docAnalysmetoder-allmankemi
download 
Report Transcription
Analysmetoder-allmankemi
Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkällor Sten-Erik Bäck Klinisk kemi Labmedicin Skåne Analyser inom allmänkemi • Beställs ofta • Har kort analystid • Analyseras utan föregående upparbetning (utfällning, extraktion etc.) • Baseras på spektrofotometri eller jonselektiv mätning • Analyseras på samma plattform • Använder färdigköpta reagens • Utförs i plasma/serum Metodprinciper inom allmänkemi P-ALAT Enzym P-ALP Enzym P-Ammonium Enzymreagens P-Apolipoprotein A1 Immunturbidimetri P-Apolipoprotein B Immunturbidimetri P-ASAT Enzym P-Bilirubin, konj Komplexbindning P-Bilirubin Komplexbindning P-Calcium Komplexbindning P-Digoxin Immunoassay P-Fosfat Komplexbindning S-Gallsyror Enzymreagens P-Glukos Enzymreagens P-GT Enzym P-HDL-kolesterol Enzymreagens P-Järn Komplexbindning Dv-Kalium Jonselektiv mätning P-Kalium Jonselektiv mätning Dv-Klorid Jonselektiv mätning P-Klorid Jonselektiv mätning P-Koldioxid P-Kolesterol P-Kreatinin (enz) P-Kreatinkinas (CK) P-LDL-kolesterol S-LD P-Lipoprotein (a) S-Litium P-Magnesium Dv-Natrium P-Natrium P-Pankreasamylas P-Paracetamol P-Salicylat P-TIBC P-Triglycerider P-Urat U-Urat P-Urea P-Homocystein Enzymreagens ER + Komplexbindning Enzymreagens Enzym Enzymreagens Enzym Immunturbidimetri Komplexbindning Komplexbindning Jonselektiv mätning Jonselektiv mätning Enzym Immunoassay (EMIT) Enzymreagens Immunturbidimetri Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Metodprinciper inom allmänkemi P-ALAT P-ALP P-ASAT P-GT P-Kreatinkinas (CK) S-LD P-Pankreasamylas P-Ammonium S-Gallsyror P-Glukos P-HDL-kolesterol P-Koldioxid P-Kreatinin (enz) P-LDL-kolesterol P-Salicylat P-Triglycerider P-Urat U-Urat P-Urea P-Homocystein Enzym Enzym Enzym Enzym Enzym Enzym Enzym Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens Enzymreagens P-Kolesterol P-Digoxin P-Paracetamol P-Apolipoprotein A1 P-Apolipoprotein B P-TIBC Lp(a) Dv-Kalium P-Kalium Dv-Klorid P-Klorid Dv-Natrium P-Natrium P-Bilirubin, konj P-Bilirubin P-Calcium P-Fosfat P-Järn S-Litium P-Magnesium Enzymregens Immunoassay Immunoassay (EMIT) Immunturbidimetri Immunturbidimetri Immunturbidimetri Immunturbidimetri Jonselektiv mätning Jonselektiv mätning Jonselektiv mätning Jonselektiv mätning Jonselektiv mätning Jonselektiv mätning Komplexbindning Komplexbindning Komplexbindning Komplexbindning Komplexbindning Komplexbindning Komplexbindning Enzymbestämningsmetoder • Enzymer används som markörsubstanser • Goda analysegenskaper – Känsliga – Lätta att mäta – Billiga Princip: do your thing! • Substrat ↔ Produkt • Substrat i överskott • Lämpliga reaktionsbetingelser i övrigt (pH, temperatur, coenzymer etc.) • Ett signalsystem => Reaktionshastigheten = k x Ea (µkat/L) Ofta utnyttjat signalsystem NADP+ + H+ + 2e- NADPH Enzymbestämningsmetoder • Mäter omvandlingen substrat – produkt • Betingelserna (pH, temperatur, cofaktorer etc.) avgör hastigheten • Optimerade betingelser för mätning har definierats av IFCC • Spårbarhet? Enzymbestämningsmetoder - mer eller mindre komplexa Nitrofenylfosfat+ H2O Nitrofenol (gul) + fosfat (ALP) L-Laktat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+ (LD) L-Alanin + 2-oxoglutarat pyruvat + L-glutamat (ALAT) Pyruvat + NADH + H+ L-Laktat + NAD+ (LD) L-Aspartat + 2-oxoglutarat oxalacetat + L-glutamat (ASAT) Oxalacetat + NADH + H+ L-Malat + NAD+ (MDH) Kreatinfosfat + ADP kreatin + ATP (CK) ATP + D-glukos ADP + G6P (HK) G6P + NADP+ D-6-fosfoglukonat + NADPH + H+ (G6PDH) Enzymer som reagens • Metoderna mäter substratkoncentration • Hög specificitet för ett visst substrat eller en substratfamilj – ex ureas, urikas, glukosoxidas – eliminerar behovet av upparbetning – minskar interferensrisken Kreatinin Urat Ammoniak Urea Glukos Laktat Triglycerider etc. Kopplad reaktion för ökad specificitet Glukos + ATP ADP + glukos-6-fosfat (HK, ospec) Glukos-6-fosfat + NADP+ 6-fosfoglukonat + NADPH + H+ (G6PDH, spec för glukos) Jfr CK-metoden Kreatinfosfat + ADP kreatin + ATP (CK) ATP + glukos ADP + G6P (HK) G6P + NADP+ 6-fosfoglukonat + NADPH + H+ (G6PDH) (Kreatinfosfat, ADP, glukos, NADP, HK, G6DPH i överskott) Exempel: kreatinin • Tidigare metod (Jaffe) komplexbindning med pikrat – känslig för interferenser (glukos, protein, bilirubin, ketonkropper etc. etc.) – många metodvarianter för att öka specificiteten Trinderreaktionen Färgreaktion • H202 + 4-aminofenazon + fenol -> kinoniminfärgämne Används i metoder för t ex • Kreatinin • Laktat • Glukos • Triglycerider • Kolesterol • HDL • LDL • Urat Metoder som utnyttjar Trinderreaktionen Kolesterolester + H2O Kolesterol + RCOOH (kolesterolesteras) Kolesterol + O2 Kolest-4-en-3-on + H2O2 (kolesteroloxidas) Kreatinin + H2O Kreatin (kreatininas) Kreatin + H2O Sarkosin + Urea (kreatinas) Sarkosin + O2 + H2O Glycin + HCHO + H2O2 (sarkosinoxidas) Urat + 2 H2O + O2 Allantoin + CO2 + H2O2 (urikas) Komplexbindningsmetoder • Användning av speciella bindarmolekyler som bildar färgade komplex med hög affinitet för analyten – Pikrinsyra (Kreatinin) – Diazoreagens (Bilirubin) – BAPTA (Ca) – FerroZine (Fe) – CPZ-III (Mg) • Traditionell klinisk kemi Jonselektiva elektroder (ISE) • Används för mätning av elektrolytkoncentrationer (eller -aktiviteter!) • Elektrokemisk mätteknik • Vanliga Na, K, (Cl) • Med eller utan spädning av provet Interferens • Analytisk – Interfererar i reaktionen – Hög bakgrund – Kompetitiv interferens • Biologisk interferens – Hemolys (inte Hb) Vanliga interferenser Källa Hur Hemolys biologisk interferens via eryrocytkomponenter, spektral interferens (Hb), direkt interferens (Hb) Bilirubin hög bakgrund, direkt interferens, kompetitiv interferens Lipider ljusspridning, volymseffekter Interferenser Hb-interferens i konjugerat bilirubin Interferenstestning • Interferogram enligt Glick* • Rekommendationer finns i CLSI-dokumentet EP7-A2. Interference testing in clinical chemistry (CLSI 2005). *Glick MR, Ryder KW, Jackson SA. Graphical comparisons of interferences in Clinical Chemistry Instrumentation. Clin Chem 32:470-5;1986 Lipidcentrifugering • Centrifugering i >10 000 x g 10 minuter ALAT ALP ASAT Bilirubin Bilirubin, konjugerat Ca CK CKMB Fosfat Glukos GT Järn Kreatinin LD Natrium, Kalium, Klorid Pankreasamylas Urat Urea Ultrafiltrering • Eliminerar bilirubininterferens i kreatininprover Elektrolyter i lipemiska prover – mäter vi rätt? • Patient i Kristianstad med L-index 1093 – Obehandlat prov hade Na 114, K 4,0 – Efter lipidcentrifugering Na 125, K 4,4 • Från insert ISE: Pseudohyponatremi • Falskt lågt analysresultat beroende på hög halt av lipider eller protein • Inträffar med metoder som mäter koncentrationen efter spädning av provet (t ex flamfotometri eller indirekt ISE (Cobas)) • Direkt ISE (ABL) mäter rätt • Plasma innehåller normalt ca 93% vatten, i vilket elektrolyterna är lösta • Resten utgörs av protein och lipider • I extrema fall kan vattenandelen vara betydligt lägre Vad händer när provet späds? • Vid en spädning följer färre natriumjoner med i alikvoten till det nya röret ju högre lipidhalt i provet Spädningssteg Prov 1 före spädning Prov 2 före spädning Prov 1 efter Prov 2 efter spädning spädning Direkt/indirekt ISE • Direkt ISE (t ex ABL) påverkas ej av höga lipid/proteinnivåer – ABL mäter därför 7% högre elektrolyter i prover med normal lipid- och proteinhalt, men… • mätresultatet kompenseras för denna skillnad – Perfekt korrelation för elektrolyter kan emellertid aldrig erhållas mellan direkta och indirekta ISEmätningar, eftersom… • kompensationen för 7% undanträngd volym bara är en genomsnittssiffra!
