docLinkki julkaisuun - UEF Electronic Publications - Itä
download 
Report Transcription
Linkki julkaisuun - UEF Electronic Publications - Itä
HYVIN PIENITAAJUISEN MAGNEETTIKENTÄN VAIKUTUS ROTAN GLIOOMASOLUJEN HAPPIRADIKAALITUOTANTOON JA DNA-VAURIOIHIN – VAIKUTUSTEN ESTÄMINEN N-ASETYYLIKYSTEIINILLÄ Joni Mustonen Pro Gradu -tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto, Ympäristötieteen laitos, Kuopio Kesäkuu 2015 ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristötiede Mustonen, Joni: Hyvin pienitaajuisen magneettikentän vaikutus rotan glioomasolujen happiradikaalituotantoon ja DNA-vaurioihin – vaikutusten estäminen N-asetyylikysteiinillä Pro Gradu -tutkielma 45 sivua, 1 liite (3 sivua) Tutkielman ohjaajat: Tutkijatohtori Jukka Luukkonen, FT Yliopistonlehtori Jonne Naarala, FT, dosentti Kesäkuu 2015 avainsanat: antioksidantti, DNA-vaurio, happiradikaali, hyvin pienitaajuinen magneettikenttä, N-asetyylikysteiini, oksidatiivinen stressi TIIVISTELMÄ Sähkömagneettisten kenttien terveysvaikutuksia on tutkittu useita vuosikymmeniä ja tutkimukset ovat osoittaneet pienitaajuisten magneettikenttien voivan aiheuttaa lisääntynyttä happiradikaalituotantoa solutasolla, mutta yksiselitteistä vastausta solutason vaikutusmekanismista ei toistaiseksi ole löydetty. Tässä tutkimuksessa selvitettiin hyvin pienitaajuisen magneettikentän aiheuttamia välittömiä vaikutuksia rotan glioomasolujen happiradikaalituotantoon DCFH-DA-menetelmällä ja DNAvauriovasteeseen yksisolugeelielektroforeesilla eli Comet Assay-menetelmällä. Tutkimuksessa selvitettiin myös, pystytäänkö mahdollisia vaikutuksia estämään yleisantioksidantti N-asetyylikysteiinillä. Osaa soluista altistettiin myös menadionille. Lisäksi määritettiin solujen elävyyttä propidiumjodidin ja digitoniinin avulla. Magneettikenttäaltistus laski happiradikaalituotantoa yhteisaltistuksessa menadionin kanssa lähes jokaisessa tapauksessa. Antioksidantti NAC laski happiradikaalituotantoa välittömästi magneettikenttäaltistuksen jälkeen määritettynä, mutta tässäkin tapauksessa happiradikaalituotanto näytti olevan pienempi magneettikenttäaltistetuilla soluilla verrattuna kontrolleihin. Menadionialtistus lisäsi happiradikaalituotantoa, mutta NAC:lla ei tätä vaikutusta pystytty estämään vastoin odotuksia, vaan NAC jopa lisäsi happiradikaalituotantoa verrattuna kontrolleihin. Useat tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että hyvin pienitaajuinen magneettikenttä lisää happiradikaalituotantoa. Tässä tutkimuksessa magneettikenttäaltistuksella happiradikaalituotanto oli kuitenkin pienempi lähes jokaisessa tapauksessa verrattuna kontrolliin. Tämä voi aiheutua siitä, että käytetty menetelmä ei ole tehokas määrittämään spesifejä happiradikaaleja, kuten superoksidianioneja tai vetyperoksideja. Magneettikentälle altistettujen solujen DNA-vauriovastetta kuvaava OTM-arvo oli suurempi verrattuna kontrollisoluihin. Magneettikenttäaltistus lisäsi DNA-vauriovastetta, mutta laski happiradikaalituotantoa. Magneettikentän vaikutusmekanismi solutason tapahtumiin voi siis olla jokin muu kuin happiradikaalituotannon kautta, mutta lisätutkimuksia tarvitaan eri solulinjoilla ja spesifisemmillä menetelmillä eri happiradikaalien määrittämiseksi. Lisäksi tarvitaan tutkimuksia eri antioksidanttien eri pitoisuuksilla, jolloin mahdolliset suojaavat vaikutukset saadaan paremmin esiin. Antioksidanttikäsittelyn keston tai ajankohdan vaikutusta magneettikentän aiheuttaman happiradikaalituotannon kasvun estämiseen tulisi myös tutkia lisää. ESIPUHE Tämä Pro Gradu -tutkielma on tehty Itä-Suomen yliopiston Ympäristötieteen laitoksen Fysikaalisten ja kemiallisten riskien tutkimusryhmässä säteilybiologian laboratoriossa Genomic instability induced by genotoxic and non-genotoxic exposures-projektissa (GITOX). Tutkielmani laboratoriotyöt suoritin kesän ja syksyn 2014 aikana. Kirjallisen osuuden tein syksyn 2014 ja kevään 2015 aikana. Esitän mitä parhaimmat kiitokseni tutkijatohtori Jukka Luukkoselle ja yliopistonlehtori Jonne Naaralalle mielenkiintoisen tutkimusaiheen tarjoamisesta ja erinomaisesta ohjauksesta aina laboratoriotöistä kirjoitusvaiheeseen. Haluan kiittää erityisesti myös laboratoriomestari Hanne Säppiä avusta laboratoriotyöskentelyssä. Kiitos myös nuorempi tutkija Mikko Herralalle tutkielmani toisena tarkastajana toimimisesta. Suuret kiitokset perheelleni, sukulaisilleni ja ystävilleni kaikesta saamastani tuesta ja kannustuksesta Pro Gradu –tutkielman teon eri vaiheissa ja opiskelujen aikana. Porissa, 9. kesäkuuta, 2015 Joni Mustonen SISÄLLYSLUETTELO 1 JOHDANTO............................................................................................................................ 5 2 KIRJALLISUUSKATSAUS ................................................................................................... 6 2.1 IONISOIMATON SÄTEILY JA SÄHKÖMAGNEETTISET KENTÄT ....................... 6 2.1.1 Hyvin pienitaajuiset magneettikentät ......................................................................... 6 2.2 OKSIDATIIVINEN STRESSI JA ANTIOKSIDANTIT ................................................. 8 2.2.1 Happiradikaalit ja oksidantit ...................................................................................... 9 2.2.2 Antioksidantit oksidatiivisen stressin torjunnassa ................................................... 10 2.2.3 Oksidatiivinen stressi solutason häiriöiden ja karsinogeneesin taustalla ................. 11 2.3 HYVIN PIENITAAJUISTEN MAGNEETTIKENTTIEN AIHEUTTAMAT SOLUTASON VAIKUTUKSET ......................................................................................... 14 2.3.1 Vaikutukset oksidatiivisiin prosesseihin, genomiin ja DNA-vaurioihin ................. 15 3 TYÖN TAVOITTEET .......................................................................................................... 18 4 AINEISTO JA MENETELMÄT .......................................................................................... 19 4.1 SOLULINJA JA SOLUVILJELY .................................................................................. 19 4.1.1 Solujen valmistelu altistuksia varten ....................................................................... 20 4.2 MÄÄRITYSMENETELMÄT ........................................................................................ 20 4.2.1 Happiradikaalituotanto ............................................................................................. 20 4.2.2 Solujen elävyys ........................................................................................................ 21 4.2.3 DNA-vauriot ............................................................................................................ 22 4.3 ESIKOKEET .................................................................................................................. 24 4.4 KOEASETELMA JA MAGNEETTIKENTTÄALTISTUSLAITTEISTO ................... 29 4.5 TILASTOLLISET ANALYYSIT .................................................................................. 30 5 TULOKSET .......................................................................................................................... 31 5.1 HAPPIRADIKAALITUOTANTO JA SOLUJEN ELÄVYYS ..................................... 31 5.2 DNA-VAURIOT ............................................................................................................ 35 6 TULOSTEN TARKASTELU ............................................................................................... 37 7 YHTEENVETO .................................................................................................................... 40 LÄHTEET ................................................................................................................................ 41 LIITE 1. KEMIKAALIT JA LIUOKSET ................................................................................ 46 5 1 JOHDANTO Sähkömagneettisille kentille altistuminen on lisääntynyt merkittävästi viime vuosikymmeninä tapahtuneen yhteiskunnan sähköistymisen ja kehittyneen elektroniikan vuoksi. Näille kentille altistuminen on kasvanut niin asuinperäisesti kuin työperäisestikin. Näin ollen huoli mahdollisista haitallisista terveysvaikutuksia on kasvanut, sillä kyseisille sähkömagneettisille kentille altistuminen on lähes jatkuvaa ja niiltä kokonaan suojautuminen mahdotonta. Sähkömagneettisten kenttien terveysvaikutuksia on tutkittu useita vuosikymmeniä. Useat tutkimukset ovat osoittaneet pienitaajuisten magneettikenttien voivan aiheuttaa lisääntynyttä happiradikaalituotantoa solutasolla, mutta yksiselitteistä vastausta solu- ja molekyylitason vaikutusmekanismista ei toistaiseksi ole löydetty. Ympäristössä ei altistuta pelkästään yhdelle altisteelle kerrallaan, joten on muistettava erilaisten yhdisteiden, niin kemiallisten kuin fysikaalisten altisteiden aiheuttama mahdollinen kokarsinogeeninen vaikutus. Pienitaajuisten magneettikenttien on havaittu aiheuttavan radikaaliparien uudelleenjärjestymistä, joten yksi mahdollinen ja todennäköisin vaikutusmekanismi on radikaaliparimekanismi. Happiradikaalit horjuttavat solun tasapainotilaa aiheuttaen oksidatiivista stressiä. Oksidatiivisen stressin ja syövän kehittymisen välillä on havaittu yhteys, sillä happiradikaalit kykenevät aiheuttamaan mutaatioita DNA:ssa. Happiradikaalien ylimäärästä aiheutuvat DNA-vauriot ovat pääosin yksöis- ja kaksoisjuostevaurioita sekä puriinien, pyrimidiinien ja deoksiriboosien rakenteiden muutoksia. Solut lisäävät antioksidanttituotantoa oksidatiivisen stressin torjunnassa. Antioksidanttien avulla solut pelkistävät haitallisia yhdisteitä vähemmän haitallisempaan muotoon. Näin ollen kiinnostava ajatus onkin, pystytäänkö antioksidanteilla vähentämään tai estämään kokonaan hyvin pienitaajuisten magneettikenttien aiheuttamia solutason vaikutuksia. Tässä tutkimuksessa selvitettiin hyvin pienitaajuisen magneettikentän aiheuttamia välittömiä vaikutuksia rotan glioomasolujen happiradikaalituotantoon ja DNA-vauriovasteeseen. Tutkimuksessa selvitettiin myös pystytäänkö mahdollisia vaikutuksia yleisantioksidantti N-asetyylikysteiinillä. Lisäksi määritettiin solujen elävyyttä. estämään 6 2 KIRJALLISUUSKATSAUS 2.1 IONISOIMATON SÄTEILY JA SÄHKÖMAGNEETTISET KENTÄT Ionisoimaton säteily on sähkö- ja magneettikentistä muodostuvaa säteilyä, joka koostuu ultraviolettisäteilystä, näkyvästä valosta, infrapunasäteilystä, radioaalloista ja pientaajuisista sähkömagneettisista kentistä. Joskus ionisoimattomaksi säteilyksi luokitellaan myös ultraääni. Ionisoimattomaan säteilyyn luokitellaan myös staattiset kentät. Maapallon staattisen magneettikentän voimakkuus on keskimäärin 0,05 mT. (Jokela 2006.) Riittävän pienillä taajuuksilla fotonin energia pienenee. Fotonin energian jäädessä alle 12 elektronivoltin, ionisaatiota ei tapahdu merkittävissä määrin, jolloin kemiallisen sidoksen ionisoitumista ei esiinny. Tällöin puhutaan ionisoimattomasta säteilystä. Ionisoimattoman säteilyn aallonpituusrajana voidaan pitää yli 100 nm aallonpituusaluetta. Kentän voimakkuuden pysyessä vakiona, kenttiä kutsutaan staattisiksi. Kentän muutosnopeuden kasvaessa kentät etenevät sähkömagneettisena aaltoliikkeenä. (Jokela 2006.) Kuvassa 1 on kaaviokuva sähkömagneettisen säteilyn spektristä taajuuksineen ja aallonpituuksineen. Taajuus 30 Hz Staattinen kenttä 300 Hz 100 kHz 300 GHz 300 THz 750 THz Hyvin Välitaajuinen Radiotaajuus- Infrapunapienitaajuinen kenttä säteily magneettikenttä magneettikenttä 10 000 km 1000 km 3 km 1 mm Näkyvä valo 1 µm 30 PHz RöntgenUltraviolettija gammasäteily säteily 400 nm 100 nm Aallonpituus Kuva 1. Sähkömagneettisen säteilyn spektri. 2.1.1 Hyvin pienitaajuiset magneettikentät Pienitaajuiset sähkö- ja magneettikentät jaotellaan välitaajuisiin ja hyvin pienitaajuisiin magneettikenttiin. Hyvin pienitaajuisten magneettikenttien taajuus on alle 300 Hz. Tämän 7 taajuisten kenttien on havaittu olevan riittävän voimakkaita indusoimaan ihmiseen sähkökenttiä. Ulkoisen magneettikentän aiheuttama induktiosähkökenttä kehoon synnyttää kehossa induktiovirtoja eli kiertäviä sähkövirtoja. Kehon koko ja asento suhteessa magneettikentän suuntaan vaikuttavat sähkömagneettisen induktion muodostumiseen. Hermoja lihassolujen sähköärsytystä voi aiheutua voimakkaista induktiosähkökentistä. (Jokela 2006). Aivotoiminnot ja monet muut elimistön biologiset toiminnot, kuten esimerkiksi ruuansulatus ovat riippuvaisia hermoston välittämistä impulsseista. Pienitaajuiset magneettikentät voivat vaikuttaa kaikkiin näihin sähköisiin hermotoimintoihin. (D’Angelo ym. 2015.) Pääasiallisia pienitaajuisten magneettikenttien lähteitä ovat sähköenergian tuotanto, jakelu ja käyttö. Kotitalouksissa huomattavimman magneettikentän voi aiheuttaa kiinteistömuuntamo. Pääosin kotitalouksissa esiintyvät 50 Hz magneettikentät ovat alle 0,1 µT kentänvoimakkuudella, mutta kiinteistömuuntamoiden läheisyydessä olevissa asuintiloissa voi esiintyä jopa yli 100 µT:n magneettikenttiä. Metalliteollisuuden prosesseissa voi esiintyä jopa 100 mT:n voimakkuudella olevia sähkömagneettisia kenttiä. Kauppaliikkeiden varashälytinportit ja lentokenttien metallinpaljastuslaitteistot voivat aiheuttaa niistä kulkevalle ihmiselle varsin suuren hetkellisen magneettikenttäaltistuksen. Kyseiset laitteet toimivat taajuusalueella 100 Hz – 100 kHz. (Jokela 2006). Kansainvälinen syöväntutkimuskeskus on luokitellut pienitaajuiset sähkömagneettiset kentät ryhmään 2B eli mahdollisesti ihmiselle karsinogeeneiksi (IARC Monographs 2002). Kyseinen luokitus perustuu epidemiologisesti osoitettuun lisääntyneen lasten leukemian ja asuinoloissa tapahtuvan hyvin pienitaajuisille magneettikentille altistumisen väliseen yhteyteen. In vivo –tutkimuksilla ilman yhteisaltisteita on hyvin pienitaajuisilla magneettikentillä havaittu vain hyvin pieniä viitteitä karsinogeenisistä vaikutuksista. Hyvin pienitaajuisten magneettikenttien on havaittu lisäävän joidenkin tunnettujen DNA-vaurioita aiheuttavien altisteiden vaikutuksia. Eräs mahdollinen mekanismi selittämään hyvin pienitaajuisten magneettikenttien aiheuttamia vaikutuksia on niin kutsuttu radikaaliparimekanismi. (Juutilainen ym. 2006). Radikaaliparit jaotellaan kahteen pääryhmään spinien tilan mukaisesti. Korreloimattomilla radikaalipareilla (uncorrelated radical pairs) elektronien spinit ovat järjestyneet sattumanvaraisesti. Spinkorreloivilla radikaalipareilla (spin-correlated radical pairs) elektronien spinien pyörimismäärä on vakio ja elektronien spinit ovat järjestyneet säännönmukaisesti. Radikaaliparimekanismin mukaisesti magneettikenttä aiheuttaa mahdollisesti muutoksia 8 happiradikaalien parittomien elektronien spineissä ja spinien suuntauksissa. (Henbest ym. 2003; Timmel & Henbest 2004). 2.2 OKSIDATIIVINEN STRESSI JA ANTIOKSIDANTIT Oksidatiivisella stressillä tarkoitetaan tilaa, jossa radikaalituotanto ja antioksidanttien määrä ovat epätasapainossa eli solun hapetus-pelkistystila ei ole tasapainossa. Tämä tasapainotila on varsin herkkä ja altis muutoksille. Normaaleissa olosuhteissa vapaiden radikaalien tuotanto ja antioksidanttipuolustus ovat tasapainossa, jolloin solu ei kärsi oksidatiivisesta stressistä. Oksidatiivisessa stressissä solukalvojen kalvopumppujen toiminta voi häiriintyä. Esimerkiksi Na+/K+-ATPaasi voi vaurioitua oksidatiivisen stressin seurauksena aiheuttaen kaliumkanavien toiminnan muutoksia, jolloin solukalvon potentiaali menee epätasapainoon. Myös Ca2+ -ionin aineenvaihdunta soluissa voi häiriintyä kasvattaen solunsisäistä Ca2+ -konsentraatiota. Yleisesti ottaen solut reagoivat hyvinkin eri tavoin radikaaleille altistuessaan ja vaikutukset ovat varsin spesifisiä solutyypille. Vetyperoksidi (H2O2), superoksidianionit ja hydroksyyliradikaalit ovat tunnettuja vapaita radikaalityyppejä ja oksidantteja, joiden on havaittu olevan yhteydessä apoptoosiin. Oksidatiivisen stressin tiedetään olevan hyvin keskeisessä osassa syövän kehityksessä, mutta toisaalta oksidatiivinen stressi ei aina ole haitallista. Esimerkiksi tulehdustilassa oksidatiivisen stressitilan tuottamat vapaat radikaalit muun muassa tuhoavat haitallisia patogeenejä. (Halliwell 2007; Negi ym. 2014; Wätjen & Beyersmann 2004.) Siqueira ym. (2005) havaitsivat tutkimuksessaan yhteyden antioksidanttipuolustuksen heikkenemisen aiheuttaman oksidatiivisen stressin ja rottien aivojen ikääntymisprosessin välillä. He havaitsivat erityisesti häiriöitä aivojen nestekierrossa. Heidän tutkimus osoitti oksidatiivisen stressin olevan monien neurodegeneratiivisten häiriöiden taustalla. Siqueira ym. (2005) havaitsivat muun muassa hippokampuksen alueella olevan heikentynyttä antioksidanttipuolustusta. Oksidatiiviselle stressille ei ole olemassa varsinaista virallista luokittelujärjestelmää, mutta se voidaan jaotella karkeasti oksidatiivisen stressitason mukaisesti taustatasoiseen oksidatiiviseen stressiin (basal oxidative stress), matalaintensiteettiseen oksidatiiviseen stressiin (low intensity oxidative stress), keski-intensiteettiseen oksidatiiviseen stressiin 9 (intermediate intensity oxidative stress) ja korkeaintensiteettiseen oksidatiiviseen stressiin (high intensity oxidative stress). Lisäksi voidaan puhua akuutista ja kroonisesta oksidatiivisesta stressistä. Akuutissa oksidatiivisessa stressitilassa happiradikaalitasot palautuvat vakaalle tasolle ajan funktiona varsin nopeasti, kun taas kroonisessa oksidatiivisessa stressitilassa happiradikaalitaso on pidempään epävakaassa tasossa aiheuttaen edelleen solun homeostaasin epätasapainoa. (Lushchak 2014.) 2.2.1 Happiradikaalit ja oksidantit Happiradikaaliksi tai vapaaksi radikaaliksi kutsutaan yhdistettä, jolla on pariton määrä elektroneja. Happiradikaaleilla on erittäin matalat aktivaatioenergiat, joten ne ovat erittäin reaktiivisia ja pystyvät pienen kokonsa ansiosta läpäisemään tehokkaasti solukalvon. Valtaosa happiradikaaleista on peräisin mitokondrioiden aineenvaihduntatapahtumista, sytokromi P450:n aineenvaihduntatapahtumista, peroksisomeista ja solun tulehdustapahtumista. (Jensen 2003; Valko ym. 2006.) Eräs keskeisimmistä happiradikaaleista on superoksidianioni (O2•-). Sitä tuotetaan mitokondriaalisessa prosessissa, jossa vesimolekyylistä vapautuu happimolekyylejä. Vetyperoksidia (H2O2) syntyy reaktioissa, jossa aminohapoista poistetaan aminoryhmät (deaminaatio) sekä superoksididismutaasientsyymin avulla superoksidianioneista. Vetyperoksidilla ei ole paritonta määrää elektroneja, joten se ei varsinaisesti toimi radikaalina, mutta reagoi radikaalien tavoin, tosin ei yhtä kiivaasti kuin radikaalit. Näin ollen vetyperoksidi luokitellaan yleisemmin oksidantiksi. Vetyperoksidilla on keskeinen osa karsinogeneesissa, koska se voi diffundoitua mitokondrioiden ja solukalvojen läpi aiheuttaen haitallisia vaikutuksia solussa. Vetyperoksidi voi aiheuttaa apoptoosia jo pieninäkin millimolaaritason pitoisuuksina. Vetyperoksidin yhtenä mahdollisena hajoamistuotteena syntyvän hydroksyyliradikaalin (•HO) on arvioitu aiheuttavan yli 50 % happiradikaalien aiheuttamista vaurioista, lipidiperoksidaatiota. sillä hydroksyyliradikaali kykenee aiheuttamaan Hydroksyyliradikaalin aiheuttamassa DNA-vauriossa syntyy 8- hydroksiguanosiiniä, jonka hydrolyysi tuottaa 8-hydroksideoksiguanosiinia (8-OHdG). 8OHdG on yleisesti käytetty markkeri happiradikaalin aiheuttamasta DNA-vauriosta. Hypokloriitti (ClO-) on amiineja, aminohappoja, tioleja, tioeettereitä, nukleotidejä ja 10 hemoproteiineja vaurioittava tehokas oksidantti. (Jensen 2003; Maccarrone ym. 1997; Reuter ym. 2010.) 2.2.2 Antioksidantit oksidatiivisen stressin torjunnassa Erään määritelmän mukaan antioksidanttina pidetään ainetta, joka pystyy heikentämään merkittävästi jonkin toisen aineen hapettavia ominaisuuksia. Antioksidantteja on olemassa lukuisia, eikä yhtä kaikenkattavaa ja parasta antioksidanttia voida nimetä. (Halliwell 2007.) Solunsisäisistä antioksidanteista tärkeimpiä ja keskeisimpiä ovat superoksididismutaasit, katalaasit, glutationiperoksidaasit sekä glutationit. Superoksididismutaasi on kaikkein tehokkain solunsisäinen antioksidantti ja se toimii katalyyttinä superoksidianionin muuntumisreaktiossa happimolekyyliksi ja vetyperoksidiksi. Katalaasi toimii peroksisomissa ja sen tehtävänä on muuntaa vetyperoksidi vedeksi ja molekulaariseksi hapeksi. Glutationiperoksidaasi torjunnassa ja se tioliantioksidantteihin sytosolissa, tumassa toimii hajottaa pääsääntöisesti peroksidit luokiteltava ja matalatasoisen vesimolekyyleiksi. solunsisäinen mitokondrioissa. antioksidantti, Tumassa oksidatiivisen Glutationi jota glutationi stressin on tärkeä esiintyy eniten ylläpitää DNA:n korjausmekanismeille välttämättömän sulfuuriproteiinin hapetustilaa. Glutationi muuntaa vetyperoksideja ja lipidiperoksideja vähemmän reaktiivisempaan muotoon yhteisessä reaktiossa glutationiperoksidaasin kanssa. Lisäksi glutationi osallistuu aminohappojen kuljettamiseen solukalvon läpi. (Valko ym. 2006.) Flavonoidit ovat hyviä ja tehokkaita antioksidantteja, sillä niiden on havaittu vaikuttavan edullisesti solunsisäiseen hapetustilaan (Williams ym. 2004). Ishige ym. (2000) havaitsivat eräiden flavonoidien toimivan suojana oksidatiivisen glutamaatin toksisuutta vastaan hiiren hippokampaalisen solulinjan (HT-22) soluilla. Kasperczyk ym. (2014) havaitsivat beetakaroteenin laskevan glutationiperoksidaasin aktiivisuutta lyijylle altistuneilla työntekijöillä, mutta esimerkiksi superoksididismutaasin aktiivisuudessa ei havaittu merkittävää muutosta. Vaikka flavonoidit ovatkin varsin hyödyllisiä ja edullisia solun toiminnan kannalta, niin silti eräiden flavonoidien on havaittu olevan sytotoksisia matalina (µM) pitoisuuksina. Seibert ym. (2011) havaitsivat muun muassa apigeniinin ja luteoliinin olevan sytotoksisia rotan C6-soluille. 11 Antioksidatiivisia vaikutuksia on havaittu myös melatoniinilla. Sen on havaittu tuottavan positiivisia vaikutuksia diabeteksesta kärsivillä retinopaattisilla rotilla. Yhtenä mahdollisena vaikutustapana lienee melatoniinin kyky suojata haiman insuliinia erittäviä β-soluja oksidatiiviselta vauriolta. (Lushchak 2014.) Hyvänä yleisantioksidanttina tunnettu kysteiinin esiaste N-asetyylikysteiini (NAC) toimii glutationisynteesissä avustavana komponenttina. Glutationia pidetään yhtenä keskeisimmistä sisäsyntyisistä antioksidanteista ja sillä on tärkeä osa immuunipuolustusjärjestelmässä. Ihmiselimistössä NAC on merkittävässä osassa antioksidanttipuolustusjärjestelmässä ja näin ollen oksidatiivisen stressin torjunnassa. NAC:n keskimääräinen puoliintumisaika on 5,6 tuntia. In vivo -kokeissa NAC:n on havaittu olevan mahdollisesti tehokas hoitokeino heroiiniriippuvuuden hoidossa. (Sansone & Sansone 2011.) Han ym. (1997) käyttivät tutkimuksessaan rotan C6-solulinjaa ja tutkivat tioliantioksidanteiksi luokiteltujen alinolihapon (LA) ja N-asetyylikysteiinin (NAC) suojaavia vaikutuksia. Sekä LA että NAC lisäsivät solujen glutationitasoja ja näin ollen suojasivat soluja glutamaatin sytotoksisuudelta. Higuchi & Matsukawa (1999) havaitsivat glutationin loppuun kuluttamisen aiheuttavan happiradikaalien lisääntymistä ja tämän puolestaan aiheuttavan apoptoosin kautta suuria DNA-fragmentteja rotan C6-soluilla. Tämän on havaittu olevan yhteydessä lipidiperoksidaatioon. Güler ym. (2008) havaitsivat NAC:n lisäävän glutationiperoksidaasin aktiivisuutta 50 Hz magneettikentälle altistettujen marsujen maksakudoksessa, joten myös heidän tutkimus osoitti NAC:n antioksidatiivisia vaikutuksia eli NAC:lla oli vaikutusta oksidatiivisen stressin torjunnassa. 2.2.3 Oksidatiivinen stressi solutason häiriöiden ja karsinogeneesin taustalla Oksidatiivisen stressin on havaittu olevan merkittävä tekijä esimerkiksi Alzheimerin ja Parkinsonin taudin synnyssä sekä myös muissa neurologisissa häiriötiloissa. Raskasmetalliioneilla on taipumusta lisätä vapaiden radikaalien tuotantoa aiheuttaen näin ollen oksidatiivista vauriota. Esimerkiksi Fe2+-, Cu2+- ja Co2+-ionien on havaittu olevan kykeneviä happiradikaalituotannon lisäämiseen. (Wätjen & Beyersmann 2004.) Wätjen & Beyersmann (2004) havaitsivat tutkimuksissaan vetyperoksidin ja kadmiumkloridin yhteisaltistuksen lisäävän apoptoottista DNA:n pilkkoutumista rotan C6-soluilla. (CdCl2) 12 Useilla in vitro –tutkimuksilla on osoitettu glutamaatin olevan sytotoksinen muun muassa kystiinin kulkeutumismekanismin häiriön aiheuttaman oksidatiivisen stressin kautta. Tästä häiriöstä aiheutuu happiradikaalituotannon kasvua. Kysteiini, jonka hapettumisesta kystiini muodostuu, toimii substraattina glutationisynteesissä (GSH). Glutamaatin aiheuttama oksidatiivinen stressi on osoitettu olevan ensisijainen sytotoksisuutta aiheuttava tekijä muun muassa C6- ja PC-12-solulinjoilla. (Han ym. 1997). Glutamaatin on havaittu lisäävän myös ihmisen neuroblastoomasolujen (SH-SY5Y) happiradikaalituotantoa sekä aiheuttavan yhdessä lyijyn kanssa oksidatiivista stressiä ja edelleen soluvauriota (Naarala ym. 1995). DNA vaurioituu jatkuvasti sisäisten ja ulkoisten tekijöiden kautta ja DNA:ta korjataan jatkuvasti korjausentsyymien toimesta. Epätasapaino vaurioiden ja korjausentsyymien toiminnassa aiheuttaa DNA-vaurioiden kertymistä ja tämä voi aiheuttaa muun muassa solukuolemaa, ikääntymistä tai syövän kehittymistä. DNA:n juostevauriot ovat joko yksöistai kaksoisjuostevaurioita. Kaksoisjuostevaurio on solun kannalta erittäin kriittinen ja yleensä kaksoisjuostevauriolla on letaali vaikutus. (Phillips ym. 2009.) Vapaiden radikaalien aiheuttaman DNA-molekyylien ja muiden biologisten molekyylien, kuten lipidien ja proteiinien hapettumisen on havaittu olevan yhteydessä lukuisiin solutason häiriöihin ja sairauksiin. Erityisesti lipidit ovat varsin alttiita vapaille radikaaleille. Lipidien hapettuminen eli lipidiperoksidaatio aiheuttaa solujen kalvorakenteiden toimintahäiriöitä. Lipidiperoksidaation reaktiotuotteet ovat erittäin sytotoksisia aiheuttaen proteiinien ja DNA:n rakenteiden muutoksia. Lipidiperoksidaation reaktiotuotteena tunnetun trans-4-hydroksi-2nonenaalin ja DNA:n reaktiossa syntyvien DNA-adduktien on havaittu olevan keskeisessä osassa syövän synnyssä. Lipidiperoksidaatiota on pystytty estämään luonnollisilla antioksidanteilla, kuten C- ja E-vitamiineilla, karotenoideilla ja flavonoideilla sekä synteettisillä antioksidanteilla. (Bartsch & Nair 2004; Negi ym. 2014; Omata ym. 2010; Sander ym. 2003.) Syövän kehityksen ja oksidatiivisen stressin välillä on havaittu selvä yhteys, sillä oksidatiivinen stressi lisää mutaatioita DNA:ssa. Happiradikaalien ylimäärästä aiheutuvan oksidatiivisen stressin kaksoisjuostevaurioita aikaansaamat sekä puriinien, DNA-vauriot pyrimidiinien ovat ja pääosin deoksiriboosien yksöis- ja rakenteiden muutoksia. Nämä DNA-vauriot voivat vaikuttaa haitallisesti solun transkriptioon eli tapahtumaan, jossa RNA-polymeraasi kopioi DNA:n geneettistä koodia RNA:ksi. Lisäksi 13 kyseiset DNA-vauriot voivat aiheuttaa replikaation eli solun DNA:n kahdentumisen häiriöitä sekä lisäksi genomin epävakaisuutta. Oksidatiivinen stressi voi häiritä myös solun signaalitransduktiota ja solun signaalinvälitystä. Näillä edellä mainituilla DNA:n vaurioilla ja häiriötiloilla on havaittu yhteyksiä karsinogeneesiin. (Reuter ym. 2010; Valko ym. 2006.) Oksidatiivisesta stressistä aiheutuva tulehdusvasteen nousu voi käynnistää suoraan happiradikaalivälitteisen syövän kehityksen tai epäsuorasti signaalivälityksen kautta. Happiradikaalit voivat aiheuttaa DNA:n juostevaurioiden lisäksi pistemutaatioita sekä mutaatioita esisyöpägeeneissä ja kasvurajoitegeeneissä, jolloin syövän kehittyminen pahanlaatuisempaan suuntaan voi olla mahdollista. Happiradikaalit kykenevät laskemaan DNA:n yhteensopimattomien nukleotidien korjaukseen (mismatch repair) liittyvien geenien entsymaattista aktiivisuutta ja lisäämään genomin hypermetylaatiota aiheuttavien DNA:n metyylitransferaasien tuotantoa. (Reuter ym. 2010.) Ikääntymisprosessi lisää solunsisäistä oksidatiivista stressiä ja happiradikaalien ylimäärän on havaittu lisäävän eturauhasen karsinogeneesiä, sillä DNA:n korjausmekanismit eivät toimi oikein oksidatiivisen stressin takia. Mieshormoni androgeenin on havaittu alentavan solunsisäisen glutationin määrää ja lisäävän näin ollen oksidatiivista stressiä androgeenivasteisissa eturauhassyöpäsoluissa (LNCaP). Oksidatiivisesta stressistä aiheutuvat vauriot lisääntyvät luonnollisesti ikääntymisen myötä ja tämä on yhtenä syynä esimerkiksi eturauhassyövän lisääntyneessä insidenssissä ikääntyneillä miehillä. (Minelli ym. 2009.) Yleisen karsinogeneesin lisäksi oksidatiivisen stressin on havaittu olevan yhteydessä fotokarsinogeneesiin iholla. Ihon entsymaattiseen antioksidanttipuolustukseen osallistuvat sytosolinen kupari-sinkkisuperoksididismutaasi (CuZnSOD), mitokondrionaalinen mangaanisuperoksididismutaasi (MnSOD) ja katalaasientsyymi. In vitro-kokeissa näiden entsyymien on havaittu muuntuvan ultraviolettisäteilyn vaikutuksesta ihosoluissa ja vastaavasti hiiren ihossa in vivo-kokeissa. Näin ollen ihosolut kärsivät oksidatiivisen stressin aiheuttamasta lisääntyneestä antioksidanttientsyymien määrä ihon ja vanhenemisprosessista. lipidiperoksidaation Onkin kiihtyminen havaittu, että pahanlaatuisessa melanoomakudoksessa on suurempi verrattuna kontrollikudokseen. (Sander ym. 2003.) 14 2.3 HYVIN PIENITAAJUISTEN SOLUTASON VAIKUTUKSET MAGNEETTIKENTTIEN AIHEUTTAMAT Sähkömagneettisten kenttien vaikutuksia soluorganelleihin, kudoksiin ja soluihin on tutkittu useiden kymmenien vuosien ajan. Useilla in vitro -tutkimuksilla on osoitettu sähkömagneettisten kenttien vaikuttavan solun fysiologiseen tilaan. Eräät tutkimukset ovat myös osoittaneet sähkömagneettisilla kentillä olevan vaikutusta solun kasvuun, mutta nämä tulokset ovat olleet kiistanalaisia. Sähkömagneettisten kenttien aiheuttamat haitalliset vaikutukset kudoksessa riippuvat kentän taajuudesta, kentänvoimakkuudesta ja altistumisajasta sekä altistuvan kohdekudoksen tai soluorganellin herkkyydestä. (D’Angelo ym. 2015; Zhang ym. 2013.) Teoreettiset tarkastelut sekä kokeelliset havainnot viittaavat siihen, ettei hyvin pienitaajuinen magneettikenttä yksinään aiheuta suoraa DNA-vauriota (Luukkonen ym. 2014). Zhang ym. (2013) havaitsivat hyvin pienitaajuisen magneettikentän parantavan ihmisen orvaskeden kantasolujen solumäärän kasvua 5 mT:n kentänvoimakkuudella. Heidän tutkimuksessaan viikon kestävä 30 minuutin päiväaltistus 50 Hz pienitaajuisella magneettikentällä tuotti parhaimman solutiheyden. Sul ym. (2006) havaitsivat 60 Hz sinimuotoisen sähkömagneettisen kentän aiheuttavan muutoksia solun tukirangan rakenteissa rotan C6-soluilla 2 mT:n kentänvoimakkuudella. He myös havaitsivat magneettikentän lisäävän aluksi solujen lisääntymistä, mutta solumäärän lisääntyessä magneettikentän havaittiin puolestaan rajoittavan kasvua. Solujen erilaistumisen ja magneettikenttäaltistumisen välillä ei tässä tutkimuksessa havaittu yhteyttä. Keskeisiä solutyyppejä immuunipuolustusjärjestelmässä ovat monosyytit ja makrofaagit, jotka voivat tuottaa erilaisia solujen viestinvälittäjäaineina tunnettuja sytokiinejä, kuten interleukiini-1-beeta (IL-1β) ja tuumorinekroositekijä alfa (TNF-α). Hyvin pienitaajuisen magneettikentän on havaittu aiheuttavan molekulaarisia ja solutason muutoksia edellä mainituissa immuunipuolustussoluissa. Näiden muutosten on arvioitu lisäävän immuunipuolustusjärjestelmän aktiivisuutta in vivo –tutkimuksissa. Sekä in vivo- että in vitro –tutkimukset antavat viitteitä, että hyvin pienitaajuiset magneettikentät vaikuttavat mahdollisesti joidenkin tulehdusvasteellisten molekyylien ilmentymään. Joidenkin tutkijoiden mukaan hyvin pienitaajuisille kentille altistuminen vaikuttaa proteiinien toimintaan niin solunsisäisesti kuin solukalvollakin. (D’Angelo ym. 2015.) 15 2.3.1 Vaikutukset oksidatiivisiin prosesseihin, genomiin ja DNA-vaurioihin Luukkonen ym. (2011) havaitsivat menadionin lisäävän ihmisen neuroblastoomasolujen (SHSY5Y) solutason vasteita, kun soluja oli altistettu ennen menadionia 100 µT 50 Hz magneettikentälle 24 h. Magneettikentälle altistettujen solujen DNA-vauriot ja mikrotumien määrä lisääntyivät menadionialtistuksen jälkeen. Sen sijaan pelkästään magneettikentälle altistetuissa soluissa ei havaittu vaikutuksia. Menadioni aiheuttaa lisääntynyttä superoksidianionien muodostumista, mutta nämä lisääntyneet superoksidianionitasot eivät ole riittäviä aiheuttamaan oksidatiivista DNA-vauriota. Menadioni aiheuttaa kuitenkin kalsiumioneista riippuvien nukleaasien aktivaatiota, jolloin aiheutuu mahdollisesti DNAvauriota. Markkanen ym. (2008) havaitsivat myös 24 h 50 Hz magneettikenttäaltistuksen lisäävän solutason vasteita yhteisaltistuksessa menadionin kanssa hiiren L929-soluilla. He korostivat tutkimuksessaan, että 100 µT kentänvoimakkuudella magneettikenttä voi aiheuttaa biologisia prosesseja, jotka voivat olla keskeisiä syövän synnyssä. Luukkonen ym. (2014) tutkivat 50 Hz magneettikentän (100 µT kentänvoimakkuus) välittömiä sekä viivästyneitä vaikutuksia genomin epävakaisuuteen, oksidatiivisiin prosesseihin ja mitokondrionaaliseen aktiivisuuteen ihmisen neuroblastoomasoluilla (SHSY5Y). Soluja altistettiin 24 h magneettikentälle sekä lisäksi osaa soluista 3 h menadionille ja havaittiin, että mikrotumien muodostuminen lisääntyi magneettikenttäaltistuksessa sekä menadionin kanssa että ilman menadionia. Magneettikenttä aiheutti antioksidanttien ja oksidanttien välisessä tasapainossa muutoksia välittömästi altistusten jälkeen määritettynä. Mitokondrionaalisen aktiivisuuden lisääntymistä havaittiin 8 päivän kuluttua magneettikenttäaltistuksesta ja lisääntynyttä happiradikaalituotantoa ja lipidiperoksidaatiota havaittiin 15 päivän jälkeen magneettikenttäaltistuksesta, mutta mitokondrionaalista aktiivisuutta ei enää tällöin havaittu. Solujen elävyyksissä ei havaittu muutoksia. Frahm ym. (2006) havaitsivat 50 Hz magneettikentän (0,05 mT; 0,1 mT; 0,5 mT; 1,0 mT kentänvoimakkuuksilla) lisäävän tilastollisesti merkitsevästi happiradikaalituotantoa hiiren promonosyyteillä kaikilla tutkituilla kentänvoimakkuuksilla 45 minuutin altistuksella. Mikrotumamäärityksiä varten he altistivat hiiren makrofaagisoluja 1,0 mT 50 Hz magneettikentälle 12, 24 ja 48 tunnin ajan, mutta he eivät havainneet tilastollisesti merkitseviä eroja mikrotumien määrässä verrattuna kontrolleihin eivätkä myöskään mitoottisten solujen määrässä. Jin ym. (2012) eivät havainneet 60 Hz magneettikentän (0,1; 0,2; 0,5; 1,0 mT) 16 vaikuttavan mikrotumien muodostumiseen hiiren sikiökautisilla fibroblasteilla ja ihmisen keuhkofibroblasteilla yhteisaltistuksessa ionisoivan säteilyn ja vetyperoksidin kanssa. Soluja altistettiin magneettikentälle neljän tunnin ajan. Jatkotutkimuksissa Jin ym. (2014) eivät havainneet 60 Hz (1 mT) magneettikentällä olevan tilastollisesti merkitsevää vaikutusta primääriin DNA-vaurioon neljän ja kuudentoista tunnin yhteisaltistuksella ionisoivan säteilyn tai vetyperoksidin kanssa. He käyttivät tutkimuksessaan hiiren fibroblasteja, ihmisen keuhkofibroblasteja sekä ihmisen maitorauhassoluja. Di Loreto ym. (2008) altistivat rotan kortikaalisia hermosoluja 50 Hz magneettikentälle (0,1 mT ja 1,0 mT kentänvoimakkuudella) seitsemän vuorokauden ajan. He eivät havainneet tilastollisesti merkitsevää eroa entsymaattisten antioksidanttien aktiivisuudessa verrattuna kontrolleihin. Happiradikaalituotannossa havaittiin pientä nousua kentänvoimakkuuden kasvaessa verrattuna kontrolliin, mutta erot eivät olleet kuitenkaan tilastollisesti merkitseviä. Solujen elävyyteen magneettikentän havaittiin vaikuttavan positiivisesti tilastollisesti merkitsevästi. Simkó ym. (2001) havaitsivat 50 Hz magneettikentän (1 mT) lisäävän superoksidianionituotantoa hiiren makrofaageilla ja Rollwitz ym. (2004) vastaavasti hiiren promonosyyteillä. Lai & Singh (1997) tutkivat 60 Hz magneettikentän vaikutusta DNA-vaurioihin rotilla (Sprague-Dawley). Rottia altistettiin magneettikentälle 0,1 mT; 0,25 mT ja 0,5 mT voimakkuudella kahden tunnin ajan ja tämän jälkeen niistä eristettiin aivosoluja. He havaitsivat tilastollisesti merkitseviä DNA:n yksöisjuostevaurioita kaikilla kentänvoimakkuuksilla aiheutettuna ja kaksoisjuostevaurioita 0,25 mT:n ja 0,5 mT:n kentänvoimakkuuksilla aiheutettuna. Singh & Lai (1998) tutkivat edelleen 60 Hz magneettikentän vaikutusta 0,5 mT:n kentänvoimakkuudella rotilla (Sprague-Dawley) ja havaitsivat, että magneettikenttä vaikuttaa DNA-proteiinien ja DNA-DNA-ristisidosten (crosslinks) muodostumiseen aivosoluissa. Kyseisillä asioilla on havaittu olevan yhteys muun muassa solukuolemaan. Wolf ym. (2005) käyttivät tutkimuksissaan ihmisen leukemiasoluja (HL-60), rotan fibroblasteja ja ihmisen diploidisia fibroblasteja (WI-38) ja altistivat niitä 24, 48 ja 72 tunnin ajan 50 Hz magneettikentälle (0,5 mT; 0,75 mT ja 1,0 mT). Magneettikenttä aiheutti DNA:n juostevauriota kaikilla tutkituilla solulinjoilla.. Lisäksi he käyttivät tutkimuksissaan antioksidantti α-tokoferolia, joka esti magneettikentän aiheuttaman DNAvaurion syntymistä. Myös happiradikaalituotanto kasvoi magneettikenttäaltistuksessa verrattuna kontrolleihin. Falone ym. (2007) havaitsivat 50 Hz (1 mT) magneettikentän 17 lisäävän happiradikaalituotantoa yhteisaltistuksessa vetyperoksidin kanssa ihmisen neuroblastoomasoluilla (SH-SY5Y) 96 tunnin altistuksella. Antioksidantti NAC (10 mM) laski happiradikaalituotantoa samalle tasolle kontrollisolujen kanssa. Magneettikenttä lisäsi glutationiperoksidaasin aktiivisuutta ja myös solujen elävyyttä. Magneettikenttä yksinään ei vaikuttanut DNA-vauriovasteeseen, mutta yhteisaltistuksessa vetyperoksidin kanssa magneettikenttä aiheutti lisääntynyttä DNA-vauriovastetta. Solujen elävyyden kasvua ihmisen neuroblastoomasoluilla (SH-SY5Y) havaitsivat myös Sulpizio ym. (2011) 50 Hz (1 mT) magneettikenttäaltistuksella viiden, kymmenen ja viidentoista päivän altistuksilla. Moret ym. (2005) tutkivat 50 Hz (1,0 mT) magneettikentän ja bentseenijohdannaisten yhteisvaikutusta ihmisen lymfoblastoidisolujen (Jürkat-solut) DNA-vauriovasteeseen ja havaitsivat, että magneettikenttä ja hydrokinoni aiheuttivat yhdessä DNA-vauriota, kun yksittäin näillä kahdella altisteella ei havaittu vaikutusta. Miyakoshi ym. (2012) havaitsivat 50 Hz (10 mT) magneettikenttäaltistuksen aiheuttavan mikrotumien muodostumista altistettujen rottien (vastasyntyneet Sprague-Dawley-rotat) astrosyyteillä 72 tunnin altistuksella. He havaitsivat myös, että antioksidantti TEMPO (4hydroksi-2,2,6,6-tetrametyyli-piperidiini-1-oksyyli) esti mikrotumien muodostumista magneettikenttäaltistuksessa. Heidän tutkimuksessaan käytettiin yhteisaltisteena bleomysiiniä, jota käytetään yleisesti syövän hoidossa. Jelenković ym. (2006) altistivat rottia (Wistar) seitsemän vuorokauden ajan 50 Hz (0,5 mT) magneettikentälle ja havaitsivat magneettikentän aiheuttavan superoksidianionituotannon lisääntymistä aivosoluissa, kuten myös lipidiperoksidaation ja superoksididismutaasin aktiivisuutta. Myös Falone ym. (2008) havaitsivat 50 Hz magneettikenttäaltistuksen (0,1 mT) aiheuttavan ikääntyneiden rottien (Sprague-Dawley) aivosolujen solunsisäisten antioksidanttipitoisuuksien lisääntymistä kymmenen päivän altistuksella. Vastaavanlaisia tuloksia ovat saaneet myös Lee ym. (2004) hiirien 60 Hz magneettikenttäaltistuksella, jossa superoksididismutaasientsyymin aktiivisuutta aivosoluissa. magneettikenttä lisäsi 18 3 TYÖN TAVOITTEET Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää hyvin pienitaajuisen magneettikentän aiheuttamia välittömiä solutason vaikutuksia rotan C6-glioomasolulinjalla ja tarkastella, mikä vaikutus yleisantioksidanttina tunnetulla N-asetyylikysteiinillä (NAC) on solujen happiradikaalituotantoon ja DNA-vaurioihin. Lisäksi haluttiin selvittää, pystytäänkö NAC:lla estämään hyvin pienitaajuisen magneettikentän aiheuttamia mahdollisia vaikutuksia. Tutkimuksessa selvitettiin happiradikaalituotantoa DCF-menetelmällä ja DNA-vauriovastetta yksisolugeelielektroforeesilla eli niin kutsutulla Comet Assay-menetelmällä. 19 4 AINEISTO JA MENETELMÄT 4.1 SOLULINJA JA SOLUVILJELY Tässä tutkimuksessa solulinjana käytettiin rotan glioomasolulinjaa (C6). Kyseinen solulinja on äärimmäisen kiivas jakautumaan. Alun perin kyseinen solulinja on saatu aikaiseksi altistamalla Wistar-Furth-rottia N-nitroso-N-metyyliurealle (NMU), jolloin rotan gliasoluista on kehittynyt glioomia (Grobben ym. 2002). Solujen kasvatusliuoksena käytettiin Dulbecco’s Modified Eagle Mediumia (Gibco, Invitrogen Corporation, Yhdysvallat), joka sisälsi 1,0 g/l D-glukoosia, 584 mg/l L-glutamiinia ja 110 mg/l pyruvaattia. Mikrobikontaminaatioriskin pienentämiseksi mediumiin lisättiin 5000 U/ml penisilliiniä ja 5000 µg/ml streptomysiiniä. Mediumiin lisättiin myös FBS:aa (fetal bovine serum) solujen kasvun tehostamiseksi. Soluja kasvatettiin soluviljelyinkubaattorissa (Heraeus HeraCell, Saksa) +37 °C:n lämpötilassa ja 5 % suhteellisessa CO2-pitoisuudessa. Soluja kasvatettiin soluviljelypulloissa (75 cm2, Nunc, Tanska). Soluja tarkkailtiin päivittäin mikroskopoimalla (Olympus CK40, Japani). Solujen siirrostaminen suoritettiin steriilisti laminaarivirtauskaapissa (Kojair Tech Oy, KR125 B, Suomi), jonka puhdistukseen käytettiin 1,5 % erifenolia ja 70 % etyylialkoholia. Puhdistumisen tehostamiseksi käytettiin UV-valoa, jota pidettiin päällä ennen työskentelyä. Soluviljelyliuokset lämmitettiin vesihauteessa (Grant Instruments Y22, Iso-Britannia) +37 °C:een. Solujen siirrostamisessa medium poistettiin pasteur-pipetillä imun avulla. Solujen irrottamiseen käytettiin 0,1 % trypsiini-liuosta (in 0,02 % EDTA in PBS w/o Ca2+, Mg2+), jota pipetoitiin kasvatuspulloon 4 ml ja annettiin vaikuttaa noin viiden minuutin ajan. Irrottamisen jälkeen kasvatuspulloon pipetoitiin 8 ml mediumia huuhdellen pulloa huolellisesti ja pipetoitiin solususpensio 15 ml:n falcon-putkeen. Falcon-putkea sentrifugoitiin (Heraeus Instruments Biofuge Primo, Kendro Laboratory Products, Saksa) solupelletin muodostamiseksi kahdeksan minuutin ajan 363 × g. Sentrifugoinnin jälkeen poistettiin supernatantti ja suspensoitiin solupelletti 1 ml:aan mediumia. Solulaskentaa varten solususpensiota laimennettiin 1:100 (10 µl solususpensiota pipetoitiin 990 µl:aan PBS-liuosta) ja vorteksoitiin huolellisesti (VMR Lab Dancer). Solulaskenta suoritettiin Moxi Z -solulaskurilla (Orflo Technologies, Yhdysvallat) pipetoimalla 75 µl 20 soluliuoslaimennosta mittaliuskalle. Laskuri antoi solumäärän, solun keskimääräisen halkaisijan ja solujen elävyysprosentin. Saadun solumäärän perusteella valmistettiin jatkoviljelyä ja altistuksia varten solususpensiot. Jatkoviljelyä varten solususpensio pipetoitiin 20 ml:aan mediumia. Soluja viljeltiin jatkoon tarpeen mukainen määrä, yleensä 0,25 × 106 tai 0,5 × 106 solua/20 ml medium. Soluja siirrostettiin keskimäärin kaksi kertaa viikossa. 4.1.1 Solujen valmistelu altistuksia varten Altistuksia ja määrityksiä varten soluja siirrostettiin joko 48-kuoppalevyille (Sigma Cell Culture Plate, Yhdysvallat) tai maljoille riippuen määrityksestä. Soluja esikasvatettiin määrityksestä riippuen joko kuoppalevyillä tai maljoilla 20 tuntia ennen altistuksien aloittamista solujen kiinnittymisen varmistamiseksi. Siirrostamiset tehtiin steriileissä olosuhteissa. DCF-määrityksiä varten soluja pipetoitiin 15 000 solua/500 µl kuoppaa kohden. Comet Assay–määritystä varten soluja pipetoitiin maljoille 25 000 solua/5 ml maljaa kohden. Esikokeissa vastaavat määrät olivat 30 000 solua/500 µl kuoppaa kohden ja 0,5 x 106 solua/5 ml maljaa kohden. 4.2 MÄÄRITYSMENETELMÄT Happiradikaalituotantoa määritettiin 48-kuoppalevyllä DCF-menetelmällä. Solujen elävyyttä määritettiin propidiumjodidin ja digitoniinin avulla fluorometrillä (Tecan Infinite F200 Pro, Tecan Group Ltd, Sveitsi). DNA-vauriota määritettiin yksisolugeelielektroforeesilla eli niin kutsutulla Comet Assay-menetelmällä. Altistukset Comet Assayta varten suoritettiin maljoilla. Määritykset tehtiin välittömästi magneettikenttäaltistuksen jälkeen. Koeasetelma kuvataan tarkemmin kappaleessa 4.4. 4.2.1 Happiradikaalituotanto Happiradikaalituotannon määritys DCF-menetelmällä perustuu 2´,7´- diklorodihydrofluoreskiinidiasetaatin (DCFH-DA) tunkeutumiseen solukalvon läpi ja reagoimiseen solun esteraasientsyymien kanssa, jolloin DCFH-DA deasyloituu ja muuntuu 21 fluoresoimattomaksi 2´,7´-diklorodihydrofluoreskiiniksi (DCFH). DCFH hapettuu happiradikaalin kohdatessaan voimakkaasti fluoresoivaksi 2´,7´-diklorofluoreskiiniksi (DCF) aiheuttaen mitattavissa olevaa fluoresenssia. (Hoet ym. 2013.) Määritys suoritettiin välittömästi altistuksen jälkeen poistamalla kuopista altisteet ja pesemällä solut kerran 0,5 ml:lla HBSS-puskuria. Tämän jälkeen solut ladattiin 40 µM DCFH-DA:lla pipetoimalla 0,5 ml kuhunkin kuoppaan. Latauksen jälkeen kuoppalevyjä inkuboitiin soluviljelyinkubaattorissa (Heraeus HeraCell, Yhdysvallat) 30 minuutin ajan. Inkuboinnin jälkeen mitattiin fluoresenssi Tecan Infinite F200 Pro –fluorometrillä (Tecan Group Ltd, Sveitsi) (eksitaatioaallonpituus 485 nm, emissioaallonpituus 535 nm). Tulokset on esitetty suhteellisina fluoresenssiyksikköinä (RFU). 4.2.2 Solujen elävyys Solujen elävyyttä määritettiin propidiumjodidin ja digitoniinin avulla. Propidiumjodidilla on taipumus sitoutua DNA:han aiheuttaen fluoresenssia. Propidiumjodidi sitoutuu kromatiiniin nekroottisissa soluissa eli solukalvovauriosta kärsivissä soluissa (Luukkonen ym. 2014). Digitoniini hajottaa solukalvon, jolloin propidiumjodidi pääsee kaikkiin soluihin aiheuttaen fluoresenssia. Elävyysmääritys suoritettiin pipetoimalla 20 µl 1,25 mM propidiumjodidia kuoppaa kohden, jolloin loppukonsentraatio kuopassa oli 50 µM. Tämän jälkeen kuoppalevyjä sekoitettiin lyhyesti kuoppalevyravistelijassa (Labsystems Wellmix, Saksa) ja inkuboitiin 20 minuuttia huoneenlämmössä valolta suojattuna. Inkubaation jälkeen mitattiin fluoresenssi Tecan Infinite F200 Pro –fluorometrillä (Tecan Group Ltd, Sveitsi) (eksitaatioaallonpituus 540 nm, emissioaallonpituus 612 nm). Maksimifluoresenssin määrittämiseksi kuoppalevyille pipetoitiin 20 µl 4 mM digitoniinia kuoppaa kohden, jolloin loppukonsentraatio kuopassa oli 160 µM. Tämän jälkeen kuoppalevyjä sekoitettiin voimakkaasti kuoppalevyravistelijassa (Labsystems Wellmix, Saksa) 20 minuutin ajan valolta suojattuna. Fluoresenssi mitattiin Tecan Infinite F200 Pro – fluorometrillä (Tecan Group Ltd, Sveitsi) (eksitaatioaallonpituus 540 emissioaallonpituus 612 nm). Solujen elävyysprosentti laskettiin seuraavalla kaavalla: nm, 22 ä (%) = 100 − ( − ) × 100 − , jossa F= fluoresenssiarvo propidiumjodidilisäyksen jälkeen Fmax = maksimifluoresenssiarvo digitoniinilisäyksen jälkeen blank1 = taustafluoresenssi propidiumjodidilisäyksen jälkeen soluttomista kuopista blank2 = taustafluoresenssi digitoniinilisäyksen jälkeen soluttomista kuopista 4.2.3 DNA-vauriot DNA-vauriovastetta määritettiin yksisolugeelielektroforeesilla (Single-Cell Gel Electrophoresis) eli niin kutsutulla Comet Assay-menetelmällä. Tämä menetelmä perustuu DNA-fragmenttien ajamiseen ulos solujen tumista sähkövirran avulla ja nämä fragmentit havaitaan mikroskopiassa komeetan kaltaisena rakenteena pää- ja häntäosineen. Menetelmällä voidaan havaita sekä DNA:n yksöis- että kaksoisjuostevaurioita. Menetelmä on erittäin käyttökelpoinen havaitsemaan yksittäisen solun kärsimän DNA-vaurion ja lisäksi tällä menetelmällä voidaan myös arvioida DNA:n korjausmekanismeja. (Da Silva ym. 2000.) Menetelmää varten objektilasit (Thermo Scientific Menzel-Gläser, Saksa) päällystettiin kastamalla laseja agaroosigeeliin. Agaroosigeeli valmistettiin liuottamalla 0,5 grammaa agaroosia (Normal Melting Point-agarose, BioWhittaker Molecular Applications, Yhdysvallat) 50 ml:aan PBS-liuosta. Liukenemisen tehostamiseksi liuosta lämmitettiin mikroaaltouunissa. Objektilasi kastettiin geelissä kolme kertaa, jonka jälkeen objektilaseja säilytettiin pakastimessa yleensä noin viikon ajan ennen käyttöä. Objektilasien pakastamisen havaittiin tehostavan agaroosigeelin kiinnipysymistä objektilaseilla analyyseissä verrattuna huoneenlämmössä säilytettyihin. Comet Assay:ta varten valmistettiin varsinaisesta valmistettiin hajotuspuskuri hajotuspuskuriliuoksesta, ja ajopuskuri. milliQ-vedestä ja Hajotuspuskuri Triton-X-100- kemikaalista (Sigma-Aldrich, Saksa). Ajopuskuri valmistettiin milliQ-vedestä, 10 M natriumhydroksidista ja 200 mM EDTA:sta. Liuokset valmistettiin määrityspäivänä vähintään tuntia ennen käyttöä ja säilytettiin jääkaapissa. Liuosten valmistus on esitettynä liitteessä 1. 23 Altistusten jälkeen altisteet poistettiin ja lisättiin solujen irrotusta varten 1 ml 0,1 % trypsiiniliuosta (in 0,02% EDTA in PBS w/o Ca2+, Mg2+) solumaljaa kohden. Trypsiinin annettiin vaikuttaa 5 minuuttia, jonka jälkeen lisättiin 2 ml mediumia neutralointia varten ja pipetoitiin saadut suspensiot 15 ml:n falcon-putkiin jäähauteessa. Putkia sentrifugoitiin 8 minuuttia 363 × g 4 °C:een lämpötilassa (Heraeus Instruments Biofuge Stratos, Kendro Laboratory Products, Saksa). Sentrifugoinnin jälkeen poistettiin supernatantti ja suspensoitiin solupelletti 500 µl:aan PBS-puskuria, jolloin laskennallinen solumäärä oli 30 000 solua/15 µl. Käytännössä kuitenkin arvioitu todellinen solumäärä objektilaseilla oli lopulta noin 15 000, sillä solujen irrotusvaiheessa ja sentrifugoinnissa osa soluista jää maljoille ja falcon-putkiin. Tämä solumäärä oli riittävä analysointeja varten. Solunäytteet pipetoitiin 15 µl eppendorf-putkiin, johon oli pipetoitu 75 µl matalasulamispisteistä agaroosia (Agarose 0,5 Low Melting Point in PBS, Sigma, Yhdysvallat) ja vorteksoitiin (Scientific Industries Vortex Genie-2, Yhdysvallat) huolellisesti. Saatua liuosta pipetoitiin 80 µl objektilasille ja annettiin olla peitinlasin alla jäillä vähintään 5 minuuttia. Tämän jälkeen poistettiin peitinlasit varoen sivukautta ja asetettiin objektilasit muovilaatikkoon, johon kaadettiin hajotuspuskuri. Hajotuspuskurin annettiin vaikuttaa tunnin ajan jääkaapissa. 15 minuuttia ennen hajotusajan päättymistä lisättiin ajopuskuriliuos elektroforeesilaitteeseen. Hajotusajan jälkeen asetettiin objektilasit elektroforeesilaitteeseen (Horizon 20-25, Gibco BRL, Yhdysvallat) ja annettiin objektilasien olla 20 minuutin ajan laitteessa ilman sähkövirtaa valolta suojattuna (unwinding) ja tämän jälkeen 25 minuutin elektroforeesiajo valolta suojattuna (Life Technologies Model 250EX Gibco BRL Electrophoresis Power Supply, Yhdysvallat; 24 V, 380 mA). Elektroforeesiajon jälkeen suoritettiin viiden minuutin neutralointipuskurointi muovilaatikossa kolme kertaa valolta suojattuna. Lopuksi objektilasit fiksattiin 96 % -etanolilla minuutin ajan (96 ml Etax AA + 4 ml milli-Q-vesi) ja vietiin objektilasit kuivumaan huoneenlämmössä valolta suojattuna. Näytteiden analysointi suoritettiin aikaisintaan seuraavana päivänä. Näytteiden analysointia varten objektilasit värjättiin etidiumbromidilla (EtBr). EtBr-värjäys suoritettiin laimentamalla 0,2 mg/ml EtBr-kantaliuosta milliQ-veteen 1:10. Tätä laimennosta pipetoitiin 75 µl objektilasia kohden ja annettiin vaikuttaa peitinlasin alla 30 minuutin ajan. Mikroskooppina käytettiin Axio Scope.A1–mikroskooppia (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Saksa), joka oli yhdistetty tietokoneeseen. Analysointisovelluksena käytettiin Comet Assay IV-sovellusta (Perceptive Instruments, Iso-Britannia). Kyseisellä ohjelmistolla pystytään 24 laskemaan solut yksitellen, jolloin ohjelmisto analysoi solun DNA-vauriovastetta kuvaavia parametrejä. Varsinaiset analysoinnit tehtiin sokkoistettuna eli analysointivaiheessa analysoija ei tiennyt mistä näytteestä oli kyse. Näin ollen virhelähdettä saatiin pienennettyä, kun näytteiden analysoija ei tiennyt analysoitavan näytteen altistetta eikä mahdolliset olettamat kunkin altisteen aiheuttamasta vaikutuksesta häirinnyt tulosten analysointia. Varsinaisten tutkimusten ja näytteiden analysointien jälkeen sokkoistukset purettiin ja tulokset käsiteltiin. 4.3 ESIKOKEET Esikokeiden tarkoituksena oli selvittää sopivat menadioni –ja antioksidanttipitoisuudet altistuksia varten. Lisäksi esikokeilla selvitettiin sopivat pitoisuudet positiivikontrolleihin, joilla varmistettiin käytettyjen menetelmien toimivuus kullakin määritystoistokerralla. Positiivikontrolleina käytettiin DCF-määrityksessä (ks. kpl 4.2.1) dietyylimaleaattia (DEM) ja DNA-vauriomäärityksessä (ks. kpl 4.2.3) metyylimetaanisulfonaattia (MMS) menetelmien toimivuuden varmistamiseksi. DEM:n tiedetään aiheuttavan lisääntynyttä happiradikaalituotantoa ja MMS:n DNA-vaurioita. Esikokeissa suoritetut altistukset pipetoitiin steriileissä olosuhteissa ja altistusinkubaatiot suoritettiin soluviljelyinkubaattorissa vastaavissa olosuhteissa kuin solujen kasvatuskin. Menadionin havaittiin laskevan happiradikaalituotantoa, mutta varsinainen annosvastesuhde ei tullut esiin kovin selvästi kahdella toistokerralla (kuva 2). Soluja altistettiin menadionin eri pitoisuuksille kolmen tunnin ajan. Altistuksen jälkeen suoritettiin välittömästi DCF-määritys. Eniten happiradikaalituotantoa laski 30 µM ja vähiten 5 µM menadionipitoisuus. 25 2000 RFU 1500 1000 500 0 0 1 5 10 15 20 25 30 40 50 Menadioni (µM) Kuva 2. Happiradikaalituotanto välittömästi menadionialtistuksen (3 h) jälkeen. Kuvassa on esitetty happiradikaalituotannon keskiarvot ja keskiarvon keskivirhe (SEM) suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 2. Kuvassa 3 on esitetty solujen elävyysprosentti välittömästi menadionialtistuksen (3 h) jälkeen mitattuna. Solujen elävyys oli kaikilla menadionipitoisuuksilla yli 80 %. Elävyysprosentti oli alhaisin 50 µM menadionille altistetuilla soluilla. 100 Elävyys (%) 80 60 40 20 0 0 1 5 10 15 20 25 30 40 50 Menadioni (µM) Kuva 3. Solujen elävyys (%) mitattuna välittömästi menadionialtistuksen (3 h) jälkeen. Kuvassa esitetty elävyysprosentit keskiarvoineen ja keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 2. 26 N-asetyylikysteiinin (NAC) havaittiin laskevan annosvastesuhteisesti happiradikaalituotantoa verrattuna kontrolliin. Soluja käsiteltiin NAC:lla 1 h ajan ja osaa soluista altistettiin 3 h ajan 20 µM menadionille. Menadionille altistetuilla soluilla happiradikaalituotanto sen sijaan nousi 2 mM NAC-pitoisuudella verrattuna kontrolliin, mutta oli kuitenkin matalampi 5 mM NACpitoisuudella kuin 2 mM. NAC:lla saatiin siis estettyä menadionin vaikutusta. (Kuva 4) 2500 - 20 µM menadioni + 20 µM menadioni RFU 2000 1500 1000 500 0 0 2 5 0 2 5 NAC (mM) Kuva 4. Happiradikaalituotanto välittömästi menadionialtistuksen (3 h) jälkeen. Ennen menadionialtistusta soluja altistettiin 1 h ajan N-asetyylikysteiinin (NAC) eri pitoisuuksille. Kuvassa on esitetty happiradikaalituotanto suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 1. Kuvassa 5 on esitetty solujen elävyysprosentti altistusten jälkeen. Soluja oli altistettu 1 h ajan 0, 2 ja 5 mM NAC-pitoisuuksille ja tämän jälkeen 3 h ajan 20 µM menadionille. Elävyydet olivat kaikissa tapauksissa yli 90 %. - 20 µM menadioni + 20 µM menadioni 100 Elävyys (%) 80 60 40 20 0 0 2 5 0 2 5 NAC (mM) Kuva 5. Solujen elävyys (%) mitattuna välittömästi altistusten (1 h NAC + 3 h menadioni) jälkeen. Kuvassa on esitetty happiradikaalituotanto suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 1. 27 Dietyylimaleaatin (DEM) havaittiin lisäävän happiradikaalituotantoa pitoisuuden (%) kasvaessa. Soluja altistettiin eri pitoisuuksille 1, 2 ja 3 h ajan ja tämän jälkeen suoritettiin välittömästi DCF-määritys. (Kuva 6) 5000 1 h altistus 2 h altistus 4000 RFU 3 h altistus 3000 2000 1000 0, 04 0, 03 5 0, 03 0, 02 5 0, 02 0, 00 5 0, 01 0, 01 5 0 0, 00 25 0 DEM (%) Kuva 6. Happiradikaalituotanto välittömästi dietyylimaleaattialtistuksen (DEM) jälkeen. Soluja altistettiin 1, 2 ja 3 h ajan DEM:n eri pitoisuuksille. Kuvassa on esitetty happiradikaalituotannon keskiarvot ja keskiarvon keskivirhe (SEM) suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 2. Kuvassa 7 on esitettynä solujen elävyysprosentti (%) välittömästi DEM-altistuksen jälkeen. Soluja altistettiin 1 h, 2 h ja 3 h DEM:n eri pitoisuuksille. Elävyys laski eniten 3 h 0,04 DEMaltistetuilla soluilla. 28 1h 100 Elävyys (%) 2h 80 3h 60 40 20 0, 04 0, 03 5 0, 03 0, 02 5 0, 02 0, 01 5 0, 01 0 0, 00 25 0, 00 5 0 DEM (%) Kuva 7. Solujen elävyys mitattuna välittömästi DEM-altistusten jälkeen. Kuvassa on esitetty elävyysprosentit keskiarvoineen ja keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Kuvassa 8 on esitetty Comet Assay –menetelmällä saadut OTM-arvot (olive tail moment) 3 h menadionialtistuksen jälkeen kahdella eri irrotustavalla. Tulokset antoivat viitteitä, että trypsinoinnilla tehtävä solujen irrotus nostaa vähemmän OTM-arvoja kuin skreippaus, joten solut päätettiin tämän perusteella irrottaa trypsinoimalla varsinaisissa määrityksissä. Kaikilla käytetyillä menadionipitoisuuksilla ei saatu esikokeissa määritettyä OTM-arvoa menetelmän herkkyyden ja yhden toistokerran takia. 15 Skreippaus Trypsiini OTM 10 5 0 0 10 20 40 Menadioni (µM) Kuva 8. Comet Assay –menetelmällä määritetyt OTM-arvot 3 h menadionialtistuksen jälkeen kahdella eri irrotustavalla. n = 1. 29 Esikokeiden perusteella positiivikontrolliksi happiradikaalimäärityksiin valittiin 0,02 % DEM-altistus (3 h), sillä kyseisellä pitoisuudella saatiin hyvää soluvastetta aikaiseksi verrattuna kontrolliin ja solujen elävyysprosentti pysyi keskimäärin 90 %. Menadionikonsentraatioksi valittiin 1 µM ja 20 µM sekä NAC-konsentraatioksi 2 mM. DNAvauriomäärityksiin menadionikonsentraatioksi valittiin 20 µM ja irrotustavaksi trypsinointi sekä positiivikontrolliksi aikaisempien tutkimusten perusteella 3 h metyylimetaanisulfonaattialtistus (MMS) 50 µg/ml. 4.4 KOEASETELMA JA MAGNEETTIKENTTÄALTISTUSLAITTEISTO Tutkimuksessa altistettiin rotan glioomasoluja (C6) 48-kuoppalevyillä tai maljoilla 50 Hz magneettikentälle (kentänvoimakkuus 100 µT) 24 h ajan. Ennen magneettikenttäaltistusta soluja altistettiin tunnin ajan antioksidantti N-asetyylikysteiinille (NAC) soluviljelyinkubaattorissa. NAC-konsentraationa käytettiin 2 mM. Magneettikenttäaltistuksen jälkeen soluja altistettiin menadionille kolmen tunnin ajan. Menadionikonsentraatioina käytettiin 1 µM ja 20 µM. Lisäksi positiivikontrolleina käytettiin DCF-määrityksessä dietyylimaleaattia (DEM) ja DNA-vauriomäärityksessä metyylimetaanisulfonaattia (MMS) menetelmien toimivuuden varmistamiseksi. Kuvassa 9 on esitettynä aikajanamuodossa koeasetelma altistusaikoineen. Altiste NAC NAC + Magneettikenttä Menadioni 1h 24 h 3h Aik a Happiradikaali -ja elävyysmääritykset sekä Comet Assay Kuva 9. Koeasetelma altistusaikoineen. Janan yläpuolella on altiste ja alapuolella altistusaika sekä määritysmenetelmien ajankohta. Magneettikenttäaltistuksessa käytettiin soluviljelyinkubaattoriin (Heraeus HeraCell, Saksa) kytkettyä magneettikenttälaitteistoa (kuva 10), joka koostui signaaligeneraattorista (BK- 30 precision 3010 Function Generator, Yhdysvallat) ja virtavahvistimesta (Peavey Electronics Corporation, M-3000 Power Amplifier, Yhdysvallat) sekä inkubaattorin sisään asetetuista kahdesta kuparikelasta, jotka olivat kooltaan 340 × 460 mm ja olivat asetettu Helmholztyyppisesti 220 mm etäisyydelle toisistaan. Näin ollen kuparikelat muodostivat mahdollisimman tasaisen magneettikentän. Inkubaattorissa vallitsi +37 °C:n lämpötila ja noin 5 % suhteellinen CO2-pitoisuus. Magneettikentän voimakkuutta mitattiin magneettikenttämittarilla (Hirst Gaussmeter CM 08, Axial Fluxgate Probe AFG100, Hirst Magnetic Instruments Ltd, Iso-Britannia). Samanaikaisesti magneettikenttäaltistuksen kanssa kontrollisoluja inkuboitiin vastaavanlaisissa olosuhteissa, mutta ilman magneettikenttää. Altistuslaitteisto kytkettiin päälle edeltävänä päivänä ennen altistusten aloittamista magneettikentän voimakkuuden tasaamisen vuoksi. Kuva 10. Magneettikenttäaltistuslaitteisto Tässä tutkimuksessa käytetyt kemikaalit ja liuokset on esitetty liitteessä (liite 1). 4.5 TILASTOLLISET ANALYYSIT Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism 6-sovelluksella ja analyyseinä käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysiä (one-way ANOVA) ja Tukey’n post-hoc-testiä. Tilastollisesti merkitsevinä tuloksina pidettiin tuloksia, joiden p-arvo oli alle 0,05 (p < 0,05). 31 5 TULOKSET 5.1 HAPPIRADIKAALITUOTANTO JA SOLUJEN ELÄVYYS Kuvassa 11 on esitettynä happiradikaalituotanto mitattuna välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen. Ennen magneettikenttäaltistusta soluja käsiteltiin tunnin ajan 2 mM NAC:lla. Kontrolli-inkubaatio suoritettiin vastaavanlaisissa olosuhteissa kuin magneettikenttäaltistuskin, happiradikaalituotantoa, mutta kuten ilman myös 2 magneettikenttää. mM NAC. Magneettikenttä Magneettikentän laski aiheuttama happiradikaalituotannon lasku ei ollut kuitenkaan tilastollisesti merkitsevää, kuten ei myös NAC:n vaikutus (p > 0,05). 2500 Sham MF RFU 2000 1500 1000 500 0 0 2 NAC (mM) Kuva 11. Happiradikaalituotanto välittömästi magneettikenttäaltistuksen (24 h) jälkeen. Ennen magneettikenttäaltistusta soluja altistettiin 1 h ajan 2 mM N-asetyylikysteiinille (NAC). Kuvassa on esitetty happiradikaalituotannon keskiarvot ja keskiarvon keskivirhe (SEM) suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä. 32 Kuvassa 12 on esitettynä solujen elävyysprosentti (%) välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen. 100 Sham MF Elävyys (%) 80 60 40 20 0 0 2 NAC (mM) Kuva 12. Solujen elävyysprosentti välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen määritettynä. Kuvassa esitettyinä elävyysprosenttien keskiarvot keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä. Kuvassa 13 on esitettynä positiivikontrollina käytetyn dietyylimaleaatin (DEM) aiheuttama happiradikaalituotanto mitattuna välittömästi altistuksen jälkeen. Soluja altistettiin 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen 3 h ajan 0,02 % DEM:lle. 3000 Sham MF RFU 2000 1000 0 0 0,02 DEM (%) Kuva 13. Happiradikaalituotanto välittömästi magneettikenttäaltistuksen ja dietyylimaleaattialtistuksen (DEM) jälkeen. Kuvassa on esitetty happiradikaalituotannon keskiarvot ja keskiarvon keskivirhe (SEM) suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä. 33 Kuvassa 14 on esitetty solujen elävyysprosentti (%) välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen ja 3 h DEM-altistuksen jälkeen. 100 Sham MF Elävyys (%) 80 60 40 20 0 0 0,02 DEM (%) Kuva 14. Solujen elävyysprosentti välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen ja 3 h DEM-altistuksen jälkeen määritettynä. Kuvassa esitettyinä elävyysprosenttien keskiarvot keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä. Kuvassa 15 on esitetty NAC-antioksidantin vaikutus menadionin aiheuttamaan happiradikaalituotantoon. Ennen magneettikenttäaltistusta osaa soluista altistettiin 1 h ajan 2 mM N-asetyylikysteiinille (NAC) ja 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen 3 h ajan 0, 1 ja 20 µM menadionille. Magneettikenttä laski happiradikaalituotantoa verrattuna kontrolliin kaikissa tapauksissa, paitsi 1 µM menadionialtistuksessa ilman 2 mM NAC:a. 2 mM NAC lisäsi happiradikaalituotantoa. Magneettikentän aiheuttama vaikutus ei ollut tilastollisesti merkitsevää (p > 0,05). NAC lisäsi tilastollisesti merkitsevästi (p < 0,05) happiradikaalituotantoa 1 µM menadionille altistetuissa soluissa verrattuna soluihin, joita oli altistettu 1 µM menadionille, mutta ei NAC:lle. Menadionin aiheuttama happiradikaalituotannon vaihtelu ei ollut tilastollisesti merkitsevää (p > 0,05), paitsi 1 µM menadionille ja 2 mM NAC:lle altistettujen solujen tapauksessa oli tilastollisesti merkitsevä ero (p < 0,05). 34 2500 RFU 2000 + 2 mM NAC - 2 mM NAC Sham MF 1500 1000 500 0 0 1 20 0 1 20 Menadioni (µM) Kuva 15. Happiradikaalituotanto välittömästi altistusten jälkeen. Kuvassa on esitetty happiradikaalituotannon keskiarvot ja keskiarvon keskivirhe (SEM) suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä. Kuvassa 16 on esitetty solujen elävyysprosentti (%) välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen ja 3 h menadionialtistuksen jälkeen määritettynä. - 2 mM NAC + 2 mM NAC 100 Sham MF Elävyys (%) 80 60 40 20 0 0 1 20 0 1 20 Menadioni (µM) Kuva 16. Solujen elävyysprosentti välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen ja 3 h menadionialtistuksen jälkeen määritettynä. Kuvassa esitettyinä elävyysprosenttien keskiarvot keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä. 35 5.2 DNA-VAURIOT Kuvassa 17 on esitetty CometAssay –menetelmällä saadut OTM-tulokset välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen. Soluja altistettiin ennen magneettikenttäaltistusta 2 mM NAC:lle 1 h ajan. Magneettikenttä nosti OTM-arvoa verrattuna kontrolliin. 2 mM NAC nosti OTM-arvoa verrattuna kontrolliin. Magneettikentän eikä NAC:n vaikutus ei ollut kuitenkaan tilastollisesti merkitsevä (p > 0,05). 6 Sham MF OTM 4 2 0 0 2 NAC (mM) Kuva 17. OTM-arvot välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen. Kuvassa on esitetty tulokset keskiarvoineen ja keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä. Kuvassa 18 on esitetty on esitetty Comet Assay –menetelmällä saadut OTM-arvot välittömästi menadionialtistuksen jälkeen. Osaa soluista altistettiin ennen 24 h magneettikenttäaltistusta 2 mM NAC:lle 1 h ajan. Magneettikenttäaltistuksen jälkeen osaa soluista altistettiin 20 µM menadionille 3 h ajan. Magneettikenttä nosti OTM-arvoa kaikissa tapauksissa, mutta kontrollissa (ilman 2 mM NAC ja 0 µM menadioni) OTM-arvo oli selvästi suurempi verrattuna muihin tapauksiin. Sekä 2 mM NAC että 20 µM menadioni nostivat OTM-arvoa verrattuna kontrolleihin. Menadionin, magneettikentän ja NAC:n vaikutukset eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (p > 0,05). Tilastollisesti merkitsevä ero havaittiin (p < 0,05) kontrollisolujen ja magneettikentälle altistettujen solujen välillä ilman NAC-käsittelyä. 36 8 - 2 mM NAC + 2 mM NAC OTM 6 Sham MF 4 2 0 0 20 0 20 Menadioni (µM) Kuva 18. OTM-arvot välittömästi 3 h menadionialtistuksen jälkeen. Kuvassa on esitetty tulokset keskiarvoineen ja keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä. Kuvassa 19 on esitetty Comet Assay –menetelmällä saadut OTM-arvot välittömästi 3 h 50 µg/ml MMS-altistuksen jälkeen määritettynä. MMS-altistus nosti OTM-arvoa kontrolliin verrattuna. 20 Sham MF OTM 15 10 5 0 0 50 MMS (µg/ml) Kuva 19. OTM-arvot välittömästi 3 h MMS-altistuksen jälkeen. Kuvassa on esitetty tulokset keskiarvoineen ja keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä. 37 6 TULOSTEN TARKASTELU Magneettikenttäaltistus laski happiradikaalituotantoa verrattuna kontrollisoluihin yhteisaltistuksessa menadionin kanssa kaikissa tapauksissa, paitsi 1 µM menadionin kanssa magneettikentän aiheuttama happiradikaalituotanto oli suurempi kuin kontrollisolujen. Antioksidantti NAC laski magneettikenttäaltistuksen happiradikaalituotantoa jälkeen määritettynä, mutta välittömästi tässäkin 24 h tapauksessa happiradikaalituotanto näytti olevan pienempi magneettikenttäaltistetuilla soluilla verrattuna kontrolleihin. NAC:n vaikutus ei ollut tilastollisesti merkitsevää välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen. Menadionialtistus lisäsi happiradikaalituotantoa, mutta NAC:lla ei tätä vaikutusta pystytty estämään vastoin odotuksia, vaan NAC jopa lisäsi happiradikaalituotantoa verrattuna kontrolleihin. NAC:n vaikutus oli tilastollisesti merkitsevä (p < 0,05) soluilla, joita oli altistettu 1 µM menadionille ja 2 mM NAC:lle, tosin vaikutus oli happiradikaalituotantoa lisäävä. Useat tutkimukset eri solulinjoilla ovat kuitenkin osoittaneet NAC:n kykenevän estämään happiradikaalituotantoa ja näin ollen oksidatiivista stressiä. Falone ym. (2007) tutkimuksessa NAC esti 50 Hz magneettikentän aiheuttamaa happiradikaalituotantoa ihmisen neuroblastoomasoluilla, tosin suuremmalla pitoisuudella ja Han ym. (1997) havaitsivat tutkimuksissaan NAC:n lisäävän solun glutationitasoja. NACpitoisuus ei siis välttämättä ollut riittävän suuri tässä tutkimuksessa estämään menadionin aiheuttamaa happiradikaalituotannon nousua C6-soluilla. Lisätutkimuksia tarvitaan eri solulinjoilla käyttämällä NAC:n eri pitoisuuksia, jotta nähdään NAC:n vaikutus happiradikaalituotantoon magneettikenttäaltistetuilla soluilla. Useissa tutkimuksissa hyvin pienitaajuisen magneettikentän on havaittu aiheuttavan lisääntynyttä happiradikaalituotantoa eri solulinjoilla ja erilaisilla kentänvoimakkuuksilla sekä altistusajoilla (Di Loreto ym. 2008; Frahm ym. 2006; Luukkonen ym. 2011; Luukkonen ym. 2014). Tässä tutkimuksessa magneettikenttäaltistuksella happiradikaalituotanto oli kuitenkin pienempi lähes jokaisessa tapauksessa verrattuna kontrolliin. Erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Tämä voi aiheutua siitä, että DCF-menetelmä ei ole tehokas määrittämään spesifejä happiradikaaleja, kuten esimerkiksi superoksidianioneja tai vetyperoksideja, vaan menetelmällä pystytään määrittämään solunsisäistä happiradikaalituotantoa yleisellä tasolla (Luukkonen ym. 2008). Luukkonen ym. (2014) havaitsivat menadionin aiheuttavan annosvasteisesti laskevaa happiradikaalituotanto voi happiradikaalituotantoa olla suurempi DCF-menetelmällä. magneettikenttäaltistetuilla Näin ollen soluilla kuin 38 kontrollisoluilla. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään spesifisempää happiradikaalituotantoa eri menetelmillä. Magneettikentälle altistettujen solujen DNA-vauriovastetta kuvaava OTM-arvo oli suurempi verrattuna kontrollisoluihin. Tilastollisesti merkitseviä eroavaisuuksia ei kuitenkaan havaittu. Hajonta OTM-arvoissa oli varsin suurta, mutta tämä on tyypillistä tälle menetelmälle menetelmän herkkyydestä aiheutuen. Vastoin odotuksia, NAC lisäsi OTM-arvoa verrattuna kontrolleihin, mutta ei tilastollisesti merkitsevästi. Luukkonen ym. (2011) kirjoittaa, että menadioni aiheuttaa kalsiumioneista riippuvien nukleaasien aktivaatiota, jolloin aiheutuu mahdollisesti DNA-vauriota ja tässä tutkimuksessa menadionialtistus kasvatti OTM-arvoa verrattuna soluihin, joita ei ollut altistettu menadionille eli menadioni aiheutti DNA-vauriota. OTM-arvo oli suurempi magneettikenttäaltistetuilla soluilla kaikissa tapauksissa, paitsi kontrollisoluilla, joita ei ollut altistettu menadionille eikä käsitelty NAC:lla. Tämä ero oli tilastollisesti merkitsevä (p < 0,05). Tässä on todennäköisesti tapahtunut jonkinlainen tekninen virhe mahdollisesti solujen irrotusvaiheessa trypsiinillä, sillä trypsiini alkaa hajottaa soluja, mikäli soluja trypsinoidaan liian kauan. Aikaisemmissa tutkimuksissa hyvin pienitaajuisen magneettikentän yhteydestä DNA-vaurioon on saatu erilaisia tuloksia. Jin ym. (2014) eivät havainneet magneettikentän aiheuttavan DNA-vauriota yksinään eivätkä myöskään vetyperoksidin kanssa, kun taas Falone ym. (2007) havaitsivat magneettikentän ja vetyperoksidin lisäävän DNA-vauriovastetta. Positiivikontrollina happiradikaalimäärityksessä käytetty dietyylimaleaatti (DEM) aiheutti odotetusti selkeää happiradikaalituotannon nousua samankaltaisesti kuin Luukkosen ym. (2014) tutkimuksessa neuroblastoomasoluilla. Tässä tutkimuksessa käytettiin esikokeiden perusteella valittua 0,02 % DEM-pitoisuutta kolmen tunnin altistuksella, kun taas Luukkonen ym. (2014) käyttivät 0,015 % DEM-pitoisuutta tunnin altistuksella. DNA- vauriomäärityksessä positiivikontrollina käytetty metyylimetaanisulfonaatti (MMS) aiheutti selkeää DNA-vauriovastetta kuvaavan OTM-arvon nousua 50 µg/ml pitoisuudella. Sekä DCF-menetelmällä että Comet Assay–menetelmällä saatiin siis vastetta aikaiseksi positiivikontrolleilla, joten ainakin niiltä osin menetelmät toimivat C6-soluilla. Magneettikenttäaltistus lisäsi DNA-vauriovastetta, mutta laski happiradikaalituotantoa rotan glioomasoluilla. Magneettikentän vaikutusmekanismi solutason tapahtumiin voi siis olla jokin 39 muu kuin happiradikaalituotannon kautta, mutta lisätutkimuksia tarvitaan eri solulinjoilla ja spesifisemmillä menetelmillä eri happiradikaalien määrittämiseksi. Lisäksi tarvitaan tutkimuksia eri antioksidanttien eri pitoisuuksilla, jolloin mahdolliset suojaavat vaikutukset saadaan paremmin esiin. Antioksidanttikäsittelyn keston tai ajankohdan vaikutusta magneettikentän aiheuttaman happiradikaalituotannon kasvun estämiseen tulisi myös tutkia lisää. Tilastollisten analyysien perusteella havaittiin, että tilastollisesti merkitseviä eroja oli soluilla, joita oli altistettu 1 µM menadionille ja 2 mM NAC:lle sekä DNA-vauriovastemäärityksessä kontrollisolujen ja magneettikentälle altistettujen solujen välillä ilman NAC-käsittelyä (p < 0,05). Tässä on kuitenkin todennäköisesti käynyt kokeen suorittamisvaiheessa jokin virhe, kuten jo aiemmin on mainittu. Tuloksissa oli havaittavissa biologisia eroavaisuuksia, joten magneettikentällä ja menadionilla sekä antioksidantti NAC:lla oli vaikutusta solutasolla tässä tutkimuksessa, vaikka tilastollisia merkitsevyyksiä ei läheskään jokaisen eroavaisuuden välillä havaittu. 6.1 VIRHELÄHTEET DNA-vauriomäärityksessä käytetyllä Comet Assay-menetelmällä saaduissa tuloksissa kontrollisolujen OTM-arvo nousi varsin korkealle tasolle verrattuna magneettikenttäaltistettuihin soluihin. Tässä on todennäköisesti käynyt jokin tekninen virhe, joka vaatii lisäselvittelyjä. Yksi mahdollinen virhetekijä on solujen irrotusvaiheessa tehtävä solujen trypsinointi. Solut ovat mahdollisesti olleet tässä tapauksessa liian kauan trypsiinin vaikutuksen alaisena, jolloin solut ovat mahdollisesti alkaneet hajoamaan nostaen näin ollen OTM-arvoa. Soluviljelyssä ja määritysmenetelmissä sekä liuosten ja altisteiden valmistuksessa käytetyt tilavuudet ovat pieniä, joten pipetoinnissa tapahtuva pienikin poikkeama voi aiheuttaa muutoksia tuloksissa. Solutason tutkimustyö vaatii äärimmäistä tarkkuutta. Työskentely laboratoriossa sujui pääosin hyvin, olosuhteet toistojen välillä olivat samankaltaiset ja solujen elävyys pysyi hyvänä toistojen välillä, joten tuloksia voidaan pitää luotettavina. Toistojen määrää lisäämällä tulosten luotettavuutta saadaan parannettua. 40 7 YHTEENVETO Magneettikenttäaltistus vähensi happiradikaalituotantoa lähes jokaisessa tapauksessa sekä ilman menadionia että menadionin kanssa. Käytetty DCF-menetelmä määrittää happiradikaalituotantoa yleisellä tasolla, joten spesifisemmät happiradikaalit eivät välttämättä määrity käytetyllä menetelmällä. NAC:lla saatiin laskettua happiradikaalituotantoa välittömästi magneettikenttäaltistuksen jälkeen määritettynä, mutta menadionialtistuksen jälkeen estävää vaikutusta ei enää ollut havaittavissa. Magneettikenttä nosti DNAvauriovastetta kuvaavaa OTM-arvoa lähes jokaisessa tapauksessa. NAC:lla tätä vaikutusta ei pystytty estämään. Tarvitaan lisätutkimuksia eri solulinjoilla ja spesifisemmillä menetelmillä eri happiradikaalien määrittämiseksi. Lisäksi tarvitaan tutkimuksia eri antioksidanttien eri pitoisuuksilla, jolloin mahdolliset suojaavat vaikutukset saadaan paremmin esiin. Antioksidanttikäsittelyn keston tai ajankohdan vaikutusta magneettikentän aiheuttaman happiradikaalituotannon nousun estämiseen tulisi myös tutkia lisää. 41 LÄHTEET Bartsch H. ja Nair J. (2004). Oxidative stress and lipid peroxidation-derived DNA-lesions in inflammation driven carcinogenesis. Cancer Detection and Prevention 28: 385-391. Da Silva J., de Freitas T.R.O., Marinho J.R., Speit G. ja Erdtmann B. (2000). An alkaline single-cell gel electrophoresis (comet) assay for environmental biomonitoring with native rodents. Genetics and Molecular Biology 23: 241-245. D’Angelo C., Costantini E., Kamal M.A. ja Reale M. (2015). Experimental model of ELFEMF exposure: Concern of human health. Saudi Journal of Biological Sciences 22: 75-84. Di Loreto S., Falone S., Caracciolo V., Sebastiani P., DʼAlessandro A., Mirabilio A., Zimmitti V. ja Amicarelli F. (2008). Fifty hertz extremely low-frequency magnetic field exposure elicits redox and trophic response in rat-cortical neurons. Journal of Cellular Physiology 219: 334-343. Falone S., Grossi M.R., Cinque B., DʼAngelo B., Tettamanti E., Cimini A., Di Ilio C. ja Amicarelli F. (2007). Fifty herz extremely low-frequency magnetic field causes changes in redox and differentiative status in neuroblastoma cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 39: 2093-2106. Falone S., Mirabilio A., Carbone M.C., Zimmitti V., Di Loreto S., Mariggiò M.A., Mancinelli R., Di Ilio C. ja Amicarelli F. (2008). Chronic exposure to 50 Hz magnetic fields causes a significant weakening of antioxidant defence systems in aged rat brain. The International Jounral of Biochemistry & Cell Biology 40: 2762-2770. Frahm J., Lantow M., Lupke M., Weiss D.G. ja Simkó M. (2006). Alteration in cellular functions in mouse macrophages after exposure to 50 Hz magnetic fields. Journal of Cellular Biochemistry 99: 168-177. Grobben B., De Deyn P.P. ja Slegers H. (2002). Rat C6 glioma as experimental model system for the study of glioblastoma growth and invasion. Cell Tissue Research 310: 257-270. Güler G., Turkozer Z., Tomruk A. ja Seyhan N. (2008). The protective effect of N-acetyl-Lcysteine and epigallocatehcin-3-gallate on electric field-induced hepatic oxidative stress. International Journal of Radiation Biology 84 (8): 669-680. Halliwell B. (2007). Biochemistry of oxidative stress. Biochemical Society Transactions 35 (5): 1147-1150. Han D., Sen C.K., Roy S., Kobayashi M.S., Tritschler H.J. ja Packer L. (1997). Protection against glutamate-induced cytotoxicity in C6 glial cells by thiol antioxidants. The American Physiological Society 273: R1771-R1778. Henbest K.B., Kukura P., Rodgers C.T., Hore P.J. ja Timmel C.R. (2003). Radio frequency magnetic field effects on a radical recombination reaction: a diagnostic test for the radical pair mechanism. Journal of American Chemical Society 126: 8102-8103. 42 Higuchi Y. ja Matsukawa S. (1999). Glutathione depletion induces giant DNA and highmolecular-weight DNA fragmentation associated with apoptosis through lipid peroxidation and protein kinase C activation in C6 glioma cells. Archives of Biochemistry and Biophysics 363 (1): 33-42. Hoet P., Nemery B. ja Napierska D. (2013). Intracellular oxidative stress caused by nanoparticles: What do we measure with the dichlorofluorescein assay?. Nano Today 8: 223227. IARC Monographs 80. (2002). Non-ionizing radiation, part 1: Static and extremely lowfrequency (ELF) electric and magnetic fields. Ishige K., Schubert D. ja Sagara Y. (2000). Flavonoids protect neuronal cells from oxidative stress by three distinct mechanism. Free Radical Biology & Medicine 30 (4): 433-446. Jelenković A., Janać B., Pešić V., Jovanović D.M., Vasiljević I. ja Prolić Z. (2006). Effects of extremely low-frequency magnetic field in the brain of rats. Brain Research Bulletin 68: 355360. Jensen S.J.K. (2003). Oxidative stress and free radicals. Journal of Molecular Structure (Theochem) 666-667: 387-392. Jin Y.B., Kang G.-Y., Lee J.S., Choi J.-II., Lee J.-W., Hong S.-C., Myung S.H. ja Lee Y.-L. (2012). Effects of micronuclei formation of 60-Hz electromagnetic field exposure with ionizing radiation, hydrogen peroxide or c-Myc overexpression. International Journal of Radiation Biology 88 (4): 374-380. Jin Y.B., Choi S.-H., Lee J.S., Kim J.-K., Lee J.-W., Hong S.-C., Myung S.H. ja Lee Y.--L. (2014). Absence of DNA damage after 60-Hz electromagnetic field exposure combined with ionizing radiation, hydrogen peroxide, or c-Myc overexpression. Radiation and Environmental Biophysics 53: 93-101. Jokela K. (2006). Säteily- ja ydinturvallisuus, osa 6: Ionisoimaton säteily – Sähkömagneettiset kentät: 1. luku: s. 16, 18, 20–22. Karisto Oy:n kirjapaino, Hämeenlinna. Juutilainen J., Kumlin T. ja Naarala J. (2006). Do extremely low frequency magnetic fields enhance the effects of environmental carcinogens? A meta-analysis of experimental studies. International Journal of Radiation Biology 82 (1): 1-12. Kasperczyk S., Dobrakowski M., Kasperchyk J., Ostalowska A., Zalejska-Fiolka J. ja Birkner E. (2014). Beta-carotene reduces oxidative stress, improves glutathione metabolism and modifies antioxidant defense systems in lead-exposed workers. Toxicology and Applied Pharmacology 280: 36-41. Lai H. ja Singh N.P. (1997). Acute exposure to a 60 Hz magnetic field increases DNA strand breaks in rat brain cells. Bioelectromagnetics 18: 156-165. 43 Lee B.-C., Johng H.-M., Lim J.-K., Jeong J.H., Baik K.Y., Nam T.J., Lee J.H., Kim J., Sohn U.D., Yoon G., Shin S. ja Soh K.-S. (2004). Effects of extremely low frequency magnetic field on the antioxidant defense system in mouse brain: a chemiluminescence study. Journal of Photochemistry and Photobiology 73: 43-48. Lushchak V.I. (2014). Free radicals, reactive oxygen species, oxidative stress and its classification. Chemico-Biological Interactions 224: 164-175. Luukkonen J., Juutilainen J. ja Naarala J. (2008). Combined effects of 872 MHz radiofrequency radiation and ferrous chloride on reactive oxygen species production and DNA damage in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. Bioelectromagnetics 31: 417-424. Luukkonen J., Liimatainen A., Höytö A., Juutilainen J. ja Naarala J. (2011). Pre-exposure to 50 Hz magnetic fields modifies menadione-induced genotoxic effects in human SH-SY5Y neuroblastoma cells.PLoS ONE 6 (3): 1-6. Luukkonen J., Liimatainen A., Juutilainen J. ja Naarala J. (2014). Induction of genomic instability, oxidative processes, and mitochondrial activity by 50 Hz magnetic fileds in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. Mutation Research 760: 33-41. Maccarrone M., Catani M.V., Iraci S., Melino G. ja Agrò A.F. (1997). A survey of reactive oxygen species and their role in dermatology. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 8: 185-202. Markkanen A., Juutilainen J. ja Naarala J. (2008). Pre-exposure to 50 Hz magnetic fields modifies menadione-induced DNA damage response in murine L929 cells. International Journal of Radiation Biology 84 (9): 742-751. Minelli A., Bellezza I., Conte C. ja Culig Z. (2009). Oxidative stress-related aging: A role for prostate cancer?. Biochimica et Biophysica Acta 1795: 83-91. Monetti M., Villarini M., Simonucci S., Fatigoni C., Scassellati-Sforzolini G., Monarca S., Pasquini R., Angelucci M. ja Strappini M. (2005). Effects of co-exposure to extremely low frequency (ELF) magnetic fields and benzene or benzene metabolites determined in vitro by the alkaline comet assay. Toxicology Letters 157: 119-128. Miyakoshi Y., Kajihara C., Shimizu H. ja Yanagisawa H. (2012). Tempol suppresses micronuclei formation in astrocytes of newborn rats exposed to 50-Hz 10-mT electromagnetic fields under bleomycin administration. Mutation Research 747: 138-141. Naarala J.T., Loikkanen J.J., Ruotsalainen M.H. ja Savolainen K.M. (1995). Lead amplifies glutamate-induced oxidative stress. Free Radical Biology & Medicine 19 (5): 689-693. Negi R., Pande D., Karki K., Kumar A., Khanna R.S. ja Khanna H.D. (2014). Association of oxidative DNA damage, protein oxidation and antioxidant function with oxidative stress induced cellular injury in pre-eclamptic/eclamptic mothers during fetal circulation. ChemicoBiological Interactions 208: 77-83. 44 Omata Y., Saito Y., Yoshida Y., Jeong B-S., Serwa R., Nam T-g., Porter N.A. ja Niki E. (2010). Action of 6-amino-3-pyridinols as novel antioxidants against free radicals and oxidative stress in solution, plasma, and cultured cells. Free Radical Biology & Medicine 48: 1358-1365. Phillips J.L., Singh N.P. ja Lai H. (2009). Electromagnetic fields and DNA damage. Pathophysiology 16: 79-88. Reuter S., Gupta S.C., Chaturvedi M.M. ja Aggarwal B.B. (2010). Oxidative stress, inflammation, and cancer: How are they linked?. Free Radical Biology & Medicine 49: 16031616. Rollwitz J., Lupke M. ja Simkó M. (2004). Fifty-hertz fields induce free radical formation in mouse bone marrow-derived promonocytes and macrophages. Biochimica et Biophysica Acta 1674: 231-238. Sander C.S., Hamm F., Elsner P. ja Thiele J.J. (2003). Oxidative stress in malignant melanoma and non-melanoma skin cancer. British Journal of Dermatology 148: 913-922. Sansone R.A. jaSansone L.A. (2011). Getting a knack for NAC. Innovations in Clinical Neuroscience 8 (1): 10-14. Seibert H., Maser E., Schweda K., Seibert S. ja Gülden M. (2011). Cytoprotective activity against peroxide-induced oxidative damage and cytotoxicity of flavonoids in C6 rat glioma cells. Food and Chemical Toxicity 49: 2398-2407. Simkó M., Droste S., Kriehuber R. ja Weiss D.G. (2001). Stimulation of phagocytosis and free radical production in murine macrophages by 50 Hz electromagnetic fields. European Jounral of Cell Biology 80: 562-566. Singh N. ja Lai H. (1998). 60 Hz magnetic field exposure induces DNA crosslinks in rat brain cells. Mutation Research 400: 313-320. Siqueira I.R., Fochesatto C., de Andrade A., Santos M., Hagen M., Bello-Klein A. ja Netto C.A. (2005). Total antioxidant capacity is impaired in different structures from aged rat brain. International Journal of Developmental Neuroscience 23: 663-671. Sul A-R., Park S-N.ja Suh H. (2006). Effects of electromagnetic fields on structure and function of rat glioma cell line. Research Journal of Microbiology 1 (2): 124-135. Sulpizio M., Falone S., Amicarelli F., Marchisio M., Di Giuseppe F., Eleuterio E., Di Ilio C. ja Angelucci S. (2011). Molecular basis underlying the biological effects elicited by extremely low-frequency magnetic field (ELF-MF) on neuroblastoma cells. Journal of Cellular Biochemistry 112: 3797-3806. Timmel C.R. ja Henbest K.B. (2004). A study of spin chemistry in weak magnetic fields. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series A, 362: 2573-2589. Valko M., Rhodes C.J., Moncol J., Izakovic M. ja Mazur M. (2006). Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions 160: 1-40. 45 Williams R.J., Spencer J.P.E. ja Rice-Evans C. (2004). Flavonoids: antioxidants or signalling molecules? Free Radical Biology & Medicine 36 (7): 838-849. Wolf F.I., Torsello A., Tedesco B., Fasanella S., Boninsegna A., DʼAscenzo M., Grassi C., Azzena G.B. ja Cittadini A. (2005). 50-Hz extremely low frequency electromagnetic fields enhance cell proliferation and DNA damage: possible involvement of a redox mechanism. Biochimica & Biophysica Acta 1743: 120-129. Wätjen W. ja Beyersmann D. (2004). Cadmium-induced apoptosis in C6 glioma cells: Influence of oxidative stress. Biometals 17: 65-78. Zhang M., Li X., Bai L., Uchida K., Bai W., Wu B., Xu W., Zhu H. ja Huang H. (2013). Effects of low frequency electromagnetic field of proliferation of human epidermal stem cells: an in vitro study. Bioelectromagnetics 34: 74-80. LIITE 1 LIITE 1. KEMIKAALIT JA LIUOKSET Kemikaalit Agaroosi (matala sulamispisteinen) = Low Melting Point-Agarose (Sigma, Yhdysvallat) Agaroosi (normaali sulamispisteinen) = Normal Melting Point-Agarose (BioWhittaker Molecular Applications, Yhdysvallat) DCF = Dikloorihydrofluoreskiinidiasetaatti (Invitrogen Corporation / Molecular Probes, Yhdysvallat) DEM = Maleic Acid Diethyl Ester (Sigma Chemical Corporation, Yhdysvallat) Dulbecco’s Modified Eagle Mediumi (Life Technologies, Yhdysvallat) Digitoniini (Sigma-Aldrich Yhdysvallat / Saksa) DMEM = Dulbecco´s Modified Eagle Medium (Gibco, Invitrogen Corporation, Yhdysvallat) EDTA = Etyleenidiamiinitetraetikkahappo (Merck KGaA, Saksa) Eriphenol Erisan Erifenol Combi (Orion yhtymä oyj NOIRO, Suomi) ETAX Aa = Absoloitu etanoli (99,5 paino-%) (Altia Oyj, Suomi) EtOH = Etyylialkoholi (Altia Corporation, Suomi) FBS = Fetal Bovine Serum = Fetaali vasikan seerumi (Gibco, Invitrogen Corporation, IsoBritannia) Menadioni (Sigma Chemical, Yhdysvallat / Sigma-Aldrich, Belgia) MMS = metyylimetaanisulfonaatti (Sigma-Aldrich, Yhdysvallat/ Saksa) Na2HPO4 = Natriumvetyfosfaatti (Merck KGaA, Saksa) NAC = N-Asetyyli-L-kysteiini (Sigma-Aldrich, Yhdysvallat) NaCl = Natriumkloridi (Fisher Chemical, Iso-Britannia) NaOH = Natriumhydroksidi (Fisher Chemical, UK) Natriumlauryylisarkosinaatti (Sigma, UK) Penisilliini-streptomysiini-liuos = 5000 U/ml penisilliiniä ja 5000 µg/ml streptomysiiniä (Gibco, Invitrogen Corporation, Kanada) PI = Propidiumjodidi (Molecular Probes, Yhdysvallat / Molecular Probes Europe, Alankomaat) Tris Base (Sigma, USA) Triton-X-100 (Sigma-Aldrich, Saksa) Trypsiini 2,5 % Liuokset Agaroosiliuos objektilaseille: Punnitse 0,5 g NMP-agaroosia ja liuota se 50 ml PBSpuskuriin. Kiehauta varoen mikroaaltouunissa, siten että liuos on kirkasta. Tarkasta nestepinta ja täydennä tarvittaessa PBS-puskurilla. Poista pinnalta ylimääräinen geelikerros. Käytettävissä heti. DCF-HBSS: 240 µl 5 mM DCF-kantaliuos + 35 ml HBSS DCF-kantaliuos (5 mM) DMSO:ssa: Liuotetaan 14,6 mg DCF:aa 14,6 ml:aan DMSO:ta. Jaetaan 120 µl:n eriin eppendorf-putkiin ja lisätään suojakaasu N2. Kääritään parafilmi ympärille ja laitetaan folioon ja silikageelillä varustettuun purkkiin. Säilytys -20⁰C. LIITE 1 Digitoniini-kantaliuos (4 mM) MilliQ-vedessä: Tehdään ensin 40 mM kantaliuos. Digitoniinia liuotetaan 49,17 mg/ml +95⁰C MilliQ-veteen 15 minuutin ajan lämpöblokissa. 40 mM kantaliuos laimennetaan eppendorf-putkiin suhteessa 1:10 MilliQ-vedellä. Säilytys +4⁰C. Elektroforeesipuskuri (ajopuskuriliuos): 1930 ml MilliQ-vesi + 60 ml NaOH (10 M) + 10 ml EDTA (200 mM). Peitä parafilmillä ja säilytä jääkaapissa ennen käyttöä. Valmistettava samana päivänä vähintään tuntia ennen käyttöä. Hajotuspuskuriliuos: 146,1 g/l NaCl + 37,2 g/l EDTA + 1,2 g/l + 10 g/l natriumlauryylisarkosinaatti. Aineet sekoitetaan MilliQ-veteen magneettisekoittajalla mielellään vetokaapissa. Liuos on tässä vaiheessa sameaa ja vaahtoaa helposti. Liuoksen pH:ta säädetään NaOH-rakeilla, kunnes pH on 10. Samalla liuos kirkastuu. Kaadetaan litran mittapulloon ja säädetään lopputilavuuteen MilliQ-vedellä. Suodatetaan liuos 0,45 µm suodattimen läpi säilöpulloon. Säilytetään huoneenlämmössä. Hajotuspuskuri: 267 ml hajotuspuskuriliuosta + 30 ml milliQ-vesi + 3 ml Triton-X-100. Peitä parafilmillä ja säilytä valolta suojattuna jääkaapissa ennen käyttöä. Valmistettava samana päivänä vähintään tuntia ennen käyttöä. HBSS: Hank´s Balanced Salt Solution (5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 3,8 mM NaH2PO4, 2,9 mM NaHCO3) pH 7,0-7,4: 900 ml:aan MilliQ-vettä liuotetaan 0,4 g KCL, 0,06 g KH2PO4, 8,0 g NaCl, 0,35 g NaHCO3, 0,048 g NaH2PO4 ja 1,0 g D-Glukoosi. Liuoksen pH tarkistetaan ja lisätään MilliQ-vettä lopputilavuuteen 1000 ml asti. Valmis liuos streriilisuodatetaan membraanisuodattimella (Millipore 0,22 µm) steriiliin säiliöpulloon. Irrotusliuos: (0,1 % trypsiini in 0,02 % EDTA in PBS w/o Ca2+, Mg2+). Tehdään PBSpuskuriin, johon lisätään ennen autoklavointia 0,04 g EDTA/200 ml. Liuos steriloidaan autoklaavissa, jonka jälkeen lisätään 8 ml 2,5 % trypsiiniä, jolloin irrotusliuoksen trypsiinivahvuus on 0,1 %. Kasvatusliuos: 500 ml DMEM (glukoosia 1,0 g/l) + 50 ml 10 % inaktivoitu FBS + 5 ml penisilliini-streptomysiini-liuosta. Inaktivoitu FBS ja penisilliini-streptomysiini-liuos (molempien säilytys -20⁰C) lisätään juuri ennen käyttöä valmiiksi jaotelluissa erissä. Menadioni-kantaliuos 100 mM MilliQ-vedessä: Liuotetaan 0,1381 g menadionia 5 ml:aan MilliQ-vettä. Jaetaan eppendorf-putkiin ja laitetaan parafilmi putkien ympärille. Säilytettävä 20⁰C. NAC-kantaliuos (0,5 M) MilliQ-vedessä: 407,98 mg NAC + 5 ml MilliQ-vettä. NAC liuotetaan lämpimässä vesihauteessa MilliQ-veteen ja täytetään lopputilavuuteen. Liuos steriilisuodatetaan membraanisuodattimella (Millipore 0,22 µM). Jaetaan eriin. Säilytys 20⁰C. Natriumhydroksidi (10 M NaOH): 200 g/500 ml NaOH. Liuotetaan punnittu aine pienissä erissä MilliQ-veteen magneettisekoittajalla vetokaapissa. Liuos lämpenee voimakkaasti. Annetaan liuoksen jäähtyä esim. jääastiassa huoneenlämpöiseksi, kaadetaan mittapulloon ja täytetään lopputilavuuteen MilliQ-vedellä. Kaadetaan valmis liuos säilöpulloon, säilytys huoneenlämmössä. LIITE 1 Neutralointipuskuri (0,4 M Tris): 48,5 g/l Tris Base. Sekoitetaan punnittu aine MilliQ-veteen magneettisekoittajalla mielellään vetokaapissa. Säädetään liuoksen pH:ksi 7,5 väkevällä suolahapolla (J.T.Baker, Holland). Kaadetaan litran mittapulloon ja säädetään lopputilavuuteen MilliQ-vedellä. Suodatetaan liuos 0,45 µm suodattimen läpi säilöpulloon. Säilytetään huoneenlämmössä. PBS + FBS (2 %) –puskuri: 1 ml FBS + 49 ml PBS PBS = Phosphate-Buffered Saline w/o Ca2+, Mg2+ 1000 ml, pH 7,4: KCl 0,20 g/l (2,7 mM), KH2PO4 0,20 g/l (1,5 mM), NaCl 8,00 g/l (137 mM), Na2HPO4 1,15 g/l (8,1 mM) PBS-FBS: 1 ml FBS + 49 ml PBS Propidiumjodidi (PI)-kantaliuos (1,25 mM) MilliQ-vedessä: punnitaan 6,68 mg PI + 8 ml MilliQ-vettä. Jaetaan 200 µl eriin. Säilytys +4⁰C.
