Conception, synthèse et développement d`inhibiteurs de l`enzyme

Conception, synthèse et développement d`inhibiteurs de l`enzyme

Conception, synthèse et développement d’inhibiteurs de l’enzyme MabA selon une
approche par fragments pour traiter la tuberculose
Encadrement : Dr Marion Flipo
Laboratoire de rattachement : U1177 Médicaments et Molécules pour Agir sur les
Systèmes Vivants – INSERM – Institut Pasteur de Lille - Université de Lille – Directeur Prof
B. Déprez
Résumé du projet de thèse
Selon les données les plus récentes, la tuberculose, une maladie causée par Mycobacterium
tuberculosis, entraîne plus de 1,4 millions de morts et 8,8 millions de nouveaux cas chaque
année dans le monde. Le traitement de la maladie implique une chimiothérapie longue qui
provoque de nombreux effets secondaires, il est donc nécessaire de trouver d’autres
solutions thérapeutiques. Le but du projet est de découvrir et d’optimiser de nouvelles
molécules actives contre l’infection par Mycobacterium tuberculosis en ciblant l’enzyme
MabA, nécessaire à la synthèse des acides mycoliques qui sont les constituants essentiels
de la paroi bactérienne.
Un criblage de 1280 composés a été réalisé au laboratoire sur la cible et a permis
l’identification de plusieurs séries chimiques originales inhibant l’enzyme MabA. Nous
sommes actuellement dans la phase de synthèse d’analogues des séries chimiques
identifiées afin d’établir des relations structure-activité. Les composés synthétisés seront
évalués dans un modèle cellulaire d’infection par Mycobacterium tuberculosis afin d’évaluer
leur activité inhibitrice de l’infection bactérienne.
L’objectif du projet est à terme de faire la preuve de concept chez l’animal en évaluant la
capacité de nos composés à diminuer l’infection bactérienne dans un modèle murin et de
proposer des têtes de série pharmaceutiques pour un usage futur chez l’homme.
L'étudiant en thèse participera à la phase d’optimisation des composés identifiés lors du
criblage. Pour cela le candidat aura en charge un important travail de chimie médicinale afin
d’établir des relations structure-activité mais aussi très rapidement des relations structurepropriétés de la série chimique étudiée. L’étudiant participera à la conception et à la
synthèse des inhibiteurs ainsi qu’à l’interprétation et l’exploitation des résultats biologiques.
Contexte scientifique sujet de recherche
Selon les données les plus récentes, la tuberculose (TB), une maladie causée par
Mycobacterium tuberculosis, entraîne plus de 1,4 millions de morts et 8,8 millions de
nouveaux cas chaque année dans le monde. Le traitement de la maladie implique une
chimiothérapie qui doit être administrée pendant six mois ou jusqu'à quatre ans pour le
traitement des souches multi-résistantes aux antibiotiques (MDR-TB). Dans ce contexte, la
thérapie est souvent associée à de graves effets secondaires, qui réduisent l'observance du
patient et conduisent à des taux élevés de rechute et de mortalité. Les récents efforts de
recherche ont abouti à l'approbation de bédaquiline, un inhibiteur de l'ATP synthase
mycobactérienne et delamanid, un inhibiteur de la biosynthèse des acides mycoliques.
Cependant, ces médicaments entraînent des effets secondaires importants donc d'autres
molécules actives contre des cibles jusque-là inexploitées sont nécessaires afin de
raccourcir les traitements et stopper l'apparition de résistances.
Les acides mycoliques sont des acides gras à très longues chaînes qui jouent un rôle
essentiel dans l'architecture et la perméabilité de la paroi de M. tuberculosis. La machinerie
de biosynthèse des acides mycoliques, qui est la cible d’antituberculeux de première et
seconde lignes, représente un réservoir important de cibles attrayantes (Figure 1).
O
R
S CoA
Thiolactomycin
TLM
Ethionamide
INH/ETH
Isoniazid
Isoxyl
ISO/THZ
Thiacetazone
C56
C60 - C90
Figure 1. Voie de biosynthèse des acides mycoliques. Le système FAS-II comprend quatre
enzymes qui agissent successivement et à plusieurs reprises pour assurer l'allongement des acides
gras, conduisant finalement à l'acide meromycolique.
La protéine appelée MabA, également nommée FabG1, est impliquée dans la biosynthèse
des acides mycoliques et catalyse la réduction NADPH-spécifique de dérivés betacétoacyles à longue chaîne. Des études génétiques ont montré que MabA était essentielle
pour la survie de M. tuberculosis, cette enzyme représente donc une cible de choix pour
démarrer un programme de découverte de médicaments. L’objectif du projet est d'utiliser des
approches très innovantes pour développer de nouveaux inhibiteurs de MabA de faible poids
moléculaire. Ces composés seront utiles pour concevoir de nouvelles thérapies contre la
tuberculose, raccourcir le traitement et surmonter la résistance aux médicaments.
Etat du sujet dans le laboratoire
Afin d’identifier des molécules capables d’inhiber l’enzyme MabA, nous avons développé au
laboratoire un test primaire à haut débit basé sur la LCMSMS que nous avons optimisé pour
une utilisation en criblage au format 384 puits. 1280 petites molécules appelées fragments
ont été criblés, et les meilleurs inhibiteurs ont été sélectionnés et validés par des
expériences de doses réponse. L'un des principaux avantages à utiliser des fragments
comme molécules de départ repose sur leur petite taille et leur faible poids moléculaire (MW
< 300 g/mol). Ils présentent donc de meilleures propriétés physico-chimiques, en particulier
au niveau de la solubilité, que des composés lead-like ou drug-like.
A partir des fragments identifiés, l’objectif du travail de thèse est d’obtenir des inhibiteurs de
MabA qui soient bactéricides avec des caractéristiques physicochimiques,
pharmacocinétiques et pharmacodynamiques adéquates pour une preuve de concept chez
l’animal et un usage futur chez l’homme.
Le projet s’articule en trois phases présentées dans la Figure 2.
En cours
Figure 2. Les 3 phases du projet

La première phase de la découverte de familles d’inhibiteurs a été réalisée. Un
criblage de 1280 composés a été effectué au laboratoire sur l’enzyme MabA et a
permis l’identification de plusieurs séries chimiques capables d’inhiber cette enzyme.

Nous sommes actuellement dans la 2ème phase du projet. Des composés analogues
des familles identifiées sont en cours de synthèse afin d’établir des relations
structure-activité.
Les critères retenus pour l’orientation des synthèses sont :
- l’augmentation de l’inhibition de MabA, mesurée grâce à la LCMSMS
- l’augmentation de l’inhibition de la croissance bactérienne
- le contrôle des paramètres physico-chimiques afin de favoriser la solubilité et
l’accès des composés à la cible
L’objectif de cette tâche est de fournir des inhibiteurs de MabA présentant des IC50
idéalement nanomolaires sur l’enzyme et sur la bactérie. La toxicité des composés
vis-à-vis des macrophages et leur sélectivité vis-à-vis d’autres enzymes
mycobactériennes sera également évaluée afin de vérifier que l’inhibition de la
croissance bactérienne n’est pas due à la toxicité des produits mais bien à leur
capacité à inhiber l’enzyme MabA.
La stabilité plasmatique et les propriétés physico-chimiques (tels que la solubilité et le
logD) des composés actifs, paramètres critiques pour la biodisponibilité in vivo, seront
déterminés expérimentalement. Afin de pouvoir rapidement estimer le risque
d’instabilité métabolique et le prendre en considération dans le développement des
séries chimiques, un test sur microsomes hépatiques sera également effectué.

La preuve de concept chez l’animal constitue la dernière phase du projet. Un objectif
particulièrement important sera l’observation d’une efficacité in vivo des composés et
la validation simultanée de l’enzyme MabA comme cible thérapeutique. Une condition
sine qua non pour atteindre cet objectif est de réussir à exposer de manière optimale
l’animal au composé testé. Pour cela il faudra administrer un composé, dont l’activité
et les caractéristiques ADME auront été préalablement optimisées, avec une
formulation adéquate. Le choix ultime des composés candidats à une « preuve de
concept » chez l’animal pourra être réalisé à la suite d’une étude de
pharmacocinétique in vivo.
Les composés ainsi sélectionnés seront testés dans un modèle murin pour évaluer
leur capacité à inhiber la croissance bactérienne.
Ce projet soutenu par un financement « Jeunes chercheurs, jeunes chercheuses » de l’ANR
s’appuie sur un consortium pluridisciplinaire qui rassemble 4 équipes avec les compétences
requises et les ressources techniques nécessaires comprenant la conception rationnelle de
molécules guidée par la cristallographie aux rayons X et la modélisation in silico, des tests
d'activité haut débit sur la cible et sur la bactérie (plateforme Equipex Imaginex) et le
profilage ADME.
Programme et échéancier de travail
Le travail du candidat au cours de ce projet se concentrera essentiellement sur la partie
« Optimisation Hit to Lead ». Il s’agira d’optimiser les inhibiteurs de MabA identifiés au
laboratoire présentant des caractéristiques physicochimiques, pharmacocinétiques, et
pharmacodynamiques adéquates pour une preuve de concept chez l’animal et un
développement futur chez l’homme.
Pour cela le candidat aura en charge un important travail de chimie médicinale afin d’établir
les relations structure-activité mais aussi très rapidement les relations structure-propriétés de
la série chimique étudiée. L’étudiant participera à la conception et à la synthèse des
inhibiteurs ainsi qu’à l’interprétation et l’exploitation des résultats. Ce travail sera réalisé au
sein de l’équipe U1177 Médicaments et Molécules pour Agir sur les Systèmes Vivants. Le
programme du projet est présenté Figure 3.
Criblage de 1280 fragments sur l’enzyme MabA

Validation de familles chimiques
Cocristallisation et criblage in silico
Mois
0
Synthèse de 50 composés/famille
Test enzymatique MabA
Test sur macrophages infectés par M. tuberculosis

18
Cocristallisation
Hit
Profil du hit :
• MW < 400 g/mol
• IC50 MabA< 10 µM
• MIC90 M. tuberculosis < 10 µg/mL
• RSA définies
• Solubilité > 10 µM
Conception et synthèse
Test enzymatique MabA
Test sur macrophages infectés par M. tuberculosis
Propriétés physico‐chimiques & ADME in vitro (stabilités plasmatique et microsomale)

Lead
36
Preuve de concept in vivo chez la souris
Profil du lead :
• MW < 400 g/mol
• clogP < 3
• IC50 MabA < 1 µM
• MIC90 M. tuberculosis < 1 µg/mL
• Solubilité > 10 µM
• Stabilité plasmatique : t1/2 > 24h
• Stabilité microsomale : t1/2 > 30 min
• Bonne exposition de la souris
Figure 3. Programme du projet
Retombées scientifiques et économiques attendues
Aucun inhibiteur de MabA de type petites molécules organiques n’est décrit à ce jour. La
découverte d’inhibiteurs de cette interaction permettra de valider cette cible et d’apporter une
nouvelle voie thérapeutique pour le traitement de la tuberculose et pourra donc faire l’objet
de dépôt de brevets et publications scientifiques dans des journaux à impact factor élevé.
Profil du candidat
Le candidat devra posséder un Master 2 en chimie organique ou chimie médicinale et être
issu de faculté de sciences, de pharmacie ou d’école d’ingénieur chimiste. Le candidat
utilisera les techniques et appareils suivants :
- chimie en phase homogène ou solide (synthèses hétérocycliques, couplages
métallocatalysés, ...)
- techniques d'analyses (LCMS, RMN)
- techniques de purification (chromatographie automatisée en phase solide, HPLC
préparative)
- outils de recherche bibliographique (Reaxys, SciFinder)
Afin d’avoir du succès dans cette recherche, le candidat devra faire preuve de rigueur,
créativité, initiative et capacité à travailler en équipe.
Collaborations et liste de publications portant directement sur le sujet
Ce projet soutenu par un financement « Jeunes chercheurs, jeunes chercheuses » de l’ANR
entre dans le cadre d’un effort collaboratif de 4 équipes de recherche :
 Inserm U1177 / Institut Pasteur de Lille / Université de Lille : Médicaments et
Molécules pour Agir sur les Systèmes Vivants
 Inserm U1019 / CNRS UMR 8204 / Institut Pasteur de Lille / Université de Lille / CIIL :
Infections Respiratoires Bactériennes : Coqueluche et Tuberculose
 Inserm UMR-S973 / Université Paris-Diderot : Molécules Thérapeutiques in silico
 Structural Biology Brussels and Molecular and Cellular Interactions, Vlaams Instituut
voor Biotechnologie, Bruxelles, Belgique
Liste des publications portant sur l’enzyme MabA :
1.
Marrakchi, H., S. Ducasse, G. Labesse, H. Montrozier, E. Margeat, L. Emorine, X.
Charpentier, M. Daffé, A. Quémard. MabA (FabG1), a Mycobacterium tuberculosis protein
involved in the long-chain fatty acid elongation system FAS-II. Microbiology, 2002, 148, 951.
2.
Parish, T., G. Roberts, F. Laval, M. Schaeffer, M. Daffé, K. Duncan. Functional
complementation of the essential gene fabG1 of Mycobacterium tuberculosis by
Mycobacterium smegmatis fabG but not Escherichia coli fabG. J. Bacteriol. 2007, 189, 3721.
3.
Veyron-Churlet, R., I. Zanella-Cléon, M. Cohen-Gonsaud, V. Molle, L. Kremer.
Phosphorylation of the Mycobacterium tuberculosis beta-ketoacyl-acyl carrier protein
reductase MabA regulates mycolic acid biosynthesis. J. Biol. Chem. 2010, 285, 12714.
Liste des publications rapportant la mise en œuvre du savoir-faire de l'U1177 dans le
domaine de la tuberculose:
1.
Willand, N., B. Dirie, X. Carette, P. Bifani, A. Singhal, M. Desroses, F. Leroux, E.
Willery, V. Mathys, R. Deprez-Poulain, G. Delcroix, F. Frenois, M. Aumercier, C. Locht, V.
Villeret, B. Deprez and A. R. Baulard. Synthetic EthR inhibitors boost antituberculous activity
of ethionamide. Nature Med. 2009, 15, 537.
2.
Flipo, M., M. Desroses, N. Lecat-Guillet, B. Dirie, X. Carette, F. Leroux, C. Piveteau,
F. Demirkaya, Z. Lens, P. Rucktooa, V. Villeret, T. Christophe, H. K. Jeon, C. Locht, P.
Brodin, B. Deprez, A. R. Baulard and N. Willand. Ethionamide Boosters: Synthesis,
Biological Activity, and Structure-Activity Relationships of a Series of 1,2,4-Oxadiazole EthR
Inhibitors. J. Med. Chem. 2011, 54, 2994.
3.
Flipo, M., M. Desroses, N. Lecat-Guillet, B. Villemagne, N. Blondiaux, F. Leroux, C.
Piveteau, V. Mathys, M. P. Flament, J. Siepmann, V. Villeret, A. Wohlkönig, R. Wintjens, S.
H. Soror, T. Christophe, H. K. Jeon, C. Locht, P. Brodin, B. Déprez, A. R. Baulard and N.
Willand. Ethionamide boosters. 2. Combining bioisosteric replacement and structure-based
drug design to solve pharmacokinetic issues in a series of potent 1,2,4-oxadiazole EthR
inhibitors. J. Med. Chem. 2012, 55, 68.
4.
Flipo, M., N. Willand, N. Lecat-Guillet, C. Hounsou, M. Desroses, F. Leroux, Z. Lens,
V. Villeret, A. Wohlkönig, R. Wintjens, T. Christophe, H. Kyoung Jeon, C. Locht, P. Brodin, A.
R. Baulard and B. Déprez. Discovery of novel N-phenylphenoxyacetamide derivatives as
EthR inhibitors and ethionamide boosters by combining high-throughput screening and
synthesis. J. Med. Chem. 2012, 55, 6391.
5.
Villemagne, B.; Flipo, M.; Blondiaux, N.; Crauste, C.; Malaquin, S.; Leroux, F.;
Piveteau, C.; Villeret, V.; Brodin, P.; Villoutreix, B.; Sperandio, O.; Soror, S.; Wohlkönig, A.;
Wintjens, R.; Deprez, B.; Baulard, A. R.; Willand, N. Ligand Efficiency Driven Design of New
Inhibitors of Mycobacterium tuberculosis Transcriptional Repressor EthR Using Fragment
Growing, Merging, and Linking Approaches. J. Med. Chem. 2014, 57, 4876.