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Nr. 32 – 2 010 Eppendorf Research plus: die perfekte Pipette ® MixMate®: die Leichtigkeit des Mischens UVette® – Präzision in Kunststoff Anwenderbericht epMotion ® Detektion der -Gal actosidase-Aktivitä t im BioPhotome im Rahmen eines ter plus Hefe „Two-Hybrid -System“ Das BioPhotom eter plus bietet eine Vielzahl von Messmeth oden, die in dem Vorgängermodell BioPhotometer nicht möglich waren. Neben den Standard methoden wie Nukleinsäure, Protein und Zelldichteb estimmungen können nun auch die Einbaurate n von Fluores zenzfarbstoffen in Biomoleküle oder aber Enzymakti vitäten mittels End punktbestimmung ermittelt werden. Martin Armbrecht , Eppendorf AG Die sogenannt e βGalac tosidase (auch als Lactase bekannt) ist das essen zielle Enzym, das dem Menschen beim Verdauen von Milchzucke Abb.1: Reaktion der β -Galactosidase r (Lactose) BioPhotometer mit ONPG. Das plus bei 405 nm Spaltprodukt hilft. Fehlt dieses nachgewiesen ONP wird im . Enzym, kommt es zu der allgemein das künstliche bekannten Lactoseint Substrat ONPG (ortho ole ranz. Leider sind Nitrophenolβgalacto weder das Substrat side) verwendet . Lactose noch Dieses Molekül, die Produkte Galactose Hierfür stehen bei dem Glucose beim BioPhotom durch oder Glucose den gelben Farbstoff eter plus dazu geeignet, u.a. die Wellenläng orthoNitrophenol die Aktivi en 340 nm, 405 tät dieses Enzyms (ONP) ersetzt ist, nm und 490 nm zur photometrisch wird von dem zu Verfügung, wobei Enzym bestimmen, da ebenso erkannt, die keine Farbstoffu Aktivität des Enzyms wie das eigentliche mset mittels Faktor, zung mit dieser Substrat Lactose. Ein enzymatischen oder Mehrpunk Die Spaltprodu Spaltung tkalibrierung bestimmt kte von verbunden ist. ONPG sind βGalactos werden kann. e und ONP (Abb.1). Es ist aber auch möglich, nur die Extinktion Dies lässt sich Das Spaltprodu einer Probe zu aber umgehen, kt (ONP) der βGalacto ermit indem teln und daraus ein sidase kann im künstlich erzeugtes selbst die Berechnun BioPhotometer Substrat für die plus bei g durchzuführen. Reaktion verwendet 405 nm detektiert wird, in welchem werden. Für die Be ein Teil des eigentliche stimmung der Aktivität wird dann In diesem Artikel n Substrates soll ein Anwendun eine durch ein Farbstoffm Standardkurve gs beispiel für das mit definierten olekül ersetzt ONP BioPhotometer und durch die enzymatis Konzentrationen plus anhand des Enzyms programmiert, che Spaltung wie in βGalactosidase freigesetzt wird. Abb. 2 angedeute Am Beispiel der gezeigt werden. t. Die Programm ier βGalactosidase ebene erreicht wird statt Lactose man über die Taste Die Aktivität eines „Parameter“ (s. Enzyms wird danach a. UserGuide 33 [1]). bestimmt, wie schnell ein Substrat (so zusagen das Futter für das Enzym) in ein entsprechendes Produkt umgewan delt wird. Diese Umsatzrate kann sich einerseits auf die Substratum setzung oder andererse its auf die Produktbil A dung beziehen. Die Einheit heißt in dem Fall µmol/min oder abgekürzt B 1 U. Wie schnell das Enzym arbeitet, hängt von verschiede nen Faktoren ab, wie z.B. dem Enzym und Substrat selbst, der Substrat und Produktko C nzen tration, der Bindung des Substrates an die katalytisch D e Bindestelle im Enzym, usw. Um diese Aktivität photometr isch nachzuweisen, bedarf es eines ent sprechenden Tests. Dabei muss die Substratumsetzung bzw. Produkt E bildung mit einer Farbstoffzunahme verbunden sein, die im BioPhotom F eter Abb. 2: Programmierun plus photometr g der Standardkurve isch nachgewie der Messungen, . A) Festlegung C) Definition der sen der Methode, dauer schon mit einzelnen Standards werden kann. B) Bestimmung einbezogen, das (hier ist direkt der Anzahl die Januar 2010 (BN 32) erspart eine zusätzliche und Wiederholunge Standardkurve die Aktivität [U] , angeben und n Umrechnung im Display erscheint,F) erste Standardmess ung, wobei die Bezeichnung hinterher), D) Kalibrationsbesomit die Inkubationsder als nächstes reich, E) Nullwert zu messende des aktuell gemessenen Standard wird für Standards oben unten rechts im rechts Display angezeigt. Detektion der β-Galactosidase-Aktivität im BioPhotometer plus · Verbesserte Spermienisolierung mittels IMSI/TESE tip · Low volume real-time PCR mit Eppendorf Masterclear Cap Strips · etc. Application Support: Europe, International: Tel. +49 1803 666 789 · E-Mail: North America: support@eppend Tel. +1 800 645 3050 · E-Mail: orf.com Asia Pacific: Tel. techserv@eppen +60 3 8023 6869 dorf.com · E-Mail: support_ asiapacific@epp endorf.com Seite 1 Editorial IMPRESSUM Redaktion: Berrit Hoff (Projektleitung) Axel Jahns, Andrés Jarrin, Natascha Weiß Anschrift: Eppendorf AG, Barkhausenweg 1, 22339 Hamburg Telefon: (040) 53801-636 Fax: (040) 53801-840 E-Mail: [email protected] Liebe Leserin, lieber Leser! Internet: www.eppendorf.com Beiträge von Lesern sind willkommen. Für unverlangt eingesandte Manuskripte wird jedoch keine Verantwortung übernommen. Irrtum und technische Änderungen vorbehalten. Ihre Ansprechpartner: Es ist uns eine besondere Freude, Ihnen in dieser neuen BioNews-Ausgabe die Eppendorf Research® plus Pipettenfamilie vorzustellen. Diese neue Generation ultraleichter Einkanal- und Mehrkanal-Pipetten erfüllt höchste Anforderungen an Präzision und Genauigkeit – verbunden mit perfekter Ergonomie und einer in vielerlei Hinsicht verbesserten Flexibilität. Mehr dazu auf den Seiten 4-5! Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH Peter-Henlein-Str. 2 50389 Wesseling-Berzdorf Tel. 01803 - 255911 (9 Cent/Minute aus dem deutschen Festnetz) E-Mail: [email protected] Vertrieb Schweiz: Vaudaux-Eppendorf AG Wie die automatische Pipettierstation epMotion® im Klinikum rechts der Isar in München verlässlich und präzise ihren „Dienst“ absolviert, lesen Sie im Anwenderbericht von Christina Schott auf den Seiten 6-7. Auf den Seiten 12-13 stellen wir Ihnen außerdem CelliGen™ BLU vor, einen innovativen Zellkultur-Bioreaktor für den Einmalgebrauch aus dem Hause New Brunswick Scientific. New Brunswick Scientific ist seit 2007 Mitglied der Eppendorf Gruppe. New Brunswicks reichhaltige Produktpalette umfasst Instrumente für die Bereiche Zellkultur, -nachweis und -aufbewahrung. Wie immer erwarten Sie auch in diesem Heft ausführliche Application Notes, interessante Berichte und News und – natürlich – ein neues Gewinnspiel mit tollen Preisen. Im Kirschgarten 30, 4124 Schönenbuch/Basel, Schweiz Tel. (061) 4821414 E-Mail: [email protected] Vertrieb Österreich: Eppendorf Austria GmbH Ignaz-Köck-Straße 10, 1210 Wien, Österreich Tel. (01) 8901364 - 0 E-Mail: [email protected] Hinweis: Die Einführung von Produkten kann in verschiedenen Märkten zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgen. Wir beraten Sie gern. Copyright: Wir wünschen Ihnen einen tollen Start in das Jahr 2010! Alle Rechte vorbehalten, einschließlich der Grafiken und Bilder Ihr BioNews Redaktionsteam © Copyright by Eppendorf AG, Januar 2010. 2 BioNews Nr. 32 Inhalt 4 6 12 Im Blickpunkt Eppendorf Research® plus: die perfekte Pipette . . . . . . . . . . . . . . 4-5 Laborpraxis Anwenderbericht epMotion ® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6-7 UVette® – Präzision in Kunststoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 Die Leichtigkeit des Mischens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Die weitreichende Pipettenspitze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 News / Tipps Fit mit epServices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Mastercycler ® Performance Pläne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 Gewinnspielsieger zu Gast bei Eppendorf . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Mauro Costa-Mattioli und Simon Boulton in Hamburg . . . . . . . . . . . 11 Innovation CelliGen™ BLU: der Zellkultur-Bioreaktor für den Einmalgebrauch . . . . 12-13 Service Stets auf dem Laufenden mit dem Eppendorf E-Mail Newsletter . . . . . . 11 Gewinnspiel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Antwortfax / Literaturanforderung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Martin Armbrecht: Detektion der -Gal actosidase-Aktivitä t im BioPhotome im Rahmen eines ter plus Hefe „Two-Hybrid -System“ Martin Armbrecht , Eppendorf AG Das BioPhotom eter plus bietet eine Vielzahl von Messmeth Die sogenannt e βGalac oden, die in dem Vorgängermodell tosidase (auch als Lactase BioPhotometer nicht möglich waren. bekannt) ist das Neben den Standard essen methoden wie zielle Enzym, das Nukleinsäure, dem Protein und Zelldichteb Menschen beim estimmungen Verdauen können nun auch die Einbaurate von Milchzucke Abb.1: Reaktion der β -Galactosidase r (Lactose) n von Fluores BioPhotometer mit ONPG. Das plus bei 405 nm zenzfarbstoffen Spaltprodukt hilft. Fehlt dieses nachgewiesen ONP wird im in Biomoleküle . Enzym, kommt oder es zu aber Enzymakti der allgemein das künstliche vitäten mittels bekannten Lactoseint Substrat ONPG End (ortho ole punktbestimmung ranz. Leider sind Nitrophenolβgalacto ermittelt werden. weder das Substrat side) verwendet . Lactose noch Dieses Molekül, die Produkte Galactose Hierfür stehen bei dem Glucose beim BioPhotom durch oder Glucose den gelben Farbstoff eter plus dazu geeignet, u.a. die Wellenläng orthoNitrophenol die Aktivi en 340 nm, 405 tät dieses Enzyms (ONP) ersetzt ist, nm und 490 nm zur photometrisch wird von dem zu Verfügung, wobei Enzym bestimmen, da ebenso erkannt, die keine Farbstoffu Aktivität des Enzyms wie das eigentliche mset mittels Faktor, zung mit dieser Substrat Lactose. Ein enzymatischen oder Mehrpunk Die Spaltprodukte Spaltung tkalibrierung bestimmt von verbunden ist. ONPG sind βGalactos werden kann. e und ONP (Abb.1). Es ist aber auch möglich, nur die Extinktion Dies lässt sich Das Spaltprodu einer Probe zu aber umgehen, kt (ONP) der βGalacto ermit indem teln und daraus ein künstlich erzeugtes sidase kann im selbst die Berechnun BioPhotometer Substrat für die plus bei g durchzuführen. Reaktion verwendet 405 nm detektiert wird, in welchem werden. Für die Be ein Teil des eigentliche stimmung der Aktivität wird dann In diesem Artikel n Substrates soll ein Anwendun eine durch ein Farbstoffm Standardkurve gs beispiel für das mit definierten olekül ersetzt ONP BioPhotometer und durch die enzymatis Konzentrationen plus anhand des Enzyms programmiert, che Spaltung wie in βGalactosidase freigesetzt wird. Abb. 2 angedeute Am Beispiel der gezeigt werden. t. Die Programm ier βGalactosidase ebene erreicht wird statt Lactose man über die Taste Die Aktivität eines „Parameter“ (s. Enzyms wird danach a. UserGuide 33 [1]). bestimmt, wie schnell ein Substrat (so zusagen das Futter für das Enzym) in ein entsprechendes Produkt umgewan delt wird. Diese Umsatzrate kann sich einerseits auf die Substratum setzung oder andererse its auf die Produktbil A dung beziehen. Die Einheit heißt in dem Fall µmol/min oder abgekürzt B 1 U. Wie schnell das Enzym arbeitet, hängt von verschiede nen Faktoren ab, wie z.B. dem Enzym und Substrat selbst, der Substrat und Produktko C nzen tration, der Bindung des Substrates an die katalytisch D e Bindestelle im Enzym, usw. Um diese Aktivität photometr isch nachzuweisen, bedarf es eines ent sprechenden Tests. Dabei muss die Substratumsetzung bzw. Produkt E bildung mit einer Farbstoffzunahme verbunden sein, die im BioPhotom F eter Abb. 2: Programmierun plus photometr g der Standardkurve isch nachgewie der Messungen, . A) Festlegung C) Definition der sen der Methode, dauer schon mit einzelnen Standards werden kann. B) Bestimmung einbezogen, das (hier ist direkt der Anzahl die Januar 2010 (BN 32) Detektion der -Galactosidase-Aktivität im BioPhotometer plus im Rahmen eines Hefe „Two-Hybrid-System“ . . . . . . . . . . . . . . . 1-2 Markus Montag: Verbesserte Spermienisolierung aus testikulärem Spermienextrakt (TESE) . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4 Johannes Aubertin: Ein optimiertes gDNA-Sequenzierprotokoll für geringen Probenverbrauch und reduzierte Reagenzienkosten auf dem Mastercycler® pro . . . . . . . . 5-6 erspart eine zusätzliche und Wiederholunge Standardkurve die Aktivität [U] , angeben und n Umrechnung im Display erscheint,F) erste Standardmess ung, wobei die Bezeichnung hinterher), D) Kalibrationsbesomit die Inkubationsder als nächstes reich, E) Nullwert zu messende des aktuell gemessenen Standard wird für Standards oben unten rechts im rechts Display angezeigt. Application Support: Europe, International: Tel. +49 1803 666 789 · E-Mail: North America: support@eppend Tel. +1 800 645 3050 · E-Mail: orf.com Asia Pacific: Tel. techserv@eppen +60 3 8023 6869 dorf.com · E-Mail: support_ asiapacific@epp endorf.com Seite 1 Beate Riekens, Dieter Knofe, Martin Seippel: Low volume real-time PCR mit Eppendorf Masterclear Cap Strips . . . . . . 7-8 BioNews Nr. 32 3 Eppendorf Research® plus: die perfekte Pipette Im Blickpunkt Janine Jacobi, Eppendorf AG Eppendorf Research plus: die perfekte Pipette ® Was würden Sie sagen, wenn jemand Sie fragt, wofür Eppendorf Pipetten stehen? Höchstwahrscheinlich denken Sie zuerst an Qualität, Langlebigkeit, das PhysioCare Concept® und vielleicht sogar an die Erfindung der ersten Pipette. Die jahrzehntelange Historie der Eppendorf Pipetten begann 1961 mit dem Verkauf der ersten Kolbenhubpipette. Ergänzt durch perfekt passende Pipettenspitzen, Eppendorf Gefäße („Eppis“) und weitere Komponenten bildete das Eppendorf Mikroliter-System die erste ganzheitliche Problemlösung für das Labor. Seither hat Eppendorf immer wieder mit innovativen Produkten erfolgreich den Weg für wissenschaftlichen Fortschritt gebahnt und sich so seinen hervorragenden Ruf in der Branche erarbeitet. Raise the limits! Ein neuer Maßstab So auch bei der neuesten Entwicklung fekter Ergonomie und einer in vielerlei in der Pipettierung unserer Hamburger Pipettenschmiede: der Eppendorf Research® plus Pipetten- Hinsicht verbesserten Flexibilität. Wie familie! plus nach den strengen Regeln des PhysioCare Concept® entwickelt. Die ungebremste Innovationsfreude unserer Entwickler und Fertigungs spezialisten, der Einsatz von High-Tech- Diese neue Generation ultraleichter Materialien sowie modernste Produk- Einkanal- und Mehrkanalpipetten erfüllt tions- und Qualitätssicherungsverfahren höchste Anforderungen an Präzision setzen immer wieder neue Maßstäbe. und Genauigkeit – verbunden mit per- alle Pipetten wurde auch die Research Dieses steht für maximale Haltbarkeit, perfektes Gleichgewicht, intuitive Bedienung und minimalen Kraftaufwand des Benutzers. Ultraleicht, aber trotzdem robust! Je mehr Kraft Sie aufwenden müssen, besonders wenn Sie viel pipettieren, desto weniger Energie bleibt Ihnen. Deshalb haben wir alles daran gesetzt, das Gewicht der Research plus und die zu ihrer Betätigung erforderlichen Kräfte weiter zu reduzieren. Und das mit messbarem Erfolg: Die Research plus ist mit ihren 71 g (leichteste Version der Fixvolumen-Modelle) das reinste Leichtgewicht – und Ihr Garant für schonendes Arbeiten. Denn schon bei einem Gewichtsunterschied von z. B. 45 g summiert sich die wöchentliche Mehrbelastung auf Eppendorf Research ® plus: ganze 4,5 Tonnen (Basis: 500 Pipettier- • 10 variabel einstellbare Pipetten (Nennvolumen 0,1 µl bis 10 ml) vorgänge täglich, 5 Tage pro Woche, • 6 Mehrkanalpipetten (Nennvolumen 0,5 bis 300 µl) 200 Arbeitstage pro Jahr). Ein „gewich- Eppendorf Research® plus • Kennziffer 231 4 112,5 kg oder – aufs Jahr gesehen – auf • 12 Fixvolumenpipetten (Nennvolumen 10 µl bis 1000 µl) BioNews Nr. 32 tiges“ Argument für die ultraleichte Research plus. Eppendorf Research® plus: die perfekte Pipette Die neue Leichtigkeit der Research plus Im Blickpunkt Hart im Nehmen und flexibel! basiert auf dem Einsatz modernster Bei aller Leichtigkeit – die Research plus Werkstoffe, wie z. B. Fortron®, einem ist hart im Nehmen und ein verlässliches Hochleistungspolymer, das besonders Werkzeug für die tägliche Routine. Sie für stark mechanisch und thermisch ist so robust und sicher, dass Sie sie beanspruchte Formteile geeignet ist und schon bald nicht mehr missen wollen. zudem über eine sehr gute Chemikalien- Dabei ist sie höchst flexibel und für jede und Oxidationsbeständigkeit verfügt. Pipettierherausforderung zu haben. Es überrascht daher nicht, dass unsere Dank der Kundenjustage können Sie z. B. Spezialisten dieses innovative Material Ihre Research plus auf eine spezifische für die Konstruktion des neuen Eppendorf PerfectPiston® Kolben-Systems der Flüssigkeit justieren. Und zur Reinigung können Sie je nach Bedarf die gesamte Research plus ausgewählt haben. Im Pipette oder nur den unteren Teil auto- Zusammenspiel mit den übrigen Werk- klavieren. stoffen entstand so eine Pipette, deren Funktionalität und Haltbarkeit in strengen Last but not least, beeindruckt die wurde und den hohen Eppendorf Quali- Research plus auch durch ihr Design. tätsanforderungen unserer Pipettenkonstrukteure absolut gerecht wird. Die weitreichende Pipettenspitze Um in Zukunft bei Pipettierarbeiten mit konischen 15 ml Tubes, engen, tiefen Gefäßen oder hohen Platten noch bessere Ergebnisse zu ermöglichen und eventuelle Quer-Kontamination durch Berühren der Gefäßwände auf ein Minimum zu reduzieren, hat Eppendorf die 103 mm lange epT.I.P.S.® 50 –1.250 µl L Pipettenspitze entwickelt. Das Design? Ausgezeichnet! Dauertests auf Herz und Nieren geprüft News Kleinste Mengen können so nahezu rückstandslos vom Boden einer 96er- oder 384er-Deepwell Platte aufgenommen werden. Das fand auch die international besetzte Jury aus renommierten Designexperten, Verschwenden Sie keine Energie die die Research plus mit dem „red dot“ Nicht nur das geringe Gewicht sorgt für Design Award 2009 auszeichnete. eine angenehme Bedienung, auch die noch weiter minimierten Betätigungskräfte tragen maßgeblich dazu bei. Ein neuer verfederter Spitzenkonus* Größtmögliche Präzision und Richtig- sorgt für perfekten Spitzensitz und keit gemäß den Anforderungen der optimale Dichtigkeit bei minimalem Aufsteckdruck. Der Dosierknopf und der Neugierig geworden? ergonomisch perfekt platzierte Abwerfer sind nicht nur spürbar, sondern auch messbar leichter zu betätigen (s. Vergleich der Bedienkräfte in Tab. 1). EN ISO 8655 erreicht sie nachweislich in Kombination mit Eppendorf Fordern Sie per Kennziffer Ihren per Mehrkanalpipetten im Volumenbe- sönlichen Prospekt an oder besuchen reich 1.200 µl. Die neue Spitze ist in die Research plus Homepage Standard Qualität, sowie in den www.eppendorf.de/research-plus. Reinheitsgraden Biopur ® und PCR clean erhältlich. Einen noch größeren *Ausnahme: 5 ml und 10 ml Pipetten Schutz für Pipette und Probe bietet dieser Tip als Filterspitze ep Dualfilter Starting forces (1000 µl) Ending forces (1000 µl) Eppendorf Research® plus T.I.P.S.® 50 –1.250 µl L (PCR clean/ steril/pyrogenfrei), die sowohl für Competitor A den Einsatz in der PCR als auch für Competitor B Anwendungen in der Bakteriologie sowie für das Arbeiten im radioakti- Competitor C ven Bereich geeignet ist. Competitor D Mehr Informationen unter Competitor E www.eppendorf.de/consumables. Competitor F 1N 2N 4N 6N 8N 10 N 12 N 14 N Tab. 1: Die Pipettierkraft wurde zur Reduzierung der Belastung minimiert. epT.I.P.S.® 50-1.250 µl L • Kennziffer 232 BioNews Nr. 32 5 Anwenderbericht epMotion ® Laborpraxis Christina Schott, Klinikum rechts der Isar der TU München 1 Anwender bericht epMotion ® Über ein halbes Jahr ist er nun schon einer von uns – unser Pipettierroboter! Zugegebenermaßen stand ich der Anschaffung mit großer Skepsis gegenüber. Doch nun gefällt er mir sehr! Christina Schott (Mitte) mit ihren Kollegen im Forschungslabor der Pathologie der TU München am Klinikum rechts der Isar Nachdem unsere Arbeitsgruppe in der Die Proteinlysate müssen hierfür auf Quantifizierung nicht im Sättigungsbe- Pathologie am Klinikum rechts der Isar Nitrozellulose-beschichtete Objektträger reich zu liegen, ist es notwendig, Ver- eine Methode zur Extraktion von Protei- aufgetragen werden. Diesen Vorgang dünnungsreihen aufzuspotten. Diese nen aus fixiertem und in Paraffin einge- hatten wir bereits automatisiert und müssen in 96-Well- und sogar 384-Well- bettetem Material etabliert hatte, wollten somit in unserem Labor das „Roboter- Platten vorgelegt werden. wir diese im größeren Maßstab mittels zeitalter“ eingeläutet. Zum Beweis der Proteinarrays untersuchen. Antikörper-Spezifität und um für die Hier ist der Roboter klar im Vorteil, der unbeirrt seine Proben verteilt, wenn man Kollegen hat, die mitten im konzentrierten Pipettieren fragen: „Ist das so eine Platte, bei der man Dich nicht ansprechen darf?“ Mein Gruppenleiter hatte bereits im Internet nach Liquid-Handling-Systemen recherchiert und war bei seinen Recherchen auf die epMotion® gestoßen. Meine anfängliche Abwehrhaltung änderte sich bereits bei der ersten Software-Demonstration. Durch die bunte Farbcodierung war der Weg der Probe gut nachvollziehbar. Allerdings war ich noch immer skeptisch, ob die epMotion wirklich unseren besonderen Anforderungen gerecht werden würde. Schließlich mussten zwei Roboter aufeinander epMotion ® 5075 LH Besuchen Sie die epMotion ® im Internet unter www.epmotion.com. epMotion® 5075 • Kennziffer 189 6 BioNews Nr. 32 abgestimmt werden! Durch den festen Pinabstand unseres Proteinspotters sind wir auf ein komplexes Pipettierschema festgelegt. Außerdem arbeiten wir mit extrem schäumen- Anwenderbericht epMotion ® Laborpraxis News Fit mit epServices Konsistente Ergebnisse mit dem Eppendorf Validierungsservice Für den Validierungsprozess werden Standards genutzt, um die Spezifikationen eines bestimmten Verwendungszweckes für das installierte Eppendorf System oder die Applikation zu überprüfen. Mit den statistischen Analysedaten (z. B. Ergebnisse zur Bestätigung der Richtigkeit und der Präzision) sind epMotion ® an ihrem Standort in den Räumlichkeiten des Forschungsbereichs der Pathologie der TU München am Klinikum rechts der Isar Sie optimal für Ihre regulatorische Dokumentation und Audits vorbereitet. Zertifizierungsservices werden aus- den Reagenzien, was das Pipettieren Test hatte die epMotion bestanden! schließlich von Eppendorf Spezialisten exakter Mengen nicht einfach macht. Jetzt stand der Bestellung nichts mehr ausgeführt. Als Beweis, dass ein Pro- Doch gemeinsam mit dem Eppendorf im Wege … nun – bis auf die Freigabe zess sich immer noch im definierten Produktspezialisten, der diese Bezeich- der Drittmittelgelder! Kurz vor Jahres Zustand befindet, oder dass eine nung wirklich zu Recht trägt, haben wir ein ende 2008 war es dann soweit. Der umgebungsbedingte Veränderung für uns zugeschnittenes Programm erar- Roboter wurde pünktlich geliefert und keinen Effekt auf die Ergebnisqualität beitet und all diese Hürden genommen. am Folgetag installiert. hat, muss das System periodisch Durch die sehr gute Geräteeinweisung Die epMotion war nicht unser einziger u.a. einen PCR-Validierungsservice für vor Ort fiel die Methodenprogrammie- Zuwachs. Auch personell hat sich unsere den Mastercycler ® ep realplex an. Der rung leicht. Arbeitsgruppe vergrößert, und inzwi- Assay basiert auf einem qPCR-Test schen arbeiten wir zu dritt am Pipettier mit spezifisch designten Primern und roboter. Wir hatten bereits nach ca. einem DNA-Template, um alle wichti- 3 Wochen erste Ergebnisse. Und dem- gen Performance-Aspekte wie den nächst starten große Studien mit Kollek- dynamischen Bereich und die Repro- Die anschaulichen Befehl-Icons sowie die Labware werden einfach per „drag and drop“ positioniert. Praktisch sind außerdem der optische Sensor, temperierbare Arbeitsflächen sowie die Möglichkeit, die Methode vor dem Lauf auf Fehler zu überprüfen. tiven von 160 – 300 Proben. Fazit Ich kann dieses Gerät und den damit Ein paar Kleinigkeiten in der Software verbundenen Service nur weiter emp- könnten noch verbessert werden, wie fehlen. zum Beispiel die Einrichtung eines „undo-Buttons“. Wird nämlich beim Verteilungsmuster versehentlich ein falsches Feld markiert, muss wieder von vorne begonnen werden. Bevor wir uns zum Kauf entschieden, Für Forschungslabore mit mittlerem Probendurchsatz, Dienstleister im ArraySektor und die Pharmaindustrie ist die epMotion sicherlich von großem Nutzen. Ich möchte sie jedenfalls nicht mehr missen. stellen. Ich pipettierte parallel per Hand und verglich dann unser beider Verdünnungsreihen – und siehe da: auch diesen duzierbarkeit abzudecken. services for premium performance Ihr Vorteil: • Konstante Funktionstüchtigkeit des Systems • Vertrauen in die Ergebnisse • Testiertes System Für weitere Auskünfte sprechen Sie bitte Ihre Eppendorf Niederlassung an. Ausführliche Informationen finden Sie musste sich die epMotion noch dem Wettstreit „Mensch gegen Maschine“ revalidiert werden. Eppendorf bietet 1 Christina Schott auch im Supportbereich Ihrer lokalen Leitende TA an der TU München Eppendorf Homepage sowie unter Klinikum rechts der Isar www.eppendorf.com/epservices. Institut für Pathologie BioNews Nr. 32 7 UVette ® – Präzision in Kunststoff Laborpraxis Tanja Musiol, Eppendorf AG UVette – Präzision in Kunststoff News ® Mastercycler Performance Pläne ® Eine reproduzierbare PCR kann nur erreicht werden, wenn die vorgegebenen Die patentierte* Eppendorf UVette ist zudem einem Kapillareffekt entgegen, eine vollständig UV-transparente Ein- so dass auch das Minimalvolumen von weg-Küvette. Sie ist ein perfektes Bei- 50 µl reproduzierbar im Zentrum des spiel für die Erfahrung Eppendorfs im Messbereiches positioniert wird. ® Bereich der Entwicklung und Fertigung von hochqualitativen Consumables und eignet sich hervorragend für mit zwei unterschiedlichen Lichtwegen, die deutlich gekennzeichnet sind. Eine Die UVetten werden aus klarem Kunst- einfache Handbewegung – eine Drehung stoff gefertigt, welcher UV- und VIS- der UVette um 90° – ermöglicht die Wahl transparent ist und eine Lichtdurchläs- zwischen dem 10 mm und dem 2 mm sigkeit zwischen 220 nm und 1600 nm Lichtweg. die Möglichkeit, die Flüssigkeit in der UVette® von allen Seiten gut einzusehen und z. B. auf Luftbläschen zu kontrol lieren, welche das Messergebnis ver fälschen könnten. Die trichterförmige Gestaltung des Küvettenbodens wirkt * US-Patent 6,249,345 ganze Lebensdauer hinweg den HerPerformance Plan Services für Master- ermöglicht die Messung von Proben lich bieten die geöffneten Seitenwände tionen Ihres Thermocyclers über die stellervorschriften entsprechen. Mit den UV- und VIS-Bereich. daher leicht gesichtet werden. Zusätz- sicher, dass die entscheidenden Funk Drehung Die einzigartige Formgebung der UVette aufweist. Der Flüssigkeitsstand kann werden. Eine regelmäßige Wartung stellt Große Flexibilität durch eine kleine spektrophotometrische Messungen im Klare Sicht Temperaturprotokolle strikt eingehalten Wird während der Messung festgestellt, dass die Probenkonzentration so hoch ist, dass sie nicht mehr mit dem 10 mm Lichtweg gemessen werden kann, wird die UVette einfach um 90° gedreht und die Probe im 2 mm Lichtweg erneut gemessen. Also in derselben Küvette – ohne eine zusätzliche Verdünnung. Ist die Probe niedriger konzentriert als angenommen, kann umgekehrt vom cycler® sichern Sie sich ein Höchstmaß an Zuverlässigkeit für Ihren Cycler! Die Wartung beinhaltet eine professionelle Oberflächen- und Thermoblock reinigung, eine Prüfung aller Funk tionen, einen Stabilitätstest und eine Analyse der Gerätestatistik. Mit der Temperatur-Verifizierung von ausgewählten Well-Positionen nach nationalen und internationalen Standards und der Justierung der Blocktemperatur können Sie reproduzierbare, korrekte Ergebnisse sicherstellen. Die Betriebsqualifizierung (OQ) beinhaltet zusätzlich eine professionelle Reinigung und Inspektion aller internen Bauteile sowie eine elektrische Prüfung. services for premium performance 2 mm auf den 10 mm Lichtweg gewechselt werden. Die UVette deckt somit Die Performance Pläne bieten: flexibel Messungen innerhalb eines • Eppendorf Qualitätsstandard weiten Konzentrationsbereiches ab. • Maßgeschneiderte Serviceoptionen Weitere Informationen über die UVette® (z. B. die Chemikalienbeständigkeit oder • Vertrauen in Ihre Ergebnisse anderer Hersteller) finden Sie unter • Dauerhaft zuverlässige und Sie können sich auch gerne per E-Mail an unsere Hotline wenden unter: [email protected]. UVette ® • Kennziffer 108 BioNews Nr. 32 Ihre Vorteile: die Auswahl an Adaptern für Geräte www.eppendorf.de/uvette. 8 • Zertifizierte Serviceberichte reproduzierbare Resultate • GLP konformes, auditiertes System Mehr Infos unter www.eppendorf.com/epservices bzw. auf den lokalen Webseiten*. *Performance Pläne sind nur in ausgewählten Ländern erhältlich. Detektion der -Galactosidase-Aktivität im BioPhotometer plus im Rahmen eines Hefe „Two-Hybrid-System“ Martin Armbrecht, Eppendorf AG Das BioPhotometer plus bietet eine Die sogenannte β-Galac Vielzahl von Messmethoden, die in dem tosidase (auch als Lactase Vorgängermodell BioPhotometer nicht bekannt) ist das essen möglich waren. Neben den Standard zielle Enzym, das dem methoden wie Nukleinsäure-, Protein- Menschen beim Verdauen und Zelldichtebestimmungen können von Milchzucker (Lactose) nun auch die Einbauraten von Fluores- hilft. Fehlt dieses Enzym, kommt es zu das künstliche Substrat ONPG (ortho- zenzfarbstoffen in Biomoleküle oder der allgemein bekannten Lactoseintole- Nitrophenol-β-galactoside) verwendet. aber Enzymaktivitäten mittels End- ranz. Leider sind weder das Substrat Dieses Molekül, bei dem Glucose durch punktbestimmung ermittelt werden. Lactose noch die Produkte Galactose den gelben Farbstoff ortho-Nitrophenol oder Glucose dazu geeignet, die Aktivi- (ONP) ersetzt ist, wird von dem Enzym tät dieses Enzyms photometrisch zu ebenso erkannt wie das eigentliche bestimmen, da keine Farbstoffumset- Substrat Lactose. Die Spaltprodukte von zung mit dieser enzymatischen Spaltung ONPG sind β-Galactose und ONP (Abb.1). Hierfür stehen beim BioPhotometer plus u.a. die Wellenlängen 340 nm, 405 nm und 490 nm zur Verfügung, wobei die Aktivität des Enzyms mittels Faktor, Einoder Mehrpunktkalibrierung bestimmt Abb.1: Reaktion der β -Galactosidase mit ONPG. Das Spaltprodukt ONP wird im BioPhotometer plus bei 405 nm nachgewiesen. verbunden ist. Das Spaltprodukt (ONP) der β-Galacto werden kann. Es ist aber auch möglich, Dies lässt sich aber umgehen, indem sidase kann im BioPhotometer plus bei nur die Extinktion einer Probe zu ermit- ein künstlich erzeugtes Substrat für die 405 nm detektiert werden. Für die Be- teln und daraus selbst die Berechnung Reaktion verwendet wird, in welchem stimmung der Aktivität wird dann eine durchzuführen. ein Teil des eigentlichen Substrates Standardkurve mit definierten ONP- durch ein Farbstoffmolekül ersetzt und Konzentrationen programmiert, wie in durch die enzymatische Spaltung Abb. 2 angedeutet. Die Programmier freigesetzt wird. Am Beispiel der ebene erreicht man über die Taste β-Galactosidase wird statt Lactose „Parameter“ (s. a. UserGuide 33 [1]). In diesem Artikel soll ein Anwendungsbeispiel für das BioPhotometer plus anhand des Enzyms β-Galactosidase gezeigt werden. Die Aktivität eines Enzyms wird danach bestimmt, wie schnell ein Substrat (sozusagen das Futter für das Enzym) in ein entsprechendes Produkt umgewandelt wird. Diese Umsatzrate kann sich einerseits auf die Substratumsetzung oder andererseits auf die Produktbil- A B C D E F dung beziehen. Die Einheit heißt in dem Fall µmol/min oder abgekürzt 1 U. Wie schnell das Enzym arbeitet, hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z.B. dem Enzym und Substrat selbst, der Substrat- und Produktkonzen tration, der Bindung des Substrates an die katalytische Bindestelle im Enzym, usw. Um diese Aktivität photometrisch nachzuweisen, bedarf es eines ent sprechenden Tests. Dabei muss die Substratumsetzung bzw. Produkt bildung mit einer Farbstoffzunahme verbunden sein, die im BioPhotometer plus photometrisch nachgewiesen werden kann. Januar 2010 (BN 32) Abb. 2: Programmierung der Standardkurve. A) Festlegung der Methode, B) Bestimmung der Anzahl und Wiederholungen der Messungen, C) Definition der einzelnen Standards (hier ist direkt die Aktivität [U] angeben und somit die Inkubationsdauer schon mit einbezogen, das erspart eine zusätzliche Umrechnung hinterher), D) Kalibrationsbereich, E) Nullwert für die Standardkurve, F) erste Standardmessung, wobei die Bezeichnung des aktuell gemessenen Standards oben rechts im Display erscheint, der als nächstes zu messende Standard wird unten rechts im Display angezeigt. Application Support: Europe, International: Tel. +49 1803 666 789 · E-Mail: [email protected] North America: Tel. +1 800 645 3050 · E-Mail: [email protected] Asia Pacific: Tel. +60 3 8023 6869 · E-Mail: support_ [email protected] Seite 1 Detektion der -Galactosidase-Aktivität im BioPhotometer plus im Rahmen eines Hefe „Two-Hybrid-System“ Die Proben mit unbekannter β-Galac Abb. 3A: Keine Bindung erfolgt, β-Galactosidase wird nicht gebildet. tosidase-Aktivität werden für einen bestimmten Zeitraum mit ONPG inkubiert Prey AD und anschließend mit Natriumcarbonat gestoppt. Die Menge an gebildetem ONP kann dann in Relation zu der BD Standardkurve gesetzt und daraus die Enzymaktivität der β-Galactosidase ermittelt werden. lacZ UAS Diese künstlichen Substrate werden Gen für β-Galactosidase Upstream Activator Sequence auch für andere photometrische Akti vitätsbestimmungen verwendet, wie Abb. 3B: Bindung zwischen beiden Hybriden erfolgreich. Transkription erfolgt, β-Galactosidase wird gebildet. z. B. der Alkalischen Phosphatase (Substrat: para-nitrophenyl-Phosphat) Prey oder α-Glucosidase (Substrat: para- AD nitrophenyl-glucosid). Aufgrund der hohen spezifischen Aktivität wird die BD β-Galactosidase mit ONPG als Indikator verwendet, wie z. B. im sogenannten Yeast-Two-Hybrid-Detektionssystem [2]. UAS Hier geht es darum, sogenannte Bin- Upstream Activator Sequence dungspartner für ein bestimmtes Protein in Hefezellen zu identifizieren. Die zu lacZ Gen für β-Galactosidase Abb. 3: Schematische Darstellung der Interaktion im „Two-Hybrid-System“. untersuchenden Proteine müssen dabei nicht zwangsläufig aus der Hefe stam- partner (z. B. aus einer Genbank) werden BioPhotometer plus verfügt über eine men, sondern können auch aus anderen neben das Gen für die Aktivierungs übersichtliche Ergebnisdarstellung und Organismen stammen. domäne von Gal4 kloniert, damit auch eine klar verständliche Bedienung. hier beide Proteine koexpremiert werden Natürlich sind die Ergebnisse aus dem können. Der Hybrid mit der Bindedomä- Two-Hybrid-System nur ein erster Hin- ne von Gal4 gilt dabei als Köder („Bait“) weis, dass bestimmte Proteine in einem für den Hybrid mit der Aktivierungs Organismus miteinander in Wechselwir- domäne („Prey“). kung treten. Anschließend sind vertiefen- Um hier die Aktivität nachzuweisen, muss das Gen für die β-Galactosidase (lacZ) zunächst expremiert werden. Dafür muss man wissen, dass für die Expremierung von lacZ ein zusätzliches de Untersuchungen notwendig, um die Protein, Gal4, notwendig ist. Gal4 be- Erfolgt eine Bindung zwischen den bei- steht aus einer Bindedomäne und einer den Hybriden, wird die Expression von Aktivierungsdomäne. Bindet Gal4 an lacZ eingeleitet und die Aktivität der Literatur: einem bestimmten Bereich oberhalb β-Galactosidase kann bestimmt werden des lacZ Gens („Upstream Aktivierung (Abb. 3B). [1] Martin Armbrecht, UserGuide, Kolori metrische Bestimmung von Fructose über Standardkurven bei 490 nm im Eppendorf BioPhotometer plus Sequenz“ [UAS]), wird lacZ expremiert. Erfolgt keine Bindung wird auch keine β- Beim Yeast-Two-Hybrid-System liegen Galactosidase gebildet und der Aktivitäts- die Bindedomäne (BD) und Aktivatordo- test fällt somit negativ aus [2] (Abb. 3A). mäne (AD) auf zwei Vektoren getrennt Mit dieser Methode können relativ leicht voneinander vor. Bindungspartner für bestimmte Proteine Grob vereinfacht dargestellt, wird das ermittelt werden. Die Interaktion kann Gen des zu untersuchenden Proteins in über den enzymatischen Nachweis mittels einen Vektor direkt vor das Gen für die β-Galactosidase-Aktivität nachgewiesen Bindedomäne von Gal4 kloniert, so dass werden, indem das Spaltprodukt ortho- beide Proteine zusammen expremiert Nitrophenol (ONP) bei 405 nm photome- werden. Auch die potenziellen Bindungs- trisch gemessen wird. Das Eppendorf Seite 2 Ursache dafür zu herauszufinden [2]. [2] Christin Buro, Svenja Beckmann, Thomas Quack und Christoph G. Grevelding. Application Note, Photometrische Quantifizierung der β-Galactosidase-Aktivität zur Untersuchung relativer Interaktionsstärken von Signaltransduktionssproteinen aus Schistosoma mansoni im Eppendorf BioPhotometer plus (Zum Download verfügbar unter www.eppendorf.de/bn/biophotometerplus) Application Support: Europe, International: Tel. +49 1803 666 789 · E-Mail: [email protected] North America: Tel. +1 800 645 3050 · E-Mail: [email protected] Asia Pacific: Tel. +60 3 8023 6869 · E-Mail: support_ [email protected] Leserservice BioPhotometer plus • Kennziffer 221 (BN 32) Januar 2010 Verbesserte Spermienisolierung aus testikulärem Spermienextrakt (TESE) Markus Montag, Abteilung für Gynäkologische Endokrinologie & Reproduktionsmedizin, Universitätsklinikum Bonn zukünftige Anwendungen tiefgefroren Zusammenfassung Einer der Hauptgründe für Unfruchtbarkeit ist eine verminderte Spermienqualität. Bei den meisten Patienten mit beeinträchtigten Spermienparametern kann die intra- werden. Somit kann die hormonelle Stimulation der Frau beginnen, sobald die Anwesenheit von Spermien innerhalb der Hoden bestätigt wurde. Dieser Ansatz hilft, unnötige Hormonbehandlungen in zytoplasmatische Spermieninjektion das Fällen, in denen die Spermienisolierung grundlegende Problem lösen, vorausge- nicht erfolgreich verläuft, zu vermeiden. setzt, dass bewegliche Spermatozoen im Ejakulat vorhanden sind. In Fällen von Azoospermie können die Spermien aus Es wird geschätzt, dass ca. 10 % aller Zyklen, in welchen ICSI angewandt wird, mit Spermatozoen aus Hodengewebe testikulärem Biopsiematerial gewonnen werden. Diese Application Note beschreibt durchgeführt werden. Material und Methoden Verglichen mit Standard-ICSI erfordert TESE zusätzliche Manipulationsschritte wie die Suche nach Spermatozoen, die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Spermien, sowie die erfolgreiche Spermiengewinnung aus der Gewebepräparation. Geeignete Instrumente tragen dazu bei, diesen Prozess so ökonomisch wie möglich zu gestalten. Geräte die Voraussetzungen und Arbeitsabläufe Obwohl die Injektion selbst wie bei einer Inversmikroskop mit Heizplatte und Hoffmann Kontrastobjektiven im Zusammenhang mit testikulärer Sper- Routine-ICSI-Behandlung mit ejakulierten mienextraktion. Spermien abläuft, ist die Isolierung von OCTAX Laser Shot™ System (Medical Technology Vertriebs-GmbH, Bruckberg) 2 TransferMan® NK2 Mikromanipulatoren (Eppendorf) Spermatozoen aus Hodengewebe von Einleitung CellTram® Air Mikroinjektor zum Halten des Embryos (Eppendorf) der Anzahl und der Qualität der Spermien Die Einführung der intrazytoplasma- im aufbereiteten Material abhängig. Da tischen Spermieninjektion (ICSI) 1992 testikuläre Spermien entweder unbeweg stellte einen Durchbruch in der Behand- lich oder nur mit beschränkter Motilität lung männlicher Unfruchtbarkeit dar [1]. ausgestattet sind, muss in einer speziell CellTram® vario Mikroinjektor zum Entfernen und für den Transfer des Polkörpers (Eppendorf) Verbrauchsmaterialien und Medien Leichtes Mineralöl (z.B. M-8410; Sigma-Aldrich, München) vorbereiteten Schale aktiv nach den Männer, deren Ejakulat nur wenige Flache Petrischalen, Zellkulturqualität (z.B. BD Falcon™ 351006; Becton Dickinson, Heidelberg) Spermien gesucht werden. Spermatozoen enthielt, konnten durch Injektion eines einzigen lebensfähigen Eppendorf bietet eine Reihe von Lösun Spermiums in eine Oozyte und nachfol- gen an, welche bei der einfachen und genden Embryotransfer ein Kind zeugen. erfolgreichen Isolierung von testikulären 1995 wurde ICSI auch bei Männern mit Spermatozoen behilflich sind – vom Mani- Azoospermie angewendet [2]. pulator mit individuell definierten Kapillar- Bei diesen Männern sind keine Spermatozoen im Ejakulat vorhanden, was entweder auf eine Blockade des Vas deferens (obstruktive Azoospermie) oder auf eine positionen bis zu speziellen Kapillaren für die effiziente Gewinnung von Spermien IMSI/TESE tip Transferkapillaren (Eppendorf) VacuTip Haltekapillaren (Eppendorf) TransferTip® (ICSI) Injektionskapillaren (Eppendorf) Kulturmedium (HEPES gepuffert, mit Antibiotika, Protein und Pyruvat versetzt) Vorbereitung der Mikroinjektionsplatte Das Erwärmen aller Medien und des Öls auch aus groben Gewebepräparationen auf 37 °C vor Arbeitsbeginn ist unerläss- zur anschließenden Injektion. lich. Ein Tröpfchen PVP und mehrere Tröpfchen Medium (10-50 µl) werden in beeinträchtigte testikuläre Spermien die Mitte der Petrischale gegeben. Zwei produktion zurückzuführen ist, bei der größere Tröpfchen (50-200 µl) könnten nur einige Bereiche innerhalb der Hoden zusätzlich für die Aufbewahrung der eine fokale Spermiogenese aufweisen Spermatozoen und/oder das Equilibrie- (nicht-obstruktive Azoospermie). ren der Kapillaren benötigt werden. Bei diesen Patienten kann durch einen Die Tröpfchen werden dann vollständig operativen Eingriff Hodengewebe entnom- mit leichtem Mineralöl abgedeckt, um men werden und die darin enthaltenen die Stabilität der Tröpfchen sowie die Spermatozoen können durch verschie- Temperatur und Osmolarität aufrechtzu- dene Methoden auf die nachfolgende erhalten. Sobald die Mikroinjektions Spermieninjektion vorbereitet werden. platte vorbereitet ist, kann sie – abhängig Im Normalfall kann das gewonnene vom verwendeten Medium – bis zum Gewebe oder die Spermiensuspension in mehrere Aliquots aufgeteilt und für Januar 2010 (BN 32) Abb. 1: Eppendorf Workstation auf einem Nikon Mikroskop mit OCTAX Laser Shot™ System eigentlichen Vorgang im Brutschrank verwahrt werden. Application Support: Europe, International: Tel. +49 1803 666 789 · E-Mail: [email protected] North America: Tel. +1 800 645 3050 · E-Mail: [email protected] Asia Pacific: Tel. +60 3 8023 6869 · E-Mail: support_ [email protected] Seite 3 Verbesserte Spermienisolierung aus testikulärem Spermienextrakt (TESE) Vorbereitung der Mikroinjektions Zellrückständen in einer Größenordnung gezielt wird, zeigt eine Veränderung der kapillaren bewegt, die die Identifikation von Sper- Schwanzgeometrie (z.B. Aufrollen) an, matozoen auf dem Schalenboden er- dass die Spermienmembran nach wie möglicht. Da testikuläre Spermien nicht vor intakt ist und das Spermium somit unbedingt beweglich sind, muss dem lebensfähig und für spätere Injektionen Suchvorgang besondere Aufmerksam- geeignet ist [4]. Die IMSI/TESE tip Mikrokapillare muss vor der Isolierung der Spermatozoen aus testikulärem Biopsiematerial eingestellt und equilibriert werden. keit geschenkt werden. Zunächst muss die Mikrokapillare in den Universalkapillarhalter eingesetzt werden, der über einen Druckschlauch mit dem Mikroinjektor verbunden ist. Wenn mit ölhaltigen Systemen gearbeitet wird (z.B. CellTram vario), müssen sämtliche Luftblasen aus dem System entfernt werden. Erst dann werden die Kapillaren vorsichtig durch die Dichtungsringe in die Halterung geschoben. Nachdem der Mikroinjektion und Beurteilung der Be- Sobald ein Spermium identifiziert wurde, fruchtung erfolgen im Wesentlichen wie kann die IMSI/TESE Kapillare in die Posi- in [5] detailliert beschrieben. Es wird tion 1 gefahren werden. Es wird empfoh- jedoch empfohlen, auch bei immotilen len, das Spermium mit dem Kopf zuerst Spermatozoen den Immobilisierungsvor- in die IMSI/TESE Kapillare zu saugen, da gang anzuwenden. Auch wenn es nicht dies effizienter ist und zudem den Anteil logisch scheint, immotile Spermatozoen an Zellrückständen, welche zusätzlich in zu immobilisieren, werden durch diese die Kapillare angesogen werden, reduziert Behandlung immotiler Spermien bessere (Abb. 2a-b). Fertilisierungsraten erzielt [5]. Universalkapillarhalter am X-Kopf des Korrespondierender Autor TransferMan NK2 befestigt worden ist, Markus Montag muss die Ausrichtung überprüft werden. Abteilung für Gynäkologische Endokrinologie & Reproduktionsmedizin Der Injektionswinkel kann mittels Rändel- Universitätsklinikum Bonn schraube und Winkelmarkierung des Sigmund-Freud-Str. 25 · D-53105 Bonn X-Kopfes individuell eingestellt werden. Tel: +49 228 287 15449 · Fax: +49 228 287 14651 Es ist wichtig, die Mikrokapillare vor dem E-mail: [email protected] Gebrauch mit Medium zu befüllen, so dass die Keimzellen niemals mit Luft oder Abb. 2a Literatur [1] Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Steirteghem Öl in Berührung geraten. Im Normalfall AC. Pregnancies after intracytoplasmic injection of wird die Equilibrierung mit ICSI-Medium single spermatozoon into an oocyte. Lancet durchgeführt. 1992 Jul 4;340(8810):17-8. [2] Tournaye H, Camus M, Goossens A, Liu J, Nagy P, Der TransferMan NK 2 kann bis zu drei Silber S, Van Steirteghem AC, Devroey P. Recent Positionen speichern. Die Kapillare kann concepts in the management of infertility because mit Hilfe eines Joysticks mühelos in jede of non-obstructive azoospermia. Hum Reprod. Richtung (x/y/z) bewegt werden. Per 1995 Oct;10 Suppl 1:115-9. Doppelklick auf den Joystick-Knopf, Abb. 2b kann die Kapillare in eine voreingestellte [3] Montag M, Rink K, Delacrétaz G, van der Ven H. The potential use of a laser-system for immobiliza- Position geführt werden. Normalerweise In Einzelfällen werden auch hoch motile tion of human spermatozoa and permeabilization of wird eine Position als Parkposition ein- Spermien gefunden. Da sich diese im the sperm plasma membrane. Hum Reprod. gestellt (Position 1). Diese ist etwas PVP-freien Medium sehr schnell bewegen, 15, 846-852 (2000). oberhalb des Tröpfchen positioniert, kann das Einfangen des Spermiums zwi- [4] Aktan TM, Montag M, Duman S, Gorkemli H, wodurch eine Zerstörung des Tröpfchens schen den anderen Zellen mit Schwierig- durch die Pipetten bei Bewegung der keiten verbunden sein. In diesem Fall Schale auf der Arbeitsfläche vermieden besteht die Möglichkeit, das Spermium wird. Eine zweite Position dient als „Ar- mittels eines einzigen Laserschusses beitsposition“, (Position 2). Diese wird in temporär zu immobilisieren, um so das der Fokalebene der Keimzellen gewählt. Ansaugen mit Hilfe der IMSI/TESE Kapil- verfügbar unter www.eppendorf.com/applications – lare zu erleichtern [3]. Im Fall von sehr CellTram) Spermiengewinnung but immotile spermatozoa. Andrologia. 2004 Dec;36(6):366-9. [5] Andrulat H, Voss S. Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) – Procedure and equipment. Eppendorf Application Note 09, June 2006 (zum Download unbeweglichen Spermien kann das Laser- Aufgrund der großen Volumina der Tröpf- system auch angewandt werden, um die chen, in denen nach Spermatozoen Lebensfähigkeit des Spermiums zu über- gesucht wird, kann die Dichte so einge- prüfen. Wenn ein einzelner Laserschuss stellt werden, dass sich die Menge an direkt auf den Schwanz des Spermiums Seite 4 Rink K, Yurdakul T. Use of a laser to detect viable Application Support: Europe, International: Tel. +49 1803 666 789 · E-Mail: [email protected] North America: Tel. +1 800 645 3050 · E-Mail: [email protected] Asia Pacific: Tel. +60 3 8023 6869 · E-Mail: support_ [email protected] Leserservice IMSI/TESE tip • Kennziffer 221 TransferMan® NK 2 • Kennziffer 164 CellTram® • Kennziffer 77 VacuTip/TransferTip® • Kennziffer 61 (BN 32) Januar 2010 Ein optimiertes gDNA-Sequenzierprotokoll für geringen Probenverbrauch und reduzierte Reagenzienkosten auf dem Mastercycler ® pro Johannes Aubertin1, 2 Institut Curie, Centre de Recherche, Paris, France; 2CNRS, UMR144, Paris, France 1 Einleitung Der herkömmliche Ablauf einer DNA- koll für DNA-Sequenzierung vor, welches von 15 min bei 37 °C und anschließend mit geringen Reaktionsvolumina für die 15 min bei 80 °C. PCR- und Sequenzierreaktion auf dem Sequenzierung besteht aus der Amplifi- Mastercycler pro funktioniert. Die PCR- kation einer bestimmten DNA-Sequenz, der Sequenzierreaktion und der Sequenzanalyse [1,2]. Geringer Proben- und Reagenzienverbrauch, stabile Reaktionsabläufe sowie einfache und schnelle Handhabung sind essenziell für ein opti- Reaktionen wurden jeweils in einem quenzierreaktion mit 0,1 μl des PCR-Pro- geführt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden danach mit Hilfe der Agarosegel- duktes pro 1 μl des gesamten Reaktionsvolumens mit dem BigDye® Terminator elektrophorese miteinander verglichen. v3.1 (Applied Biosystems, Darmstadt) Die Sequenzierreaktionen wurden jeweils Probenverbrauch ist erforderlich, wenn in 5 μl, 10 μl und 20 μl durchgeführt. mit wertvollem und limitiertem Material Anschließend wurde die Qualität der gearbeitet wird, wie z.B. Tumorgewebe Sequenzergebnisse vergleichend beurteilt. Material und Methoden Ein geringer Reagenzienverbrauch ge- Zunächst wurden die PCR-Produktkonzen- winnt bei hohem Durchsatz an Bedeutung, da die Kosten für Reagenzien schnell zum limitierenden Faktor werden können. Instabile Reaktionsabläufe beeinträchtigen die Qualität der Resultate und kosten Zeit, da fehlgeschlagene Sequenzierung von 8 verschiedenen Loci des IRS1-Gens an 95 Blasenkrebs- IRS1-Gens mittels PCR amplifiziert: proben durchgeführt, um die Robustheit ist eine Möglichkeit, um den Verbrauch 5’-TCCACCTCGGATTGTCTCTTC-3’ an Probenmaterial und Reagenzien zu Reverse-Primer vermindern. PCR- und Sequenzierreakti- 5’-GGGCATATAGTCTCCACTGCC-3’ PCR 2 PCR-Gefäßen bietet ein hohes Maß an Schutz vor Verdunstung; es werden jedoch besondere Verbrauchsmittel sowie ein „Heat Sealing“-Gerät benötigt. Mit dem neuen Mastercycler ® pro haben 674 bp-Fragment des IRS1-Gens: Forward-Primer mina, die getestet wurden, zu überprüfen (s. Application Note 212). Die Sequenz reaktionen wurden auf einem ABI Prism® 3130XL (Applied Biosystems) analysiert. Sämtliche temperaturabhängigen Inkubationen wurden auf einem Eppendorf Mastercycler ® pro durchgeführt. Ergebnisse und Diskussion Die Agarosegelanalyse der PCR-Pro- Reverse-Primer dukte ergab eine einzige Bande bei etwa 5’-GCTGGGTGTGCTTAAAGGATC-3’ 700 bp (Abb. 1). Die PCR wurde mit dem HotStarTaq® PCR Kit (Qiagen, Hilden) nach Hersteller- angaben in 50 μl, 20 μl und 10 μl Gesamt- M - PCR 1 PCR 2 10 µl 20 µl 50 µl 10 µl 20 µl 50 µl volumen mit einer Konzentration von 2 ng/μl gDNA durchgeführt. (Details zum sowie 1520 Sequenzreaktionen bei 95 PCR-Programm s. Application Note 212 gDNA-Proben aus Blasenkrebstumoren unter www.eppendorf.com/applications). > 700 bp — Aufreinigung des PCR-Produktes den Standard PCR-Platten verwendet, Films verschlossen wurden. Diese Appli- Nach Zugabe von 1 μl ExoSAP-It ® (USB Europe GmbH, Staufen) zu 5 μl des cation Note stellt ein optimiertes Proto- PCR-Produktes erfolgte eine Inkubation die mittels eines selbstklebenden PCR- Januar 2010 (BN 32) der Reaktionen in den geringsten Volu- 5’-CACAGAGATGATGCCTGCCTA-3’ wir 760 low volume PCR-Reaktionen durchgeführt. Für alle Reaktionen wur- auf 20 μl eingestellt. wurden zwei verschiedene Regionen des Forward-Primer Hitzeversiegelung („Heat Sealing“) von das Gesamtvolumen der Reaktionen mit Milli-Q® Wasser (Millipore, Schwalbach) den die Amplifikation und nachfolgende Die Reduzierung des Reaktionsvolumens aktion gegenüber Verdunstung. Die waren (s. Application Note 212), wurde volumina miteinander verglichen. Hierzu 699 bp-Fragment des IRS1-Gens: na erhöhen z.B. die Anfälligkeit der Re- Sequenzierreaktion abgeschlossen Nach diesen ersten Untersuchungen wur- individuell wiederholt werden müssen. Bedingungen. Geringe Reaktionsvolumi- Nachdem die Temperaturzyklen der ergebnisse der verschiedenen Reaktions- PCR 1 gute Ergebnisqualität jedoch stabile in 5 μl, 10 μl und 20 μl durchgeführt. trationen und die Qualität der Sequenzier- PCR-Läufe oder Sequenzierreaktionen onen benötigen für zuverlässige und Gemäß Herstellerangaben wurde die Se- Volumen von 10 μl, 20 μl und 50 μl durch- males Sequenzierprotokoll. Ein geringer oder forensischen Proben [3]. Sequenzierreaktion Abb. 1: Vergleich der PCR-Produktkonzentration mit Hilfe des Agarosegels. 5 μl des PCR-Produktes wurden auf ein 1,5 % Agarosegel aufgetragen. M = 100 bp Leiter, – = Negativkontrolle Application Support: Europe, International: Tel. +49 1803 666 789 · E-Mail: [email protected] North America: Tel. +1 800 645 3050 · E-Mail: [email protected] Asia Pacific: Tel. +60 3 8023 6869 · E-Mail: support_ [email protected] Seite 5 Ein optimiertes gDNA-Sequenzierprotokoll für geringen Probenverbrauch und reduzierte Reagenzienkosten auf dem Mastercycler ® pro Die Konzentrationen der PCR-Produkte eine Verringerung der absoluten Signal- Unser Sequenzierungsprojekt des hu- waren bei 10 μl, 20 μl und 50 μl Gesamt- intensität der Roh-Sequenzdaten festge- manen IRS1-Gens, welches in geringen reaktionsvolumen miteinander vergleich- stellt. Allerdings waren die Elektrophero- Probenvolumina durchgeführt wurde, bar. Lediglich bei 50 μl wurde eine leichte gramme der analysierten Ergebnisse aus ergab 760 PCR-Produkte und 1520 Abnahme der Konzentration festgestellt, den verschiedenen Volumina kaum zu Sequenzen. Da sämtliche Sequenzen was möglicherweise an der langsameren unterscheiden (Abb. 2). von guter Qualität waren und keine der Temperierung der Proben mit dem größ- Um die Robustheit der low volume PCR- ten Volumen liegen könnte. Die ausge- und Sequenzierreaktionen zu überprü- wählten PCR-Reaktionen deuten darauf fen, haben wir die gesamte kodierende hin, dass PCR-Reaktionen in 10 μl, 20 μl Region des IRS1-Gens (3720 bp) in 95 und 50 μl Gesamtreaktionsvolumen auf Reaktionen wiederholt werden musste, haben wir volles Vertrauen in die Robustheit der low volume PCR- und Sequenzierreaktionen auf dem Mastercycler pro. Blasenkrebsproben sequenziert. Insge- Mit der Durchführung dieses optimierten samt erhielten wir 1520 Sequenzen. Protokolls können die Kosten für PCR- Sämtliche Sequenzen konnten in allen Reagenzien sowie der Probenverbrauch 95 Blasenkrebsproben zweifelsfrei be- im Vergleich zu 20 μl Reaktionen halbiert Abb. 2 zeigt einen repräsentativen Aus- stimmt werden (Daten nicht gezeigt). Das werden. Die Reagenzienkosten für die schnitt von drei Elektropherogrammen. Sequenzierreaktionen können um 75 % Die Elektropherogramme, die von den Verschließen der Eppendorf twin.tec® PCR Plate 96 (skirted) mit einem selbst- 5 μl, 10 μl und 20 μl Sequenzierreakti- klebenden Film reichte aus, um Verdun- Reaktionsvolumen. onen erhalten wurden, sind vergleichbar stung systematisch zu vermeiden. Es (Abb. 2). Es wurden keine Unterschiede war auf dem Mastercycler pro nicht im Hintergrundsignal festgestellt. Mit erforderlich, die Probengefäße mittels abnehmendem Gesamtvolumen wurde Hitzeversiegelung zu verschließen. dem Mastercycler pro durchgeführt werden können, ohne dass die Konzentration des PCR-Produktes beeinträchtigt wird. reduziert werden, verglichen mit 20 μl Unsere Ergebnisse zeigen, dass PCRund Sequenzierreaktionen erfolgreich und mit großer Robustheit in geringen Reaktionsvolumina durchgeführt werden können, ohne dass die Qualität beeinträchtigt wird. Danksagung Wir danken Aurélie Herault für tech- PCR2 RVS 5 µl nischen Rat, François Radvanyi, Yves Allory und Thierry Lebret für ihre Unterstützung, sowie Laurence Tremolet für Sequenzanalyse und technischen Rat. Korrespondenz: [email protected] Literatur PCR2 RVS 10 µl [1] Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS 74: 5463–7. [2] Stoflet ES, Koeberl DD, Sarkar G, Sommer SS (1988). Genomic amplification with transcript sequencing. Science 239: 491-4. [3] Leclair B, Sgueglia JB, Wojtowicz PC, Juston AC, Fregeau CJ, Fourney RM (2003). STR DNA typing: increased sensitivity and efficient sample consump- PCR2 RVS 20 µl tion using reduced PCR reaction volumes. Journal of Forensic Science 48: 1001-13. Abb. 2: Repräsentativer Ausschnitt der Elektropherogramme der 5 μl, 10 μl und 20 μl Sequenzierreaktionen Seite 6 Application Support: Europe, International: Tel. +49 1803 666 789 · E-Mail: [email protected] North America: Tel. +1 800 645 3050 · E-Mail: [email protected] Asia Pacific: Tel. +60 3 8023 6869 · E-Mail: support_ [email protected] Leserservice Mastercycler ® pro • Kennziffer 224 Eppendorf twin.tec ® PCR Plates • Kennziffer 171 (BN 32) Januar 2010 Low volume real-time PCR mit Eppendorf Masterclear Cap Strips Beate Riekens, Eppendorf AG, Hamburg Dieter Knofe, Eppendorf Instrumente GmbH, Hamburg Martin Seippel, Eppendorf Polymere GmbH, Oldenburg/H. mit geringen Volumina und den damit Einleitung häufig verbundenen niedrigen Fluores- Aufgrund des stetig wachsenden Pro- Eppendorf Mastercycler ® ep realplex4 S mit folgendem Programm durchgeführt: zenzsignalen. benaufkommens in der PCR werden zunehmend PCR-Ansätze mit kleinen Material und Methoden Reaktionsvolumina durchgeführt. Diese Die Transmissionsmessung der Master- Vorgehensweise bietet den Vorteil, dass clear Cap Strips und der Gefäßdeckel- dadurch die Kosten für Reagenzien ebenfalls reduziert werden können. streifen zweier Wettbewerber wurde in einem Saphire2 TM (Tecan, Crailsheim) Das höhere Probenaufkommen aber durchgeführt. Dazu wurden die 8 Deckel auch die reduzierten Reaktionsansätze der jeweiligen Streifen einzeln in einem erfordern häufig ein automatisches PCR- Wellenlängenbereich von 400 bis 750 nm Setup, da damit auch kleinste Volumina mit 50 nm Abständen gemessen. An- präzise pipettiert werden können. schließend wurden die Werte jeweils gemittelt und die Standardabweichung Darüber hinaus spielen die verwendeten berechnet. Einwegartikel eine erhebliche Rolle. So Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing/ Elongation 95 °C 95 °C 60 °C 2 min 10 s 30 s 40 Zyklen Ergebnisse und Diskussion In der real-time PCR bzw. konventionellen PCR werden zum Verschließen von Gefäßen und Platten häufig flache oder nach oben gewölbte Deckel verwendet. Die Eppendorf Masterclear Cap Strips haben dagegen ein innenliegendes optisches Fenster, welches im Vergleich können auf diese Anwendung angepasste Für das real-time PCR-Experiment zu einem flachen Deckel das Gesamtvo- 0,1 ml PCR-Gefäße verwendet werden, wurde folgendes PCR-System in einer SYBR® Green Anwendung eingesetzt: lumen eines leeren 0,2 ml PCR-Gefäßes die allerdings den Nachteil haben, dass um 44 % reduziert (siehe Abb. 1). sie nur in entsprechend modifizierte Thermoblöcke von PCR-Geräten passen. In Standard PCR-Gefäßen bzw. -Platten PCR-Target: 108 bp-Fragment aus Lambda DNA Forward-Primer cgcacaggaactgaagaatg (600 nM): mit einem Volumen von 0,2 ml dagegen Reverse-Primer ccgtcgagaatactggcaat (300 nM): ist das Dampfvolumen sehr hoch. Dies kann bei der Verwendung von kleinsten Template: Reaktionsansätzen mit weniger als 10 µl zur unerwünschten Kondensation an den Gefäßwänden oder -deckeln führen. Lambda DNA (Roche, Mannheim) Es wurde manuell eine Verdünnungsreihe der Lambda-DNA für einen Bereich von Daraus ergeben sich Veränderungen 100-1 x 108 Kopien je Reaktionsansatz bezüglich der Konzentration der Reak erstellt. Um den Einfluss von eventuellen tionskomponenten, die wiederum zur Pipettierungenauigkeiten auszuschließen, Reduzierung der PCR-Effizienz oder wurden zu den verschiedenen DNA-Kon- schlimmstenfalls zum Misslingen der zentrationen alle weiteren Komponenten PCR führen können. Hier kann gezeigt zugegeben. Abb. 1: Geringeres Dampfvolumen von 0,2 ml PCRGefäßen, die mit Masterclear Cap Strips (hellgrau) verschlossen sind, im Vergleich zu Gefäßen mit flachen Gefäßd eckeln (dunkelgrau). Diese Mini-Mastermixe wurden in je 12 Die sich daraus ergebende Verringerung Replikaten à 2,5 µl mit Hilfe der epMotion® 5070 (Eppendorf) in eine Eppendorf des Dampfdrucks ermöglicht die Durch- twin.tec ® real-time PCR Platte (semi- Volumina unter Verwendung von Stan- skirted) pipettiert. Jeweils drei Spalten dard PCR-Gefäßen und -Platten. werden, dass durch das Verschließen mit den Eppendorf Masterclear Cap Strips das Dampfvolumen der 0,2 ml PCR-Gefäße aufgrund der innenliegen den optischen Fenster deutlich reduziert wird, so dass sich diese ebenfalls für die Durchführung von PCR-Reaktionen mit kleinsten Volumina eignen. Darüber hinaus ermöglicht das optische Fenster der Platte wurden mit Eppendorf Masterclear Cap Strips bzw. mit Gefäßdeckelstreifen anderer Anbieter verschlossen. führung von PCR-Reaktionen mit kleinen Die besonders dünnwandigen optischen Fenster der Masterclear Cap Strips zeichnen sich durch eine sehr gute mit Transmissionswerten von mehr als Im Anschluss daran wurde die Platte Durchlässigkeit für Licht mit Wellenlän- 90 % den Einsatz in der real-time PCR zentrifugiert und eine real-time PCR im gen von 450 bis 700 nm aus (Abb. 2). Januar 2010 (BN 32) Application Support: Europe, International: Tel. +49 1803 666 789 · E-Mail: [email protected] North America: Tel. +1 800 645 3050 · E-Mail: [email protected] Asia Pacific: Tel. +60 3 8023 6869 · E-Mail: support_ [email protected] Seite 7 Low volume real-time PCR mit Eppendorf Masterclear Cap Strips 95 Transmission [%] 90 85 80 einen die größtmögliche Damit erhöht sich die Sensitivität des Anregung der Fluoreszenz Assays nahezu um den Faktor 2, voraus- und zum anderen maximale gesetzt es liegt eine Amplifikations Fluoreszenzsignale wäh- effizienz von 100 % zu Grunde. Gerade rend der Detektion sicher- bei der Analyse von Proben mit geringen zustellen. Außerdem sollten Nukleinsäurekonzentrationen kann dies sich die optischen Fenster von Vorteil sein. durch eine geringe Variabili- 75 Masterclear Cap Strips Competitor B 70 400 450 500 550 600 650 700 750 wavelength [nm] Abb. 2: Transmission verschiedener Gefäßdeckelstreifen Die Transmission von je 8 Deckeln eines Streifens wurde im Wellenlängenbereich von 450 bis 700 nm gemessen. Die Werte wurden gemittelt und die Standardabweichungen als Fehlerbalken angegeben. geringe Streuung bei der Die Eppendorf Masterclear Cap Strips Messung von Replikaten zu ermöglichen durch die innenliegenden gewährleisten. Fenster die Durchführung von PCR-Reaktionsansätzen mit kleinsten Volumina. Zu- In einem real-time PCR- werden, dass aufgrund der guten Trans- PCR relevanten Wellenlängen > 500 nm mission der Masterclear Cap Strips wird eine Transmission von über 90 % ausreichend hohe Fluoreszenzsignale erreicht. Im Vergleich dazu sind die Ge- selbst in einem Reaktionsansatz von fäßdeckelstreifen von Wettbewerbern in nur 2,5 µl gemessen werden konnten. diesem Wellenlängenbereich weniger Diese waren zudem doppelt so hoch wie durchlässig. Darüber hinaus wird deut- die durch die Gefäßdeckelstreifen des lich, dass die Transmission dieser Ge- Wettbewerbers gemessenen Signale länge abhängt. sätzlich kann durch die dünnen optischen Experiment konnte gezeigt Insbesondere in den für die real-time fäßdeckelstreifen stärker von der Wellen- Schlussfolgerung tät auszeichnen, um eine Competitor A Fenster die Sensitivität von real-time PCR-Versuchen erhöht werden. Dies ist vor allem von Vorteil bei real-time PCRSystemen mit niedrigen Fluoreszenzsig nalen und bei der Detektion von Nukleinsäureproben mit geringen Kopienzahlen. Leserservice epMotion® 5070 • Kennziffer 189 (Abb. 3). Masterclear Cap Strips • Kennziffer 229 Der Anstieg der Fluoreszenz kann da- Mastercycler ® ep realplex • Kennziffer 204 twin.tec real-time PCR Plates • Kennziffer 223 So bewegt sich die Durchlässigkeit der durch zu einem früheren Zeitpunkt von Gefäßdeckelstreifen von Wettbewerber dem Grundrauschen der Fluoreszenz- B von 80 % bei der Wellenlänge von messung unterschieden werden. Dies 400 nm bis maximal 89 % im langwel- wiederum führt dazu, dass alle Nuklein- ligen Bereich. Im Fall von Wettbewerber säureverdünnungen ca. einen PCR- A ist diese Abhängigkeit gleichermaßen Zyklus früher detektiert werden können stark ausgeprägt. Hier liegen die Trans- (kleine Abb. in 3). Disclaimer Practice of the patented polymerase chain reaction (PCR) process requires a license. The Eppendorf [or appropriate trademark] Thermal Cycler is an Authorized Thermal Cycler and may be used with PCR licenses available from Applied Biosystems. Its use with Authorized Reagents also provides a limited PCR license in accordance with the label rights accompanying such reagents. This is a Licensed real-time Thermal Cycler under Applera’s United States Patent No. 6,814,934 and corresponding claims in non-U.S. counterparts thereof, for use in research and for all other applied fields except human in vitro diagnostics. No right is conveyed expressly, by implication or by estoppel under any other patent claim. missionen jedoch insgesamt deutlich niedriger. So werden im kurzwelligen 15000 Bereich Werte von gut 71 % erzielt und 14000 1000 Wellenlängenbereich von 400 bis 750 nm im Mittel bei 0,3. Die Gefäßdeckelstreifen des Wettbewerbers B sind vergleichbar Fluorescence (norm) 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 9000 0 -50 -100 -150 8000 4 5 6 7 8 Cycle 9 10 11 12 7000 6000 5000 4000 3000 gut, die des Wettbewerbers A dagegen haben eine mittlere Standardabweichung Seite 8 600 10000 Fluorescence (norm) liegt die Standardabweichung über den sollte möglichst dünn sein, um zum 700 11000 Strip durch eine geringe Varianz aus. So sung durch die Gefäßabdeckung. Diese 750 650 optischen Fenster eines Masterclear Cap meisten Geräten die Fluoreszenzmes- 800 12000 Zusätzlich zeichnen sich die einzelnen In der real-time PCR erfolgt bei den 900 850 erreichen maximal 82 % bei 700 nm. von 1,6. 950 13000 2000 1000 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Cycle Abb. 3: Low volume real-time PCR mit verschiedenen Gefäßdeckelstreifen Verdünnungen von 100 bis 1x10 8 Kopien Lambda-DNA pro Reaktionsansatz (2,5 µl) wurden in Anwesenheit von SYBR Green in einer twin.tec real-time PCR Platte amplifiziert, die mit Masterclear Cap Strips (blau) und Gefäßdeckelstreifen eines Wettbewerbers (rot) verschlossen wurde. Application Support: Europe, International: Tel. +49 1803 666 789 · E-Mail: [email protected] North America: Tel. +1 800 645 3050 · E-Mail: [email protected] Asia Pacific: Tel. +60 3 8023 6869 · E-Mail: support_ [email protected] (BN 32) Januar 2010 Die Leichtigkeit des Mischens Laborpraxis Sabine Kühn, Eppendorf AG Die Leichtigkeit des Mischens Jeder Anwender ist sich der Bedeutung des Mischens bewusst – vollständiges und effektives Durchmischen eines Reaktionsansatzes ist die Grundvoraussetzung für ein aussagekräftiges Ergebnis. Man weiss allerdings auch, dass effizientes Mischen von kleinen Volumina nicht durch einfaches Erhöhen der Mischgeschwindigkeit erreicht wird. Perfektes Mischen erfolgt, wenn Parameter wie Geschwindigkeit, Art der Mischbewegung sowie der Mischradius optimal zusammenwirken. Eppendorf hat sich dieser Thematik angenommen, und das Resultat heisst „MixMate®”. Der perfekte Schwung … Der MixMate ist in der Lage, sämtliche Probenarten innerhalb einer Minute vollständig zu durchmischen, unab hängig von Probeneigenschaften und Gefäßgeometrie [1]. Die Grundlage für diese Fähigkeit ist eine Kombination aus absolut planarem Mischmodus und optimaler kreisförmiger Mischbewegung, welche die maximale Mischenergie auf die Reaktionsflüssigkeit zu übertragen vermag. chaotische Mischbewegungen und Das Mischen hochviskoser Lösungen in somit Deckelbenetzung (d.h. zusätzliche kleinen Volumina ist eine weitere an- Zentrifugation nach dem Mischen ist spruchsvolle Herausforderung an einen nicht mehr erforderlich), sowie das Mixer, welcher der MixMate problemlos Risiko der Kreuzkontamination [2]. gewachsen ist: viskose Lösungen wie … für jede Aufgabe Glycerin und Polyethylenglykol (PEG) werden häufig hochkonzentriert einge- Ein weiteres wichtiges Thema im Labor setzt. Neueste Erkenntnisse zeigen, dass ist das Resuspendieren fester Zellpellets, der MixMate sogar 90%ige Glycerin was sich häufig als äußerst arbeits lösungen bei 20 °C innerhalb einer Minute intensiv und zeitaufwändig herausstellt. vollständig durchmischt [4]. Diese Zeit kann deutlich verkürzt werden: Mit dem MixMate können sogar Das Resultat ist eine perfekte Strudel- Bakterienpellets in 384-Well-Platten bewegung. Zusätzlich verhindert die innerhalb einer Minute komplett re Anti-Spill-Technologie unkontrollierte, suspendiert werden [3]. Zum schnellen und vollständigen Durchmischen einzelner Gefäße ist Vortexen die Methode der Wahl. Aus diesem Grund verfügt der MixMate zusätzlich über eine integrierte Vortex-Funktion. Fazit: Für perfektes Mischen gibt es eine perfekte Lösung – MixMate! Literatur: [1] Application Note 130: Comparison of mixing performance in 96- and 384-well plates of Eppendorf MixMate and competitor devices [2] Application Note 129: Eppendorf MixMate – Nachweis kontrollierten Mischens ohne Deckel benetzung mit Hilfe eines PCR-basierten Schachbrettmuster-Assays [3] Application Note 131: Eppendorf MixMate – Resuspendieren von Bakterienpellets in DeepwellPlatten (96- und 384-Well) und Reaktionsgefäßen [4] Application Note 159: Mixing of highly viscous liquids using Eppendorf MixMate Diese Application Notes können Sie herunterladen unter www.eppendorf.de/bn/mixmate. MixMate ® • Kennziffer 206 BioNews Nr. 32 9 Zu Gast bei Eppendorf News Berrit Hoff, Eppendorf AG Zu Gast bei Eppendorf News Vielen Dank! Dr. Richard M. Badge von der Universität Leicester, England, war der glück liche Hauptgewinner eines von der Eppendorf AG zwischen dem 1. April und 30. Juni 2009 durchgeführten großen Online-Gewinnspiels. Vor 30 Jahren revolutionierte Eppendorf die Laborwelt – mit der Einführung des ersten Handdispensers, der Multipette®. Die erfolgreiche Beantwortung einiger Der glückliche Gewinner, Dr. Richard M. Spezialfragen zu Eppendorfs Multipette® Badge von der Universität Leicester, Dieses Jubiläum ist für plus und Combitips plus qualifizierte die England, besuchte die Eppendorf AG in Eppendorf ein guter Teilnehmer für die tägliche Auslosung Hamburg Anfang August 2009. Anlass, allen Multi eines Multipette plus Handdispensers. Darüber hinaus wurde am Ende der Aktion unter allen Teilnehmern der Hauptpreis verlost: eine Flugreise nach Hamburg mit Aufenthalt in einem 5-Sterne-Hotel, ausführlichen Besichtigungen der Produktionsstätten in Hamburg und Oldenburg (Kunststoffwerk), „Mein Besuch bei der Eppendorf AG war eine großartige Erfahrung“, so Richard Badge. „Ich hatte eine tolle Zeit! Es war wirklich interessant, die Produktionsstätten zu sehen, mir blieb aber auch noch genug Zeit, um Hamburg zu genießen!“ petten-Fans herzlich zu danken! Die elek tronische Multipette stream wird, solange der Vorrat reicht, mit einem Extra-Bonbon ausgeliefert, einem exklusiven digitalen einem „Meet und Greet“ mit dem Multi- Mehr Informationen unter Bilderrahmen mit pette/Combitip-Team in der Eppendorf www.eppendorf.de/winner. 3,5-Zoll-Display. Mehr über Dr. Badge erfahren Sie unter Freuen Sie sich auf eine www.le.ac.uk/ge/pages/staff/ Auswahl an Multipette- staff_pages/badge.html. Motiven oder machen Sie Konzernzentrale, einem exklusiven praktischen Training nach Wahl im Eppendorf Training Center und natürlich mit jeder Menge Sightseeing in Hamburg! den Bilderrahmenganz einfach zu Ihrem persönlichen Fotoalbum. Ankunft in der Eppendorf Konzernzentrale Besichtigung des Eppendorf Kunststoffwerkes (Eppendorf Polymere GmbH) in Oldenburg/Holstein Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte an Ihren teilnehmenden Eppendorf Partner oder besuchen Sie www.eppendorf.com/bn/mppromotion. Aktuelle Informationen zum Multipette-Jubiläum finden Sie unter www.eppendorf.com/30years. „Hands-on Training“ im Eppendorf Training Center Multipette ® plus • Kennziffer 125 10 BioNews Nr. 32 Richard M. Badge vor dem Hamburger Rathaus Multipette ® stream/Xstream • Kennziffer 208 Mauro Costa-Mattioli und Simon Boulton in Hamburg News Carolyn Powell & Berrit Hoff, Eppendorf AG Mauro Costa-Mattioli und Simon Boulton in Hamburg Dr. Mauro Costa-Mattioli von der Ab J. Boulton (London Research Institute, teilung für Neurowissenschaften am Clare Hall Laboratories, UK) bei Eppen- Baylor College of Medicine, Texas, dorf zu Gast gewesen. USA, der Preisträger des Eppendorf & Science Prize for Neurobiology 2008, war im Sommer 2009 zu Gast in der Eppendorf Konzernzentrale in Hamburg. Service Bleiben Sie auf dem Laufenden! Auch er hielt einen Vortrag über seine prämierte Forschung an SPAR1, einer neu entdeckten Helikase. Bei dieser Gelegenheit führte Kerri Smith (Podcast Abonnieren Sie Bei dieser Gelegenheit hielt Dr. Costa- Redakteurin der Nature Publishing Mattioli einen Vortrag über seine bahn- Group, London) ein Interview mit Simon brechende Erforschung der Bedeutung Boulton. In diesem spricht er über sein translationaler Kontrolle bei der Bildung Forschungsgebiet, seine Überraschung, Mit unserem Newsletter sind Sie langfristiger Erinnerungen. Als Anden- als er vom Preisgewinn erfuhr, und die immer auf dem neuesten Stand. ken an seinen Besuch erhielt er die Bedeutung dieser Auszeichnung für ihn neue Research plus Pipette. und seine Mitarbeiter. Der internationale Hören Sie dieses interessante und Eppendorf & Science gleichzeitig unterhaltsame Interview Prize for Neurobiology als Podcast online unter wird von Eppendorf und dem Fachmaga- www.eppendorf.com/bn/podcast2008. zin Science ausgelobt. Er ist mit 25.000 US-Dollar dotiert. Mehr Informationen unter www.eppendorf.com/prize. Der Eppendorf Young Investigator Award wird in Zusammenar- Bereits im Frühjahr 2009 war der Preis- beit mit Nature verliehen. Er ist mit träger 2008 des Eppendorf Award for 15.000 Euro dotiert. Mehr Informationen Young European Investigators, Dr. Simon unter www.eppendorf.com/award. den Eppendorf E-Mail Newsletter! Erhalten Sie kostenlos Informationen über • Neue Eppendorf Produkte • Exklusive Angebote (z.B. Eppendorf Advantage Aktionen) • Events (z.B. Messen) • Anwendungstipps für Ihre Eppendorf Produkte • Neue Prämien bei ep-points, Eppendorfs Bonusprogramm • und vieles mehr! Alles aus erster Hand – damit Ihnen nichts entgeht! Natürlich können Sie den News letter jederzeit bequem wieder abbestellen. Jetzt abonnieren unter Dr. Mauro Costa-Mattioli (r.) erhält eine Research plus Pipette, überreicht von Dr. Axel Jahns, Eppendorf AG. Kerri Smith (Nature) interviewt Dr. Simon Boulton für den Award Podcast. www.eppendorf.com/newsletter. BioNews Nr. 32 11 Innovation Neu! CelliGen™ BLU: der Zellkultur-Bioreaktor für den Einmalgebrauch Rich Mirro, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA Neu! CelliGen™ BLU: der ZellkulturBioreaktor für den Einmalgebrauch Neu: CelliGen™ BLU Rührkessel-Bioreaktor für den Einmalgebrauch! Durch die Kombination von Eppendorfs Kompetenz in der Entwicklung von Labor-Kunststoffverbrauchsartikeln und der Expertise von New Brunswick Scientific im Bereich der Fermentation und Zellkultur-Bioprozesstechnologie entstand eine neue Lösung für Bioreaktorsysteme. Der CelliGen™ BLU, mit einer leistungsstarken integrierten Kontrollstation sowie einem Kessel für den Einmalgebrauch, ist einfach zu hand haben, sorgt für hervorragende Prozesskontrolle und ermöglicht Durchlaufzeiten von nur wenigen Minuten. Schnelles Set-up, hoher Durchsatz, einfache Handhabung, dass die vertraute Rührkesseltechnologie eingesetzt wird, echtes „Upscaling“ wodurch Ihr Prozess problemlos in den Produktionsmaßstab Mit CelliGen BLU können 5,0 und 14,0 Liter Rührkesselgefäße für den Einmalgebrauch eingesetzt werden. Diese sind bereits sterilisiert und werden gebrauchsfertig angeliefert – weder Reinigung noch Autoklavieren sind notwendig. Sämtliche Komponenten, die mit dem Produkt in Kontakt kommen, sind aus USP Klasse VI Materialien gefertigt und somit auf potenziell „ausblutende“ und extrahierbare Stoffe getestet. Das System ist somit für Anwendungen nach FDA-Richtlinien hervorragend geeignet. Anders als traditionelle Beutel-Einwegsysteme ohne eine wirkliche Gaskontrolle, die bei größeren Volumina schnell unhandlich werden können, kann der CelliGen BLU präzise bis zu 32 Prozessparameter, einschließlich pH und gelösten Sauerstoff (D.O.), überwachen und steuern. Dies beinhaltet multiple Optionen für die Kontrolle von bis zu vier Gasen. Das Gute ist, hochskaliert werden kann. Vergleich mit ähnlichen Bioreaktor-Systemen Zur Überprüfung der Fähigkeit des CelliGen BLU, die Wachstumsbedingungen sowohl am Sollwert zu kontrollieren als auch eine hohe Zelldichte zu produzieren, haben Wissenschaftler im hauseigenenen Labor von New Brunswick Scientific das Wachstum von CHO-Zelllinien (Chinese-Hamster-Ovary) in drei verschiedenen Bioreaktorsystemen verglichen: • CelliGen BLU Bioreaktor mit 5 Liter Gesamtvolumen / 3,5 Liter Arbeitsvolumen, mit vor-sterilisierten Einweggefäßen • CelliGen 310 Bioreaktor mit 5 Liter Gesamtvolumen / 3,5 Liter Arbeitsvolumen, autoklavierter Glasreaktor (NBS) • Kultursystem im Beutel-Inkubator mit 10 Liter Gesamtvolumen / 5 Liter Arbeitsvolumen, mit vor-sterilisierten Einmalbeuteln Die CHO-Zellline (ATCC, Manassas, VA, USA) wurde auf serumfreies Medium prä-adaptiert; ein CD-CHO-serumfreies Medium (Invitrogen Bestellnummer 12490-025; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) wurde eingesetzt. Die Kontrollparameter für alle drei Systeme (unten aufgeführt) wurden so einheitlich wie möglich eingestellt. 1) CelliGen BLU Sollwerte: Temperatur: 37 °C pH Sollwert: 7,0 Neutralzone: 0,10 Gelöster Sauerstoff (DO): 40 % Mischgeschwindigkeit: 70-80 rpm Gas-Überzug: 0,2-0,3 Standard Liter pro Minute (SLPM) durch 4-Gas Einstellung über den gesamten Lauf Belüftung mit 4-Gas Modus bei 0-20 CCM durch Kaskadenkontrolle von gelöstem Sauerstoff (Dissolved Oxygen; DO) bis Gasflo, nach 2 Tagen Inkubation 12 BioNews Nr. 32 Neu! CelliGen™ BLU: der Zellkultur-Bioreaktor für den Einmalgebrauch Innovation Jeder Produktionslauf dauerte 7 Tage. Tägliche Messungen 2) CelliGen 310 Sollwerte waren identisch, bis auf: von Glucose- und Lactatkonzentrationen wurden mit Hilfe Mischgeschwindigkeit: 80-100 rpm Gas-Überzug: 0,2-0,3 SLPM durch 4-Gas Modus während der ersten 2 Tage Belüftung bei 0,1-0,2 SLPM durch 4-Gas Modus nach 2 Tagen Inkubation eines YSI 2700 Analyseinstruments (YSI Inc., Yellow Springs, OH, USA) bestimmt. Zelldichte und -lebensfähigkeit wurden durch einen NucleoCounter von New Brunswick bestimmt. 3) Taumelschüttel-Inkubator und -Beutel-Sollwerte sind Innerhalb der 7-Tage-Produktion wuchsen die CHO-Zellen wahrscheinlich nahezu gleichwertig zu den Sollwerten, die für stetig in allen drei Bioreaktorsystemen bis zum 5. Tag, bis zu die Rührkesselreaktoren eingesetzt werden: dem Punkt, wo die Nährstoffquelle Glucose verbraucht war. Temperatur: 37 °C pH Sollwert: etwa 7,0 Wie in Tabelle 1 gezeigt, erreichte der CelliGen BLU eine maximale lebende Zellzahl von 5,55 x 106 Zellen / ml, verglichen mit Gelöster Sauerstoff (DO): etwa 40 % 5,39 x 106 Zellen / ml für das autoklavierbare System und 4,77 x Mischgeschwindigkeit: 18 rpm 106 Zellen / ml im Taumelschüttel-Inkubator mit Beutel-System. Taumelwinkel: 8° Der Anteil lebensfähiger Zellen blieb in allen drei Fällen bis Gas-Überzug: 0,1-0,3 SLPM durch Luft mit 0-5 % CO2, pH-abhängig Ende des 5. Tages hoch und lag bei 96,8 % oder besser. CelliGen BLU Bioreaktor CelliGen 310 Bioreaktor Taumelschüttel-Inkubator / Beutel-System Zeit Gesamtzellzahl Lebensfähige Zellen Lebensfähigkeit Gesamtzellzahl Lebensfähige Zellen Lebensfähigkeit Gesamtzellzahl Lebensfähige Zellen Lebensfähigkeit [Tag] [10 6 Zellen/ml] [10 6 Zellen/ml] [%] [10 6 Zellen/ml] [10 6 Zellen/ml] [%] [10 6 Zellen/ml] [10 6 Zellen/ml] [%] 0 0,31 0,30 97,9 0,31 0,30 97,9 0,31 0,30 97,9 1 0,69 0,68 97,1 0,64 0,62 96,5 0,61 0,58 96,8 2 1,42 1,39 97,6 1,31 1,29 97,9 1,33 1,30 97,6 3 2,57 2,51 97,6 2,47 2,41 97,8 2,36 2,32 98,4 4 4,02 3,92 97,5 4,04 3,98 98,6 3,89 3,83 98,5 5 5,70 5,55 97,3 5,46 5,39 98,7 4,83 4,77 98,9 6 5,98 4,52 76,6 5,67 4,13 72,7 5,46 3,67 67,3 7 6,71 3,21 47,8 6,25 3,12 49,7 5,59 2,73 48,8 Tabelle 1: Vergleich von CHO-Wachstum und -Lebensfähigkeit unter ähnlichen Kulturbedingungen in drei Bioreaktor-Tischmodellen Mehr Informationen über CelliGen BLU finden Sie bei New Brunswick: www.nbsc.com/BLU. News Innovative Geräte für Zellkultur, -nachweis und -aufbewahrung CelliGen BLU ist nur der neueste Zuwachs zu New Brunswick Scientifics reichhaltiger Palette an innovativen Geräten für Zellkultur, -nachweis und -aufbewahrung. New Brunswick stellt u. a. besonders umweltfreundliche Ultratiefkühlschränke und -truhen mit auf Kohlenwasserstoff basierenden Kühlsystemen her, welche die EU-Normen 2012 zur Energieeinsparung erfüllen. Moderne CO2-Brutschränke, die größte Auswahl an biologischen Schüttlern sowie Fermenter und Gär- und Bioreaktoren vom Labor- bis zum Produktionsmaßstab runden das Angebot ab. Die Reaktoren werden in der Stammzellforschung sowie in der Impfstoffherstellung und Proteinproduktion, Biotreibstoff-Forschung, D iagnostik, u. v. m. eingesetzt. 1946 gegründet und 2007 von der Eppendorf AG übernommen, befindet sich das Hauptquartier von New Brunswick Scientific in Edison N.J., USA, mit weltweitem Vertrieb und Service-Dienstleistungen. BioNews Nr. 32 13 Gewinnspiel Service Gewinnspiel Online teilnehmen unter www.eppendorf.de/bn-service Die Lösung des Preisrätsels aus BioNews Nr. 30 lautete verwenden, uns eine E-Mail an [email protected] senden „Mastercycler ® pro“. Stephen M. Laidlaw, PhD, vom Imperial oder unser Online-Formular unter www.eppendorf.de/bn-service College London, UK, gewann den ersten Preis, einen nutzen! Unter allen richtigen Einsendungen verlosen wir wieder Montblanc Füllfederhalter. attraktive Preise. Die Gewinner werden schriftlich benachrichtigt. ® Eine Barauszahlung ist nicht möglich. Viel Spaß bei unserem neuen Rätsel! Bringen Sie die eingekreisten Buchstaben in die richtige Rei- Der Rechtsweg ist ausgeschlossen. Eppendorf-Mitarbeiter und henfolge und schicken Sie uns die richtige Antwort bis zum deren Angehörige dürfen nicht teilnehmen. Der Gewinner des 30. Juni 2010. Sie können hierfür das Antwortfax (Seite 15) ersten Preises wird in Ausgabe 34 veröffentlicht. 1 2 3 4 9 5 6 10 7 11 15 16 17 21 32 33 23 34 35 43 36 37 44 6. bis 15. Preis: 52 53 je 200 Bonus ep-points 54 56 WA AGERECHT Ideal für PCR Spezielle Computertaste Engl. Personalpronomen Australien ist down ... Gegenteil von contra Chem. Zeichen für Xenon Gibt es auch „wireless“ Methode zur künstlichen Befruchtung Wird für Gelelektrophorese benötigt Abk. für Maine Chem. Zeichen für Tellur Tatsächlich, wahr Abk. für Mister Chem. Zeichen für Osmium Liberté, Fraternité, ... ? Chem. Zeichen für Strontium SENKRECHT 9 3 40 41 42 45 46 47 49 51 55 56 Chem. Zeichen für Rhenium Englische Eva Meist in Verbindung mit Vera Testicular Sperm Extraction Erfunden von Kary Mullis Television in Kürze Mattweißes Mineral Gegenteil von off Bewertung Edelgas Englische Forschung Warenzeichenhinweise BIOPUR · CELLTRAM · EP DUALFILTER T.I.P.S. · EPMOTION · EPPENDORF · EPPENDORF PERFECTPISTON* · EPPENDORF RESEARCH · EPPENDORF TUBES · EPPENDORF TWIN.TEC · EP T.I.P.S. · MASTERCYCLER · MIXMATE · MULTIPETTE · PHYSIOCARE CONCEPT · R EPEATER** · TRANSFERMAN · TRANSFERTIP · UVETTE sind eingetragene Marken der Eppendorf AG. (*Nur Europa. **Nur USA.) Irrtum vorbehalten. Stand Januar 2010. 14 je 1 MP3-Player 48 51 55 1 9 10 11 13 14 15 18 20 25 26 27 29 31 33 38 2. bis 5. Preis: 45 47 1 Eppendorf Research® plus Mehrkanalpipette 10-100 µl 38 41 46 50 24 30 40 42 19 27 29 39 49 18 26 28 31 14 22 25 1. Preis: 12 13 20 8 BioNews Nr. 32 1 2 3 4 5 6 7 8 12 15 16 17 19 21 22 23 Vorname von 6 senkrecht Nun, dann… ebenfalls in Englisch Datenstrom Länderkürzel für Rumänien Chem. Abkürzung für Kupfer Berühmte Nobelpreisträgerin (Nachname) Eduard und Edwin in kurz Lateinischer König Chem. Abkürzung für Rhenium Stadt in Kalifornien (Abk.) 10 x 10 Meter Elend, Misere Kurzform von 24 senkrecht Träger der Erbinformation (pl.) Lat. Vorsilbe für “halb” Ohne das geht kein Cowboy vor die Tür 4 2 28 30 32 34 35 36 37 43 44 45 48 50 52 53 54 Schwedischer Chemiker, Erfinder und Preisstifter (Vorname) Festung, Befestigungsanlage Was real-time und reverse Transkriptase gemeinsam haben Gewässer Chem. Abkürzung für Germanium Virtueller Stellvertreter Franz. männl. Artikel Spitzt der Engländer, um zu hören Abk. für Sankt Sogar in Englisch Gegenteil von Minus Typisch engl. Biersorte Abkürzung für 55 waagerecht Chem. Zeichen für Tantal Länderkürzel für den Iran Abk. für New Hampshire ABI PRISM ist eine eingetragene Marke von Applied Biosystems. BIGDYE ist eine eingetragene Marke von Applera Corporation. CELLIGEN ist eine Marke von New Brunswick Scientific. EXOSAP-IT ist eine eingetragene Marke von USB Corporation (Part of Affymetrix). FALCON ist eine Marke von Becton Dickinson. FORTRON ist eine eingetragene Marke von Ticona. HOTSTARTAQ ist eine eingetragene Marke von Qiagen. MILLI-Q ist eine eingetragene Marke von Millipore Corporation. OCTAX Laser Shot ist eine Marke von Medical Technology Vertriebs-GmbH. SAFIRE 2 ist eine Marke von Tecan. SYBR ist eine eingetragene Marke von Molecular Probes. Antwortfax /Literaturanforderung Service An Eppendorf AG, Hamburg, z. Hd. Anton Janott, Fax 040 - 5 38 01- 8 40 (Bitte deutlich schreiben, keine Privatadressen) Firma / Universität / Klinik Titel / Vorname / Name Institut Straße Abteilung / Funktion PLZ / Ort E-Mail Telefon Telefax N E U ! Jetzt online BioNews gratis abonnieren oder Literatur anfordern unter www.eppendorf.de/bn-service Bitte senden Sie mir Informationen zu den Kennziffern: Helfen Sie uns bitte, Ihre Abonnement-Daten zu pflegen: 61 VacuTip/TransferTip® Ich bin bereits Eppendorf BioNews Abonnent. 77 CellTram® Bitte aktualisieren Sie meine Adresse (s.o.). 108 UVette® Ich bin neuer Abonnent. Bitte schicken Sie mir regelmäßig 125 Multipette® plus 164 TransferMan® NK 2 171 Eppendorf twin.tec® PCR Plates 189 epMotion® 5075 204 Mastercycler ® ep realplex 206 MixMate® 208 Multipette® stream/Xstream 221 BioPhotometer plus 223 Eppendorf twin.tec® real-time PCR Plates 224 Mastercycler ® pro 229 Masterclear Cap Strips 230 IMSI/TESE tip 231 Eppendorf Research® plus 232 epT.I.P.S.® 50-1.250 µl L gratis die Eppendorf BioNews (2 Ausgaben pro Jahr). Ich habe Interesse an einem E-Mail-Newsletter von Eppendorf. (Oben im Adressblock bitte E-Mail-Adresse angeben). Ich habe Kommentare zur BioNews Nr. 32: Ich habe Anregungen für die nächste BioNews: Eppendorf Gesamtkatalog 2010 Lösung BioNews Gewinnspiel aus BioNews Nr. 32: E E Einsendeschluss für das Gewinnspiel: 30.06. 2010. Nutzen Sie die praktische Online-Teilnahme unter www.eppendorf.de/bn-service. BioNews Nr. 32 15 ABN 3213010 Entry Point! Students with Disabilities Entry Point! Students with Disabilities To meet the challenge of the competitive economy in the new millennium, private industry and government research agencies must expand the pool of technical talent. AAAS started Entry Point!, a program that offers students disabilities competitive internship To meet the challenge of the competitive economywith in the new millennium, private industry opportunities in science, engineering, mathematics, computer science, and some of and government research agencies must expand the pool of technical talent. AAASfields started business. 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