Manual de Prácticas de Laboratorio

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Manual de Prácticas
de
Laboratorio
de
Biotecnología
M. en C. Evelyn Romero Borbón
M. en C. y T. Lorena Ramírez Velasco
Lic. en Químico Farmacobiólogo
Biotecnología
Extracto del Reglamento de Laboratorios
de Química (D-CL-20) del Centro Universitario UTEG
Artículo 1.- El presente reglamento es obligatorio y de observancia general, tanto para
el personal como para los alumnos que conforman la comunidad universitaria UTEG, y
tiene por objeto regular el uso y conservación de los laboratorios y equipos
especializados en química, incluyendo a sus ramas disciplinarias, así como los
derechos y obligaciones de los usuarios y encargados de los mismos.
Artículo 3.- Para los efectos de este reglamento se entiende por:
a. Agente Infeccioso: microorganismo capaz de causar una enfermedad si se
reúnen las condiciones para ello y cuya presencia en un residuo lo hace
peligroso.
b. Laboratorio de Química: lugar habilitado con material e instrumentos
especializados para realizar investigaciones y experimentos de tipo científico, en
la materia de química incluyendo sus ramas disciplinarias.
c. Residuos Peligrosos: son aquellos que posean alguna de las características de
corrosividad, reactividad, explosividad, toxicidad, inflamabilidad, o que contengan
agentes infecciosos que les confieran peligrosidad, así como envases,
recipientes, embalajes y suelos que hayan sido contaminados cuando se
transfieran a otro sitio.
d. Residuos Peligroso Biológico-Infecciosos: aquellos clasificados como tales
en las Normas Oficiales Mexicanas, como la sangre, sus componentes y
derivados; cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos; desechos
patológicos como tejidos, órganos, cadáveres y partes de animales; muestras
biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico,
excluyendo orina y excremento; residuos no anatómicos como materiales de
curación que contengan algún tipo de líquido corporal y derivados de los
laboratorios; y objetos punzocortantes contaminados y no contaminados
(lancetas, jeringas, porta y cubreobjetos, navajas de bisturí).
e. Usuario: toda persona miembro de la comunidad universitaria UTEG, sea
personal académico, alumnos y trabajadores administrativos, que utilice o haga
uso de los laboratorios de química.
Artículo 6.- Toda persona que haga uso de los laboratorios deberá registrar su ingreso
en las bitácoras correspondientes que, para el efecto de registro, posea el centro
universitario, anotando su nombre, matricula o número de empleado y firma.
Artículo 7.- Todas las prácticas y/o experimentos que se realicen en los laboratorios
deberán estar supervisados por el docente de la asignatura correspondiente.
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Biotecnología
Artículo 8.- Los usuarios deberán portar, al ingresar a los laboratorios, el siguiente
atuendo:
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.
Bata blanca de manga larga abotonada, con el logo de la institución.
Lentes de seguridad.
Paño o franela para limpiar su área de trabajo.
No usar lentes de contacto, quienes necesiten lentes correctivos deberán portar
anteojos.
Calzado cerrado, de piso, no de tela y suela antiderrapante (el zapato deberá
cubrir completamente el empeine; no se permitirá la entrada con zapato abierto o
semicerrado, con o sin calcetines).
Pantalón largo de mezclilla o gabardina de algodón. No se permite la entrada con
pantalón corto, faldas, blusas escotadas o de tirantes.
Cabello recogido (en el laboratorio que se requiera portar cofia).
Uñas cortas y limpias, sin esmalte.
No accesorios como aretes, anillos, cadenas, pulseras, esclavas y/o relojes.
Portar guantes de látex y cubre bocas (bajo indicación del docente, de acuerdo al
tipo de práctica y de laboratorio).
Mujeres sin maquillaje, de acuerdo al tipo de práctica y de laboratorio, bajo la
indicación del docente.
Asimismo, es obligatorio llevar a cabo la técnica de lavado de manos indicada por los
docentes al iniciar y al terminar la práctica.
Artículo 9.- El docente deberá identificar los riesgos específicos de cada práctica e
indicar las medidas y procedimientos de seguridad adecuados para su realización, en
especial si el alumno pudiera estar expuesto a situaciones de peligro o riesgo, con
sustancias peligrosas por el tipo de sus características explosivas, volátiles, corrosivas,
reactivas, tóxicas, inflamables o infeccionas.
Artículo 11.- Durante el desarrollo de las prácticas en los laboratorios, los docentes a
cargo son responsables directos del correcto uso de las instalaciones, material, equipo,
reactivos y sustancias, siendo su obligación reportar cualquier irregularidad descubierta
en los mismos, notificando por escrito de inmediato al personal a cargo de los
laboratorios, así como de los eventuales infractores en su caso.
Artículo 12.- El docente que utilice los laboratorios deberá permanecer en los mismos
hasta que concluya la práctica, siendo responsable de proporcionar una asesoría
adecuada y de calidad a los alumnos durante su desarrollo, así como del
comportamiento de los alumnos.
Artículo 13.- Los alumnos son responsables del material y equipo de los laboratorios
que empleen durante las prácticas. En caso de falla o desperfecto en los equipos,
deberán reportarlo de inmediato al docente a cargo de la práctica y/o al Técnico
Laboratorista y/o Coordinador de Laboratorios. Para el caso de que algún alumno
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Biotecnología
rompa de manera accidental o intencionada el material o instrumentos del laboratorio,
deberá reponerlo en la misma calidad, cantidad y de la misma marca que el que le fue
entregado.
Artículo 14.- Son obligaciones de los usuarios de los Laboratorios de Química, las
siguientes:
a. Asistir con puntualidad a las prácticas.
b. Permanecer en orden y guardar silencio.
c. Abstenerse de jugar, correr, hacer bromas y emplear lenguaje inadecuado dentro
de las instalaciones.
d. Realizar el lavado de manos indicado por el docente antes de iniciar la práctica.
e. Atender a las indicaciones de vestimenta y atuendo indispensable para asistir a
las prácticas.
f. Acatar a la brevedad las indicaciones del docente o encargado del laboratorio y/o
técnico auxiliar de laboratorio.
g. Hacer un uso adecuado de las instalaciones, equipo, materiales, sustancias y/o
reactivos.
h. Respetar los horarios y condiciones de uso de los laboratorios y sus equipos
especializados.
i. Revisar con antelación al desarrollo de la práctica, en el manual correspondiente,
el material necesario para su realización, solicitado por el docente y/o técnico y/o
encargado de laboratorio, ya que sin él no podrán realizarla, ni ingresar al
laboratorio, sin excepción.
j. Atender a las indicaciones del docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio,
para la disposición final de las sustancias y reactivos empleados durante las
prácticas.
k. Localizar el equipo de seguridad para que, en cualquier contingencia, puedan
operarlo.
l. Usar solamente equipo que se encuentre en buenas condiciones y reportar
cualquier desperfecto de inmediato a su docente y/o encargado de laboratorio.
m. Guardar su material limpio, seco y completo en la gaveta asignada para tal
efecto.
n. Una vez concluida la actividad dentro del laboratorio, dejar en perfecto orden el
entorno en el cual estuvo trabajando; apagar y entregar equipos y materiales,
limpiar las mesas de trabajo, acomodar las bancas o sillas; retirar y limpiar los
papeles y elementos utilizados, y reportar cualquier falla del equipo.
Artículo 15.- Los alumnos tienen la posibilidad de alquilar en la dirección administrativa
del plantel, un lócker al inicio de cada ciclo escolar, para el efecto de que guarden sus
objetos personales durante las prácticas de laboratorio; en caso contrario, los alumnos
no podrán dejar sus pertenencias en los pasillos, aulas o dentro del laboratorio, y la
institución no se hace responsable de los daños que puedan sufrir.
III
Biotecnología
Artículo 16.-El alumno deberá leer cuidadosamente las etiquetas de los reactivos; en
caso de accidente, deberá actuar con calma y reportar inmediatamente lo sucedido al
docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio.
Artículo 17.- Los alumnos deberán observar los cuidados necesarios para el manejo de
los equipos utilizados en la práctica y leer previamente el instructivo de trabajo, el cual
se encontrará al lado del equipo. Cualquier duda al respecto deberá consultarla con el
encargado y/o técnico del laboratorio y/o docente.
Artículo 25.- Para poder ingresar a los laboratorios, el alumno deberá portar el atuendo
establecido en el presente reglamento, en caso contrario, será facultad del Docente y/o
encargado y/o técnico de laboratorio, restringirle el acceso al mismo; de igual manera,
deberá asistir con puntualidad en las horas programadas para la práctica.
Se nombrará lista de asistencia 10 diez minutos después de la hora señalada para la
práctica, después de lo cual no se permitirá el acceso o salida a ningún alumno; sin
excepción.
Artículo 26.- Se dará una tolerancia de sólo 5 cinco minutos para desocupar las
instalaciones, una vez concluido el horario designado. La ausencia de un docente o
grupo de alumnos en el horario posterior al que le corresponde, no da derecho a seguir
ocupando los laboratorios. Ante la omisión reiterada en el cumplimiento de este artículo
(dos o más veces), se podrá negar una nueva reservación, a criterio del Director
Académico.
Artículo 28.- El docente deberá respetar las fechas y número de prácticas establecidas
por él mismo en el programa de prácticas del laboratorio. Si el docente planea realizar
una práctica diferente a la programada, deberá notificar con preferencia 3 tres días de
anticipación para evitar el gasto innecesario de reactivos y/o uso de equipos. Ante la
omisión reiterada en el cumplimiento de este artículo (dos o más veces), se podrá negar
una nueva reservación, a criterio del Director Académico.
Artículo 29.- El usuario conservará y mantendrá el orden y limpieza de las instalaciones
y equipos de los laboratorios de química. Si el laboratorio se encuentra sucio antes de
empezar la sesión, el usuario deberá reportarlo al encargado y/o técnico en turno; en
caso de no recibir respuesta favorable, se deberá reportar a la Dirección Académica.
Artículo 30.- Al inicio de cada semestre los alumnos deberán agruparse por equipos o
mesas de laboratorio para realizar las prácticas que les corresponda durante todo el
ciclo escolar, nombrando un representante. El docente y/o encargado y/o técnico de
laboratorio les entregará por equipo o mesa el material que requerirán a lo largo del
semestre, firmando el responsable del equipo, mismo que deberán guardar en la gaveta
IV
Biotecnología
que les corresponda. Al final del semestre, el material deberá ser devuelto íntegro, de lo
contrario le será condicionada la reinscripción al equipo completo.
Existe material que no debe reusarse por la naturaleza de las muestras que se manejan
(como portaobjetos, cubreobjetos), este material deberá desecharse en su contenedor
correspondiente y el alumno deberá reponerlo en la práctica inmediata posterior en que
fue desechado.
Artículo 31.- Al inicio de cada práctica el alumno deberá solicitar al docente y/o
encargado y/o técnico de laboratorio la llave de la gaveta donde se encuentra su
material, para poder emplear el requerido durante la práctica; al final de la misma el
material deberá ser devuelto completamente limpio y seco. En caso de que éste sufra
algún desperfecto, deberá reportarlo al docente y/o encargado del laboratorio, de lo
contrario, asumirá la responsabilidad correspondiente.
Artículo 32.- Por ningún motivo el alumno deberá tratar de abrir o reparar el material o
equipo del laboratorio por sí mismo. Cualquier falla en el equipo o material deberá ser
reportada al docente o técnico y/o encargado del laboratorio.
Artículo 33.- El material y/o equipo utilizado debe ser devuelto en las condiciones que
fue prestado. Por tal motivo, en caso de que el usuario dañe el equipo y/o material a su
cargo de manera accidental o intencional, deberá reponerlo en la práctica inmediata
posterior por uno igual en marca y características. En caso contrario, se le negará el
servicio por tiempo indefinido y se levantará el acta correspondiente, ajeno a la sanción
que le corresponda de acuerdo al Reglamento de Alumnos.
En el caso de docentes y/o técnicos laboratoristas que dañen algún equipo o material,
se valorará el por parte de Coordinación de Laboratorios y la Dirección Académica; en
caso de que tengan que pagar o reponer el material esto se puede hacer mediante un
descuento vía nómina previo Vo. Bo. del departamento de Recursos Humanos.
Artículo 34.- Para el caso de que el laboratorio no cuente con las muestras necesarias
para el desarrollo de la práctica, el docente deberá solicitarlas a sus alumnos con
anticipación.
Artículo 38.- Se debe conservar siempre limpia la mesa de trabajo al inicio, durante y al
finalizar cada práctica; depositar toda la basura en los cestos correspondientes.
Los vertederos deberán estar siempre libres de residuos, no se deberán arrojar cuerpos
sólidos ni papeles.
Artículo 44.- Queda estrictamente prohibido a los usuarios lo siguiente:
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Biotecnología
a. Mascar chicle, introducir y consumir bebidas, alimentos, cigarrillos o cualquier
tipo de golosina dentro del área de laboratorios.
b. El uso de lentes oscuros, gorras, audífonos, teléfonos celulares, reproductor de
música o video; videojuegos o cualquier equipo electrónico de entretenimiento o
comunicación no permitido durante el uso de los laboratorios.
c. El uso de sandalias, bermudas, pantalones cortos, cabello largo suelto,
accesorios prominentes y corbata.
d. Ingresar al laboratorio, tanto alumnos como docentes, sin bata de marga larga o
con una bata diferente a la reglamentaria.
e. El desorden y ruidos fuera de lo normal, dentro y fuera de los laboratorios; en
todo caso los usuarios deberán esperar para su ingreso en el perímetro de
acceso a que llegue su docente.
f. La entrada a personas ajenas a la comunidad Universitaria UTEG.
g. Correr, jugar, hacer bromas o acciones que pongan el peligro su seguridad y la
de sus compañeros.
h. Ingresar a los laboratorios si no está presente el docente o encargado de
laboratorio.
i. Utilizar computadora durante la clase, excepto si se requiere para exponer algún
tema.
j. Introducirse objetos en la boca.
k. Hacer uso del equipo de seguridad y/o salida de emergencia cuando no sea
necesario.
l. Mezclar sustancias y reactivos sin la debida autorización del docente o
encargado de laboratorio.
m. Hacer un uso incorrecto del mobiliario, equipos, instalaciones, sustancias o
reactivos de los laboratorios.
n. Proferir palabras altisonantes u ofensivas entre los alumnos, docentes, técnicos
y/o encargados de laboratorio.
o. Las demás que sean establecidas por el docente, encargado y/o técnico o
Director Académico, para garantizar el buen funcionamiento y conservación de
los equipos y laboratorios de química.
Artículo 45.- Ningún alumno podrá permanecer en el recinto de los laboratorios en
ausencia de sus docentes o del responsable de laboratorio, ni portando una bata ajena
a la reglamentaria.
Ningún docente podrá permanecer en los laboratorios fuera de su programa de
prácticas sin la autorización del encargado de laboratorio y/o Director Académico de la
carrera y/o portando bata ajena a la reglamentaria.
Artículo 46.- En caso de incumplimiento a los lineamientos establecidos en el presente
reglamento, podrán ser aplicadas por el encargado o personal responsable del
laboratorio, el docente, el Director Académico y/o Administrativo, según sea el caso, sin
perjuicio de exigir la reparación de los daños ocasionados, las siguientes sanciones:
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a.
b.
c.
d.
Amonestación verbal o escrita.
Retención de credenciales.
Suspensión del servicio.
Las sanciones establecidas en el reglamento que por su relación con el Centro
Universitario le correspondan.
Artículo 47.- El alumno debe comportarse adecuadamente dentro de las instalaciones
del laboratorio, hacer uso apropiado del lenguaje oral y escrito, respetar a sus
profesores y compañeros de clase técnicos y/o encargados de laboratorio; en caso
contrario se le suspenderá el servicio temporalmente o en casos graves
indefinidamente, a criterio del docente o del encargado y/o técnico del laboratorio,
previo el aval de Dirección Académica.
Artículo 48.- Los alumnos que incumplan con las disposiciones contenidas en el
presente reglamento, deberán ser reportados por el docente y/o encargado y/o técnico
de laboratorio al Director Académico que corresponda, para que con base en el
Procedimiento de Determinación de Responsabilidad y Aplicación de Sanciones
establecido en el Reglamento de Alumnos, se determine la sanción que le corresponda
de acuerdo a la gravedad de la infracción y se glose copia del acta respectiva al
expediente del alumno.
Artículo 49.- Los docentes y técnicos y/o encargados de laboratorios que incumplan las
obligaciones que este reglamento les confiere, podrán ser sancionados con base en la
gravedad de la infracción, de acuerdo al Reglamento de Docentes o Interior de Trabajo,
según corresponda.
Artículo 50.- Los casos no previstos en este Reglamento serán solucionados por el
encargado o técnico del laboratorio, o por el Director Académico en su caso, atendiendo
a los intereses de la comunidad y teniendo a la vista el cumplimiento de las finalidades
que son propias del servicio de los laboratorios de Química del Centro Universitario.
El presente reglamento fue modificado a petición del Director Académico de la
Licenciatura en Químico Farmacobiólogo durante revisión oficiosa R03/0114 en el mes
de enero de 2014; en virtud de lo anterior se deberá entender que subsiste el contenido
en todas sus partes del presente reglamento, en lo que ve a aquellas disposiciones que
no fueron modificadas. Estas reformas entrarán en vigor a partir del mes de enero de
2014, previa autorización del Director del Macroproceso correspondiente.
TABLA DE MODIFICACIONES
REVISIÓN
R02
FECHA APROBACIÓN
Enero de 2013
MODIFICACIONES
Artículo 4, 8 inciso e) y f) y 18.
VII
Biotecnología
Contenido
Introducción, 1
Práctica Nº 1. Curva de crecimiento microbiano (bacteria), 3
Práctica Nº 2. Curva de crecimiento microbiano (levadura), 9
Práctica Nº 3. Cinética enzimática de la invertasa vía la determinación de la velocidad
inicial, 17
Práctica Nº 4. Efecto de la concentración de sustrato e inhibición de la actividad
enzimática de la invertasa, 25
Práctica Nº 5. Inmovilización de enzimas por el método de atrapamiento en gel de
alginato, 35
Práctica Nº 6. Preparación de un inóculo de levadura (Kluyveromyces marxianus) para
inducir actividad inulinasa, 41
Práctica Nº 7. Elaboración de miel de agave (jarabe de alta fructosa) vía enzimática:
aplicación de enzimas como la inulinasa, 45
Práctica Nº 8. Cuantificación de actividad inulinasa y concentración de azúcares del
fermento obtenido en la elaboración de jarabe de alta fructosa, 51
Práctica Nº 9. Preparación de un inóculo del hongo (Aspergillus niger) para inducir la
expresión de actividad pectinolítica, 56
Práctica Nº 10. Producción de enzimas pectinolíticas por fermentación sólida
empleando residuos de frutas, 61
Práctica Nº 11. Cuantificación de actividad pectinasa producida por Aspergillus niger en
fermentación sólida, 67
Práctica Nº 12. Detección de enzimas pectinolíticas por métodos electroforéticos, 73
Bibliografía, 81
Recomendaciones para el manejo de residuos biológico infecciosos, 83
Biotecnología
Introducción
La biotecnología puede definirse, de manera general, como la utilización de organismos
vivos, o bien, sistemas o procesos biológicos, para la producción industrial y servicios.
La biotecnología es interdisciplinaria, ya que comprende un campo muy amplio de
estudio; podemos decir que esta disciplina integra las ciencias de la vida con la
ingeniería. De manera general, también podemos dividir la biotecnología en áreas como
biotecnología farmacéutica, biotecnología vegetal, biotecnología de alimentos,
biotecnología ambiental, biotecnología marina, biotecnología industrial, de tal manera,
que la biotecnología utiliza las herramientas tecnológicas de cada rama de la ciencia
para generar bienes y servicios. Por lo anterior, se requiere un profundo conocimiento
de las ciencias básicas para comprender las posibilidades que ofrece la biotecnología.
La biotecnología ha estado presente entre nosotros desde hace miles de años:
desde la manipulación empírica de microorganismos para la producción de alimentos
como la cerveza, el queso, el pan, el koji, el yogurt, el vino, entre otros, hasta la época
actual con la manipulación genética de microorganismos para la producción de
antibióticos, vacunas, hormonas, tratamientos médicos mediante terapia génica, nuevas
variedades de cultivo resistentes al estrés ambiental y plagas, tecnologías «verdes» o
«amigables» con el ambiente, para el tratamiento de residuos industriales, sólo por
mencionar algunas aplicaciones modernas.
Aunque la biotecnología conlleva el uso potencial de todas las formas de vida, los
microorganismos han jugado un papel destacado en el desarrollo de esta disciplina.
Esto es debido a la facilidad de cultivo, la rápida velocidad de crecimiento y lo barato
que pueden resultar los medios de cultivo, especialmente los provenientes de desechos
industriales; aunado esto a las posibilidades de manipulación genética a las que pueden
ser sometidos para mejoramiento de la cepa y, por consiguiente, la obtención de
nuevos productos.
Este manual busca integrar los conocimientos adquiridos por el alumno durante
las la clases, con la aplicación de las técnicas experimentales de la biotecnología en el
laboratorio. Se busca que el estudiante, apoyado en los conceptos básicos de química,
bioquímica, microbiología y tecnología enzimática, desarrolle habilidades tecnológicas
para la aplicación de los microorganismos en procesos de producción de metabolitos de
interés para la industria alimenticia y farmacéutica, además de conocer las ventajas de
la biotecnología sobre técnicas químicas o físicas en el aprovechamiento de residuos.
M. en C. Evelyn Romero Borbón
M. en C y T. Lorena Ramírez Velasco
1
Biotecnología
Práctica Nº 1
Curva de crecimiento microbiano (bacteria)
Fundamento
Se entiende por ‘crecimiento microbiano’ al aumento del número de microorganismos a
lo largo del tiempo. Este incremento poblacional, que resulta de la multiplicación celular,
es un componente esencial de la función microbiana, y con él se asocian el crecimiento
así como la generación metabólica. De hecho, las bacterias son máquinas de
duplicación constante, en las que se incluyen reacciones cuya finalidad es la formación
de las macromoléculas necesarias para el ensamblaje de las nuevas estructuras
celulares de sus descendientes.
Como en la mayoría de los procariotes, las bacterias se dividen por fisión binaria,
mediante la cual la célula madre, al alcanzar determinado volumen, se divide dando dos
células hijas. El proceso de fisión binaria consiste en la autoduplicación del material
hereditario, seguido de la repartición en las dos células hijas, las que se separa por
estrangulamiento de la membrana celular y formación de la pared celular.
El conocimiento de las características de crecimiento de un microorganismo es
muy importante, pues con él se pueden reproducir los procesos industriales y aumentar
los rendimientos propios de los procesos generadores de metabolitos.
En cultivos de producción por lotes, el aumento en la masa celular como
consecuencia del cambio en el número de células o absorbancia por unidad de tiempo
(velocidad de crecimiento), permite establecer una típica curva de crecimiento en la que
se pueden observar las diferentes fases de la misma:
•
•
•
Fase de latencia o de retardo: aquí existe un aparente reposo en el que las
células sintetizan las enzimas necesarias para la actividad metabólica que deben
llevar. Cuando se hacen mediciones del número de células en distintos tiempos
dentro de esta fase, el valor no cambia sustancialmente. En cambio,
interiormente las células trabajan de manera muy activa, adaptando el equipo
enzimático al medio de cultivo. La bacteria se prepara para hacer uso de los
nutrientes que le aporta el medio, por lo tanto es la fase de adaptación al medio,
con aumento de la masa celular pero no del número de células.
Fase exponencial: la velocidad de crecimiento en esta etapa es exponencial.
Esta velocidad depende del tipo de microorganismo que se trate y de diversos
factores ambientales, tales como la temperatura, el pH, oxigenación, entre otros.
En cuanto a la generación de metabolitos primarios y secundarios, los primeros
se forman durante el crecimiento exponencial, mientras que los segundos, se
producen casi al final de esta fase y son compuestos que no forman parte del
metabolismo energético de la célula. Como ejemplos de metabolitos se
encuentran el etanol, lipasas, proteasas, entre otras.
Fase estacionaria: cuando la velocidad comienza a disminuir hasta hacerse nula,
se alcanza la fase estacionaria, ya que los cambios en la composición y
3
Biotecnología
•
concentración de los nutrientes entre el cultivo del inóculo y el medio fresco
pueden desencadenar el control y la regulación de la actividad enzimática. Esta
fase se caracteriza por el agotamiento del suministro de algún nutriente esencial
o por la acumulación de productos metabólicos que sean tóxicos. También puede
ser por la disminución de la oxigenación o cambios en las condiciones de pH del
medio de cultivo. En esta fase se equilibran el número de células nuevas con el
número de células que mueren.
Fase de la muerte celular: cuando el cultivo entra a esta fase, el número de
células que mueren se va haciendo mayor. La pendiente de esta fase puede ser
más o menos pronunciada de acuerdo al tipo de microorganismo de que se trate.
Suelen presentarse pendientes menos bruscas cuando el microorganismo
presenta alguna resistencia (esporas).
Conteo de microorganismos
Muchos estudios requieren la determinación del número de microorganismos presentes
en una unidad de volumen. Los recuentos se pueden efectuar por diferentes métodos,
ya sea sólo contando células vivas o también vivas y muertas.
Métodos de conteo directo al microscopio
Permiten efectuar el conteo de las células totales vivas y muertas. Su ventaja es que
son rápidos. Dentro de estos métodos están:
•
•
•
•
•
Conteo microscópico directo por el método de Breed.
Conteo microscópico directo en cámara de Petroff-Hauser.
Contadores electrónicos.
Métodos de conteo en medio de cultivo: método de diluciones y vaciado en caja,
técnica de conteo en placa por extensión superficial, recuento por filtro de
membrana, y siembra en tubo o recuento el número más probable.
Conteo turbidimétrico.
En esta práctica se trabajará con el conteo turbidimétrico, el cual en una suspensión
microbiana, la cantidad de células está directamente relacionada con la turbiedad o
densidad óptica de la misma, e inversamente relacionada con la cantidad de luz que
pasa a través de ella. Esto permite determinar con bastante exactitud la cantidad de
microorganismos en la suspensión mediante la determinación de la turbiedad a través
de un espectrofotómetro. Los resultados son comparados con una curva estándar
construida con una suspensión testigo de concentraciones conocidas. La turbiedad que
resulta en la suspensión microbiana se aproxima a la producida por un cierto número de
células en suspensión. Esta técnica es útil solamente para organismos unicelulares de
pocos micrómetros (μm), como las bacterias, lo que les permite mantenerse
suspendidos y homogéneamente distribuidos.
4
Biotecnología
Objetivo de la práctica
•
Determinar los parámetros cinéticos de una fermentación en cultivo por lote.
Recursos de la práctica
•
•
•
•
•
•
•
•
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•
•
•
•
Material
Matraz Erlenmeyer de
250 ml (1).
Matraces Erlenmeyer de
125 ml (2).
Tubos de rosca de
20-25 ml (10).
Gradilla para los tubos de
ensayo (1).
Pipetas de 5 ml
estériles (10).
Pipetas de 1 ml
estériles (10).
Pipetas Pasteur (2).
Probeta de 100 ml (1).
Piseta de agua
destilada (1).
Piseta con alcohol etílico
al 70 % (v/v).
Cubetas de plástico para
espectrofotómetro (10).
Espátulas (2).
Charolas para pesado (2).
•
•
•
•
•
Reactivos
Extracto de levadura
(10 mg).
Caldo nutritivo
(200 ml).
HCl 1 N (100 ml).
NaOH 1 N (100 ml).
Cepa Escherichia coli.
•
•
•
•
•
•
•
Equipo
Mecheros de
Fischer (2).
Potenciómetro (1).
Plancha de
calentamiento con
agitación (1).
Agitadores orbitales (2).
Incubadoras (2).
Espectrofotómetro
UV/Vis (1).
Centrífuga (1).
Procedimiento
1. Preparar un cultivo de Escherichia coli en un matraz Erlenmeyer con caldo nutritivo
con 0.1 % de extracto de levadura y a pH de 6.5; esto será 12 horas antes de iniciar
la práctica. Este cultivo (matraz A) se utilizará como inóculo.
2. Cada equipo preparará 120 ml de caldo nutritivo con 0.1 % de extracto de levadura
en un matraz de 250 ml. Después se ajustará el pH del medio al pH correspondiente
(pH=5 o pH=7) en el que el equipo monitoreará la cinética.
3. Estos medios de cultivo se deberán repartir en dos tipos de recipientes diferentes:
en dos tubos de ensayo con tapón de rosca con 10 ml de medio de cultivo cada
tubo, y el resto del medio de cultivo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón
de algodón cubierto de tela de gasa.
5
Biotecnología
4. Esterilizar en autoclave (15 lb/in2, 121 °C por 15 min.) las pipetas, los medios de
cultivo y los tubos vacíos.
5. En condiciones asépticas, inocular con 10 ml del cultivo E. coli (matraz A) en un
matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de caldo nutritivo (matraz B).
Homogeneizar el cultivo agitando suavemente y tomar inmediatamente, con una
pipeta estéril, 3 ml para pasarlos a un tubo de ensayo estéril. Esta muestra
corresponde al tiempo cero (t=0). Mantenerla a 4 °C.
6. El matraz B es colocado en un agitador orbital a una velocidad de 100 rpm,
incubando a la temperatura correspondiente (25 °C o 37 °C). De la misma manera,
se tomarán muestras de 3 ml cada 30 min. hasta completar 4 horas de incubación.
Se irán conservando a 4 °C.
7. Leer la densidad óptica (DO) de cada muestra en un espectrofotómetro a 560 nm,
calibrado previamente con medio de cultivo estéril. En dado caso que las muestras
reporten una DO igual o mayor a 0.8, se harán diluciones con caldo de cultivo estéril.
8. Registrar los datos de DO del cultivo de E. coli para cada condición de pH y
temperatura con respecto al tiempo.
Actividades de la práctica
1. Elaborar una gráfica de DO vs. tiempo para cada condición de pH y temperatura, e
identificar las fases de crecimiento y la duración (t) de cada una.
2. Determinar la tasa específica de crecimiento (µ) con los datos de la fase exponencial
en la gráfica y calcular el tiempo de duplicación de E. coli en cada condición de pH y
temperatura.
6
Biotecnología
Resultados
Observaciones
Conclusiones
7
Biotecnología
Bibliografía consultada para contestar
las actividades del Manual de Prácticas de Laboratorio
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
2.3.4.5.-
Datos del alumno
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
Anexo
Caldo nutritivo. Es un medio líquido complejo para uso general en el cultivo de
bacterias.
Ingredientes
Peptona de caseína
NaCl
Extracto de carne
pH
•
•
•
8
(g/l)
5.0
8.0
3.0
6.5-7.0
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado y ajustar el pH.
Distribuir en tubos de ensayo o matraces.
Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
Biotecnología
Práctica Nº 2
Curva de crecimiento microbiano (levadura)
Fundamento
Se entiende por ‘crecimiento microbiano’ al aumento del número de microorganismos a
lo largo del tiempo. Este incremento poblacional, que resulta de la multiplicación celular,
es un componente esencial de la función microbiana, y con él se asocian el crecimiento
así como la generación metabólica. De hecho, las bacterias son máquinas de
duplicación constante, en las que se incluyen reacciones cuya finalidad es la formación
de las macromoléculas necesarias para el ensamblaje de las nuevas estructuras
celulares de sus descendientes.
En el caso de las levaduras se dividen por gemación. Ésta consiste en la
formación una pequeña protuberancia que aumenta progresivamente de tamaño; luego
se produce la división en el núcleo y una de las mitades de éste migra hacia el botón.
Finalmente, éste crece hasta tener un tamaño suficiente y se separa, formando otra
célula idéntica a la madre. Las células hijas, sin importar el procedimiento de división
celular, deben heredar todo el potencial genético y son idénticasa la madre.
En cultivos de producción por lotes, el aumento en la masa celular como
consecuencia del cambio en el número de células o absorbancia por unidad de tiempo
(velocidad de crecimiento), permite establecer una típica curva de crecimiento en la que
se pueden observar las diferentes fases de la misma:
•
•
•
Fase de latencia o de retardo: aquí existe un aparente reposo en el que las
células sintetizan las enzimas necesarias para la actividad metabólica que deben
llevar. Cuando se hacen mediciones del número de células en distintos tiempos
dentro de esta fase, el valor no cambia sustancialmente. En cambio,
interiormente las células trabajan de manera muy activa, adaptando el equipo
enzimático al medio de cultivo. El microorganismo se prepara para hacer uso de
los nutrientes que le aporta el medio, por lo tanto es la fase de adaptación al
medio, con aumento de la masa celular pero no del número de células.
Fase exponencial: la velocidad de crecimiento en esta etapa es exponencial.
Esta velocidad depende del tipo de microorganismo que se trate y de diversos
factores ambientales, tales como la temperatura, el pH, oxigenación, entre otros.
En cuanto a la generación de metabolitos primarios y secundarios, los primeros
se forman durante el crecimiento exponencial, mientras que los segundos, se
producen casi al final de esta fase y son compuestos que no forman parte del
metabolismo energético de la célula. Como ejemplos de metabolitos se
encuentran el etanol, lipasas, proteasas, entre otras.
Fase estacionaria: cuando la velocidad comienza a disminuir hasta hacerse nula,
se alcanza la fase estacionaria, ya que los cambios en la composición y
concentración de los nutrientes entre el cultivo del inóculo y el medio fresco
pueden desencadenar el control y la regulación de la actividad enzimática. Esta
9
Biotecnología
•
fase se caracteriza por el agotamiento del suministro de algún nutriente esencial
o por la acumulación de productos metabólicos que sean tóxicos. También puede
ser por la disminución de la oxigenación o cambios en las condiciones de pH del
medio de cultivo. En esta fase se equilibran el número de células nuevas con el
número de células que mueren.
Fase de la muerte celular: cuando el cultivo entra a esta fase, el número de
células que mueren se va haciendo mayor. La pendiente de esta fase puede ser
más o menos pronunciada de acuerdo al tipo de microorganismo de que se trate.
Suelen presentarse pendientes menos bruscas cuando el microorganismo
presenta alguna resistencia (esporas).
Conteo de microorganismos
Muchos estudios requieren la determinación del número de microorganismos presentes
en una unidad de volumen. Los recuentos se pueden efectuar por diferentes métodos,
ya sea sólo contando células vivas o también vivas y muertas.
Métodos de conteo directo al microscopio
Permiten efectuar el conteo de las células totales vivas y muertas. Su ventaja es que
son rápidos. Dentro de estos métodos están:
•
•
•
•
•
Conteo microscópico directo por el método de Breed.
Conteo microscópico directo en cámara de Petroff-Hauser.
Contadores electrónicos.
Métodos de conteo en medio de cultivo: método de diluciones y vaciado en caja,
técnica de conteo en placa por extensión superficial, recuento por filtro de
membrana, y siembra en tubo o recuento el número más probable.
Conteo turbidimétrico.
En esta práctica se trabajará con el conteo turbidimétrico, basada en la medida de la
turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La
turbidez es proporcional a la masa de las partículas en suspensión (células) y su
medida nos permite estimarla. Para ello las medidas se hacen a una longitud de onda
adecuada y los valores son denominados ‘valores de densidad óptica’. La limitación de
este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue entre células vivas y
muertas y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a
10,000 células por mililitro.
Objetivo de la práctica
•
10
Determinar los parámetros cinéticos de una fermentación de levadura en cultivo por
lote.
Biotecnología
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material
250 ml (1).
Matraces Erlenmeyer
de 125 ml (2).
Tubos de rosca de
20-25 ml (10).
Gradilla para los tubos
de ensayo (1).
Pipetas de 5 ml
estériles (10).
Pipetas de 1 ml
estériles (10).
Pipetas Pasteur (2).
Piseta de agua
destilada (1).
Piseta con alcohol
etílico al 70% (v/v).
Cubetas de plástico
para
espectrofotómetro (10).
Espátulas (2).
Charolas para
pesado (2).
•
•
•
•
•
Reactivos
Extracto de levadura
(10 mg).
Caldo nutritivo (200 ml).
HCl 1N (100 ml).
NaOH 1N (100 ml).
Cepa Saccharomyces
cerevisiae.
•
•
•
•
•
•
•
Equipo
Mecheros de
Fischer (2).
Potenciómetro (1).
Plancha de
calentamiento con
agitación (1).
Agitadores orbitales (2).
Incubadoras (2).
Espectrofotómetro
UV/Vis (1).
Centrífuga (1).
Procedimiento
1. Preparar un cultivo de Saccharomyces cerevisiae en un matraz Erlenmeyer con
caldo nutritivo con 0.1 % de extracto de levadura y a un pH de 6.5; esto será
24 horas antes de iniciar la práctica. Este cultivo (matraz A) se utilizará como
inóculo.
2. Cada equipo preparará 120 ml de caldo nutritivo con 0.1 % de extracto de levadura
en un matraz de 250 ml. Después se ajustará el pH del medio al pH correspondiente
(pH=5 y pH=7) en el que el equipo monitoreará la cinética.
3. Estos medios de cultivo se deberán repartir en dos tipos de recipientes diferentes:
en dos tubos de ensayo con tapón de rosca con 10 ml de medio de cultivo cada
tubo, y el resto del medio de cultivo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón
de algodón cubierto de tela de gasa.
4. Esterilizar en autoclave (15 lb/in2, 121 °C por 15 min.) las pipetas, los medios de
cultivo y los tubos vacíos.
11
Biotecnología
5. En condiciones asépticas, inocular con 10 ml del cultivo S. cerevisiae (matraz A) en
un matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de caldo nutritivo (matraz B).
Homogeneizar el cultivo agitando suavemente y tomar inmediatamente, con una
pipeta estéril, 3 ml para pasarlos a un tubo de ensayo estéril. Esta muestra
corresponde al tiempo cero (t=0); mantenerla a 4 °C.
6. El matraz B es colocado en un agitador orbital a una velocidad de 100 rpm,
incubando a la temperatura correspondiente (25 °C o 37 °C). De la misma manera,
se tomarán muestras de 3 ml cada 6 horas hasta completar 48 horas de incubación
y se irán conservando a 4 °C.
7. Leer la densidad óptica (DO) de cada muestra en un espectrofotómetro a 560 nm,
calibrado previamente con medio de cultivo estéril. En dado caso que las muestras
reporten una DO igual o mayor a 0.8, se harán diluciones con caldo de cultivo estéril.
8. Registrar los datos de DO del cultivo de S. cerevisiae para cada condición de pH y
temperatura con respecto al tiempo.
1. Elaborar una gráfica de DO vs. tiempo para cada condición de pH y temperatura, e
identificar las fases de crecimiento y la duración (t) de cada una.
12
Biotecnología
2. Determinar la tasa específica de crecimiento (µ) con los datos de la fase exponencial
en la gráfica y calcular el tiempo de duplicación de S. cerevisiae en cada condición
de pH y temperatura.
3. Reportar las diferencias encontradas en la Práctica 1 y la Práctica 2, con respecto al
crecimiento microbiano entre bacterias y levaduras.
4. ¿Cuál es la aplicación y la importancia de los estudios de cinética del crecimiento
microbiano?
13
Biotecnología
Resultados
Observaciones
Conclusiones
14
Biotecnología
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
2.3.4.5.-
Datos del alumno
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
Anexo
Caldo nutritivo. Es un medio líquido complejo para uso general en el cultivo de
bacterias.
Ingredientes
Peptona de caseína
NaCl
Extracto de carne
pH
•
•
•
(g/l)
5.0
8.0
3.0
6.5-7.0
Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado y ajustar el pH.
Distribuir en tubos de ensayo o matraces.
Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
15
Biotecnología
Práctica Nº 3
Cinética enzimática de la invertasa
vía determinación de la velocidad inicial
Fundamento
La actividad catalítica de una enzima se determina midiendo la velocidad inicial de
reacción, que es la pendiente de la curva de progreso en el tiempo cero. Inicialmente,
las reacciones transcurren linealmente, pudiéndose tomar la pendiente de esta recta
como velocidad inicial. A tiempos más largos, el progreso de la reacción se aparta de la
linealidad. Esta caída de la velocidad de reacción se debe a la disminución significativa
de la concentración de sustrato, aunque también pueden influir otros factores como el
aumento de la concentración de producto, cambios de pH, inactivación de la enzima,
etcétera. La máxima fiabilidad en la determinación de la actividad de la enzima la
suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de progreso
lineal de la reacción.
Efecto de la temperatura y pH sobre la actividad enzimática
Puesto que la estructura proteica es la que determina la actividad enzimática, cualquier
causa que perturbe esta estructura puede llevar a una pérdida de actividad. Aunque el
rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimáticas es muy
estrecho, los ligeros cambios suelen tener una considerable influencia. Al aumentar la
temperatura, la velocidad de reacción aumenta y, para casi todas las enzimas, un
incremento de 10 °C duplica e incluso triplica la velocidad de reacción. Por otro lado,
ese mismo aumento de temperatura acelera también la inactivación de la enzima por
desnaturalización térmica. Para muchas enzimas, la región de inactivación térmica está
muy próxima de la temperatura óptima.
Durante la fase de incremento de la velocidad por efecto de la temperatura, la
relación entre ésta y la temperatura viene determinada por la ecuación de Arrhenius:
⁄
ln
ln
⁄
Donde Ea es la energía de activación, R la constante de los gases y T la temperatura
absoluta; el valor de Ea se puede calcular a partir de la representación de Arrhenius.
Con respecto al pH óptimo de las enzimas, éste varía ampliamente, sin embargo,
la gran mayoría lo tiene entre 4 y 8; muchas de ellas, alrededor del pH fisiológico del
organismo (~7.3-7.4). Algunas enzimas muestran una amplia tolerancia a los cambios
de pH, pero otras trabajan bien sólo en un estrecho rango. La relación entre pH y la
actividad, depende del comportamiento ácido-base de la enzima y del propio sustrato.
Sustrato y enzima pueden contener grupos funcionales ácidos y básicos, siendo su
grado de disociación dependiente del pH lo que determinará, entre otros aspectos, la
17
Biotecnología
conformación de las proteínas, la capacidad de unión del sustrato al centro activo de la
enzima y la capacidad de transformación del sustrato.
Invertasa
Por otro lado, la sacarosa es un disacárido compuesto de una molécula α-D-glucosa y
una molécula de β-D-fructosa, unidas por un enlace α-1,4-glicosídico. Cuando este
enlace es hidrolizado, se produce una mezcla equimolar de glucosa y fructosa. Esta
mezcla de monosacáridos es llamada ‘azúcar invertida’. Una enzima que hidroliza este
enlace es la invertasa (β-fructofuranosidasa, EC 3.2.1.26).
Para definir la actividad de una preparación enzimática se utilizan en la práctica
distintas expresiones. La cantidad de enzima se indica habitualmente en unidad de
actividad enzimática (U). Se define como la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de un micromol de sustrato por minuto (µmol/min), bajo condiciones
óptimas de temperatura y pH. Normalmente las unidades de actividad que contiene una
solución se suelen expresar en función del volumen de la misma (U/ml). El Sistema
Internacional de Unidades ha definido la unidad de actividad enzimática como la
cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se
llama ‘katal’ (kat). Como 1 mol son 1x106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta
que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan
frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal
(nkat, 10-9 kat). Para el caso de la determinación de la actividad invertasa utilizada en
esta práctica, se usará la siguiente fórmula:
Donde:
V
es el volumen total del ensayo (ml), que para el caso de los ensayos realizados en
esta práctica es de 10.25 ml.
t
es el tiempo del ensayo (min).
Venz es el volumen de enzima empleada en el ensayo (ml), 0.25 para los ensayos
realizados en esta práctica.
Vmed es el volumen utilizado en la determinación colorimétrica (ml), y como se usarán
cubetas para el espectrofotómetro con un volumen de 1 ml, el valor usado será 1.
FD es el factor de dilución de la muestra medida.
µmoles de glucosa liberados se calcularán mediante la relación de la concentración
con la absorbancia obtenidos de la curva de calibración.
Objetivos de la práctica
•
•
18
Medir los parámetros cinéticos de la enzima invertasa.
Explicar los mecanismos de acción enzimáticos para extrapolar a enzimas de uso
farmaceútico.
Biotecnología
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material
Tubos de rosca (20-25 ml,
60 tubos).
Pipeta de vidrio de
0.5 ml (5).
Pipeta de vidrio de
5 ml (10).
Pipetas Pasteur de
plástico.
Vasos de precipitado de
50 ml (5).
Vaso de precipitado de
250 ml (5).
Piseta de agua
destilada (1).
Piseta de solución de
etanol al 70 % (1).
Gradillas para tubos de
ensayo (4).
el espectrofotómetro (15).
Guantes de látex.
•
•
•
•
•
Reactivos
Buffer acetato de
sodio, 50 mM, pH 5.0
(200 ml).
Glucosa anhidra
(4 mg/ml, 20 ml).
Extracto enzimático de
invertasa de levadura
de panadería (10 ml).
Reactivo de DNS
(150 ml).
Sacarosa (0.2 M,
50 ml).
•
•
•
•
•
•
•
Equipo
Termómetro.
Parrilla de
calentamiento.
Centrífuga.
Balanza.
Espectrofotómetro
UV/Vis.
Potenciómetro.
Vórtex.
El extracto enzimático se preparará suspendiendo 50 mg de preparado liofilizado de la
levadura en 10 ml de buffer de extracción (buffer acetato 0.05 M, pH 5.0). Agitar la
mezcla durante 15 min., centrifugar y tomar el sobrenadante como extracto enzimático.
Procedimiento
Curva de calibración
1. En una gradilla poner 12 tubos de ensayo, etiquetarlos del 0 al 5, y agregar lo que
aparece en la TABLA 1; donde la solución patrón es la solución de glucosa a 4 mg/ml.
19
Biotecnología
Tabla 1. Preparación de la curva patrón para cuantificación de azúcares utilizando el
reactivo DNS.
Solución
Agua
Concentración de
Concentración de
Tubo
patrón (ml)
(ml)
glucosa (mg/ml)
glucosa (µmoles)
0
0.0
2.0
0.0
0.00
1
0.4
1.6
0.2
1.11
2
0.8
1.2
0.4
2.22
3
1.2
0.8
0.6
3.33
4
1.6
0.4
0.8
4.44
5
2.0
0.0
1.0
5.55
2. A cada uno de estos tubos agregar 2 ml del reactivo DNS y llevarlos a ebullición
durante 5 minutos en un baño de agua. Pasado este tiempo, los tubos se pondrán a
enfriar al chorro de agua o bien podrán dejarse enfriar por sí solos hasta que
alcancen la temperatura ambiente.
3. Cuando los tubos alcancen la temperatura ambiente, agregar 16 ml de agua agitar
en el vórtex.
4. Se tomará 1 ml de cada tubo y éstos se colocarán en cubetas desechables para
tomar lectura en el espectrofotómetro a 540 nm, calibrando con el blanco, el cual
contiene todos los reactivos excepto el problema, es decir, contiene 2 ml de agua,
2 ml de DNS y 16 ml de agua.
Determinación de velocidades iniciales
1. Preparar los siguientes tubos con las mezclas indicadas en la TABLA 2.
Tabla 2. Mezcla de ensayo estándar para la determinación de la actividad invertasa.
Buffer acetatos
Extracto
Agua destilada
100 mM, pH 5
enzimático
Sacarosa 0.2 M
Tubo
(ml)
(ml)
(ml)
(µl)
Blanco
2.5
5.0
2.75
-
Problema
2.5
5.0
2.5
250.0
2. Las mezclas se incuban a 55 °C, en un baño de agua con temperatura controlada.
Se tomarán 1 ml de ambos tubos a los 5, 10, 15, 20 y 30 minutos y se colocarán en
otro tubo.
3. Inmediatamente después de tomar la muestra (1 ml), se añade 1 ml del reactivo
DNS y se coloca en ebullición durante 5 min. Pasado este tiempo se enfrían los
20
Biotecnología
tubos y se agregan 8 ml de agua destilada; se agitan en el vórtex. La absorbancia
de la muestra problema se determina a 540 nm, utilizando como blanco la mezcla de
ensayo del blanco. Esto se repetirá con cada punto de la cinética.
4. A partir de los valores de absorbancia y el tiempo de incubación, se pueden
determinar los valores de actividad enzimática.
Efecto de la temperatura sobre la actividad invertasa
1. Preparar 4 series de tubos (un blanco y un problema para cada temperatura). Los
tubos se prepararán de acuerdo a los valores reportados en la TABLA 2.
2. Los tubos serán incubados a temperatura ambiente (25 °C), 40, 50 y 60 °C por un
periodo de 15 min.
3. Transcurrido el tiempo de incubación, se tomará 1 ml de cada tubo y se le añadirá
1 ml del reactivo de DNS, para ser incubados a ebullición durante 5 min.
4. Enfriar los tubos con las mezclas, adicionar 8 ml de agua destilada y agitar en el
vórtex, para después medir en el espectrofotómetro a 540 nm, utilizando como
blanco la mezcla de ensayo del blanco de sustrato para cada serie de temperatura.
Efecto del pH sobre la actividad invertasa
1. Preparar una serie de tubos conforme a lo indicado en TABLA 3.
Tabla 3. Preparación de muestras para observar el efecto del pH sobre la actividad invertasa.
Sacarosa 0.2 M
Agua destilada
Extracto
Tubo
Buffer (ml)
(ml)
(ml)
enzimático (µl)
1
2.5
5.0 (A)
2.5
250
1 blanco
2.5
5.0 (A)
2.75
-
2
2.5
5.0 (B)
2.5
250
2 blanco
2.5
5.0 (B)
2.75
-
3
2.5
5.0 (C)
2.5
250
3 blanco
2.5
5.0 (C)
2.75
-
4
2.5
5.0 (D)
2.5
250
4 blanco
2.5
5.0 (D)
2.75
-
Siendo el buffer: A) citrato de sodio, 50 mM, pH 3.0; B) acetatos 50 mM, pH 4.0; C) acetatos
50 mM, pH 5; D) fosfatos 50 mM, pH 7.
2. Incubar los tubos a 55 °C durante 15 min.
3. Después de la incubación tomar 1 ml de cada tubo y pasarlo a un tubo limpio,
agregar 1 ml de DNS, e incubar a ebullición durante 5 min.
4. Enfriar y agregar 8 ml de agua destilada, agitar en el vórtex.
21
Biotecnología
5. Determinar la absorbancia a 540 nm en el espectrofotómetro, utilizando en cada
mezcla problema su blanco correspondiente.
1. Mencione algunas aplicaciones industriales de la enzima invertasa.
2. Graficar la concentración de la glucosa (en µmoles) y las absorbancias obtenidas de
las muestras de la curva de calibración. Obtener la ecuación de la pendiente.
3. Graficar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. ¿Cuál es la
temperatura óptima de la enzima? Elaborar una gráfica del efecto del pH sobre la
actividad enzimática, y reportar el pH óptimo.
22
Biotecnología
Resultados
Observaciones
Conclusiones
23
Biotecnología
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
2.3.4.5.-
Datos del alumno
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
24
Biotecnología
Práctica Nº 4
Efecto de la concentración de sustrato
e inhibición de la actividad enzimática de la invertasa
Fundamento
La actividad de una enzima se puede determinar midiendo la cantidad de producto
formado (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. De esta manera, existen
distintos factores que pueden modificar la actividad enzimática. Los factores que
pueden modificar la actividad enzimática, entre otros, son:
•
•
•
•
•
Concentración de enzima
Concentración de sustrato
Temperatura
pH
Inhibidores
Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática
A medida que aumenta la cantidad de sustrato, la velocidad aumenta en forma lineal
(zona proporcional), luego, si bien la velocidad continua aumentando, ya es de forma
lineal (zona mixta), hasta que finalmente la reacción alcanza una velocidad máxima que
es constante, se vuelve independiente de la cantidad de sustrato (zona de saturación).
Esto ocurre debido a que los sitios activos de las enzimas se encuentran interactuando
completamente con las moléculas de sustratos, por lo tanto, hasta que no finalice la
reacción no puede unirse a otro sustrato.
Inhibidores
Muchos tipos de moléculas inhiben a las enzimas y actúan de diversas maneras. Estos
inhibidores pueden ser inhibición irreversible o una inhibición reversible.
•
•
Inhibidores irreversibles: se enlazan con fuerza a la enzima de forma covalente a
algún aminoácido del sitio activo. Producen cambios permanentes en la molécula de
la enzima, con deterioro definitivo de su capacidad catalítica.
Inhibidores reversibles: estos inhibidores implican una unión no covalente a la
enzima, pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la
actividad enzimática y en la forma en que afectan la cinética de reacción. Dentro de
este grupo se encuentran los inhibidores competitivos, no competitivos e
incompetitivos.
o Inhibidores competitivos: compiten con el sustrato por el sitio activo de la
enzima, y si aumentamos la cantidad de sustrato, el efecto inhibidor se
revierte, alcanzándose la velocidad máxima.
25
Biotecnología
o Inhibidores no competitivos: se enlazan a un sitio distinto del sitio activo, de
forma que el inhibidor se pude unir a la enzima libre o bien se puede unir al
complejo enzima-sustrato, pero en ninguno de estos caso se obtendrán
productos.
o Inhibidor incompetitivo: estos inhibidores se fijan a un sitio distinto al del
sustrato, con la diferencia que solamente se fija al complejo enzima-sustrato.
Los inhibidores de enzimas pueden ser encontrados en la naturaleza, pero también
pueden ser diseñados y producidos como parte de la industria. En lo que compete al ser
humano, estos inhibidores son utilizados principalmente como fármacos en el
tratamiento de diversas enfermedades.
Invertasa
Por otro lado, la sacarosa es un disacárido compuesto de una molécula α-D-glucosa y
una molécula de β-D-fructosa, unidas por un enlace α-1,4-glicosídico. Cuando este
enlace es hidrolizado, se produce una mezcla equimolar de glucosa y fructosa. Esta
mezcla de monosacáridos es llamada ‘azúcar invertida’. Una enzima que hidroliza este
enlace es la invertasa (β-fructofuranosidasa, EC 3.2.1.26).
Para definir la actividad de una preparación enzimática se utilizan en la práctica
distintas expresiones. La cantidad de enzima se indica habitualmente en unidad de
actividad enzimática (U). Se define como la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de un micromol de sustrato por minuto (µmol/min), bajo condiciones
óptimas de temperatura y pH. Normalmente las unidades de actividad que contiene una
solución se suelen expresar en función del volumen de la misma (U/ml). El Sistema
Internacional de Unidades ha definido la unidad de actividad enzimática como la
cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se
llama ‘katal’ (kat). Como 1 mol son 1x106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta
que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan
frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal
(nkat, 10-9 kat). Para el caso de la determinación de la actividad invertasa utilizada en
esta práctica, se usará la siguiente fórmula:
Donde:
V
t
Venz
Vmed
FD
26
es el volumen total del ensayo (ml), que para el caso de los ensayos realizados en
esta práctica es de 10.25 ml.
es el tiempo del ensayo (min).
es el volumen de enzima empleada en el ensayo (ml), 0.25 para los ensayos
realizados en esta práctica.
es el volumen utilizado en la determinación colorimétrica (ml), y como se usarán
cubetas para el espectrofotómetro con un volumen de 1 ml, el valor usado será 1.
es el factor de dilución de la muestra medida.
Biotecnología
µmoles de glucosa liberados se calcularán mediante la relación de la concentración
con la absorbancia obtenidos de la curva de calibración.
Objetivos de la práctica
•
•
•
Medir los parámetros cinéticos de la enzima invertasa.
Medir el efecto de los inhibidores sobre la actividad enzimática.
Explicar los mecanismos de acción enzimáticos para extrapolar a enzimas de uso
farmacéutico.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material
Tubos de rosca (20-25 ml,
60 tubos).
Pipeta de vidrio de
0.5 ml (5).
Pipeta de vidrio de
5 ml (10).
Pipetas Pasteur de
plástico.
Vasos de precipitado de
50 ml (5).
Vaso de precipitado de
250 ml (5).
Piseta de agua
destilada (1).
Gradillas para tubos de
ensayo (4).
el espectrofotómetro (15).
Guantes de látex.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Reactivos
Buffer citrato de sodio,
50 mM, pH 3.0 (50 ml).
Buffer acetato de sodio,
50 mM, pH 4.0 (50 ml).
Buffer acetato de sodio,
50 mM, pH 5.0 (200 ml).
Buffer fosfato de sodio,
50 mM, pH 7.0 (50 ml).
CuSO4 (0.1 M, 10 ml).
Glucosa anhidra
(4 mg/ml, 20 ml).
Extracto enzimático de
invertasa de levadura de
panadería (10 ml).
Reactivo de DNS
(150 ml).
Sacarosa (0.2 M, 50 ml).
•
•
•
•
•
•
•
Equipo
Termómetro.
Parrilla de
calentamiento.
Centrífuga.
Balanza.
Espectrofotómetro
UV/Vis.
Potenciómetro.
Vórtex.
El extracto enzimático se preparará suspendiendo 50 mg de preparado liofilizado de la
levadura en 10 ml de buffer de extracción (buffer acetato 0.05 M, pH 5.0). Agitar la
mezcla durante 15 min., centrifugar y tomar el sobrenadante como extracto enzimático.
27
Biotecnología
Procedimiento
Curva de calibración
1. En una gradilla poner 12 tubos de ensayo, etiquetarlos del 0 al 5, y agregar lo que
aparece en la TABLA 1; donde la solución patrón es la solución de glucosa a 4 mg/ml.
Tabla 1. Preparación de la curva patrón para cuantificación de azúcares utilizando el
reactivo DNS.
Solución
Agua
Concentración de
Concentración de
Tubo
patrón (ml)
(ml)
glucosa (mg/ml)
glucosa (µmoles)
0
0.0
2.0
0.0
0.00
1
0.4
1.6
0.2
1.11
2
0.8
1.2
0.4
2.22
3
1.2
0.8
0.6
3.33
4
1.6
0.4
0.8
4.44
5
2.0
0.0
1.0
5.55
2. A cada uno de estos tubos agregar 2 ml del reactivo DNS y llevarlos a ebullición
durante 5 minutos en un baño de agua. Pasado este tiempo, los tubos se pondrán a
enfriar al chorro de agua o bien podrán dejarse enfriar por sí solos hasta que
alcancen la temperatura ambiente.
3. Cuando los tubos alcancen la temperatura ambiente, agregar 16 ml de agua y agitar
en el vórtex.
4. Se tomará 1 ml de cada tubo y se colocará en cubetas desechables, para tomar
lectura en el espectrofotómetro a 540 nm, calibrando con el blanco, el cual contiene
todos los reactivos excepto el problema, es decir, contiene 2 ml de agua, 2 ml de
DNS y 16 ml de agua.
Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad invertasa
1. Preparar unos tubos como se describen en la TABLA 2. La solución de sacarosa a
20 mM se prepara diluyendo la solución 200 mM 1:10 (10 veces). Para cada tubo
hacer un tubo con blanco, el cual consistirá en 5 ml de buffer acetatos (50 mM,
pH 5), 5 ml de agua destilada y 250 µl de enzima.
28
Biotecnología
Tabla 2. Preparación de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones.
Concentración de
Concentración
sacarosa en la
Solución de
Tubo
añadida a la mezcla
Dilución
mezcla de ensayo
sacarosa (mM)
de ensayo (mM)
(mM)
A
2.5
10
20
1:2
B
5.0
20
200
1:10
C
10.0
40
200
1:5
D
20.0
80
200
1:2.5
E
50.0
200
200
-
... continuación Tabla 2.
Tubo
Solución de
sacarosa (ml)
Buffer acetato
0.05 M, pH 5 (ml)
Agua destilada (ml)
Extracto
enzimático
(µl)
A
5.0
5.0
-
250
B
1.0
5.0
4.0
250
C
2.0
5.0
3.0
250
D
4.0
5.0
1.0
250
E
5.0
5.0
-
250
… continuación Tabla 2.
Tubo
Solución de
sacarosa (ml)
Buffer acetato
0.05 M, pH 5 (ml)
Agua destilada (ml)
Extracto
enzimático
(µl)
A blanco
5.0
5.0
0.25
-
B blanco
1.0
5.0
4.25
-
C blanco
2.0
5.0
3.25
-
D blanco
4.0
5.0
1.25
-
E blanco
5.0
5.0
0.25
-
2. Incubar los tubos a 55 °C durante 15 min.
29
Biotecnología
3. Después de la incubación, tomar 1 ml de cada tubo y pasarlo a un tubo limpio;
agregar 1 ml de DNS e incubar a ebullición durante 5 min.
4. Enfriar y agregar 8 ml de agua destilada; agitar en el vórtex.
5. Determinar la absorbancia a 540 nm en el espectrofotómetro, utilizando en cada
Inhibición de la enzima
1. Preparar los tubos como se muestran en la TABLA 3.
Tubo
A
B
C
D
E
F
Sacarosa 0.2 M
(ml)
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
…continuación Tabla 3.
Sacarosa 0.2 M
Tubo
(ml)
A blanco
5.0
B blanco
5.0
C blanco
5.0
D blanco
5.0
E blanco
5.0
F blanco
5.0
Tabla 3. Inhibición enzimática.
CuSO4 0.1 M
Agua destilada
(ml)
(ml)
0.0
5.0
0.5
4.5
1.0
4.0
2.0
3.0
4.0
1.0
5.0
0.0
CuSO4 0.1M
(ml)
0.0
0.5
1.0
2.0
4.0
5.0
Agua destilada
(ml)
5.25
4.75
4.25
3.25
1.25
0.25
Extracto
enzimático (µl)
250
250
250
250
250
250
Extracto
enzimático (µl)
-
2. Incubar los tubos a 55 °C por 15 min.
3. Después de la incubación tomar 1 ml de cada tubo y pasarlo a un tubo limpio;
agregar 1 ml de DNS e incubar a ebullición durante 5 min.
4. Enfriar y agregar 8 ml de agua destilada, agitar en el vórtex, para después
determinar la absorbancia a 540 nm en el espectrofotómetro, utilizando en cada
30
Biotecnología
1. Graficar la concentración de la glucosa (en µmoles) y las absorbancias obtenidas de
las muestras de la curva de calibración. Obtener la ecuación de la pendiente.
2. Graficar la velocidad de reacción contra la concentración de sustrato. ¿La reacción
sigue la cinética de Michaelis-Menten? Calcular los valores de Vmax y Km.
3. Graficar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. ¿Cuál es la
temperatura óptima de la enzima? Elaborar una gráfica del efecto del pH sobre la
actividad enzimática y reportar el pH óptimo.
31
Biotecnología
Resultados
Observaciones
Conclusiones
32
Biotecnología
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
2.3.4.5.-
Datos del alumno
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
33
Biotecnología
Práctica Nº 5
Inmovilización de enzimas por el método
de atrapamiento en gel de alginato
Fundamento
El empleo de enzimas como catalizadores en procesos industriales está limitado por los
altos costos de producción y la baja estabilidad de las enzimas durante su almacenaje.
La estabilidad se ve reducida debido a cambios en el pH y temperatura del medio en el
que trabajan, incluso pueden llegar a sufrir cambios conformacionales a causa de la
fricción, presión osmótica y otros factores que se presentan durante su uso. El efecto
acumulado de todos estos factores disminuye la vida útil de las enzimas, por lo que su
reutilización se convierte en una opción atractiva para disminuir costos.
La inmovilización de enzimas se define como cualquier técnica que permita la
reutilización o el uso continuo del biocatalizador. La encapsulación en gel de alginato es
una técnica barata y sencilla. El alginato es un polisacárido natural, formado por
unidades de ácido β-D-manurónico y ácido α-L-gulurónico, que se encuentra en las
algas marrón y en algunas bacterias como Pseudomonas y Azotobacter. Actualmente,
los alginatos comerciales más comunes provienen de las algas Laminaria digitata,
Laminaria hyperborea, Laminaria japonica y Ascophyllum nodosum, entre otras. Para
extraer el alginato se emplean soluciones acuosas alcalinas, normalmente con NaOH.
Después de filtrar el extracto y para obtener el alginato por precipitación, se le añade
NaCl o CaCl2. Posteriormente se agrega HCl para transformarlo en ácido algínico. Por
último, después de su purificación y conversión, se produce el alginato de sodio en
forma de polvo y soluble en agua.
Los cationes divalentes inducen la gelificación del alginato mediante el
ordenamiento lineal de las cadenas del polímero, donde el catión queda atrapado entre
las cadenas, debido al intercambio iónico que se genera entre los bloques de ácido
gulurónico y el catión divalente. El calcio es el catión más utilizado para la
inmovilización en geles de alginato, debido a su baja toxicidad. Los geles de alginato
son matrices porosas semipermeables que permiten a la enzima atrapada en el gel
interactuar con el medio que lo rodea, sin embargo, esto conlleva una desventaja: la
posibilidad de pérdida de enzima debido a la filtración.
Las propiedades funcionales de las enzimas de uso industrial, como la invertasa,
pueden mejorarse mediante las técnicas de inmovilización. La invertasa fue la primera
enzima en ser inmovilizada en el año de 1916. Su función es la hidrólisis de la sacarosa
en fructosa y glucosa. Este biocatalizador tiene gran importancia comercial en la
industria de alimentos y bebidas, ya que el producto de su reacción tiene aplicaciones
muy diversas, como la elaboración de miel artificial y como agente humectante para el
relleno blando de caramelos, o como ingrediente en cosméticos, por citar algunos.
Además, la invertasa está involucrada en los procesos fermentativos de la elaboración
de bebidas alcohólicas. Por sus múltiples aplicaciones industriales, este biocatalizador
es un buen ejemplo para demostrar los beneficios de la inmovilización de enzimas.
35
Biotecnología
Objetivos
•
•
Explicar el proceso de inmovilización de enzimas en gel de alginato.
Describir las ventajas tecnológicas de la inmovilización sobre los procesos con
enzimas libres.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material
Tubos de ensayo
15-20 ml (5).
Pinzas para tubos de
ensayo.
Jeringa de 5 ml con
aguja (1).
Vaso de precipitados de
250 ml (2).
Agitador magnético.
Embudo.
Papel filtro Nº 1.
Frasco de vidrio con tapa
de rosca 100 ml.
Pipeta de vidrio 5 ml (3).
Pipeta de vidrio 1 ml (3).
Gradilla para tubos de
ensayo.
Espátula para pesado.
Tina para baño.
Cubetas desechables
1 ml para
espectrofotómetro.
Perilla.
Piseta con agua
destilada.
•
•
•
•
•
•
Reactivos
Invertasa de levadura
Saccharomyces
cerevisiae (2 mg).
Solución de alginato de
sodio al 2 % (p/v) de
viscosidad media (10 ml).
Solución de CaCl2 al 2 %
(p/v) (150 ml).
Solución de azúcar
invertida al 70 % (p/v)
(50 ml).
Sacarosa 0.2 M en
50 mM de buffer de
acetato de sodio, pH 5
(15 ml).
Solución DNS (1 ml).
•
•
•
•
•
Equipo
Plancha con
agitación magnética.
Vórtex.
Espectrofotómetro
UV/Vis.
Balanza granataria.
Balanza analítica.
Procedimiento
Elaboración de cápsulas
1. Disolver 2 mg de invertasa en 10 ml de alginato de sodio al 2 % (p/v) en un tubo de
ensayo. Si es necesario, utilizar un vórtex para homogenizar la solución.
2. Llenar una jeringa con la solución preparada.
36
Biotecnología
3. Colocar los 100 ml de la solución de CaCl2 al 2 % (p/v) en un vaso de precipitado de
250 ml, en agitación media constante a temperatura ambiente.
4. Añadir lentamente y gota a gota toda la solución de invertasa en la solución de
CaCl2 al 2 % (p/v) a una distancia no mayor de 10 cm de la superficie de la solución
de CaCl2.
5. Las cápsulas formadas se deben mantener en la misma solución por 2 horas.
6. Filtrar las cápsulas en un embudo con papel filtro Nº 1.
7. Lavar las cápsulas con 50 ml de CaCl2 en el mismo embudo.
8. Almacenar las cápsulas en una solución al 70 % (p/v) de azúcar invertida a 4 °C
hasta su uso.
Medición de actividad invertasa con la enzima inmovilizada
1. Pesar 10 cápsulas de alginato en una balanza y colocarlas en un tubo de ensayo.
2. Agregar a las cápsulas 5 ml de sacarosa 0.2 M en buffer de acetato 50 mM, pH 5.0,
agitando suavemente y dejarlo reposar por 15 minutos a temperatura ambiente
(25 °C).
3. Tomar 0.5 ml de la mezcla anterior y mezclarla con 0.5 ml de solución DNS en un
tubo de ensayo limpio.
4. Calentar a ebullición el tubo con la mezcla anterior durante 5 minutos e
inmediatamente después enfriarlo hasta que alcance la temperatura ambiente.
5. Diluir el contenido del tubo con 4 ml de agua destilada, agitando en vórtex para
homogenizar adecuadamente.
6. Colocar 1 ml de la dilución anterior (por duplicado) en una cubeta de plástico para
espectrofotómetro y tomar lectura a 540 nm.
7. Calcular la actividad enzimática de la enzima inmovilizada mediante la siguiente
fórmula:
ó
Donde:
Volumen de reacción: volumen de sustrato (glucosa) utilizado en mililitros.
μmoles de glucosa liberados: se calcula mediante la relación de la concentración de
glucosa con la absorbancia obtenida en la curva de calibración, convertidos a
micromoles.
Tiempo: tiempo en minutos de la reacción.
Volumen de lectura: volumen utilizado en la determinación colorimétrica en mililitros.
mg de perlas: peso obtenido de las 10 perlas en gramos.
Nota 1: Si se realizaron diluciones, se deberá multiplicar el resultado de la ecuación
anterior por el factor de dilución empleado.
Nota 2: preparar un blanco de la misma manera que la reacción, sólo que sin cápsulas
de alginato. Emplear la curva de calibración realizada en la práctica Nº 3.
37
Biotecnología
1. ¿Qué son los alginatos?
2. ¿De dónde provienen los alginatos?
3. ¿Por qué los alginatos son buenos como agentes inmovilizadores de enzimas?
4. ¿Por qué el calcio se prefiere sobre el resto de los cationes divalentes para la
formación de los geles de alginato?
5. Mencione los problemas que pueden presentarse en la formación de las perlas de
alginato y cómo éstos afectan a la enzima inmovilizada y sus propiedades.
Resultados
38
Biotecnología
Observaciones
Conclusiones
las actividades del Manual de Prácticas del laboratorio
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
2.3.-
Datos del alumno
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
39
Biotecnología
Práctica Nº 6
Preparación de un inóculo de levadura
(Kluyveromyces marxianus) para inducir actividad inulinasa
Fundamento
Los fructanos, polímeros de fructosa, son los principales carbohidratos de reserva en
plantas como los agaves. Existen diferentes tipos de fructanos, entre los más
estudiados se encuentra la inulina, que se forma por enlaces β(2→1) fructosil fructosa,
formando cadenas lineales de fructosa con una glucosa en el extremo terminal y, en
menor medida, puede presentar ramificaciones con enlaces tipo β(2→6) fructosil
fructosa. La inulina es soluble en agua y normalmente es extraída de plantas frescas
por difusión en agua caliente, ya que la solubilidad de la inulina en el agua se
incrementa notablemente con el aumento de la temperatura. La hidrólisis controlada
térmica, química o enzimática de la inulina, puede generar oligosacáridos de fructosa y
jarabes de alta fructosa, según el tipo de tratamiento y condiciones empleadas en la
hidrólisis.
La hidrólisis enzimática de la inulina se da mediante la acción de las inulinasas,
que de acuerdo con su modo de operación pueden dividirse en dos tipos: exoinulinasas, que hidrolizan los enlaces terminales liberando sacarosa y fructosa, y las
endo-inulinasas, que rompen los enlaces que unen las unidades de fructosa que se
encuentran alejados de los enlaces terminales de la inulina, generando fructooligosacáridos. Se han utilizado diferentes tipos de microorganismos para la producción
de inulinasas, como bacterias, levaduras y hongos, pero los que han demostrado una
mayor capacidad para producirlas son levaduras del género Kluyveromyces,
Torulaspora y Pichia, así como hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium.
Kluyveromyces marxianus es una levadura ampliamente estudiada en la
producción de inulinasas. Los reportes indican que esta levadura es capaz de
hiperproducir inulinasas en su forma nativa, esto es, sin necesidad de modificaciones
genéticas, por lo que es interesante explotar este microorganismo en los medios de
cultivo adecuados para la producción de jarabes concentrados de fructosa mediante la
producción de inulinasas.
Objetivo
•
Distinguir la importancia de la preparación inóculos para inducir la expresión
específica de enzimas de interés biotecnológico.
41
Biotecnología
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material
Espátula de pesado (1).
Charola de pesado (3).
100 ml (1).
Agitador magnético (1).
Pipeta Pasteur (1).
250 ml (1).
Algodón.
Tela de gasa.
Cinta adhesiva.
Guantes de asbesto.
Mechero Fisher (2).
Piseta con alcohol al
70 % (v/v).
Piseta con agua
destilada.
Asa bacteriológica (1).
•
•
•
•
•
Reactivos
Cepa de
Kluyveromyces
marxianus en caja Petri
con agar dextrosa de
papa.
Inulina de agave.
Extracto de levadura.
Peptona.
HCl 0.5 N.
•
•
•
•
Equipo
Balanza analítica.
Potenciómetro.
Autoclave.
Incubadora con
agitación rotatoria y
control de temperatura.
Procedimiento
Preparación del inóculo
1. En una balanza analítica pesar 0.5 g de inulina de agave, 0.5 g de extracto de
levadura y 1 g de peptona.
2. Disolver los reactivos con 50 ml de agua destilada en un vaso de precipitado de
100 ml. Si es necesario, utilizar un agitador magnético para lograr la completa
solubilización del medio.
3. Ajustar el pH del medio de cultivo a 5.5 con HCl 0.5 N, empleando un potenciómetro.
Utilizar una pipeta Pasteur añadiendo gota a gota el ácido o la base y cuidando de
agitar la solución adecuadamente.
4. Vaciar la solución en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
5. Tapar el matraz con un tapón de algodón envuelto en tela de gasa y, por último,
cubrir el tapón con papel estraza o en su defecto, papel de aluminio.
6. Esterilizar el medio de cultivo a 121 °C durante 15 minutos.
7. Dejar enfriar el medio de cultivo hasta aproximadamente 40 °C.
8. En condiciones de esterilidad, tomar una asada de una colonia de la cepa de la
levadura Kluyveromyces marxianus y disolverla en el medio de cultivo.
9. Colocar el matraz en un agitador rotatorio a 30 °C a 200 revoluciones por minuto
durante 24 horas.
42
Biotecnología
1. ¿Qué es la inulina?
2. ¿Qué función tiene la inulina en el medio de cultivo del inóculo?
3. ¿Por qué es importante sustituir la glucosa por inulina en el medio de cultivo del
inóculo?
Resultados
Observaciones
43
Biotecnología
Conclusiones
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
2.3.-
Datos del alumno
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
44
Biotecnología
Práctica Nº 7
Elaboración de miel de agave (jarabe de alta fructosa)
vía enzimática: aplicación de enzimas como la inulinasa
Fundamento
El jugo de agave es fuente natural de polifructanos como la inulina, por lo que puede
emplearse como fuente de carbono para la producción de inulinasas en condiciones
fermentativas controladas y, consecuentemente, obtener miel de agave. Los jarabes de
alta fructosa han venido sustituyendo el empleo de la sacarosa como endulzante
principal en la industria de los alimentos, debido a su mayor capacidad edulcorante, su
menor costo de producción, su mayor solubilidad en agua, baja tendencia a la
cristalización, su bajo nivel calórico y, sobre todo, que su biodisponibilidad no depende
de la insulina, por lo que se considera un alimento apto para personas diabéticas.
El jarabe de alta fructosa de agave es un potencial sustituto del jarabe proveniente
de almidón de maíz, ya que un típico proceso de producción de jarabe de alta fructosa
de almidón utiliza la enzima α-amilasa para hidrolizar el almidón, seguidamente de la
glucoamilasa para sacarificar el almidón hidrolizado por el 94 % del contenido de
dextrosa y, por último, este producto debe pasar un proceso de isomerización para
convertirse en fructosa y obtener de esta manera el jarabe. Este proceso incrementa los
costos de producción; en cambio, el jarabe proveniente del agave sólo requiere un paso
de hidrólisis enzimática, convirtiendo el proceso en una opción más atractiva para la
industria de edulcorantes.
Objetivo
•
Distinguir la aplicación de las enzimas en los procesos biotecnológicos para la
elaboración de alimentos.
45
Biotecnología
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material
Pipetas de 5 ml (2).
Perilla.
Piseta de agua destilada.
Gradilla para tubos.
Tubos de rosca
10-20 ml (5).
Cubetas desechables 1 ml
para espectrofotómetro.
Tina para baño.
Pipeta Pasteur (2).
Vaso de precipitados
250 ml (1).
Agitador magnético (1).
Matraz Erlenmeyer
250 ml (1).
Algodón.
Tela de gasa.
Cinta adhesiva.
Papel de estraza.
Guantes de asbesto.
Pipeta 10 ml estéril (1).
Mechero Fisher (2).
Piseta con alcohol etílico
al 70 % (v/v).
Microtubos estériles
2 ml (30).
Pipeta 5 ml estéril (5).
•
•
•
•
Reactivos
Solución de DNS.
Extracto de levadura.
NaOH 0.5 N.
HCl 0.5 N.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Equipo
Espectrofotómetro
UV/Vis.
Plancha de
calentamiento con
agitación magnética.
Refractómetro.
Balanza analítica.
Potenciómetro.
Autoclave.
Campana de flujo
laminar.
Congelador.
Incubadora con
agitación rotatoria y
control de temperatura.
Procedimiento
Preparación del medio de cultivo para fermentación
1. Tomar una muestra de jugo de agave y analizar su contenido de azúcares
reductores totales mediante la técnica de DNS aprendida en la Práctica Nº 2.
Efectuar diluciones del jugo en agua destilada si es necesario. Emplear los mismos
datos obtenidos en la curva de glucosa elaborada anteriormente, pero graficando
esta curva en g/l. La concentración de azúcares reductores totales se calcula
directamente con la ecuación de la recta.
2. La concentración de azúcares reductores totales del jugo de agave debe ajustarse,
si así lo requiere, a no más de 30 g/l, empleando agua destilada para la dilución.
46
Biotecnología
3. Una vez diluido el jugo de agave hasta la concentración correcta de azúcares
reductores totales, se procederá a medir los grados Brix de la solución, empleando
para ello un refractómetro. El refractómetro debe calibrarse a cero grados Brix con
una gota de agua destilada a 25 °C. Posteriormente se colocará una gota de la
solución de jugo de agave en el refractómetro y se tomará lectura en la escala del
aparato.
4. Medir 90 ml de jugo de agave en una probeta y vaciarlo en un vaso de precipitados
de 250 ml.
5. En una balanza analítica pesar 1 g de extracto de levadura y añadirlo al jugo de
agave, cuidando que se disuelva por completo en el jugo. Si es necesario utilizar un
agitador magnético.
6. Ajustar el pH del medio de cultivo a 5.5 con NaOH 0.5 N o HCl 0.5 N, empleando un
potenciómetro. Utilizar una pipeta Pasteur, añadiendo gota a gota el ácido o la base
y cuidando de agitar la solución adecuadamente.
7. Vaciar el medio de cultivo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y colocarle un tapón
de algodón envuelto en tela de gasa; por último, cubrir el tapón con papel estraza o
papel de aluminio.
9. Dejar enfriar el medio de cultivo hasta aproximadamente 40 °C.
10. Con una pipeta tomar 10 ml del inóculo preparado en la práctica anterior y añadirlo
al medio de cultivo (en condiciones de esterilidad, empleando para este efecto
2 mecheros Fisher o la campana de flujo laminar).
11. Tomar una muestra de 3 ml del medio de cultivo y colocarlo en un microtubo,
guardándolo en congelación (-20 °C). Éste será el tiempo 0.
12. Colocar el matraz en una incubadora con agitación rotatoria a 30 °C a
150 revoluciones por minuto durante 48 horas.
13. Cada 12 horas se tomará una muestra de 3 ml de medio de cultivo (en condiciones
de esterilidad, empleando para este efecto 2 mecheros Fisher o la campana de flujo
laminar) y se colocarán en microtubos de 1.5 ml o 2 ml, almacenándolos en
condiciones de congelación (-20 °C) y cuidando de etiquetarlos de manera
adecuada en cuanto al tiempo (horas de cultivo) que corresponde cada muestra.
Será un total de 4 muestras durante la fermentación: 12 h, 24 h, 36 h y 48 h.
1. ¿Por qué los jarabes de alta fructosa son preferidos sobre la sacarosa?
2. Mencione qué enzimas y en qué orden intervienen en la transformación del almidón
de maíz en jarabe de alta fructosa.
47
Biotecnología
Resultados
Observaciones
Conclusiones
48
Biotecnología
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
2.3.Datos del alumno
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
49
Biotecnología
Práctica Nº 8
Cuantificación de actividad inulinasa y concentración de azúcares
del fermento obtenido en la elaboración de jarabe de alta fructosa
Fundamento
Los jarabes de alta fructosa son apreciados por los beneficios que producen en la salud
de quienes los consumen, como el aumento en la absorción de hierro en niños, la
prevención del cáncer de colon y la estimulación del crecimiento de la flora intestinal,
por mencionar algunos. La fructosa puede producirse a partir del almidón por vía
enzimática involucrando tres pasos de conversión, por lo que la mejor forma de
producirla es mediante el empleo de inulinasas de origen microbiano, que después de
un solo paso de hidrólisis de la inulina se pueden obtener rendimientos de hasta 95 %
de fructosa pura. Es por esto que las exo-inulinasas provenientes de diferentes
microorganismos crecidos en medios que contienen inulina son apreciadas en la
industria de la fabricación de jarabes de fructosa.
La Norma Oficial Mexicana que establece las especificaciones que debe cumplir
un jarabe elaborado con base en jugo de agave, es la NMX-FF-110-SCFI-2008
«Productos Alimenticios – Jarabe de agave – Especificaciones y métodos de prueba».
Esta Norma especifica que un jarabe proveniente de agave azul debe contener un
mínimo de 74 °Bx y 80 % de fructosa; en cambio, un jarabe proveniente de Agave
salmiana puede contener como mínimo 70 % de fructosa. De no alcanzar estos
parámetros mínimos en el producto final, se podrá entonces decir que el producto
obtenido es un jarabe de agave «parcialmente hidrolizado».
Objetivos
•
•
Conocer el comportamiento de la actividad inulinasa durante el transcurso de la
fermentación.
Determinar la eficacia de la levadura Kluyveromyces marxianus como productora de
exo-inulinasas extracelulares para la producción de jarabe de alta fructosa.
51
Biotecnología
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material
Pipeta Pasteur (2).
Microtubos de 2 ml (20).
Tubos de ensayo con tapa
de rosca 20-25 ml (25).
Perilla.
Tina para baño.
Cubetas desechables 1 ml
Piseta con agua destilada.
Reactivos
• Buffer de acetato de sodio
50 mM, pH 5.0 (50 ml).
• Solución de inulina al 5 %
(p/v) en buffer de acetatos
50 mM, pH 5.0 (200 ml).
• Solución de DNS.
•
•
•
•
•
Equipo
Vórtex.
Centrífuga para
microtubos.
Plancha de
calentamiento.
Espectrofotómetro
UV/Vis.
Refractómetro.
Procedimiento
Cuantificación de actividad inulinasa
1. Al finalizar la fermentación, las muestras tomadas serán descongeladas a
temperatura ambiente.
2. Una vez descongeladas, cada tubo se agitará con vórtex para homogenizar el medio
de cultivo.
3. Los tubos se centrifugarán a 13,000 revoluciones por minuto durante 5 minutos.
4. El sobrenadante de cada tubo será extraído con una pipeta Pasteur y colocado en
un microtubo nuevo cada uno, etiquetado correctamente para identificar cada
muestra.
5. Se tomará 1 ml de cada muestra y se diluirá 2 y 10 veces en buffer de acetatos
0.05 M, pH 5.0 en tubos de ensayo.
6. Se agregará a cada tubo 15 ml de una solución de inulina al 5 % (p/v).
7. Todas las reacciones serán calentadas a 50 °C durante 15 min. en baño de agua.
8. Tomar 0.5 ml de cada reacción y colocar en un tubo nuevo, añadiendo de inmediato
0.5 ml de reactivo DNS y colocando todos los tubos en ebullición durante 5 min.
9. Todos los tubos se dejarán enfriar a temperatura ambiente.
10. Añadir a cada tubo 4 ml de agua destilada y disolver adecuadamente. Puede
utilizarse un vórtex.
11. Tomar 1 ml de cada tubo y colocarlo en una cubeta desechable.
12. Tomar lectura a una longitud de onda de 540 nm en un espectofotómetro.
13. Calcular las U/ml de actividad inulinasa mediante la siguiente fórmula:
ó
52
Biotecnología
Donde:
Volumen de reacción: volumen de sustrato (glucosa) utilizado en mililitros.
μmoles de glucosa liberados: se calcula mediante la relación de la concentración de
glucosa con la absorbancia obtenida en la curva de calibración, convertidos a
micromoles.
Volumen de muestra: volumen del extracto enzimático utilizado en la reacción.
Nota: preparar un blanco de la misma manera que la reacción, empleando agua
destilada en vez de extracto enzimático. Emplear la curva de calibración elaborada en la
práctica Nº 3.
14. Medir los grados Brix del sobrenadante de cada muestra, empleando para ello un
refractómetro. El refractómetro debe calibrarse a cero grados Brix con una gota de
agua destilada a 25 °C. Posteriormente se colocará una gota de la solución de jugo
de agave en el refractómetro y se tomará lectura en la escala del aparato.
1. Elabore una gráfica donde exprese el comportamiento de la actividad inulinasa en
U/ml a través del tiempo.
53
Biotecnología
2. Elabore una gráfica donde exprese el comportamiento de los grados Brix del medio
de cultivo a través del tiempo.
Resultados
54
Biotecnología
Observaciones
Conclusiones
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
55
Biotecnología
Práctica Nº 9
Preparación de un inóculo del hongo (Aspergillus
niger) para inducir la expresión de actividad pectinolítica
Fundamento
La pectina es un polisacárido complejo que forma parte de la estructura celular del
tejido vegetal, principalmente de la pared celular. Se compone de unidades de ácido
D-galacturónico esterificados con residuos de metilados. También puede contener
residuos de ramnosa. Las enzimas encargadas de hidrolizar la pectina son las
pectinasas. Estas enzimas pueden ser encontradas tanto en plantas como en bacterias
fitopatógenas, levaduras y hongos. La mayoría de las pectinasas comerciales provienen
de hongos como Aspergillus niger, sin embargo, también pueden producirse empleando
microorganismos de géneros diversos como Penicillium, Saccharomyces,
Pseudomonas o Lactobacillus, entre otros. En las plantas, las pectinasas pueden
encontrarse en gran variedad de frutos, ya que estas enzimas se encuentran
involucradas en el metabolismo de la pared celular durante el crecimiento, la
maduración del fruto, la senescencia y en la patogénesis.
Las pectinasas tienen su mayor aplicación en la industria de jugos de frutas, ayudando
a la solubilización de la pulpa y en la clarificación. Estas enzimas actúan reduciendo la
viscosidad de la pulpa, de tal manera que facilita el manejo y procesado del jugo.
Además de mejorar la textura y firmeza de algunas frutas y verduras procesadas,
también se utiliza para producir almidón libre de pectina, para refinar fibras vegetales,
entre otros.
Los hongos se caracterizan por poseer una maquinaria enzimática muy diversa y
son apreciados por la facilidad que con producen enzimas extracelulares, que
minimizan costos de purificación, al no tener que recurrir a métodos de lisis para la
extracción de los metabolitos. La obtención de enzimas mediante el aprovechamiento
de residuos agroindustriales abarata costos de producción, ya que permite dar
tratamiento a desechos que de otra manera generarían contaminación, pues muchos de
estos residuos no pueden ser utilizados directamente para alimento animal porque
contienen sustancias que pueden resultar tóxicas. Esto convierte al tratamiento
enzimático en una herramienta valiosa para tratar estos desperdicios, obteniendo
metabolitos muy apreciados en la industria, valorizando así los desechos de este tipo.
Objetivo
•
56
Comprender las características que los hongos poseen para la producción de
enzimas de interés industrial.
Biotecnología
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material
Matraz Erlenmeyer de 250
ml.
Probeta de 100 ml.
Espátula de pesado.
Charola de pesado.
Algodón.
Tela de gasa.
Papel de estraza.
Cinta adhesiva.
Tijeras.
Guantes de asbesto.
Pipeta de 5 ml estéril.
Pipeta de 1 ml estéril.
Perilla.
Mechero de Fisher (2).
Piseta con alcohol etílico al
70 % (v/v).
Cuchillo y tabla de picar.
Charola para horno.
Reactivos
• Cepa de Aspergillus niger
en agar dextrosa de papa
inclinado.
• Agar dextrosa de papa.
• Solución de Tween 80 al
0.01 % (v/v) estéril (10 ml).
•
•
•
•
•
Equipo
Autoclave.
Balanza analítica.
Plancha de
calentamiento con
agitación
magnética.
Incubadora.
Horno eléctrico.
Procedimiento
Preparación del inóculo
1. En un matraz Erlenmeyer de 250 ml preparar 50 ml de medio de cultivo agar
dextrosa de papa, agregar 0.5 g de pectina y disolver completamente. Si es
necesario, utilizar agitación magnética.
2. Tapar el matraz con un tapón de algodón envuelto en tela de gasa y, por último,
cubrir el tapón con papel estraza.
4. Dejar enfriar el medio de cultivo hasta que gelifique.
5. Bajo condiciones de esterilidad, tomar 10 ml de Tween 80 estéril al 0.01 % (v/v) y
añadirlo al cultivo en agar inclinado que contiene Aspergillus niger.
6. Agitar suavemente el tubo para desprender la mayor cantidad de esporas posible del
agar.
7. Tomar de 1.5 a 2 ml de la solución de esporas desprendidas del cultivo y añadirlas
al matraz con 50 ml de agar dextrosa de papa y pectina preparado anteriormente,
cuidando de que la solución de esporas quede esparcida lo más uniformemente
posible sobre toda la superficie del medio.
8. Colocar el matraz en una incubadora a 30 °C durante 5 días.
57
Biotecnología
Preparación previa del sustrato inductor y el soporte para la fermentación
1. Pelar la fruta elegida por cada equipo hasta obtener 250 g de cáscara.
2. Cortar las cáscaras de la fruta en trozos pequeños (0.5 cm).
3. Colocar las cáscaras de fruta picadas en charolas y secarlas en horno a 45 °C
durante 24 horas.
4. Por otra parte, cortar el poliuretano en cubos de aproximadamente 0.3-0.5 cm hasta
completar 5 g; guardarlo en una bolsa de plástico debidamente etiquetada.
1.- ¿Cómo están involucradas las pectinasas en el metabolismo microbiano y vegetal?
2.- ¿Cuáles son las principales aplicaciones de las pectinasas en la industria?
3.- ¿Qué características metabólicas hacen de los hongos buenos productores de
enzimas en la industria?
Resultados
58
Biotecnología
Observaciones
Conclusiones
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
2.3.-
Datos del alumno
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
59
Biotecnología
Práctica Nº 10
Producción de enzimas pectinolíticas por
fermentación sólida empleando residuos de frutas
Fundamento
La fermentación sólida puede definirse como el crecimiento de los
microorganismos en materiales sólidos húmedos en ausencia de agua libre. Este tipo
de fermentación se utiliza en la industria, desde su aplicación para la biorremediación y
biodegradación de compuestos tóxicos, la producción de compuestos bioactivos y
enzimas, hasta la producción de ácidos orgánicos y otros productos como pigmentos,
carotenoides y biopesticidas, entre muchos otros.
La fermentación sólida ofrece ventajas sobre la fermentación sumergida, por
ejemplo, una menor generación de efluentes, el empleo de equipos de fermentación
más sencillos y una concentración relativamente mayor de productos, además que en
fermentación sólida es menos probable que ocurran contaminaciones por bacterias
debido a la baja actividad de agua del medio de cultivo.
Una de las ventajas más importantes que plantea la fermentación sólida, es que
es el medio ideal para la propagación de microorganismos como los hongos, ya que las
características de este tipo de fermentación simulan las condiciones naturales donde se
desarrollan éstos en su medio ambiente, aunado a la posibilidad de utilizar medios de
cultivo provenientes de residuos de origen agroindustrial, lo que abarata costos.
El empleo de hongos para la producción de pectinasas utilizando residuos de la
industria del procesado de frutas, es una buena opción para disminuir el impacto
ecológico que estos desechos plantean al ambiente, generando productos de alto valor
comercial.
Objetivos
•
•
Comprender la importancia del aprovechamiento de residuos de origen
agroindustrial mediante la aplicación de técnicas biotecnológicas para la producción
de metabolitos de alto valor agregado, como las enzimas.
Definir las principales ventajas que la fermentación sólida tiene sobre la
fermentación sumergida.
61
Biotecnología
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material
Tamiz Nº 40, 50 o 60.
Cámara de Neubauer.
Bolsas de plástico.
Tijeras.
Poliuretano (5 g).
Mechero de Fisher (2).
Piseta con alcohol etílico al
70 % (v/v).
Probeta de 50 ml estéril.
Agitador magnético estéril.
Gasa (15x15 cm) estéril.
Embudo estéril.
125 ml con tapón de
algodón, estéril.
Tubos de ensayo con tapa
de rosca estériles (5).
Vaso de precipitado 250 ml.
Probeta de 100 ml.
Espátula para pesado.
Charola de pesado (3).
Pipeta Pasteur.
250 ml con tapón de
algodón estéril (5).
•
•
•
•
Reactivos
Tween 80 0.01% (v/v)
estéril (100 ml).
KH2PO4.
MgSO4.
NaOH 0.5 N.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Equipo
Molino.
Balanza granataria.
Campana de flujo
laminar.
Plancha de
calentamiento con
agitación.
Vortex.
Microscopio.
Potenciómetro.
Balanza analítica.
Autoclave.
Incubadora.
Congelador.
Procedimiento
Preparación del sustrato inductor y el soporte para fermentación
1. Una vez secas, las cáscaras de fruta deben ser molidas y trituradas hasta obtener
un polvo fino. La molienda puede hacerse con un molino para granos de café
comercial, una licuadora o un molino de laboratorio. En su defecto, podría utilizarse
un mortero.
2. El polvo de las cáscaras será tamizado con un tamiz de malla con corte entre 40 y
60 puntos.
3. Deberá obtenerse un mínimo de 20 g de material tamizado, que será guardado en
una bolsa de plástico y etiquetado adecuadamente.
62
Biotecnología
Extracción de esporas para inóculo
1. En condiciones de esterilidad, añadir 50 ml de Tween 80 al 0.0 1% (v/v) al matraz
cultivado con esporas de Aspergillus niger.
2. Colocar el matraz en agitación, haciendo uso de un agitador magnético para
desprender las esporas. El matraz deberá tener colocado el tapón de algodón en
todo momento. Deberá cuidarse que la agitación no sea excesiva, ya que esto
podría desprender partes del agar y dificultar la extracción de las esporas.
3. Una vez desprendidas las esporas, éstas deberán filtrarse a través de tela de gasa
estéril utilizando un embudo, dejando caer el filtrado en un matraz estéril de 125 ml y
colocando un tapón de algodón envuelto en gasa al finalizar el filtrado.
4. En tubos de ensayo estériles, diluir 10 y 100 veces la dilución de esporas con
Tween 80 al 0.01 % (v/v) estéril. Pueden emplearse diluciones con un volumen total
de 5 ml.
5. En una cámara de Neubauer hacer el conteo de esporas y calcular el número de
esporas contenido por mililitro en el filtrado.
Fermentación para producción de pectinasas
1. En un vaso de precipitados de 250 ml, preparar una solución de 75 ml que contenga
375 mg de KH2PO4 y 75 mg de MgSO4. Utilizar agitación magnética para solubilizar
totalmente los reactivos.
2. Con un potenciómetro, ajustar el pH a 6.0 unidades con NaOH 0.5 N.
3. En una bolsa de plástico doble, colocar el poliuretano cortado y agregar los 75 ml de
la solución de sales, tratando de que el poliuretano absorba la solución lo más
homogéneamente posible. Por último, agregar los 20 g de cáscara de fruta molida y
tamizada. Distribuir homogéneamente.
4. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121 °C durante 15 minutos,
cuidando que la bolsa de plástico no quede en contacto directo con partes metálicas
para evitar su rompimiento durante la esterilización.
5. Una vez esterilizado, esperar que el medio de cultivo se enfríe.
6. Emplear guantes de látex para protección. En condiciones de esterilidad, inocular el
medio de cultivo con 2 x 107 esporas por gramo de materia seca; considerando la
materia seca como la suma de los gramos de cáscara de fruta y los gramos de
poliuretano. Emplear la siguiente fórmula:
ó
2 10
.
Nota: multiplicar el resultado de la ecuación por el factor de dilución utilizado para el
conteo de las esporas.
7. Homogeneizar manualmente durante aproximadamente 5 minutos.
8. Dividir equitativamente el contenido de la bolsa en 5 matraces Erlenmeyer de 250 ml
estériles con tapón de algodón cubierto de tela de gasa. Puede utilizarse si se desea
63
Biotecnología
una balanza granataria para que cada matraz contenga 5 g de medio de cultivo
inoculado.
9. Colocar todos los matraces en una incubadora a 30 °C durante 5 días.
10. Cada 24 horas se deberá extraer un matraz de la incubadora y vaciar su contenido
en una bolsa de plástico, que será etiquetada adecuadamente con el tiempo de
fermentación que le corresponde y la fruta utilizada como inductor. La bolsa deberá
colocarse en congelación (-20 °C) hasta ser utilizada.
1. ¿Por qué la fermentación sólida se prefiere sobre la fermentación líquida cuando se
emplean hongos?
2. ¿Qué diferencias podrían obtenerse en los resultados de esta práctica de realizarse
con fermentación líquida (sumergida)?
Resultados
64
Biotecnología
Observaciones
Conclusiones
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
65
Biotecnología
Práctica Nº 11
Cuantificación de actividad pectinasa
producida por Aspergillus niger en fermentación sólida
Fundamento
La fermentación sólida tiene un gran potencial para la producción de enzimas, y los
residuos agroindustriales son considerados como sustratos adecuados para la
producción de pectinasas. La síntesis microbiana de enzimas pectinolíticas está
fuertemente influenciada por los componentes del medio de cultivo. La mayoría de las
enzimas inducidas extracelularmente es sintetizada en mayor cantidad cuando los
inductores adecuados o específicos están presentes en el medio de cultivo.
La pectina es un polisacárido que ocupa hasta una tercera parte del peso seco del
tejido vegetal. Está formada por largas cadenas de ácido galacturónico con residuos de
grupos carboxilo y con diferentes grados de metil ésteres. Es producida comercialmente
como un polvo de color café claro y se extrae principalmente de frutos cítricos. Se
emplea en mayor medida como agente gelificante en mermeladas, gelatinas y dulces,
además de que funge como agente estabilizador en jugos de frutas y bebidas lácteas.
Las pectinasas son de primordial importancia para las plantas, ya que ayudan en
la extensión de la pared celular y además suavizan algunos tejidos vegetales durante la
maduración y el almacenamiento. De acuerdo con su modo de acción, las pectinasas
pueden ser de tres tipos: hidrolasas (poligalacturonasas), liasas (pectin-liasa y pectatoliasa) y esterasas (pectin-esterasa). Debido a la diversidad en su modo de acción, las
pectinasas se utilizan comúnmente en procesos de degradación de material vegetal,
como en el aceleramiento de la extracción de jugos de frutas. Una de las más
estudiadas y comercializadas, es la poligalacturonasa.
Objetivo
•
Comprender el modo de acción de las poligalacturonasas, mediante la
determinación de su actividad pectinolítica.
67
Biotecnología
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material
Piseta con agua destilada.
Guantes de látex.
Tijeras.
Microtubos (30).
Pipeta de 1 ml (15).
Pipeta de 5 ml (15).
Tubo de ensayo de 15 ml (50).
Tina para baño.
Perilla.
Cubetas desechables de 1 ml
Reactivos
Equipo
• Solución de pectina al 1 % • Centrífuga para
(p/v) en buffer de citratos
microtubos.
50 mM, pH 4.5 (10 ml).
• Plancha de
calentamiento.
• Solución de DNS (100 ml).
• Buffer de citrato de sodio
• Espectrofotómetro
50 mM, pH 4.5 (50 ml).
UV/Vis.
Procedimiento
Preparación de extractos enzimáticos y cuantificación de actividad pectinasa
1. Descongelar los fermentos obtenidos durante los 5 días de experimentación.
2. Agregar 30 ml de agua destilada a cada bolsa y homogeneizarlas manualmente
durante 3-5 minutos.
3. Cortar una de las esquinas inferiores de cada bolsa y, mediante presión manual,
extraer el contenido líquido en un tubo de ensayo, cuidando que no salgan cubos de
poliuretano. Emplear guantes de látex para protección.
4. Tomar de 1 a 1.5 ml de cada extracto y colocar en microtubos debidamente
etiquetados.
5. Centrifugar a 13,000 revoluciones por minuto durante 5 minutos.
6. Extraer los sobrenadantes y colocarlos en tubos nuevos debidamente etiquetados.
7. Diluir cada muestra 2 y 10 veces en tubos, empleando agua destilada.
8. En un tubo de ensayo colocar 0.5 ml de sobrenadante y 0.5 ml de solución de
pectina al 1 % (p/v).
9. Incubar a 50 °C durante 30 minutos en baño de agua.
10. Añadir 3 ml de reactivo DNS y colocar el tubo en ebullición durante 10 minutos.
11. Enfriar la reacción hasta temperatura ambiente (30 °C).
12. Tomar 1 ml de la reacción y colocarlo en una cubeta desechable para
espectrofotómetro; tomar lectura a una longitud de onda de 575 nm.
13. Calcular las U/ml de actividad pectinasa obtenidas utilizando la siguiente ecuación:
ó
á
.
ó
Donde:
68
Biotecnología
Volumen de reacción: volumen de sustrato (pectina) utilizado en mililitros.
μmoles de ácido D-galacturónico liberados: se calcula mediante la relación de la
concentración de pectina con la absorbancia obtenida en la curva de calibración,
convertidos a micromoles.
Volumen de muestra: volumen del extracto enzimático utilizado en la reacción.
Nota: deberá prepararse un blanco donde la muestra será agua destilada.
Preparación de la curva de calibración con ácido D-galacturónico
1. Elaborar una curva de calibración de ácido D-galacturónico por duplicado, partiendo
de una solución patrón concentrada de 1 g/l como indica la siguiente tabla.
2.
3.
4.
5.
0
0.0009
1.88
2.82
ml de
solución
patrón
0
1
2
3
ml de buffer de
citratos 0.05 M,
pH 4.5
5
4
3
2
0.8
3.77
4
1
1
4.71
5
0
Tubo
Concentración
en g/l
Concentración
en mM
1
2
3
4
0
0.2
0.4
0.6
5
6
Tomar 1 ml de cada tubo y añadir 3 ml de solución DNS en un tubo limpio.
Colocar en ebullición todos los tubos durante 10 minutos.
Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Tomar 1 ml de cada tubo, colocarlo en una cubeta desechable
espectrofotómetro y tomar lectura a una longitud de onda de 575 nm.
para
1. Elabore una gráfica donde exprese el comportamiento de la actividad pectinasa en
U/ml a través del tiempo.
69
Biotecnología
Resultados
Observaciones
Conclusiones
70
Biotecnología
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
2.3.-
Datos del alumno
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
71
Biotecnología
Práctica Nº 12
Detección de enzimas pectinolíticas por métodos electroforéticos
Fundamento
Las pectinasas son un conjunto de enzimas que hidrolizan la pectina. Están
ampliamente distribuidas en la naturaleza y son producidas por vegetales, frutas y
microorganismos (hongos, levaduras y bacterias). Estas enzimas presentan una
extensa aplicación en la industria alimentaria, siendo utilizadas principalmente en la
obtención de pulpas, jugos, vinos y cervezas.
Las pectinasas se clasifican en:
•
•
•
Enzimas desesterificantes (pectinesterasas). Estas enzimas, al hidrolizar los
enlaces éster metílico, liberan metanol y producen pectina de bajo metoxilo e
incluso ácido poligalacturónico o pectato; son las más abundantes e importantes
en las frutas, sobre todo en los cítricos.
Enzimas despolimerizantes (hidrolasas y liasas). Se clasifican por el modo de
ataque al esqueleto de ácido poligalacturónico. Además pueden romper los
enlaces glucosídicos α(1-4) entre los monómeros de ácido galacturónico de las
pectinas.
Protopectinasas. Son enzimas que solubilizan la protopectina.
Zimogramas
La zimografía es una técnica electroforética, basada en los geles SDS-PAGE y la
aplicación de un sustrato copolimerizado con la poliacrilamida. Las proteínas son
preparadas con los buffer estándares SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras (no se
calientan ni se adicionan agentes reductores). Después de la electroforesis, el gel es
incubado en condiciones específicas para la actividad enzimática a detectar; cuando la
enzima hidroliza el sustrato, se pueden visualizar bandas sobre el gel.
Al efectuar la electroforesis bajo condiciones no desnaturalizantes, se separan las
proteínas de acuerdo con su tamaño molecular y propiedades de carga, mientras el
tamaño del poro de acrilamida sirve como tamiz molecular.
Esta técnica tiene varios beneficios:
•
•
•
Es relativamente barato.
Requiere tiempos de ensayos cortos.
Varias enzimas con la misma actividad pueden ser detectadas en un mismo gel.
73
Biotecnología
Objetivo
•
Comprender la separación de proteínas (enzimas) mediante una técnica
electroforética.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
74
Material
Espátula de pesado.
Charola de pesado.
Piseta con agua
destilada.
Micropipeta de 1ml (1).
Micropipeta de 100 µl (1).
Micropipeta de 10 µl.
Puntas para micropipeta
de 1 ml (20).
de 100 µl (20).
de 10 µl (20).
20 ml (2).
250 ml.
Probeta de 1000 ml.
Charolas de pesado.
Guantes de látex.
Microtubos (15).
Gradilla para
microtubos (2).
Tina para baño.
Vidrio con separador de
1.5 mm para
electroforesis (2).
Vidrio para
electroforesis (2).
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Reactivos
Extractos enzimáticos de la
práctica Nº 11 (1 ml de cada
extracto).
Solución de
acrilamida/biscacrilamida
30 % / 0.8 %.
Buffer Tris 3 M, pH 8.8
(20 ml).
Buffer Tris 3 M, pH 6.8 (20
ml).
Persulfato de amonio 10 %
(p/v) (1 ml).
TEMED (1 ml).
Buffer de migración 10 X
(Tris 0.25 M, glicina 2 M,
SDS 1 %) (200 ml).
Buffer de carga 10 X (TrisHCl 2 M, EDTA 50 mM, azul
de bromofenol 0.1 %,glicerol
0.1 %) (1 ml).
Buffer glicina 100 mM,
CaCl2 1.5 mM, pH 10.0
(100 ml).
Solución ácido
poligalacturónico 0.1 % (p/v)
(100 ml).
Solución rojo de rutenio
0.05 % (p/v) (100 ml).
Solución azul de Coomassie
(azul de Coomassie 0.25 %,
etanol 45.5 %, ácido acético
0.09 %) (200 ml).
•
•
•
•
•
•
•
Equipo
Balanza analítica.
Incubadora.
Sistema para
electroforesis.
Juego de vidrios para
electroforesis (2).
Fuente de poder para
realizar la
electroforesis.
Congelador.
Centrífuga para
microtubos.
Biotecnología
Procedimiento
Preparación del gel de electroforesis en condiciones nativas
1. Los vidrios para electroforesis deberán estar perfectamente limpios y secos, además
de manipularse con guantes. Para esta práctica se emplearán vidrios con
espaciadores de 1.5 mm. Se toman los vidrios, uno con espaciadores integrados y
otro más pequeño, y se acomodan en el soporte asegurándolos moviendo los
broches (FIGURA 1). Montarlos en el soporte transparente para dejarlos fijos.
Figura 1.
2. En un vaso de precipitados de 25 ml, preparar el gel de separación (inferior), en el
orden que muestra la TABLA 1.
Tabla 1. Gel separador para electroforesis.
Soluciones
(ml)
Acrilamida / bisacrilamida 30 % / 0.8 %
6.55
Tris 3 M pH 8.8
2.63
Agua
10.24
(µl)
APS 10 %
112.5
TEMED
11.3
3. Verter la solución anterior en los vidrios (2 juegos de vidrios) montados en el soporte
transparente (FIGURA 2). Este soporte deberá estar en una mesa nivelada.
Figura 2.
75
Biotecnología
4. Agregar cuidadosamente agua. Cuando el gel esté completamente polimerizado
(alrededor de 30 minutos), retirar el agua.
5. Preparar el gel concentrador (superior) en un vaso de precipitados, en el orden que
muestra la TABLA 2.
Tabla 2. Gel concentrador para electroforesis.
Solución
(ml)
Acrilamida / bisacrilamida 30 % / 0.8 %
1.25
Tris 3M pH 6.8
0.5
Sucrosa 66 %
1.68
Agua
4.0
(µl)
APS 10 %
28.13
TEMED
5.63
6. Verter la mezcla sobre el gel separador y colocar el peine. Esperar hasta que
polimerice.
7. Desmontar los vidrios del soporte transparente y verde; ensamblarlos en el soporte
de la cubeta de electroforesis (FIGURA 3) y ponerlos dentro de la cubeta para
electroforesis.
Figura 3.
8. La cubeta para la electroforesis deberá colocarse dentro de un recipiente con hielo.
Una vez colocados los soportes con los geles dentro de la cubeta, se vertirá el buffer
de migración.
Preparación de las muestras
1. Descongelar las muestras de extractos enzimáticos generados en la Práctica Nº 11.
76
Biotecnología
2. Cuando las muestras se hayan descongelado por completo, tomar 80 µl de la
muestra, colocarla en un microtubo y adicionar 10 µl buffer de carga. Agitar en el
vórtex y mantener a 4 °C.
Condiciones de corrida de electroforesis
1. Quitar cuidadosamente el peine de los geles superiores.
2. Al quitar el peine quedarán formados pozos, donde se depositarán las muestras. En
cada pozo poner cuidadosamente 35 µl de muestra con ayuda de micropipetas. Se
pondrán las mismas muestras en el mismo orden en el gel colocados del otro lado
del soporte, dentro de la cubeta de electroforesis.
3. Colocar la tapa con los electrodos sobre la cubeta y conectar correctamente a la
fuente de poder.
4. Encender la fuente de poder y hacer la corrida de electroforesis a 110 V.
5. Apagar la fuente de poder cuando el frente del gel (línea azul) comience a emerger.
6. Sacar los soportes con los vidrios de la cubeta y desmontarlos cuidadosamente para
extraer cada gel. Poner un gel (gel A) en un recipiente con la solución de azul de
Coomassie y el otro ponerlo en otro recipiente plástico para el zimograma (gel B).
Zimograma para la detección de pectinasa
1. Lavar el gel B en agua destilada, esto es, poner el gel en el recipiente de plástico y
agregar agua destilada hasta que se cubra por completo; dejarlo ahí durante
20 minutos. Retirar el agua y desecharla.
2. Lavar el gel con buffer glicina 100 mM, pH 10.0 y CaCl2 1.5 mM por 30 minutos.
3. Transcurrido ese tiempo, retirar el buffer y poner sobre el gel una solución con 0.1 %
de ácido poligalacturónico disuelto en el buffer glicina 100 mM y CaCl2, pH 10.0.
4. Incubar a 45 °C por 30 minutos.
5. Colocar sobre el gel una solución con 0.05 de rojo de rutenio (p/v) durante
10 minutos y lavar con agua hasta que las bandas comiencen a ser visibles. Tome el
tiempo de aparición de las bandas de hidrólisis.
1. Describa brevemente los tipos de electroforesis existentes.
77
Biotecnología
2. De las muestras analizadas, ¿en cuál apareció primero la banda de hidrólisis?
¿Concuerda con la muestra que presentó mayor actividad enzimática en la práctica
anterior (Nº 11)?
78
Biotecnología
Resultados
Observaciones
Conclusiones
79
Biotecnología
Título
1.-
Autor
Página
Editorial
2.3.-
Datos del alumno
Nombre del alumno
Fecha
Grado/grupo/turno
Calificación
80
Biotecnología
Bibliografía
Alarcón, LR; Olivas, E. (2004). Manual de prácticas de microbiología básica y
microbiología de alimentos. México: Universidad Autónoma de Ciudad Juárez.
Aquiahuatl, MA; Volke, T.; Prado, LA; Shirai, K.; Ramírez, F. & Salazar, M. (2012).
Manual de prácticas de laboratorio de microbiología general. México: Universidad
Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa.
Asare-Brown & E., Bullock, C. (1988). «Simple practical investigations using invertase».
Biochemical Education. 16(2), 98-100.
Brock, D.; Madigan, M.; Martinko, J. & Parker, J. (2009). Brock. Biología de los
microorganismos. España: Prentice-Hall.
Brown, C.; Campbell, I. & Priest, F. (1989). Introducción a la biotecnología. Zaragoza,
España: Acribia, SA.
Corona-González, R.; Pelayo-Ortiz, C.; González-Álvarez, V. & Zúñiga-Partida,
V. (2005). «Optimización de la Producción de Inulinasas por Saccharomyces sp.
a partir de Agave tequilana Weber variedad azul». e-Gnosis, 3, 1-10.
d'Avila-Levy, C.; Santos, ALS; Cuervo, P.; Batista, J. & Branquinha, MH (2012).
«Applications of Zymography (Substrate-SDS-PAGE) for Peptidase Screening».
En S. Magdeldin (ed.) Post-Genomica Era, Gel Electrophoresis - Advanced
Technique.
Darah, I.; Taufiq, M., & Lim, S. (2013). «Pomelo Citrus grandis (L.) Osbeck peel as an
economical alternative substrate for fungal pectinase production». Food Science
and Biotechnology, 22, 1683-1690.
Flores, J.; Gschaedler, A.; Amaya-Delgado, L.; Herrera-López, E.; Arellano, M. &
Arrizon, J. (2013). «Simultaneous saccharification and fermentation of Agave
tequilana fructans by Kluyveromyces marxianus yeasts for bioethanol and tequila
production». Bioresource Technology, 146, 267-273.
García-Aguirre, M.; Sáenz-Álvaro, V.; Rodríguez-Soto, M.; Vicente-Magueyal, F.;
Botello-Álvarez, E.; Jiménez-Islas, H.; Cárdenas-Manríquez, M.; RicoMartínez, R. & Navarrete-Bolaños, J. (2009). «Strategy for biotechnological
process design applied to the enzymatic hydrolysis of Agave fructooligosaccharides to obtain fructose-rich syrups». Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 57, 10205-10210.
Kotwal, S. & Shankar, V. (2009). «Immobilized invertase». Biotechnology Advances,
27(4), 311-322.
Kulshrestha, S.; Tyagi, P.; Sindhi., & Yadavilli, K. (2013). «Invertase and its applications
– A brief review». Journal of Pharmacy Research, 7, 792-797.
Kumar, S.; Sharma, H. & Sarkar (2011). «Effect of substrate and fermentation conditions
on pectinase and cellulose production by Aspergillus niger NCIM 548 in
submerged (SmF) and solid state fermentation (SSF)». Food Science and
Biotechnology, 20, 1289-1298.
Kumar, Y.; Varakumar, S. & Reddy, O. (2010). «Production and optimization of
polygalacturonase from mango (Mangifera indica L.) peel using Fusarium
81
Biotecnología
moniliforme in solid state fermentation». World Journal of Microbiology and
Biotechnology, 26, 1973-1980.
Maldonado, M.; Navarro, A. & Callieri, D. (1986). «Production of pectinase by
Aspergillus sp. using differently pretreated lemon peel as the carbon source».
Biotechnology Letters, 8(7), 501-504.
Mathews, CK; Ahern, KG; Van Holde, KE (2002). Bioquímica. Addison-Wesley.
Milovanović, A.; Božić, N. & Vujčić (2007). «Cell wall invertase immobilization within
calcium alginate beads». Food Chemistry, 104(1), 81-86.
Montáñez, J.; González, J.; Bernardino, A. & Ramos, E. (2011). «Enzymatic production
of high fructose syrup from Agave tequilana fructans and its physicochemical
characterization». African Journal of Biotechnology, 10, 19137-19143.
Naidu, G. & Panda, T. (1998). «Production of pectolytic enzymes – a review».
Bioprocess Engineering, 19, 355-361.
Namasivayam, E.; Ravindar, J.; Mariappan, K.; Akil, J.; Kumar, M. & Jayaraj, RL (2011).
«Production of Extracellular Pectinase by Bacillus Cereus Isolated From Market
Solid Waste». Journal of Bioanalysis & Biomedicine, 3(3), 70-75.
Pandey, A.; Soccol, C.; Selvakumar, P.; Soccol, V.; Krieger, N.; & Fontana, J. (1999).
«Recent Developments in Microbial Inulinases. Its Production, Properties, and
Industrial Applications». Applied Biochemistry and Biotechnology, 81(1), 35-52.
Pressey, R. & Shaw, R. (1996). «Effect of temperature on invertase, invertase inhibitor,
and sugars in potato tubers». Plant physiology, 41(10), 1657-1661.
Tanriseven, A. & Doğan, S. (2001). «Immobilization of invertase within calcium alginate
gel capsules». Process Biochemistry, 36, 1081-1083.
Sánchez, P.; Hernández, R.; Pedraz, J. & Orive, G. (2013). «Encapsulation of Cells in
Alginate Gels». En JM Guisan (ed.) Immobilization of Enzymes and Cells
(pp. 313-326). Madrid, España: Humana Press.
Selvakumar, P. & Pandey, A. (1999). «Comparative studies on inulinase synthesis by
Staphylococcus sp. and Kluyveromyces marxianus in submerged culture».
Bioresource Technology, 69(2), 123-127.
Sharma, N.; Rathore, M. & Sharma, M. (2013). «Microbial pectinase: sources,
characterization and applications». Reviews in Environmental Science and
Bio/Technology, 12(1), 45-60.
Uma, C.; Gomathi, D.; Ravikumar, G.; Kalaiselvi, M. & Palaniswamy. M. (2012).
«Production and properties of invertase from Cladosporium cladosporioides in
SmF using pomegranate peel waste as substrate». Asian Pacific Journal of
Tropical Biomedicine, 2(2), S605, S611.
Wiseman, A. (1986). Principios de biotecnología. Zaragoza, España: Acribia, SA.
82
Biotecnología
Recomendaciones para el manejo de residuos biológico infecciosos
Durante el desarrollo de las prácticas del laboratorio de biotecnología se manipularán
microorganismos vivos, por lo cual se deberán seguir los reglamentos establecidos para
el manejo y desecho de residuos biológico infecciosos en el laboratorio, de acuerdo con
la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud
ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones
de manejo.
Para efectos de esta NOM y la utilización dentro de este Manual de Prácticas, se
consideran residuos peligrosos biológico-infecciosos los siguientes:
•
•
Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así
como los generados en la producción y control de agentes biológico-infecciosos.
Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos
de agentes biológico-infecciosos.
Los alumnos deberán colocar los residuos en los recipientes correspondientes para que
sean tratados por los prestadores de servicio.
Los prestadores de servicios deben cumplir con las disposiciones
correspondientes a las siguientes fases de manejo, según el caso:
a)
b)
c)
d)
e)
Identificación de los residuos.
Envasado de los residuos generados.
Almacenamiento temporal.
Tratamiento.
Disposición final.
Tipo de residuos
Estado físico
Envasado
Color
Cultivos y cepas de
agentes infecciosos
Sólidos
Bolsas de
polietileno
Rojo
Objetos punzocortantes
Sólidos
Recipientes
rígidos de
polipropileno
Rojo
Tratamiento
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos deben ser tratados por métodos físicos o
químicos que garanticen la eliminación de microorganismos patógenos y deben hacerse
irreconocibles para su disposición final en los sitios autorizados.
Para este fin, los residuos generados no son considerados patógenos, pues se
utilizan microorganismos utilizados en la industria alimenticia considerados como
83
Biotecnología
seguros para consumo humano, por lo que se esterilizarán en autoclave para
posteriormente ser desechados.
Disposición final
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos tratados e irreconocibles, podrán
disponerse como residuos no peligrosos en sitios autorizados por las autoridades
competentes.
Manejo de sustancias tóxicas e irritantes
Durante la mayoría de las prácticas del laboratorio de biotecnología se trabajará con el
ácido 3,5-dinitrosalicílico, que puede ocasionar irritación al contacto con la piel e
irritación en las vías respiratorias al ser inhalado, por lo que es de gran importancia el
empleo de guantes durante su manipulación.
Los residuos generados de este reactivo deberán colocarse en un contenedor
exclusivo y cerrado para su disposición final.
84

Manual de Prácticas de Laboratorio

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