doc2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE - Slovensko genetsko društvo
download 
Report Transcription
2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE - Slovensko genetsko društvo
SLOVENSKO GENETSKO DRUŠTVO V SODELOVANJU S SLOVENSKIM DRUŠTVOM ZA HUMANO GENETIKO 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE PIRAN 16. SEPTEMBER 2011 SLOVENSKO GENETSKO DRUŠTVO v sodelovanju s SLOVENSKIM DRUŠTVOM ZA HUMANO GENETIKO 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Morska biološka postaja Nacionalni inštitut za biologijo Piran 16. september 2011 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Organizatorji Slovensko genetsko društvo v sodelovanju s Slovenskim društvom za humano genetiko Nacionalnim inštitutom za biologijo Morska biološka postaja Piran Univerzo v Ljubljani Biotehniška fakulteta in Medicinska fakulteta Univerzo v Mariboru Medicinska fakulteta in Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Urednik Uroš Potočnik Andreja Ramšak Strokovni recenzenti Peter Dovč Damjan Glavač Simon Horvat Branka Javornik Vladimir Meglič Uroš Potočnik Darja Žgur Bertok Oblikovanje in postavitev: Katja Repnik Založnik: Slovensko genetsko društvo, Ljubljana, september 2011 Število izvodov: 60 Za lektorski pregled besedil so odgovorni avtorji prispevkov. 2 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE CIP - Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana 575(082) KOLOKVIJ iz genetike (2 ; 2011 ; Piran) [Drugi] 2. Kolokvij iz genetike, Piran, 16. september 2011 [Elektronski vir] / [organizatorji] Slovensko genetsko društvo ... [et al.] ; [urednik Uroš Potočnik, Andreja Ramšak]. - El. knjiga. - Ljubljana: Slovensko genetsko društvo, 2011 ISBN 978-961-90534-6-1 1. Potočnik, Uroš, 1969- 2. Slovensko genetsko društvo 257517568 3 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Člani odborov Znanstveni odbor Peter Dovč Damjan Glavač Simon Horvat Branka Javornik Uroš Potočnik Organizacijski odbor Andreja Ramšak Tanja Kunej Peter Dovč Simon Horvat Uroš Potočnik Katja Repnik Jana Ferdin 4 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE VSEBINA PROGRAM SREČANJA ……………………………………………………………………………………………………..…8 UVODNO PREDAVANJE Jana Žel: Gensko spremenjeni organizmi v Sloveniji ………………………………………………………………………………………....…11 PREDAVANJA BIOTEHNOLOGIJA INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE ….………………………………………………..…….…12 Jasmina Beltram: Identifikacija novih rekombinatnih kongenih linij za kvantitativni lokus Fob3a, ki vpliva na zamaščevanje pri miših ….……………………………………………………………………………………....……13 Rok Keber: Karakterizacija mišjih zarodkov s popolnim izničenjem holesterogenega gena citokrom p450 lanosterol 14α- demetilaze (Cyp51) ….………………………………………………………………………….. ………...……22 Olja Bregar: Proteomska analiza micelijskih proteinov fitopatogene glive Monilinia laxa ……….…………………………………………………………………….. ……………...29 Aljaž Majer: Izolacija in karakterizacija kandidatnih genov za odpornost na hmeljevo uvelost …….……………………………………………...………………………………...………30 Miha Modic in Tobias R. Richer: Generation of transgenic rabbits using Sleeping Beauty …….……………………………………………...………………………………...………31 Ana Rotter: Orodja sistemske biologije za proučevanje interakcij patogen – gostitelj …….……………………………………………...………………………………...………32 PREDAVANJA GENOMIKA MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI ..………………………………………………..………33 Irena Godnič: Genetska variabilnost genov za mikro RNA pri govedu …….…………………………………………………...…………………………………...34 Daša Jevšinek Skok: Asociacijska analiza haplotipov v genu FTO (Fat mass and obesity associated gene) z lastnostmi zamaščevanja pri govedu …………………………………………………………………………….. …...……….…43 5 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Petra Perin: Povišana ekspresija genov IL12B pri otrocih z astmo se zniža z uporabo zdravila montelukast …………………………….……………………………………………….. ……………...49 Katja Repnik: eQTL analiza izbranih kromosomskih področij pri slovenskih bolnikih s kronično vnetno črevesno boleznijo …………………………………………………………………………………...….. ….…59 Tjaša Rešetič: Transkriptom razvijajočega plodu oljke (Olea europaea L.) pridobljen z naslednjo generacijo določevanja nukleotidnih zaporedij …………………………………………………………………………….. ………...….…70 Tina Svetek: Elektroforetska kariotipizacija in vsebnost jedrne DNA v hmeljnih izolatih glive Verticillium albo-atrum …………………………………………………………………………….. ……….……...71 Minja Zorc: Napovedovanje kandidatnih genov za nalaganje maščobe znotraj kvantitativnih lokusov (QTL) pri prašiču s pomočjo sistema Ondex …………………………………………………………………………….. …………....…72 POSTERJI BIOTEHNOLOGIJA INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE ….………………………………………………..………73 Barbara Pipan: Informativnost mikrosatelitnih markerjev za razlikovanje med spolno kompatibilnimi sorodniki vrste Brassica napus L. ………………………………………………………………………….. ………..………..74 Katja Rostohar: Modeliranje prenosa genov in stopnje tujeprašnosti pri koruzi v primeru soobstoja z GSO ………………………………………………………………………….. ………..………..81 Tanja Zadražnik: Proučevanje proteoma listov navadnega fižola (Phaseolus vulgaris L.) v povezavi s sušnim stresom ………………………………………………………………………….. ………..………..92 Ida Istinič: Ocenitev transgenih linij krompirja (Solanum tuberosum L., cv. Desiree) s čezmerno ekspresijo krompirjevega cisteinskega proteaznega inhibitorja za odpornost proti abiotskim stresnim dejavnikom …………………………………………………………………………….. ………...…..100 Živa Petkovšek: Sev Escherichia coli Nissle 1917 izkazuje boljšo protimikrobno aktivnost kot genetsko spremenjeni izogeni sev z zapisom za sintezo kolicina E7 ………………………………………………………………………….. ………..………101 Sonja Prpar: In vivo in in vitro odkritje epitelnih celic iz kozje mlečne žleze s proliferativnim potencialom ………………………………………………………………………….. ………..………102 6 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE POSTERJI GENOMIKA MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI .………………………………………………..……...103 Manuela Čitar: Virulentni dejavniki izolatov bakterije Escherichia coli iz blata zdravih ljudi ………………………………………………………………………….. ………..………104 Blaž Jesenko: Razlikovanje izolatov bakterije escherichia coli iz blata zdravih ljudi z metodo ERIC-PCR .……………………………………………………………………………..………...…111 Maruška Medved: Povezava polimorfizma -13910C>T v promotorju gena LCT s simptomi značilnimi za laktozno netoleranco ……………...……………………………………………………………………...……117 Mitja Mitrovič: Obdelava podatkov genotipizacije polimorfizmov SNP pridobljenih z uporabo DNK mikromrež ………………………………………………………………….……………..….…..…..123 Eva Čeh: Identifikacija kandidatnih lokusov za ektopični ureter pri kraškem ovčarju ………………………………………………………………………………...……....….136 Jana Ferdin: Podatkovna zbirka epigenetsko uravnavanih mikro RNA pri raku …………………………………………………………………………….. ……...…….137 Simona Kamenšek: Izpostavljanje kolicinu M povzroča pri bakteriji Escherichia coli spremembe v nastanku zunajceličnih polisaharidov …………………………………………………….……………………….. …………….138 Jernej Ogorevc: Uporaba integrativnega primerjalno-genomskega pristopa za odkrivanje kandidatnih genov in bioloških poti povezanih s kriptorhizmom ………………………………………………………………………….. ………..………139 KAZALO AVTORJEV ………………………………………………………………………………………..….….…….140 7 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE PROGRAM SREČANJA 8.30 – 9.00 Registracija Otvoritev 2. Kolokvija iz genetike Uvodni pozdrav: Andreja Ramšak in Simon Horvat 9.00 Uvodno predavanje Predsednik: Simon Horvat Jana Žel Gensko spremenjeni organizmi v Sloveniji 9.05 – 9.40 Biotehnologija in Interakcije genom-okolje Vodji sekcije: Branka Javornik, Darja Žgur Bertok Jasmina Beltram Identifikacija novih rekombinatnih kongenih linij za kvantitativni lokus Fob3a, ki vpliva na zamaščevanje pri miših 9.40 – 9.55 Rok Keber Karakterizacija mišjih zarodkov s popolnim izničenjem holesterogenega gena citokrom p450 lanosterol 14αdemetilaze (Cyp51) 9.55 – 10.10 Olja Bregar Proteomska analiza micelijskih proteinov fitopatogene glive Monilinia laxa 10.10 – 10.25 Aljaž Majer Izolacija in karakterizacija kandidatnih genov za odpornost na hmeljevo uvelost Miha Modic in Tobias R. Richer 10.25 – 10.40 10.40 – 10.55 Generation of transgenic rabbits using Sleeping Beauty Ana Rotter Orodja sistemske biologije za proučevanje interakcij patogen – gostitelj Odmor za kavo, ogled posterjev 8 10.55 – 11.10 11.10 – 11.40 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Genomika in Molekulske osnove bolezni Vodji sekcije: Simon Horvat, Uroš Potočnik Irena Godnič 11.40 – 11.55 Genetska variabilnost genov za mikro RNA pri govedu Daša Jevšinek Skok Asociacijska analiza haplotipov v genu FTO (Fat mass and obesity associated gene) z lastnostmi zamaščevanja pri govedu 11.55 – 12.10 Petra Perin Povišana ekspresija genov IL12B pri otrocih z astmo se zniža z uporabo zdravila montelukast 12.10 – 12.25 Katja Repnik eQTL analiza izbranih kromosomskih področij pri slovenskih bolnikih s kronično vnetno črevesno boleznijo 12.25 – 12.40 Tjaša Rešetič Transkriptom razvijajočega plodu oljke (Olea europaea L.) pridoboljen z naslednjo generacijo določevanja nukleotidnih zaporedij 12.40 – 12.55 Tina Svetek Elektroforetska kariotipizacija in vsebnost jedrne DNA v hmeljnih izolatih glive Verticillium albo-atrum 12.55 – 13.10 Minja Zorc Napovedovanje kandidatnih genov za nalaganje maščobe znotraj kvantitativnih lokusov (QTL) pri prašiču s pomočjo sistema Ondex Odmor – samopostrežni bar, ogled posterjev Skupščina Slovenskega genetskega društva in razglasitev najboljšega predavanja ter postra 9 13.10 – 13.25 13.25 – 14.30 14.30 – 15.30 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 11.10 – 11.40 in 13.25 – 14.30 Ogled posterjev Eva Čeh Identifikacija kandidatnih lokusov za ektopični ureter pri kraškem ovčarju Jana Ferdin Podatkovna zbirka epigenetsko uravnavanih mikro RNA pri raku Ida Istinič Ocenitev transgenih linij krompirja (Solanum tuberosum L., cv. Desiree) s čezmerno ekspresijo krompirjevega cisteinskega proteaznega inhibitorja za odpornost proti abiotskim stresnim dejavnikom Blaž Jesenko Razlikovanje izolatov bakterije Escherichia coli iz blata zdravih ljudi z metodo ERIC-PCR Simona Kamenšek Izpostavljanje kolicinu M povzroča pri bakteriji Escherichia coli spremembe v nastanku zunajceličnih polisaharidov Maruška Medved Povezava polimorfizma -13910C>T v promotorju gena LCT s simptomi značilnimi za laktozno netoleranco Mitja Mitrovič Obdelava podatkov genotipizacije polimorfizmov SNP pridobljenih z uporabo DNK mikromrež Jernej Ogorevc Uporaba integrativnega primerjalno-genomskega pristopa za odkrivanje kandidatnih genov in bioloških poti povezanih s kriptorhizmom Živa Petkovšek Sev Escherichia coli Nissle 1917 izkazuje boljšo protimikrobno aktivnost kot genetsko spremenjeni izogeni sev z zapisom za sintezo kolicina E7 Barbara Pipan Informativnost mikrosatelitnih markerjev za razlikovanje med spolno kompatibilnimi sorodniki vrste Brassica napus L. Katja Rostohar Modeliranje prenosa genov in stopnje tujeprašnosti pri koruzi v primeru soobstoja z GSO Manuela Čitar Virulentni dejavniki izolatov bakterije Escherichia coli iz blata zdravih ljudi Tanja Zadražnik Proučevanje proteoma listov navadnega fižola (Phaseolus vulgaris L.) v povezavi s sušnim stresom 10 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE UVODNO PREDAVANJE Gensko spremenjeni organizmi v Sloveniji dr. Jana Žel Nacionalni inštitut za biologijo, Večna pot 111, 1000 Ljubljana, [email protected] Gensko spremenjeni organizmi (GSO) so lahko v zaprtih sistemih (laboratorijih, rastlinjakih), v poljskih poskusih ali pa so odobreni za sproščanje. V tem primeru so lahko odobreni za gojenje ali za predelavo za uporabo za hrano ali krmo. Možne so tudi uporabe za druge namene npr. v zdravstvu, farmaciji ipd. V vsaki od teh stopenj so potrebne prijave na uradne organe, presoja tveganj, odobritev in nadaljnja kontrola. Prisotnost GSO v Sloveniji na vsaki od teh stopenj bo obravnavano v predavanju in primerjano s stanjem v ostalih državah Evropske skupnosti. Za kvalitetno uradno kontrolo GSO, je potrebno tudi določanje GSO. Nacionalni inštitut za biologijo je s strani Ministrstva za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano pooblaščen kot nacionalni referenčni laboratorij za določanje GSO v hrani in krmi ter kot preizkusni laboratorij. S strani Ministrstva za okolje in prostor je pooblaščen za analiziranje in testiranje odvzetih vzorcev, razvoj analitičnih in testnih metod ter druge naloge, povezane s kontrolo določanja GSO, v okviru katere poteka tudi analiza GSO v semenih. Poleg tega je Nacionalni inštitut za biologijo imenovan za nosilca nacionalnega etalona za množino snovi s strani Urada za meroslovje, kar je dodatno priznanje za kvaliteto in natančnost analiz. V prezentaciji bodo predstavljene aktivnosti na področju določanja GSO, ki so nujne za kvalitetno izvajanje podpore uradne kontrole. Gensko spremenjeni organizmi se hitro razvijajo in vedno novi so odobreni za trženje. To zahteva nove pristope pri določanju. Poleg tega so pripravljeni za trženje produkti rezultata novih tehnik, za katere v okviru različnih delovnih skupin v okviru Evropski skupnosti potekajo strokovne diskusije ali spadajo pod GSO zakonodajo ali ne. Tudi za določanje teh novih organizmov je bila ustanovljena delovna skupina, katere član je bila tudi raziskovalka Nacionalnega inštituta za biologijo. V predavanju se bomo dotaknili teh novih organizmov in možnosti njihovega določanja. Reference Jana Žel, Mojca Milavec, Dany Morisset, Damien Plan, Guy Van den Eede, Kristina Gruden: HOW TO RELIABLY TEST FOR GMOs, Springer Brief, v pripravi (October 2011) 11 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE PREDAVANJA BIOTEHNOLOGIJA INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE 12 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE ZNANSTVENI PRISPEVEK Identifikacija novih rekombinatnih kongenih linij za kvantitativni lokus Fob3a, ki vpliva na zamaščevanje pri miših Identifiction of new recombinant congenic lines for a quantitative trait locus Fob3a affecting fatness in mice Jasmina Beltram1, Simon Horvat2 1 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Groblje 3, 1230 Domžale 2 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko,Katedra za genetiko, animalno biotehnologijo in imunologijo, Groblje 3, 1230 Domžale, [email protected] Izvleček: Sodobni način življenja ter pomanjkanje telesne aktivnosti lahko vodita v debelost in posledično tudi privedeta do različnih zdravstvenih težav. Po drugi strani pa zavedanje pomena zdrave prehrane spodbuja rejce k vzreji domačih živali s čim manjšo zamaščenostjo. Nalaganje maščevja je kompleksna lastnost, na katero vpliva veliko število genov in okolje. Zato so za preučevanje takšnih vplivov primernejši poligeni živalski modeli, ki smo jih uporabili tudi v našem poskusu. Slednji so bili razviti iz dveh mišjih linij, divergentno selekcioniranih na delež telesnih maščob (debela linija F ter vitka linija L). Cilj te raziskovalne naloge je bil identificirati nove rekombinantne kongene mišje linije z donorskim odsekom vitke linije, znotraj katerega se nahaja kvantitativni lokus Fob3a za nalaganje maščevja. Uspelo nam je odkriti 16 rekombinant, ki bodo služile za nadaljnje parjenje in pridobivanje novih homozigotnih rekombinantnih kongenih linij s krajšimi donorskimi odseki vitke linije. Rezultati naše raziskave na kvantitativnem lokusu Fob3a so pokazali statistično signifikanten vpliv na zamaščevanje pri F2-križanju kongene linije 15FHV. Razlike med genotipi FF in LL na preučevanem odseku so kazale na aditivni učinek zamenjave alelov na lastnosti zamaščenosti. Ali se te razlike kažejo tudi v ješčnosti, smo preverili z analizo konzumacije krme. Le-ta je pokazala, da konzumacija krme pada glede na število alelov L ter da se nakazuje aditivni vpliv, ki pa deluje v obratni smeri od pričakovane – da miši genotipa LL na odseku Fob3a pojedo več kot miši genotipa FF. Rekombinantne kongene linije, ki smo jih razvili v okviru te raziskovalne naloge, bodo odličen genetski vir za natančnejše preučevanje vpliva fiziološkega učinka Fob3a na zamaščevanje in bodo omogočile nadaljnje študije za odkritje vzročne mutacije. Ključne besede: molekularna genetika, kvantitativni lokusi, QTL, Fob3a, rekombinantne kongene linije, miši, zamaščevanje. Uvod V zadnjem desetletju je debelost postala ena izmed perečih kronično povezanih bolezni. Definirana je kot stanje prekomernega kopičenja telesnih maščob 1 oziroma naravne zaloge energije preko običajne ravni . Zaradi debelosti in prekomerne telesne mase je ogroženo zdravje, povečana pa je tudi predispozicija za različne bolezni, kot so diabetes, bolezni srca in ožilja, povečan krvni tlak, 13 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE neplodnost, zapleti ob rojstvu, artritis, astma ter slabo zdravstveno stanje 2 nasploh . V času pomanjkanja, ko je bila hrana na voljo le občasno in je bilo tveganje za lakoto zmeraj prisotno, za pridobivanje hrane in preživetje nasploh pa so bili potrebni veliki fizični napori, je človek skozi evolucijo razvil posebne mehanizme, ki učinkovito kopičijo in porabljajo maščobne zaloge v telesu. Tako so geni, ki sodelujejo v teh mehanizmih in povečujejo dovzetnost za debelost, ljudem omogočali prednost za preživetje v času pomanjkanja hrane. Posledično vsebuje tudi moderna človeška vrsta visoko pogostnost genotipov, ki so sposobni učinkovito vzdrževati biološke funkcije in skladiščiti odvečno energijo v 3 maščobnem tkivu . Študije na dvojčkih, večgeneracijskih rodovnikih ter splošne populacijske študije na prebivalstvu, združene študije, kot tudi živalski modeli, so pokazali, da ima debelost visok delež genetske komponente, oziroma je posledica tudi kompleksnih interakcij med številnimi geni in okoljem. K temu so prispevale tudi redke mutacije pri ljudeh in živalskih modelih, s katerimi so znanstveniki dobili vpogled v poti, ki so vključene v uravnavanje telesne mase. Kartiranje kvantitativnih lokusov (QTL) je zato pomembna osnova za iskanje 4 genov, ki vplivajo na že ugotovljene kromosomske učinke . Kvantitativni lokus je tisti, ki ima merljive fenotipske spremembe zaradi genetskih in/ali okoljskih vplivov. Na splošno so QTL-i več faktorski in so pod vplivom polimorfnih genov, zato lahko eden ali več kvantitativnih lokusov vpliva na preučevani fenotip. Veliko raziskav z različnimi živalskimi modeli in pristopi je usmerjenih k iskanju kvantitativnih lokusov za odstotek telesne maščobe: Analiza kartiranja kvantitativnega lokusa pri križanju med F in L linijo je pokazala štiri signifikantne kromosomske regije z geni, ki vplivajo na delež maščob, Fob1 (angl. F-line obesity QTL 1), Fob2, Fob3 in Fob4 na 2., 12., 15. in X kromosomu. Fob1 je pojasnil 4,9 %, Fob2 19,5 %, Fob3 14,4 % in Fob4 7,3 % fenotipske variance za odstotek maščobe v F2. Medtem ko imajo Fob1, Fob3 in Fob4 aditiven učinek, ima Fob2 dominanten genetski vpliv. Pri vseh štirih odkritih QTL-ih pa so učinki pozitivni, kar pomeni, da aleli iz linije F zvišujejo odstotek maščobe. Zaradi velikega vpliva na vsebnost maščobe (delež maščob pri homozigotnih živalih debele linije se je zvišal za 4,62 %) in močne statistične podpore (vrednost LOD 5 6 11,3) je Fob3 zanimiv za nadaljnje raziskave . Tako so Stylianou in sod. (2004) v grobem genetskem kartiranju kvantitativnega lokusa Fob3 odkrili dve regiji znotraj omenjenega QTL-a, Fob3a in Fob3b. Slednja imata neodvisne, vendar v isti smeri (na delež maščobe) delujoče učinke. Kvantitativna lokusa imata pomemben aditiven in dominanten vpliv na telesno maso, vendar na debelost (delež maščobe in relativna masa gonadalne maščobe) vplivata aditivno. Ocenjen aditiven učinek na delež maščobe pri Fob3a je skoraj dvakrat tolikšen (1,62 %), kolikšen je vpliv na delež maščob pri Fob3b (0,71 %), ne glede na to pa sta oba 7 pomembna . 8 Natančnejše kartiranje obeh lokusov je pokazalo, da se znotraj Fob3b nahajajo za nastanek debelosti pomembni kandidatni geni Dgat1 (katalizira končni korak v sintezi trigliceridov), Gpihbp1 (kodira protein, ki je vpleten v transport lipidov in holesterola v krvi), Rhpn1 (nosi zapis za protein, ki sodeluje v procesu nastanka maščobnih celic) ter Ly6a (povzroča nenormalno zgradbo maščobnih celice pri 14 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE transgenih miših). Za QTL Fob3a, na katerem temelji tudi naše pričujoče 9 raziskovalno delo, pa je bila razvita kongena linija , na kateri so opravili fenotipsko karakterizacijo ter statistično analizo homozigotnih živali. Rezultati te raziskave kažejo na to, da se QTL nahaja na intervalu od 40,14 Mbp do 60,62 Mbp pri kongeni liniji V. Znotraj te regije pa naj bi se nahajali sledeči, za nastanek debelosti, kandidatni geni: Trhr (vpliva na debelost preko ščitničnih metaboličnih poteh), Enpp2 (igra vlogo pri uravnavanju razvoja maščobnega tkiva ter vseh z debelostjo povezanih patoloških stanj v telesu), Trip1 (vpliva na koncentracije trigliceridov v krvi in na pojav hipertrigliceridemije) in Sqle (vpleten v lipogenezo in biosintezo holesterola). Genetsko kartiranje z uporabo kongenih linij je ena od strategij za identificiranje kvantitativnih lokusov ter nadaljnjo izolacijo genov znotraj teh regij. Razvijemo jih s prenosom določenega segmenta genoma iz ene linije (tako imenovane donor linije) na genetsko ozadje druge linije (sprejemne linije) preko več generacij 10 povratnega križanja in selekcije na želen genetski interval . Identifikacija kvantitativnih lokusov za nalaganje maščevja z manjšimi vplivi na izražen fenotip bi pripomogla k hitrejši uporabi tega znanja za zdravljenje debelosti pri ljudeh in selekciji živali na manjšo zamaščenost. Tako je bil glavni namen identificirati nove rekombinantne kongene živali za kvantitativni lokus Fob3a na 15. kromosomu mišje linije, divergento selekcionirane na odstotek telesnih maščob. Pri kongenih linijah z zelo majhnim donorskim segmentom predstavlja identifikacija novih rekombinant zaradi manjše pogostnosti rekombinacij velik izziv. Identificiranje le-teh pa je pomembno za razvoj novih subkongenih linij z ožjim donorskim segmentom, s čimer se poveča možnost odkritja novih vzročnih genov, ki vplivajo na nalaganje maščevja. Materiali in metode Nove rekombinante smo iskali znotraj mišje populacije F 2, ki smo jo razvili iz na delež telesne mase selekcionirane linije F (debela linija) in kongene linije 15FHV, pri kateri se kvantitativni lokus Fob3a nahaja med 40,14 in 60,62 Mbp na 15. kromosomu. Za genotipizacijo živali smo uporabili tehniko verižne reakcije s polimerazo ter za vsak mikrosatelitski genetski označevalec ločili aleli F in L s postopkom agarozne gelske eletroforeze. Uporabljali smo 4 % gel, kateremu je bil dodan etidijev bromid, ki fluorescira pod ultravijolično svetlobo, ko se vgradi v DNA. S tem so postali rezultati vidni. Genotipe za posamezen genetski marker smo določili s pomočjo že znanih kontrol (homozigot FF, homozigot LL in heterozigot FL), ki smo jih dodajali na gel. Vsako miš smo genotipizirali s petimi polimorfnimi mikrosatelitskimi genetskimi označevalci. Če so se genotipi med markerji za posamezno žival razlikovali, smo le-to šteli kot rekombinantno. V fenotipsko analizo smo vključili 118 živali iz F 2-križanja kongene mišje linije 15FHV. Miši smo genotipizirali na odseku Fob3a za vsak posamezen mikrosatelitski genetski označevalec, žrtvovali ter z anatomskim seciranjem odvzeli in tehtali pet maščobnih depojev: abdominalni, femoralni, mezenterialni in 2 gonadalni maščobni depo ter rjavo maščobo. Dobljene genotipe smo testirali z χ testom, da smo preverili ali so frekvence genotipov v skladu s 1. Mendlovim 15 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE zakonom dedovanja, in sicer, da so v razmerju FF:FL:LL=1:2:1. Meritve maščobnih depojev smo testirali s statističnima modeloma v programu R. Za statistično značilne smo smatrali tiste razlike med genotipi, kjer so bile pvrednosti manjše od 0,05. Konzumacijo krme smo merili v dveh obdobjih po 14 dni, kjer smo v prvem obdobju imeli živali v kletkah po parih, ločene glede na spol, v drugem obdobju so pa bile miši v kletkah posamično. V prvo obdobje meritev konzumacije krme je bilo vključenih 44 živali, v drugo pa 54 živali. Miši smo razdelili v tri skupine glede na genotip v odseku Fob3a. Tudi pri tej analizi smo uporabili program R, v katerem smo dobljene meritve obdelali s statističnima modeloma. Razlike med genotipi s p-vrednostmi manjšimi od 0,05, smo smatrali za statistično značilne. Rezultati Uspeli smo odkriti 16 novih rekombinant, sedem samic in devet samcev. Kromosomska sestava osnovne linije FHV in genetska sestava odseka Fob3a pri omenjenih rekombinantah je prikazana na sliki 1. Genetsko ozadje prejemne linije F je prikazano s črnim stolpcem, medtem ko tanka črna črta predstavlja donorski segment linije L. Dele na kromosomu, kjer genetski označevalci niso bili polimorfni, smo označili s svetlo sivim stolpcem, saj nismo mogli določiti, ali genomski odsek pripada liniji F ali liniji L. Slika 1: Genetska sestava odseka Fob3a novih rekombinantov, ki izvirajo iz F2 populacije križanja kongene linije 15FHV in linije F. 16 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE V programu R smo testirali statistična modela za fenotipske podatke F2-križanja kongene linije 15FHV. S prvim statističnim modelom smo pridobili rezultate o tem, kakšna so povprečja genotipov oziroma kolikšen je vpliv alelov, z drugim pa kakšen je povprečni učinek zamenjave alela (Preglednica 1). V preglednici 1 lahko vidimo, da so živali genotipa FF na odseku Fob3a imele skoraj povsod največje povprečne vrednosti, razen pri femoralni maščobi, živali genotipa LL na odseku Fob3a pa najmanjše. Regresijski koeficient je pri vseh lastnostih (gonadalni, abdominalni, femoralni in mezenterialni maščobni depo ter rjava maščoba) negativen, kar pove, da zamenjava enega alela F poveča maso maščobnega depoja. Signifikantne razlike (Pr > 0,95) med genotipoma FF in LL na odseku Fob3a, so prikazane z odebeljenimi številkami v preglednici 2. Nakazuje se tudi statistično značilna razlika pri rjavi maščobi med genotipoma FF in FL na odseku Fob3a. Genotip Lastnost GON (g) ABD (g) FEM (g) MEZ (g) RJA (g) FF 0,82 ± 0,04 0,32 ± 0,03 0,70 ± 0,03 0,81 ± 0,04 0,13 ± 0,01 FL 0,80 ± 0,04 0,31 ± 0,03 0,72 ± 0,04 0,80 ± 0,04 0,12 ± 0,01 LL 0,65 ± 0,05 0,24 ± 0,03 0,59 ± 0,04 0,61 ± 0,04 0,11 ± 0,01 b -0,04 ± 0,02 -0,08 ± 0,03 -0,06 ± 0,02 -0,09 ± 0,02 -0,01 ± 0,004 * Pr(FF > FL) 0,61 0,56 0,32 0,62 0,88 1,00 0,98 0,99 1,00 0,99 Pr(FF > LL)** * Pr(FF > FL) – da je homozigot FF kongene linije 15FHV iz križanja F2 je bolj zamaščen od ** heterozigota FL iz iste populacije; Pr (FF > LL) - da je homozigot FF kongene linije 15FHV iz križanja F2 bolj zamaščen od homozigota LL iz iste linije. Preglednica 1: Rezultati analize (povprečja s standardnimi odkloni ter verjetnostmi) fenotipskih podatkov za odstotek telesnih maščob pri F 2 kongeni liniji 15FHV glede na genotip. Živali genotipa FF na odseku Fob3a dosegajo večjo telesno maso in imajo nasploh večje mase posameznih maščobnih depojev kot miši genotipa LL, kar lahko vidimo na sliki 1. Najvišji masi sta bili zabeleženi pri gonadalnem (0,82 g) in mezenterialnem (0,81 g) maščobnem depoju, ki sta obsegali vrednosti od 0,55 do nekje 0,90 g. Nekoliko manjše povprečne vrednosti so imele miši pri femoralni maščobi (od 0,50 do 0,80 g). Pri abdominalni (0,20 do 0,35 g) in rjavi maščobi (0,10 do 0,14 g) pa smo izmerili najmanjše vrednosti. Iz slike 1 je razviden aditivni genetski učinek – za vsak zamenjan alel F z alelom L se zmanjša masa maščobnega depoja. Slednje je najlepše prikazano na sliki z maso rjave maščobe. Za vsak zamenjan alel F se masa maščobnega depoja zmanjša za 0,01 g. Pri gonadalni, mezenterialni, femoralni in abdominalni maščobi je poleg negativnega trenda vidna tudi dominantnost alela F nad alelom L, saj so pri vseh štirih primerih vrednosti FL živali enake ali celo nekoliko večje od povprečij genotipa FF. 17 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 2: Povprečne vrednosti maščobnih depojev s standardno napako (g) pri F 2križanju kongene linije 15FHV. Iz preglednice 2 lahko vidimo, da je povprečje parov pri živalih genotipa FF (5,11 g) večje od genotipa FL (4,77 g) in genotipa LL (4,98 g). Tudi regresijski koeficient je negativen (-0,08), kar pove, da konzumacija krme pada glede na število alelov L. Na podlagi teh vrednosti bi lahko sklepali, da se nakazuje aditivni vpliv. Ker pa je standardni odklon regresijskega koeficienta večji kot sama ocena, gre pri genotipu FL bolj za naključno odstopanje. To domnevo je še dodatno potrdila statistično neznačilna verjetnost (0,74), da je aditivni učinek negativen. V drugem delu poskusa pa je padanje konzumacije krme glede na število alelov L bolj vidno. Prav tako je tudi verjetnost, da je aditivni vpliv negativen, statistično značilna (0,95). Tudi v tem primeru aditivni genetski učinek ni velik, oziroma nima velikega vpliva. Kaže se pa večje odstopanje med genotipoma FF in LL (Pr > 0,95), kar nakazuje na statistično značilno razliko med obema homozigotoma. 18 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Lastnost Konzumacija krme Konzumacija krme – – par (g/dan) posameznik (g/dan) FF 5,11 ± 0,22 6,15 ± 0,26 FL 4,77 ± 0,16 5,96 ± 0,26 LL 4,98 ± 0,22 5,61 ± 0,29 b -0,08 ± 0,11 -0,27 ± 0,17 0,96 Pr(FF > FL)* 0,73 0,95 Pr(FF > LL)** 0,73 *** 0,95 Pr (b < 0) 0,74 * Pr(FF > FL) – verjetnost, da je homozigot FF kongene linije 15FHV iz križanja F2 konzumira več krme od heterozigota FL iz iste linije; ** Pr (FF > LL) – verjetnost, da je homozigot FF kongene linije 15FHV iz križanja F2 konzumira več krme od homozigota LL iz iste linije; *** Pr(b < 0) – verjetnost, da je povprečni učinek zamenjave alelov negativen. Genotip Preglednica 2: Rezultati analize (povprečja s standardnimi odkloni ter verjetnostmi) fenotipskih podatkov za konzumacijo krme pri F 2-križanju kongene liniji 15FHV glede na genotip. Na sliki 3 so prikazani rezultati analize konzumacije krme s statističnima modeloma. Vrednosti se nahajajo nekje med 5 do 6,7 g/dan, pri čemer ima genotip FF največje vrednosti, genotip LL pa najmanjše. Na sliki lahko vidimo trend padanja konzumacije krme z zamenjavo enega alela F za alel L. Slednje nakazuje aditivni genetski učinek, ki je statistično značilen v primeru merjenja porabe krme, ko so miši v kletkah posamično. Odstopanje je opaznejše le med genotipoma FF (6,15 ± 0,26 g) in LL (5,61 ± 0,29 g) na odseku Fob3a ter kaže na to, da aditivni vpliv ni tako velik. Le-ta se v prvem delu poskusa sploh ni izkazal za statistično značilnega, saj je bila napaka večja od ocene regresijskega koeficienta (Preglednica 2). Konzumacija krme (g/dan) 7 6,5 6 5,5 5 FF FL LL Genotip Slika 3: Povprečna konzumacija krme glede na genotip pri miših linije 15FHV, ko so bile v kletkah posamično. 19 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Diskusija Identificirali smo 16 rekombinatnih živali v F 2-križanju kongene linije 15FHV s krajšim donorskim odsekom. Slednje bomo uporabili za nadaljnja križanja in pridobivanje novih kongenih linij s krajšim donorskim segmentom, s čimer pa se bo tudi povečala verjetnost odkritja vzročnih genov, ki vplivajo na zamaščevanje pri miših. Fenotipska analiza podakov pridobljenih od živali iz križanja F 2 kongene mišje lijnije 15FHV je pokazala, da kvantitativni lokus Fob3a vpliva na nalaganje različnih maščobnih depojev in pridobivanje telesne mase pri različni starosti. Dobljeni rezultati kažejo na statistično značilne razlike med genotipi za posamezen maščobni depo ter signifikanten aditivni vpliv. S tem smo dobili dokaz, da alela F poveča maso maščobnega depoja, kar pomeni, da QTL Fob3a na donorskem segmentu linije L res vpliva na nalaganje maščobe. Pri analizi konzumacije krme, kjer smo preverjali hipotezo, da kvantitativni lokus Fob3a ne povzroča razlik v konzumaciji krme, smo prišli do rezultata, ki je bili ravno obraten od pričakovanega. Vrednosti analize kažejo na aditivni vpliv alele F, vendar pa ta ni signifikanten zaradi velikih vrednosti standardnega odklona. Identificirani rekombinantni osebki ter ugotovitve, da kvantitativni lokus Fob3a na 15. kromosomu vpliva na zamaščevanje, predstavljajo odličen vir za nadaljnje natančnejše preučevanje QTL-a ter odkrivanje kandidatnih genov, ki vplivajo na zamaščevanje tako pri ljudeh, kot tudi živalih. Reference 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. L. Bünger, W.G. Hill. Genetics of body composition and metabolic rate. V: The mouse in animal genetics and breeding research. Eisen E.J. (ed.). London, Imperial College Press. 2007: 131–160. S. Inoue, P. Zimmet. The Asia-Pacific perspective: Redefining obesity and its treatment. Australia, Health communications Australia Pty Limited. 2000: 56 str. R.J.F. Loos, C. Bouchard. Obesity - is it a genetic disorder? Journal of Internal Medicine. 2003, 154: 401–425. S. Aksu, D. Koczan, U. Renne, H.J. Thiesen, G.A. Brockmann. Differentially expressed genes in adipose tissues of high body weight-selected (obese) and unselected (lean) mouse lines. Journal of Applied Genetics. 2007, 48, 2: 133–143. S. Horvat, L. Bünger, V.M. Falcone, P. Mackay, A. Law, G. Bulfield, P.D. Keightley. Mapping of obesity QTLs in a cross between mouse lines divergently selected on fat content. Mammalian Genome. 2000, 11: 2–7. I.M. Stylianou, J.K. Chrisitians, P.D. Keightles, L. Bünger, M. Clinton, G. Bulfield, S. Horvat. Genetic complexity of an obesity QTL (Fob3) revealed by detailed genetic mapping. Mammalian Genome. 2004, 15: 472–481. I.M. Stylianou, M. Clinton, P.D. Keightley, C. Pritchard, Z. Tymovska-Lallane, L. Bünger, S. Horvat. Microarray gene expression analysis of the Fob3b obesity QTL identifies positional candidate gene Sqle perturbed cholesterol and glycosis pathways. Physiological Genomics. 2005, 20: 224–232. 20 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Z. Prevoršek. Identifikacija kvantitativnih lokusov za nalaganje maščevja pri miših z genetskim kartiranjem kongenih linij in bioinformacijsko analizo haplotipov. Doktorska disertacija. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko. 2010: 157 str. 9. Z. Prevoršek, G. Gorjanc, B. Paigen, S. Horvat. Congenic and bioinformatics analyses resolved a major-effect Fob3b QTL on mouse Chr 15 into two closely linked loci. Mammalian Genome. 2010, 21: 172–185. 10. J. Flint, W. Valdar, S. Shifman, R. Mott. Strategies from mapping and cloning quantitative trait genes in rodents. Nature Reviews Genetics. 2005, 6: 271–286. 8. Zahvala Zali Prevoršek se iskreno zahvaljujem za pomoč pri anatomskem seciranju in zbiranju meritev ter za vso strokovno pomoč tekom raziskave. Za pravilno obdelavo podatkov in interpretacijo rezultatov pa gre zahvala Gregorju Gorjancu. Abstract. The current life style, unbalanced diet and lack of exercise can lead to obesity and consequently to a variety of health problems. On the other hand, increased awareness regarding importance of healthy diet encourages animal breeders to breed domestic animals with minimal level of fatness. Polygenic animal models are very appropriate to study such traits, because fat deposition is a complex character influenced by a large number of genes and environment. Animal models used in our experiment were developed from two mouse lines, divergently selected on body fat percentage (Fat (F) and Lean (L) lines). The aim of this research project was to identify new recombinant congenic lines, which carry donor segments of different lengths of an obesity locus Fob3a originating from the Lean line. We identified 17 recombinant animals, which can now be further crossed and mated to generate new homozygous congenic lines with shorter overlapping donor segments of Fob3a. Analysis of phenotypic data in the population segregating for Fob3a showed that there were statistically significant differences between the FF and LL genotypes in various fatness traits. This provides strong evidence of a presence of the obesity quantitative locus which showed an additive genetic effect. With the analysis of food consumption, we wanted to verify whether differences between genotypes in daily food intake also exist. Results showed decreasing of food consumption with regard to the number of alleles L. They also indicated additive effect, which operates in the opposite direction than expected – mice with genotype LL consume more food than mice with genotype FF in the Fob3a segment. Hence, the recombinant congenic lines will play an important role as a genetic resource for more physiological studies of the Fob3a effect and will enable eventual positional cloning and identification of the casual mutation. Keywords: molecular genetics, quantitative trait loci, QTL, Fob3a, recombinant congenic lines, mice, fatness. 21 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE ZNANSTVENI PRISPEVEK Karakterizacija mišjih zarodkov s popolnim izničenjem holesterogenega gena citokrom P450 lanosterol 14- demetilaze (Cyp51) Rok Keber1, Helena Motaln1,2, Kay D. Wagner3,4, Nataša Debeljak6, Minoo Rassoulzadegan4,5, Jure Ačimovič6, Damjana Rozman6 in Simon Horvat1,7 1 Univerza v Ljubljani, Biotehniška Fakulteta, Oddelek za zootehniko, Groblje 3, 1230 Domžale, [email protected], [email protected] 2 Nacionalni Inštitut za Biologijo, Oddelek za genetsko toksikologijo in biologijo raka, Večna pot 111, 1000 Ljubljana, [email protected] 3 INSERM U907, Nica, Francija 4 Université de Nice, Sophia-Antipolis, Nica, Francija, [email protected], [email protected] 5 INSERM U636, Nica, Francija 6 Univerza v Ljubljani, Medicinska Fakulteta, Center za Funkcijsko Genomiko in Biočipe, Zaloška 4, 1000 Ljubljana, Jure acimovic [email protected], [email protected] 7 Nacionalni Inštitut za Kemijo, Hajdrihova 19, 1000 Ljubljana, [email protected] Izvleček. Gen Cyp51 kodira encim lanosterol 14α-demetilazo, ki sodeluje pri enem izmed ključnih korakov holesterolne biosinteze. Holesterol je pomembna komponenta membran, prekurzor za sintezo steroidnih hormonov in žolčnih kislin ter aktivator morfogenetske poti sonic hedgehog. Kljub temu, da ima gen Cyp51 več pomembnih funkcij, njegova dejanska vloga in vivo še ni bila pojasnjena. Da bi preučili vlogo gena Cyp51 med razvojem zarodka smo razvili transgeni mišji model s popolnim izničenjem tega gena. Zaradi popolne okvare funkcije encima CYP51 je v Cyp51-/- zarodkih prišlo do kopičenja substratov tega encima ter odsotnosti sterolnih produktov. Pri Cyp51-/- zarodkih je prišlo do podkožnega edema, skrajšane spodnje čeljusti, ter deformacij repa in okončin. Histološka analiza je pokazala tudi nepravilnosti v razvoju srca in možgan. Cyp51-/- zarodki so odmrli pri petnajstem dnevu razvoja. Podkožni edem še ni bil opisan pri nobenem od mišjih modelov z izničenim genom za sintezo holesterola. Predvidevamo, da edem nastane kot posledica nepravilnega delovanja srca, kar potrjuje tudi histološka analiza. Naš živalski model s popolnim izničenjem gena Cyp51 razkriva esencialno vlogo tega gena med razvojem zarodka. Model lahko služi kot orodje za raziskovanje človeških genetskih bolezni z okvarami v sintezi holesterola. Ključne besede: Cyp51, Citokromi P450, holesterol, živalski modeli. Uvod Holesterol je izjemno pomembna biološka molekula, ki sodeluje pri izgradnji membran, ter sintezi steroidnih hormonov, vitamina D in žolčnih kislin. Sodeluje tudi pri regulaciji morfogenetskih poti kot je denimo SHH (ang.: sonic hedgehog). Približno polovica holesterola v telesu živali izhaja iz de novo sinteze, drugo polovico pa organizem pridobi iz prehrane. Sintetizira se v vseh celicah telesa, 22 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE največ pa ga nastane v jetrnih in črevesnih celicah. Sinteza vključuje preko dvajset encimskih reakcij, kjer poleg končnega produkta – holesterola, nastajajo številni sterolni intermediati z domnevno pomembnimi funkcijami v razvoju organizma. Funkcije intermediatov začetnih poti sinteze holesterola so že dolgo znane. Primer je koencim Q10, ki nastane iz produktov mevalonatne poti. Novejše študije razkrivajo tudi pomen sterolnih intermediatov kasnejših stopenj sinteze holesterola. Primer je mejozo - aktivirajoči sterol MAS (ang.: Meiosis activating sterol), ki sodeluje pri zorenju jajčne celice [1]. Sinteza in privzem holesterola iz hrane sta natančno uravnavana procesa, saj povečana količina holesterola vodi v nastanek ateroskleroze, ki se uvršča med glavne vzroke za smrt v razvitih državah. Poznanih je osem genetskih bolezni, ki nastanejo kot posledica okvar v genih za sintezo ali privzem holesterola. Zaradi naštetih dejstev je biosinteza in transport holesterola pogosta tematika bioloških raziskav. Natančno vlogo posameznega gena v biosintetski poti holesterola je mogoče določiti le s popolnim ali delnim izničenjem gena v mišjem modelu in vivo. Na specifično funkcijo posameznega gena sklepamo iz fenotipskih posledic izničenja gena v živali. Kljub velikemu pomenu holesterola za organizem, natančna vloga vseh genov, ki so vključeni v njegovo sintezo še ni poznana. Obstaja sedem transgenih mišjih modelov s ciljnim izničenjem gena za de novo sintezo holesterola. Ti modeli kažejo, da okvare genov začetnih stopenj sinteze holesterola vodijo v propad zgodnjih zarodkov, zarodki z okvarami kasnejših stopenj sinteze pa se razvijejo do naprednejših stopenj. Posledice izničenja genov so različne in gensko specifične, pogosto pa se kot fenotip pojavijo spremembe v obrazno-lobanjskem delu in deformacije okončin. Nekateri živalski modeli služijo kot model za genetske bolezni pri človeku [2]. Primer je transgena miš z izničenim genom 7 dehidroholesterol reduktaza (Dhcr7), ki je uporaben model za študij SLOS sindroma (ang.: Smith-Lemli-Opitz Syndrome) pri ljudeh . Na voljo so že vsi živalski modeli z izničenjem pomembnejših genov v sintezi holesterola z izjemo gena Cyp51. Gen Cyp51 kodira encim 14α-demetilazo, ki je evolucijsko najbolj ohranjen encim iz družine citokromov P450. Prisoten je v vseh kraljestvih od bakterij do sesalcev. Cyp51 katalizira pretvorbo lanosterola in 24,25-dihidrolanosterola v FF-MAS (ang.: follicular fluid-MAS),ki se pretvori v T-MAS (ang.: testis-MAS) in v nadaljnjih encimskih korakih vodi v sintezo holesterola. Namen naše študije je bil določiti in vivo vlogo gena Cyp51 med razvojem zarodka z analizo mišjega modela s popolnim izničenjem gena Cyp5. Materiali in metode Transgeno miš, ki omogoča časovno in tkivno specifično izničenje gena Cyp51 smo pripravili z metodo ciljanja genov [3]. Z uporabo matičnih zarodnih celic smo v gen Cyp51 vstavili loxP zaporedji, ki ob prisotnosti proteina CRE omogočata izrez eksona 3 in 4. Da bi pridobili odrasle osebke z izničeno varianto gena lox/lox Cyp51 (Cyp51 ) smo homozigotno miš z vključki loxP mest (Cyp51 ) križali z EIIa-Cre transgeno mišjo, ki izraža transgen Cre na stopnji zigote. Samicam iz +/medsebojnih križanj Cyp51 živali smo odvzemali zarodke na različnih stopnjah razvoja – od starosti 10,5 dalje (E10,5). Posamezne zarodke smo osamili iz 23 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE zarodkovih ovojnic, jih fotografirali ter pregledali na morebitne morfološke spremembe. Del repa smo shranili za genotipizacijo, zarodek pa smo zamrznili v tekočem dušiku ali pa fiksirali v 4% paraformaldehidu za nadaljnje histološke analize. Odrasle živali in zarodke smo genotipizirali z metodo verižne reakcije s polimerazo (ang.:PCR). Uporabili smo pare oligonukleotidnih začetnikov, ki + zajemajo LoxP mesta in na ta način ločili med divjim tipom alela (Cyp51 ), alelom lox z vključki loxP (Cyp51 ) ter izničenim alelom (Cyp51 ). Zamrznjene zarodke smo uporabili za izolacijo proteinov, RNA ter merjenje +/+ -/sterolnih intermediatov. Iz zarodkov genotipa Cyp51 in Cyp51 smo izolirali membranske frakcije proteinov in s standardno Western analizo preverili prisotnost proteina CYP51. Za pozitivno kontrolo smo uporabili izoliran rekombinantni goveji protein. Za izolacijo RNA smo uporabili zarodke vseh treh genotipov. RNA smo izolirali z uporabo Tri reagenta (Ambion), jo reverzno prepisali v cDNA in uporabili za kvantitativno analizo izražanja ključnih genov v sintezi holesterola: Cyp51, 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencimA reduktaze (Hmgcr) ter lanosterol sintaze (Lss). Uporabili smo SYBR® green tehnologijo in LightCycler 480 za detekcijo (Roche). Kvantitativno analizo sterolnih intremediatov smo izvedli po postopku plinske kromatografije in masne spektroskopije [4]. V statističnih analizah smo uporabili 4 zarodke vsakega genotipa. Fiksirane zarodke smo dehidrirali v seriji alkoholov in jih vklopili v parafin. Pripravili smo prečne in vzdolžne rezine zarodkov debeline 5 μm in jih barvali s hematoksilinom in eozinom po standardnem protokolu. Histološke preparate smo pregledali na morebitne spremembe v tkivih in organskih sistemih zarodkov z izničenim genom Cyp51 v primerjavi z zarodki divjega tipa. Rezultati +/- Pri genotipizaciji 185 potomcev medsebojnih paritev Cyp51 živali nismo našli -/niti ene odrasle Cyp51 živali. Iz tega smo sklepali, da živali z okvarami obeh alelov gena Cyp51 ne preživijo do rojstva. Da bi ugotovili na kateri razvojni stopnji pride do propada zarodkov smo genotipizirali zarodke na šestih razvojnih stopnjah (E10,5 – E15,5). Ugotovljena razmerja med genotipi so bila v skladu s pričakovanim mendelskim razmerjem (1:2:1) vse do starosti E14,5. Pri razvojni -/stopnji E15,5 pa živi zarodki genotipa Cyp51 niso bili več prisotni (slika 1A), saj so bili ti vidni le še kot skupki apoptotskega tkiva. Rezultati kažejo, da zarodki brez funkcionalnega gena Cyp51 propadejo pri petnajstem dnevu razvoja. -/Odsotnost funkcionalnega CYP51 proteina pri Cyp51 zarodkih smo potrdili z western analizo. Uporabili smo protitelesa, ki se vežejo na odsek CYP51 proteina, ki je skupen vsem vrstam sesalcev. CYP51 proteina (53kDA) pri zarodkih s popolnim izničenjem gena nismo detektirali, kljub temu, da je skupna količina proteinov pri vzorcu z izničenim genom (-/-) podvojena, kar je razvidno iz močnejše lise za β-aktin. CYP51 protein je lepo viden pri zarodkih divjega tipa (+/+) in pozitivni kontroli (Slika 1B). Stopnjo znižanja izražanja Cyp51 RNA prepisa po izničenju gena Cyp51 ter učinek tega znižanja na ostale gene v sintezni poti holesterola smo kvantitativno ovrednotili s PCR v realnem času. Poleg gena Cyp51 smo preverjali še izražanje genov Hmgcr in Lss, ki sodelujeta pri ključnih korakih sinteze in regulacije sinteze holesterola. Pri heterozigotnih 24 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE zarodkih se je količina Cyp51 RNA zmanjšala na polovico, pri zarodkih z obema izničenima alelama pa na približno 20%. Pri slednjih je prišlo tudi do znatnega povišanja izražanja genov Hmgcr in Lss. Izražanje gena Hmgcr se je povišalo za 2-krat, izražanje gena Lss pa za kar 2,7-krat. Izražanje obeh genov je pri heterozigotih ostalo nespremenjeno (Slika 1C). CYP51 katalizira pretvorbo lanosterola in 24,25-dihidrolanosterola v intermediat MAS, ki se v nadaljnjih encimskih korakih pretvori do holesterola. Posledice okvare te encimske reakcije smo preverili s kvantifikacijo nekaterih sterolnih intermediatov holesterolne poti v zarodkih. Meritve kažejo ekstremno kopičenje substratov encima CYP51 (lanosterola in 24,25-dihidrolanosterola) pri zarodkih s popolnim izničenjem gena Cyp51. Količina lanosterola je v primerjavi z zarodki divjega tipa povečana za 93krat, količina 24,25-dihidrolanosterola pa za kar 2100-krat. Do statistično značilnega povišanja omenjenih substratov je prišlo tudi pri heterozigotih. Sterolnih intermediatov, ki nastanejo v nadaljnjih encimskih korakih (T-MAS in cimosterol), pri zarodkih s popolno okvaro CYP51 funkcije nismo izmerili, količina končnega produkta-holesterola pa se znižala za 2,5-krat. Pri heterozigotnih zarodkih so količne T-MAS, cimosterola in holesterola ostale nespremenjene. Natančna morfološka analiza je razkrila številne nepravilnosti pri zarodkih s popolnim izničenjem gena Cyp51. Nekatere nepravilnosti zarodkov pri starosti E14,5 so prikazane na sliki 1. Na sliki 1A, ki prikazuje celoten zarodek, je lepo viden podkožni edem. Slika 1C prikazuje povečano sliko površine kože, kjer edem izgleda kot s tekočino napolnjeno podkožje. Histološka analiza kaže, da so v edemu prisotne mezenhimu podobne celice z obsežnimi medceličnimi prostori. Na sliki 1A lahko poleg edema opazimo tudi hemoragije površine kože in skrajšano spodnjo čeljust. Slika 1B prikazuje zadnji del trebušne strani zarodka, -/kjer lahko vidimo močno spremenjen rep in okončine pri Cyp51 zarodku. Rep je skrajšan in zavit. Okončine so slabše razvite z različnimi nepravilnostmi v zasnovi prstov. Natančna analiza okončin je razkrila različne primere sindaktilije (zraščeni prsti) in polidaktilije (večje število prstov). Te spremembe so najbolje vidne pri zarodkih, ki so tik pred propadom (E15), saj so prsti pri tej starosti že bolj razviti (ni prikazano na sliki). Slika 1D prikazuje stranski histološki prerez sprednjega dela možganov, kjer opazimo močno zaostalost v razvoju ganglijskih izrastkov (ang.: GE - ganglionic eminences). To so izrastki spodnjega dela možganskih ventriklov telencefalona, ki so prisotni med razvojem zarodkovih možganov. V nadaljnjem razvoju se oblikujejo v bazalne ganglije in sodelujejo pri izoblikovanju nad njim ležeče možganske skorje. Histološka analiza je poleg spremenjenih možganskih struktur razkrila tudi nepravilnosti v razvoju srca. Najbolj očitna je stanjšana stena srca pri zarodkih z izničenim genom Cyp51. 25 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE +/- Slika 1: Analiza potomcev medsebojnih križanj Cyp51 živali. A.) Frekvenčna analiza zarodkov po genotipih na različnih stopnjah razvoja ter že rojenih potomcev kaže statistično značilno odstopanje od standardnega mendelskega razmerja pri E15,5 in rojenih živalih starih 21 dni. Tu živali z izničenim genom Cyp51 niso bili prisotni, kar nakazuje na smrtnost zarodkov pri E15. Analizirali smo povprečno 84 zarodkov na razvojno stopnjo ter 185 rojenih živali. B.) Western analiza membranskih frakcij proteinov izoliranih iz zarodkov divjega tipa in zarodkov s popolnim izničenjem gena Cyp51 prikazuje popolno odsotnost CYP51 proteina (53kDA) pri slednjih. Beta aktin smo uporabili za kontrolo količine nanešenih proteinov. Za pozitivno kontrolo smo uporabili rekombinantni goveji CYP51 protein. C.) Kvantitativna analiza izražanja genov Cyp51, Hmgcr in Lss pri zarodkih vseh treh genotipov starosti E12,5. Ekspresija gena Cyp51 je pri heterozigotih (+/-) znižana na približno 50%, pri osebkih s popolnim izničenjem gena Cyp51 pa je prisotno manj kot 20% Cyp51 prepisa. Izražanje genov Hmgcr in Lss je pri zarodkih s popolnim izničenjem gena Cyp51 močno povišano. D.) Analiza vsebnosti sterolov pri zarodkih starosti E12,5. Vsebnost lanosterola in dihidrolanosterola je močno povišana pri heterozigotnih zarodkih in zarodkih s popolnim izničenjem gena Cyp51. Pri slednjih smo izmerili tudi statistično zmanjšanje količine holesterola. T-MAS in cimosterol sta pri in zarodkih s popolnim izničenjem gena Cyp51 pod mejo detekcije (ND). 26 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 2: Primeri morfoloških in histoloških sprememb pri zarodkih z izničenim genom Cyp51 starosti E14,5. A.) Pri zarodku brez funkcionalnega gena Cyp51 (/-) pride do nastanka podkožnega edema in površinskih hemoragij. B.) Povečava repa in zadnjih okončin prikazuje napake v razvoju skeletnih elementov. C.) Slika prikazuje obseg kožnega edema pri zarodkih z izničenim genom Cyp51. Histološka analiza razkrije, da so v edemu prisotne mezenhimu podobne celice z obsežnimi medceličnimi prostori. D.) Prečni prerez možganov kaže na močno zaostalost v razvoju sprednjega dela možganov. MGE (median ganglionic eminence, LGE (lateral ganglionic eminence). Merilo prikazuje 1 milimeter. Diskusija Pri S postopkom ciljanja genov smo pridobili mišji model s popolnim izničenjem funkcije CYP51, kar smo potrdili z molekularno - biološkimi metodami na ravni DNA, RNA in na proteinski ravni. Sterolne analize nudijo dodaten dokaz o popolni okvari encima CYP51, saj smo izmerili ekstremno kopičenje substratov in odsotnost produktov CYP51 encimske reakcije. Pomanjkanje holesterola se izraža tudi s povišanim izražanjem genov Hmgcr in Lss, ki sta vključena v negativno povratno zanko regulacije količine holesterola. S frekvenčno analizo genotipov na različnih stopnjah razvoja smo ugotovili, da zarodki brez funkcionalnega proteina CYP51 odmrejo pri približno petnajstem dnevu starosti. Temu sledi hitra razgradnja z apoptozo in resorbcija zarodka v steno maternice. Zanimivo je, da zarodki z okvarami v različnih genih za sintezo holesterola preživijo različno dolgo. Iz tega lahko sklepamo, da smrtnost zarodkov ni nujno posledica pomanjkanja končnega produkta - holesterola, ki ga zarodek do določene starosti pridobiva tudi iz materinega krvnega obtoka, temveč tudi neravnovesja v sterolnih intermediatih s še neopisano funkcijo. Okvare v razvoju skeleta okončin, obrazno-lobanjskega dela ter možganov, ki smo jih opazili pri -/Cyp51 zarodkih, so pri živalskih modelih, kot tudi ljudeh z okvarami v genih za sintezo holesterola pogost pojav. Podkožni edem pa je fenotip, ki pri živalskih modelih z izničenjem genov holesterolne poti do sedaj še ni bil opisan. Tovrstni edem lahko nastane iz različnih vzrokov, najpogosteje pa ga povezujejo z nepravilnim delovanjem srca in ožilja. Kadar srce ni sposobno vzdrževati 27 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE ustreznega pretoka krvi skozi ožilje, pride do spremembe tlaka krvi v ožilju in -/izločanja plazme v medceličnino. Ker je histološka analiza Cyp51 zarodkov pokazala stanjšanje srčne mišice, je v našem primeru nepravilno delovanje srca najverjetnejša razlaga za nastanek edema. Z vidika molekularno bioloških mehanizmov, ki vodijo v nastanek opisanih fenotipov je glavni skupni imenovalec SHH morfogen. SHH ima specifično vlogo pri razvoju in diferenciaciji skeleta, srca ter možganskega sistema. Ker je holesterol potreben za aktivacijo SHH morfogenetske poti je možno, da lokalno pomanjkanje holesterola med razvojem zarodka prispeva k nastanku opisanih nepravilnosti. Zaradi kompleksnosti procesov med razvojem zarodka, je dejanske vzroke, ki vodijo v nastanek patoloških sprememb, težko določiti. Za določevanje tkivno in časovno specifične vloge posameznega gena je bolje uporabiti živalske modele s pogojno inaktivacijo gena v poljubnem tkivu in poljubni razvojni stopnji. Reference 1. 2. 3. 4. Byskov AG, Andersen CY, Nordholm L, Thogersen H, Xia G, et al. (1995) Chemical structure of sterols that activate oocyte meiosis. Nature 374: 559-562. Horvat S, McWhir J, Rozman D (2011) Defects in cholesterol synthesis genes in mouse and in humans: lessons for drug development and safer treatments. Drug Metab Rev 43: 69-90. Keber R, Motaln H, Wagner KD, Debeljak N, Rassoulzadegan M, et al. (2011) Mouse knockout of the cholesterogenic cytochrome P450 lanosterol 14{alpha}-Demethylase (CYP51) resembles Antley-Bixler syndrome. Journal of Biological Chemistry. Acimovic J, Lovgren-Sandblom A, Monostory K, Rozman D, Golicnik M, et al. (2009) Combined gas chromatographic/mass spectrometric analysis of cholesterol precursors and plant sterols in cultured cells. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 877: 2081-2086. Abstract. Lanosterol 14α-demethylase encoded by the Cyp51 gene controls one of the key steps in cholesterol biosynthesis. Cholesterol is an essential precursor for production of steroid hormones and bile acids, integral part of eukaryotic membrane and activator of sonic hedgehog morphogenetic pathway. Despite the important housekeeping function of Cyp51, its actual role has not yet been demonstrated in vivo. We developed Cyp51 full knockout transgenic mouse model to study the role of Cyp51 in embryo development. Complete ablation of CYP51 function in Cyp51-/embryos resulted in marked accumulation of upstream substrates and absence of sterol products of CYP51 enzyme reaction. Cyp51-/- embryos displayed several abnormalities including subcutaneous edema, shortened mandibula, kinked tail, and various deformations in limb development. Histological analysis revealed anomalies in development of brain and heart. Such embryos died at E15 of embryonic development. Subcutaneous edema has not been previously described in knockout models of cholesterol pathway genes. We assume this phenotype is a consequence of developmental abnormalities in embryonic heart which can be supported by histological analysis. Our Cyp51-/- knockout model demonstrates the importance of Cyp51 in embryo development and can serve as a model to study some human conditions with impairment of cholesterol synthesis. Keywords: Cyp51, Cytochrome P450, Cholesterol, knockout models. 28 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Proteomska analiza micelijskih proteinov fitopatogene glive Monilinia laxa Olja Bregar, Stanislav Mandelc, Branka Javornik Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Katedra za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, [email protected] Glive rjave gnilobe Monilinia laxa (Aderh. & Ruhl.) Honey, Monilinia fructigena (Aderh. & Ruhl.) Honey in Monilinia fructicola (Wint.) so ena najpomembnejših rastlinskih patogenov koščičarjev in pečkarjev v Evropi. Z molekularnim markerskim sistemom AFLP smo analizirali genetsko raznolikost fitopatogene glive vrste M. laxa ter potrdili razdelitev izolatov v dve skupini, glede na gostitelja. Najprej smo vzpostavili referenčno mapo micelijskih proteinov, ki nam je razkrila več kot 800 proteinskih lis. Lise smo analizirali na poliakrilamidnem gelu z nelinearnim pH razpona 3-11 ter 14-116 kDa molekulske mase ter jih pobarvali s Coomassie barvilom. Tri tehnične in tri biološke ponovitve, skupaj 28 gelov in 252 lis, smo uporabili za določitev tehnični in biološki koeficient variance. Povprečni analitični CV izolatov iz jablan je 13% ter 13% za izolate, pridobljene iz marelic. Povprečni biološki koeficient variance za izolate iz jablan je 21% ter 25% za izolate iz marelic. Prav tako smo uporabili multivariatno statistiko. Z metodo glavnih komponent smo izolate ločili v dve skupini, ki sovpadata z izvorom izolacije. 50 lis smo analizirali z LC-MS/MS, od tega 48 lis identificirali z več kot enim peptidnim zadetkom. Med identificiranimi micelijskimi proteini najdemo proteine metabolizma amino kislin, ogljikovih hidratov ter metabolizma maščobnih kislin in proteine, ki so vpleteni v celični odgovor na stresne dejavnike ter proteini, vpleteni v produkcijo celične energije. 29 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Izolacija in karakterizacija kandidatnih genov za odpornost na hmeljevo uvelost Aljaž Majer, Branka Javornik, Jernej Jakše Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Katedra za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, [email protected] Hmeljeva uvelost, ki jo povzroča gliva Verticillium albo-atrum, je pomembna bolezen hmelja, ki lahko povzroči precejšnjo izgubo pridelka v prizadetih področjih. Viri odpornosti na glive rodu Verticillium so poznani pri več rastlinskih vrstah, mehanizem pojava odpornosti pa je najbolje opisan pri paradižniku, kjer gre za monogensko lastnost, posredovano z lokusom Ve. Na hmeljevo uvelost najbolj odporen kultivar hmelja je angleški kultivar ‘Wye Target’, pri katerem je odpornost predvidoma podedovana od predniškega divjega ameriškega hmelja. Kratek del hmeljeve sekvence, podobne paradižnikovemu Ve genu, je bil predhodno izoliran z degeneriranimi začetnimi oligonukleotidi, pripravljeni na podlagi poravnave paradižnikovega zaporedja in podobnih zaporedij pri drugih rastlinskih vrstah. Z uporabo postopka TAIL-PCR smo pridobili nukleotidna zaporedja celotnih kodogenih regij dveh podobnih skupin genov pri kultivarju ‘Wye Target’, ki smo jih poimenovali HlVe1 in HlVe2. Obe skupini zaporedij kažeta strukturne značilnosti paradižnikovega Ve gena. Zaporedja HlVe2 smo uspešno klonirali. Gre za tri oblike gena, od katerih sta dve predvidoma funkcionalni, tretja pa je psevdogenska. Na podlagi pridobljenih zaporedij HlVe2 smo razvili genetski označevalec za družino ‘Wye Target’ X ‘2/1’ s 144 potomci in ga dodali na obstoječo karto povezanosti. Izkazalo se je, da označevalec sovpada z lokusom kvantitativne lastnosti za hmeljevo uvelost. Kloniranje HlVe1 še ni bilo uspešno. Segregacija markerjev, razvitih na podlagi s TAIL-PCR pridobljenega zaporedja HlVe1, kaže, da gre verjetno za dva homozigotna lokusa. Nadaljnje delo na lokusih HlVe bo obsegalo primerjavo nukleotidnih zaporedij obeh skupin genov pri odpornih in neodpornih kultivarjih hmelja ter funkcijsko analizo različnih oblik gena HlVe2 v transgenem modelnem patosistemu. Ključne besede: geni za odpornost, hmeljeva uvelost, molekulsko kloniranje, razvoj molekulskih označevalcev. 30 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Generation of transgenic rabbits using Sleeping Beauty Miha Modic1, Tobias R. Richter2 1 WZW Weihenstephan, Technische Universität München, Nemčija Adult Neurogenesis Group; Insitute for Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum München; Ingolstädter Landstraße 1, D-85764 Neuherberg, Nemčija; [email protected] 2 Chair of Livestock Biotechnology, WZW Weihenstephan, Technische Universität München, Liesel-Beckmann Str, 1; D-85354 Freising, Nemčija, [email protected] The ability to generate transgenic rabbits (Oryctolagus cuniculus) in a fast and efficient way would benefit biomedical research. So far, transgenic rabbits have been mainly produced by pronuclear microinjection of DNA molecules into fertilized oocytes. This method is characterized by a very low efficiency and the genomic integration of the added DNA occurs at random and often in form of concatemeres and can result in gene silencing due to positional effects. Here, we used a transposon-based system Sleeping Beauty (SB) to integrate genes of interest into the rabbit genome as stable single-copies without the formation of concatemeres. The integration occurs at random into accessible regions of the genome. The transposon system consists of two vectors, one carrying the gene of interest (GOI) the other carrying the gene for transposase, to prevent the integration of the transposase bearing vector. To assess this vector system for production of transgenic rabbits, the red fluorescent marker gene mCherry under transcriptional control of a cytomegalovirus early enhancer element / chicken beta-actin promoter (CAGGs – CMV) was transfected into rabbit mesenchymal stem cells to test the optimal ratio of transposase to vector in vitro. This was then used to produce transgenic rabbits by microinjection into rabbit fertilized oocytes. In this preliminary experiment animals were analysed at day 21 of pregnancy, whereby 3 out of 20 foetuses (15%) showed a uniform expression of mCherry. PCR revealed that none of the non-mCherry-expressing foetuses had a copy of the GOI. Further, PCR showed that the transposase-bearing vector was not integrated. As an animal model for diabetes, we designed SB with a mutated Insulin gene. Here, the Akita- mutation of the mouse was introduced in the rabbit insulin gene (INS) and showed functional in cell-culture assays. The SB-INS-Akita was then microinjected into rabbit fertilized oocytes and transferred to foster mothers. Ključne besede: transzgeneza, transpozoni, Sleeping Beauty, diabetes, Akita mutacija, insercijska mutageneza, kunec. 31 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Orodja sistemske biologije za proučevanje interakcij patogen – gostitelj Ana Rotter Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo, [email protected] Sistemska biologija je povezana s pridobivanjem velikega števila podatkov. To omogoča pridobivanje novih znanj, obenem pa predstavlja velik izziv tako v smislu (i) obdelave podatkov in njihovega ustreznega shranjevanja kot v smislu (ii) interpretacije dobljenih rezultatov. Eden izmed temeljev sistemske biologije je preučevanje izražanja genov z metodami mikromrež. Tehnologija mikromrež nam daje odličen vpogled v gene, ki imajo podobne vzorce izražanja oziroma poišče gene, katerih izražanje se pod določenimi eksperimentalnimi pogoji značilno razlikuje. Vendar pa imajo mikromreže dve pomembni značilnosti, ki sta hkrati bili navdih za mnoge bioinformatske in biostatistične raziskovalne projekte po svetu. Pri takih poskusih imamo majhno število ponovitev poskusov (od nekaj do – izjemno redko, vsaj pri rastlinskih poskusih- nekaj deset ponovitev) ter veliko število genov (nekaj deset tisoč), katerih izražanje merimo. To predstavlja velik izziv pri obdelavi podatkov, kjer testiramo na tisoče ničelnih hipotez hkrati, obenem pa želimo iz osnovnih eksperimentalnih rezultatov izluščiti čimveč informacij. V splošnem je podatkovna obdelava takih podatkov večstopenjska in obsega: kontrolo kakovosti in predprocesiranje, statistična obdelava podatkov ter biološka interpretacija rezultatov. Predstavljeni bodo postopki podatkovne obdelave, ki smo jih za proučevanje interakcij pathogen (virus, fitoplazma) – gostitelj (krompir, vinska trta) uporabili na Oddelku za biotehnologijo in sistemsko biologijo. Izmed metod predprocesiranja je bilo pokazano, da je ravno normalizacija podatkov tista, ki ključno vpliva na končen rezultat, t.j. seznam diferencialno izraženih genov. Zato predlagamo uporabo dveh načinov normalizacij. Nadaljujemo s statistično obdelavo podatkov. Pri tem izberemo ustrezen statistični model, v katerega skušamo vključiti čimveč spremenljivk, ki naj ustrezno opišejo sistem. Končni rezultat predstavljata seznama diferencialno izraženih genov. Seznama sta dva, ker uporabimo dve normalizaciji. Le gene, ki se pojavljajo v preseku obeh seznamov diferencialno izraženih genov, uporabimo za nadaljnjo obdelavo, t.j. biološko interpretacijo rezultatov. Sezname diferencialno izraženih genov lažje interpretiramo z ustreznimi vizualizacijskimi orodji, s katerimi odkrijemo zanimive biološke razlage, do katerih bi sicer težko prišli. Zato smo za obdelavo transkriptomskih podatkov krompirja in vinske trte implementirali orodje MapMan; sem smo vključili na novo izdelane diagrame pomembnih metabolni poti (fenilpropanoidna, terpenoidna in karotenoidna pot) oziroma interakcij gostitelj / patogen. Ključne besede: sistemska biologija, statistika, podatkovna obdelava, interakcije, patogen, gostitelj, krompir, vinska trta. 32 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE PREDAVANJA GENOMIKA MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI 33 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI ZNANSTVENI PRISPEVEK Genetska variabilnost genov za mikro RNA pri govedu Irena Godnič1, Minja Zorc2, Daša Jevšinek Skok1, Simon Horvat1, Peter Dovč1, Milena Kovač1, Tanja Kunej1 1 Oddelek za zootehniko, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani, Groblje 3, 1230, Domžale, Slovenija 2 Inštitut za biostatistiko in medicinsko informatiko, Medicinska fakulteta, Vrazov trg 2, 1104 Ljubljana, Slovenija Izvleček. Mikro RNA (miRNA) spadajo med nekodirajoče RNA s pomembno vlogo v potranskripcijskem uravnavanju tarčnih genov. Za uravnavanje je ključna komplementarnost med tarčno mRNA in območjem na miRNA odgovornim za njuno prepoznavanje in vezavo, imenovanim območje »seed«. V predhodnih študijah so dokazali, da genetska variabilnost genov za miRNA (miR-SNP) vpliva na fenotipsko raznolikost ter dovzetnost za bolezni pri človeku in miši. Polimorfizmi v genih za miRNA predstavljajo potencial za razvoj biooznačevalcev za fenotipske lastnosti tudi v živinoreji. V ta namen smo razvili prosto dostopno bioinformacijsko orodje za identifikacijo polimorfizmov v genih za miRNA. Z razvitim orodjem smo identificirali 18 SNP-jev, ki se nahajajo v zapisih za pre-miRNA pri govedu. Zbrani polimorfizmi predhodno še niso bili opisani v povezavi z miRNA, prav tako v podatkovnih zbirkah še ni znan njihov status validacije. Ugotovili smo, da je gostota SNP-jev največja v območju »seed«, kar je v nasprotju s predpostavko o močni evolucijski ohranjenosti tega območja. Validirali smo tri SNP-je v primarnem zapisu gena za miRNA bta-mir-2313 pri govedu. Razvito bioinformacijsko orodje je raziskovalcem lahko v pomoč pri načrtovanju novih projektov za proučevanje vpliva genetske variabilnosti genov za miRNA na fenotipske lastnosti pri govedu. Uvod Mikro RNA (miRNA; angl. microRNA) so nekodirajoče molekule RNA dolge približno 21 nukleotidov, ki z vezavo na tarčne mRNA potranskripcijsko uravnavajo izražanje genov. Z vezavo na komplementarno zaporedje na 3'neprevedeni regiji (3'-UTR; angl. untranslated region) tarčnih genov zavirajo 1 njihovo prevajanje . Biogeneza miRNA se prične v jedru s primarnim prepisom (pri-miRNA; angl. primary miRNA) dolgim več sto ali tisoč baznih parov, ki se z delovanjem endonukleaznega encima Drosha preoblikuje v približno 60 do 70 nukleotidov dolgo prekurzorsko miRNA (pre-miRNA; angl. precursor miRNA). Pre-miRNA ima značilno zgradbo stebla-zanke (angl. stem-loop), na katero v citoplazmi deluje encim Dicer, ki reže obe verigi dupleksa in tako oblikuje zrelo 1,2 miRNA (angl. mature miRNA) . Med produkte cepljenja z Dicerjem spadajo tudi 3 komplementarna zaporedja zrelih miRNA, ki jih označujemo kot miRNA* in so 4 običajno prepisane v nižjem odstotku kot zrele miRNA . Del zrele miRNA, 2-7 oz. 2-8 nukleotidov na 5'-koncu miRNA, imenovano tudi območje »seed«, je 34 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE odgovoren za prepoznavanje in vezavo miRNA na mRNA in s tem ključnega 5 pomena pri zaviranju prevajanja tarčnih genov . Spremembe v profilu izražanja miRNA so bile povezane z različnimi 6,7 boleznimi, med drugim tudi s številnimi tipi raka . Do sprememb pride tudi zaradi polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP; angl. single nucleotide polymorphism) v 1) genih za miRNA, 2) njihovih tarčah, ali 3) genih, ki kodirajo proteine sodelujoče v biogenezi miRNA (angl. silencing machinery). Ti polimorfizmi prispevajo k razlikam v fenotipu ter so posledično povezani tudi s proizvodnimi lastnostmi in dovzetnostjo za bolezni, kot na primer rak, nevrološke motnje, mišična hiperdistrofija, atrofija želodčne sluznice, kardiovaskularne 8-11 bolezni in diabetes tipa 2 . Izraz miR-SNP se nanaša na polimorfizem v zapisu genov za miRNA, medtem ko miR-TS-SNP označuje SNP-je v tarčnih mestih 5 (TS; angl. target sites) za vezavo miRNA na mRNA . Polimorfizmi v genih za miRNA spremenijo njihov zapis in s tem omogočijo, izničijo ali zmanjšajo 12 sposobnost vezave na tarčno mesto . Ocenjeno je, da posamezna miRNA 13 uravnava približno 200 tarčnih genov , zaradi česar predvidevajo, da imajo 5,10,13 polimorfizmi v genih za miRNA večje posledice kot tisti v tarčnih mestih . V centralni podatkovni zbirki za miRNA, miRBase je trenutno zbranih 662 miRNA 14 15 za govedo , vendar se bo to število v prihodnosti najverjetneje še povečevalo . Polimorfizmi v genih za miRNA pri govedu imajo v podatkovnih zbirkah (NCBI) še neznan status validacije in predhodno še niso bili opisani v povezavi z miRNA. Ker govedo predstavlja tako prehranski vir, kot živalski model, bi biooznačevalci osnovani na polimorfizmih miRNA prispevali k proučevanju fenotipskih lastnosti zanimivih v živinoreji in medicini. V tej študiji smo zato sistematsko zbrali polimorfne gene za miRNA ter eksperimentalno validirali miRNA bta-mir-2313 s SNP-jem v območju »seed« in dvema pri-miRNA SNP. Materiali in metode Razvoj bioinformacijskega orodja za identifikacijo polimorfizmov v genih za miRNA. Razvito spletno orodje za identifikacijo polimorfizmov v genih za miRNA deluje kot CGI (angl. Common Gateway Interface) program napisan v programskem jeziku Pearl in integrira podatke iz več virov. Informacije o nukleotidnih zaporedjih, genomski lokaciji in nomenklaturi miRNA pri govedu povzema iz zbirke miRBase, verzija 17, april 2011 (n=662) (http://www.mirbase.org/), informacije o SNP-jih pa iz podatkovne zbirke NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) in Ensembl, verzija 63, junij 2011 (http://www.ensembl.org/index.html). Genomske lokacije genov za miRNA s SNP-ji smo prikazali na genetski karti z uporabo spletnega orodja Flash GViewer (http://gmod.org/wiki/Flashgviewer/). Uporabljeni vzorci. Vzorce pasme slovenskega simentalskega goveda smo pridobili v okviru ARRS projekta mapiranja genoma (J4-9252 MAS za pitovne in klavne lastnosti pri kombiniranih pasmah goveda, vodja prof. Kovač M.) iz nacionalnega testa potomcev. Genomsko DNA smo izolirali iz semena osmih očetov z uporabo kompleta reagentov DNeasy Blood & Tissue (QiaGen, Düsseldorf, Nemčija). 35 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Ugotavljanje nukleotidnega zaporedja in validacija miR-SNP-jev pri govedu. Začetne oligonukleotide za validacijo miR-SNP-jev z metodo sekvenciranja smo 16 izbrali s spletnim orodjem Primer3 . Za validacijo SNP-ja rs41761413 v bta-mir2313 smo izbrali začetne oligonukleotide (F) 5'-GCACAGACTCTCAGCCACTG-3' in (R) 5'-CTGACTGAGGCTCTCGCTCT-3'. Uspešnost verižne reakcije s polimerazo (PCR; angl. polymerase chain reaction) smo preverili na 1,5% agaroznem gelu. Produkte PCR smo najprej očistili z uporabo 0,3 µl eksonukleaze I (ExoI; angl. Exonuclease I) (Fermentas, Vilnius, Litva) in 0,6 µl alkalne fosfataze rakov (SAP; angl. shrimp alkaline phosphatase) (Fermentas, Vilnius, Litva) ter po sekvenčni reakciji vzorce pripravili za izvedbo kapilarne elektroforeze na ABI3130xl, s katero smo identificirali polimorfizme v pomnoženih produktih. Rezultati in diskusija V študiji smo razvili spletno orodje za identifikacijo polimorfizmov v genih za miRNA pri govedu. Za eksperimentalno validacijo smo izbrali SNP, ki se nahaja v območju »seed« bta-mir-2313 ter dvema SNP v pri-miRNA. Razvoj orodja za identifikacijo miR-SNP-jev pri govedu. Razvili smo prosto dostopno spletno orodje za identifikacijo polimorfizmov v genih za miRNA (http://www.integratomics-time.com/miR-seed). V primeru, da se SNP nahaja v območju »seed«, je to na izpisu posebej označeno (slika 1). Orodje bomo dopolnjevali in posodabljali v skladu z novimi verzijami podatkovnih zbirk genov za miRNA in SNP-jev pri govedu. Slika 1: Prikaz spletnega orodja miR-seed za iskanje SNP-jev v genih za miRNA pri govedu. Primer miRNA bta-mir-2313 s SNP-jem v območju »seed« (rs41761413). 36 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE SNP ID Lokacija SNP-ja v sekundarni strukturi miRNA Nukleotidna zamenjava rs41974473 steblo* A>G miRNA Lokacija v genomu (gen) bta-mir-7-1 intergenski rs41974474 steblo* T>C bta-mir-19a intergenski rs43702263 steblo* G>T bta-mir-29e intronski (MCP_BOVIN) rs41825418 »seed« T>C mir-320b intergenski rs43416688 steblo* G>A bta-mir-1179 intergenski rs41974457 steblo* A>G bta-mir-181b intergenski rs41990658 steblo* G>A rs41765809 steblo* G>A rs41765810 steblo* G>A rs41765811 steblo* T>C bta-mir-2284d intronski (SWP70_BOVIN) bta-mir-2284s intergenski rs43430325 zanka T>G bta-mir-2305 intronski (RIN2) rs41686132 steblo* T>G bta-mir-2313 intergenski rs41761413 »seed« C>T bta-mir-2329-1 intergenski bta-mir-2329-2 intergenski rs41885631 zanka T>G bta-mir-2380 intronski (A5D7A1_BOVIN) rs43771654 steblo* T>C bta-mir-2388 intronski (Q2HJD6_BOVIN) rs43722771 zanka G>A bta-mir-2419 intergenski rs43400521 miRNAΔ»seed« G>A bta-mir-2450c intronski (HTT) rs42658514 »seed« A>G Preglednica 1: Seznam SNP-jev v genih za miRNA pri govedu. MCP_BOVIN – membrane cofactor protein; SWP70_BOVIN – switch-associated protein 70; RIN2 – Ras and Rab interactor 2; A5D7A1_BOVIN – SS18 protein; Q2HJD6_BOVIN – CUX1 protein – cut-like homeobox 1; HTT – huntingtin. Identifikacija miR-SNP-jev pri govedu. S presekom genomske lokacije vseh trenutno znanih genov za miRNA (n=662) in SNP-jev pri govedu (n=2.074.230) smo našli 18 SNP-jev, ki ležijo znotraj 16 genov za miRNA (preglednica 1). SNP-ji so se glede na lokacijo v sekundarni strukturi pre-miRNA nahajali v 12 štirih regijah, ki imajo različen funkcionalen pomen : Tri znotraj območja Δ»seed« »seed«, eden v zreli miRNA brez območja »seed« (miRNA ), tri v zanki in enajst v steblu (brez zrele miRNA in zanke; steblo*) (slika 2A in preglednica 1). Primer sekundarne strukture bta-mir-2419 s SNP-jem v miRNA* je prikazan na sliki 2B. Ugotovili smo relativno nizko raven polimorfizmov v pre-miRNA kot celoti, medtem ko so bili SNP-ji v območju »seed« najpogostejši glede na velikost posameznega območja, kar je v skladu z nedavnimi ugotovitvami o 37 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE večji polimorfnosti območja »seed« v primerjavi z ostalimi odseki pre-miRNA 17 pri kokoši . Slika 2: Sekundarna struktura miRNA in primer miRNA s SNP-jem v miRNA*. A: sekundarna struktura pre-miRNA je v obliki stebla-zanke. Steblo (angl. stem) se deli na steblo* (brez miRNA/miRNA*) in zrelo miRNA oz. komplementarno miRNA*. Zrela miRNA je zgrajena iz območja »seed« (črno) Δ»seed« in miRNA - zrela miRNA brez območja »seed« (osvetljeno) (prirejeno po Saunders in sod., 2007). B: zapis za miRNA bta-mir-2419 s SNP-jem v miRNA*. Označeni sta zrela miRNA in miRNA* (vijoličen zapis), območje »seed« (podčrtano) in SNP. Genomska razporeditev miR-SNP-jev pri govedu. Genomske lokacije genov za miRNA s SNP-ji pri govedu smo prikazali na genetski karti (http://www.integratomics-time.com/miRNA_variations/genetic_maps/cattle) (slika 3). miR-SNP-ji so se v večini primerov nahajali v intergenskih miRNA (10/16), v šestih primerih pa v intronskih miRNA. (bta-mir-29e, -2284d, -2305, 2380, -2388 in -2450c). Ena intronska miRNA (bta-mir-29e) je bila v protismiselni orientaciji (angl. antisense), preostalih pet pa v smiselni (angl. sense) orientiraciji z gostiteljskimi geni (angl. host genes). Geni za miRNA imajo lahko v primeru smiselne orientacije z gostiteljskimi geni skupne 18 prepisovalne mehanizme . Gostiteljski geni smiselno orientiranih intronskih miRNA so na genetski karti zapisani z rdečo barvo (slika 3). 38 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 3: Genomske lokacije SNP-jev v genih za miRNA pri govedu označene s puščicami na kromosomih obarvanih s črno barvo. Gostiteljski geni smiselno orientiranih intronskih miRNA so zapisani z rdečo barvo. Validacija miR-SNP-jev pri govedu. Zbrani SNP-ji imajo po navedbah podatkovnih zbirk (NCBI in Ensembl) neznan status validacije in predhodnih študijah še niso bili genotipizirani. Za eksperimentalno validacijo SNP-jev smo izbrali bta-mir-2313, ker je vsebovala SNP v območju »seed« (rs41761413). Ta del zrele miRNA ima namreč ključno vlogo pri prepoznavanju vezavnega mesta na tarčnih mRNA. Analizirali smo osem vzorcev bikov iz populacije pasme slovenskega simentalskega goveda. Pri validaciji smo v bližini polimorfnega mesta v območju seed dodatno identificirali še dva SNP-ja v pripadajoči pri-miRNA (rs41761412 in rs41761414) (slika 4). Pri SNP-ju rs41761412 je bila prisotna poli-alelna zamenjava G>T>A, za katero je bila v podatkovni zbirki navedena samo bialelna zamenjava A>G. V prihodnjih raziskavah bomo genotipizacijo bta-mir-2313 izvedli na vzorcih fenotipiziranih družin polbratov in njihovih očetov iz slovenske populacije slovenskega simentalskega goveda. Za nadaljnje raziskave bi bila zanimiva tudi SNP-ja v bta-mir-2284d (rs41765809) in bta-mir-7-1 (rs41974473), ki sta se nahajala tri nukleotide pred zapisom za zrelo miRNA in tako predstavljata potencialen vpliv 5 na prepoznavanje in delovanja encima Drosha . 39 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 4: Validacija treh SNP-jev v pri-miRNA bta-mir-2313 pri govedu. Medvrstna primerjava genetske variabilnosti genov za miRNA je pokazala najnižjo gostoto SNP-jev v genomu pri govedu (preglednica 2). Pri govedu se pojavlja šest SNP-jev vsakih 10 kb, medtem ko se pri človeku pojavlja 90 SNPjev / 10 kb in pri miši 40 SNP-jev / 10 kb. Vrednosti gostote SNP-jev se bodo s posodabljanjem in dopolnjevanjem podatkovnih zbirk za miRNA in SNP-je še spreminjale. Skupno število SNP-jev v pre-miRNA št. SNP-jev v območju seed Organizem št. miRNA Skupno število SNP-jev v genomu Človek 1424 29.838.367 1077 118 Miš 720 14.973.146 172 13 Govedo 662 2.074.230 18 3 Preglednica 2: Medvrstna primerjava števila SNP-jev v genih za miRNA. Zaključek Študija predstavlja prvo analizo genetske variabilnosti genov za miRNA pri govedu in bo prispevala k razvoju molekularnih označevalcev za uporabo v selekcijskih programih rejnih živali. 40 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Reference 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell 2004;116(2):281-297. Lee Y, Jeon K, Lee J-T, Kim S, Kim VN. MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization. EMBO J 2002;21(17):4663-4670. Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science 2001;294(5543):858862. Lim LP, Lau NC, Weinstein EG, Abdelhakim A, Yekta S, Rhoades MW, Burge CB, Bartel DP. The microRNAs of Caenorhabditis elegans. Genes & Development 2003;17(8):991-1008. Sun G, Yan J, Noltner K, Feng J, Li H, Sarkis DA, Sommer SS, Rossi JJ. SNPs in human miRNA genes affect biogenesis and function. RNA 2009;15(9):1640-1651. Kunej T, Godnic I, Ferdin J, Horvat S, Dovc P, Calin GA. Epigenetic regulation of microRNAs in cancer: An integrated review of literature. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, In Press. Ferdin J, Kunej T, Calin G. Non-coding RNAs: Identification of Cancer-Associated microRNAs by Gene Profiling. Technology in Cancer Research & Treatment 2010;9(2):123-138. Georges M, Coppieters W, Charlier C. Polymorphic miRNA-mediated gene regulation: contribution to phenotypic variation and disease. Current Opinion in Genetics & Development 2007;17(3):166-176. Fabbri M, Valeri N, Calin GA. MicroRNAs and genomic variations: from Proteus tricks to Prometheus gift. Carcinogenesis 2009;30(6):912-917. Mishra PJ, Bertino JR. MicroRNA polymorphisms: the future of pharmacogenomics, molecular epidemiology and individualized medicine. Pharmacogenomics 2009;10(3):399-416. Hoffman AE, Zheng T, Yi C, Leaderer D, Weidhaas J, Slack F, Zhang Y, Paranjape T, Zhu Y. microRNA miR-196a-2 and Breast Cancer: A Genetic and Epigenetic Association Study and Functional Analysis. Cancer Research 2009;69(14):5970-5977. Saunders MA, Liang H, Li W-H. Human polymorphism at microRNAs and microRNA target sites. Proceedings of the National Academy of Sciences 2007;104(9):33003305. Rajewsky N. microRNA target predictions in animals. Nat Genet 2006. Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase: integrating microRNA annotation and deepsequencing data. Nucleic Acids Research 2011;39(suppl 1):D152-D157. Strozzi F, Mazza R, Malinverni R, Williams JL. Annotation of 390 bovine miRNA genes by sequence similarity with other species. Anim Genet 2009;40(1):125. Rozen S, Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol 2000;132:365-386. Zhang C-s, Geng L-y, Zhang J, Zhu W-j, Du L-x. Chicken Polymorphism at PreMicroRNAs Inferred from SNP Data. Bioinformatics and Biomedical Engineering (iCBBE), 2010 4th International Conference on. Chengdu; 2010. p 1-4. Li S-C, Tang P, Lin W-C. Intronic MicroRNA: Discovery and Biological Implications. DNA and Cell Biology 2007;26(4):195-207. 41 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Abstract. MicroRNAs (miRNA) are a class of non-coding RNAs important in posttranscriptional regulation of target genes. Regulation requires complementarity between the target mRNA and the miRNA region responsible for their recognition and binding, also called the seed region. Previous studies have proven that genetic variability of miRNA genes (miR-SNP) has an impact on phenotypic variation and disease susceptibility in human and mice. Polymorphisms in miRNA genes could therefore represent biomarkers for phenotypic traits important also in livestock. For this purpose we generated an online bioinformatic tool developed for identification of polymorphisms in miRNA genes. We identified 18 SNPs in pre-miRNA in cattle that have not yet been described in the miRNA context in previous studies and have an unknown validation status. We found that the density of SNPs was the highest in the seed region, which is in contrary to the presumption of a strong evolutionary conservation of this region. We validated three SNPs in the primary transcript of the miRNA gene bta-mir-2313 in cattle. The generated bioinformatic tool (webbased database tool) can serve researchers as a starting point in designing projects researching the influence of genetic variability of miRNA genes in cattle. 42 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI ZNANSTVENI PRISPEVEK Asociacijska analiza haplotipov v genu FTO (Fat mass and obesity associated gene) z lastnostmi zamaščevanja pri govedu Association analysis of the FTO (Fat mass and obesity associated gene) haplotypes with fat depositon traits in cattle Daša Jevšinek Skok1, Tanja Kunej1, Peter Dovč1, Milena Kovač1 in Simon Horvat1, 2 1 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenija 2 Kemijski inštitut, Hajdrihova 19, SI-1001 Ljubljana, Slovenija Izvleček. Vse pogostejše pojavljanje debelosti je pospešilo prizadevanja znanstvenikov za odkrivanje genov in mehanizmov povezanih s to boleznijo. Prekomerno nalaganje maščobe je nezaželeno tudi pri prireji mesa in mleka iz ekonomskih razlogov, ter zaradi vse večjega povpraševanja porabnikov po manj mastnih proizvodih. Odkritje genov, povezanih z nalaganjem maščobe, je ključ do zdravljenja in nadzora tovrstnih motenj tako pri ljudeh kot tudi pri živalih. Vpliv gena FTO (angl. Fat mass and obesity associated gene) na lastnosti zamaščevanja so dokazali pri človeku, miši, prašiču in govedu. Namen te preliminarne študije je bil identificirati SNP (ang. Single nucleotide polymorphism) označevalce v različnih odsekih gena FTO za določanje sorodstva in identifikacijo haplotipov pri očetih in polbratih v populaciji slovenskega lisastega goveda. Od skupno 25 identificiranih SNP-jev smo uporabili 12 najbolj informativnih pri 31 očetih in 105 polbratih slovenskega lisastega goveda. Analizo točnosti rodovnikov smo izvedli s programom ATLAS. Za analizo haplotipov smo uporabili program Haploview, s katerim smo identificirali dva bloka. Statistično značilne razlike za delež loja smo opazili za SNPje “ex2 T>C”, “int2 indel*>T” in int8 C>T. Rezultati te študije bodo prispevali k razvijanju molekularnih označevalcev za uporabo v selekcijskih programih goveda za učinkovitejšo odbiro živali, ki imajo željen genotip za lastnosti zamaščevanja. Ključne besede: govedo, zamaščevanje, FTO, SNP, analiza haplotipov. Uvod Debelost je problem razvitega sveta in v zadnjem času tudi dežel v razvoju. Za debelostjo zbolevajo ljudje vseh generacij, pojavlja pa se tudi pri domačih živalih, kjer pogosteje govorimo o zamaščenosti oziroma nalaganju maščobnega tkiva. Debelost prištevamo med dedne bolezni, ki se prenašajo s prednikov na potomce, kar lahko poveča delež obolelih v naslednjih generacijah. Z nalaganjem maščobe je bilo povezanih že čez 1500 kandidatnih genov. Med najobetavnejše kandidatne gene uvrščamo tudi gen FTO (angl. Fat mass and obesity associated gene). Vpliv gena FTO na nalaganje maščobe (indeks telesne mase; BMI) je bil 6, 9 in 2 prvič opisan pri človeku v treh med seboj neodvisnih študijah . Leto kasneje 7 sta Loos in Brouchard vpliv gena FTO na BMI potrdila s študijo na trinajstih skupinah ljudi. Pri domačih živalih so vpliv gena FTO na lastnosti zamaščevanja 43 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE največkrat opisali pri prašičih, najnovejša odkritja pa so nalaganje maščob in gen FTO povezala tudi pri govedu. Povezavo med vsebnostjo intramuskularne maščobe in polimorfizmom gena FTO so pri prašičih pasme duroc potrdili 4, 5 Fontanesi in sod. . Pri prašičih križancih med kitajsko pasmo jinhua in pietrain 11 so Zhang in sod. odkrili sedem polimorfizmov v nukleotidnem zaporedju gena FTO, med katerimi so enega povezali z vsebnostjo intramuskularne maščobe. Pri petih kitajskih avtohtonih pasmah goveda so gen FTO povezali z nalaganjem 10 podkožne maščobe in maščobe v dolgi hrbtni mišici (M. longissimus dorsi) . 3 Sekvenca gena FTO je med vretenčarji zelo ohranjena , vendar pri govedu njegov vpliv na nalaganje maščobe še ni dobro raziskan. V okviru projekta MAS (na markerje oprta selekcija, ang. marker assisted selection) smo zbrali in analizirali podatke o genetski variabilnosti in vplivu gena FTO na lastnosti zamaščevanja na vzorcu populacije slovenskega lisastega goveda. Materiali in metode Živali in lastnosti: Vzorce goveda lisaste pasme smo pridobili v okviru projekta mapiranja genoma (ARRS J4-9252 MAS za pitovne in klavne lastnosti kombiniranih pasem goveda) iz nacionalnega progenega testa. Na razpolago smo imeli fenotipizirane družine polbratov in njihovih očetov iz slovenske populacije lisaste pasme goveda. Po koncu testa so bili potomci zaklani in prepeljani v šolsko klavnico in razsekvalnico, kjer je bila izvedena disekcija na mišice, kosti in kite. V analizo so bile vključene naslednje lastnosti: klavnost, indeks konformacije, masa loja, delež loja, masa ob zakolu, masa toplih polovic, razmerje med mesom in lojem in subjektivna ocena loja. V analize je bilo vključenih 31 očetov in 105 potomcev. Identifikacija in genotipizacija polimorfizmov v genu FTO. V vzorčni populaciji smo identificirali 25 SNP-jev na različnih odsekih gena FTO, med katerimi smo za genotipizacijo izbrali 12 najbolj informativnih. Genotipizacijo smo izvedli z metodami PCR-RFLP, PCR v realnem času in določanjem nukleotidnega zaporedja. Začetne oligonukleotide in TaqMan sonde (Applied Biosystems) smo izbrali s programskima orodjema BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) in Repeat masker analysis (http://www.repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker). Za iskanje ustreznih začetnih oligonukleotidov za metodo PCR-RFLP smo uporabili programsko orodje Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Za izbor restrikcijskih encimov smo uporabili programski orodji NEBcutter (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) in Webcutter 2.0 (http://bio.lundberg.gu.se/cutter2/). Genomsko DNA smo izolirali iz semena očetov in mišičnega tkiva potomcev z uporabo kompleta reagentov DNeasy Blood & Tissue (QiaGen, Nemčija). Preverjanje skladnosti rodovniških podatkov in analiza haplotipov. Za preverjanje 8 genotipiziranih podatkov in porekla smo uporabili programsko orodje ATLAS . Za analizo vezavnega neravnotežja (angl. linkage disequilibrium (LD)) 12 najbolj 0 informativnih SNP-jev smo uporabili programsko orodje Haploview 4.2 . Analizo haplotipov smo izvedli na vzorcu 31 očetov in 105 polbratov slovenske populacije lisastega goveda. 44 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 9 Statistična analiza. Za statistične analize smo uporabili paket SAS/STAT . Za analizo po posameznih SNP-jih je bil uporabljen model: yijkl= µ + Si + Gj + ok + eijkl (1) Kjer yijkl predstavlja analizirano lastnost, µ srednjo vrednost za lastnost, S i vpliv sezone (i = 1 - 7), Gj SNP ( j = 1 - 12), ok naključni vpliv očeta in eijkl ostanek. Rezultati Na različnih odsekih gena FTO smo identificirali 25 SNP-jev, med katerimi jih je bilo osem navedenih v podatkovnih zbirkah, ostale pa smo identificirali z določanjem nukleotidnega zaporedja. V vzorčni populaciji smo genotipizirali 12 najbolj informativnih SNP-jev. Poreklo smo preverjali na podlagi rezultatov genotipizacije z uporabo programskega orodja ATLAS. Primer ujemanja štirih polbratov in očeta v vseh analiziranih SNP-jih je prikazan na sliki 1. V nadaljnje analize smo vključili le podatke ujemajočih se potomcev v več kot devetih SNP-jih. Slika 1: Primer preverjanja porekla med očetom in njegovimi štirimi potomci z uporabo pogramskega orodja ATLAS (1: adenin (A), 2: citozin (C), 3: gvanin (G), 4: timin (T)). Haploview za analizo vezave dveh sosednjih markerjev uporablja algoritem EM (ang. expectation-maximization algorithm). Z metodo največjega verjetja izračuna 2 0 različne statistike (npr. vrednosti D', LOD in r ) za vse štiri kombinacije gamet . Genomska organizacija gena FTO pri govedu, 12 analiziranih polimorfizmov ter 2 odnosi med pari povezav med gametami na podlagi r in frekvence med njimi so prikazane na sliki 2. V vzorčni populaciji slovenskega lisastega goveda smo identificirali dva haplotipska bloka. Polimorfizmi “int1 T>C”, “ex2 T>C” in “int2 indel*>T” zastopajo prvi haplotipski blok, “int7 A>T” in “int7 G>A” pa drugega. Opazili smo dva popolno vezana lokusa (“ex2 T>C” in “int2 indel*>T”), ki se v 2 populaciji ne rekombinirata (r = 1). V asociacijski analizi smo zato od 12 uporabili le 11 SNP-jev (rs41870726, int1 T>C, ex2 T>C, int4 G>T, int5 A>G, rs41636320, int7 T>G, int7 A>T, int7 G>A, int8 C>T in 3'UTR C>T). 45 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 2: Organizacija in analiza haplotipov z 12-imi polimorfizmi v genu FTO pri slovenskem lisastem govedu. Vpliv polimorfizmov v genu FTO smo analizirali za osem lastnosti zamaščevanja. Statistično značilne razlike smo odkrili med deležem loja in SNP-jema “ex2 T>C” (p= 0,026), ter “int8 C>T” (p= 0,014) (preglednica 1). Oba polimorfizma kažeta naddominanco pri dedovanju, pri čemer imajo osebki, heterozigotni za SNP “ex2 T>C” višji, za SNP “int8 C>T” pa nižji delež loja v primerjavi s homozigotnimi osebki. Ocena za delež loja Standardna napaka ocene CC 11,99 0,51 CT 12,49 0,33 TT 10,86 0,62 CC 12,65 0,33 CT 11,34 0,45 TT 11,69 0,81 Genotip ex2 T>C int8 C>T Preglednica 1: Ocenjene vrednosti za delež loja za “ex2 T>C” in “int8 C>T”. 46 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Diskusija Prekomerno nalaganje maščobe je nezaželeno tako pri ljudeh, kjer predstavlja dejavnike tveganja za zdravje, kot tudi pri domačih živalih, predvsem pri prireji mesa in mleka iz ekonomskih razlogov ter zaradi vse večjega povpraševanja porabnikov po izdelkih z manj maščobe. Predhodne raziskave so potrdile povezanost debelosti s številnimi lokusi. Med najobetavnejše kandidatne gene za nalaganje maščobe uvrščamo gen FTO. Njegov vpliv na lastnosti zamaščevanja so opisali pri človeku, miši, prašiču in govedu. V naši študiji smo vpiv genetske variabilnosti gena FTO na lastnosti zamaščevanja dokazali na vzorčni populaciji slovenskega lisastega goveda. V analize smo vključili le podatke potomcev, ki se ujemajo v več kot devetih SNPjih in tako zagotovili verodostojnost analiziranih podatkov. Z uporabo programskega orodja Haploview smo za analiziranih 12 polimorfizmov v vzorčni populaciji slovenskega lisastega goveda zaznali dva haplotipska bloka. Potrdili smo razlike med deležem loja ter dvema SNP-jema: “ex2 T>C” (p= 0,026) in “int8 C>T” (p= 0,014), ki kažeta naddominanco pri dedovanju. Znani so učinki naddominance pri domačih živalih za nekatere mutacije z velikimi učinki (npr. mutacija Inverdale ali Calipyge pri ovcah). Glede na evolucijsko ohranjenost gena FTO bi bilo smiselno podobne raziskave izvesti tudi pri drugih vrstah domačih živali (drobnica, perutnina, kunci, ...). V prihodnjih raziskavah bi bilo potrebno lastnosti zamaščevanja še natančneje opredeliti in izmeriti, s čimer bi vpliv gena natančneje določili. Raziskave vpliva gena FTO na klavne lastnosti bomo nadaljevali na večjem vzorcu očetov in polbratov, z vključitvijo večjega števila novih polimorfizmov, z njimi identificirali nove bloke haplotipov in tako povečali občutljivost detekcije statistično značilnega učinka določenega genskega odseka. Rezultati študije bodo prispevali k razvijanju molekularnih označevalcev za uporabo v selekcijskih programih goveda za učinkovitejšo odbiro živali, ki imajo željen genotip za lastnosti zamaščevanja in s tem pripomogli k hitrejši uvedbi selekcije, ki temelji na genskih označevalcih. Reference 1. 2. 3. 4. Barrett J.C., Fry B., Maller J., Daly M.J. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 2005, 21: 263-265. Dina C., Meyre D., Gallina S., Durand E., Körner A., Jacobson P., Carlsson LM., Kiess W., Vatin V., Lecoeur C., Delplanque J., Vaillant E., Pattou F., Ruiz J., Weill J., LevyMarchal C., Horber F., Potoczna N., Hercberg S., Le Stunff C., Bougnères P., Kovacs P., Marre M., Balkau B., Cauchi S., Chèvre J.C., Froguel P. Variation in FTO contributes to childhood obesity and severe adult obesity. Nat. Genet. 2007, 39: 724–726. Fan B., Du Z-Q., Rothschild MF. The fat mass and obesity associated (FTO) gene is associated with intramuscular fat content and growth rate in the pig. Animal biotechnology 2009, 20, 58-70. Fontanesi L., Scotti E., Buttazzoni L., Davoli R., Russo V.. The porcine fat mass and obesity associated (FTO) gene is associated with fat deposition in Italian Duroc pigs. Animal Genetics 2009, 40(1): 90-93. 47 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Fontanesi L., Scotti E., Buttazzoni L., Dall’Olio S., Bagnato A., Fiego D.P.L., Davoli R., Russo V.. Confirmed association between a single nucleotide polymorphism in the FTO gene and obesity-related traits in heavy pigs. Molecular Biology Reports 2010, 37(1): 461-466. 6. Frayling TM., Timpson NJ., Weedon MN., Zeggini E., Freathy RM., Lindgren CM., Perry JRB., Elliot KS., Lango H., Rayner NW., Shields B., Harries LW., Barret JC., Ellard S.,Groves CJ., Knight B., Patch AM., Ness AR., Ebrahim S., Lawlor DA., Ring SM., BenShlomo Y., Jarvelin MR., Sovio U., Bennett AJ., Melzer D., Ferrucci L., Loos RJF., BarrosoGD., Wareham NJ., Karpe F., Owen KR., Cardon LR., Walker M., Hitman GA., PalmerCNA., Doney ASF., Morris AD., Smith GD., The wellcome trust case control consortium,Hattersley AT, McCarthy MI. A common variant in the FTO gene is associated with body mass index and predisposes to childhood and adult obesity. Science 2007, 316: 889-894. 7. Loos R.J.F. and Bouchard C. FTO: the first gene contributing to common forms of human obesity. Obesity Reviews 2008, 9: 246–250. 8. Pérez-Enciso E., García-Bernal P.G., Pérez-Enciso M. Atlas: A Java-Based Tool for Managing Genotypes. Journal of Heredity 2005, 96(5): 623-625. 9. SAS Inst. Inc. The SAS System for Windows, Release 9.1. Cary, NC, SAS Institute 2002. Scureti A., Sanna S., Chen W-M., Uda M., Albai G., Strait J., Najjar S., Nagaraja R., Orru M., Usala G., Dei M., Ali S., Maschio A., Busonero F., Mulas A., Ehret GB., Fink AA., Weder AB., Cooper RS., Galan P., Chakravarti A., Schlessinger D., Cao A., Lakatta E., Abecasis GR. Genome-wide association scan shows genetic variants in the FTO gene are associated with obesity-related traits. PloS Genet 2007, 3: e115. 10. Wei S., Zan L., Ujan J.A., Wang H., Yang Y., Adoligbe C. Novel polymorphism of the bovine fat mass and obesity-associated (FTO) gene are related to backfat thickness and longissimus muscle area in five Chinese native cattle breeds. African Journal of Biotechnology 2011. 10(15): 2820-2824. 11. Zhang L.F., Miao X.T., Hua X.C., Jiang X.L., Lu Y.P., Xu N.Y. Polymorphism in 5' regulatory region of the porcine fat mass and obesity associated (FTO) gene is associated with intramuscular fat content in a Jinhua x Pietrain F2 reference population. Journal of Animal and Veterinary Advances 2009, 8(11): 2329–2334 5. Abstract. The high incidence of obesity through generations increased the efforts of scientists to discover the genes and mechanisms associated with this disease. For economic reasons and due to growing consumer's demand for products with lower fat content, is excessive fat deposition also undesirable in meat and milk production. The discovery of genes associated with fat deposition is the key to better treatment and control of such disorders both in humans and in animals. Genetic variants in recently identified fat mass and obesity associated (FTO) gene have been shown to have a relatively large effect on human obesity and some carcass traits in model organisms, pigs and more recently also in cattle. The objective of this preliminary study was to identify SNP markers within the FTO gene for the evaluation of pedigree data accuracy and determination of haplotypes in paternal half-sib families of Slovenian Simmental cattle. Out of 25 polymorphic SNPs identified 12 most informative SNPs were used for genotyping 31 sires and 105 half-sib progeny. The ATLAS program was used for paternity testing. Haplotype analysis revealed two haplotype blocks. The effect of SNPs “ex2 T>C”, “int2 indel*>T” and int8 C>T was significant on carcass fat percentage. Results of this study will contribute to the development of molecular markers in cattle selection programs allowing more effective, marker assisted selection for animals with desired genotype for fatness. Key words: cattle, fatness, FTO, SNP, haplotype analysis. 48 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI ZNANSTVENI PRISPEVEK Povišana ekspresija genov IL12B pri otrocih z astmo se zniža z uporabo zdravila montelukast Expression of IL12B genes is increased in children with asthma and is reduced after therapy with montelukast Petra Perin1,2, Katja Repnik2, Carina Pinto Kozmus2, Vojko Berce3, Maja Kavalar3, Uroš Potočnik1,2 1 Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Smetanova ul. 17, 2000 Maribor, [email protected] 2 Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta,Slomškov trg 15, 2000 Maribor, uros.potoč[email protected] 3 Univerzitetni klinični center Maribor, Ljubljanska ul. 6, 2000 Maribor Izvleček. Astma je najpogostejša resna kronična bolezen otrok. Dosedanje ugotovitve kažejo, da ima pomembno vlogo v razvoju astme kromosomska regija 5q31-33, kjer se nahajajo geni za številne citokine, med njimi tudi gena IL13 in IL12B. Mnoge študije so že analizirale vlogo IL13 in IL12B pri nastanku astme, vendar si rezultati različnih študij med seboj nasprotujejo. Nejasna je tudi njuna vloga pri izražanju bolezni in pri odzivu na terapijo. Namen naše študije je ugotoviti vlogo polimorfizmov posameznega nukleotida (ang. SNP) v genih IL13, IL12B in IL23R v patogenezi astme pri slovenskih otrocih z astmo ter ugotoviti, kako polimorfizmi v omenjenih genih vplivajo na odziv na terapijo s protilevkotrienskimi zdravili in inhalacijskimi kortikosteroidi. V raziskavo smo zajeli 288 otrok z astmo in 186 zdravih posameznikov. Genotipizacijo smo izvedli s tehniko verižne reakcije s polimerazo in polimorfizma dolžin restrikcijskih fragmentov (PCR-RFLP). S TaqMan testom in uporabo PCR v realnem času smo izmerili gensko ekspresijo. Podatke smo statistično analizirali s pomočjo programa SPSS 17.0. Kot prvi smo povezali polimorfizem rs1295686 v genu IL13 z neatopijsko obliko astme (p=0,016), nismo pa potrdili povezave tudi z atopijsko astmo. Ugotovili smo značilno višjo ekspresijo gena IL12B pri bolnikih z astmo v primerjavi s kontrolno skupino (p<0,001). Pri astmatikih se ekspresija gena IL12B zniža po terapiji s proti-levkotrienskim zdravilom montelukastom (p=0,015). Z eQTL analizo smo ugotovili, da je ekspresija IL12B značilno višja pri nosilcih vsaj enega alela G za SNP rs6887695, ki so ga predhodne študije povezale z imunskimi boleznimi kot sta Crohnova bolezen in psoriaza. V naši študiji smo kot prvi ugotovili tudi vpliv alela G za SNP rs6887695 na stopnjo obstrukcije dihalnih poti pri astmi (p=0,006). Potrdili smo že v predhodnih študijah ugotovljeno povezavo IL13 s povišano koncentracijo IgE (p=0,013). Nadalje smo kot prvi ugotovili vpliv IL23R na težo astme. Na ekspresijo gena IL23R vplivajo proti-levkotrienska zdravila, ekspresija katerega se po terapiji značilno zviša (p=0,001). Rezultati naše študije kažejo, da imajo geni, ki kodirajo interlevkina IL12B in IL13 ter receptor za IL23 pomembno vlogo v patogenezi astme. Predvsem ugotovitve o značilno višji ekspresiji gena IL12B pri astmatikih in delovanju proti-levkotrienskih zdravil na znižanje le tega pri bolnikih z astmo, bi lahko v bodoče služile kot diagnostični označevalec, ki bi pripomogel tudi k ustreznejši izbiri terapije. Ključne besede: astma, interlevkini, asociacijska študija, genska ekspresija. 49 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Uvod Astma je najpogostejša resna kronična bolezen dihal, za katero zboli kar 10% otrok 1, 2 do 18. leta starosti . Gre za kompleksno, poligensko bolezen, katere razvoja ni 3, 4 mogoče pojasniti z enim samim mehanizmom ali genom . Asociacijske študije pri astmi se v veliki meri osredotočajo na iskanje genov, ki kodirajo proteine 5, 6 imunskega odziva in alergijskega vnetja . Citokinski genski klaster, lociran na 5q31-33 regiji, vsebuje številne potencialne kandidatne gene za astmo, med njimi 7, 8 gen za interlevkin (IL)-12B in gen za IL-13 . Rezultati različnih študij kažejo na 8-10 povezavo te regije s hiperreaktivnostjo dihal in s težo astme . IL12B kodira pomemben citokin, oziroma podenoto imunomodulatornega citokina IL-12, ki spodbuja nastanek celic Th1 in zavira delovanje Th2 citokinov, ki so povezani z astmo. IL-12 ima prav tako pomembno vlogo v primarnem imunskem 11, 12 odzivu na viruse, ki so lahko sprožilci astmatičnega napada . Rezultati različnih neodvisnih študij, ki so preučevali vlogo gena IL12B pri astmi, so si med sabo 4, 12, 13 nasprotujoči . IL13 je eden izmed najpogosteje preučevanih kandidatnih genov za astmo. Kodira citokin IL-13, ki ga izločajo celice Th2 in ima pomembno vlogo pri razvoju 14 alergijskega vnetja dihalnih poti . Spodbuja diferenciacijo B-celic in nastajanje 15 imunoglobulinov (Ig)E . Večina študij, je potrdila pomemben vpliv tega gena pri pojavnosti in teži astme, med njimi tudi asociacijska študija na celotnem genomu 16 17 (GWA) . Nekaj študij je ugotovilo tudi povezavo s povišano koncentracijo IgE . Zelo malo pa je študij, ki bi vpliv IL13 analizirale ločeno v različnih podskupinah astmatikov, kot sta atopijska in neatopijska oblika. Gen IL23R je lociran na 1p31 kromosomu in kodira receptor za IL-23, ključno 18 komponento imunoregulatorne signalne poti, v katero je vključen tudi IL-12 . Mnoge študije so identificirale IL23R kot dejavnik tveganja za razvoj kroničnih 19, 20 imunskih bolezni, ki so sorodne astmi . Njegova vloga v patogenezi astme še ni bila preučevana. Mnogo polimorfizmov posameznega nukleotida (ang SNP-ov) v omenjenih genih, ki so jih predhodne študije povezale bodisi z astmo, bodisi s katero izmed sorodnih bolezni, se nahaja v nekodirajočih regijah, zato so mehanizmi njihovega vpliva še nejasni. Korak naprej k razlagi njihovega delovanja in vpliva na razvoj ter potek bolezni predstavljajo študije genske ekspresije. Prav tako imajo geni, vpleteni v patogenezo astme, lahko tudi pomembno vlogo pri odzivu posameznika na proti21 astmatično terapijo . Za omenjene gene zaenkrat obstaja le malo ekspresijskih študij. Doslej tudi še niso analizirali vpliva proti-astmatičnih zdravil na ekspresijo teh genov. Poznavanje značilnih sprememb v ekspresiji genov bi lahko omogočilo lažje diagnosticiranje bolezni, poznavanje vpliva zdravil na ekspresijo pa tudi lažje odločanje za izbor terapije. S pomočjo asociacijske analize izbranih SNP-ov v nekodirajočih delih genov IL12B, IL13 in IL23R, predhodno povezanih s kroničnimi imunskimi boleznimi, je bil cilj naše študije ugotoviti, kako ti geni vplivajo na razvoj astme pri slovenskih otrocih. Z analizo SNP-ov v korelaciji s kliničnimi parametri, smo želeli ugotoviti vlogo izbranih genov pri poteku in lastnostih bolezni. Preverili smo tudi ali imajo SNP-ji v nekodirajočih regijah, ki so bili v naši ali v prejšnjih študijah na kakršenkoli način povezani z astmo, regulatorno vlogo pri genski ekspresiji. S primerjavo 50 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE ekspresije med bolniki in zdravimi posamezniki smo preverili ali pride pri astmi do spremenjenega izražanja genov. Preučili smo tudi, kako na ekspresijo genov IL12B, IL13 in IL23R vplivajo proti-levkotrienska zdravila (npr. montelukast) in inhalacijski kortikosteroidi, ki se pri zdravljenju astme najpogosteje uporabljajo in za katere je značilno, da je odziv bolnikov pri prejemanju le teh heterogen. Materiali in metode V raziskavo je bilo vključenih 288 otrok z astmo, od tega 189 z atopijsko, 84 z neatopijsko obliko bolezni, pri 15 pacientih pa oblika bolezni ni bila določena. Otrokom je bila diagnoza astme v skladu z merili AST (American Thoraric Society) 22, 23 postavljena v okviru pulmološke ambulante otroškega oddelka Splošne bolnišnice v Murski Soboti oz. v Univerzitetnim kliničnem centru Maribor. Kot kontrolno skupino smo uporabili krvne vzorce 186 zdravih oseb brez astme, alergije, bolezni dihal in drugih kroničnih vnetnih bolezni. V omenjenih ambulantah so preiskovance na podlagi alergoloških testov opredelili kot atopike ali neatopike. Otrokom je bila izmerjena pljučna funkcija s spirometrom Vitalograph 2150 (Compact, Buckingham, Velika Britanija). Pri spirometriji smo izmerili forsirano vitalno kapaciteto (FVC) in volumen v prvi sekundi forsiranega izdiha (FEV1), katerega vrednost smo za namene statistične analize izrazili kot 19 odstotek predvidene vrednosti glede na starost, spol in višino . Hiperaktivnost dihal smo analizirali z bronhoprovokacijskim testom z metaholinom in izračunali kumulativni odmerek metaholina (PC20), pri katerem FEV1 pade za 20% glede na izhodišče. Večini bolnikov je bila izmerjena tudi vsebnost dušikovega oksida v izdihanem zraku (FENO). Vsem preiskovancem je bilo odvzeto 12 ml periferne venske krvi za genetsko analizo ter določitev celokupnih imunoglobulinov razreda E (Cel IgE). Po opravljenih preiskavah je bilo 193 otrok z astmo zdravljenih z inhalacijskim kortikosteroidom flutikazon propionatom, 86 pa s proti-levkotrienskim zdravilom montelukastom. Odziv na proti-astmatično terapijo je bil ocenjen s pomočjo razlike med vrednostjo FEV1 pred terapijo in 4 tedne po terapiji (dFEV1). 4 tedne po uvedbi terapije je bila kri za genetsko analizo ponovno odvzeta 103 otrokom. Iz krvi bolnikov in zdravih posameznikov smo s pomočjo Ficoll-Paque Plus (GE Healtcare) pridobili limfocite, iz katerih smo s pomočjo TRI reagenta (Sigma) izolirali DNA in RNA in jo raztopili v vodi v končni koncentraciji 50 µg/ml. S pomočjo spletne aplikacije Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) smo načrtovali začetne oligonukleotide ter s programom GenneRunner izbrali ustrezne restrikcijske encime. Genotipizacijo smo izvedli s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (Polymerase chain reaction – PCR) in s pomočjo metode polimorfizma dolžin restrikcijskih fragmentov (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm – RFLP) in sicer za vse bolnike in zdrave posameznike za SNP-je, navedene v preglednici 1. PCR smo izvedli po naslednjih pogojih: 95°C 5 min, 35 ciklov po 95°C 30 s, (55-64)°C 30 s, 72°C 30 s. PCR produkte smo inkubirali z ustreznimi restrikcijskimi encimi, navedenimi v preglednici 1, pri temperaturi 37 °C čez noč ter produkte restrikcije detektirali na 2 % agaroznem gelu. Optimalne temperature 51 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE pripenjanja začetnih oligonukleotidov, ustrezne restrikcijske encime ter velikost produkta pred in po restrikciji prikazuje preglednica 1. rs število Začetni primer Tm PCR produkt Restrikcijski Produkt po Končni primer (°C) (bp) encim restrikciji (bp) 55 240 Hph I 64 215 Eco72 I 55 259 Dde I TTTCAGCGTGAGACCATTCA rs6887695 CCCCTAGGTCACAAGCGTAG CCACCTCGATTTTGGTGTCT rs1295686 ACTCCTACCTGGGCCTCAAT TCTGCCAATTCCCTAAAC rs7517847 AAGTAGGTGTGGATTGCC CC: 207+38 GG: 161+46+38 AA: 215 GG: 150+65 GG: 259 TT: 91+168 Preglednica 1: Izbrani SNP-i za genotipizacijo, sekvence začetnih oligonukleotidov, pogoji za PCR-RFLP reakcijo ter velikost fragmentov po izvedenem testu. Za merjenje genske ekspresije smo najprej izvedli reverzno transkripcijo RNA s High Capacity Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Z dobljeno cDNK smo izvedli reakcijo kvantitativnega PCR (qPCR) na aparaturi LC480 (Roche), pri čemer smo uporabili TaqMan test (Applied Biosystems) za detekcijo izbranih genov ter LC480 Probes Master (Roche). Pogoji za PCR reakcijo so bili naslednji: začetna denaturacija 95°C 10 min, čemur je sledilo 55 ciklov po 95°C 15 s, 60°C 60 s in 72°C 1 s. Kot referenčni gen smo uporabili TaqMan test za gen B2M (Applied Biosystems). Ekspresijo genov IL12B, IL13 in IL23R smo izmerili v vzorcih krvnih limfocitov 91 zdravih posameznikov in 164 bolnikov z astmo, med katerimi smo za 103 bolnike še enkrat analizirali ekspresijo 4 tedne po uvedbi terapije (39 izmed njih jih je prejemalo terapijo s proti-levkotrieni, 64 pa z inhalacijskimi kortikosteroidi). Nivo -∆∆Cp ekspresije smo izračunali po metodi 2 , kjer smo kot kalibrator uporabili povprečne vrednosti ∆Cp celotnega vzorca, ki smo ga primerjali pri posameznem testu. Rezultate smo statistično ovrednotili s pomočjo programskega paketa SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). S testom hi-kvadrat in Fischerjevim natančnim testom smo izračunali razlike med frekvencami alelov in genotipov med astmatiki in kontrolno skupino. Za izračun vpliva alelov in genotipov na posamezne klinične in laboratorijske parametre ter za analizo ekspresije smo uporabili neparametrični Mann-Whitney test. Za ovrednotenje vpliva terapije na spremembo ekspresije smo uporabili tudi neparametrični Wilcoxon-ov test za parna vzorca. Za statistično signifikantno smo smatrali povezavo, pri kateri je bila vrednost p<0,05. Rezultati Asociacijska analiza V naši študiji smo ugotovili povezavo SNP-a rs1295686 z neatopijsko obliko astme pri slovenskih otrocih. V skupini neatopijskih astmatikov je značilno nižja frekvenca homozigotov za alel G (43,2%) v primerjavi s kontrolno skupino (59,6%, p = 0.016, OR = 0.514, 95% CI = 0.302 - 0.877; Preglednica 2). 52 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Frekvenca alela G 72,0 % (p = 0,189) 67,9 % (p = 0,053) 74,2 % (p = 0,540) 76,1 % Pod-skupina Vsi astmatiki Ne-atopijski astmatiki Atopijski astmatiki Kontrolna skupina Frekvenca genotipa GG 50,5 % (p = 0,066) 43,2 % (p = 0,016) 54,4 % (p = 0,338) 59,6 % Preglednica 2: Frekvence alela G in genotipa GG za SNP rs1295986 na genu IL13 in statistične značilnosti posameznih skupin astmatikov v primerjavi s kontrolno skupino; p vrednost je izračunana s χ2-testom. Povezava med polimorfizmi in kliničnimi parametri V naši študiji smo analizirali vpliv alelov in genotipov izbranih SNP-jev na klinične parametre. Statistično analizo smo izvedli po dominantnem in recesivnem modelu. Ugotovili smo pomembno vlogo genov IL12B, IL13 in IL23R pri vplivu na klinične značilnosti bolnikov z astmo. Rezultati so povzeti v Preglednici 3. Gen (SNP) IL12B (rs6887695) CC+CG / GG IL13 (rs1295686) AA+AG / GG IL23R (rs7517847) CC / CT+TT Podskupina FEV1 (%) FEV1/FVC FeNO (ppb) PC20 (mg/ml) Cel IgE (U/ml) Vsi astmatiki 0,473 0,028 0,201 0,315 0,904 Atopiki 0,857 0,006 0,189 0,442 0,952 Ne-atopiki 0,153 0,668 0,305 0,240 0,736 Vsi astmatiki 0,840 0,941 0,092 0,693 0,013 Atopiki 0,466 0,734 0,201 0,261 0,720 Ne-atopiki 0,373 0,365 0,098 0,097 0,036 Vsi astmatiki 0,012 0,720 0,408 0,052 0,847 Atopiki 0,024 0,785 0,848 0,055 0,747 Ne-atopiki 0,061 0,640 0,160 0,212 0,453 Preglednica 3: Povezava med SNP-i rs6887695, rs1295686 in rs7517847 ter kliničnimi parametri; FEV1 = volumen v prvi sekundi forsiranega izdiha; FVC = forsirana vitalna pljučna kapaciteta; FEV1/FVC = merilo obstrukcije; PC20 = koncentracija metaholina, ki povzroči 20% padec FEV1; Cel IgE = koncentracija celokupnih imunoglobulinov razreda E v krvnem serumu; eozinofilija = koncentracija eozinofilcev v krvi. Vrednosti v tabeli = pvrednosti izračunane z neparametrčnim Mann-Withney testom. Za SNP rs6887695 smo ugotovili, da imajo astmatiki z genotipom GG nižje razmerje FEV1/FVC (87, interkvartilni rang=11) v primerjavi s heterozigoti in homozigoti za alel C (90, interkvartilni rang=9; p=0,028) in s tem bolj izraženo 53 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE obstrukcijo dihalnih poti. V skupini bolnikov z atopijsko astmo je bila ta povezava statistično še bolj značilna (p=0,006), nismo pa je potrdili pri neatopijskih astmatikih. Nadalje smo ugotovili statistično značilno povezavo genotipa GG za SNP rs1295686 na genu IL13 s povišano koncentracijo Cel IgE (473 U/ml, int.rang=481) v primerjavi zbolniki z genotipom AA ali AG (256 U/ml, int.rang=542; p=0,013). Zanimivo je, da smo to povezavo potrdili zgolj pri neatopijskih astmatikih, kljub temu, da naj bi bila koncentracija IgE merilo atopije. SNP rs7517847 na genu IL23R oz. njegov alel T pa je povezan z zmanjšano pljučno funkcijo oz. težjo astmo. Za astmatike z vsaj enim alelom T je vrednost FEV1 značilno nižja (89%, int.rang=18) v primerjavi s homozigoti za alel G (93%, int.rang=17; p=0,012). Noben izmed izbranih SNP-jev ne vpliva na odziv na terapijo s protilevkotrienskim zdravilom montelukast ali z inhalacijskimi kortikosteroidi. Ekspresijska analiza Z analizo genske ekspresije smo ugotovili značilno razliko v ekspresiji gena IL12B med astmatiki in kontrolno skupino. Bolniki z astmo imajo povišano ekspresijo (2 ∆∆Cp -∆∆Cp =1,48, int.rang=1,98) v primerjavi z zdravimi posamezniki (2 =0,56, int.rang=1,15; p=1,88E-05), kot je prikazano na Sliki 1. Pri ugotavljanju vpliva genotipa SNP-a rs6887695 na ekspresijo pa smo ugotovili, da se IL12B močneje izraža pri osebah, ki so nosilci vsaj enega izmed alelov G (p=0,035). Nadalje smo ugotovili značilno znižanje ekspresije gena IL12B pri astmatikih po 4 tednih terapije s montelukastom. Ekspresija IL12B se zniža pri 73% zdravljenih -∆∆Cp bolnikov in sicer je mediana nivoja ekspresije pred terapijo znašala 2 =3,03, int.rang=6,19, po terapiji pa je bila mediana nivoja ekspresije istih oseb značilno -∆∆Cp nižja (2 =0,47 int.rang=1,75; p=0,015), kar prikazuje Slika 2. Ugotovili smo tudi vpliv proti-astmatične terapije na ekspresijo gena IL23R. Ta se po uporabi proti-levkotrienskih zdravil značilno zviša in sicer je mediana nivoja -∆∆Cp ekspresije bolnikov pred terapijo z montelukastom 2 =0,47, int.rang=0,48, 4 -∆∆Cp tedne po uvedbi terapije pa 2 =2,26, int.rang=6,55 (p=0,001). Slika 2: Ekspresija gena IL12B pred in 4 tedne po uvedbi terapije s proti-levkotrienskim zdravilom mononukleast. Slika 1: Ekspresija gena IL12B pri astmatikih in pri kontrolni skupini. 54 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Diskusija Rezultati naše študije kažejo, da ima gen IL12B, ki kodira podenoto citokina IL12, pomembno vlogo v patogenezi astme, kar se kaže v značilno povišani ekspresiji pri bolnikih z astmo v primerjavi s kontrolno skupino. Kot prvi smo ugotovili, da se ekspresija gena IL12B zniža z uporabo proti-levkotrienskih zdravil, ki sicer delujejo kot inhibitorji encima 5-lipooksigenaze ali antagonisti 24 levkotrienskih receptorjev . Vendar pa mehanizmi delovanja proti-levkotrienskih zdravil niso v celoti pojasnjeni, kakor tudi ne njihov vpliv na ostale komponente levkotrienske signalne poti. Zanimivo je, da uporaba proti-astmatičnih zdravil, ki znižajo ekspresijo gena IL12B, hkrati poviša ekspresijo gena za receptor citokina IL-23, kljub temu, da se ekspresija gena IL23R pri astmatikih ne razlikuje od ekspresije gena IL23R pri kontrolni skupini. Ker sta IL12B in IL23R vpletena v isto signalno pot je sicer pričakovati, da se sprememba v količini ene komponente odraža tudi pri preostalih komponentah signalne poti. V bodoče bi bilo tako dobro načrtovati študije, s katerimi bi ugotovili, kako se zvišanje prvotno normalne ekspresije IL23R po terapiji s proti-levkotrieni fenotipsko odraža in ali je morda povezano s kakšnimi stranskimi učinki. Predhodne študije so ugotovile, da na povišano ekspresijo gena IL12B vpliva 13, 25 polimorfizem CTCTAA>GC v promotorju tega gena . V naši študiji smo ugotovili, da je ekspresija odvisna tudi od SNP-a rs6887695 in sicer, da imajo posamezniki z vsaj enim alelom G značilno višjo ekspresijo v primerjavi s homozigoti za alel C. Alel G so mnoge študije z visoko statistično značilnostjo povezale z večjim tveganjem za kronične avtoimunske bolezni kot sta Crohnova 20, 26 bolezen in psoriaza . Mi vpliva SNP-a rs6887895 na pojavnost astme nismo našli, vendar pa smo ugotovili povezavo alela G z bolj izraženo obstrukcijo dihalnih poti. Kot prvi smo ugotovili, da ima SNP rs7517847 na genu IL23R, ki sicer na samo pojavnost astme ne vpliva, pomembno vlogo pri njeni resnosti in sicer imajo bolniki z vsaj enim alelom T močneje znižano pljučno funkcijo in s tem težjo astmo. G varianta, ki je bila identificirana kot zaščitni alel pred Crohnovo boleznijo 27 deluje tudi kot zaščitni alel za razvoj težje oblike bolezni znotraj skupine astmatikov. V naši študiji smo ugotovili značilno nižjo frekvenco homozigotov za alel G za SNP rs1295685 na genu IL13 pri bolnikih z neatopijsko obliko astme. Frekvenca homozigotov GG je tudi pri atopijskih astmatikih nižja kot pri zdravih kontrolah, vendar razlika ni dovolj velika, da bi jo opredelili kot statistično značilno. Ti rezultati kažejo, da deluje alel A SNP-ja rs1295686 kot dejavnik tveganja za pojav neatopijske astme v populaciji slovenskih otrok. Mnoge študije so predhodno že 28-30 povezale gen IL13 in astmo . Prvi med njimi je bil van Pouw Kraan s 28 sodelavci , ki je ugotovil vpliv IL13 pri nastanku atopijske astme. Vendar pa ni analiziral SNP-a, ki smo ga preučevali v naši študiji. SNP rs1295686 je z astmo 16 povezala ameriška GWA študija , povezavo pa je ovrgel Sadefhnejad s 31 sodelavci . Glede na naše rezultate in rezultate predhodnih študij bi zato lahko sklepali, da ima IL13 različno vlogo pri atopijski in neatopijski obliki bolezni in zato tudi različni SNP-ji tega gena, ki med sabo niso v vezavnem neravnovesju, 55 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 31 različno vplivajo. Sklepamo lahko, da Sadeghnejad v svoji študiji ni našel povezave z astmo za SNP rs1295686, ker je proučeval astmatike kot celotno skupino, preiskovani polimorfizem pa ima, kot kaže naša študija, pomembno vlogo samo pri neatopijski astmi. To smo potrdili tudi z analizo kliničnih parametrov, kjer smo potrdili predhodno ugotovljen vpliv gena IL13 na 17, 32 koncentracijo Cel IgE . Vendar pa pri ločeni analizi vpliva SNP-a rs1295686 na Cel IgE v obeh podskupinah, v skupini atopijskih astmatikov nismo ugotovili statistično značilne razlike med atopiki z različnimi genotipi. Povezavo smo potrdili le v podskupini neatopikov, kar je zanimivo, saj je Cel IgE eden izmed pokazateljev atopije. Rezultati naše študije kažejo na to, da imajo geni IL12B, IL13 in IL23R pomembno vlogo bodisi v razvoju, poteku ali zdravljenju astme. Za jasnejšo sliko bi morali študijo še nadgraditi z analizo večjega števila genov, ki sodelujejo v signalnih poteh povezanih predvsem z IL12B in IL23R, rezultate o vplivu terapije na ekspresijo pa bi bilo potrebno potrditi na večjem številu vzorcev. Vseeno lahko rečemo, da naši rezultati prispevajo k razumevanju patogeneze astme in da bi v bodoče omenjeni geni lahko služili kot diagnostični in prognostični označevalci, ki bi pripomogli k razvoju individualiziranega zdravljenja astme. Naša študija ekspresije nakazuje tudi na možnost identifikacije novih in bolj specifičnih terapevtskih tarč pri zdravljenju astme. Reference 1. Castro,M., Chaplin,D.D., Walter,M.J., & Holtzman,M.J. Could asthma be worsened by stimulating the T-helper type 1 immune response? Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 22, 143146 (2000). 2. Berce,V., Repnik,K., & Potocnik,U. Association of CCR5-delta32 mutation with reduced risk of nonatopic asthma in Slovenian children. J. Asthma 45, 780-784 (2008). 3. Berce,V. & Potocnik,U. Association of Q551R polymorphism in the interleukin 4 receptor gene with nonatopic asthma in Slovenian children. Wien. Klin. Wochenschr. 122 Suppl 2, 11-18 (2010). 4. Rogers,A.J. et al. Assessing the reproducibility of asthma candidate gene associations, using genome-wide data. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 1084-1090 (2009). 5. Hoffjan,S. & Ober,C. Present status on the genetic studies of asthma. Curr. Opin. Immunol. 14, 709-717 (2002). 6. Peddle,L. & Rahman,P. Genetic epidemiology of complex phenotypes. Methods Mol. Biol. 473, 187-201 (2009). 7. Kabesch,M. et al. Polymorphisms in eosinophil pathway genes, asthma and atopy. Allergy 62, 423-428 (2007). 8. Yokouchi,Y. et al. Significant evidence for linkage of mite-sensitive childhood asthma to chromosome 5q31-q33 near the interleukin 12 B locus by a genome-wide search in Japanese families. Genomics 66, 152-160 (2000). 9. Noguchi,E. et al. Evidence for linkage between asthma/atopy in childhood and chromosome 5q31-q33 in a Japanese population. Am. J. Respir. Crit Care Med. 156, 1390-1393 (1997). 10. Palmer,L.J. et al. Linkage of chromosome 5q and 11q gene markers to asthma-associated quantitative traits in Australian children. Am. J. Respir. Crit Care Med. 158, 1825-1830 (1998). 56 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 11. Tug,E., Ozbey,U., Tug,T., & Yuce,H. Relationship between the IL-12B promoter polymorphism and allergic rhinitis, familial asthma, serum total IgE, and eosinophil level in asthma patients. J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 19, 21-26 (2009). 12. Randolph,A.G. et al. The IL12B gene is associated with asthma. Am. J. Hum. Genet. 75, 709-715 (2004). 13. Morahan,G. et al. Association of IL12B promoter polymorphism with severity of atopic and non-atopic asthma in children. Lancet 360, 455-459 (2002). 14. Palikhe,N.S. et al. IL-13 Gene Polymorphisms are Associated With Rhinosinusitis and Eosinophilic Inflammation in Aspirin Intolerant Asthma. Allergy Asthma Immunol. Res. 2, 134-140 (2010). 15. Cocks,B.G., de Waal,M.R., Galizzi,J.P., de Vries,J.E., & Aversa,G. IL-13 induces proliferation and differentiation of human B cells activated by the CD40 ligand. Int. Immunol. 5, 657-663 (1993). 16. Li,X. et al. Genome-wide association study of asthma identifies RAD50-IL13 and HLADR/DQ regions. J. Allergy Clin. Immunol. 125, 328-335 (2010). 17. Leung,T.F. et al. A polymorphism in the coding region of interleukin-13 gene is associated with atopy but not asthma in Chinese children. Clin. Exp. Allergy 31, 1515-1521 (2001). 18. Gazouli,M. et al. NOD2/CARD15, ATG16L1 and IL23R gene polymorphisms and childhood-onset of Crohn's disease. World J. Gastroenterol. 16, 1753-1758 (2010). 19. Lacher,M. et al. Association of the interleukin-23 receptor gene variant rs11209026 with Crohn's disease in German children. Acta Paediatr. 99, 727-733 (2010). 20. Nair,R.P. et al. Polymorphisms of the IL12B and IL23R genes are associated with psoriasis. J. Invest Dermatol. 128, 1653-1661 (2008). 21. Berce,V. & Potocnik,U. Functional polymorphism in CTLA4 gene influences the response to therapy with inhaled corticosteroids in Slovenian children with atopic asthma. Biomarkers 15, 158-166 (2010). 22. Guidelines for the diagnosis and management of asthma. National Heart, Lung, and Blood Institute. National Asthma Education Program. Expert Panel Report. J. Allergy Clin. Immunol. 88, 425-534 (1991). 23. Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and asthma. This official statement of the American Thoracic Society was adopted by the ATS Board of Directors, November 1986. Am. Rev. Respir. Dis. 136, 225244 (1987). 24. Lima,J.J., Blake,K.V., Tantisira,K.G., & Weiss,S.T. Pharmacogenetics of asthma. Curr. Opin. Pulm. Med. 15, 57-62 (2009). 25. Hirota,T. et al. Functional haplotypes of IL-12B are associated with childhood atopic asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 789-795 (2005). 26. Marquez,A. et al. IL23R and IL12B polymorphisms in Spanish IBD patients: no evidence of interaction. Inflamm. Bowel. Dis. 14, 1192-1196 (2008). 27. Ferguson,L.R. et al. IL23R and IL12B SNPs and Haplotypes Strongly Associate with Crohn's Disease Risk in a New Zealand Population. Gastroenterol. Res. Pract. 2010, 539461 (2010). 28. van der Pouw Kraan TC et al. An IL-13 promoter polymorphism associated with increased risk of allergic asthma. Genes Immun. 1, 61-65 (1999). 29. van der Pouw Kraan TC et al. Chronic obstructive pulmonary disease is associated with the -1055 IL-13 promoter polymorphism. Genes Immun. 3, 436-439 (2002). 30. Heinzmann,A. et al. Joint influences of Acidic-Mammalian-Chitinase with Interleukin-4 and Toll-like receptor-10 with Interleukin-13 in the genetics of asthma. Pediatr. Allergy Immunol. 21, e679-e686 (2010). 31. Sadeghnejad,A. et al. IL13 gene polymorphisms modify the effect of exposure to tobacco smoke on persistent wheeze and asthma in childhood, a longitudinal study. Respir. Res. 9, 2 (2008). 57 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 32. Wu,B., Liu,J.L., Chen,M., Deng,R.Q., & Wu,D. [Correlation of interleukin-13 gene 1112c/T polymorphism with asthma and total plasma IgE levels]. Zhonghua Jie. He. He. Hu Xi. Za Zhi. 27, 668-671 (2004). Abstract. Asthma is the most common serious chronic disease in children. Recently, polymorphisms in the cytokine gene cluster on 5q31-33 region, that includes genes IL12B and IL13, , was associated with asthma development. However, independent follow-up studies aiming to confirm association of single nucleotide polymorphisms (SNPs)in IL12B and IL13 genes with asthma have been inconclusive. Morovere, the role of SNPs in IL12B and IL13 genes in asthma behavior and response to therapy is poorly characterized. The aim of our study is to analyze the role of IL13, IL12B and IL23R genes in asthma pathogenesis, in Slovenian children with asthma, and determinate their role in response to therapy with antileukotriene drugs and inhaled corticosteroids. In this study, we have included 288 children with asthma and 186 healthy individuals. Genotyping was performed by PCR-RFLP technique. Gene expression was measured by TaqMan assay using real-time PCR. The data were statistically analyzed with SPSS 17.0 program package. We found an association of IL13 with non-atopic asthma (p=0,016) but not with atopic asthma phenotype. In addition, we were the first to found the significantly higher expression of IL12B in patients with asthma compared to the control group (p <0,001).The expression of IL12B was reduced in asthmatics after treatment with anti-leukotriene drug montelukast (p = 0,015). In eQTL analysis, we found that the expression of IL12B is significantly higher in carriers of at least one allele of SNP rs6887695 G, which was in preliminary studies identified as a risk factor for chronic immunemediated diseases such as Crohn's disease and psoriasis. In our study, we were the first to found an impact of allele G on airway obstruction in asthma (p = 0,006). In addition, we have confirmed an association of IL13 gene and increased IgE level (p = 0,013). As first we also determinated the impact of IL23R on pulmonary function and severity of asthma. Antileukotriene drug (montelukast) affect the expression of IL23R gene, which significantly increased after the therapy (p=0,001). The results of our study suggest that genes coding interleukins IL12B and IL13 and IL23 receptor have an important role in the pathogenesis of asthma. The finding of a significantly higher IL12B expression in asthma patients may in future serve as diagnostic or prognostic marker for asthma and the finding that anti-leukotriene drugs decrease its expression may become an important biomarker in choice of therapy. Keywords: asthma, interleukins, association analysis, gene expression. 58 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI ZNANSTVENI PRISPEVEK eQTL analiza izbranih kromosomskih področij pri slovenskih bolnikih s kronično vnetno črevesno boleznijo eQTL analysis of selected chromosomal regions in Slovenian patients with inflammatory bowel disease Katja Repnik1, Uroš Potočnik1,2 1 Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, Center za humano molekularno genetiko in farmakogenomiko, Slomškov trg 15, 2000 Maribor, [email protected] 2 Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Smetanova 17 in Medicinska fakulteta, Center za humano molekularno genetiko in farmakogenomiko, Slomškov trg 15, 2000 Maribor Izvleček. Kronična vnetna črevesna bolezen (KVČB) je kompleksna bolezen, na nastanek in potek katere poleg dejavnikov okolja vpliva tudi genetska zasnova posameznika. Izraža se predvsem v dveh oblikah in sicer kot Crohn-ova bolezen (CB) in ulcerozni kolitis (UK). Do danes je bilo za KVČB izvedenih več kot 30 asociacijskih študij v celotnem genomu (GWA študije). Pri pregledu vseh GWA študij smo ugotovili, da se nekaj manj kot 10 % polimorfizmov posameznega nukleotida (SNP), ki so povezani z nastankom KVČB, nahaja v kodirajočih regijah (eksonih) genoma, medtem ko se ostalih 90 % SNP-jev nahaja v nekodirajočih regijah in regijah med geni oziroma v ti. genskih puščavah. Mehanizem, kako ti SNP-ji vplivajo na patogenezo KVČB in na katere gene in proteine vplivajo, ni poznan. Za interpretacijo funkcionalnih posledic teh variant in opis funkcionalno pomembnih variant smo izbrali metodo, s katero je možno korelirati nivo izražanja genskih transkriptov z genomsko lokacijo – tehnika eQTL (ang. expression quantitative trait loci) mapiranja. Iz objavljenih GWA študij, narejenih pri bolnikih s KVČB na različnih populacijah, smo pridobili 402 SNP-jev, ki so bili statistično močno povezani s KVČB (p < 10-5). Za pridobljene SNP-je smo določili regije 250 kbp navzgor in 250 kbp navzdol od SNP-ja, s čemer smo določili 208 regij s pripadajočimi geni. Iz petih objavljenih eQTL študij smo pridobili 9562 eQTL povezav, ki smo jih nato prekrižali z regijami, pridobljenimi iz GWA študij. S tem smo določili, kateri so tisti polimorfizmi, povezani z boleznijo in hkrati vplivajo na izražanje enega ali več genov iz posamezne regije. Tako smo izbrali regije, za katere smo eQTL analizo izvedli v krvnih limfocitih slovenskih bolnikov s KVČB. Z metodo verižne reakcije s polimerazo (PCR), čemur je sledila reakcija polimorfizmov dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP), smo pridobili genotipe za izbrane SNP-je, ter s tehniko obratne transkripcije in verižne reakcije s polimerazo v realnem času – qRT-PCR, izmerili izražanje genov iz izbranih regij v krvnih limfocitih bolnikov in zdravih posameznikov. Naredili smo asociacijsko analizo izbranih SNP-jev, ter eQTL analizo, pri čemer smo ugotavljali ali se ekspresija gena razlikuje pri posameznikih z različnimi genotipi. Ugotovili smo, da je eQTL metoda učinkovita metoda pri odkrivanju genov, povezanih z nastankom bolezni še posebej v primerih, kjer ni jasno, kateri je tisti gen iz določene regije, ki je povezan z boleznijo. Z metodo pa se da pojasniti tudi mehanizme vpliva nekodirajočih polimorfizmov na funkcijsko izražanje proteina, saj nekodirajoči polimorfizmi najverjetneje usmerjeno ne vplivajo na strukturo in funkcijo proteina, je pa zelo verjetno, da vplivajo na nivo izraženega proteina. Ključne besede: kronična vnetna črevesna bolezen, genetski polimorfizmi SNP, genska ekspresija, eQTL analiza. 59 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Uvod Kronična vnetna črevesna bolezen (KVČB) je poligenska avtoimuna bolezen, na nastanek katere pomembno vplivajo genetski dejavniki, dejavniki okolja in struktura črevesne mikroflore. Glavna podtipa KVČB sta Crohn-ova bolezen (CB), za katero so značilna kronična vnetja v celotni prebavni cevi, vključno s tankim črevesom, in ulcerozni kolitis (UK), kjer je vnetje omejeno pretežno na 1 široko črevo in danko . Prvi odkriti gen za CB, ki je bil kasneje dokazan v skoraj vseh študijah, je bil gen NOD2/CARD15 na kromosomu 16, ki je 2 vključen v prepoznavanje bakterij in prenos signala za stimulacijo apoptoze . Kmalu po odkritju NOD2 gena v povezavi s Crohn-ovo boleznijo so prav tako z 3 analizo genetske vezave odkrili lokus na kromosomu 5q31 (IBD5) in 4 kromosomu 10q23 (DLG5) močno povezan s Crohn-ovo boleznijo, čeprav je ponovljivost teh regij slabša. Skozi leta se je nato povezava z boleznijo pokazala za številne lokuse, vendar so se ugotovitve pri različnih študijah za različne populacije zelo razlikovale. Velik napredek pri študiju kompleksnih bolezni so tako prinesle ti. asociacijske študije v celotnem genomu (ang. GWA za genome wide association). GWA študije temeljijo na sistemu kontrole-primeri (case-control), pri čemer genotipiziramo tisoče SNP-jev v celotnem genomu na veliki skupini 5 posameznikov z boleznijo in zdravih posameznikih . Prva GWA študija pri bolnikih s Crohn-ovo boleznijo je bila objavljena v letu 2005, pri kateri so analizirali okoli 80 000 SNP-jev na populaciji okoli 480 bolnikov s Crohn-ovo 6 boleznijo in 350 kontrolah . Naslednja GWA študija v letu 2006 je obsegala že 7 več kot 300 000 SNP-jev ter več kot 500 bolnikov in kontrol . Z nizanjem GWA študij je število genetskih dejavnikov, povezanih z boleznijo, eksponentno rastlo. Ker je genetska komponenta večja pri Crohn-ovi bolezni, so bile prve GWA študije narejene predvsem pri bolnikih s to obliko KVČB. Prvih 5 GWA študij je identificiralo 10 novih lokusov in so replicirale že predhodno potrjene 6-10 asociacije (NOD2, IBD5) . Prve GWA študije, opravljene pri bolnikih z ulceroznim kolitisom so replicirale lokuse, ki so bili odkriti v povezavi s Crohnovo boleznijo. Pokazalo se je, da so številni geni, kot sta na primer IL23R in IL12B, povezani tudi z nastankom ulceroznega kolitisa, medtem ko sta na primer gena NOD2 in ATG16L1, ki sta vključena v avtofagijo, specifična le za Crohn-ovo bolezen. Z rastjo števila asociacijskih študij v celotnem genomu so se začele pojavljati tudi metaanalize celotnega genoma. Zadnja GWA metaanaliza pri bolnikih s Crohn-ovo boleznijo je vključila 6 GWA študij in glavne signale iz asociacijskih analiz replicirala na več kot 15 000 bolnikih s Crohn-ovo boleznijo in 14 000 zdravih posameznikih. Rezultat te metaanalize je 71 lokusov, vpletenih v nastanek Crohn-ove bolezni, s čemer lahko razložimo nekaj več kot 20 % genetskega dejavnika tveganja za nastanek 11 Crohn-ove bolezni . Zadnja metaanaliza, narejena pri bolnikih z ulceroznim kolitisom, ki je združila prav tako 6 GWA študij in glavne signale replicirala na več kot 9 000 bolnikih in 12 000 kontrolah, je opisala že 47 lokusov, povezanih z nastankom ulceroznega kolitisa, s čemer lahko razložimo okoli 16 % 12 genetskega dejavnika tveganja za nastanek te oblike KVČB . Vendar kljub temu, da lahko asociacijske analize identificirajo polimorfizme ali druge 60 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE genetske variante, povezane z boleznijo in drugimi fenotipi, dajejo slab vpogled v to, katera je ta funkcionalna varianta in/ali mehanizem. Zato je potrebno najti takšno metodologijo, ki omogoča interpretacijo funkcionalnih posledic teh variant in opis funkcionalno pomembnih variant. Z obravnavanjem genske ekspresije kot kvantitativne sledi je možno korelirati nivo izražanja genskih transkriptov z genomsko lokacijo – tehnika eQTL (ang. expression quantitative 13 trait loci) mapiranja . Študije eQTL mapiranja tako predstavljajo način identificiranja genetskih variant, ki vplivajo na regulacijo genov. Kombiniranje eQTL študij z rezultati vezavnih ali asociacijskih študij pomaga predvideti specifično regulatorno vlogo polimorfnih mest predhodno povezanih z boleznijo. Zadnje študije so tako pokazale, da so variante, v GWA študiji povezane z nekim fenotipom, razporejene v lokuse obogatene z geni, ki so 14 povezani z biološko potjo posameznega fenotipa . Materiali in metode In silico analiza Iz 27 objavljenih GWA študij, ki so bile narejene pri bolnikih s KVČB v različnih populacijah, smo vključili 402 SNP-jev, ki so bili statistično močno povezani s -5 KVČB (p < 10 ). Za pridobljene SNP-je smo določili regije 250 kbp navzgor in 250 kbp navzdol od SNP-ja, s čemer smo določili 208 regij s pripadajočimi geni. Iz petih objavljenih eQTL študij smo pridobili 9562 eQTL povezav, ki smo jih nato prekrižali z regijami, pridobljenimi iz GWA študij. S tem smo določili, kateri so tisti SNP-ji, ki so povezani s KVČB v drugih populacijah in hkrati vplivajo na izražanje enega ali več genov iz posamezne regije. Za analizo smo izbrali naslednje 3 regije: regija na kromosomu 5 (IBD5 regija), kjer so SNP-ji, povezani z boleznijo, v visokem vezavnem neravnovesju (LD – linkage disequilibrium) in glavni gen iz te regije še ni znan; regija na kromosomu 17, kjer bi lahko SNP, povezan z boleznijo, vplival na ekspresijo dveh genov in sicer ORMDL3 in PSMD3; ter regijo na kromosomu 2q33, kjer je bilo pokazano, da SNP, povezan z nekaterimi drugimi avtoimunskimi boleznimi, vpliva na izražanje izoform gena CTLA4, ni pa še razjasnjena vloga v KVČB. Izolacija RNA in DNA V študijo smo vključili 350 zdravih posameznikov in 550 bolnikov s kronično črevesno boleznijo (KVČB), med katerimi je bilo 350 bolnikov s Crohn-ovo boleznijo (CB), 120 bolnikov s CB, ki niso odgovarjali na standardno terapijo ali pa so razvili hude stranske učinke (CB refraktorni) in 200 bolnikov z ulcerozni kolitisom (UK). DNA in RNA smo izolirali iz 9 ml krvi in sicer tako, da smo najprej z reagentom FicollPaque PLUS (GE Healthcare) pridobili limfocite in nato s TRI reagentom (Sigma) po navodilih proizvajalca izolirali DNA in RNA. Genotipizacija in merjenje genske ekspresije Genotipizirali smo SNP-je, opisane v preglednici 1. Najprej smo izvedli verižno reakcijo s polimerazo (PCR) pri naslednjih pogojih: 95°C 5 min, 35 ciklov po 95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s. PCR produkt smo po reakciji preverili na 2 % 61 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE agaroznem gelu. Po PCR reakciji smo produkt za genotipizacijo inkubirali skupaj s pripadajočim restrikcijskim encimom pri 37 °C čez noč. Produkte smo ponovno preverili na 2 % agaroznem gelu. SNP (rs številka) GEN rs3087243 CTLA4 rs1050152 SLC22A4 rs2631372 SLC22A5 rs2872507 ORMDL3 Začetni in končni oligonukleotid Velikost RE* produkta CACCACTATTTGGGATATACC AGGTCTATATTTCAGGAAGGC GAGAGTCCTCCTATCTGATTG TAGCTATTCTTCCATGCTTAT GTTATCACAGGACTTGTTTGT GAGGTCAACATTCTTCTCATA GGGATACTCAAACTGTATCTTTCC GTAGCATCAACATGTCATTAGAAG 216 Nco I 250 Mnl I 249 BseL I 200 Nco I Velikost produkta po restrikciji AA: 196 + 20 GG: 216 AG: 216 + 196 + 20 CC: 131 + 102 + 17 TT: 233 + 17 CT: 233 + 131 + 102 + 17 CC: 189 + 60 GG: 249 CG: 249 + 189 + 60 AA=95+105 GG=200 AG=200+105+95 Preglednica 1: zaporedje začetnih oligonukleotidov, pričakovana velikost produkta po PCR reakciji ter uporabljen restrikcijski encim z velikostmi produktov po restrikciji za izbrane SNP-je. * RE = restrikcijski encim Za merjenje genske ekspresije smo najprej izvedli reverzno transkripcijo RNK s High Capacity Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Z dobljeno cDNK smo izvedli reakcijo kvantitativnega PCR (qPCR) na aparaturi LC480 (Roche) z Maxima® SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas). Izmerili smo ekspresijo genov prikazanih v preglednici 2. mRNA Začetni oligonukleotid Končni oligonukleotid sCTLA4 GEN NM_001037631.2 CATCTGCAAGGTGGAGCTCAT GGCTTCTTTTCTTTAGCAATTACATAAATC flCTLA NM_005214.4 GAACCCAGATTTATGTAATTGATCCA CCGAACTAACTGCTGCAAGGA SLC22A5 NM_003060.3 GTGCTGCCACTGTTTGCTTA GGGGGACTCAGGGATGAA SLC22A4 NM_003059.2 CGGAATATTGCCATAATGACC CAGAGCAAAGTAACCCACTGAG IRF1 NM_002198.2 GGCACATCCCAGTGGAAG CCCTTCCTCATCCTCATCTGT ORMDL3 NM_139280.1 TCACCAACCTCATTCACAACA CAAAGGGTGTCCCCTTCAC PSMD3 NM_002809.2 TTATCACGCCCGGGTCTA AGCCGAGCATGCAAGAAG GAPDH NM_002046.3 GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAAGATGGTGATGGGATTTC B2M NM_004048.2 TTCTGGCCTGGAGGCTATC TCAGGAAATTTGACTTTCCATTC Preglednica 2: zaporedje začetnih oligonukleotidov izbranih genov za merjenje ekspresije. Pogoji za PCR reakcijo so bili naslednji: začetna denaturacija 95°C 10 min, čemur je sledilo 40 ciklov po 95°C 15 s, 60°C 30 s in 72°C 30 s. Za referenčna gena smo uporabili dva hišna gena in sicer GAPDH ter B2M. 62 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Statistična analiza Ekspresijo izbranih genov smo relativno ovrednotili glede na stabilno izražanje 2 -∆∆Cp 15 hišnih genov, tj. B2M in GAPD, po metodi 2 . Vse dobljene rezultate smo statistično obdelali s programom SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, USA). Za asociacijsko analizo povezave genotipa in alela z boleznijo smo uporabili Fisherjev natančni test, za analizo ekspresije pa neparametrični Mann-Whitney test. Za statistično signifikantne rezultate smo razglasili vse rezultate, katerih p vrednost je znašala < 0,05. Za analizo haplotipov smo uporabili Golden Helix, SNP and variation suit 7 programsko orodje. Rezultati In silico analiza Iz GWA študij smo pridobili 402 SNP-jev, ki so pripadali 208 lokusom. Od 402 SNP-jev jih je bilo 37 (9,20 %) kodirajočih, 365 (90,80 %) pa nekodirajočih, in sicer se jih je 147/402 (36,5%) nahajalo v nekodirajočih regijah gena (intronih), 218 (54,23%) pa v regijah med dvema genoma, t.i. »genskih puščavah«. Iz objavljenih eQTL študij smo pridobili 9562 eQTL povezav. Po prekrižanju GWA in eQTL podatkov smo ugotovili, da za 104 lokuse (50,00 %), povezane z boleznijo KVČB, ne moremo določiti eQTL gena, medtem ko lahko za 65 lokusov (31,25 %) določimo 1 eQTL gen, za 23 lokusov (11,06 %) 2 eQTL gena, za preostalih 16 lokusov (7,69 %) pa 3 ali več eQTL genov. Za nadaljnjo podrobnejšo analizo smo izbrali 3 regije, opisane v metodah in sicer eno regijo na kromosomu 5, eno na kromosomu 17 in eno na kromosomu 2. Asociacijska analiza V naši študiji smo izvedli genotipizacijo 4 izbranih SNP-jev v izbranih treh regijah za podrobnejšo analizo pri 350 zdravih posameznikih ter 550 bolnikih s KVČB, med katerimi je bilo 350 bolnikov s CB, 120 bolnikov s CB, ki niso odgovarjali na standardno terapijo ali pa so razvili hude stranske učinke – CB refraktorni ter 200 bolnikov z UK. Frekvence genotipov niso odstopale od Hardy-Weinbergovega ravnotežja. Preglednica 3 prikazuje asociacijsko analizo izbranih SNP-jev pri skupini bolnikov glede na fenotip bolezni, ter pri kontrolni skupini. Vse štiri izbrane SNP-je smo povezali z vsaj enim fenotipom KVČB. Za SNP rs3087243 na genu CTLA4 smo ugotovili, da je frekvenca alela G statistično višja pri skupini bolnikov s KVČB (0,654) v primerjavi s kontrolno skupino (0,539, p=<0,001). Za SNP rs1050152 smo našli statistično signifikantno povišanje frekvence alela T v skupini bolnikov s CB refraktorni (0,517) v primerjavi s kontrolno skupino (0,415, p=0,005). Prav tako je bila pri skupini CB refraktorni višja frekvenca alela C (0,771) v primerjavi s kontrolno skupino (0,659, p=0,001) za SNP rs2631372 na genu SLC22A5. Za SNP rs2872507 na genu ORMDL3 pa smo ugotovili višjo frekvenco alela A pri skupini bolnikov z UK (0,467) v primerjavi s kontrolno skupino (0,404, p=0,050). 63 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE SNP rs3087243 MAF controls (N=350) MAF KVČB (N=550) MAF CB (N=350) MAF CB refraktorni (N=120) MAF UK (N=200) 0,461 0,346 0,367 0,378 0,299 <0,001 0,002 0,009 <0,001 0,623 0,683 0,653 0,500 0,501-0,776 0,540-0,864 0,523-0,842 0,367-0,682 0,438 0,444 0,517 0,378 p value 0,361 0,344 0,007 0,254 OR 1,100 1,128 1,508 0,856 0,901-1,343 0,881-1,444 1,117-2,035 0,657-1,116 0,307 0,302 0,229 0,357 p value 0,170 0,213 0,002 0,620 OR 0,858 0,835 0,582 1,075 0,693-1,063 0,635-1,098 0,411-0,822 0,815-1,419 0,413 0,396 0,394 0,467 p value 0,384 0,407 0,421 0,050 OR 0,965 0,967 0,958 0,776 0,791-1,178 0,773-1,209 0,708-1,296 0,577-1,043 GEN CTLA4 alel A p value OR 95 % CI rs1050152 SLC22A4 alel T 0,415 95 % CI rs2631372 SLC22A5 alel G 0,341 95 % CI rs2872507 ORMDL3 alel A 95 % CI 0,404 Preglednica 3. Asociacijska analiza izbranih SNP-jev. MAF= frekvenca redkejšega alela p = statistično določena signifikanca s Fisherjevim natančnim testom OR = razmerje obetov 95 % CI = 95 % interval zaupanja Ekspresijska analiza Ekspresijsko analizo izbranih genov smo izvedli v krvnih limfocitih zdravih posameznikov in bolnikov s KVČB. Razporeditev genotipov za vse štiri SNP-je je bila med bolniki in kontrolno skupino, ki so bili vključeni v ekspresijsko analizo podobna kot frekvenca genotipov obeh skupin pri asociacijski analizi. Ugotovili smo statistično nižjo ekspresijo genov SLC22A5 (p=0,001), SLC22A4 (p=0,049) in CTLA4 (p<0,001) v krvnih limfocitih pri bolnikih s KVČB v primerjavi z zdravimi posamezniki. Pri primerjavi ekspresije izbranih genov glede na genotip izbranih SNP-jev smo ugotovili, da SNP rs2872507 vpliva na ekspresijo gena ORMDL3 in sicer je pri posameznikih z genotipom GG ekspresija gena signifikantno višja (mediana relativne ekspresije 1,177) v primerjavi z ekspresijo gena ORMDL3 pri posameznikih z genotipom AA (mediana relativne ekspresije 0,758, p=1,42E-11). Pri primerjavi ekspresije gena PSMD3 glede na genotip SNP-ja rs2872507 nismo našli razlik v izražanju pri posameznikih z genotipom AA in GG. Nadalje smo z eQTL analizo regije IBD5 ugotovili, da SNP rs1050152 vpliva na ekspresijo gena SLC22A5 in sicer je pri bolezenskem genotipu TT tega SNP-ja ekspresija gena SLC22A5 nižja (0,434) v 64 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE primerjavi z ekspresijo tega gena pri posameznikih z genotipom CC (0,900, p=0,002), medtem ko ta SNP na ekspresijo gena SLC22A4 ne vpliva. Pri analizi regije na kromosomu 2q33 smo ugotovili, da funkcijski SNP rs3087243 vpliva na izražanje razmerja obeh izoform gena CTLA4 in sicer je izražanje sCTLA4/flCTLA4 pri posameznikih z bolezenskim genotipom GG SNP-ja rs3087243 nižje v primerjavi s posamezniki z genotipom AA (p=0,034). Rezultate prikazuje preglednica 4 ter slike 1, 2 in 3. SNP eQTL gen rs2872507 Mediana ekspresije p vrednost AA AG GG AA vs. GG ORMDL3 0,758 1,028 1,177 1,42E-11 PSMD3 1,059 1,078 1,059 0,913 CC CT TT CC vs. TT SLC22A5 0,900 0,754 0,434 2,00E-03 SLC22A4 0,881 0,828 0,788 0,862 CC CG GG CC vs. GG SLC22A5 0,584 0,874 0,909 1,50E-02 SLC22A4 0,766 0,866 2,189 2,20E-02 AA AG GG AA vs. GG sCTLA4/flCTLA4 0,600 0,510 0,470 3,40E-02 rs1050152 rs2631372 rs3087243 Preglednica 4. eQTL analiza izbranih SNP-jev in genov. p = statistično določena signifikanca z neparametričnim Mann-Whitney-jevim testom Slika 1: Ekspresija gena SLC22A5 v krvnih limfocitih bolnikov s KVČB v odvisnosti od genotipa SNP-a rs1050152. 65 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 2: Ekspresija gena ORMDL3 v krvnih limfocitih bolnikov s KVČB v odvisnosti od genotipa SNP-a rs2872507. Slika 3: Razmerje ekspresije izoform gena CTLA4, sCTLA4/flCTLA4 v krvnih limfocitih bolnikov s KVČB v odvisnosti od genotipa SNP-a rs3087243. Diskusija Rezultati naše študije kažejo na povezavo vseh treh izbranih regij z nastankom KVČB Pokazali smo, da sta gena SLC22A4 in SLC22A5 iz IBD5 regije povezana z nastankom resnejše oblike Crohn-ove bolezne (CB), tj. refraktorne oblike CB, pri kateri posamezniki ne odgovarjajo na standardno terapijo z antibiotiki, kortikosteroidi in imunosupresivi, ter razvijejo težko obliko bolezni s številnimi zapleti, kot je na primer pojav fistul. Gen za citotoksični T limfocitni antigen 4 (CTLA4), ki sodeluje pri regulaciji aktivnosti T-celic, smo povezali z obema glavnima oblikama KVČB, tj. CB in UK. ORMDL3 gen pa smo povezali z nastankom druge glavne oblike KVČB, tj. UK. Dodatno smo z našo študijo želeli ugotoviti ali je iz posamezne regije z boleznijo povezanih več genov. V ta namen smo izmerili ekspresijo izbranih genov ter 66 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE ugotavljali ali se izražanje teh genov spremeni pri posameznem genotipu izbranega SNP-ja. Z eQTL analizo smo tako ugotovili, da je glavni gen iz IBD5 regije, ki je povezan z nastankom bolezni, gen SLC22A5, saj funkcijski SNP rs1050152 vpliva na ekspresijo gena SLC22A5, medtem ko se ekspresija gena SLC22A4 ne spremeni (16). Z eQTL analizo regije na kromosomu 17q12-q21, za katero se je pokazalo, da lahko polimorfizmi vplivajo na ekspresijo tako gena ORMDL3 kot tudi gena PSMD3, smo ugotovili, da s KVČB povezan SNP rs2872507 vpliva le na ekspresijo gena ORMDL3, medtem ko se ekspresija gena PSMD3 glede na genotip tega SNP-ja ne spremeni. Nadalje pa smo z eQTL analizo ugotovili, da se v odvisnosti od genotipa spreminja tudi izražanje posamezne izoforme gena. Regija na kromosomu 2q33, kjer se gen CTLA4, ki je ključni negativni regulator T-celičnega imunskega odgovora in so ga povezali s številnimi drugimi kroničnimi avtoimunskimi boleznimi, lahko izraža v dveh izoformah in sicer v varianti, ki predstavlja daljši transkript in kodira na membrano vezano izoformo (flCTLA4) ter v varianti, kateri manjka ekson v kodirajoči regiji, kar premakne bralni okvir. Kodirana izoforma je topna in ji manjka transmembranska domena (sCTLA4). Izkazalo se je, da lahko funkcionalni SNP rs3087243 regulira količino sCTLA izoforme. V naši študiji smo pokazali, da je razmerje obeh izoform, sCTLA/flCTLA4, nižje pri bolezenskem genotipu GG tega SNP-ja, kar sovpada z ostalimi študijami, narejenimi pri drugih avtoimunskih boleznih (17). Z našo študijo smo pokazali, da je eQTL metoda učinkovita metoda pri odkrivanju genov, povezanih z nastankom ali potekom bolezni. Metoda je še posebej učinkovita tam, kjer je z boleznijo povezanih več potencialnih genov in glavni gen še ni odkrit ali pa je kandidatno področje v visokem vezavnem neravnovesju (LD) in ni jasno, kateri je glavni gen povezan z boleznijo. Z metodo pa se da pojasniti tudi mehanizme vpliva nekodirajočih polimorfizmov na funkcijsko izražanje proteina, saj nekodirajoči polimorfizmi najverjetneje direktno ne vplivajo na strukturo in funkcijo proteina, je pa zelo verjetno, da vplivajo na nivo izraženega proteina. Reference 1. 2. 3. Cho, J. H. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nat.Rev.Immunol. 2008, 8: 458-466. Hugot, J. P., Chamaillard, M., Zouali, H., Lesage, S., Cezard, J. P., Belaiche, J., Almer, S., Tysk, C., O'Morain, C. A., Gassull, M., Binder, V., Finkel, Y., Cortot, A., Modigliani, R., Laurent-Puig, P., Gower-Rousseau, C., Macry, J., Colombel, J. F., Sahbatou, M., and Thomas, G. Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn's disease. Nature 2001, 411: 599-603. Rioux, J. D., Daly, M. J., Silverberg, M. S., Lindblad, K., Steinhart, H., Cohen, Z., Delmonte, T., Kocher, K., Miller, K., Guschwan, S., Kulbokas, E. J., O'Leary, S., Winchester, E., Dewar, K., Green, T., Stone, V., Chow, C., Cohen, A., Langelier, D., Lapointe, G., Gaudet, D., Faith, J., Branco, N., Bull, S. B., McLeod, R. S., Griffiths, A. M., Bitton, A., Greenberg, G. R., Lander, E. S., Siminovitch, K. A., and Hudson, T. J. Genetic variation in the 5q31 cytokine gene cluster confers susceptibility to Crohn disease. Nat. Genet. 2001, 29: 223-228. 67 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Stoll, M., Corneliussen, B., Costello, C. M., Waetzig, G. H., Mellgard, B., Koch, W. A., Rosenstiel, P., Albrecht, M., Croucher, P. J. P., Seegert, D., Nikolaus, S., Hampe, J., Lengauer, T., Pierrou, S., Foelsch, U. R., Mathew, C. G., Lagerstrom-Fermer, M., Schreiber, S. Genetic variation in DLG5 is associated with inflammatory bowel disease. Nat. Genet. 2004, 36: 476-480. Manolio, TA. Genomewide association studies and assesment of the risk of disease. N Engl J Med, 2010, 363(2): 166-76. Yamazaki, K et al. Single nucleotide polymorphisms in TNFSF15 confer susceptibility to Crohn's disease. Hum.Mol.Genet. 2005, 14: 3499-3506. Duerr, RH et al. A genome-wide association study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene. Science. 2006, 314: 1461-1463. Hampe, J et al. A genome-wide association scan of nonsynonymous SNPs identifies a susceptibility variant for Crohn disease in ATG16L1. Nat.Genet. 2007, 39: 207-211. Rioux, JD et al. Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis. Nat.Genet. 2007, 39: 596-604. Libioulle, C et al. Novel Crohn disease locus identified by genome-wide association maps to a gene desert on 5p13.1 and modulates expression of PTGER4. PLoS.Genet. 2007, 3:e58 Franke, A. et al. Genome-wide meta-analysis increases to 71 the number of confirmed Crohn’s disease susceptibility loci. Nat. Genet. 2010, 42(12): 1118-1126. Anderson, CA. et al. Meta-analysis identifies 29 additional ulcerative colitis risk loci, increasing the number of confirmed associations to 47. Nat. Genet. 2011, 43(3): 246252. Franke L., Jansen RC. eQTL Analysis in Humans. Methods Mol Biol. 2009, 573: 311-28. Nicolae, DL. et al. Trait-associated SNPs are more likely to be eQTLs: annotiation to enhance discovery from GWAS. PLOS Genetics. 2010, 6(4): e1000888. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001, 25: 402-408. Repnik, K., Potočnik, U. Haplotype in the IBD5 region is associated with refractory Crohn's disease in Slovenian patients and modulates expression of the SLC22A5 gene. J Gastroenterol. 2011, Jun 22. Repnik, K., Potočnik, U. CTLA4 CT60 single-nucleotide polymorphism is associated with Slovenian inflammatory bowel disease patients and regulates expression of CTLA4 isoforms. DNA Cell Biol. 2010, 29(10): 603-10. 68 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Abstract. Inflammatory bowel disease (IBD) is complex disease where several environmental and genetic factors play role. Two major types of IBD exist, Crohn disease (CD) and ulcerative colitis (UC). To date, more than 30 genome wide association studies (GWA) were performed in IBD patients. Using GWA data we found that slightly less than 10% of single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with IBD are located in coding regions of genome while the remaining 90% are located in non-coding regions of genes or in gene deserts. The mechanism how this SNPs affect the pathogenesis of IBD and which genes and proteins the effect remains unknown. For interpretation of functional consequences of these variants and functional description of important variants we chose a method which correlate level of expression of gene transcripts with genomic location expression quantitative trait loci (eQTL) mapping. From published GWA studies performed in patients with IBD in different populations we obtained 402 SNPs that were statistically significantly associated with disease (p < 10-5). For derived SNPs we identified regions 250 kbp up- and 250 kbp downstream from the SNP. We identified 208 gene associated regions. From five published eQTL studies we obtained 9562 eQTL correlations and crossed them with regions derived from GWA studies. In this way we determined which SNPs are associated with the disease and effect expression of one or more genes from each region. We chose regions for which we performed eQTL analysis in blood lymphocytes of Slovenian IBD patients. Using PCRRFLP method we obtained genotypes for selected SNPs and with quantitative real time PCR (qRT-PCR) technique we measured expression of genes from selected regions in blood lymphocytes of patients and healthy controls. We performed association analysis of selected SNPs and eQTL analysis in which we assessed whether expression of gene differs in individuals with different genotypes. We found that eQTL method is an efficient method for identification of genes, associated with the disease especially in cases where it is not clear which gene from the region is associated with the disease. Using this method we can also explain the mechanism in which way non-coding SNPs effect expression of proteins while non-coding SNPs directly cannot effect on structure and function of protein but it is very likely that they affect the level of expressed protein. Keywords: inlammatory bowel disease, polymorphisms SNPs, gene expression, eQTL analysis. 69 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Transkriptom razvijajočega plodu oljke (Olea europaea L.) pridobljen z naslednjo generacijo določevanja nukleotidnih zaporedij Tjaša Rešetič1, Dunja Bandelj1, Branka Javornik2, Jernej Jakše1,2 1 Univerza na Primorskem, Znanstveno-raziskovalno središče, Garibaldijeva 1, 6000 Koper, [email protected] 2 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Katedra za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana V slovenskih oljčnih nasadih je Istrska belica najbolj zastopana sorta. Njeni plodovi so poznani po zelo visoki vsebnosti skupnih biofenolov in so dober vir nasičenih maščobnih kislin. Razvoj plodov je genetsko reguliran proces na katerega vplivajo tudi okoljski dejavniki. Znani so mnogi fiziološki in biokemični podatki o rasti, razvoju in zorenju oljčnih plodov. V genskih podatkovnih bazah najdemo malo podatkov o genskih sekvencah oljke in njihovih produktih. Označevalci izraženih nukleotidnih zaporedij (EST) in cDNA zaporedja so orodja, ki nam lahko zagotovijo neposredne informacije o transkriptih in s tem o izraženih delih genoma. So eden izmed pomembnih virov za raziskovanje transkriptoma. V ta namen smo iz razvijajočih plodov oljke preko celotne razvojne faze pridobili RNA vzorec, ki nam je bil osnova za izdelavo normalizirane cDNA knjižnice pripravljene s pomočjo endonukleaze tipa II GsuI. Tako pripravljeni knjižnici smo določili nukleotidno zaporedje s pirosekvenatorjem Roche 454 FLX. Pridobljene sekvence smo primarno obdelali (python skripta sff_extract) in določili 560.578 zaporedij, katerih povprečna dolžina je bila 286 bp, skupna dolžina pa 160 Mb. Tehnologija sekveniranja temelji na uporabi konkatemerne cDNA, zato smo hibridna zaporedja, ki so imela prisotno linkersko zaporedje v sredini razdelili na dve neodvisni zaporedji (SSAHA2 programski paket). Zaporedjem smo nadalje odstranili dele linkerjev, morebitne še vedno prisotne poly-A regije in odstranili vsa prekratka in neuporabna zaporedja (Seqclean perl skripta in Megablast).Tako smo na koncu določili 577.025 očiščenih zaporedij cDNA oljke v skupni dolžini 139Mb. Povprečna dolžina zaporedij je bila 241 bp. V nadaljevanju smo želeli izbrati najbolj primerno orodje za združevanje cDNA zaporedij v soseke. Zaporedja smo na osnovi podobnosti in dolžine prekrivanja združili v domnevna 'konsenzus' zaporedja z uporabo različnih združevalcev, kot so CAP3 (TGICL, PAVE v2.5, iAssembler), MIRA, Newbler 2.3 in CLC Genomics Workbench. Uspešnost združevanja smo preverili z BLASTX primerjavo s proteinsko podatkovno bazo, kjer je bil glavni kriterij dolžina zadetkov. Z izboljšanjem poznavanjem sestave genov in njihovega izražanja, bomo pridobili nove informacije o procesu razvoja, fiziologiji dozorevanja, primarnem metabolizmu in sintezi zdravilnih substanc biofenolov v plodu oljke. Ključne besede: Istrska bioinformatika, biofenoli. belica, oljka, 70 izražena nukleotidna zaporedja, EST, 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Elektroforetska kariotipizacija in vsebnost jedrne DNA v hmeljnih izolatih glive Verticillium albo-atrum Tina Svetek 1, Sebastjan Radišek 2, Borut Bohanec 1, Branka Javornik 1 1 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Ljubljana, Slovenija 2 Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Žalec, Slovenija [email protected] Verticillium albo-atrum je talna fitopatogena gliva, ki povzroča bolezni uvelosti na številnih rastlinskih vrstah. Prisotna je tudi v slovenskih hmeljiščih, s čimer ogroža pridelavo hmelja (Humulus lupulus L.). Izolati iz različnih okuženih rastlin hmelja so bili na osnovi testa na virulenco in molekulske variabilnosti, ugotovljene z AFLP metodo, opredeljeni v dve patogeni skupini: PG1 izolati, ki povzročajo blago obliko hmeljeve uvelosti in PG2 izolati, ki povzročajo letalno hmeljevo uvelost in rastlino uničijo. Pri primerjavi slovenskih patotipov z izolati V. albo-atrum iz drugih evropskih hmeljišč in izolati V. albo-atrum iz drugih gostiteljskih rastlin smo ugotovili, da obstajajo genetske razlike med vsemi blagimi in letalnimi izolati ter med izolati iz drugih rastlin. Pokazalo se je tudi, da so slovenski letalni izolati in letalni izolati iz drugih geografskih območij genetsko povezani. V primerjalni analizi micelijskih proteomov dveh patotipov so se pokazale podobnosti znotraj blagih ter znotraj letalnih patotipov. V prvih raziskavah velikosti genoma izolatov PG1 in PG2, ugotovljeni s pretočno citometrijo, smo videli, da imajo letalni izolati večjo vsebnost jedrne DNA. Povprečna izmerjena velikost genoma izolatov PG1 je 25 Mbp, izolatov PG2 pa 37 Mbp. Razlike v genomu so se pokazale tudi s kariotipizacijo s pomočjo pulzne elektroforeze, pri PG1 izolatih je na gelu vidnih šest lis, vsota njihovih velikosti je 25 Mbp, kar kaže na prisotnost šestih kromosomov. Izolati PG2 imajo na elektroforetskem gelu pet lis, dve izmed njih sta močnejši, kar namiguje na komigracijo kromosomov. Ocenjeno število kromosomov patotipa PG2 je sedem, vsota njihovih velikosti pa 33 Mbp. 71 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Napovedovanje kandidatnih genov za nalaganje maščevja znotraj kvantitativnih lokusov (QTL) pri prašiču s pomočjo sistema Ondex Minja Zorc1, Keywan Hassani-Pak2, Tanja Kunej3, Daša Jevšinek Skok3, Milena Kovač3, Chris Rawlings2 1 Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biostatistiko in medicinsko informatiko, Vrazov trg 2, 1104 Ljubljana, [email protected] 2 Rothamsted Research, Centre for Mathematical and Computational Biology, Harpenden, Hertfordshire, AL5 2JQ, UK 3 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Groblje 3, 1230 Domžale Pri selekciji z molekularnimi označevalci (angl. marker assisted selection) predstavlja izziv napovedovanje kandidatnih genov za proizvodne lastnosti. Pristopi klasične (angl. forward) genetike identificirajo lokuse na genomu, povezane z določenim fenotipom. Pri izbiri obetavnejših kandidatnih genov med potencialnimi geni za določeno lastnost upoštevamo funkcionalne anotacije, udeleženost genov v bioloških poteh, tkivno-specifično izražanje, primerjalno genomiko, povezave s fenotipom in literaturo. Združevanje in analiza tako raznolikih informacij sta za biologe zahtevna, zato je nujen razvoj avtomatiziranih in sistematičnih metod. Razvili smo integrativen in na mrežah temelječ (angl. network based) pristop za identifikacijo kandidatnih genov znotraj kvantitatinih lokusov (QTL; angl. Quantitative trait loci). Proučevali smo nalaganja maščevja pri prašičih. Želeli smo identificirati kandidatne gene znotraj QTL-ov, povezanih s to lastnostjo. Za gradnjo obširnega omrežja znanja (angl. knowledge network) smo uporabili sistem Ondex (www.ondex.org) in integrirali raznolike informacije iz zbirk: Ensembl, AnimalQTLdb, UniProtKB, Gene Ontology, OMIM, KEGG in MEDLINE. Sistem Ondex omogoča iskanje na osnovi lastnosti, združeno s tehnikami sklepanja in vizualizacije z mrežami in olajša napovedovanje kandidatnih genov za kompleksne fenotipe, kot je debelost. Primer napovedovanja kandidatnih genov za debelost pri prašiču smo izvedli tako, da smo kot ključne besede za iskanje na osnovi lastnosti v sistem Ondex vnesli besede 'obesity', 'fatness' in 'backfat', iskanje pa omejili na QTL regijo za debelost pri prašiču na kromosomu 17 (15000 kbp –23000 kbp). Kot obetaven kandidatni gen za nalaganje maščevja smo identificirali gen F1SBK4. Opisan nov pristop za napovedovanje kandidatnih genov je možno uporabiti tudi za druge poligenske lastnosti in predstavlja osnovo za eksperimentalno validacijo Ključne besede: kandidatni gen, QTL, prašič, debelost. 72 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE POSTERJI BIOTEHNOLOGIJA INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE 73 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE ZNANSTVENI PRISPEVEK Informativnost mikrosatelitnih markerjev za razlikovanje med spolno kompatibilnimi sorodniki vrste Brassica napus L. Informativity of microsatellite markers for distinguishing between sexually compatible relatives of Brassica napus L. Barbara Pipan1, Jelka Šuštar-Vozlič1 in Vladimir Meglič1 1 Kmetijski inštitut Slovenije, Hacquetova ulica 17, 1000 Ljubljana [email protected] Izvleček. Informativnost molekulskih markerjev (označevalcev) je pri genetski analizi razlikovanja med sorodnimi genotipi zelo pomembna informacija. V študiji smo analizirali mere variabilnosti 15-ih mikrosatelitnih markerjev (izoliranih iz različnih vrst iz rodu Brassica) za razlikovanje med spolno kompatibilnimi sorodniki vrste Brassica napus L. V študijo smo vključili referenčne genotipe iz družine Brassicaceae, ki imajo v naravi visoko sposobnost oprašitve z B. napus, dva genotipa B. napus subsp. napobrassica, dva genotipa B. napus subsp. napus (njihovo seme smo pridobili iz genskih bank) ter genotipe podivjanih in plevelnih spolno kompatibilnih sorodnikov, ki smo jih v letih 2008 in 2010 zbirali na območju celotne Slovenije. Analizirana skupina rastlinskih vzorcev je bila sicer zelo raznolika, saj je vključevala predstavnike različnih rodov znotraj Brassicaceae (Brassica, Diplotaxis, Raphanus, Rapistrum, Sinapis), znotraj njih pa tudi predstavnike istih vrst. Morfološko so si te rastline zelo podobne, nekatere med njimi je tudi težko razlikovati, vendar pa so njihove genetske razlike tolikšne, da te genotipe z uporabo izbranih mikrosatelitnih markerjev lahko ločimo in hkrati ugotovimo tudi, če je v naravi prišlo do spontanih oprašitev med njimi. Rezultati analize parametrov variabilnosti za izbrane mikrosatelitne lokuse so pokazali, da le-ti obravnavane genotipe med sabo dobro ločijo, saj je njihova povprečna informacijska vrednost polimorfizma 0,754, skupna verjetnost enakosti genotipov pa le 1,272x10-24. Povprečno se je na posameznem lokusu namnožilo 16,9 alelov, ki so glede na nizko verjetnost enakosti genotipov tudi enakomerno razporejeni med analiziranimi vzorci. Nizka povprečna vrednost pričakovane heterozigotnosti (0,872) predstavlja visoko verjetnost izbranih markerjev za ločevanje med genotipi in hkrati odraža njihovo genetsko raznolikost. Ugotovili smo, da so bili glede na rezultate mer variabilnosti izbrani mikrosatelitni markerji visoko polimorfni in visoko informativni, zato bomo z njihovo uporabo v nadaljevanju lahko določevali stopnje prenosa genov na nivoju vrste, podvrste in sorte. Ključne besede: Brassica napus L., spolno kompatibilni sorodniki, mikrosatelitni markerji (označevalci), lokus, mere variabilnosti mikrosatelitov, prenos genov. Uvod Brassica napus L. je vsesplošno uporabna rastlina, ki spada v raznoliko družino križnic (Brassicaceae). Vrsta vključuje dve po namenu pridelave precej različni podvrsti. Prva skupina obsega zelenjadne predstavnike, med njimi pomembno podzemno (rumeno) kolerabo (B. napus L. subsp. napobrassica), druga podvrsta (B. napus L. subsp. napus) pa združuje prezimno in 1 spomladansko ter oljno in krmno obliko navadne ogrščice . Vse omenjene oblike se pridelujejo tudi v Sloveniji, najbolj aktualna pa je pridelava oljne 74 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE ogrščice. B. napus je kot alotetraploidna rastlinska vrsta nastala s spontanim medvrstnim križanjem med repo (B. rapa L.; AA genom, 2n=20) in zeljem (B. oleracea L.; CC genom, 2n=18). V osnovi je samoprašna rastlinska vrsta, vendar pa v odvisnosti od posameznega genotipa in specifičnih vplivov okolja lahko delež tujeprašnosti dosega od 5 do 47%, oprašujejo pa jo predvsem 2 čebele, lahko pa tudi veter . Glede na genetski nastanek vrste B. napus in njene biološke karakteristike lahko v naravi prihaja tudi do medvrstnih križanj z njenimi spolno kompatibilnimi sorodniki iz družine križnic. Visoko sposobnost opraševanja z B. napus imajo predvsem B. rapa, B. juncea, B. oleracea, B. nigra, Raphanus raphanistrum, Diplotaxis erucoides, D. muralis, Sinapis alba, 3 S. arvensis, D. tenuifolia, Rapistrum rugosum in Raphanus sativus . Njihova prisotnost v pridelovalnih razmerah lahko omogoči prenos genov iz nekultiviranih oblik (plevelnih in podivjanih) v gojene rastline B. napus ali obratno. Spremljanje takih nenadzorovanih opraševanj je zanimivo predvsem z vidika sortne čistosti in kakovosti pridelka oljne ogrščice, krmne ogrščice ter podzemne kolerabe; dolgoročno pa prenosi genov vplivajo na ko-evolucijo razvoja sorodnih rastlinskih vrst. Za identifikacijo takih križanj na nivoju DNK smo v raziskavi uporabili mikrosatelitne molekulske markerje (označevalce), ki so kodominatni, hipervariabilni, visoko polimorfni in se pogosto ter enakomerno pojavljajo v genomu. Zato je njihova informativnost ključno merilo za uspešno genetsko razlikovanje med sicer zelo sorodnimi rastlinskimi vrstami, ki pa klub temu spadajo v različne rodove znotraj Brassicaceae, četudi imajo nekatere med njimi skupen izvor in so si morfološko zelo podobne. Materiali in metode V analizo smo vključili dve skupini predstavnikov iz družine Brassicaceae. Prva skupina je zajemala spolno kompatibilne sorodnike B. napus, ki se v Sloveniji pojavljajo kot plevelne rastline ali pa se pridelujejo za hrano in krmo. Med te referenčne genotipe smo vključili tudi štiri genotipe B. napus, ki (so) se pridelovali v Sloveniji, in sicer dva genotipa oljne ogrščice ter dva genotipa podzemne kolerabe. Seme vseh referenčnih genotipov (preglednica 1) smo pridobili iz genskih bank, zato je tudi njihov izvor jasen. Druga skupina pa je zajemala predstavnike, ki so se pojavljali v naravnem pridelovalnem prostoru. Zbrani so bili v letih 2008 in 2010 po celotni Sloveniji in obsegajo: 8 genotipov B. rapa, po 1 genotip D. muralis, B. nigra in S.alba ter 15 genotipov S. arvensis. 75 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Preglednica 1: Referenčni genotipi spolno kompatibilnih sorodnikov B. napus, pridobljeni iz genskih bank. Iz rastlinskega materiala (mladi listi) smo izolirali DNK po optimiziranem protokolu proizvajalca Qiagen z uporabo BioSprint 15 DNA Plant Kit-a in robota MagMax. Želena mikrosatelitna zaporedja (preglednica 2) smo namnoževali v PCR (10µl) pri optimiziranih pogojih za posamezen lokus. 76 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Preglednica 2: Lastnosti uporabljenih mikrosatelitnih markerjev. Za determinacijo natančne dolžine alelov smo vsak začetni oligonukleotid 5' obarvali s flourescentnimi oznakami 5-FAM, NED, 6-HEX. Fragmenta analiza je potekala na ABI3130, obdelava rezultatov je bila izvedena v programu GeneScan4.0 (ABI). Analizo vrednotenja izbranih mikrosatelitnih markerjev smo 8 izdelali v programu Identity4.0 . Rezultati Na podlagi rezultatov vrednotenja primernosti uporabljenih mikrosatelitnih markerjev na 15-ih različnih lokusih pri ločevanju vključenih genotipov se je analiza izkazala kot zelo informativna, saj je skupna verjetnost enakosti genotipov -24 (PI) zelo nizka, le 1,272x10 . Povprečna informacijska vrednost polimorfizma (PIC) je 0,754, kar pomeni, da je informativnost uporabljenih mikrosatelitnih markerjev oz. stopnja, pri kateri določimo genetsko identiteto rastlin, visoka. Povprečna stopnja pričakovane heterozigotnosti (He) za vse lokuse znaša 0,872, to pomeni, da so uporabljeni mikrosatelitni markerji zelo primerni za ločevanje vključenih genotipov med seboj in da so le-ti genetsko zelo raznoliki. Ta vrednost je pogojena tudi s številom alelov in njihovo frekvenco na posameznem lokusu, saj se je povprečno namnožilo 16,9 alelov na lokus. Povprečna dejanska heterozigotnost (Ho) je 0,553, kar predstavlja delež heterozigotnih predstavnikov v analizirani skupini vzorcev. Razlika med He in Ho je bila največja na lokusih MR187, Ni3-G04b, BRMS-050 in BN83B1, kar je posledica prisotnosti ničtih alelov na teh lokusih, saj njihova ocena frekvence presega vrednost 0,2. Kot najbolj informativni so se izkazali lokusi Na12-A07, BN83B1 in Ra2-E12. Njihova PIC vrednost je nad 0,8, verjetnost enakosti genotipov pa je pod 0,02. Srednje 77 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE informativna skupina mikrosatelitnih markerjev glede na parametre variabilnosti vključuje lokuse BRMS-050, Ra2-A01, MR187, Ol13-E08, Na10-A08, Ra3-H10, Ni4-D09 in Ni3-G04b. Informacijska vrednost polimorfizma se giblje med 0,7 in 0,8. Kot najmanj primerni mikrosatelitni markerji pa so se v analizi izkazali lokusi Ol12-E03, Ol12-D05 in Ni4-H04, saj se njihove PIC vrednosti med 0,6 in 0,7. Rezultati analize na osnovi različnih parametrov variabilnosti za posamezen lokus so predstavljeni v preglednici 3. Lokus Št. alelov OFo Ho He PIC PI BN83B1 18 0,263 0,412 0,915 0,829 0,013 BRMS-050 20 0,266 0,390 0,893 0,791 0,020 MR187 20 0,296 0,325 0,884 0,772 0,023 Na10-A08 21 0,160 0,571 0,871 0,761 0,024 Na12-A07 22 0,153 0,628 0,922 0,843 0,011 Na12-C08 14 0,229 0,467 0,902 0,803 0,017 Ni3-G04b 14 0,253 0,384 0,855 0,713 0,037 Ni4-D09 14 0,164 0,560 0,868 0,739 0,030 Ni4-H04 14 0,123 0,558 0,778 0,607 0,070 Ol12-D05 20 0,136 0,563 0,809 0,668 0,048 Ol12-E03 14 0,066 0,714 0,836 0,685 0,045 Ol13-E08 15 0,157 0,581 0,877 0,753 0,027 Ra2-A01 14 0,068 0,760 0,887 0,774 0,022 Ra2-E12 16 0,168 0,583 0,902 0,807 0,017 Ra3-H10 18 0,039 0,804 0,878 0,761 0,025 Skupaj 254 Povprečje 16,9 1,272x10 0,553 0,872 -24 0,754 Preglednica 3: Parametri variabilnosti za posamezne lokuse, kjer je: OF o - ocena frekvence ničtih alelov, Ho - dejanska heterozigotnost, He - pričakovana heterozigotnost, PIC – Informacijska vrednost polimorfizma in PI – verjetnost enakosti genotipov. Diskusija Na osnovi različnih parametrov variabilnosti za posamezen marker (lokus) je mogoče interpretirati dobljene rezultate o informativnosti in ustreznosti uporabe molekulskih markerjev. Z uporabo izbranih markerjev smo uspešno ločili genotipe na nivoju vrste, podvrste in sorte, povprečno se je na posameznem lokusu namnožilo 16,9 alelov. V analizo so vključeni tudi zelo sorodni predstavniki vrste B. napus, nekateri imajo skupni izvor in so si tudi po zunanjem izgledu zelo podobni. Tako bi v zgodnji fazi razvoja na podlagi morfoloških znakov težko ločili med oljno ogrščico (B. napus) in oljno repico (B. rapa), čeprav so genetske razlike med njima tolikšne, da spadata v različni vrsti. Zato ju je z uporabo primernih mikrosatelitnih markerjev mogoče ločiti, kar smo dokazali tudi v naši analizi. Poleg tega so izbrani mikrosatelitni markerji pokazali dovolj visoko 78 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE informativnost tudi za ločevanje genotipov znotraj vrste, med oljno ogrščico (B. napus subsp. napus) in podzemno kolerabo (B. napus subsp. napobrassica) ter tudi med različnimi sortami iste vrste (med sortama oljne ogrščice in med sortama podzemne kolerabe). Izvor B. napus po teoriji trikotnega diagrama (angl. Triangle of U) razlaga spontana kombinacija genomov treh predniških vrst iz rodu Brassica (B. nigra, B. oleracea, B. rapa) iz katerih so nastale tri nove oljne in 9 zelenjadne vrste (medvrstni križanci) (B. carinata, B. juncea, B.napus) . Zato so si ti predstavniki genetsko zelo blizu, vendar smo jih s pomočjo mikrosatelitnih markerjev, ki so bili izolirani iz različnih rastlinskih vrst iz rodu Brassica (preglednica 2), lahko uspešno ločili. Glede na rezultate PI vrednosti za vse lokuse, ki so bile nizke, lahko sklepamo, da so izbrani mikrosatelitni markerji ustrezni. PI vrednost namreč predstavlja verjetnost, da imata katerakoli dva izbrana genotipa dva enaka alela na posameznem lokusu, zato je vrednost odvisna od števila alelov in njihove frekvence. Nizka povprečna PI vrednost kaže tudi na enakomerno razporejenost alelov med analiziranimi vzorci. Marker BRMS, ki se je v analizi spolno kompatibilnih sorodnikov B. napus izkazal kot srednje informativen, s PIC vrednostjo 0,791, se je v tudi v podobni študiji identifikacije polimorfizmov znotraj B. rapa izkazal za malenkost bolj informativnega; tam je 5 bila njegova PIC vrednost 0,845 . Kot najbolj informativni so se izkazali markerji, izolirani iz rodu Brassica (BN83B1) ter iz vrst B. napus in B. rapa, zato so lahko le-ti njihove predstavnike tudi uspešno ločili. Ocenjena frekvenca prisotnosti ničtih alelov, ki je bila najvišja na lokusu MR187 in smo ga označili kot srednje informativnega pa je verjetno posledica prisotnosti homozigotnih ničtih genotipov, pri katerih PCR amplifikacije sploh ni bilo. Ugotovili smo, da so bili glede na rezultate mer variabilnosti izbrani mikrosatelitni markerji visoko polimorfni in visoko informativni, četudi so bili analizirani genotipi precej raznoliki. Na nekaterih lokusih smo na podlagi visoke PIC vrednosti lahko uspešno ločili tudi genotipe znotraj vrste, podvrste in celo med sortami. Glede na to predpostavljamo, da bomo z uporabo najbolj informativnih markerjev v nadaljnjih analizah lahko uspešno določil tudi opraševalne in sorodstvene povezave med referenčnimi genotipi in tistimi, ki se pojavljajo v naravnem okolju kot plevelne ali podivjane rastline. Ti predstavniki se iz leta v leto ohranjajo, akumulirajo gene iz spontanih opraševanj s spolno kompatibilnimi sorodniki, zato bomo na podlagi podatkov te analize lahko identificirali tudi kvalitativne spremembe v alelni strukturi med obravnavanimi genotipi ter ocenili genetsko razdaljo in stopnje prenosa genov med njimi. Reference 1. 2. 3. R. Snowdon, W. Lühs, W. Friedt. Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants. V: Oilseeds, Volume 2. Kole, C. (ed.). The Pennsylvania State University, Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 2007, 55-114 W. Friedt, R. Snowdon. 2009. Oil crops, Handbook of Plant Breeding 4.V: Oilseed rape. Vollman J., Rajcan I. (eds.). Giessen, Springer Science+Business Media: 2009; 91-126 C. A. Stace. New Flora of the British Isles. Second edition. Cambridge: 1997; 1095 str. 79 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 4. A. K. Szewc-McFadden, S. Kresovich, S. M. Bliek, S. E. Mitchell, J. R. McFerson J. R. Identification of polymorphic, conserved simple sequence repeats (SSRs) in cultivated Brassica species. Teheor. Appl. Genet., 1996; 93: 534-538 5. K. Suwabe, H. Iketani, T. Nunome, T. Kage. Isolation and characterization of microsatellites in B. rapa. Theor. Appl. Genet., 2002; 104: 1092 1098 6. M. I. Uzanova, W. Ecke. Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in oilseed rape (B. napus L.). Plant Breeding, 1999; 118: 323-236 A. J. Lowe, C. Moule, M. Trick, K. J. Edwards. Efficient large-scale development of microsatellites for marker and mapping applications in Brassica crop species. Theor Appl Genet., 2004; 108: 1103-1112 7. H. W. Wagner, K. M. Sefc. IDENTITY4.0. Centre for Applied Genetics, University of Agricultural Sciences Viienna, 1999 8. U. Nagaharu. Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization. Japan J. Bot., 1935; 7: 389-452. Abstract. Informativity of molecular markers is very important information in genetic analysis for distinguishing between related genotypes. In our study, we analyzed the parameters of variability for 15 microsatellite markers (isolated from different focal species of the genus Brassica) to distinguish between sexually compatible relatives of Brassica napus. There were included reference genotypes from the Brassicaceae family with high affinity of natural cross-pollination with B. napus, two genotypes B. napus subsp. napobrassica, two genotypes B. napus subsp. napus (their seeds were obtained from gene banks), and feral or weed genotypes of sexually compatible relatives that we have collected in the years 2008 and 2010 around Slovenia. The analyzed group of plant samples was actually very diverse, involving representatives of different genera within the Brassicaceae (Brassica, Diplotaxis, Raphanus, Rapistrum, Sinapis), and within representatives of the same species. Morphologically are these plants very similar but their genetic differences allow us to distinguish between genotypes by using selected microsatellite markers and determine if the spontaneous cross-pollination naturally occurred. Results of the parameters of variability for selected microsatellite loci distinguish these genotypes well because the average polymorphic information content is 0.754, the total probability of identity is very low, 1.272x10-24. On average, 16.9 alleles per locus were amplified, which are, considering to low value of probability of identity, uniformly distributed among the analyzed samples. Low average of expected heterozygosity (0.872) presents a high probability of selected markers to distinguish between genotypes and reflecting their genetic diversity. We have found that the calculated values of parameters show high informativity and polymorphism of selected micoratellite markers and that we are capable to determine the gene flow on the level of species, subspecies and varieties, successfully. Keywords: Brassica napus L., sexually compatible relatives, microsatellite markers, locus, the parameters of variability, gene flow. 80 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE ZNANSTVENI PRISPEVEK Modeliranje prenosa genov in stopnje tujeprašnosti pri koruzi v primeru soobstoja z GSO Katja Rostohar1, Andrej Blejec2 , Vladimir Meglič1, Jelka ŠuštarVozlič1 1 Kmetijski inštitut Slovenije, Hacquetova ulica 17, 1000 LJUBLJANA 2 Nacionalni inštitut za biologijo, Večna pot 111, 1000 Ljubljana Izvleček. Koruza je tujeprašna rastlina, zato je v primeru soobstoja GSO in ne-GSO posevkov možno opraševanje med njimi. Na osnovi podatkov poljskega poskusa smo preučevali različne dejavnike, ki vplivajo na nenamerno prisotnost GSO, ki nastane zaradi prenosa genov (tujeprašnosti) med GSO in ne-GSO posevki. V primeru soobstoja smo preučevali razporeditev deležev tuje oplodnje oz. stopnje tujeprašnosti (TP) v ne-GS posevkih. Na osnovi rezultatov smo razvili model, ki omogočajo določevanje TP v ne GS posevkih. Na TP je vplival predvsem položaj posevkov (donorja in receptorja). Najvišji deleži TP so bili v neposredni bližini donorja. Z oddaljenostjo od donorja deleži TP eksponentno padajo. Z metodo prileganja smo na osnovi izmerjenih deležev TP na določenih razdaljah od donorja razvili modele, funkcije prileganja, ki določajo delež TP. S pomočjo funkcij smo izračunali razdalje, kjer delež TP pade pod izbrano mejo (npr. 0,9%) ter povprečne deleže TP na celotni njivi, ki so pomembni pri označevanju posevkov v primeru soobstoja. Povprečen delež na celotni njivi je odvisen od položaja donorskega (GS) in receptorskega (ne GS) polja ter od dolžine receptorskega polja. Predpisano mejo označevanja 0,9% presežejo le posevki, ki mejijo z donorjem s celotnim robnim delom (tip A) in so krajši od 45m. Predpisano mejo označevanja 0,9% presežejo le posevki, ki mejijo z donorjem s celotnim robnim delom (tip A) in so krajši od 45m. Daljši posevki od 50m pa so imeli povprečen delež TP nižji od 0,9%. Prav tako so na njivah, ki mejijo z donorjem samo s kotnim delom (tip B), povprečni deleži TP pod predpisano mejo 0,9%, kar omogoča soobstoj GS posevkov z ostalimi. Ključne besede: GSO, koruza, tujeprašnost, prenos genov, EU zakonodaja, soobstoj, modeliranje. Uvod Koruza je tujeprašna rastlina z ločenimi moškimi in ženskimi cvetovi, ki se oprašuje s pomočjo vetra. V večini primerov traja prašenje od 7 do 10 dni in je odvisno od vremenskih razmer. Pelod praši v velikih količinah, 14 – 50 1 milijonov pelodnih zrn na povprečno razvito koruzno rastlino . Cvetni prah je 2 relativno velik in težak, kar ima vpliv na njegovo disperzijo v prostoru . 3 Koruza je najbolj razširjena poljščina v Sloveniji . V letu 2009 so v Evropski uniji (EU) gensko spremenjeno (GS) koruzo pridelovali na 94,750 ha, od tega 4 80 % v Španiji . V Sloveniji GS hibridov koruze še ne pridelujemo. Slovenija kot članica EU ne more izključiti nobenega tipa kmetovanja, to bi bilo 5 namreč v nasprotju z zakonodajo EU. Namen zakona je zagotavljanje pravnega okvirja, v katerem bodo ob upoštevanju pravil soobstoja mogoče vse oblike kmetovanja. Ker so pogoji za kmetovanje v posameznih državah 81 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE članicah (oz. pokrajinah) različni, evropska komisija področja o soobstoju ni 6 zakonsko predpisala, ampak je izdelala le priporočila (2010/c 200/01) , po katerih vsaka država to področje lahko ureja sama. Da ima potrošnik možnost 7 proste izbire med GS in ne-GS izdelki, je po Direktivi 1830/2003 , predpisano označevanje izdelkov, ki vsebujejo GSO. Ker pa lahko pride do nenamerne 8 prisotnosti dovoljenih GSO v ne-GS izdelkih je po direktivi 1829/203 predpisana vrednost 0,9% za hrano in krmo, do katere označevanje ni potrebno. Tako je primeru soobstoja pomembno določiti raven nenamerne prisotnosti GSO v ne-transgenih posevkih že pred spravilom, da se le-ti 9 ustrezno ločijo in označijo in se tako zagotovi ustrezna sledljivost . Viri nenamerne prisotnosti GSO pri koruzi so znani in jih razdelimo v štiri tipe: primesi v semenu (nečisto seme), tuja oplodnja (tujeprašnost), samosevne 10 rastline ter mešanje tekom spravila, predelave ali shranjevanja . Tujeprašnost pri koruzi je največja prav med sosednjimi posevki, kjer so tujeprašnost 1,11,12,13 proučevali v številnih študijah . Prenos genov oz. stopnjo tujeprašnost 1,14 lahko simuliramo s pomočjo barvnih markerev . Na stopno TP vplivajo različni dejavniki: Eden od pomembnih dejavnikov je koncentracija peloda. Ta je odvisna od vremenskih razmer (temperature, vlažnosti, vetra …) ter količine rastlin, ki sproščajo pelod. Zaradi relativno visoke teže koruznega peloda se le-ta v večini odloži na krajših razdaljah, zato TP z razdaljo od vira pada. Visoke temperature ter nizka relativna vlažnost 13 vplivata na povišanje koncentracije peloda ter na skrajšanje časa cvetenja . Močan veter lahko prenaša pelod na daljše razdalje in s tem poveča oplodnjo na večjih razdaljah. Veter ima pomemben vpliv le v primerih, ko ima zadostno moč in prevladujočo smer. Okoli 98 % peloda se odloži na prvih 25 m, le redki, odvisno od vremenskih razmer, se odložijo na razdaljah daljših od 100m. 1 Prisotnost tuje oplodnje je bila dokazana tudi na razdalji večji od 200m . Seveda pa naravne ovire, kot so drevesa ali posevki koruze, večje (izolacijske) razdalje med polji ter časovni zamik cvetenja med sosednjimi posevki koruze 1,12,13 zmanjšajo TP med posevki . Vpliv imajo lahko tudi lokalne vremenske 15 razmere . Ker so v različnih pridelovalnih in okoljskih razmerah pogoji različni, 16 je potrebno vsako situacijo obravnavati posebej . Zaradi številnih dejavnikov, ki vplivajo na TP, so deleži zelo variabilni. Delež TP z oddaljenostjo od vira 17 pada, prav tako variabilnost , kar je pomembno pri ocenjevanju deleža tujeprašnosti v posevkih. Dejanske deleže na celotnem posevku lahko 18,19 natančneje določimo s pomočjo metod vzorčenja na polju . Deleži pa so pomembni za sledljivost GSO ter dosledno označevanje, ki omogoča kupcem prosto izbiro. S pomočjo manjšega poljskega poskusa smo (v okviru mednarodnega in domačega projekta o soobstoju) preučevali vpliv različnih dejavnikov na stopnjo tujeprašnosti (TP) ter predstavili TP med sosednjimi posevki. Tako smo razvili modele (funkcije prileganja), ki napovedujejo stopnjo TP na sosednjih posevkih, ki sta ključna pri določanju pravil soobstoja. 82 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Materiali in metode Poljski poskus S pomočjo dvoletnega poskusa, ki smo ga izvajali v Jabljah pri Trzinu, smo pridobili podatke o tujeprašnosti na polju. Na polju velikosti 120 m x 120 m je bila rumena sorta (simulirala gensko spremenjeno) posajena v sredini na razdalji 20 m x 20 m, območje imenujemo donorsko polje ali donor, okoli nje na razdalji 50 m pa je posajena bela koruza (simulirala konvencionalno sorto), območje imenujemo receptorsko polje ali receptor. Rumena koruza praši na območju bele koruze; tako oplojena zrnja na beli koruzi so rumeno obarvana – tujeprašno zrnje, 9 slika 1. Delež rumenega zrnja nam pove stopnjo TP oziroma pretok genov . Slika 1: Rumeno obarvano, tujeprašno, zrnje na beli koruzi Vzorce (koruzne storže) smo pobrali v treh različnih mrežah. V osnovni mreži (OM), kjer so bili vzorci enakomerno razporejeni po celotnem polju, smo pobrali 1470 vzorcev. Okoli donorja, kjer smo pričakovali višje deleže, smo dodatno pobirali vzorce v dveh mrežah. V prvi mreži smo zajeli 10m pas okoli donorja, zgostitvena mreža 1 (ZM1), kjer smo dodatno pobrali 631 vzorcev. V drugi še bolj zgoščeni mreži, zgostitvena mreža 2 (ZM2), smo vzorčne enote pobirali na razdalji 3 m okoli donorja, dodatno smo pobrali 390 vzorcev. Vsakem vzorcu (storžu) smo prešteli rumeno in belo zrnje, da bi izračunali stopnjo TP. V času cvetenja smo merili čas cvetenja donorskim in receptorskim rastlinam, da bi ugotovili ali je bilo cvetenje enakomerno. S pomočjo meteoroloških postaj smo merili temperaturo ter smer in moč vetra, da bi z analizo ugotovili vpliv teh dejavnikov na TP. Metode Podatke (meteorološke, geometrijske ter TP) smo za nadaljnje analize uredili v Excelu. 1 Na osnovi podatkov izražanja rumenega markerja , smo delež TP oz. delež prenosa GS genov izrazili kot delež rumenega zrnja na beli koruzi polovic. 20 S metodami regresijskih analiz v programskem paketu WEKA smo ugotavljali 83 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE vpliv različnih parametrov na TP. Podatke smo analizirali z uporabo razvrstitvenih 21 dreves (classifier trees) in metodo M5P . Kot odvisne spremenljivke smo v analizo vključili geometrijske parametre; mindist označuje najkrajšo razdaljo vzorčne enote do roba donorja, visangle označuje kot med vzorčno enoto ter skrajnima robovoma donorja za vsako posamezno enoto. Od meteoroloških podatkov smo v analizo vključili podatke za veter. Spremenljivka windT izraža vsoto dolžin čez donor ter windP označuje skupna vsoto ur, ki jih opravi veter, ko piha v smeri proti vzorčni enoti. Kot neodvisno spremenljivko smo v izrazili TP (%). Rezultate smo predstavili z modelnimi drevesi. Spodnji del drevesa smo obrezali. S pomočjo Pearsonovega korelacijskega koeficienta (CC) smo merili moč pojasnjene variabilnosti posameznim modelom. Delež TP na celotnem polju ali določenem delu, smo izračunali kot povprečno vrednost vzorčnih enot v osnovni mreži na določenem območjih, saj so tam enote razporejene enakomerno po celotnem receptorju. 22 S pomočjo statističnega programa R smo analizirali deleže TP na različnih položajih njive glede na oddaljenost od donorja (x). Ocenili smo povprečne vrednosti v dva metra širokih pasovih glede na oddaljenost od vira. Z metodo 23 prileganja, nonlinear least squares NLS , smo določili funkcijo prileganja parametra K in a, kjer smo uporabili potenčno funkcijo oblike: (1) Funkcija določa TP(%) na razdalji x od donorja. Parameter K določa TP v neposredni bližini vira ter parameter a določa koeficient padanja TP z oddaljenostjo od donorja. Za določeno stopnjo TP smo izrazili razdaljo x, tako smo dobili razdaljo na receptorskem polju, kjer TP pade pod izbran delež TP. Izračunali smo razdalje na polju kjer TP pade pod mejo 0,9%, 0,5%, 0,3% ter 0,1%. (2) Z integriranjem funkcije TP(x) po dolžini njive d (d1 je začetek njive in d2 je konec njive) smo ocenili delež TP na celotnem polju: (3) Uporabili smo dolžine njiv d1=0.05 ter d2=25m, d2=50m in d2=100m. 84 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Rezultati Vpliv parametrov na TP Z regresijsko analizo, kjer smo vključili odvisne spremenljivke (visangle, mindist, windP, windTL) smo ugotovili, da na delež TP vplivajo predvsem geometrijski parametri. Iz modelnih dreves razberemo, da imata glavni vpliv na TP spremenljivki razdalja od donorja (mindist) ter vidni kot vzorčne enote z donorjem (visangle), ki se pojavita pri cepljenju drevesa (v sivih okencih) V prvi analizi smo vključili enote vseh mrež (OM, ZM1, ZM2). Največji vpliv na TP je pokazala geometrijska spremenljivka oddaljenost od vira (mindist), slika 2. Na koncu modelnega drevesa, kjer lahko razberemo deleže TP (v rumenih okencih) v posameznih razvrstitvenih skupinah, so največji deleži v skupinah, ki bliže vira (mindist manjši). Na razdalji do 1m je pričakovan delež TP 9.4%. Na razdalji od 3,8m – 11,5m pa približno 0,6 %, kar je pod mejo označevanja 0,9%. Model je pojasnil 83.8 % variabilnosti spremenljivke TP. Slika 2: Modelno drevo za napovedano vrednosti TP(%) z uporabo programske opreme WEKA, kjer so bili v analizo vključeni podatki vseh treh mrež (OM, ZM1, ZM2). Da bi bili vzorci enakomerno razporejeni po celotnem polju, smo v drugi analizi vključili le vzorčne enote osnovne mreže (OM). Regresijsko drevo (slika 3), pokaže največjo odvisnost TP s spremenljivko vidni kot (visangle). Ta določa položaj vzorčne enote, glede na donor. Enote, ki so ob stranicah ter enote, ki so bliže donorju in imajo zato večji kot z donorjem (večja vrednost visangle). Na teh enotah so tudi povišani deleži TP. Model pojasni 83,6% variabilnosti spremenljivke TP. 85 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 3: Modelno drevo za napovedano vrednosti TP(%) z uporabo programske opreme WEKA, kjer so bili v analizo vključeni podatki osnovne mreže (OM). Če iz regresijske analize izključimo meteorološke parametre, se del pojasnjene variabilnosti zmanjša za manj kot 1 %. Zato smo glede na položaj vzorčne enote glede na donor, receptorsko polje razdelili na dva tipa: tip polja A, ki je v stiku z donorjem s celotno dolžino (robno polje), ter tip polja B, ki je v stiku z donorjem le s kotnim delom (kotno polje), slika 4. Slika 4: Shematski prikaz poljskega poskusa z dvema tipoma polja, A in B. Deleži TP na njivi Večji deleži tujeprašnosti so bili na območjih, ki so bliže donorju,. Delež tujeprašnosti z razdaljo, pri obeh tipih polja (A in B), eksponentno pada, slika 5. Višji deleži so na polju A (robno polje) kot na polju B (kotno polje), graf 1. Razlike med deleži tipa polja A in B pa so le na prvih 10m. Na bolj oddaljenih razdaljah od donorja, več kot 15m, so povprečni deleži TP pri obeh tipih polja izenačijo in znašajo približno 0.1%. 86 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 5: Povprečen delež TP(%) na receptorskem polju v odvisnosti od razdalje (m) od donorja. Povprečni delež TP na celotnem receptorskem polju tipu polja A, dolžine 50 m je bil 0,8% ter na tipu polja B, dolžine 50m, 0,11%. Funkcije prileganja Z metodo prileganja smo določili parametre (K in a) potenčne funkcije (enačba 1) posebej za polje tipa A in B, ter tako dobili funkcije prileganja, slika 6. Funkcija prileganja za tip polja A ima višjo vrednost parametra K (TP so na krajših razdaljah večje) in parametra a (TP z razdaljo hitreje pada) kot funkcija prileganja za tip polja B. Slika 6: Odvisnost TP od razdalje (logaritemska skala) za tip polja A in B. Točke označujejo povprečne deleže TP(%) na določenih razdaljah; premice prikazujejo izračunane funkcije prileganja; vodoravne črte označujejo izbrane deleže TP(%). *Izračunani parameV legendi so v oklepih podani izračunani parametri funkcij prileganja. 87 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Iz funkcij prileganja smo izračunali razdalje (enačba 2), na katerih delež TP pade pod izbrano mejo, preglednica 1. Pri tipu polja A pade TP pod mejo označevanja na razdalji 5m, medtem ko pri tipu B že na razdalji 2m od donorja. Nižji delež TP je dosežen na daljših razdaljah od donorja. Delež TP pade pod 0,1% pri tipu A na razdalji 22m, ter pri tipu B na razdalji 35m. Z integriranjem funkcije prileganja po dolžini polja (enačba 3) smo ocenili povprečni delež TP na celotnem polju, TP(d), za oba tipa polja, A in B, preglednica 1. Deleži na tipu polja A so bili višji kot pri tipu polja B. Vrednosti so primerljive s povprečnimi vrednostmi vzorčnih enot poljskega poskusa, kjer je bil povprečni delež TP na polju tipa A 0,8%, dolžine njive 50m, ocenjen delež (enačba 3) pri dolžini njive, TP(50m) pa je bil 0,82%. Na tipu polja B so deleži TP nižji, zato so tudi povprečni delež na celotni njivi nižji in znaša na njivi velikosti 50x50m (oddaljenost od donorja 70m) 0,11%, ocena TP z integralom funkcije prileganja za tip polja B (enačba 3), pri dolžini njive, TP(70m) je znašal 0,17%. Preglednica 1: Razdalje (m), kjer je dosežen določen delež TP; povprečnih deležev na celotnem posevku pri izbranih dolžinah njive – d(m). Povprečen delež na polju je odvisen predvsem od položaja receptorja glede na donor (tip polja A ali B) ter od dolžine njive (posevka). Na njivah tipa A, ki so krajše od 25m je ocenjeni povprečni delež višji od 0,9% in znaša pri dolžini njive 25m 1,6%. Ocenjen delež na njivi dolžine 100 ne pade pod 0,3%. Diskusija Nenamerna tujeprašnost med sosednjimi posevki koruze lahko povzroča prisotnost GSO v konvencionalnih in ekoloških posevkih. S pomočjo poljskega poskusa, kjer smo se omejili na majhna in razdrobljena polja (značilna za Slovenijo), smo preučevali dejavnike, ki vplivajo na tujeprašnost ter preučevali deleže TP med sosednjimi posevki koruze, z namenom da bi ugotovili možnost soobstoja GS posevkov z ostalimi. Ker sta donor in receptor cvetela sočasno, vpliva zamika cvetenja nismo ocenjevali. Z regresijsko analizo smo ugotovili, da na TP pri koruzi, pri zmernih vremenskih pogojih, vplivajo predvsem geometrijski parametri. Večji deleži tujeprašnosti so bili na območjih, ki so bliže donorju, kar je pričakovati, saj je 11 koncentracija peloda na tem območju večja . Prav tako je pomemben položaj njive, kjer so deleži na robnih delih polja (tip polja A) višji od tistih, ki mejijo z donorjem le v kotnem delu (tip polja B). Meteorološki parametri v našem poskusu niso imeli značilnega vpliva, kot v nekaterih drugih študijah z malim donorjem in 88 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 1 zmernimi vremenskimi pogoji . Ker na TP vpliva oddaljenost od vira, smo s pomočjo metod prileganja ocenili parametre funkcije, ki ocenjuje delež TP v odvisnosti od razdalje TP(x). Potrdili 1, 12, 13 smo, da delež TP z razdaljo od vira (x) strmo pada, kot v drugih študijah . Funkcije smo uporabili za izračun TP na celotnem polju in jih primerjali s predpisanimi mejnimi vrednostmi, ki so pomembne pri ugotavljanju možnosti soobstoja ter zagotavljanju sledljivosti, saj morajo biti pridelki, ki vsebujejo delež GSO nad predpisano mejo vrednostjo (0,9%) označeni da vsebujejo GSO. Izračunani deleži po modelu so bili primerljivi z povprečno vrednostjo vzorčnih enot v osnovni mreži. Ker so deleži v neposredni bližini donorja relativno visoki in z razdaljo strmo padajo, je povprečen delež TP na celotni njivi odvisen od dolžine njive. Ugotovili smo, da je soobstoj med različnimi načini kmetovanja možen tudi v primerih, kjer so posevki v neposredni bližini. Na njivah krajših od 45 m tipa A je ocenjen povprečni delež TP na polju nad 0,9%. Na posevkih daljših od 50 m pa so pričakovani povprečni delež nižji od 0,9%. Na tipu polja B, kjer so deleži TP nižji, je na posevkih daljših od 25m povprečen delež TP pod 0,31%, zato pridelkov s teh posevkov ni potrebno označevati da vsebujejo GSO (pri mejni vrednosti 0,9%). Na njivah krajših od 45 m tipa A je ocenjen povprečni delež TP na polju nad 0,9%, zato je pridelke teh posevkov potrebno označiti da vsebujejo GSO. Z uporabo izolacijskih razdalj (isolation distance), zaščitnih pasov koruze (discard/buffer zone) ali časovnega zamika cvetenja med donorjem in 12 receptorjem lahko dodatno zmanjšamo tujeprašnost med posevki ter tako preprečimo nenamerno prisotnost GSO v ne-GSO posevkih in omogočimo soobstoj. Seveda pa je potrebno upoštevati, da so pri večjih njivah koncentracije peloda 11 višje , zato so deleži tuje oplodnje med sosednjimi njivami večji. Na delež GSO vplivajo še drugi viri (samosevne rastline, nečisto seme …), ki dodatno zvišajo 24, 25, 16 delež nenamerne prisotnosti GSO v posevkih . 16 Ker so deleži TP zelo variabilen pri različnih situacijah , lahko dejanski delež TP na polju ocenimo z vzorčenjem posevka, kjer ocenimo delež s pomočjo funkcije prileganj. Tako je delež TP na polju odvisen od oblike funkcije prileganja 9 (vzorčnih ocen) ter od dimenzije (dolžine) receptorskega polja . Reference 1. 2. 3. 4. 5. Čergan, Z. Koruza. Kmečki glas, Ljubljana. 2008. 314 str. Bannert, M. Simulation of transgenic pollen dispersal by use of different grain colour maize. Dissertation no. 16508. Swiss Federal Institute of Technology of Zürich. 2006. 92 p. Statistični urad Republike Slovenije (SURS). SI-Stat podatkovni portal. Dosegljivo na: http://pxweb.stat.si/pxweb/Database/Okolje/Okolje.asp (10.7.2011) GMO Compass, 2010. GM plants in the EU in 2009. Dosegljivo na: http://www.gmocompass.org/eng/home/ (10.7.2011) Ur.l. RS, št. 41/2009. Zakon o soobstoju gensko spremenjenih rastlin z ostalimi kmetijskimi rastlinami (ZSGSROKR). Dosegljivo na: http://zakonodaja.gov.si/rpsi/r06/predpis_ZAKO4836.html (23.4.2009) 89 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Evropska komisija. PRIPOROČILO KOMISIJE z dne 13. julija 2010 o smernicah za razvoj nacionalnih ukrepov soobstoja za preprečevanje nenamerne prisotnosti GSO v konvencionalnih in ekoloških pridelkih (2010/C 200/01). Dosegljivo na: http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/ LexUriServ.do?uri=OJ:C:2010:200:0001:0005:SL:PDF (21.7.2010) Uredba (ES) št. 1830/2003 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2003 o sledljivosti in označevanju gensko spremenjenih organizmov ter sledljivosti živil in krme, proizvedenih iz gensko spremenjenih organizmov, ter o spremembi Direktive 2001/18/ES http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32003R1830:SL:HTML (21.7.2010) Uredba (ES) št. 1829/2003 EVROPSKEGA PARLAMENTA IN SVETA z dne 22. septembra 2003 o gensko spremenjenih živilih in krmi. Dosegljivo na: http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=DD:13:32:32003R1829:SL:PDF (21.7.2010) Rostohar, K., Čergan, Z., Blejec, A., Kozjak, P., Meglič, V., Šuštar Vozlič, J. Soobstoj in določanje gensko spremenjenih organizmov v konvencionalni koruzi (Zea mays L.) na polju. Novi izzivi v poljedelstvu 2010: zbornik simpozija. Rogaška Slatina. 2010, str.145-149. Čergan, Z. is sod. , Dolničar, P., Kozjak P., Meglič, V., Šuštar-Vozlič, J., Ugrinović, k., Verbič, J., Vrščaj B., Zemljič A. Soobstoj in ohranjanje biotske raznovrstnosti v kmetijstvu (agrobiodiverzitete): specifične tehnologije pridelovanja in ohranjanje genskih virov kmetijskih rastlin. Kmetijski inštitut Slovenije, Ljubljana. 2005, 47 str. Jarosz, N., B. Loubet, B. Durand, A. McCartney, X. Foueillassar, in L. Huber. Field measurements of airborne concentration and deposition rate of maize pollen. Agricultural and Forest Meteorology. 2003, 119(1-2): 37-51. Della Porta G., Ederle D., Bucchini L., Prandi M., Verderio A., Pozzi C. Maize pollen mediated gene flow in the Po valley (Italy): Source-recipient distance and effect of flowering time. Europ. J. Agronomy. 2008, 28: 255-265. Langhof Maren; Hommel Bernd; Huesken Alexandra in sodelavci. Coexistence in Maize: Isolation Distance in Dependence on Conventional Maize Field Depth and Separate Edge Harvest. Crop Science. 2010, 50(4): 1496-1508 Chilcutt C.F. and Tabashnik B.E. Contamination of refuges by Bacillus thuringiensis toxin genes from transgenic maize. PNAS. 2004, 101(20):7526-7529. Hüsken A., Dietz-Pfeilstetter A. Pollen-mediated intraspecific gene flow from herbicide resistant oilseed rape (Brassica napus L.). Transgenic Res. 2007, 16: 557-569. Devos, Y., Demont, M., Dillen, K., Reheul, D., Kaiser, M., Sanvido, O. Coexistence of genetically modified (GM) and non-GM crops in the European Union. A review. Agronomy for Sustainable Development. 2009, 29: 11-30 Rostohar, K., Blejec, A., Meglič, V., Šuštar Vozlič, J. Application of statistical program R for development of sampling schemes for ensuring coexistence measures in maize fields. Program and abstracts: edited by Lara Lusa and Janez Stare. Statistical Society of Slovenia, Ljubljana. 2008, str. 58-59. Šuštar Vozlič, J., Rostohar, K., Blejec, A., Kozjak, P., Čergan, Z., Meglič, V. Development of sampling approaches for the determination of the presence of genetically modified organisms at the field level. Anal. bioanal. chem. 2010, 396(6): 2031. Allnutt, TR., Dwyer, M., McMillan, J., Henry, C., Langrell, S. Sampling and modelling for the quantification of adventitious genetically modified presence in maize. J Agr Food Chem. 2008, 56 (9): 3232-3237 Witten I.H., Frank, E. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques. Morgan Kaufmann, San Francisco. 2005, 2 edition. 90 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 21. Wang Y, Witten IH. Induction of model trees for predicting continuous classes. In: Proceedings of the Poster Papers of the European Conference on Machine Learning. Faculty of Informatics and Statistics, University of Economics, Prague. 1997. 22. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. 2008. 23. Bates, D. M. and Chambers, J. M. Nonlinear models. Chapter 10 of Statistical Models in S. eds J. M. Chambers and T. J. Hastie, Wadsworth & Brooks/Cole. 1992. 24. Palaudelmàs, M., G. Peñas, E. Melé, J. Serra, J. Salvia, M. Pla, A. Nadal, in J. Messeguer. Effect of volunteers on maize gene flow. Transgenic Res. 2009, 18(4): 583-594. 25. Dietiker, D., P. Stamp, in W. Eugster. 2011. Predicting seed admixture in maize combining flowering characteristics and a Lagrangian stochastic dispersion model. Field Crops Research. 2011, 121(2): 256-267. Abstract. In the case of the coexistence of genetically modified (GM) and non-GM maize cross-pollination can occur between neighbouring fields and cause adventitious presence of GM maize in non-GMO crop. Based on a field trial data, we studied various factors that affect cross-pollination (gene flow) and to determine the outcrossing rate (OCR) in the neighbouring fields that are important in setting in the coexistence of GM crops with others. On this basis, we have developed a model that determines the OCR in the neighbouring fields. Geometrical parameters such as position of the GM (donor) and non-GM (receptor) maize field showed the highest influence on cross-pollination. The highest OCRs were in the direct vicinity of the pollen source (donor) up to the distance 15m. With increase distance from the pollen source, the OCR rapidly decreased. The fitting method was used to estimate the OCR as a function of distance OCR(x). The function was used to calculate distance where the OCR decreased below a selected threshold (0.9%, 0.5% ...) and to calculate the mean OCR on the entire field. The measures are important for the labelling of the harvested grain and in the assessment of co-existence between different crop productions. The mean OCR on the total field is dependent on the position of donor and receptor fields and on the length of the receptor field. The selected threshold exceeded only in the field type A (field to field situation) in the fields with a length less than 45m. Longer fields, more than 50m, and fields of type B had overall mean OCR below the threshold 0.9%, which allows the coexistence of GM crops with others. Keywords: GMO, maize, cross-fertilization, gene flow, outcrossing rate, the EU legislation, co-existence, modelling. 91 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE ZNANSTVENI PRISPEVEK Proučevanje proteoma listov navadnega fižola (Phaseolus vulgaris L.) v povezavi s sušnim stresom Study of proteome of common bean (Phaseolus vulgaris L.) leaves subjected to drought stress Tanja Zadražnik1, Kristin Hollung2, Vladimir Meglič1, Jelka ŠuštarVozlič1 1 Kmetijski inštitut Slovenije, Oddelek za poljedeljstvo in semenarstvo, Hacquetova ulica 17, 1000 Ljubljana, [email protected] 2 Nofima Mat, Osloveien 1, NO-1430 Ås, Norveška Izvleček. Sušni stres povzroča slabšo rast in razvoj rastlin, posledično pa vpliva na močno zmanjšanje pridelka agronomsko pomembnih rastlin, kot so tudi stročnice in med njimi navadni fižol. Cilj naše raziskave je bil določiti proteinske lise v listih izbrane sorte (»Starozagorski čern«) navadnega fižola (Phaseolus vulgaris L.), ki se različno izražajo v pogojih sušnega stresa glede na kontrolne pogoje. V ta namen so bile rastline v poskusu podvržene različnim stopnjam sušnega stresa (zgodnja in pozna faza), vključili pa smo tudi normalno zalivane rastline, ki so nam služile kot kontrolni vzorec. S pomočjo dvodimenzionalne gelske elektroforeze (2-DE) smo ločili diferencialno fluorescentno označene proteine rastlin podvrženih stresu in kontrolnim rastlinam. Na podlagi 543 proteinskih lis ločenih z 2-DE smo s pomočjo programa Progenesis SameSpot, ki omogoča obdelavo, prilaganje in statistično analizo proteinskih lis ter s statistično analizo regresije na osnovi vsote najmanjših kvadratov določili 76 proteinskih točk za nadaljnjo analizo z masno spektroskopijo. Ključne besede: navadni fižol (Phaseolus vulgaris L.), suša, proteomika, proteini, dvodimenzionalna gelska elektroforeza. Uvod Suša predstavlja enega izmed najbolj pogostih in škodljivih abiotskih stresov, kateremu so rastline med rastjo in razvojem večkrat izpostavljene. Splošni odziv rastlin na sušni stres vključuje fiziološke, celične in molekularne procese, 1 ki pomagajo rastlini pri spopadanju s stresom . Zelo pomemben pristop za analizo proteinov, udeleženih pri odgovoru rastlin na stresne razmere, omogoča proteomska analiza, s katero lahko identificiramo in kvantificiramo proteine v določenem tkivu in določenem trenutku. Proteom predstavlja zelo kompleksno in dinamično mrežo proteinov v celici, zato je mogoča le delna 2 identifikacija celičnega proteoma . Raziskave izražanja proteinov pri odzivu na stresne razmere pri navadnem fižolu (Phasoelus vulgaris L.) igrajo pomembno 3 vlogo, saj je navadni fižol zelo zastopan v prehrani ljudi povsod po svetu . Objavljene so številne raziskave sušnega stresa na proteomskem nivoju pri 4,5,6,7 različnih rastlinskih vrstah . Pri stročnicah so raziskave proteoma povezanega s sušnim stresom opravljene večinoma na modelnem organizmu, 92 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 8 9 10 ki ga predstavlja trnata meteljka , poleg tega pa še na soji , čičeriki ter 11 arašidih . Z molekulskimi analizami so identificirali številne gene, ki se inducirajo v sušnih razmerah ter transkripcijske faktorje, ki regulirajo gensko ekspresijo povezano s stresom. Produkti genov, induciranih ob suši, imajo vlogo tako pri začetnem odgovoru na stres, kot tudi pri vzpostavljanju tolerance. Pri navadnem repnjakovcu (Arabidopsis thaliana) in rižu so identificirali dve skupini proteinov, ki se izražajo v sušnih razmerah. Prva skupina vključuje proteine, za katere predvidevajo, da imajo vlogo pri razvoju tolerance. Sem spadajo šaperoni in LEA proteini (»late embryogenesis abundant protein«), osmotini, »antifreeze« proteini, mRNA-vezavni proteini, ključni encimi za biosintezo osmolitov, transportni proteini za vodo, sladkorje in prolin, detoksifikacijski encimi in številne proteaze. Drugo skupino pa sestavljajo regulatorni proteini oz. t.i. proteinski faktorji, ki so udeleženi pri regulaciji signalne transdukcije in ekspresiji genov povezanih s stresom. Omenjena skupina vključuje transkripcijske faktorje, kinaze in fosfataze, encime, ki so udeleženi pri 12 metabolizmu fosfolipidov in signalne molekule . Namen naše študije je poiskati razlike na proteinskem nivoju med rastlinami navadnega fižola, izpostavljenega sušnemu stresu in rastlinami pri normalnih pogojih rasti, kajti proteomska analiza odziva na sušni stres pri navadnem fižolu še ni bila opravljena, prav tako pa tudi še niso jasno opredeljeni mehanizmi odziva na sušo pri rastlinah. Materiali in metode Potek poskusa in priprava rastlinskega materiala. V proteomsko analizo sušnega stresa pri navadnem fižolu (Phaseolus vulgaris L.) smo vključili eno sorto - »Starozagorski čern« (Semenarna Ljubljana). Poskus je potekal v plastenjaku v Jabljah, vključenih je bilo 40 rastlin. Semena smo posadili v mešanico substrata in vermikulita (1:1, v/v). Po petih tednih rasti smo prenehali zalivati polovico rastlin, ostale rastline pa smo normalno zalivali in so služile kot kontrolni vzorec. Po 7, 12 in 17 dneh po prenehanju zalivanja smo začeli z vzorčenjem rastlin (preglednica 1). Vzorčili smo tretji pravi sredinski listič, vzorce pa smo takoj potopili v tekoči dušik in nato shranili na -80°C do nadaljnjih analiz. Vodni status rastline smo opredelili z relativno vsebnostjo vode (RVV) v tretjem strankem lističu. Obravnavanje Opis suša 1 suša 2 suša 3 blagi stres močnejši stres hud stres Vzorčenje rastlin po prenehanju zalivanja 7 dni 12 dni 17 dni Preglednica 1: Prikaz poteka poskusa. Vzorčili smo pet stresiranih in pet kontrolnih rastlin pri vsakem obravnavanju. 93 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Ekstrakcija proteinov. V analizo proteinov smo vključili kontrolne in stresirane rastline po 12 in 17 dneh od prenehanja zalivanja (suša 2 in suša 3). Vključili smo po štiri ponovitve za vsako obravnavanje. Liste smo homogenizirali v terilnici s tekočim dušikom, homogeniziran fin prah pa prenesli v epice ter dodali ohlajen aceton z 10% TCA in 1% DTT. Sledila je inkubacija 2 uri na -20°C in centrifugiranje 15 min na 4°C pri 13000 g. Odstanili smo supernatant ter trikrat spirali pelet z acetonom in 1% DTT. Pelet smo posušili na zraku ter nato raztopili v ekstrakcijskem pufru (7M urea, 2M tiourea, 4% CHAPS, 1% DTT). Supernatant smo prenesli v nove epice ter shranili vzorce na -80°C. Za oceno koncentracije proteinov smo enak volumen vzorcev nanesli na 1D gelsko elektroforezo. Fluorescentno označevanje proteinov in 2D gelska elekroforeza. Vzorce proteinskih ekstrakov navadnega fižola smo označili s fluorescentnimi barvili (Dyeagnostics) po navodilih proizvajalca. Fluorescentno označevanje temelji na principu diferencialne gelske elektroforeze (DIGE). Ločitev proteinov v prvi dimenziji smo izvedli na trakovih z imobiliziranim pH gradientom (IPG trakovi, BioRad), 24 cm, pri pH območju 5-8. Na posamezni strip smo nanesli dva proteinska vzorca (en označen z G-Dye200 in G-Dye300) in interni standard (G-Dye100), ki je bila mešanica vseh vzorcev vključenih v analizo. Izoelektrično fokusiranje je potekalo na Ettan IPGPhor II (GE Healthcare BioSciences). V drugi dimenziji so se proteini ločili na 12,5 % SDS-PAGE preko sistema EttanDALT twelve (GE Healthcare Bio-Sciences). Po končani elektroforezi smo gele skenirali s EttanDIGE Imager (GE Healthcare Bio-Sciences), pri specifični valovni dolžini ekscitacije in emisije za posamezno barvilo. Analiza podatkov. Podatke skeniranih gelov smo analizirali s programom Progenesis SameSpot (Nonlinear Dynamics), kjer smo izbrali referenčni gel in ročno pregledali ujemanje proteinskih lis med geli. S programom smo določili proteinske točke, ki so se statistično značilno razlikovale med stresiranimi in kontrolnimi rastlinami. Normalizirane volumne proteinskih lis smo analizirali še s statističnim programom Unscrambler (CAMO), kjer smo opravili analizo glavnih komponent (PCA) in analizo regresije na osnovi vsote najmanjših kvadratov (PLS). Na podlagi statistične analize in ročnega preverjanje proteinskih lis v programu Progenesis SameSpot smo določili proteinske točke za nadaljno analizo z masno spektrometrijo (MS). Rezultati Vpliv sušnega stresa na relativno vsebnost vode v listih. Rastline navadnega fižola smo podvrgli trem stopnjam suše, pri vsaki stopnji suše pa smo istočasno določili še RVV kontrolnim rastlinam. Pri prvi in drugi stopnji suše je bila vrednost RVV pri stresiranih rastlinah okoli 70 %, pri najhujši stopnji suše pa je dosegla vrednost 45 % (graf 1). Vrednosti RVV pri normalno zalivanih rastlinah so dosegle 78 – 90 %. 94 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Graf 1: Prikaz RVV v listih rastlin podvrženim suši in normalno zalivanih rastlin glede na tri različne stopnje sušnega stresa. Za določitev RVV smo vključili po pet rastlin podvrženem stresu in normalno zalivanih pri vsaki stopnji suše. Proteomska analiza proteinov in statistična analiza. S pomočjo 2-D gelov, kjer smo ločili proteine izolirane iz kontrolnih in stresiranih rastlin, smo detektirali 543 proteinskih točk, ki so se ujemale med vsemi obravnavanimi geli v pH območju 58 in območju molekulske mase od 10 – 100 kDa. S pomočjo statistične analize v programu Progenesis SameSpot in PLS analize smo določili proteinske lise, katerih natančno ujemanje med geli smo ročno pregledali s pomočjo programa Progenesis SameSpot. Določili smo 76 proteinskih lis, ki so se statistično značilno razlikovale med stresiranimi in kontrolnimi rastlinami (slika 2). Izmed 76 proteinskih lis smo zasledili 36 proteinskih točk, katerih izražanje se je zmanjšalo v pogojih suše, pri 40-ih proteinskihi lisah pa smo zasledili povečano izražanje v sušnem stresu. De novo indukcija izražanja proteinov v sušnem stresu je razvidna na sliki 3 v primeru proteinske lise 683. Analizo PCA, v katero smo vključili 543 normaliziranih volumnov proteinskih točk, smo uporabili za prikaz grupiranja vzorcev podvrženim stresu in kontrolnih vzorcev (slika 1). Prva komponenta pojasnjuje največ razprešenosti osnovnih podatkov, in sicer 38 %, druga komponenta pa pojasni 11 % variance. Omenjene analize so pokazale na primerno kakovost podatkov pridobljenih iz 2-D gelov. 95 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 1. Ovrednotenje razlik oz. variabilnosti med kontrolnimi vzorci in vzorci v sušnem stresu z analizo PCA. Pomen oznak: S3_ST1 – S3_ST4: suša 3 (štiri ponovitve), S2_ST1 – S2_ST4: suša 2, C3_ST1- C3_ST4: kontrola 3 (vzorčenje rastlin istočasno kot pri suši 3), C2_ST1 – C2_ST4: kontrola 2 (vzorčenje istočasno kot pri suši 2). Slika 2: 2-D gel s prikazanimi številkami proteinskih lis, katerih izražanje se je spremenilo v pogojih suše. 96 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 3: 3D pogled proteinske lise št. 683 s programom Progenesis SameSpot (levo) ter grafični prikaz logaritma normaliziranih volumnov glede na stresirane (suša 2 in 3) in kontrolne pogoje (kontrola 2 in 3) določenih z analizo v omenjenem programu (desno). Iz 3D prikaza je razvidno, da je verjetno prišlo do de novo indukcije izražanja proteina delno že v fazi suše 2, najbolj pa v pozni fazi suše. Diskusija Odgovor rastlin na stres je dinamičen proces, ki je odvisen od intenzitete stresa in 13 njegovega trajanja . Priprava rastlinskega materiala je ključna za kakršnekoli nadaljnje analize, vključno z analizo proteoma. V našem primeru smo poskus izvedli s tremi stopnjami suše, v analizo proteoma listov navadnega fižola pa smo vključili samo drugo in zadnjo fazo sušnega stresa, ker med prvo in drugo fazo sušnega stresa po določitvi RVV v listih ni bilo razlik. Vrednosti RVV v listih nakazujejo stopnjo dehidriranosti rastline, zato so nam služile kot pokazatelj določene faze suše. V našem primeru je bila za določitev razlik na nivoju 97 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE proteinov bistvena tretja faza suše, kajti tu smo v največji meri opazili povečano ali zmanjšano stopnjo izražanja proteinov (slika 2). Tako smo v analizo smiselno vključili vzorce, ki so se pri primerjalni analizi proteinskih profilov vzorcev rastlin izpostavljenih suši in proteinskih profilov kontrolnih vzorcev ter pri statistični analizi najbolj razlikovali. Razlike v proteinskem profilu različnih vzorcev smo matematično ovrednotili s PCA analizo. Tu je iz razvrstitve vzorcev glede na prvo in drugo komponento opazno združevanje vzorcev po obravnavanjih (suša 2 in 3 ter kontrola 2 in 3, slika 1), kar pomeni da ima sušni stres vpliv na sestavo proteoma v danih razmerah. Samo s pomočjo statistične analize proteinskih lis s programom Progenesis SameSpot, ki omogoča obdelavo in prileganje gelov nam ni uspelo določiti primernega števila proteinskih lis, katerih izražanje se je spremenilo v sušnem stresu. Statistična analiza programa omogoča določitev p-vrednosti, ki so pridobljene s statističnim testom ANOVA (analiza variance) ter recipročne qvrednosti. S programom smo dobili preveliko število proteinskih lis s spremenjenih izražanjem v stresnih pogojih, natančen ročni pregled proteinskih lis med vsemi geli v omenjenem programu pa je pokazal, da niso vse proteinske točke primerne za nadaljnjo obravnavo. Zato smo opravili še statistično analizo z metodo PLS, s katero smo lahko napovedali različne kvantitativne lastnosti vzorcev. Proteinske lise, pri katerih se je izražanje spremenilo v sušnem stresu in smo jih določili z metodo PLS, smo še preverili s statistično analizo v programu Progenesis SameSpot, kjer smo tudi ročno pregledali njihovo primernost za nadaljnjo analizo z MS. Tako smo določili 76 proteinskih lis, pri katerih je prišlo do povečanega ali zmanjšanega izražanja v stresnih pogojih glede na kontrolne pogoje. V sklopu naše raziskave bomo v nadaljevanju opravili še identifikacijo omenjenih 76 proteinskih lis, katerih izražanje se razlikuje med rastlinami podvrženimi stresu in kontrolnimi rastlinami. Glede na podobne študije opravljene na drugih rastlinah pričakujemo, da bodo imeli pri odgovoru na sušni stres najpomembnejšo vlogo proteini udeleženi v procesih metabolizma, proteini z zaščitno in detoksifikacijsko vlogo ter proteini, ki so udeleženi v procesih fotosinteze in signalne 14 transdukcije . Reference 1. 2. 3. 4. 5. Ramachanda Reddy A., Chaitanya KV, Vivekanandan M. Drought-induced responses of photosynthesis and antioxidant metabolism in higher plants. Journal of Plant Physiology 2004; 161: 1189-1202. Graves PR, Haystead TA. Molecular biologist's guide to proteomics. Microbiol Mol Biol Rev. 2002; 66(1):39-63. Broughton W. J., Hernandez G. Blair M., Beebe S., Gepts, P., Vanderleyden, J. Beans (Phaseolus spp.) – model food legumes. Plant and Soil 2003; 252: 55–128. Salekdeh G.H., Siopongco J., Wade L.J. Ghareyazie B., Bennett J.. A proteomic approach to analyzing drought- and salt-responiveness in rice. Field Crops Research 2002; 76: 199-219. Hajheidari M., Abdollahian-Noghabi M., Askari H., Heidari M., Sadeghian S.Y., Ober E.S., Salekdeh G.H. Proteome analysis of sugar beet leaves under drought stress. Proteomics 2005; 5(4): 950-60. 98 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Vincent D., Lapierre C., Pollet B., Cornic G., Negroni L., Zivy M. Water deficits affect caffeate O-methyltransferase, lignification, and related enzymes in maize leaves. A proteomic investigation. Plant Physiol 2005; 137: 949-960. Caruso G., Cavaliere C., Foglia P., Gubbiotti R., Samperi R., Laganà A.. 2009. Analysis of drought responsive proteins in wheat (Triticum durum) by 2D-PAGE and MALDITOF mass spectrometry. Plant Science 2009; 177(6): 570-576. Larrainzar E., Wienkoop S., Weckwerth W., Ladrera R., Arrese-Igor C., González E. Medicago truncatula Root Nodule Proteome Analysis Reveals Differential Plant and Bacteroid Responses to Drought Stress. Plant Phisiology 2007; 144: 1495-1507. Yamaguchi M., Valliyodan B., Zhang J.,. Lenoble M., Yu O., Rogers E., Nguyen H., Sharp R. Regulation of growth response to water stress in the soybean primary root. I. Proteomic analysis reveals region-specific regulation of phenylpropanoid metabolismand control of free iron in the elongation zone. Plant, Cell and Environment 2010; 33: 223–243. Pandey A., Chakraborty S., Datta A., Chakraborty N. Proteomics Approach to Identify Dehydration Responsive Nuclear Proteins from Chickpea (Cicer arietinum L.). Molecular & Cellular Proteomics 2007; 7:88–107. Kottapalli K.R., Rakwal R., Shibato J., Burow G., Tissue D., Burke J., Puppala N., Burow M., Payton P. Physiology and proteomics of the water-deficit stress response in three contrasting peanut genotypes. Plant, Cell & Environment 2009; 32(4): 380-407. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Gene networks involved in drought stress response and tolerance. Journal of Experimental Botany 2007; 58: 221-227. Kosová K., Vítámvás P., Prášil IT., Renaut J. Plant proteome changes under abiotic stress - Contribution of proteomics studies to understanding plant stress response. J Proteomics 2011; doi:10.1016/j.jprot.2011.02.006. Wang W, Vinocur B, Altman A. Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: towards genetic engineering for stress tolerance. Planta 2003; 218(1):114. Abstract. Drought is a limiting factor concerning plant growth and development and has a strong negative impact on productivity of agricultural important crops, such as grain legumes and among those, common bean. The goal of our study was to determine differentially expressed protein spots in drought stressed samples compared to control samples of common bean (Phaseolus vulgaris L.) leaves. A variety »Starozagorski čern« was selected for the experiment. For this purpose different stages of drought stress (early and late phase of drought) and regularly watered plants as control stage of treatment were included in the experiment. Protein samples from plants subjected to stressed and control conditions were labelled with different fluorescent dyes and were separated using twodimensional gel electrophoresis (2-DE). A total of 543 different leaf proteins were detected by 2-DE. Out of the total protein spots matched between all gels, 76 of them were differentially expressed due to a drought stress. These protein spots were determined by statistical analysis with Progenesis SameSpot software, which allows processing, alignment and analysis of statistical data of detected protein spots. Significance testing was also performed by partial least square regression analysis. Differentially expressed protein spots need to be further identified by mass spectrometry. Keywords: common bean (Phaseolus vulgaris L.), drought, proteomics, two-dimensional gel electrophoresis. 99 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Ocenitev transgenih linij krompirja (Solanum tuberosum L., cv. Désirée) s čezmerno ekspresijo krompirjevega cisteinskega proteaznega inhibitorja za odpornost proti abiotskim stresnim dejavnikom Ida Istinič, Hana Uršič, David Dobnik, Špela Baebler, Kristina Gruden, Jana Žel Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo Večna pot 111, 1000 Ljubljana, [email protected] Abiotski stresni dejavniki, kot so suša, slanost in ekstremne temperature, predstavljajo veliko težavo za rast rastlin in zmanjšajo njihov pridelek, hkrati pa negativno vplivajo na stanje v okolju. Raziskovanje in razvoj transgenih rastlin z vnesenimi geni za izboljšanje odpornosti proti tem stresnim dejavnikom sta v zadnjem času zelo intenzivna. Kmalu na tržišču pričakujemo prve transgene rastline z izboljšano odpornostjo proti suši. Mehanizmi in metaboliti, ki so vpleteni v odgovor rastlin na stres, so bili v zadnjih letih intenzivno proučevani. Eni izmed metabolitov vključenih v odgovor rastlin na stres so tudi proteazni inhibitorji. Le ti so vključeni v odgovor tako na nekatere biotske kot abiotske stresne dejavnike. Krompirjevi cisteinski proteazni inhibitorji (ang. potato cysteine proteinase inhibitors -PCPI) predstavljajo samostojno skupino proteinov, saj ne kažejo homologije z naddružinami ostalih znanih cisteinskih proteaznih inhibitorjev. PCPI spadajo v družino tripsinskih inhibitorjev Kunitz-ovega tipa. Ti inhibitorji so del krompirjevega obrambnega odgovora ob napadu žuželk in patogenih organizmov. Prav tako pa je bilo pokazano, da je izražanje PCPI pri različnih kultivarjih krompirja inducirano tudi ob okužbi z virusom PVY. V naši raziskavi nas je zanimalo, če prekomerno izražanje PCPI v dveh transgenih linijah krompirja sorte Désirée vpliva na spremenjen odgovor rastlin na abiotske stresne dejavnike. Transgeni liniji smo primerjali z rastlinami divjega tipa. Testiranja za ocenitev odpornosti proti nizkim temperaturam smo naredili in vitro v tkivnih kulturah, testiranja za ocenitev odpornosti proti suši smo testirali v zemlji, odpornost proti slanosti pa tako in vitro v tkivnih kulturah kot tudi v zemlji. Ključne besede: abiotski stres, krompirjev cisteinski proteazni inhibitor, suša, slanost, transgeni krompir. 100 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Sev Escherichia coli Nissle 1917 izkazuje boljšo protimikrobno aktivnost kot genetsko spremenjeni izogeni sev z zapisom za sintezo kolicina E7 Živa Petkovšek, Darja Žgur Bertok, Marjanca Starčič Erjavec Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani, Večna pot 111, 1000 Ljubljana, [email protected] Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) je probiotični sev, ki se uporablja pri preprečevanju ali zdravljenju črevesnih okužb. Študije njegov pozitiven učinek povezujejo predvsem z oviranjem patogenih bakterij pri vezavi na in vdoru v epitelne celice. EcN ima tudi genetski zapis za sintezo 2 bakteriocinov, mikrocina H47 in mikrocina M, ki izkazujeta citotoksičen efekt le na ozko sorodne vrste. Med bakteriocine prištevamo tudi kolicin E7, katerega sev EcN ne kodira, zanj pa sta značilna precejšnja učinkovitost in majhna razširjenost imunosti med kliničnimi izolati E. coli iz zunajčrevesnih okužb. V predhodnih raziskavah smo ugotovili, da sev EcN in vitro zavira tudi rast izolatov E. coli iz zunajčrevesnih okužb (okužbe sečil, kožne infekcije). Da bi njegovo učinkovitost še povečali, smo sev genetsko modificirali in mu dodali informacijo za sintezo še enega bakteriocina, kolicina E7, novonastali sev pa poimenovali ŽP. Nato smo z gojitvenimi tehnikami ugotavljali, kako učinkovito seva EcN in ŽP zavirata rast kliničnih izolatov E. coli iz zunajčrevesnih okužb. V študijo smo vključili klinične izolate, občutljive za delovanje mikrocinov H47 in M, ter izolat, ki kodira mikrocina H47 in M in je potemtakem imun za njuno delovanje. Pričakovali smo, da bo konstrukt ŽP še uspešneje zaviral rast kliničnih izolatov. Zlasti smo večji učinek pričakovali v primerih, ko je bil klinični izolat imun za delovanje mikrocinov H47 in M, ne pa tudi na delovanje kolicina E7. Naši rezultati pa so pokazali, da je bil sev EcN v vseh primerih učinkovitejši. Pojav si razlagamo tako, da je zaradi genetske modifikacije seva prišlo do počasnejšega metabolizma bakterije, slabše rasti in posledično manjše protimikrobne učinkovitosti seva. Ključne besede: Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), ŽP, klinični izolati, protimikrobna aktivnost, kolicin E7. 101 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE BIOTEHNOLOGIJA, INTERAKCIJE GENOM - OKOLJE POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA In vivo in in vitro odkritje epitelnih celic iz kozje mlečne žleze s proliferativnim potencialom Sonja Prpar1, Eugenio Martignani2, Peter Dovč1, Mario Baratta2 1 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Domžale, [email protected] 2 Univerza v Torinu, Fakulteta za veterinarsko medicino, Oddelek za veterinarsko morfofiziologijo, Grugliasco (Torino), Italija Izvleček. Matične celice v kozji mlečni žlezi do sedaj še niso bile raziskane, obstaja pa nekaj študij na epitelni frakciji izolirani iz kravje mlečne žleze. Matične celice se pri človeku in miši nahajajo v bazalni celični populaciji, pri drugih vrstah pa tega še niso dokazali. Kljub velikemu naboru protiteles, ki reagirajo z mišjimi in človeškimi epitopi, je izolacija čiste populacije matičnih celic še vedno nemogoča, saj do danes še vedno ni odkritih definitivnih markerjev. V naši študiji smo z in vitro in in vivo testi hoteli dokazati, da se v mlečni žlezi koze nahajajo predniške celice oziroma celice podobne matičnim celicam. V testu za dokaz klonogene proliferacije predniških celic smo kozje epitelne celice v nizkem številu nacepili na, s kolagenom prevlečene, rastne posodice skupaj z, z mitomicinom C, inaktiviranimi fibroblasti. Kolonije, ki so zrasle, smo okarakterizirali morfološko in imunofluorescentno. Glede na izražanje za linijo specifičnih citokeratinov, 14 in 18, smo določili frekvenco posameznih predniških celic. Vsebnost predniških celic je bila odvisna od testiranega vzorca in je znašala: (i) od 20-70% za luminalne prednike; (ii) od 20-80% za mioepitelne in (iii) do 20% za bipotentne predniške celice. In vivo dokaz za prisotnost matičnih celic je regeneracija epitelnih struktur v kolagenskih gelčkih. Ker še iščemo delujoča protitelesa za sortiranje epitelnih celic, smo v preliminarnih testih uporabili nesortirane celice, ki naj bi vsebovale tudi nekaj matičnih celic. Celice smo zmešali z inaktiviranimi fibroblasti in jih imobilizirali v kolagenske gelčke ter slednje vsadili pod ledvično kapsulo miši NOD/SCID . Po 4-6 tednih smo gelčke odstranili in jih po fiksaciji vklopili v parafin. Imunofluorescentno smo obarvali strukture, ki spominjajo na epitelij v intaktni kozji mlečni žlezi, kjer na CK14pozitivne mioepitelne celice pokrivajo CK18-pozitivne luminalne celice, ki se odpirajo v lumen. Tako smo dokazali, da v kozji mlečni žlezi obstajajo celice, ki so zmožne proliferacije in regeneracije. Ključne besede: prežvekovalci, mlečna žleza, matične celice, transplantacija. 102 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE POSTERJI GENOMIKA MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI 103 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI ZNANSTVENI PRISPEVEK Virulentni dejavniki izolatov bakterije Escherichia coli iz blata zdravih ljudi Virulence factors of Escherichia coli isolates from feces of healthy people Manuela Čitar1, Marjanca Starčič Erjavec2, Darja Žgur-Bertok3 1 Medis, d.o.o., p.p. 2646, Brnčičeva 1, 1001 Ljubljana; [email protected] 2 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo,Večna pot 111, 1000 Ljubljana; [email protected] 3 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo,Večna pot 111, 1000 Ljubljana; [email protected] Izvleček. Praviloma bakterija Escherichia coli (E. coli) in gostitelj sobivata v mutualističnem odnosu, vendar so sevi E. coli zaradi specifičnih virulentnih dejavnikov sposobni povzročiti gostitelju številne črevesne in zunajčrevesne okužbe. Medtem ko črevesne okužbe pozvročajo sevi E. coli pridobljeni iz okolja, je črevesna mikrobiota posameznika rezervoar E. coli, ki pozvročajo zunajčrevesne okužbe. Da bi ugotovili prevalenco potencialno patogenih zunajčrevesnih sevov E. coli med črevesno mikrobioto, smo zbirko 90 sevov E. coli, izoliranih iz blata zdravih ljudi v obdobju od 01. 03. do 04.09. 2009 na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani s pomočjo metode PCR uvrstili v filogenetsko skupino in pregledali prisotnost zapisov za naslednje dejavnike, povezane z virulenco: cnf1, hlyA, papGII, papGIII, sfaDE, afa/draBC, iucD, usp in tcpC. Naši rezultati kažejo, da je 30 (33 %) vseh pregledanih izolatov spadalo v filogenetsko skupino B2, 27 (30 %) v skupino D, 20 (22 %) v skupino A in 13 sevov (14 %) v skupino B1. Zapis cnf1 smo zasledili pri 5 (6 %) sevih, hlyA pri 7 (8 %), papGII pri 7 (8 %), papGIII pri 3 (3 %), sfaDE pri 15 (17 %), afa/draBC pri 4 (4%), iucD pri 35 (39 %), usp pri 22 (24 %) in tcpC pri 7 (8 %) vseh testiranih sevov. Naši rezultati kažejo, da med sevi E. coli človeške črevesne mikrobiote obstaja visok virulentni potencial, ki omogoča nastanek različnih zunajčrevesnih okužb. Ključne besede: dejavniki/okužbe. Escherichia coli/komenzalni sevi/filogenetske skupine/virulentni Uvod Naravno mikrobioto človeka sestavljajo vsi mikroorganizmi, ki naseljujejo sluznice in kožo zdravih gostiteljev. Naravna mikrobiota kolonizira gostitelja že takoj po rojstvu in predstavlja za gostitelja velik zaklad, saj ga ščiti pred vdorom in kolonizacijo patogenih mikrobov in posledično razvojem okužbe ter je 1,2 pomembna pri presnovi in sintezi nekaterih rastnih dejavnikov . Bakterija Escherichia coli (E. coli) je del normalne črevesne mikrobiote in večinoma ne povzroča okužb, a v določenih primerih lahko E. coli povzroča različne 3,4 črevesne (sevi IPEC) in zunajčrevesne okužbe (sevi ExPEC) . Ali so sevi E. coli patogeni oz. sposobni povzročiti bolezensko stanje gostitelja, je odvisno od lastnosti bakterije, torej od njenih genskih zapisov za virulentne dejavnike 104 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE (različne fimbrije in adhezine, toksine, sisteme za privzem železa,…), od zdravstvenega stanja gostitelja in tudi od same interakcije patogenega 3 mikroorganizma in gostitelja . Črevesne okužbe povzročajo sevi E. coli, ki so pridobljeni iz okolja (kontaminirana hrana in voda), a rezervoar E. coli, ki povzročijo zunajčrevesne okužbe, je črevesna mikrobiota posameznika. Namen naše študije je bilo ugotoviti prevalenco potencialno patogenih zunajčrevesnih sevov E. coli med črevesno mikrobioto zdravih ljudi in ugotavljanje povezave med filogenetskimi skupinami in naborom genetskih zapisov virulentnih dejavnikov. Materiali in metode V študijo smo vključili 90 izolatov bakterije E. coli (zbirka BJ Skupine za molekularno genetiko Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani) izoliranih iz blata zdravih ljudi moškega (44 oz. 49 %) in ženskega (46 oz. 51 %) spola različnih starosti, ki niso prejemali nobenih antimikrobnih zdravil za terapevtske oziroma profilaktične namene v obdobju od 01.03.2009 do 04.09.2009. Vseh 90 izolatov smo s pomočjo metode verižne reakcije s polimerazo (PCR) uvrstili v filogenetske skupine. Ugotavljali smo tudi prisotnost zapisov izbranih virulentnih dejavnikov oz. dejavnikov, povezanih z virulenco sevov E. coli, izoliranih iz zunajčrevesnih okužb, zlasti okužb urinarne poti. Vse uporabljene seve smo gojili ali na trdnih gojiščih ali v tekočih gojiščih gojišč LuriaBertani. Inkubirali smo jih preko noči pri 37 °C, tekoča gojišča pa smo inkubirali na stresalniku pri isti temperaturi. Izolate smo razvrstili v filogenetsko skupino (A, 5 B1, B2 ali D) z uporabo metode PCR po Clermontu . Vse izolate smo z metodo PCR pregledali za prisotnost zapisov za naslednje dejavnike, povezane z virulenco: cnf1 (citotoksični nekrotizirajoči faktor tipa 1), hlyA (-hemolizin), papGII (adhezin II P-fimbrije), papGIII (adhezin III P-fimbrije), sfaDE (S-fimbrije), afa/draBC (družina adhezinov Afa/Dr), iucD (aerobaktin), usp (uropatogeni specifični protein Usp) in tcpC (zapis za strukturno homologno beljakovino signalizacijske domene TLR-receptorjev). Vse uporabljene začetne oligonukleotide in programe v naši študiji za izvajanje metode PCR smo zasledili 6-12 v prejšnjih študijah . Statistično značilnost povezav dobljenih rezultatov smo 13 ugotavljali s Fisherjevim natančnim testom . Zaradi multiple korelacije smo uporabili Bonferronijev popravek. Kot statistično značilne rezultate, po Bonferronijevi korekciji, smo šteli tiste rezultate, ki so imeli vrednost P ≤ 0,05. Rezultati Naša študija kaže, da večina izolatov pregledane zbirke 90-tih sevov spada v filogenetsko skupino B2 ali D, oz. največ sevov spada v skupino B2 (30 (33 %)), sledi ji skupina D s kar 27 (30 %) sevi. Dvajset (22 %) izolatov smo uvrstili v skupino A in 13 (14 %) smo uvrstili v skupino B1. Med pregledanimi sevi je bil najštevilčnejši zapis virulentnega dejavnika iucD s kar 35 pozitivnimi sevi (39 %), temu je sledil usp s 22 (24 %), sfaDE s 15 (17 %), tcpC, hlyA in papGII s 7 (8 %), cnf1 s 5 (6 %), afa/draBC s 4 (4 %) in papGIII s 3 105 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE (3 %) pozitivnimi izolati. Povprečno število virulentnih dejavnikov na sev je močno variiralo med različnimi filogenetskimi skupinami (preglednica 1). Sevi v skupini B2 so imeli največje število virulentnih dejavnikov, v povprečju kar 2,46; skupini B2 je sledila skupina D z v povprečju 0,81 virulentnim dejavnikom; skupina A z 0,45 virulentnih dejavnikov na sev; medtem ko v izolatih skupina B1 nismo našli nobenih virulentnih dejavnikov. Kar 47 izolatov (52 %) je imelo zapis za vsaj enega izmed preučevanih virulentnih dejavnikov. Dvajset (22 %) je bilo takih, ki so imeli zapis za samo en virulentni dejavnik. Če ne upoštevamo dejavnika za preživetje oz. prisotnost zapisa iucD, je imelo 31 (34 %) izolatov zapis za vsaj en virulentni dejavnik. Opazili smo tudi, da je večina izolatov, ki ni imela zapisa za kateregakoli od testiranih virulentnih dejavnikov, sodila v filogenetsko skupino A ali B1, medtem ko je bilo takih sevov v skupini B2 najmanj. Porazdelitev virulentnih dejavnikov med filogenetskimi skupinami (preglednica 1) je pokazala statistično značilno korelacijo genov usp, sfaDE in tcpC in filogenetsko skupino B2. Vrednost P pri vseh omenjenih genih je bila manjša od 0,01. Lastnost Virulentni dejavniki (VD) Toksini cnf1 hlyA usp Fimbrije in/ali adhezini papGII papGIII sfaDE afa/draBC Privzem železa iucD Drugi tcpC Št. VD 0 1 2 3 4 5 6 a Povprečno št. VD Vsi izolati (90 [100]) Prevalenca (N [%]) Filogenetske skupine (N [%]) A B1 B2 D (20 [22]) (13 [14]) (30 [33]) (27 [30]) 5 (6) 7 (8) 22 (24) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 5 (17) 6 (20) 18 (60)*** 0 (0) 1 (4) 4 (15) 7 3 15 4 0 0 0 1 0 0 0 0 4 3 15 0 3 0 0 3 (8) (3) (17) (4) (0) (0) (0) (5) (0) (0) (0) (0) ( ) 35 (39) 8 (40) 0 (0) * 7 (8) 0 (0) 0 (0) 43 (48) 20 (22) 10 (11) 10 (11) 3 (3) 1 (1) 3 (3) 1,16 12 (60) 7 (35) 1 (5) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0,45 13 0 0 0 0 0 0 (100) (0) (0) (0) (0) (0) (0) 0,00 (13) (10) (50)*** (0) 16 (53) 7 (23)** 5 5 5 8 3 1 3 (17) (17) (17) (27) (10) (3) (10) 2,46 (11) (0) (0) (11) 11 (41) 0 (0) 13 (48) 8 (30) 4 (15) 2 (7) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0,81 Preglednica 1: Prevalenca virulentnih dejavnikov, število virulentnih dejavnikov in občutljivost za antibiotike po filogenetskih skupinah. VD - virulentni dejavniki, N - število. Statistično značilnost korelacije med pregledanimi lastnosti in filogenetski skupini smo ugotavljali s Fisherjevim natančnim testom in Bonferronijevim popravkom. Statistično značilne vrednosti P so označene z zvezdico. 106 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE a Simboli: *, p <0,05, **, P <0,01, ***, P <0,001. Negativne korelacije so v oklepajih. : Povprečno št. VD povprečno število virulentnih dejavnikov smo izračunali za vsak izolat kot vsota vseh odkritih genskih zapisov virulentnih dejavnikov. Prikazana številka v preglednici predstavlja povprečno število virulentnih dejavnikov. Diskusija V tej študiji smo pregledali razporejenost v filogenetske skupine in prisotnost različnih virulentnih dejavnikov 90-ih izolatov E. coli, pridobljenih iz blata zdravih oseb. Glede na to, da so v številnih študijah ugotovili, da sevi E. coli, ki veljajo za patogene oz. potencialno patogene spadajo v filogenetsko skupino B2 ali D, smo pričakovali uvrstitev večine pregledanih sevov iz blata zdravih ljudi v filogenetsko skupino A ali B1, katere štejejo za komenzale. Iz zbranih rezultatov vidimo, da temu ni tako, saj smo največ sevov zbirke BJ uvrstili v skupino B2, kateri sledijo skupina D, skupina A in nazadnje skupina B1. Dobljene rezultate smo primerjali tudi z drugimi podobnimi študijami oz. tistimi, ki so analizirali izolate črevesne mikrobiote zdravih ljudi (preglednica 2). Kot smo že prej omenili, rezultati o razvrstitvi v filogenetske skupine niso sledili pričakovanju, saj smo večino izolatov zbirke BJ uvrstili v skupini B2 in D. Nekatere študije 14, 15 16,17 podpirajo naše rezultate , druge študije pa našim rezultatom nasprotujejo , saj so te zaznale zelo nizko prisotnost skupine B2 med izolati iz zdravih ljudi. Različni dejavniki lahko vplivajo na razporeditev sevov v filogenetske skupine, kot npr. razlike v geografskem poreklu gostiteljske skupine, socialno ekonomski 15,18,19 status gostitelja, razlike v odvzemu vzorcev, spol in starost gostitelja . Skladno z rezultati analize filogenetskih skupin, smo veliko število nekaterih zapisov za virulentne dejavnike zasledili prav pri skupini B2 - geni usp, sfaDE in tcpC. Omenjeni geni kažejo tudi statistično značilno povezavo s filogenetsko skupino B2. Prevalenca testiranih virulentnih dejavnikov je bila najvišja pri skupini B2 in D. Glede na dobljene rezultate lahko domnevamo, da imajo izolirani sevi iz zdravih ljudi nezanemarljiv in kar visok virulentni potencial in tako lahko povzročijo gostitelju različne zunajčrevesne okužbe. Če primerjamo prevalenco zapisov virulentnih dejavnikov, pregledanih v naši raziskavi, s prevalencami pri drugih študijah, navedenih v preglednici 2, ugotovimo, da ni večjih odstopanj med študijami. Iz dobljenih rezultatov lahko sklepamo, da velik delež človeške črevesne mikrobiote sestavljajo sevi, katere lahko označimo kot sposobne povzročanja zunajčrevesnih okužb. S preventivnim zdravljenjem oz. cepljenjem, ki bi vzbudilo specifično delovanje imunskega sistema proti specifičnim virulentnim dejavnikom, bi lahko preprečili okužbe z E. coli, pod pogojem, da ne bi kakorkoli škodovali 3 komenzalnim sevom, ki so del naravne človeške mikrobiote . 107 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Prevalenca (N [%]) izolatov) Izolati iz prejšnjih raziskav Sevi zbirke BJ iz naše študije (n = 90) Izolati brisa rektuma 1 (n = 71) Izolati brisa rektuma 2 (n = 88) Izolati brisa rektuma 3 (n = 40) Izolati iz vzorca blata4 (n = 266) Filogenetske skupine A B1 B2 D B2 ali D Virulentni dejavniki papGII papGIII sfaDE afa/draBC hlyA cnf1 usp iucD tcpC 20 13 30 27 57 (22) (14) (33) (30) (63) 11 13 38 9 47 (15) (18) (54) (13) (66) 7 3 15 4 7 5 22 35 7 (8) (3) (17) (4) (8) (6) (24) (39) (8) 13 6 11 4 10 9 (18) (8) (15)b (6)d (14)g (13) 18 11 42 17 59 (20) (13) (48) (19) (67) 10 6 9 15 24 (25) (15) (23) (38) (60) 11 2 10 6 (13)č (2)e (11)h (7) 9 1 7 0 4 4 (23) (3) (18)b (0) (10) (10) 35 (40)i 52 33 120 61 181 51 14 51 43 (20) (12) (45) (23) (68) (19)b (5) (19)g (16) Izolati iz vzorca blata 6 (n = 168) Izolati iz vzorca blata 5 Zmerno topli pas (n = 176) 46 (26) 14 (8) 76 (43) 40 (23) 116 (66) Tropski pas (n = 167) 95 (57) 32 (19) 25 (15) 15 (9) 40 (24) Mali (n = 55) 13 32 1 9 10 (24) (58) (2) (16) (18) Hrvaška ( n = 57) 20 18 11 8 19 (35) (32) (19) (14) (33) Francija (n = 56) 34 7 6 9 15 19 (11)a 6 2 7 6 (4)c (1)f (4)h (4) 27 (16)i (61) (13) (11) (16) (27) Skupaj (n = 168) 67 57 18 26 44 Preglednica 2: Prevalenca filogenetskih skupin in virulentnih dejavnikov izolatov naše raziskave, v primerjavi z izolati prejšnjih raziskav, izvedenih na črevesni mikrobioti zdravih ljudi. 1 Podatki iz vira Sannes in sod., 200414; 2 Podatki iz vira Zhang in sod., 200215; 3 Podatki iz vira Moreno in sod., 200916; 4 Podatki iz vira Gordon in sod., 200518 (pri izračunih so upoštevali izolate zdravih in bolnih gostiteljev hkrati); 5 Podatki iz vira Escobar-Páramo in sod., 200419; 6 Podatki iz vira Duriez in sod., 200117. Opombe: VD - virulentni dejavniki, N - število. Različne študije so pregledale prisotnost različnih genov istega virulentnega dejavnika. Razlike smo označili in navedli ustrezne pregledane gene: a pap, b sfa/focDE, c sfa/foc, č sfa, d afa/dra, e drb, f afa, g hlyD, h hly, i aer, 108 (40) (34) (11) (15) (26) 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Reference 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. K. Seme. Normalna mikrobna flora. V: Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo. M. Gubina, A. Ihan (ur.). Ljubljana, 2002, Medicinski razgledi: 59 - 64. J. Kaper, J. Nataro, and H. Mobley. Pathogenic Escherichia coli. Nat. Rev. Microbiol. 2004, 2, 123-140. T. A. Russo and J. R. Johnson. Medical and economic impact of extraintestinal infections due to Escherichia coli: Focus on an increasingly important endemic problem. Microbes Infect. 2003, 5, 449-456. T. J. Wiles, R. R. Kulesus and M. A. Mulvey. Origins and virulence mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. Exp. Mol. Pathol. 2008, 85, 11-19. O. Clermont, S. Bonacorsi and E. Bingen. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 4555-4558. S. Yamamoto, A. Terai, K. Yuri, H. Kurazono, Y. Takeda and O. Yoshida. Detection of urovirulence factors in Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995, 12, 85-90. M. Nakano, S. Yamamoto, A. Terai, O. Ogawa, S. Makino, H. Hayashi and others. Structural and sequence diversity of the pathogenicity island of uropathogenic Escherichia coli which encodes the USP protein. FEMS Microbiol. Lett. 2001, 205, 71-76. M. Starčič Erjavec, B. Jesenko, Ž. Petkovšek and D. Žgur-Bertok. Prevalence and associations of tcpC, a gene encoding a Toll/interleukin-1 receptors domaincontaining protein, among Escherichia coli urinary tract infection, skin and soft tissue infection, and commensal isolates. J. Clin. Microbiol. 2010, 48, 966-968. I. Kuhar, M. Grabnar and D. Žgur-Bertok. Virulence determination of uropathogenic Escherichia coli in fecal strains from intestinal infections and healthy individuals. FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164, 243-248. J. Johnson and A. Stell. Extended virulence genotypes of Escherichia coli strains from patients with urosepsis in relation to phylogeny and host compromise. J. Infect. Dis. 2000, 181, 261-272. C. Le Bouguénec, M. Archambaud and A. Labigne. Rapid and specific detection of the pap, afa and sfa adhesion-encoding operons in uropathogenic Escherichia coli strains by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 1992, 30, 1189-1193. J. R. Johnson and J. J. Brown. A novel multiply primed polymerase chain reaction assay for identification of variant papG genes encoding the Gal(alpha 1-4)Galbinding PapG adhesins of Escherichia coli. J. Infect. Dis. 1996, 173, 920-926. Ø Langsrud. Fisher's exact test. Oslo, 2004, Statistics Norway, Division for Statistical Methods and Standards. http://www.langsrud.com/fisher.htm (November, 2009) M. R. Sannes, M. A. Kuskowski, K. Owens, A. Gajewski and J. R. Johnson. Virulence factor profiles and phylogenetic background of Escherichia coli isolates from veterans with bacteremia and uninfected control subjects. J. Infect. Dis. 2004, 190, 2121-2128. L. Zhang, B. Foxman and C. Marrs. Both urinary and rectal Escherichia coli isolates are dominated by strains of phylogenetic group B2. J. Clin. Microbiol., 2002, 40, 3951-3955. E. Moreno, J. R. Johnson, T. Pérez, G. Prats, M. A. Kuskowski and A. Andreu. Structure and urovirulence characteristics of the fecal Escherichia coli population among healthy women. Microbes Infect. 2009, 11, 274-280. 109 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 17. P. Duriez, O. Clermont, S. Bonacorsi, E. Bingen, A. Chaventré, J. Elion and others. Commensal Escherichia coli isolates are phylogenetically distributed among geographically distinct human populations. Microbiology 2001, 147, 1671-1676. 18. D. M. Gordon, S. E. Stern and P. J. Collignon. Influence of age and sex of human hosts on the distribution of Escherichia coli ECOR groups and virulence traits. Microbiology 2005, 151, 15-23. 19. P. Escobar-Parámo, K. Grenet, A. Le Menac'h, L. Rode, E. Salgado, C. Amorin and others. Large-scale population structure of human commensal Escherichia coli isolates. Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70, 5698-5700. Abstract. Usually, Escherichia coli (E. coli) and its host coexist in mutual benefit, but there are several highly adapted E. coli strains that have acquired specific virulence factors and can cause an impressive variety of different types of intestinal and extraintestinal diseases. While intestinal infections are caused by E. coli strains acquired from environment, the reservoir of extraintestinal pathogenic E. coli strains is the intestinal microbiota. In order to screen for the prevalence of potentially extraintestinal pathogenic E. coli strains in the intestinal microbiota, a collection of 90 E. coli strains isolated at the Department of Biology, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana in the time period from 01. 03. to 04. 09. 2009 from feces of healthy humans, was using the method of PCR amplification screened for the phylogenetic groups and the following virulence (related) genes: cnf1, hlyA, papGII, papGIII, sfaDE, afa/draBC, iucD, usp and tcpC. Our results showed that 30 (33 %) of the studied E. coli isolates belonged to the B2 group, 27 (30 %) to the D group, 20 (22 %) to the A group, and 13 (14 %) to the B1 group. The cnf1 gene sequence was detected in 5 (6 %) of strains, hlyA in 7 (8 %), papGII in 7 (8 %), papGIII in 3 (3 %), sfaDE in 15 (17 %), afa/draBC in 4 (4 %), iucD in 35 (39 %), usp in 22 (24 %) and tcpC in 7 (8 %) of the tested isolates. Our results indicate that in the human gut microbiota a high enough virulence potential is harboured in the strains to enable the E. coli strains to cause different extraintestinal infections. Keywords: Escherichia coli/commensal strains/phylogenetic group/virulence factors/infections. 110 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Razlikovanje izolatov bakterije Escherichia coli iz blata zdravih ljudi z metodo ERIC-PCR Differentiation of Escherichia coli isolates from stool samples of healthy individuals with ERIC-PCR method Blaž Jesenko, Darja Žgur-Bertok, Marjanca Starčič Erjavec Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, Večna pot 111, Ljubljana, [email protected] 1000 Izvleček. Iz blata zdravih ljudi smo od 01. 03. do 04. 09. 2009 izolirali 90 izolatov bakterije Escherichia coli (po en izolat iz posameznika). Z namenom razlikovanja posameznih izolatov, vključno z izolati pridobljenih od ljudi, ki so živeli v isti skupnosti, smo izvedli ERIC-PCR. ERIC-PCR je tehnika verižnega pomnoževanja s polimerazo, s katero pridobimo za vsak sev različno število različno velikih pomnoženih fragmentov DNA. Z elektroforetskimi tehnikami lahko DNA ločimo ter glede na število in velikost pomnoženih fragmentov razberemo različne profile ERIC-PCR. Primerjava dobljenih profilov ERIC-PCR je pokazala, da se določeni sevi v zbirki ponavljajo ter, da se isti sevi nahajajo v širši populaciji in ne samo v isti družinski skupnosti. Ključne besede: Escherichia coli, komenzalni sevi, blato zdravih ljudi, izolacija iz blata, filogenetske skupine, molekularne metode, ERIC-PCR. Uvod Mikrobiota, pestra in dinamična združba mikroorganizmov, naseljuje kožo in sluznice zdravih ljudi in običajno ne povzroča bolezenskih znakov. Sestava mikrobiote (nabor različnih bakterijskih in glivnih vrst) ter relativni deleži vrst se spreminjajo glede na posameznika, mesto kolonizacije ter časovno obdobje. Prve bakterije, ki kolonizirajo človekova prebavila, pridobimo med prehodom skozi porodni kanal. Kasneje, tekom življenja, se sestava črevesne mikrobiote spreminja, odvisno od ustreznega inokuluma ter prilagojenosti seva, s katerim pride gostitelj v stik. Bakterija Escherichia coli (E. coli) je najbolj številčna fakultativno anaerobna bakterija v črevesni mikrobioti. Preživi tudi zunaj črevesja. Ni vrstno specifična in lahko kolonizira človeka in živali s stalno telesno temperaturo, prav tako tudi plazilce. V večini primerov ima gostitelj od E. coli korist, ali zaradi njene prisotnosti vsaj nima simptomov bolezni.V primeru poškodbe naravnih pregrad, ali v primeru, da ima bakterija ustrezne virulentne dejavnike lahko E. coli povzroča tudi bolezni. V bakterijskih kromosomih je več družin ponavljajočih se zaporedij DNA. Med njimi so tudi zaporedja ERIC, ki jih najdemo v prepisanih delih intergenskih regij med člani družine Enterobacteriaceae ter Vibrionaceae. Skupno ERIC zaporedje je dolgo 127 bp in 111 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE tvori nepopoln palindrom. Glede na razlike v zaporedjih ERIC in njihov obstoj so razvili začetne oligonukleotide za metodo verižnega pomnoževanja DNA. Oligonukleotidi nalegajo na palindromska zaporedja in se pomnožujejo v nasprotni smeri. Pomnožila naj bi se DNA med blizu ležečimi zaporedji ERIC. Izkazalo se je, da je metoda ERIC-PCR odvisna od drugih dejavnikov in ne samo od zaporedij ERIC. Ker vsi dejavniki od katerih je odvisna metoda niso znani, smo se osredotočili na analizo posameznih zbranih izolatov s pomočjo metode ERIC-PCR. Materiali in metode V študijo je bilo vključenih 90 izolatov bakterije E. coli, ki sestavljajo zbirko komenzalnih sevov E. coli Skupine za molekularne genetiko Oddelka za biologijo na Biotehniški fakulteti, Univerze v Ljubljani. Sevom smo v predhodnih raziskavah že določili filogenetsko skupino in prisotnost izbranih zapisov za virulentne 1 dejavnike (VD), značilnih za zunajčrevesne patogene seve E. coli . ERIC 2 zaporedja smo pomnoževali z metodo po Versalovicu . Ocenjene dolžine fragmentov smo vnesli v tabelo in ugotavljali povezave med fragmenti posameznih velikosti ter virulentnimi dejavniki in filogenetskimi skupinami. Rezultate smo statistično ovrednotili s Fisherjevim točnim testom (http://www.langsrud.com/fisher.htm). Za statistično signifikantno smo smatrali povezavo, kjer je P<0,05. Rezultati ERIC-PCR reakcija je proizvedla 81 različnih profilov ERIC-PCR. Iz treh izolatov nam z metodo ERIC-PCR ni uspelo pridobiti ustreznega DNA-prstnega odtisa. Eden od njih pri pomnoževanju ni tvoril produkta, druga dva sta tvorila premalo specifične produkte. Enake profile so tvorili sevi z različnimi ozadji. Sevi BJ16, BJ17, BJ3 so bili izolirani iz dveh oseb iste skupnosti in osebe druge skupnosti. Seva BJ6 in BJ13 sta bila izolirana iz oseb različnih skupnosti in ob upoštevanju predhodno znanih genetskih lastnosti se je izkazalo, da seva nista identična. Sevi BJ30, BJ32 in BJ33 so bili izolirani iz oseb iste skupnosti. V zbirki profilov ERIC-PCR je opazna močna prisotnost pomnožkov velikosti 450, 750, 1200 bp. V literaturi je omenjena povezava med zdravo črevesno mikrobioto 3 ter ERIC-PCR pomnožki velikosti 500, 800 in 1000 bp . Med ERIC-PCR pomnožki ter genetskimi lastnostmi smo našli 31 povezav. Zaradi velikega števila testov nismo opravili Bonferronijevega popravka. Izkazalo se je, da imajo filogenetske skupine več verjetnih povezav s posameznimi dolžinami z ERIC-PCR pomnoženih fragmentov kot virulentni dejavniki (VD) in odpornosti proti antibiotikom. 112 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 1: Primer elektroforeze pomnožkov ERIC-PCR sevov E. coli zbirke BJ Na sliki od leve proti desni:1 kb lestvica, sevi BJ14, BJ41, BJ56, BJ52, BJ76, BJ6, 1 kb lestvica. 113 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE lastnosti\dolžine 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 A 0,174 0,045 1 0,749 0,588 0,384 0,584 0,079 1 0,251 0,039 1 1 0,509 0,059 0,332 1 0,038 0,07 0,252 0,013 0,375 1 0,675 0,239 0,056 0,774 0,46 0,425 1 0,455 0,81 0,625 1 0,091 0,532 0,808 0,009 0,14 0,028 0,348 0,668 0,022 0,119 1 0,405 0,554 0,435 4E-05 0,062 1 0,07 0,136 0,108 0,334 1 0,498 0,669 1 0,285 1 0,802 0,705 1 1 0,474 0,805 1 0,073 0,083 0,111 0,238 0,649 0,825 1 1 0,08 0,568 1 0,694 0,253 0,634 0,233 0,814 0,502 0,131 1 0,548 1 1 0,558 1 1 1 1 0,568 1 0,101 0,169 0,197 1 1 0,752 0,728 0,397 0,068 0,578 0,788 0,593 1 1 0,725 0,543 1 0,484 0,765 1 1 1 0,061 0,495 0,586 0,042 0,581 0,596 0,332 1 1 0,506 0,378 1 0,527 1 0,568 0,571 1 1 0,355 0,028 0,272 0,465 0,043 0,53 0,588 1 0,065 0,114 0,588 1 3E-04 1 1 1 0,46 0,201 1 0,73 1 0,01 0,59 0,247 1 1 0,722 0,586 1 0,725 0,314 1 0,258 0,57 1 1 0,062 0,214 1 0,253 1 1 0,538 1 0,289 0,133 1 0,575 1 1 0,131 1 0,089 0,34 1 0,675 1 1 1 0,584 1 1 0,195 0,04 0,054 1 1 7E-04 0,006 0,173 0,338 1 0,657 1 0,452 0,258 0,569 0,62 0,231 0,258 0,465 0,238 0,149 1 1 0,592 0,688 0,389 1 0,425 1 1 1 1 0,673 0,456 1 0,375 0,019 0,088 1 1 1 0,543 0,478 1 0,518 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,478 1 1 0,588 0,656 0,126 1 0,644 1 1 1 0,582 1 1 1 0,605 1 0,613 1 0,74 0,702 0,371 0,545 0,003 1 0,007 0,347 0,004 0,125 0,192 0,015 1 1 0,756 0,219 0,317 0,021 0,772 3E-04 0,473 0,026 0,384 0,11 0,058 0,116 0,002 6E-05 0,266 0,241 0,231 0,057 0,093 1 0,174 0,451 0,068 0,518 0,588 0,147 0,584 0,313 1 0,702 0,039 0,592 1 0,001 0,532 0,518 1 0,005 0,033 0,035 0,084 0,585 0,009 0,329 0,046 1 0,74 1 0,195 0,548 0,389 0,024 0,406 0,409 0,57 1 0,294 0,005 1 0,295 1 0,031 1 1 0,048 1 1 1 1 1 1 0,585 1 0,046 0,316 1 0,074 1 0,349 1 0,204 0,1 1 1 0,016 0,316 0,316 1 0,585 0,588 1 0,126 1 0,375 1 0,003 1 0,582 0,1 1 0,164 1 1 0,316 1 1 1 1 0,478 1 0,15 1 1 1 0,317 0,444 1 1 0,461 0,495 0,478 1 1 1 0,345 1 0,057 1 0,069 1 1 0,172 0,253 1 1 1 1 1 1 B1 B2 D cnf1 iucD hlyA papGII papGIII sfaDE usp tcpC afa/draBC traJ Inter. Amp Inter. Tc Inter. Cip Preglednica 1: S Fischerjevim točnim testom izračunane vrednosti P za korelacijo med lastnostmi sevov ter na gelčku odčitanimi velikostmi lis ERIC-PCR profilov. 114 1 0,592 0,228 1 0,349 0,7 0,405 1 1 0,095 1 0,456 1 0,001 1 1 1 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE filogenetske skupine virulentni dejavniki razmerje fil.sk / vir. dej. št. najdenih povezav /100 testov 0,05<P 14,42 7,692 1,875 št.najdenih povezav/100 testov P<0,01 5,769 3,550 1,625 Preglednica 2: Relativno število najdenih povezav med pomnožki ERIC-PCR ter filogenetskimi skupinami in virulentnimi dejavniki. Diskusija V naši raziskavi smo dokazali da je metoda ERIC-PCR primerna za ugotavljanje podobnosti sevov E. coli. Kljub temu, da je metoda zasnovana okoli ponavljajočih se zaporedij, se je v preteklosti izkazalo, da ERIC-PCR pomnožki niso povezani 4 z ERIC zaporedji ali zaporedji v njihovi bližini . Kljub temu je primerjava števila izkazanih povezav med ERIC-PCR pomnožki in filogenetskimi skupinami ter virulentimi dejavniki pokazala, da sevi enake filogenetske skupine tvorijo podobne ERIC-PCR profile. Zaradi podobnosti med sevi iste filogenetske skupine prihaja do večjega števila statistično značilnih povezav z ERIC-PCR pomnožki kot v primeru virulentnih dejavnikov. Kljub temu, da so podobne metode na ostalih 5 ponavljajočih se elementih že prešle v klinično uporabo , ostajata problematični ponovljivost ter ločljivost metode. V naši raziskavi smo imeli na razpolago podatke o virulentnih dejavnikih posameznih sevov in nekaterih povezavah med posamezniki iz katerih so bili omenjeni vzorci izolirani. S pomočjo teh podatkov smo v nekaterih primerih lahko sklepali glede identičnosti sevov med različnimi posamezniki v raziskavi. Naši rezultati potrjujejo tezo, da so posamezni sevi E. coli lahko enaki znotraj ožjih skupnosti in da se lahko razširijo na druge 6 posameznike izven teh skupnosti . Reference 1. 2. 3. 4. 5. Čitar M. 2011.Virulentni dejavniki izolatov bakterije Escherichia coli iz blata zdravih ljudi. Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije: 97 str. Versalovic J., Koeuth T., Lupski J. R., 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research, 19: 6823 - 6831 Wei G., Pan L., Du H., Chen J., Zhao L. 2004. ERIC-PCR fingerprinting-based community DNA hybridization to pinpoint genome-specific fragments as molecular markers to identify and track populations common to healthy human guts. Journal of Microbiological Methods, 59: 91 - 108 Gillings M., Holley M. 1997. Repetitive element PCR fingerprinting (rep-PCR) using enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) primers is not necessarily directed at ERIC elements. Letters in Applied Microbiology, 25: 17 - 21 Shutt C. K., Pounder J. I., Page S. R., Schaecher B. J., Woods G. L. 2005. Clinical evaluation of the DiversiLab microbial typing system using repetitive-sequence115 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 6. based PCR for characterization of Staphylococcus aureus strains. Journal of Clinical Microbiology, 43: 1187 – 1192 Tenaillon O., Skurnik D., Picard D. Denamur E. 2010. The population genetics of commensal Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology, 8 :207 - 217 Abstract. From feces of healthy volunteers 90 Escherichia coli isolates were isolated from March 1st till September 4th, 2009 (one isolate per person). In order to differentiate the isolates, including isolates from persons living in same community, the ERIC-PCR was performed. ERIC-PCR, a method based on the polymerase chain reaction, amplifies for each strain specific DNA fragments. The amplified DNA fragments are afterwards separated with eletrcophoresis techniques and ERIC-PCR profiles are determined. The analysis of obtained ERIC-PCR profiles showed that, some isolates in the analysed collection belong to the same strain and that some strains are found in a wider population and not only in the same family community. Keywords: Escherichia coli, commensal strains, feces of healthy individuals, isolation from feces, phylogenetic groups, molecular methods, ERIC-PCR. 116 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI ZNANSTVENI PRISPEVEK Povezava polimorfizma -13910C>T v promotorju gena LCT s simptomi značilnimi za laktozno netoleranco Correlation between polymorphism -13910C>T in the LCT gene promoter and symptomes characteristic for lactose intolerance Maruška Medved1, Uroš Potočnik1,2 1 Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo,Smetanova 17, 2000 Maribor, [email protected] 2 Univerza v Mariboru, Medicinska fakulteta, Center za humano molekularno genetiko in farmakogenomiko, Slomškov trg 15, 2000 Maribor, [email protected] Izvleček. Laktozna netoleranca je avtosomno recesivna metabolna lastnost, ki je značilna za okrog 75% odraslega svetovnega prebivalstva. Posamezniki z laktozno netoleranco imajo mutacijo -13910C>T v genu LCT, ki povzroči znižano aktivnost encima laktaze, kar onemogoča popolno razgradnjo laktoze na glukozo in galaktozo v tankem črevesu, to pa povzroči neprijetne simptome, predvsem drisko, napenjanje, vetrovi neprijetnega vonja, brbotanje in bolečina v trebuhu. Raziskava opravljena na finski populaciji, je pokazala 100% povezavo med mutiranim CC genotipom in klinično dokazano laktozno netoleranco. V raziskavi smo določili frekvenco mutacije v promotorskem delu gena LCT v slovenski populaciji. V raziskavo smo zajeli 607 naključnih posameznikov, pri katerih smo preverili pogostost posameznega genotipa polimorfizma -13910C>T v genu LCT. Nadalje smo pri naključno izbranih posameznikih s pomočjo anketnega vprašalnika, ki je zajemal 42 vprašanj, preverili prehranske navade. V raziskavi smo iskali povezavo med genotipom polimorfizma 13910C>T v genu LCT, za laktozno netoleranco, s simptomi in vnosom laktoze. Delež oseb z nizko laktazno aktivnostjo, torej genotipom CC je bil 36,5%, delež oseb z genotipom CT 46,6% ter genotipom TT 16,8%. Pri preiskovancih smo preverili tedenski vnos laktoze ter primerjali vnos laktoze z posameznimi genotipi ter s pojavljanjem simptomov. Preiskovanci z genotipom CC so imeli višji vnos laktoze, kot preiskovanci z genotipoma CT in TT. Med preiskovanci, pri katerih so se simptomi pojavili po zaužitju mleka in mlečnih izdelkov, je bil vnos laktoze nižji kot pri preiskovancih, pri katerih simptomi se ne pojavijo po zaužitju mleka in mlečnih izdelkov (p=0,035, CI=-150,8-7,273). Med preiskovanci, ki imajo simptome značilne za laktozno netoleranco, je vnos laktoze prav tako nižji kot pri preiskovancih, ki so mnenja, da se ti simptomi pojavijo po zaužitju mleka in mlečnih izdelkov (p=0,031, CI=-154,03 - -8,11). V raziskavi smo merili tudi ekspresijo gena LCT v skupini anketiranih preiskovancev. Ekspresija gena LCT je bila med preiskovanci s simptomi bistveno nižja (27,87), kot med preiskovanci, ki nimajo simptomov značilnih za laktozno netoleranco (37,25). Primerjava se je izkazala kot statistično signifikantna (p=0,046). Naša raziskava je ena izmed redkih raziskav, ki ob genotipizaciji preverjajo tudi prehrambene navade preiskovancev, zato bi bilo potrebno naše ugotovitve potrditi in nadgraditi še na večjem številu vzorcev, saj bi bili rezultati tako še bolj zanesljivi. Naše ugotovitve bi lahko pomembno prispevale k razumevanju vpliva vnosa laktoze na izražanje simptomov pri osebah z bolezenskim genotipom CC polimorfizma -13910C>T v genu LCT in v prihodnosti morda prispevale delček k boljšemu poznavanju laktozne netolerance in s tem zmanjšanju težav mnogim posameznikom, ki trpijo zaradi simptomov, ki jih bolezen laktozna netoleranca povzroča. Ključne besede: Laktozna netoleranca, LCT, asociacijska študija, genotipizacija. 117 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Uvod Laktozna netoleranca je avtosomno recesivna metabolna lastnost, ki je značilna za 75% odraslega svetovnega prebivalstva. Povzroči jo pomanjkanje encima laktaze, kar onemogoča popolno razgradnjo laktoze na glukozo in galaktozo v 1 tankem črevesju . Nerazgradnja laktoze pa povzroči neprijetne simptome, kot so driska, napenjanje, vetrovi neprijetnega vonja, brbotanje in bolečina v trebuhu ter mnoge druge. Posamezniki z laktozno netoleranco imajo mutacijo -13910C>T v genu LCT, ki povzroči znižano aktivnost encima laktaze (laktaza-florizin 2 hidrolaza, LPH) . Frekvenca mutacije se razlikuje v populacijah in je nižja pri 3 populacijah, ki so se v zgodovini preživljale z živinorejo in bile odvisne od mleka . To potrjuje tudi raziskava, ki je pokazala 100% povezavo med mutiranim CC genotipom in klinično dokazano laktozno netoleranco ter raziskava opravljena na japonski populaciji, ki je pokazala 100% frekvenco mutacije -13910C>T v 4,5 omenjeni populaciji . Laktozno netoleranco določamo s pomočjo dveh kliničnih testov. Najpogosteje uporabimo dihalni test z vodikom, merimo pa lahko tudi zvišanje vrednosti glukoze v krvi, ki je ob pomanjkanju laktaze ni. Mogoča je tudi diagnostika, ko ob endoskopski preiskavi prebavil odvzamemo košček sluznice tankega črevesa za določanje aktivnosti encima laktaze. Omenjeni testi so zelo neprijetni, delno invazivni, zato se jih zdravstvo redko poslužuje, posledično pa ostaja velik delež posameznikov z laktozno netoleranco neodkrit. V primerjavi z omenjenimi testi je genetski test neinvazniven in zanesljiv, vendar pa se postavlja vprašanje ali ga je smiselno izvajati pri vseh posameznikih s simptomi, ki kažejo na laktozno netoleranco. Simptomi, povezani z laktozno netoleranco, namreč sovpadajo s simptomi številnih drugih bolezni prebavil. V naši raziskavi smo preučili vpliv polimorfizma -13910C>T v promotorskem 6 področju gena LCT . V raziskavo smo zajeli 186 naključnih posameznikov in preverili pogostost posameznih laktaznih genotipov. Z anketiranjem posameznikov, z vprašalnikom, smo ugotavljali njihove prehrambene navade. Predvsem nas je zanimala količina zaužite laktoze ter pogostost prebavnih težav, ki so značilne za laktozno netoleranco. Materiali in metode V raziskavo smo vključili 607 preiskovancev izmed katerih smo 60 naključnih tudi anketirali. Njihova povprečna starost je bila 29,57 ± 14,36. Sestava po spolu je bila 60% žensk in 40% moških. 25 preiskovancev je bilo družinskih članov, ostali so bili izbrani naključno. Vsem preiskovancem je bilo odvzeto štirikrat po V = 3 mL krvi v sterilne epruvete, ki so vsebovale antikoagulant K-EDTA. Ob odvzemu krvi so preiskovanci izpolnili anketni vprašalnik o uživanju mleka in mlečnih izdelkov, o prehrambenih navadah ter o znakih laktozne netolerance. Vsi preiskovanci so podpisali privolitev za sodelovanje v raziskavi. Iz krvi bolnikov in kontrol smo s pomočjo Ficoll-Paque Plus (GE Healtcare) osamili limfocite. Iz limfocitov smo s pomočjo TRI reagenta (Sigma) po navodilih proizvajalca osamili DNK in jo raztopili v vodi v končni koncentraciji 50 µg/ml. 118 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE S pomočjo bioinformatskega orodja HuGE Navigator (http://www.hugenavigator.net/HuGENavigator/startPagePedia.do) smo poiskali asociacijske študije, narejene v različnih populacijah ter po pregledu celotne literature za analizo izbrali polimorfizem -13910C/T v genu LCT. S pomočjo spletnih aplikacij SNPCutter (http://bioinfo.bsd.uchicago.edu/SNP_cutter.htm) in Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) smo načrtovali začetne oligonukleotide. S programom GeneRunner in spletno aplikacijo SNPCutter smo izbrali ustrezne restrikcijske encime za določitev genotipov izbranega SNP-a. Genotipizacijo smo izvedli s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (Polymerase chain reaction – PCR) in s pomočjo metode polimorfizma dolžin restrikcijskih fragmentov (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm – RFLP) . PCR smo izvedli po naslednjih pogojih: 95°C 5 min, 35 ciklov po 95 °C 30 s, 63°C 30 s, 72°C 30 s. Po končani reakciji smo PCR produkt preverili na 2 % agaroznem gelu. PCR produktom smo dodali restrikcijski encim FaqI in jih inkubirali pri 37 °C čez noč. Produkte smo ponovno detektirali na 2 % agaroznem gelu. Slika1 prikazuje shematski prikaz detekcije DNA na agaroznem gelu za polimorfizem po restrikciji. Slika 1: Shema in slika detekcije DNA na agaroznem gelu za SNP rs4988235 na genu LCT. Rezultate smo statistično ovrednotili s pomočjo programskega paketa SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). S testom hi-kvadrat in Fischerjevim natančnim testom smo izračunali razlike med frekvencami alelov in genotipov med preiskovanci. Vpliv alelov in genotipov na posamezne klinične in laboratorijske parametre smo izračunali s pomočjo t-testa za dva neodvisna vzorca. Za statistično signifikantno smo smatrali povezavo, pri kateri je bila vrednost p < 0,05. Rezultati V skupini preiskovancev je imelo 36,5 % oseb genotip CC, ki je povezan z laktozno netoleranco. 63,5 % preiskovancev je imelo genotip CT ali TT, ki sta povezana s sposobnostjo razgradnje laktoze. Rezultate prikazuje preglednica 1. 119 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Genotip Število oseb n=607 Odstotek oseb Alel Alelna frekvenca CC 222 36,6 % C 0,649 CT 283 46,6 % T 0,351 TT 102 16,8 % Preglednica 1: Pogostost genotipov CC, CT in TT, ter alelna frekvenca alelov C in T v zdravi slovenski populaciji. Preiskovance smo genotipizirali za polimorfizem rs4988235. V preglednici 2 so prikazane frekvence genotipov skupine anketiranih preiskovancev. Genotip Število oseb n=140 Odstotek oseb Alel Alelna frekvenca CC 59 42,14 % C 0,65 CT 63 45,0 % T 0,35 TT 18 12,86 % Preglednica 2: Pogostost genotipov CC, CT in TT, ter alelna frekvenca alelov C in T pri preiskovancih za katere smo izvedli anketo o prehrambenih navadah. Preiskovanci so po odvzemu krvi rešili anketne vprašalnike. V raziskavi smo skušali ugotoviti povezavo med genotipom CC ter simptomi in vnosom laktoze, zato smo naredili primerjavo med genotipi in simptomi ter simptomi in vnosom laktoze. Med preiskovanci je bilo nosilcev genotipa CC 59, od tega jih je imelo simptome 29 (49,1%), 30 (50,8%) pa ne. Preiskovancev, pri katerih se simptomi pojavijo po zaužitju mleka in mlečnih izdelkov je bilo le šest (20,7%). Z genotipom CT je bilo 63 preiskovancev, od tega jih je imelo 42 (66,67%) simptome značilne za laktozno netoleranco, 21 (33,33%) pa ne. Takih preiskovancev, pri katerih se simptomi pojavijo po zaužitju mleka in mlečnih izdelkov je bilo devet (21,95%). Z genotipom TT je bilo 18 preiskovancev, od tega jih je imelo 6 (33,33%) simptome, 12 (66,67%) pa ne. Mnenja, da simptomi pojavijo po zaužitju mleka in mlečnih izdelkov je bil le en preiskovanec. Zanimal nas je tudi natančen tedenski vnos laktoze in količina laktoze, ki preiskovancem povzroča neprijetne simptome, ki se pojavijo kot posledica laktozne netolerance. Vnos laktoze preiskovancev se giblje med 0g laktoze tedensko do 800g laktoze. Večina preiskovancev (58,68%) zaužije nad 100g laktoze, od tega 30 (42,2%) z genotipom CC, 34 (47,88%) z genotipom CT in 7 z genotipom TT (9,86%). Vnos laktoze, ki povzroča težave, je pri večini (77,27%) preiskovancev okrog 10g laktoze pri enem obroku. Pri omenjeni količini se težave pojavijo petim (31,25%) preiskovancem z genotipom CC in devetim (56,25%) z genotipom CT ter dvema (12,5%) preiskovancema z genotipom TT. Pri preiskovancih smo preverili tedenski vnos laktoze ter primerjali vnos laktoze z posameznimi genotipi ter s pojavljanjem simptomov. Preiskovanci z genotipom CC so imeli višji vnos laktoze, kot preiskovanci z genotipoma CT in TT. Med preiskovanci, pri katerih so se simptomi pojavili po zaužitju mleka in mlečnih izdelkov, je bil vnos laktoze nižji kot pri preiskovancih, pri katerih se simptomi ne 120 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE pojavijo po zaužitju mleka in mlečnih izdelkov (p=0,035, CI=-150,8-7,273). Med preiskovanci, ki imajo simptome značilne za laktozno netoleranco, je vnos laktoze prav tako nižji pri preiskovancih, ki so mnenja, da se ti simptomi pojavijo po zaužitju mleka in mlečnih izdelkov (p=0,031, CI=-154,03 - -8,11). Preiskovanci, pri katerih se simptomi značilni za laktozno netoleranco pojavljajo pogosteje zaužijejo nižje količine laktoze kot preiskovancih pri katerih se simptomi pojavljajo manj pogosto. Diskusija V naši raziskavi nas je zanimala pogostost posameznih laktaznih genotipov v slovenski populaciji. Delež oseb z nizko laktazno aktivnostjo, torej genotipom CC je bil 36,39%, delež oseb z genotipom CT 47,15%, ter delež oseb z genotipom TT 16,46%. Rezultate smo primerjali s študijami opravljenimi na drugih populacijah in ugotovili da je delež oseb z genotipom CC najbolj podoben tistemu 7,8 v madžarski, nemški in ruski populaciji Ugotovili smo tudi, da je delež oseb z genotipom CC precej višji, kot pri skandinavskih populacijah, kjer se ta giblje 9 okrog 5% , ter precej nižji kot pri afriških populacijah, kjer se ta giblje okrog 80%, 4,5,10 pri nekaterih populacijah pa ta znaša celo do 100%. Montgomery, Büller in Rings s sodelavci so ugotovili, da na intenzivnost simptomov vplivajo, poleg genotipa še črevesna flora, hormoni, količina zaužite 11 laktoze in subjektivno doživljanje simptomov. Naša raziskava je pokazala, da posamezniki, ki imajo simptome značilne za laktozno netoleranco zužijejo bistveno manj laktoze kot preiskovanci, ki simptomov značilnih za laktozno netoleranco nimajo. Naša raziskava je ena izmed redkih tovrstnih raziskav, saj je večina raziskav opravljena v klinični praksi, prav tako pa večina raziskav preverja zanesljivost HBT testa in laktoznega testa z odvzemom krvi. Zato bi bilo potrebno naše ugotovitve potrditi in nadgraditi še na večjem številu vzorcev, saj bi bili rezultati tako še bolj zanesljivi. Naše ugotovitve bi lahko pomembno prispevale k razumevanju vpliva vnosa laktoze na izražanje simptomov pri osebah z bolezenskim, CC, genotipom in v prihodnosti morda prispevale delček k boljšemu poznavanju laktozne netolerance in s tem zmanjšanju težav mnogim posameznikom, ki trpijo zaradi simptomov, ki jih laktozna netoleranca povzroča. Reference 1. 2. 3. 4. 5. Swallow, D. M., Poulter, M. & Hollox, E. J. Intolerance to lactose and other dietary sugars. Drug Metab Dispos. 2001,29, 513-516. Enattah, N. S. S. T. S. E. e. al. Identification of a variant associated with adult-type hypolactasia. Nature genetics 2002, 30, 233-237 Tishkoff S.A.et al. Convergent adaptation of human lactase persistence in Africa and Europe. Nature genetics 2006, 39, 31-40. Enattah, N. S. et al. Identification of a variant associated with adult-type hypolactasia. Nat. Genet. 2002, 30, 233-237. Mattar, R. et al. Frequency of LCT -13910C>T single nucleotide polymorphism associated with adult-type hypolactasia/lactase persistence among Brazilians of different ethnic groups. Nutr. J. 2009 8, 46. 121 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 6. Harvey CB, Pratt WS & Islam I. DNA polymorphismis in the lactase gene. Hum.Genet. 1995, 3, 27-41. 7. Krawczyk, M. et al. Concordance of genetic and breath tests for lactose intolerance in a tertiary referral centre. J. Gastrointestin. Liver Dis. 2008, 17, 135-139. 8. Nagy, D. et al. Prevalence of adult-type hypolactasia as diagnosed with genetic and lactose hydrogen breath tests in Hungarians. Eur. J. Clin. Nutr. 2009, 63, 909-912. 9. Jorgensen, M. K., Thode, J., Davidsen, B., Gerner, C. & Bathum, L. [Diagnosing lactose intolerance in adults]. Ugeskr. Laeger 2008 170, 3309-3312. 10. Babu, J., Kumar, S., Babu, P., Prasad, J. H. & Ghoshal, U. C. Frequency of lactose malabsorption among healthy southern and northern Indian populations by genetic analysis and lactose hydrogen breath and tolerance tests. Am. J. Clin. Nutr. 2010, 91, 140-146. 11. Montgomery, R. K., Buller, H. A., Rings, E. H. & Grand, R. J. Lactose intolerance and the genetic regulation of intestinal lactase-phlorizin hydrolase. FASEB J. 1991, 5, 28242832. Abstract. Lactose intolerance is an inherited autosomal recessive metabolic characteristic that affects approximately 75% of the adult world population. Individuals with lactose intolerance have a mutation -13910C> T in the LCT gene, which causes reduced activity of the enzyme lactase, which prevents the complete degradation of lactose to glucose and galactose in the small intestine, which causes unpleasant symptoms, primarily diarrhea, bloating, flatulence odor and abdominal pain. Research carried out on a Finnish population showed a 100% link between the mutant CC genotype and clinically proven lactose intolerance. In this study we determined the frequency of mutations in the promoter of the LCT gene in the Slovenian population. In the survey we evaluated 607 randomly chosen healthy individuals in which we examined the frequency of individual lactase genotypes. Through the questionnaire, which included 42 questions, we checked the nutritional habits of randomly selected individuals. In this study we searched for a connection between the medical, CC, genotype for lactose intolerance and the symptoms and lactose intake. We also measured the LCT gene expression. The prevalence of the CC genotype was 36,5%, CT genotype 46,6% and the TT genotype 16,8%. We checked the weekly intake of lactose and compare the weekly intake of lactose with the genotypes and the occurrence of symptoms. Subjects with CC genotype had a higher intake of lactose, such as subjects with CT and TT genotypes. The lactose intake was among subjects with symptoms after ingestion of milk and dairy products lower, than in subjects whose symptoms do not occur after ingestion of milk and milk products (p = 0.035, CI =- 150.8-7.273). The lactose intake was also lower among subjects with symptoms of lactose intolerance, than in subjects who are of the opinion that the symptoms occur after ingestion of milk and milk products (p = 0.031, CI =- 154.03 - -8.11 ). In this study we also measured the LCT gene expresion. LCT gene expression was among the subject with symptoms significantly lower (27,87) than among subjects without symptoms characteristic for lactose intolerance (37,25). The comparision has proved to be statisticaly significant (p=0,046). Our study is one of the few studies that don’t examine only the genotyping, but also the dietary habits of the subjects. Further studies and a larger number of samples are needed to confirm and to build further our findings. Our findings could have important contributions to understanding the influence of lactose on the expression of symptoms in subjects with medical, CC, genotype and may contribute in the future a fraction to a better knowledge of the lactose intolerance, thereby reducing the problem to many individuals, who suffer from symptoms of the disease lactose intolerance. Keywords: lactose intolerance, LCT, association study, genotyping. 122 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI ZNANSTVENI PRISPEVEK Obdelava podatkov genotipizacije polimorfizmov SNP pridobljenih z uporabo DNK mikromrež Processing of SNP genotype data obtained with DNA microarrays Mitja Mitrovič1,2, Rinse K. Weersma2, Uroš Potočnik1,3 1Univerza v Mariboru,Medicinska fakulteta, Center za humano molekularno genetiko in farmakogenomiko, Slomškov trg 15, 2000 Maribor 2Univerzitetni klinični center Groningen, Oddelek za Genetiko, Oostersingel 47, Groningen, Nizozemska 3Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Smetanova 17, 2000 Maribor Izvleček. Za odkrivanje povezav med variacijami v zaporedju DNK in kompleksnimi boleznimi se v zadnjem času uporabljajo asociacijske študije na celotnem genomu (ang. genome-wide association study - GWAs), katerih z DNA mikromrežami določamo genotipe bolnikov in zdravih posameznikov za več 100.000 polimorfizmov posameznega nukleotida (ang. single nucleotide polymorphisms - SNP). Z večanjem števila vzporednih testov (t.j. številom SNP-jev) se veča tudi verjetnost, da bomo dobili statistično značilne povezave čisto po naključju. Zato velik izziv pri izvedbi GWAs predstavlja pravilna obdelava ogromne količine dobljenih podatkov, saj lahko majhna napaka v genski tipizaciji odločilno vpliva na rezultate statistične analize alelnih in genotipskih frekvenc. Namen te študije je optimizacija protokola kontrole kakovosti (KK) z bioinformatskim orodjem PLINK, nato pa statistična analiza podatkov pridobljenih z DNA mikromrežo »Immunochip« (iCHIP) na 256 slovenskih bolnikih s kronično vnetno črevesno boleznijo (KVČB) in 236 zdravih posameznikih iz slovenske populacije. iCHIP je po meri izdelana mikromreža z 200.000 SNPi za gosto gensko tipizacijo 186 genomskih regij povezanih z 12 avtoimunskimi boleznimi. V prvem sklopu KK, ki smo ga izvedli na skupno 492 posameznikih, smo odkrili in izločili 1 zdravega posameznika z neskladnim spolom in 14 zdravih posameznikov z manjkajočimi genotipi. Z analizo identičnosti po poreklu (ang. identity by descent - IBD) in identičnosti po stanju (ang. identity by state - IBS) smo izločili 37 posameznikov (od tega 30 bolnikov) s sorodstvenimi vezmi prve in druge stopnje. Z analizo prinicipalnih komponent in primerjavo z 10 referenčnimi populacijami iz projekta HapMap smo odkrili in izločili 3 zdrave posameznike z divergentnim poreklom. Skupno smo izločili 55 posameznikov, preostale (226 bolnikov, 211 kontrol) pa uporabili v nadaljnji statistični analizi. Drugi sklop KK glede na SNP smo pričeli na 196.524 SNP-jih. V prvem koraku smo z ročnim preverjanjem »genotipskih oblakov« za vsak SNP iz nadaljnje analize izločili 17.216 SNPov. Nadalje smo izločili 19 SNP-jev s prekomernim deležem manjkajočih genotipov (> 2 %), 8.329 SNP-jev s statistično značilnimi razlikami (p < 0,00001) v stopnji manjkajočih genotipov med bolniki in zdravimi posamezniki in 1.190 SNP-jev z značilnim odstopanjem od Hardy-Weinbergovega ravnotežja (ang. Hardy-Weinberg equilibrium - HWE) pri zdravih posameznikih. Po KK smo v asociacijsko analizo vključili 226 bolnikov s KVČB in 211 kontrol z genotipi za 169.774 SNPov in replicirali večino lokusov, ki so bili povezani s CB v predhodnih GWAs. Ključne besede: genska tipizacija, Immunochip, kronično vnetna črevesna bolezen, kontrola kakovosti. 123 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Uvod Kronična vnetna črevesna bolezen (KVČB) je kompleksno vnetje prebavil, ki ga delimo na Crohnovo bolezen (CB) in ulcerozni kolitis (UK), v 10-15 % primerov pa bolezni ne moremo uvrstiti ne v eno ne v drugo skupino in govorimo o intermediarnem kolitisu (IK). V nedavnih meta-analizah asociacijskih študij na celotnem genomu (ang. GWAs za genome-wide association study) je bilo s CB 1,2 povezanih 71 lokusov, z UK pa 47 , ki pa razložijo le približno 20 % heritabilitete povezane s KVČB. Kljub številnim GWA študijam in obsežnim meta-analizam pa z zvezi z genetsko predispozicijo h KVČB ostajajo nekatera neodgovorjena vprašanja: i) kako razložiti preostali delež heritabilitete, upoštevajoč redke variante in nove pogoste polimorfizme (MAF > 5 %) ; ii) odkrivanje vzročnih variant in pripadajočih genov (ali vsaj zožitev genetskega področja od koder prihajajo GWAs signali). Za raziskave teh in ostalih vprašanj povezanih z genetiko kompleksnih bolezni je bil ustanovljen mednarodni konzorcij 3,4 Immunochip oz. iCHIP . Jedro tega projekta je po meri izdelana DNA mikromreža (Illumina), ki vključuje podatke sekveniranja iz projekta 1000 5 Genomes in ostalih projektov resekveniranja, splošne variante za 12 avtoimunskih bolezni (avtoimunska bolezen ščitnice, ankilizirajoči spondilitis, Crohnova bolezen, celiakija, pomanjkanje IgA, multipla skleroza, primarna biliarna ciroza, psoriaza, revmatoidni artritis, sistemski lupus eritematozus, diabetes T1 in ulcerozni kolitis) iz predhodnih GWA študij. V okviru konzorcija je bilo izbranih 186 različnih lokusov s številnimi označevalci, ki izpolnjujejo kriterij -8 statistične značilnosti na celotnem genomu (p < 5x10 ). V primerjavi s standardnimi DNA mikromrežami (npr. Hap550, Illumina) je gostota označevalcev na iCHIP-u 20-30 -krat večja (Sliki 1a in 1b). 124 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 1a. Primerjava porazdelitve gostote označevalcev med iCHIPom in standardno DNA mikromrežo Hap550 (Illumina). Na abscisi so do sedaj odkriti CB lokusi, na ordinati pa število označevalcev v določenem lokusu. Slika 1b. Primerjava porazdelitve gostote označevalcev med iCHIPom in standardno DNA mikromrežo Hap550 (Illumina). Na abscisi so do sedaj odkriti UK lokusi, na ordinati pa število označevalcev v določenem lokusu. Materiali in metode Vzorci V študijo smo vključili 256 slovenskih bolnikov s KVČB, od tega 202 bolnikov s CB, 37 bolnikov z UK in 17 bolnikov z IK. V kontrolno skupino smo vključili 236 zdravih posameznikov. Študijo je odobrila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko. Genomsko DNA 255 bolnikov s KVČB in 236 zdravih TM posameznikov smo izolirali iz levkocitov z reagentoma Ficoll-Paque Plus (GE TM Healthcare Bio-Sciences, Švedska) in TriReagent (Sigma-Aldrich, ZDA) v skladu s standardnima protokoloma proizvajalcev. Genotipizacija Vzorce smo genotipizirali s hibridizacijo na DNA mikromrežo Immunochip v skladu s protokolom proizvajalca (Illumina). Genetske pozicije markerjev temeljijo na NCBI različici 36 (hg18). 125 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Kontrola kakovosti Protokol kontrole kakovosti (KK) smo izvedli z bioinformatskim orodjem PLINK 6 v1.07 na 256 slovenskih bolnikih s kronično vnetno črevesno boleznijo (KVČB) in 236 zdravih posameznikih iz slovenske populacije. V GWAs testiramo večje število SNPov (npr. 200.000 – 1.000.000), zato lahko tudi majhna napaka v genski tipizaciji odločilno vpliva na rezultate. Če npr. testiramo 1 milijon označevalcev in bo delež neuspešno tipiziranih označevalcev znašal 0,001, potem bo zaradi lažno-pozitivnih povezav v nadaljnjo analizo po nepotrebnem vključenih 1.000označevalcev. Izločitev peščice neustreznih posameznikov bo imelo manjši vpliv na statistično moč (in rezultate) kot izločitev neustreznih SNP-jev, saj vsak izločen SNP predstavlja potencialno spregledano povezavo med boleznijo in določenim lokusom. Zato najprej izvedemo kontrolo kvalitete posameznikov, nato pa kontrolo kvalitete SNP-jev. V prvem sklopu KK, ki smo ga izvedli na skupno 492 slovenskih posameznikih, smo odkrili in izločili 1 zdravega posameznika z neskladnim spolom. Odkrivanje in izločanje vzorcev z neskladnim spolom izvajamo z analizo SNP-jev na kromosomu X. Ker imajo moški le eno kopijo kromosoma X, ne morejo biti heterozigoti, razen za SNP-je v pseudo-avtosomni regiji kromosoma Y. Običajno bodo posamezniki moškega spola za izbrane označevalce kromosoma X v celoti homozigoti (stopnja homozigotnosti = 1), medtem ko pri ženskih posameznicah pričakujemo stopnjo homozigotnosti < 0,2. Primer: pri vzorcu moškega spola, ki mu nepravilno pripišemo ženski spol, bo stopnja homozigotnosti višja od pričakovane. Pri vzorcu ženskega spola, ki ga označimo kot moškega, pa bo stopnja homozigotnosti nižja od pričakovane. V naslednjem koraku smo izločili 14 zdravih posameznikov s povišano stopnjo manjkajočih genotipov. Vzorci DNA z nizko kvaliteto ali koncentracijo bodo imeli podpovprečno stopnjo določanja genotipov (ang. call rate). Mejno vrednost določimo arbitrarno, z natančnim opazovanjem porazdelitve manjkajočih genotipov na vseh vzorcih. Običajno se giblje med 3 – 7 %, v našem primeru pa smo izbrali 2 % (t.j. posamezniki z več kot 2 % manjkajočih genotipov bodo izločeni iz analize). Tudi prevelika odstopanja od povprečne stopnje heterozigotnosti (razen pri spolnih kromosomih) lahko nakazujejo na kontaminacijo DNK ali sorodstvene vezi. Mejni vrednosti stopnje določanja genotipov in stopnje heterozigotnosti lahko določimo računsko in predstavimo grafično (slika 2). 126 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 Heterozygosity rate 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE ● ● ●● ● ● ● ● ●●● ● ●● ●●● ● ● ● ●● ●●●●● ● ●●● ●● ● ● ● ●●●● ●●●●● ●●●● ● ● ●●●● ●● ●●●● ● ●● ●●● ●●●●● ● ● ●●●● ● ●●●●● ● ● ●● ●●●●●●●● ● ●● ●● ● ● ● ● ●●● ● ●● ●●● ●●●● ● ●●●● ●●●●● ●● ● ● ●●●●● ●●●● ●●●●●●● ●● ● ●● ●● ●●●● ●● ●● ●● ●●●●●●● ● ● ●● ●● ● ●●● ●● ● ●●●●●●●●●●●●●●● ●● ●● ●● ●●● ●●● ● ●● ●●●●●●●●● ● ●● ●●●●● ● ●● ●● ● ● ●● ●●● ●● ● ●● ●●●●●●●● ●● ●● ●● ●●●●●●●● ●●●● ●● ● ●●● ●●●●●● ●● ● ●●●●● ●● ●●●●●●●●●●● ●● ●● ●● ●●● ●●●●● ●● ● ●● ● ●● ●●● ●●● ●●●●● ●● ●●●● ●●● ●● ● ●● ●● ●●● ● ●● ●●●●● ● ●● ●● ● ● ●●● ●●● ●●●●●● ●● ●●● ● ● ●● ●●●● ●●● ●●●●● ●●●● ● ●●●● ●● ●●●● ●● ● ● ●● ● ● ●● ● ●● ● ●●● ● ●● ● ●●●●●●● ●●● ●●● ● ● ●● ● ● ●●● ●● ● ● ●●●● ● ● ● ● ● ● ●●●● ● ● ●●●●● ● ●● ● ●●●● ● ● ●● ●● ● ●●●●●● ● ●● ●● ●● ●●●● ● ●● ● ● ●● ● ●● ●● ● ●● ● ●●●●●●● ●● ●●●●● ●● ●● ●● ● ●● ●● ●●● ●●● ● ●● ●● ●●●● ●● ●● ●●●● ●● ● ● ● ●● ●●● ●● ●● ●● ● ● ●● ● ● ●● ●● ●●● ●●● ● ● ●● ●● ●●●● ●● ●●●● ●● ●● ●● ● ● ●●● ●● ●● ●●● ●● ●● ● ●● ●● ●●● ●●●●●●●●● ●●●●● ● ●● ●● ●● ●● ● ●●● ● ●● ●● ● ● ●● ●●● ● ●● ●● ●●● ●●●●●●●● ● ● ● ●● ●● ●●●●●●●●● ●●●● ● ●● ●● ●●● ●● ● ●●●●●● ●●● ●●●● ●●● ●● ● ●● ●● ●● ●● ●●●● ● ● ● ● ●●● ●●● ●● ● ● ●●●●●● ●●●●●●●●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●●●●● ● ● ● ● ●● ●●●●●● ● ●●● ● ● ●●●●●●●●●● ● ●●●● ● ● ● ● ●●● ●● ● ● ● ●● ● ● ●●●●● ●● ● ● ●● ●● ●● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ●● ●●● ●●●● ● ● ●● ● ● ●● ● ●●● ●● ●● ●●●● ●●●●●●● ● ●● ●● ●● ●● ●● ●● ●● ● ●● ●● ●● ● ● ● ●● ● ● ● ●●●●●●● ● ● ● ●●●● ●● ● ● ● ● ●● ● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●●● ● ●●●●●●●●●●●●●●●●●● ● ● ● ●●● ●●● ●●●● ●● ● ● ●●●● ● ●●●●● ● ●● ●●● ● ● ●● ● ●● ●● ●● ●● ●●● ● ●●●● ● ●●● ●●●●● ● ●● ● ●●●●●● ●●●●●●●● ●● ● ●●●●● ● ●●●● ●● ●●● ● ●● ●●● ● ●● ●● ● ●● ● ● ● ●● ●●●●● ●●●●● ● ●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●●● ●●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 0.001 0.01 0.1 1 Proportion of missing genotypes Slika 2. Mejni vrednosti stopnje določanja genotipov in stopnje heterozigotnosti. Posameznike, ki imajo delež neuspešno tipiziranih SNP-jev > 0,02 (navpična črtkana črta) in/ali stopnjo heterozigotnosti zunaj intervala Hpovp ± 3 s.d. (vodoravni črtkani črti) izključimo iz nadaljnje analize. Kriteriji izbire mejnih vrednosti se razlikujejo od študije do študije in so odvisni predvsem od uporabljene platforme in zasnove GWAs. Z analizo identičnosti po poreklu (ang. identity by descent - IBD) in identičnosti po stanju (ang. identity by state - IBS) smo izločili 37 posameznikov (od tega 30 bolnikov) s sorodstvenimi vezmi prve in druge stopnje. Ena od temeljnih predpostavk populacijskih GWAs je, da si preučevani posamezniki niso v sorodu. Z drugimi besedami, največja dovoljena sorodnost med posamezniki v GWAs je omejena na tretje koleno (tretjestopenjska sorodnost). Pri podvojenih vzorcih (duplikati) ali posameznikih z bližjimi sorodstvenimi vezmi bodo določeni genotipi zastopani pogosteje, kar pa ne bo odraz dejanskega stanja v populaciji. Duplikate in sorodnike odkrivamo z metodo enakosti po stanju, in sicer, za vsak par posameznikov glede na povprečni delež skupnih oz. deljenih genotipov (brez spolnih kromosomov). Metoda deluje najbolje, če jo uporabimo na zbirki neodvisnih SNP-jev (v našem primeru 8.918 SNP-jev), kar dosežemo tako, da predhodno iz analize izključimo regije z visoko neuravnoteženostjo vezave (ang. LD za linkage disequilibrium) in SNP-je z MAF < 5 %. S tem ustvarimo zbirko SNP-je, ki imajo na 2 2 danem intervalu (npr. 50 kb) r < 0,2 (r je koeficient genetske korelacije in merilo 2 LD, vrednost r = 1 nakazuje, da sta SNP-ja v popolni korelaciji, medtem ko vrednost 0 nakazuje, da sta neodvisna drug od drugega). S testiranjem takšne zbirke SNPov bomo za duplikate dobili vrednost IBS = 1. Po ugotavljanju sorodnosti z IBS, izračunamo stopnjo sorodnosti tudi z metodo IBD. Tukaj pri 127 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 0.20 duplikatih in enojajčnih dvojčkih pričakujemo IBD = 1, pri sorodnikih prve stopnje IBD = 0,5, pri sorodnikih druge stopnje IBD = 0,25 in pri sorodnikih tretje stopnje IBD = 0,125. Zaradi napak v genski tipizaciji, LD in raznolikosti populacijske strukture prihaja do odstopanj od teoretičnih vrednosti IBD, zato pa dogovoru iz nadaljnje analize izločimo enega v paru posameznikov z IBD > 0,1875. Z analizo prinicipalnih komponent in primerjavo z 10 referenčnimi populacijami iz 7 projekta HapMap smo odkrili in izločili 3 zdrave posameznike z divergentnim poreklom. Posameznike z neskladnim oz. divergentnim poreklom (t.j. posameznikovo genetsko ozadje znatno odstopa od povprečja preiskovane/referenčne populacije) odkrivamo z metodama PCA (ang. principal component analysis) oz. MDS (ang. multidimensional scaling). Pri obeh izračunamo principalne komponente iz podatkovne matrice, sestavljene iz številnih potencialno koreliranih spremenljivk. Prva komponenta zajema največ variacije dane podatkovne zbirke, opazovane spremenljivke so posamezniki, potencialno korelirane spremenljivke pa SNPi. Model principalnih komponent temelji na zbirki nedovisnih SNP-jev (podobno kot IBS in IBD). V tej študiji smo izvedli tri različice MDS na 8.918 SNPih: globalno, lokalno in primeri-kontrole (slike 3, 4, 5). 0.15 Indian Dutch Slovenian Han Chinese Yoruban Utah Gujarati Toscani Mexican Japanese Kenyans Maasai Chinese−Denver 0.10 ● ●●●● ●●●● ● ●●●●●● ● ●●●● ●●● ● ●● ●●● ● ●●●●●●●● ●● ● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ●● ●●● ● ●● ●● ● ● ● ● ●● ● ●●● ●● ● ● ●● ● ●● ● ●● ● ●●● ● ●●● ●● ●●●● ●● ● ● ● ●● ●● ●● ● ● ● ● ● ●● ●●●●●●●● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● 0.05 MDS C2 ● ●●● ●●● ● ● ●●●●●● ● ●●● ● ●●● ●● ●● ●● ●● ●● ●● ●● ● ● ●● ● ●● ● ●● ● ●●● ●●● ●●●●●●●●●● ●●● ●●● ● ●●●● ●●●●●● ● ● ●● ● ● ● ●● ● ●● ● ●● ●● ●● ●●●●●●●● ●●●● ● ● ●● ●●●● ● ● ● ●● ●● ●● ●●●●●● ●● ● ● ●● ● ●● ●● ●●● ●●●●● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●● ●●● ●●● ●● ● ●●●● ● ●●● ●●●● ●● ● ● ●● ●● ● ● ●● ●●● ● ●● ●● ●● ● ● ●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●●● ●● ●● ●● ● ●●●●● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●● ● ●● ● ● ●●●● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ●● ●●● ● ● ● ●●●● ●● ● ● ● ●●●●● ● ● ● ●●● ●●● ● ● ●● ● ● ●● ●●● ● ● ● ● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●●●● ●● ●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ●● ●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ●● ●● ● ●● ● ●● ● ● ●● ● ●● ● ●● ● ● ●● ●● ● ●● ● ● ● ● ●●● ● ●● ● ●● ● ●●●●●●● ●● ●●●● ● ● 0.00 ●● ●● ● ● ●●●●●●● ●●●● ●●●● ● ● ●● ● ● ●●● ● ● ●● ●●● ●● ● ●● ● ● ● ●● ●●●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ●●● ● ●● ● ● ●● ● ● ●● ● ● ●●● ●● ●● ● ● ● ● ●● ● ● ● ●● ● ● ●●● ●● ● ●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ●● ●● ● ●● ● ● ● ● ●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●●●●●● ● ●● ●● ●●●●● ● ● ●● ● ●● ● ●● ●● ● ● ●● ● ● ● ●● ●● ● ●●● ●● ● ●●●● ●●●● ●● ● ● ●●● ● ● ● ●● ● ●●● ●●● ●● ● ●●●●● ● ● ●●●● ● ●● ●●●●●●●● ● ●●●●● ● ● ●● ●●●●● ● ●● ●●●● ● ● ●●●● ●● ●● ●●● ●●● ● ●●●● ● ● ●● ● ●●● ●● ● ●● ● ●● ●●● ●● ● ●●● ● ●● ●● ● ●● ●● ● ●●● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ●●●●● ● ● ● ●● ●● ● ●● ●● ●● ● ●● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●● ●●● ●●●● ●●● ● ●●● ● ● ● ●●●●● ● −0.10 −0.05 ● ● ●● ● ●● ●● ● ●●●●●●●●●● ●● ● ● ●●●● ● ●●● ●● ●●● ●●●● ● ●●● ● ●●●● ●● ● ●● ●● ●●●● ● ●● ● ●● ●● ●● ●●●● ● ● ● ●● ●● ●● ● ●● ●●●● ● ●● ●●●●● ● ●● ● ● ●● ●● ●●●●● ●●●●●●●●● ●●● ● ● −0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 MDS C1 Slika 3. Globalna različica MDS. Na diagramu sta na x in y oseh prikazani prva in druga principalna komponenta. Točke prikazujejo posameznike različnih populacij; 10 populacij iz projekta HapMap in 3 testirane populacije (slovenska, nizozemska in indijska). Črne točke prikazujejo posameznike iz slovenske populacije. Trije slovenski posamezniki močno odstopajo od povprečja evropskih populacij, saj so med povrečjem evropskih in indijskih populacij. 128 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 4. Lokalna različica MDS. Na diagramu so prikazani posamezniki evropske populacije, ki pričakovano bolj ali manj sovpadajo. Po izračunu mejnih vrednosti intervalov obeh komponent, so se vsi posamezniki znašli znotraj teh intervalov. 129 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 5. MDS na primerih in kontrolah. Na diagramu so prikazani slovenski KVČB bolniki in zdravi posamezniki, ki sovpadajo. Po izračunu mejnih vrednosti intervalov obeh komponent, so se vsi posamezniki znašli znotraj teh intervalov. Skupno smo v KK glede na posameznika, izločili 55 slovenskih posameznikov; preostalih 226 bolnikov in 211 kontrol pa smo uporabili v nadaljnji statistični analizi. V drugem sklopu smo izvedli KK glede na SNP, in sicer, za 196.524 SNP-jev. V prvem koraku smo z ročnim preverjanjem »genotipskih oblakov« za vsak SNP iz nadaljnje analize izločili 17.216 SNP-jev. Nato smo izločili 8.329 SNP-jev z znatnimi razlikami (p < 0.00001) v stopnji manjkajočih genotipov med bolniki in zdravimi posamezniki. Nadalje smo izločili 19 SNP-jev s prekomernim deležem manjkajočih genotipov (> 2 %) in 1.190 SNP-jev z značilnim odstopanjem od HardyWeinbergovega ravnotežja (ang. Hardy-Weinberg equilibrium - HWE) pri zdravih posameznikih. Odstopanja od HWE lahko kažejo na napake v določanju genotipov, zato SNP-je, ki značilno odstopajo od HWE izločimo. Vendar lahko odstopanja od HWE kažejo tudi na selekcijo; pri vzorcih bolnikov pričakujemo odstopanja od HWE, zlasti pri SNP-jih iz kandidatnih bolezenskih lokusov. Zato je odstopanja od HWE smiselno preverjati le na vzorcih zdravih posameznikov. Prag značilnega odstopanja od HWE, pri katerem ohranimo ali izločimo določen SNP se med študijami razlikuje (v tej študiji smo uporabili p < 0,0001). 130 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Statistična analiza Statistično analizo smo izvedli z orodjem PLINK, diagrame smo načrtovali z 8 statističnim paketom R . Rezultati Po KK je bilo v asociacijsko analizo vključenih 226 KVČB bolnikov in 211 kontrol z genotipi za 169.774 SNP-jev. S primerjavo alelnih frekvenc med primeri in kontrolami smo za vsak SNP izračunali p-vrednost, razmerje obetov (ang. odds ratio – OR) in interval zaupanja 95 % (ang. confidence interval – CI95%). Uspešnost KK smo ocenili z Q-Q (kvantil-kvantil) diagrami in izračunom faktorja -Q diagrami so grafična metoda za grafično analizo verjetnostnih distribucij populacij. V našem primeru so to pričakovane in opažene p-vrednosti. Pri teh diagramih so eden ob drugega postavljeni kvantili dotičnih verjetnostnih distribucij. V primeru, da z nekim lokusom ne opazimo asociacije, bosta pričakovana in opažena p-vrednost enaki (na diagramu se to vidi kot premica y = x). Za merodajno oceno KK je slovenska populacija premajhna, zato smo v analizo vključili še nizozemsko in indijsko populacijo. Zaradi različnih populacij smo za izračun p-vrednosti uporabili Cochran-Mantel-Haenszel test za 2608 primerov, 2099 kontrol in 169.774 SNP-jev (slika 6). Slika 6. Q-Q diagram za 2608 primerov, 2099 kontrol in 169.774 SNP-jev. Distribucija opaženih p-vrednosti močno odstopa od distribucije pričakovanih pvrednosti, kar nakazuje na asociacije (še posebej na “repu” krivulje). Faktor inflacije se po uspešni KK na standardnih mikromrežah giblje okoli 1,20. V našem 131 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE primeru je λ = 1,53, kar ni presenetljivo, glede na to, da so na iCHIPu zbrane le bolezenske regije (hypothesis-driven platform). Uspešnost KK smo testirali tudi na zbirki t.i. bralno – pisalnih (oz. ničelnih) SNPjev, s katerimi ne pričakujemo asociacije. Tako smo p-vrednosti izračunali s Cochran-Mantel-Haenszel testom za 2608 primerov, 2099 kontrol in 2.583 SNPjev (slika 7). 7 6 Observed (−logP) 5 4 ● ● 3 ● ● ●● 2 1 0 ●● ●●●●● ●● ● ●● ● ●●● ●●●●● ●●●● ●●● ● ● ● ●●●●●● ●●●●●●●●● ●●●●● ●●●●● ● ● ● ● ● ● ●●●● ●●● ●●●●● ●●●●●● ●●●●●●● ●● ● ●● ● ● ●● ● ● ●●● ● ● ●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ●●● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ●● ● ●● ●● ●● ●● ●● ●● ● ● ●● ● ●● ●● ●● ●● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● 0 1 2 ●● ● ● ● 3 4 5 6 7 Expected (−logP) Slika 7. Q-Q diagram za 2608 primerov, 2099 kontrol in 2.583 “bralno-pisalnih” SNP-jev. V tem je bil faktor inflacije λ = 1,01, kar potrjuje, da je bila KK izvedena pravilno in uspešno. Rezultati statistične analize (primerjave alelnih frekvenc med primeri in kontrolami) so prikazani v “Manhattan” diagramu (slika 8) in povzeti v preglednici 1. 132 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 8. Manhattan diagram za 202 bolnika s CB in 211 zdravih posameznikov. Na abscisi so kromosomi, na ordinati pa negativni logaritmi p-vrednosti. Iz slike je razvidno, da zaradi majhnega vzorca slovenske populacije nismo dosegli standardnega GWA praga (rdeča črta, p < 5x10-8). CHR Alleles Freq_1 Freq_2 P OR Gene 1 rs11465804 SNP G/T 0.01676 0.05024 0.01118 0.3222 IL23R 10 rs17582416 G/T 0.3855 0.3038 0.01681 1.437 CCNY 5 rs11747270 G/A 0.1117 0.06459 0.01977 1.822 IRGM 5 rs2188962 T/C 0.4804 0.4019 0.02795 1.376 SLC22A5 9 rs10758669 C/A 0.4302 0.3565 0.0359 1.363 JAK2 5 rs4613763 C/T 0.176 0.1244 0.04382 1.503 PTGER4 Preglednica 1. Povzetek statistične analize slovenskih bolnikov s CB in zdravih posameznikov. Iz preglednice 1 je razvidno, da smo na slovenski populaciji replicirali večino lokusov, ki so bili povezani s CB v predhodnih GWAs. Za primerjavo smo v statistično analizo vključili tudi primere in kontrole iz nizozemske in indijske populacije, skupno 2608 primerov KVČB in 2099 kontrol (slika 9). 133 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE Slika 9. Manhattan diagram za 2608 primerov KVČB in 2099 zdravih posameznikov. Na abscisi so kromosomi, na ordinati pa negativni logaritmi pvrednosti. S povečanjem vzorca smo replicirali predhodno znane KVČBkandidatne lokuse in znatno presegli standardni GWA prag (rdeča črta, p < 5x10-8). Kljub povečanju vzorca posameznikov, pa še zmeraj nismo imeli dovolj statistične moči za detekcijo novih asociacij s KVČB. Diskusija Iz te študije je razvidno, da smo uspešno optimizirali protokol kontrole kakovosti tako na slovenski kot ostalih populacijah bolnikov s KVČB in zdravih posameznikov. V kontroli kakovosti glede na posameznika smo največ posameznikov (37) izločili pri preverjanju sorodstvenih vezi (IBS/IBD), kar lahko kaže na nepravilno označevanje vzorcev (duplikati) in/ali pomanjkljivosti pri naboru DNA vzorcev (sorodniki). V tej študiji smo na slovenski populaciji replicirali predhodno znane bolezenske lokuse. S povečanjem vzorca oz. 134 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE vključenjem nizozemskih in indijskih primerov in kontrol smo znatno presegli standarden GWA prag p-vrednosti. Zdi se zelo verjetno, da bi z nadaljnjim večanjem števila posameznikov pridobili dovolj statistične moči za odkrivanje novih asociacij med lokusi in KVČB. Z nadaljnjo postopno pogojno analizo bomo skušali odkriti resnične vzročne polimorfizme, ki prispevajo h genetski predispoziciji h KVČB. Reference 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Franke et al. Genome-wide meta-analysis increases to 71 the number of confirmed Crohn's disease susceptibility loci, Nat Genet 2010, 1118-25. Anderson et al. Meta-analysis identifies 29 additional ulcerative colitis risk loci, increasing the number of confirmed associations to 47, Nat Genet 2011, 246-52. Cortes, A. & Brown, M.A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis research & therapy 2011, 101. http://www.immunochip.org.uk/ http://www.1000genomes.org/ Purcell, S. et al. PLINK: a tool set for whole-genome association and populationbased linkage analyses. Am j hum genet 2007, 559-75. http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/ R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing 2008, Vienna, Austria. http://www.Rproject.org. Abstract Genome-wide association studies (GWAs) are well known genetic tool for detection of associations between markers and complex diseases, such as inflammatory bowel disease. In this study we describe quality control (QC) steps that involve the identification and removal of DNA samples and markers that introduce bias. These critical steps, conducted in bioinformatic tool PLINK have the greatest influence to the success of a case-control study and are necessary before statistically testing for association. We optimized the QC protocol for 256 Slovenian inflammatory bowel disease patients and 236 healthy individuals, which were hybridized to Immunochip (iCHIP), a custom Illumina Infinium HD array. iCHIP was designed to densely genotype 186 distinct loci containing markers meeting genome wide significance criteria (p < 5x10-8) from twelve immunemediated disease, using 1000Genomes and any other available disease specific resequencing data and immune-mediated disease loci identified by common variant GWAs. In the first QC step, conducted on total of 492 individuals, we detected and removed 1 healthy individual with sex-mismatch and 14 healthy individuals with low call rates. Subsequently, we performed identity by descent (IBD) and identity by state (IBS) analyses and removed 37 duplicates and related individuals. Next, we perfomed multidimensional scaling analysis on our and 10 reference populations HapMap and excluded 3 healthy individuals with divergent ancestry. In total, we removed 55 individuals and the remaining 226 cases and 211 controls were used in association testing. Second part of QC was performed on »per marker« basis on 196.524 SNPs. First, we manually inspected the genotyping clusters and removed 17.216 SNPs with inadequate genotyping clusters. Next, we removed 19 SNPs with an excessive missing data rates (> 2 %), 8.329 SNPs with significantly different genotype call rates between cases and controls and 1.190 SNPs that deviated from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) in controls (p < 0.0001). After QC we tested 226 cases and 211 controls for association on 169.774 SNPs and replicated most of established inflammatory bowel disease loci. Keywords: genotyping, Immunochip, inflammatory bowel disease, quality control. 135 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Identifikacija kandidatnih lokusov za ektopični ureter pri kraškem ovčarju Eva Čeh, Peter Dovč Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Groblje 3, 1230 Domžale, [email protected] Ektopični ureter (EU) je prirojena anatomska nepravilnost enega ali obeh sečevodov, pri čemer se ustje uretra ne pripenja na trikotnik sečnega mehurja, temveč na različna mesta vzdolž sečevoda, vrat mehurja, nožnico ali maternico in predstavlja najbolj pogost vzrok uhajanja seča pri mladih psih. Incidenca EU pri kraškemu ovčarju, ki predstavlja majhno in genetsko izolirano ter homogeno populacijo, narašča s trenutno vsaj 10 diagnostično potrjenimi primeri in dodatno vsaj 14 primeri zaznanih uroloških nepravilnosti. S 170k SNP čipom (Illumina Infinium CanineHD Beadchip) smo izvedli asociacijsko študijo in analizirali vzorce 5 klinično potrjenih primerov EU in 5 zdravih kontrolnih osebkov kraševca. Identificirali smo štiri kandidatne lokuse na kromosomih CFA11 (lokus z dvema SNP-jema (p=0,003) in lokus z enim SNPjem (p=0,014)), CFA18 (en SNP (p=0,014)) in CFA20 (10 SNP-jev (p=0,003)). Eden od SNP-jev na kromosomu 11 se nahaja v intronu gena COMMD10, ostali SNP-ji pa imajo intergenske lokacije. Funkcija gena COMMD10 ni dobro poznana, vendar pa je bil njegov homolog COMMD5 že prepoznan kot regulator rasti epitelnih celic ledvice. V haplo-bloku SNP-jev na kromosomu 20 so anotirani geni, ki imajo prav tako potrjeno vlogo pri renalni embriogenezi in razvejanju uretrovega brstiča (gen PSPN in duplikacija gena NRTN). Po popravku zaradi hkratnega testiranja več hipotez s permutacijskim postopkom max(T) programskega paketa plink noben od testiranih SNP-jev ni dosegel globalne statistične značilnosti (EMP2 P≤ 0,05), vendar pa je bil test interakcij identificiranih SNP-jev statistično značilen (p=0,0001). V prid oligogenega dedovanja kaže tudi analiza rodovnikov. Starši vseh prizadetih psov so bili zdravi, kar izključuje monogeno dominantno dedovanje. Proti sumu monogenega recesivnega dedovanja pa botruje nizka pojavnost EU v leglih, ki jo običajno predstavljajo posamezni osebki. Ali je za navidezno kompleksnejši način dedovanja odgovorno pomanjkanje podatkov o dodatnih primerih EU, nepopolna penetranca ali večstranska narava bolezni še ni znano in je poleg validacije odkritih polimorfizmov predmet trenutnih raziskav. Ključne besede: ektopični ureter, kraški ovčar, asociacijska študija, SNP čip, kandidatni geni, oligogeno dedovanje. 136 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Podatkovna zbirka epigenetsko uravnavanih genov za mikro RNA pri raku človeka Jana Ferdin1, Minja Zorc2, Irena Godnič1, Simon Horvat1,3, Peter Dovč1, Tanja Kunej1 1 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta,Oddelek za zootehniko, Groblje 3, 1230 Domžale, [email protected] 2 Kemijski inštitut, Laboratorij za biotehnologijo, Hajdrihova 19, 1001 Ljubljana 3 Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biostatistiko in medicinsko informatiko, Vrazov trg 2, 1104 Ljubljana Mikro RNA (miRNA) so raznolika skupina ne-kodirajočih molekul RNA (nkRNA; angl. non-coding RNA), vpletena v uravnavanje translacije in razgradnjo mRNA. Na ta način pri človeku nadzorujejo približno 30% genov. Geni za miRNA pri raku človeka (onkomiR) so lahko utišani s povišano stopnjo metilacije CpG otokov, ki gene za miRNA lahko vsebujejo ali se nahajajo v njihovi neposredni bližini. Metilacija genov za miRNA predstavlja velik potencial za diagnostiko sprememb pri raku človeka in določitev tarč za njegovo usmerjeno epigenetsko terapijo. Zaradi naraščanja števila objav na to temo, ki so metodološko zelo raznolike, je smiselno sistematsko zbrati in urediti objavljene podatke. Iz tega razloga smo razvili podatkovno zbirko in spletno orodje za integracijo objavljenih podatkov na temo epigenetskega uravnavanja miRNA pri raku. Zbrali smo 66 študij, v katerih so obravnavali epigenetsko uravnavane gene za miRNA pri skupno 28 tipih raka. Podatkovna zbirka vsebuje 133 epigenetsko uravnavanih miRNA, med katerimi jih je 48,1% (64/133) povezanih z več različnimi tkivi raka. Preostalih 51,9% (69/133) je povezanih le z enim tipom raka, zato predstavljajo potencial za razvoj rak-specifičnih biomarkerjev, tako za diagnostične kot tudi terapevtske namene. Redno posodabljanje podatkovne zbirke s podatki iz novih publikacij bo omogočalo še bolj natančno določitev in selekcijo miRNA biomarkerjev specifičnih za tip raka pri človeku. Poleg tega bo možno podatkovno zbirko v prihodnosti razširiti še na druge vrste nkRNA in tudi druge epigenetske mehanizme. Razvito orodje predstavlja koristno začetno orodje raziskovalcem, ki bodo na zbranih podatkih lahko izvajali bolj usmerjeno testiranje svojih hipotez in načrtovanje laboratorijskih eksperimentov. Ključne besede: ne-kodirajoče RNA (nkRNA), mikro RNA (miRNA), onkomiR, CpG otok, epigenetika, rak, biomarker, podatkovna zbirka. 137 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Izpostavljanje kolicinu M povzroča pri bakteriji Escherichia coli spremembe v nastanku zunajceličnih polisaharidov Simona Kamenšek in Darja Žgur Bertok Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, Večna pot 111, 1000 Ljubljana, [email protected] Kolicini so toksični eksoproteini, ki jih sintetizirajo kolicinogeni sevi bakterijske vrste Escherichia coli in nekaterih drugih vrst iz družine Enterobacteriaceae. Z zaviranjem občutljivih bakterij iste družine imajo veliko vlogo pri ohranjanju mikrobne raznolikosti. Kolicini imajo različne mehanizme delovanja: oblikujejo pore v citoplazemski membrani; razgrajujejo nukleinske kisline; ali inhibirajo sintezo peptidoglikana, kot v primeru kolicina M. Kolicin M je v naravi med najpogostejšimi kolicini in je v načinu delovanja edinstven. Njegovo bakteriolitično delovanje je posledica prekinitve peptidoglikanske polimerizacije z encimatsko razgradnjo undekaprenilnih fosfatnih peptidoglikanskih prekurzorjev. V raziskavi smo preučevali vpliv kolicina M na transkripcijsko aktivnost seva Escherichia coli MG1655 po izpostavitvi očiščenemu kolicinu M za 1 uro. Za kontrolo smo uporabili neizpostavljeno kulturo. Izolirali smo celotno RNA in za analizo izražanja genov uporabili genomske mikromreže GeneChip E. coli Genome 2.0 Array ter pridobljene podatke potrdili s PCR v realnem času. Veliko diferencialno izraženih genov je vpletenih v metabolizem celične stene. Odkrili smo povišano izražanje genov vključenih v biosintezo kolanske kisline, polisaharida, ki oblikuje rahlo povezano saharidno mrežo, ki ščiti celice pred okoljskimi vplivi, kot je povečana ozmolarnost ali izsuševanje, in pogosto obdaja bakterije v biofilmih, kjer jih ščiti pred zunanjimi motnjami. Poleg teh genov so bili nadizraženi tudi geni yjbEFGH, ki so odgovorni za nastanek zunajceličnega polisaharida, drugačnega od kolanske kisline. Bakterije imajo različne signalne sisteme za zaznavanje in odzivanje na dejavnike okolja. Bakterijska ovojnica je prva obrambna črta pred večino zunanjih stresnih stanj; njene komponente zaznavajo motnje in prenašajo signal za indukcijo transkripcijskega reprogramiranja, ki vodi v adaptacijski odziv. Ključne besede: kolicini, kolicin M, analiza izražanja genov, mikromreže, PCR v realnem času, kolanska kislina. 138 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE GENOMIKA, MOLEKULSKE OSNOVE BOLEZNI POVZETEK ZNANSTVENEGA PRISPEVKA Uporaba integrativnega primerjalno-genomskega pristopa za odkrivanje kandidatnih genov in bioloških poti povezanih s kriptorhizmom Jernej Ogorevc1, Carlo Vittorio Cannistraci2, Minja Zorc3, Peter Dovč1, Tanja Kunej1 1 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Domžale, [email protected] 2 King Abdullah University for Science and Technology, Jeddah, Kingdom of Saudi Arabia 3 Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biostatistiko in medicinsko informatiko, Ljubljana Kriptorhizem je stanje, ko se testis in z njim povezane strukture ne spustijo v skrotum. Pri novorojencih moškega spola predstavlja najpogostejšo kongenitalno motnjo, ki ima lahko za posledico neplodnost in povečano verjetnost za razvoj raka na modih. Na nastanek kriptorhizma vplivajo tako okoljski, kot genetski dejavniki. V naši študiji smo sistematično integrirali, v literaturi opisane, genetske dejavnike, povezane s kriptorhizmom. Zbrali smo lokuse, pridobljene na sedmih različnih vrstah in z uporabo različnih študijskih pristopov. Na osnovi zbranih podatkov smo identificirali biološke poti s pripadajočimi geni, ki bi utegnili vsaj deloma pojasniti genetske vzroke za nastanek te bolezni. Zbrani lokusi vsebujejo kromosomske mutacije in kandidatne gene, povezane s kriptorhizmom. Predstavljeni so v obliki človeških ortologov in umeščeni na interaktivno genetsko karto, ki razkriva prekrivanja med lokusi in omogoča komplementacijo dokazov iz različnih virov ter odkrivanje položajnih kandidatnih genov oz. genskih regij. S pomočjo mreže proteinskih interakcij smo, na podlagi prvih sosedov kandidatnih genov pridobljenih iz literature, predlagali dodatnih 40 kandidatnih genov, povezanih s kriptorhizmom. Kandidatne gene smo nato umestili v pripadajoče biološke poti in določili osem najbolj značilnih. S hierarhičnim združevanjem v gruče smo določili gene, ki sodelujejo v skupnih bioloških poteh in biološke poti, ki si delijo skupne gene. Glede na število dokazov iz literature in glede na zastopanost v značilnih bioloških poteh, povezanih s kriptorhizmom, smo določene kandidatne gene izpostavili kot primerne za nadaljne funkcionalne študije. Sistemska analiza zbranih kandidatnih lokusov nam je omogočila razkritje najpomembnejših bioloških poti in kandidatnih genov, domnevno vpletenih v patogenezo kriptorhizma. Ključne besede: kriptorhizem, kandidatni geni, integratomika, biološke poti, proteinske interakcije, sistemska biologija. 139 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE KAZALO AVTORJEV Ačimovič Jure 22 Martignani Eugenio 102 Baebler Špela 100 Medved Maruška 117 Bandelj Dunja 70 Meglič Vladimir 74, 81, 92 102 Mitrovič Mitja 123 31 Baratta Mario Beltram Jasmina 13 Modic Miha Berce Vojko 49 Motaln Helena 22 Blejec Andrej 81 Ogorevc Jernej 139 71 Perin Petra 49 Petkovšek Živa 101 Pinto Kozmus Carina 49 Pipan Barbara 74 104 Potočnik Uroš 49, 59, 117, 123 102 Bohanec Borut Bregar Olja 29 Cannistraci Carlo Vittorio 139 Čeh Eva 136 Čitar Manuela Debeljak Nataša 22 Prpar Sonja Dobnik David 100 Radišek Sebastjan 71 Dovč Peter 34, 43, 102, 136, 137, 139 Rassoulzadegan Minoo 22 137 Rawlings Chris 72 49, 59 Ferdin Jana Godnič Irena 34, 137 Repnik Katja Gruden Kristina 100 Rešetič Tjaša 70 Hassani-Pak Keywan 72 Richter Tobias R. 31 92 Rostohar Katja 81 32 Hollung Kristin Horvat Simon 13, 22, 34, 43, 137 Rotter Ana Istinič Ida 100 Rozman Damjana 22 Jakše Jernej 30, 70 Starčič Erjavec Marjanca 101, 104, 111 29, 30, 70, 71 Svetek Tina 71 74, 81, 92 Javornik Branka Jesenko Blaž 111 Šuštar-Vozlič Jelka Jevšinek Skok Daša 34, 43, 72 Uršič Hana 100 Kamenšek Simona 138 Wagner Kay D. 22 49 Weersma Rinse K. 123 92 Kavalar Maja 22 Zadražnik Tanja Kovač Milena 34, 43, 72 Zorc Minja 34, 72, 137, 139 Kunej Tanja 34, 43, 72, 137, 139 Žel Jana 11, 100 Majer Aljaž 30 Žgur Bertok Darja 101, 104, 111, 138 Mandelc Stanislav 29 Keber Rok 140 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE ZAPISKI 141 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE ZAPISKI 142 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE ZAPISKI 143 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE ZAPISKI 144 2. KOLOKVIJ IZ GENETIKE 145
