Analysmetoder-allmankemi

Comments

Transcription

Analysmetoder-allmankemi
Kemiska metodprinciper inom
allmänkemi samt vanliga felkällor
Sten-Erik Bäck
Klinisk kemi
Labmedicin Skåne
Analyser inom allmänkemi
• Beställs ofta
• Har kort analystid
• Analyseras utan föregående upparbetning
(utfällning, extraktion etc.)
• Baseras på spektrofotometri eller jonselektiv
mätning
• Analyseras på samma plattform
• Använder färdigköpta reagens
• Utförs i plasma/serum
Metodprinciper inom allmänkemi
P-ALAT
Enzym
P-ALP
Enzym
P-Ammonium
Enzymreagens
P-Apolipoprotein A1 Immunturbidimetri
P-Apolipoprotein B Immunturbidimetri
P-ASAT
Enzym
P-Bilirubin, konj
Komplexbindning
P-Bilirubin
Komplexbindning
P-Calcium
Komplexbindning
P-Digoxin
Immunoassay
P-Fosfat
Komplexbindning
S-Gallsyror
Enzymreagens
P-Glukos
Enzymreagens
P-GT
Enzym
P-HDL-kolesterol
Enzymreagens
P-Järn
Komplexbindning
Dv-Kalium
Jonselektiv mätning
P-Kalium
Jonselektiv mätning
Dv-Klorid
Jonselektiv mätning
P-Klorid
Jonselektiv mätning
P-Koldioxid
P-Kolesterol
P-Kreatinin (enz)
P-Kreatinkinas (CK)
P-LDL-kolesterol
S-LD
P-Lipoprotein (a)
S-Litium
P-Magnesium
Dv-Natrium
P-Natrium
P-Pankreasamylas
P-Paracetamol
P-Salicylat
P-TIBC
P-Triglycerider
P-Urat
U-Urat
P-Urea
P-Homocystein
Enzymreagens
ER + Komplexbindning
Enzymreagens
Enzym
Enzymreagens
Enzym
Immunturbidimetri
Komplexbindning
Komplexbindning
Jonselektiv mätning
Jonselektiv mätning
Enzym
Immunoassay (EMIT)
Enzymreagens
Immunturbidimetri
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Metodprinciper inom allmänkemi
P-ALAT
P-ALP
P-ASAT
P-GT
P-Kreatinkinas (CK)
S-LD
P-Pankreasamylas
P-Ammonium
S-Gallsyror
P-Glukos
P-HDL-kolesterol
P-Koldioxid
P-Kreatinin (enz)
P-LDL-kolesterol
P-Salicylat
P-Triglycerider
P-Urat
U-Urat
P-Urea
P-Homocystein
Enzym
Enzym
Enzym
Enzym
Enzym
Enzym
Enzym
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
Enzymreagens
P-Kolesterol
P-Digoxin
P-Paracetamol
P-Apolipoprotein A1
P-Apolipoprotein B
P-TIBC
Lp(a)
Dv-Kalium
P-Kalium
Dv-Klorid
P-Klorid
Dv-Natrium
P-Natrium
P-Bilirubin, konj
P-Bilirubin
P-Calcium
P-Fosfat
P-Järn
S-Litium
P-Magnesium
Enzymregens
Immunoassay
Immunoassay (EMIT)
Immunturbidimetri
Immunturbidimetri
Immunturbidimetri
Immunturbidimetri
Jonselektiv mätning
Jonselektiv mätning
Jonselektiv mätning
Jonselektiv mätning
Jonselektiv mätning
Jonselektiv mätning
Komplexbindning
Komplexbindning
Komplexbindning
Komplexbindning
Komplexbindning
Komplexbindning
Komplexbindning
Enzymbestämningsmetoder
• Enzymer används som markörsubstanser
• Goda analysegenskaper
– Känsliga
– Lätta att mäta
– Billiga
Princip: do your thing!
• Substrat ↔ Produkt
• Substrat i överskott
• Lämpliga reaktionsbetingelser i övrigt (pH,
temperatur, coenzymer etc.)
• Ett signalsystem
=> Reaktionshastigheten = k x Ea (µkat/L)
Ofta utnyttjat signalsystem
NADP+ + H+ + 2e-  NADPH
Enzymbestämningsmetoder
• Mäter omvandlingen
substrat – produkt
• Betingelserna (pH,
temperatur, cofaktorer
etc.) avgör hastigheten
• Optimerade betingelser
för mätning har
definierats av IFCC
• Spårbarhet?
Enzymbestämningsmetoder - mer eller
mindre komplexa
Nitrofenylfosfat+ H2O  Nitrofenol (gul) + fosfat (ALP)
L-Laktat + NAD+  Pyruvat + NADH + H+ (LD)
L-Alanin + 2-oxoglutarat  pyruvat + L-glutamat (ALAT)
Pyruvat + NADH + H+  L-Laktat + NAD+ (LD)
L-Aspartat + 2-oxoglutarat  oxalacetat + L-glutamat (ASAT)
Oxalacetat + NADH + H+  L-Malat + NAD+ (MDH)
Kreatinfosfat + ADP  kreatin + ATP (CK)
ATP + D-glukos  ADP + G6P (HK)
G6P + NADP+  D-6-fosfoglukonat + NADPH + H+ (G6PDH)
Enzymer som reagens
• Metoderna mäter
substratkoncentration
• Hög specificitet för ett
visst substrat eller en
substratfamilj
– ex ureas, urikas,
glukosoxidas
– eliminerar behovet av
upparbetning
– minskar
interferensrisken
Kreatinin
Urat
Ammoniak
Urea
Glukos
Laktat
Triglycerider
etc.
Kopplad reaktion för ökad specificitet
Glukos + ATP  ADP + glukos-6-fosfat (HK,
ospec)
Glukos-6-fosfat + NADP+  6-fosfoglukonat +
NADPH + H+ (G6PDH, spec för glukos)
Jfr CK-metoden
Kreatinfosfat + ADP  kreatin + ATP (CK)
ATP + glukos  ADP + G6P (HK)
G6P + NADP+  6-fosfoglukonat + NADPH + H+
(G6PDH)
(Kreatinfosfat, ADP, glukos, NADP, HK, G6DPH i överskott)
Exempel: kreatinin
• Tidigare metod (Jaffe) komplexbindning med
pikrat
– känslig för interferenser (glukos, protein, bilirubin,
ketonkropper etc. etc.)
– många metodvarianter för att öka specificiteten
Trinderreaktionen
Färgreaktion
• H202 + 4-aminofenazon +
fenol -> kinoniminfärgämne
Används i metoder för t ex
• Kreatinin
• Laktat
• Glukos
• Triglycerider
• Kolesterol
• HDL
• LDL
• Urat
Metoder som utnyttjar Trinderreaktionen
Kolesterolester + H2O Kolesterol + RCOOH (kolesterolesteras)
Kolesterol + O2  Kolest-4-en-3-on + H2O2 (kolesteroloxidas)
Kreatinin + H2O  Kreatin (kreatininas)
Kreatin + H2O  Sarkosin + Urea (kreatinas)
Sarkosin + O2 + H2O  Glycin + HCHO + H2O2 (sarkosinoxidas)
Urat + 2 H2O + O2  Allantoin + CO2 + H2O2 (urikas)
Komplexbindningsmetoder
• Användning av speciella bindarmolekyler som
bildar färgade komplex med hög affinitet för
analyten
– Pikrinsyra (Kreatinin)
– Diazoreagens (Bilirubin)
– BAPTA (Ca)
– FerroZine (Fe)
– CPZ-III (Mg)
• Traditionell klinisk kemi
Jonselektiva elektroder (ISE)
• Används för mätning av
elektrolytkoncentrationer (eller -aktiviteter!)
• Elektrokemisk mätteknik
• Vanliga Na, K, (Cl)
• Med eller utan spädning av provet
Interferens
• Analytisk
– Interfererar i reaktionen
– Hög bakgrund
– Kompetitiv interferens
• Biologisk interferens
– Hemolys (inte Hb)
Vanliga interferenser
Källa
Hur
Hemolys
biologisk interferens via
eryrocytkomponenter,
spektral interferens (Hb),
direkt interferens (Hb)
Bilirubin
hög bakgrund,
direkt interferens,
kompetitiv interferens
Lipider
ljusspridning, volymseffekter
Interferenser
Hb-interferens i konjugerat bilirubin
Interferenstestning
• Interferogram enligt
Glick*
• Rekommendationer
finns i CLSI-dokumentet
EP7-A2. Interference
testing in clinical
chemistry (CLSI 2005).
*Glick MR, Ryder KW, Jackson SA. Graphical comparisons of interferences in Clinical
Chemistry Instrumentation. Clin Chem 32:470-5;1986
Lipidcentrifugering
• Centrifugering i >10 000 x g 10 minuter
ALAT
ALP
ASAT
Bilirubin
Bilirubin, konjugerat
Ca
CK
CKMB
Fosfat
Glukos
GT
Järn
Kreatinin
LD
Natrium, Kalium, Klorid
Pankreasamylas
Urat
Urea
Ultrafiltrering
• Eliminerar
bilirubininterferens i
kreatininprover
Elektrolyter i lipemiska prover – mäter vi rätt?
• Patient i Kristianstad med L-index 1093
– Obehandlat prov hade Na 114, K 4,0
– Efter lipidcentrifugering Na 125, K 4,4
• Från insert ISE:
Pseudohyponatremi
• Falskt lågt analysresultat beroende på hög halt
av lipider eller protein
• Inträffar med metoder som mäter
koncentrationen efter spädning av provet (t ex
flamfotometri eller indirekt ISE (Cobas))
• Direkt ISE (ABL) mäter rätt
• Plasma innehåller normalt ca 93% vatten, i
vilket elektrolyterna är lösta
• Resten utgörs av protein och lipider
• I extrema fall kan vattenandelen vara betydligt
lägre
Vad händer när provet späds?
• Vid en spädning följer färre natriumjoner med
i alikvoten till det nya röret ju högre lipidhalt i
provet
Spädningssteg
Prov 1 före
spädning
Prov 2 före
spädning
Prov 1 efter Prov 2 efter
spädning
spädning
Direkt/indirekt ISE
• Direkt ISE (t ex ABL) påverkas ej av höga lipid/proteinnivåer
– ABL mäter därför 7% högre elektrolyter i prover
med normal lipid- och proteinhalt, men…
• mätresultatet kompenseras för denna skillnad
– Perfekt korrelation för elektrolyter kan emellertid
aldrig erhållas mellan direkta och indirekta ISEmätningar, eftersom…
• kompensationen för 7% undanträngd volym bara är en
genomsnittssiffra!

Similar documents