Diapositiva 1 - grupocitometria.org.ar

Diagnóstico de Trombocitopatías por CF
Dra. Fabiana Alberto
Departamento de Hemostasia y Trombosis
Instituto de Investigaciones Hematológicas
Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires
HEMOSTASIA
Conjunto de mecanismos fisiológicos que aseguran el
mantenimiento de la integridad del sistema vascular frente a la
injuria.
La hemostasia involucra:
PROTEÍNAS DE LA COAGULACIÓN (PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
SOLUBLES)
PLAQUETAS (ELEMENTOS FORMES EN SUSPENSIÓN)
ENDOTELIO VASCULAR (SUPERFICIE QUE LIMITA LA VASCULATURA)
Es un proceso dinámico, localizado en el sitio de injuria, gracias
al balance entre mecanismos de activación e inactivación que
actúan de manera coordinada.
MICROCIRCULACIÓN
Regulación de la
presión sanguínea y
distribución del flujo.
Capilares
Vénula
Arteriola
MICROCIRCULACIÓN
Zona de alta fuerza de
cizallamiento (shear
stress)
Sección
Flujo laminar
EVALUACIÓN DEL SANGRADO
ESPONTÁNEO
SITIO
Cutáneo-mucoso
Articular o muscular
VW
Hemofilia A / B
Trombocitopenia
VW tipo 3
Trombocitopatías
Déficit severos
Coagulograma normal
o alterado
Coagulograma alterado
SNC - cordón umbilical
FXIII
Coagulograma
normal
EVALUACIÓN DEL SANGRADO
POST-QUIRÚRGICO
TIPO DE SANGRADO
Babeo
Plaquetas o VWD
Napa, coágulo deficiente
Fibrinolisis
Borbotones
Sutura
MOMENTO
Inmediato o precoz
Plaquetas, VWD, factores
Tardío
FXIII, Fibrinógeno, 2 AP
Plaquetas
-Pequeñas células anucleadas (diámetro 2 m, volumen 7-9 fl)
- Concentración promedio en sangre 150 - 400 x 109 / l
- Derivan de la fragmentación de los megacariocitos
de médula ósea
- Circulan en condiciones de reposo
con apariencia de una lenteja.
- La integridad funcional del endotelio
asegura el estado de reposo gracias
a la producción de PGI2 y NO.
Plaquetas
- Producción en condiciones fisiológicas:
1011plaquetas / día
- Tiempo de vida media: 12 días
- Trombopoyetina (TPO) regula la producción.
- Síntesis de TPO: hígado, médula
y riñón.
- Eliminación de TPO: por unión de alta
afinidad sobre receptores plaquetarios y
megacariocitos.
- La producción puede aumentar hasta
10 veces si hay aumento de la destrucción
o consumo.
Plaquetas jóvenes tienen
mayor volumen plaquetario
ESTRUCTURA INTERNA
Sistema canalicular
conectado a superficie
Microtúbulos
Gránulos alfa
Gránulos densos
Glicógeno
Mitocondrias
CITOESQUELETO
MICROTÚBULOS
MALLA DE ACTINA
G-Actina
(Monomero Globulares)
F-Actina (Filamentos)
Filamina A (ABP-280),
talina,
K-actina,
miosina I y II
Gránulos alfa
Proteínas Adhesivas : VWF, Fg, Fn
Vn, TSP-1,
laminina-8
Proteínas-Coagulación : FV/Va, multimerin,
FXI, proteína S,
HMWK,antithrombina
Proteínas Fibrinoliticas : Plasminogeno, PAI-I
osteonectina,
2-antiplasmina,
TAFI
Distintas poblaciones de gránulos alfa
PROTEINAS ANGIOGENICAS
PROANGIOGENICA
- VEGF
- bFGF
- EGF
- PDGF
- EGF
- MMPs
ANTI-ANGIOGENICA
- Endostatina
- PF4
- Thrombospondin-1
-2-macroglobulina
- PAI 1
- Angiostatina
FACTORES DE CRECIMIENTO
Kisucka J et al, 2009
GRANULOS DENSOS
ADP, ATP, SEROTONINA, HISTAMINA
Ca 2+…
RECEPTORES PLAQUETARIOS DE MEMBRANA
. Glicoproteínas
. Receptores de siete dominios de transmembrana
INTEGRINAS
GP IIb-IIIa
GP VI-FcR
(receptor de fibrinógeno,
vWF)
GP Ia-IIa
(receptor de colágeno)
(receptor de
colágeno)
GP Ic´-IIa
GP Ib-IX-V
ACTIVACION
(receptor de vWF)
GP Ic-IIa
Receptores
de ADP
(P2Y1-P2Y12)
Receptores
de tromboxano
Receptores
Receptores
de ADR
de trombina (alfa-beta)
(PAR1-PAR3)
Iniciación: captura, adhesión, activación
GP Ib-IX-V
GP VI
GP Ia-IIa
Activación
de la integrina
Secreción de
gránulos
Cambios en el
citoesqueleto
Síntesis de Tx
Extensión: cohesión y secreción
Woulfe DS, 2005
“La vía final común: activación de la integrina IIb-IIIa”
GP IIb-IIIa
GP IIb-IIIa
Respuesta plaquetaria a la injuria
Iniciación: captura, adhesión, activación
Extensión: cohesión y secreción
Perpetuación: estabilización del trombo
Regulación del crecimiento y estabilidad del trombo para lograr
una respuesta óptima a la injuria
Oclusión
Volumen del trombo
Riesgo de trombosis
Crecimiento descontrolado
(hipercoagulabilidad)
Respuesta óptima
Hemostasia
Riesgo de sangrado
Falla para formar un trombo estable
Estabilidad
insuficiente
Tiempo
Regulación del crecimiento del trombo y estabilidad para alcanzar una respuesta óptima
frente a la injuria
Flujo
Capa externa,
permeable, plaquetas
ligeramente adherentes
Zona relativamente
permeable, plaquetas con
grado variable de activación
Capa interna,
impermeable de
plaquetas degranuladas
Journal of Thrombosis and Haemostasis
pages 66-75, 22 JUL 2011 DOI: 10.1111/j.1538-7836.2011.04364.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1538-7836.2011.04364.x/full#f3
Regulación del crecimiento y estabilidad del trombo
Journal of Thrombosis and Haemostasis
pages 66-75, 22 JUL 2011 DOI: 10.1111/j.1538-7836.2011.04364.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1538-7836.2011.04364.x/full#f2
GP
Ib-V-IX
Anormalidades plaquetarias
(trombocitopatías)
- de los receptores para
proteínas adhesivas
GP Ia IIa
GP VI
TXA2
GP IIb IIIa
ADR
 
- de los receptores
para agonistas solubles
- de los gránulos
- de los mecanismos de
transducción de señal
- de los fosfolípidos procoagulantes
- de las proteínas del
citoesqueleto
- misceláneas, desórdenes
no caracterizados
ADP
IIa
Agregometría
Agonistas de uso común:
ADP (2.5-5.0 µM)
Agonistas especiales:
ADR (10.0 µM)
TRAP, activador del receptor de IIa (10.0 µM)
Colágeno (1.0 µg/ml)
U46619, análogo del tromboxano, (1.0 µM)
Acido araquidónico (0.5 mM)
Ionóforo de calcio (1.0 µM)
Ristocetina (0.5 y 1.2 mg/ml)
ADP
% de agregación
máxima
ADR
AA
colágeno
AJUSTES BÁSICOS DEL SOFTWARE
ADQUISICIÓN
10000 eventos
CELL-QUEST
ESCALA DE FCS/SSC
UMBRAL DE FCS
ACTIVACIÓN PLAQUETARIA: CAMBIO DE FORMA Y AGREGACIÓN.
Plaquetas sin estimular
Plaquetas estimuladas con ADP
Plaquetas
agregadas
Ausencia de
agregados
Plaquetas estimuladas en presencia de un antiagregante
CITOMETRÍA DE FLUJO
RECEPTORES DE SUPERFICIE
MARCADORES INTRAPLAQUETARIOS
MARCADORES DE ACTIVACIÓN
FUNCIONALIDAD y …………..
ESQUEMA BÁSICO DE MARCACIÓN
TOMA DE MUESTRA - 5 mL
ANTICOAGULANTE (CITRATO DE Na, ACD, EDTA-SO4Mg )
SE
PRP
PL
DILUCIÓN
100.109 PLAQ/L
TRAZADORES
+ 45L BUFFER + 5L PLAQ.
FLUORESCENTES
FIJACIÓN y DILUCIÓN
Trombocitopatías hereditarias
Anomalías de los receptores para proteínas adhesivas
. GP IIb/IIIa: Tromboastenia de Glanzmann
. GP Ib-V-IX: - Bernard-Soulier
- von Willebrand tipo plaquetario
. GP Ia/IIa
. GP VI
. GP IV
TROMBOASTENIA DE GLANZMANN
GLICOPROTEINA IIb-IIIa
• Heterodimero calcio dependiente
• Integrina mas abundante en superficie
• Receptor de Fibrinogeno, vW, Fibronectina
ALTERACIONES DE LA GP IIb-IIIa
• Ausencia del receptor en superficie
• Disminución del número de receptores
• Incapacidad de fijar Fibrinógeno
• Retracción del Coagulo anómala
IIHEMA-ANM
Agregación ADP 5 μM (TG)
Agregación y liberación con colágeno 8 ug/ml (TG)
TROMBOASTENIA DE GLAZMMAN: MARCACION EN
SUPERFICIE
KG
KG
MM
MM
RETRACCION DEL COAGULO (TG)
CUANTIFICACION DE GP DE MEMBRANA PLAQUETARIA
CytoQuantTMGp ( Stago)
Microesferas: gráfico de puntos
FSCH vs SSCH
Histogramas de fluorescencia
D
B
A
Marker Media Nº GP/esferas
M1 (D) 1201
63000
M2 (C) 466
19000
M3 (B) 112
4500
M4 (A)
8
350
Moléculas de
Gp/plaq.
C
IMF
Leytin V, 1996
Relación de densidades
CD 61 (IIIa)
densidad de expresión de CD 61
3.0
Paciente
log FL1
Normal
2.5
2.0
1.5
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
log FSH
Dn: anti-log 1.204 = 16.0
Dp: anti-log 1.285 = 19.3
Dp/Dn x 100: 19.3/16.0 x 100 = 120%
Best-fit values
Slope
Y-intercept
X-intercept
1/slope
95% Confidence Intervals
Slope
Y-intercept when X=0.0
X-intercept when Y=0.0
Goodness of Fit
r²
Sy.x
normal
paciente
0.6948 ± 0.01882
1.204 ± 0.03258
-1.733
1.439
0.6429 ± 0.02894
1.285 ± 0.04456
-1.999
1.555
0.6138 to 0.7757
1.064 to 1.344
-2.186 to -1.374
0.2752 to 1.011
0.7189 to 1.851
-6.697 to -0.7147
0.9985
0.01657
0.9980
0.01488
Monitoreo terapia de reemplazo
con concentrado de plaquetas,
previo a cirugía, en paciente
con TG.
Before surgery
After surgery
1 st
1 st
2 nd
2 nd
3 rd
3 rd
Negative Patient
Negative
IIb-IIIa control
IIb-IIIa Patient
13-05-2005-BORDEAUX
TROMBOCITOPENIAS HEREDITARIAS
Plaquetas de tamaño pequeño
. Síndrome de Wiskot-Aldrich
. Trombocitopenia ligada al cromosoma X
Plaquetas de tamaño normal
. Trombocitopenia amegacariocítica congénita
. Trombocitopenia autosómica dominante
Plaquetas de tamaño grande
.Síndrome de Bernard Soulier
.Relacionadas al MYH9 (Síndrome de Sebastian, Síndrome de Fechtner,
Síndrome de Epstein, Anomalía de May-Haegglin)
.Síndrome de plaquetas grises
.Macrotrombocitopenia del Mediterráneo
.Pseudo von Willebrand o von Willebrand tipo plaquetario
Macroplaquetas en trombocitopenia
macroplaqueta
plaqueta normal
BERNARD SOULIER
•Ausencia del complejo GP Ib-IX-V
•Autosómico recesivo, infrecuente
•Con-sanguinidad, Cromosoma 17, 23 y 3
•Sangrado moderado a importante
•Trombocitopenia
•Plaquetas de mayor tamaño y deformables
•Sobrevida plaquetaria acortada
BERNARD SOULIER
• Tiempo de sangría prolongado
• Adhesividad ausente
• Agregación ausente con Ristocetina, Botrocetina y
von Willebrand bovino
GP IX CD42a
• Antígeno CD42
GP Ib CD42b y CD42c
GP V CD42d
Paciente de 6 años, sexo femenino, que consulta por trombocitopenia crónica.
Epistaxis desde el año y medio de edad, bilateral, con internación y
requerimiento transfusional. Hematomas fáciles. No hubo sangrado con caída
del cordón umbilical. Sin antecedentes de consaguinidad.
Síndrome de BERNARD SOULLIER
Paciente
P
P
CD42-b
Dispersión frontalTamaño (FSH)
P: 202
Madre: 65
Control: 47
CD42-b (GP Ib)
(IFM)
P:25
Madre: 171
Control: 257
Relación CD42b/FSH
P: 0.12
M: 2.6
C: 5.5
Madre
CD61
P
CD61 (GP IIIa)
(IFM)
P: 389
Madre: 176
Control: 167
Relación CD61/FSH
P: 1.93
M: 2.7
C: 3.6
27/05/1987. Paciente de 52 años, sexo masculino, que consulta por hemorragia post extracción
dentaria que requirió internación y transfusión en 1960. Presentaba sangrado profuso por heridas. En
su familia una hermana presentaba epistaxis. Sus dos hijos no tenían manifestaciones de sangrado.
Los estudios mostraron TS cohibido a los 10 minutos, leve trombocitopenia, ausencia de agregación
con ristocetina que no corrigió con PN. Debe operarse de vesícula.
Diagnóstico: trombocitopatía severa con sospecha de síndrome de Bernard-Soulier.
5/08/2008. El paciente no se operó ni se atendió en ningún centro durante este período.
Recuento de plaquetas: 124.000 mm3
Citometría
Paciente: 114 media FSH
Control normal: 49 media FSH
Citometría
CD42b: dos poblaciones con diferente nivel de
expresión de Ib, una que representa 70% del total
de las plaquetas del paciente con 22% de densidad
respecto del normal. La segunda población (30%),
con 4% de densidad respecto del normal
CD61: idéntico nivel de expresión respecto del
normal
Trombocitopatías hereditarias
GP Ib-V-IX:
- von Willebrand tipo plaquetario (PT-VWD)
Desordem hemorrágico, raro, autosómico dominante, debido
a una mutación en GP Ib que produce una aumento de
afinidad por el facotr de von Willebrabd (VWF). Con
frecuencia se diagnostica mal como VWD2B por las
similitudes entre estas condiciones.
Unión de VWF a plaquetas en presencia de concentraciones
crecientes de ristocetina.
Azul: PRP normal + ristocetina 1.2 mg/ml
Rojo: PRP de paciente con VWD-PT
Gris: PRP de pacientes con VWD-2B (n:4)
Agregación con ristocetina
Giannini S, 2010
Ensayos de mezclas para agregación y CF
Unión de VWF a plaquetas en presencia de de
ristocetina 1mg/ml en mezclas de plaquetas
lavadas y plasma.
Rojo: plaquetas lavadas control + plasma control
Verde: plaquetas lavadas control + plasma paciente
Negro:Plaquetas lavadas paciente + plasma paciente
Azul: plaquetas lavadas paciente + plasma del control
Giannini S, 2010
TROMBOCITOPENIAS HEREDITARIAS
Relacionadas al MYH9
(Síndrome de Sebastian, Síndrome de Fechtner, Síndrome de Epstein, Anomalía de May-Haegglin)
IIHEMA-ANM
MYH9 ?
FSH
Dispersión frontalTamaño
(FSH)
P: 152
Control: 66
P
CD42-b
CD42-b (GP Ib)
(IFM)
P
P: 145
Control: 63
Relación 42b/FSH
P: 0.95
C: 0.95
CD61
P
CD61 (GP IIIa)
(IFM)
P: 463
Control: 168
Relación 42b/FSH
P: 3.04
C: 2.54
Hipótesis de sangrado en MYH9
Densidad de expresión de glicoproteínas en macrotrombocitopenias
El análisis molecular revela una nueva mutación
en el gen de β3 que determina una deleción,
produciendo la pérdida de los aminoácidos 647686 del ectodominio de la integrina β3.
CD41
CD61
Paciente: negro
Normal: blanco
Control negativo: gris
CD61
Gresele P et al. Haematologica 2009;94:663-669
Trombocitopatías hereditarias
Anomalías de los de los gránulos
plaquetarios
. Déficit de gránulos densos: déficit de pool de depósito, HermanskyPudlak, Chediak Hygashi, TAR, Wiskott-Aldrich.
. Déficit de gránulos alfa: Gray, White, Quebec, Paris-TrousseauJacobsen.
. Déficit combinado alfa y densos
MARCACION INTRAPLAQUETARIA
Fg
Vw
PRP, SE (EXTRACCIÓN CON EDTA 2% o
CITRATO)
GP
ADP
ATP
MEPACRINA, (QUINACRINA MUSTARD, 0.2
mM CF)
PRP (300.000/ul) 5 ul en
50 ul de tampón isotónico
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
40L BUFFER, 5 L MEPA, 5 L PlQ.
40L BUFFER, 5 L BUFFER, 5 L PlQ.
INCUBACIÓN-40min
MEPACRINA
PACIENTE
NEGATIVO
MEPACRINA
NORMAL
LAVADO
CITÓMETRO
MARCACION INTRAPLAQUETARIA
PERMEABILIZACION
SAPONINA 1%
FIJACION PFA 1%10 min
Fg
Vw GP
ADP
ATP
ADP
ATP
Fg
Vw
GP
Superficie
IIb
Marcación:
Superficie
IIIa
- CN adecuados
- Controles
positivos de
permeabilización
Total
IIb
Total
IIIa
Control de
permeabilización
CD63
SÍNDROME DE GRAY
Nurden, P. et al. Blood 2004;104:107-114
control
PACIENTE
a-Fg INTRAPLAQUETARIO
IIHEMA-ANM
Trombocitopatías hereditarias
Anomalías en las vías de transducción de señales
. Anomalías en la vía del AA/ tromboxano A2
. Defecto en la movilización del Ca 2+
. Deficiencia en proteínas G (GQ)
. Defectos en la fosforilación de
plecstrina y metabolismo
del fosfatidilinositol…
ect, ect, ect
MOVILIZACION DE CALCIO

Ca 2+

AGONISTA


Orai 1
PLC
RIAM KLENDIN3
PIP 2
IP 3
RE
Ca 2+
Ca 2+
Ca 2+
IP3-R
DAG
+
Ca 2+
PKC
CALDAGGEFI
Rap1 GTP TALIN
Rap1 GDP
TALIN
KLENDIN3
MOVILIZACION DE CALCIO
Sbrana S, Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 74B:30–39 (2008)
MOVILIZACION DE CALCIO
Adquisición de las muestras
Escala lineal:
• para intervalos regulares
• apropiada para señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000)
Escala logarítmica:
• para intervalos crecientes
• cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-10.000)
MOVILIZACION DE CALCIO
Acetoximetil éster (AM) del Fluo-3
METODOLOGÍA:
PL en Buffer con
Ca2+ ( 1mM)
Incubación con FURA-2
Lavado, Resuspensión
Control positivo: ionóforo
de calcio
Evitar el exceso de marca:
- disminuye la
sensibilidad
- puede resultar en
compartimentalización del
colorante
Col 8g / mL
Sin estímulo
Col 1g/mL
IIHEMA-ANM
MOVILIZACION DE CALCIO
Acetoximetil éster (AM) del Fluo-3
BUFFER
+ Thr
HT + Thr
BERMEJO E et al, 2003
Trombocitopatías hereditarias
Anomalías de los receptores para agonistas solubles
. Receptor de tromboxano A2
. Receptor adrenérgico
. Receptor del ADP, P2Y12
REACTIVIDAD DEL RECEPTOR P2Y12
KIT-BIOCYTEX-CF
ADP
AC
P2Y12
PGE1
AMPc
PKA
VASP
Anticuerpo anti VASP-P
VASP-P
PLAQ. INHIBIDAS
PLAQ. ACTIVADAS
MULLER i, 2003
BARRAGAN P, 2003
Flow cytometric analysis of intraplatelet VASP phosphorylation for the detection of
clopidogrel resistance in patients with ischemic cardiovascular diseases
( IFM
PGE
- IFM PGE+ADP )X100 = IRP
IFM PGE.
J Thromb Haemost 2005
TERAPÉUTICA:
resistencia al clopidogrel
DIAGNOSTICO:
alteraciones en el receptor de P2Y12
J Thromb Haemost 2010
J Thromb Haemost 2005
Marcadores de activación plaquetaria
Activación plaquetaria asociada a cambios en el flujo
Flujo estenótico
Aceleración
Desaceleración
Turbulencia
Placa
Activación plaquetaria asociada a endotelio activado
Marcadores de activación plaquetaria
Michelson AD (Platelets, Second Edition)
Aplicación de la citometría de flujo
Marcadores de activación plaquetaria:
- expresión de marcadores de activación en la superficie de la
plaqueta (ex vivo)
CD62P
P-selectina
% positivos
golll
IMF
Condiciones analíticas de difícil
estandarización:
- anticoagulantes
- tiempo de ensayo
- controles negativos adecuados
- expresión de resultados
(% de eventos positivos,
intensidad media de fluorescencia)
- escasas referencias de CV intra e
interensayo
RESULTADOS EN SMP (TE, PV)
20
%positive platelets
CD62
CD63
B-FG
15
10
5
0
Controls
Patients
Controls
Patients
Controls
Patients
BERMEJO et al, Blood Coagul Fibrinolysis 2004; 15:1–6
CINETICA DE UNIÓN
DE RECEPTORES: PAC-1, a-FG, a-VWF, GPs
DE ACTIVACION: CD62P, CD63
AGONISTAS:
ADP 20M, Thr 1 a 5 U/ml, TRAP
IIHEMA-ANM
Marcadores de activación plaquetaria
Activación de las plaquetas in vitro con
agonistas en concentraciones subumbral para evidenciar hiperreactividad
plaquetaria
% de positividad
100
IFM PAC-1 (aspirina)
IFM PAC-1 (SPD)
IFM PAC-1 (normal)
trombocitemia
80
IFM PAC-1
(trombocitemia)
normal
60
SPD
40
aspirina
20
0
0
5
10
15
Tiempo (minutos)
20
25
Hipercoagulabilidad e inflamación
Inflamación y hemostasia son procesos íntimamente ligados. Cada uno
propaga e intensifica al otro. Cuando fallan los mecanismo de control, se
genera el potencial para un círculo vicioso de trombogénesis e inflamación.
AGREGADOS MIXTOS
PLAQ-LEUCO
DNA CD66b CD42
DNA CD66b CD42
AGREGADOS MIXTOS
PLAQ-LEUCO: ACTIVACION CON TRAP
MICROPARTICULAS PLAQUETARIA: <1 μm/Annexin V+
Activación plaquetaria mediada por anticuerpos:
“Trombocitopenia inducida por heparina,
anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”
- Factor plaquetario 4
- Anexina V
Tomer A, 1999
Control
positivo
Anexina V
Tomer A, 1999
Activación plaquetaria mediada por anticuerpos:
“Trombocitopenia inducida por heparina,
anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”
Tomer A, 1999
CD41 (IIb)
Generación de ROS y contenido de GSH de
plaquetas normales y talasémicos
Especies reactivas del oxígeno (ROS): 2’-7’ diclorofluoresceína diacetato
(DCF), liposoluble, pierde los grupos acetato en el interior de la célula, no
puede salir, no fluorescente, cuando se oxida por efecto de los ROS emite
fluorescencia en canal verde.
Glutatión reducido (GSH): mercury orange, se une de manera covalente a
sulfidrilos(grupos(R–SH), emite fluorescencia en canal rojo.
Amer J, 2004
DETERMINACIÓN DE ROS / GSH
IFM 3
92
M1
50
IFM 170
M1
IFM 230
M1
M1
PL+ H2O2 + HON
PL + H2O2 + BUFFER
PL + H2O2 + BUFFER
PL+ H2O2 + HON
ROS- DCF
-2-7-DICHLOROFLUORESCIN ACETATE
GSH-MO
-MERCURY ORANGE
PROTOCOLO
-1 MARCAR CON DCF
-2 LAVAR
-3 TRATAMIENTO (H2O2, Buffer, HON)
PROTOCOLO
-TRATAMIENTO (H2O2, Buffer, HON)
-MARCAR CON MO
-LAVAR
M1
TROMBOCITOPENIA INMUNE
CAUSA:
Destrucción plaquetaria por anticuerpos
que reconocen glicoproteínas específicas
de la menbrana plaquetaria:IIb-IIIa, Ib-IX, Ia-IIa
IgG
PLAQUETAS NORMALES
1
Pool intraplaquetario
(IgG totales plaq.)
20.000 moléculas
gránulos plaquetarios,
adquiridas por pinocitosis
2
Pool de superficie
(IgG asociada a sup. Plaq.),
100 moléculas,
unión de anticuerpos naturales
que reconocen estructuras
modificadas sobre plaquetas
viejas.
INMUNOGLOBULINAS
METODOLOGIAS
•EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS TOTALES
•EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS ASOCIADOS
A SUPERFICIE :
inmuno-radiometría
inmuno-fluorescencia directa
MAIPA y PAICA (especifidad del anticuerpo)
Apectos metodológicos
-Obtención del plasma rico en plaquetas
- Lavado de plaquetas
-Anticuerpos: marcadores de población CD 41, CD 42,
empleo de Ac anti-Igs F(ab)2
-Controles: control negativo de marcación,
procesamiento en paralelo de por lo menos dos
muestras normales
-Expresión de resultados:
-IFM ajustando a región de FSH constante
-2-INDICE: IFM / FSCH
-Valores de corte: IgG 11.0 IFM, IgM 6.0 IFM
Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria:
detección por citometría de flujo
Media: 36
Control
normal
M1
Paciente
CD41+
Media: 92
M1
Control normal
IgG
10 IFM
Negativo
3 IFM
IgM
3 IFM
Paciente
Negativo
3 IFM
M1
M1
IgG
34 IFM
IgM
31 IFM
Caso clínico:
Paciente de sexo femenino de 81 años con antecedentes de psoriasis que
comienza hace un año con hematomas fáciles en miembros y tronco,
sangrado en lesiones descamativas y episodios frecuentes de epistaxis que
requieren en varias oportunidades tratamiento con taponamiento y
cauterización.
Derivada con diagnóstico presuntivo de Tromboastenia de Glanzmann.
No tiene antecedentes de hemorragia post parto ni post exodoncia.
TAC de cuello, tórax, abdomen y pelvis, proteinograma electroforético
pendientes.
Laboratorio IIHEMA
Fecha
Plaquetas
TS
(Ivy)
Adhes
.
Lisis
TTPA
22-11-11
239 x
109/L
2 min
8%
140 min
42
23-02-12
245 x
109/L
-
-
-
-
-
-
-
-
05-03-12
237 x
109/L
-
-
-
-
-
-
-
18 min
(cohibido)
TP
VIII
vWF:A
g
vWF:RCo
90%
110%
175%
154%
Agregación 22-12-2011
Agregación 22-12-2011
Liberación
disminuida
Liberación
disminuida
Paciente derivada de otro centro que reporta un estudio de agregación
tipo Tromboastenia de Glanzmann…
Se convirtió en un SPD ????
Agregación 23-02-2012
Cambio de forma
Liberación
disminuida
Liberación
disminuida
Cambio de forma
Volvimos al Glanzmann ???
Citometría de flujo
Paciente
Control normal
FSH: 47 (media)
CD 41 (GP IIb): 103.2 IMF
CD 61 (GP IIIa): 156.3 IMF
CD 42b (GP Ib): 198.7 IMF
FSH: 56 (media)
CD 41 (GP IIb): 100.9 IMF
CD 61 (GP IIIa): 173.0 IMF
CD 42b (GP Ib): 180.0 IMF
Tromboastenia de Glanzmann
- Hereditarias
Retracción
coágulo
GP IIbIIIa
Fibrinógeno
plaquetario
Tipo I
ausente
ausente
ausente
Tipo II
disminuida
> 5%
30-60%
Variantes
- Adquiridas
Alt.cualitativas
Agregación 05-03-2012
Trombastenia de Glanzmann !!!
Agregación 05-03-2012
Estudio de mezclas para
detectar efecto inhibitorio
Plasma paciente
Partes iguales de PRP normal
y PPP paciente.
Partes iguales de PRP normal
y PPP normal no autólogo
(control).
Plasma control
Plasma paciente
Plasma paciente
Agregación 05-03-2012
50%PRP N
+
50%PPP N (no autólogo)
50%PRP N
+
50%PPP paciente
% inhibición agregación
m axim a
Inhibición de agregación en
PRP normal
100
50%
75
25%
50
12.5%
25
6.25%
0
0
10
20
30
40
50
%PPP paciente en la mezcla
Inhibición dosis-dependiente,
No potencia con incubación (1hora 37º)
60
Inmunoglobulinas asociadas a plaquetas 05-03-2012
Marcación directa sobre plaquetas lavadas con anti-IgG humana, anti-IgM humana. Selección de
la población que marca para CD42 (GP Ib).
Control
CD42+
R1
anti Ig-G
Paciente
R2
anti Ig-G
176.5 IMF
10.4 IMF
anti Ig-M
CD42+
anti Ig-M
Inmunoglobulinas asociadas a plaquetas 08-03-2012
Marcación indirecta: plaquetas normales enfrentadas a plasma del paciente o plasma normal no
autólogo, lavadas y resuspendidas medio tamponado. Luego marcación con anti-IgG humano o
anti-IgM humana. Selección de la población que marca para CD42 (GP Ib).
Plaq normales CD42+
Plasma control
Plaq normales
Plasma paciente
R1
CD42+
R2
anti Ig-G
anti Ig-G
23 IMF
anti Ig-M
anti Ig-M
240 IMF