1 Mikroskopije Sestava aparature za slikanje Interakcija med snovjo

Transcription

1 Mikroskopije Sestava aparature za slikanje Interakcija med snovjo
Mikroskopije
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Sestava aparature za slikanje
Interakcija med snovjo in valovanjem (delci)
IZVOR
valovanja (delcev)
„OPTIKA“
OPAZOVANA SNOV / PRIPRAVA VZORCA
„OPTIKA“
DETEKTOR
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
1
Primerjaj med metodami!!
• občutljivost
• razmerje signal/šum
Kontrast –
zaznavanje
robov/mej!!!
• dinamični razpon
• prostorska ločljivost
• časovna ločljivost
• osnovni princip nastanka slike
• pogoji priprave opazovanega sistema
• komponente aparatur oz. opreme
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Mikroskopija
•
Pred očesom potrebujemo vmesnik, ki
poveča sliko ! Slednja pomeni povečane
razdalje med deli slike oz. povečanimi koti !
•
Še vedno gledamo krajevno odvisno
absorbcijo svetlobe !
•
V vsaki točki slike zbiramo svetlobo
– iz vseh optičnih ravnin in
– različnih valovnih dolžin !
•
Kontrast pomeni razliko
v inteziteti v dveh točkah
slike !
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
2
Povečava mikroskopa
okular kot
povečevalno steklo
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Primeri slik optične mikroskopije
majhni organizmi,
organi
(6x, ~ 100 m)
1 mm = 1000 m
tkiva
(600x, ~ 10 m)
posamezne celice
(1000x, ~ 1 m)
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
3
Povečava vs. ločljivost
Poljubno velika povečava nam ne da poljubno velike ločljivosti!!
GEOMETRIJSKA OPTIKA
Zoran Arsov
VALOVNA OPTIKA
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Uklon na eni reži in interferenčni vzorec
Airyjev disk
*
....
točkast izvor
svetlobe
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
4
Rayleighjev kriterij
S1 max.
S2 (1.) min.
dva točkasta
izvora (S1, S2)
y … lateralna ločljivost
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Meja ločljivosti pri optičnem mikroskopu
kot zajema 
(kotna apertura)
y ≈ 0.61  / sin
y bo manjši za nižje 
in večje 
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
5
Kako lahko povečamo ločljivost
y = 0.61  / (n sin) =
= 0.61  / NA
NA ... numerična apertura
imerzijska mikroskopija
  /n
(n ... lomni količnik)
y ≈ 200 nm ≈ /2
 = 450 nm
n = 1.5
 = 70°
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Lateralna vs. aksialna ločljivost
z ≈ 2 y
3D Airyjev vzorec
Zoran Arsov
2D Airyjev vzorec
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
6
Različni načini izvedbe presevne optične
mikroskopije
Metode za neobarvane vzorce!!
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Mikroskopija s svetlim poljem
Svetlobna mikroskopija eritrocitov
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
7
Mikroskopija s temnim poljem
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Fluorescenčna mikroskopija
•
Ne gledamo absorpcije vse svetlobe,
temveč le tisto, ki se absorbira na
fluorescenčnih označevalcih, ki svetlobo
absorbirajo ter jo nato emitirajo pri višji
valovni dolžini (nižji energiji) !
svetlo polje
Zoran Arsov
fluorescenca
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
8
Fluorescenčna mikroskopija celic; sestavljena slika iz slik citoskeleta, jedra in membran
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Časovna ločljivost
dinamika membranskih domen na orjaških lipidnih vesiklih
0 s
5 s
10 s
15 s
10 µm
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
9
Konfokalna mikroskopija
•
Dodatna drobna zaslonka zbira
svetlobo le iz izbrane optične
ravnine !
•
V vsaki točki slike zbiramo
svetlobo
– iz ene same izbrane optične
ravnine in
– različnih valovnih dolžin !
•
Kontrast pomeni razliko v inteziteti
v dveh točkah slike v eni optični
ravnini !
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
z
fluorescenca
Zoran Arsov
6 m
konfokalna fluor.
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
10
Spektroskopija
• Ne zanima nas, od kje prihaja
svetloba, temveč kakšna je !
• Gledamo spekter ! Iz celotne
slike zbiramo svetlobo in jo
analiziramo pri različnih
valovnih dolžinah !
• Kontrast pomeni razliko
spektralne gostote pri dveh
podobnih valovnih dolžinah !
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Konfokalna mikrospektroskopija
•
Na detektorju zmoremo ločiti
svetlobo različnih valovnih dolžin !
•
Gledamo krajevno odvisno
absorbcijo spektra svetlobe !
Ne zanima nas le intenziteta
spektra, temveč posamezni deli
spektra oz. spektralna gostota, ki
se s krajem spreminja !
•
Kontrast pomeni katerikoli razliko
v spektru v dveh točkah slike !
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
11
Fluorescence intensity (a.u.)
konfokalno
mikrospektroskopija
Membrane probe
Nanoparticles
500
550
600
Wavelength (nm)
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
IR in ramanska mikrospektroskopija
• Na detektorju zmoremo ločiti
svetlobo različnih valovnih
dolžin v IR področju!
• Gledamo krajevno odvisno
absorbcijo IR ali Ramanskega
spektra!
Zanimajo nas posamezni deli
spektra, npr. slika v izbranem
vibracijskem načinu določene
kemijske skupine !
IR vs. Raman
y = 0.61  / (n sin) =
= 0.61  / NA
NA ... numerična apertura
• Kontrast pomeni katerikoli
razliko v spektru v dveh točkah
slike !
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
12
KONCEPT vibracijske MIKROSPEKTROSKOPIJE!!!
V vsaki točki slike zajamemo celoten vibracijski
spekter.
To pomeni, da lahko kontrastiramo sliko preko
lokalizacije različnih molekulskih skupin
(kemično mapiranje). Intenziteta barve lahko
pomeni lokalno koncentracijo neke snovi.
Pri SPEKTROSKOPIJI
posnamemo povprečen
vibracijski spekter vzorca.
NI KRAJEVNE
INFORMACIJE o razporeditvi
komponent v vzorcu!!!
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Sklopitev FTIR spektrometra in mikroskopa
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
13
Shema FTIR mikroskopa
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Možnosti za
zajem slike
vrstični mikroskop
(zajem slike točko
po točko)
mikroskop s FPA
detektorjem
(zajem celotne
slike hkrati)
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
14
Shema Ramanskega mikroskopa
spektrometer z
detektorjem
posebni optični filtri!!!
notch – (anti)Stokes
edge - Stokes
prostor za vzorce
Zoran Arsov
monokromatski izvor
STABILNOST!!!
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Spektralna ločljivost - Raman
odvisnost od disperzijskih
lastnosti uklonske mrežice
Zoran Arsov
odvisnost od goriščne
razdalje zrcal v spektrometru
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
15
Stimulated Raman Scattering Microscopy –
Mikroskopija s stimuliranim ramanskim sipanjem
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
16
Ko svetlobo zamenjajo hitri delci
Zelo hitri delci se namreč obnašajo kot svetloba !
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Presevna elektronska mikroskopija (TEM)
• Gledamo krajevno odvisno
(ne)sipanje hitrih elektronov !
• V vsaki točki slike zbiramo
elektrone, ki se niso sipali na
vzorcu, ki mora biti v vakuumu
in na prevodnem nosilcu (da se
vzorec ne nabija) !
leča
• Kontrast pomeni razliko
v sipanju elektronov v dveh
točkah slike, ki je odvisna od
mase sipalcev (jeder) !
Zoran Arsov
elektromagnetna
leča
(tuljava,
kondenzator)
fosforna plošča
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
17
TEM Golgijevega aparata rastlinskih celic
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Vrstična elektronska mikroskopija (SEM)
• Gledamo krajevno odvisno
emisijo sekundarno vzbujenih
elektronov zaradi trkov z
elektroni zelo ozkega snopa!
• Kontrast pomeni razliko
v intenziteti sekundarnih
elektronov v dveh točkah slike,
ki je odvisna od mase sipalcev
in njihove elektronske strukture!
Zoran Arsov
elektromagnetna
leča kot objektiv
elektromagnetna
leča kot deflektor
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
18
SEM izvornih celic
Zoran Arsov
Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
19