THE HISTORY OF CRYOGENIC STORAGE
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THE HISTORY OF CRYOGENIC STORAGE
Labtec Services AG Nordstrasse 9 CH 5612 Villmergen T 056 619 89 19 F 056 619 89 18 [email protected] www.labtec-services.ch THE HISTORY OF CRYOGENIC STORAGE © Labtec Services AG 1 von 6 ENTWICKLUNGEN BEI DER KRYOGENISCHEN LAGERUNG Roel van den Bosch, Cryogenic Industry Consultant. Deutsche Bearbeitung Labtec Services AG Geschichte Die Kryotechnik hat sich im 19. Jahrhundert als Ergebnis von wissenschaftlichen Versuchen zur Verflüssigung von permanenten Gasen entwickelt. Unter den bekannten permanenten Gasen fanden Sauerstoff und Stickstoff als Hauptbestandteile der Luft die grösste Beachtung. Bei der Verflüssigung von Gasen spielte der schottische Chemiker James Dewar (1842–1923) eine wichtige Rolle. Er war es, der im Jahre 1892 die erste Isolierflasche für die Lagerung und den Transport von flüssigen Gasen entwickelte. Diese Art von Vakuumflaschen wird heute noch weithin verwendet, und einzelne davon werden nach dem Namen ihres Erfinders immer noch Dewar genannt. Dewar Gefässe der ersten Generation Kryotechnik Kryotechnik ist die Wissenschaft der Erzeugung und Untersuchung von Tieftemperaturbedingungen. Das Wort Kryotechnik kommt vom griechischen Wort "kryos" (κρύος) für Frost, Eis. In der Kryotechnik als wissenschaftliche Disziplin bezieht sich der Begriff kryogenisch auf Temperaturen von rund 100°C bis hinunter zum absoluten Nullpunkt (-273°C). Kryokonservierung Dies ist ein Verfahren, bei dem beispielsweise Zellen oder ganze Gewebe durch Abkühlung bis auf kryogenische Temperaturen wie -196°C (den Siedepunkt von flüssigem Stickstoff) konserviert werden. Bei diesen Temperaturen endet jegliches biologisches Leben. Wird aber das konservierte Material gegen Eisbildung ausserhalb der Zellen, Dehydrierung oder Eisbildung im Inneren der Zellen nicht ausreichend geschützt, dann wird es häufig während des Gefrierprozesses und/oder während des Schmelzens beschädigt, was sich auf die Lebensfähigkeit negativ auswirken wird. Kryoprotektoren, stufenweises Gefrieren und kontrolliertes Schmelzen stellen Mittel und Mechanismen zur Verminderung von Frostschäden dar. Flüssiger Stickstoff (Liquid Nitrogen LN2) Flüssiger Stickstoff ist eine relativ kostengünstige kryogenische Flüssigkeit und deshalb im Gebrauch für verschiedene kryogenische Verfahren weit verbreitet. Gasförmiger Stickstoff (N2) bildet den Grossteil der Atmosphäre (78.03%). Unter atmosphärischem Druck kondensiert (verflüssigt sich) gasförmiger Stickstoff (N2) bei einer Temperatur von -196°C und gefriert bei -210°C. Flüssiger Stickstoff ist inaktiv, farblos, nicht ätzend, nicht brennbar und extrem kalt. Sehr kleine Mengen von Flüssigkeit verdampfen zu grossen Gasmengen. James Dewar 1842 – 1923 © Labtec Services AG Aus einem Liter LN2 entstehen 700 Liter von N2-Gas. 2 von 6 Flüssiglagerung Seit James Dewar 1892 den Vakuum-Dewar erfunden hat, wurde und wird weiterhin dieser Behälter für langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff verwendet. Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von -196°C war während Jahrzehnten die bevorzugte Methode für kryogenische Lagerung. Obwohl das Eintauchen von Stoffen in flüssigen Stickstoff und deren Entnahme daraus eine gefahrvolle und unangenehme Tätigkeit darstellt, war es für viele Jahre die einzige zur Verfügung stehende Methode; Materialien bei einer Temperatur unter dem Rekristallisationspunkt (RP) von Wasser zu lagern. Dieser Punkt liegt bei rund minus 135°C. Dazumal war bereits bekannt, dass Zellen auch langfristig lebensfähig und unverändert bleiben, wenn sie bei Temperaturen von 196°C gelagert werden, also sichere 60 Grad vom Rekristallisationspunkt entfernt, also oberhalb der Temperatur wo Eiskristalle irreparable Schäden am gelagerten Material verursachen können. Zudem bot die Lagerung bei konstanten -196°C den bestmöglichen Temperaturgradient, bei dem durch Temperaturschwankungen verursachte Schäden ausgeschlossen werden konnten. Querkontaminierung und ansteckende Krankheiten Wie alle Flüssigkeiten ist auch flüssiger Stickstoff ein möglicher Träger von Kontaminierungsstoffen. Während langfristiger Kryokonservierung sammeln sich Eisablagerungen in Lagerdewars an, und dieses Eis stellt unter Umständen ein Risiko von mikrobischer Kontaminierung der gelagerten Proben dar. Eis sammelt sich in LN2 oberhalb eines offenen Dewar in der Atmosphäre an. Dieses Eis fällt in den im Gefäss befindlichen flüssigen Stickstoff oder es bildet sich Eis an den kalten Oberflächen des Dewar oder am Aufbewahrungsbehälter, der in das LN2 im Gefäss eingebracht wird. Solch eine zunehmende Menge von Eiskristallen schliesst anderes Material wie Bakterien, Pilzsporen und allgemeine Schmutzpartikel im flüssigen Stickstoff ein. Zusätzlich besteht auch das Risiko, dass flüssiger Stickstoff selbst zum Überträger von biologischer Kontamination unter den eingelagerten Proben wird. Man hat klare Beweise für die Übertragung von Hepatitis B zwischen gefrorenen Knochenmarkproben in einem Lagertank mit flüssigem Stickstoff gefunden, die zu einer klinischen Infektion bei Transplantationspatienten geführt haben (Teddar et al., 1995; Fountain et al., 1997). Zweifellos sind geeignete aseptische Verfahren und andere Laborregeln die Grundlage für den Schutz der gelagerten Proben, aber was häufig übersehen und unterschätzt wird, ist das mögliche Einströmen von flüssigem Stickstoff in die Probengefässe während des Eintauchens. Unter einwandfreien Bedingungen mögen moderne Gefässe perfekt und dicht zum Eintauchen geeignet sein, aber der Hersteller der solchen Vials hat keine Kontrolle über die Handhabung des Gefässverschlusses. Dies ist auch der Grund dafür, dass die Mehrheit der Hersteller von Probenlagergefässen heutzutage auffordern, ihre Produkte nicht in flüssigen Stickstoff einzutauchen. Lagerung in Flüssigem Stickstoff © Labtec Services AG So gesehen besteht auch bei den modernsten Vials die Möglichkeit von Undichtigkeiten. Abgesehen davon, dass kryogenische Temperaturen Kunststoffvials und dem Verschlussmaterial stark zusetzen, kommt die grösste Gefahr vom Druckgefälle, das bei der Abkühlung der Gefässe um 200 Grad Celsius entsteht. Eine vorhandene Gasmenge wird durch ihren Druck, ihr Volumen und ihre Temperatur bestimmt, entsprechend der 3 von 6 Gleichung: pV = nRT. Wenn die Temperatur beim Eintauchen in flüssigen Stickstoff zurück geht, reduziert sich der Druck in den Lagergefässen ebenfalls, wobei ein erheblicher Druckunterschied entsteht, wodurch flüssiger Stickstoff in das Innere der Vials gepresst werden kann. Dies vor allem wenn der Verschluss nicht ordnungsgemäss zugeschraubt ist, eine deformierte Dichtung aufweist oder zu fest zugeschraubt wird. Abgesehen vom Querkontaminierungsrisiko kann das Eindringen von flüssigem Stickstoff dann eine Explosion verursachen, wenn die Gefässe ins Labor gebracht werden und der eingeschlossene Stickstoff in dieser Umgebung schnell zum Sieden kommt. (Zur Erinnerung: bei der Umwandlung von LN2 in N2 tritt eine Ausdehnung auf das 700fache ein.) die für die gewöhnliche Lagerung in Flüssigkeit verwendet werden. Im Falle der Dampflagerung wird der Pegel von LN2 im Behälter auf einen Drittel reduziert und die Gestelle mit den Proben werden entweder von der Flüssigkeit durch den Einsatz einer Plattform getrennt oder die untersten Positionen der Gestelle (die in der Flüssigkeit befindlichen Plätze) werden nicht für die Lagerung der Proben verwendet. Bei Lagerung in Dampf kommen die Proben nicht mit LN2 in Berührung, aber neben diesem grossen Vorteil gibt es auch bedeutende Nachteile wie: 1. Verlust von Lagerkapazität, indem der Teil, wo sich das LN2 befindet, nicht genutzt werden kann. 2. Die Dampftemperatur hängt zu stark vom LN2-Pegel ab. 3. Die Möglichkeit grosser vertikaler Temperaturgradienten ist vorhanden. Wird biologisches Material nicht bei Temperaturen unter dem Rekristallisationspunkt von wässrigen Lösungen (ca. -130 bis 140°C; Mazur, 1970) gelagert, verschlechtert sich während langfristiger Lagerung die Lebensfähigkeit. Probengefässe und Boxen aus Polycarbonat für die Lagerung bei -196°C Als in den 1980er Jahren erstmals HIV/AIDS bekannt wurde, bereitete das Risiko der Querkontamination bei der Lagerung von Proben in flüssigem Stickstoff zunehmend Sorge. Später wurden die Befürchtungen bestätigt (Bielanski et al., 2000), dass im Falle der Kontaminierung von flüssigem Stickstoff mit einem Virus, Embryos die in unversiegelten Behältern in diesem Stickstoff lagern, durch diese Viren verseucht werden können. Wir können abschliessend feststellen, dass HIV/AIDS sowie andere ansteckende Krankheiten den Wechsel von der traditionellen Lagerung in flüssigem Stickstoff zu einer solchen in Stickstoffdampf geführt haben. Dampf-Phasen-Lagerung Die Lagerung von Proben im Dampf von flüssigem Stickstoff schaltet das mögliche Risiko von Querkontaminierung durch flüssigen Stickstoff aus. Diese Art der Lagerung wird meistens in denselben Kühlbehältern (Typ Dewar oder Selbstfüller) vorgenommen, © Labtec Services AG Dampfphasenlagerung in Standard Behälter 4 von 6 Dies mag für Materialien angehen, die in grosser Zahl eingefroren werden und bei denen ein gewisser Verlust der Lebensfähigkeit keine praktischen Probleme aufwirft, wohl kann es aber für anderes wertvolles Probematerial solche Probleme verursachen. Man schrieb das Jahr 2000, als ein amerikanischer Hersteller von Tiefkühlgeräten für kryogenische Lagerung (Custom Biogenic Systems) das erste System für -190°C Trockenlagerung als praktisch erste grössere Neuheit für kryogenische Lagerung seit den Tagen von James Dewar entwickelte. Das übliche Ziel ist es, Proben bei einer Temperatur gut unter dem Rekristallisationspunkt aufzubewahren, und je grösser der Puffer zwischen diesem Punkt und der herrschenden Lagertemperatur ist, desto sicherer ist die Lagerung. Leider weisen viele herkömmliche Lagersysteme grosse vertikale Temperaturgradienten auf, wobei es leicht möglich ist, dass Proben Temperaturen über dem Rekristallisationspunkt ausgesetzt sind. Ferner sind bestimmte Materialien selbst für Temperaturwechsel im Bereich zwischen 130 und -190°C anfällig. Hybridome (Zellkulturen von Hybridzellen), als Beispiel, sind bekannt, für die Empfindlichkeit bei dauernden Temperaturwechsel. Eine gleichbleibende Lagertemperatur mit dem grösstmöglichen Puffer zum Rekristallisationspunkt und dem bestmöglichen Gradient stellt die Ideallösung dar. Herkömmliche Dampf-Phasen-Tiefkühlgeräte können diese Idealbedingungen nicht erfüllen. Einige Produkte wurden mit Hitzeweichen nachgerüstet, um die Verdampfung von LN2 zwecks Herabsetzung der Dampftemperatur zu erhöhen, aber abgesehen davon, dass solche Vorrichtungen den Verbrauch von LN2 steigern und die Eisbildung rund um den Deckel erhöhen können, erreichen sie immer noch nicht die Stabilität und die Temperatur, die eine einwandfreie Langzeitlagerung bieten sollte. Neueste Entwicklungen -190°C Trockenlagerung Eigentlich beruhen alle früheren Methoden der kryogenischen Lagerung auf der Erfindung von James Dewar, also auf einer Art von Lagerung, die während über 100 Jahre gebräuchlich war. In der Zwischenzeit hat sich viel entwickelt, z.B. auf dem Gebiet der Zellkulturen. Man stelle sich nur all die neuen Medien und neuen Techniken in der Probenvorbereitung vor, doch letzten Endes landet das meiste Probenmaterial immer noch in einem Dewar mit flüssigem Stickstoff. Mit grossem Aufwand hat man die Lebensfähigkeit der gelagerten Materialien gesteigert, aber nur wenig wurde geändert, sobald es um die kryogenische Lagerung geht. © Labtec Services AG Trockenlagersystem mit LN2 im Mantel Dieses neue Lagerungssystem verwendet das gleiche Vakuumgefäss wie konventionelle Tiefkühlgeräte, aber anstatt den Fundus von flüssigem Stickstoff im Tank zu haben, befindet sich das LN2 in den Wänden dieses Tiefkühlgerätes. Abgesehen von der hierdurch erzielten Verminderung des Risikos einer Querkontaminierung durch LN2 (es befindet sich eben kein LN2 im Tank), konnte man im Lagerungsbereich eine Luftzirkulation einrichten, mit der durch die Kombination der Konvektion von Boden und Wänden von oben bis unten eine sehr stabile Temperatur von rund 190°C erzielt wird. Dies zusammen mit der Tatsache, dass das gesamte Innere des Tiefkühlgerätes für die Lagerung zur Verfügung steht, macht diese Methode künftig zum bevorzugten kryogenischen Lagerungsverfahren. Es gibt natürlich auch mechanische Tiefkühlgeräte, die in der Lage sind, kryogenische Temperaturen zu erreichen. Hersteller wie Thermo und Sanyo beliefern den Markt mit 5 von 6 solchen Geräten, in denen ebenfalls keine Berührung mit der Flüssigkeit eintreten kann. Diese Geräte gehören deshalb auch zur Trockenlagerungskategorie. Der einzige Unterschied zwischen diesen mechanischen Trockenlagerungssystemen und den nichtmechanischen Geräten besteht darin, dass die tiefste Lagertemperatur bei ersteren 152°C beträgt verglichen mit -192°C bei den anderen. weder Situation verhüten, die Funktionen oder Unversehrtheit von Geweben und Zellen nachteilig beeinflussen könnte. Sind bei Ihnen Gewebe und Zellen noch in einer Dampftemperatur gelagert, die eventuell zu warm ist oder einen zu grossen Gradienten hat, empfehlen wir ihnen eine entsprechende Risikoanalyse zu erstellen. Zweifelsohne haben die Trockenlagerungssysteme mit einem Temperaturbereich von ca. -190°C eine grosse Zukunft. Sie bieten die Vorteile von LN2 (stabile Temperatur etwa 60°C entfernt vom Rekristallisationspunkt) ohne dessen Nachteile (Querkontaminierung durch LN2 und risikobelastete Handhabung durch den Anwender). Europäische Richtlinien Alle europäischen Regierungen haben sich ernsthaft mit den Risiken von Querkontaminierung wie auch von Verminderung der Lebensfähigkeit durch grosse vertikale Temperaturgradienten während der Kryolagerung befasst. Besonders im Hinblick auf menschliche Gewebe und Zellen, hat die Europäische Gemeinschaft die Richtlinie 2004/23/EG des Europäischen Parlaments und des Rates vom 31. März 2004 zur Festlegung von Qualitäts- und Sicherheitsstandards für die Spende, Beschaffung, Testung, Verarbeitung, Konservierung, Lagerung und Verteilung von menschlichen Geweben und Zellen erlassen. Die Frist zur Verwirklichung ist im April 2006 abgelaufen. Artikel 20.3 dieser Richtlinien bezieht sich darauf, dass Einrichtungen in ihren Standardbetriebsverfahren besondere Vorschriften aufnehmen sollen, um die Kontaminierung anderer Gewebe und Zellen zu verhindern. Sind menschliches Gewebe oder Zellen bei Ihnen heute noch in flüssigem Stickstoff gelagert respektive getaucht, dann wäre es wahrscheinlich an der Zeit, die Lagerungsstrategie neu zu überdenken. Artikel 21.3 dieser Richtlinien bezieht sich darauf, dass Einrichtungen Verfahren ausgestalten und anwenden, die den Eintritt jed- © Labtec Services AG Schlussfolgerungen Während 100 Jahren war Kryolagerung gleichbedeutend mit Lagerung in flüssigem Stickstoff. Die zunehmende Zahl von ansteckenden Krankheiten hat zu einem Wechsel von der Lagerung in Flüssigkeit zur Lagerung in Dampf geführt. Während die Entwicklung der Techniken, Media und Kryoprotektoren zur Verbesserung der Lebensfähigkeit beigetragen haben, hat umgekehrt der Übergang zur Dampflagerung mit grossen vertikalen Temperaturunterschieden eine Verminderung der Lebensfähigkeit der gelagerten Proben verursacht. Sowohl als Folge des oben erwähnten als auch einer Risikoanalyse auf Grund der neuen europäischen Richtlinien findet heute ein Wechsel zu den neuen -190°CLagersystemen statt, kryogenischen Tiefkühlgeräten, die speziell dafür konstruiert wurden, ohne Stickstoff im Lagerraum zu arbeiten. Zusammenfassung Die Entwicklungen bei der Kryolagerung laufen von Flüssiglagerung zur Dampflagerung und heute zu -190°CTrockenlagerung. Labtec Services AG Nordstrasse 9 CH 5612 Villmergen T 056 619 89 19 F 056 619 89 18 www.labtec-services.ch 6 von 6