Nationales Symposium zur Influenzaforschung in Deutschland 2009

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Nationales Symposium
zur Influenzaforschung
in Deutschland
2009
22.-24. November 2009
BERLIN
Themen
Forschungsergebnisse der zwei nationalen Influenza-Netzwerke
Forschungssofortprogramm Influenza und FluResearchNet
- Epidemiologie
- Diagnostik
- Pathogenese
- Prophylaxe und Therapie
Keynotes
Albert D.M.E. Osterhaus (Rotterdam)
Hans-Dieter Klenk (Marburg)
Xavier Saelens (Ghent)
Organisation und wissenschaftliche Leitung
Jörg Hacker (Berlin)
Reinhard Kurth (Berlin)
Johannes Löwer (Langen)
Stephan Ludwig (Münster)
Thomas Mettenleiter (Greifswald - Insel Riems)
Thorsten Wolff (Berlin)
Veranstaltungsort
Kaiserin-Friedrich Stiftung
Robert-Koch-Platz 7; 10115 Berlin-Mitte
Abstracts (bis 02.11.09) und Anmeldungen
unter www.zoonosen.net
Kontakt:Thorsten Wolff
[email protected]
030-18754-2278
Gefördert durch
Bundesministerium für Gesundheit (BMG)
Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft
und Verbraucherschutz (BMELV)
Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF)
Programm
Inhaltsverzeichnis
Programm.....................................................................................................................2
Vorträge........................................................................................................................6
Epidemiologie ...............................................................................................................7
Diagnostik...................................................................................................................15
Pathogenese ..............................................................................................................21
Prophylaxe..................................................................................................................34
Antivirale Therapie......................................................................................................39
Poster: Epidemiologie.................................................................................................43
Poster: Diagnostik.......................................................................................................49
Poster: Pathogenese ..................................................................................................58
Poster: Vakzine und Therapie ....................................................................................76
Teilnehmerverzeichnis................................................................................................94
1
Programm
Programm
Nationales Symposium für Influenzaforschung
Kaiserin-Friedrich-Stiftung, Robert Koch-Platz 7, 10115 Berlin
22. – 24. November 2009
Sonntag, 22.11.2009
ab 15:00
Registrierung und Posteraufbau
16:00
Begrüßung
Prof. Dr. Jörg Hacker (Präsident, RKI)
Grußworte
Prof. Dr. T. Mettenleiter (Präsident, FLI)
Prof. Dr. J. Löwer (Präsident, PEI)
Prof. Dr. S. Ludwig (Koordinator, FluResearchNet)
16:30
Keynote
Prof. Dr. Ab Osterhaus (Erasmus University, Rotterdam)
1. Session: Epidemiologie und Public Health - I
17:15 – 18:30
Alpers et al.
Aufbau einer Interventionsepidemiologischen Taskforce
U. Buchholz et al.
Bestimmung epidemiologischer Dynamikparameter des pandemischen
Influenzavirus A/H1N1
H. Claus et al.
SurvNet@RKI – Das Meldesystem zum Infektionsschutzgesetz
19 – 22 Uhr
Get-together
Hörsaal-Ruine, Medizin-Historisches Museum Charitè (siehe Lageplan)
Montag, 23.11.2009
2. Session: Epidemiologie und Public Health – II
09:00 – 10:20
E. Starick et al.
Molecular epidemiology of avian influenza in wild birds
A. Globig et al.
Monitoring mit Indikatortieren in Gebieten mit hoher Wasservogeldichte
2
Programm
A. Mathey et al.
AI-DB und NEW FLUBIRD-DB- – Neue Datenbank und Analysewerkzeuge für
den Aufbau eines Frühwarnnetzwerkes für das Auftreten aviärer
Influenzavirusinfektionen bei Zugvögeln
R. Zell et al.
Untersuchung der Schweineinfluenza-Aktivität in Deutschland
10:20- 10:50
Kaffee-Pause; Posterbesichtigung
3. Session: Diagnostik - Moderation: B. Schweiger
10:50 – 12:30
A. Gall et al.
Entwicklung und Einsatz der DNA-Chip-Technologie für eine umfassende
Influenza A-Diagnostik
A. Postel et al.
Neue Methoden zur Detektion aviärer Influenza Viren- real-time RT-LAMP und
serologischer Biochip
T. Letzel et al.
AIV-Nachweise: Sensitive rekombinante Zellkultursysteme
M. Schulze et al.
Entwicklung eines elektrischen BioChips für den Nachweis und die
Differenzierung von Influenza Viren
S. Duwe et al.
Entwicklung schneller Methoden zum Nachweis antiviraler Resistenzen bei
Influenzaviren
12:30
Mittagspause
14:00
Keynote
Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk (Philipps-Universität Marburg)
Pathogenitätsmechanismen und Wirtsadaptation von Influenzaviren und deren
Relevanz für die Pandemie 2009.
4. Session: Pathogenese – I - Moderation: M. Beer., S. Pleschka
14:45 – 16:45
A. Breithaupt et al.
Untersuchungen zur Pathogenese des hämorrhagischen Syndroms und zum
Organtropismus von hochvirulenten H5N1 Isolaten in unterschiedlichen Spezies
D. Kalthoff et al.
Untersuchungen zur Empfänglichkeit von ausgewählten Vogelspezies und
Säugetieren für das in Deutschland isolierte HPAIV H5N1
3
Programm
O. Stech et al.
Die Einführung einer polybasischen Spaltstelle in ein niedrigpathogenes aviäres
H3N8 Virus führt nicht zum hochvirulenten Phänotyp.
J. Bogs et al.
Die Virulenzdeterminanten der H5N1-HPAIV befinden sich sowohl im HA als auch
in den anderen viralen Proteinen und liegen schon in niedrigpathogenen H5N1Stämmen in verdeckter Form vor.
E. Holznagel et al.
Vergleichende H5N1 und H1N1v Pathogenesestudien im Frettchenmodell
V. Weinheimer et al.
Humanpathogene, aviäre und porzine Influenzaviren zeigen deutliche
Unterschiede hinsichtlich ihrer Vermehrung in einem humanen ex vivo LungenInfektionsmodell
16:45 - 17:15
Kaffeepause; Posterbesichtigung
5. Session: Pathogenese II - Moderation: T. Vahlenkamp, P. Staeheli
17:15 - 19:15
K. Hoegner et al.
Macrophage TRAIL expression is IFN-ß-dependent and mediates alveolar
epithelial apoptosis and barrier dysfunction in influenza virus pneumonia
E. Pauli et al.
Evading the cytokine burst - Influenza A virus inhibits type I IFN signaling via NFκB dependent induction of SOCS-3 expression
M. Matthaei et al.
H5N1 Influenza A Virusisolate aus Vögeln und Menschen stimulieren das
humane Typ I Interferonsystem unterschiedlich stark trotz funktioneller NS1
Proteine
B. Mänz et al.
Two strategies – one goal: adaptive mutations in the polymerase of two human
H5N1 strains results in different preferences towards transcription and replication
but equal pathogenicity in mice
H. Petersen et al.
Vergleichende Charakterisierung von H7-Typ HPAIV-Reassortanten mit einem
H5-Typ HPAIV NS-Segment in aviären Trachealringkulturen und in
verschiedenen Zellkultur-Systemen.
S. Gohrbandt et al.
Hochpathogene aviäre H5 Viren benötigen neben dem Erwerb der polybasischen
Spaltstelle die Anpassung benachbarter Regionen im Hämagglutinin
Ende: ca. 19:15
4
Programm
Dienstag, 24.11.2009
09:00
Keynote
Dr. Xavier Saelens (University of Ghent)
A universal influenza A vaccine based on the M2 ectodomain: where do we
stand?"
6. Session: Impfstoffe - Moderation: R. Wagner, O. Planz
09:45 – 11:05
R. Dürrwald et al.
Entwicklung eines trivalenten Impfstoffes zur Immunprophylaxe der
Schweineinfluenza auf der Basis aktueller Stämme der Subtypen H1N1, H3N2
und H1N2
E. Topfstedt et al.
Rekombinante Newcastle Disease Viren als Markervakzine gegen
hochpathogene aviäre Influenzaviren vom Subtyp H5
I. Sipo et al.
Entwicklung und Charakterisierung von genetischen AAV-basierten Influenza
Impfstoffen
Y. Süzer et al.
Eine einmalige Impfung und niedrige Dosen eines MVA-basierten H5N1Impfstoffes sind ausreichend für die Induktion einer kreuz-reaktiven
Schutzwirkung gegen H5N1
11:05
Kaffeepause; Posterbesichtigung
7. Session: Antivirale Therapie - Moderation: S. Ludwig
11:30 – 12:30
D. Topf et al.
Vergleichende Untersuchungen zur Oseltamivir-Empfindlichkeit von
Influenzavirus A/swine/Potsdam/15/81 in vitro, in der Maus und im Schwein
D. Kugel et al.
Interferons as emergency antiviral agents against highly pathogenic influenza A
viruses: efficacy evaluation in animal transmission models
O. Planz et al.
The NF-κB-inhibitor SC75741 efficiently blocks influenza virus propagation in vitro
and in vivo without the tendency to induce resistant virus variants
12:30
Abschluss-Diskussion
Perspektiven der Influenzaforschung in Deutschland
13:00 Verabschiedung und Lunch
5
Vorträge
Vorträge
6
Epidemiologie
Epidemiologie
7
Epidemiologie
Aufbau einer Interventionsepidemiologischen Taskforce
(Projektteil I.1b)
1
1
Alpers, K. ; Dehnert, M ; Krause, G.
1
1
Robert Koch-Institut, Abteilung für Infektionsepidemiologie, Berlin;
Im Rahmen der Postgraduiertenausbildung für angewandte Epidemiologie (PAE) wird die
interventionsepidemiologische Fachkapazität gesteigert, um mit einer speziell ausgebildeten
Taskforce einem pandemischen Ereignis rechtzeitig und adäquat begegnen zu können. Die PAE
folgt in der Ausbildungsmethode dabei dem Epidemic Intelligence Service bei den Centers for
Disease Prevention and Control und ist eng verzahnt mit dem European Programme for
Intervention Epidemiology Training (EPIET). Im Rahmen der SFI-Projektförderung wurde das
am RKI bereits seit 1996 bestehende Programm in folgender Weise adaptiert und ausgebaut:
RKI-Epidemiologen und Statistiker wurden aktiv in die Netzwerkaktivitäten auf Europäischer
Ebene eingebunden, nationale und internationale Module entwickelt und die Anzahl der
auszubildenden Experten erhöht. Zudem wurde in Kooperation mit der Charité Berlin der
Materstudiengang für „Applied Epidemiology“ zum Wintersemester 2009/2010 eingerichtet.
Teilnehmer der PAE waren in folgende influenzaspezifische Projekte federführend eingebunden:
Aufbau einer Computerbasierten syndromischen Influenza Sentinel Surveillance, Untersuchung
zur Influenza-Impfeffektivität in 4 Ausbrüchen in Hessen 2007-2009, Oseltamivir-Resistenz bei
Influenza H1N1 2008 in Europa, Analyse von Daten aus der virologischen InfluenzaSurveillance, Untersuchung einer bundesweiten Häufung von Influenza B assoziierten Myositis
Erkrankungen 2007/2008, Machbarkeitsstudie: Rettungsleitstellendaten der Berliner Feuerwehr
für syndromische Influenzasurveillance, Untersuchung zum Influenza-Risiko von medizinisch
tätigem Personal im Krankenhaus (iRisk ®), Survey unter Personen, die am Aufsammeln von
verendeten Wildvögeln auf Rügen im Februar und März 2006 beteiligt waren, Studie zum
Kontaktverhalten von Pflegepersonal in Krankenhäusern in Bayern. Ein Großteil der Projekte
wurde bereits auf internationalen wissenschaftlichen Konferenzen präsentiert und zur
Publikation in Fachzeitschriften eingereicht. Beim Ausbruch der pandemischen Neuen Influenza
AH1N1, waren darüber hinaus alle Teilnehmer der PAE aktiv eingebunden in 15 Feldeinsätzen
innerhalb Deutschlands zur Untersuchung der Dynamikparameter (siehe Projekt I2) sowie beim
Betrieb des Krisenkommunikationszentrums (siehe Projekt I1c). Eine aktuelle Auswertung auf
Europäische Ebene hat gezeigt, dass Teilnehmer des deutschen PAE-Programms über 59 %
der pandemiespezifischen Einsätze in Europa im Rahmen des EPIET-Verbundes betrieben. Der
Ausbau und die Neugestaltung der PAE hat sich somit bereits jetzt als sehr effektive Investition
für die epidemiologische Pandemiekontrolle in Deutschland heraus gestellt.
Kontakt:
Alpers, Katharina; Robert Koch-Institut, [email protected]
8
Epidemiologie
Bestimmung epidemiologischer Dynamikparameter des
pandemischen Influenzavirus A/H1N1
(Projektteil I.2)
Buchholz U;1 Süß T; 1 Dupke, Susann; 1 Grunow, Roland; 1 Haas, Walter; 1 Krause, Gérard 1
on behalf of the Robert Koch – Institute Shedding Investigation Group
1
Robert-Koch-Institut; Berlin
Zur Schaffung von Evidenz als Basis für Empfehlungen im Bereich des öffentlichen
Gesundheitsdienstes und für mathematische Modellierungen müssen wesentliche
epidemiologische und virologische Parameter des pandemischen Influenzavirus A/H1N1
bestimmt werden.
Ein in den Vorsaisonen vorbereitetes und einstudiertes Protokoll konnte mit Beginn der
Pandemie sofort zum Einsatz gebracht werden. In Familien mit laborbestätigten Fällen erhoben
wir täglich die Häufigkeit und Stärke der klinischen Symptome und bestimmten mittels RT-PCR
aus Patientenproben die Viruslast.
Wir untersuchten 36 Haushalte mit 83 Haushaltskontakten, von denen 15 laborbestätigte Fälle
wurden. Die sekundäre Haushaltserkrankungsrate unter Haushaltskontakten, die keine
Prophylaxe erhalten hatten, war 26% (12/47), einer (8%) der 12 Fälle war asymptomatisch.
Der Mittelwert bzw. Median des seriellen Intervalls betrug 2,6 bzw. 3 Tage (Spannweite: 1-3
Tage). In Patientenproben konnte virale RNA im Durchschnitt für 6,6 Tage nach
Symptombeginn identifiziert werden, bei Patienten mit antiviraler Therapie könnte sich die
Ausscheidungsdauer um 1,4 Tage gegenüber nicht oder nicht rechtzeitig behandelte Patienten
verkürzen (p-Wert=0.06). Das Ausscheidungsprofil korrelierte gut mit der anhand eines
Symptomscores beschriebenen Klinik (r2=98%). Verglichen mit anderen nasopharyngealen
Proben war Nasenspülwasser der deutlich sensitivste Probentyp.
Unsere Studie trägt wichtige Informationen zur akkumulierenden Evidenzbasis des
pandemischen Influenzavirus bei. Die Ergebnisse unterstützen die Idee, dass das pandemische
Virus in vielen Aspekten saisonalen Influenzaviren ähnlich ist.
Kontakt:
Buchholz, Udo; Robert-Koch-Institut; [email protected]
9
Epidemiologie
SurvNet@RKI – Das Meldesystem zum
Infektionsschutzgesetz
(Projektteil I.1a)
1
1
1
1
1
Claus, H. ; Poggensee, G ; Eckelmann, F. ; Kirchner, G. ; Pape, E. ; Krause, G
1
1
Robert Koch-Institut, Abteilung für Infektionsepidemiologie, Berlin
Im Verlauf einer Influenza-Pandemie aber auch beim Auftreten von anderen
Infektionskrankheiten, die eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellen können, ist
für die Einleitung geeigneter Maßnahmen und die Umsetzung von Strategieänderungen im
Verlauf der Ereignisse eine möglichst aktuelle und genaue Kenntnis der epidemiologischen
Situation in Deutschland unabdingbar. Ausgehend vom dem bereits bestehenden elektronischen
Übermittlungs- und Datenbanksystem „SurvNet@RKI“ wurde hierzu ein neues elektronisches
Surveillancesystem entwickelt, das sowohl in der Frühphase einer pandemischen Entwicklung
ausführliche Informationen über alle auftretenden Einzelfälle des Infektionsgeschehens
aufbereiten kann, sich aber auch an kurzfristige Änderungen des Meldesystems (z.B. durch
neue Meldeverordnungen oder wachsende Belastungen von Seiten der melde- und
übermittlungspflichtigen Einrichtungen) und sich neu ergebenden Fragestellungen anpassen
kann.
Das neue System benutzt die C#.Net-Plattform, einen MS SQL-Datenbankserver, XML als
Datentransport und Webservices. Es umfasst standardisierte Strukturen für die 65 gemäß IfSG
zu übermittelnde Meldetatbestände, einschließlich der im Juli 2009 eingeführten MRSAMeldepflicht, sowie zusätzliche 15 Meldetatbestände, die aufgrund erweiterter
Landesverordnungen meldepflichtig sind. Eine Schnittstelle bereitet das System für die sichere
und nachvollziehbare elektronische Meldung durch Arzt und Labor vor. Die Datenbank enthält
ein umfangreiches, systematisiertes Metadatensystem (ca. 2.000 Variablen mit insgesamt über
10.000 vordefinierten Ausprägungen). Ein Änderungsmanagementsystem erlaubt fortlaufende
Ergänzungen und Korrekturen, wobei jeder Daten- bzw. Kenntnisstand rückwirkend abgerufen
werden kann. Zur Erfassung von Ausbrüchen wurde ein Konzept entwickelt, dass auf Grundlage
der Dateneingabe der Gesundheitsämter eine erste automatisierte deskriptive epidemiologische
Datenaufbereitung ermöglicht. Zahlreiche Algorithmen zur Bewertung und Plausibilisierung der
erfassten Daten sollen den Nutzer bei der Dateneingabe unterstützen und die Datenqualität
erhöhen.
Eine erste Version des neuen Surveillancesystems ist fertig gestellt und wird derzeit
umfangreichen Anwendertests unterzogen. Die schrittweise Einführung des neuen Programms
in den zuständigen Landesbehörden und Gesundheitsämtern ist für den Jahresbeginn 2010
vorgesehen. Für die aktuelle Pandemie wurde ein eigenes Programm entwickelt, bei dem
dieselben Programmiertechniken eingesetzt wurden. So konnten konkrete Erfahrungen
bezüglich der Neuen Influenza A/H1N1 in die Ausgestaltung des neuen Programms einfließen.
Vor allem jedoch wurde deutlich, wie dringend eine solche flexible Surveillance-Struktur benötigt
wird.
Kontakt:
Claus, Hermann; Robert Koch-Institut, [email protected]
10
Epidemiologie
FSI project 1-36: Molecular epidemiology of avian influenza in
wild birds
Starick, E., Fereidouni, S.R.
Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems
Avian influenza (AI) represents one of the greatest concerns for public health that has emerged
from the animal reservoir in recent years. Avian influenza viruses (AIV) have been shown to
infect a great variety of birds including domestic poultry and several species of mammals. Wild
birds are the main reservoirs of AI viruses in the nature. A molecular epidemiological
investigation of avian influenza viruses in wild birds involves different interrelated approaches:
Wild birds’ avian influenza surveillance: Wild birds are the donors of recent pandemic
viruses. As an important part of this project, we investigated more than 7000 tracheal, cloacal or
faecal samples collected from wild birds in Ukraine, Tanzania, Iran, Egypt, Sudan and
Kazakhstan in collaboration with different international and organizations (FAO, Wetland
International, GAINS, CIRAD).
Subtyping of avian influenza viruses: Several hundreds of low-pathogenic AIV (LPAIV) were
sub-typed during this study by neuraminidase RT-PCR assays developed in the framework of
the project. Using these assays, we identified a number of unusual HA/NA combinations, such
as H13N8, H10N4, H1N6, H11N1 and H10N8.
Sequencing and phylogenetic analysis of AIV: More than 300 low and highly pathogenic AIV
(HPAIV) belonging to different subtypes were sequenced during this study to correlate genetic
and epidemiological factors. Several outbreaks of low and highly pathogenic AI in wild birds and
in poultry in Germany caused by H5 avian influenza viruses were investigated. Based on fulllength sequences of viruses isolated from wild birds and different poultry species, molecular
determinants for important biological markers were characterised. Phylogenetic analyses of the
sequences generated during the project and thousands obtained from Genbank and using
different methods and software were carried out.
Molecular characterization of pathogenicity: Avian influenza viruses of both pathotypes, LP
and HP, can infect various hosts including wild birds, poultry and mammals. We studied genetic
determined species-specific and pathogenicity markers of these viruses which are one of the
best indicators of prerequisite changes for host adaptation and evolution. In addition, we
developed a new method for pathotyping of low and highly pathogenic AIV based on restriction
enzyme pattern of cleavage site.
Immunologic determinants: Genetic characteristics of the viruses as well as cellular
determinants and immunological factors of the potential host contribute to the pathogenesis of
influenza A virus infection for specific hosts. There are many gaps related to knowledge of
immunological processes after an influenza virus infection in wild waterfowls. Using animal
experiments, we found new facts regarding dynamics of specific antibody responses induced in
mallards after infection by or immunization with low pathogenic avian influenza viruses. In
addition, we investigated the influence of homo- and heterosubtypic immunity induced by LPAI
viruses on clinical signs and virus shedding after subsequent HPAIV H5N1 infection.
In summary: The knowledge of molecular epidemiology based on phylogenetic analyses is an
important tool for tracing genetic evolution of influenza viruses during transmission from one
species or continent to other one. All mentioned approaches give us confident tools for a better
preparedness to further emerging influenza viruses in animal hosts and for early warning
systems to reduce transmission of such viruses to human beings and to commercial poultry
flocks.
Kontakt:
Elke Starick, Friedrich-Loeffler-Institut Insel Riems, [email protected]
11
Epidemiologie
Monitoring mit Indikatortieren in Gebieten mit hoher
Wasservogeldichte
1
1,2
1
1
1
1
1
Globig, A. ; Matthes, D. ; Kraatz, U. ; Strunk, P. ; Fereidouni, S. ; Starick, E. ; Häuslaigner, R. ; Fiedler,
2
1
1
1
1
W. ; Grund, C. ; Harder, T. ; Mettenleiter, T. ; Beer, M.
1
Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, 17493 Greifswald-Insel Riems
Max-Planck-Institut für Ornithologie, Schlossallee 2, 78351 Radolfzell
2
In der EU ist seit dem Jahr 2003 ein aktives Wildvogelmonitoring vorgeschrieben, um das
Vorkommen und die Verbreitung von maßregelungspflichtigen aviären Influenzaviren (AIV) zu
erfassen. An diesem Monitoringprogramm beteiligt sich auch die Bundesrepublik Deutschland,
insbesondere seit dem Auftreten von hoch pathogenen (HP) AIV bei Wildvögeln im Jahr 2006, in
beträchtlichem Umfang.
Die Beprobung von lebenden/gesunden Wildvögeln ist jedoch äußerst zeit- und kostenintensiv
und darüber hinaus abhängig vom Einsatz eines spezialisierten Personenkreises. Trotz großer
Anstrengungen bleiben viele scheue Enten und andere Wasservögeln für eine
Lebendbeprobung unerreichbar. Da die Prävalenz von Influenzaviren stark vom Beprobungsort,
-zeitpunkt und beprobter Vogelart abhängt, überwiegend aber sehr gering ist, werden die
Kapazitäten in den Untersuchungseinrichtungen durch ein großes Probenaufkommen stark
belastet.
Stockenten (Anas plathyrhynchos) sind als Wirt für alle bisher beschriebenen AIV-Subtypen
bekannt. Daher wurden für das Projekt handaufgezogene AI-serologisch sowie virologisch
negativ getestete Stockenten als Indikatortiere eingesetzt. Im Herbst 2006 wurden in
Naturschutzgebieten (Boddengewässer in Mecklenburg-Vorpommern, Binnengewässer in
Brandenburg und Bereich Bodensee), die eine dichte Population wildlebender Wasservögel
ganzjährig aufweisen, drei Indikatoranlagen (je 10-15 Enten) in Betrieb genommen. Durch eine
vierzehntägige Beprobung der flugunfähigen Indikatortiere wurden die in der wilden
Wasservogelpopulation kursierenden AIV angezeigt, was gleichzeitig als Frühwarnsystem für
den Eintrag von HPAIV durch Wildvögel dienen sollte.
Während der 20-monatigen Untersuchungszeit konnten bei den Indikatorenten an allen drei
Standorten zahlreiche AIV-Infektionen verschiedener Subtypen nachgewiesen werden, darunter
auch niedrig pathogene H5- und H7-Viren. Dagegen waren die Proben stets negativ für das HP
H5N1 Virus asiatischen Ursprungs.
Die Vorteile des Einsatzes von Indikatorenten bestehen in einer hohen Isolierungsrate bei einem
verhältnismäßig geringen Aufwand und in einer über die Jahre hinweg konstant durchführbaren,
statistisch auswertbaren Kontrolle verschiedener, schwer erreichbarer Vogelpopulationen.
Nach Beendigung des Projektes im Herbst 2008 wurde die Station am Bodensee von dem
internationalen Projekt „Constanze“ übernommen. Die Anlage am Felchowsee führt das
Ministerium für Ländliche Entwicklung, Umwelt und Verbraucherschutz des Landes
Brandenburg weiter. Die Betreuung und Beprobung der vorpommerschen Indikatorenten wird
weiterhin durch das FLI organisiert.
Kontakt:
Dr. Anja Globig, Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, 17593 Greifswald-Insel Riems;
[email protected]
12
Epidemiologie
AI-DB und NEW FLUBIRD-DB – Neue Datenbank und
Analysewerkzeuge für den Aufbau eines
Frühwarnnetzwerkes für das Auftreten aviärer
Influenzavirusinfektionen bei Zugvögeln
1
1
1
1
1
1
1
Mathey, A. ; Staubach, C. ; Kowalczyk, S. ; Klöß, D. ; Richter, S. ; Kranz, P. ; Schröder, R. ; Globig,
1
1
1
2
1
3
A. ; Unger, F. ; Wilking, H. ; Harder, T. ; Conraths, F.J. ; New-Flubird Consortium
1
2
Institut für Epidemiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Wusterhausen; Nationales Referenzlabor für
3
Geflügelpest (NRL AIV), Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems; Koordination: Osterhaus A,
3
th
Erasmus University Medical Center, Rotterdam, Niederlande; Finanziert durch die EU – Six Framework
Programme for Research and Technological Development (FP6)
Im AI Monitoring von Wildvögeln, das seit 2005 koordiniert durch die EU, in Deutschland
bundesweit durchgeführt wird, sind bis dato 125.180 Tiere virologisch untersucht worden. In
einem FSI-geförderten Projekt am IfE des FLI wurde eine nationale Datenbank „Wildvogel
Monitoring zur Aviären Influenza“ (AI-DB) entwickelt, die eine Datensammlung und
breitgefächerte Analyse erlaubt (Globig et al., 2009, Wilking et al., 2009). Weiterhin wurde eine
vollständige Kompatibilität zur europäischen Wildvogel-DB bei der EU Kommission
implementiert, um einen lückenlosen Datenaustausch zu gewährleisten.
Mit dem Ziel, den fortbestehenden Erkenntnislücken bezüglich der Biologie und Verbreitung von
aviären Influenzaviren bei Wildvögeln zu begegnen, wurde 2006 im Rahmen eines EU FP6
Projektes („NewFluBird“ - Network for Early Warning of Influenza Viruses in Migratory Birds in
Europe) ein interdisziplinäres Netzwerk geschaffen, in das Experten aus den Bereichen
Virologie, Ornithologie und Epidemiologie eingebunden sind. Der Austausch von Daten und
Expertenwissen, sowie der gemeinsame Aufbau einer zielgerichteten Surveillance soll
erleichtert und instrumentalisiert werden. Als zentrales Werkzeug wurde vom FLI eine
Datenbank entworfen, in der AIV- bzw. ornithologiebezogene Daten und Erkenntnisse der
genannten Fachrichtungen zusammengeführt werden können. Eine angeschlossene WebApplikation bietet den dreizehn Partnerinstituten unterschiedliche Möglichkeit zur interaktiven
Aufbereitung, Integration und Analyse der Datensammlung.
Nach der Zusammenführung für die jeweilige Fragestellung relevanter Datensätze durch
Selektion gemeinsamer Parameter (z.B. Vogelspezies, Virus-Subtypen, Georeferenzen, Datum),
können resultierende (Daten-)Teilmengen in vorbereiteten Tabellen, Diagrammen und
thematischen Karten geordnet und zusammenfassend dargestellt werden. Insbesondere die
Möglichkeit, gefilterte Teilmengen eines Datentyps als Selektionsmaske für einen anderen zu
verwenden, erlaubt eine gekoppelte, integrative Analyse. So können Gebiete in Abhängigkeit
der Häufigkeit ausgewählter Vogelspezies (Daten des „International Waterbird Census“,
koordiniert von „Wetlands International“), oder einer ökologischen Charakterisierung („Corine
Landcover“ Daten der EU) bestimmt, und als räumliche Selektionsgrundlage für positive und
negative virologische Resultate verwendet werden.
Für die deskriptive statistische Analyse wird ein bayesianisches Model entwickelt, welches die
raum-zeitliche Verteilung von AI Prävalenzen in Abhängigkeit von Populationsdichten von
Wildvögeln, beziehungsweise von Umweltfaktoren beschreibt. Ornithologisches Expertenwissen
sowie Resultate aus experimentellen Infektionsstudien sollen durch Parametrisierung eines
SEIR-Models berücksichtigt werden.
Ein über Europa hinausreichender Datenaustausch mit thematisch verwandten Initiativen, wie
z.B. GAINS (Global Avian Influenza Network for Surveillance) oder Datensystemen der FAO ist
durch die Implementierung kompatibler Strukturen und Kodiersysteme gewährleistet.
Kontakt:
Mathey, Alexander; Friedrich-Loeffler-Institut, [email protected]
13
Epidemiologie
Untersuchung der Schweineinfluenza-Aktivität in
Deutschland
1
1
1
1
1
2
Zell, R. ; Philipps, A. ; Krumbholz, A. ; Schmidtke, M. ; Bauer, K.; Wutzler, P. ; Dürrwald, R.
1
2
Institut für Virologie und Antivirale Therapie, Jena; Abteilung Forschung und Entwicklung, IDT Biologika
GmbH, Dessau-Roßlau
Zur Untersuchung der Schweineinfluenza-Aktivität in Deutschland wurde von der IDT Biologika
GmbH ein Serosurvey und ein Virusisolierungsprogramm etabliert. 2008/09 wurden mehr als
12.000 Seren aus 1.500 Schweinebeständen untersucht. Die serologische Untersuchung ergab
folgende Prävalenzen: auf Individualebene H1N1 59%, H1N2 31%, H3N2 54%, auf
Bestandsebene H1N1 67%, H1N2 35%, H3N2 60%. Im Rahmen des
Virusisolierungsprogramms wurden 2008/09 aus 738 Einsendungen 136 Virusisolate
angezüchtet. Die Virusisolate wurden serologisch typisiert und zur weiteren genetischen und
phänotypischen Charakterisierung an das IVAT in Jena übergeben. Die genetische
Charakterisierung der Isolate erfolgte durch Sequenzierung. Rund 100 Isolate wurden komplett
sequenziert. Die Auswertung der Sequenzen ist noch nicht abgeschlossen, aber es ist
hervorzuheben, daß seit 1989 alle bekannten Virusisolate Amantadin-resistent sind.
Überraschend viele Reassortierungen konnten nachgewiesen werden. Die Virussequenzierung
erfolgte sowohl mit herkömmlichen Methoden als auch in Kooperation mit dem Fritz-LipmannInstitut Jena auf zwei NGS-Plattformen. Ziel dieser Kooperation ist die Entwicklung eines
effizienten, kostengünstigen Protokolls zur Multiplex-Sequenzierung von Influenzaviren und
anderen RNA-Viren. Zur phänotypischen Charakterisierung von porzinen Influenzaviren wurden
rund 120 Virusisolate auf Resistenzen gegenüber Amantadin und Neuraminidaseinhibitoren
getestet. Neun Isolate mit geringer Empfänglichkeit gegen Neuraminidase-Inhibitoren wurden
identifiziert.
Kontakt:
Zell, Roland; Institut für Virologie und Antivirale Therapie, E-Mail-Adresse: [email protected]
14
Diagnostik
Diagnostik
15
Diagnostik
Entwicklung und Einsatz der DNA-Chip-Technologie für eine
umfassende Influenza A-Diagnostik
1
1
1
1
2
1
Gall, A. , B. Hoffmann , T. Harder , C. Grund , R. Ehricht , und M. Beer
1
Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, 17493 Greifswald - Insel Riems
2
Clondiag GmbH, Löbstedter Strasse 103-105, 07749 Jena
Vor dem Hintergrund des kontinuierlichen Auftretens neuer Virusstämme sind schnelle und
verlässliche Methoden zur umfassenden Charakterisierung von Aviären Influenzaviren (AIV)
essentiell für die Diagnostik. Im Rahmen von Monitoringprogrammen oder Ausbruchsszenarien
werden die Grenzen herkömmlicher molekularer Methoden, wie z.B. der real-time RT-PCR oder
Sequenzierung, offensichtlich. DNA-Chips (Microarrays) hingegen erlauben die simultane
Detektion einer Vielzahl von Genen und bieten daher neue Möglichkeiten.
Es wurde ein Microarray-System entwickelt, mit dem Subtypisierungen aller 16 Haemagglutininund 9 Neuraminidase-Subtypen aviärer Influenzaviren möglich sind. Darüber hinaus erlaubt das
Verfahren die Pathotypisierung und spezifische Detektion des seit 2006 in Deutschland
aufgetretenen HPAIV H5N1/Asia clade 2.2, sowie die Differenzierung eurasischer und
nordamerikanischer AIV H5- und H7-Isolate. Mit dem ArrayTube System der Firma Clonediag
wurde eine kostengünstige Lösung (ca. € 25/Probe) gewählt, die in anderen Bereichen (z. B. in
der Chlamydien-Diagnostik) bereits erfolgreich eingesetzt wird. Aufgrund der in
Reaktionsgefäße integrierten Microarrays ist das System kompatibel mit herkömmlicher
Laborausstattung. Der Test ist relativ einfach und schnell durchzuführen, durch die
kolorimetrische Auswertung robust und somit gut für die Routinediagnostik geeignet. Das neue
Testverfahren erlaubt die sensitive, spezifische und umfassende Feinanalyse von AIV aus
Virusisolaten und diagnostischen Proben innerhalb von 24 Stunden. Es ist seit einigen Monaten
fester Bestandteil des Methodenspektrums des Nationalen Referenzlabors für Aviäre Influenza
am Friedrich-Loeffler-Institut. Im Zusammenhang mit dem Auftreten des pandemic
Influenzavirus H1N1/09 wurde das System problemlos auch für dieses Virus adaptiert.
Ein weiterer Ausbau dieses Systems im Hinblick auf die verbesserte Erkennung und
Charakterisierung von Influenza A –Viren humanen und porcinen Ursprungs ist in Planung.
Literatur:
Gall A, Hoffmann B, Harder T, Grund C, Ehricht R, Beer M. Rapid and highly sensitive neuraminidase subtyping of
avian influenza viruses by use of a diagnostic DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 2009 Sep;47(9):2985-8.
Gall A, Hoffmann B, Harder T, Grund C, Ehricht R, Beer M. Rapid haemagglutinin subtyping and pathotyping of avian
influenza viruses by a DNA microarray. J. Virol. Methods. 2009 Sep;160(1-2):200-5.
Gall A, Hoffmann B, Harder T, Grund C, Höper D, Beer M. Design and validation of a microarray for detection,
hemagglutinin subtyping, and pathotyping of avian influenza viruses. J. Clin. Microbiol. 2009 Feb;47(2):327-34.
Gall A, Hoffmann B, Harder T, Grund C, Beer M. Universal primer set for amplification and sequencing of HA0
cleavage sites of all influenza A viruses. J. Clin. Microbiol. 2008 Aug;46(8):2561-7.
Kontakt:
Hoffmann, Bernd, Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, [email protected]
16
Diagnostik
Neue Methoden zur Detektion aviärer Influenza Virenreal-time RT-LAMP und serologischer Biochip
1
1
1
1
Postel, A. , Grund, C. ; Beer, M. ; Harder, T.C.
1
Institut für Virus Diagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifwald-Insel Riems.
Der Bedarf an zuverlässigen und gleichzeitig sensitiven molekularen Schnelltests für den on-site
Nachweis aviärer Influenzaviren (AIV) definierten die Zielsetzungen des Projektes FSI 2-1.2.1.
Einerseits wurde die Evaluierung bereits bestehender molekularer Schnelltests, andererseits die
Entwicklung eines serologischen Schnelltests („Biochip“) für den subtypenspezifischen
Nachweis von AIV bzw. Serum-Antikörpern bearbeitet.
Zwei subtypenspezifische kommerzielle Primerkits, „Avian Flu H5 / H7“ (Eiken Chemical, Japan)
für den Nachweis viraler RNA der AIV Subtypen H5 und H7 mittels isothermaler Amplifikation
(LAMP; loop mediated isothermal amplification) wurden evaluiert. Zur Ermittlung der
analytischen Spezifität und Sensitivität der real-time RT-LAMP (rRT-LAMP) wurden serielle
Verdünnungen von RNA der AIV Subtypen H1, H2, H5, H6, H7 und H10 getestet und mit den
Ergebnissen validierter real-time RT-PCRs verglichen. Die Detektionslimits der rRT-LAMP lagen
bei RNA-Verdünnungen, die im Mittel einen Ct-Wert von 28,6 (H5) bzw. 26,7 (H7) in der rRTPCR aufwiesen. Die Nachweisgrenze der H5 bzw. H7-spezifischen rRT-PCR lag bei Ct 37,1, so
dass die rRT-LAMP durchschnittlich etwa um den Faktor 1000 weniger sensitiv war als die rRTPCR. Die Sensitivität der LAMP variierte sehr stark in Abhängigkeit vom verwendeten
Virusisolat. Aufgrund geringerer Spezifität und Sensitivität ist die rRT-LAMP in der derzeitigen
Form der rRT-PCR deutlich unterlegen, dennoch kann die LAMP aufgrund des geringen
apparativen Aufwands für schlecht ausgestattete Labore und unter Berücksichtigung ihrer
Limitationen ein wertvoller on-site Assay sein.
Die Entwicklung eines subtypen-spezifischen serologischen Schnelltests erfolgte nach dem
Prinzip eines kompetitiven ELISAs unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten ELISAPlatten bzw. eines Biochips der Firma BioTeZ, Berlin. Strategie für die Herstellung der TestAntigene war die rekombinante baculovirale Expression in Insektenzellen. Das Nukleokapsidprotein als Antigen für den generischen Nachweis AIV spezifischer Antikörper wurde als GSTFusionsprotein exprimiert, gereinigt und chemisch biotinyliert. Die H5 und H7-Antigene für den
Nachweis subtypen-spezifischer Serum-Antikörper wurden mit Hilfe eines bigenischen
Baculoviruskonstruktes sekretorisch exprimiert und durch heterologe Ko-Expression der BiotinLigase BirA aus E. coli monospezifisch in vivo biotinyliert. Verschiedene monoklonale Antikörper
wurden bezüglich Ihrer Reaktivität mittels Westernblot-Analyse, Immunperoxidase-MonolayerAssay und Hämagglutinationshemmung charakterisiert und auf kompetitive Eigenschaften hin
untersucht. Geeignete monoklonale Antikörper wurden zusammen mit den auf den StreptavidinMatrizen gekoppelten Antigenen als kompetitiver ELISA konfektioniert. Der etablierte ELISA
ermöglicht eine spezifische und sensitive Detektion H5 und H7 subtypspezifischer SerumAntikörper unabhängig von der Vogel-/Geflügelart.
Kontakt:
Harder, Timm; O.I.E. und Nationales Referenzlabor für Aviäre Influenza, Institut für Virusdiagnostik,
Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems, [email protected]
17
Diagnostik
AIV-Nachweise: Sensitive rekombinante Zellkultursysteme
(FSI 2-1.2.2)
1
1
1
Letzel, T ; Beer, M ; Harder, T.
1
OIE und Nationales Referenzlabor für Aviäre Influenza, Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-LoefflerInstitut, Greifswald-Insel Riems, Germany
Die labortechnische Arbeit mit aviären Influenzaviren (AIV) wird wesentlich durch den Umstand
erschwert, dass niedrig-pathogene Subtypen dieser Viren sich nicht ohne erhebliche Probleme
in Zellkulturen isolieren bzw. kontinuierlich vermehren lassen. Diese Viren machen aber das
Gros der Diagnostik in klinischen Verdachtsfällen und im Rahmen von Surveillanceprogrammen
aus. Eine kontinuierliche Replikation von AIVs niedriger Pathogenität (LPAIV) ist in den
verfügbaren Zelllinien nicht per se möglich, da hierzu erforderliche Endoproteasen nicht
exprimiert und somit Nachkommenvirionen nicht mit infektionstüchtigen HA1,2-Trimeren
ausgerüstet werden können. Ziel des Projektes war die Produktion einer oder mehrerer
Zelllinien als Alternative zu embryonierten Hühnereiern in der Diagnostik.
Zunächst wurden verschiedene Zelllinien aus der Zellbank des FLI auf ihre Basispermissivität
für AIV untersucht. Im Vergleich zur Kontrollzelllinie MDCK+ zeigten die Zelllinien QM-9
(Wachtelmuskulatur) und ST (porcines testikuläres Gewebe) die höchsten Merkmalssummen
und wurden für weitere Versuche ausgewählt. Durch FACS-Analysen mit markiertem Maackia
Amurensis Lectin II (MAL II) und Sambucus Nigra Lectin (SNA) konnte gezeigt werden, dass
auf den ausgewählten Zelllinien Sialinsäurerezeptortypen der Typen α-2,3 und α-2,6 vorlagen.
Ein in vivo Reporter-Assay wurde etabliert, um die selektierten Zelllinien hinsichtlich ihrer
endogenen Proteaseaktivität innerhalb des trans-Golgi Apparates zu überprüfen. QM-9 und ST
Zellen prozessierten SEAP-Konstrukte mit polybasischer HA Schnittstelle aber auch solche des
Subtyps H1 mit einer monobasischen Spaltstelle. Endoproteolytische Aktivität für monobasische
Schnittstellen anderer AIV-Subtypen war jedoch nicht nachweisbar, so dass entsprechend
geeignete Endoproteasen substituiert werden mussten. Hierzu wurde die TransmembranSerinprotease humanen und porcinen Ursprungs ausgewählt, für die die Prozessierbarkeit
rekombinanter, monobasischer Hämagglutinine verschiedener AIV HA-Subtypen gezeigt werden
konnte. Bereits in transient transfizierten Zellen konnte eine multizyklische Replikation niedrigpathogener AIV induziert werden. Stabil transfizierte Linien, in denen die
Endoproteaseexpression reguliert werden kann, wurden generiert.
Weitere Experimente konzentrieren sich nun auf die Komplettierung und Verbreiterung des
Glycanrezeptorenspektrums dieser Zellen.
Kontakt:
18
Diagnostik
Entwicklung eines elektrischen BioChips für den Nachweis
und die Differenzierung von Influenza Viren
a
a
b
b
a
Martin Schulze , Barbara Biere , Ralf Wörl , Rainer Hintsche , Andreas Nitsche , Brunhilde Schweiger
a
b
a
Robert Koch-Institut, Nordufer 20, D-13353 Berlin, Deutschland
AJ eBioChip GmbH, Fraunhoferstraße 1, D-25524 Itzehoe, Deutschland
Angesichts zunehmender Globalisierung nimmt die Gefahr der raschen Ausbreitung von
Infektionskrankheiten, welche Epidemien oder Pandemien auslösen können, stetig zu. Für eine
schnelle medizinische Intervention ist es daher notwendig, spezifische und sensitive
Nachweissysteme für bekannte und neuartige Pathogene zu entwickeln. Durch mobile
Laborgeräte gewinnt die Möglichkeit einer vor-Ort-Diagnostik zunehmend an Bedeutung. Eine
solche neue Entwicklung stellt das ePaTox-Gerät von AJ eBioChip dar. Der ePaTox basiert auf
der Hybridisierung und dem anschließenden elektrochemischen Nachweis von zuvor mittels
konventioneller uniplex oder multiplex PCR hergestellter PCR-Produkte auf einem spezifischen
BioChip.
In den vergangenen Jahren wurde von uns in Zusammenarbeit mit AJ eBioChip ein BioChip für
den Nachweis von Influenza A- und B-Viren entwickelt. Der BioChip ermöglicht außerdem eine
Differenzierung der Influenza A-Viren der humanpathogenen Subtypen H1N1, H2N2, H3N2 und
der aviären Subtypen H5, H7 und H9. Für die Validierung des bisherigen BioChips wurden
Probenmaterial aus den Influenza-Saisons 2006/2007 und 2007/2008 sowie Isolate aviärer
Viren eingesetzt. Dabei zeigte sich, dass Sensitivität und Spezifität dieser Methode mit der der
real-time PCR vergleichbar sind.
In den kommenden Monaten soll der Chip darüber hinaus mit spezifischen Assays für den
Nachweis des neuen Influenza A H1N1v-Virus ausgerüstet werden. Hierfür wurden bereits
spezifische PCRs für den Nachweis der Hämagglutinin- und Neuraminidasegene der neuen
Viren entwickelt und etabliert. Die Validierung dieser real-time PCRs erfolgte anhand von mehr
als 3000 Patientenproben, die seit April 2009 auf das Vorhandensein von saisonalen und neuen
Influenzaviren untersucht wurden. Die Einbeziehung dieser Assays auf dem BioChip ist derzeit
in Vorbereitung.
Insgesamt erwies sich der ePaTox als verlässliches automatisiertes System für einen schnellen
und unkomplizierten Nachweis sowie eine umfassende Differenzierung von Influenzaviren. Es
ist mit seinen Maßen von 33x23x15 cm sowie einem Gewicht von 2,8 kg darüber hinaus ebenso
für den mobilen Einsatz wie auch für einen stationären Einsatz im Labor geeignet.
Kontakt:
Martin Schulze
Robert Koch-Institut
[email protected]
19
Diagnostik
Entwicklung schneller Methoden zum Nachweis antiviraler
Resistenzen bei Influenzaviren
1
1
1
Duwe, S. ; Wedde, M. ; Schweiger, B. ;
1
Robert Koch-Institut, Berlin;
Resistenzen gegen die derzeit verfügbaren Wirkstoffe zur Therapie und Prophylaxe von
Influenzainfektionen entstehen durch Subtyp- und Inhibitor-spezifische Mutationen in den
therapeutischen Zielproteinen M2 Protein und Neuraminidase. Im Rahmen des FSI Projektes
wurden mit Hilfe der Pyrosequenztechnik Strategien (PSQ-PCR) entwickelt und etabliert, die es
ermöglichen schnell und zeitnah Influenza A-Viren der Subtypen A/H1N1, A/H3N2 und A/H5N1
sowie Influenza B-Viren auf das Vorliegen solcher genotypischer Resistenzen zu untersuchen.
Zur phänotypischen Analyse wurden ein fluorometrischer Neuraminidaseaktivitätstest und
Plaque-Reduktions-Assays eingesetzt.
Die Methoden konnten beim Auftreten der neuen Virusvariante A/H1N1v schnell angepasst und
auf das neue Erregerspektrum erweitert werden. Sofort nach Verfügbarkeit der ersten
Genomsequenzen wurden auf klassischer Sequenzierung basierende Resistenzanalysen der
Neuraminidasegene entwickelt und durchgeführt. Dadurch konnten neben der Analyse
bekannter Mutationen auch weitere Sequenzinformationen erhalten werden. Zur schnellen
Analyse resistenz-assoziierter Mutationen bei einer großen Anzahl von Viren wurde parallel
dazu die Sequenzierung der NA- und M2- Gene mit Hilfe der Pyrosequenztechnik entwickelt und
etabliert. Die Assays verfügen über eine hohe Sensitivität, so dass die Untersuchung nur
geringe Mengen viraler RNA erfordert und direkt aus respiratorischen Proben erfolgen kann. Um
Resistenzen zu erfassen, die nicht in bekannten Mutationen begründet sind, erfolgten
phänotypische Analysen von ausgewählten Isolaten. Bis Ende Oktober zeigte sich jedes der
insgesamt 375 getesteten neuen A/H1N1v-Viren sensitiv gegenüber Neuraminidase-inhibitoren.
Jedoch wurde in 100% der 286 untersuchten Virusisolate eine durch den Austausch S31N im
M2 Protein begründete Resistenz gegen Amantadin gezeigt.
Die umfassende Resistenzanalyse von repräsentativ für die in Deutschland zwischen Anfang
Oktober 1998 und Ende Oktober 2009 zirkulierenden Influenza A-Viren der Subtypen A/H1N1,
A/H1N1v, A/H3N2, A/H5N1 und Influenza B-Viren zeigte eine Co-Zirkulation resistenter und
sensitiver Viren verschiedener Subtypen in Deutschland. So zirkulieren seit dem Winter 2004
Amantadin-resistente Viren des Subtyps A/H3N2, seit November 2007 A/H1N1-Viren mit einer
Resistenz gegen Oseltamivir (Tamiflu®) und seit April 2009 Amantadin-resistente A/H1N1v der
neuen Virusvariante in Deutschland. Die erhobenen Daten werden regelmäßig im Rahmen der
Wochenberichte der Arbeitsgemeinschaft Influenza publiziert und in die Resistenzdatenbank
des ECDC/WHO eingepflegt.
Da jederzeit durch Reassortmentereignisse oder spontane Mutationen Resistenzeigenschaften
erworben und neue (multi)resistente Virusvarianten entstehen können, ist die weitere
umfassende Überwachung und Dokumentation der Resistenzsituation in Deutschland von
großer Bedeutung.
Kontakt:
Duwe, Susanne; Robert Koch-Institut, [email protected]
20
Pathogenese
Pathogenese
21
Pathogenese
Untersuchungen zur Pathogenese des hämorrhagischen
Syndroms und zum Organtropismus von hochvirulenten
H5N1 Isolaten in unterschiedlichen Spezies
1
1
1
1
1
1
1
Breithaupt, A. ; Teifke, J.P. ; Beer, M. ; Kalthoff, D. ; Veits, J. ; Deckers, D. ; Schröer, D. ;
2
3
3
4
1
Kalhoro, N. ; Kaspers, B. ; Krohmann, C. ; Koczan, D. ; Vahlenkamp, T.W.
1
Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems
2
Institut für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover
3
Institut für Tierphysiologie, Ludwig-Maximilians-Universität, München
4
Institut für Immunologie, Universität Rostock, Rostock
Einleitung: Das Krankheitsbild der hochpathogenen aviären Influenzavirusinfektion im Geflügel
zeigt eine hohe Variabilität, die durch die extreme Virulenzbreite des Erregers bedingt wird.
Immunhistochemische Untersuchungen zeigen, dass diese Variabilität im Gewebetropismus des
Erregers wieder zu finden ist. Insbesondere in Hühnervögeln ist die Infektion der Blutgefäßzellen
ausgeprägt. In dieser Spezies zeigt sich eine schwere systemische Erkrankung mit hoher
Mortalität und einer disseminierten Blutungsneigung (hämorrhagisches Syndrom). Neben der
direkten Infektion des Gefäßendothels wird eine überschießende Immunantwort („Cytokine
storm“) als Ursache für diese Symptome diskutiert.
Material und Methoden: Zur Untersuchung des Organtropismus wurden Hühner, Entenvögel und
Sperlingsvögel mit unterschiedlichen hochpathogenen aviären Influenzaviren (HPAIV) infiziert
und umfangreich beprobt. Immunhistochemisch erfolgte der Nachweis von InfluenzavirusNukleoprotein-Antigen mittels ABC-Methode am Paraffinschnitt.
Die Auswirkungen einer HPAIV Infektion auf die Genexpression von permanenten
Hühnerfibroblastenzellen, wurde mittels Microarraytechnologie analysiert. Als Modell diente die
Zelllinie DF-1, die mit HPAIV H5N1 infiziert wurde. Der Chicken Genome Array® von Affymetrix
ermöglichte die semi-quantitative Erfassung differentiell exprimierter Gene unter besonderer
Berücksichtung von Entzündungsmediatoren und Blutgerinnungsfaktoren.
Ergebnisse: Das Influenzavirus Antigen ließ sich bei allen verstorbenen Tieren im
Nervengewebe nachweisen (Neurotropismus). Darüber hinaus lag bei Hühnern stets ein
Endotheltropismus vor, der in Entenvögeln und Sperlingsvögeln selten nachgewiesen wurde.
Der Epitheltropismus in den Parenchymen einzelner Spezies war sehr variabel. Neben
nekrotischen Organveränderungen, die von einer geringen Entzündung begleitet wurden, fand
sich häufig eine massive Lymphozytendepletion in Milz und Bursa.
Die bisherige Auswertung der Untersuchungen mittels Microarray zeigte, dass bei infizierten
Zellen interessanterweise der Anzahl an Genen mit erhöhter Expression eine deutlich größere
Anzahl an Genen mit verringerter Expression gegenüberstand. Differentiell exprimierte Gene der
Immunmodulatoren und der Blutgerinnungskaskade waren u.a. TNFSF-15, TRAF-6, MYD88,
TICAM1, MAPK1, NF-kappa-B sowie Thrombomodulin und Thromboplastin.
Kontakt:
Breithaupt, Angele; Friedrich-Loeffler-Institut, [email protected]
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Pathogenese
Untersuchungen zur Empfänglichkeit von ausgewählten
Vogelspezies und Säugetieren für das in Deutschland
isolierte HPAIV H5N1
1
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2
1
Kalthoff, D. ; Breithaupt, A. , Harder, T. ; Vahlenkamp, T. ; Beer, M.
1
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Greifswald-Insel Riems; Friedrich-Loeffler-Institut,
Institut für Infektionsmedizin, Greifswald-Insel Riems;
HPAIV H5N1 Viren zeichnen sich im Unterschied zu anderen Influenzaviren durch eine
außerordentlich hohe Virulenz in Verbindung mit einem breiten Spezies-Tropismus (inklusive
Mensch) aus. Die Determinanten dieser Besonderheiten sind sowohl auf Seiten des Virus wie
auf Seiten des Wirts zum Großteil unbekannt. Mittels experimenteller Infektion von
Säugetierspezies und verschiedener Vogelspezies konnten speziesspezifische pathogenetische
Parameter bestimmt werden. Dabei wurden Untersuchungen zu den Mechanismen der
Virusvermehrung, des Zelltropismus, der Virusausscheidung, der Inkubationsperiode sowie zur
molekularen und biologischen Charakterisierung der Viren angestellt. Sowohl dosisabhängige
wie auch immunologisch induzierte Unterschiede hinsichtlich der Empfänglichkeit und des
weiteren Krankheitsverlauf wurden festgestellt und weiter untersucht. Außerdem konnten durch
den Vergleich von HPAI-Viren der Jahre 2006 und 2007 virusspezifische Virulenzunterschiede
detektiert und charakterisiert werden.
Damit konnten beispielsweise für die Infektion von Rindern, Höckerschwänen, verschiedenen
Singvogelspezies und im Rahmen eines Mausmodells neue pathogenetische Kenndaten
ermittelt werden. So lassen sich Rinder infizieren und sie serokonvertieren anschließend,
scheiden jedoch kaum H5N1 Virus aus. Höckerschwäne sind hochempfänglich für die Infektion,
es werden erhebliche Virusmengen ausgeschieden und naive Tiere erliegen rasch einer
Infektion mit hoher Dosis. Kreuzprotektive (heterologe) Antikörper können Schwäne allerdings
vor der klinischen Erkrankung, nicht jedoch vor einer Infektion und Virusausscheidung schützen.
Weiterhin konnte erstmal gezeigt werden, dass der Migrationsstatus (stark ziehend, schwach
ziehend, nicht ziehend) von Schwarzkehlchen (Saxicola torquata) keinen Einfluss auf die sehr
hohe Empfänglichkeit dieser Singvögel gegenüber HPAIV H5N1 hat und obwohl die minimal
infektiöse Dosis für Blutschnabelweber (Quelea quelea) mehr als 100fach höher ist als diejenige
von Mönchsgrasmücken (Sylvia atricapilla), zeigen beide Spezies einen ausgeprägten
Neurotropismus
Die Ergebnisse dienen dem besseren Verständnis der Pathogenese von HPAIV H5N1. Dieser
Erkenntnisgewinn ist unerlässlich für eine Bewertung und epidemiologische Vorhersage von
Ausbrüchen mit diesen Isolaten bei verschiedenen Spezies und für die Beurteilung des
Gefährdungspotentials des Menschen.
Literatur:
Kalthoff D, Breithaupt A, Teifke JP, Globig A, Harder T, Mettenleiter TC, Beer M. Highly pathogenic avian influenza
virus (H5N1) in experimentally infected adult mute swans. Emerg Infect Dis. 2008 Aug;14(8):1267-70
Kalthoff D, Hoffmann B, Harder T, Durban M, Beer M. Experimental infection of cattle with highly pathogenic avian
influenza virus (H5N1). Emerg Infect Dis. 2008 Jul;14(7):1132-4
Kalthoff D, Breithaupt A, Helm B, Teifke JP, Beer M. Migratory status is not related to the susceptibility to HPAIV
H5N1 in an insectivorous passerine species. PLoS One. 2009 Jul 9;4(7):e6170.
Kontakt:
Kalthoff, Donata; Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Greifswald –
Insel Riems, [email protected]
23
Pathogenese
Die Einführung einer polybasischen Spaltstelle in ein
niedrigpathogenes aviäres H3N8 Virus führt nicht zum
hochvirulenten Phänotyp
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2
2
Stech, O. ; Veits, J. ; Weber, S. ; Deckers, D. ; Schröer, D. ; Vahlenkamp, T. ; Breithaupt, A. ; Teifke,
2
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J. ; Mettenleiter, T. C. ; Stech, J.
Friedrich-Loeffler-Institut, Institute für
Riems
1
Molekularbiologie und für
2
Infektionsmedizin, Greifswald-Insel
Hochpathogene aviäre Influenzaviren (HPAIV) unterscheiden sich von niedrigpathogenen
Stämmen durch eine polybasische Spaltstelle im Hämagglutinin (HA) und gehören
ausschließlich zum Serotyp H5 oder H7. Um zu untersuchen, ob die Einführung einer
polybasischen Spaltstelle in ein niedrigpathogenes aviäres Influenzavirus mit einem anderem
HA-Serotyp für eine unmittelbare Transformation in ein HPAIV ausreicht, wurde mittels reverser
Genetik die Spaltstellenregion einschließlich benachbarter Aminosäuren von
A/Duck/Ukraine/1/1963 (H3N8) an die der HPAIV A/Chicken/Italy/8/98 (H5N2),
A/Chicken/HongKong/220/97 (H5N1) oder A/Chicken/Germany/R28/03 (H7N7) angepasst. Alle
drei Spaltstellenmutanten können im Gegensatz zum avirulenten Wildtyp in Abwesenheit von
exogenem Trypsin replizieren. Ihre in-vitro-Eigenschaften entsprechen daher einem HPAIV. Im
Huhn hingegen zeigten sie keine hohe Pathogenität, führten aber im Gegensatz zum avirulenten
Wildtyp bei einigen Tieren zu vorübergehenden Erkrankungen. Weiterhin konnten die
Spaltstellenmutanten aus Kloakentupfern von Tieren mit klinischer Symptomatik reisoliert
werden, was auf eine gesteigerte Replikation in vivo hindeutet. Zusammengefasst zeigen diese
Ergebnisse, dass die hohe Virulenz der HPAIV im Huhn nicht nur von einer polybasischen HASpaltstelle, sondern darüber hinaus von weiteren Determinanten im HA selbst oder in den
anderen viralen Proteinen abhängt. Daher ist der notwendige Erwerb einer polybasischen HASpaltstelle durch ein niedrigpathogenes Vorläufervirus nur ein Schritt in der Evolution zum
HPAIV.
Kontakt:
Stech, Olga; Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Molekularbiologie, [email protected]
24
Pathogenese
Die Virulenzdeterminanten der H5N1-HPAIV befinden sich
sowohl im HA als auch in den anderen viralen Proteinen und
liegen schon in niedrigpathogenen H5N1-Stämmen in
verdeckter Form vor
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1
1
2
2
Bogs, J. ; Veits, J. ; Gohrbandt, S. ; Hundt, J. ; Stech, O. ; Breithaupt, A. ; Teifke, J. ; Mettenleiter, T.
1
1
C. ; Stech, J.
1
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institute für Molekularbiologie und Infektionsmedizin, 17493 Greifswald – Insel
Riems
Hochpathogene aviäre Influenzaviren (HPAIV) unterscheiden sich von allen anderen
Influenzaviren durch ein polybasisches Spaltmotiv im Hämagglutinin (HA). In dieser Studie
wurde das Potential eines niedrigpathogenen aviären H5N1-Stammes zur unmittelbaren
Umwandlung in ein HPAIV untersucht. Mittels reverser Genetik ersetzten wir die monobasische
Spaltstelle des Isolates A/Teal/Foehr/Wv632/05 (H5N1) (TF05) durch das polybasische Motiv
eines HPAIV (TF05poly). Um das Virulenzpotential aller viralen Gene eines H5N1 HPAIV zu
betrachten, stellten wir zwei Reassortanten mit dem HA-Gen des HPAIV
A/Swan/Germany/R65/06 (R65) und den verbleibenden sieben Gensegementen von TF05
(TF05-HA(R65)) sowie in umgekehrter Genkonstellation mit dem mutierten HA von TF05 und
den verbleibenden Virusgenen von R65 (R65-HA(TF05poly)) her. TF05poly und beide
Reassortanten konnten in-vitro ohne Zugabe von Trypsin replizieren - eine typische Eigenschaft
eines HPAIV. Weiterhin waren im Gegensatz zum avirulenten TF05 die Varianten TF05poly,
TF05-HA(R65) und R65-HA(TF05poly) pathogen im Huhn mit steigender Tendenz: Während die
HA-Spaltstellenmutante TF05poly eine temporäre nicht-letale Erkrankung bei allen Tieren
verursachte, führte die Reassortante TF05-HA(R65) zum Tode in 3 von 10 Tieren. Die
Reassortante R65-HA(TF05poly) zeigte die höchste Letalität, da 8 von 10 Tieren verstarben,
was der Virulenz „natürlicher“ HPAIV-Stämme entspricht. Zusammenfassend zeigen unsere
Untersuchungen, dass der Erwerb einer polybasischen HA-Spaltstelle nur einer von mehreren
notwendigen Schritten in der Evolution eines niedrigpathogenen H5N1-Vorläuferstammes zu
einem HPAIV ist und dass niedrigpathogene aviäre H5N1-Stämme bereits ein verdecktes
Virulenzpotential besitzen können. Darüber hinaus befinden sich die weiteren
Virulenzdeterminanten der H5N1 HPAIV unabhängig von der polybasischen HA-Spaltstelle im
gesamten HA selbst und in den anderen viralen Proteinen.
Kontakt:
Bogs, Jessica; Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Molekularbiologie, [email protected]
25
Pathogenese
Vergleichende H5N1 und H1N1v Pathogenesestudien im
Frettchenmodell
1
1
1
1
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2
2
1
Holznagel, E. ; Yutzy, B. ; Kruip, C. ; Wagner, R. ; Plesker, R. ; Eickmann, M. ; Becker, S. ; Löwer, J.
1
2
Paul-Ehrlich-Institut , Langen; Institut für Virologie , Philipps-Universität, Marburg.
Einleitung – Frettchen (Mustela putorius furo) stellen in der Influenza-Forschung das Tiermodell
der Wahl dar. Nachfolgend wird das Pathogenitätspotential von zwei Influenza-A-Isolaten
ermittelt und miteinander verglichen: A/cat/Germany/R606/2006 (H5N1) und A/Hamburg/5/2009
als Vertreter für pandemisches H1N1v (Schweinegrippevirus).
Material und Methoden – Frettchen wurden intranasal mit dem Isolat R606 (106, 107 und 108
EID50, 5 Tiere je Dosis) und dem Isolat A/Hamburg (106 TCID50, 5 Tiere je Dosis) inokuliert.
Klinische Parameter (Körpergewicht, Körpertemperatur, Spielfreude/Aufmerksamkeit und
respiratorische Symptome) wurden jeweils täglich um 8.00 und 15.00 Uhr ermittelt. Täglich
genommene Nasentupferproben dienten zur Bestimmung der Virusausscheidung (TCID50). Post
mortem wurden histolopathologisch Organläsionsprofile erstellt und Gewebe in der IHC auf
Virusantigen untersucht.
Ergebnisse – Bei relativ vergleichbarer Infektionsdosis (106 EID50 bzw. TCID50) erzielte das
H5N1-Isolat R606 einen deutlich höheren klinischen Pathogenitäts-Index als das H1N1v-Isolat
Ham09: 7 (5 – 9) bzw. 2 (1 - 2.5). Die H1N1v-Infektion verlief mehrheitlich subklinisch. Hohe
H5N1-Infektionsdosen (108 ID50) erhöhten den Pathogenitäts-Index des R606-Isolates
signifikant: 17 (15 – 19). Als Folge dieser hohen Infektionsdosen entwickelten sich schwere
interstitielle Pneumonien. Hingegen verliefen die H5N1-Infektionen mit 106 EID50 eher mild.
Virusantigen ließ sich immunhistologisch sowohl bei H5N1- als auch bei H1N1v-infizierten
Frettchen in Lungengeweben nachweisen. Vorläufige Daten zeigen, dass das H1N1v-Isolat
Ham09 zudem hochkontagiös ist.
Diskussion – Das H1N1v-Isolat Ham09 verursacht im Frettchenmodell einen subklinischen
Verlauf. Es ist allerdings unklar, ob eine höhere initiale Infektionsdosis den Krankheitsverlauf
möglicherweise erschweren kann. Das H5N1-Isolat R606 ist für Frettchen – dosis-abhängig –
relativ pathogen. Beide Viren sind in ihrer Ausbreitung nicht auf den oberen Atmungstrakt
beschränkt.
Kontakt: Dr. Holznagel, Edgar; Paul-Ehrlich-Institut, [email protected]
26
Pathogenese
Humanpathogene, aviäre und porzine Influenzaviren zeigen
deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Vermehrung in
einem humanen ex vivo Lungen-Infektionsmodell
1
2
1
3
3
2
Viola K. Weinheimer , Anne Becher , Markus Matthaei , Torsten Bauer , Mario Tönnies , A. Hocke ,
2
1
Stefan Hippenstiel und Thorsten Wolff
1
2
Fachgebiet Influenza/Respiratorische Viren, Robert Koch-Institut, Berlin; Medizinische Klinik m. S.
3
Infektiologie Charité, Berlin; HELIOS Klinikum Emil von Behring, Berlin
Einleitung
Saisonale Influenzaviren, hochpathogene aviäre H5N1 Viren und die pandemischen „swine
origin“ H1N1 Viren replizieren im humanen Respirationstrakt, während niedrig-pathogene aviäre
Viren sich dort kaum vermehren. Humane respiratorische Epithelzellen exprimieren sowohl
„aviäre“ als auch „humane“ Rezeptoren, so dass diese Unterschiede nicht allein durch die
Rezeptorverteilung erklärt werden können. Wir untersuchen daher die Hypothese, dass die
angeborene Immunität eine entscheidende Rolle bei der Restriktion spielt und diese Barriere
von hoch-pathogenen Viren durch bisher nicht identifizierte Mechanismen überwunden wird.
Methoden
Um den Beitrag der angeborenen Immunität zur Abwehr von Grippeviren im humanen
Respirationstrakt zu untersuchen, wurde ein humanes ex vivo Lungenkulturmodell aus
Patientenmaterial etabliert. Im Gegensatz zu häufig untersuchten permanenten Zelllinien, bleibt
bei diesen Explantaten die Komplexität der verschiedenen Zelltypen in der humanen Lunge
erhalten. In diesem neuen Infektionsmodell wurden unterschiedliche Viren mittels
Standardplaquetests und Immunhistochemie auf ihre Vermehrungsfähigkeit sowie ihren
Zelltropismus untersucht.
Ergebnisse/Diskussion
Sowohl ein saisonaler H3N2 Stamm als auch ein hochpathogenes H5N1 Patientenisolat
replizierten effizient in dem Lungenmodel, während ein niedrigpathogener aviärer Stamm sich
kaum vermehrte. Interessanterweise zeigten das humanpathogene und das aviäre Virus einen
unterschiedlichen Zelltropismus: der saisonale Stamm infizierte überwiegend Zellen im Bereich
der Bronchiolen, während das niedrigpathogene aviäre Virus vor allem in alveolaren Zellen
nachweisbar war. Neue pandemische „swine-origin“ H1N1 Viren zeigten im Vergleich zu einem
klassischen porzinen Influenzavirus ein erhöhtes Wachstum, welches jedoch deutlich unter dem
des saisonalen Stammes lag. Dies deutet auf eine noch unvollständige Adaptation für den
unteren Respirationstrakt hin, die möglicherweise die bisher überwiegend milden klinischen
Verläufe bei Patienten erklären könnte.
Derzeit untersuchen wir im Detail die nach Infektion induzierten Zytokine und Signalmoleküle,
um deren Beitrag zur Speziesbarriere zu klären.
Kontakt;
Priv.-Doz. Dr. Thorsten Wolff, Robert Koch-Institut, Berlin; [email protected]
27
Pathogenese
Macrophage TRAIL expression is IFN-ß-dependent and
mediates alveolar epithelial apoptosis and barrier
dysfunction in influenza virus pneumonia
1
2
3
4
1
1
1
Hoegner, K. ; Pleschka, S. ; Albrecht, J. ; Driever, F. ; Seeger, W. ; Lohmeyer, J. ; Herold, S.
1
University of Giessen Lung Center, Giessen, Germany
2
Institute of Medical Virology, University of Giessen, Germany
3
Department of General and Thoracic Surgery, Justus-Liebig-University, Giessen, Germany
4
Department of Pathology, Justus-Liebig-University, Giessen, Germany
Rationale: Influenza virus (IV) pneumonia occasionally progresses to acute lung injury
(ALI/ARDS). Although alveolar macrophages (AM) have been attributed a significant role in the
host defense towards IV, they were shown to contribute to lung injury progression by release of
pro-inflammatory mediators and cytokines such as the pro-apoptotic TNF-related apoptosisinducing ligand (TRAIL). However, the molecular signals underlying the regulation of
macrophage TRAIL and its epithelially expressed receptor DR5 upon IV infection remain elusive.
Methods and Results: IV (PR/8, H1N1) infection in vitro resulted in transcriptional and
translational upregulation of TRAIL in murine and human primary alveolar macrophages (AM),
and in enhanced expression of DR5 in human and murine isolated type I AEC (qRT-PCR,
FACS). IV-induced TRAIL upregulation was dependent on protein kinase R (PKR)-mediated NFқB activation, and on resulting auto-/paracrine interferon-ß (IFN-ß) released from AM and AEC,
as demonstrated by use of PKR-deficient AM and specific inhibitors. Additionally, TRAIL was
upregulated on FACS-separated F4/80-positive AM in PR/8 infected C57BL/6 mice in vivo at
day 8 post infection when PR/8 was largely cleared and type I IFN levels were increased in lung
homogenates. Finally, abrogation of TRAIL signalling resulted in delayed IV clearance, but
significantly reduced AEC apoptosis, alveolar leakage and mortality in PR/8 infected mice.
Conclusion: These data demonstrate that IFN-ß released from PR/8-infected AM and AEC in a
PKR-NF-қB-dependent manner is an important auto-/paracrine inducer of macrophage TRAIL
expression significantly contributing to loss of alveolar epithelial barrier integrity during severe IV
pneumonia.
Dr. Susanne Herold
University of Giessen Lung Center
Department of Internal Medicine II
Klinikstr. 36
D-35392 Giessen
[email protected]
28
Pathogenese
Evading the cytokine burst - Influenza A virus inhibits type I
IFN signaling via NF-κB dependent induction of SOCS-3
expression
1
2
3
3
Pauli, E. ; Wolff, T. ; Roth, J. ; Viemann, D. ; Ludwig, S.
1
2
1
3
Institute of Molecular Virology (IMV), WWU Münster, Robert-Koch-Institute, Berlin, Institute of
Immunology and Department of Pediatrics, WWU Münster
The type I interferon (IFN) system is a first line of defense against viral infections. Viruses have
developed various mechanisms to counteract this response. So far, the interferon antagonistic
activity of influenza A viruses was mainly observed on the level of IFNβ gene induction via
action of the viral NS1 protein. Here we present data indicating that influenza A viruses not only
suppress IFNβ gene induction but also inhibit type I IFN signaling through a mechanism
involving SOCS-3 gene induction. Our study was based on the observation that in cells that
were infected with influenza A virus and subsequently stimulated with IFNα/β, STAT1
phosphorylation was strongly reduced. This impaired STAT1 activation was not due to the action
of viral proteins but rather appeared to be induced by accumulation of viral 5´triphosphate RNA
in the cell. Suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins are potent endogenous inhibitors
of JAK/STAT signaling. Closer examination revealed that SOCS-3 but not SOCS-1 mRNA levels
increase in an RNA- and NF-kappaB-dependent but type I IFN-independent manner early in the
viral replication cycle. This direct viral induction of SOCS-3 mRNA and protein expression
appears to be relevant for suppression of the antiviral response since in SOCS-3 deficient cells
a sustained phosphorylation of STAT1 correlated with elevated expression of type I IFNdependent genes. As a consequence, progeny virus titers were reduced in SOCS-3 deficient
cells or in cells were SOCS-3 expression was knocked-down by siRNA. These data provide first
evidence that influenza A viruses suppress type I IFN signaling on the level of JAK/STAT
activation. The inhibitory effect is at least in part due to the induction of SOCS-3 gene
expression, which results in an impaired antiviral response. This mechanism may account for
the ability of highly pathogenic influenza viruses to efficently replicate in a antiviral cytokine
environment caused by a cytokine burst.
Kontakt:
Ludwig, Stephan
Institut für Molekuare Virologie (IMV)
Zentrum für Molekualrbiologie der Entzündung
WWU Münster
Von-Esmarch-Str. 56
48161 Münster
Email: [email protected]
29
Pathogenese
H5N1 Influenza A Virusisolate aus Vögeln und Menschen
stimulieren das humane Typ I Interferonsystem
unterschiedlich stark trotz funktioneller NS1 Proteine
Markus Matthaei, Viola Weinheimer und Thorsten Wolff; Robert Koch-Institut, Nordufer 20, 13353 Berlin
Hoch-pathogene H5N1-Influenza A Viren (IAV) können direkt von Vögeln auf den Menschen
übertragen werden. Diese Infektionen verlaufen zu etwa 60% fatal und können begleitet sein
von einer starken nicht-adaptiven Immunantwort und hoher Viruslast. Frühere Untersuchungen
von H5N1-Patientenisolaten in verschiedenen Zellkultur- und Tiermodellen führten zu
unterschiedlichen Aussagen über die Aktivierung der nicht-adaptiven Immunität und deren
Einfluss auf die Vermehrung der H5N1-Stämme. Die antiviralen Typ I Interferone (IFN)-alpha
und -beta sind wichtige Mediatoren der nicht-adaptiven Immunantwort. Epidemische IAV
unterdrücken mit ihrem Nichtstrukturprotein1 (NS1) die Aktivierung der Typ I IFN-Gene,
während einige Studien eine starke Typ I IFN-Induktion während H5N1-Infektionen beschreiben.
Dies könnte auf eine eingeschränkte Funktionalität der H5N1-NS1-Proteine in humanen Zellen
deuten, was zu einer verstärkten Zytokinsekretion führen könnte. Wir untersuchten daher, ob
verschiedene H5N1-Isolate die Typ I IFN-Expression in humanen Zellen im Vergleich zu
epidemischen IAV unterschiedlich modulieren.
Dazu wurde die Typ I IFN-Induktion und Vermehrungsfähigkeit von drei aviären und zwei H5N1Patientenisolaten mit einem saisonalen H3N2-Stamm verglichen. Die aviären H5N1-Isolate
erreichten geringere Titer in humanem Lungengewebe und Lungenepithelzelllinien und
induzierten eine stärkere IFN-beta-Sekretion als die H5N1-Patientenisolate und der H3N2Stamm. Die Vermehrung aller Stämme war durch Zugabe von IFN-alpha in das
Zellkulturmedium inhibierbar. Mittels reverser Genetik wurden zusätzlich reassortante Viren
generiert, die die jeweiligen H5N1-NS-Segmente im Hintergrund des H3N2-Stammes tragen.
Die rekombinanten H3N2-NS-Reassortanten replizierten ohne eine starke Typ I IFN-Antwort
auszulösen und alle NS1-Proteine unterdrückten effizient die Aktivierung eines humanen IFNbeta-Promotors.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die H5N1-NS1-Proteine im Hintergrund des saisonalen H3N2IAV dessen Replikation komplementieren und die Aktivierung des Typ I IFN-Systems effektiv
unterdrücken. Die hohe IFN-beta-Induktion durch die H5N1-Vogelisolate wird demnach nicht
durch eine eingeschränkte NS1-Funktionalität in humanen Zellen verursacht und bedingt
wahrscheinlich die niedrige Vermehrungsrate dieser Viren. Dies und die IFN-Sensitivität aller
Stämme deuten auf eine ähnliche Wirksamkeit von Typ I IFN im Menschen, wie in Mäusen,
Frettchen und Meerschweinchen hin, in denen eine IFN-Behandlung die Viruslast bei H5N1Infektionen deutlich senkt. Die in humanen Zellen funktionellen H5N1-NS1-Proteine
untermauern das pandemische Potential dieser Stämme und deuten auf uncharakterisierte
Veränderungen im viralen Genom hin, die den Patientenisolaten eine gute Vermehrung in
humanen Zellen ermöglichen, den Vogelisolaten aber fehlen.
Kontakt:
Matthaei, Markus; Robert Koch-Institut, Berlin; [email protected]
30
Pathogenese
Two strategies – one goal: adaptive mutations in the
polymerase of two human H5N1 strains results in different
preferences towards transcription and replication but equal
pathogenicity in mice
B. Mänz1, 2, D. Mayer1, H.-D. Klenk2 and M. Schwemmle1
1
Department of Virology, University Freiburg, 2Institute for Virology, University Marburg
For most human H5N1 isolates, including the strain A/Viet Nam/1203/2004 (Vn), adaptation to
mammals requires a lysine at position 627 in PB2. However, several exceptions, e.g. the isolate
A/Thailand/1(KAN-1)/2004, harbor glutamate at this position. The goal of this study was to show
whether other adaptive mutations in the viral polymerase compensate for the presence of 627E
and whether the Vn and KAN-1 polymerases show differences in transcription and replication.
Introduction of KAN-1-specific amino acids (aa) in the Vn PB2627E background revealed that
positions 391 and 701 in PB2 as well as 142 and 421 in PA were decisive for efficient
polymerase activity of KAN-1. Infection of cell cultures and mice with mutant KAN-1 viruses
verified the importance of these aa in PB2 and PA for virulence. To gain insights into the
transcription profile of KAN-1 and Vn polymerase, we analyzed the effect of PB2 on viral protein
expression. Late in infection, cells infected with the recombinant KAN-1 (rKAN) virus showed
remarkably lower levels of viral proteins than cells infected with rKAN expressing PB2Vn (rKANPB2Vn), whereas the opposite was found early in infection. Primer extension analysis of three
different viral genes confirmed reduced mRNA levels in rKAN-PB2Vn-infected cells at an early
time point, while this was reversed at a late stage of infection. Complementary to these findings,
cRNA and vRNA levels were both significantly higher in rKAN-PB2Vn-infected cells at all
analyzed time points. We conclude from our data that the KAN-1 and Vn polymerases differ in
their transcription and replication kinetics. Since the virulence in mice was comparable between
rKAN and rKAN-PB2Vn, we further speculate that the enhanced replication activity of PB2Vncontaining polymerase complexes compensate late in infection for the general reduced
transcriptional activity.
Kontakt:
Benjamin Mänz; [email protected]
31
Pathogenese
Vergleichende Charakterisierung von H7-Typ HPAIVReassortanten mit einem H5-Typ HPAIV NS-Segment in
aviären Trachealringkulturen und in verschiedenen
Zellkultur-Systemen
* Petersen, Henning 1, * Wang, Zongfang 2, Lenz, Eva 2, Stein, Michael 2, Rautenschlein, Silke 1,
Pleschka, Stephan 2
1
2
Kinik für Geflügel, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Medizinische Virologie, JustusLiebig-Universität Gießen (* haben gleichwertig zur Arbeit beigetragen)
Neue H5-Subtypen hoch pathogener aviärer Influenzaviren (HPAIV) haben sich von Asien nach
Europa ausgebreitet und große Verluste in Geflügelpopulationen verursacht. Humane
Infektionen zeigen eine Sterblichkeitsrate von ca. 60%. Obwohl tödlich für Hausgeflügel, haben
H7-Subtypen bis jetzt nur gelegentlich milde Infektionen im Menschen verursacht (mit
Ausnahme eines Todesfalles). Die Reassortierung mit H5-HPAIV könnte ihr pathogenes und
pandemisches Potential ändern. Die Tatsache, daß beide Subtypen im Geflügel zirkulieren, hat
uns angeregt zu analysieren, welchen Effekt die mögliche Reassortierung zwischen H7- und H5HPAIV auf die Pathogenität und Transmission von H7-Subtypen hat.
Reassortante H7-HPAIV mit einem NS-Segment von H5-HPAIV wurden erfolgreich mittels
reverser Genetik erzeugt. Wild-Typ FPV (WT): A/FPV/Rostock/34 (H7N1) und die
Reassortanten FPV NS GD: mit dem NS-Segment von A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1), FPV
NS VN: mit dem NS-Segment von A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), FPV NS Ma: mit dem NSSegment von A/Mallard/Netherlands/12/00 (H7N3). Wir untersuchten die Infektions- und
Vermehrungsmöglichkeit dieser Varianten in verschiedenen Zellinien von Säugern und Vögeln
(MDCK, Vero, A549, 293T und QT6, LMH) und vergleichend in Trachealringkulturen (TOC) von
Puten- und Hühnerembryonen. Foci-Größe, Replikations-Effizienz, Wirts-Tropismus, RNPKernexport und Apoptose- / IFN-Induktion wurde mit permanenten Zellen, sowie Vermehrung,
Pathogenität, Wirts-Tropismus und Apoptose-Induktion in TOC untersucht.
Wir zeigen, daß das NS-Segment von H5-HPAIV die Charakteristika von H7-HPAIV ändern
kann, einschließlich Vermehrungs-Effizienz, Wirts-Tropismus, Pathogenität, das Potential
Apoptose zu induzieren und Effizienz des RNP-Kernexports. Puten-TOC scheinen
empfänglicher für die Infektion mit WT-FPV und den Reassortanten zu sein, da, verglichen mit
Hühner-TOC, höhere Virustiter und eine signifikant frühere Induktion der Apoptose zu
beobachten war. Diese speziesbezogenen Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber den
Virustypen sind unabhängig von der Virulenz des WT-FPV oder der Reassortanten, ebenso wie
die Induktion der Apoptose. In permanenten Säuger- und Vogelzellinien zeigen die
verschiedenen Virusvarianten unterschiedliche Foci-Phänotypen und Vermehrungsraten, welche
sich auch zwischen Säuger- und Vogelzellinien unterscheiden. Die Ergebnisse zeigen, dass
Reassortierung zwischen einem strikt aviären H7-HPAIV und natürlich auftretenden H5-HPAIV
tatsächlich zu neuen Viren führen kann, welche neue Charakteristika zeigen und womöglich
eine Gefährdung für Mensch und Tier darstellen können.
Kontakt:
Pleschka, Stephan; Institut für Medizinische Virologie, [email protected]
32
Pathogenese
Hochpathogene aviäre H5 Viren benötigen neben dem Erwerb
der polybasischen Spaltstelle die Anpassung benachbarter
Regionen im Hämagglutinin
1
1
1
2
1
1
Gohrbandt, S. ; Hundt, J. ; Veits, J. ; Breithaupt, A. ; Weber, S. ; Mettenleiter, T. C. ; Stech, J.
1
1
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Molekularbiologie, Greifswald-Insel Riems, Germany; FriedrichLoeffler-Institut, Institut für Infektionsmedizin, Greifswald-Insel Riems, Germany
Die polybasische Spaltstelle des Hämagglutinins (HA) ist bei hochpathogenen aviären
Influenzaviren (HPAIV) primäre Virulenzdeterminante. Niedrigpathogene aviäre Influenzaviren
vom Subtyp H5 haben ein Valin an Position P7 (Aminosäurerest 7 N-terminal zur Spaltstelle),
während H5 HPAIV mit langem polybasischem Spaltmotiv an der entsprechenden Position Serin
oder Threonin tragen. Des Weiteren besitzen alle niedrigpathogenen H5-Stämme an P2 ein
Threonin. Diese Beobachtungen legen nahe, dass der Erwerb einer polybasischen Spaltstelle
mehrere Schritte erfordert. Um zu untersuchen, ob diese Positionen einen Einfluss auf
Spaltungseffizienz des HA und Virulenz haben, wurden von uns monobasische
Spaltstellenmutanten des HPAIV A/Swan/Germany/R65/06 H5N1 (R65) hergestellt: R65monoS-ER; R65mono-V-ER mit dem Austausch von Serin zu Valin an P7; R65mono-S-ETR und
R65mono-V-ETR jeweils mit Insertion eines Threonin an P2. Des Weiteren wurde auch im HA
von R65 mit polybasischer Spaltstelle Serin an zu P7 analoger Position durch Valin ersetzt
(R65-V). In Zellkultur erfolgt die Replikation aller monobasischen Deletionsmutanten
ausschließlich unter Zugabe von Trypsin. Bemerkenswerterweise ist die HA-Spaltung von
R65mono-S-ER nicht vollständig. Hühner erkrankten nach Infektion mit diesen Mutanten nicht,
während R65-infizierte Tiere nach zwei Tagen verstarben. Hingegen zeigten Hühner, die mit
R65-V infiziert wurden, eine verlängerte Überlebenszeit. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass
Serin an P7-analoger Position im HA von R65 zur Virulenz beiträgt. Zusammengenommen
bedeutet dies, dass die Evolution eines niedrigpathogenen H5-Virus zu einem HPAIV mit
polybasischer Spaltstelle in mehreren Schritten erfolgt. Nicht nur der Erwerb basischer
Aminosäuren in der Spaltstellenregion ist erforderlich sondern auch die Anpassung von deren
Umgebung.
Kontakt:
Sandra Gohrbandt, Friedrich-Loeffler-Institut; [email protected]
33
Prophylaxe
Prophylaxe
34
Prophylaxe
Entwicklung eines trivalenten Impfstoffes zur
Immunprophylaxe der Schweineinfluenza auf der Basis
aktueller Stämme der Subtypen H1N1, H3N2 und H1N2
1
2
Dürrwald, R. ; Zell, R.
1
2
IDT Biologika GmbH, Dessau-Roßlau; Institut für Virologie und Antivirale Therapie, Universitätsklinikum
Jena, Jena
Der Subtyp H1N2 der Influenza A Viren beim Schwein enthält ein H1 Hämagglutinin, das
serologisch nicht mit den bei Schweinen vorkommenden H1N1-Viren kreuzreagiert. Um die
Verbreitung dieses Subtyps zu untersuchen, wurde ein Programm zur Überwachung der
Schweineinfluenza initiiert. Dieses wird seit 7 Jahren ununterbrochen durchgeführt. Die
epidemiologische Bedeutung des Subtyps H1N2 wurde nachgewiesen.
Die bisher zur Immunprophylaxe der Schweineinfluenza verfügbaren Impfstoffe enthalten nur
die Subtypen H1N1 und H3N2. Zudem sind alle mit Mineralölen adjuvantiert. Diese Mineralöle
sind in der Lage, kurzzeitig Fieber zu induzieren. Sie wirken daher gleichzeitig als Stressoren
und können latente Infektionen aktivieren.
Um der neuen epidemiologischen Situation zu entsprechen, wurde ein trivalenter Impfstoff
entwickelt, der die Subtypen H1N1, H3N2 und H1N2 enthält und zugleich ein verträgliches
Adjuvans besitzt, das kein Fieber induziert.
Stämme der drei Subtypen wurden als Impfstämme selektiert. Sie wurden ursprünglich von
erkrankten Schweinen aus Regionen mit hoher Schweinedichte isoliert. Zur Kultivierung wurde
ein effizientes Zellkulturverfahren entwickelt. Die Viren werden nach der Kultivierung mit
binärem Ethylenimin inaktiviert. Als Adjuvans wird eine Substanz aus der Gruppe der
Carboxyvinylpolymere verwendet. Dieses Adjuvans induziert kein Fieber, auch nicht in der
kritischen Phase der ersten 24 Stunden nach der Injektion, in welcher Mineralöle kurzzeitige
Fieberreaktionen von 41 bis 42°C bei Schweinen auslösen können.
Der Impfstoff wurde in umfangreichen Untersuchungen hinsichtlich Verträglichkeit und
Wirksamkeit getestet. Er durchläuft ein zentrales Zulassungsverfahren bei der EMEA. Die List of
Questions and List of Outstanding Issues wurden vollständig beantwortet. Mit der Zulassung
wird in den nächsten Wochen gerechnet.
Im Zusammenhang mit der A/H1N1v-Pandemie beim Menschen war es von Interesse, die
Kreuzreaktivität der in Schweineinfluenzaimpfstoffen enthaltenen Impfstämme mit dem neuen
Virus zu testen. Serologische Untersuchungen ergaben, dass alle in Europa eingesetzten H1N1Impfstämme kreuzreaktiv zu dem A/H1N1v-Virus sind, wenn sie mit einem starken Adjuvans
eingesetzt werden. Mehrere Stämme von A/H1N1v wurden an die Produktionszelllinie adaptiert.
Labormuster von Impfstoffen mit dem neuen A/H1N1v-Virus wurden hergestellt, an Schweine
verimpft und bezüglich ihrer Wirksamkeit serologisch und in Infektionsversuchen gegen den
H1N1-Impfstamm aus dem trivalenten Impfstoff geprüft. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen
werden vorgestellt.
Kontakt:
Dürrwald, Ralf; IDT Biologika GmbH, E-Mail: [email protected]
35
Prophylaxe
Rekombinante Newcastle Disease Viren als Markervakzinen
gegen hochpathogene aviäre Influenzaviren vom Subtyp H5
1
2
1
2
1
Topfstedt, E. ; Deckers, D. ; Veits, J. , Grund, C. ; Mettenleiter, T.C. ; Römer-Oberdörfer, A.
1
1
2
Institut für Molekularbiologie; Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut , D-17493 GreifswaldInsel Riems
Die Entwicklung moderner Impfstoffe gegen hoch pathogene aviäre Influenza, die zum einen
nach Massenapplikation als Spray oder im Trinkwasser einen zuverlässigen Schutz vermitteln
und zum anderen die Unterscheidung zwischen geimpften und infizierten Tieren (DIVA-Prinzip)
ermöglichen, war Gegenstand unserer Arbeiten im Rahmen des FSI Programms.
Die Verwendung des Newcastle Disease Virus (NDV) als Vektor für die Expression z.B. des H5
Proteins des hochpathogenen aviären Influenzavirus (HPAIV) bietet die Möglichkeit, Geflügel
simultan gegen zwei bedeutsame Viruserkrankungen zu schützen. Für die Impfung gegen die
Newcastle Krankheit wird u.a. der Lebendimpfstoff Clone 30 erfolgreich eingesetzt. Das von
uns für dieses Virus etablierte reverse genetische System ermöglicht die Herstellung
rekombinanter Viren mit verändertem Genom und damit auch die Expression fremder Proteine.
Zur Herstellung rekombinanter NDV, die das Hämagglutinin oder das Hämagglutinin und die
Neuraminidase des HPAIV A/Singschwan/Deutschland/R65/06 (H5N1) exprimieren, wurden die
Gene für H5, N1 bzw. ein verändertes H5, bei dem die polybasische proteolytische Spaltstelle
des H5 zu einer monobasischen Spaltstelle verändert wurde (H5lp), zwischen die NDV Gene
des Fusionsproteins (F) und des Hämagglutinin-Neuraminidase Proteins (HN) bzw. zwischen
die Gene des Phospoproteins (P) und des Matrixproteins (M) inseriert. Die generierten Viren
NDVH5RFHN, NDVH5RlpFHN und NDVH5N1R wurden in vitro charakterisiert. Zur
Untersuchung der Schutzwirkung wurden drei Wochen alte, spezifisch pathogen freie Hühner
mit jeweils einer Rekombinanten immunisiert und drei Wochen später mit HPAIV vom Subtyp H5
infiziert. Dabei zeigte sich, dass alle Tiere gegen Infektion mit dem homologen HPAIV H5N1
geschützt waren. Bei Infektion mit einem heterologen HPAIV H5N1 war bei allen drei
Immunisierungsgruppen der größte Teil der Tiere geschützt, jedoch gab es vereinzelt
Erkrankungen und in jeder Gruppe auch Tiere, die an der Infektion verstarben bzw. bis zum
Versuchsende Krankheitszeichen aufwiesen. Im Gegensatz dazu zeigte nach einer
Belastungsinfektion mit einer letalen Dosis des heterologen HPAIV A/Huhn/Italien/8/98 (H5N2)
keines der Tiere Krankheitssymptome. Die Untersuchung von Antikörpertiter, Virusausscheidung und Serokonversion bei den drei Versuchsgruppen ergab, dass alle drei NDV-AIV
Rekombinanten eine hohe protektive Wirkung aufweisen, die nach Infektion der immunisierten
Tiere eine Markerdiagnostik ermöglichen.
Kontakt:
Römer-Oberdörfer, Angela; Institut für Molekularbiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, [email protected]
36
Prophylaxe
Entwicklung und Charakterisierung von genetischen AAVbasierten Influenza Impstoffen
1
1
1
1
2
2
1
1
Sipo, I. , Knauf, M , Semmler, I. , Wildner, J. , Fechner, H. , Poller, W. , Kurth, R. , Norley, S.
1
2
Robert Koch-Institut, Berlin, Institut für Kardiologie & Pneumologie, Charité - Universitätsmedizin, Berlin
Einleitung
Das Auftreten immer neuer Influenzavirus-Varianten mit unvorhersehbaren Folgen, macht neue
Impfstoffestrategien dringend notwendig. Diese sollten sowohl einen breitwirksamen Schutz in
der Bevölkerung gewähren, als auch schnell an neue Viren angepasst und produziert werden
können. Das hochpathogene aviäre Influenzavirus H5N1, das seit 1997 in Asien ausgebrochen
ist, hat bisher weltweit 442 Menschen infiziert (Mortalitätsrate von 60%). Dieses hochpathogene
Virus könnte eine Pandemie mit fatalen Folgen für die Bevölkerung auslösen. Zur Vorbereitung
auf eine mögliche Pandemie wurden genetische, Adeno-Assoziertes Virus (AAV)-basierte
Influenza-Impfstoffe entwickelt und evaluiert. Dabei wurden AAV-Vektoren generiert, die für die
konservierten H5N1-Immunogene: Nukleoprotein NP, Matrixprotein M1, Ionen-Kanal Protein M2
sowie das weniger konservierte Haemagglutinin kodieren. Weiterhin wurden angesichts der
derzeitigen Schweinegrippe-Pandemie genetische Impfstoffe gegen das aktuelle H1N1-Virus in
die Entwicklung einbezogen.
Methoden
Die rekombinanten AAV-Vektoren wurden in HEK293T-Zellen produziert und durch
Ultrazentrifugation angereichert. Die zelluläre Immunantwort in immunisierten Mäusen wurde
durch INF-γ basierte ELISPOT-Assays gemessen. Für die Belastungsstudien wurden die Mäuse
intranasal mit Influenzaviren infiziert.
Ergebnisse
Immunogenitätsstudien in Mäusen zeigen, dass die H5- und NP-kodierende Impfvektoren eine
starke H5- bzw. NP-spezifische T-Zellantwort hervorrufen. Das M1-basierte Konstrukt zeigte im
Vergleich zu H5 und NP eine mäßige Immunantwort. In keinem der beiden Mausstämme konnte
eine M2-spezifische T-Zellantwort beobachtet werden. Die bisherigen Belastungsstudien zeigen,
dass 60% bzw. 30% der NP-immunisierten Mäuse eine Infektion mit 5 bzw. 100 MLD50
homologen H5N1 Virus überleben. Nach einer multivalenten Immunisierung mit vier
Impfkonstrukten steigt die Überlebensrate auf 80% nach Belastung mit 5 MLD50 eines
homologen H5N1-Virus, während 40% der geimpften Tiere eine Belastung mit einem
heterologen H5N1-Virus überleben. Es konnte auch eine geringere Viruslast in den Lungen der
immunisierten Tiere festgestellt werden.
Im Bezug auf das Schweinegrippenvirus H1N1 zeigen erste Ergebnisse eine starke Induktion
der T-Zellantwort nach Immunisierung mit H1-, NP- und M1-exprimierenden AAV-basierten
Impfvektoren. Erste Belastungsexperimente haben gezeigt, dass 40% der immunisierten Mäuse
eine Infektion mit der letalen Dosis des heterologen H1N1-Virus (A/Puerto Rico/8/1934)
überleben.
Schlussfolgerung
Diese Ergebnisse zeigen, dass genetische, AAV-basierte Impstoffe einen Schutz gegen eine
letale Infektion mit homologen und heterologen Influenzaviren ermöglichen. Weitere
Verbesserungen und Untersuchungen, auch in anderen Tiermodellen, sind erforderlich um die
Effizienz des Systems zu optimieren.
Kontakt:
Sipo, Isaac ; Robert Koch-Institut, Berlin, [email protected]
37
Prophylaxe
Eine einmalige Impfung und niedrige Dosen eines MVAbasierten H5N1-Impfstoffes sind ausreichend für die
Induktion einer kreuz-reaktiven Schutzwirkung gegen H5N1
1
2
1
1
2
1
2
Kreijtz, J. ; Süzer, Y. ; Mutsert, G. ; van Amerongen, G. ; Schwantes, A. ; Fouchier, R. ; Löwer, J. ;
1
1,3
1
Osterhaus, A. ; Sutter, G. and Rimmelzwaan, G.
Erasmus Universität, Rotterdam; 2 Paul-Ehrlich-Institut, Langen (Hessen); 3 LudwigMaximillians-Universiät, München
1
Infektionen des Menschen mit hoch pathogenen aviären Influenza Viren (HPAI) des Subtyps
H5N1 führen zu hoher Morbidität und Mortalität. Die Häufigkeit von Infektionen nimmt seit 2003
stetig zu und dadurch auch die mögliche Entstehung einer H5N1-Pandemie. Daher ist die
Entwicklung von sicheren und effektiven Impfstoffen wünschenswert. Modifizierte Vaccinia Virus
Ankara-(MVA)-basierte H5N1-Impfstoffe zeigten bereits in zwei Tiermodellen einen effektiven
Schutz nach zweimaliger Applikation hoher Impfdosen. Die Verwendung niedrigerer Dosen des
Impfstoffes würde die Möglichkeit eröffnen, eine viel größere Anzahl von Individuen zu
vakzinieren. Zusätzlich wäre hierbei die Induktion einer ausreichenden Schutzwirkung nach nur
einer einzigen Applikation wünschenswert.
Folglich wollten wir die minimalen Voraussetzungen, welche zur Induktion einer protektiven
Immunität durch MVA-basierte H5N1-Vakzine in Mäusen nötig sind, untersuchen. Zu diesem
Zweck wurden Mäuse ein- oder zweimal mit absteigenden Dosen eines rekombinanten MVA,
welches das Hämagglutinin-Gen (HA) des Influenza Virus A/Vietnam/1194/04 exprimiert,
geimpft. Durch eine Infektion mit einem homologen Clade 1- und einem heterologen
Clade 2.1-Influenza Virus sollte die protektive Effizienz dieser Impfung untersucht werden.
Die Ergebnisse zeigten, dass MVA-basierte Impfstoffe selbst bei Verwendung niedriger Dosen
und bei einmaliger Applikation eine Schutzwirkung hervorrufen, welche selbst gegen
unterschiedliche H5N1-Stämme wirksam ist, und dass diese damit äußerst vorteilhafte
Eigenschaften eines H5N1-Impfstoff-Kandidaten aufweisen.
Kontakt:
Sutter,Gerd; Ludwig-Maximillians-Universität, [email protected]
Süzer, Yasemin; Paul-Ehrlich-Institut, [email protected]
38
Antivirale Therapie
Antivirale Therapie
39
Antivirale Therapie
Vergleichende Untersuchungen zur OseltamivirEmpfindlichkeit von Influenzavirus A/swine/Potsdam/15/81 in
vitro, in der Maus und im Schwein
a
b
a
a
a
b
a
Topf, D. , Dürrwald, R. , Bauer, K. , Braun, H. , Richter, M. , Schlegel, M. , Wutzler, P. , Schmidtke,
a
M.
a
Institut für Virologie und Antivirale Therapie, Universitätsklinikum Jena, Hans-Knoell-Straße 2, 07745
b
Jena, Abteilung Forschung und Entwicklung, IDT Biologika GmbH, Dessau-Roßlau, Am Pharmapark 1,
06861, Germany
Wie das Beispiel des derzeitig zirkulierenden pandemischen Influenza-A-Virus (FLUAV) vom
Subtyp H1N1 zeigt, können Gensegmente von porzinen Influenzaviren im Ergebnis einer
Reassortierung zum Bestandteil humanpathogener Viren werden. Im konkreten Fall stammen
die Genomsegmente 6 und 7 von europäischen porzinen FLUAV. Sie kodieren Targetproteine
für vorhandene Grippemedikamente, den Ionenkanal M2 und die Neuraminidase. Bisher
existieren kaum Daten zur Empfindlichkeit europäischer porziner FLUAV gegenüber
Neuraminidasehemmern. Das Teilprojekt 10.3 des FluResearchNet soll u.a. dazu beitragen,
diese Lücke zu schließen. Ein Ziel bestand darin, die Oseltamivir-Empfindlichkeit des in
Deutschland isolierten Influenzavirus A/swine/Potsdam/15/81 in vitro, in der Maus und im
Schwein zu vergleichen.
Das Isolat A/swine/Potsdam/15/81 erwies sich in einem Chemilumineszenz-basierten NAHemmtest als sehr Oseltamivir-empfindlich (50%ige NA-Hemmkonzentration: 0.24 nM).
Oseltamivir hemmte zudem im nanomolaren Konzentrationsbereich die Virus-induzierte
Plaquebildung, den Virusertrag und die Virusausbreitung in MDCK-Zellen.
Die gute Oseltamivir-Empfindlichkeit dieses Isolates bestätigte sich auch in vivo. Placebobehandelte weibliche BALB/c-Mäuse erkrankten ca. 2 Tage nach Infektion mit
A/swine/Potsdam/15/81 (105 TCID50/20 µl/Maus) und verloren bis zu 35 % ihres Körpergewichts.
Bei 40 % der Mäuse führte die Infektion nach 9-12 Tagen zum Tod. Die überlebenden Tiere
gesundeten bis zum Tag 17 p.i. Als Folge der Virusreplikation ließ sich zum 21. Tag p.i. in der
Lunge eine starke Entzündungsreaktion beobachten, die mit einer deutlichen Erhöhung des
Lungengewichts einherging. Die Oseltamivirbehandlung infizierter Mäuse (5 mg/kg, 2 x täglich;
an 5 aufeinander folgenden Tagen) verhinderte die Letalität, verkürzte die Krankheitsdauer um 3
Tage und reduzierte signifikant die klinischen Anzeichen der Erkrankung. Außerdem führte die
Gabe des Virustatikums zu einem signifikant niedrigeren Körpergewichtsverlust und
histopathologischen Grad der Lunge.
Das klinische Bild der Erkrankung im Schwein ähnelt stark der Grippe beim Menschen. In
A/swine/Potsdam/15/81-infizierten Schweinen verhinderte die Gabe von Oseltamivir (78 mg/kg,
2 x täglich, an 5 aufeinander folgenden Tagen) komplett die in den Placebo-behandelten Tieren
beobachtete Klinik und das damit einhergehende Fieber am Tag 1-2 p.i. Die Virusausscheidung
war ebenfalls signifikant reduziert. Zudem kam es zu einer signifikanten Reduktion der
Lungenentzündung.
Insgesamt lässt sich feststellen, dass Oseltamivir sehr gut in vitro sowie in vivo gegen das Isolat
A/swine/Potsdam/15/81 wirkt und die etablierten Modelle sich für Untersuchungen neuer
potenzieller Virustatika eignen.
Kontakt:
Topf, Dominik, Institut für Virologie und Antivirale Therapie, Universitätsklinikum Jena,
[email protected]
40
Antivirale Therapie
Interferons as emergency antiviral agents against highly
pathogenic influenza A viruses: efficacy evaluation in animal
transmission models
Daniela Kugel1, Veronika von Messling2, John Steel3, Anice Lowen3, Otto Haller1 & Peter Staeheli1
Dept. Virology, University of Freiburg, Freiburg, Germany
INRS-Institut Armand-Frappier, University of Quebec, Montreal, Canada
3
Dept. Microbiology, Mount Sinai School of Medicine, New York, New York, USA
1
2
About 20 years ago, the prophylactic use of interferon (IFN)-α for respiratory viral infections was
evaluated in several clinical trials. The studies showed that rhinovirus and influenza virus
infections were significantly milder in treated individuals. However, since prolonged intranasal
administration of IFN-α caused a clinical picture which is not distinguishable from common cold,
this treatment was never licensed for clinical use. We argued that these relatively mild side
effects might be acceptable if IFN-α was used as emergency drug in the case of an influenza
pandemic. We found that intranasal treatment of ferrets with IFN-α before infection with a
seasonal H1N1 strain reduced viral titers in nasal washes at least 100-fold compared to mocktreated controls. IFN-treated animals developed only mild and transient respiratory symptoms,
and the characteristic fever peak seen in mock-treated ferrets two days after infection was not
observed. However, IFN-α did not enhance survival after infection with a contemporary H5N1
virus, although viral titers in nasal washes were significantly reduced at days one and three post
infection. The guinea pig model was used to determine whether IFN might reduce transmission
of the new pandemic H1N1 virus. We found that virus transmission was fully blocked through
daily intranasal administration of IFN-α to either inoculated or exposed animals. Thus, intranasal
application of IFN-α seems to protect well against viruses which replicate mainly in the upper
respiratory tract, but not so well against highly pathogenic influenza viruses which disseminate
to the lung.
41
Antivirale Therapie
The NF-κB-inhibitor SC75741 efficiently blocks influenza
virus propagation in vitro and in vivo without the tendency to
induce resistant virus variants
1;
1
2
2
Planz, O. , Droebner, K. ; Ehrhardt, C. ; Ludwig, S.
1
Friedrich-Loeffler Institut; Institute of Immunology, Paul-Ehrlich Str. 28 D-72076 Tübingen, Germany;
Institute of Molecular Virology; Münster, Germany
2
Influenza is still one of the major plagues worldwide. The appearance of highly pathogenic avian
H5N1 viruses in humans and the emergence of resistant H5N1 variants against neuraminidase
inhibitors highlight the need for new and amply available antiviral drugs. We and others have
demonstrated that influenza virus misuses the cellular IKK/NF-κB signaling pathway for efficient
replication suggesting that this module may be a suitable target for antiviral intervention. Here
we show that the novel NF-κB inhibitor SC75741 efficiently blocks replication of influenza A and
B viruses, including avian and human A/H5N1 isolates, in vitro and in a mouse infection model in
concentration that do not affect cell viability or metabolism. The underlying molecular
mechanism of SC75741 action involves impaired expression of proapoptotic factors, subsequent
inhibition of caspase activation as well as block of caspase-mediated nuclear export of viral
ribonucleoproteins. Besides this direct antiviral effect the drug also suppresses virus-induced
overproduction of cytokines and
chemokines, suggesting that it might prevent the so-called cytokine burst that is discussed as an
important pathogenicity determinant of infections with highly pathogenic influenza viruses, such
as the A/H5N1 strains. Most importantly the drug did not show any tendency to induce resistant
virus variants. Thus, a SC75741-based drug may serve as a broadly active non-toxic antiinfluenza agent.
Kontakt:
Prof. Dr. Planz, Oliver; Friedrich-Loeffler-Institut, Tübingen, [email protected]
42
Poster: Epidemiologie
43
Poster E 1
Aviäre Influenza: ein neuer Wildvogel-Monitoringansatz
1
1
2
2
1
Schoene, C.U.R. ;Staubach, C. ; Harder, T.C. ; Globig, A. ; Conraths, F.J.
1
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, Wusterhausen; Friedrich-Loeffler-Institut, Hauptsitz
Insel Riems; Greifswald – Insel Riems
Die Feststellung der Prävalenz niedrig-pathogener aviärer Influenza (LPAI) der Subtypen H5 /
H7 in der Wildvogelpopulation ist ein wichtiger Bestandteil der risikobasierten Überwachung
hochpathogener aviärer Influenza (HPAI) Viren. In unserer Studie haben wir Informationen über
(1) Vorkommen und Häufigkeit von Wildvogelspezies in den 34 RAMSAR-Gebieten
Deutschlands verglichen mit (2) Ergebnissen von Abfragen der Wildvogel-Datenbank (AI-DB)
sowie dem TierSeuchenNachrichtensystem (TSN) für den Zeitraum vom 1. Januar 2006 bis zum
7. Mai 2009. Von den insgesamt 86.894 untersuchten Proben waren 1.121 (1,29%) Influenza A
Virus (AIV) positiv mit 620 (0,71%) Nachweisen der Subtypen H5 / H7. Von den 6.403 (7,37%)
von jagdbarem Federwild stammenden Proben, waren 225 (0,26%) AIV-positiv, von denen
wiederum 45 (0,05%) den Subtypen H5 / H7 angehörten. Diese Proben wiesen somit eine
höhere Prozentzahl AIV positiver Nachweise (3,51%) auf als die Gesamtzahl aller Proben,
während der Anteil an H5 / H7 Subtypen mit 0,70% in etwa gleich hoch war. Ausgehend von
diesen Ergebnissen stellen wir eine Methode zur Auswahl von Wildvogelspezies im Rahmen
eines risikobasierten AIV Monitoring vor. Diese sogenannten Indikatorspezies haben dabei eine
größere Wahrscheinlichkeit, einen höheren Anteil AIV-positiver Nachweise zu erzielen. Am
Beispiel Deutschlands haben wir mit dieser Methode Stockente (Anas plathyrhynchos),
Reiherente (Aythya fuligula), Bläßgans (Anser albifrons), Kanadagans (Branta canadensis),
Singschwan (Cygnus cygnus), Schellente (Bucephala clangula), Haubentaucher (Podiceps
cristatus), Schwarzhalstaucher (Podiceps nigiricollis) und Höckerschwan (Cygnus olor), sowie
Mäusebussard (Buteo buteo) als Indikatorspezies identifiziert. Unser zielgerichteter
Monitoringansatz eignet sich universell zur Auswahl von Wildvogel-Indikatorspezies an
Gewässern und in stark gefährdeten Arealen weltweit bei gleichzeitiger Reduzierung der
benötigten Probenzahl und ohne die Aussagekraft der Untersuchungen zu verringern.
Kontakt:
Schoene, Claudia; Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, [email protected]
44
Poster E 2
H5N1-Wildvogel-Monitoring: Möglichkeiten und Grenzen des
Nachweis eines in Raum und Zeit hochmobilen Pathogens
1
1
1
2
2
1
Wilking, H. ; Ziller, M. ; Staubach, C. ; Globig, A. ; Harder, T.C. ; Conraths, F.J.
1
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, Wusterhausen; Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für
Virusdiagnostik, Insel Riems
Das flächenhafte Monitoring von Wildvögeln auf Infektionen mit Influenzaviren stellt hohe
Anforderungen an Ornithologen und Veterinär-Epidemiologen. In einer internetbasierten
Datenbank wurden Monitoring-Daten zum Influenzastatus zusammen mit der Georeferenzierung
und der taxonomischen Klassifizierung der beprobten Wildvögel gespeichert. Dieser Datensatz
beschreibt die Situation von Influenza-Infektionen bei Wildvögeln in Deutschland und sollte die
frühzeitige Erkennung und eine Abschätzung des Ausmaßes neuer Einträge ermöglichen. Die
Analyse von Ausbrüchen bei Wildvögeln in Deutschland zeigte, dass das Virus bei Wildvögeln in
Raum und Zeit in hohem Maße mobil war. Eine Vielzahl von Ordnungen und Arten von
Wildvögeln war von HPAIV H5N1-Infektionen betroffen. Eine jahreszeitliche Tendenz von
Infektionen war nicht zu erkennen.
Wir prüften die Frage, ob das Flächenmonitoring von Wildvögeln geeignet ist, endemische
HPAIV H5N1-Infektionen über einen langen Zeitraum für ausgewählte Regionen zu detektieren
bzw. die Anwesenheit des Erregers mit einer gewissen Sicherheit auszuschließen. Hierzu wurde
ein statistisches Auswertungsmodell entwickelt, mit dem die Prävalenz von HPAIV H5N1
geschätzt, die obere Grenze des 95%-Konfidenzintervall ermittelt und der Abstand der
Punktschätzer zur oberen Grenze des Konfidenzintervalls als Maß für die Präzision der
Schätzung genutzt wurde. Dieses Vorgehen gestattete auch die Beurteilung der Zuverlässigkeit,
die das Monitoring für einen bestimmten geographischen Ort für Aussagen zur Abwesenheit von
HPAIV H5N1 bot. Die Intervallschätzung erlaubte somit die Angabe derjenigen Virusprävalenz,
die mit dem Monitoring nicht detektiert werden konnte, obwohl sie eventuell in der
Wildvogelpopulation vorhanden war. Elemente der Auswertung sind gleitende Mittelwerte für
Zeiteffekte, eine Wichtung nach räumlicher Entfernung und eine Wichtung nach Zielspezies. Die
Ergebnisse dieser Analyse für mehrere Orte zeigten, dass das Wildvogel-Monitoring es nicht zu
jedem Zeitpunkt leistete, eine geringe Prävalenz bei Wildvögeln über einen längeren Zeitraum
zu detektieren. Das entwickelte Auswertungs-Schema erwies sich dabei als nützlich für die
Erkennung von Zeitintervallen, geographischen Einheiten und Wildvogel-Spezies, bei denen das
Monitoring zuverlässige Ergebnisse für die Erkennung von HPAIV H5N1-Infektionen nicht liefern
konnte, weil das Probenaufkommen zu niedrig war. Eine zielgerichtete räumliche und zeitliche
Beprobung in Verbindung mit einem verbesserten Kenntnisstand zur Empfänglichkeit und zu
den Vektoreigenschaften einzelner Vogelarten kann in Zukunft eventuell zu einem
aussagekräftigerem Monitoring mit deutlich verbesserter Präzision innerhalb von
Risikopopulationen führen.
Kontakt:
Conraths, Franz J.; Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, Seestraße 55, D - 16868
Wusterhausen, [email protected]
45
Poster E 3
Zu Teilprojekt I.4: Die Kampagne „Wir gegen Viren“ im
Überblick
Meilicke, G.; Bartels C.; Riedmann, K.; Biederbick, W.
Das Teilprojekt I.4 des Forschungssofortprogramms Influenza entwickelte eine
Informationsstrategie für den Fall einer Influenza-Pandemie. Fragestellung dabei war, wie die
Bevölkerung möglichst schnell und wirkungsvoll persönliche Infektionsschutz-Kompetenz
aufbauen kann. Insbesondere sollte dem Einzelnen eine Risikoeinschätzung und das Wissen
um angemessenes Schutzverhalten für die Bewältigung einer Pandemie vermittelt werden.
Im Rahmen des Projektes wurde in einer qualitativen Studie zunächst das aktuelle Erleben von
Grippe und Pandemie in der Bevölkerung untersucht. Es erfolgte eine Bestandsaufnahme und
Analyse von Informationsmaterialien nationaler und internationaler Institutionen im Bereich der
pandemischen Influenza. In Abstimmung mit Experten wurden öffentlich relevantes
Influenzawissen und Verhaltensempfehlungen zusammengetragen und schließlich als einfache
neun Regeln zur Hygiene im Alltag formuliert.
Auf Basis der neun Regeln wurden im Rahmen des Projekts anschließend Medien und ein
kommunikatives Dach für die Infektionsschutzaufklärung gegenüber der Bevölkerung entwickelt:
a) Die Broschüre „Selbstverteidigung gegen Viren“ gibt einen umfassenden Einblick in die neun
Regeln. Es wird erklärt, was jeder einzelne tun kann, um sich und andere vor Erkältung, Grippe
und Magen-Darm-Infekt zu schützen.
b) Das Web-Portal www.wir-gegen-viren.de bereitet die Informationen der Broschüre
webgerecht auf und gibt zusätzliche Hintergrundinformationen. Weitere Medien der Aktion
stehen hier zum Download bereit.
c) Der TV-Spot „Händewaschen schützt“ behandelt das Schwerpunktthema Händehygiene im
Alltag.
d) Eine Aufkleberaktion für öffentliche Toiletten, ebenfalls zum Schwerpunktthema
Händehygiene, soll direkt am Ort des Geschehens ans Händewaschen erinnern.
e) Das Motto „Wir gegen Viren“: Die Wort-Bild-Marke wird auf allen Medien eingesetzt. Sie ist
das zentrale Motto und Wiedererkennungssymbol der erarbeiteten
Kommunikationsmaßnahmen.
Die Medien wurden am 30. März 2009 veröffentlicht. Bestellbar sind sie bei der Bundeszentrale
für gesundheitliche Aufklärung. Seit Aufkommen der H1N1-Pandemie werden die Medien der
Kampagne „Wir gegen Viren“ in höheren Auflagen nachproduziert und verstärkt eingesetzt. Die
in der Kampagne dargestellten Verhaltensregeln werden von zahlreichen Multiplikatoren in
Unternehmen, Behörden und Medien aufgegriffen und weiterverbreitet. Eine Darstellung der
vorliegenden Medien ist veröffentlicht unter www.wir-gegen-viren.de
Kontakt: Gerald Meilicke; Robert Koch-Institut, [email protected]
46
Poster E 4
Räumliche Modellierung erhöhter Aktivität von akuten
respiratorischen Erkrankungen als Indikator für die
Influenzaausbreitung
(Projektteil I.3)
1
1
1
1
Dettmann, M. ; an der Heiden, M. ; Claus, H. ; Krause, G.
1
Robert Koch-Institut, Abteilung für Infektionsepidemiologie, Berlin
Die saisonale Influenza folgt einem räumlichen und zeitlichen Ausbreitungsmuster, das sich im
erhöhten Auftreten akuter respiratorischer Erkrankungen (ARE) widerspiegelt. Während die
Früherkennung einer Epidemie vor allem durch die virologische Surveillance erfolgt, kann die
räumliche und zeitliche Ausbreitung auf Bevölkerungsebene auf Grundlage der Daten der
syndromischen Surveillance quantifiziert werden.
Die Influenzasurveillance der Arbeitsgemeinschaft Influenza (AGI) basiert auf den wöchentlichen
Daten von Sentinelärzten, die das Auftreten von akuten respiratorischen Erkrankungen (ARE)
melden. Die Stärke der Influenza-Aktivität wird einerseits anhand des korrigierten Praxisindex
dargestellt, durch den die Aktivitätsmuster verschiedener Arztpraxen vergleichbar werden.
Ausgehend von den Sentinelpraxen werden die Daten des korrigierten Praxisindex für eine
Flächendarstellung auf einem regelmäßigem Gitter über Deutschland interpoliert. Diese
Schätzung erfolgt mittels des Kriging-Verfahrens, einem geostatistischen
Interpolationsverfahren. Dabei wird eine räumliche Abhängigkeit der Daten vorausgesetzt. Die
unbekannten Werte werden durch ein gewichtetes Mittel der bekannten Nachbarwerte
geschätzt. Die automatisierte Erstellung dieser Karten erfolgt unter Anwendung des
Statistikprogramms R.
Anhand der wöchentlichen Kartendarstellungen, die auf der Webseite der AGI publiziert werden,
ist es möglich räumliche und zeitliche Trends im Ausbreitungsgeschehen zu beobachten. Mit
Beginn der Influenzasaison 2009/2010 zeigt sich die Aktivität der pandemischen Influenza als
zusätzliche Krankheitslast auf Bevölkerungsebene anhand der Daten der AGI (hohe Werte des
korrigierten Praxisindex in Bayern korrelieren mit den Meldedaten zur Neuen Influenza).
Eine Verletzung der vorausgesetzten räumlichen Abhängigkeit kann durch extreme Werte im
Datensatz verursacht werden, insbesondere aber auch durch moderate Unterschiede des
korrigierten Praxisindex von nah beieinander liegende Arztpraxen.
Weitere Limitationen ergeben sich durch die ungleichmäßige geographische Verteilung der
Praxen und die Heterogenität (z.B. Praxisspezialisierung, Größe und Einzugsgebiet der Praxen).
Gebiete in Grenz- oder Insellage können naturgemäß schlechter dargestellt werden.
Dettmann, Marleen; Robert Koch-Institut, [email protected]
47
Poster E 5
Das Lagezentrum im RKI als Nationales
Koordinationszentrum
(Projektteil I.1c)
1
Gilsdorf, Andreas , Krause, Gérard.
1
1
Robert Koch-Institut, Abteilung für Infektionsepidemiologie, Berlin;
Das Lagezentrum im RKI ist das nationale Koordinierungszentrum für
infektionsepidemiologische Ereignisse, die nationale Koordinierung und Situationseinschätzung
erfordern. Hier werden alle Informationen aus den Bundesländern und aus anderen Quellen
verarbeitet, Aufgaben koordiniert und bearbeitet und Situationseinschätzungen durchgeführt und
kommuniziert.
Dafür ist geschultes, fachkompetentes Personal erforderlich, welches eine Kontinuität in der
Aufgabenbearbeitung gewährleisten kann. Neben einer Schichtleitung, die als Krisenmanager
fungiert, sind weitere Funktionen zu besetzen: Kommunikation, Protokoll, Aufgabenverteilungund Monitoring, epidemiologische Situationsüberwachung, Fallrückverfolgung, Technische
Unterstützung und fachliche Unterstützung. Für die Erfüllung dieser Aufgaben werden pro
Schicht zwischen 6 und 8 Personen erfordert. Während Krisenzeiten ist eine Funktion des
Lagezentrums von morgens bis abends und am Wochenende sicher zu stellen.
Das Lagezentrum ist in einem speziellen Raum untergebracht, der die nötige technische
Ausstattung hat. Zusätzlich ist ein Video/Audiokonferenzraum nötig sowie ein Briefingraum.
Regelmäßig auftretende Arbeiten sind in Standard Operation Procedures aufgelistet, um einen
hohen Qualitätsstandard und Kontinuität zu gewährleisten.
Die Analyse der ersten 2 Monate Lagezentrum Arbeit in Erwiderung der Pandemie haben
gezeigt, dass 94 Personen eingesetzt waren, die insgesamt 642 Personenschichten gearbeitet
haben (=4500 Arbeitsstunden, 560 Arbeitstage). Ca. 100 Situationseinschätzungen sind
versandt worden. In den zwei Monaten wurden ca. 800 Aufgaben organisiert. Dies war nur
möglich, weil die Mitarbeiter aus verschiedensten Fachgebieten das Lagezentrum unterstützt
haben, auch unter Einschränkung ihrer normalen Dienstaufgaben und Projekte.
Herausforderungen für die Zukunft sind unter anderem: Aufrechterhaltung der Qualität und
Kontinuität auch über längere Zeiträume, Weiterführung anderer relevanten Projekte,
Dokumenten- und E-Mail-Sicherung, Entwicklung von neuen IT-Programmen während der Krise,
Mobilisierung von Ressourcen für Ad-hoc-Aufgaben.
Insgesamt hat das Lagezentrum gut funktioniert, allerdings unter teilweise improvisierten
Umständen. Hier sollten mehr professionelle Lösungen gefunden werden. Auch sollte zur
Kontinuitätswahrung ausschließlich fürs Lagezentrum eingesetzte Mitarbeiter eingeplant
werden, um langfristig eine gute Krisenbewältigung sicherzustellen.
Kontakt:
Gilsdorf, Andreas; RKI, [email protected]
48
Poster: Diagnostik
Poster: Diagnostik
49
Poster: Diagnostik
Poster D1
Schnelle Diagnose und Stammdifferenzierung von Isolaten
des aviären Influenzavirus (AIV) durch ‚restriction fragment
mass fingerprint’ (RFMF) Analyse
1
1
1
Michael, K. ; Mettenleiter T.C. ; Karger, A.
1
Institut für Molekularbiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, 1793 Greifswald-Insel Riems
Aufgrund ihres hohen Informationsgehaltes und ihrer Schnelligkeit (Hochdurchsatzfähigkeit) hat
die Bedeutung der Massenspektrometrie (MS) in der Bioanalytik in den letzten Jahren stetig
zugenommen. In einem pandemischen Szenario mit hohen Probenzahlen und hohem Zeitdruck
könnten auf MS basierende Diagnoseverfahren aufgrund dieser Eigenschaften eine wertvolle
Ergänzung zu den etablierten diagnostischen Verfahren werden.
Die hier entwickelte massenspektrometrische Methode zum Nachweis des AIV geht von viraler
RNA aus. In einer RT-PCR wird zunächst ein circa 170 Nukleotide langer Abschnitt des
Hämagglutinin (HA) Gens amplifiziert, der auch die den Pathotyp bestimmende proteolytische
Spaltstelle des HA umfasst. Nach einem Restriktionsverdau werden die erhaltenen Fragmente
in einem MALDI-TOF Massenspektrometer analysiert. Die Diagnose und Stammdifferenzierung
erfolgt aus dem Vergleich der experimentellen Fragmentmassen mit den aus Sequenzdaten
berechneten analog der Identifizierung von Proteinen aus ihrem proteolytischen Peptidmuster
(‚peptide mass fingerprint’, PMF) durch ‚restriction fragment mass fingerprint’. Das Verfahren
wurde an 27 AIV-Isolaten verschiedener Subtypen angewandt. Im Durchschnitt konnten 90 %
der Sequenz aus der unmittelbaren Umgebung der Spaltstelle aus den Fragmentmassen
rekonstruiert werden und die eindeutige Zuordnung der Spektren zu den Subtypen war in allen
Fällen möglich. Auch die eindeutige Differenzierung von 5 verschiedenen Isolaten des Subtyps
H5N1 gelang aufgrund ihrer charakteristischen Restriktionsmassenmuster. Die in-silico Analyse
aller zugänglichen HA-spezifischen Sequenzen erlaubte die Identifizierung H5-spezifischer und
H5N1-spezifischer Fragmentmassen sowie einer Massensignatur mit 3 Massen, die Isolate des
Subtyps H5N1 mit 98% Zuverlässigkeit anzeigt. Alle 3 Massen konnten auch experimentell
nachgewiesen werden. Solche Signaturen sind zur schnellen Diagnose von AIV des Subtyps
H5N1 im hohen Durchsatz hervorragend geeignet.
Kontakt:
Karger, Axel; Friedrich-Loeffler-Institut, [email protected]
50
Poster: Diagnostik
Poster D2
Einsatz der Pyrosequenzierungs-Technik zur schnellen
Charakterisierung von neuen Influenzaviren A/H1N1v und zur
Identifizierung der Pathogenitätsfaktoren PB1-F2-Ser 66 und
PB2-Lys 627/-Asn 701
Wedde, M.; Biere, B.;Wählisch, S.;Hafemann, S.; Schweiger, B.
Robert Koch-Institut, Berlin
Im Rahmen der Überwachung und Charakterisierung von neuen Influenzaviren A/H1N1v
ergaben Genomanalysen des HA-Segments charakteristische Unterschiede zu
A/California/04/09. Seit dem Ausbruch der Neuen Grippe zirkulierten California/07/09-ähnliche
Varianten, die durch die Substitution T197A charakterisiert sind. Darüber hinaus ko-zirkuliert
eine weitere Variante, die durch die Substitution S203T gekennzeichnet ist und in der
vorliegenden Studie als A/Berlin/75/09-Variante definiert wurde. Basierend auf beiden
Substitutionen wurde ein PCR-gestützter Pyrosequenzierungs (PSQ)-Assay entwickelt. Erste
Analysen von A/H1N1v positiven Patientenproben (n=11) zeigten, dass bei diesen Patienten nur
A/Berlin/75/09-ähnliche detektiert wurden.
Die PSQ-Technik wurde darüber hinaus eingesetzt, um Aminosäuren zu identifizieren, die für
die Pathogenität von Influenzaviren relevant sind. Untersucht wurden das auf dem PB1Segment kodierte Apoptose-induzierende PB1-F2 Protein und die Substitution N66S, die im
Zusammenhang mit der Erhöhung pathogener Eigenschaften von Influenzaviren nachgewiesen
wurde. PB1-F2 (90 aa) liegt bei den neuen A/H1N1v Viren in trunkierter Form vor (11 aa) und
Asparagin (N) in Position 66. Für die Identifizierung der beiden vor der Position 66 liegenden
Stopcodons als auch für die Identifizierung von N66S wurden spezifische PSQ-Assays
entwickelt. Die Analyse von 9 A/H1N1v-Isolaten ergab keine Veränderungen im Genprofil.
Die auf dem PB2-Segment kodierten Pathogenitätsfaktoren Lys-627 und Asn-701 wurden
ebenfalls in die Untersuchungen einbezogen. Diese Positionen sind bei A/H1N1v durch Glu-627
und Asp-701 besetzt. Die Substitutionen E627K und D701N sind mit einer erhöhten
Pathogenität assoziiert, da zum einen die Virusreplikation bei niedrigeren Temperaturen (41°C
→ 33°C) erhöht ist und eine Anpassung an die Temperatur der Nase des Menschen darstellt
(E627K) und zum anderen die Bindung an den zellulären nuklearen Import-Faktor Importin α
erhöht sein soll (D701N). Die PSQ-Analyse (n=11) beider Faktoren ergab bisher keine
Veränderungen zum Wildtyp.
Der Einsatz der PSQ hat sich als geeignete Technik erwiesen, um schnell und sicher sowohl
Mutationen zu untersuchen, die zu einer Erhöhung der pathogenen Eigenschaften von A/H1N1v
führen können, als auch neue Influenzavarianten zu detektieren. Die schnelle Identifizierung von
neuen Virusvarianten ist wiederum Voraussetzung für eine optimale Impfstoffentwicklung.
Kontakt:
Wedde, Marianne; Robert Koch-Institut, [email protected]
51
Poster: Diagnostik
Poster D3
Projekt Nr.: FSI2 1.4.2: Herstellung monoklonaler Antikörper
zur serologischen Diagnostik
1
1
Hähnel, J. ; Dauber, M.
Es wurden Methoden zur In-Vitro-Vermehrung von aviären Influenzaviren sowie deren
Reinigung und Anreicherung etabliert und optimiert. Entsprechend präparierte Viren stellten eine
notwendige Voraussetzung dar für die Generierung virusspezifischer monoklonaler Antikörper
(MAK). Ferner wurde ein Verfahren zur Separierung der Neuraminidase (NA) etabliert, um eine
stärkere Immunantwort gegen dieses gewöhnlich gering immunogene Protein zu initiieren.
Insgesamt kamen zum Einsatz Viren mit 12 verschiedenen Hämagglutinin- (HA-) und 4 NASubtypen.
BalbC-Mäuse wurden mehrfach in mehrwöchigem Abstand mit Präparationen von nativem Virus
immunisiert. Zur Entwicklung von Antikörpern gegen einen bestimmten HA-Subtyp erfolgte die
Immunisierung, soweit möglich, mit verschiedenen Virusisolaten desselben Subtyps. Für die
Gewinnung von NA-spezifischen Antikörpern wurden zur Immunisierung Vollvirus und NAPräparationen verwendet. Fusionen von Myelomzellen (SP 2/0) und stimulierten Milzzellen
erfolgten 5-7 Monate nach Immunisierungsbeginn.
Insgesamt wurden 62 Fusionen durchgeführt, verteilt auf 21 Versuchstiergruppen. Daraus
resultierten mehr als 10800 ausgewachsene Zellklone, von denen wiederum 308 Antikörper
produzierten, die in der Immunfluoreszenz mit homologen Virussubtypen reagierten. Nach
Überprüfung dieser Reagenten hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität mit anderen Subtypen
verblieben bisher 69 HA- und NA-subtypenspezifische MAKs. Die generierten MAKs verteilen
sich bezüglich ihrer Spezifität nach bisherigen Erkenntnissen wie folgt: 3x HA1, 1x HA3, 3x HA4,
4x HA5, 1x HA6, 11x HA7, 3x HA8, 10x HA9, 4x HA11, 1x HA13, 9x NA1, 3x NA2, 1x NA7, 4x
H7N7, 2x HA6 und HA13; 9 MAKs reagieren isolatspezifisch. Darüber hinaus wurde ein MAK
gefunden, welcher alle bisher getesteten HA-Subtypen in der Immunfluoreszenz und im
Westernblot markiert.
Zur weiteren Charakterisierung wurde ein Teil der MAKs im Westernblot analysiert. Die noch
nicht abgeschlossenen Untersuchungen zeigen, dass die HA-spezifischen MAKs vorrangig mit
dem HA1 reagieren.
Neben HA- und NA-spezifischen MAKs wurden unter Verwendung von bakteriell exprimiertem
Nichtstrukturprotein 1 (NS1; K. Kühn) zwei MAKs etabliert.
Kontakt:
Hähnel, Juliane; Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik
E-Mail-Adresse [email protected]
52
Poster: Diagnostik
Poster D4
Monoklonale Antikörper gegen Influenzavirus H5N1 und ihr
Potential für die Verbesserung der H5N1-Schnelldiagnostik
1
1
2
2
2
1
Neubauer, K. ; Linke, S. ; Dorner, B. ; Dorner, M. ; Pauli, G. ; Schweiger, B.
1
2
Robert Koch-Institut, Nationales Referenzzentrum für Influenza, Berlin; Robert Koch-Institut, Zentrum für
Biologische Sicherheit, Berlin
Das Auftreten des hochpathogenen aviären Influenzavirus (HPAIV) des Subtyps H5N1 führte zu
großen Ausbrüchen bei Geflügel und auch immer wieder zu Übertragungen auf den Menschen
mit einem hohen Prozentsatz an fatalen Ausgängen. Für das Management von HPAIInfektionen sind eine effektive Diagnostik und Kontrollmaßnahmen unumgänglich. Der Einsatz
bislang kommerziell erhältlicher Schnellteste zum Nachweis von AIVH5-Antigen im Menschen
ist als kritisch einzuschätzen, da diese Teste entweder eine geringere Sensitivität als
herkömmliche Influenza A-Testkits haben, nicht H5-spezifisch sind oder jeglicher
Validierungsangaben entbehren. Ziel unseres Projektes war daher die Generierung
monoklonaler Antikörper (mAks) und die Evaluierung ihres Potentials für ein sensitiveres und
spezifisches schnelles Antigennachweissystem für H5-Viren.
Die Immunisierung von Mäusen mit inaktiviertem HPAIVH5N1 A/Whooper swan/Germany/R652/06 resultierte in 11 vielversprechenden mAks, die weitergehend charakterisiert wurden. Die
Untersuchung dieser Antikörper im indirektem ELISA gegen frühere und aktuell zirkulierende
AIVH5-Isolate, Influenzaviren aller anderen HA-Subtypen sowie weitere relevante Viren und
Bakterien, die respiratorische Symptome verursachen können, erbrachte 7 mAks, die
ausschließlich AIVH5 detektierten. Westernblot-Analysen zeigten, dass 10 mAks Epitope des
HA-Proteins erkennen, nur ein mAk reagierte mit dem M1-Protein. Während die Zielepitope des
HA-Proteins konformell zu sein scheinen, bindet mAk 10/1/D6 vermutlich ein lineares Epitop auf
dem M1-Protein. Ein mAk zeigte Reaktiviät mit HPAI H5 im Immunfluoreszenztest und zwei
Antikörper hatten virusneutralisierende Eigenschaften. Sandwich-ELISA-Studien demonstrierten
die H5-Spezifität von 8/11 mAks und ihr Vermögen, niedrige Antigenkonzentrationen
nachzuweisen. In einer Pilotstudie unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen
Testplattform und zwei aus unserem generierten Panel ausgewählten mAks indizierten eine
Nachweisgrenze von 0.01-0.1 HA-Einheiten, was einer etwa 10-100-fach höheren Sensitivität im
Vergleich zu bislang verfügbaren AIVH5-Testkits entspricht.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die generierten murinen mAks für die Entwicklung
verschiedener Tests zum Nachweis von AIVH5-Infektionen geeignet sind. Sie haben zudem das
Potential, die existierenden Schnellteste zum Antigennachweis sowohl hinsichtlich ihrer
Sensitivität als auch ihrer Spezifität zu verbessern.
Kontakt:
Neubauer, Katrin; Robert Koch-Institut Berlin, [email protected]
53
Poster: Diagnostik
Poster D5
Entwicklung und Prüfung von DIVA-Diagnostik
Kühn, K.; Beer, M.
Eine wichtige Basis für die Tierseuchenüberwachung und -bekämpfung bildet das DIVA
(differentiating infected from vaccinated animals)-Konzept, es beinhaltet neben dem markierten
Impfstoff ein Detektionssystem, das zwischen geimpften und -feldvirusinfizierten Tieren zu
differenzieren vermag (DIVA- oder Marker-Tests). Die EU verfolgte bislang eine Nicht-ImpfPolitik, da die herkömmlichen Vakzinen mit den verfügbaren Testsystemen interferieren.
Unter Berücksichtigung möglicher DIVA-Impfkonzepte wurde an der Etablierung und Validierung
diagnostischer Testsysteme gearbeitet. Durch die rekombinante Expression ausgewählter
Proteine (Neuraminidase 1 und 2 (N1, N2), Nucleokapsidprotein (NP) und Nichtstrukturprotein 1
(NS1) wurde zunächst die antigene Grundlage für den Aufbau entsprechender
Detektionssysteme gelegt.
Die Charakterisierung der Proteine erfolgte zu einem geringen Anteil mit kommerziellen Seren,
da insbesondere zu Beginn der Arbeiten nur wenige Antikörper verfügbar waren. Zusätzlich
wurden Tierversuchsseren auf ihre Eignung für den Nachweis der rekombinanten Proteine
untersucht. Des Weiteren konnten eigene petidgenerierte polyklonale Antikörper gegen NS1 in
Kaninchen generiert werden. Ebenso konnte das bakteriell exprimierte NS1 mit Erfolg zur
Produktion polyklonaler Antikörper genutzt werden. Kürzlich konnten zudem in Zusammenarbeit
mit dem Projekt FSI 2-1.4.2 zwei monoklonale NS1-Antikörper etabliert werden.
Die heterologen rekombinanten Proteine wurden in verschiedenen Testsystemen (Indirekter
Immunfluoreszenzassay (iIFA), ELISA) eingesetzt und wichtige Parameter wie Sensitivität,
Spezifität, Reproduzierbarkeit, Inter- und Intravariationskoeffizient analysiert. Die für die
Validierung erforderlichen Seren wurden einem eigens für die Testung zusammengestellten
umfangreichen Serenpanel von mehr als 750 verschiedenen Seren, die spezifisch gegen
verschiedene Hämagglutinin- bzw. Neuraminidasesubtypen gerichtet sind, entnommen.
Darunter sind sowohl Tierversuchsseren, Seren aus einem Ausbruchsgeschehen als auch
Seren mit Antikörpern gegen differentialdiagnostisch bedeutsame Erreger und Seren von SpfTieren.
Die Bewertung der Ergebnisse erfolgte dabei in engem Bezug zu den am Markt verfügbaren
potentiellen DIVA-Diagnostika. Dazu wurden unterschiedliche kommerzielle ELISA-Systeme,
welche Antikörper gegen NS1, NP, N1, H5 und H7 detektieren, mit einem indirekten
Immunflueoreszenzassay (iIFA), basierend auf rekombinant exprimierter Neuraminidase 1,
vergleichend analysiert.
Kontakt:
Kühn, Katrin; Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems,
[email protected]
54
Poster: Diagnostik
Poster D6
Referenzmaterialien für die Validierung und
Qualitätssicherung der Diagnostik der aviären Influenza (FSI
1–1.3)
1
1
Häuslaigner, R. ,Wäckerlin, R. , Grund, C.
1
1
Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, Riems
Im Rahmen des FSI-Projektes 1.1.3 sollte der Bestand an Referenzmaterialien des O.I.E. und
Nationalen Referenzlabors für Aiviäre Influenza des FLI aufgestockt und diversifiziert werden,
um den Bedarf der Forschungs- und Diagnoseaktivitäten an einer breiten Palette von Aviären
Influenzavirus (AIV) spezifischen Reagenzien decken zu können.
Im Rahmen dieses Projektes wurden Referenzstämme sowie Referenzseren für alle 16 AIV
Hämagglutinin (H)-Subtypen sowie alle 9 AIV Neuraminidase (N)-Subtypen hergestellt. Für die
Mehrzahl der Subtypen, insbesondere für die Subtypen H5 und H7 stehen darüber hinaus nun
mehrere H- bzw. N-Kombinationen mit den entsprechenden Referenzseren zur Verfügung. Mit
Hilfe rekombinanter Newcastle Disease Viren wurden monospezifische Seren gegen einzelne
AIV-Proteine generiert, die sich insbesondere als Kontrollen für Testsysteme eignen bei denen
eine Interferenz zwischen H- und N-spezifischen Antikörpern ausgeschlossen werden soll. Die
etablierte Qualitätssicherung war darauf ausgerichtet, ein immunologisches als auch ein
genetisches Profil der hergestellten Antigene zu erstellen. Für einen ausgewählten H7spezifischen monoklonalen Antikörper wurde darüber hinaus eine Epitopcharakterisierung
durchgeführt. Die Materialien waren ebenfalls Grundlage für die Validierung von Testsystemen
für die Untersuchung von Wildvogelseren. Zur Verwaltung des Referenzmaterials wurde eine
Labordatenbank (LabCollector) etabliert, die eine breite Zugriffsmöglichkeit auf die Reagenzien
und eine entsprechend effiziente Verwaltung ermöglicht.
Die Präsentation wird einen Überblick über die Palette der hergestellten Reagenzien liefern.
Anhand von zwei Beispielen soll einerseits auf die Bedeutung einer breiten Palette von
Referenzmaterialen für die AIV-Diagnostik hingewiesen werden, andererseits aber verdeutlicht
werden, dass die Herstellung von Referenzmaterialien ein dynamischer Prozess ist, der einer
ständigen Anpassung und Pflege bedarf.
Kontakt:
Grund, Christian; Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut Institut,
[email protected]
55
Poster: Diagnostik
Poster D7
Ultraschnelle Ad-Hoc Pathotypisierung und
Charakterisierung von AIV Gesamtgenomen
Höper, D., Hoffmann, B., Beer, M.
Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, 17493 Greifswald – Insel Riems
Es wurde ein robustes und sensitives Protokoll für die Herstellung der zur Sequenzierung mit
dem Genome Sequencer FLX notwendigen doppelsträngigen DNA aus der genomischen RNA
der Influenzaviren etabliert. Dieses Protokoll basiert auf der spezifischen reversen Transkription
und anschließenden Amplifikation der Genomsegmente mittels RT-PCR.
Für die Bearbeitung der bei der Sequenzierung anfallenden Rohdaten sowie der damit
assoziierten Kenndaten wurde eine Datenbank in R programmiert. Mit dieser Datenbank sind
einerseits die Handhabung aller Daten und andererseits auch die Steuerung der
Datenauswertung möglich. Durch die Integration aller für die Bearbeitung der Daten wichtigen
Funktionen in die Datenbank ist eine effektive und fehlerfreie Auswertung zuverlässig möglich.
Für die gezielte Analyse der Sequenzen der Influenzaviren wurden spezifisch an die Analyse
der Influenzavirus-Genome angepasste Abläufe programmiert. Diese programmierten
Analyseabläufe beinhalten ein optimiertes Assembly, eine erste Analyse der Variabilität der
zugrunde liegenden Viruspopulation, die Bestimmung der open reading frames sowie der
codierten Proteine und nicht zuletzt die Suche der nächstverwandten Viren. Auch die Analyse
der möglichen bei der Interspeziestransmission auftretenden bzw. dafür notwendigen
Veränderungen der Virus-Quasispezies wurde vorbereitet und kann auf der Basis der erstellten
Arbeitsabläufe nun effektiv durchgeführt werden.
Kontakt:
Höper, D., Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für
Tiergesundheit, Greifswald – Insel Riems, [email protected]
56
Poster: Diagnostik
Poster D8
Bestimmung des Pathogenitäts-Index von Influenza-Viren im
Frettchen
1
1
1
1
1
1
Holznagel, E. ; Kruip, C. ; Yutzy, B. ; Horvath, R. ; Wagner, R. ; Plesker, R. ; Löwer, J.
1
Paul-Ehrlich-Institut , Langen.
Frettchen (Mustela putorius furo) stellen in der Influenza-Forschung das Tiermodell der Wahl
dar. Das Pathogenitätspotential von Influenza-Viren für den Menschen kann mit seiner Hilfe
näherungsweise bestimmt werden. Standardisierungsprobleme (subjektive klinische
Beurteilungskriterien, die Genauigkeit der eingesetzten Infektionsdosis ID50) und ein
beschränkter Zugang zu Influenza-seronegativen Tieren können seinen Nutzen einschränken,
Labor-übergreifende Datenvergleiche erschweren oder auch die Ursache für divergierende
Ergebnisse sein.
Am Paul-Ehrlich-Institut wurde eine Influenza-seronegative Frettchenzucht etabliert, um unter
relativ standardisierten Bedingungen tierexperimentell Pathogenitäts-Indizes für InfluenzaIsolate zu bestimmen.
Körpertemperaturveränderungen, Gewichtsveränderungen und standardisiert erhobene
klinische Symptome ergeben hierbei einen klinischen Pathogenitäts-Index (Ferret Clinical Index,
FCI); dieser basiert auf einem Punkte-System. Ein zweiter Pathogenitäts-Index beruht auf
histologisch bestimmten Organläsionsprofilen (Ferret Tissue Index, FTI). Beide Indizes addieren
sich zu einem Gesamt-Pathogenitäts-Index (Ferret Pathogenicity Index, FPI).
Es werden Bedingungen und Ergebnisse der Frettchenzucht demonstriert, wichtige
physiologische Parameter aufgelistet, Probleme bei der Erstellung der Indizes geschildert und
beispielhaft Pathogenitäts-Indizes von verschiedenen Feldisolaten und Reassortanten bestimmt
und erläutert.
Kontakt:
Dr. Holznagel, Edgar/Yutzy, Barbara, Paul-Ehrlich-Institut, [email protected] / [email protected]
57
Poster: Pathogenese
Poster: Pathogenese
58
Poster: Pathogenese
Poster P 1
Adaptation eines H9N2 Aviären Influenza Virus (AIV) an
Trachealringkulturen unterschiedlicher Vogelspezies
1
2
3
1
Petersen, H. ; Matrosovich, M.N. ; Pleschka, S. ; Rautenschlein, S.
1
2
Klinik für Geflügel, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover; Institut für Virologie, Philipps-Universität
3
Marburg; Institut für Medizinische Virologie, Justus-Liebig-Universität Gießen
Aviäre Influenza Viren (AIV) haben das Potential, Speziesbarrieren zu überwinden und durch
Adaptation an neue Wirt ihre Virulenz zu steigern. Über Transmission und Adaptation gering
pathogener AIV (LPAIV) zwischen verschiedenen Vogelspezies ist im Gegensatz zur
Transmission zwischen Vogel- und Säugerspezies wenig bekannt. Da durch Mutation aus
LPAIV hoch pathogene AIV (HPAIV) entstehen können, ist es zur Einschätzung des
Risikopotentials wichtig, diese Adaptationsmechanismen in verschiedenen Vogelspezies mit
unterschiedlicher AIV-Empfänglichkeit zu untersuchen. Puten sind für ihre hohe AIVEmpfänglichkeit und die Entwicklung schwerer klinischer Symptomatik bekannt.
Wassergebundene Vogelarten wie z.B. Enten hingegen gelten als natürliches Reservoir für AIV
und zeigen meist keine klinischen Symptome. Die Rolle der Taube bei der Verbreitung von AIV
konnte trotz erfolgter Infektionsstudien bisher nicht geklärt werden. Epidemiologische Studien
haben gezeigt, dass Tauben sporadisch LPAIV unterschiedlichen Subtyps tragen.
Ziel unserer Studie war es, die AIV- Empfänglichkeit, die potentielle Adaptation und die
Replikation von LPAIV in Trachealringkulturen (TOC) verschiedener Vogelspezies zu
untersuchen. Es wurden TOC von Pute, Pekingente und Brieftaube präpariert und mit einem
H9N2 Feldisolat (A/chicken/Saudi Arabia/CP7/1998) infiziert. In drei aufeinander folgenden
Passagen wurde die Virus- Replikationsrate und die Ziliaraktivität sowie auf adaptive Mutationen
in verschiedenen AIV Proteinen untersucht. Es wurde ein signifikanter Anstieg der AIVReplikationsrate in Verbindung mit einer früher einsetzenden Ziliostase in TOC von Pute und
Pekingente nach drei Passagen beobachtet. Interessanterweise hat das H9N2 Virus
Brieftauben-TOC infiziert, allerdings keine Ziliostase induziert. Die Virustiter stiegen aber auch
bei der Brieftaube mit zunehmender Passage an. Nach drei Passagen wurden bei den drei
Vogelspezies Mutationen im Hämagglutinin (HA), bei Pute und Pekingente im Bereich der
Rezeptorbindungsstelle und bei der Brieftaube im Bereich der Spaltstelle detektiert. Somit
konnte gezeigt werden, dass sich das LPAIV H9N2 erfolgreich an Zellen des oberen
Respirationstrakts verschiedener Vogelspezies adaptieren kann. Die AIV-Wachstumskurven
über die drei Passagen zeigten jedoch signifikante Unterschiede zwischen Pute, Pekingente und
Brieftaube. Mutationen im HA scheinen eine bedeutende Rolle bei der Adaptation zu spielen.
Die Mutationen im Bereich der Rezeptorbindungsstelle des HA nach Passagen in Puten-TOC
lasse eine veränderte Bindungsspezifität mit einer Verschiebung zu humanen Rezeptoren
vermuten, was auf eine bedeutsame epidemiologische Rolle der Pute bei AIV Ausbrüchen
hinweist.
Kontakt:
Rautenschlein, Silke; Klinik für Geflügel, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover,
[email protected]
59
Poster: Pathogenese
Poster P 2
Infektion of enddifferenzierter Atemwegsepithelzellen durch
porzine Influenzaviren
1
2
Darsaniya Punyadarsaniya , Isabel Hennig-Pauka , Christine W INTER
1
1
WESSELS , Georg H ERRLER
1+3
, Christel SCHWEGMANN-
1
Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Klinik für kleine Klauentiere, Tierärztliche Hochschule Hannover
3
Klinik für Geflügel, Tierärztliche Hochschule Hannover
2
Schweine spielen eine wichtige Rolle in der Epidemiologie von influenzaviren. Sie gelten als
„Mischgefäß“ für die Neusortierung von genetischem Material aus humanen, porzinen und
aviären Influenzaviren. Die derzeitige H1N1-Pandemie ist ein weiterer Beleg für die Bedeutung
von Schweinen als Wirtsorganismen für Influenzaviren. Primäre Zielzellen von Influenzaviren
sind die Epithelzellen des Respirationstrakts. Die Infektion dieser Zellen durch porzine
Influenzaviren ist nicht gut characterisiert. Um mehr Information über die Interaktion von
porzinen Influenzaviren mit den Zielzellen im Respirationstrakt zu erhalten, haben wir ein
Kultursystem für enddifferenzierte respiratorische Epithelzellen etabliert:
Lungenpräzisionsschnitte (precision-cut lung slices, PCLS). Bei PCLS liegen die differenzierten
Epithelialzellen (zilientragende Zellen, schleim-produzierende Zellen) so vor wie im
Respirationstrakt. Dies gilt sowohl für das Mengenverhältnis als auch für die räumliche
Verteilung. Sie sind in Kultur mehr als eine Woche lebensfähig, wie man der Zilienaktivität
entnehmen kann. Weitere Kriterien der Lebensfähigkeit sind die metacholin-induzierbare
Bronchokonstriktion und die Färbung mit Vitalfarbstoffen. Altenativ bemühen wir uns derzeit
noch, ein Air-liquid-interface-System mit Filterkulturen von primären Atemwegsepithelzellen zu
etablieren. Die Eignung von PCLS für Infektionsversuche mit porzinen Influenzaviren wurde
dadurch gezeigt, dass nach der Infektion mit einem H1N1-Virus mittels ImmunfluoreszenzMikroskopie infzizierte Zellen im Flimmerepithel nachgewiesen werden konnten. PCLS wurden
über ihre Reaktivität mit Pflanzenlektinen auch hinsichtlich der Expression von Sialinsäuren
untersucht. Färbung mit dem Agglutinin von Sambucus nigra zeigte, dass α2,6-gebundene
Sialinsäure am stärksten im Bereich des Flimmerepithels exprimiert waren. Dagegen war die
Färbung mit dem Agglutinin von Maackia amurensis, das spezifisch α2,3-gebundene
Sialinsäuren erkennt, stärker in den tieferliegenden Zellschichten ausgeprägt.
Kontakt:
Punyadarsaniya, Darsaniya; Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Virologie,
[email protected]
60
Poster: Pathogenese
Poster P 3
Aviäre Influenzaviren nutzen unterschiedliche Rezeptoren für
die Infektion des respiratorischen Epithels verschiedener
aviärer Wirtsspezies
1
1+2
Bohm, M. ; Winter, C.
1
1
; Herrler, G.
2
Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule, Hannover ; Klinik für Geflügel, Tierärztliche Hochschule,
Hannover
Durch die Bindung des Hämagglutinins an Zelloberflächenrezeptoren wird die
Influenzavirusinfektion eingeleitet. Als entscheidende Rezeptordeterminante wirken dabei
Sialinsäuren. Die Verteilung von α-2,3 und α-2,6-gebundenen Sialinsäuren auf verschiedenen
Zelltypen sowie die Präferenz eines Virus für diese Rezeptordeterminanten bestimmt sowohl die
Zell- als auch Speziesspezifität des Virus.
Wir haben die Infektion aviärer Influenzaviren des H7 und H9 Subtyps in Trachealringkulturen
(TOCs) des Huhns und der Pute charakterisiert. TOCs bewahren die natürliche Anordnung der
Epithelzellen zueinander und eine Infektion durch ziliostatische Viren, wie Influenzaviren, ist
durch Beobachtung der Zilienaktivität einfach zu verfolgen.
Um die Rolle der Sialinsäuren in der Entstehung der Infektion zu untersuchen, wurden die TOCs
mit Neuraminidase vorbehandelt, um die Zellen vor der Virusinfektion zu schützen. Wie erwartet
wurde durch die Enzymbehandlung der ziliostatische Effekt eines Virus des H7N7-Subtyps
verhindert oder hinausgezögert. Im Gegensatz dazu wurde kein protektiver Effekt auf die
Ziliostase beobachtet, die durch einen H9N2-Stamm in Hühner-TOCs hervorgerufen wurde. Die
Infektion von Puten-TOCs mit H9N2 war jedoch Neuraminidase-sensitiv.
Fluoreszenzfärbungen mittels spezifischer Lektine zur Visualisierung von α-2,3 und α-2,6gebundenen Sialinsäuren zeigen, dass respiratorische Epithelzellen sowohl des Huhns als auch
der Pute α-2,3-gebundene Sialinsäuren tragen; α-2,6-gebundene Sialinsäuren wurden jedoch
nur an der Oberfläche des respiratorischen Epithels der Pute gefunden, nicht aber beim Huhn.
Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass aviäre Influenzaviren in Abhängigkeit ihres
Hämagglutinin-Subtyps und der Wirtsspezies unterschiedliche Rezeptoren zum Anheften an die
Wirtszelle verwenden können.
Kontakt:
Bohm, Maren; Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover, [email protected]
61
Poster: Pathogenese
Poster P 4
Charakterisierung der Bindungseigenschaften löslicher
Hämagglutinine aviärer Influenza Viren.
1
2
Sauer, Anne-Kathrin. ; Bohm, Maren. ; Herrler, Georg.
1
3
2
Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover; Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule
3
Hannover; Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover
Die Bindungsspezifität des Hämagglutinins der Influenza A-Viren ist entscheidend für den
Wirtszelltropismus des Virus. Die Rezeptordeterminanten für Influenza A-Viren sind terminale
Sialinsäuren von Makromolekülen auf der Wirtszelloberfläche. Während aviäre Influenzaviren
bevorzugt an α2,3-gebundene Sialinsäuren binden, haben humane Influenzaviren eine
Präferenz für α2,6-gebundene Sialinsäuren. Um zwischen diesen beiden Zuckertypen auf der
Zelloberfläche zu unterscheiden werden in der Regel die Pflanzenlektine MAA (α2,3-gebunde
Sialinsäuren) und SNA (α2,6-gebundene Sialinsäuren) verwendet. Angesichts der Vielzahl
verschiedener Oligosaccharid-Strukturen und auch der unterschiedlichen HämagglutininSubtypen sind zwei Pflanzenlektine nicht ausreichend, um die Bindungsstellen von
Influenzaviren zu charakterisieren.
Als Alternative zu den Pflanzenlektinen haben wir die Strategie gewählt, die
Influenzahämagglutinine als Lektine zu verwenden. Zu diesem Zweck haben wir chimäre
Proteine erzeugt, bei denen die Ektodomäne eines H7-Hämagglutinins entweder an die FcKomponente eines humanen IgG und an die GCN4- Trimerisierungsdomäne gekoppelt war.
Diese veränderten Hämagglutinine wurden nach der Transfektion in den Zellkulturüberstand
sezerniert und nach Konzentrierung für Bindungstests verwendet. Sowohl durch
Fluoreszenzmikroskopie als auch per Durchflusszytometrie konnte die Bindung der löslichen
H7-Hämagglutinine an MDCK II-Zellen nachgewiesen werden. Letztere Methode erlaubt es
auch, den Effekt zu quantifzieren. Die Spezifität der Bindung zeigte sich darin, dass sie
sialinsäure-abhängig war, d.h. eine Vorbehandlung mit Neuraminidase konnte die Bindung
verhindern. Die löslichen Hämagglutinine versprechen, ein interessantes Hilfsmittel zu sein bei
der Charakterisierung der zellulären Interaktionspartner der verschiedenen Hämagglutinine von
Influenzaviren.
Kontakt:
Sauer, Anne-Kathrin; Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover,
[email protected]
62
Poster: Pathogenese
Poster P 5
Sialinsäure-bindende Eigenschaften aviärer Influenzaviren
vom Subtyp H9N2 - Adaptation ans respiratorische Epithel
von Huhn und Pute
1
1
2
Meike DIEDERICHS , Maren BOHM , Henning PETERSEN , Christine W INTER
1
1
Christel SCHWEGMANN-WESSELS , Georg HERRLER
1+2
2
, Silke R AUTENSCHLEIN ,
1
Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, Deutschland;
Klinik für Geflügel, Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, Deutschland
2
Wir konnten zeigen, dass im Ei vermehrte aviäre Influenzaviren des Subtyps H9N2
unterschiedliche Anforderungen für die Infektion des respiratorischen Epithels von Huhn und
Pute aufweisen. Eine Vorbehandlung von Trachealringkulturen (TOC) der Pute mit
Neuraminidase hatte einen protektiven Effekt auf die Infektion mit dem H9N2-Virus. Die Infektion
von Hühner-TOC hingegen wurde durch die Entfernung von Sialinsäuren von der Zelloberfläche
nicht beeinflusst (Bohm et al., in Vorbereitung).
Für eine weitere Analyse der Bindungseigenschaften des H9N2-Virus wurde das im Ei
vermehrte Virus viermal in Hühner- bzw. Puten-TOC passagiert. Das Passagieren des Virus in
TOC führte zu einer Adaptation, die sich darin zeigte, dass die Infektion mit dem adaptierten
H9N2-Virus in einer wesentlich kürzeren Zeit zur vollständigen Ziliostase führte. Während eine
Infektion von Hühner-TOC mit dem an Hühner-TOC adaptierten Virus etwa drei Tage eher zur
vollständigen Ziliostase führt als eine Infektion mit dem ursprünglichen Virus, hat eine Infektion
von Puten-TOC mit dem an die Pute adaptierten Virus zwar einen ähnlichen Effekt, dieser ist
jedoch schwächer ausgeprägt. Die Vorbehandlung von Hühner- und Puten-TOC mit
Neuraminidase zeigte sowohl bei dem an Hühner-TOC adaptierten, als auch an bei dem an
Puten-TOC adaptierten Virus keinen protektiven Effekt.
Die adaptierten Viren werden momentan hinsichtlich ihrer Affinität für α-2,6- bzw. α-2,3gebundene Sialinsäuren untersucht. Von H9N2 Viren ist bekannt, dass sie bevorzugt an α-2,6gebundene Sialinsäuren binden. Da wir zeigen konnten, dass auf der Oberfläche des
respiratorischen Epithels von Hühnern nur α-2,3-gebundene Sialinsäuren vorhanden sind,
untersuchen wir gegenwärtig, ob die Adaptation an Hühner- oder Puten-TOC zu einer
Veränderung in Bezug auf die Präferenz für α-2,6- bzw. α-2,3-gebundene Sialinsäuren führt.
Parallel dazu werden die Sequenzen des Hämagglutinins, sowohl vom ursprünglichen als auch
von den adaptierten Viren, hinsichtlich möglicher Aminosäureveränderungen, die mit dem
Adaptationsprozess verbunden sein könnten, analysiert. Desweiteren werden die adaptierten
Viren im Vergleich zum ursprünglichen Virus in naher Zukunft im heterologen System (Mensch
oder Schwein) untersucht werden.
Kontakt:
Diederichs, Meike; Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule Hannover;
[email protected]
63
Poster: Pathogenese
Poster P 6
NS1 protein of pathogenic H5N1 avian influenza virus does
not suppress interferon synthesis in chickens
1
2
2
3
3
3
Nicola Penski , Carsten Krohmann , Sonja Kothlow , Sandra Gohrbandt , Jana Hundt , Jutta Veits ,
3
3
3
2
1
Angele Breithaupt , Jürgen Stech , Thomas Vahlenkamp , Bernd Kaspers and Peter Staeheli
1
2
Department of Virology, University of Freiburg, Freiburg, Germany; Institute of Animal Physiology,
3
University of Munich, Munich, Germany; Friedrich-Löffler-Institut, Isle of Riems, Germany
Mutants of a highly pathogenic H5N1 influenza A virus that either contain a C-terminally
truncated NS1 gene or lack NS1 altogether were attenuated in chicken embryos cells and
activated type I interferon (IFN) genes much more strongly than wild-type virus. The mutant
viruses were also attenuated in mice and induced much more IFN in mouse lungs than wild-type
virus. In 5-week-old chickens, the NS1-deficient virus was highly attenuated, but the mutant
virus expressing C-terminally truncated NS1 retained a high degree of virulence and was able to
kill chickens, although with delayed kinetics compared to wild-type virus. Surprisingly, at early
and late times post infection, the mutant viruses induced lower rather than higher levels of type I
IFN in the lung or other tissues of infected chickens compared to wild-type virus, suggesting that
NS1 cannot suppress IFN gene expression in at least one cell population of the chicken which
produces large amounts of this cytokine in response to viral infection. Interestingly, treatment of
chicken embryo cells prior to infection did not strongly inhibit replication of the wild-type H5N1
virus. Similarly, intravenous treatment of chickens with high doses of exogenous chicken IFNalpha prior to and during infection failed to confer protection against wild-type H5N1 virus
challenge. Taken together our data indicate that the primary role of the influenza a virus NS1
protein during infection of birds is not suppression of IFN synthesis and that type I IFN does not
contribute substantially to resistance of chickens against highly pathogenic influenza a viruses.
64
Poster: Pathogenese
Poster P 7
Untersuchungen zur Virulenz von Influenza A-Viren des
Subtyps H5N1: Beitrag der C-terminalen PDZ
Ligandendomäne des NS1 Proteins
1
1
2
2
1.
Zielecki, Florian. ; Semmler, Ilia. ; Kalthoff, Donata. ; Beer, Martin. ; Wolff, Thorsten.
1
2
Robert Koch-Institut , Berlin; Friedrich-Loeffler-Institut , Riems;
Die meisten hoch-pathogenen aviären Influenza A Viren kodieren am C-Terminus ihres NS1
Proteins das PDZ-Liganden Motiv (PL) ESEV, während saisonale Influenzaviren hierbei auf
RSKV enden. PL Motive binden an PDZ Domänen innerhalb von Proteinen, die in zellulären
Signalwegen fungieren. Es konnte gezeigt werden, dass das „aviäre“ ESEV-Motiv des NS1
Proteins zahlreiche humane PDZ Domänen-Proteine erkennt und zudem bei Einbringung in das
Maus-adaptierte H1N1 Influenzavirus A/WSN/33 die Pathogenität erhöht. Für das RSKV-Motiv
konnte dagegen fast keine Bindung an humane PDZ Domänen in vitro, noch ein modulierender
Effekt auf die Virulenz des A/WSN/33 Virus festgestellt werden. Das Influenza
A/Vietnam/1203/04 Virus (VN/1203) vom Subtyp H5N1 exprimiert ein C-terminal trunkiertes NS1
Protein, das daher kein PL Motiv trägt. Interessanterweise ist dieses Virus dennoch hochpathogen für Menschen, Hühner, Frettchen und Mäuse.
Unser Ziel ist, die ungeklärte Rolle des C-terminalen NS1 Motivs in der Virusreplikation in vitro
und in vivo zu beschreiben, und mögliche Veränderungen der Pathogenität im Tiermodell zu
bestimmen. Daher etablierten wir ein revers-genetisches System für das VN/1203 Virus und
generierten neben dem WT auch zwei Virusvarianten, deren NS1 C-Terminus rekonstituiert war
und auf ESEV oder RSKV endete. Vergleichende Replikationsanalysen auf verschiedenen
Zelllinien zeigten, dass sich die ESEV-Variante sowohl auf humanen A549 Alveolarzellen als
auch auf Mausfibroblasten deutlich schlechter als WT und RSKV-Virusvariante vermehrte. Auf
embryonierten Hühnerfibroblasten waren dagegen keine Unterschiede zu erkennen.
Pathogenitätsstudien in Mäusen ergaben, dass eine Infektion mit beiden Virusmutanten jeweils
einen leicht verzögerten Krankheitsverlauf bezüglich Gewichtsverlusts und Letalität im Vergleich
zum WT zur Folge hatte. Die ermittelten Virustiter in verschiedenen Organen waren dagegen
sehr ähnlich. Die Bestimmung des Intravenösen Pathogenitätsindex in Hühnern zeigte, dass
beide Virusmutanten wie der WT hoch-pathogen sind.
Die Pathogenität von Influenza A Viren wird nicht nur durch ein Gen bestimmt, sondern wird
durch das Zusammenspiel mehrerer Gene definiert. Unsere Ergebnisse deuten daraufhin, dass
das C-terminale ESEV-Motiv des NS1 Proteins keinen signifikanten Einfluss auf die hohe
Pathogenität des H5N1 Virus in der Maus und im Huhn hat, jedoch die Vermehrungsfähigkeit in
humanen Zellen einschränkt. Es ist möglich, dass PL-Motive im NS1 Protein die virale Virulenz
variabel in Abhängigkeit vom Virusstamm und der Wirtsspezies modulieren.
Kontakt:
Zielecki, Florian; Robert Koch-Institut, [email protected]
65
Poster: Pathogenese
Poster P 8
Der genetische Hintergrund beeinflusst die Wirtsabwehr
gegenüber Influenza- Infektionen
1
1
1
1
1
Barkha Srivastava , Paulina Błażejewska , Nuno Viegas , Tatiana Nedelko and Klaus Schughart
1
Abteilung Experimentelle Mausgenetik, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung & Tierärztliche
Hochschule Hannover, Inhoffenstr. 7, D-38124 Braunschweig,
Die Genetik des Wirtes beeinflusst in hohem Maße die Empfindlichkeit des Wirtes gegenüber
einer Infektion. Wir haben den Einfluss des genetischen Hintergrundes des Wirtes gegenüber
einer Infektion mit Influenza A H1N1 und H7N7 Viren in Mäusen untersucht. Es wurden 7
verschiedene
Labormausstämme
mit
PR8
infiziert
und
deren
Gewichtsverlust
und
Überlebensraten nach der Infektion analysiert. Zwei Stämme, DBA/2J und A/J, zeigten eine sehr
hohe Empfindlichkeit gegenüber der viralen Infektion. Die Mäuse dieser Stämme starben
innerhalb der ersten sieben Tage nach Infektion. Im Gegensatz dazu überlebten alle Tiere der
anderen Mausstämme. In den empfindlichen DBA/2J Mäusen war der LD50 mehr als 1000-fach
niedriger als in den resistenten C57BL/6J Mäusen. Desweiteren zeigten die DBA/2J Mäuse eine
höhere Virusbelastung der Lunge sowie erhöhte Expression von Cytokinen und Chemokinen.
Kontakt:
Srivastava, Barkha; Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH, [email protected]
66
Poster: Pathogenese
Poster P 9
Analyse einer potentiell antiviralen Mx Aktivität beim Huhn
1
2
2
2
2
Benjamin Schusser ,Antje Reuter ,Nicola Penski ,Georg Kochs ,Peter Staeheli ,Bernd
1
1
Kaspers ,Sonja Kothlow
1
2
Institut für Physiologie, Physiologische Chemie und Tierernährung,Universität München;
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Abteilung Virologie,Universität Freiburg
Eine Schlüsselrolle in der antiviralen Abwehr gegen Influenza Viren kommt dem Typ I IFN
System zu. Studien in Mäusen haben dabei PKR und Mx Proteine als essentielle
Effektormoleküle der IFN Antwort identifiziert. Mx Proteine sind in allen Säugern bekannt und
gehören zur Familie der großen GTPasen. Im Huhn wurde Mx zunächst als zytoplasmatisches
Protein ohne antivirale Aktivität beschrieben. Jedoch haben vergangene Studien gezeigt, dass
das Hühner Mx (chMx)Gen hoch polymorph ist und ein Asn/Ser Polymorphismus an
Aminosäurenposition 631 möglicherweise über das Vorhandensein antiviraler Aktivität
entscheidet.
Um dies zu überprüfen, wurden zunächst embryonale Hühnerfibroblasten mit definiertem
homozygotem Mx 631 Genotyp generiert. Deren Stimulation mit chIFN führte zwar zu einem
Dosis abhängiger Schutz der Zellen gegen verschiedene Influenza A Viren, ein Unterschied in
der antiviralen Aktivität der beiden Mx-Isoformen konnte aber nicht nachgewiesen werden.
Um Effekte durch weitere Polymorphismen im Mx Gen auszuschließen, wurden mittels
zielgerichteter Mutagenese chMx Konstrukte generiert, die sich ausschließlich an
Aminosäurenposition 631 unterscheiden. Diese Konstrukte wurden sowohl in Säugerzellen mit
Hilfe eines retroviralen Vektor Systems (RCAS), als auch in Hühnerzellen überexprimiert und
auf ihre antivirale Aktivität gegenüber Influenza A Virus Infektionen untersucht. Dabei konnte
weder bei der Expression von ch Mx in Säugerzellen noch bei der Überexpression in
Hühnerzellen eine antivirale Aktivität der chMx Konstrukte detektiert werden.
Mit Hilfe des RCAS Systems wurden die Mx Konstrukte in Hühnerembryonen überexprimiert
und deren Anfälligkeit gegenüber Influenza A Virus Infektionen überprüft. Während die
Expression von Maus Mx1 zur Reduktion der Virustiter führte, konnte auch in diesem in vivo
System für keine der beiden chMx Isolformen ein antiviraler Effekt beobachtet werden,
Unsere bisherigen Ergebnisse legen nahe, dass dem Mx-Protein beim Huhn keine zentrale
Rolle in der Vermittlung von Effektorfunktionen des IFN-Systems zukommt. Aus diesem Grund
sind weitere Studien nötig, um die Faktoren zu identifizieren, welche die IFN abhängige
Resistenz gegen Influenza A Virus Infektionen vermitteln.
Kontakt:
Schusser,Benjamin;
Institut für Physiologie, Physiologische Chemie und Tierernährung;
[email protected]
67
Poster: Pathogenese
Poster P 10
Influenza infection causes an inhibition of the immune
response in human monocytes: the role of the rar-related
orphan receptor alpha
1
2
3
1,2
Friesenhagen, J. ; Viemann, D. ; Ludwig, S. ; Roth, J. .
1
2
Institute of Immunology, University of Münster, Germany; Department of Pediatrics, University Hospital
3
of Münster, Germany; Institute of Virology, ZMBE, University of Münster, Germany.
Background: As patients suffering from an infection with highly pathogenic influenza viruses
like H5N1 show an overwhelming cytokine storm, we investigated the response of monocytes,
the main producers of cytokines, to an influenza infection.
Materials and Methods: Primary human monocytes were infected with H5N1 virus as well as
with two lower pathogenic virus strains, FPV and PR8. The cell response was analyzed by RTPCR, FACS staining, Western Blot and Affymetrix gene array for three independent blood
donors.
Results: RT-PCR experiments showed that the viruses induce a strong interferon response and
that the cells release distinct cytokines and chemokines. Interestingly, H5N1 induced the most
limited cell response which might be an escape strategy promoting systemic infection. These
findings were confirmed in a genome-wide gene expression analysis. The data obtained here
showed a clearly reduced inflammatory response in monocytes compared to other cell types
with the highest suppression in H5N1 infected cells. All three viruses led to an inhibition of the
nuclear factor kappa B (NF-κB), whereas an overrepresentation of the rar-related orphan
receptor alpha (RORα), a repressor of inflammatory responses, was found.
Conclusions: Clinical infection with H5N1 is associated with a cytokine storm. In contrast to
this, human monocytes showed a reduced immune response after infection with H5N1 which
could be related to differential recruitment of transcription factors. The reduced activation of
monocytes by H5N1 could represent a critical escape strategy promoting systemic infection.
Kontakt:
Friesenhagen, Judith; Institut für Immunologie, Münster, [email protected]
68
Poster: Pathogenese
Poster P 11
Constitutively expressed chicken interferon-α1
retards the replication of highly pathogenic avian
influenza virus in ovo
1
2
2
1
A. Reuter ; B. Schusser ; S. Kothlow ; P. Staeheli
1
2
Department of Virology, University of Freiburg, Freiburg, Germany; Institute for Animal Physiology,
University of Munich, Munich, Germany
Background: Influenza A viruses can severely compromise human health. Some influenza A
virus strains are also highly pathogenic for birds, thus posing a serious threat for the poultry
industry. One of the key players in antiviral defence against influenza viruses is the type I
interferon (IFN) system. However, the role of IFN during influenza virus infections in birds has to
date not been investigated in much detail.
Methods: Using the RCAS (Replication-Competent ASLV long terminal repeat (LTR) with a
Splice acceptor) vector system we expressed chicken IFN-α1 (chIFN-α1) in chicken embryo
fibroblasts (CEFs). Cells releasing these retroviruses were then used to generate transgenic
chicken embryos.
Results: RCAS-mediated expression of chIFN-α1 in CEF cultures strongly reduced the
replication of different influenza A virus strains including highly pathogenic FPV/Rostock (H7N1).
Substantial levels of IFN activity were detected in the heart tissue and allantoic fluid of
transgenic chicken embryos carrying RCAS-chIFN-α1. RCAS-chIFN-α1-transgenic embryos
showed prolonged survival compared to appropriate controls when infected with either human
influenza virus strain WSN/33 (H1N1) or FPV/Rostock.
Conclusions: Constitutively expressed chIFN-α1 can inhibit the replication of influenza A
viruses in vitro and in ovo. Future work will reveal if hatched transgenic birds exhibit enhanced
resistance to highly pathogenic influenza A viruses.
Corresponding author:
[email protected]
69
Poster: Pathogenese
Poster P 12
Immungenetik von Influenza Infektionen in Mäusen
1
1
1
1
1
Tatiana Nedelko , Barkha Srivastava , Paulina Błażejewska , Rudi Alberts , Klaus Schughart
1
Abteilung Experimentelle Mausgenetik, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung & Tierärztliche
Hochschule Hannover, Inhoffenstr. 7, D-38124 Braunschweig
Die genetischen Faktoren, welche die Empfindlichkeit des Wirts gegenüber einer InfluenzaInfektion bestimmen, sind größtenteils unbekannt. Daher wurden verschiedene
Mauspopulationen, rekombinante Inzuchtstämme (BXD), inter-spezifische rekombinante
congene Stämme (BcG) sowie F2-Rückkreuzungstiere (D2B6F1 x D2) mit Maus-adaptieretem
PR8 Influenza A Virus infiziert, und Gewichtsverlust sowie Überlebensrate bestimmt. Die
bisherigen Ergebnisse zeigen ein komplexes Vererbungsmuster. Die detaillierte genetische
Kartierung wird derzeit weiter fortgeführt.
Kontakt:
Dr. Tatiana Nedelko
Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung
[email protected]
70
Poster: Pathogenese
Poster P 13
Die angeborene murine Immunabwehr antwortet auf
verschiedene Isolate des Influenza A/ Puerto Rico/8 Stammes
mit unterschiedlicher Virulenz
1
1
Viegas Nuno , Blazejewska Paulina , Schughart Klaus
1
1
Abteilung Experimentelle Mausgenetik, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig &
Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover
Influenza ist eine ernstzunehmende Erkrankung der Atemwege, welche die Gesundheit
beeinträchtigt und zum Tode führen kann. Die saisonalen Grippeepidemien, die durch Varianten
der Influenza Subtypen H1N1 und H3N2 verursacht werden, führen jährlich bis zu einer Million
Toten weltweit. Während des letzten Jahrhunderts haben hoch virulente H1N1 Stämme ein
Drittel der menschlichen Population infiziert und über 50 Millionen Todesopfer gefordert.
Infektionen mit hoch virulenten Influenza Stämmen führen zu einer exzessiven
inflammatorischen Antwort des Wirtes, die oft tödlich endet.
Um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die zu einer exzessiven Immunantwort
während der Infektion führen, haben wir Mäuse des Stammes C57BL/6 mit zwei verschiedenen
Isolaten des Mausadaptierten Stammes Influenza A/Puerto Rico/8 (PR8) infiziert. Die beiden
H1N1 Isolate zeigen unterschiedliche Virulenz: das Isolat (PR8/L) zeigt eine schwache
inflammatorische Antwort. Im Gegensatz dazu induziert das Isolat (PR8/H) eine starke
inflammatorische Antwort und ist lethal. Beide Viren induzieren eine unterschiedliche
angeborene Immunantwort. Die Infektion der Mäuse mit PR8/H führte zu einer erhöhten Cytokin
Produktion und zu einer zellulären Infiltration der Lunge durch Zellen des angeborenen
Immunsystems. Als Folge dieser stärkeren und schnelleren Infiltration der Lunge zeigten die mit
PR8/H infizierten Mäuse Lungenschädigungen in höherem Ausmaß.
Zwei verwandte Isolate des Influenza A Virus mit unterschiedlicher Virulenz ermöglichen es uns
somit, die Immunantwort des Wirtes besser zu verstehen und neue anti-virale Therapien zu
entwickeln.
Kontakt:
Viegas, Nuno; Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Inhoffenstrasse 7, 38124, Braunschweig;
[email protected]
71
Poster: Pathogenese
Poster P 14
NF-kappaB and p38 MAPK dependent global gene expression
profiles in influenza virus infected endothelial cells
1,3
1
2
2
1
Schmolke, M. ; Börgeling, Y. ; Viemann, D. ; Roth, J. ; Ludwig, S.
1
Institute of Molecular Virology, Center for Molecular Biology of Inflammation, Westfälische Wilhelms2
Universität Münster, Germany; Institute of Immunology, Westfälische Wilhelms-Universität Münster,
3
Germany; Mount Sinai School of Medicine, Department of Microbiology, New York, USA
The appearance of highly pathogenic avian H5N1 influenza viruses (HPAIV) in humans in 1997
that still circulate and give rise to fatal infections pose a major threat to mankind. Infections with
HPAI viruses of the H5 and H7 subtypes lead to haemorrhagic lesions and internal bleeding in
infected birds and most likely also humans. Recent work has demonstrated a strong tropism of
H7 viruses for the endothelium. Since HPAI viruses are characterized by a strong induction of
cytokines in the infected individum (cytokine storm) endothelial cell responses may contribute to
the pathogeniciy of these viruses. This prompted us to analyse virus-induced global gene
expression profiles (Affymetrix cDNA Array) in primary endothelial cells (HUVEC) infected with
either the HPAIV A/FPV/Bratislava (H7N7) or the human reference isolate A/PR8/34 (H1N1). To
identify the subset of FPV-induced genes that are controlled via the p38 MAPK or the NFkappaB signaling pathway we further performed comparative gene expression studies in cells
treated with the specific p38 kinase inhibitor SB202190 or the specific NF-kappaB inhibiting
compound BAY1175-80. As one of the prominent findings we observed that the majority of FPVinduced genes are type I interferon dependent and are not expressed in cells where NF-kappaB
was inhibited. This identifies NF-kappaB as a major regulator of the antiviral IFN response, most
likely due to the control of the initial expression of IFNß. Both viruses also downregulate a huge
number of genes (FPV: 4000 genes, PR8: 1000 genes) presumably due to cap snatching during
viral mRNA synthesis. While FPV in general up-regulates a smaller number of genes compared
to PR8 (53 genes compared to 311 genes) nearly all genes induced by FPV are also induced by
PR8 (43 genes). Nevertheless there are also some genes that are exclusively up-regulated by
FPV only. Finally, specific patterns of gene induction were identified by comparison of influenza
virus infection to other endothelial activators such as TNFalpha, S. aureus or Hantavirus. The
relevance of these findings for the tissue tropism and pathogenicity of HPAIV will be discussed.
Contact:
Ludwig, Stephan; Institute of Molecular Virology, Center for Molecular Biology of Inflammation,
[email protected]
72
Poster: Pathogenese
Poster P 15
Biphasic Function of p38 MAPK Signaling in the Primary Host
Gene Response to H5N1 Influenza A Virus infection
1
2
1
Börgeling, Y. ; Schmolke, M. ; Ludwig S.
1
Institute of Molecular Virology, Center for Molecular Biology of Inflammation, Westfälische Wilhelms2
Universität Münster, Münster, Germany; Mount Sinai School of Medicine, Department of Microbiology,
New York, USA
The group of highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) is able to induce severe septichemorrhagic inflammation and genetic recombination between human and avian influenza
viruses is feared to create novel pandemic virus strains that are responsible for major morbidity
and mortality. One of the intriguing features of infections by viruses of the H5N1 subtype is the
induced cytokine burst that strongly contributes to viral pathogenicity. It has been suggested,
that this cytokine overexpression is an intrinsic feature of infected cells and due to a
hyperinduction of p38 mitogen-activated protein kinase. To address the role of p38 MAPK
signaling in H5N1 infected endothelial and epithelial cells we performed global gene profiling
experiments in the presence or absence of the p38-specific inhibitor SB202190. We could show,
that inhibition of p38 leads to reduced expression of IFNβ and other cytokines after H5N1
infection in both cell types. Furthermore, the expression of interferon stimulated genes, that were
induced by IFNβ treatment or conditioned media from H5N1 infected cells was decreased when
the acceptor cells were preincubated with SB202190. These observations show, that p38 acts
on two levels of the antiviral type I IFN response. Initially the kinase regulates IFNβ induction
and at a later stage p38 controls IFN signaling and expression of IFN-stimulated genes.
Contact:
Börgeling, Yvonne; Institute of Molecular Virology, Center for Molecular Biology of Inflammation,
[email protected]
73
Poster: Pathogenese
Poster P 16
Capability of avian viral NS1 proteins to bind to the cellular
adaptor proteins Crk/CrkL determines ability to partially
suppress JNK-ATF2-activation and apoptosis induction
1
2
1
1
Hrincius, E.-R. ; Wolff, T. ; Ludwig, S. ; Ehrhardt, C.
1
Institute of Molecular Virology, WWU, Muenster, Germany
2
RKI, Berlin, Germany
The non-structural protein 1 (A/NS1) of influenza A viruses (IAV) harbors several src homology
domain (SH)-binding motifs which are required for interaction with cellular proteins, such as the
p85beta subunit of PI3-kinase. Besides A/NS1 interaction with p85beta it could be shown, that a
SH3-binding motif (aa 212-217 [PPLPPK]) within A/NS1 is essential for binding to the cellular
adaptor proteins Crk/CrkL. Both regulate diverse pathways in the cell including activation of the
MAP-kinase JNK, that was previously shown by us to mediate antiviral responses. To elucidate
Crk/CrkL functions in infected cells we knocked-down expression of the proteins by an siRNA
approach. We could demonstrate that only those IAV that encode a A/NS1-protein harboring the
SH3-binding motif 2 PPLPPK are attenuated upon downregulation of Crk/CrkL. It was also
observed that the PPLPPK site-harboring candidate strains exhibit a stronger viral activation of
the JNK/ATF-2 signaling-module compared to other strains and that knock-down of the adaptor
proteins resulted in an even stronger activation of this virus-induced antiviral acting pathway.
While downregulation of Crk did not alter mRNA-level of IFN-beta or type I IFN induced genes,
reduced expression of the protein resulted in enhanced cell death and Caspase 9 cleavage
upon infection with IAV strains that are able to bind to Crk/CrkL.
The data so far suggest that A/NS1 binding to Crk or CrkL contributes to the suppression of the
antiviral acting JNK/ATF-2 pathway. The Crk/CrkL binding capability may have only evolved in
virus strains that over-induce this antiviral signaling module to suppress its detrimental action.
Contact:
Hrincius, Eike-Roman
Institute of Molecular Virology, Center for Molecular Biology of Inflammation
[email protected]
74
Poster: Pathogenese
Poster P 17
Erforschung von Pathogenitätsdeterminanten aviärer
Influenza A H9N2 Subtypen mittels reverser Genetik
1
1
1
1
Alex, N. ; Hammann, J. ; Göpfert, C. ; Wagner, R.
1
Paul Ehrlich Institut, Langen
Influenzaviren des Subtyps H9N2 sind endemisch in den asiatischen und europäischen
Geflügelbeständen. Wiederholte, von der WHO bestätigte, humane Infektionen beweisen die
Fähigkeit dieses Subtyps die Wirtsbarriere zu überschreiten. Der H9N2 Subtyp besitzt somit die
Voraussetzungen für ein potentiell pandemisches Influenzavirus.
Wir sind daran interessiert, Faktoren aufzudecken, die eine Rolle in der Wirtsspezifität und der
Pathogenität zirkulierender niedrigpathogener aviärer H9N2 Influenzaviren spielen. Hierfür
wurden drei asiatische Wildtyp-Isolate in-vitro charakterisiert. Zunächst wurden die Viren Plaque
aufgereinigt und in embryonierten Hühnereiern vermehrt. Wachstumskinetiken sowie
Trypsinabhängigkeit in unterschiedlichen Zelllinien (MDCK, Vero und A549) wurden untersucht.
Eines der verwendeten Isolate zeigte dabei einen deutlichen Zelltropismus. Es replizierte
trypsinabhängig in MDCK Zellen nicht jedoch in Vero Zellen. Bei einem anderen Isolat wurde
eine strikte Trypsinabhängigkeit in Vero Zellen beobachtet, wohingegen die Replikation in
MDCK Zellen trypsinunabhängig verlief. Gegenstand der derzeitigen Untersuchung ist die
Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen.
Zur Identifizierung spezifischer H9N2 Pathogenitäts- und Tropismusdeterminanten wird das
reverse Genetik System verwendet. Die entsprechenden RNA-Pol-I-Plasmide für die
Oberflächenproteine HA und die Neuraminidase (NA) sowie für das Matrixprotein und das
Nichtstrukturprotein wurden kloniert. Zurzeit werden Reassortanten mit einem oder mehreren
H9N2 Segmente in dem genetischen Hintergrund der humanen H1N1 Viren A/Puerto
Rico/8/1934 bzw. A/WSN/1933 generiert. Replikationsstudien in Zellkultur sollen Aufschluss
über die funktionelle Bedeutung der H9N2 Proteine geben. Die Relevanz einzelner
Aminosäuremotive für die Virulenz kann anschließend mittels gezielt gesetzten Mutationen
analysiert werden.
Ziel der Untersuchung ist die Aufklärung neuer Motive, die für die Wirtsspezifität bzw. die
Pathogenität mitverantwortlich sind.
Kontakt:
Alex, Nina; Paul Ehrlich Institut, [email protected]
75
Poster: Vakzine und Therapie
76
Poster V 1
Rekombinantes NDV/AIVH7 zur Impfung gegen Newcastle
Disease und hochpathogene aviäre Influenza vom Subtyp H7
1
1
1
1
Schröer, D. ; Veits, J. ; Römer-Oberdörfer, A. ; Mettenleiter, T. C.
1
Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, 17493 Greifswald-Insel Riems
Niedrigpathogene aviäre Influenzaviren (AIV) der Subtypen H5 und H7 können während der
Zirkulation in Geflügelbeständen zu hoch pathogenen Viren mutieren. Dies wird durch den
Einsatz von Inaktivat-Vakzinen sogar noch begünstigt, wenn Geflügel zwar vor Erkrankung
geschützt, aber die Ausscheidung des Feldvirus nicht vollständig verhindert wird, da eine
Unterscheidung von infizierten und vakzinierten Tieren (DIVA-Prinzip) mit Vollvirusimpfstoffen
nicht oder nur schwer möglich ist. Eine kommerziell erhältliche Vektorvakzine auf Basis eines
rekombinanten Geflügelpockenvirus, welches das H5 Hämagglutinin des AIV exprimiert, erlaubt
eine solche Unterscheidung. Allerdings erfordert dieser Impfstoff, wie auch die Totimpfstoffe,
eine individuelle Applikation. Daher wurde in dieser Studie eine Hämagglutinin-exprimierende
Newcastle Disease Virus (NDV)-Rekombinante generiert, welche neben der Anwendung des
DIVA-Konzeptes Immunisierungen über Massenapplikationsverfahren, wie z. B. Spray oder
Trinkwasser erlauben sollte.
Dazu wurde mittels reverser Genetik das AIV H7 Hämagglutinin-Gen als zusätzliche
Transkriptionseinheit in die intergene Region des Fusionsprotein- und HämagglutininNeuraminidase-Gens des NDV Lebendvirusvakzinestammes Clone 30 inseriert. Die Expression
des Hämagglutinins wurde überprüft und die Schutzwirkung der Rekombinante gegen H7 HPAI
sowie Newcastle Disease in spezifisch-pathogen-freien Hühnern nach okulonasaler Applikation
getestet.
Eine einmalige Immunisierung induzierte in allen Tieren sowohl NDV- als auch H7-spezifische
Antikörper und vermittelte Schutz gegen H7 HPAIV A/chicken/Italy/445/99 (H7N1) als auch
gegen virulentes NDV (Stamm Herts 33/56). Keines der immunisierten Tiere erkrankte klinisch,
während alle nicht immunisierten Kontrollhühner innerhalb weniger Tage verstarben. Realtime
RT-PCR Analysen von Tupferproben aus Rachen und Kloaken zeigten, dass die
Virusausscheidung in immunisierten Hühnern gegenüber nicht-immunisierten Kontrolltieren
stark reduziert war. Darüber hinaus waren mittels eines ELISAs auf Basis des AIV
Nukleoproteins immunisierte Tiere von immunisierten und nachfolgend AIV-infizierten Tieren
einfach serologisch unterscheidbar.
Damit repräsentiert die H7-exprimierende NDV-Rekombinante eine kostengünstige,
massenapplikationsfähige Markervakzine gegen AI, welche bei prohylaktischem Einsatz
zugleich als bivalente Vakzine gegen die beiden bedeutendsten Infektionskrankheiten des
Geflügels, aviäre Influenza und Newcastle Disease, genutzt werden könnte.
Kontakt:
Veits, Jutta; Friedrich-Loeffler-Institut, [email protected]
77
Poster V 2
Herstellung und Evaluierung H5 Hämagglutinin und N1
Neuraminidase exprimierender ILTV-Rekombinanten als
Lebendvakzinen gegen HPAIV-Infektionen von Hühnern
Pavlova, S. P.; Veits, J.; Mettenleiter, T.C.; Fuchs, W.
Institut für Molekularbiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald – Insel Riems
Die infektiöse Laryngotracheitis der Hühner wird durch ein Alphaherpesvirus (ILTV) verursacht
und mit attenuierten Lebendvirus-Impfstoffen bekämpft, die eine schnelle und kostengünstige
Applikation über Augentropfen, Aerosol oder Trinkwasser erlauben. Bereits früher wurde
gezeigt, dass eine Immunisierung mit ILTV-Rekombinanten, die das Hämagglutinin
hochpathogener aviärer Influenzaviren (HPAIV) exprimieren, Hühner gegen eine HPAIVInfektion schützen kann (Lüschow et al., 2001, Vaccine 19:4249-59; Veits et al., 2003, J Gen
Virol 84:3343-52). Allerdings vermittelten die beschriebenen ILTV-Mutanten nur partiellen
Schutz gegen neuere HPAIV vom Subtyp H5N1. Deshalb wurde ein versatiler ILTV-Vektor
generiert, in dessen defekten dUTPase-Genlocus die Hämagglutinin- und/oder NeuraminidaseGene des HPAIV A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1; clade 1) inseriert wurden. Gegenüber
früheren Konstrukten konnte die Expression der Fremdproteine unter Kontrolle der immediateearly Promotoren des humanen oder murinen Cytomegalievirus durch Einführung synthetischer
Introns deutlich gesteigert werden. Durch die Deletion des dUTPase-Gens wurde die in vitro
Replikation der ILTV-Rekombinanten nicht beeinträchtigt, aber eine ausreichende Attenuierung
in vivo erzielt. Nach einmaliger okularer Immunisierung mit H5-ILTV, N1-ILTV, beiden
Rekombinanten oder einer doppelexprimierenden Mutante (H5N1-ILTV) entwickelten alle
untersuchten Hühner H5- und/oder N1-spezifische Serumantikörper. Dennoch waren mit N1ILTV immunisierte Tiere nicht gegen Belastungsinfektionen mit homologem HPAIV geschützt,
zeigten aber im Vergleich zu nicht geimpften Kontrolltieren verlängerte Überlebenszeiten. Im
Gegensatz dazu überlebten alle mit H5-ILTV, H5-ILTV und N1-ILTV, oder H5N1-ILTV geimpften
Tiere die Belastungsinfektion ohne erkennbare Krankheitssymptome. Durch real-time RT-PCR
konnte in den mit H5- oder H5N1-ILTV immunisierten Hühnern eine begrenzte HPAIVReplikation nachgewiesen werden, während die Doppelvakzinierung mit H5-ILTV und N1-ILTV
offensichtlich eine sterile Immunität vermittelte. Die etwas geringere Wirksamkeit von H5N1ILTV war vermutlich auf eine reduzierte Expression der beiden Influenzavirusproteine
zurückzuführen. Die Wirksamkeit von H5-ILTV gegen letale Belastungsinfektionen mit
heterologen HPAIV wurde ebenfalls untersucht. Dabei zeigte sich, dass geimpfte Tiere
vollständig gegen Erkrankung durch HPAIV A/swan/Germany/R65/2006 (H5N1; clade 2.2;
96,1% Homologie zum Impfvirus-Hämagglutinin) geschützt waren, und dass HPAIV
A/chicken/Italy/8/98 (H5N2; 93,8% Homologie) zwar bei 20% der geimpften Tiere minimale
klinische Symptome, aber keine Todesfälle verursachte. In allen Fällen wurde außerdem eine
deutliche Reduktion der Virusausscheidung gegenüber nicht geimpften Kontrollen festgestellt.
Wie andere Vektorimpfstoffe erlauben die ILTV-Rekombinanten eine Unterscheidung geimpfter
von AIV-infizierten Tieren durch serologische Testung auf Antikörper gegen das Influenzavirus
Nukleoprotein.
Kontakt:
Pavlova, Sophia P.; Friedrich-Loeffler-Institut; [email protected]
78
Poster V 3
Eine attenuierte Lebend-Vakzine mit Elastase-abhängiger
Hämagglutinin-Spaltstelle gegen HPAIV H5N1 im Huhn
1
1
1
1
2
2
1
Hundt, J. ; Gohrbandt, S. ; Veits, J. ; Pavlova S. P. ; Blohm, U. ; Breithaupt, A. ; Stech, O. ; Mettenleiter,
1
1
T. C. ; Stech, J.
1
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institute für Molekularbiologie und Infektionsmedizin, Greifswald-Riems
Hochpathogene aviäre Influenza A Viren (HPAIV) führen zu verheerenden Verlusten in der
Geflügelindustrie. Wiederholte Übertragungen von HPAIV auf den Menschen sind zudem
besorgniserregend im Hinblick auf die Entstehung einer möglichen Pandemie. Die proteolytische
Aktivierung des Oberflächenproteins Hämagglutinin (HA) durch Wirtsproteasen ist essentiell für
die Replikation jedes Influenzavirusstammes. Über die Einführung eines atypischen SpaltstellenMotivs im HA, das nur durch für das Virus in vivo begrenzt zugängliche Proteasen gespalten
werden kann, ist es deshalb möglich, die Virusreplikation auf lediglich einen Zyklus zu
beschränken. Die Einführung der HA-Spaltstelle als Ansatz für die Generierung einer
Lebendvakzine wurde bereits mit einem mausadaptierten und einem Influenza-Virus aus dem
Schwein getestet (Stech, Expert Rev Vaccines 7(6): 739-743 (2008) and Masic et al., J Virol
83(19):10198-210 (2009)). In der hier vorgestellten Studie soll die Eignung einer
Spaltstellenmutante als Lebendvakzine gegen HPAIV im Huhn untersucht werden. Mit Hilfe der
reversen Genetik wurde die polybasische HA-Spaltstelle des HPAIV A/Swan/Germany/R65/06
(H5N1) (R65) durch ein Elastase-Motiv (R65-E) ersetzt. Die Spaltstellenmutante R65-E wurde
anschließend durch Wachstumskinetik, Plaquetest und Western-Blot in vitro charakterisiert.
Western-Blot-Analysen zeigen die effektive Spaltung des HA0-Vorläuferproteins von R65-E
durch Elastase. In Zellkultur wies die R65-E-Mutante zudem ein ähnliches Wachstumsverhalten
wie das Wildtyp-Virus auf. Bisher konnte gezeigt werden, dass R65-E in vitro ausschließlich in
Anwesenheit von Elastase repliziert. Im weiteren Verlauf dieses Projektes sollen der Grad der
Attenuierung und der Organtropismus von R65-E im Huhn im Vergleich zum hochpathogenen
Wildtypvirus sowie die Fähigkeit der Lebendvakzine, Hühner vor einer Belastungsinfektion mit
dem homologen Wildtyp und einem anderen hochpathogenen H5-Virus zu schützen,
einschließlich der damit verbundenen immunologischen Parameter untersucht werden.
Kontakt:
Hundt, Jana, Friedrich-Loeffler-Institut, [email protected].
79
Poster V 4
Schutz gegen homologe und heterologe Belastung nach
Immunisierung mit genetischen Multigen-/MultivektorImpfstoffen basiert auf aviäre H5N1- und porzine H1N1Influenza.
1
1
1
1
2
1
1
Norley, S. ; Sipo, I. ; Knauf, M. ; Wildner, J. ; Siccardi, A. ; Semmler, I , Kurth, R.
1
2
Robert Koch-Institut, Berlin; University of Milan, Italy
Obwohl effektive Impfstoffe gegen Influenza vorhanden sind und generell gebraucht werden, ist
jeder hergestellte Impfstoff typspezifisch und muß daher „maßgeschneidert“ werden, um dem
jeweiligen zirkulierenden Virustyp einer Pandemie zu entsprechen. Die Herstellung eines
solchen Impfstoffes dauert sechs bis neun Monate, und während dieser Zeit hat die erste
Pandemiewelle bereits stattgefunden. Aus diesem Grunde besteht die Notwendigkeit für einen
Impfstoff, der generell in der Lage ist, eine breite Immunantwort zu induzieren, die, auch wenn
hundertprozentiger Schutz nicht gegeben sein mag, die Schwere des Krankheitsverlaufs und die
Transmissionsrate des Virus in infizierten Individuen reduziert. Ein möglicher Ansatz um dies zu
erreichen ist der Gebrauch genetischer Vakzine, mit deren Hilfe zelluläre Immunantworten
gegen konservierte Influenzaproteine induziert werden können.
Als Teil des „Forschungsprogramms Influenza des Bundes“ wurden die Gene für die HA-, NP-,
M1- und M2-Proteine des H5N1/VN1203/04 Isolats des Vogelgrippevirus jeweils in wildtyp- und
codonoptimierter Variante in vier verschiedene Vektoren eingebracht: Plasmid-DNA, adenoassoziiertes Virus (AAV), Adenovirus (Ad) und modifiziertes Vaccinia Virus Ankara (MVA). Die
Konstrukte wurden (oder werden z.Zt.) einzeln und in verschiedenen Kombinationen
untereinander bezüglich ihrer in vitro Expression und T- und B-Zell Immunogenität in Mäusen
charakterisiert.
Plasmidbasierte, multigenetische Vakzine, die Mäusen per GeneGun appliziert wurden, boten
Schutz gegen letale Belastungen mit dem homologen H5N1/VN1203/04- und dem deutlich
heterologen H5N1/R65/06-Stamm, jedoch nicht gegen H1N1/PR8/34. Ähnliche Ergebnisse
wurden mit genetischen Impfstoffen erzielt, die auf replikationsinkompetenten AAVs basierten.
Darüber hinaus konnte mit den MVA-basierten Vakzinen ein hundertprozentiger Schutz gegen
eine heterologe Belastung mit H5N1 induziert werden.
Mit dem Aufkommen von H1N1-Influenza wurde das Projekt ausgeweitet, um genetische
Vakzine gegen den neuen zirkulierenden Pandemiestamm zu entwickeln. Codonoptimierte
Versionen der HA-, NP- und M1-Gene wurden synthetisiert und Vakzine basiert auf den vier
verschiedenen Vektoren wurden hergestellt. Mäuse, die mit diesen H1N1-basierten DNAImpfstoffen immunisiert und mit dem relativ aggressiven H1N1/PR8/34 Stamm belastet wurden,
waren nicht vor der Infektion geschützt, allerdings zeigten diejenigen Mäuse, die mit AAVbasierten Impfsoffen immunisiert worden waren signifikanten Schutz gegen die heterologe
Belastung. Belastungsexperimente mit dem homologen H1N1 Stamm werden derzeit
ausgeführt.
Kontakt:
Norley, Stephen; Robert Koch-Institut, [email protected]
80
Poster V 5
Produktion adenoviral basierter genetischer Vakzine gegen
pandemische Influenza
1
1
1
1
Wildner, J. ; Knauf, M. ; Norley, S. ; Kurth, R.
1
Robert Koch-Institut, Berlin
Genetische Vakzine stellen eine Alternative zu den konventionellen Influenza-Impfstoffen,
welche sehr spezifisch sind und daher stets an den aktuellen Influenza-Stamm angepasst
werden müssen, dar. Im Rahmen des Sofortprogramms Influenza entschied man sich zur
Produktion und Charakterisierung genetischer Vakzine, die das humane Adenovirus 5 (Ad5) als
Vektor verwenden. Diese Vektoren codieren sowohl für H5N1-Gene als auch für die neuen
mexikanischen H1N1-Gene. Zur Induktion eines breitenwirksamen Schutzes sollen die Vektoren
nicht nur für die Hämagglutinine H1 und H5, sondern auch für die hochkonservierten Gene
Matrixprotein M1 und Nukleoprotein NP codieren. Durch Vergleich der Immunogenität und
Effektivität der individuellen Vektoren sowohl untereinander als auch mit anderen genetischen
Vakzinen sollte ein Einblick in den Schutzmechanismus gegeben werden, so dass der
vielversprechendste Vektor oder Vektor-Kombination gewählt werden kann.
Zur Herstellung der rekombinanten adenoviralen Vektoren wurde das AdEasy™-System
(Stratagene) genutzt. Dieses basiert auf einer in E.coli stattfindenden homologen Rekombination
zwischen dem E1-deletierten adenoviralen Plasmid-Vektor pAdEasy-1 und einem ShuttleVektor, der das Transgen enthält. Hieraus entstandene Vektoren werden dann in der Zelllinie
HEK 293 durch Trans-Komplementierung der E1-Region amplifiziert, so dass
replikationsdefiziente Viruspartikel entstehen. Mittels Plaque-Assay können daraufhin einzelne
virale Klone gewählt und untersucht werden. Korrekte Klone werden dann vermehrt und
gereinigt.
Die Klonierung der Influenzagene in den Shuttle-Vektor sowie die Rekombination mit pAdEasy-1
wurde für die H5N1- sowie für die H1N1-Gene erfolgreich beendet. Die TransKomplementierung in HEK 293, die Amplifikation und Überprüfung der viralen Klone ist teils
bereits abgeschlossen. Die Expression der Transgene konnte, soweit die Vektoren vorhanden
waren, im Western Blot nachgewiesen werden, woraufhin die Viren dann vermehrt wurden. In
elektronenmikroskopischen Aufnahmen einiger rekombinanter adenoviraler Vektoren konnte die
korrekte ikosahedrale Struktur gezeigt werden.
Sobald alle Vektoren verfügbar sind, wird deren Immunogenität in Mäusen untersucht. Dabei
werden die Ad5-Vektoren sowohl allein als auch in heterologer Prime-Boost-Kombination mit
anderen Vektoren, DNA-, AAV- bzw. MVA-basiert, eingesetzt und bewertet. Letztlich soll dann
der vielversprechendste Vektor bzw. Vektor-Kombination nach Belastung immunisierter Mäuse
mit infektiösem H5N1 bzw. H1N1 bestimmt werden.
Kontakt:
Wildner, Judith; Robert Koch-Institut, [email protected]
81
Poster V 6
Breitenwirksame Gene Gun Impfstoffe
gegen Influenza H5N1
1
2
3
4
Knauf, M. ; Sipo, I. ; Norley, S. ; Kurth, R. ;
1
2
3
4
Robert Koch-Institut, Berlin; Robert Koch-Institut, Berlin; Robert Koch-Institut, Berlin; Robert KochInstitut, Berlin;
Die Entwicklung einer schnellen Methode zur Erzeugung von Impfstoffen ist von größter
Bedeutung angesichts einer erwarteten Influenzapandemie. Genetische Vakzine erlauben
maximale Anpassungsfähigkeit und Geschwindigkeit der Produktion bei niedrigsten Kosten.
Daher wurden Expressionsplasmide mit den Genen von H5, M1, M2 und NP unter Kontrolle
eines CMV-Promoters hergestellt, sowohl wild-typ als auch codonoptimiert, und wurden als
Impfstoff per Gene Gun in Mäusen getestet. Die codonoptimierten Gene von Influenza
A/Vietnam/1194/2004 wurden über eine neue PCR-verwandte Methode de novo synthetisiert,
während die Wildtypgene per Primerverlängerungs-PCR kloniert wurden. Die Expression der
Gene in Zellkultur wurde per Western Blot und Immunfluoreszenz überprüft. Als
immunomodulatorisches Gen wurde codon-optimiertes Interleukin 21 erzeugt und in
Kombinationen mit GM-CSF und Interleukin 12 getestet, um die Impfreaktion zu steigern. Die
Untersuchungen mit einzelnen Influenzagenen lassen die Vermutung eines Schutzes zu,
welcher fast ausschließlich durch das Gen des Nucleoproteins NP vermittelt wird. Dieser Schutz
geht einher mit entsprechend hohen Werten an NP-spezifischen Interferon-gammasezernierenden Zellen im Elispot, darunter vor allem zytotoxische Lymphozyten. Es wurden
H5N1- breitenwirksame Impfstoffe erzeugt, die 80% der Mäuse vor bis zu 50 LD50 an H5N1Viren aus unterschiedlichen Familien schützen, jedoch nicht vor dem mausadaptierten H1N1Virus Influenza A/PR/8/34. Dieser Ansatz bietet sich weiterhin für Prime-Boost-Versuche an,
momentan werden unterschiedliche Kombinationen von Impfvektoren untersucht.
Kontakt:
Dr. Stephen Norley, P12, Nordufer 20, 13353 Berlin, email : [email protected]
82
Poster V 7
Rekombinantes Modifiziertes Vaccinia Virus Ankara (MVA)
als Impfstoff gegen H5N1-Infektionen im Frettchen
1
1
1
1
1
1
1
Holznagel, E. ; Suezer, Y. ; Yutzy, B. ; Kruip, C. ; Alex, N. ; Wagner, R. ; Plesker, R. ;
2
1,3
1
Mettenleitner, T. ; Sutter, G. and Löwer, J.
1
2
3
Paul-Ehrlich-Institut, Langen (Hessen); Friedrich-Löffler-Institut, Riems; Ludwig-MaximillianUniversität, München
Hoch pathogene aviäre Influenza Viren (HPAI) des Subtyps H5N1 sind weltweit für eine
wachsende Anzahl von Infektionen beim Menschen verantwortlich. Angesichts der Gefahr einer
Vogelgrippe-Pandemie mit H5N1-Viren sollten sichere und effektive Impfstoffe schnellstmöglich
verfügbar sein. Mit einem rekombinanten modifizierten Vaccinia Virus Ankara (MVA), welches
das Hämagglutinin-(HA)-Gen eines H5N1-Viruses (MVA-HA-VN/04) exprimiert, konnten wir
bereits Schutzwirkungen gegen homologe sowie heterologe H5N1-Infektionen in Mäusen und
Makaken nachweisen (Kreijtz et al. JID 2007; Kreijtz et al. JID 2009). Das Frettchen (Mustela
putorius furo) stellt in der Influenza-Forschung das Tiermodell der Wahl dar. Es ermöglicht die
Beurteilung des Pathogenitäts-Potenzials verschiedenster Influenza-Viren für den Menschen.
Wir haben deshalb den MVA-HA-VN/04 Impfstoff-Kandidaten auch in diesem Tiermodell
getestet.
Es wurden jeweils 10 Frettchen mit MVA-HA-VN/04, PBS oder MVAwt (zweimal im Abstand von
vier Wochen) intramuskulär immunisiert. Der Impferfolg wurde mittels Serokonversion
festgestellt. Nach weiteren vier Wochen wurden jeweils 5 Tiere aus den einzelnen Gruppen
MVA-HA, PBS und MVAwt mit dem A/Thailand/1(KAN-1)/2004 Isolat bzw. mit dem
A/Germany/R606/2006 Isolat intranasal mit einer Dosis von jeweils 106 EID50 infiziert.
Vier Tage nach Inokulation wurden alle Tiere euthanasiert.
Der klinische Verlauf wurde auf der Basis einer standardisierten Punkte-Skala
(Körpertemperatur, Körpergewicht, Symptome) dokumentiert. Postmortal wurden
histopathologische Organläsionsprofile erstellt. Die klinische Symptomatik verlief bei allen
ungeimpften Frettchen (PBS) unabhängig vom verwendeten Isolat überwiegend mild:
interstitielle Pneumonien fanden sich nur in 3/5 (Isolat R606) bzw. 2/5 (Isolat Kan-1) der
infizierten Frettchen. Die verwendete Standard-Infektionsdosis von 106 EID50 wurde nachfolgend
als Low-dose Challenge eingestuft. Spätere in vivo-Titrationsstudien zeigten, dass man z.B. mit
einem Inokulum von >107 EID50 R606 bei 5/5 Tieren interstitielle Pneumonien bzw. einen
schweren Krankheitsverlauf auslösen kann. Die fehlenden Krankheitsfälle in den geimpften
Gruppen sind auf Grund der geringen Gruppenunterschiede statistisch nicht signifikant, deuten
aber darauf hin, dass diese Form der Impfung auch im Frettchenmodell Schutzwirkung erzielt.
Kontakt:
83
Poster V 8
Präklinische Evaluierung eines neuartigen Impfstoffes gegen
Influenza A/H5N1 basierend auf dem Modifizierten Vaccinia
Virus Ankara (MVA)
1
2
1
1
1
2
Kreijtz, J. ; Suezer, Y. ; Mutsert, G. ; van den Brand, J. ; van Amerongen, G. ; Schnierle, B. ;
1
1
2
1
2,3
1
Kuiken, T. ; Fouchier, R. ; Löwer, J. ; Osterhaus, A. ; Sutter, G. and Rimmelzwaan, G.
1
2
3
Erasmus Universität, Rotterdam; Paul-Ehrlich-Institut, Langen (Hessen); Ludwig-MaximilliansUniversiät, München
Hoch pathogene aviäre Influenza Viren (HPAI) des Subtyps H5N1 besitzen eine Letalität von
über 60%. Seit 2003 wird eine immer höher werdende Rate an Infektionen beim Menschen
gemeldet, wodurch die Gefahr einer pandemischen Ausbreitung steigt. Angesichts dieser
Gefahr ist ein sicherer und effektiver Impfstoff, welcher schnell verfügbar ist, wünschenswert.
Das Modifizierte Vaccinia Virus Ankara (MVA), welches das Hämagglutinin-Gen (HA) eines
Influenza A-Virus des H5N1 Subtyps exprimiert, stellt einen vielversprechenden ImpfstoffKandidat dar. Seine protektive Schutzwirkung gegen homologe und heterologe H5N1Infektionen wurde bereits in Mäusen gezeigt (Kreijtz et al. JID 2007). Hier haben wir nun einen
rekombinanten MVA-Impfstoff, welcher das HA des Influenza A/H5N1 Virus A/Vietnam/1194/04
(MVA-HA-VN/04) exprimiert, in Affen getestet. Zur Beurteilung der Schutzwirkung dieses
neuartigen Impfstoffes wurden Javaneraffen (Macaca fascicularis) zweimal im Abstand von vier
Wochen geimpft und anschließend mit Influenza Virus A/Vietnam/1194/04 (clade 1) oder
A/Indonesia/5/05 (clade 2.1) infiziert. Die Vakzinierung mit MVA-HA-VN/04 induzierte kreuzreaktive Antikörper, verhinderte die Virus-Replikation im oberen und unteren Respirationstrakt
sowie die Entwicklung einer schweren nekrotisierenden broncho-intestinalen Pneumonie.
Folglich stellt MVA-HA-VN/04 einen vielversprechenden Impfstoff-Kandidaten für die Induktion
einer protektiven Immunität gegen HPAI des Subtyps H5N1 dar, der die Fähigkeit zur Protektion
auch gegen H5N1-Viren unterschiedlicher Clades aufweist.
Kontakt:
Sutter, Gerd; Ludwig-Maximillians-Universiät, [email protected]
84
Poster V 9
Pilotstudie zum Einsatz kommerziell erhältlicher AIV H5Impfstoffe in Geflügelhaltungen unter Feldbedingungen (FSI
1.2-2)
1
2
3
4
1
Miriam Rudolf , M. Pöppel , A. Fröhlich , T. Mettenleiter , M. Beer , T. Harder
1
1
OIE und Nationales Referenzlabor für Aviäre Influenza, Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler2
3
Institut, Greifswald-Insel Riems, Germany; Tierarztpraxis, Delbrück, Germany; Institut für
Epidemiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Wusterhausen, Germany;
4
Institut für Molekularbiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems, Germany
Ein flächendeckender Einsatz von Impfungen des Geflügels gegen das Geflügelpestvirus H5N1 ist
umstritten, da insbesondere aus dem Felde nur wenige Daten zu den Erfolgsaussichten vorliegen.
Gegenstand der Studie war es, den Aufwand und die Effektivität einer Impfung mit einer konventionellen,
lizensierten Vakzine zum Schutz gegen Geflügelpest des Subtyps H5 (HPAIV H5) unter Feldbedingungen
in kommerziell betriebenen Geflügelbetrieben dreier Nutzungsrichtungen zu bewerten. Die Belastbarkeit
der induzierten Immunität wurde in Infektionsversuchen auf der Insel Riems mit einem hochpathogenen
H5N1 Geflügelpestvirus geprüft.
Die Immunisierung von Legehennen induzierte zwar einen klinischen Schutz, jedoch keine sterile
Immunität, so dass auch geimpfte, gesund erscheinende Hennen nach Belastung mit HPAIV H5N1 das
Virus auf ungeimpfte und geimpfte Kontakttiere übertragen konnten, allerdings mit erheblich verminderter
Effizienz infolge reduzierter Virusaus-scheidung. Mindestens halbjährliche Auffrischungsimpfungen waren
erforderlich, um den klinischen Schutz der Hühner zu sichern. Dennoch traten vereinzelt Todesfälle
infolge bakterieller Infektionen bei korrekt geimpften Legehennen nach Belastung mit dem HPAIV H5N1
auf: Offenbar kam es zu einer ungünstigen Beeinflussung des Verlaufs der HPAIV Belastungsinfektion,
wenn gleichzeitig opportunistische Infektionen anderer Genese (z.B. E. coli) bestanden. Gänse waren
bereits nach der ersten Impfung vor Erkrankung geschützt, schieden jedoch auch nach abgeschlossener
Grundimmunisierung HPAIV H5N1 aus und konnten ungeimpfte Kontakttiere infizieren. Dagegen war die
Übertragung auf geimpfte Kontakttiere nahezu vollständig unterbunden. Geimpfte, allerdings auch
ungeimpfte adulte Enten erkrankten in den Belastungsversuchen nicht und schieden nur unregelmäßig
Virus aus. Es konnte jedoch eine Serokonversion der geimpften, inokulierten Tiere und auch bei deren
Kontakttieren nachgewiesen werden, so dass eine geringgradige Viruszirkulation in geimpften
Entenbeständen nicht vollständig ausgeschlossen werden konnte.
In Hühnervögelbeständen, jedoch in der Regel nicht in Wassergeflügelhaltungen, ist der Einbruch
eines Geflügelpestvirus mit einem raschen Anstieg der Sterblichkeit verbunden. Dies kann im Rahmen
der „Syndrom-Surveillance“ als universelles Frühwarnsystem eines HPAIV Ausbruchs genutzt werden.
Bei geimpften, klinisch geschützten Hühnern und Puten wäre eine Syndrom-Surveillance nicht mehr
durchführbar. Gleichzeitig aber konnte die Verbreitung von Feldvirus im geimpften Legehennenbestand
nicht sicher verhindert werden. Hieraus ergibt sich die Gefahr, dass in solchen Beständen HPAIV
unerkannt zirkulieren und verbreitet werden kann. Daher wird die Impfung von Hühnergeflügel weiterhin
als kritisch angesehen. Von HPAIV exponierten, geimpften Wassergeflügelbeständen mit homogener
Immunität würde dieser Studie nach dagegen vermutlich keine Gefahr einer weiteren Verschleppung von
HPAIV ausgehen. Eine Vakzinierung größeren Maßstabs bei Wassergeflügel erscheint hiernach sinnvoll,
wenn ein entsprechend großes Gefährdungspotenzial, also ein hoher Infektionsdruck bestünde. Hierdurch
würde das Risiko unerkannter endemischer Infektionen sowie der Virusverbreitung gesenkt werden.
Wenn gleichzeitig hochempfängliche Hühnervögelbestände von Vakzinierungskampagnen ausgespart
würden, bliebe deren wichtige klinische Frühwarnfunktion erhalten.
Kontakt:
85
Poster V 10
Wirksamkeit von mRNA-basierenden Vakzinen gegen letale
Influenza A Infektion in Mäusen
1
2
2
2
2
1
Petsch B. * , Schnee M. *, Neumann K. , Kallen K-J. , Kramps T. und Stitz L. .
(* gleichberechtigte Autoren)
1
,2
Institut für Immunologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Tübingen CureVac GmbH, Tübingen.
Das Influenza A Virus ist eine weltweite Bedrohung für die öffentliche Gesundheit. Gleichzeitig
ist die Impfung gegen diesen Erreger, aufgrund antigenischer Variabilität, schwierig. Angesichts
des pandemischen Potentials der Grippe, werden verbesserte Methoden zur schnelleren und
flexibleren Herstellung geeigneter Vakzine, aber auch grundlegend neue Ansätze zur Induktion
eines breiten Schutzes dringend benötigt. Messenger RNA (mRNA) Vakzine haben gegenüber
herkömmlichen Ansätzen wesentliche konzeptionelle Vorteile: sie können schnell und flexibel
angepasst und produziert werden und sind, nach geeigneter Formulierung, bei Raumtemperatur
stabil.
Wir zeigen die Eignung eines proprietären RNA Vakzinformats (basierend auf der RNActive®
Technologie) zur Immunisierung gegen Influenza-Infektionen bei Mäusen. Dazu wurden Tiere
nach Impfung mit Hämagglutinin-kodierender RNA Vakzine mit zehnfacher mittlerer letaler Dosis
(LD50) des homologen Virus infiziert. Spezifisch immunisierte Tiere waren, im Gegensatz zu
Kontrollgruppen, vollständig geschützt. Schutz konnte darüber hinaus bereits durch einmalige
Dosisgabe erzielt werden und war nach zweimaliger Gabe über ein Jahr stabil. Nachfolgende
Experimente belegten die Übertragbarkeit des Ansatzes auf weitere Influenza Antigene
(Neuraminidase, Matrix- und Nukleoprotein) und Virusstämme (Neue Influenza A H1N1, H5N1).
Die Schutzwirkung konservierter Antigene (insbesondere Matrix- und Nukleoprotein) legt die
prinzipielle Machbarkeit einer RNA Vakzine zur Immunisierung gegen eine Vielzahl von
Influenzastämmen nahe. RNA Vakzine stellen somit eine neuartige, vielversprechende und
schnell anpassbare Technologie für einen effizienten Schutz vor Infektionskrankheiten dar.
Kontakt:
Stitz, Lothar; Institut für Immunologie, Friedrich-Loeffler-Institut, [email protected]
Kramps, Thomas; CureVac GmbH, [email protected]
86
Poster V 11
Inaktivierbarkeit von Influenzaviren im Zusammenhang mit
der Virussicherheit von Plasmaprodukten
1
1
1
1
Möller, P. ; Göpfert, C. ; Wagner, R. ; Blümel J.
1
Paul-Ehrlich-Institut, 63225 Langen
Einleitung: Ungeachtet der gegenwärtigen Bedrohung durch potenziell pandemische
Influenzaviren wird Spenderblut keiner influenzaspezifischen Testung unterzogen. Allerdings
wird bei der Produktion von Medikamenten aus gepooltem Humanplasma routinemäßig eine
Behandlung mit Lösungsmittels/Detergenzien („SD treatment“: solvent detergent) durchgeführt,
um etwaig vorhandene Viruskontaminationen zu inaktivieren. Vor diesem Hintergrund wollten
wir die Inaktivierungskapazität gängiger SD-Verfahren gegenüber verschiedenen
Influenzaisolaten (Subtypen H1N1, H5N1, H6N1, H7N1, H9N2) untersuchen, um die
Virussicherheit dieser Produkte besser einschätzen zu können.
Ergebnisse: Alle drei getesteten SD-Verfahren bewirkten eine effektive Inaktivierung von in
Zellkultur angezüchteten Viren. Eine schnelle und vollständige Inaktivierung von auf
Hühnereiern vermehrten Viren wurde bei Verwendung von Tri-n-butyl phosphate (TNBP) in
Kombination mit Triton x-100 beobachtet. Allerdings war bei Verwendung einer Kombination aus
TNBP mit Tween 80 oder Natriumdeoxycholat die Inaktivierungskinetik bei Ei-gewachsenen
H5N1- und H7N1-Isolaten deutlich verzögert und weniger effizient. Durch parallele Versuche mit
hoch gereinigten in Hühnereiern angezogenen H7N1 Virus-präparationen konnten wir zeigen,
dass die Anwesenheit von Fremdproteinen und Lipiden aus der Allantoisflüssigkeit einen
signifikanten Einfluss auf die Inaktivierungskapazität der verwendeten SD-Verfahren hat. Dies
zeigt deutlich, dass der Einfluss von Protein- und/oder Lipidverunreinigungen bei der
Entwicklung geeigneter Inaktivierungsverfahren genau geprüft und berücksichtigt werden muss.
Kontakt: Wagner, Ralf, Paul-Ehrlich-Institut, [email protected]
87
Poster V 12
Optimierung der Wirksamkeitsbestimmung von
Influenzaimpfstoffen mittels serologischer Methoden
1
1
1
1
1
1
Wagner, R. ; Göpfert, C. ; Hammann, J. ; Neumann, B. ; Alex, N. ; Erfurth, C.
1
Paul-Ehrlich-Institut, 63225 Langen
Dieses äußerst wichtige Feld angewandter Forschung des PEI ist eng verknüpft mit den
Zulassungsaufgaben des Instituts in Kooperation mit der europäischen Arzneimittelbehörde
(EMEA). So trat im Rahmen der Verfahren für die Musterzulassungen der pandemischen H5N1Impfstoffe („Vogelgrippe“) klar zutage, dass die Genauigkeit und der Grad der Standardisierung
der zur Wirksamkeitsbestimmung eingesetzten serologischen Tests äußerst unzureichend sind.
Daher wurden die drei klassischen serologischen Wirksamkeitstest - dies sind der
Hämagglutinationshemmtest (HI), der Neutralisationstest (NT) und der Hämolysetest (SRH) am Institut etabliert und Anstrengungen zur Verbesserung der Standardisierung unternommen.
Die Ergebnisse dieser Arbeiten konnten bereits erfolgreich im Rahmen der Teilnahme des PEI
an einer europäischen Ringstudie der EDQM („European Directorate for the Quality of
Medicines“) zur Ermittlung der Standardisierbarkeit der Methoden und Vergleichbarkeit der
Ergebnisse verschiedener Labore eingebracht werden. Durch Testung einer großen Anzahl von
Seren aus klinischen Studien konnten jüngst wichtige Erkenntnisse zum bestehenden
Immunstatus in der Bevölkerung gegen die neue pandemische H1N1-Influenza und die durch
saisonale Impfung erreichbare Kreuzreaktivität gewonnen werden. Diese Daten sind von
zentraler Bedeutung für die Entwicklung von spezifischen Impfschemata für verschiedene
Altersgruppen. Die in diesen Untersuchungen erworbene umfangreiche serologische Expertise
gestattet es dem PEI mittlerweile als eines von zwei von der EMEA benannten europäischen
„Zentral-Laboren“ („Central lab“) zu agieren. Diese Labore sollen einen Teil der von den
Impfstoffherstellern im Rahmen von klinischen Studien gewonnen Patientenseren gegen-testen,
um potenzielle Schwachstellen bei der Bestimmung der Impfstoff-Wirksamkeit zu identifizieren
und auszuräumen. Die etablierte serologische Methodik ist darüber hinaus auch von zentraler
Bedeutung für die gegenwärtig durchgeführten Frettchenstudien zur Ermittlung des Einflusses
neuartiger Adjuvanzien auf die Wirksamkeit pandemischer H1N1-Impfstoffen. Das PEI stellt die
für diese Untersuchungen benötigten Versuchstiere aus der hauseigenen Frettchenzucht zur
Verfügung.
Kontakt: Wagner, Ralf, Paul-Ehrlich-Institut, [email protected]
88
Poster V 13
An der Schnittstelle von Zulassung und Forschung:
Untersuchungen zur Wirksamkeitsbestimmung von
Influenzaimpfstoffen
1
1
1
2
1
1
Göpfert, C. ; Hammann, J. ; Neumann, B. ; Erfurth, C. ; Alex, N. ; Wagner, R.
1
2
Paul-Ehrlich-Institut, Langen; Philipps-Universität Marburg, Marburg
Influenza Impfstoffe werden in der EU auf Grund der Bewertung der Qualität der Herstellung und
der Bewertung der klinischen Daten zugelassen. In klinischen Studien werden die Sicherheit
und die Wirksamkeit der Impfstoffe untersucht. Da für Influenza Impfstoffe klinische
Wirksamkeitsstudien nicht möglich sind, werden anti-Hämagglutinin (HA) Antikörper als
serologische Korrelate der Immunität mittels Hämagglutinationshemmtest (HAT) oder einfacher
radialer Hämolyse (SRH) gemessen.
Die Stammzusammensetzung der saisonalen Influenza Impfstoffe wird jährlich an die aktuell
zirkulierenden Stämme angepasst und es werden jährlich klinische Studien zur Bewertung der
Immunogenität der Impfstoffe durchgeführt. Für präpandemische und pandemische Impfstoffe
werden diese serologischen Korrelate der Immunität ebenfalls zur Bewertung der Impfstoffe
herangezogen. Zusätzlich zum HAT oder SRH Test ist für die Bewertung der Wirksamkeit
pandemischer Impfstoffe ein Virusneutralisationstest erforderlich.
Das Ziel des FSI Teilprojektes IV.1c ist die Weiterentwicklung und bestmögliche
Standardisierung des klassischen HAT und die Etablierung des Mikroneutralisationstests (MNT)
zur Wirksamkeitsbestimmung von Influenzaimpfstoffen. Dabei sollen die Zuverlässigkeit und die
Aussagekraft der Tests verbessert und miteinander verglichen werden.
Im Rahmen des FSI wurde der klassische HAT und der MNT etabliert. Für Untersuchungen zur
Verbesserung der HAT Methodik wurde die Verwendung von Erythrozyten verschiedener
Spezies (Huhn, Truthahn, Meerschweinchen, Pferd), die Verwendung verschiedener Antigene
(Wildtyp Influenza Isolate und Reassortanten aus dem embryonierten Hühnerei oder aus
Zellkultur) und verschiedener Referenzseren bzw. interner Standards getestet und deren
Einfluss auf die Aussagekraft des Tests untersucht. Die Verwendung verschiedener Antigene
und Referenzseren bzw. interner Standards wurde auch im MNT untersucht. Beide Tests
werden nach Abschluss der Untersuchungen formal validiert.
Erfahrungen haben gezeigt, dass unterschiedliche serologische Ergebnisse zwischen Laboren
die Bewertung der Wirksamkeit von Impfstoffen beeinflussen. Aus diesem Grund hat das PaulEhrlich-Institut an einem europäischen Ringversuch zur Standardisierung des HAT und SRH
Tests teilgenommen. Ziel ist es, zur Bewertung der Wirksamkeit von Influenza Impfstoffen neue
Erkenntnisse an der Schnittstelle von Zulassung und Forschung zu gewinnen.
Kontakt:
Göpfert, Constanze; Paul-Ehrlich-Institut, [email protected]
89
Poster V 14
Effiziente Universalklonierung von Influenzavirusgenen für
schnelle Etablierung von Systemen der reversen Genetik
Kreibich, A.; Stech, O.; Bogs, J.; Gohrbandt, S.; Hundt, J.; Weber, S.; Mettenleiter, T. C.; Stech, J.
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Molekularbiologie, 17493 Greifswald – Insel Riems
Die reverse Genetik von Influenza-A-Viren ist zum unverzichtbaren Werkzeug in
Grundlagenforschung und Impfstoffentwicklung geworden. Revers-genetische Systeme
ermöglichen die gezielte Herstellung massgeschneiderter rekombinanter Viren durch
Kotransfektion von Plasmiden, die die cDNA aller acht Gensegmente enthalten. Wir stellen hier
eine schnelle und universelle Klonierungsmethode für Influenza-A-Viren vor, die unabhängig von
Restriktionsschnittstellen und DNA-Ligation ist.
In den verwendeten Plasmidvektor pHW2000 wurde der für bestimmte E. coli-Laborstämme
letale Selektionsmarker ccdB flankiert von den beiden Influenza-Gensegment-Enden eingeführt.
Diese Termini sind bei allen Gensegmenten aller Influenza-A-Stämme hochkonserviert und
bleiben während der Klonierung unverändert. Dies erlaubt den Einsatz kürzerer PCR-Primer,
was die Synthese großer Mengen an Insert ermöglicht. Die Verwendung des letalen ccdB-Gens
selektiert gegen den unmodifizierten Ausgangsvektor nach Transformation in kompetente
Bakterien. Das resultierende Plasmid pHWSccdB wird zusammen mit dem gereinigten PCRProdukt des Virusgens in einer modifizierten Quikchange™-Reaktion eingesetzt. Die beiden
Stränge des PCR-Produktes dienen dabei als Megaprimer und hybridisieren mittels ihrem 3‘Ende mit der entsprechenden Bindungsstelle im Plasmidvektor. Sie werden dann durch Anbau
weiterer Nukleotide verlängert. Dabei entstehen relaxierte zirkuläre Moleküle mit Strangbrüchen
(target-primed plasmid amplification).
Für weitere Reduktion der notwendigen PCR haben wir ein Primerpaar mit verkürzten 3’-Enden
konstruiert. Dieses Primerpaar ermöglicht es, die Anzahl der notwendigen acht PCR-Reaktionen
für die Herstellung von Inserts für jedes Gensegment zu beschränken, da die HA-, NA-, NP-, Mund NS-Gene parallel in voller Länge amplifiziert und dann aufgrund ihrer unterschiedlichen
Größe in der Gelelektrophorese aufgetrennt werden können. Darüber hinaus ist im Gegensatz
zur etablierten PCR für die universelle Amplifikation von Influenzavirusgenen mit diesem
Primerpaar die vollständige Amplifikation von NA-Genen aller neun Serotypen möglich.
Mit dieser Methode konnten wir komplette funktionelle Plasmidsätze der acht Gensegmente von
zwölf Influenza-A-Viren herstellen. Zusammenfassend kann man sagen, dass dieser Ansatz
eine schnelle und verlässliche Klonierung jedes Segments eines beliebigen Influenza-A-Virus
ohne Kenntnis der Sequenzen ermöglicht.
Kontakt:
Kreibich, Anne; Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Molekularbiologie, [email protected]
90
Poster V 15
Vergleichende Untersuchungen zur OseltamivirEmpfindlichkeit von Influenzavirus A/swine/Potsdam/15/81 in
vitro, in der Maus und im Schwein
a
b
a
a
a
b
a
Topf, D. , Dürrwald, R. , Bauer, K. , Braun, H. , Richter, M. , Schlegel, M. , Wutzler, P. , Schmidtke,
a
M.
a
Institut für Virologie und Antivirale Therapie, Universitätsklinikum Jena, Hans-Knoell-Straße 2, 07745
b
Jena, Abteilung Forschung und Entwicklung, IDT Biologika GmbH, Dessau-Roßlau, Am Pharmapark 1,
06861, Germany
Wie das Beispiel des derzeitig zirkulierenden pandemischen Influenza-A-Virus (FLUAV) vom
Subtyp H1N1 zeigt, können Gensegmente von porzinen Influenzaviren im Ergebnis einer
Reassortierung zum Bestandteil humanpathogener Viren werden. Im konkreten Fall stammen
die Genomsegmente 6 und 7 von europäischen porzinen FLUAV. Sie kodieren Targetproteine
für vorhandene Grippemedikamente, den Ionenkanal M2 und die Neuraminidase. Bisher
existieren kaum Daten zur Empfindlichkeit europäischer porziner FLUAV gegenüber
Neuraminidasehemmern. Das Teilprojekt 10.3 des FluResearchNet soll u.a. dazu beitragen,
diese Lücke zu schließen. Ein Ziel bestand darin, die Oseltamivir-Empfindlichkeit des in
Deutschland isolierten Influenzavirus A/swine/Potsdam/15/81 in vitro, in der Maus und im
Schwein zu vergleichen.
Das Isolat A/swine/Potsdam/15/81 erwies sich in einem Chemilumineszenz-basierten NAHemmtest als sehr Oseltamivir-empfindlich (50%ige NA-Hemmkonzentration: 0.24 nM).
Oseltamivir hemmte zudem im nanomolaren Konzentrationsbereich die Virus-induzierte
Plaquebildung, den Virusertrag und die Virusausbreitung in MDCK-Zellen.
Die gute Oseltamivir-Empfindlichkeit dieses Isolates bestätigte sich auch in vivo. Placebobehandelte weibliche BALB/c-Mäuse erkrankten ca. 2 Tage nach Infektion mit
A/swine/Potsdam/15/81 (105 TCID50/20 µl/Maus) und verloren bis zu 35 % ihres
Körpergewichts. Bei 40 % der Mäuse führte die Infektion nach 9-12 Tagen zum Tod. Die
überlebenden Tiere gesundeten bis zum Tag 17 p.i. Als Folge der Virusreplikation ließ sich zum
21. Tag p.i. in der Lunge eine starke Entzündungsreaktion beobachten, die mit einer deutlichen
Erhöhung des Lungengewichts einherging. Die Oseltamivirbehandlung infizierter Mäuse (5
mg/kg, 2 x täglich; an 5 aufeinander folgenden Tagen) verhinderte die Letalität, verkürzte die
Krankheitsdauer um 3 Tage und reduzierte signifikant die klinischen Anzeichen der Erkrankung.
Außerdem führte die Gabe des Virustatikums zu einem signifikant niedrigeren
Körpergewichtsverlust und histopathologischen Grad der Lunge.
Das klinische Bild der Erkrankung im Schwein ähnelt stark der Grippe beim Menschen. In
A/swine/Potsdam/15/81-infizierten Schweinen verhinderte die Gabe von Oseltamivir (78 mg/kg,
2 x täglich, an 5 aufeinander folgenden Tagen) komplett die in den Placebo-behandelten Tieren
beobachtete Klinik und das damit einhergehende Fieber am Tag 1-2 p.i. Die Virusausscheidung
war ebenfalls signifikant reduziert. Zudem kam es zu einer signifikanten Reduktion der
Lungenentzündung.
Insgesamt lässt sich feststellen, dass Oseltamivir sehr gut in vitro sowie in vivo gegen das Isolat
A/swine/Potsdam/15/81 wirkt und die etablierten Modelle sich für Untersuchungen neuer
potenzieller Virustatika eignen.
Kontakt:
Topf, Dominik, Institut für Virologie und Antivirale Therapie, Universitätsklinikum Jena,
[email protected]
91
Poster V 16
Low dose interferon type I treatment was effective against
H5N1 and swine-origin H1N1 influenza A viruses in vitro and
in vivo
1;
1
1
1
2
Planz, O. , Droebner, K. ; Vogel, A. ; Haasbach, E. Cummins, J.
1
Friedrich-Loeffler Institut; Institute of Immunology, Paul-Ehrlich Str. 28 D-72076 Tübingen, Germany;
Amarillo Bioscience, Texas U.S.A.
2
Highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5N1 virus infection leads to high lethality in mammals
as a result of extensive alveolar immune inflammatory infiltrates causing tissue damage that
compromises lung function. Additionally, H1N1 viruses are a major topic of human health care
especially after the current pandemic caused by the new emerging swine-origin influenza virus
(S-OIV). The innate immune response to influenza A viruses initially involves the production of
type I and type II interferons (IFN). Innate cytokine responses, such as interferon alpha and beta
(IFN-α/β) play a crucial role in determining the rate of virus replication in the initial stage of the
infection and in shaping the initial inflammatory and downstream adaptive immune responses.
The fact that there is an urgent need for new antivirals against influenza virus and that type I IFN
is already in clinical use raise the question whether IFN type I treatment would be suitable
against influenza virus infection.
In our study we examined the effect of IFN alpha on the replication of HPAI H5N1 and S-OI virus
in vitro and in vivo after IFN-α treatment. Therefore, we treated mice intranasaly (i.n.) with low
dose IFN-α (1000 units) during virus infection. A single pretreatment reduces progeny virus titer
in the lung up to 1.4 log units. The antiviral effect against H5N1 was increased up to 2 log units
after multiple pretreatment. Survival analyses showed that IFN-α treatment protected mice
against a lethal H5N1 influenza virus infection. Furthermore, we determined reduction of S-OIV
titers in vitro and in vivo. The amount of IFN-α used caused no toxicological findings in the
spleen or liver.
Our data gave rise to the assumption that oral IFN type I treatment leads to the induction of
antiviral cytokines that might be involved in the reduction of H5N1 and S-OIV titer in the lung.
This assumption is supported by a clinical study that was recently performed in Australia.
Kontakt:
Prof. Dr. Planz, Oliver; Friedrich-Loeffler-Institut, Tübingen, [email protected]
92
93
Teilnehmerverzeichnis
(Stand 10.11.2009)
Forsc h ungs-Sofor tprogr amm Influen z a
Abbas, Tariq
Friedrich-Loeffler-Institut,
Institut für Epidemiologie,
Wusterhausen
[email protected]
Abt, Dr. Marion
[email protected]
Alpers, Dr. Katharina
[email protected]
Beer, PD Dr. Martin
Insel Riems
[email protected]
Biere, Dr. Barbara
[email protected]
Bogs, Jessica
Insel Riems
[email protected]
Breithaupt, Angele
Insel Riems
[email protected]
Buchholz, Dr. Udo
[email protected]
Claus, Dr. Hermann
[email protected]
Dauber, Dr. Malte
Institut für Virusdiagnostik,
Insel Riems
[email protected]
Deckers, Daniela
Institut für
Infektionsmedizin, Insel
Riems
[email protected]
Dettmann, Marleen
[email protected]
Duwe, Dr. Susanne
[email protected]
Fereidouni, Dr. Sasan
Insel Riems
[email protected]
Globig, Dr. Anja
Insel Riems
[email protected]
94
Gohrbandt, Sandra
Insel Riems
[email protected]
Göpfert, Dr. Constanze
Paul-Ehrlich-Institut
[email protected]
Grund, Dr. Christian
Insel Riems
[email protected]
Hähnel, Juliane
Insel Riems
[email protected]
Hoffmann, Dr. Bernd
Insel Riems
[email protected]
Holznagel, Dr. Edgar
[email protected]
Höper, Dr Dirk
Insel Riems
[email protected]
Hundt, Jana
Insel Riems
[email protected]
Kalthoff, Dr. Donata
Insel Riems
[email protected]
Karger, Dr. Axel
Insel Riems
[email protected]
Kreibich, Anne
Institut für
Molekularbiologie, Insel
Riems
[email protected]
Kühn, Dr. Katrin
Insel Riems
[email protected]
Kurth, Prof. Dr. Reinhard
[email protected]
Letzel, Tobias
Insel Riems
[email protected]
Mathey, Alexander
Wusterhausen
[email protected]
Matthaei, Markus
[email protected]
95
Neubauer, Dr. Katrin
[email protected]
Norley, Dr. Stephen
Robert Koch-Institute
[email protected]
Pavlova, Sophia
Insel Riems
[email protected]
Postel, Dr. Alexander
Insel Riems
[email protected]
Petsch, Dr. Benjamin
Institut für Immunologie,
Tübingen
[email protected]
Römer-Oberdörfer, Dr. Angela
Insel Riems
[email protected]
Schoene, Dr. med. vet. Claudia Friedrich-Loeffler-Institut,
Wusterhausen
[email protected]
Schulze, Dip Ing Martin
[email protected]
Schwantes, Dr. Astrid
[email protected]
Schweiger, Dr. Brunhilde
[email protected]
Sipo, Dr. Isaac
[email protected]
Starick, Elke
Insel Riems
[email protected]
Stech, Dr. Jürgen
Insel Riems
[email protected]
Stech, Dr. Olga
Insel Riems
[email protected]
Stitz, Prof. Dr. Lothar
Institut für Immunologie,
Tübingen
[email protected]
Süzer, Dr. Yasemin
[email protected]
Vahlenkamp, PD Dr. Thomas
Insel Riems
[email protected]
Veits, Dr. Jutta
Insel Riems
[email protected]
96
Wagner, Marianne
Bundesanstalt für
Landwirtschaft und
Ernährung
[email protected]
Wedde, Marianne
[email protected]
Wildner, Judith
[email protected]
Wolff, Dr. Thorsten
[email protected]
Yutzy, Barbara
[email protected]
Zielecki, Florian
[email protected]
Bahgat, Dr. Mahmoud
Helmholtz Zentrum für
Infektionsforschung
[email protected]
Bohm, Maren
Tierärztliche Hochschule
Hannover, Institut für
Virologie
[email protected]
Börgeling, Yvonne
Universität Münster,
Institut für Molekulare
Virologie, ZMBE
[email protected]
Diederichs, Meike
Virologie
[email protected]
Dürrwald, Dr. Ralf
IDT Biologika GmbH
[email protected]
Friesenhagen, Judith
Institut für Immunologie
Münster
[email protected]
Herold, Dr. Susanne
Universität Gießen,
Department of Internal
Medicine II
[email protected]
Herrler, Prof. Dr. Georg
Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover
[email protected]
Hrincius, Eike-Roman
Virologie
[email protected]
FluR ese ar c h N e t
97
Kopp, Dr. Ursula
DLR-Projektträger
Gesundheitsforschung
[email protected]
Kothlow, Dr. Sonja
LMU München,
Institut für Tierphysiologie
[email protected]
Mänz, Benjamin
Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Hygiene,
Universität Freiburg
[email protected]
Nedelko, Dr. Tatiana
Infektionsforschung
[email protected]
Petersen, Henning
Hannover, Klinik für
Geflügel
[email protected]
Philipps, Anja
Institut für Virologie und
Antivirale Therapie
[email protected]
Planz, Prof. Dr. Oliver
Friedrich-Loeffler-Institut
Tübingen
[email protected]
Pleschka, Prof. Dr. Stephan
Universität Gießen,
Virologie
[email protected]
Punyadarsaniya, Darsaniya
Hannover
[email protected]
Rautenschlein, Prof. Silke
Hannover, Klinik für
Gefllügel
[email protected]
Reuter, Antje
Universität Freiburg
[email protected]
Roth, Prof. Dr. Johannes
Institut für Immunologie
[email protected]
Sauer, Anne-Kathrin
Virologie
[email protected]
Schmidtke, PD Dr. Michaela
Universitätsklinikum Jena,
Insititut für Virologie und
Antivirale Therapie
[email protected]
98
Schughart, Prof. Dr. Klaus
Helmholtz-Zentrum für
Infektionsforschung
[email protected]
Schusser, Benjamin
LMU München,
Tierärztliche Fakultät
[email protected]
Schwemmle, Prof. Martin
Universität Freiburg,
Institut für medizinische
Mikrobiologie und Hygiene
[email protected]
Srivastava, Barkha
Infektionsforschung
Universität Freiburg,
Virologie
[email protected]
Topf, Dominik
Universitätsklinikum Jena,
Institut für Virologie und
antivirale Therapie
[email protected]
Viegas, Dr. Nuno
Infektionsforschung
[email protected]
Wang, Zhongfang
Virologie
[email protected]
Weinheimer, Viola
[email protected]
Wilk, PhD Esther
Infektionsforschung
[email protected]
Zell, PD Dr. Roland
Universitätsklinikum Jena
[email protected]
Staeheli, Prof. Peter
[email protected]
Org a nisa tion und wissensc h a f tli c h e L ei tu n g:
Hacker, Prof. Dr. Jörg
Kurth, Prof. Dr. Reinhard
Löwer, Prof. Dr. Johannes
Ludwig, Prof. Dr. Stephan
Virologie
Mettenleiter, Prof. Dr. Thomas
Insel Riems
99
Semmler, Dr. Ilia
Nationale
Forschungsplattform für
Zoonosen c/o TMF e.V.
Wolff, Dr. Thorsten
100

Nationales Symposium zur Influenzaforschung in Deutschland 2009

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