expresión funcional y ubicación subcelular del transportador de

Profesor Patrocinante
Dra. Ilona I. Concha G.
Instituto de Bioquímica
Facultad de Ciencias
Profesor Copatrocinante
Dra. Maite A. Castro G.
Instituto de Bioquímica
Facultad de Ciencias
EXPRESIÓN FUNCIONAL Y UBICACIÓN SUBCELULAR DEL
TRANSPORTADOR DE ACIDO ASCORBICO SVCT2 EN CÉLULAS DE
SERTOLI CULTIVADAS IN VITRO FORMANDO BARRERAS.
Tesis de Grado presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
RODRIGO ALEJANDRO MALDONADO ÁGUILA
VALDIVIA – CHILE
2008
AGRADECIMIENTOS
Quisiera comenzar agradeciendo a todos los integrantes del laboratorio de
Señalización Celular del Instituto de Bioquímica de la Universidad Austral de
Chile, comenzando por la Dra. Ilona Concha por darme la oportunidad de ser
parte de este grupo, además de la confianza depositada en mí. Así también no
puedo dejar de nombrar a la Dra. Maite Castro, a la Dra. Constanza Angulo y al
Dr. Alfredo Ramírez que fueron los que de alguna forma me recibieron y me
ayudaron en los primeros pasos dentro del laboratorio, a Danai Bucher,
Eduardo Pulgar, Felipe Beltrán, Héctor Mancilla, Silvana Castilla, Anibal Acuña
y Magdalena Esparza por todos los gratos momentos que hicieron del trabajo
de tesis una etapa muy agradable.
Finalmente quisiera agradecer profundamente a toda mi familia por su
incondicional apoyo, que ha sido fundamental en toda mi vida universitaria: a
mi padre Jorge Maldonado, a mi madre Erica Águila, a mi abuela Marta Oliver y
a mis hermanos Miguel Ángel y Joaquín.
Financiamiento: Proyecto Regular FON DEC YT 1060135 (IC), Dirección de
Investigación y Desarrollo, UACh, Escuela de Bioquímica, UACh,
Dirección de Estudios de Pregrado, UACh y al Instituto de Bioquímica,
UACh.
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
1. RESUMEN…...………………………………………………………………………….…1
2. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………....4
3. OBJETIVOS……………………………………………………………………………...17
4. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………..18
4.1 MATERIALES....………………………………………………………………..18
4.1.1 REACTIVOS QUIMÍCOS………...………...……………………............…18
4.1.2 MATERIAL BIOLÓGICO…………………………..…...…………………...21
4.2 MÉTODOS……………..…………………..…………………………………...22
4.2.1 CULTIVOS CELULARES……..……….…………………………………....22
4.2.1.1 CULTIVO DE CÉLULAS DE SERTOLI 42GPA9.…………..................22
4.2.1.2 CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS DE SERTOLI DE RATA
ADULTA...........................................................................................................22
4.2.1.3 CULTIVOS DE CÉLULAS DE SERTOLI 42GPA9 EN SISTEMAS
BICAMERALES………………………………….………………………………... 23
4.2.2 EXTRACCIÓN DE COLÁGENO TIPO I…..…………………………...…24
4.2.3 TRATAMIENTO DE PLACAS DE CULTIVO CON COLÁGENO TIPO I.24
4.2.4 INMUNOHISTOQUÍMICA EN CORTES DE TESTÍCULO……………....25
4.2.5 INMUNOCITOQUÍMICA DE CÉLULAS DE SERTOLI. ……...…….....…26
4.2.6 ENSAYOS DE TRANSPORTE …….………………………...…………....27
4.2.7 AMPLIFICACIÓN PLASMIDIAL.…………………..…………….. ……….28
4.2.7.1 TRANSFORMACIÓN BACTERIANA………..…..………………..…..…28
4.2.7.2 PURIFICACIÓN PLASMIDIAL.……………..…………………………....28
4.2.8 ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN….………………………………………..….31
ii
4.2.9 TRANSFECCIONES CELULARES………………………………………..31
5. RESULTADOS......................…………………………………………………………..32
5.1 Análisis de la presencia del marcador específico de células de Sertoli WT1
en cortes de testículo de rata adulta, células de cultivo primario de rata adulta y
en células de Sertoli de la línea 42GPA9…………………………………….……32
5.2 Análisis de la expresión de los transportadores de vitamina C (sodiumvitamin C transporters, SVCTs) en cortes de testículo de rata adulta.............35
5.3 Expresión de los transportadores de vitamina C, SVCT1 y SVCT2, en
cultivos primarios de células de Sertoli de rata adulta y en la línea celular de
Sertoli 42GPA9…………….……………..…………………………………………39
5.4 Expresión de los transportadores facilitativos de hexosas GLUT1, GLUT2,
GLUT3, GLUT4, GLUT5 y GLUT8 en células de Sertoli de cultivo primario de
rata adulta y en la línea celular de Sertoli 42GPA9.…..………………………….42
5.5 Análisis funcional de los transportadores de ácido ascórbico (SVCTs) en
células de Sertoli de cultivo primario de ratas adultas y en células de Sertoli de la
línea 42GPA9…………………………………………………...………………..….46
5.6 Estudio de la generación de una monocapa sellada in vitro por parte de las
células de Sertoli 42GPA9 cultivadas en sistemas bicamerales ……………….53
5.7 Análisis del transporte de ácido ascórbico en células de Sertoli 42GPA9
cultivadas en sistemas bicamerales..................................................................57
5.8 Análisis in sílico de las secuencias aminoacídicas de los SVCTs de humano,
rata y ratón que serían determinantes en la polarización intracelular de estos
transportadores ……………………………………….…………………………….60
5.9 Análisis de las construcciones SVCT1-YFP y SVCT2-GFP y su expresión en
las células de Sertoli 42GPA9………….…………………………………………..64
iii
5.10 Estudio de la ubicación subcelular y funcionalidad del transportador de AA
SVCT2 acoplado a la proteína fluorescente (GFP) en células de Sertoli 42GPA9
formando monocapa in vitro……………………………………………………...…69
6. DISCUSIÓN……………………………………………………………………..............74
7. PROYECCIONES…………………………………………………………………….....90
8. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………….91
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Componentes celulares del túbulo seminífero……………………………..…6
Figura 2. Esquema de los plasmidios utilizados para las transfecciones celulares......30
Figura
3.
Las
células
de
Sertoli
expresan
el
marcador
específico
WT1..………………………………...………………………………………………………34
Figura 4. Expresión de transportadores SVCT1 y SVCT2 en cortes de testículo de
rata adulta…………………………………………………….…………………................37
Figura 5. Las células de Sertoli en cultivo primario y de la línea celular 42GPA9
expresan los transportadores de ácido ascórbico (SVCTs)…..…………..………….....41
Figura 6. Las células de Sertoli en cultivo primario y de la línea celular 42GPA9
expresan transportadores de ácido deshidroascórbico (GLUTs)………………….…….45
Figura 7. Los transportadores de ácido ascórbico (AA) son funcionales en células de
Sertoli de cultivo primario……………………………………………………………..….....49
Figura 8. Los transportadores de ácido ascórbico son funcionales en células de Sertoli
de la línea 42GPA9…………………………………………………………………….…...52
Figura 9. Las células de Sertoli 42GPA9 son capaces de formar una monocapa
sellada………………………………………………………………………………………..56
Figura 10. Las células de Sertoli formando monocapa son capaces de incorporar ácido
ascórbico tanto desde el polo apical como basolateral………………..……………...…59
Figura 11. Secuencia consenso en la cola C-terminal determinaría ubicación apical en
los transportadores SVCTs …………………………………………….………………....62
Figura 12. Confirmación de la presencia y ubicación adecuada de la secuencia de los
transportadores SVCT1-2 en los vectores, junto a la expresión de las proteínas de
fusión SVCT1-YFP y SVCT2-GFP en células de Sertoli 42GPA9…………….………..66
v
Figura 13. SVCT2-GFP se expresa en ambos polos de la barrera formada por células
de Sertoli 42GPA9 y dicha expresión es funcional…………..………………….............72
vi
LISTADO DE ABREVIATURAS
AA
: ácido ascórbico
Asbt
: transportador de ácidos biliares dependientes de sodio
BHT
: barrera hemato-testicular
BSA
: albúmina de suero de bovino
Cit B
: citocalasina B
Cit E
: citocalasina E
DAPI
: 4`, 6`-diamino-2-fenilindol
DHA
: ácido deshidroascórbico
DMEM
: medio Dulbelcco’s Eagle modificado enriquecido con F-12
DOG
: 2-desoxiglucosa
DS
: desviación estándar
EAAT-3
: transportador de glutamato dependiente de sodio 3
EDTA
: ácido etilendiaminotetracético
FBS
: suero bovino fetal
GFP
: green fluorescent protein
GLUT
: transportador facilitativo de hexosas
IgG
: inmunoglobulina G
IP
: ioduro de propidio
Kb
: kilo pares de bases
Km
: constante de Michaelis-Menten
mtAA
: ácido ascórbico mitocondrial
OMG
: 3-o-metilglucosa
vii
PBS
: tampón fosfato salino
Phl
: floridzina
PKC
: proteína quinasa C
PMA
: forbol 12-miristato 13-acetato
ROS
: especies reactivas de oxígeno
SGLT
: co-transportadores de sodio-glucosa
SVCT
: co-transportador de sodio-vitamina C
TER
: resistencia eléctrica transepitelial
Tris
: tris-(hidroximetil)-aminometano
Tritón X-100
: octal fenoxi polietoxietanol
Vmax
: velocidad máxima
YFP
: yellow fluorescent protein
1
1. RESUMEN
Vitamina C es un micronutriente esencial requerido para diversas funciones en el
organismo. Una deficiencia de vitamina C
en la dieta conlleva a una variedad de
trastornos clínicos como el escorbuto, cicatrización anormal de lesiones, problemas en
tejido conectivo y óseo e inestabilidad vasomotora. Esta molécula existe en dos formas
químicas:
la
forma
reducida
(ácido
ascórbico)
y
la
forma
oxidada
(ácido
deshidroascórbico). Ambas formas son capaces de ingresar a las células gracias a dos
sistemas diferentes. La forma oxidada lo hace mediante un sistema bidireccional, de
baja afinidad pero de alta capacidad, que incluye a los denominados transportadores
facilitativos de hexosas GLUTs. Mientras que la forma reducida lo hace gracias a un
sistema unidireccional, de alta afinidad pero de baja capacidad, llamados cotransportadores de sodio-ascorbato SVCTs.
Bajos niveles de vitamina C en testículo provocan cambios degenerativos, como la
descamación de túbulo seminífero y disminución del peso de los testículos entre otros
efectos deletéreos, lo que se asemeja a un estado de privación androgénica.
La interrogante acerca de cómo el ácido ascórbico es capaz de ingresar al epitelio
germinal masculino se ha mantenido sin resolver por más de 80 años. En el presente
trabajo demostramos la expresión de los transportadores de vitamina C (tanto reducida
como oxidada) en el túbulo seminífero y células de Sertoli.
La expresión de los
transportadores SVCTs resultó ser funcional en células de Sertoli de cultivo primario
como en la línea celular de Sertoli 42GPA9. Además, demostramos que las células de
Sertoli 42GPA9 son capaces de formar una monocapa sellada e incorporar ácido
ascórbico tanto desde el polo apical como basolateral al analizarlas en sistemas
bicamerales. La ubicación subcelular del transportador SVCT2 en el epitelio polarizado
de células de Sertoli fue moderadamente apical cuando SVCT2-GFP fué transfectado.
Estos resultados indican que los transportadores de vitamina C funcionales (SVCTs) se
expresan en las células de Sertoli y que la localización de la isoforma SVCT2 en una
monocapa polarizada de células de Sertoli tiene un impacto directo en nuestra
2
comprensión del mecanismo de cómo la vitamina C es transportada através de la
barrera hemato-testicular.
3
SUMMARY
Vitamin C is an essential micronutrient required for many functions in the organism.
Dietary deficiencies in vitamin C lead to a variety of clinical abnormalities such as
scurvy, delayed wound healing, bone and connective tissues disorders and vasomotor
instability. This molecule exists in two chemical forms: the reduced form (ascorbic acid)
and the oxidized form (dehydroascorbic acid). Both forms can get into the cells using
two different transporter systems. The oxidized form is uptaked by a bidirectional, low
affinity, high capacity system that includes the facilitative glucose transporters (GLUTs).
While the reduced form does it by an unidirectional, high affinity, low capacity system,
the sodium-vitamin c cotransporters (SVCTs).
Low levels of vitamin C in testis cause degenerative changes, such as desquamation of
the seminiferous epithelium and a testes weight decrease among other deleterius
effects, similar to androgenic deprivation.
The main unresolved question for more than 80 years is how ascorbic acid enters the
male germinal epithelium. In the present work, we demonstrated the expression of the
vitamin C (both reduced and oxidized) transporters in the seminiferous tubule and Sertoli
cells. The expression of the SVCTs transporters was functional in primary cultures of
Sertoli cells and 42GPA9 Sertoli cell line. Moreover, we demonstrated that 42GPA9
Sertoli cells are capable to form a sealed monolayer and to incorporate ascorbic acid
from both apical and basolateral surfaces when they are studied in transwells systems.
The subcelullar localization of SVCT2 transporter in polarized epithelium of Sertoli cells
was moderately apical when SVCT2-GFP was transfected. These results indicate that
active vitamin C transporters (SVCTs) are expressed in Sertoli cells
and that
the
surface localization of SVCT2 isoform in a polarized monolayer of Sertoli cells has a
direct impact on our understanding of the mechanism for vitamin C transport across the
hemato-testicular barrier.
4
2. INTRODUCCIÓN
El testículo es una glándula de función dual, ya que produce espermatozoides y
la hormona sexual masculina, testosterona. Este órgano está dividido aproximadamente
en 250 lobulillos testiculares los cuales están compuestos de 1 a 4 túbulos seminíferos
envueltos en tejido conectivo enriquecido en vasos sanguíneos y nervios. Los túbulos
seminíferos miden aproximadamente 0,2 mm de diámetro y 30 a 70 cm de longitud, y
están constituidos en su parte más externa por una cápsula de tejido conjuntivo, luego
por una lámina basal donde se sustenta un complejo epitelio estratificado conformado
por dos tipos de células. Por una parte las células de soporte nutricional y mecánico
denominadas células de Sertoli, y por otra parte, las células que componen la línea
espermatogénica donde encontramos, desde la parte basal hasta el lumen tubular,
espermatogonias, espermatocitos pre-leptoténicos y leptoténicos, espermatocitos
paquiténicos, espermátidas redondas, espermátidas elongadas hasta llegar a los
espermatozoides en la zona luminal (Xia et al., 2005) (Figura 1 a la derecha).
Las células de Sertoli son alargadas y de citoplasma irregular con muchos
procesos que sostienen las células germinales, debido a que cada célula de Sertoli
puede “cuidar” entre 30-50 células germinales en distintos estados de su desarrollo (Xia
et al., 2005) (Figura 1 a la izquierda). En rata, las células de Sertoli cesan de proliferar
alrededor del día 20 post-natal y el número de estas células “cuidadoras” determina
cuántas células de la estirpe espermatogénica pueden ser soportadas y desarrolladas
en este complejo proceso (Xia et al., 2005). Estas células presentan un núcleo ubicado
5
Figura
1:
Componentes
celulares
del
túbulo
seminífero.
Representación
esquemática de los componentes del epitelio seminífero desde la zona basal hasta el
lumen tubular. La franja superior de la imagen muestra un capilar sanguíneo en
contacto con la lámina basal. A la derecha se indican las zonas que abarcan los
compartimentos basal y adluminal con flechas. En la región izquierda de la imagen se
presenta la localización tubular de todo el linaje germinal masculino en desarrollo
mientras que a la derecha se muestra una célula de Sertoli sosteniendo a un par de
espermátidas. En rojo se destaca la formación de la barrera hemato-testicular (BHT)
entre dos células de Sertoli. Las líneas negras indican los nombres de los organelos de
las
células
de
Sertoli.
Esquema
modificados
http://www.endotext.org/male/male1/figures/figure11.png y Xia et al. (2005).
desde
6
7
en la zona basal y un nucléolo muy acentuado (Dym & Fawcett, 1970). La membrana
basal juega un rol crucial en la función de las células de Sertoli ya que afecta la
morfología y el comportamiento. Además, afecta procesos como diferenciación,
crecimiento celular y migración los cuales dependen del sustrato al que estén unidos.
Se ha descrito que modificaciones en la funcionalidad de la membrana basal causa un
desplazamiento anormal del epitelio seminífero en ratas (Siu & Cheng, 2004).
En el testículo se ha descrito la presencia de una barrera que impide el libre paso
de sustancias desde el torrente sanguíneo hasta la región luminal, la barrera hematotesticular. Esta barrera no se encuentra en contacto directo con la circulación sistémica
como la barrera hemato-encefálica, y la capacidad de aislar el acceso a la región
luminal se debe a las uniones estrechas generadas entre células de Sertoli vecinas
(Dym & Fawcett, 1970). Estas células maduran junto con las primeras células germinales en
desarrollo formando la barrera antes de que los primeros espermatocitos den origen a las
espermátidas haploides.
Así, esta barrera da origen a dos compartimentos: el basal
donde encontramos espermatogonias y espermatocitos preleptoténicos y al adluminal que
contiene las células germinales más desarrolladas las cuales se ubican entre células de
Sertoli contiguas. Esta barrera no es rígida ya que los espermatocitos pre-leptoténicos y
leptoténicos deben pasar desde el compartimento basal al aduminal atravesando dicha
barrera para seguir desarrollándose y para que esto ocurra se ha demostrado en los
últimos años que citoquinas, oxido nítrico, quinasas, fosfatasas, proteasas e inhibidores de
proteasas son responsables del dinamismo de la barrera hemato-testicular (Yan et al.,
2005).
8
De esta manera, podemos observar que las células de Sertoli cumplen un rol
fundamental para que el desarrollo espermatogénico sea adecuado. Las células de Sertoli
son, por una parte, reguladas mediante proteínas liberadas de células peritubulares
(fibroblastos y células mioides) que estimulan la producción de la proteína de unión a
andrógenos (ABP) y transferrina (Skinner et al., 1985), mientras que por otra parte regulan
el destino del linaje espermatogénico mediante una serie de factores paracrinos (Erkkila et
al., 2002; Griswold et al., 1998). La barrera hemato-testicular en combinación con los
productos producidos por las células de Sertoli, como proteínas transportadoras de iones
metálicos, proteasas, inhibidores de proteasas y glicoproteínas, generan un ambiente
único y esencial en el compartimento adluminal del túbulo (Griswold et al., 1998).
Una molécula capaz de atravesar la barrera hemato-testicular es la vitamina C
(ácido deshidroascórbico), denominada químicamente 2-oxo-L-treo-hexonono-1,4-lactona2,3-enediol (Naidu et al., 2003), esta vitamina puede encontrarse de dos formas
biológicamente activas, la forma reducida o ácido ascórbico (AA), y la forma oxidada o
ácido deshidroascórbico (DHA) (Carr & Frei, 1999). La vitamina C se absorbe a nivel de
intestino delgado y la forma reducida o AA es la que se encuentra predominantemente en
el plasma de seres vivos en concentraciones que fluctúan entre 20 y 50 µM (Schorah et
al., 1996; Capellman et al., 1994). Leucocitos, particularmente neutrófilos, poseen
concentraciones muy altas de AA y son probablemente el vehículo primario para la
distribución a todo el cuerpo (Luck et al., 1995). La vida media del ácido L-ascórbico es
aproximadamente de 16 días en humanos, y se requieren alrededor de 1 mg/Kg/día para
mantener una reserva adecuada (Linster & Van Shaftingen, 2007). El AA es hidrosoluble,
sensible al aire, luz, calor y se destruye fácilmente durante periodos de almacenamiento
9
prolongados (Naidu et al., 2003; Sönmez et al., 2005). En humanos el ácido ascórbico es
un micronutriente esencial requerido para una serie de procesos biológicos como
reacciones enzimáticas y como antioxidante (Wang et al., 2000), razón por la cual ha sido
denominado como el antioxidante plasmático hidrosoluble más efectivo ya que es capaz
de prevenir la iniciación del efecto oxidante en comparación con otros antioxidantes unidos
a lipoproteínas (α-tocoferol, licopeno, β-caroteno entre otros) los cuales sólo disminuyen el
efecto (Frei et al., 1991). La vitamina C se describió también como el compuesto
hidrosoluble más abundante que actúa en reacciones de un electrón, y esto se debe
probablemente a que juega un rol importante como cofactor en reacciones catalizadas por
oxigenasas dependientes de metales quienes están involucradas en la síntesis de por
ejemplo carnitina y colágeno (Linster & Van Shaftingen, 2007; Carr & Frei, 1999). El
colágeno requiere de AA para el proceso de hidroxilación de esta proteína, lo que permite
que se lleve a cabo un mejor plegamiento garantizando una función adecuada como tejido
conectivo (Iqbal et al., 2004). Por otro lado, el AA aumenta los niveles intracelulares de
fierro y modula la expresión de genes reguladores de este metal, ferritina y el receptor de
transferrina (Duarte et al., 2007).
La mayoría de plantas y animales sintetizan ácido ascórbico a partir de D-glucosa
o D-galactosa. Sin embargo cobayos, murciélagos de la fruta, primates y el hombre son
incapaces de sintetizar esta molécula debido a la deficiencia de la enzima L-gulonolactona
oxidasa que actúa en el último paso donde cataliza la oxidación de L-gulono-γ-lactona a
ácido ascórbico (Naidu et al., 2003). De este modo, no es sorprendente que una
deficiencia en la dieta de ácido ascórbico lleve a desórdenes metabólicos en hombres y
animales que son incapaces de sintetizar esta molécula, como el escorbuto, el cual se
10
caracteriza por la caída de dientes, debilidad ósea y un desgaste de músculos y piel
(Linster & Van Shaftingen, 2007; Millar et al., 1992). Muchos estudios bioquímicos, clínicos
y epidemiológicos indican que la vitamina C es beneficiosa en diversas enfermedades
crónicas como riesgo cardiovascular, cáncer, cataratas (Carr & Frei, 1999) así como
también, para cumplir funciones antiaterogénicas e inmunosupresoras junto con ser
citotóxica impidiendo el crecimiento de líneas celulares malignas y no malignas tanto in
vitro como in vivo (Naidu et al., 2003). La vitamina C tiene una particular importancia a
nivel cerebral debido a su íntima conexión con el metabolismo de importantes
neurotransmisores (Subramanian et al., 1977) ya que modula la neurotransmisión
glutamatérgica y la dopaminérgica así como también actúa como cofactor en la síntesis de
catecolaminas y es requerido para la liberación de noradrenalina y acetilcolina desde las
vesículas sinápticas (Ziylan et al., 2006). También, la suplementación de células derivadas
de epidermis de rata con AA produce una diferenciación en dichas células aumentando su
función de barrera epidérmica (Pasonen-Seppànen et al., 2001). De esta manera
podemos observar que la vitamina C cumple funciones relevantes en distintos tejidos
además de ser un agente importante para contrarrestar diversas patologías como por
ejemplo, a nivel testicular donde se describen 2 funciones principales: la mantención de la
estructura tubular y la funcionalidad del plasma seminal (Luck et al., 1995). En cobayos se
ha descrito que una deficiencia de vitamina C produce una descamación del epitelio del
túbulo seminífero (Lindsay & Medes, 1926), una disminución en el peso de los testículos
(Sapra et al., 1987), así como también cambios degenerativos en otros órganos
reproductivos y causa un efecto similar al de privación androgénica lo que conlleva a un
inadecuado funcionamiento de estos tejidos (Chinoy et al., 1986). En el testículo la
11
producción de especies oxígeno reactivas (ROS) es un evento fisiológico normal, por lo
que una sobreproducción de dichas especies puede ser perjudicial para el desarrollo
espermático ya que por ejemplo, la lipoperoxidación destruye la matriz lipídica de la
membrana de los espermatozoides lo que conlleva a una pérdida en la motilidad y
defectos en la integridad de membrana, proceso que está asociado con infertilidad
(Sönmez et al., 2005). Altas dosis de AA son capaces de reestablecer la fertilidad en
hombres infértiles, mientras que dosis moderadas (400 mg/día) inducen la ovulación en
mujeres anovuladoras (Millar et al., 1992; Hornig, 1981). AA también tiene la capacidad de
proteger a los espermatozoides del daño oxidativo al DNA, que afecta la calidad
espermática y provocaría un aumento en el riesgo de daños genéticos especialmente en
poblaciones con bajas concentraciones de ácido ascórbico como los fumadores (Fraga et
al. 1991). Debido a esto, se describió que una suplementación con AA a pacientes
fumadores generan una mejora en la calidad espermática (Dawson et al., 1992). Así como
también, la ingesta de AA en estos pacientes provoca una disminución de la excreción
urinaria de metabolitos nicotínicos debido a un menor consumo junto con una disminución
en el metabolismo de la nicotina (Dawson et al., 1999).
Como hemos visto, la vitamina C desarrolla funciones muy importantes en diversos
tejidos, razón por la cual el estudio de cómo esta molécula es capaz de pasar a través de
las membranas plasmáticas es crucial, ya que debido a sus características como
hidrosolubilidad, tamaño y carga es incapaz de atravesar las membranas celulares
(Wilson et al., 2005). Sin embargo, existen distintos sistemas de transportadores descritos
tanto para la forma reducida como la oxidada. Así, en 1993 Vera et al. descubrieron que
los transportadores facilitativos de hexosas son fisiológicamente efectivos transportadores
12
de la forma oxidada de la vitamina C (DHA). Estas proteínas tienen una masa aproximada
de 45-55 kDa, se caracterizan por realizar un transporte facilitado que no requiere ATP, es
independiente de sodio y dicho transporte ocurre a favor del gradiente de concentración
del sustrato (Muekler et al., 1994; Joost & Thorens, 2001). Los GLUTs pertenecen a la
familia SLC2 donde todos los productos de expresión de estos genes se caracterizan por
poseer 12 dominios de transmembrana con los extremos amino y carboxilo ubicados en la
zona citoplasmática de la membrana celular (Uldry et al., 2004). Existen hasta el momento
14 isoformas para los GLUTs de las cuales 11 han sido descritas para catalizar el
transporte de azúcares, donde cada isotipo exhibe una distinta especificidad por el
sustrato, características cinéticas y perfil de expresión (Scheepers et al., 2004). Pueden
ser separadas estructuralmente en grupos donde GLUT 1-4 componen la clase 1, la clase
2 está compuesta por GLUT5, 7, 9 y 11 mientras que GLUT 6, 8, 10 y 12 integran la clase
3 (Uldry et al., 2004). Aunque existe una gran cantidad de miembros en esta familia de
transportadores tienen una identidad de un 65% y esta homología de secuencia recae
especialmente en los segmentos transmembrana (Klip & Páquet, 1990).
GLUT1 fue el primer transportador en ser caracterizado por clonamiento molecular,
se encuentra en la mayoría de los tejidos con diferentes niveles de expresión en distintos
tipos celulares dependiendo de la actividad metabólica de glucosa, como en barreras
sangre-tejido especialmente en la barrera hemato-encefálica, además posee como
sustratos a glucosa, galactosa, manosa y glucosamina. GLUT2 transporta con baja
afinidad glucosa, manosa, galactosa y fructosa pero transporta con alta afinidad
glucosamina, está presente en la membrana basolateral de las células intestinales como
en el epitelio de absorción a nivel renal. GLUT3 transporta con alta afinidad glucosa y
13
también galactosa, manosa, maltosa y xilosa, se expresa principalmente en cerebro y
testículo. GLUT4 transporta glucosa así como también DHA y glucosamina, se encuentra
en vesículas intracelulares que responden al estímulo de insulina translocando el
transportador a la membrana celular. Por otro lado GLUT5 transporta fructosa y se
expresa principalmente en
el yeyuno del intestino delgado. GLUT6 se expresa
principalmente en cerebro y bazo, y junto con GLUT8, GLUT10 y GLUT11 transportan
glucosa. En el caso de GLUT9 debido a su alto grado de identidad con GLUT5 se cree
que podría transportar fructosa. Por el contrario GLUT12 y GLUT14 no han sido
caracterizados en cuanto a su funcionalidad ni expresión (Joost & Thorens, 2001; Uldry et
al., 2004).
El transporte de DHA se ha definido para ciertas isoformas las cuales son GLUT1,
GLUT2, GLUT3 y GLUT4 donde el ingreso de la forma oxidada de la vitamina C, la cual es
estructuralmente similar a la glucosa, puede ser inhibido competitivamente por otros
azúcares (Vera et al. 1995). Es necesario destacar que el transporte de DHA mediado por
GLUTs requiere de un proceso llamado “bystander effect” el cual se refiere a la oxidación
local de AA (que predomina ampliamente en el organismo en relación a DHA) a DHA para
que las células adyacentes lo capten a través de los GLUTs y luego intracelularmente sea
reducido a AA inmediatamente (Nualart et al., 2003). Además, se describió que la isoforma
GLUT1 es capaz de transportar la forma oxidada de la vitamina C al interior de la
mitocondria donde es reducida y acumulada como ácido ascórbico mitocondrial (mtAA)
para proteger el genoma y membranas mitocondriales del daño oxidativo (Sagun et al.,
2005).
14
Por otra parte la forma reducida de la vitamina C ingresa a las células gracias a los
co-transportadores de sodio/ascorbato (SVCTs). Estos transportadores poseen una masa
de entre 50-75 kDa (Wu et al., 2003; Savini et al., 2007) y se caracterizan por realizar el
transporte en contra del gradiente de concentración del sustrato para lo cual son activados
gracias al gradiente electroquímico de sodio (Siliprandi et al., 1979). Las dos isoformas
descritas, SVCT1 y SVCT2, son codificadas por los genes SLC23A1 y SLC23A2,
respectivamente (Wang et al., 2000; Erichsen et al., 2001) y poseen una identidad de
secuencia aminoacídica de alrededor de un 65% (Tsukaguchi et al., 1999). Ambos
transportadores tienen un perfil hidropático similar con 12 dominios transmembrana y con
los extremos amino y carboxilo terminal intracelulares (Wang et al., 1999; Tsukaguchi et
al., 1999; Liang et al., 2001; Linster & Van Shaftingen, 2007). También se ha descrito que
el pH óptimo de transporte fluctúa entre 5.5-7.4 y la estequiometría del transporte es 2:1
Na:ácido ascórbico, específicamente para SVCT2 el orden del transporte sería Na:AA:Na
(Diliberto et al., 1983; Liang et al., 2001: Godoy et al., 2007). Sin embargo, ambos
transportadores han sido descritos según sus características
estructurales, cinéticas,
funcionales y de expresión en distintos tejidos encontrándose divergencias en estos
aspectos. SVCT1 está conformado por 604 aminoácidos en rata, 605 en ratón y 598 en
humanos con una masa molecular de entre 65-75 kDa (Tsukaguchi et al., 1999; Faaland
et al., 1998; Daruwala et al., 1999; Savini et al., 2007). Para este transportador se
describió una secuencia específica en la cola C-terminal que codifica para un motivo de
plegamiento β así como también la ubicación apical de SVCT1 lo que se observó el 2003
en células CaCo-2 diferenciadas y se ratificó en células renales un año después (Maulén
et al., 2003; Subramanian et al., 2004). La Km descrita para SVCT1 es entre 75-237 µM y
15
la incorporación de ácido ascórbico mediada por el gradiente de sodio es electrogénica
(Wang et al., 1999; Wang et al., 2000; Tsukaguchi et al., 1999; Daruwala et al., 1999). Por
su parte, SVCT2 está compuesto por 592 aminoácidos en rata, 647 en ratón y 650 en
humano (Tsukaguchi et al., 1999; Gispert et al., 2000; Daruwala etal., 1999) posee un
peso molecular de 50-70 kDa y una Km descrita en distintos tipos celulares entre los 20100 µM y una velocidad máxima menor que la descrita para SVCT1 independientemente
de la especie (Tsukaguchi et al., 1999; Liang et al., 2001). En líneas celulares intestinales
y de riñón (CaCo-2 y MDCK, respectivamente) en estados pre-confluentes y postconfluentes se ha localizado a SVCT2 en la zona basolateral (Boyer et al., 2005). Los
análisis de expresión tejido-específicos realizados mediante técnicas como Northern Blot,
e hibridación in situ han descrito que SVCT1 y SVCT2 poseen distintos patrones. Los
RNAs de SVCT1 han sido ubicados en gran cantidad en riñón, intestino e hígado y
minoritariamente en timo, próstata, ovario y colon. Por su parte, SVCT2 está
abundantemente expresado en la región cerebral y en la retina así como también, en
corazón, placenta, testículos, glándula adrenal, pero no en músculo esquelético ni hígado.
Específicamente a nivel neuronal la mantención de AA intracelular mediado por SVCT2 es
crucial para el desarrollo, maduración funcional y respuesta antioxidante de estas células
(Qiu et al., 2007). Ambos transportadores han sido encontrados en células epiteliales de
bronquíolos y epidídimo (Tsukaguchi et al., 1999; Rajan et al., 1999; Wang et al., 1999;
Wang et al., 2000; Liang et al., 2001). De esta forma podemos ver que SVCT1 cumpliría
una función en la homeostasis corporal a través de la absorción intestinal y reabsorción
renal de AA, mientras que SVCT2 sería preponderante en la mantención de AA
16
intracelular en tejidos especializados, metabólicamente activos y protegiendo contra el
estrés oxidativo (Tsukaguchi et al., 1999; Wang et al., 1999; Savini et al., 2007).
Actualmente, no existe información alguna acerca de cómo la vitamina C es
transportada a través de la barreta hemato-testicular, específicamente cómo el ácido
ascórbico es capaz de ingresar al compartimento adluminal generado por las uniones
estrechas de las células de Sertoli donde encontramos células germinales masculinas en
desarrollo.
Por lo tanto, analizando las evidencias expuestas anteriormente de que la vitamina
C es fundamental para un desarrollo testicular normal y por consiguiente del linaje
espermatogénico, además de resultados iniciales en el laboratorio que demuestran la
presencia de los transportadores de vitamina C tanto reducida (SVCTs) como oxidada
(GLUTs) en la línea celular de Sertoli 42GPA9 se propone la siguiente hipótesis: “La
existencia de una segregación selectiva de los transportadores de vitamina C a los
compartimentos apical y basolateral en células de Sertoli, permite el transporte
vectorial de esta vitamina”.
17
3. OBJETIVOS
Para responder a la hipótesis planteada se propusieron los siguientes objetivos:
-
Obtener y caracterizar las células de Sertoli de cultivo primario y de la línea
celular 42GPA9 por inmunofluorescencia, además de analizar la funcionalidad
de los transportadores de AA.
-
Establecer la formación de una monocapa sellada por parte de las células de
Sertoli y determinar el ella la funcionalidad de los transportadores de AA.
-
Analizar la localización y funcionalidad del transportador SVCT2-GFP en células
de Sertoli formando barrera.
18
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 MATERIALES
4.1.1 REACTIVOS QUÍMICOS
De Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) se obtuvieron los siguientes
reactivos: albúmina de suero bovino (BSA), agarosa, bicarbonato de sodio, cloruro de
calcio, colagenasa tipo IV (C5138), D-(+)-glucosa, DNAsa (D5025), dodecilsulfato de sodio
(SDS), EDTA, glicina, hialuronidasa (H 1136), HEPES, Histochoice (fijador de tejido),
ioduro de propidio, 2-mercaptoetanol, rojo fenol, Tritón X-100 y Tween 20.
De Merk & Co, Inc. (Darmstadt, Alemania) fueron adquiridos los siguientes
reactivos: acetona, ácido acético, ácido clorhídrico, alcohol etílico, alcohol isopropílico,
alcohol metílico, cloruro de sodio, fosfato diácido de sodio, fosfato dihidrógeno de potasio,
glicerol, HEPES, hidróxido de sodio, Tris y xilol.
De Gibco-BRL Laboratorios Life Technologies, Inc. (Rockville, MD, USA)
fueron utilizados:, fungizona, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y OPTIMEM.
De United Status Biological (Swampscott, MA, USA) se obtuvo medio
Dulbelco´s Eagle modificado enriquecido con F-12 (DMEM-F12) y medio de crecimiento
LB de Hyclone (Logan, UT, USA), suero bovino fetal (FBS) y tripsina (SH 30042.01).
19
De Alpha Dignostics Internacional, Inc. (San Antonio, TX, USA), se obtuvieron
los anticuerpos policlonales antipéptido (ubicado en la región C-terminal citoplasmática)
para detectar GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4, GLUT5 y GLUT8. Los anticuerpos antiSVCT1 (sc-9924), anti-SVCT2 (sc-9927 y sc-9926) y anti-WT1 (C-19) fueron adquiridos de
Santa Cruz Biotechnology (Sta. Cruz, CA, USA).
De Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL, USA) se adquirieron los anticuerpos
secundarios conjugados a peroxidasa, anti-IgG de ratón, anti-IgG de cabra y anti-IgG de
conejo, mientras que de Molecular Probes (Eugene, OR, USA), fueron adquiridos los
anticuerpos anti-IgG de ratón conjugados a Alexa fluor 594 (rojo), anticuerpo anti-IgG de
conejo conjugado a Alexa fluor 488 (verde) y anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado a
Alexa fluor 488 (verde).
De DAKO (Carpintería, MA, USA) se adquirió el medio de montaje para
fluorescencia.
De MBI Fermentas (Hanover, MD, USA), fueron obtenidos las enzimas de
restricción XhoI, BamHI, HindIII y EcorI.
De Corning Incorporated (Costar) (Acton, MA, USA) (número de catálogo 3450)
se utilizaron placas bicamerales o “transwells” de 6 pocillos, que contienen un inserto de
poliéster de 0,4 µm.
20
Finalmente, los equipos utilizados fueron los siguientes: pHmetro Radiometer
Copenhagen PHM 83 Autocal, balanza Precisa 180ª, cámara de Neubauer, centrífuga
Eppendorf 5417-R, centrífuga Beckman Coulter Allegra 6, centrífuga Microv Fisher
Scientific, incubador para cultivo NuaireTMDH Autoflow, gabinete de seguridad biológica
NuaireTM Class II UN-425-600-E, microscopio confocal Leica DM RA2, microscopio
confocal OLYMPUS Fluoview FV 1000, microscopio de epifluorescencia ZEISS Axioskop
2 con cámara NiKON Digital camera DXM1200, microscopio invertido OLYMPUS CKX41,
fuente de poder EPS 250 de Scientific Company, bomba peristáltica ISMATEC S.A
modelo 7624-03, agitador magnético IKAMAGR RCT, sonicador Ultrasonic Homogenizer
4710 Cole Parmer Instruments Co., espectrofotómetro Shimadzu UV-120-12, Trans-Blot
BD SemyDry Transfer Cell BIORAD, sistema de electroforesis y transferencia Mini
ProteanR Tri-Carb 1600 TR, agitador orbital Lab-Line, baño termorregulado Haake D8,
freezer a -70ºC Foma Scientific Bio-freezer 8425, freezer a -20ºC Consul, refrigerador
Fensa. Electroporador de células eucariotas Multiporator y cubetas de electroporación
Eppendorf.
21
4.1.2 MATERIAL BIOLÓGICO
Para lo cultivos primarios de células de Sertoli y cortes histológicos se utilizaron
ratas Sprague-Dawley (de 1 a 9 meses) obtenidas del bioterio de la Universidad Austral de
Chile, donde son mantenidos según las normas vigentes. Estos animales de
experimentación son anestesiados con éter y sacrificados por decapitación, según las
medidas de bioseguridad del “Manual de Normas de Bioseguridad” de CONICYT de 2008.
Los restos animales son cremados en el incinerador del Fundo Teja Norte de la
Universidad Austral de Chile, donde se descartan los desechos biológicos de acuerdo al
Manual de Procedimiento para el Manejo de Residuos de la UACh. Por otro lado las
células de Sertoli de la línea
42GPA9 fueron obtenidas del Grupo de Estudio de
Comunicaciones Celulares, Histopatología-Embriología del Doctor Dominique Segretain
de la Universidad de París, Francia.
La cepa bacteriana DH5-α fue otorgada por Dr. Felipe Barros del Centro de
Estudios Científicos (CECS) de Valdivia, Chile. Además, los plasmidos pEYFP-SVCT1 y
pEGFP-SVCT2 fueron donados por Dr. Juan Carlos Vera de la Universidad de
Concepción, Concepción, Chile.
22
4.2 MÉTODOS
4.2.1 CULTIVOS CELULARES
4.2.1.1 CULTIVO DE CÉLULAS DE SERTOLI 42GPA9. Las células de Sertoli 42GPA9
se cultivaron en medio DMEM-F12 suplementado con un 10% de FBS (suero bovino fetal),
L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 mg/mL y fungizona 50 ng/mL a
32ºC y 5% de CO2 (Bourdon et al., 1998; Xing & Sairam, 2001).
4.2.1.2 CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS DE SERTOLI DE RATA ADULTA. Dicho
cultivo se realizó utilizando ratas Sprague-Dawley sexualemente maduras (mayores de 30
días). El procedimiento se realizó según el protocolo descrito por Anway et al., (2003)
con algunas modificaciones. Los testículos de ratas adultas fueron removidos y
desencapsulados, luego se utilizó un testículo y se sumergió en 10 mL de Hanks 1X y
se realizaron 2 lavados con el mismo tampón. Posteriormente, se agregó una solución
de colagenasa (10 ml, 500 µl colagenasa 10mg/ml en solucion CaCl2 30 mM, pH 7.4,
34°C, 15 minutos de agitación leve) de manera de disgregar sin fragmentar los túbulos.
Se eliminó el sobrenadante y se lavó 3 veces con 10 ml de Hanks 1x. Luego, se incubó
en solución de tripsina (10 ml, 0.5 mg/ml tripsina en Hanks 1X, pH 7.4, 37ºC, 15 minutos
sin agitar) y se lavó 2 veces (10 ml de Hanks 1X). Los túbulos fueron lavados por
tercera vez en una solución de FBS 10% (10 ml, 1 ml FBS en Hanks 1X). Para separar
las células de Sertoli de las células germinales, los túbulos fueron tratados con una
solución (10 ml) que contiene una mezcla de enzimas (colagenasa 0.1%, hialuronidasa
0.2%, DNasa I 0.04%, 1 ml FBS, en Hanks 1X a pH 7.4) a 34 °C agitando durante 40
minutos. La preparación se centrifugó a 800 xg durante 3 minutos de manera de
23
peletear las células de Sertoli. Este sedimento fué lavado 3 veces con Hanks 1X.
Finalmente se aplicó un “shock” hipotónico para aumentar la pureza del pellet
agregando 5 ml de solución Hanks 1X y luego 12,5 ml de solución Hanks 1:10 en agua
desionizada, e invirtiendo el tubo con cuidado para dispersar el sedimento obtenido
anteriormente, esta solución se centrifugó nuevamente a 800 xg durante 3 minutos y se
eliminó el sobrenadante para resuspender en Hank`s 1x. Posteriormente, se filtró la
solución por una malla (diámetro de poro 75 µm), y el filtrado se lavó 2 veces con 10 ml
de DMEM F12 completo y se resuspendió nuevamente en 5ml de DMEM F12 y se
siembraron las células aisladas sobre matriz con colágeno. Las células fueron
mantenidas a 32ºC con un 5% de CO2 durante aproximadamente 2 semanas, tiempo
donde se utilizaron para realizar los experimentos.
4.2.1.3
CULTIVOS
DE
CÉLULAS
DE
SERTOLI
42GPA9
EN
SISTEMAS
BICAMERALES. Se cultivaron las células en el inserto (compartimento superior) de las
placas de cultivo bicamerales de 6 pocillos (diámetro de poro 0,4 µm). Las células
fueron cultivadas sobre una matriz de colágeno y luego mantenidas por 15 días en
dichos sistemas cambiando el medio día por medio (Rao et al., 1997; Hue et al., 1998).
24
4.2.2 EXTRACCIÓN DE COLÁGENO TIPO 1. El colágeno tipo 1 fue obtenido a partir
de colas de rata. Se utilizaron 5 colas de rata mantenidas a -20ºC, las cuales se
descongelaron y limpiaron con etanol al 70%. El material y las colas se mantuvieron por
15 min. bajo luz ultravioleta y se trabajó en una cámara de flujo laminar tipo II para
prevenir la contaminación. Se cortó la piel a lo largo de la cola desde la punta hasta la
base y se retiró, luego se cortó la cola en secciones y se dejó secar durante 2 horas a
temperatura ambiente. Posteriormente se retiraron las fibras de colágeno desde la base
intentando obtener las fibras lo más delgadas posible y evitando contaminación con
vasos sanguíneos adyacentes. Las fibras estériles y secas se pesaron en una placa
petri para luego ser diluidas en ácido acético 0.1% en cantidad suficiente para obtener
una concentración de 4 mg/mL. Luego de 4 días de agitación se removió el material no
disuelto por centrifugación y se obtuvo una solución stock de colágeno con una
concentración aproximada de 4 mg/mL, la cual se almacenó a 4ºC (Berry et al., 1991).
4.2.3 TRATAMIENTO DE PLACAS DE CULTIVO CON COLÄGENO TIPO I. A las
placas de cultivo utilizadas (6 o 12 pocillos) e insertos de placas de sistemas
bicamerales se les agregó una concentración de 8 µg/cm2 de colágeno tipo I(Berry et
al., 1991). Las placas se dejaron secar por 2 días en una estufa a 37ºC, y luego, se
lavaron 2 veces con agua destilada estéril y se dejaron bajo luz UV por 1 hora.
25
4.2.4 INMUNOHISTOQUÍMICA EN CORTES DE TESTÍCULO. La localización de
proteínas fue analizada utilizando el método de inmunohistoquímica en cortes de
testículo de ratón incluidos en parafina (Angulo et al., 1998). Se procedió a desparafinar
e hidratar los cortes de testículo mediante la incubación de éstos en xilol dos veces por
3 min, en etanol 100% dos veces por 3 min, en etanol 80% por 3 min, en etanol 70%
por 3 min, en etanol 50% por 3 min, y por último en agua destilada dos veces por 5 min.
Luego los cortes fueron tratados con una solución de citrato 10mM pH 6,0 en
microondas durante 1 min a 100% de potencia, 10 min a 10% de potencia y finalmente
15 minutos a temperatura ambiente para después lavar con agua destilada dos veces
por 5 min y así producir la recuperación antigénica. Luego los cortes fueron lavados dos
veces con tampón fosfato salino, PBS 1X (NaH2PO4 15 mM pH 7,4, NaCl 150 mM).
Posteriormente se bloquearon los cortes durante una hora a temperatura ambiente en
una cámara húmeda con solución PBS 1X que contiene BSA 1%, leche descremada
5% y Tritón X-100 0,3% (solución de bloqueo). Luego, los cortes fueron incubados
durante toda la noche a 4ºC en una cámara húmeda con los anticuerpos primarios
adecuados. Dichos anticuerpos fueron diluidos a 1:100 en solución de bloqueo. Como
control negativo, se realizó la incubación sin utilizar el anticuerpo primario. Los
anticuerpos secundarios fueron anti-IgG de conejo conjugado a Alexa fluor 488, anti-IgG
de cabra conjugado a Alexa fluor 488 en una dilución 1:300 en solución de bloqueo. Los
núcleos fueron teñidos utilizando ioduro de propidio 1,7 µg/mL. Las muestras fueron
montadas utilizando medio de montaje para fluorescencia DAKO y visualizadas en un
microscopio confocal invertido.
26
4.2.5 INMUNOCITOQUÍMICA DE CÉLULAS DE SERTOLI. Las células fueron
cultivadas sobre cubreobjetos redondos de vidrio (12 mm), previamente esterilizados y
cubiertos con colágeno. Las preparaciones se fijaron con Histochoice, previo lavado con
PBS 0,1M pH 7,4. Luego se permeabilizaron las membranas celulares utilizando Tritón
X-100 al 0,3% en PBS 0,1M para facilitar el acceso a antígenos intracelulares. Para
realizar la inmunocitoquímica los preparados celulares fueron incubados durante 1 hora
a temperatura ambiente en solución de bloqueo (BSA 1% y leche descremada 5% en
PBS 0,1M). Dicha solución de bloqueo se utilizó para incubar las muestras con los
anticuerpos primarios en una cámara húmeda durante toda la noche a 4ºC. Como
anticuerpos secundarios se utilizó anti-IgG de conejo conjugado a Alexa fluor 488, antiIgG de cabra conjugado a Alexa fluor 488 o anti-IgG de ratón conjugado a Alexa fluor
596, según fuera el caso, en una dilución 1:300 en solución de bloqueo. Como controles
negativos se incubaron las muestras en ausencia del anticuerpo primario. Los núcleos
fueron teñidos con ioduro de propidio 1,7 µg/mL. Las muestras se montaron utilizando
medio de montaje para fluorescencia DAKO y visualizadas en un microscopio confocal
invertido (Zambrano et al., 2001).
27
4.2.6 ENSAYOS DE TRANSPORTE. Para los ensayos de transporte los cultivos
primarios de células de Sertoli y las células 42GPA9 fueron crecidos en placas de 12
pocillos. Previo a cada experimento, se analizaron cuidadosamente los cultivos
celulares bajo el microscopio, de modo de asegurar que solo los pocillos con densidad
celular uniforme fuesen usados. Además, se despegaron las células de tres pocillos de
estas placas, las cuales fueron cuantificadas utilizando una cámara de Neubauer con el
fin de estimar el número promedio de células totales por pocillo. Los ensayos de
incorporación con radioisótopos se realizaron según lo descrito por Angulo et al (1998).
Las células fueron lavadas con tampón de incubación (Hepes 15 mM, NaCl 135 mM,
KCl 5 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl 0,8 mM, pH 7,4) e incubadas en esta misma solución
durante 30 min a 32ºC para permitir el equilibrio en los espacios intra y extracelular.
Luego se realizaron los ensayos de captación utilizando ácido ascórbico radioactivo
(14C-AA). Dicha reacción fue detenida aplicando tampón de incubación que contenía
HgCl2 de 0,2 mM en tres ocasiones. Posteriormente las células fueron tratadas con
200 µL de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, SDS 0,2%) y la radiactividad
incorporada es medida por un contador de centelleo. Los detalles de los ensayos de
transporte se encuentran en la tesis doctoral de la Dra. María Constanza Angulo
González y en la publicación de la misma en el año 2008.
28
4.2.7 AMPLIFICACIÓN PLASMIDIAL.
4.2.7.1 TRANSFORMACIÓN BACTERIANA. Las células competentes DH5-α fueron
transformadas utilizando los plasmidios pEYFPN1-SVCT1 (inserto entre sitio de corte
para HindIII y SacII) o pEGFPN1-SVCT2 (inserto entre sitios de corte para EcoRI y
SacII) según sea el caso (Figura 2). Dichas bacterias fueron almacenadas en un
volumen de 50 µL a -80ºC y se descongelaron en hielo durante 5 min para luego
mezclar con 1 µL del plasmidio de interés durante 30 min. Después se aplicó un “shock”
térmico a 42ºC durante 90 segundos y posteriormente se incubó por 2 min en hielo.
Luego se agregaron 450 µL de medio LB (10 g. de peptona, 5 g. de bacto-extracto
levadura, 5 g. de NaCl, pH 7 para un litro de solución) sin antibiótico y se agitó la
mezcla a 225 rpm por 1 hr a 37ºC para después plaquear alrededor de 200 µL de esta
mezcla en una placa de medio LB-agar (20 mL de solución) a la cual se le agregó 12 µL
de kanamicina 50 ng/mL la cual se dejo incubando a 37ºC por 16-24 hr
aproximadamente.
4.2.7.2 PURIFICACIÓN PLASMIDIAL. Luego de observar el crecimiento de colonias al
finalizar el procedimiento 3.2.10.1 se realizó la purificación del plasmidio a utilizar
siguiendo los pasos del protocolo del kit AxyPrep Plasmid Midiprep. (Axygen
Biosciences)
29
Figura 2: Esquema de los plasmidios utilizados para las transfecciones celulares.
(A) representación del plasmidio que codifica para la proteína fluorescente amarilla (YFP)
pEYFP-N1. (B) representación del plasmidio que codifica para la proteína fluorescente
verde (GFP). En ambos casos se extiende, en la parte inferior de las imágenes, el sitio de
restricción múltiple donde se insertó la secuencia específica de los transportadores a
estudiar (entre líneas negras) de los cuales se generaron los vectores pEYFPN1-SVCT1 y
pEGFPN1-SVCT2. Los asteriscos (*) en azul indican los cortes enzimáticos realizados con
XhoI, en verde con BamHI y en naranjo con EcoRI en los ensayos de digestión mostrados
en la Figura 12.
30
31
4.2.8 ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN. Los plásmidos fueron digeridos utilizando
diversas enzimas de restricción, según fuera el caso. Los productos de restricción
obtenidos fueron resueltos en geles de agarosa 1 % al cual se le agregó ioduro de
propidio para luego aplicar una intensidad de corriente de 70 mA por 1 hr y visualizar el gel
en un transiluminador UV donde se obtuvo una imagen del mismo gracias a un software
computacional.
4.2.9 TRANSFECCIONES CELULARES. Una vez que las células se encontraban en
un nivel de confluencia adecuado se les retiró el medio y se les agregó el mismo medio
sin antibióticos 24 horas previo a la transfección. Luego se tripsinizaron y contaron para
así utilizar un número adecuado de células. Las células transfectadas se
resuspendieron en medio Optimem (temperado a 37ºC) y se incubaron durante 8
minutos en hielo. Posteriormente, se agregaron 400 µL de suspensión celular a una
cubeta de electroporación (la cual estaba pre-enfriada en hielo) más 1,3 µL de
plasmidio y se aplicó un pulso de 280 V por 80 µsegundos. Las células electroporadas
fueron incubadas en las mismas cuvetas de electroporación, durante 2 min. en hielo y
luego fueron sembradas en placas de cultivo con medio sin antibiótico.
32
5. RESULTADOS
5.1 Análisis de la presencia del marcador específico de células de Sertoli WT1 en
cortes de testículo de rata adulta, células de cultivo primario de rata adulta y en
células de Sertoli de la línea 42GPA9. Para iniciar el estudio de esta tesis fue necesario
contar con un marcador de las células en estudio que nos permitiera ratificar la presencia
de las células de Sertoli que deseábamos analizar. Por lo antes mencionado, se
seleccionó a la proteína WT1, la cuál es un factor de transcripción de la familia de factores
activadores de dedos de zinc, es muy abundante en el tumor de Wilms (WT, Wilms
Tumor) (Matsunaga et al., 1981) que es un tumor embrionario del riñón y se expresa
específicamente en células de Sertoli y no en células germinales (Merhi et al., 2001). Esto
nos permitió diferenciar entre estos dos componentes del epitelio del túbulo seminífero. En
contraste, se utilizó paralelamente un marcador de células germinales llamado protamina,
que es una proteína tipo histona y que cumple la función de empaquetar el material
genético pero de una forma más potente que las histonas, esto ocurre entre los estadíos
de espermatocitos pre y leptoténicos tardíos y espermátida redonda (Lam et al., 1971). Al
utilizar la técnica de inmunofluorescencia indirecta se observó la inmunolocalización de
este marcador en la zona basal del túbulo seminífero, lugar donde se ha descrito la
ubicación de los núcleos de las células de Sertoli (Figura 3, A), mientras que en la Figura
3, B se aprecian marcadas las prolongaciones tan comunes de este tipo celular.
Paralelamente el marcador de células germinales (protamina) se pudo localizar en la zona
media del túbulo seminífero (Figura 3, A´y B`), sitio donde por su parte están las células
33
Figura 3: Las células de Sertoli expresan el marcador específico WT1.
Inmunolocalización visualizada por microscopía confocal utilizando anticuerpos anti-WT1 y
anti-protamina en cortes de testículo de rata adulta (A, A`, B, B`), en cultivo primario de
células de Sertoli de rata adulta (C) y en la línea celular de Sertoli 42GPA9 (C`). En B, C y
C` los núcleos fueron teñidos con ioduro de propidio. La barra de magnificación
corresponde a 50 µm (A, B) y a 20 µm (B, B`, C, C`). L: lumen del túbulo seminífero.
34
35
germinales en desarrollo. Por otro lado, al analizar la inmunorreacción de WT1 en células
de Sertoli de cultivo primario en comparación con las células de Sertoli de la línea celular
42GPA9, se observó un abundante patrón inmunorreactivo en ambos casos (Figura 3, C
y C´), lo que concuerda con la similitud en relación a la expresión del marcador de los dos
tipos celulares que se utilizarán a lo largo de la tesis.
Con respecto a los resultados mencionados podemos confirmar entonces que WT1 es
un buen marcador de células de Sertoli, ya sea en cortes de testículo de rata adulta, en
células de Sertoli de cultivo primario de rata adulta y de las células de Sertoli de la línea
42GPA9.
5.2 Análisis de la expresión de los transportadores de vitamina C (sodium-vitamin
C transporters, SVCTs) en cortes de testículo de rata adulta. La vitamina C es una
molécula que puede ser transportada por dos sistemas distintos. Los transportadores
facilitativos de hexosas (GLUTs) que incorporan la forma oxidada de la vitamina C
(ácido deshidroascórbico, DHA), mientras que la forma reducida (ácido ascórbico, AA)
es adquirida por los co-transportadores de sodio-vitamina C (SVCTs) quienes se
caracterizan por ser activados por el gradiente de sodio y ser dependientes de cationes
bivalentes como calcio y magnesio (Godoy et al., 2007). Cabe enfatizar que cerca del
100 % de la vitamina C presente en el organismo se encuentra en la forma reducida
(AA) o ácido ascórbico (Schora et al., 1996) por lo que el estudio del transporte de AA
es relevante en un contexto fisiológico. Por dichas razones se analizó la expresión de
los transportadores SVCTs en cortes de testículos de ratas adultas observándose en la
Figura 4 un patrón inmunorreactivo distinto para ambas isoformas.
36
Figura 4: Expresión de transportadores SVCT1 y SVCT2 en cortes de testículo de
rata adulta. Co-inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para las
proteínas WT1, SVCT1 en los paneles izquierdos y SVCT2 en las imágenes a la
derecha. Los núcleos fueron marcados con TOPRO 3 en ambos casos. La serie de
imágenes superiores exponen, a la izquierda, los tres canales adquiridos (WT1, SVCT1
y TOPRO 3) más la superposición de ellas. A la derecha, la misma serie de imágenes
pero el canal en rojo representa a SVCT2. Las dos imágenes inferiores muestran un
aumento de una sección de los paneles superiores. La barra de magnificación
corresponde a 20 µm en todas las imágenes. Los cortes se visualizaron utilizando
microscopía confocal. L: lumen del túbulo seminífero, LB: lámina basal, ESg:
espermatogonia, SC: célula de Sertoli, ESc: espermatocito, ESd: espermátida, ESz:
espermatozoide.
37
38
La isoforma SVCT1 inmunorreacciona de manera poco abundante y precisa en forma
de gránulos en la zona basal, media y en el lumen. En la zona basal sucede
específicamente en las células de Sertoli, que correaccionan con WT1, mientras que en
la zona media del túbulo en las células germinales y prolongaciones de las células de
Sertoli, y finalmente en el lumen tubular en las colas de los espermatozoides (Figura 4,
paneles a la izquierda). Por su parte, la isoforma SVCT2 presenta un patrón
inmunorreactivo mucho más abundante e intenso en relación a SVCT1 abarcando todo
el epitelio tubular desde la zona basal inmunorreaccionando las espermatogonias,
células de Sertoli, espermatocitos pre-leptoténicos y leptoténicos, espermatocitos
paquiténicos, espermátidas redondas, espermátidas elongadas y espermatozoides en la
zona luminal así como también cabe destacar la colocalización entre los anticuerpos
para WT1 y SVCT2, observada en amarillo, por todo el citoplasma de las células de
Sertoli desde la región basal hasta la zona donde se ubican las cabezas de las
espermátidas (Xia et al., 2005) (Figura 4, paneles a la derecha). Los controles
negativos se realizaron sin utilizar el primer anticuerpo (datos no mostrados).
En relación a los resultados obtenidos se puede decir entonces que los transportadores
de vitamina C (SVCTs) tienen un nivel expresión diferente en el tejido testicular ya que
la isoforma SVCT1 es menos abundante y precisa en distintas regiones del epitelio
tubular, mientras que SVCT2 presenta un nivel de expresión mucho más abundante e
intenso a través de todo el túbulo seminífero desde la zona basal hasta el lumen.
39
5.3 Expresión de los transportadores de vitamina C, SVCT1 y SVCT2, en cultivos
primarios de células de Sertoli de rata adulta y en la línea celular de Sertoli
42GPA9. Estudios anteriores se refieren a la distribución tisular de los transportadores
de vitamina C y se determinó que la isoforma SVCT2 se expresaría en el testículo
(Tsukaguchi et al., 1999). Pero no existen estudios que comprueben la expresión de
estos transportadores en células de Sertoli. Por lo tanto, se procedió a realizar ensayos
de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para las dos isoformas en
células de Sertoli de cultivo primario de ratas adultas y en células de Sertoli de la línea
celular 42GPA9 (Figura 5). Para los cultivos primarios de células de Sertoli de rata
adulta se observó un patrón inmunorreactivo diferente para ambas isoformas, SVCT1
presentó una reacción positiva escasa y de forma granular en todo el citoplasma,
mientras que para la isoforma SVCT2 se observó una inmunorreacción mucho más
abundante y con algunos focos de reacción muy intensos (Figura 5, 4 paneles
superiores). Por su parte, al realizar la inmunofluorescencia en la línea celular de
Sertoli 42GPA9 se observó que ambas isoformas se expresan abundantemente por
todo el citoplasma de esta línea celular, pero presentan un tipo de expresión distinta ya
que SVCT1 se aprecia de una forma más punteada y precisa mientras que SVCT2 lo
hace de una forma más homogénea a través del citoplasma de las células (Figura 5,
paneles inferiores).
40
Figura 5: Las células de Sertoli en cultivo primario y de la línea celular 42GPA9
expresan los transportadores de ácido ascórbico (SVCTs). Inmunocitoquímica
utilizando anticuerpos específicos anti-SVCT1 y anti-SVCT2. Los núcleos fueron teñidos
con ioduro de propidio en todos los casos. Las imágenes superiores corresponden a
cultivos primarios de células de Sertoli, mientras que las dos imágenes inferiores
corresponden a células de la línea celular de Sertoli 42GPA9. La barra de magnificación
corresponde a 20 µm para los 4 paneles.
41
42
En base a los resultados arrojados por los ensayos de inmunofluorescencia descritos
anteriormente se puede afirmar que las isoformas de los transportadores de vitamina C,
SVCT1 y SVCT2, se expresan en distintos niveles tanto en los cultivos primarios de
células de Sertoli de rata adulta, lo que concuerda con los resultados obtenidos en los
cortes de testículo ya que existe una mayor inmunorreacción del transportador SVCT2
en relación a SVCT1, así como también en la línea celular de Sertoli 42GPA9.
5.4 Expresión de los transportadores facilitativos de hexosas GLUT1, GLUT2,
GLUT3, GLUT4, GLUT5 y GLUT8 en células de Sertoli de cultivo primario de rata
adulta y en la línea celular de Sertoli 42GPA9. La familia de los GLUTs tiene la
capacidad de transportar ácido deshidroascórbico (DHA) (Vera et al., 1993), razón por la
cuál es materia de análisis para lograr los objetivos planteados en la tesis. Además, en el
testículo se ha descrito la expresión de diversas isoformas de los transportadores
facilitativos de hexosas (GLUTs) como por ejemplo GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4,
GLUT5 y GLUT8 (Ulisse et al., 1992; Burant & Davidson, 1994; Burant et al., 1992; Angulo
et al., 1998; Doege et al., 2000; Ibberson et al., 2000; Carosa et al., 2005). Pero
particularmente en las células de Sertoli sólo se demostró la presencia de los mRNA de
las isoformas GLUT1 y GLUT8 (Carosa et al., 2005). Aunque sólo se ha descrito que las
isoformas GLUT1, GLUT2, GLUT3 y GLUT4 transportan DHA también se estudiaron las
isoformas GLUT5 y GLUT8 que transportan otros sustratos como fructosa y galactosa que
son moléculas utilizadas para obtener energía en el testículo. Al realizar los ensayos de
inmunofluorescencia se obtuvo que existen divergencias en cuanto a la expresión de
dichos transportadores al comparar los resultados obtenidos en los cultivos primarios de
43
células de Sertoli de rata adulta con los resultados de la línea celular de Sertoli 42GPA9
(Figura 6). En los cultivos primarios para las isoforma GLUT1 y GLUT2 se observó una
inmunorreacción abundante y con estilo punteado a nivel de todo el citoplasma (Figura 6,
A arriba). Similar fue la reacción para GLUT3 ya que también se observó bastante
reacción positiva de manera punteada o gránulos, perinuclear y en la membrana
plasmática (Figura 6, A arriba). Por su parte GLUT4 y GLUT 8 inmunorreaccionan de
manera mucho menos abundante y más débil, pero manteniendo el patrón punteado
(Figura 6, B arriba). Para GLUT5, en cambio, no se observa inmunoreacción (Figura 6,
B arriba). En relación a los ensayos realizados en células de Sertoli de la línea 42GPA9
se observó que todas las isoformas analizadas presentan inmunorreacción positiva.
Donde GLUT1 inmunorreacciona a nivel citoplasmático pero principalmente a nivel de
membrana (Figura 6, A abajo). Mientras que GLUT2 (Figura 6, A abajo) y GLUT4
(Figura 6, B abajo) lo hacen de una manera bastante menos abundante y sólo en el
citoplasma en forma de gránulos. En contraste las isoformas GLUT3 (Figura 6, A abajo),
GLUT5 y GLUT8 (Figura 6, B abajo) inmunorreaccionan positivamente a nivel
citoplasmático también con un patrón punteado o granular y en el caso de GLUT8 algunas
células se encuentran marcadas en la membrana (Figura 6, B abajo).
De acuerdo a los resultados obtenidos al realizar los ensayos de inmunofluorescencia en
células de Sertoli de cultivo primario de rata adultas y en células de la línea celular de
Sertoli 42GPA9, podemos afirmar que los cultivos primarios presentan principalmente las
isoformas GLUT1, GLUT2 y GLUT3 y en mucho menor grado GLUT4 y GLUT8, mientras
que el transportador GLUT5 no es expresado en este tipo celular.
44
Figura 6: Las células de Sertoli en cultivo primario y de la línea celular 42GPA9
expresan transportadores de ácido deshidroascórbico (GLUTs). Inmunofluorescencia
utilizando anticuerpos específicos contra las isoformas GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4,
GLUT5 y GLUT8 en células de Sertoli de cultivo primario y de la línea 42GPA9. Los
núcleos se tiñeron con ioduro de propidio. Las imágenes fueron visualizadas utilizando
microscopía confocal. La barra de magnificación corresponde a 50 µm para las isoformas
GLUT 1 y 3 de los cultivos primarios y 20 µm para el resto de las imágenes.
45
A
Cultivo
primario
células
de
Sertoli
Línea
celular
de
Sertoli
42GPA9
B
Cultivo
primario
células
de
Sertoli
Línea
celular
de
Sertoli
42GPA9
A
B
C
46
Por otro lado, las células de Sertoli de la línea 42GPA9 presentan fundamentalmente las
isoformas GLUT1, GLUT3, GLUT5 y GLUT8, mientras que GLUT2 y GLUT4 son
expresados considerablemente en menor abundancia.
5.5 Análisis funcional de los transportadores de ácido ascórbico (SVCTs) en células
de Sertoli de cultivo primario de ratas adultas y en células de Sertoli de la línea
42GPA9. Los aspectos funcionales de los transportadores de ácido ascórbico han sido
estudiados en varios sistemas celulares. Sin embargo, las propiedades cinéticas de
SVCT1 y SVCT2 difieren dependiendo del tipo celular, tejido o especie. Se ha
determinado que la Km para ambos transportadores en diversas líneas celulares y cultivos
primarios corresponde a valores de entre 65-237 µM para SVCT1 y 20-100 µM para
SVCT2. Ambas isoformas presentan distintas capacidades para el transporte de ácido
ascórbico ya que SVCT1 presenta una mayor capacidad pero menor afinidad mientras
que al contrario SVCT2 tiene una menor capacidad pero una afinidad mayor (Savini et al.,
2007; Godoy et al., 2007). Por esta razón se realizaron ensayos de transporte utilizando
ácido ascórbico radiactivo para averiguar si la expresión de los transportadores descrita
anteriormente es también funcional en los cultivos primarios de células de Sertoli de rata
adulta y en las células de Sertoli de la línea 42GPA9. La incorporación de AA 100 µM a
32ºC se presentó de manera lineal durante los 2 primeros minutos alcanzando el estado
de equilibrio después de 5 minutos (Figura 7, A y B), determinándose también la
velocidad inicial para el transporte de AA que fue 754 ± 50 pmoles/106cel/min. Por otro
lado, al analizar la incorporación de AA utilizando inhibidores como ouabaína, que inhibe
la bomba sodio-potasio ATPasa generando un desequilibrio del gradiente electroquímico
47
del ión sodio, y citocalasina B, que inhibe los transportadores facilitativos de hexosas, se
observó que el transporte de AA fue mermado en aproximadamente un 80% al utilizar
ouabaína y no se vió afectado por el uso de citocalasina B (Figura 7, C). En el caso que
se reemplazó el sodio del medio de incubación por cloruro de colina se observó una
inhibición del transporte cercano al 90% lo que concuerda con la manera de funcionar de
los co-transportadores de sodio-ascorbato.
Por otro lado, al analizar funcionalmente los co-transportradores de sodio-ascorbato
en la línea celular de Sertoli 42GPA9 (Figura 8) se comenzó por estudiar el transporte de
AA y dicho ensayo indicó que la incorporación de AA es lineal por los primeros 10 min y la
velocidad inicial corresponde a 214 ± 43 pmoles/106 células/min (Figura 8, A círculos
llenos). Luego al analizar la dependencia del ión sodio para el transporte de AA 100 µM
se reemplazó este ión en el tampón de transporte por cloruro de colina y se observó una
disminución aproximada de un 75% de la incorporación. La velocidad inicial fue 71
± 34 pmoles/ 106 células/min (Figura 8, A círculos vacíos). Después se realizó un
ensayo de dosis respuesta durante 5 min de incorporación lo que resultó en que el
transporte de AA se ve saturado a concentraciones sobre los 150 µM (Figura 8, B).
Utilizando los datos de transporte se hace una gráfica de Eadie-Hofstee lo que nos revela
la presencia de al menos dos componentes funcionales distintos responsables del
transporte de AA en este
48
Figura 7: Los transportadores de ácido ascórbico (AA) son funcionales en células
de Sertoli de cultivo primario. Las células se sembraron en placas recubiertas con
colágeno y se mantuvieron en cultivo durante 7 días previos al ensayo. (A) Cinética de
incorporación de AA 100 µM a 32 ºC (R=0,9599). (B) Cinética de incorporación de AA 100
µM a 32 ºC durante los primeros 60 segundos (R=0,9897). (C) Efecto de distintos
inhibidores sobre la incorporación de AA 100 µM (32 ºC, 1 min). Cit B: citocalasina B,
Colina: cloruro de colina. ***p<0,001.
49
50
tipo celular y cada uno de estos componentes con distintas afinidades por el sustrato. El
componente de mayor afinidad presenta una Km aparente de 10-12 µM y una velocidad
máxima de 30-31 pmoles/106 células/min (Figura 8, C círculos vacíos), mientras que el
componente de menos afinidad tiene una Km aparente de 38 µM y una velocidad máxima
de 70-90 pmoles/106 células/min (Figura 8, C círculos llenos). Para seguir
caracterizando el transporte de AA en las células de Sertoli, se realizó un ensayo de dosis
respuesta a distintas concentraciones de sodio de AA 100 µM y se observó un efecto
cooperativo por la curva sigmoídea obtenida en la gráfica de la dosis dependencia (Figura
8, D). Para corroborar este resultado se utilizaron los datos del transporte para ser
analizados en un gráfico de Hill. Este método reveló una línea recta con un coeficiente de
Hill de 2.3 (Figura 8, E). Luego para confirmar que el transporte descrito anteriormente es
específico, se realizaron ensayos de inhibición del transporte de AA 100 µM durante 5 min
(Figura 8, F). Al utilizar floridzina (Phl), que es un inhibidor de los transportadores de
sodio-glucosa (SGLT), se redujo en un 75% la incorporación en relación al control. De
igual manera disminuyó el transporte de AA al utilizar el inhibidor ouabaína (Oua). En
cambio, al realizar los ensayos utilizando los inhibidores citocalasina E (Cit E), inhibe
SGLT1, y citocalasina B (Cit B) no se evidenció efecto alguno sobre el transporte de AA
que no disminuyó.
51
Figura 8: Los transportadores de ácido ascórbico son funcionales en células de
Sertoli de la línea 42GPA9. (A) Incorporación de
14
C-AA 100 µM a 32ºC por 600 s en
presencia de NaCl (●) o reemplazándolo con cloruro de colina (Ο). (B) Curva de dosis
respuesta de
14
C-AA en 5 min de incorporación a 32ºC. (C) Gráfica de Eadie-Hofstee en
relación a la dependencia del sustrato para
14
C-AA. (D) Curva de dosis respuesta a
distintas concentraciones de Na+ durante 2 min a 32ºC para
14
C-AA 100 µM. (E) Gráfica
de Hill en relación a la dependencia de sustrato para Na+. (F) Análisis del transporte de
14
C-AA 100 µM en presencia de diversos inhibidores durante 2 min de ensayo a 32ºC.
Los datos muestran el promedio ± DS de tres experimentos. Las líneas en los gráficos
corresponden a una regresión no-lineal (R>0.99) de una curva exponencial simple con dos
parámetros (A), hipérbola simple rectangular (B), sigmoídea con tres parámetros (D) y una
regresión lineal (C y E, R>0.98). En F los asteriscos indican la diferencia estadística en
relación a 21 controles (*p<0.01 y **p<0.001).
52
Angulo et al., (2008) J Cell Physiol. 217, 708-716.
53
De estos resultados obtenidos podemos concluir que la incorporación de ácido ascórbico
en células de Sertoli de cultivo primario de rata adulta es del tipo SVCT, y por lo tanto se
puede decir que la expresión de los transportadores es funcional. Además que la
incorporación de la vitamina C reducida en células de la línea de Sertoli 42GPA9 presenta
características cinéticas que concuerdan con las descritas para los co-transportadores de
sodio-ascorbato.
5.6 Estudio de la generación de una monocapa sellada in vitro por parte de las
células de Sertoli 42GPA9 cultivadas en sistemas bicamerales. Los sistemas
bicamerales han sido bastantemente utilizados para poder estudiar células que por un
lado forman monocapa y por otro se polarizan in vitro. Esto gracias a que el poro del
inserto otorga la posibilidad de que la célula este en contacto con los compartimentos,
apical y basal generados en dichos sistemas, permitiendo el paso de cualquier molécula
que pueda atravesar el poro de 0,4 µm. Las células de Sertoli son capaces de formar una
monocapa sellada gracias a la formación de uniones estrechas. El filtro poroso del inserto
recubierto con colágeno junto a los dos compartimentos existentes es estos sistemas,
permite polarizar esta monocapa simulando la organización del epitelio seminífero. Para
poder validar la formación de la monocapa sellada de las células de Sertoli 42GPA9 sobre
los insertos de los sistemas bicamerales se analizaron diversos parámetros, el primero de
ellos es si es que las células 42GPA9 eran capaces de crecer y de que forma lo hacían en
placas cubiertas o no con colágeno. Para ello se sembraron y cultivaron durante 18 días
células sobre placas tratadas y no tratadas con colágeno, observándose hasta los 12
primeros días que el crecimiento de células era parejo. Distinto fue el comportamiento a
54
partir del día 13 en adelante, ya que las células comenzaron a despegarse,
sugerentemente producto de su confluencia, y por lo tanto disminuyendo el conteo de
células (Figura 9, A). Así, todos los experimentos posteriores se realizaron recubriendo
las placas o insertos con colágeno antes de sembrar las células. Otro parámetro analizado
fue el paso del colorante azul de tripán a través de la monocapa formada por las células
42GPA9 ubicadas en el inserto apical hacía el compartimento basal. Para esto se tomaron
alícuotas desde el compartimento basal y se midió la absorbancia a 595 nm,
observándose que la absorbancia disminuía con el pasar de los días de cultivo (Figura 9,
B) llegando prácticamente a un 0%, en relación al control, a los 15 días de cultivo. Lo que
se puede visualizar al levantar el inserto (imagen dentro de la Figura 9, B). Por otro lado,
se analizó el paso de manitol radioactivo, ya que esta molécula es capaz de atravesar
trans-espitelialmente la capa celular. Esta molécula disminuyó drásticamente su paso con
el pasar de los días de cultivo, llegando el día 15 a menos de un 10% del paso observado
en el control (Figura 9, C). Por último se estudiaron dos parámetros más, la formación de
uniones estrechas mediante la utilización de anticuerpos específicos para la proteína ZO1, componente de dichas uniones, observando una inmunorreacción muy precisa en la
zona de la membrana plasmática (imagen dentro de la Figura 9, D), mientras que el
aumento de la resistencia eléctrica también otorgó datos que sustentan la formación de
una monocapa sellada, ya que a los 15 días de cultivo se puede ver un aumento de
alrededor de 5 veces con respecto a la resistencia medida al primer día (Figura 9, D).
Estos resultados son consistentes para confirmar que las células de la línea de Sertoli
42GPA9 son capaces de formar una monocapa sellada in vitro al ser cultivadas en
sistemas bicamerales.
55
Figura 9: Las células de Sertoli 42GPA9 son capaces de formar una monocapa
sellada. (A) Gráfica de crecimiento de las células 42GPA9 en presencia y ausencia de
colágeno. (B) Gráfica que muestra la difusión de azul de tripán en distintos días de cultivo
a través de la monocapa formada por las células de Sertoli 42GPA9, junto a una imagen
que muestra como la monocapa retiene el colorante en el inserto del sistema bicameral.
(C) Curvas de transporte transepitelial de manitol a distintos días de cultivo de células
42GPA9. (D) Arriba: Formación de uniones estrechas en cultivos de células de Sertoli
42GPA9 en sistemas bicamerales, arriba, inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo
específico contra la proteína ZO-1, las cabezas de flecha indican la inmunorreacción en
membrana plasmática de las células. Los núcleos fueron teñidos con DAPI y la barra de
magnificación corresponde a 3 µm. Abajo: gráfica de la resistencia eléctrica en relación de
los distintos días de cultivo de las células 42GPA9 en sistemas bicamerales.
56
57
5.7 Análisis del transporte de ácido ascórbico en células de Sertoli 42GPA9
cultivadas en sistemas bicamerales. Los sistemas bicamerales nos permiten polarizar
las células de Sertoli 42GPA9 cultivadas en el inserto de estos sistemas. Una vez que las
células llegan a confluencia generan una barrera biológica que se encuentra ubicada
sobre una matriz de colágeno. De esta forma, se procedió a realizar ensayos de transporte
de ácido ascórbico, a 32º C, en esta estructura celular para verificar si es que existe algún
grado de polarización de los transportadores de dicho sustrato (SVCT1 y SVCT2), tanto
hacia el lado apical como para el basolateral. Los ensayos de incorporación indicaron que
el transporte de AA se mantiene lineal por al menos 2 minutos, con una velocidad inicial
de 11,1 ± 1,5 pmoles/106celxmin al agregar el sustrato desde el compartimento apical
09(Figura 10, A). Mientras que al adicionar AA desde la zona basal se observó que la
incorporación se mantiene lineal durante los 3 primeros minutos con una velocidad inicial
de 18,4 ± 2,1 pmoles/106celxmin (Figura 10, A`). Por otra parte los ensayos de dosis
respuesta, realizados con incorporaciones de 1 minuto, arrojaron una curva de
saturación que muestra la presencia de un solo componente saturable al agregar AA
tanto apical como basolateralmente. Estas datos, ajustados a una regresión hiperbólica,
nos entregan valores cinéticos de Km= 45 ± 6 µM
y Vmax= 255 ± 44
pmoles/106celxmin (Figura 10, B) para las incorporaciones desde la zona apical
mientras que para las realizadas desde la región basolateral se obtuvieron valores de
Km= 53 ± 5 µM y Vmax= 540 ± 37 pmoles/106celxmin (Figura 10, B`). Al linealizar los
datos de las curvas de dosis respuesta utilizando el análisis de Eaddie-Hofstee se
observó la presencia de un sólo componente en ambos casos y se obtuvieron los
siguientes parámetros cinéticos: una Km aparente de 46 ± 3,5 µM y una Vmax de 296 ±
58
Figura 10: Las células de Sertoli formando monocapa son capaces de incorporar
ácido ascórbico tanto desde el polo apical como basolateral. Transporte de AA en
células de Sertoli 42GPA9 cultivadas en sistemas bicamerales recubiertos con una matriz
de colágeno. En (A, A´), cinética de incorporación de ácido ascórbico 100 µM a 32ºC
desde los compartimentos apical (R: 0.9935) y basolateral (R. 0,9993), respectivamente.
En (B, B´), curva de dosis respuesta utilizando ácido ascórbico a distintas concentraciones
durante 1 minuto a 32ºC desde los compartimentos apical (R: 0.9986) y basolateral (R:
0.9963) respectivamente. En (C, C´), análisis de Eaddie-Hofstee de los datos obtenidos en
las curvas de saturación (B, B´). Sobre las gráficas se ubican los esquemas de cómo se
realizaron los ensayos aplicando el sustrato radiactivo en ambos polos.
59
Apical
Basolateral
60
39 pmoles/106celxmin (Figura 10, C) para los ensayos realizados apicalmente, y una
Km aparente de 54 ± 3 µM junto a una Vmax de 490 ± 30 pmoles/106celxmin (Figura
10, C`) para los ensayos realizados en el compartimento basal.
Los parámetros cinéticos obtenidos muestran que no se logró observar una polarización
los transportadores SVCTs en las células de Sertoli 42GPA9 formando monocapa, ya
que según los valores de Km obtenidos no se puede discriminar entre la presencia de
un transportador u otro al analizar los datos de transporte apicales y basolaterales. Sin
embargo, los valores de Vmax (296 ± 39 pmoles/106celxmin apical y 490 ± 30
pmoles/106celxmin basolateral) nos indicarían que podríamos encontrar una mayor
cantidad de transportador, ya sea SVCT1 o SVCT2, en la membrana basolateral debido
a que este parámetro se encuentra aumentado en la región basal en comparación con
la apical.
5.8 Análisis in sílico de las secuencias aminoacídicas de los SVCTs de humano, rata
y ratón que serían determinantes en la polarización intracelular de estos
transportadores. Con el fin de identificar los determinantes moleculares que dictarían la
ubicación subcelular del transportador humano SVCT1 en células que generan epitelios
polarizados, Subramanian et al. en el 2004 realizaron mutaciones progresivas en la cola
C-terminal de este transportador en células renales e intestinales y delimitaron una
secuencia de 10 aminoácidos (PICPVFKGFS), esta región es la que estaría involucrada
en la polarización intracelular, específicamente apical, de hSVCT1. En la Figura 11, A se
presenta parte de los resultados expuestos por Subramanian et al., 2004 donde a la
61
Figura 11: Secuencia consenso en la cola C-terminal determinaría ubicación apical
en los transportadores SVCT´s. Estudio in sílico de la secuencia PICPVFKGFS y su
influencia en la ubicación intracelular de los transportadores SVCT´s. (A) Análisis de la
secuencias C-terminal de los transportadores SVCT1 de humano (h), rata (r) y ratón (m)
comparándolas con las secuencias de ubicación apical del transportador de glutamato
sodio dependiente humano 3 (EAAT-3) VNGGFA/S, destacado en gris, y con la secuencia
que genera un giro beta y ubicación apical en transportadores de ácidos biliares
dependientes de sodio de rata (Asbt) T N K G F Q, destacados en amarillo. (AII)
Predicción de la localización de giros beta utilizando un modelo de residuos acoplados
en tetrapéptidos dentro de secuencias putativas para la ubicación apical de hSVCT1.
(B) Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de las colas C-terminales
descubiertas en las isoformas SVCT1 y SVCT2 de humano (h), rata (r) y ratón (m), con
la secuencia consenso PICPVFKGFS. En color rojo se destacan los aminoácidos
hidrofobicos, en magenta los básicos y en verde los básicos que poseen grupos hidroxilo o
amino. (*) corresponde a la identidad absoluta en todas las secuencias, (.) a
sustituciones semi-conservadas y (:) a sustituciones conservadas de acuerdo al patrón
de colores.
62
Subramanian et al. (2004) J Biol Chem. 279, 27719-28
63
derecha del panel se muestra un alineamiento de secuencias aminoacídicas de las colas
C-terminales de los transportadores SVCT1 de humano (h), rata (r) y ratón (m) junto con la
secuencias C-terminales del transportador de glutamato sodio dependiente humano 3
(EAAT-3) y la del transportador de ácidos biliares dependientes de sodio de rata (Asbt),
VNGGFA/S (destacada en gris) y TNKGFQ (destacada en amarillo), respectivamente. Se
observa una gran identidad entre las secuencias de SVCT1 de las distintas especies y la
secuencia que dicta la ubicación apical del transportador EAAT-3 en células MDCK, ya
que 4 de 6 aminoácidos coinciden. Así también se correlacionan los residuos de la cola Cterminal del transportador hSVCT1 con la secuencia que, además de determinar la
polarización apical del transportador Asbt, produce un giro beta en esta zona de la
proteína, ya que 3 de 5 aminoácidos están conservados. Luego se quiso analizar si es que
la secuencia VFKGFS en hSVCT1 podría conferir un giro beta que ubique al transportador
apicalmente y se aplicó un método predictivo para identificar giros beta en proteínas. Así
se llegó al análisis de Chou que corresponde a un modelo que estudia residuos acoplados
en tetrapéptidos generando una razón (∆) donde los valores ∆>0 indican que el
tetrapéptido forma un giro beta (Chou, 1997). Utilizando este método se obtuvo que el
tetrapéptido VFKG entrega un valor idóneo para generar un giro beta en relación a otros
tetrapéptidos presentes en la secuencia C-terminal del transportador hSVCT1 (Figura 11,
A gráfico a la derecha). Al realizar un alineamiento de secuencias aminoacídicas del
transportador de AA SVCT2, de humano (h), rata (r) y ratón (m) con la secuencia
consenso descrita por Subramanian et al. (2004) en la isoforma hSVCT1 PICPVFKGFS
se observó que existe un gran porcentaje de identidad ya que 5 de 10 residuos coinciden y
además que de los 5 aminoácidos de SVCT2 (de humano, rata y ratón) que no coinciden
64
con la secuencia consenso, 2 corresponden con el carácter básico y polar entregando así
solo una real diferencia en 3 aminoácidos (Figura 11, B).
De este estudio in sílico podemos concluir que efectivamente la isoforma SVCT1 de las
especies humana, rata y ratón presenta una secuencia en el extremo C-terminal
(PICPVFKGFS) que por un lado permitiría dar origen a un giro beta y por otro dictaría la
ubicación apical del transportador en células que forman epitelio. Por otro lado, la isoforma
SVCT2 de las especies humana, rata y ratón también posee una secuencia en el extremo
C-terminal muy similar a la presente en SVCT1 que permitiría su polarización apical en
células que forman epitelios.
5.9 Análisis de las construcciones SVCT1-YFP y SVCT2-GFP y su expresión en las
células de Sertoli 42GPA9. La utilización de proteínas fusionadas a proteínas
fluorescentes para poder seguir su tráfico o simplemente localizarlas dentro de la célula,
es una técnica que se ha utilizado rutinariamente en los últimos años. La “proteína
fluorescente verde” o GFP (green fluorescent protein) es sólo una de las más usadas, por
ejemplo se utiliza GFP fusionado a una proteína (MS2) que se une a loops de RNA para
detectar el tráfico de estos mRNA en células vivas como fibroblastos (Querido et al.,
2008). Por otro lado la “proteina fluorescente amarilla” o YFP (yellow fluorescent protein)
también ha sido utilizada, específicamente para los transportadores de ácido ascórbico, ya
que en el año 2004 Subramanian y su grupo lograron detectar una secuencia que permite
la ubicación apical de SVCT1 humano en epitelios polarizados, como fue mencionado
anteriormente, haciendo uso de la proteína de fusión hSVCT1-YFP, de la cuál se
generaron diversas mutantes. En la Figura 12 se muestran los resultados de las
65
Figura 12: Confirmación de la presencia y ubicación adecuada de la secuencia de
los transportadores SVCT1-2 en los vectores, junto a la expresión de las proteínas
de fusión SVCT1-YFP y SVCT2-GFP en células de Sertoli 42GPA9. (A) a la izquierda,
transfección de células 42GPA9 utilizando el vector de expresión SVCT1-YFP visualizada
mediante microscopía confocal. La flecha indica el núcleo de la célula transfectada. A la
derecha, digestiones del plásmido pEYFP-N1 que contiene inserto la secuencia del
transportador SVCT1. El carril más a la izquierda corresponde a la corrida del estándar de
pares de base. En el carril 1, vector sin digerir. En el carril 2, vector digerido con las
enzima XhoI. En el carril 3, vector digerido con la enzima BamHI. En el carril 4, vector
digerido con las enzimas BamHI y XhoI. En (B), a la izquierda, transfección de células
42GPA9 con SVCT2-GFP observada por microscopía confocal. Las flechas indican los
núcleos de las células transfectadas. A la derecha, digestiones del plásmido pEGFP-N1
con un inserto que codifica para la secuencia del transportador SVCT2. El carril más a la
izquierda corresponde a la corrida del estándar de pares de base. Carril 1, vector sin
digerir. Carril 2, vector digerido con HindIII. Carril 3, vector digerido con Ecori y BamHI.
Carril 4, vector digerido con BamHI. Carril 5, vector digerido con XhoI. Las barras de
magnificación corresponden a 20 µm en ambos casos. En los geles las flechas indican las
bandas más destacadas de cada digestión.
66
67
transfecciones realizadas en células de Sertoli 42GPA9, utilizando los plásmidos pEYFPN1 y p-EGFPN1, quienes poseen un inserto que codifica para SVCT1 y SVCT2,
respectivamente. SVCT1-YFP se observa de color amarillo en todo el citoplasma, incluso
en las prolongaciones de las células de Sertoli (Figura 12 A, a la izquierda), a la derecha
de la imagen podemos observar el gel control, donde se cargaron las distintas digestiones
del plásmido con el inserto para ratificar su presencia. El carril ubicado más hacia la
izquierda se cargó el estándar de pares de bases, en el carril número 1 se cargó el
plásmido sin digerir observándose las dos formas que adquieren estas estructuras, la
enrollada (coiled, más retrasada en la corrida) y la sobre-enrollada (supercoiled, que
avanza más en el gel), no pudiéndose revelar el peso adecuado del plásmido más el
inserto que es de 6.5 Kb. En el carril 2 se digirió el plásmido con la enzima de restricción
XhoI el cuál corta 20 pb río arriba del sitio donde está ubicado el inserto (el inserto se
encuentra entre los sitios de corte para HindIII y SacII, ver Figura 2 donde están
especificados los sitios de múltiple clonamiento) y 20 pb río abajo desde donde comienza
la secuencia del transportador, obteniendo así el plásmido prácticamente linealizado con
un peso de alrededor de 6.5 Kb. En el carril 3 se utilizó la enzima BamHI para digerir,
resultando dos bandas, una de alrededor de 900 pb y otra de 5.6 Kb lo que concuerda con
el corte en posición 905 (de un total de 1887 bases) de la secuencia de SVCT1, junto al
que ocurre 10 pb río abajo de donde termina la secuencia del transportador. En el carril 4
se realizó una digestión doble utilizando ambas enzimas mencionadas, XhoI y BamHI,
para liberar el inserto ya que ambas enzimas flanquean los sitios de inserción de la
secuencia del transportador adicionado. De este ensayo se obtuvieron distintas bandas, la
más pequeña que coincide con la observada al digerir con BamHI más la que se obtiene
68
de la doble digestión, o sea dos bandas de alrededor de 900 pb. Luego se observa una
banda bien marcada alrededor de las 5 Kb lo que corresponde al plásmido sin el inserto
(Figura 12 A, a la derecha). Así mismo, SVCT2-GFP se expresa al transfectar las células
de Sertoli 42GPA9, también en la región citoplasmática, observándose de una manera
similar, en relación a la abundancia, que SVCT1-YFP (Figura 12 B, a la izquierda). A la
derecha de esta imagen también ubicamos el gel control, donde también se realizaron
diversas digestiones del vector SVCT2-GFP que esta inserto entre los sitio de corte para
EcoRI y SacII. El carril más a la izquierda corresponde al estándar de pares de bases. El
carril número 1 contiene el plásmido sin digerir, visualizándose también ambas formas
coiled más retrasada en el gel y super-coiled que avanza más en la corrida. El carril
número 2 contiene la digestión usando la enzima HindIII para linealizar el plásmido,
observándose una banda de alrededor de 6.7 Kb, que corresponde con el único sitio de
corte que se presenta en la secuencia de múltiple clonamiento, sin encontrarse algún sitio
en la secuencia del transportador para que esta enzima corte. En el carril número 3 se
realizó una digestión doble con las enzimas EcoRI y BamHI, para tratar de liberar gran
parte del inserto. Al utilizar estas enzimas se obtuvieron bandas de entre 500 y 600 pb,
que se pueden visualizar muy levemente en el gel, sin embargo, se observa claramente
una banda de alrededor de 800 pb. Estas 3 bandas corresponden a los cortes generados
por BamHI en la secuencia de SVCT2. También se puede ver la banda del plásmido sin el
inserto a nivel de las 4.6 a 4.7 Kb. En el carril número 4 se digirió usando solamente
BamHI para cerciorarse que el inserto se encuentra bien posicionado, y se obtuvieron las
bandas esperadas, una banda que se observa levemente de alrededor de 500 pb, otra
más intensa de 800 pb y por último se observa la banda del plásmido más una parte del
69
inserto (de cerca de 640 pb) alrededor de los 5.3 Kb. En el carril número 5 se utilizó la
enzima de restricción XhoI, que tiene un sitio de corte un par de bases río arriba
flanqueando el inserto y otro dentro del inserto en la posición 527. Por lo tanto, de esta
digestión podemos visualizar levemente una banda alrededor de las 500 pb más la banda
que corresponde al plásmido con la sección del inserto que se ubica en la región cercana
a las 6.2 Kb (se observa más arriba que la de la digestión anterior que era de 5.3 Kb)
(Figura 12 B, a la derecha).
De estos resultados podemos concluir que las secuencias de los transportadores SVCT1 y
SVCT2 insertos se encuentran dentro de los vectores y están bien posicionados. Además,
las proteínas de fusión SVCT1-YFP y SVCT2-GFP son expresadas al transfectar el
sistema celular en uso, localizándolas en la membrana plasmática y principalmente en la
región del citoplasma.
5.10 Estudio de la ubicación subcelular y funcionalidad del transportador de AA
SVCT2 acoplado a la proteína fluorescente (GFP) en células de Sertoli 42GPA9
formando monocapa in vitro. El vector de expresión SVCT2-GFP, analizado
anteriormente, fue utilizado para transfectar células de Sertoli 42GPA9 formando una
monocapa in vitro. Estas fueron cultivadas en placas de 12 pocillos recubiertas con
colágeno para generar una matriz y así polarizar la monocapa que se formará con las
células de Sertoli. De esta forma podemos identificar que el polo inmediatamente en
contacto con esta matriz corresponde al basal y el que está hacia el medio de cultivo es el
polo apical. Las células cercanas a un 100% de confluencia se transfectaron utilizando el
plásmido mencionado anteriormente mediante ensayos de electroporación, a 280 Voltios
70
durante 80 µsegundos, y se estudió la expresión mediante microscopía confocal y la
funcionalidad realizando incorporaciones de AA a las 24, 48 y 72 horas luego de
transfectar. Se observó que a las 48 horas post-transfección cerca de un 90% de las
células se encontraban expresando el transportador SVCT2-GFP. La expresión
transportador SVCT2 fusionado a GFP, que se visualizó por microscopía confocal no
presenta una polarización significativa hacia alguno de los polos de la monocapa formada
por las células de Sertoli, como se puede apreciar en color verde en ambas zonas de la
barrera biológica formada (Figura 12, A). Sin embargo, cabe destacar que existe un leve
aumento en la expresión de SVCT2-GFP hacia la zona apical en comparación a la
basolateral. Lo que fue corroborado al realizar más ensayos de transfección en células
formando monocapa, donde también se observó una ubicación apical de la proteína
recombinante más convincente (datos no mostrados). Por otro lado, al efectuar ensayos
de incorporación de AA en las células transfectadas con SVCT2-GFP se analizó la
funcionalidad del transportador. Estos ensayos se realizaron a 37ºC incorporando AA 100
µM durante 2 minutos a las 24, 48 y 72 horas posteriores a la transfección. Los datos
obtenidos indican que efectivamente el transportador es funcional, y que la incorporación
de AA llega a un peak, en concordancia con la expresión, a las 48 horas posteriores a la
transfección (Figura 12, B), en comparación a los ensayos realizados a las 24 y 72 horas
post-transfección.
71
Figura 13: SVCT2-GFP se expresa en ambos polos de la barrera formada por células
de Sertoli 42GPA9 y dicha expresión es funcional. (A) Análisis por microscopía
confocal de la expresión de SVCT2-GFP en células de Sertoli crecidas sobre cubre
objetos de vidrio los cuales se encontraban cubiertos por una matriz de colágeno. La
imagen elegida fue tomada a las 48 horas post-transfección, debido a que a las 24 y 72
horas luego de transfectar no se observó expresión. Los paneles de mayor tamaño
corresponden a una imagen tomada en el plano x-y (líneas amarillas con series z
proyectadas). Los paneles rectangulares inferiores y a la derecha son imágenes de las
secciones verticales xz e yz, respectivamente. Las líneas en blanco muestran la ubicación
de una célula en particular. (B) Porcentaje de incorporación de ácido ascórbico 100 µM (2
min. de captación a 37 ºC), en relación al control, en cultivo de células de Sertoli 42GPA9
transfectadas con y SVCT2-GFP después de 24, 48 y 72 horas posterior a la transfección.
Los controles fueron transfectados utilizando el vector sin inserto.
72
A
B
73
Los resultados obtenidos, luego de realizar las transfecciones junto a los ensayos de
transporte, indican que al sobreexpresar el transportador SVCT2-GFP en las células de
Sertoli 42GPA9 formando monocapa, no se evidencia una clara y significativa polarización
de este, aunque es posible observar un leve aumento de la expresión en la cara apical al
compararla con la zona basolateral. Cabe destacar que dicho aumento en la expresión se
logra a las 48 horas post-transfección, lo cuál concuerda totalmente con el aumento de la
incorporación de AA a ese mismo tiempo, al compararlo con los ensayos de transporte a
las 24 y 72 horas post-transfección.
74
6. DISCUSIÓN.
La salud reproductiva del hombre se ha visto mermada en las últimas décadas, ha sufrido
cambios adversos, lo que ha despertado la atención pública y más aún científica. Muchos
reportes indican que en estos momentos existe una disminución de la calidad así como
también en la cuenta espermática. Además, es común ver como aumentan los casos de
malformaciones congénitas en los órganos reproductores masculinos, como la hipospadia
(uretra ubicada en un sector no usual del órgano genital) y la criptoquídea (ausencia de
uno de ambos testículos en el escroto), de igual manera ocurre con los casos de cáncer
testicular que se hacen cada vez más frecuentes (Monsees et al., 2000). Lo mismo está
ocurriendo en el reino animal donde los problemas reproductivos van en aumento (Irvine,
2000). Todas estas complicaciones indican que la fertilidad masculina, en humanos y
animales, se está viendo afectada por factores principalmente ambientales. La exposición
a contaminantes es una de las claves de estos cambios, ya que por ejemplo existen
perturbaciones hormonales generadas por moléculas con propiedades estrogénicas o
antiandrogénicas presentes en el ambiente. Otros factores más personales como el estilo
de vida, estrés ocupacional, mala alimentación y el consumo excesivo de cigarrillos y
alcohol pueden afectar también la fertilidad. Por otro lado, drogas, plastificantes, solventes
orgánicos, pesticidas y metales pesados utilizan como blanco a células del sistema
reproductor masculino, específicamente a las células de Sertoli (Monsees et al., 2000;
Pflieger-Bruss et al., 2004; Irvine, 2000). Estas células son las encargadas de permitir un
desarrollo adecuado de la línea germinal masculina debido a que por un lado generan un
ambiente especializado para el desarrollo de estas células, formando la barrera hemato-
75
testicular (gracias a uniones estrechas generadas entre ellas) que impide el paso de
sustancias tóxicas, y por otro lado entregan soporte mecánico y nutricional al linaje
germinal masculino. Por lo mencionado anteriormente, es crucial que estas células no se
vean afectadas para así alcanzar un desarrollo del tejido testicular morfo y fisiológico
apropiado.
Para contrarrestar estos efectos nocivos en contra de la salud reproductiva se han
realizado diversos estudios utilizando una molécula con características muy particulares,
vitamina C. Esta vitamina, que no podemos sintetizar por lo que sólo la adquirimos de la
dieta, se encuentra muy concentrada en el tejido testicular, observándose una
concentración de 200 µM la que es alrededor de 4 veces mayor que la plasmática (Moser
et al., 1987). Además, es indicada como una molécula antioxidante por excelencia ya que
es capaz de neutralizar la oxidación de biomoléculas, por ejemplo en espermatozoides
protege del daño oxidativo al DNA previniendo la formación de nucleósidos oxidados, lo
que genera mutaciones que podrían ser causantes de malformaciones (Fraga et al.,
1991), mientras que a nivel de membrana plasmática disminuye la lipoperoxidación, lo que
ayuda a restaurar la integridad de la membrana como también a una motilidad adecuada.
Vitamina C ingresa a las células gracias a dos sistemas de transportadores, los GLUTs y
los SVCTs. La forma oxidada (DHA, ácido deshidroascórbico) lo hace mediante un
sistema bidireccional, de menor afinidad pero de mayor capacidad, los GLUTs, mientras
que la forma reducida (AA, ácido ascórbico) lo hace por medio de un sistema
unidireccional, activado por el ión sodio, de mayor afinidad pero de menor capacidad, los
SVCTs.
76
Bajos niveles de ácido ascórbico están asociados a características como un bajo conteo
de espermatozoides, alto número de espermatozoides anormales, baja motilidad,
aglutinación y degeneración del epitelio germinal masculino (en cobayos) (Lindsay &
Medes, 1926). Estudios han reportado que al administrar ácido ascórbico mejoran todos
estos fenómenos causados por la falta de esta vitamina, por lo que podemos decir que
esta molécula tiene una función crucial en cuanto a la integridad del túbulo seminífero y la
funcionalidad espermática, ya que al reestablecerse en concentraciones adecuadas se
mejoran los rasgos reproductivos (Luck et al., 1995; Sònmez et al., 2005).
Para estudiar cómo vitamina C difunde a través del tejido testicular, nos propusimos
estudiar este mecanismo a nivel de células de Sertoli, específicamente cómo esta
molécula es capaz de atravesar la barrera hemato-testicular. Se comenzó realizando
ensayos de inmunofluorescencia para detectar un buen marcador de células de Sertoli.
Acertadamente se utilizaron anticuerpos específicos contra la proteína WT1, lo que
permitió inmunolocalizarlo principalmente en la zona basal del túbulo donde se encuentran
los núcleos de las células de Sertoli, al realizar los ensayos de inmunofluorescencia en
cortes de tejido. La ubicación preferencialmente cerca del núcleo, que presenta el
marcador WT1, puede explicarse debido a que a que es un factor de transcripción.
Además, no se observa inmunorreación con las células germinales en la zona medial del
túbulo, lo que se corroboró al utilizar el marcador de células germinales, protamina, el cual
se inmunodetectó efectivamente en esta zona del túbulo. Resultados positivos se
obtuvieron también al utilizar anticuerpos específicos contra el marcador WT1 en cultivo
primario de células de Sertoli de rata adulta y de la línea celular de Sertoli 42GPA9
(inmortalizada de ratón). De esta forma, contamos con un marcador específico, que
77
mantiene su expresión hasta por al menos 15 días en cultivos primarios (datos no
mostrados), y que nos permite detectar diferencialmente las células de Sertoli de las
células germinales.
Luego de identificar y haber ratificado la utilidad de WT1 como un buen marcador de
células de Sertoli, nos propusimos analizar la expresión de los transportadores de vitamina
C reducida (AA) SVCT1 y SVCT2 en cortes de testículo de rata. Los SVCTs fueron
descritos por primera vez en el año 1999 en tejido testicular de rata por Tsukaguchi et al.
específicamente la isoforma SVCT2 en células intersticiales y espermatocitos mediante la
técnica de hibridación in situ. Mientras que en el mismo año Daruwala et al. clonó ambas
isoformas humanas (hSVCT1 y hSVCT2)
desde una biblioteca de cDNA de riñón
humano, utilizando ovocitos de Xenopus leavis como sistema de expresión observando
que ambos transportadores expresados eran funcionales. Los datos obtenidos de las
inmunofluorescencias en cortes de testículo de rata nos indican que tanto SVCT1 como
SVCT2 están presentes en el túbulo seminífero, ya que inmunolocalizan tanto en células
de Sertoli, células germinales y espermatozoides. Sin embargo, ambas isoformas
presentan distintas intensidades de señal inmunorreactiva. SVCT2 se observa de manera
mucho más abundante a lo largo de todo el túbulo, desde las células de Sertoli pasando
por todo el linaje germinal hasta las cabezas y colas de los espermatozoides, en relación
a SVCT1 que sólo inmunorreacciona de manera precisa principalmente en células de
Sertoli y colas de espermatozoides. Cabe destacar que la inmunorreaccion de SVCT2 es
mucho más intensa en las células de Sertoli en comparación con la de SVCT1. Esto se
puede advertir gracias a la co-inmunorreacción con WT1 principalmente en la zona basal.
Sin embargo, es relevante advertir que no se puede definir algún grado de polarización
78
tanto hacia el polo apical o basal de SVCT2 en los cortes, sólo un aumento de
inmunolocalización de SVCT2 por sobre SVCT1. Algo similar ocurre al realizar los mismos
ensayos en células de Sertoli extraídas de cultivos primarios de ratas adultas. En ese
caso, al igual que en los cortes de testículo, se observa también una inmunolocalización
más intensa y abundante del transportador SVCT2 en relación a SVCT1. Por su parte, en
las células de Sertoli de la línea 42GPA9 observamos una inmunodetección equivalente
para ambas isoformas, aunque con patrones distintos: más punteado para SVCT1,
mientras que más homogéneo para SVCT2.
La forma reducida de la vitamina C, ácido deshidroascórbico (DHA), ingresa a las células
gracias a los transportadores facilitativos de hexosas GLUTS (Vera et al., 1993). En
testículo se ha descrito la presencia de distintas isoformas de estos transportadores
específicamente en células germinales y espermatozoides (Rauch et al., 2005; Angulo et
al., 1998). Sin embargo, en células de Sertoli no existen reportes de la existencia de
alguna de las isoformas de los GLUTs. La presencia de estos transportadores en las
células de Sertoli es importante, ya que el transporte de DHA mediado por los GLUTs es
uno de los mecanismos con las que se puede aumentar las concentraciones intracelulares
de AA gracias al efecto “bystander” (Nualart et al., 2003). Debido a esto nos propusimos
analizar la inmunolocalización de estos transportadores en las células de Sertoli de cultivo
primario y de la línea celular 42GPA9, utilizando anticuerpos específicos para distintas
isoformas de los GLUTs. Nuestros resultados indican que en cultivos primarios de células
de Sertoli de rata adulta se observa que principalmente inmunorreaccionan las isoformas
GLUT1, GLUT2, GLUT3 y GLUT4. Mientras que GLUT8 presenta una señal
inmunorreactiva bastante escasa. GLUT5 no se inmunodetecta en estas células. Al
79
realizar el mismo ensayo en las células de Sertoli 42GPA9 observamos que todas las
isoformas tratadas inmunorreaccionan positivamente con distintas intensidades. Las
isoformas que presentan una mayor señal inmunorreactiva son GLUT1, GLUT3 y GLUT5.
Las diferencias entre ambos sistemas celulares, con respecto a las inmunodetecciones, se
puede deber a que los dos tipos provienen de especies distintas, el cultivo primario
proviene de testículo de rata, mientras que las células de Sertoli 42GPA9 son células
inmortalizadas a partir de testículo de ratón. Además, existe la posibilidad de que las
líneas celulares, a medida que aumentan el número de pasajes, tiendan a cambiar sus
patrones de expresión y a desdiferenciarse, encontrando así, proteínas expresadas en
distintos niveles en un tipo celular en comparación con en el otro, como es este el caso.
Los dos sistemas que transportan vitamina C, tanto AA como DHA, presentan distintas
afinidades por sus respectivos sustratos. Para los SVCTs, el parámetro cinético que
permite comparar la afinidad por el sustrato, Km, está definido en el orden de µM (70-230
µM para SVCT1, y 20-100 µM para SVCT2), mientras que para los GLUTs el mismo
parámetro se encuentra en el orden de mM (GLUT1 0,8-1,1 mM, GLUT2 4-6 mM, GLUT3
1,4-2 mM y GLUT4 0,9-1 mM) (Vera et al., 1993; Rumsey et al., 1997; Rumsey et al.,
2000; Godoy et al., 2007). Además, es necesario destacar que del “pool” de vitamina C
existente que circula por nuestro organismo, cerca del 98% se encuentra reducido, ósea
como ácido ascórbico, y solo el 2% restante se encuentra oxidado como ácido
deshidroascórbico (Schora et al., 1996). Entonces, debido a que los SVCTs presentan
mayor afinidad por AA que los GLUTs por DHA y que cerca del 100% de la vitamina C
circulante lo hace la forma reducida (AA), o sea como sustrato para los SVCTs, nos
enfocamos en utilizar a los SVCTs, por sobre los GLUTs, como modelo de estudio para
80
analizar cómo la vitamina C es capaz de atravesar la barrera hemato-testicular y llegar
desde el torrente sanguíneo hasta las células germinales pasando por las células de
Sertoli.
Para esto, comenzamos por estudiar si es que los transportadores de ácido ascórbico
(AA) que habíamos encontrado en las células de Sertoli de cultivo primario y en la línea
celular 42GPA9 eran funcionales. Los resultados obtenidos indican que efectivamente en
ambos sistemas celulares los transportadores de ácido ascórbico (SVCTS) son
funcionales, observándose en células de cultivo primario de rata adulta un transporte lineal
de AA 100 µM, a 32ºC, hasta al menos 2 minutos alcanzando el equilibrio alrededor de los
5 minutos con una velocidad inicial de 754±50 pmoles/106células x min. Al analizar la
especificidad del transporte utilizando inhibidores se obtuvo que, al tratar con ouabaína
(inhibidor de la bomba Na+/K+ ATPasa) y al reemplazar el cloruro de Na+ del tampón de
transporte por cloruro de colina, disminuyó drásticamente la incorporación de AA lo que
no ocurrió al tratar con el inhibidor de los GLUTs, citocalasina B. Mientras que en las
células de Sertoli 42GPA9 se observó que la incorporación de AA 100 µM, a 32 ºC, se
mantiene lineal hasta los 10 minutos con una velocidad inicial de 214 ± 43 pmoles/ 106
células/min, y que a los 5 minutos de incorporación el transporte se satura alrededor de
los 150 µM de AA. Además, los ensayos cinéticos indican que la incorporación AA
presenta dos componentes, uno de mayor afinidad que correspondería a SVCT2, Km 1012 µM, con una Vmax de 30-31 pmoles/106células x minuto, y uno de menor afinidad que
correspondería a SVCT1, con una Km de 38 µM y una Vmax de 70-90 pmoles/106células
x minuto. Analizando los resultados del ensayo de dependencia del ión Na+ podemos
observar que al aumentar las concentraciones de Na+ la velocidad del transporte se
81
expresa, en la gráfica, como una curva sigmoidea, y que al estudiar los datos de
transporte en la ecuación de Hill obtenemos un coeficiente de Hill igual a 2. Más aún, al
hacer uso de distinto inhibidores, como ouabaína y floridzina, que disminuyeron
radicalmente el transporte de AA se puede asegurar que la incorporación de este sustrato,
tanto en células de cultivo primario como en las células de la línea 42GPA9, es
específicamente mediada por los SVCTS. Cabe mencionar que no se realizó una
caracterización cinética más acabada en las células de cultivo primario debido a que por
un lado el número las células obtenidas sólo crecen en tamaño y no en número, y por otro
lado las células que se obtienen de un cultivo primario no son más de 2 millones, lo que es
insuficiente para una caracterización cinética completa.
Luego de haber investigado la presencia de los transportadores de AA (SVCT1 y SVCT2)
en células de Sertoli de cultivo primario y de la línea 42GPA9, y que además la
incorporación de este sustrato es específicamente del tipo SVCT, nos dedicamos a
examinar qué sucede con los transportadores de AA en las células de Sertoli formando
una monocapa in vitro, simulando la barrera hemato-testicular, y emulando lo que ocurre
in vivo en los túbulos seminíferos. Para esto comenzamos experimentando qué sucedía
con las células cultivadas sobre una matriz de colágeno que simule una lámina basal,
obteniendo una mantención del número de células hasta por lo menos 20 días de cultivo.
Estas células se mantenían pegadas a la matriz, no así al cultivarlas sin colágeno, ya que
al día 12 de cultivo las células se despegaban y por consiguiente morían. Teniendo un
soporte que imita una lámina basal como es el colágeno, que por lo demás es el principal
componente de la lámina basal del túbulo seminífero, realizamos ensayos que
comprueben la formación, mantenimiento e integridad de una barrera celular generada por
82
uniones estrechas como la resistencia eléctrica transepitelial (TER), difusión restringida de
colorantes y otras moléculas marcadas radiactivamente como 3H-manitol en sistemas
bicamerales, los cuales permiten polarizar las monocapas generadas por las células
(Byers et al., 1986; Janecki & Steinberger 1986; Wong et al., 2000; Chung & Cheng 2001;
Djakiew & Onoda 1993; Mruk & Cheng 2004). Al utilizar el colorante azul de tripán como
molécula reportera de la formación de una monocapa celular sellada, se observó que a
medida que aumentan los días el paso de este colorante disminuye drásticamente, es así
como al día 15 de cultivo prácticamente menos de un 4% del total de colorante adicionado
es capaz de atravesar la barrera celular, visualizándose como queda gran parte del
colorante ubicado en el inserto del sistema bicameral. Por otro lado, cuando usamos una
molécula que es capaz de difundir transcelularrmente como lo es manitol, el cual estaba
marcado radiactivamente (3H-manitol) para poder medirlo, también disminuyó su paso a
través de la monocapa generada por las células de Sertoli alrededor del día 15, donde
menos de un 3% del 3H-manitol total fue capaz de difundir por la barrera formada.
Además, al utilizar uno de los ensayos mayormente descritos en la literatura para
confirmar la formación de una monocapa sellada, como es la resistencia eléctrica
transepitelial, conseguimos obtener un aumento correlacionado con los ensayos
anteriores, obteniendo también al día 15 del cultivo un incremento de alrededor de 4 veces
la resistencia eléctrica en relación al control, que fue medida en el sistema bicameral sin
células. El valor obtenido, a los 15 días de cultivo, fue alrededor de 210 ohm x cm2. Este
valor es mucho más bajo que los obtenidos al analizar otros sistemas celulares que
generan monocapas selladas como las células Marbin-Darby de riñón canino (MDCK) o
queratinocitos, que llegan a valores de 1000-2000 ohm x cm2. Sin embargo, existen
83
estudios que reportan valores de 100 ohm x cm2 para la monocapa sellada formada por
células de Sertoli in vitro, lo que sólo sugiere que las uniones estrechas generadas por
estas células in vitro son moderadamente estrechas en comparación a otros tipo celulares
(Gumbiner & Simons, 1986; Balda et al., 1991; Balda et al., 1993; Mruk & Cheng, 2004).
Por último, corroboramos la expresión de la proteína ZO-1 (zona occludens-one), que está
asociada a la zona citoplasmática de las uniones estrechas (Balda et al., 1993), en las
células de Sertoli cultivadas in vitro formando barrera, específicamente a nivel de la
membrana celular. Todos estos datos son consistentes para poder ratificar que las células
de Sertoli cultivadas in vitro son capaces de formar una monocapa sellada, íntegra y que
limita el paso de sustancias transcelularmente. Ahora, existen estudios recientes que han
demostrado que la inclusión de andrógenos, cAMP, e inhibidores de proteasas a cultivos
de células de Sertoli durante la formación de una capa sellada, pueden aumentar la
estrechez de la permeabilidad de la barrera in vitro. Demostrando así que existen muchos
factores in vivo que son capaces de contribuir a la estrechez de la barrera celular (Chung
& Cheng, 2001; Janecki et al., 1991-1992; Okanlawon & Dym, 1996; Mruk & Cheng,
2004).
Luego de haber generado un modelo in vitro de barrera hemato-testicular cultivando
células de Sertoli 42GPA9 en los insertos de los sistemas bicamerales recubiertos con
colágeno, podemos definir claramente los compartimentos apical y basolateral, emulando
de cierta forma lo que sucede en los túbulos seminíferos, donde esta barrera es capaz de
dar origen a estos dos compartimentos. Como observamos en células pre-confluentes, los
transportadores de AA se expresan en las células 42GPA9 y son funcionales, sin
embargo, con células de Sertoli formando una barrera sellada no existen datos que
84
indiquen algún grado de polarización de los transportadores SVCTs. Para resolver esta
interrogante se realizaron cinéticas de transporte de AA 100 µM a 32º C y curvas de dosis
respuesta a distintas concentraciones de AA agregando el sustrato radiactivo tanto por la
zona apical como basolateral. Los resultados obtenidos indican que apicalmente la
incorporación de AA se mantiene lineal hasta los 2 minutos con una velocidad inicial de
11,1 ± 1,5 pmoles/106células x minuto, con una Km aparente de 46 ± 3,5 µM y una Vmax
de 296 ± 39 pmoles/106células x minuto. Mientras que para el transporte de AA por la
región basal se caracterizó por presentarse lineal hasta los 3 primeros minutos con una
velocidad inicial de 18,4 ± 2,1 pmoles/106células x minuto, con una Km aparente de 54 ± 3
µM y una Vmax de 490 ± 30 pmoles/106células x minuto. Además, bajo el análisis de
Eaddie-Hofstee, en ambos casos se observó la presencia de un solo componente. Estos
datos no son consistentes para definir una polarización funcional de los SVCTs en células
de Sertoli cultivadas in vitro formando barrera. Sólo podemos decir que, por los valores de
Km obtenidos, existe un mezcla de ambas isoformas de transportadores que son
funcionales tanto en la región apical como basal, y que podría existir un mayor número de
transportadores (SVCT1 o SVCT2) en la zona basal en comparación a la apical, según los
valores de Vmax obtenidos (490 ± 30 pmoles/106 células x minuto, basal y 296 ± 39
pmoles/106 células x minuto, apical). El aumento en la cantidad de transportadores SVCTs
en la región basal podría ser explicado debido a que se necesita de un gran número de
transportadores que sean capaces de incorporar AA desde el plasma sanguíneo y así
concentrarlo en el testículo. Además, la presencia de los transportadores de AA en la
región apical podría responder a un posible transporte retrogrado de vitamina C desde el
epidídimo hacia las células de Sertoli, con el fin de concentrarla en estas células.
85
La polarización de estos transportadores, en epitelios especializados, ha sido muy
estudiada últimamente, específicamente en células que forman monocapa como las
células de carcinoma de colon CaCo-2 y las MDCK de riñón canino, observándose
resultados que varían de un tipo celular a otro. Por ejemplo, se ha logrado detectar que las
isoformas SVCT1 y SVCT2 presentan una ubicación polarizada en células CaCo-2 y
MDCK, donde SVCT1 se ubica principalmente en el polo apical mientras que SVCT2 lo
hace en el polo basolateral (Boyer et al., 2005; Maulén et al., 2003; Subramanian et al.,
2004). Por otro lado, se ha descrito que SVCT2 se localiza en la zona apical de
microvellosidades en tanicitos β1 y en la membrana apical de las células del epitelio nasal
(García et al., 2005; Fisher et al., 2004). En el año 2004 Subramanian et al. realizando
distintas mutaciones en secuencia de SVCT1 humana descubrió una secuencia en la cola
C-terminal que dicta la localización apical de este transportador en células CaCo-2 y
MDCK. Esta secuencia de 10 aminoácidos (PICPVFKGFS) es casi completamente
conservada entre las especies humano, rata y ratón. Sólo difieren en un aminoácido de la
secuencia consenso rata y ratón en relación a la especie humana. Sin embargo, la
diferencia en este aminoácido es silenciosa ya que ambos son básicos (K, lisina en
humano y R, arginina en rata y ratón) por lo que no cambia la polaridad de ese sector del
transportador. Al analizar in sílico lo que sucede con esta secuencia consenso en la región
C-terminal del transportador SVCT2, para humano, rata y ratón, logramos observar que de
los diez aminoácidos que componen esta secuencia, 5 son conservados en las tres
especies para ambos transportadores. Además, de los 5 aminoácidos que no son
conservados 2 mantienen la polaridad del residuo de la secuencia consenso ((C)
cisteína/(S) serina en la secuencia consenso y (S) serina/(T) treonina en SVCT2 de
86
humano, rata y ratón). Por lo que sólo existe una diferencia de 3 aminoácidos en relación
a los 10 de la secuencia consenso. Esto nos podría ayudar a corroborar la ubicación
apical de SVCT2, analizada en trabajos anteriormente mencionados, además de no
excluir la posibilidad de que este transportador pudiese ubicarse apicalmente, y no sólo en
la zona basal como fue descrito en las células CaCo-2 y MDCK.
Para analizar lo que ocurre con la ubicación subcelular de los transportadores de AA en
las células de Sertoli formando monocapa, y si existe algún grado de polarización,
decidimos utilizar los transportadores fusionados a proteínas fluorescentes. En este caso
las secuencias de los transportadores SVCT1 y SVCT2 fueron insertadas en los
plásmidos pEYFP-N1 y p-EGFP-N1 respectivamente, los cuales se utilizaron para
transfectar células de Sertoli confluentes. Los resultados obtenidos indican que tanto
SVCT1-YFP como SVCT2-GFP se expresan en este tipo celular. También es necesario
mencionar que los insertos se encuentran adecuadamente ubicados en los vectores de
expresión, lo que se corroboró utilizando enzimas de restricción para digerir los plásmidos
junto a sus insertos respectivos. Si bien en los geles control de cada plásmido no se
utilizaron las enzimas de restricción específicas para cada inserto (HindIII y SacII para
SVCT1 y EcoRI y SacII para SVCT2) debido a que no contábamos con ellas, se realizaron
digestiones utilizando otras enzimas que flanqueaban estos sitios de corte. Esto asegura
que para trabajos posteriores contamos con los construcciones adecuados para poder
localizar a los transportadores de AA en las células de Sertoli.
Como anteriormente nos enfocamos en el trabajo con los transportadores de AA (SVCTs)
por sobre los transportadores de DHA (GLUTs) debido a que, por un lado cerca del 100%
de la vitamina C plasmática lo hace la forma reducida (AA), y por otro lado, los SVCTs
87
poseen una afinidad mayor por su sustrato que los GLUTs, para los experimentos
posteriores nos centraremos en el trabajo con la isoforma SVCT2 (en este caso SVCT2GFP), debido a que como en testículo AA se encuentra alrededor de 4 veces más
concentrado que en el plasma sanguíneo (Moser et al., 1987), y por lo tanto los
transportadores deben concentrar este sustrato, esta isoforma es más afín por AA que
SVCT1, lo que también es avalado por los ensayos de inmunohistoquímica. Además, está
descrito que SVCT2 es crucial en el transporte de AA en sistemas metabólicamente
activos (como las células de Sertoli que “mantienen” las células germinales) y tejidos
especializados (como lo es el epitelio del túbulo seminífero) (Savini 2007). Es así que
realizamos ensayos de transfección de cultivos de células de Sertoli 42GPA9 cercanas al
100% de confluencia con el vector SVCT2-GFP, para poder analizar la ubicación de este
transportador y su funcionalidad en células formando una monocapa. Los resultados
indicaron que a las 48 horas post-transfección aumenta tanto la expresión del
transportador fusionado a GFP, como la incorporación de AA en células transfectadas con
respecto a un control no transfectado. Lo que nos indica que los transportadores
transfectados son funcionales, a pesar de no ser idénticos a los transportadores nativos ya
que poseen la secuencia de GFP fusionada en su cola C-terminal. Algo similar ocurrió
cuando Subramanian et al. en el 2004 transfectando células MDCK en sistemas
bicamerales, en este caso con SVCT1-YFP, observó que aumentaba la incorporación de
AA desde la región donde visualizaba más transportador. La expresión de la proteína
recombinante en la monocapa de células de Sertoli fue visualizada en todo el citoplasma y
preferentemente en la membrana apical. Esto es consistente con la hipótesis de que
podría existir un transporte retrógrado de vitamina C desde el epidídimo hacia las células
88
de Sertoli. También existe la posibilidad de que la ubicación apical del transportador
SVCT2 en la barrera hemato-testicular, permita captar AA que se encuentre en el espacio
generado entre las células de Sertoli y las germinales. El AA en este espacio
presumiblemente podría responder a un reciclamiento de vitamina C, ya que las células
germinales podrían liberar DHA a este espacio el cuál se reduciría para ser captado por
las células de Sertoli.
Según los resultados obtenidos en esta tesis por primera vez se pudo detectar la
presencia de los transportadores de vitamina C oxidada (GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4
y GLUT8) y reducida (SVCT1 y SVCT2), siendo estos últimos funcionales, en células de
Sertoli de cultivo primario. Además, los datos indican que las células de Sertoli son
capaces de formar una barrera sellada in vitro y que el transporte de AA es
específicamente mediado por los SVCTs en este sistema celular. Por último, no es posible
apoyar la hipótesis planteada acerca de que los transportadores de vitamina C, en este
caso SVCT2, se encuentren polarizados en cultivos de células de Sertoli formando
monocapa, debido a que por un lado los ensayos funcionales de incorporación en
sistemas bicamerales sólo indican que podría existir una mayor cantidad de transportador
en la región basal, sin poder identificar mediante los parámetros cinéticos una polarización
de las isoformas SVCTs. Por otro lado, al transfectar las células tampoco se observó una
marcada polarización del transportador SVCT2-GFP en células de Sertoli 42GPA9
formando monocapa, como se puede visualizar en la región basal de células CaCo-2 y
MDCK. Sólo podemos decir que existe una leve, pero no significativa, tendencia a
ubicarse en la membrana apical.
89
La ubicación subcelular de los transportadores SVCTs en las células de Sertoli que forman
la barrera hemato-testicular es crucial para comprender cómo ocurre la concentración de
esta molécula. La presencia del transportador SVCT2 en ambos polos de la barrera
hemato-testicular nos permite explicar la concentración de AA desde el compartimento
basal (que esta en contacto con el torrente sanguíneo) hacia el compartimento adluminal
(donde encontramos células germinales) y desde este compartimento hacia las células de
Sertoli, observándose una concentración de AA tanto en el tejido testicular como en las
células de Sertoli. Lo que es esencial para el adecuado desarrollo fisiológico del epitelio
seminífero.
90
7. PROYECCIONES
La gran cantidad de factores que afectan la fertilidad masculina hoy en día es
sorprendente. Por lo cual el estudio de formas para contrarrestar este daño es de bastante
importancia. La mayoría de los factores que perjudican el sistema reproductor masculino
lo hace generando especies reactivas de oxigeno (ROS). Debido a esto, es fundamental
que las defensas antioxidantes se encuentren en niveles adecuados para neutralizar los
daños. Entonces, el estudio de cómo la vitamina C es capaz de alcanzar el compartimento
adluminal se hace muy importante. En este contexto, se puede seguir estudiando la
ubicación subcelular de los distintos transportadores de vitamina C, ya sean los SVCTs o
los GLUTs, pero en células formando monocapa cultivadas en sistemas bicamerales. Es
más, es posible realizar co-cultivos de células de Sertoli transfectadas, con los diversos
transportadores de vitamina C fusionados a proteínas fluorescentes, con células
germinales en sistemas bicamerales, para así observar la ubicación de estos bajo
condiciones bastante más cercanas a las observadas in vivo. Además, utilizando esta
misma estrategia se podría analizar si es que las células de Sertoli, transfectadas con los
transportadores de vitamina C, son capaces de proteger en mayor grado al simular
condiciones de estrés oxidativo, que al utilizar células de Sertoli no transfectadas. Esto
sería fundamental para comprender tanto la función de las células de Sertoli por sí solas,
como la de los transportadores de vitamina C.
91
8. BIBLIOGRAFÍA
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