Identifiering och kvantifiering av protein

Ill. Klaas 1978. Wikimedia Commons
Laboration i kemi
Illustrationen ovan
visar gelfiltrering av
två ämnen med olika
molekylstorlek.
Säkerhet
Identifiering och
kvantifiering
I experimentet påvisas först protein med hjälp av natriumhydroxid och kopparsulfat (Biuretprov), därefter används gelfiltrering med sephadexgel för att separera protein efter storlek.
Biuretprovet är en färgreaktion som beror på att kopparjoner reagerar med peptidbindningar i alkalisk lösning och bildar ett violett/blått molekylkomplex.
Sephadex är en polysackarid som sväller i vatten till ett tredimensionellt nätverk och
bildar en gel. Vid tillverkningen av Sephadex utgår man från polysackariden dextran som
bildas av bakterien Leuconostoc mesenteroides. Gelfiltrering fungerar som en omvänd sil.
De största partiklarna går igenom snabbast. Mindre molekyler tränger in i nätverket och
fastnar, medan större molekyler passerar nätverket snabbast. Fundera på vilket resultat man
kan förvänta sig baserat på den information som ges av läraren och som finns i läroboken.
Koppar är en tungmetall, som samlas upp i lämpligt kärl. 2 M NaOH är frätande. Vid stänk
i ögonen av NaOH finns risk för bestående synskada och blindhet.
Del 1
Material
Kemikaler
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Utförande
1. Gör en proteinlösning genom att röra ner en spatel albumin i 25 cm3 destillerat vatten.
2. Häll lite av provlösningen i ett provrör. Tillsätt 10 droppar NaOH-lösning och ett par
droppar CuSO4-lösning. Skaka.
3. Vilken färg visar lösningen?
4. Krossa några blötlagda ärtor i en mortel med lite vatten. Överför blandningen till ett
provrör och gör Biuretprovet enligt punkt 2. Innehåller ärtorna protein?
NaOH-lösning (ca 2 mol/dm3)
CuSO4-lösning (ca 0,5 mol/dm3)
albumin
blötlagda ärtor
spatel
provrör
liten bägare
mätglas
dropprör
mortel och pistill
Laborationen har utarbetats av
Kemilärarnas resurscentrum, 2014.
Projektet genomförs med stöd av Skolverket,
se www.bioresurs.uu.se/Vuxenwebben
Del 2
Material
Kemikaler
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
pasteurpipett av glas
bomull
sephadexgel-lösning, G25
plastpipett (er)
ca 4 cm silikonslang
påsklämma
mikrotiterplatta
NaOH-lösning (ca 2 mol/dm3)
NaCl-lösning (ca 0,15 mol/dm3)
CuSO4-lösning (ca 0,5 mol/dm3)
lättmjölk (utspädd)
Utförande
1. För ner en bomullstuss i pasteurpipetten och tryck försiktigt ihop den med en glasstav.
Det ska bildas ett lager av ca 1-2 cm bomull längst ner i pipetten. Fäst pasteurpipetten
i ett stativ.
2. Fäst en kort gummislang i pasteurpipettens nedre öppning.
3. Skaka försiktigt bägaren med sephadexgel-lösning och sug upp vätskan med plastpipett.
4. Spruta försiktigt ned lösningen i pastuerpipetten och låt överskottsvätskan rinna igenom. Stoppa vätskeflödet strax innan vätskeytan når gelfasen. Reglera flödet med en
påsklämma, som fästs på slangen vid den nedre öppningen,
5. Fortsätt att packa gelen tills gelpelarens höjd når upp till cirka halva pastuerpipetten.
6. Använd plastpipett och skölj igenom gelen med NaCl-lösning genom att fylla pasteurpipetten upp till kanten och låta lösningen rinna ut. Obs! Gelen får inte bli torr – anBomull
vänd klämman för att stanna flödet strax innan vätskan når gelens yta.
7. Tillsätt sex droppar utspädd mjölk till gelen. Öppna klämman och låt dropparna sjunka in i gelen.
Gummislang 8. Fyll kolonnen med NaCl-lösning och samla upp vätskan som kommer ut med hjälp av
med pås­
mikrotiterplattan, ca 2-3 droppar per brunn.
klämma
9. Tillsätt en droppe av vardera NaOH- och CuSO4-lösning till varje brunn. Vad händer?
10. Ställ in mikrovågsugnen på LÅG effekt och kör mikrotiterplattan tills färgförändring
inträffat (ca 15-45 sek). Vilka iakttagelser kan man göra?
Resultat och
utvärdering 1. Stämde dina förväntningar inför laborationen med resultatet? Om inte, förklara varför.
Begrepp att
känna till efter genomförd
laboration
2. Analysera det praktiska utförandet. Hur fungerar stegen i del 1 och 2 och vilken betydelse har de?
3. Ange eventuella felkällor.
4. Diskutera säkerhetsaspekterna.
5. Föreslå några nya frågeställningar och situationer när dessa laborationer kan användas.
Proteinstrukturer
Denaturering
Mjölkproteiner
Proteinrika livsmedel
Biurettest
Gelfiltrering baserad på storlek (Sephadex)
Laborationen har utarbetats av
Kemilärarnas resurscentrum, 2014.
Projektet genomförs med stöd av Skolverket,
se www.bioresurs.uu.se/Vuxenwebben