HEMOGRAMA AUTOMATIZADO

HEMOGRAMA
AUTOMATIZADO
BQCO. GONZALO OJEDA
HEMATOLOGÍA CLÍNICA
FaCENA – UNNE
2013
AUTOMATIZACIÓN EN
HEMATOLOGÍA
Exactitud
Precisión
Rapidez
Standarización
Screening
TOMA DE MUESTRA Y
PROCESAMIENTO
Sangre entera(EDTA-K3)
Volumen requerido
Procesamiento dentro de
las 8 h
Conservar refrigerada
Temperatura ambiente
PRINCIPIOS DE MEDICION
Impedancia Eléctrica
Espectrometría de Absorción
Citometría de Flujo
Dispersión óptica
Fluorescencia
Citoquímica: Peroxidasa
EQUIPOS
IMPEDANCIA + ESPECTROMETRÍA
ABSORCIÓN : COULTER (RBC-INDICE
HEMATIMÉTRICOS – PLT – WBC – HB)
IMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA +
ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN: 3
DIFF
IMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA +
ESPECTROMETRÍA + DISPERCIÓN DE
LUZ/FLUORESCENCIA/ OTRA : EQUIPOS
5 DIFF
PRINCIPIO COULTER
 Wallace Coulter (1913-1998)
IMPEDANCIA ELECTRÓNICA Y
RADIOFRECUENCIA
Impedancia electrónica o la resistencia a la
corriente continua (cc) de bajo voltaje fue
desarrollada por Wallace Coulter en la
década de 1950 y es la metodología
utilizada con mayor frecuencia
La radiofrecuencia (RF) o la resistencia a la
corriente electromagnética de alto voltaje a
veces se utiliza junto con la impedancia
electrónica de la CC.
IMPEDANCIA ELECTRÓNICA
El principio de impedancia en el recuento
de células se basa en la detección y
medición de cambios en la resistencia
eléctrica producida por las células cuando
atraviesan una apertura pequeña
Las células suspendidas en un diluyente
conductor de la electricidad ,se arrastran a
través de una apertura (orificio) en un tubo
de vidrio
RECUENTO DE
PLT Y RBCs
Impedancia Volumétrica
N° Pulsos :proporcional al N° de células
Amplitud del pulso :proporcional al tamaño
de la célula
El numero de pulsos es proporcional
al numero de células contadas
El tamaño del pulso de voltaje es
proporcional al tamaño de la célula
(volumen)
Lo que permite la discriminación y el
conteo de células de tamaño
especifico
INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.
CLASIFICACION DE LOS IMPULSOS
ELECTRICOS GENERADOS POR RBC Y
PLT.
RBC`s
Plaquetas.
Los pulsos se reúnen y ordenan
(canalizan) según su amplitud mediante
analizadores de la altura de pulsos
Los datos se trazan en un grafico de
distribución de frecuencias o histograma
de distribución de tamaño con el numero
relativo en el eje de las y el tamaño (
numero del canal equivalente al tamaño
especifico) en el eje de las x
El histograma producido representa la
distribución del volumen de las células
contadas
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
Histograma de Eritrocitos
INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.
INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.
Limite flotante
para división de
PLQ/RBC
Media
MCV
Ancho de Distribución
Conteo por impedancia: RBC y PLT
MCV
PLQ's
Zona Microcitica.
Zona Macrocitica.
Linfocitos.
50
100 150 200 250 300 350
Conteo por impedancia: RBC y PLT.
PLQ's
Ancho de Distribución
Eritrocítica.
50
100 150 200 250 300 350
ADE – RDW – INDICE DE
ANISOCITOSIS
La amplitud de distribución eritrocitaria (RDW)
se calcula a partir del histograma como el
coeficiente de variación de la distribución del
volumen eritrocitario. Con valores de
referencia de 11.5-14 %
El RDW es un índice de anisocitocis, que en
realidad refleja la relación entre la desviación
estándar y el VCM
El VCM es un promedio tomado de los datos
de distribución eritrocitaria de tamaño.
¿Qué significa RDW?
“RDW – Ancho de la distribución de la curva de los eritrocitos ”
 Dos
fórmulas matemáticas usadas para describir la variación
de tamaño de los eritrocitos (Anisocitosis).
RDW-CV
Definición: Es el coeficiente de
variación alrededor de la media
(X) correspondiente a la curva
de distribución del volumen de
los glóbulos rojos
VR: 11.5 – 14 %
RDW-SD
Definición: Medida directa (en fl) del ancho de la
curva de los glóbulos rojos (RBC) Tomada 20%
arriba de la línea base
El ancho es medido al 20% de la altura relativa. A
esta altura es donde se encuentra la mayor
variación de tamaños de las células
RDW-SD
Histograma de Eritrocitos
Altura
relativa
La curva más ancha
Representa a la población
Con mayor anisocitosis
20%
Tamaño de los Eritrocitos en fl
Conteo por impedancia: RBC y PLQ.
Macrocitosis.
50
100 150 200 250 300 350
Conteo por impedancia: RBC y PLQ.
Macrocitosis.
MCV aprox. de 102 fl
50
100 150 200 250 300 350
Conteo por impedancia: RBC y PLQ.
Microcitosis.
50
100 150 200 250 300 350
Conteo por impedancia: RBC y PLQ.
Microcitosis.
MCV Aprox de 70 fl
50
100 150 200 250 300 350
FACTORES QUE PRODUCEN
INTERFERENCIA
FACTORES
PARÁMETRO
AFECTADO
Crioaglutinina
GR ,VCM ,CHCM
Aglutinaciòn de GR
Lipemia ,ictericia
,quilomicrones
Hb
La turbidez afecta la
lectura
espectrofotomètrica
HbCM
Hemólisis
GR , Hto
Gr lisados y no
contados
GR resistentes a la
lisis con Hb
anormales
GB , Hb
Gr (Hb : S,C,F) no
pueden lisarse y se
cuentan como GB
Microcitosis o
esquistocitos
GR
El tamaño
eritrocitario < que el
umbral
GR nucleados
,fragmento de
Megacariocitos
GB
Se cuentan como GB
Histograma de plaquetas.
Histograma de plaquetas.
Límite para la Zona para
cálculo del
zona de
. VPM
plaquetas.
2 fl
Plaquetas
Límite flotante
para división de
PLQ/RBC
35 fl
Histograma normal de plaquetas.
2
5
10
15
20
25
30
35
INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.
Histograma normal de plaquetas.
El punto de partida debe ser 2 fl en la
base del histograma.
2
5
10
15
20
25
30
35
INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.
Histograma normal de plaquetas.
El VPM es la media
aritmética de la población de
plaquetas.
No será calculado en
presencia de alertas de
plaquetas.
2
5
10
15
20
25
30
35
INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.
Histograma normal de plaquetas.
El histograma debe hacerse
asintótico con la horizontal hacia
los 25-30 fl
2
5
10
15
20
25
30
35
ALARMAS PARA RBC Y PLT
RBC/MORPH
LRI
URI
LURI
PSEUDOAGLUTINACIÓN CON
EDTA
IMPORTANCIA DEL FROTIS DE
PUNTA DE AGUJA
RECUENTO VS ESTIMACIÓN
RECUENTO POR
IMPEDANCIA DE
WBC
RECUENTO DE LEUCOCITOS
 El conteo se realiza en un transductor de Von Behrens.
 Los impulsos eléctricos detectados son clasificados y
almacenados en un histograma con canales de 1 fl de ancho
SOBREESTIMACIÓN POR
PRESENCIA DE
ERITROBLASTOS
 Ej: WBC 30.000 /mm3
200 eritroblastos por cada 100 GB
300 (WBC+EB)-----------100
30.000 ---------------------x=10.000
Gb corregidos= Gb contador – (Gb contador x 100)
(EB+100)
Conteo por impedancia: WBC.
Histograma Normal de Leucocitos por
Impedancia.
50
100 150 200 250 300 350
Conteo por impedancia: WBC.
Histograma Normal de Leucocitos por
Impedancia.
LIM
50
MID
GRAN
100 150 200 250 300 350
Conteo por impedancia: WBC.
Histograma Normal de Leucocitos por
Impedancia.
Ubicación Normal del pico
LIM es entre 50-75 fl
50
100 150 200 250 300 350
Conteo por impedancia: WBC.
Histograma Normal de Leucocitos por
Impedancia.
MID
50
La región MID debe ser
un valle entre las
regiones LIM y GRAN.
100 150 200 250 300 350
ALARMAS
DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Se utiliza el sobrante de la dilución con que se
realizó el conteo de WBC.
Método de la Cianmetahemoglobina
Se realiza la lectura en la celda de
hemoglobina a 540 nm con un blanco para
cada muestra.
El valor de absorbancia obtenido se interpola
en la curva de calibración almacenada en el
instrumento.
DISPERSIÓN
ÓPTICA
Una corriente de muestra centrada en forma
hidrodinámica se dirige a través de un
cuarzo para flujo celular por el que pasa una
fuente de luz centrada (un láser de helio
neón polarizado en sentido vertical). La luz
dispersada se divide en varios ángulos
Se utilizan varias combinaciones de estas
mediciones para diferenciar y cuantificar las
cinco subpoblaciones leucocitaria principales
:neutrófilos ,linfocitos ,monocitos , eosinófilos
y basófilos
Enfoque hidrodinámico
Minimiza la
acumulación de
proteínas
Elimina la circulación
retrograda
Reduce la
irregularidad de la
altura de pulso
Reduce la perdida
por pasaje
coincidente
Enfoque analítico
Iluminado por medio de
un laser helio neón
Enfocado
hidrodinámicamente a
traves de una celda de
flujo de diseño especial
Medición de las
carácteristicas de
dispersión óptica de la
luz para las celdas
individuales
Separación por dispersión polarizada
con múltiples ángulos (M.A.P.S.S).
-La dispersión frontal de luz 0° :se usa para
determinar el TAMAÑO CELULAR (FORWARD
SCATTER)
-La dispersión ortogonal de 90° : para determinar
la LOBULARIDAD CELULAR. (SIDE SCATTER)
-La dispersión de la luz en ángulo estrecho de
10°:se correlaciona con COMPLEJIDAD
CELULAR (SIDE SCATTER)
-La dispersión de luz despolarizada de 90° (90D)
para evaluar la GRANULARIDAD CELULAR.
 El citograma MAPSS
final muestra los eventos
de celdas individuales
los cuales se definen por
medio del uso del color
TECNOLOGIA CVS
La muestra una vez tratada es dirigida a una
celda de flujo (Flow cell) en la cual por el diseño
hidrodinámico, los leucocitos se alinean y pasan
formados uno a uno y en donde se realizan las
siguientes mediciones
 Volumen
 Mediante impedancia de baja frecuencia se determina el
volumen de la célula
 Impedancia (resistencia a la cc de bajo voltaje)
 Conductividad
 La densidad interna de la célula es proporcional al
tamaño del pulso o al cambio de la señal de
Radiofrecuencia
 RF(ola resistencia a la corriente magnética de alta
voltaje)
 Scatter
 La dispersión (scatter) de luz láser indica la estructura y
forma de la célula
Los cambios de voltaje de CC y RF pueden
detectarse en forma simultánea
Pueden graficarse en forma comparativa la impedancia y la conductividad :se forma
Un citograma de distribución bidimensional ,este trazado de dispersión muestra poblaciones
celulares como cúmulos <por análisis computarizado se determinan los recuentos celulares
 DF1: Volumen vs. Scatter
 El trazado de dispersión de la función de discriminación
DF1 del volumen vs dispersión de la luz muestra. una
separación clara de Nt ,L y, Mo, Eo
Sysmex XS-1000i
Descripción del Cell Dyn 3200
 Tecnología óptica :PLT,WBC;RBC
 Tecnología diferencial MAPSS
 Reticulocitos
OTRAS TECNOLOGÍAS
Tecnología para Hemoglobina
Reactivo libre de cianuro




Grupo hidrofóbico del SLS que se une a la molécula de la globina
Ocurre un cambio de configuración
Oxidación de Fe 2+ --> Fe 3+
Grupos Hidrofílicos de SLS se unen a Fe --> SLS-Hb
Fe 3+
Fe 2+
SLS
Fe 3+
Sysmex XS-1000i
Tecnología
En los Xs el Hto se mide
electrónicamente, basado en
el principio de que el pulso
producido cuando un Gr
pasa a través de la apertura
es proporcional al volumen
de la célula
El Hto se determina
comparando el volumen total
o acumulado de Gr con el
volumen de sangre completa
en la dilución
Por Citometría de Flujo se obtiene información
acerca de la composición y madurez celular
Fluorescencia
Información del contenido de RNA y
DNA
Dispersión lateral
Información de la estructura
interna
Láser
Dispersión frontal
Tamaño de la célula
Sysmex XS-1000i
Tecnología
Cuantificación de Gránulos Inmaduros
Información útil sobre el diferencial
extendido de leucocitos

IG:
promielocitos
mielocitos
metamielocitos
Maduración de neutrófilos
Blastos
promielo
mielo
IG
metamielo
bandas
segmentos
Cuantificación de Gránulos Inmaduros
IG Master
Canal del diferencial
Normal
IG % , #
Dispersión lateral
Detección de los RBC resistentes a la
hemólisis
Conteo óptico nucleado NOC
Análisis óptico de las plaquetas
 Por medio del uso de
un enfoque de
dispersión óptica de
la luz con ángulo
dual se logra una
buena separación de
los GR y las plq
 Ademas , la
presencia de los
cúmulos de plq se
puede detectar en
forma confiable
Medida de los eritroblastos
Los EB son contados y separados de los WBC
basados en su tamaño y cantidad de
fluorescencia
Recuentos de Reticulocitos
Método de Referencia: Azul de Metileno
Variación entre observadores
Altos coeficientes de variación
Laboriosos
Métodos automatizados
Azul de metileno
Fluorescentes
Canal reticulocitos - Fluorescente
RETSEARCH II (Diluyente + Colorante)
WBC
RET
Tinción:
Polimetino: ARN
Oxazina: ADN
Fl muy alta
Fl alta
RBC
Fl baja
Canal de los reticulocitos
..
.
Utilidad Clínica - FIR
Confirmación de Anemia Aplástica
Permite la clasificación de anemias por su
capacidad eritropoyética
..
.
Talasemia vs. deficiencia de Hierro
Anemia de los procesos crónicos
Hipoproducción vs. respuesta eritroide
temprana
Detección de implante correcto luego de
transplante
Contenido de Hb de los reticulocitos
Ret-He
Reticulocitos con contenido de Hb
<28pg Hipocrómicos
Son identificados con colorantes
fluorescentes por la posición en el
dispersograma de acuerdo con la
fluorescencia y la luz dispersada
frontalmente
Contenido de Hb de los reticulocitos
Ret-He