4: Der Unterschied zwischen dem PEPperPRINT-Verfahren und der Spot-Synthese ist das verwendete „feste“
Lösungsmittel und der wärmeinduzierte Phasenwechsel
der Aminosäure-Partikel von
fest nach flüssig.
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Dr. Frank Breitling
Deutsches Krebsforschungszentrum
Im Neuenheimer Feld 280
Abteilung Molekulare Genomanalyse
Tel.: 06221-42 4747
Fax: 06221-42 3454
eMail: [email protected]
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Roche Applied Science
The matriXarray platform:
a novel and flexible approach
for gene analysis
Horst Donner, Uschi Brehm, Jochen Hurlebaus, Jochen Renzing, Angelika Roesler and Bruno Frey,
Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Penzberg, Germany
The parallel investigation of hundreds to thousands of different genes by DNA microarray analysis
has shifted the focus of many researchers from a genetic to a genomic level. Based on the four-letter code,
genomic information is available as DNA (genome) or RNA (transcriptome) in living cells. Whilst
RNA as the mediator between genomic information and gene function is used to monitor the
expression of genes, DNA as the mediator between the genomic information of different generations
is used to screen for mutations among different individuals and populations.
Microarrays in general are composed of a two or three-dimensional solid surface where DNA used as
capture molecule (probe) is attached. Many spots are distributed over the surface in an arranged
fashion containing a specific probe sequence. Each of the sequences corresponds to a specific target
sequence enabling the researcher to measure hybridization of thousands of different sequences in
parallel. The formation of the probe sequences varies among different microarray platforms. Whereas
cDNA microarrays are composed of amplified double-stranded DNA fragments (several 100 bp of
length); oligonucleotide arrays are utilizing single-stranded DNA molecules (varying from 20 up to
80 bp in length). These oligonucleotides can be synthesized ex-situ and are then automatically printed
onto the surface, or can be synthesized on the array.
The production method of microarrays is essential for reproducibility and reliability of the experiments. Whereas the standardized and reproducible cultivation and amplification of bacterial DNA
clones is difficult to achieve, the synthesis of oligonucleotides could be more easily embedded into an
industrial workflow including several quality control steps. Oligonucleotide microarray platforms
also offer more flexibility, especially when probe synthesis can be addressed individually for each spot
on each array. This flexibility can only be achieved by utilizing an on chip synthesis principle.
matriXarray: new technology for
chip design and production
A maximal flexibility provided by the
matriXarray platform from Roche Applied
Science is based on the in-situ synthesis of
DNA on semiconductor integrated circuits
as well as the virtual flask technology. Figure 1 shows a 6-inch silicon wafer, that forms
the basal surface of the array. A porous reaction layer is applied on one side of the semiconductor surface in order to enhance sur-
face area. The three-dimensional array surface is covered by a disposable housing including an inlet and outlet.
Oligonucleotide synthesis is performed utilizing phosphoramidite chemistry and electrochemical deprotection. This electrochemical
deprotection is controlled individually for
each spot on each array leading to a maximum flexibility within and between arrays.
Virtual flask technology prevents the diffusion of the reaction compounds in order to
Fig. 1: Array fabrication for
on-chip synthesis. Top
left: a wafer containing
many microarrays; middle:
single matriXarray in a
rectangular format; lower
right: small section of the
matriXarray showing individually addressable electrodes and their associated circuits.
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Fig. 2: Virtual flask technology. Three electrodes are turned on while the other electrodes
remain off. Electrochemically generated acids
from active electrodes enable the specific coupling of the next nucleotide by de-protection via
H+ ions. Hereby coupling efficiency is greater
98% allowing oligonucleotide synthesis of more
than 25 bp in length.
avoid contamination of surrounding electrodes. So far, up to 1000 features could be synthesized individually per array (figure 2).
The first essential step in planning an microarray-experiment is careful selection of
capture probe sequences. For optimal performance these oligonucleotides should have
similar melting temperatures, avoid secondary structures and should be checked for crosshybridization within the pool of target sequences. In RNA-profiling this pool of target
sequences is not 100% characterized even for
human applications. Additionally, the huge
number of unknown splice variants necessitates the ability to rapidly iterate microarray
designs. With the matriXarray system of
Roche Applied Science, a complete workflow for convenient on-line design, ordering
and delivery of customized microarrays will
be made available.
Optimized kits
for target preparation
Target preparation is related to the starting
amount and platform used in the experiment. Kits and reagents have been developed by Roche Applied Science for direct
labeling of targets during cDNA synthesis as
well as target amplification. For the application of the matriXarray platform incorporation of labeled nucleotides during T7 amplification (Eberwine protocol) is recommended. According to the amount of starting
material, a method for PCR amplification
prior to the T7 amplification has been developed. Consequently labeled targets can be
generated from as little as 50 ng of total
RNA.
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workflow is fully automated in order to enhance reproducibility of the results.
Applications
Today expression-profiling as well as mutation analyses are the two main applications
for microarray analysis. Two examples for
both applications are the evaluation of expression profiles from rat tissues as well as
the analysis of mutations within the cystic
fibrosis transmembrane conductor (CFTR)
gene.
Fig. 3: Image overlay of a co-hybridization experiment utilizing rat liver and brain tissues. 24
spots out of a 1 k array co-hybridization experiment show the expression of tissue-specific
and tissue-independent genes. Spots coloured
red indicate liver specific, those coloured green
indicate brain specific cDNA. Yellow spots show
simultaneous expression in both tissue types.
Gene names corresponding to the probes
within the numbered spots are listed below:
1. fatty acid binding protein 1, fabp1: specific
for liver;
2. creatine kinase: specific for brain
3. alpha-tubulin: housekeeping-gene expressed
in liver and brain
4. acidic calcium-independent phospholipase
A2: housekeeping-gene expressed in liver and
brain
Comparison of expression profiles derived
from various rat tissues
By using inbred rat strains for tissue comparison (e.g. liver, kidney, heart etc.), a variation based on the genetic background is minimized. Set up experiments are focused on
genes displaying an ON/OFF mode based
on the specific physiological function of each
organ. Distinct expression of those genes
together with so-called house keeping genes
are shown in figure 3. Differences of gene
expression within a tissue or between several tissues can be further calculated by a data
analysis software. This software enables the
researcher to evaluate ratios as well as to
perform hierarchical clustering.
Mutation analysis within the CFTR gene
Fully automated hybridization
and image acquisition
For hybridization and subsequent reading
of the chips only arrays, targets and buffer
components have to be inserted into to the
matriXarray hybridizing and imaging instrument. A pipetting robot performs liquid
handling and image acquisition is done by
CCD camera. A complete experimental workflow for 6 different arrays can be completed
in less than 6 hours. Image analysis is performed at the same workstation utilizing proprietary software tools. The hybridization
Cystic fibrosis is the most common, early
lethal genetic disease within Caucasians.
Whilst more than one thousand mutations
are described so far, only a few of them are
responsible for nearly 99% of aberrant transcripts. Since these mutations include single
or dinucleotide insertions and deletions as
well as single base pair substitutions the
CFTR gene serves as a suitable target for
microarray analysis. Typical results are
shown in figure 4.
For gene expression as well as mutation analysis several alternative methods are availab-
Fig. 4: Mutation detection
within the cystic fibrosis
(CFTR) gene. A labeled fifteen-plex PCR reaction covering more than 30 polymorphic sites within the CFTR
gene was hybridized onto a
matriXarray chip. As an example, three probes for the
wild type sequence (corresponding to three polymorphic
sites) as well as three corresponding nucleotide substitutions are displayed. As the
sample was extracted from a
healthy individual, only probes corresponding to the wild
type (WT, indicated in blue)
produce positive signals.
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le (e.g. RT-PCR, Northern Blots, RFLP, etc.).
The key advantage of microarray experiments
is the parallelization of hybridization experiments. Although these parameters differ
between expression profiling and mutation
detection, parallelization requires optimal
hybridization conditions as well as probe
sequences for hundreds or thousands of genes or polymorphic sites within the same
experiment. Since assay optimization could
not be achieved in a single-step approach,
flexibility is one of the key features of the
matriXarray System of Roche Applied Science.
Summary
Array technology is delivering new information about complex interactions at a molecular level. This knowledge will be reshaping
the ways how research will be conducted in
the future. Especially in respect to complex
human diseases microarray analysis is expected to deliver fundamental insight in pathogenic processes. It might help therefore to
increase the prognostic and therapeutic capabilities of medical treatments in the future.
By utilizing the matriXarray platform developed by Roche Applied Science, researchers
are now able to address the rapidly increasing amount of new data more flexible, within
their array experiment. This includes change
of probe sequences, gene lists as well as the
switch between organisms and applications.
Furthermore, together with optimized kits
and reagents the matriXarray platform offers
superior solutions for the complete workflow of an array experiment. This might be of
great importance especially when protocols
and/or data should be exchanged between
different labs.
Together with MagNA Pure LC and the LightCycler System the matriXarray platform expands the portfolio of automated systems for
nucleic acid analysis of Roche Applied
Science. Especially the interaction between
these different platforms might help to speed
up research and development in the future. A
first impression of the matriXarray platform
could be received at the MEDICA in November 2002 although launch of the system will
be during the year 2003.
Correspondence
Horst Donner, PhD
Roche Applied Science
Roche Diagnostics GmbH/House 241, Room 379
Nonnenwald 2
D-82372 Penzberg
Tel: 08856-60 3901
Fax: 08856-60 3156
eMail: [email protected]
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Microarrays
Nanopumpen verbessern
die Microarray-Inkubation
Dr. Jürgen Scriba, Andreas Tögl, Dr. Roland Kirchner, Advalytix AG, Brunnthal
Mit einer neuartigen Technologie gelingt es, die Probenflüssigkeit während der Inkubation von
Microarrays im Kapillarspalt ohne zusätzliche Totvolumina effektiv zu durchmischen. Die Durchmischung erhöht die Signalintensität, verkürzt die Inkubationszeiten und ermöglicht die in-situ-Messung
der Reaktionskinetik.
DNA- und Protein-Microarrays spielen in
vielen Bereichen der biologischen Forschung
eine immer wichtigere Rolle. Ihr geringer
Probenverbrauch und die hohe Parallelität
der Assays machen sie zu einer Schlüsseltechnologie im Hochdurchsatz-Screening.
Hochdichte Chips ermöglichen die Expressionsanalyse eines vollständigen Genoms in
einem Experiment. Für viele Anwendungen
von der routinemäßigen Nahrungsmittelanalyse bis zur Genexpressionsanalyse stehen
kommerzielle Chips zur Verfügung. Die zahlreichen am Markt erhältlichen Spotter- und
Readersysteme, spezielle Slides mit optimierten Oberflächen und hochwertige Verbrauchsmaterialien machen Microarray-basierte Assays zu einem Standard in vielen
Abb.1: AdvacardTM mit drei Mischerchips, Funktionsprinzip der auf dem Chip integrierten Nanopumpen, die mit Hilfe von Oberflächenwellen
Strömungen in Flüssigkeiten anregen.
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Betrachtet man die Situation eines Microarrays im Maßstab 1 zu 1000, wird das Problem
intuitiv klar: Auf einem Slide von der Größe
eines Fußballplatzes stünde die Probenlösung etwa knöcheltief. Die Spots sind in diesem Bild etwa handtellergroß. Daß während
endlicher Inkubationszeiten DNA-Moleküle
aus der rechten Spielfeldhälfte den passenden Spot auf dem linken Elfmeterpunkt finden, ist praktisch ausgeschlossen, da sie durch
Diffusion während eines Tages in diesem
Maßstab nur einige Meter überwinden können. Moleküle außerhalb dieses Radius tragen nicht zum Signal eines Spots bei. Abhän-
Abb. 2: Verteilung von Farbstoff im Kapillarspalt über einem Objektträger in 15 Minuten. Oben: Bei
Durchmischung mit SAW-Nanopumpen, unten: ohne Durchmischung
Labors. Gleichwohl läßt ein zentraler Bereich
der Microarray-Technologie nach wie vor
breiten Raum für eine Optimierung: Die spezifische Bindung zwischen Target-Molekülen in der Probenflüssigkeit und den an der
Slideoberfläche immobilisierten Fängermolekülen findet in einer äußerst ungünstigen
Geometrie statt. Da im Kapillarspalt zwischen
Slide und Deckglas ohne zusätzliche Maßnahmen die Durchmischung auf Diffusion
beschränkt ist, kommt es in der unmittelbaren Nachbarschaft der Fängermoleküle zu
Verarmungszonen, die nur durch Diffusion
ausgeglichen werden können. Die Folge sind
lange Inkubationszeiten, Inhomogenitäten
auf dem Array und ein nicht optimales Signal-Rausch-Verhältnis.
So trivial sich das Problem der Durchmischung auf makroskopischer Ebene darstellt,
so hartnäckig entzieht es sich der mikrofluidischen Lösung. Einerseits fehlte bislang das
mikromechanische Pendant zum Magnetrührer, der im Kapillarspalt mit einer Höhe von
nur 0,1mm eingesetzt werden könnte. Andererseits verhindert die geringe Dicke des Flüssigkeitsfilms die Bildung von Turbulenzen.
Deshalb können Inkubationssysteme, die mit
Hilfe externer Pumpen versuchen, die Probenlösung im Kapillarspalt zu durchmischen,
bestenfalls laminare Strömungen im Spalt
erzeugen. Da laminare Strömungsfäden jedoch per se stationär sind, ist eine flächige
Durchmischung ausgeschlossen. Die zur Befüllung externer fluidischer Systeme nötigen
Zusatzvolumina und die damit verbundene
Verdünnung der Probe – zum Teil um Faktoren – kann zudem einen möglichen
positiven Effekt auf die Reaktionskinetik
und das Reaktionsgleichgewicht zunichte
machen.
gig von der relativen Konzentration der verschiedenen Bindungspartner können manche Spots daher nicht die maximale Intensität
erreichen, es kommt zur lokalen Verarmung.
Fehlende Durchmischung ist zudem vermutlich auch für Beeinträchtigungen der Signalqualität, wie Intensitätsgradienten, „Doughnut“-Artefakte etc. verantwortlich.
Totvolumina-freie Nanopumpen
ohne bewegliche Teile
Die Advalytix AG hat jetzt Nanopumpen
entwickelt, die eine effektive Agitation kleinster Probenmengen ohne zusätzliche Totvolumina ermöglicht. Die Pumpen sind auf der
Oberfläche von Chips integriert, die anstelle
eines Deckglases in der üblichen Inkubationsgeometrie angewendet werden können.
Die Pumpen enthalten keinerlei mechanisch
bewegliche Teile, zur Agitation der Flüssigkeit dienen sogenannte akustische Oberflächenwellen (Surface Acoustic Wave – SAW).
Die SAW-Technik wird seit langem in der
Elektronik eingesetzt, so finden sich zum Beispiel in Mobiltelefonen gleich mehrere Oberflächenwellenfilter. Zur Anregung der Wellen dienen dabei metallische Elektroden auf
dem piezoelektrischen Chip. Diese sogenannten Transducer wandeln ein hochfrequentes
elektrisches Signal in eine mechanische Vibration um. Mit einer Amplitude im Nanometerbereich und Wellenlängen von einigen Mikrometern breiten sich die Wellen wie Erdbeben im Nanoformat über den Chip aus 1.
Dabei übertragen sie einen Teil ihrer Energie
auf die Flüssigkeit an der Chipoberfläche.
Abbildung 1 zeigt das Funktionsprinzip eines solchen Mischer-Chips und die
AdvacardTM – eine Kunststoffkarte mit drei
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Mischer-Chips – die in der Lage ist, den Reaktionsraum über einem Objektträger zu durchmischen.
Die SAW-induzierte Strömung innerhalb eines geschlossenen Volumens führt zu einer
effizienten Durchmischung der Flüssigkeit –
insbesondere dann, wenn die Frequenz oder
die Amplitude der SAW im Lauf des Experiments geändert wird. Die programmierbare
Variation der Mischparameter verändert die
Geometrie der Strömungsmuster im Kapillarspalt, so daß durch die Überlagerung verschiedener laminarer Strömungen im Lauf
der Zeit eine großflächige quasi-chaotische
Durchmischung erreicht wird. Abbildung 2
illustriert die Wirkung der Nanopumpen am
Beispiel der Verteilung eines Farbstoffes: Die
Bildreihe zeigt einen Blick auf eine Inkubationskammer, in der eine Advacard auf einen
Objektträger gedrückt wird. Durch vier zusätzliche, für diesen Zweck angebrachte Öffnungen wurde Farbstoff in den Kapillarspalt
zwischen Advacard und Slide pipettiert. Die
untere Bildreihe zeigt die Verteilung des Farbstoffes innerhalb von 15 Minuten durch Diffusion: Die durch das Zugeben des Farbstoffs
erzeugten, annähernd runden Bereiche von
ca. 5 mm Durchmesser verändern sich im
Beobachtungszeitraum nur wenig. Die obere
Bildreihe zeigt das Experiment mit SAW-
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Nanopumpen. Hier wird der Farbstoff nach
kurzer Zeit über den gesamten Reaktionsraum verteilt und die Probenlösung vollständig homogenisiert.
Applikationen
Der positive Effekt der Durchmischung während der Inkubation läßt sich insbesondere
bei in-situ-Messungen gut demonstrieren.
Abbildung 3 zeigt die zeitliche Veränderung
des Fluoreszenzsignals eines DNA-Hybridisierungsereignisses. Die Messung erfolgte in
Echtzeit während der Inkubation mit Hilfe
eines Fluoreszenzmikroskops. Ohne Durchmischung (Datenreihe „signal no mix“) steigt
die Signalintensität annähernd linear. Anzeichen für eine Sättigung der Reaktionskinetik
sind im Beobachtungszeitraum nicht zu erkennen. Offenbar ist die Probenlösung oberhalb des Spots nach wenigen Minuten verarmt, und neue Reaktionspartner können nur
mit der Diffusionsgeschwindigkeit – und
damit nur sehr langsam – nachgeliefert werden. Mit Nanopumpen-Durchmischung (Datenreihe „signal mix“) wird nach etwa 90
Minuten die Sättigung erreicht. Auffallend
ist die um den Faktor 4 höhere Endintensität.
Die Mischtechnik macht so Kurzzeitexperimente möglich: Nach einem Viertel der Reak-
Abb. 3: Zeitliche Entwicklung der Fluoreszenzintensität eines Spots auf einem DNA-Microarray,
mit („signal mix“) und ohne („signal no mix“)
Durchmischung während der Hybridisierung
tionszeit sind bereits rund zwei Drittel der
Signalstärke erreicht. Die Durchmischung der
Probenlösung läßt sich somit auf zweierlei
Weise zur Optimierung von Hybridisierungsexperimenten nutzen: In einem Langzeitexperiment ist das Sättigungssignal mit geringerer Probenkonzentration zu erzielen. Die
Zeit bis zum Erreichen eines aussagefähigen
Signals kann gegenüber dem ungemischten
Fall verkürzt werden. Des weiteren läßt sich
die Reaktionskinetik in-situ bestimmen.
Abbildung 4 zeigt diese beiden Effekte am
Beispiel eines am NMI, Reutlingen, entwickelten Protein-Sandwich-Assays. Die mit
Info ordern? Kennziffer 16 LW 03 oder www.biocom.de
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Abb. 4: Fluoreszenzsignale eines HuIgGSandwich-Assays.
A. 2x45 min. Inkubation ohne Durchmischung, B. 2x5
min. Inkubation mit
Durchmischung,
C. 2x15 min. Inkubation mit einem Viertel der Probenkonzentration
C
dem Pfeil markierte Spotreihe enthält AntiHuIgG-Replikas. In Bild A wurde die zweistufige Inkubation ohne Durchmischung in zweimal 45 Minuten durchgeführt. Die beiden Bilder B und C wurden nach einer Inkubation mit
Durchmischung aufgenommen. Sie zeigen in
der Falschfarbendarstellung annähernd dieselbe Intensität und Signalqualität, obwohl im
Fall B die Inkubationszeit auf zweimal 5 Minuten verkürzt wurde. Für C wurde zweimal 15
Minuten inkubiert, jedoch die Konzentration
um Faktor 4 verringert.
Die positiven Effekte der Durchmischung sind
für DNA-Microarrays ähnlich. Hier hängt
erwartungsgemäß der Einfluß der Agitation
auf die Reaktionskinetik von der Länge der
verwendeten Sequenzen ab. Abbildung 5
zeigt die Auswertung eines E. coli-Arrays,
dessen einstündige Inkubation mit und ohne
Mischen unter ansonsten identischen Reaktionsbedingungen durchgeführt wurde. Die
blauen Balken zeigen die Signale ohne Durchmischung. Für das Experiment, das durch die
roten Balken dargestellt wird, wurden die
Nanopumpen ohne Variation der Mischparameter betrieben, der Kapillarspalt wurde
also im wesentlichen laminar durchströmt.
Die Signalintensität steigt an. Eine weitere
Optimierung der Reaktionskinetik wird je-
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doch im dritten Experiment erreicht, das
durch Variation der Betriebsparameter der
SAW-Pumpen eine quasi-chaotische Durchmischung erzielt (grüne Balken). Die Durchmischung verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis um den Faktor 4, die Spot-Homogenität erhöht sich um den Faktor 5.
Array Booster
In Zusammenarbeit mit der Firma Grohmann
Biotech Automation hat Advalytix ein Inkubationsgerät für Microarrays im StandardSlideformat entwickelt und unlängst vorgestellt. Der ArrayBoosterTM verfügt über vier
unabhängig zu programmierende Reaktionskammern (s. Abb. 5). Die Kammern können
auf übliche Inkubationstemperaturen zwischen 30 und 70 Grad Celsius temperiert
werden. Der Slide wird in die Kammer eingelegt und mit einer AdvacardTM abgedeckt,
wobei Spacer an den Rändern der Karte für
einen Kapillarspalt einer definierten Dicke
von 100 Mikrometer sorgen. Für unterschiedlich große Spotfelder stehen drei AdvacardTypen unterschiedlicher Breite mit ein, zwei
oder drei Nanopumpen-Chips zur Verfügung. Die so gebildeten Kapillaren nehmen
zwischen 20 und 150µl Probenflüssigkeit auf.
Durch die Anfertigung applikationsspezifischer Mischerkarten kann die Menge der Probenflüssigkeit noch weiter reduziert werden.
Während der Inkubation steuert ein Mikroprozessor die Nanopumpen. Durch Variation von Größen wie Amplitude und Frequenz
der angelegten Wechselspannung wird eine
Mischsequenz durchgeführt, die sich auf die
jeweilige Reaktionskinetik und physikalische
Randbedingungen, wie zum Beispiel die Viskosität des verwendeten Puffers abstimmen
läßt. Abbildung 6 zeigt das Gerät mit geöffneten Kammern.
Mit Hilfe der Nanopumpen-Mischtechnik läßt
sich das Problem verfälschter Kinetiken in
vielen kapillar dimensionierten Reaktionsräumen lösen. Neben der diskutierten Anwendung zur Inkubation von Microarrays ist
auch ihr Einsatz in der Färbung oder in-situHybridisierung von Gewebeschnitten in der
Erprobung. Da die Oberfläche der Mischer-
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Chips mit einem weiten Spektrum von passivierten oder reaktiven Schichten belegt werden kann, ist ihr Einsatz in allen biochemisch
relevanten Reaktionsmilieus möglich. Die
Pumpen sind frei von beweglichen Teilen
und Totvolumina, die Gefahr von Kontaminationen wird so minimiert. Das Chipmaterial ist transparent, in hoher optischer Qualität
verfügbar und zeigt keine Eigenfluoreszenz,
so daß sich Nanopumpen auch problemlos in
optische Echtzeit-Analysegeräte integrieren
lassen, etwa in einer Küvetten-Geometrie.
Denkbar ist auch die Integration in Mikround Nanotiterplatten. Die Nanopumpen sind
in der Lage, nicht nur Flüssigkeiten, sondern
auch in Flüssigkeit suspendiertes Material
gezielt zu bewegen. Erste Tests zeigen gute
Ergebnisse bei der Agitation von suspendierten Zellen. Die erzeugten Strömungen rei-
Abb. 6: ArrayBoosterTM-Inkubationsstation für
Standard-Microarrays mit vier Kammern. In einer Sandwich-Geometrie von Advacard und
Slide wird die Probenflüssigkeit mit Hilfe von
SAW-Nanopumpen durchmischt.
chen aus, um selbst adhärierte Zellen von der
Oberfläche zu lösen, ohne ihre Vitalität negativ zu beeinflussen. In diesem Zusammenhang verspricht das Konzept des „intelligenten Slides“ mit integrierten Pumpen interessante neue Anwendungen.
Literatur
[1] „Nano-Beben auf dem Chip“, Achim Wixforth,
Physikalische Blätter 54, 649 (1998)
Korrespondenzadresse
Abb. 5: E. coli-Array nach
einer Stunde Inkubation;
blau: ohne Durchmischung,
rot: mit laminarer Durchströmung des Kapillarspalts,
grün: mit quasi-chaotischer
Durchmischung
14 | Nr. III/2002
Dr. Jürgen Scriba
Advalytix AG
Eugen-Sänger-Str. 53.0
D-85649 Brunnthal
Tel.: 089-607-45831, Fax: 089-607-45810
eMail: [email protected], www.advalytix.de
Kennziffer 17 LW 03 Info ordern? |transkript LABORWELT
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Drug Discovery
Biochip für die Analyse
zellulärer Ionenkanäle
Niels Fertig1, Michèle Klau2, Michael George1, Robert Blick2, Jan C. Behrends2
Nanion Technologies GmbH, München, 2Center for NanoScience (CeNS) der LMU, München
1
Die Elektrophysiologie (Patch-clamp) ist der Standard für die pharmakologische Validierung potentieller Medikamente, die auf Ionenkanäle wirken. Das klassische Patch-clamp-Verfahren ist aber nicht
hochdurchsatzfähig, was eine Voraussetzung für einen Einsatz bei der Wirkstoffsuche ist. Wir stellen
hier eine neue chipbasierte Patch-clamp-Methode vor, die mit Hilfe mikrostrukturierter Glas-Chips
elektrophysiologische Messungen an Zellen ermöglicht. Die Technologie ist automatisiert und parallelisierbar und eignet sich damit für den Hochdurchsatz.
Eine der wichtigsten Eigenschaften von Zellen ist ihre Erregbarkeit. Durch physikalische
oder chemische Reize werden in der Zellmembran Ionenkanäle geöffnet oder geschlossen. Ionenkanäle sind Proteine, die in ihrem
Inneren eine für Ionen durchlässige Pore bilden können. Sie sind für den Grundlagenforscher interessant als elementare erregbare
Strukturen in der Biologie und für den Arzt
oder Pharmakologen als Angriffspunkt einer
großen Zahl wichtiger Medikamente,
beispielsweise gegen epileptische Anfälle,
Herzrhythmusstörungen, Bluthochdruck und
Diabetes.
Um die Ionenkanalfunktion direkt analysieren zu können, ist es notwendig, eine elektrisch leitfähige Verbindung zum Zellinneren zu schaffen. Der Grundstein dazu wurde
vor mehr als 50 Jahren mit der Entwicklung
von Ultramikroelektroden gelegt (Ling &
Gerard 1949). Bringt man ein dünnes Glasröhrchen in der Mitte zum Schmelzen und
zieht dann rasch an beiden Enden, bis die
beiden Hälften getrennt sind, so entstehen
zwei Glaspipetten mit Spitzendurchmessern
A
von wenigen Mikrometern oder weit darunter. Diese Mikropipetten können mit einer
elektrisch leitenden Salzlösung gefüllt und
durch die Membran in die Zelle eingestochen
werden, um Spannung und Strom über die
Zellmembran zu messen (intrazelluläre Ableitung).
Ihren Höhepunkt erreichte die Mikropipettentechnologie jedoch mit der Patch-clampTechnik (Hamill et al. 1981, Neher & Sakmann 1995). Sie wurde von Erwin Neher
und Bert Sakmann (Nobelpreis für Medizin
oder Physiologie 1991) entwickelt und erlaubte erstmals Messungen von Strömen
durch einzelne Ionenkanäle und damit den
eigentlichen Beweis für deren Existenz. Die
Idee war, einen nur wenige Mikrometer großen Fleck (patch) der Zellmembran mit Hilfe
eines elektronischen Rückkopplungs-Schaltkreises bei einer definierten elektrischen
Spannung zu halten (oder zu ‚klemmen‘:
clamp), um dann anhand des Rückkopplungs-Signals den Ionenstrom durch dieses
Areal zu beobachten. Dazu wurde die Mikropipette nur aufgesetzt, statt sie durch die
B
Abb. 1: Die durch „klassische Mikrostrukturierung“ hergestellte Glas-Mikropipette und die subzellulären Dimensionen aktueller Festkörperstrukturen A: Der Prozeß des lokalen Erhitzens und Auseinanderziehens eines Glasröhrchens (Schema oben rechts) resultiert in Aperturen mit µm-Öffnungen, die hier in sukzessive stärker vergrößerten Aufnahmen im Rasterelektronenmikroskop (REM)
gezeigt sind (im Uhrzeigersinn von links oben). B: Gegenüberstellung von zwei REM-Aufnahmen einer kultivierten Nervenzelle (großes Bild) und eines Nano-Resonators aus der Arbeitsgruppe Blick
am Lehrstuhl für Halbleiterphysik (Prof. Dr. Kotthaus) bei gleicher Vergrößerung. Man beachte, daß
die Dimensionen der kleinsten Bestandteile der künstlich hergestellten Struktur in der gleichen Größenordnung liegen, wie die der kleinsten subzellulären Fortsätze des Neurons.
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Membran in die Zelle zu stechen. Es stellte
sich heraus, daß sich insbesondere durch
leichtes Einsaugen des unter der Pipettenöffnung befindlichen Membran’flecks’ ein
sehr enger Kontakt zwischen Glas und Zellmembran und damit gegenüber dem außerhalb von Zelle und Pipette befindlichen
Medium eine sehr gute Abdichtung erreichen läßt. Ein hoher elektrischer Widerstand
dieser Kontaktzone, der üblicherweise deutlich über einer Milliarde Ohm (1 GOhm)
liegt, verringert zufällige Störsignale soweit,
daß es möglich ist, die winzigen Ströme
(einige Billionstel Ampère) zu messen, die
durch einzelne Proteinkanäle fließen. Eine
weitere wichtige Entdeckung war, daß man
durch weiteres, stärkeres Ansaugen des
Membranflecks diesen im Inneren der Pipette zerreißen kann, ohne deswegen die
gute Abdichtung nach außen zu verlieren.
Dadurch wurde ähnlich wie bei der intrazellulären Ableitung ein elektrischer Zugang
zum Inneren der Zelle gebildet. In dieser
Konfiguration wird also die gesamte restliche Zellmembran auf einem kontrollierten
Potential festgehalten (Whole-cell-Patchclamp, Ganzzell-Ableitung). Diese Weiterentwicklung ermöglichte es nicht nur, Ionenströme mit nie dagewesener Auflösung
aufzuzeichnen, sondern auch, von Zellen,
ihren Fortsätzen oder gar von Organellen
abzuleiten, die zu klein sind, um den Einstich einer intrazellulären Glasmikroelektrode zu ‚überleben‘. Heute ist „Patch-clamping“ die am häufigsten verwendete Ableittechnik in der zellulären Elektrophysiologie.
Von der Pipette zum Chip
Obgleich sich die Anwendungsmöglichkeiten der durch Schmelzen und Ausziehen entstehenden, mikroskopisch feinen Hohlnadeln
beträchtlich erweitert haben, ist die zur Herstellung der Mikropipetten verwendete Technik noch immer dieselbe. Tatsächlich ist kaum
ein eleganteres Verfahren als diese „klassische Mikrostrukturierung“ denkbar, um ein
Werkzeug von subzellulären Dimensionen
mit einem etwa streichholzdicken und damit
handhabbaren Griff herzustellen (Abb. 1A).
Dennoch wird seit einigen Jahren in verschiedenen Arbeitsgruppen der Versuch unternommen, statt der Hohlnadelspitze eine mikrometergroße Öffnung (Apertur) in einem
Chip-ähnlichen, planaren Träger für das
„Patch-clamping“ zu verwenden (Schmidt
et al. 2000, Fertig et al. 2000, Fertig et al. 2001,
Klemic et al. 2002, Fertig et al. 2002).
Da Festkörperstrukturen mit Hilfe von modernen Mikro- und Nanostrukturierungstechniken leicht auf subzelluläre Dimensionen
gebracht werden können (Abb. 1B), ist die
Nutzbarmachung für biologische Fragestellungen naheliegend. Um das Patch-clampVerfahren mit einem mikrostrukturierten
Chip durchzuführen, ist es zweckmäßig, die
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Abb. 2: Prinzip des klassischen Patch-clamping mit der Mikropipette (A)
und des Patch-clamping mit Hilfe einer Apertur in einem planaren Substrat-Chip (B). Im klassischen Verfahren wird die Öffnung der Pipette unter Sicht mit Hilfe eines x-y-z-Manipulators auf die Zelle plaziert. Im Gegensatz wird beim „Patch-clamp-on a-chip“ die Zelle durch Unterdruck
auf der Apertur positioniert. Manipulator und Mikroskop entfallen. In C ist
die Strukturierung schematisch dargestellt und REM-Aufnahmen einer
durch Ionenspurätzen erzeugten Apertur abgebildet. Das obere Bild zeigt
den Eingang des Konus, das untere den Ausgang der Apertur, die perfekt
rund und glatt ist, wodurch die Bildung eines hohen Abdichtwiderstandes
ermöglicht wird.
räumliche Beziehung von Zelle und Ableitöffnung umzukehren: anstatt eine Hohlnadel an die Zelle heranzubewegen, sollte die Zelle auf
einer Öffnung in einem planaren Substrat in Position gebracht werden
(Patch-clamp-on-a-chip, Abb. 2). Eine solche Anordnung bietet verschiedene Vorteile:
1. Geringeres Meßrauschen: Während der Abschlußwiderstand zwischen Zellmembran und Glas für hochauflösende Messungen möglichst hoch sein sollte, gilt für den Innenwiderstand der Mikroelektrode sowie für ihre elektrische Kapazität das Gegenteil. Je niedriger Innenwiderstand und Kapazität, desto geringer sind störende
zufällige Signalfluktuationen (Rauschen). Bei der Pipette bildet sich
die mikrometerfeine Spitze erst am Ende eines einige Millimeter
langen, dünnen Schaftes. Dies bedeutet erstens, daß der Strom
durch die Pipette über eine Endstrecke von mehreren 100 µm einen
relativ großen Widerstand überwinden muß, und daß zweitens die
Wand der Pipette in diesem Bereich sehr dünn ist, was eine hohe
Kapazität bedingt. Bei der mikrostrukturierten Apertur in einem
z.B. nur 200 µm dicken Substrat kann nun diese entscheidende
Endstrecke auf einige wenige Mikrometer verkürzt werden, da die
mikroskopische Öffnung nicht durch Ausziehen sondern beispielsweise durch Ätzverfahren gebildet wird. Bei diesen reicht eine viel
kürzere Strecke aus, um auf sub-µm-Dimensionen zu kommen.
Außerdem ist in einer planaren Anordnung die Apertur überall von
einer sehr dicken Wand umgeben, so daß die Kapazität ebenfalls
verringert wird. Beides zusammen bewirkt eine verbesserte Meßauflösung.
2. Die planare Geometrie ermöglicht einen einfachen Zugang für
gleichzeitige optische Messungen – besonders für solche, die Objektive mit großer numerischer Apertur und mit geringem Arbeitsabstand erfordern oder die durch Lichtstreuung an der Pipette gestört
würden. Zudem ermöglicht es der flache Aufbau, elektrische Ableitungen an Zellen oder Membranflecken mit dem lokalen Einsatz
von Rastersondenverfahren zu kombinieren, wie etwa der Rasterkraftmikroskopie oder der optischen Nahfeldmikroskopie.
3. Parallelisierung: Flache Chips können im Gegensatz zu Mikropipetten mit hochgradig parallelen Verfahren hergestellt werden, wie sie
aus der Halbleitertechnologie bekannt sind. Zudem können mehrere Aperturen in einen Chip eingebracht werden, so daß viele
Messungen gleichzeitig durchgeführt werden können.
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4. Automatisierung: Der flache Aufbau des
Chips und die Tatsache, daß die Zelle und
nicht die Apertur bewegt werden muß, vereinfachen das Prozedere erheblich: Die einzige bewegliche Komponente ist die Zelle –
daher kommt ein solches Verfahren ohne
Manipulatoren oder optische Kontrollinstrumente aus. Darüber hinaus sind relative
Bewegungen von Apertur und Zelle ausgeschlossen, so daß keine Vibrationsdämpfung mehr erforderlich ist. Der gesamte Prozeß eignet sich unter diesen Bedingungen
viel eher zur Automatisierung als das klassische Patch-clamp-Verfahren.
Mikrostrukturierung
Bei ersten Versuchen wurden Substrate auf
der Basis von Silizium verwendet, weil für
die Strukturierung dieses Materials seit langem Standardmethoden etabliert sind. Das
Silizium wurde mit Siliziumnitrid beschichtet und daraufhin „unterätzt“, so daß sich
freitragende Siliziumnitridschichten ausbilden lassen. In diese Isolatormembran lassen
sich feine Öffnungen einbringen, um so die
Geometrie der Pipettenspitze nachzubilden.
Es ist zudem möglich, Zellmembranen stabil
in der Apertur zu plazieren (Fertig et al. 1999).
Im Verlauf der Versuche traten jedoch einige
gravierende Nachteile dieses Materials
zutage, die allesamt mit den Halbleitereigenschaften des Siliziums zu tun haben (schlechte elektrische Isolation, Photoeffekt, Autofluoreszenz). Aufgrund der zu geringen Kontaktfläche mit der nur wenige 100 Nanometer
dicken Siliziumnitridschicht ist die Geome-
Abb. 3: Ableitungen von Zellen mit Hilfe des
Patch-clamp-Chips. A: Schema der Zellpositionierung aus der Suspension durch Unterdruck.
B: Lichtmikroskopisches Bild einer auf der Apertur positionierten CHO-Zelle. C: Ganzzell-Ableitung (s. Einleitung) von einer CHO-Zelle. Es wurde eine Serie rechteckförmiger Spannungsbefehle steigender Amplitude angelegt (obere Spuren), wodurch die von dieser Zelle exprimierten
Kaliumkanäle geöffnet werden (Kontrolle: mittlere Spuren). Nach Zugabe des Skorpiontoxins
Charybdotoxin (ChTX, untere Spuren) ist dieser
Strom erwartungsgemäß blockiert. D: Messung
von Einzelkanalströmen mit dem Chip. In dem
untersuchten Membranfleck befinden sich mehrere Kanäle. Die durchgezogenen Linien zeigen
die Stromstufen an, zwischen denen das Signal
durch das statistische Öffnen und Schließen einzelner Kanäle fluktuiert.
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trie der Siliziumproben für die Ausbildung
eines elektrisch dichten Abschlusses zwischen
Membran und Chip zudem ungeeignet.
Aufgrund dieser Schwierigkeiten kehrten wir
zum klassischen und für Patch-Clamp Pipetten bewährten Material zurück – dem Glas –,
das all diese Nachteile nicht aufweist. Zwar
existieren keine Standard-Techniken, mit
denen sich Aperturen im µm- bis sub-µmMaßstab in Glas herstellen lassen, jedoch verfügt die Gesellschaft für Schwerionenforschung in Darmstadt über eine geeignete
Methode. Beim Einzelionenspur-Ätzen (Single-Ion-Track-Etching, (SITE), Spohr 1990),
wird ein einzelnes hochenergetisches, vielfach geladenes, schweres Ion (z.B Au+18) durch
eine dünne Glasmembran geschickt und hinterläßt eine Störung der Struktur im Substrat
(die so genannte Ionenspur, Abb. 2C). Diese
Spur wird naßchemisch deutlich schneller
geätzt als das intakte Grundmaterial. Durch
einseitiges Ätzen können kegelförmige Poren mit einem Enddurchmesser von mehreren µm bis unter 1 µm (Abb. 2C) hergestellt
werden. Die so produzierten Aperturen sind
vollständig rund und glatt und eignen sich
daher gut für die Ausbildung eines elektrisch
dichten Kontakts mit den Zellen. Die Möglichkeit, die Geometrie der Pore durch die
Wahl des Substrats zu verändern, macht das
Verfahren zusätzlich attraktiv.
Elektrophysiologische
Experimente mit planaren
Mikrostrukturen aus Glas
Für die Anwendung im Drug Screening ist
das Ziel, mit der planaren Glas-Apertur die
Aktivität von Ionenkanälen in Zellen zu detektieren. Weiterhin sollen zu testende Substanzen an den Zellen appliziert werden, um
deren pharmakologische Wirkung auf die
Ionenkanäle zu bestimmen. Der Kontakt mit
dem Zellinneren wird im wesentlichen genau so hergestellt, wie es bei der konventionellen Ganzzell-Ableitung geschieht (s.o), nur
daß die Zellen in Suspension aufgebracht
und dann durch Ansaugen auf die Apertur
positioniert werden (Abb. 3A, B). Die ersten
Zellen, an denen wir eine erfolgreiche Ganzzell-Ableitung auf dem Glaschip durchführten, waren N1E115-Neuroblastom-Zellen.
Seitdem haben wir eine Vielzahl anderer Zellinien erfolgreich verwendet, wie etwa Chinese Hamster Ovary (CHO), Human Embryonic Kidney (HEK) und NG108 Neuroblastom/Gliom-Hybridzellen. Solche Zellinien
werden im Drug Screening häufig verwendet, weil sie sich nahezu unbegrenzt vermehren und gentechnisch dazu gebracht werden
können, beliebige Proteine herzustellen. Als
Beispiel ist die Ableitung einer genetisch veränderten CHO-Zelle gezeigt, die einen Kalium-Ionenkanal exprimiert (Abb. 3C, Fertig et
al. 2002). Mit dem Patch-clamp-Chip können
auch Ströme durch einzelne Kanäle gemessen werden (Abb. 3D).
Abb. 4: Parallelisierung und Automatisierung
des „Patch-clamping“. A: Eine gebrauchsfertige
Matrix von Aperturen in einem Glassubstrat.
Diese Aufnahme im Reinraum veranschaulicht
die Möglichkeit der Parallelisierung. B: Schema
des in Entwicklung befindlichen Patch-ClampAutomaten. Der Prototyp wird 4x4-Matrizes verwenden. Die Applikation von Testsubstanzen
erfolgt ebenfalls automatisch mit Hilfe eines
Mehrkanal-Pipettierroboters.
Parallelisierung
und Automatisierung
Planare Aperturen eröffnen die Möglichkeit,
Patch-Clamp-Messungen zu automatisieren
und zu parallelisieren. Ein solches Gerät, das
für das „Hochdurchsatz-Patch-clamping“
geeignet wäre, wird von der pharmazeutischen Industrie dringend erwartet, da sich
mit ihm eine Vielzahl von möglicherweise
auf Ionenkanäle wirkenden Substanzen in
kurzer Zeit auf ihre Wirkung hin testen ließe
(Xu et al. 2001; Sigworth et al. 2002). Man
kann sich andererseits eine ganze Reihe äußerst interessanter Projekte der Grundlagenforschung vorstellen, die in den Bereich der
„Ionenkanal-Proteomics“ oder „Channelomics“ (Jurkat-Rott et al., im Druck) fallen,
und die mit der jetzigen seriellen Arbeitsweise kaum realisiert werden können. Sie könnten sich zum Beispiel mit der Frage beschäftigen, wie sich systemische Veränderungen –
etwa epileptische Anfälle oder Lernvorgänge
– auf die Expression und Funktion von Ionenkanälen in Gehirnzellen auswirken. Darüber
hinaus wird es ein Hochdurchsatz-Gerät –
wie wir es entwickeln – ermöglichen, in einem vertretbaren zeitlichen Rahmen für jede
Mutante oder Variante eines Ionenkanals ein
vollständiges pharmakologisches Profil zu
erstellen. Solche Projekte müssen sich heute
auf wesentlich weniger präzise und weniger
quantitative Messungen stützen, wie etwa
die Abschätzung von Änderungen des Membranpotentials mit Hilfe optischer Methoden
(s. z.B. Adkins et al. 2001). Solche Experimente würden zudem von der Tatsache profitieren, daß die untersuchten Zellen durch ihre
Position auf dem Chip eindeutig identifizier|transkript LABORWELT
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bar sind. So können sie wegen der guten optischen Eigenschaften des
Glas-Chips parallel zur elektrophysiologischen Ableitung mit Fluoreszenztechniken untersucht werden.
Die Nanion Technologies GmbH entwickelt derzeit ein zuverlässig
arbeitendes Hochdurchsatz-Patch-clamp-Gerät. Der erste Prototyp
des Geräts wird 16 Ableit-Positionen besitzen, von denen je vier
gleichzeitig mit automatischem Lösungsaustausch und hochqualitativer elektrischer Ableitung untersucht werden können (Abb. 4). Die
Erfolgsrate der für die Messung notwendigen Sealbildung liegt je
nach Zelltyp etwa bei 40 bis 60%, so daß mit einem solchen Gerät acht
verwertbare und stabile Ableitungen je 16fach-Chip erreicht werden
können. Eine typische Messung, wie etwa die Erstellung einer Konzentrations-Wirkungs-Kurve mit 10 unterschiedlichen Konzentrationen und jeweils 8 Wiederholungen an verschiedenen Zellen, wird
dann in ungefähr 30 Minuten abgeschlossen sein. Wird eine solche
Messung wie heute üblich von Hand durchgeführt, benötigt man
rund eine Woche.
Der von Nanion entwickelte Patch-clamp-Automat vereinfacht und
beschleunigt elektrophysiologische Untersuchungen von Ionenkanälen deutlich. Die Technologie findet daher ihren Einsatz im Drug
Screening-Prozeß der Pharmazeutischen Industrie bei der Entwicklung
von Ionenkanalmodulatoren, aber auch im Forschungslabor von Universitäten und Instituten, die auf dem Gebiet der Ionenkanäle tätig sind.
Danksagung
Die Autoren danken den Professoren J.P. Kotthaus und H.E. Gaub
(beide Sektion Physik und Center for NanoScience, LMU München)
sowie G. ten Bruggencate (Physiologisches Institut, LMU München) für
ihre stete Unterstützung und Dr. C. Trautmann (Gesellschaft für Schwerionenforschung, Darmstadt) für die Einführung in die und die Hilfe bei
der Ionenspur-Strukturierung. Die CHO-zellen wurden freundlicherweise von der 4SC AG, MArtinsried, zur Verfügung gestellt.
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Literatur
Adkins CE, Pillai GV, Kerby J, Bonnert TP, Haldon C, McKernan RM, Gonzalez JE, Oades K, Whiting PJ, Simpson PB. α4β3δ GABA(A) receptors characterized by fluorescence resonance energy
transfer-derived measurements of membrane potential. J. Biol. Chem., 276:38934-38939 (2001).
Fertig, N., Tilke, A., Blick, R.H., Behrends J.C., ten Bruggencate, G. and Kotthaus, J.P.. Stable integration of isolated cell membrane patches in nanomachined aperture. Appl. Phys. Lett.
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Fertig, N., Meyer, Ch., Blick, R.H., Trautmann, Ch. and Behrends, J.C.. Microstructured glass
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Fertig, N, Blick, RH, Behrends, JC. Whole cell patch clamp recording performed on a planar
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Hamill, O.P., A. Marty, E. Neher, B. Sakmann and F.J. Sigworth, Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. 391(2):85-100 (1981).
Jurkat-Rott, K., Rüdel, R., Lehmann-Horn, F.: Channelomics. In: Myology, 3rd edition (Eds. Engel,
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Klemic KG, Klemic JF, Reed MA, Sigworth FJ. Micromolded PDMS planar electrode allows
patch clamp electrical recordings from cells. Biosens Bioelectron. 17, 597-604 (2002).
Ling, G , Gerard, RW. The normal membrane potential of frog sartorius fibres. J. Cell. Comp.
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Sakmann, B., and E. Neher. Single Channel Recording. Plenum Press, New York (1995).
Schmidt C, Mayer M, Vogel H. A Chip-Based Biosensor for the Functional Analysis of Single Ion
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Sigworth, FJ, Klemic KG. Patch clamp on a chip (New & Notable). Biophys. J. 82: 2831-832 (2002).
Spohr, R. Ion tracks and microtechnology. Vieweg, Braunschweig (1990).
Xu, J., Wang, X., Ensign, B., Li, M., Wu, L., Guia, A. and Xu, J. Ion-channel assay technologies:
quo vadis? Drug Discovery Today 6:1278-1287 (2001).
Korrespondenzadresse
Nanion Technologies GmbH
Pettenkoferstraße 12, 80336 München
Tel.: 089-5996 260, Fax: 089-5996 250
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Nr. III/2002 | 19
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Proteomics
Neue Protein-Microarrays
und Zytokin-Detektions-Chips
Dr. Jens Beator, Schleicher & Schuell Bioscience GmbH, Dassel
Anwendungsspektrum
von Protein-Microarrays
Überlegungen zum
geeigneten Substrat
Nach den DNA-Microarrays rücken ProteinMicroarrays immer stärker in den Mittelpunkt des Interesses, etwa um Proteom-Studien durchzuführen. Bereits Ende der achtziger Jahre beschrieb Ekins1, daß „MikrospotAssays“ von herausragender Nachweisempfindlichkeit sind, und ähnliche Ansätze wurden bereits für die Herstellung von Antikörper-Makroarrays beschrieben (z.B. 2). Die im
Zuge der Genomforschung etablierten Geräte-Entwicklungen der letzten Jahre ermöglichten auch die Herstellung von ProteinMicroarrays („Proteinchips“) – mit vielen tausend Proben auf kleinster Fläche. In jüngster
Zeit ist eine ganze Reihe neuer experimenteller Ansätze beschrieben worden, die neue
Perspektiven im Rahmen der Proteom-Forschung aufzeigen. Tabelle 1 zeigt eine Auswahl vielversprechender Anwendungen und
Publikationen, die das Einsatzspektrum von
Protein-Microarrays eindrucksvoll belegen.
Die Anforderungen an eine ideale ProteinMicroarray-Plattform lassen sich gut definieren: kompatibel mit vorhandenen Spotting-Robotern und Auswertungssystemen,
geeignet für gängige Detektionsmethoden
(inklusive Fluoreszenz), hohe und gleichmäßige Bindungskapazität sowie reproduzierbare Oberflächeneigenschaften. Für Proteinnachweise hat sich seit Jahrzehnten Nitrozellulose, mit der spezifische und hochempfindliche Nachweise vom Western Blot
bis hin zum immunchromatographischen
Schwangerschaftstest möglich sind11, als geeignetes Substrat erwiesen. Besonders wichtig ist hier die Erfahrung, daß Antikörper
und Antigene auf Nitrozellulose weit über
ein Jahr hinaus ihre molekulare Erkennungsund Bindungsspezifität behalten. Ohne diese Eigenschaft wäre zum Beispiel die Vielzahl kommerziell erhältlicher Western BlotStreifen mit verschiedensten Antigenen und
Tabelle 1: Anwendungsbeispiele Protein-Microarrays
Beschreibung
Zellysate verschiedener Gewebe3 oder IEF-Proteinfraktionen4 wurden gespottet, Antigene mit Antikörpern und gängigen Detektionssystemen nachgewiesen
Antikörper-Microarrays Antikörper wurden gespottet und inkubiert mit biotinylierten Zellysaten (kolorimetrische Detektion)5, Leukozyten (mikroskopische Auswertung)6 oder GFP/RFP (Fluoreszenz-Detektion)7
Antigen-Microarrays
Bakterielle Oberflächen-Antigene wurden gespottet und spezifische
IgM- oder IgG-Bindung in Human-Seren nachgewiesen (Fluoreszenz-Detektion)8
ProteindomänenFusionsproteine aus GST und verschiedenen Proteindomänen
Microarrays
wurden gespottet, neue Protein-Protein-Interaktionen bzw.
-Bindungsprofile wurden nachgewiesen (Fluoreszenz-Detektion)9
Zytokin-Detektionschip Parallele Detektion von bis zu 16 Zytokinen in einer Probe im
„Protein Microarray ELISA“ (Fluoreszenz-Detektion)10
Microarray-Western
A
B
Abb. 1: Nitrozellulosestruktur. A: Zellulose, B. nach Nitrierung; der Substitutionsgsgrad der Hydroxylgruppen beträgt 1,9 bis 2,4.
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Antikörpern für die Immundiagnostik nicht
denkbar. Nitrozellulose wird durch Nitrierung von Zellulose hergestellt (Abb. 1) und ist
der Grundstoff für die Herstellung von Membranen in reproduzierbarer, gleichmäßiger
Qualität. Der Rohstoffauswahl kommt dabei
eine wesentliche Bedeutung zu. Eine Membran kann als „flacher Schwamm“ aufgefaßt
werden (Abb. 2), der aufgrund seiner mikroporösen Struktur eine enorme Oberflächenvergrößerung aufweist. Daher besitzt eine Nit-
Abb. 2: Mikroporöse Nitrozellulosestruktur,
FAST Slide, rasterelektronenmikroskopische
Aufnahme, 30.000 fach.
rozellulosemembran eine sehr hohe Bindungskapazität bzw. sehr hohe Nachweisempfindlichkeit verglichen mit planaren Oberflächen.
Aufgrund dieser Erfahrungen war es naheliegend, Objektträger (Slides) mit dreidimensionaler Nitrozellulosebeschichtung zu entwickeln (FAST™ Slides), die eine gute Gerätekompatibilität mit idealen Immobilisierungsund Nachweiseigenschaften vereinen.
Vergleich von Plattformen
für Microarrays
Wie sehen die Ergebnisse in der Praxis aus?
Sam Hanash (Präsident der Human Proteomics Organization HUPO) hat die Eignung
von Aldehyd-, Amino- und Nitrozellulosebeschichteten Objektträgern verglichen4. Im
Ergebnis war die Nachweisempfindlichkeit
für Antigene in verschiedenen Proteinfraktionen auf Nitrozellulose-beschichteten Slides
(FAST Slides) am höchsten. Die Arbeitsgruppe um Liotta an den National Institutes of
Health (NIH) in Bethesda, USA, hat in einer
Methodenentwicklung die Kanzerogenese in
verschiedenen Zellgruppen untersucht3. In
einem Microarray-Western wurde die Nachweisempfindlichkeit auf FAST Slides am Beispiel des Markerproteins PSA (Prostata-spezifisches Antigen) näher untersucht: Die Nachweisgrenze lag im Bereich von wenigen Femtogramm, also im zeptomolaren Bereich (10–21
Mol). Die Signale waren linear und quantifizierbar in einem Bereich von 1,25 fg bis 20 fg.
Eine plausible Erklärung für diese hohe
Nachweisempfindlichkeit auf FAST Slides
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Tabelle 2: Nachweisplattformen im Vergleich. n.v.: Daten nicht verfügbar
FAST Slides
AldehydSlides
AminoSlides
NachweisMicro-Western3
empfindlichkeit4, 7
++++
10–21 Mol PSA
fg PSA
++
n.v.
Probenverlust
nach Spotting7
≤5%
TNFα
α10
IL-210
1 pg/ml
10 pg/ml
95 %
n.v.
n.v.
+
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
liefert die Arbeit von Wu7, in der verschiedene Slides für Studien zu Protein-ProteinWechselwirkungen untersucht wurden. Aldehyd- oder Aldehyd-ähnliche Beschichtungen zeigten nach Inkubation, Waschen und
Detektion einen Verlust von 95% der ursprünglich aufgetragenen Proteinmenge,
während die Nitrozellulose-Beschichtung
weniger als 5% Verluste aufwies. Die dreidimensionale Schwammstruktur der FAST
Slides führt zu wesentlich höherer Aufnahme- und Bindungskapazität für Proteine im
Vergleich zu anderen Slides und wird als
Ursache für die höhere Nachweisempfindlichkeit betrachtet. Tabelle 2 enthält eine
Übersicht verschiedener Nachweisplattformen.
Reproduzierbarkeit
Mit der Nitrozellulose-Dünnbeschichtung
von Objektträgern ohne Klebemittel können
physikalisch-chemische Inhomogenitäten
von Glas und störende Einflüsse von Klebern praktisch ausgeschlossen werden. Die
dreidimensionale Nitrozellulose-Beschichtung gewährleistet daher eine reproduzierbare Fertigung – für die Herstellung von
Proteinchips beispielsweise zur Quantifizierung in Expressionsstudien eine wichtige
Voraussetzung. Daneben wurde beobach-
tet, daß die Spot-zu-Spot-Reproduzierbarkeit auf FAST Slides deutlich gleichmäßiger
ist als auf planaren Oberflächen: CV ≤ 5 %
bei geeigneten Spot-Robotern(eigene Untersuchungen, 3)
. Die aufgetragenen Proben werden von
der mikroporösen Struktur gleichmäßig aufgenommen und immobilisiert. Ebenso
gleichmäßig ist die Signalabgabe bei der
anschließenden Detektion, verstärkt durch
die große spezifische Oberfläche.
22 | Nr. III/2002
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Darüber hinaus ist für die Fluoreszenzdetektion von Protein-Microarrays eine
scheinbar widersprüchliche Protokollanpassung von entscheidender Bedeutung: Sowohl für die Blockierung als auch für die
nachfolgenden Waschschritte sollten keine
Blockierungsreagenzien auf Proteinbasis
eingesetzt werden. Die „Eigenfluoreszenz“
auf FAST Slides wird vernachlässigbar,
wenn ohne BSA, Kasein oder Milchpulver
nur mit z. B. TBS-Tween 20 (Tris Buffered
Saline, TWEEN 0,1%, bis zu 2%) blockiert
und gewaschen wird.
Neue Horizonte:
Human-Zytokin-Detektionschip
In einer neuen Methodenentwicklung wurde
ein ELISA für 16 verschiedene Human-Zytokine im Microarrayformat entwickelt10. In
A
Fluoreszenzdetektion
Die Fluoreszenzmarkierung ermöglicht
hochempfindlichen Nachweis, Quantifizierung und Mehrfachmarkierung (siehe auch
LABORWELT I/2002; II/2002, S. 6). Daher
wurde schon früh versucht, Fluoreszenzdetektion auf Membranen vor allem für
den DNA/RNA-Nachweis zu etablieren.
In vielen Fällen wurde dabei eine nicht akzeptable Hintergrundfluoreszenz auf den
Membranen beobachtet. Bei der Entwicklung der FAST Slides wurde diesem Aspekt
besondere Aufmerksamkeit geschenkt.
Durch Optimierung der Rezeptur und Herstellungstechnologie ohne Kleber und Stützgewebe für eine sehr dünne Beschichtung
von nur 15µm (im Vergleich zu 100 bis
120µm bei Membranen) konnte die „Eigenfluoreszenz“ drastisch gesenkt werden.
Tabelle 3: ELISA und Protein-Microarray-ELISA für die Human-Zytokin-Detektion10.
fett: bessere Nachweisgrenze bzw. Linearität
Human-Zytokin
Angiogenin
ICAM-1
IFN-γγ
β
IL-1β
IL-2
IL-4
IL-6
IL-8
IL-10
IL-12p40
IL-12p70
IL-13
IP-10
TGF-1
α
TNF-α
TNF RII
VEGF
H
Nachweisgrenze [pg/ml]
Microarray
ELISA
1
3,2
100
80
100
10
1
10
10
400
100
16
10
10
1
16
100
80
1
80
10
16
100
80
10
100
32
80
1
10
10
80
1
16
linearer Bereich [log-Einheiten]
Microarray
ELISA
3
3
2
2
2
3
3
1
3
1,5
2
1
3
1,5
2
2
2
2
3
1
2
1
2
2
3
1,5
3
2
2
1,5
3
2
3
1
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Abb. 3 A: Zytokin-Mengen in Zellkultur nach
Lipopolysaccharid-Behandlung (LPS). Links:
–LPS, rechts +LPS. Nach LPS-Behandlung
(5 µg/ml, 6 h) wurden Lysate von THP1-Lymphozyten 1:4 mit Medium verdünnt und mit
dem ProVision™ HCA-Human-Zytokin-Array inkubiert. Gebundene Zytokine wurden nachgewiesen mit biotinyliertem Antikörper-Cocktail
und Streptavidin-Cy5. Links: –LPS, Kontrolle,
endogene Zytokin-Expression, rechts: +LPS, erhöhte Zytokin-Expression. Chip-Belegung: siehe
3B, oberste und unterste Reihe sind Detektionskontrollen („landing lights“)
3B: Chip-Belegung des Human-Zytokin-Detektionschips mit monoklonalen Antikörpern
Abbildung 3 ist als Anwendungsbeispiel die
Änderung des Zytokin-Expressionsmusters in
einer Zellkultur nach Lipopolysaccharid-Behandlung (LPS) dargestellt. Um die Leistungsfähigkeit des Protein-Microarray-ELISA näher zu charakterisieren, wurden separat für
jedes Zytokin die Nachweisgrenze und der
lineare Meßbereich mit einem kommerziell
erhältlichen ELISA-System verglichen. Für die
meisten Zytokine war die Nachweisempfindlichkeit im Protein-Microarray deutlich besser
als in der Mikrotiterplatte, und auch der linea|transkript LABORWELT
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re Meßbereich war für fast alle Zytokine größer (Tab. 3). Darüber hinaus
lassen sich im Protein-Microarray mehrere Zytokine parallel in derselben Probe quantifizieren. Die Verwendung eines speziell entwickelten
Array-Puffers führte dabei zu einer konstant hohen Signalverstärkung
verglichen mit anderen üblichen Auftragspuffern über einen Zeitraum
von vielen Monaten. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen haben zur
Entwicklung eines kommerziell erhältlichen Human-Zytokin-Detektionschips geführt (ProVision™ HCA).
Ausblick
Die Publikationen in Tabelle 1 zeigen das enorme Anwendungspotential von Protein-Microarrays. In den USA werden derzeit
Großforschungsprogramme zur Proteom-Forschung auf Basis von
Protein-Microarrays auf FAST Slides geplant (z. B. vom NHLBI,
National Heart, Lung, and Blood Institute, Proteomics Initiative). Weitere Anwendungsgebiete sind denkbar – etwa zur Identifizierung
neuer Protein-Protein-Wechselwirkungen für die pharmazeutische
Wirkstoffsuche oder die Entwicklung von Proteinchips für diagnostische Anwendungen. Die hohe Nachweisempfindlichkeit, reproduzierbare Fertigung und Langzeitstabilität von Protein-Microarrays auf FAST Slides sprechen dafür, daß diese Plattform zum
weltweiten Standard wird. Zur Erhöhung des Probendurchsatzes
werden multiple Arrays auf einem Slide (wie z. B. im HumanZytokin-Detektionschip, s.o.) voraussichtlich eine große Rolle
spielen.
Literatur
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(2002) A. Espejo, M.T. Bedford; Biochemical Journal, immediate e-publication,
doi:10.1042 BJ20020860
[10] Development of a multi-cytokine assay panel in a protein microarray format
on a nitrocellulose surface - comparison to traditional ELISA assays. Tonkinson,
J.L., Osborn, D.S. and Stillman, B.A. Oak Ridge Conference (2002)
[11] Nitrocellulose: A tried and true polymer finds utility as a post-genomic substrate. J.L. Tonkinson and B.A. Stillman (2002), Frontiers in Bioscience 7, 1-12
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Protein-Arrays
Proteinchips – neue Werkzeuge
für Diagnostik und Proteomics
Christian F. Vöhringer, Dieter Stoll, Markus F. Templin, Thomas O. Joos
NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen
Durch die Verfügbarkeit von Protein-Microarrays verändern miniaturisierte Assaysysteme auch die
Proteinforschung. Für die Herstellung und Auswertung der Proteinmicroarrays kann die aus der DNAArray-Technologie bereits bekannte, kommerziell erhältliche Technik eingesetzt werden. Fängermoleküle werden in Reihen und Spalten auf Trägermaterialien immobilisiert. Zur Detektion und Quantifizierung der Zielmoleküle werden Ligandenbindungstests durchgeführt, deren Auswertung heute überwiegend auf fluoreszenzbasierten Methoden beruht. Die Protein-Microarray-Technologie ermöglicht eine
schnelle, kostengünstige und zuverlässige Analyse vieler Parameter bei geringstem Material- und
Probenverbrauch – Eigenschaften, die vor dem Hintergrund individualisierter Therapiestrategien
besondere Bedeutung erlangen. Auch für die Proteomforschung, die in der „post genomic era“ im
Zentrum des Interesses steht, weist die Protein-Microarray-Technologie wegen ihrer HochdurchsatzTauglichkeit enormes Potential auf.
Key Words: Protein-Microarray-Technologie, Ambient Analyte Assay, Immunoassay, Ligandenbindungstest
Mit dem Abschluß verschiedener GenomSequenzierungsprojekte begann die sogenannte „post genomic era“. Der Wissenschaft
stehen jetzt Informationen über die strukturelle Organisation der Genome zahlreicher
Organismen zur Verfügung, über die Anzahl
der darin vorhandenen Gene und deren potentielle Genprodukte. Das nächste Ziel ist
jetzt die Identifizierung definierter Produkte
eines bestimmten Gens und die Zuordnung
einer Funktion für dieses Genprodukt.
Das Proteom als Korrelat des
physiologischen Zustands
Der funktionelle Status einer Zelle, eines Organs oder Organismus korreliert mit der Zusammensetzung der aktuell vorhandenen
Gesamtheit aller Proteine einer Zelle – ihrem
Proteom. Das Proteom unterliegt ständigen
Veränderungen, das heißt, das Genom einer
Zelle codiert viele Proteome. Das Erfassen
der dynamischen Veränderungen, der eine
Zelle auf der Proteinebene unterliegt, ist
möglicherweise ein Weg zum Verständnis
der molekularen Wechselwirkungen, auf der
die zelluläre Regulation beruht. Ziel der Proteomforschung ist es darum, das Vorkommen, die Menge und die posttranslationalen
Modifikationen aller Proteine einer Zelle oder
eines Gewebes zu definierten Zeitpunkten zu
erfassen1.
Für das Verständnis von physiologischen oder
pathophysiologischen Prozessen in Zellen
und Geweben ist die Aufklärung der beteiligten Proteine der erste wichtige Schritt. Etablierte DNA-Chip-Technologien erlauben die
Analyse von Expressionsmustern einer Zel-
T
le. Die Analyse tausender mRNA-Populationen auf einem einzigen DNA-Chip2 liefert
Information über die Transkription bestimmter Gene. Die vorhandene mRNA-Menge
korreliert aber nicht notwendigerweise mit
der Menge der tatsächlich synthetisierten
Proteine und liefert deshalb nur Hinweise
auf die Expression der betreffenden Proteine.
Das Erstellen von Expressionsmustern auf
Proteinebene erfolgt zumeist als vergleichende oder substraktive Analyse. Hierbei werden „behandelte“ und native Zellen verglichen, um Veränderungen im Expressionsniveau bestimmter Proteine zu verfolgen. Klassischerweise werden Proteinfraktionen beider Zellpopulationen parallel mittels 2D-Gelelektrophorese untersucht. Mehrere tausend
Proteine können dabei in einem Einzelexperiment aufgetrennt und anschließend mittels
massenspekroskopischer Analytik (Peptid
mapping) identifiziert werden. Die Effizienz
dieser Methodik erlaubt es allerdings nicht,
alle Proteine einer Zelle in einem Einzelexperiment zu erfassen. Auch lassen sich diese
Techniken nur schwierig in automatisierte
Prozesse einbinden. Im Zuge der Anstrengungen, geeignete Alternativen zu entwickeln, wurde deshalb versucht, die bereits
etablierten Methoden der DNA-Chip-Technologie für Proteine nutzbar zu machen.
Am Beispiel des Gene Expression Profiling
zeigen sich die Vorteile von parallelisierten
Microspot-Arrays gegenüber konventionellen Methoden besonders deutlich. Proteinoder mRNA-Proben, die aus den zu vergleichenden Zellpopulationen stammen, werden
mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert – damit ist die Herkunft jeder Probe
anhand ihrer Fluoreszenzfarbe zu ermitteln.
Für die eigentliche Analyse werden gleiche
Mengen beider markierter Proben gemischt
und auf einem Microarray mit Spots von
spezifischen Antikörpern hybridisiert. Das
Verhältnis der Intensität der beiden Fluoreszenzfarbstoffe zueinander gibt Auskunft über
Abb. 1: Miniaturisierte Assaysysteme – Signaldichte und Gesamtsignal
im Microspot. Der Verlauf von Signaldichte (Signalintensität/Fläche) und
Gesamtsignalhöhe (Signalintensität) wurde für ansteigende Fängermolekülmengen im Microspot ermittelt. Da die Belegungsdichte der Fängermoleküle für alle Microspots identisch bleibt, repräsentieren größere
Microspots steigende Mengen an Fängermolekül. Das Gesamtsignal
(Gesamtsignal-Intensität) wächst ebenfalls mit steigender Fängermolekülmenge an und erreicht ein Maximum, wenn praktisch alle in der
Probe verfügbaren Fängermoleküle im Microspot gebunden sind. Für
Microspots mit kleiner werdender Fläche, in denen weniger Fängermoleküle immobilisiert sind, wächst dagegen der Wert für die Signaldichte
(Signalintensität /Fläche) an und erreicht einen nahezu konstanten Wert
wenn die Fängermolekül-Konzentration den Wert 0,1/ K unterschreitet
(K für Assoziationskonstante). Diese Bedingungen entsprechen den Voraussetzungen für den Ambient Analyte Assay: die Konzentration der freien Zielmoleküle in der Probe wird durch die Komplexbildung mit den im
Microspot immobilisierten Fängermolekülen praktisch nicht verändert.
Die Abbildung wurde aus [4] modifiziert, die Signalintensität bzw. der
abgeleitete Flächenquotient (Signaldichte) sind in der Abbildung
logarithmisch skaliert.
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Abb. 2: Vergleichende Proteomanalyse. Die erfolgreichsten Strategien um
bestimmte Genaktivitätsmuster physiologischen oder pathologischen Zuständen zuordnen zu können (Genom- und Proteomanalyse) verfolgen
substraktive oder vergleichende (komparative) Ansätze. Biomoleküle, die
das Proteom einer Zelle oder eines Gewebes repräsentieren (Proteine,
DNA oder mRNA) werden aus zwei phänotypisch unterschiedlichen
Quellen isoliert und einer kompetitiven Analyse unterzogen. Im allgemeinen werden dazu die Proteomkorrelate aus den beiden Vergleichsproben
mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert – in der Abbildung
rot (behandelte Probe) und grün (native Kontrolle) dargestellt. Auf diese
Weise lassen sich die Proteine aufgrund ihrer Fluoreszenzfarbe einem der
beiden Phänotypen zuordnen. Unterschiede im Expressionsmuster die
charakteristisch für einen Phänotyp sind, lassen sich mit diesen Vergleichsproben relativ einfach ermitteln. Die markierten Proteome beider
Phänotypen werden zu gleichen Anteilen gemischt und auf einem
Microarray analysiert. Im Test konkurrieren identische Zielproteine aus jeder Probe um die spezifischen Fängermoleküle im Microspot. Werden die
Fluoreszenzbilder für beide Fuoreszenzfarbstoffe passend übereinander
gelegt, lassen sie sich auf die resultierende Farbe hin auswerten. Aus der
resultierenden Farbe eines Spots lassen sich Rückschlüsse auf die Menge
des jeweiligen Proteins in den Proben der zwei Phänotypen ziehen. Wird
ein Protein in der Testsituation gegenüber der Kontrollsituation hochreguliert, ist zu erwarten, daß die resultierende Fluoreszenzfarbe des entsprechenden Microspots der behandelten Probe entspricht (in der Abbildung
rot). Wird die Expression eines Proteins in der Testsituation gegenüber
der Kontrollsituation unterdrückt, ist die Fluoreszenzfarbe der Kontrolle
(in der Abbildung grün) zu erwarten. Für unveränderte Expressionsverhältnisse ist entsprechend die resultierende Mischfarbe zu erwarten (in
der Abbildung gelb).
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das Expressionsniveau eines bestimmten Proteins in der behandelten
Probe gegenüber der unbehandelten Kontrolle (Abb. 2).
Erhöhte Sensitivität durch Miniaturisierung –
Ambient Analyte Assay
Protein-Microarray-Experimente wurden von Roger Ekins und Mitarbeitern bereits in den achtziger Jahren beschrieben3. Sie entwickel-
Kennziffer 22 LW 03 oder www.biocom.de Info ordern? |transkript LABORWELT
Nr. III/2002 | 25
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A
B
ten ein Microspot-Assay-System für den immunologischen Nachweis von TSH (thyroid
stimulating hormone) und HbsAg (Hepatitis
B-Oberflächenantigen). Mit diesem Immunoassay konnten beide Analyten noch in femtomolaren Konzentrationen (106 Moleküle pro
ml) quantifiziert werden.
Die von Ekins formulierte „Ambient Analyte
Assay“-Theorie beschreibt, aus welchem
Grund miniaturisierte LigandenbindungsAssays eine signifikant höhere Sensitivität
besitzen können als Immunoassay-Systeme
im herkömmlichen Maßstab.
Von entscheidender Bedeutung für das Funktionsprinzip dieser Ligandenbindungs-Assays ist die Miniaturisierung des Systems.
Die Fängermoleküle werden auf einer extrem kleinen Fläche – dem Microspot – an
eine feste Phase gekoppelt. Obwohl die Gesamtmenge der Fängermoleküle sehr klein
ist, sind diese im Microspot in einer sehr
hohen Dichte angeordnet. Die im Microspot
immobilisierten Fängermoleküle bilden mit
ihren Zielmolekülen Komplexe aus, deren
Anzahl durch die Menge der Fängermoleküle limitiert – also gering – ist. Aus diesem
Grund bleibt die Konzentration der freien
Zielmoleküle in der Probe praktisch unverändert. Dies gilt selbst für Komplexe mit sehr
hohen Affinitätskonstanten oder bei niedriger Konzentrationen der Zielproteine in der
Probe. Unter Bedingungen, bei denen im
Microspot nicht mehr als 0,1/ K Fängermoleküle immobilisiert sind, wobei K die Affinitätskonstante des Komplexbildungsprozesses sein soll, spricht man vom „Ambient Analyte Assay“. Hier korrelieren die Meßwerte
für den Anteil des im Komplex gebundenen
Zielproteins direkt mit der Gesamtkonzentration des Zielproteins in der Probe. Messungen unter solchen Bedingungen sind darüber
hinaus unabhängig vom eingesetzten Probenvolumen, was hochsensitive Assays bei
minimalem Materialverbrauch ermöglicht.
Es gibt zwei Tatsachen, die die erhöhte Sensitivität des Ambient Analyte Assays erklären:
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Abb. 3: Quantitative Proteomanalyse. In Abbildung A ist die Quantifizierung diverser Proteine einer Probe dargestellt. Die verschiedenen Proteine
wurden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und können parallel in einem Microarray-Experiment detektiert werden. Dazu werden die entsprechenden Proteine der Probe über Fängerantikörper spezifisch gebunden,
die in den Microspots immobilisiert sind. Die Intensität des Signals korreliert mit der Menge des gefangenen Proteins. Geeignete Kontrollspots, wie
Positiv- und Negativproben sowie interne Standards, die zur Kalibrierung
mitgeführt werden, erlauben eine sehr verläßliche Quantifizierung der Proteine mittels Microarrays. B. Im Reverse Phase Assay repräsentiert jeder
Microspot das Proteom einer Zelle oder eines Gewebes (Abb. B) – oder
Teile davon. Diese Palette unterschiedlicher Proteine wird anschließend in
multiplexen Assays analysiert, wobei unterschiedlich markierte, spezifische Antikörper parallel eingesetzt werden können. Auf diese Weise lassen sich theoretisch mit N Antikörpern (markiert mit N unterschiedlichen
Fluoreszenzfarbstoffen) N unterschiedliche Proteine in einem einzigen Spot
analysieren. Limitierend sind neben der begrenzten Anzahl geeigneter
Fluoreszenzfarbstoffe, die Anzahl der Anregungswellenlängen in den
Arrayscannern und die Kompatibilität der entsprechenden Antikörper
untereinander.
die Komplexbildungsreaktion findet bei
maximaler Konzentration des Zielmoleküls
statt, die Fänger-Zielmolekülkomplexe bilden sich auf einer extrem kleinen Fläche –
dem Microspot –, was zu einer hohen lokalen
Signalintensität führt (Abb. 1). Folgende Überlegung verdeutlicht diesen Zusammenhang:
Auf einer Oberfläche werden Microspots zunehmender Fläche aus einer Fängermoleküllösung konstanter Konzentration erzeugt. Mit
zunehmender Spotfläche nimmt also die Gesamtmenge an immobilisierten Fängermolekülen zu, was zu einem ansteigenden Gesamtsignal für den jeweiligen Spot im Assay
führt. Da das entsprechende Zielprotein nicht
in unbegrenzter Menge in der Probe vorhanden ist, nimmt jedoch die Signaldichte mit
wachsender Spotfläche ab. Die Bildung der
Komplexe aus Fänger und Zielprotein führt
zu einer Abnahme der Konzentration freier
Zielproteine in der Probe, und gleichzeitig
sind die gebildeten Komplexe auf einer größeren Fläche verteilt. Dies resultiert in einem
geringeren Maximalsignal pro Fläche für einen Spot mit großer Fläche. Für kleine Spots
wird zwar das Gesamtsignal kleiner, die Signaldichte aber steigt an (Abb. 1). Von einer
bestimmten Spotfläche an erreicht der Wert
der Signaldichte ein Optimum und wächst
nicht weiter an (unter Ambient Analyte Assay-Bedingungen ist die Zielproteinmenge
kein limitierender Faktor)4.
Molekulare Diagnostik und
Proteomforschung
Für die Herstellung planarer Protein-Microarray-Systeme werden vor allem aktivierte Glasoberflächen oder Membranmaterialien (Nitrocellulose, Polyvinyl u.a.) mit niedriger Eigenfluoreszenz eingesetzt. Für die Generierung und Auswertung der Mikrospots werden die kommerziell erhältlichen Spottingsysteme und Laserscanner verwendet, die
aus der DNA-Array-Technologie bekannt
sind: Nadel-basierte Kontaktdrucksysteme
oder Mikrodispensiersysteme (Ink-Jet- oder
Elektrospray-Technologie; www.biochipnet.
de). Mit diesen Systemen werden automatisiert Nanoliter der Fängermoleküllösungen
in Reihen und Spalten auf dem Trägermaterial abgesetzt und dort fixiert. Die Detektionssysteme beruhen überwiegend auf der Messung von fluoreszenzmarkierten Molekülen
(markierte Liganden oder markierte Detektionsantikörper). Alternativ kommen in den
letzten Jahren verstärkt kapillare „microfluidic“ Arrays (Lab on a chip) oder „Bead“basierte Systeme zur Quantifizierung von
Proteinen aus komplexen biologischen Proben zum Einsatz. Hier werden die spezifischen Fängermoleküle auf farblich kodierte
Mikrosphären aus Polystyrol gebunden und
über eine modifizierte FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting) ausgewertet5. Neben Nachweisverfahren, die eine Markierung (Fluoreszenz, Chemilumineszenz,
Radioaktivität, Bioitin) der nachzuweisenden
Proteine erfordern, werden auch markierungsfreie Detektionsverfahren (Surface Plasmon Resonance SPR, Massenspektroskopie
u.a.) entwickelt.
Basierend auf den Arbeiten von Ekins wurden im Bereich der medizinischen Diagnostik in den letzten Jahren einige Arbeiten zur
qualitativen und quantitativen Analyse einer
Vielzahl unterschiedlicher Proteine mit Hilfe
von multiplexen Protein-Microarrays publiziert6-8. Bisher existiert allerdings noch kein
Microarray-basierter Nachweis auf dem Diagnostikmarkt. Die Vorteile und die Zugänglichkeit dieser miniaturisierten Technologie
für Automatisierungsprozesse machen die
Protein-Microarray-Assays besonders geeignet für High Throughput-Anwendungen, wie
sie beispielsweise im Wirkstoffscreening der
pharmazeutischen Industrie oder für die
molekulare Diagnostik9 existieren. Diskutiert
wird ebenfalls, komplexe Fragestellungen in
der Proteomforschung mit „array based proteomics“-Ansätzen anzugehen. Hierbei sollen tausende spezifischer Fängermoleküle auf
kleinstem Raum auf Trägermaterialien immobilisiert werden, um definierte Proteine
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(Partial-Proteom) aus dem komplexen Proteingemisch des GesamtProteoms schneller und kostengünstiger als bisher zu quantifizieren10,11.
Kostengünstige, hochspezifische Fängermoleküle sind für die „array
based proteomics“ unbedingte Voraussetzung und werden dazu in
großer Anzahl benötigt. Sie können zum einen durch klassische
Immunisierungstrategien (polyklonale und monoklonale Antikörper), zum anderen über molekularbiologische Methoden wie die
Phage-Display-Technologie erhalten werden. Zu den rekombinant
erzeugten Fängermolekülen zählen auch Antigen-bindende Fragmente wie Fab oder scFv. Das sind Antikörperderivate die in vitro
einer Affinitätsselektion unterworfen und damit für spezifische Anforderungen optimiert werden können („in-vitro-Evolution“). Denkbar sind auch ganz andere Fängermoleküle, wie DNA- und PeptidAptamere oder Affibodies, die durch die Modifikation von Bindeproteinen bakterieller Herkunft erzeugt werden (Übersicht in [12]).
An diese Fängermoleküle können etwa Proteine des Gesamt-Proteoms binden, die zuvor an geeigneten funktionellen Gruppen (Amino-, Carbonsäuregruppen, Tyrosin) spezifisch markiert wurden. Nachdem Proteine ausgewaschen wurden, die unspezifisch an die Microarray-Oberfläche adsorbiert sind, werden die spezifischen Komplexe
ortsaufgelöst mit geeigneten Detektionssystemen nachgewiesen13.
Im „Reverse phase protein microarray“14 werden ganze Proteinfraktionen, die aus Zell- oder Gewebemikrosektionen gewonnen werden,
auf Trägermaterialien fixiert. Jeder Microspot repräsentiert hier das
Proteom einer, mit einem Krankheitsverlauf korrelierbaren, histologisch veränderten Gewebeprobe oder von angrenzendem, nicht verändertem Gewebe. Diese Proteome werden auf molekulare Korrelate
der vorliegenden Erkrankung untersucht, die von prognostischem
Wert für eine individualisierte Therapiestrategie sein können.
Prinzipiell lassen sich für Protein-Microarray-Systeme alle molekularen Wechselwirkungen einsetzen, bei denen sich zwei Partnermoleküle spezifisch erkennen. Dazu zählen neben den erwähnten Antigen/Antikörper-Reaktionen die Nukleinsäure/Protein-, Peptid/Protein-, Protein/Protein-, Rezeptor/Ligand- und Enzym/Substratmolekül-Wechselwirkung (Abb. 4, S. 29). Oligonukleotid-Arrays können
bei der Charakterisierung und Identifizierung von DNA-bindenden
Proteinen wie Transkriptionsfaktoren eingesetzt werden. Enzym/
Substrat-Arrays wurden bereits für die Untersuchung so unterschiedlicher Enzymklassen wie Restriktionsendonukleasen, Peroxidasen,
Phosphatasen und Proteinkinasen eingesetzt. Mit rekombinant exprimierten Enzymen wurden bereits neue spezifische Substrate einzelner Kinasen identifiziert. Zur Identifikation neuartiger Liganden für
Rezeptormoleküle wurden niedermolekulare organische Verbindungen mittels kombinatorischer Chemie erzeugt und ihre Affinität zu
möglichen Zielproteinen ermittelt. Die Verfügbarkeit synthetischer
Peptide und rekombinanter Proteine erschließt die Möglichkeit, das
breite Feld der Protein/Protein-Interaktionen mittels Microarrays zu
untersuchen. Die enormen Möglichkeiten, die diese Technologie für
die Proteomforschung bietet, demonstriert die Arbeit von Zhu et al.15.
Exemplarisch wurde dazu die Interaktion von Calmodulin mit 5.800
unterschiedlichen, rekombinant erzeugten Proteinen (ca. 90% des
gesamten Hefegenoms) auf einem einzigen Chip analysiert. Neben
der Bestätigung bekannter Interaktionen wurden dabei auch neuartige Bindungspartner für Calmodulin identifiziert.
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Möglichkeiten und Grenzen
der Protein-Microarray-Technologie
Die Protein-Microarray-Technologie weist enormes Potential für die
Immundiagnostik in der medizinischen Forschung auf. Sie kombiniert die hochparallelisierte, schnelle und kostengünstige Analyse
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Nr. III/2002 | 27
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Abb. 4: Fängermolekülklassen für den Einsatz in Protein-Microarrays. Diverse Klassen von Biomolekülen können in Microspots als Fängermoleküle immobilisiert werden. Die Interaktionen mit ihren
spezifischen Bindepartnern können qualitativ und quantitativ erfaßt werden. Unter A ist eine Antigen/Antikörper-Wechselwirkung skizziert, B illustriert einen typischen Sandwich-Immuntest. In Abbildung C ist die Wechselwirkung eines Enzyms mit seinem spezifischen Substrat angedeutet. Dabei ist das Substrat (S) der Kinase im Microspot immobilisiert und wird spezifisch von der Kinase
phosphoryliert (P). Die Interaktion von Bindemolekülen eines ganz anderen Typs ist unter D dargestellt. Diese synthetisch erzeugten Fängermoleküle werden Aptamere genannt und können aus
Nukleotiden, Ribonukleotiden oder Aminosäureresten (Peptide) aufgebaut sein. In E ist die spezifische Interaktion zwischen Proteinen untereinander dargestellt. Abbildung F zeigt die Rezeptor/
Ligand-Wechselwirkung. Ein typisches Beispiel einer solchen Interaktion ist die Erkennung eines
Rezeptormoleküls durch niedermolekulare Syntheseprodukte (kombinatorische Chemie), die als
Fängermoleküle immobilisiert wurden.
aller wichtigen diagnostischen Parameter mit
minimalem Material- und Probenverbrauch.
Vor dem Hintergrund individualisierter Therapiestrategien und minimal-invasiver Eingriffe kommt dieser Eigenschaft besondere
Bedeutung zu. Proteinmicroarrays ermöglichen eine engmaschige Kontrolle des Therapieerfolges mit minimalen Mengen an Biopsiematerial. Proteinexpressionsprofile biologischer Proben erlauben die Analyse und Identifikation neuer Markerproteine für die medizinische Diagnostik, aber auch grundlagenorientierte Erkenntnisse für die Proteomforschung. Trotz der vielversprechenden neuen
Ideen und Technologien im Bereich der Proteinarray-Entwicklung und -Anwendung darf
nicht übersehen werden, daß alle Protein-Chipbasierten Ansätze zur Proteom-Analyse nur
eine Momentaufnahme der Proteinexpression oder Proteinmodifikationen einer Zelle,
eines Gewebes oder eines Organismus in einem definierten Funktionszustand liefern. Dynamische zelluläre Prozesse müssen daher
zusätzlich über direkte „Functional Genomics“Ansätze – also in vivo-Funktionsanalysen von
Genprodukten im direkten zellulären Kontext
– analysiert werden. Erst die Kombination der
Erkenntnisse aus der Proteom-Analyse und
„Functional Genomics“ wird ein echtes Verständnis des dynamischen Verhaltens von
Zellen und Organismen ermöglichen.
Literatur
[1] Lopez, M.F., Electrophoresis 21 (2000), 1082-1093.
[2] Debouck, C., Goodfellow, P.N., Nat Genet 21 (1999), 48ff.
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|transkript LABORWELT
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[15] Zhu, H., Bilgin, M., Bangham, R., Hall, D., Casamayor,
A., Bertone, P., Lan, N., Jansen, R., Bidlingmaier, S., Houfek, T., Mitchell, T., Miller, P., Dean, R. A., Gerstein, M., Snyder, M., Science 293 (2001) 2101-2105.
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Korrespondenzadresse
Dr. Thomas Joos
NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches
Institut an der Universität Tübingen
Markwiesenstr. 55
72770 Reutlingen
Tel.: 07121-51530-844, Fax: 07121-51530-16
eMail: [email protected], www.nmi.de
Kennziffer 24 LW 03 Info ordern? Nr. III/2002 | 29
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Proteomics
Neueste Entwicklungen des
ProteinChip®-Systems
PD Dr. Andreas Wiesner, Dr. Ralf Bogumil, Ciphergen Biosystems, Deutschland
Das von Ciphergen Biosystems Inc. entwickelte ProteinChip®-System basiert auf der sogenannten surface
enhanced laser desorption/ionization (SELDI)-Technologie1-3. Die hier erstmals verwirklichte on chipKombination von Chromatographie und Massenspektrometrie ermöglicht die direkte Analyse nahezu jeder
proteinhaltigen Lösung und kommt dabei mit Probenmengen im µl-Bereich aus. Komplexe biologische
Flüssigkeiten und stark mit Detergenz und Salz versetzte Präparationen können ohne Vorbehandlung
untersucht werden. Die darin enthaltenen Proteine lassen sich quantifizieren.
Die bisherigen Anwendungsgebiete vergleichendes Protein Profiling und Biomarker Discovery, schnelle
und probensparende on chip-Entwicklung von Reinigungsprotokollen, verlustfreies Peptid-mapping zur
Proteinidentifizierung, Monitoring von Kinaseaktivitäten und anderen enzymatischen Reaktionen sowie
Antikörper-Antigen-Bindungsstudien und Rezeptor-Liganden-Interaktionen wurden unlängst um zwei
wichtige Erweiterungen der Basisversion des ProteinChip-Systems ergänzt: die Biomarker PatternsTM
Software, die die Aufklärung und Analyse komplizierter Proteinmuster zur Entwicklung von Vorhersagemodellen erlaubt, und das ProteinChip-Interface, das die Kopplung der ProteinChip-Arrays an TandemMS-Geräte ermöglicht.
Biomarker PatternsTM Software
Die Basisversion des ProteinChip-Systems ermöglicht mit dem Biomarker Wizard ein schnelles Erkennen potentieller Biomarker: Die Signale gleicher Molekulargewichte werden dabei
zu Clustern zusammengefaßt und die Intensitäten der korrespondierenden Cluster zwischen den Proben verglichen – signifikante
Unterschiede weisen auf potentielle Markerproteine hin, die mit höheren Probenzahlen
überprüft werden können. Dabei wird vor-
ausgesetzt, daß sich einzelne Marker in ihrer
Gruppe immer ähnlich verhalten.
Oft zeigen Proben jedoch Proteinmuster, bei
denen es nicht leicht fällt, verläßliche einzelne
Marker für ein bestimmtes Krankheitsbild oder
einen definierten physiologischen Zustand zu
finden. Hier setzt die neue Biomarker Patterns-Software ein. Mit ihr können komplizierte Verteilungen der Signalintensitäten analysiert und diese Muster dann gruppenspezifisch in Form eines Entscheidungsbaumes (de-
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cision tree) zugeordnet werden4. Dieses praxisbewährte Verfahren5,6 hat sich als besonders geeignet erwiesen, um die vom ProteinChip-System generierten Daten auszuwerten7.
Die vom Biomarker Wizard ermittelten Signalintensitäten aller Cluster werden dazu in
das Biomarker Patterns-Programm importiert,
gehen dort als Variable in die Analyse ein und
werden zunächst in einer Lernphase zur Erstellung eines Baumdiagramms (tree building)
eingesetzt (Abb. 1). Beginnend mit einem Basis-Knotenpunkt (root node), in dem alle Variablen enthalten sind, sucht das Programm
nach einem Weg, die Aufspaltung in zwei
möglichst „gruppenreine“ Tochter-Knotenpunkte (child nodes) zu erreichen. Dazu werden alle Variablen (also Signalintensitäten)
auf ihre Befähigung als splitter überprüft, die
am besten geeigneten ausgewählt und Regeln (=Schwellenwerte der Intensitäten) für
die Aufteilung in die beiden Tochtergruppen
erstellt. Der Prozeß wiederholt sich für jeden
Tochter-Knotenpunkt, der damit gleichzeitig
zu einem neuen Basisknotenpunkt wird. Das
Ergebnis ist eine baumartige Verzweigung,
die erst dann gestoppt wird, wenn nur noch
eine Probe in einem Knotenpunkt enthalten ist
oder keine Unterschiede mehr zwischen den
Proben eines Knotens ermittelt werden. Die
Anzahl der Tochterknoten wird dann
schrittweise durch eine interne Überprüfung
des Modells mit „reservierten“ Variablen (cross
validation) wieder reduziert, so daß letztendlich
ein praxistaugliches Baumdiagramm (optimal
tree) entsteht. Es liefert Informationen über die
Wichtigkeit der einzelnen Marker und gibt
Auskunft über den zu erwartenden Vorhersagewert (prediction success). Dieses Modell kann
dann zur Klassifizierung unbekannter Proben, also für prognostische und diagnostische
Zwecke, eingesetzt werden.
ProteinChip®-Interface
Das Interface kombiniert Ciphergens SELDIbasierte ProteinChip-Technologie mit den erweiterten Möglichkeiten der QqTOF TandemMassenspektrometrie, also der Peptidsequenzierung und hochgenauen Massenanalyse. Die
ProteinChip-Arrays werden über eine austauschbare UV-Laserdesorptions-Ionenquelle – das Interface PCI 1000 – direkt mit Tandem-Massenspektrometern von Applied Biosystems (Sciex-Serie) oder Micromass verbunden. Anschließend können die auf den ProteinChip-Arrays befindlichen Peptide ohne
Wechsel der experimentellen Plattform näher
untersucht werden.
Abb. 1: Ergebnis einer Biomarker PatternsTM – Analyse (vereinfachtes Schema). Das Programm errechnet, welche Signale und Intensitäten die sauberste Gruppenaufteilung ermöglichen und nimmt
danach die Zuordnug vor. Der prediction success ist der entscheidende Wert für die Praxistauglichkeit des Modells, das anschließend mit unabhängigen Datensätzen auf seine Vorhersagekraft getestet wird.
30 | Nr. III/2002
Neben der Sequenzierung der auf den chromatographischen Arrays gebundenen Proteine können zum Beispiel auch auf voraktivierten ProteinChip-Arrays Antikörper oder Rezeptoren kovalent gebunden werden und die
entsprechenden Bindungspartner aus komplexen biologischen Proben spezifisch angereichert werden. Durch partielle on-chip-Pro|transkript LABORWELT
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teolyse gekoppelt mit MS/MS-Analysen, ist
eine Identifizierung dieser Protein-Wechselwirkungspartner oder auch ein Epitop-Mapping möglich. Auf diese Weise wurden kürzlich Rezeptor-Erkennungssegmente8 und Collagen-Bindungsproteine9 identifiziert. Der Einsatz der biologisch modifizierten Oberflächen
in Kombination mit Qq-TOF-MS wird in Zukunft eine schnelle Analyse und Identifizierung von physiologisch wichtigen ProteinWechselwirkungspartnern ermöglichen. Eine
weitere Anwendung ist die Anreicherung
phosphorylierter Peptide durch IMAC-Gallium-Arrays, wobei mittels des Interfaces eine
Sequenzierung und damit eine Bestimmung
der Phosphorylierungsstelle möglich ist. Zusätzlich zu diesen speziellen Anwendungen
kann das Interface auch für StandardMALDI-Anwendungen eingesetzt werden.
Das PCI 1000 Interface erlaubt ein sehr schnelles Einbringen der Probe, Justierungen der
Arrayposition sind nicht erforderlich. Eine
besondere Eigenschaft des SELDI-Interface ist
sein effizientes Ion-cooling-Design. Dies ermöglicht alle gängigen UV-MALDI Matrices,
einschließlich α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (CHCA), optimal zu nutzen. Die Sensitivität
liegt bei Peptiden im unteren Femtomol-Bereich sowohl im MS- als auch im MS-MS Mode.
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Abb. 2: Das ProteinChip®-Interface PCI-1000.
Das Interface-Paket besteht aus dem SELDI-Interface, einem elektronischen Controller, einem
leistungsstarken, hochfrequenten Stickstoff-Laser, einer fortschrittlichen Fiberoptik-Technik
und einer einfach zu bedienenden Software.
Literatur
[1] Weinberger, S.R, Dalmasso, E.A., Fung, E.T., Curr.
Opin. Chem. Biol. 6 (2001), 86-91.
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hammer, PF, Yasui, Y., Ziding, F., Wright, G. (2002)
Cancer Research 62, 3609-3614.
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[9] Reid, G., Gan, B.S., She, Y.M., Ens, W., Weinberger, S., Howard, J.C., Appl. Environ. Microbiol., Feb.
(2002), 68, 977-980.
Korrespondenzadresse
PD Dr. Andreas Wiesner
([email protected])
Dr. Ralf Bogumil ([email protected])
Field Research Scientists
Ciphergen Biosystems GmbH
Hannah-Vogt-Str. 1
37085 Göttingen
Tel.: 0551-30663-0
Fax: 0551-30663-20
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|transkript LABORWELT
Nr. III/2002 | 31
32 | Nr. III/2002
Two lasers 635m and 532 nm
Die Detektion erfolgt durch eine CCD-Kamera, die die Two photomultiplier tubes, 16 bit digitization,
auf der aktiven Fläche des Biochips erzeugte
emission filters optimized for Cy3 and Cy5
Chemilumineszenz erfaßt
376 x 290 Pixel; 1000 dpi
175W Xenon-Lampe
Multicolor-Fluoreszenz-Imaging-System
1,3 Mio. Pixel hochauflösende CCD-Kamera
5. Anregung
6. Detektion/Kompomenten
ca. 33.000 g
13. Preis (ab...Euro) für Basisversion
on request
adjustable focus, laser power attenuation, small
footprint. 3 Licenses of GenePixTM Pro Software
included
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automatic filter wheel for additional emission filters,
small footprint. 2 Licenses of GenePixTM Pro
Software included.
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Proteinchips basieren auf standardisierten
Glassobjekträgern der Größe : 76 mm x 26 mm mit
amino- oder epoxysilanisierten Oberflächen
C
12. Besonderheiten
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Standard scope of delivery 4-6 weeks
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Standard scope of delivery 4-6 weeks
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GenoSensorSystem: 71.650 g
Array 300: 2.144 g
GenoSensor-System: GenoSensor-Reader +
Macintosh G4-Computer (128 MB) +
hochauflösende CCD-Kamera + Array300-Chip
11. Standardlieferumfang
E
Multianalysegerät + Software; Laptop auf Anfrage
1 cm2
120µm Durchmesser pro Spot, Arraybereich ca.
40mm2
10. Scan area
4 orders of magnitude (10 000:1)
5-100 microns, user defined
B
GenePixPro Microarray Analysis Software: One-touch calibration and signal matching for all GenePix
scanners, Full support for 16-bit grayscale TIFF images, Four-channel image analysis, Third-party image
alignment, Automated barcode reading, Linear and area measurement tools, Automated block and feature
alignment , Multiple methods of background subtraction and ratio calculation, Displays background pixels
on the image, Manual and automatic feature flagging for quality control and normalization with user-defined
criteria, Full integration with web-based genomics databases, Automatically generates Scatter Plot of any
analysis measurements, including regression and standard deviation lines, Lab Book records all hardware
and software operations, Integrated Array List Generator easily maps feature information (e.g., gene name)
onto array image and into Results file, Array List (GAL) files allow user-defined columns, Scripting of all
acquisition and analysis functions, Links directly to Acuity microarray informatics software
Acuity Microarray Database and advanced Analysis Software: Hierarchical clustering with many different
similarity metrics • Self-organizing maps (SOMs) with many different similarity metrics • Order
dendrograms with SOMs • K-Means and K-Medians with many different similarity metrics • Principal
components analysis; Gene Shaving; Find similar gene • Imports and displays full annotation data •
Normalization wizard • Scripting engine for customizable analysis through VBScript, JavaScript or ActiveX
objects • Dendrograms; 2-D• Interactive plots; Animated interactive 3-D plots; Line graphs • Scatter plots;
Color tables; Export as PDF; Export as AVI • Supports Microsoft SQL Server 2000; ODBC-compliant • Full
client/server model for effortless local, LAN or remote TCP/IP access, Includes Microsoft SQL Server
Desktop Edition
Windows 2000-Applikation zur Automation der
ELISA-Protokolle nach individuellen Vorgaben
9. Datenauswertung/Software
5-100 microns, user defined
Ü
Bei einer Meßzeit von 1 min können durch die CCD- 4 orders of magnitude (10 000:1)
Kamera Leuchtdichten im Bereich von 20 fW/cm2 bis
0,2nW/cm2 erfaßt werden. Die Abb. löst dabei
Strukturen auf der Probe mit einer Größe von ca. 20
µm auf.
T
8. Nachweisgrenze/Signal-noise ratio
Two lasers 635m and 532 nm
K
One photomultiplier tube, 16 bit digitization, 8
position filter wheel with emission filters optimized
for Cy3 and Cy5
R
Keine Anregung erforderlich
Laserscanner for microarrays on standard
microscope slides. Sequential scanning with 2 lasers.
Detection by 1 photmultiplier and optimized
digitization results in optimal signal to noise ratio and
sensitivity: 0.1 fluor/micron2 (Cy3/Cy5). Automatic 8
position filter wheel for additional emission filters.
Dynamic control and compensation of laser power
ensures reproducibility and signal uniformity. Data
transfer between Scanner and Computer via SCSI
Interface. Sophisticated analysis software for reliable
interpretation of scan data.
A
7. Pixel/Auflösung
Laserscanner for microarrays on standard
microscope slides. Simultaneous scanning with 2
lasers reduces scan time and eliminates image
alignment. Detection by 2 photmultipliers and
optimized digitization results in optimal signal to
noise ratio and sensitivity: 0.1 fluor/micron2
(Cy3/Cy5). Dynamic control and compensation of
laserpower ensures reproducibility and signal
uniformity. Data transfer between Scanner and
Computer via SCSI Interface. Sophisticated analysis
software for reliable interpretation of scan data
Array300-Chip: genomischer Microarray, basierend Sämtliche bekannten ELISA-Techniken
auf der auf CGH-Technologie, 287 versch. Genloci
in Triplikaten: 41 Subtelomere,
Mikrodeletionsbereiche, Tumorsuppressorgen- und
Onkogenbereiche
GenePixTM Personal 4100A (Axon Instruments)
Laserscanner with integrated microarray analysis
software
GenePixTM 4000B (Axon Instruments)
4. Arbeitsprinzip
Immun-o-mat
Automatisierte Plattform zur Anwendung von Immu- Laserscanner with integrated microarray analysis
noassays, das Gerät integriert sowohl die praktische software
Durchführung des Assays, als auch die anschließende softwaregestütze Auswertung, der Protein-Chip
kann mit max. 1600 Spots belegt werden
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GenoSensor-System: GenoSensor-Reader +
Macintosh G4-Computer (128 MB) +
hochauflösende CCD-Kamera + Array300-Chip
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Fax: 05152-2070
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Biozym Diagnostik GmbH
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Ansprechperson: Dr. Jörg Reichwein
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1. Firmenanschrift/Ansprechpartner
M
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kompatible mit dem BioRobotics Micro-Arrayer
Sehr kurze Meßzeiten im Bereich von Sekunden,
mliche Mikroreaktionsgefäße mit DNA-Microarrays
„MicroGrid“ (einfache Übergabe der Informationen „MicroGrid“ (einfache Übergabe der Informationen
abhängig von der Labelintensität und dem Arraykombiniert, das Array stellt praktisch den Boden des der Spotbezeichnungen und der Position der Spots der Spotbezeichnungen und der Position der Spots
Größe. Optional : dynamische Messungen (z.B.
Reaktionsgefäßes dar. Dadurch ist eine einfache
aus dem Print-Prozeß in die arrayWoRx
aus dem Print-Prozess in die arrayWoRx
Schmelzkurvenanalysen). Bar/Dotcode Reader.
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Analysesoftware)• kompatible mit komplexen Data- Analysesoftware) • kompatible mit komplexen Datadem "Tube", mit gängigem Laborequipment möglich. • Mining Sofware-Paketen wie z.B. Spotfire(R)
Mining Sofware-Paketen wie z.B. Spotfire(R)
Für den Hybridisierungsnachweis wird ein robustes,
nicht-fluoreszentes Markierungsverfahren eingesetzt,
das auf einer katalytisch induzierten Silber-Präzipitation basiert. Die Detektion des Hybridisierungsmusters kann dadurch mit einfachen, extrem
kostengüntigen Transmissionsmessungen erfolgen
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74.900 g
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R
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-bearbeitung und -auswertung. Dadurch sind
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Guido Lützenkirchen
Guido Lützenkirchen
eMail: [email protected]
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arrayWoRx“auto“ Biochip Reader
arrayWoRx“e“ Biochip Reader
automatisiert, bis zu 25 Biochips werden autoAnregung durch eine Weißlichtquelle • Standardmatisch gescannt, optional mit individuellen Meß- filtersatz erlaubt Detektion von 89 marktgängigen
parametern (z.B. Auflösung, Belichtungszeit etc.) • Fluorochromen • 4 Wellenlängen parallel detektierbar
Anregung durch eine Weißlichtquelle • Standard- • auf Wunsch können kundenspezifische Filter
filtersatz erlaubt Detektion von 89 marktgängigen eingebaut werden • Detektion durch High End CCDFluorochromen • 4 Wellenlängen parallel detektier- Kamera (gekühlt) • Detektion von Silberpräzipitaten
bar • auf Wunsch können kundenspezifische Filter möglich • integrierter Barcode Reader • alle
eingebaut werden • Detektion durch High Endgängigen Biochip Formate werden unterstützt
CCD-Kamera (gekühlt) • Detektion von Silberpräzi- (metrische- oder amerikanische Standardslides,
pitaten möglich • integrierter Barcode Reader • alle Schleicher & Schuell, Exiqon Euray etc) • unterstützt
gängigen Biochip-Formate werden unterstützt
alle gängigen Biochip Anwendungen wie Genexpres(metrische- oder amerikanische Standardslides,
sion und Genotypisierung als auch Protein- und
Schleicher & Schuell, Exiqon Euray etc) • unterGewebearrays • die Auflösung ist in einem Bereich
stützt alle gängigen Biochip-Anwendungen wie
von 3,25 bis 26 µm/Pixel frei wählbar • auch
Genexpression und Genotypisierung sowie Protein- automatisiert verfügbar (siehe arrayWoRx“auto“)
und Gewebearrays • die Auflösung ist in einem
Bereich von 3,25 bis 26 µm/Pixel frei wählbar
Der ATR 01 Reader mißt Hybridisierungsmuster eines Ein beliebiges Fluorchrom wird mittels spezifischen Excitationsfilter optimal angeregt. Die emittierte
AT-Arrays online im Transmissions-Modus. Die hybri- Fluoreszenzenergie wird nach dem passieren eines Emissionsfilters auf eine CCD-Kamera geleitet. Im
disierten Targetmoleküle werden dazu mit GoldparGegensatz zu verstärkenden Detektoren (PMT) integriert die gekühlte CCD-Kamera die Fluoreszenzsignale,
tikeln markiert, die nach Zugabe einer Silber-Verstär- was zu einem sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis führt
kerlösung die Enstehung eines Silberniederschlags
katalysieren. Das entstehende Silber-Präzipitat, das
das spezifische Hybridisierungmuster abbildet, wird
dynamisch oder in einer Endpunktmessung detektiert.
keine
Weißlichtquelle (Metall Halid, 250 Watt)
Weißlichtquelle (Metall Halid, 250 Watt)
optisch, Transmissionsmessungen (keine
CCD-Kamera (gekühlt)
CCD-Kamera (gekühlt)
Fluoreszenz!), Lichtquelle LED, Detektor CCD-Kamera
Pixelanzahl: 752 x 582 oder Pixelfly
3,25 bis 26 µm/Pixel frei wählbar
3,25 bis 26 µm/Pixel frei wählbar
Detektion von DNA im pM-Bereich, dynamischer
kleiner 0,1 Moleküle / µm2
kleiner 0,1 Moleküle / µm2
Bereich 1pM - 100nM (105
SNR: 774:1
SNR: 774:1
Der AT Reader ATR 01 wird zusammen mit Frame
Generierung von 16 bit Tiff-Bildern, einzeln oder überlagert (z.B. Genexpression) • Spotfinding • Analyse
Grabber-Karte und kompletter Steuer- und
der Signalintensitäten der einzelnen Farbkanäle • Analyse der Ratios (Genexpression) mit vier
Bildauswertesoftware IconoClust-AT geliefert
Background-Subtraktionsmethoden • verschiedene implementierte Normalisierung-Methoden •
Archivierungsmodul • Ergebnisstabellen kompatibel mit komplexen Analyse- und Clustering-Programmen
wie z.B. Spotfire(R) • Unterstützung der Intranetanbindung (ftp-Server, Web-Server, Windows-FileSharing)
2,5 mm x 2.5 mm (Abbildung)
CLONDIAG chip technologies GmbH
Löbstedterstr. 103-105, 07749 Jena
Tel.: 03641-59 47 0, Fax: 03641-59 47 20
eMail: [email protected]
www.clondiag.com
Ansprechpartner: Dr. Karin Adelhelm
ArrayTube Reader ATR 01
Lesegerät für ArrayTubes (ATs) von CLONDIAG,
Die ATs bestehen aus einem StandardMikroreaktionsgefäßen mit integrierten 2 mm x 2 mm
großen Microarray
I
4. Arbeitsprinzip
2. Gerätebezeichnung/Serie
3. Kurzbeschreibung des Produktes/Systems und
seiner Komponenten
1. Firmenanschrift/Ansprechpartner
M
R
Nr. III/2002 | 33
34 | Nr. III/2002
13. Preis (ab...Euro) für Basisversion
130 000.- g
Lizensiertes Produkt der Firma Affymetrix. Konfokaler Laserscanner mit kann neben Fluoreszenzfarbstoffen auch Radioisotope (3H, 33P, 32P, 35S,
„Flying objective lens“-Technologie. Automatische Focus-Einstellung für 14C etc) detektieren
Verwendung verschiedenen Slide-Formate. Sequentielles Scanning liefert
Daten beider Kanäle ohne das Risiko eines Crosstalks zwischen den
Farbstoffen.
12. Besonderheiten
127mm x 85 mm oder 5 glass slides mit je 74 x 23 mm gleichzeitig
Scan Area: 7500 µm x 2200 µm
Scan Area: bis zu Mikroplatten-Format
Preis ab 101.041,- g
Messung von 4 Objektträgern auf Adapter im
Mikroplattenformat, Twister/Stackerintegration für
Vollautomatisierung, Barcodereaderoption, erweiterte Analyse
über Netzwerklizenz optional, für multiple Analyselizenzen,
Windows 2000
Je nach Konfiguration Gerät mit 2, 3 oder 4 Lasern mit
zugehörigen Fluoreszenzdetektionsfiltern, 1 oder 2 PMT's; PC: 1
GB RAM mit CD-Brenner, 19" Monitor, Windows 2000 und
umfangreiches Software-Paket (inkl. Tecan LSA Analysesoftware
H
Gerät mit 2 Lasern und 3 Fluoreszenzdetektionsfiltern, Pentium-III
Rechner, Easy-to-Use Software und Handbuch.
C
10. Scan area
I
11. Standardlieferumfang
Array-Auswertesofware AIDA Array Evaluation professional, optional: AIDA Automatisierte hocheffiziente Detektion von
Array Clusterer, Partisan Array Lims
Spots/Subgrids/Grids, vielfältige Methoden zur
Hintergrundcharakterisierung und Datennormalisierung,
umfangreiche Berechnungsmethoden und Statistikfunktionen,
Gruppierung von Zellen/Grids/Bildern zur verbesserten
Charakterisierung der Daten, dynamische Verknüpfung von
Datentabellen und Grafiken (Histogramm, Scatterplot, Zellen/Spotinformation), Templates- und Makroprogrammierung
Der Scanner wird mit Pentium-III Rechner (500 MHz) und BedienungsSoftware geliefert
9. Datenauswertung/Software
Über Software einstellbare Auflösung: 4, 8, 10, 20, 40 µm
S
0,1 Fluorescein-Äquivalent / µm2 • Dynamischer Bereich: 5
Größenordnungen
5µ, 10µ 20µ oder 100µ selektierbar
R
0.1 Moleküle/µm2 Cy3 oder Cy5
E
10 µm Auflösung
1 oder 2 PMTs (für simultane parallele Detektion von 2
Wellenlängen) • Emissionsfilter: 1 oder 2 Filter-Schlitten, jeweils
Platz für 4 Filter. Standardausstattung: 2 Laser System optimiert
für CY5, CY3; 3 Laser-System: CY5, CY3 + 1 Standard-Filter; 4
Laser System: CY5, CY3, 2 Standard-Filter. Weitere Filter auf
Anfrage erhältlich.
B
wählbar: Fluoreszenzdetektion mit konfokaler oder nichtkonfokaler Optik,
Detektion von Radioisotopen mit Fuji IP-Technologie
Ü
< 1 Cy3 Molekül/µm2
3 Filter mit 551, 570 und 665 nm
6. Detektion/Kompomenten
T
Anregung über Laser: 633nm, 543nm, 594nm, 488nm
K
zwei oder drei interne Laser: blau (473nm) SHG, grün (532nm) SHG, rot
(640nm)LD
Microarray-Scanner mit 2 - 4 Lasern und 1 oder 2 PMTs.
5-Achsen Autofokussystem mit großem optischem
Arbeitsabstand ermöglicht außerordentliche Formatflexibilität
und ist Garant für Reproduzierbarkeit und exzellente Uniformität;
Flexible Konfokalität in Kombination mit Autofokus optimiert
Signal/Hintergrund-Verhältnis für verschiedene Formate und
Proben: MicroArrays oder andere Fluoreszenzsubstrate in
typischen Objektträgern (mit oder ohne Deckglas), Gelen,
Gewebeschnitten, Mikroplatten; Hochdurchsatz durch
Automation: Slide-Adapter im MTP-Format und Barcodereader
R
7. Pixel/Auflösung
2 Laser mit 523 nm bzw. 635 nm. Photo multiplier tube (PMT).
5. Anregung
konfocaler/nicht-konfokaler Laser-Scanner mit PMT-Detektion
Microarray-Scanner mit dem beliebige Objektträger-Formate,
beliebige Array-Formate und beliebige Fluoreszenz-Farbstoffe
bearbeitet werden können und der auch noch in
Automationslösungen integriert werden kann. Ermöglicht
konfokales und nicht-konfokales Array-Scannen. Die Scanner
sind in verschiedenen Laser-Konfigurationen erhältlich und
bieten die Flexibilität auch dicke Substrate, Flüssigkeiten, Gele
und eingekapselte Chip-Array-Formate genauso problemlos zu
analysieren wie verschiedene Glas-Objektträger bis hin zum
Mikroplatten-Format. Hohe Scangeschwindigkeit: 3,5 Minuten
für 1 Objektträger (2 Farben parallel).
LS Series Laser Scanner
Tecan Deutschland GmbH,
Theodor-Storm-Str. 17
74564 Crailsheim
Dr. Jürgen Fetzer
Tel. +49 7951 9417-18 Fax -42, [email protected]
www.tecan.com
A
8. Nachweisgrenze/Signal-noise ratio
Konfokales Laserscanning-Gerät mit 2 Lasern und 3 Filtern. Einbau
zusätzlicher Filter bzw. Laser möglich für hohe Flexibilität bei der
Auswahl der Fluoreszenzfarbstoffe. Patentierte Flying Objective Lens
Technologie
4. Arbeitsprinzip
Laser Scanner
FLA 8000
Affymetrix 428TM Array Scanner
Microarray Reader (Laser-System)
2. Gerätebezeichnung/Serie
Fujifilm Tokyo/ raytest
Benzstraße 4
75334 Straubenhardt
Dr. Michael Liebler
eMail: [email protected]
MWG Biotech AG
Anzinger Strasse 7a
D-85560 Ebersberg
eMail: [email protected]
www.mwg-biotech.com
Dr. Sabine Ott
Tel.: 08092-8289-905
3. Kurzbeschreibung des Produktes/Systems und
seiner Komponenten
1. Firmenanschrift/Ansprechpartner
M
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DNA-Microarrays
Fluoreszenzchip für
die Standardisierung von
Microarray-Experimenten
Karin Adelhelm, Thomas Kaiser, Jens Tuchscherer, Eugen Ermantraut
CLONDIAG® chip technologies GmbH, Jena
Die DNA-Array-Technologie hat sich im Bereich der funktionellen Genomanalyse weltweit etabliert.
Der Einsatz von DNA-Arrays ermöglicht die schnelle und hochparallele Durchführung von Genexpressions-Studien sowie von Genotypisierungs- und Mutationsanalysen. In kurzer Zeit fallen
dabei eine Vielzahl von Daten an, die je nach Labor mit unterschiedlichen Arraybild-Auslesegeräten
und dazugehörigen Bildauswerteprogrammen generiert wurden. Um diese Daten miteinander vergleichen zu können, ist es zwingend erforderlich, über geeignete Standardisierungs- und Normalisierungswerkzeuge zu verfügen. Hier stellen wir einen neuartigen Fluoreszenzchip vor, der den
Vergleich der verschiedenen fluoreszenzbasierten Verfahren zur Bilderzeugung und Bildauswertung
ermöglicht.
Key Words: Fluoreszenzstandard, Microarrays, Reader-Kalibrierung, Normalisierung
Der Vergleich von Daten, die im Rahmen
von DNA-Microarray-Experimenten generiert wurden, ist (heute) nicht ohne weiteres möglich, selbst wenn die Daten im gleichen Labor entstanden sind. Das liegt zum
einen an der großen Vielfalt der unterschiedlichen DNA-Array-Formate, die eingesetzt
werden. Zum anderen hängen die Testergebnisse stark vom jeweils verfügbaren
Arraybild-Auslesegerät (Array-Scanner,
CCD-Mikroskope usw.) und dessen Meßparametern sowie vom jeweiligen Bildauswerteprozeß ab – im folgenden zusammen-
gefaßt als „Imaging-Parameter“1,2. Mit dem
hier präsentierten Chip steht erstmals ein
Werkzeug zur Verfügung, das den Vergleich und die Standardisierung von Array-Bildern erlaubt, die mit verschiedenen
Imaging-Parametern erzeugt wurden.
Aufbau des Fluoreszenzchips
Der Fluoreszenzstandard FluorIS (Fluoreszenz-Intensitäts-Standard) besteht aus einem Chip der Fläche 10 mm x 10 mm, der
mit fluoreszierenden Strukturen verschie-
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dener, genau definierter Größen und Intensitäten versehen ist. Integriert in einen herkömmlichen Objektträger-großen Halter,
läßt sich FluorIS einfach in Standard-Auslesegeräten wie Microarray-Scannern einsetzen und auslesen (Abb. 1a, S. 36). Die
fluoreszierenden Bereiche des Chips bestehen aus einem Polymer, das über den gesamten optisch sichtbaren Spektralbereich
stabile Fluoreszenz-Eigenschaften besitzt.
Die einzelnen Array-Strukturen unterschiedlicher Größe und Intensität werden
mittels Mikrostrukturierungs-Techniken
auf Borofloat-Glas hergestellt. Bildet man
den FluorIS-Chip mit einem MicroarrayAuslesegerät wie einem Fluoreszenzscanner oder -Mikroskop ab, so lassen sich Aussagen über Auflösung und Empfindlichkeit des jeweiligen Systems erstellen. Ein
typisches Fluoreszenzbild von FluorIS ist
in Abbildung 1b dargestellt. Hier wurde
ein FluorIS-Chips mit Array-Strukturen der
Größen 4 µm x 4 µm, 8 µm x 8 µm und 32 µm
x 32 µm eingesetzt. Die einzelnen Bereiche
mit Strukturen gleicher Größe weisen drei
genau definierte, abgestufte Intensitäten
auf, mit deren Hilfe Sensitivitätsaussagen
zum jeweiligen System gemacht werden
können. Die Strukturen der Größe 4 µm
sind nicht genau differenzierbar, da der
eingesetzte Scanner – wie die meisten Array-Auslesegeräte – eine Auflösungsgrenze von 5 µm hat. Generell kann FluorIS mit
beliebigen fluoreszenten Strukturen der
Größen 4 µm bis 200 µm und mit variablen
Intensitäts-Abstufungen gefertigt werden.
Daneben ist die Herstellung von Chips mit
Millimeter-großen, homogenen Polymerflächen möglich, deren Einsatz die Kontrolle
der homogenen Ausleuchtung von CCD-
Info ordern? Kennziffer 26 LW 03 oder www.biocom.de
Anzeige
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Nr. III/2002 | 35
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Abb. 1: Der Fluoreszenzchip
ist in einen transparenten
Träger integriert, der Größe
und Form eines Objektträgers aufweist (1a). Ein typisches Fluoreszenzbild von
FluorIS, das mit einem konventionellen MicroarrayScanner erhalten wurde, ist
in Abb. 1b zu sehen. Im
vorliegenden Beispiel wurde ein Chip mit Strukturen
der Größen 4 µm x 4 µm, 8
µm x 8 µm und 32 µm x 32
µm gescannt. Die einzelnen
FluorIS-Felder variieren dabei in drei definierten Intensitätsabstufungen, die für
die oberste Reihe in einer
3D-Falschfarben-Darstellung
verdeutlicht wurden.
A
B
basierten Mikroskopen erlaubt. Die genaue
Struktur kann somit an individuelle Experiment- und Gerätebedingungen angepaßt
werden.
Optische Eigenschaften
Eine wichtige Voraussetzung für den Einsatz von FluorIS als Werkzeug zum Vergleich verschiedener Imaging-Parameter
sind die besonderen optischen Eigenschaften des fluoreszierenden Polymers, das zur
Chip-Herstellung eingesetzt wird. Die
FluorIS-Strukturen weisen auch bei wiederholtem Einsatz in Lesegeräten wie Scannern
über einen längeren Zeitraum stabile Fluoreszenzintensitäten auf, die nach einer Konditionierungsphase von etwa 10 Messungen
erreicht werden (Abb. 2). Die Verhältnisse
der einzelnen Intensitätsstufen I3/I1 und
I2/I1 bleiben konstant. Damit läßt sich der
Fluoreszenz-Standard optimal als Kalibrierwerkzeug zur Leistungskontrolle des eingesetzten Readers oder zum Vergleich von
Bildern einsetzen, die mit verschiedenen Systemen erhalten wurden. Daneben kann der
Standard bei nahezu beliebigen Anregungswellenlängen eingesetzt werden, da die
Strukturen stabile Fluoreszenzeigenschaften
innerhalb des sichtbaren Spektralbereichs
besitzen. In Abbildung 3 sind die FluorISIntensitäten für fünf verschiedene Anregungswellenlängen dargestellt, die typischerweise verwendet werden. Für jede
Anregungswellenlänge wird dabei ein eigenes „Intensitätsprofil“ erhalten, das charakteristisch für das jeweils eingesetzte Auslesegerät ist.
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eingesetzten Auslesegeräte jedoch Schwankungen auf; so sind zum Beispiel Leistungsfluktuationen von Scanner-Anregungsquellen von bis zu 20 % innerhalb eines Meßtages
möglich. Die Intensitätswerte der mit dem
Gerät gemessenen Fluoreszenzbilder ist direkt proportional zur Energie des Anregungslichtes; die zu verschiedenen Zeitpunkten
gemessenen Bilder lassen sich nicht mehr
direkt miteinander vergleichen. Hier kann
der Fluoreszenzstandard als Instrument zur
Kontrolle und Kalibrierung der physikalischen Meßparameter eingesetzt werden. Da
er stabil fluoreszierende Bereiche enthält, lassen sich nach wiederholter Detektion von
FluorIS in einem Auslesegerät, z.B. vor jeder
Messung eines Hybridisierungsbildes, direkt
Aussagen über vorhandene Energieschwankungen machen. Mit Hilfe der Auswertung
der drei Intensitätsstufen von FluorIS können die erhaltenen Resultate gegebenenfalls
korrigiert werden (Abb. 4).
Neben dem Einsatz von FluorIS zur Kontrolle der Meßparameter eines Reader-Systems
kann er auch zum direkten Vergleich der
Leistungsparameter verschiedener Auslesegeräte herangezogen werden. Auf diese Weise können auch Fluoreszenzbilder miteinander verglichen werden, die z.B. in zwei
verschiedenen Laboratorien mit unterschiedlichen Scannern detektiert wurden. In Abbildung 5 sind die Werte der drei FluorISIntensitätsstufen für zwei verschiedene Array-Scanner aufgetragen. Für beide Systeme
wurde ein unterschiedliches Intensitätsmuster für die drei FluorIS-Intensitätsstufen I1, I2
und I3 erhalten, das direkt die unterschiedlichen Meßparameter wie Anregungsenergie
oder Detektorleistung des jeweiligen Systems widerspiegelt.
Die Anwendung von FluorIS als physikalischem Standard eröffnet die Möglichkeit,
Microarray-Daten, die zu verschiedenen Zeiten, mit verschiedenen Experimenten oder
in verschiedenen Laboratorien generiert
wurden, zu vergleichen und zu normalisieren. Damit ist ein wichtiger Schritt in Richtung vergleichbare und standardisierbare
Array-Experimente unternommen. In einem
Anwendungsmöglichkeiten
von FluorIS
Abb. 2: Charakteristisches Fluoreszenzverhaltens der FluorIS-Strukturen im Verlauf von 100
Einzelmessungen: Intensität der drei einzelnen
Intensitätsstufen I1 (+), I2 (*) und I3 (x) von FluorIS (oberer Teil der Abbildung) und Auswertung der Intensitätsverhältnisse I3/I1 und I2/I1.
36 | Nr. III/2002
Um Resultate aus Microarray-Experimenten
vergleichen zu können, die innerhalb eines
Experimentes oder verschiedener Versuchsreihen gesammelt wurden, sind neben der
kontrolliert reproduzierbaren ExperimentDurchführung konstante Bedingungen bei
der Detektion der fluoreszenten Hybridisierungsbilder erforderlich. In vielen Fällen
weisen die physikalischen Meßparameter der
Abb. 3: Mittelwerte der drei FluorIS-Intensitätsstufen, gemessen bei den Anregungswellenlängen für fünf unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe.
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Abb. 5: Charakteristisches Intensitätsmuster nach der Detektion von
FluorIS mit zwei verschiedenen Microarray-Scannern. Die Aufnahmen
wurden bei den Anregungswellenlängen für die Fluoreszenz-Farbstoffe
Cy5™ und Cy3™ vorgenommen, die bei den meisten Auslesegeräten
standardmäßig einstellbar sind.
Abb. 4: Verhalten der Fluoreszenzintensitäts-Stufen des Standards in
Abhängigkeit von der Laser-Anregungsenergie des eingesetzten Detektionsgerätes.
zweiten Schritt wird für künftige Anwendungen ein modifizierter
FluorIS-Standard verfügbar sein, der direkt im Experiment-Array,
beispielsweise dem Microarray-Slide, integriert ist und damit einen
noch direkteren und besseren Vergleich der Arraydaten ermöglicht.
Literatur
[1] Diehl , F., Grahlmann, S., Beier, M., Hoheisel, J.D. 2001. Manufacturing DNA
microarrays of high spot homogeneity and reduced background signal. Nucleic
Acids Research 29 (7): e38
[2] Schuchhardt, J., Beule, D., Malik, A., Wolski, E., Eickhoff, H., Lehrach, H.,
Herzel, H. 2000. Normalization strategies for cDNA microarrays. Nucleic Acids
Research 28 (10): e47
Korrespondenzadresse
CLONDIAG® chip technologies GmbH
Dr. Karin Adelhelm
Löbstedter Straße 103-105
07749 Jena
Tel.: 03641-59 47 0
Fax: 03641-59 47 20
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Nr. III/2002 | 37
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Service
Custom Chips und Custom Service
für die Genexpressionsanalytik
auf Microarrays
Michael Gismann, BioChip Technologies GmbH, ein Unternehmen der GeneScan Gruppe, Freiburg
Microarrays (Biochips) – miniaturisierte und automatisierbare Analyse-Plattformen mit hoher paralleler Testkapazität – sind zu wertvollen Werkzeugen in der biomedizinischen Forschung und Anwendung geworden. Eines der Haupteinsatzgebiete für Microarrays sind Genexpressionsanalysen. Wegen
der Komplexizität dieser Multi-Parameter-Genaktivitätsstudien und wegen hoher Anfangsinvestitionen sind die Einstiegshürden in die Microarray-Technologie derzeit hoch. Eine Einstiegshilfe bieten
Microarrays, die von kompetenten Anbietern nach kundenspezifischen Wünschen gefertigt werden
(Custom Chips) oder als Fertigchips auf bestimmte Anwendungsgebiete zugeschnitten sind (z.B.
ConceptArraysTM). In Kombination mit einem kundenorientierten „Expression Profiling Service“, der
nach Wunsch einige oder alle Einzelschritte von der Versuchsplanung bis zur Datenauswertung
abdeckt, wird es akademischen und industriellen Anwendern möglich, die Microarray-Technologie mit
ihrem enormen Potential für sich zu erschließen und zu nutzen.
Key Words: Microarrays, Biochips, Genexpressionsanalysen, ConceptArraysTM, Expression Profiling
Service, Toxikologie, Krebsforschung
Für die simultane Expressionsanalyse einer
Vielzahl von Genen sind Microarrays (Biochips) die idealen Hochdurchsatzwerkzeuge. In einem biologischen System liefern Ver-
gleichsstudien zwischen den Genaktivitätsprofilen eines Testzustands und eines Kontrollzustands (Vergleichspaare z.B. krank/
gesund oder behandelt/unbehandelt) wich-
Abb. 1: Der experimentelle Ablauf einer ZweiFarb-Genexpressionsanalyse auf Microarrays
tige Aussagen zum Grundverständnis von
Zellen und Organismen, zur zellulären Antwort auf Umweltfaktoren wie Fremd- und
Giftstoffe und zur Diagnose und Therapie
von Krankheiten1,2. Allerdings handelt es
sich bei der Microarray-Technologie um ein
sehr anspruchsvolles Verfahren, das in der
Planungs-, Umsetzungs- und Auswertungs-
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phase ein hohes Maß an fachlicher Kompetenz und für die experimentelle Durchführung eine Ausstattung mit Spezialgeräten wie
Printern und Readern erfordert. Um Wissenschaft und Industrie
einen problemlosen Zugang zur Microarray-Technologie zu ermöglichen und eine fundierte Entscheidungsgrundlage zu schaffen,
bietet die Firma GeneScan ein Voll-Service-Konzept an, das alle
Phasen der Chipherstellung und Genexpressionsanalytik abdeckt.
Spezialgefertigte Custom Chips und
standardisierte ConceptArraysTM
Als Microarray-Plattform im GeneScan-Serviceangebot (Abb. 1) dienen einerseits maßgeschneiderte „Custom Chips“, die spezifisch für
die Fragestellungen und Wünsche von individuellen Anwendern
aus der Wissenschaft („ScienceChips“) und Industrie („BusinessChips“) konzipiert und hergestellt werden. Andererseits werden
themenspezifische Anwendungschips der ConceptArrayTM-Serie angeboten, die derzeit bekannte relevante DNA-Sonden aus einem
bestimmten Forschungs- oder Anwendungsbereich auf einem vorkonfigurierten Microarray vereinigen. Das Spektrum wird ständig
erweitert und reicht bereits von der Krebsforschung (CancerChip)
und Untersuchung von akuten und chronischen Entzündungsprozessen (InflameChip) bis hin zu toxikologischen Fragestellungen
(ToxChip).
Alle Biochips der ConceptArrayTM-Serie enthalten als Informationsträger vorsynthetisierte und chemisch an einen Glasträger gekoppelte Oligonukleotide. Im Gegensatz zu cDNA-Sonden, die als PCRProdukte auf den Chip gespottet werden, bieten Oligonukleotide
beim Sondendesign die Möglichkeit, die Sequenz durch Datenbankrecherchen gegen das gesamte bekannte Transkriptom abzugleichen und so maximale Spezifität zu erreichen3. Auf diese Weise
können unerwünschte Kreuzhybridisierungen vermieden werden,
und es kann sogar gezielt zwischen hochhomologen Mitgliedern von
Multigenfamilien unterschieden werden. Alle Chip-gebundenen Oligonukleotide sind normalisiert für die Hybridisierungsbedingungen.
Außerdem sind sie mit 50 Nukleotiden Länge, einem ansynthetisier-
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Abb. 2: Zwei-Farb-Genexpressionsexperiment auf einem ToxChip. HepG2Zellen wurden mit CdCl2 behandelt (Testzellen) oder blieben unbehandelt
(Kontrollzellen). Die aus beiden Zelltypen isolierte mRNA wurde während
der reversen Transkription entweder mit dem Farbstoff Cy3 (grün) oder
mit Cy5 (rot) markiert und auf dem Chip cohybridisiert. a) Identische
Chipausschnitte von drei verschiedenen Hybridisierungsvarianten. Links:
Testzellen Cy3/Kontrollzellen Cy5; Mitte: Testzellen Cy3/Testzellen Cy5,
Rechts: Testzellen Cy5/Kontrollzellen Cy3. b) Gesamtchip, aus dem der
auf dem mittleren Bild gezeigte Ausschnitt stammt
Kennziffer 28 LW 03 oder www.biocom.de Info ordern? |transkript LABORWELT
Nr. III/2002 | 39
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Abb. 3: Hierarchische Cluster-Analyse einer Genexpressions-Zeitkinetik nach CdCl2-Behandlung. HepG2
Zellen wurden 30 Minuten in Anwesenheit von CdCl2 behandelt und nach Mediumwechsel zu den angegebenen Zeiten für die Genexpressionsanalyse aufgearbeitet. Kontrollzellen blieben unbehandelt. In
der Clusteranalyse der zugrundeliegenden Zwei-Farb-Experimente repräsentieren rote horizontale Linien CdCl2-induzierte Gene im zeitlichen Verlauf. Die Ausschnittvergrößerung auf der rechten Seite zeigt
in der hierarchischen Anordnung den Bereich der Gene mit den höchsten Induktionsfaktoren.
ten Spacer und der chemischen Modifikation
für die Oberflächenkopplung an das Trägermaterial optimal an die Verwendung auf der
Microarray-Plattform angepaßt. Durchgängig tragen ConceptArraysTM integrierte positive und negative Kontrollen sowie die Sonden
des ArrayFit-Systems4 zur Datennormalisierung bei Zwei-Farb-Genexpressionsanalysen.
Einsatzgebiete von
ConceptArraysTM
Krebserkrankungen zeigen ein vielschichtiges, multifaktorielles Krankheitsbild mit komplexen Genaktivitätsmustern, die mit bestimmten Krebsstadien oder Krebstypen assoziiert sind5. Sogenannte Cluster-Analysen
tragen dazu bei, Gene zu finden, die gemeinsam an- oder abgeschaltet werden und daher
möglicherweise über dieselben Regulationsmechanismen und Signalwege in der Zelle
gesteuert werden. Das Ziel der biomedizinischen Genexpressionsanalysen auf Microarrays ist es, Krankheitsmuster zu erkennen,
Tumortypen molekular zu klassifizieren und
Vorhersagen über Krebsrisiken, Krankheitsverläufe und richtige Therapieansätze zu treffen. Letztendlich sollen Krebserkrankungen
frühzeitig und exakter diagnostiziert und
neue Therapien im Kampf gegen den Krebs
entwickelt werden.
Microarrays erlauben in einem einzigen Analysegang Aussagen über die Genaktivitätsmuster von Zellen nach Einwirkung von
Fremdstoffen (Xenobiotika), Schadstoffen
oder Giften und sind daher in allen Bereichen
einsetzbar, in denen toxikologische Untersuchungen durchgeführt werden6. Das ist bei
der Wirkstoffsuche und -entwicklung in den
präklinischen Tests der pharmazeutischen
Industrie der Fall. Dort ist die Evaluierung
der Toxizität von Wirkstoffen ein zeitaufwendiger, kostenintensiver und geschwindigkeitsbestimmender Schritt. Auch die toxischen Potentiale von Zusatz- und Inhaltsstoffen in der Lebensmittel- oder Kosmetikin40 | Nr. III/2002
dustrie sowie von Schadstoffen in der Umweltbiotechnologie könnten durch Biochipgestützte Screening-Verfahren in Zellkultursystemen effizienter und umfassender abgeschätzt werden. Da bisher viele Arzneimittel,
Kosmetika oder Umweltstoffe routinemäßig
am lebenden Tier getestet werden, können
Screening-Verfahren in Zellkulturen dazu
beitragen, die Zahl der Tierexperimente einzuschränken.
„Expression Profiling Service”
Trotz der offensichtlichen Vorteile von Microarrays liegen die Hürden für den Einstieg
in diese relativ neue Technologie hoch. Kundenorientierte Voll-Service-Angebote ermöglichen auch Firmen, deren Kernkompetenz
nicht auf dem Gebiet der Molekularbiologie
liegt, den Zugang zu Genexpressionsanalysen auf Microarrays. Der „Expression Profiling Service“ von GeneScan ist ein flexibler,
modular aufgebauter Komplettservice, der
alle Schritte der Versuchsplanung, experimentellen Umsetzung und Datenauswertung
abdeckt. Ganz nach Wunsch und eigenen
Möglichkeiten kann der Interessent jedes
Durchführungsmodul selbst bearbeiten oder
aber in Auftrag geben. Im Extremfall ist noch
nicht einmal ein eigenes Labor notwendig,
denn selbst die Zellkulturexperimente für
toxikologische Untersuchungen werden als
Auftragsdienst übernommen.
Die experimentellen Schritte einer Zwei-FarbGenexpressionsanalyse sind in Abbildung 1
dargestellt. Abbildung 2 und Abbildung 3
zeigen zwei ToxChip-Analysen von Cadmium-behandelten Zellen als Anwendungsbeispiele. Das Schwermetall Cadmium wirkt als
Zellgift und löst eine oxidative Streßantwort
aus, in deren Verlauf hauptsächlich Gene
angeschaltet werden, deren Proteinprodukte
für die Wiederherstellung der normalen Zellfunktionen verantwortlich sind (Redox-Regulationsenzyme, Hitzeschock-Proteine, Chaperone).
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Zur effektiven Verarbeitung und Auswertung der enormen Datenfülle hat GeneScan
das DataBridge-Konzept zur online-Bereitstellung und interaktiven Auswertung der gewonnenen Microarray-Daten entwickelt. Der
Anwender hat per Internet Zugriff auf seine
Daten, die er mit der bereitgestellten Software (auch übergreifend) auswerten und grafisch darstellen kann. Besonders hervorzuheben ist die Möglichkeit des „online coaching“,
das heißt der direkten Betreuung durch einen
Bioinformatiker des Unternehmens, der über
eine Internetverbindung mit dem Anwender
interaktiv am gleichen Datensatz arbeitet.
Hinter dem „Expression Profiling Service“
steht GeneScans langjährige Erfahrung in der
Entwicklung, Herstellung und Anwendung
von Microarrays. Alle Einzelprozesse sind
optimiert, standardisiert und folgen den Regeln des Qualitätsmanagements, was maximale Effizienz, Datensicherheit und Reproduzierbarkeit gewährleistet.
Custom Chips und Custom Service bieten
Anwendern aus Wissenschaft und Industrie
die Möglichkeit, das Potential von Genexpressionsanalysen auf Microarrays für ihre
spezifischen Fragestellungen auszuloten und
auf dieser Erfahrungsbasis fundierte Entscheidungen über den Einstieg in die MicroarrayTechnologie zu treffen. Je nach Probenaufkommen, laborspezifischen Voraussetzungen
und apparativen Gegebenheiten kann das
Beauftragen eines Dienstleisters (Outsourcing) oder die Etablierung der Technologie im eigenen Labor die wirtschaftlichere
Lösung sein.
Literatur
[1] Lockhart, D.J., Winzeler, E.A., Nature 405 (2000),
827-836.
[2] Young, R.A., Cell 102 (2000), 9-15.
[3] Kane, M.D., Jatkoe, T.A., Stumpf, C.R., Lu, J., Thomas, J.D., Madore, S.J., Nucleic Acids Research 28
(2000), 4552-4557.
[4] Vonderstrass, S., Hallensleben-Steen, W., Bioforum 4 (2002), 189-190.
[5] Alizadeh, A.A., Eisen, M.B., Davis, R.E., Ma, C.,
Lossos, I.S., Rosenwald, A., Boldrick, J.C., Sabet, H.,
Tran, T., Yu, X., Powell, J.I., Yang, L., Martl, G.E.,
Moore, T., Hudson, J., Lu, L., Lewis, D.B., Tibshirani,
R., Sherlock, G., Chan, W.C., Greiner, T.C., Weisenburger, D.D., Armitage, J.O., Warnke, R., Levy, R., Wilson, W., Grever, M.R., Byrd, J.C., Botstein, D., Brown,
P.O., Nature 403 (2000), 503-511.
[6] Pennie, W.D., Toxicology Letters 112-113 (2000),
473-477.
Korrespondenzadresse
Michael Gismann
BioChip Technologies GmbH –
ein Unternehmen der GeneScan Gruppe
Engesserstraße 4
79108 Freiburg
Tel.: 0761-5038 131, Fax: 0761-5038 166
eMail: [email protected]
www.genescan.com
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Produkte & Service
DNA-Microarrays – Werkzeuge
für die Molekulare Medizin
Dr. Lutz Wehmeier und Dr. Sabine Ott, MWG-BIOTECH AG, Ebersberg
DNA-Microarrays haben sich zu einem unentbehrlichen Werkzeug für die Untersuchung von GenExpressionsprofilen in der Pharmakogenomik, Toxikogenomik, Entwicklungsbiologie, Krebsforschung und vielen anderen Forschungsrichtungen entwickelt. Die Auswirkungen von Krankheiten,
Umweltfaktoren, Therapeutika und vielen anderen Effekten auf die Expression mehrerer tausend Gene
können mit Hilfe der Microarray-Technologie parallel analysiert werden.
So lassen sich zum Beispiel die Expressionsprofile von Tumorzellen mit denen gesunder Zellen
vergleichen und daraus eine Aussage über die Regulation tausender Gene ableiten. Mit Hilfe der
gewonnenen Daten ist es möglich, Ursachen von Erkrankungen, Einflüssen von Umweltfaktoren oder
Effekten von Therapeutika kosteneffizient und schnell zu erforschen.
Komplette Produktpalette
MWG Biotech bietet Wissenschaftlern auf
dem Gebiet der Microarrays eine umfassende Palette an Applikationslösungen in höchster Qualität und Reproduzierbarkeit. Von
hochdichten Catalog-Arrays verschiedener
eukaryotischer und prokaryotischer ModellOrganismen, über kundenspezifische Custom-Arrays bis hin zu Oligonukleotid-Sets
zur Eigenfertigung von Microarrays.
Die hochdichten Catalog-Arrays, wie etwa
der 30.000 Gene umfassende MWG Human
30K Array, werden meist für ein Erst-Screening eingesetzt, das heißt, es wird die Expression aller menschlichen Gene in einem
bestimmten Zustand der Zelle untersucht.
Dies geschieht meist in Form einer Cohybridisierung, also dem direkten Vergleich der
Expression in zwei unterschiedlichen Zu-
ständen, wodurch in der Regel eine überschaubare Anzahl differentiell regulierter
Gene ermittelt wird. Diese sind für den Forscher für weitere Analysen von Interesse.
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Hier gewährleistet MWG Biotechs Custom
Array-Service die individuelle Zusammenstellung interessanter Gene jedes pro- oder
eukaryotischen Organismus auf einem
speziellen Custom-Array. Die so mögliche
Reduktion von 30.000 Genen auf die etwa
2 bis 300 wirklich interessanten Gene ermöglicht es dem Forscher, schnell, kosteneffizient und mit einer überschaubaren
Menge an Daten eine große Anzahl von
Zellen, Zuständen, Therapeutika o.ä.
durchzutesten.
Sofern ein eigenes Instrumentarium zur Arrayproduktion zur Verfügung steht, ist es
möglich, alle oder individuelle Oligonukleotid-Sonden der MWG Catalog Arrays als
Oligoset zu bestellen und selbst Arrays zu
spotten. Werden Oligo-Sets für Organismen
benötigt, für die noch keine Catalog Arrays
vorliegen, so bietet die MWG-Biotech AG
kompletten Design- und Synthese-Service
für die speziellen gewünschten Gene an.
Hierzu greift das Unternehmen auf seine
hohe Bioinformatik-Kompetenz und jahre-
Abb. 1: Chip-Herstellung bei
MWG-Biotech AG
Info ordern? Kennziffer 29 LW 03 oder www.biocom.de
Anzeige
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lange Expertise als europäischer Marktführer in der Oligonukleotidsynthese zurück,
so daß Aufträge schnell und effizient nach
MWG-Biotechs bewährter Ein-Gen/EinOligo-Methode hergestellt werden können.
Die Catalog- und Customarrays von MWG
Biotech basieren auf hochreinen HPSF®-Oligonukleotid-Sonden mit einer Länge von
50 Nukleotiden. Zahlreiche Studien zeigen,
daß 50mere eine optimale Balance zwischen
Sensitivität und Spezifität darstellen.
Zudem ist bei dieser Länge noch eine Qualitätskontrolle über Massenspektrometrie
möglich, was Array-Oligonukleotide in
voller Länge garantiert (siehe LABORWELT
2/2000).
Die Oligonukleotide werden mit einer Aminomodifikation versehen und auf epoxybeschichtete Glasobjektträger gedruckt. Alle
Schritte der Arrayentwicklung - von der
Bioinformatik über die Oligonukleotidsynthese bis hin zur Herstellung der Arrays –
finden bei MWG-Biotech statt.
Bioinformatik
MWG Biotech besitzt eine leistungsstarke
Bioinformatik-Abteilung, die es ermöglicht,
auch ausgefallenen Kundenwünschen ge-
Abb. 3: Auswertung von DNA-Microarrays
recht zu werden: von der Annotation generierter Sequenzdaten über spezielle Bioinformatikfragen bis hin zum hochspezifischen Oligonukleotid-Design für Arrays.
Beim Design der Arrays werden zunächst
Oligonukleotide bestimmt, die aufgrund ihrer physikalischen Parameter wie GC-Gehalt und Schmelztemperatur (TM) geeignet
sind und weder Sekundärstrukturen ausbilden noch „Self-Annealing” zeigen. Diese
Oligonukleotide durchlaufen dann intensive BLAST- und Smith-Waterman-Analysen
gegen die komplette Sequenz des entsprechenden Organismus, um Kreuzhybridisierungen auszuschließen. Die Basis dafür stellen proprietäre, nicht-redundante und speziesspezifische CodeSeq®-Datenbanken dar.
Weiterhin ist die MWG-Bioinformatik in
der Lage, ein hochspezifisches und statistisch zuverlässiges Oligonukleotid-Design
von einem Oligonukleotid pro Gen zu garantieren. Dies hilft, die Auswertung des
Arrays stark zu vereinfachen und die Datenmenge erheblich zu reduzieren.
Auch spezielle Fragestellungen, wie die Detektion von Splice-Varianten oder die kundenorientierte Positionierung der Oligonukleotide, werden beim Design berücksichtigt.
Custom-Arrays
Im Anschluß an ein Screening mit Catalog
Arrays bietet MWG Biotech die Möglichkeit, speziellere Fragestellungen mit einem
individuellen Kunden-Array zu beantworten.
Dazu werden die aus einem Screening oder
aus der Literatur ermittelten Gene auf einen persönlichen Customarray gebracht,
der auf die speziellen Fragestellungen des
Kunden zugeschnitten ist.
Abb. 2: Chip-Herstellung bei MWG-Biotech AG
42 | Nr. III/2002
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einem bestehenden Oligo-Set noch weitere
Oligonukleotide hinzugefügt werden. Dadurch kann ein kundenspezifischer CustomArray stets auch über den aktuellen Zeitpunkt hinaus noch an spezielle Anforderungen und Fragestellungen angepaßt werden.
Das DNA Microarray-Komplettprogramm
ergänzen eine Vielzahl von Serviceleistungen der Bioinformatik, Workshops, wie auch
Instrumente zur Chipherstellung und –auswertung, sowie Softwarelösungen.
Oligonukleotid-Technologie
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Nach Einsenden der Genliste oder der Sequenzen entwirft MWG-Biotech innerhalb
der kürzestmöglichen Zeit einen persönlichen Array. Das flexible Array-Design erlaubt es, nach der ersten Lieferung von Custom Arrays diese noch weiter zu modifizieren. So können beispielsweise Oligonukleotide ergänzt oder entfernt werden oder
Für alle Organismen in MWG-Biotechs Catalog Array-Portfolio kann mit Hilfe des
Unternehmens-eigenen, Internet-basierten
Compact Gene Index ein individuelles Subset von Genen - repräsentiert durch die für
die MWG Catalog Arrays bereits entworfenen Oligonukleotide – zusammengestellt
werden. Dieser Bioinformatik-Service wird
auch für weitere wichtige Modellorganismen wie Zebrafisch, Arabidopsis und
C. elegans auf der MWG-Website bereitgestellt werden.
Mit einem umfassenden Produkt- und Serviceportfolio zum Thema DNA-Microarrays
ist die MWG-Biotech AG damit in der Lage,
Abb. 4: MWG Human 30K Array mit 30.000 Genen des Menschen
schnell und kostengünstig applikationsorientierte und maßgeschneiderte Lösungen
aus Produkt, Service und Instrument für
hochspezifische Anforderungen zur Verfügung zu stellen. In Forschungs- und Technologiekooperationen sowie mit der Entwicklung von DNA-Microarrays zu spezifischen physiologischen und pathogenen
Themenbereichen legt die Microarray-F&EAbteilung der MWG-Biotech AG zudem
die Grundlagen für die Weiterentwicklung
dieser wichtigen Werkzeuge in Richtung
klinische Individualdiagnostik.
Korrespondenzadresse
Ulrike Schramm
Public Relations Manager
MWG-BIOTECH AG
Anzinger Straße 7a
D-85560 Ebersberg
Tel.: 08092-8289 929
Fax: 08092-8289 514
eMail: [email protected]
www.mwg-biotech.com
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PCR
Hochdurchsatz-PCR, ein
Werkzeug auf dem Weg vom
Genom zum Expressionsprofil
Patricia Langer, Markus Schuppler, Wolfram Hemmer; GATC Biotech AG, Konstanz
Seit dem Anbruch der „Post-Genom-Ära“ wurden große Teile des Erbguts verschiedenster Organismen bereits entziffert. Einblicke in die von den DNA-Sequenzen determinierten zellulären Funktionsmechanismen ermöglicht die Untersuchung differentieller Gen-Expressionsprofile. Die DNA-ChipTechnologie gilt dabei heute als eine Schlüsseltechnologie: Charakteristische Gene, Gen-Abschnitte
oder auch nicht charakterisierte Fragmente werden auf Arrays aufgebracht und stehen für verschiedenste Screening-Methoden zur Verfügung. Ein entscheidender Schritt auf dem Weg zum DNAArray oder DNA-Chip ist die Amplifikation der entsprechenden Gen-Abschnitte über Hochdurchsatz-PCR (HT-PCR).
Key Words: automatisches Primerdesign, PCR im 96-Well-MTP Format, prokaryotische vs. eukaryotische Templates, cDNA-Banken als Templates, universelle vs. spezifische HT-PCR, Pipettierroboter/automatische Klon-Picker
Primer-Design und PCR
im Hochdurchsatz
Die Automatisierung der PCR beginnt bereits
beim Computer-basierten Primerdesign. Mit
Hilfe spezieller Software (z.B. Primer3) werden für beliebig viele Zielsequenzen Primer
entworfen. Faktoren, wie die Größe der zu
produzierenden PCR-Produkte und uniforme Annealing-Temperaturen der Primersätze, werden dabei automatisch berücksichtigt. Um störende Nebenprodukte zu vermeiden, können Parameter definiert werden, die die Spezifität der Primer bestimmen. Eine größtmögliche Effizienz der PCR
wird durch die routinemäßige Prüfung der
Sequenzen auf die Ausbildung von Haarnadelschleifen („Hairpins“), Homo- und Hetero-Oligomeren erreicht. Die so entworfenen
HT-Primer werden schließlich im 96-WellMikrotiterplatten-Maßstab synthetisiert und
für die PCR verwendet. Sofern nötig, werden die Standard-PCR-Bedingungen (eingesetzte Polymerase, Temperatur-Protokolle,
MgCl2-Konzentration und andere Reaktionsbedingungen) den jeweiligen Ansprüchen
angepaßt. Automatisierfähige Prozesse im
Gesamtablauf können von Pipettier-Robotern durchgeführt werden. Optional kann
auch eine anschließende Aufreinigung der
PCR–Produkte im HT-Maßstab durchgeführt werden.
Projekt-Beispiele
Abhängig von der individuellen Fragestellung unterscheiden sich bereits die Ausgangsmaterialien und damit die PCR-Templates. Dabei kann es sich beispielsweise um
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die Generierung von Amplifikaten bakterieller „Open Reading Frames“ (ORFs), definierter eukaryotischer Gene über einen RTPCR-Ansatz oder ausgewählter Klone aus
cDNA-Banken handeln.
Um Expressionsprofile prokaryotischer Organismen zu untersuchen, werden zunächst
im entsprechenden Genom mit Hilfe der
Bioinformatik mögliche (putative) codierende Bereiche (ORFs) gesucht. Diese Zielsequenzen werden anschließend unter Verwendung spezifischer Primersätze mittels
HT-PCR aus der genomischen DNA amplifiziert. Die fertigen PCR-Produkte können
anschließend auf Filter oder andere TrägerMaterialien aufgebracht werden.
Bei eukaryotischen Organismen können unterschiedliche Wege beschritten werden, um
Informationen über das „Transkriptom“ –
also die tatsächlich in einem Zelltyp, einem
Gewebe oder einem Organismus exprimierten Gene – zu erhalten. Der erste Schritt ist
stets die reverse Transkription der mRNA.
Die gewonnene cDNA kann direkt als Template eingesetzt werden, um bekannte GenAbschnitte mit spezifischen HT-Primersätzen zu amplifizieren. Erfahrungsgemäß haben derartige Projekte, in denen mehrere
hundert Gene amplifiziert werden sollen,
eine Erfolgsquote von mehr als 80 %. Die
Amplifikate können nun direkt auf Filter
gespottet werden, die dann für Screening-
Abb. 1: Der Weg von der genetischen Information zum DNA-Chip führt in vielen Fällen über die
Hochdurchsatz-PCR. Erläuterung siehe Text
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Zwecke zur Verfügung stehen. Mit solchen
Filtern lassen sich beispielsweise erste Evaluierungsschritte für einen geplanten Einsatz der Amplifikate auf Microarrays durchführen.
Bisher unbekannte Transkripte können
durch den Einsatz von normalisierten oder
subtrahierten cDNA-Banken als Ausgangsmaterial identifiziert werden. In solchen optimierten cDNA-Banken sind seltene oder
gewebespezifische Transkripte stark angereichert1. Mit Hilfe automatischer Klon-Pikker werden aus den primären Banken zunächst arrangierte Klon-Bibliotheken im 96oder 384-Well-MTP-Format erstellt. Diese
können dann im Hochdurchsatz sequenziert
werden, um eine gezielte Auswahl für die
weitere Bearbeitung treffen zu können. Interessante Klone werden dann mittels automatisiertem „Hit Picking“ in neuen MTPs
(Subset-MTPs) rearrangiert. Auf der Grundlage der Sequenzdaten können wiederum
spezifische HT-Primersätze generiert werden, um aus definierten Subsets der KlonBibliotheken Amplifikate zu erzeugen.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß
zunächst ohne Vorauswahl Klone einer optimierten cDNA-Bank für einem Array verwendet werden: Zur universellen Amplifikation der subklonierten cDNA können Primer eingesetzt werden, die an flankierende
Vektor-Sequenzen binden. Die Klone einer
arrangierten Bibliothek im MTP-Format werden dann als automatisch pipettierbare Templates einer HT-PCR mit besagten universellen Primern verwendet. Aufgrund der Kontaminationsgefahr, die bei einer universellen
– und damit „unspezifischen“ – PCR oder bei
der Lagerhaltung der Klone grundsätzlich
besteht, ist jedoch ein spezifischer (oder zumindest semi-spezifischer) Ansatz zu empfehlen. Aus welchem Ausgangsmaterial auch
immer die Amplifikation erfolgt, das Spotten von PCR-Produkten auf Filter oder andere Träger hat gegenüber dem Aufbringen
von Bakterienkolonien den entscheidenden
Vorteil, daß ausschließlich die gewünschte
DNA-Sequenz aufgebracht wird. Der bei einer Koloniehybridisierung auftretende unspezifische Hintergrund und damit die Anzahl der falsch-positiven Signale in Screening-Verfahren wird so deutlich reduziert.
Literatur
[1] Gradl G. et al., BIOspektrum, 2002, 5/02, in press
Korrespondenzadresse
Dr. Patricia Langer
GATC Biotech AG
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Tel:. 07531-81 60 68
eMail: [email protected]
www.gatc-biotech.com
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Technologie
DNA- und Protein-Microarrays –
Höchste Empfindlichkeit durch
Planare Wellenleitertechnologie
Dr. Michael Pawlak, Michael Schneider, Dr. Eginhard Schick, Dr. Gerhard M. Kresbach und
Dr. Markus Ehrat, Zeptosens AG, Witterswil, Schweiz
Die Ansprüche an die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und den Durchsatz von MicroarraySystemen nehmen seit einigen Jahren kontinuierlich zu. Die von Zeptosens für Microarray-Anwendungen weiterentwickelte Planare Wellenleitertechnologie ermöglicht einen bedeutenden Schritt zur
Erfüllung dieser Ansprüche. Basierend auf dieser Technologie hat Zeptosens neue Produkte unter den
Handelsnamen SensiChipTM und SensiChipTM Reader für DNA-Microarrays sowie ZeptoCHIPTM
und ZeptoREADERTM für Protein-Microarrays kommerzialisiert.
Die Planare Wellenleitertechnologie erlaubt – in Kombination mit signifikanten Verbesserungen der
Oberflächenchemie, der Mikrofluidik, der Assaydurchführung, der neu entwickelten Auslesetechnologie und der Bildauswertung – eine zuverlässige und vollautomatische Messung von bis zu 300
Microarrays in einem analytischen Lauf. Dabei kann jeder dieser Microarrays mit bis zu einigen
hundert Erkennungselementen zur Detektion von wenigen hundert bis tausend Kopien von Genen
und Proteinen in höchster Präzision ausgestattet sein. Die Empfindlichkeit des Systems erlaubt es
dabei, ohne eine enzymatische Signalverstärkung zu arbeiten.
Key Words: DNA-Microarrays, Protein-Microarrays, PWG, Planare Wellenleitertechnologie, Planar Waveguide Technologie, ZeptoREADERTM, SensiChipTM Reader, ZeptoCHIPTM, SensiChipTM
Die mit der Genom- und Proteomforschung
aufgeworfenen wissenschaftlichen Fragestellungen haben die Entwicklung neuer ultraempfindlicher und schneller analytischer
Abb. 1: Grundlegende biologische Prozesse und
Regulationsmechanismen der eukayotischen
Zelle. Hochsensitive und parallel arbeitende
Analysetechniken wie Microarrays sind notwendig, um die komplexen Steuer- und Regulationsmechanismen simultan zu erfassen.
Hochdurchsatz-Technologien vorangetrieben. Die 2001 in einem ersten Schritt abgeschlossene (Roh-)Sequenzierung des
menschlichen Genoms1,2 und die darauf basierenden Analysen zeigten rund 30.000 bis
40.000 codierende Gene. Diese dienen – wenn
man die verschiedenen Splicing- und Polyadenylierungsvarianten berücksichtigt – als
Bauplan für einige 100.000 verschiedene Proteine. Informationen über diese Vielzahl von
Genen und Proteinen können nur mit Methoden gewonnen werden, die mehrere hundert Gene oder Proteine parallel aus einer
kleinen Probe messen können. Neben den
seit einiger Zeit eingesetzten DNA-Microarrays oder etablierteren Techniken wie 2DGel-Elektrophorese, Western Blots und
MALDI-Massenspektrometrie gewinnen
Protein-Microarrays immer mehr an Bedeutung für die parallele Analyse einer großen
Anzahl verschiedener Wirk- und Markersubstanzen.
Während sich die Funktionelle Genomik mit
dem Zusammenspiel und der Regulation der
unterschiedlich exprimierten Gene beschäftigt, ist es das Aufgabengebiet der „Funktionellen Proteomik“, die Regelmechanismen
auf dem sehr viel breiteren und komplexeren
Gebiet der Protein-Expression und der Protein-Ligand-Wechselwirkung zu erforschen
und zu verstehen. Beide Themengebiete befassen sich sowohl mit der Aufrechterhaltung der internen Steuerung wie auch mit der
Reaktion auf interne oder externe Störungen
zellulärer Regelmechanismen – sei es durch
Krankheit oder durch Gabe pharmakologisch
oder xenobiotisch wirksamer Substanzen.
Beiden Bereichen ist gemein, daß die regulatorischen Biomoleküle typischerweise in sehr
geringen Konzentrationen vorkommen – bis
hinab zu wenigen Kopien pro Zelle („low
abundant genes“ bzw. „low abundant proteins“). Bei der Proteomik kommt erschwerend dazu, daß die Zielmoleküle unterschiedlich modifiziert (z.B. phosphoryliert oder glykosyliert) und in verschiedenen Aktivitätszuständen vorliegen können.
Das Wissen, welches Protein in welcher
Menge, in welchem Aktivitätszustand, an
welcher Position in welchem Signaltrans|transkript LABORWELT
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Abb. 2: Aufbau und Detektionsprinzip eines Planaren Wellenleiters: Ein zu
einer Linie aufgefächerter Laserstrahl wird mit Hilfe eines Beugungs-Gitters in die hochbrechende Schicht eines Wellenleiterchips eingekoppelt.
Das starke oberflächennahe evaneszente Lichtfeld regt nur oberflächengebundene Bindungskomplexe zur Fluoreszenz an und liefert damit
höchste Empfindlichkeit.
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duktionsweg und in welchem Zusammenhang mit einem Krankheitszustand steht, ist sowohl für die Auswahl von potentiellen
Wirkstoffgruppen, die Pharmaentwicklung als auch die Diagnostik
bedeutend. Dieses Wissen führt zur Definition von Markermolekülen – biologischen Substanzen, die von hoher Aussagekraft für
bestimmte Vorgänge und Mechanismen in Organismen sind und die
zur Beschreibung komplexer Systeme dienen (Abb. 1).
Praxisanforderungen
In einer eukaryotischen Zelle befinden sich ungefähr 100 bis 500
Femtogramm (fg) mRNA. Diese mRNA-Population unterteilt sich in
drei Gruppen: ca. 0,1 % mit großer (>1000 pro Zelle), rund 5 % mit
mittlerer und etwa 95 % mit sehr geringer Kopienzahl (< 10 pro
Zelle). Bei exprimierten Proteinen ist die Streubreite von geringer
und sehr hoher Konzentration in einer Zelle oft noch größer. Damit
gewinnt der Faktor Selektivität – die Möglichkeit des Erkennens
einzelner Molekülpopulationen in komplex zusammengesetzten
biologischen Matrices – sehr an Bedeutung.
Steht nur wenig Probematerial zur Verfügung – wie zum Beispiel
beim Gewinnen ausgewählter Einzelzellen mit Laser-Mikrosektion
(Laser Capture Microdissection, LCM), der minimal invasiven Nadelbiopsie oder bei der dreidimensionalen Tumoruntersuchung zur
Abgrenzung von gut- und bösartigen Geweberegionen –, steigen die
Anforderungen an die Leistungsfähigkeit des Analysensystems beträchtlich.
Wegen mangelnder Empfindlichkeit konnte bis heute ein Großteil von
Boten- und Signalstoffen nicht oder nur nach aufwendiger enzymatischer oder chemisch-physikalischer Verstärkung detektiert werden –
oft um den Preis ungenauer oder fehlerhafter Ergebnisse.
Gesteigerte NachweisEmpfindlichkeit mit
SensiChipTM und ZeptoMARKTM
Die höchstmögliche Nachweisempfindlichkeit der DNA- und Protein-Microarrays läßt sich nicht durch die Optimierung eines einzelnen Parameters erreichen. Wir haben – neben der Entwicklung der
Planaren Wellenleitertechnologie als Basis zur hochempfindlichen
und gleichzeitig robusten Fluoreszenzdetektion von Microarrays –
eine Vielzahl weiterer Schlüsselfaktoren optimiert. Dies reicht von
optimalen Herstellungsbedingungen bei der Produktion von
Microarrays über die Verwendung spezieller Oberflächen, die bei
minimaler unspezifischer Bindung die Erkennungselemente in einer möglichst nativen Form präsentieren, der Verwendung speziell
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Mehr Informationen ordern? Faxseite: Kennziffer 30 LW 03
konstruierter Proben- und Reaktionsbehältnissen bis hin zur Optimierung von Assaybedingungen für die parallele Analyse einer
Vielzahl von Erkennungsreaktionen bei gleichzeitiger Kompatibilität mit biologischen Matrices.
Planare Wellenleitertechnologie:
Verwendung für Microarrays
Im Gegensatz zu den üblicherweise im Bereich der Microarrays
verwendeten Fluoreszenz-Scannern detektiert die in den ZeptosensSystemen eingesetzte Planare Wellenleitertechnologie (Planar
Waveguide (PWG) oder Evaneszent-Feld-Technologie) nur die an die
Oberfläche gebundenen Analyten und erzeugt keine Fluoreszenz in
der darüber befindlichen Lösung. Damit werden Störsignale wie etwa
ein starkes Hintergrundsignal durch fluoreszenzmarkierte, aber nicht
gebundene Moleküle in der Lösung vermieden.
Bei der PWG-Technologie wird monochromatisches Licht über ein
Beugungsgitter in eine dünne transparente und hochbrechende
Schicht aus Tantalpentoxid (Ta2O5) eingekoppelt, die auf ein Trägersubstrat aus Glas aufgebracht ist. Das evaneszente Feld wird durch
Lichtleitung in dieser wellenleitenden Schicht erzeugt und hat in der
hier verwendeten Konfiguration eine Eindringtiefe von einigen 100
nm in das umgebende wäßrige Medium. Die auf der Oberfläche
gebildeten Biomolekülkomplexe befinden sich im Bereich des evaneszenten Feldes. Abbildung 2 zeigt schematisch den Aufbau eines
Dünnschichtwellenleiters.
Der ZeptoREADER™ und der im Aufbau ähnliche SensiChip™
Reader (zur Auslesung der DNA-Microarrays) sind mit LaserlichtNr. III/2002 | 45
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croarrays, die jeweils mit einer individuell
befüllbaren Mikrofluidik-Struktur versehen
sind (Abb. 3a). Fünf dieser ZeptoCHIPsTM können in beliebiger Reihenfolge in einen ZeptoCARRIERTM eingesetzt werden, der die Abmessungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte besitzt, was die automatisierte Prozessierung
der Microarrays, zum Beispiel durch Pipettierroboter, wesentlich erleichtert. Der ZeptoREADERTM (Abb. 3b) kann bis zu 10 ZeptoCARRIERTM aufnehmen und ermöglicht die
vollautomatische Messung von bis zu 300 Microarrays in einem Arbeitsgang. Die Fluoreszenzsignale der individuellen Spots eines rund
5 x 7 mm großen Microarrays werden durch
eine CCD-Kamera als Vollbild aufgenommen,
also nicht durch Scannen. Die Belichtungszeiten können in einem weiten Bereich variiert
werden, was das Erfassen sehr starker sowie
sehr schwacher Fluoreszenzsignale ermöglicht. Die Bildanalyse und Auswertung erfolgt
mit einer neuen, auf die speziellen Eigenschaften der ZeptoCHIPS™ und des ZeptoREADERs abgestimmten ZeptoVIEW™ Image
Analysis-Software.
Abb. 3a: ZeptoCARRIER™ mit bis zu fünf ZeptoCHIPs™ im Außenformat einer Mikrotiterplatte. ZeptoCHIPs™ mit sechs Microarrays können über eine angebundene Mikrofluidikstruktur mit Probe- und Waschlösungen in Kontakt
gebracht werden.
Abb. 3b: ZeptoREADER™ Workstation: Lesegerät für bis zu 50 ZeptoCHIPs in 10 ZeptoCARRIER™. Damit können bis zu 300 Microarrays für einen Meßvorgang beladen und automatisch ausgelesen werden.
quellen zur Fluoreszenzanregung bei 635 nm
(„rot“) und 532 nm („grün“), sowie optional
für die Protein-Microarray- Anwendungen bei
492 nm („blau“) ausgerüstet. Jeder ZeptoCHIPTM besteht aus sechs individuellen Mi-
Nachweis von einigen hundert
Molekülen möglich
Je nach Anwendungsgebiet und Versuchsbedingungen kann die PWG-Technologie im
Vergleich zur Scannertechnologie Microarray-Bilder mit 50- bis 100fach besserem Signal/Rausch-Verhältnis liefern. Abbildung
4 zeigt am Beispiel eines Protein-Microarrays
die mit PWG erreichbare, absolute Erfassungsgrenze für fluoreszenzmarkierte Proteine im Zeptomol-Bereich. Dazu wurde auf
einem Chip ein Microarray mit Verdünnungen eines fluoreszenzmarkierten Proteins erstellt und im Scanner und dann im ZeptoREADER ausgelesen.
Capture- und Reverse Microarrays
Abb. 4: Bestimmung der Einzelspot-Detektionsgenzen (limit of detection, LOD) eines mit
Cy5-Fluorophoren markierten Rinderserumalbumins (BSA) beladenen Microarrays. Es wurden
jeweils fünf Spots einer Cy5-BSA-Verdünnungsreihe mittels Ink-Jet-Technologie auf den Chip
aufgetragen. In einem Spot wurden 500 pl Lösung deponiert. Die LOD liegt bei der Spotreihe
der 2 pM-Lösung. Dies impliziert, daß in einem
Spot noch 1 Zeptomol markiertes Protein nachgewiesen werden kann. Dies entspricht ca. 600
Proteinmolekülen, mit einer durchschnittlichen
Markierungsrate von 3 Fluorophoren pro
Molekül.
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Beim Design von Microarrays sind grundsätzlich zwei verschiedene Formate möglich:
Capture-Microarrays und Reverse Microarrays. Bei Capture-Microarrays werden Erkennungselemente für ein ausgesuchtes Set zu
untersuchender Zielmoleküle hergestellt und
auf der Chip-Oberfläche als Spots aufgebracht. Bei DNA-Microarrays bestehen diese
Erkennungselemente typischerweise aus
cDNA beziehungsweise aus Oligonucleotiden in einer Länge zwischen ca. 14 und 90
Nucleobasen; bei Protein-Microarrays häufig aus mono- oder polyklonalen Antikörpern, exprimierten oder aufgereinigten Proteinen oder synthetisierten Peptid-Epitopen.
Die Erkennung der Zielmoleküle in den aufgebrachten Lösungen (Gewebe- oder Zellextrakte, Seren, usw.) erfolgt durch hochselektive biospezifische Wechselwirkung. Die
Detektion erfolgt bei DNA-Microarrays direkt über markierte DNA-Targetmoleküle;
bei Protein-Microarrays wird der oberflächen-
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gebundene Analytkomplex üblicherweise
durch Zugabe eines zusätzlichen zweiten fluoreszenzmarkierten Detektions-Antikörpers
im Sandwich-Assay-Format nachgewiesen.
Bei Reverse Microarrays werden Zell- oder
Gewebeextraktproben, die Zellproteine als
potentielle Analyten enthalten, in Form eines
Arrays auf den Chip aufgebracht. Bei diesem
Arraytyp werden die Analysenproben gespottet und anschließend in jeder Probe einer
oder mehrer Analyten quantitativ bestimmt.
Dies erfolgt mit einem analytspezifischen,
fluoreszenzmarkierten Antikörper aus einer
wäßrigen Lösung. Im Gegensatz zum Sandwich-Assayformat bei Capture-Microarrays
wird beim Reverse Microarray nur ein Antikörper zur Detektion benötigt und damit der
Aufwand deutlich reduziert, der mit der Herstellung hochspezifischer Antikörperpaare
verbunden ist. Bei Reverse Microarrays ist
eine hohe Empfindlichkeit der eingesetzten
Detektionstechnologie besonders wichtig, da
im Gegensatz zu den Capture-Microarrays
keine Anreicherung der Analyten auf der
Oberfläche erfolgt. Reverse Microarrays erlauben also die gleichzeitige Untersuchung
einer großen Probenzahl auf die Anwesenheit eines oder mehrerer gesuchter Biomarker, wobei von jeder Probe nur kleinste Volumina eingesetzt werden müssen. Es stehen
dabei generell alle Proteine des Zellproteoms
als mögliche Analyten zur Verfügung.
DNA-Microarrays – der Zugang zu
„verborgener“ Information
Zeptosens stellt DNA-Microarrays mit bis zu
1.000 verschiedenen Genen pro Chip unter
dem Markennamen SensiChipTM her. Diese
werden mit dem dazugehörigen SensiChipTM
Reader und der Auswertesoftware SensiChipTM View exklusiv vom Partnerunternehmen QIAGEN3 vertrieben. Unter Verwendung speziell angepaßter Pufferlösungen und
Hybridisierungsbedingungen lassen sich
auch niedrigst konzentrierte mRNAs („low
abundant genes“) ohne enzymatische Verstärkung der Zielmoleküle wie etwa durch
PCR oder T7 direkt aus Proben, die 1 µg
Total-RNA enthalten, messen und damit
mögliche Fehler durch die Verstärkung vermeiden (Abb. 5).
Protein-Microarrays4-6
Im Gegensatz zu DNA-Microarrays, bei denen nur eine einzige Molekülklasse auf der
Chipoberfläche immobilisiert wird, ist die
Variationsbreite möglicher – zur biomolekularen Erkennung nutzbarer – Moleküle bei
den Protein-Microarrays sehr viel breiter. Eine
besondere Herausforderung besteht darin,
die Vielfalt an unterschiedlich stabilen Proteinspecies von Antikörpern über Peptide, Enzyme, bis hin zu sehr empfindlichen zellmembranständigen Rezeptoren auf der Chip|transkript LABORWELT
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oberfläche in hoher und zugänglicher Dichte
zu immobilisieren und sie gleichzeitig in einer möglichst funktionellen Form zu erhalten (Abb. 6).
Für diese verschiedenen Anwendungsbereiche hat Zeptosens spezielle Oberflächen entwickelt, zum Beispiel auf Basis selbstorganisierender monomolekulerer Schichten (sogenannte self-assembled monolayers, SAM) aus
Alkylphosphaten7. Diese monomolekularen
Schichten sind sehr homogen und geordnet
und können durch Funktionalisierung der
Alkylenden an spezifische Anforderungen
der Erkennungselemente angepaßt werden.
Die Oberflächen erlauben es etwa, Proteine
sowohl adsorptiv (z.B. Antikörper) als auch
funktionell gerichtet (z.B. His-Tag-Proteine)
auf der ausgewählten Chipoberfläche zu immobilisieren.
Abb. 5: Bestimmung der RNA-Expression aus etwa 100 ng mRNA (Maus). Links: Auswertung mittels
PWG-Technologie. Rechts: Auswertung mit einem konventionellen Fluoreszenzscanner. Mitte: Gegenüberstellung der Intensitätsprofile.
A
B
Des weiteren werden Coploymere auf der
Basis von Polyethylenglykol (PEG) und Polylysin verwendet, das beipielsweise endständige Biotingruppen trägt. Längenoptimiertes PEG garantiert einerseits die gute Zugänglichkeit der Biotingruppen und minimiert gleichzeitig die unerwünschte unspezifische Adsorption von Proteinen aus biologischen Matrices. Dies erlaubt sehr empfindliche und spezifische Messungen von Analyten aus Serum, Zell- oder Gewebeextrakten
ohne große zusätzliche Aufreinigung.
Die zielgerichtete optimale Anpassung einer
Oberfläche an die speziellen Anforderungen
eines Assays und der vorliegenden Matrix
zeigt selbst bei der Messung mit konventionellen Scannern das große Potential der Verbesserung der Nachweisgrenzen auf (Abb. 7). Die
Kombination einer optimierten Oberfläche mit
der PWG-Technologie zeigt die vollen Möglichkeiten des Zeptosens-Verfahrens.
Antikörper-Microarrays – für die
Expressionsanalyse und
Validierung von Markerproteinen
Antikörper-Microarrays werden benutzt, um
parallel die Expression einer größeren Anzahl
definierter Zielproteine zu erfassenso zum
Beispiel von Markersubstanzen, die karzinogene Gewebeveränderungen, Veränderungen
des Metabolismus oder toxische Effekte als
Folge der Verabreichung pharmakologischer
Wirksubstanzen widerspiegeln. Diese Messungen müssen schnell und effizient quantitative Aussagen – auch bei komplexen Matrices
wie Serumproben aus präklinischen Studien –
liefern und tragen entscheidend dazu bei, die
Entwicklung neuer Medikamente ressourcensparender zu gestalten.
Die Miniaturisierung herkömmlicher Mikrotiterplatten zu Microarrays erlaubt die Messung der Analyten auf mehreren CaptureSpots des Microarrays und damit eine erste
statistische Mittelung der Resultate. Neben
den spezifischen Capture-Antikörpern können auch Referenzproteine auf einen Mic|transkript LABORWELT
Abb. 6: Aufbauschemata von Zeptosens‘ Protein-Microarrays im Capture Array-Format:
A. Antikörper-Array (links): Drei verschiedene Capture-Antikörper (drei Spotbereiche schematisch
angedeutet in rot, grün, blau) adsorptiv aufgetragen auf einer hydrophoben ZeptoCHIP-Oberfläche;
Messung (unten): Es können parallel mehrere „low abundance“-Marker (Signaltransduktionsmarker, Zytokine, usw.) gleichzeitig in einer Probe (z.B. Serum, Zelllysat) quantifiziert werden. Das Array wird inkubiert mit einer Mischung von markerhaltiger Probe und den Detektionsantikörpern für
die selektierten Analyten (rot, grün, blau).
B. Peptid-Array (oben): Drei verschiedene Peptidepitope (3 Spotbereiche schematisch angedeutet in
rot, grün, blau) gerichtet und kovalent fixiert über ein Ankermolekül (Streptavidin) auf einer biotinylierten ZeptoCHIP-Oberfläche; Messung (unten): Es können eine Vielzahl von Seren auf epitopspezifische Antikörper hin untersucht werden. Das Array wird zuerst mit Serum inkubiert; nach einem
Waschschritt wird ein fluoreszenzmarkierter Detektionsantikörper appliziert, der die Fc-Bereiche der
Analytantikörper speziesspezifisch erkennt. In beiden Fällen (A) und (B) wird mittels eines Sandwich-Assay-Formates detektiert.
roarray aufgebracht werden, die Chip- und
Geräte-spezifische Parameter sowie biologische Effekte der eingesetzten Proben berücksichtigen. Die Vielzahl von Referenzierungsmöglichkeiten erlaubt es, die Messungen sehr
präzise durchzuführen und trotz der kleinen
Probevolumina sehr zuverlässige Resultate
zu erhalten. In Abbildung 8 werden die Er-
gebnisse einer Parallelbestimmung von mehreren Markern anhand der Signal-Dosis-Meßkurven und der Präzisionsprofile von drei
Zytokinen in einer Fünffach-Bestimmung mit
Zeptosens-Antikörperarrays gezeigt. Die
Konzentrationsbestimmung geschieht durch
den Vergleich mit Standardsignalkurven, die
mit Hilfe definierter Mischungen der ver-
Abb. 7: Einfluß der Oberflächenchemie auf die Nachweisgrenzen – hier dargestellt als Detektionsgrenzen
β
für das Zytokin IL-1β
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Abb. 8: ZytokinMicroarrays –
Mehrfachbestimmung
von Markersubstanzen
in Serum.
schiedenen Analyten in unterschiedlicher
Konzentration generiert wurden. Mit Hilfe
dieses Verfahrens können diese Markersubstanzen für Entzündungsprozesse bis zu einer Konzentration von nur 1 bis10 pg/ml in
Serum gemessen werden. Diese Microarrays
zeichnen sich durch eine sehr geringe unspezifische Bindung der Nachweisantikörper,
sehr schwache Hintergrundsignale, keine
Kreuzreaktivitäten und eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Spotsignale mit Variationen von 5 bis 10 % aus und erlauben deshalb
sehr empfindliche Messungen auch in Anwesenheit von Serummatrix. Es kann davon
ausgegangen werden, daß bei Vorliegen hochspezifischer Antikörper 20 Analyten mit derselben Präzision auf Microarrays gemessen
werden können.
Peptid-Microarrays – für die
Entwicklung neuer Impfstoffe
Die richtige Identifizierung und Charakterisierung immunogener Peptidsequenzen ist
ein wesentlicher Bestandteil bei der Entwick-
lung neuer Impfstoffe. Durch die Kombination neuer genomischer Ansätze mit effektiven, parallel arbeitenden Analysemethoden
beim Screenen von Personenseren können
solche Impfstoffe schneller gefunden und
entwickelt werden. Peptid-Microarrays bieten eine Möglichkeit für eine effiziente Analyseplattform bei der Entwicklung solcher
Impfstoffe (Zusammenarbeit mit Intercell AG,
Wien8).
Biotinylierte Peptid-Epitope werden über
Anbinden eines spezifischen Ankermoleküls
(z.B. Streptavidin) in Form von Microarrays
auf Biotin-terminierte ZeptoCHIPsTM aufgebracht. Humanseren werden in Verdünnungsreihen mit den Peptidarrays inkubiert
und so Bindungsprofile der serenspezifischen
Antikörper gegen die oberflächenimmobilisierten Peptid-Epitope erstellt. Aus den Signalen nach Inkubation mit Verdünnungsreihen der Seren können die Titer der jeweiligen
Serenantikörper bestimmt werden. Die von
Zeptosens entwickelte Oberflächenchemie
trägt wesentlich dazu bei, die spezifische Bindung und die Zugänglichkeit der Antikörper
T
zu den Epitopen zu fördern. Durch die zusätzlich stark unterdrückte, unspezifische
Bindung von Serumproteinen an die Chipoberfläche konnte eine sehr hohe Detektionsempfindlichkeit erreicht werden – teilweise
bis zu Faktor 30 höher als in konventionellen
Peptid-ELISAs. Diese Empfindlichkeit erlaubt
es, auch sehr kleine relative Änderungen der
Bindungsprofile nachzuweisen. Abbildung 9
zeigt typische Signalbilder einer Serumverdünnungsreihe (1:1000 bis 1:30000) auf einem ZeptoCHIP™ mit sechs Arrays. Aus den
jeweiligen Verdünnungskurven wurden die
Serumtiter für die entsprechenden Peptide
ermittelt. Zur Zeit können bis zu 250 Peptide
im Duplikat in die Zeptosens-Microarrays
integriert werden.
Fazit
Die von der Zeptosens AG entwickelte Kombination der Microarray-Technologie mit der
Planaren Wellenleitertechnologie ermöglicht
es, die für aussagekräftige Untersuchungen
erforderlichen Mengen an biologischem Material und den damit verbundenen Aufarbeitungsaufwand deutlich zu senken. Die
durch rein optische Prinzipien sowie durch
konsequente Verfahrensoptimierung begründete Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit vermeidet die sonst oft mit chemischen oder biochemischen/molekularbiologischen Signalverstärkungsmethoden
einhergehenden Signalverfälschungen.
Literatur
[1] E.S. Lander et al., Initial sequencing and analysis
of the human genome, Nature 409, 860–921 (2001)
[2] J.C. Venter et al., The sequence of the human genome, Science 291, 1304-135 (2001)
[3] SensiChipTM Array Detection System.
www.qiagen.com
[4] H. Zhu et al., Global Analysis of Protein Activities
Using Proteome Chips, Science 293, 2101–2105
(2001)
[5] M.F. Templin et al., Protein Microarray Technology, Trends Biotechnol. 20, 160-166 (2002)
[6] M. Pawlak et al., Zeptosens’ protein microarrays:
A novel high performance microarray platform for low
abundance protein analysis, Proteomics 2(4), 383393 (2002)
[7] M. Textor et al., Structural Chemistry on Self-Assembled Monolayers of Octadecylphosphoric Acid on
Tantalum Oxide Surfaces, Langmuir 16, 3257 – 3271
(2000)
[8] Intercell entwickelt prophylaktische und therapeutische Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten und
Krebs. www.intercell.com.
Korrespondenzadresse
Abb. 9: Serie von sechs identischen ZeptoCHIP™ Peptid-Arrays, die mit unterschiedlichen Verdünnungen menschlichen Serums inkubiert wurden. Aus den Verdünnungskurven lassen sich die Titer der
Seren für eine Vielzahl von Peptid-Epitopen gleichzeitig quantitativ bestimmen. Rechts gezeigt ist die
Verdünnungskurve eines einzelnen Peptids.
48 | Nr. III/2002
Zeptosens AG
Benkenstraße 254
CH-4108 Witterswil
Tel.: +41-61-726 8181
Fax: +41-61-726 8171
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Kennziffer 33 LW 03
Kennziffer 35 LW 03
ArabidopsisMicroarray-Kit
Slides und Cus- Modifizierte Oligonukleotide
tom-Arrays für Thermo Hybaid hat seine Palet- Darüber hinaus kann auf Kunte an fluoreszenzmarkierten Olidenwunsch – auch per onlinereproduzierbare gonukleotiden durch zwei Li- Order (Oligonukleotide) – fast
zenz-Verträge komplettiert. Für
den Bereich DNA-SequenzieDNA-Analysen
rung bietet das Biotech-Unter-
Einen Microarray-Kit mit
14.800 spezifischen Sequenzen
der Modellpflanze Arabidopsis
thaliana aus öffentlichen Datenbanken haben die Unternehmen Agilent Technologies und
Paradigm Genetics Anfang Juli
vorgestellt. Der mit 60meren
bestückte Standard-Objektträger ermöglicht ein genomweites High-Content-Screening.
Die aktivierten Glas-Slides der
Picorapid GmbH für Microarray-Analysen eignen sich
wegen ihrer außergewöhnlich
homogenen Oberfläche nicht
nur für den Einsatz in der For-
Kennziffer 34 LW 03
Neuer Protein
Microarray-Kit
FAST™ PAK 2
Mit dem neuen Protein Microarray Kit „Fast Pak 2“ von
Schleicher & Schuell BioScience
können jetzt zwei verschiedene
Microarrays oder Proben auf einem einzigen Slide untersucht
werden. Die Slides haben zwei
getrennte Pads von 20 x 20 mm
und die passenden Inkubationskammern (siehe Bild), was
eine parallele Ergebnisauswertung ermöglich. Protein Microarrays auf FAST-Slides sind für
Original FAST Slide und Inkubationskammer (links). FAST PAK 2
Slides und Inkubationskammer
(rechts)
mindestens 22 Monate stabil,
wenn die Proben mit dem speziell entwickelten FAST PAK
Array-Puffer aufgetragen werden. Durch die dreidimensionale Nitrocellulose-Beschichtung
ist die Signalstärke und die
Spot-Morphologie reproduzierbar – von Slide zu Slide und
von Pad zu Pad. Der Kit kann
in Kombination mit vorhandenen Arrayern und Scannern
verwendet werden. Nachweise
sind mit Fluoreszenz, Chemolumineszenz, Colorimetrie oder
Radioaktivität möglich.
|transkript LABORWELT
schung, sondern auch für diagnostische und bioanalytische
Anwendungen. Die Isothiocyanat-aktivierte Oberfläche der
PicoSlides™, auf der aminomodifizierte Oligonukleotide,
cDNAs etc. kovalent fest gebunden werden, wird in einem
standardisierten, qualitätskontrollierten Verfahren unter
Reinraumbedingungen hergestellt. Mit einem speziellen Laserverfahren können PicoSlides™ mit einem Zahlen-, DataMatrix- oder Barcode versehen werden, der gegen Hybridisierungslösungen resistent
ist.
Pico-Slides™ bilden die Basis
für Picorapids leistungsfähigen
Custom-Array-Service (PicoArrays™). Ein zum Patent angemeldetes, kontaktfreies PiezoSpottingverfahren gewährleistet die Dosierung strikt standardisierter Volumina, was zu äußerst homogenen Spots führt,
die eine präzise Signalquantifizierung ermöglichen. Zusammen mit der hohen Oberflächenqualität der PicoSlides™
wird so eine optimale Intraund Interarray-Reproduzierbarkeit erreicht. Das niedrige
Hintergrundsignal und die
hohe Bindungskapazität der
Pico-Slides™ gewährleisten ein
großes Signal-/Rauschverhältnis und höchste Sensitivität bei
der Microarray-Analyse.
Kennziffer 36 LW 03
nehmen ab sofort Oligo-Markierungen mit den FluoreszenzFarbstoffen IRDye™700 und IRDye™800 der Firma Li-Cor, Inc.
an. Ein weiteres Abkommen für
die Real-Time-PCR wurde mit
Biosearch Technologies, Inc. getroffen. Thermo Hybaid liefert
als besondere Modifikation jetzt
auch doppelt-markierte DNASonden mit den Black-HoleQuenchern BHQ1, BHQ2 und
BHQ3. Damit bietet Thermo Hybaid mehr als dreißig StandardFarbstoffmodifikationen an.
jede Fluoreszenz-Markierung
synthetisiert werden. Die Oligonukleotide sind RP-HPLCgereinigt und werden mit Qualitätszertifikat ausgeliefert.
Kennziffer 37 LW 03
SNP-Assays-on-Demand
Funktionell validierte Assays
speziell für das genetische
Screening mit hohem Durchsatz
hat das Unternehmen Applied
Biosystems vor kurzem auf den
Markt gebracht.
Von positiven Erfahrungen berichtet Prof. Dr. Stefan Schreiber, Kieler Koordinator des Nationalen Genomforschungsnetzes, der die Assays zur Mutationsidentifizierung getestet hat:
„Statt monatelang genomische
Daten durchzugehen und eigene Assays zu entwickeln, konnten wir zwei bis drei Wochen
nach Bestellung der Assays-on-
Demand mit unseren Studien
beginnen.“
Bisher hat Applied Biosystems
77.000 Assays für die SNP-Genotypisierung und 9.200 Assays
für die quantitative Genexpressionsanalyse freigegeben.
Kennziffer 38 LW 03
Non-enzymatic RNA labeling
PerkinElmer Life Sciences has
introduced a fast, easy-to-use
RNA Labeling Kit. The
MICROMAX ASAP RNA Labeling Kit is the only complete kit
for direct labeling of RNA using
novel non-enzymatic ULS (Universal Linkage System) technology for carrying out differential
gene expression assays.
Allowing researchers to investigate the in situ RNA instead of a
copy unlike current direct enzy-
matic protocols incorporating
cyanine nucleotides or the amino allyl enzymatic labeling protocols, MICROMAX ASAP provides a faster, less complex procedure, easily be carried out by
first-time users.
The MICROMAX ASAP RNA
Labeling Kit (MPS544) contains
enough labeling reagents and
hybridization buffer for the dual
fluorescence detection of 25
glass microarray experiments.
Nr. III/2002 | 49
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Kennziffer 39 LW 03
Protein-Microarrays ohne Chip-Spotter herstellen
Die CHIMERA BIOTEC GmbH,
Dortmund (www.chimerabiotec.de), hat mit der DDI-Technologie (DNA-Directed-Immobilization) eine innovative Plattform zur hochparallelen Immobilisierung von Proteinen entwickelt. Die DDI-Methode ermöglicht eine auf Selbstorganisation beruhende, sehr milde
Kupplung beliebiger Proteine
auf festen Substraten (Glas-,
Kunstoff- oder Metalloberflächen), bei der die maximale biologische Aktivität der Proteine
erhalten bleibt. Gegenüber herkömmlichen Methoden zur Protein-Immobilisierung ergeben
sich eine ganze Reihe von Vorteilen. Mit der DDI-Technologie
können Proteinarrays mit einem
Kit-System ohne teuren Microarrayspotter vom Anwender
selbst „just-in-time“ hergestellt
werden. Das Kit enthält neben
einem etablierten und gut lager-
Impressum
Die Themenhefte LABORWELT
erscheinen zweimonatlich im
Verlag der
BIOCOM AG
Stralsunder Str. 58-59
D- 13355 Berlin
Tel. 030/264921-50
Fax 030/264921-11
eMail: [email protected]
Internet: www.biocom.de
Redaktion:
Andrea Schneider (Chefredaktion)
Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk
Anzeigenleitung:
Oliver Schnell
Tel. 030/264921-45
eMail: [email protected]
Leserservice:
Tel. 030/264921-40
Graphik & Bildredaktion:
Heiko Fritz
Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehen in der inhaltlichen Verantwortung der Autoren. Alle Beiträge
sind urheberrechtlich geschützt.
Ohne schriftliche Genehmigung der
BIOCOM AG darf kein Teil in irgendeiner Form reproduziert oder mit
elektronischen Systemen verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet
werden.
© BIOCOM AG, Berlin
50 | Nr. III/2002
baren DNA-Chip die zu immobilisierenden Proteine, die mit
ausgewählten, zum Chip komplementären Nukleinsäure-Tags
modifiziert sind. Hierdurch entfällt nicht nur die häufig proble-
matische Lagerung der empfindlichen Proteinchips, sondern die DDI-gebundenen Proteine besitzen wegen des Nukleinsäure-Linkers auch eine außergewöhnlich hohe Aktivität.
assays. Darüber hinaus wird
die Produktlinie durch die Entwicklung kundenspezifischer
Arrays abgerundet.
Für die DDI-Technologie entwickelte CHIMERA eine neu-
artige Kupplungschemie für
die Herstellung von DNA-Arrays mit extrem hoher Bindungskapazität. So übertreffen
CHIMERAs 3D-Chips die Immobilisierungskapazität handelsüblicher Beschichtungen
um ein Vielfaches und gestatten darüber hinaus die Regenerierung und damit die Wiederverwendung der DNA- bzw.
DDI-Arrays ohne Verlust der
Bindungskapazität. CHIMERAs 3D-Technologie wird neben den DDI-Kits auch in
Form aktivierter Slides für Nukleinsäure- und Protein-Arrays
vermarktet. In CHIMERAs
Entwicklungspipeline befinden
sich derzeit verschiedene Spezialapplikationen,
beispielsweise maßgeschneiderte Oberflächen für Arrays
aus lipophilen Membranproteinen für das Wirkstoffscreening.
Kennziffer 40 LW 03
Kennziffer 41 LW 03
Kennziffer 42 LW 03
Data Mining
Genotyping
in a new light
geniom® one
CHIMERA entwickelt und vertreibt als weltweit einziger Anbieter standardisierte Kits zur
Anwendung selbstorganisierender Antikörper-Arrays für
parallelisierte Mikro-Immuno-
Immunoassay auf DDI-Basis: Oligonukleotid-markierte Antikörper werden
an einem DNA-Chip immobilisiert (a) und für einen ELISA verwendet (b,c).
Im Anschluß läßt sich der DNA-Chip regenerieren und für weitere Experimente verwenden.
Spezielle Anwendungsvorlagen
für die Genexpressionsanalyse
stellt der Software-Hersteller
SPSS Science auf der BIODIGITAL 2002 in Freiburg vor (Halle
2, Stand 550). In die neue Version 7.0 der Data Mining-Software „Celementine“ ist ein spezieller „Clementine Microarray
CAT“ optional eingebunden.
Das Programm Clementine wird
zur Untersuchung von Struktur/Aktivitäts-Beziehungen,
ADME/Tox-Verhalten und
Genexpressionsdaten eingesetzt.
Das Programm soll neben der
Clusteranalyse auch Voraussagen ermöglichen. Zur Erleichterung bestimmter Anwendungsroutinen bietet Clementine vorgefertigte Anwendungsvorlagen
(CATs), die mit neuen Daten
bestmögliches Data Mining ermöglichen. Der Microarray CAT
führt durch die grundlegenden
Schritte zur Analyse von Genexpressionsdaten – Datenvorbereitung, Feature-Selektion, Klassifizierung sowie Clustering und
Visualisierung.
The new PSQ™HS 96A System
from Pyrosequencing delivers
cost-efficient genotyping of
small amounts of sample DNA
(typically 5-10µl of PCR product). Multiplexing reduces
costs and increases throughput,
while in built automation supplies the system with up to ten
plates from the integrated stacker. Efficiency is further improved with the new Vacuum Prep
Tool, which delivers fast and
simple sample preparation. In
addition, as throughput needs
increase, it will be possible to
upgrade to a 384-format HS solution.
geniom® one integriert die Microarray-Produktion, Hybridisierung und Fluoreszenzdetektion. Standard- und CustomArrays mit individuellen Oligonukleotidsonden können innerhalb weniger Stunden durch in
situ-Synthese in jedem Labor
hergestellt und analysiert werden. Hochparallele Experimente zur Genexpression oder zur
Genotypisierung lassen sich somit zeit- und kostensparend,
flexibel und zuverlässig durchführen.
Mikrofluidische Verfahren bewirken eine effektive Hybridisierung und minimieren den
Verbrauch an Reagenzien und
Probenmaterial. Die direkte
Umsetzung von Sequenzdaten
und Sonden in digitale Arrays
ermöglicht, daß für alle sequenzierten Organismen Arrays
selbst entwickelt und hergestellt werden können.
Kennziffer 31 LW 03 Info ? |transkript LABORWELT