isolasi, pemurnian dan penentuan beberapa sifat protease

ISO LASI, PEMURNIAN DAN PENENTUAN BEBERAPA SIFAT PROTEASE-SH
DARI BAKTERI BONGKREK PSEUDOMONAS COCOVENENANS X-128
ABSTRAK DISERTASI
dan
Maksud
tujuan
penelitian ini adalah
untuk
mengisolasi, memurnikan protease sulfhidril (protease-SH)
dari
Pseudomonas
cocovenenans
X-128
dan
menetapkan
beberapa sifat-sifatnya sebagai langkah pertama untuk
mengungkapkan enzimologi bakteri bongkrek.
Hingga kini orang memperhatikan bakteri bongkrek
hanya aspek kedua racunnya saja yaitu toksoflavin dan
asam bongkrek. Aspek enzimologi bakteri yang sering
menimbulkan keracunan, sepanjang pengetahuan kami belum
banyak diungkapkan orang kecuali dalam penelitian ini.
Dalam penelitian pendahuluan kami menemukan bahwa
bakteri ini memproduksi protease-SH intraselular.
Adanya
protease-SH dalam bakteri bongkrek sangat menarik perhatian, karena in vitro asam bongkrek menghambat protease
-SH,
sedangkan in vivo senyawa ini tidak mematikan
bakteri tersebut. Pada umumnya protease-SH hanya banyak
ditemukan
dalam tumbuh-tumbuhan dan jarang ditemukan
dalam mikroorganisme. Seperti diketahui, protease juga
memegang peran penting dalam metabolisme,ilmiah_d-anindustri.. Dengan alasan ini,
maka
disini
protease-SH
dari
Pseudomonas cocovenenans X-128 diisolasi, dimurnikan dan
ditetapkan sifat-sifatnya.
Untuk
cocovenenans
mengisolasi
enzim ini,
maka
Pseudomonas
X-128 dibiakkan dalam media cair menurut
N.A Azis ditambah 0,2 % b/v pepton. Semula pembiakan
bakteri dilakukan dengan cara mengocok biakan lebih dari
48 jam, pada suhu kamar sampai mencapai serapan 3,0 pada
X 650 nm. Kemudian protease-SH diekstraksi dengan cara
sonikasi suspensi bakteri dalam larutan 1 % NaCl pada
suhu
2°C
selama 15 menit, lalu disentrifugasi pada
2950 x g dan suhu 4°C. Uji aktifitas protease-SH dilakukan menurut metode Kunitz dan kadar protein ditetapkan
menurut metode Lowry. Ekstrak kasar protease-SH dari
biakan bakteri ini (FEKB) mempunyai aktifitas spesifik
369 unit per mg protein dan disimpan pada -15°C dalam
lemari pembeku untuk percobaan selanjutnya.
Aktifitas spesifik adalah jumlah unit aktifitas per
mg protein. Satu unit aktifitas didefinisikan sebagai
kenaikan serapan hasil reaksi enzim selama 30 menit
sebesar
0,001
di
atas
serapan kontrol reagen
pada
X 276 nm.
Setelah
X-128 banyak
diketahui
bahwa
memproduksi
Pseudomonas
protease-SH
pada
cocovenenans
akhir
fasa
pertumbuhan eksponensial, maka pada eksperimen selanjutnya pengocokan dilakukan selama 20 jam. Ekstrak kasar
protease-SH dari biakan ini (FEKB') ternyata mempunyai
aktifitas spesifik lebih tinggi dari pada FEKB yaitu
503 unit per mg protein.
Pemurnian FEKB dilakukan setelah FEKB didialisis
dengan air kemudian difraksinasi dengan cara pengendapan
bertahap dengan aseton dingin (-15°C) sampai konsentrasi
akhir 30 %, 50 %, dan 70 % v/v aseton. Semua fraksi
didialisis dengan 2,5 mM Tris-HC1 pH 8,0 pada 4°C. Hasil
uji
aktifitas
menunjukkan
bahwa
fraksi
endapan
pada
tas protease-SH terbesar dengan aktifitas spesifik 457
unit per mg protein. Fraksi ini disimpan pada -15°C untuk
percobaan selanjutnya.
FEKB' yang masih segar tidak disimpan dalam lemari
pembeku
tetapi
langsung
difraksinasi
dengan
aseton.
Ternyata fraksi endapan pada aseton 50 % v/v (FEnA'-50)
mempunyai
aktifitas
spesifik
lebih
tinggi
dari
pada
FEnA-50, yaitu 1.213 unit per mg protein.
Selanjutnya
FEnA-50
difraksinasi
dengan
kolom
Sephadex G-150 dalam bufer Tris-HC1 pH 8,2 sebagai eluen
pada suhu 4°C. Fraksinasi ini menghasilkan 13 fraksi
protease-SH, antara lain FS-1, FS-9, dan FS-11, berturutturut mempunyai aktifitas spesifik 1.166 unit, 8.974 unit
dan 15.172 unit per mg protein dengan tingkat kemurnian
3,24, dan 41 kali FEKB.
Hasil uji kemurnian dengan cara elektroforesis disk
gel poliakrilamida dengan pewarnaan amido hitam, ternyata
FS-9 sudah murni terdiri atas satu pita protein. Karena
jumlah unit aktifitas fraksi ini sangat sedikit, maka
FS-1 yang masih terdiri atas 7 pita protein difraksinasi
lagi dengan kolom DEAE Sephacel dalam gradien eluen
0 - 0,5 M NaCl pH 7,2 pada 4°C. Fraksinasi ini menghasilkan 19 fraksi antara lain FD-5 dan FD-6 yang mempunyai
aktifitas spesifik sangat tinggi yaitu 79.797 dan 34.065
unit per mg protein dengan tingkat kemurnian 216 dan 92
kali
FEKB.
kromatografi
Kadar
protein
semua
fraksi
ditetapkan dengan cara
hasil
kolom
spektrofotometri
sinar ultraviolet. Ternyata FD-5 dan FD-6 jumlahnya juga
sangat
sedikit
sehingga
sifat-sifatnya
belum
dapat
ditetapkan.
Setelah diketahui baik FEKB maupun FEnA-50 tidak
stabil jika disimpan dalam keadaan beku, maka untuk
maksud fraksinasi, FEnA'-50 yang masih segar juga lang
-
sung difraksinasi dengan kolom Sephadex G-150 dengan
cara yang sama. Fraksinasi dengan cara ini menghasilkan
17 fraksi protease-SH, antara lain FS'-1, FS'-2, FS'-3,
FS'-4, dan FS'-6 yang mempunyai aktifitas spesifik sangat
tinggi, berturut-turut adalah 18.557 unit, 22.686 unit,
21.838 unit, 56.068 unit dan 62.941 unit per mg protein
dengan tingkat kemurnian 36, 45, 43, 111 dan 65 kali
FEKB'.
Hasil uji kemurnian secara elektroforesis disk gel
poliakrilamida
menunjukkan
bahwa
FS'-1
sudah
murni.
FS'-1 mengandung 92.600 unit aktifitas protease-SH atau
53 kali FS-9 dan 39 kali FD-5 sehingga fraksi ini dapat
ditetapkan sifat-sifatnya dengan bermacam-macam perco
-
baan. Hasil percobaan menunjukkan bahwa:
Enzim murni yang diperoleh mempunyai pH optimum 8,0
untuk substrat kasein dan pada pH 9,2 masih tetap aktif.
Suhu optimum enzim ini adalah 35°C dan masih tetap aktif
walaupun sudah disimpan selama 10 menit pada 70°C dan
98°C. Atas dasar aktifitas pada berbagai pH dan suhu ini,
maka enzim tersebut dapat digolongkan sebagai proteaseSH basa yang termostabil.
Sepanjang
pengetahuan
kami,
yang
enzim
telah
berhasil kami murnikan ini belum pernah ada yang mengungkapkan.
Maka
kami
mengusulkan
nama
cocovenein
untuk
menyebutnya.
Aktifitas cocovenein dihambat oleh beberapa pengham-
bat protease -SH
sebagai
berikut:
CuSO4,
HgClz,
pCMB,
K3Fe(CN)6 dan Iodoasetat pada konsentrasi akhir yang
1,4 x 10- 4 M, berturut-turut sebesar 48 %,
sama
72 %, 23
b,
12 %, dan 17 %. Penghambatan ini menunjukkan dengan jelas
bahwa
cocovenein
murni
dari
Pseudomonas
cocovenenans
X-128 adalah protease -SH.
Cocovenein diaktifkan oleh MnSO4 dan ZnSO4 pada
konsentrasi akhir
1 x 10- 3 M sebesar 40 % dan 94 %
tetapi
enzim ini dihambat oleh 1 x 10- 4 M NaEDTA sebesar 100
%.
Oleh karena itu cocovenein diduga sebagai enzim logam.
Asam bongkrek yang sudah diketahui menghambat papain,
bromelin, dan fisin serta protease -SH dari sperma
sapi Friesian Holstein ternyata pada cocovenein mempunyai
dua efek yaitu penghambatan dan pengaktifan. Pada konsentrasi akhir substrat yang tinggi
di
atas
0,375
%
b/v
kasein, asam bongkrek menghambat aktifitas cocovenein.
Sebaliknya pada konsentrasi akhir substrat
yang
rendah
di bawah 0,375 % b/v kasein, asam bongkrek mengaktifkan
cocovenein. Toksoflavin juga menghambat aktifitas cocovenein secara tak bersaing dengan Ki = 7,7 x 10- 6
M.
Cocovenein dihambat oleh substrat kasein, secara
bersaing dengan a = 3,0 dan Ks
=
0,83
%.
substrat ini menunjukkan bahwa cocovenein
Penghambatan
mempunyai
beberapa sub-bagian aktif pada bagian aktifnya.
Fenomena dari bakteri bongkrek tersebut di atas
belum pernah diungkapkan orang dan baru pertama kali ini
kami temukan pada Pseudomonas cocovenenans X-128.
BM
cocovenein
adalah
620.000
ditetapkan
dengan
cara elektroforesis gel poliakrilamida tak terdenaturasi,
karena penetapan secara elektroforesis SDS-gel poliakrilamida enzim ini terurai menjadi 3 subunit protein dengan
BM 450.000,
320.000 dan 47.000.
Spesifitas cocovenein telah diuji terhadap 0,001 M
substrat
sintetik
Hipuril-L-Arginin
Na-Benzoil-Arginin
dan
Etil
Glisin-4-Nitroanilida
25°C serta Benzoil-Arginin-Amida pada suhu
Ester,
Na-
pada
suhu
35°C
dalam
bufer Tris-HC1 pH 8,0. Enzim ini berturut-turut mempunyai
aktifitas sebesar 0,18 %,
0,26 %, 6,9 % dan 0 ~. Dengan
alasan ini cocovenein kami duga mempunyai spesifitas yang
tinggi dengan aktifitas aminopeptidase.
Dari hasil-hasil penelitian di atas dapat disimpulkan bahwa cocovenein merupakan protease-SH baru yang
belum pernah diungkapkan peneliti lain.
Diharapkan basil penelitian ini dapat mengungkapkan
lebih lanjut mengenai enzimologi bakteri bongkrek,
kelak
dapat memberikan sumbangan dalam mencegah pertumbuhan
bakteri yang sering menimbulkan keracunan.
Disamping itu diharapkan pula protease-SH
dari
bakteri bongkrek dapat berguna untuk keperluan ilmiah,
industri dan farmasi seperti halnya papain, bromelin, dan
fisin.
ABSTRACT
The purpose of this research is to isolate, purify
and characterize sulfhydryl protease (SH-protease)
Pseudomonas cocovenenans X-128,
as
the
first
step
from
to
reveal the enzymology of bongkrekic bacterium.
Most of the work which have been done so far deal
with the two toxic substances toxoflavin and bongkrekic
acid
produced
by
this
bacterium.
Where
as
to
our
knowledge no work on the enzymology of this bacterium
which often causes poisoning has been carried out except
for this research.
In the preliminary study we found that the bongkrekic
bacterium produced intracellular
SH-protease.
The existence of this enzyme in this bacterium has
attracted attention because in vitro bongkrekic acid
inhibits the 8H-protease while in vivo does not kill
bongkrekic bacterium.
Generally SH-proteases are only
found in certain plants and are rarely found in microorganism. Protease is also known to play an important
role in metabolism, scientific and industry.
reason SH-protease from
Pseudomonas
For
this
cocovenenans X-128
was isolated, purified and characterized.
To isolate this enzyme the bacteria were grown in
the liquid media according to N.A. Azis and this was
added with pepton of 0,2
%
w/v.
Firstly the cultured
bacteria were incubated and shaken for a few hours every
day totalling up to 48 hours at the room temperature
until the absorption of the culture reached 3,0 at X650
nm. Then. the SH-protease was extracted by sonication of
the bacteria suspension in 1 % NaCl solution at 2°C for
15 minutes, then centrifuged at 2950
x
g at 4°C. The
activity tests of SH-protease were carried out according
to Kunitz's method and the protein content was determined
according to Lowry's method. The crude extract of the
SH-protease from the culture which was shaken (FEKB) had
specific activity of 369 units per mg ofprotein. Finally
it was stored at -15°C for subsequent experiment.
The specific activity is the amount of units activity per mg of protein. One unit acitivity of SH-protease
.
is defined as the increase in absorption of 0,001 of the
product for 30 minutes which is corrected by the reagent
blank and measured at X 276 nm.
After it had been known that
Pseudomonas
cocove-
nenans X-128 produced SH-protease abunddantly at the end
of the exponential phase of the bacterial growth, the
bacteria were grown by shaking
continously for 20
hours. The crude extract of SH-protease obtained in this
way (FEKB') appeared to have higher specific activity
than FEKB viz. 503 units per mg of protein.
The purification of FEKB was carried out after it
was dialysed with water, then was fractionized using
the gradual precipatation method with aceton at very
low temperature (-15°C) until reaching the final concentration of 30 %, 50 %, 70 % v/v of aceton respectively.
All of those fractions were dialysed with 2,5 mM Tris-HC1
pH 8,0. The result of the acitivity tests showed the
precipitated fraction at the final concentration of 50 %
of aceton (FEnA-50) contained the
,
highest
total
units
activity and specifik activity of 457 units per mg
protein. Then it was stored at -15°C for subsquent
experiment.
The fresh FEKB' was not stored in the freezer but
was fractionized directly with aceton in the same manner.
The obtained precipitated fraction at 50 % v/v of aceton
( FEnA'-50) had higher sepecific activity then FEnA-50,
that is 1213 units per mg of protein.
FEnA-50
was
fractionized
further
on
column
of
Sephadex G-150 with Tris-HC1 buffer pH 8,2 as the eluent
at
4°C.
This
fractionation
produce
13
fractions
of
SH-protease, especially FS-1, FS-9 and 15172 units per mg
of protein respectively with the purity of 3,24 and 41
folds of FEKB.
The result of the purity test on disk gel polyacrylamide electrophoresis with amido black staining showed
that FS-9 was pure because it consisted only one protein
band. The amount
of
this
fraction
was
very small,
therefore FS-1 which still consisted of 7 protein bands
was
fractionized
again
with
column
of
DEAE-Sephacel
in 0 - 0,5 M NaCl solution pH 7,2 as the gradient eluent
at 4°C. This fractionation produced 19 fractions of
SH-protease. Two of them were FD-5 and FD-6 had very high
specific activity that were 79797 units and 34065 units
per mg of protein reprectively with the purity 216 and 92
folds of FEKB. The protein content of all obtained fractions from column chromatography were determined by means
of the UV light spectrophotometry method. Unfortunately
the amounth FS-9, FD-5 and FD-6 were so small that the
properties of these enzymes could not be determined
Because of the fact that either FEKB or FEnA-50
were unstable if they were stored in the frezeer, for
the
characterization
purpose
the
fresh
was
FEnA'-50
fractionized directly with column of Sephadex G-150 in
the same manner. This fractionation produced 17 fractions. Some of them were FS'-1, FS'-2, FS'-3, FS'-4 and
FS'-6 having specific activity of 18557 units, 22686
units, 21838 units, 50668 units and 62941 units per mg
protein respectively with purity of 36, 45, 43, 111, and
65 folds of FEKB'.
The result of the purity test on disk gel polyacrylamide elektrophoresis showed thas FS'-1
was
a
pure
fraction. FS'-1 contained 92600 units activity or 53
folds of units activity of FS-9 and 39 folds of units
activity of FD-5,
which
enzyme
characterized
could
be
was
sufficient
by
means
so
that
of
this
several
kinds of experiments. The result of those showed that:
The obtained pure enzyme had a optimum pH of 8,0 for
casein as the subtrate and at pH 9,2 it remained active.
The optimum temperature of this enzyme appeared to be
35°C and it remained active although it had been stored
at 70°C and 98°C for 10 minutes. For this reason the
above mentioned enzyme could be grouped as the alkaline
thermostable SH-protease.
To our knowledge the pure enzyme as obtained above
has never been described before, so we propose the name
cocovenein for it.
Cocovenein
acitivity
was
inhibited
by
some
of
SH-protease inhibitors viz._ CuSO4,_ HgClz, pCMB, KaFe(CN)s
and Iodoasetat at the same consentration of 1,4 x 10-4
M,
up to 48 %, 72 %, 23 %, 12 %, and 17 % respectively. This
inhibition
showed
that
the
pure
cocovenein
from
Pseudomonas cocovenenans X-128 was truly SH-protease.
Cocovenein was activated by MnSO4 and ZnSO4 at the
final concentration of 1 x LO-3 M, up to 40 % and
94
%
respectively but this enzyme was inhibited by NaEDTA at
the final concentration of 1
x 10-4
M,
up
to
100
%
therefore cocovenein was presumed to be metalloenzyme.
Bongkrekic acid that had been known to inhibit
papain, bromelin and ficin activity and also SH-protease
from bull sperm of Friesian Holstein, was found to have
two effects of inhibition and activation on cocovenein.
At high concentration of casein substrate above 0,375 %
w/v,
bongkrekic
acid
inhibited
cocovenein
activity.
Contrary to the low concentration of casein substrate
below 0,375 % w/v, bongkrekic acid increased the activity
of cocovenein.
Toksoflavin inhibited the activity of
cocovenein noncompetitively with Ki = 7,7 x 10Cocovenein
was
also
inhibited
by
6
M.
its
casein
substrate competitively with a = 3,0 and Ks = 0,83 %.
This substrate inhibition showed that cocovenein had two
or more subactive sites on its active site.
The
above
mentioned
phenomena
from
bongkrekic
bacterium had never been described befor, and we found
those
phenomena firstly on
Pseudomonas
cocovenenans
X-128.
Molecular weight of cocovenein was 620000 which was
determined by using nondenaturation gel polyacrylamide
electrophoresis in Tris-Glycine buffer pH 8,3 and amido
black staining. The determination by means of SDS-gel
polyacrylamide
electrophoresis
showed
that
enzyme
dissociated into three protein subunits with molecular
weight of 450000, 320000 and 47000 respectively.
The specivity of cocovenein had been tested on
0,001 M of synthetic substrate viz. Na-Benzoyl-L-Arginine
-Ethyl Ester,
Na-Hypuryl-L-Arginine,
Glycine-4-
Nitro-
anilide at 25°C and Benzoyl-Arginine Amide at 35°C in
Tris-HC1 buffer pH 8,0. This enzyme had the activity of
0,18 %, 0,26 %, 6,9 % and 0 % respectively. For this
reason we pressumed that cocovenein have high specivity
with aminopeptidase activity.
It can be concluded that cocovenein investigated
in this research is a new kind of SH-protease not yet
previously studied.
The result of this research are expected to be able
to further reveal the enzymology of bongkrekic bacterium
so that in the future they will be to contribute to the
prevention of the bacterial growth which often causes
poisoning. Besides,
SH-protease
from
they are also expected that the
bongkrekic
bacterium be useful for
scientific and industrial purpose as papain, bromelin and
ficin are.