Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transcription

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073
Farmaceutyczny
www.fpn.info.pl
Cena 24,50 zł
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH
IC Value - Current 3.66
MNiSW 4
ROK VI (X)
Nr 1/2009 (48)
Scientific Review in Pharmacy
Aktywność transkrypcyjna genów kodujących
enzymy odpowiedzialne za detoksykację
ksenobiotyków u chorych na nowotwór krTAni
Badanie zależności pomiędzy strukturą
i działaniem pochodnych benzodiazepiny.
Część I. Nie-nukleozydowe inhibitory
odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1
RECEPTORY I TRANSPORTERY AMIN BIOGENNYCH
W ŁOŻYSKU W PRZEBIEGU NADCIŚNIENIA
INDUKOWANEGO CIĄŻĄ I CUKRZYCY CIĄŻOWEJ
Rola naturalnych antyoksydantów
w profilaktyce chorób cywilizacyjnych
Technologia produkcji kapsułek miękkich
Telmisartan – wyjątkowy wśród sartanów
aktywator receptora PPAR-γ
Wpływ amidynowego analogu melfalanu
na indukcję apoptozy
w komórkach fibroblastów skóry ludzkiej
oraz w komórkach raka piersi MCF-7
i MDA-MB 231
ISSN 1425-5073
Wydalanie siarczanów chondroityno
-dermatanowych z moczem w przebiegu procesu
fizjologicznego starzenia się ustroju.
Siarczany chondroityno-dermatanowe
w diagnostyce i farmakoterapii
1
Farmaceutyczny
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
Index Copernicus 2,51
Redaktor Naczelny:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
Adres redakcji:
41-200 Sosnowiec, ul. Jedności 8
Tel. 500 722 219
Fax. 032/364-11-34
Mail: [email protected]
Konsultacyjna Rada Naukowa
Przewodniczący:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec
Członkowie:
Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok
Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków
Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź
Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak -Lublin
Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań
Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin
Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec
Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice
Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa
Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok
Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław
Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin
Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk
Mgr Agnieszka Jura – Półtorak
Mgr Anna Szeremeta
Sekretarz Naukowy:
Dr n. med. Robert D. Wojtyczka
Członkowie Kolegium Redakcyjnego:
Dr n. farm. Paweł Olczyk
Dr n. biol. Małgorzata Kępa
Mgr Anna Szeremeta
Wydawca:
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego
Adres Wydawcy:
ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała
tel. (0-33) 817-28-79 fax (0-33)817-36-31
Prezes: dr n. med. Adam Kwieciński
Marketing Manager:
Agnieszka Romańska
[email protected]
Opracowanie graficzne:
Robert Cyganik
Skład:
Jerzy Partyka
Nakład: do 7 000 egz.
Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja
zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe
jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja
nie odpowiada.
Spis treści
Aktywność transkrypcyjna genów kodujących
enzymy odpowiedzialne za detoksykację
ksenobiotyków u chorych na nowotwór krTAni
5
9
RECEPTORY I TRANSPORTERY AMIN BIOGENNYCH
W ŁOŻYSKU W PRZEBIEGU NADCIŚNIENIA
INDUKOWANEGO CIĄŻĄ I CUKRZYCY CIĄŻOWEJ
18
23
Technologia produkcji kapsułek miękkich0
28
Telmisartan – wyjątkowy wśród sartanów
aktywator receptora PPAR-γ
32
Wpływ amidynowego analogu melfalanu
na indukcję apoptozy w komórkach fibroblastów skóry ludzkiej
oraz w komórkach raka piersi MCF-7
i MDA-MB 231
37
Wydalanie siarczanów chondroityno
-dermatanowych z moczem w przebiegu procesu
fizjologicznego starzenia się ustroju.
Siarczany chondroityno-dermatanowe
w diagnostyce 0i farmakoterapii
44
Szanowni Państwo,
Koleżanki i Koledzy,
Drodzy Czytelnicy
Z przyjemnością rekomenduję Państwu pierwszy w 2009
roku numer Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego.
Przynosi on dobre wieści dla nas, autorów publikacji.
Nie trzeba będzie uiszczać opłaty za druk prac w naszym
czasopiśmie. Tak więc tak jak do tej pory, publikowanie
prac przyjętych do druku będzie bezpłatne.
Mam także zaszczyt poinformować Państwa, iż
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy pozyskał finansowe
wsparcie ze strony Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa
Wyższego, co świadczy o uznaniu i rosnącej randze naszego
wspólnego czasopisma.
Przypominam Państwu, iż w ocenie ministerialnej
FPN posiada 4 punkty MNiSW. W aktualnym rankingu
Index Copernicus, punktacja Farmaceutycznego Przeglądu
Naukowego wzrosła do wartości 3,66. Ranking ten ma
wielkie znaczenie przy ubieganiu się o umieszczenie
czasopisma w liczących się bazach danych.
Zachęcam Państwa – jak zawsze – do publikowania prac,
oryginalnych i poglądowych w FPN. Czasopismo nasze
powinno być także płaszczyzną przekazywania informacji
o zjazdach, kongresach i konferencjach – krajowych
i międzynarodowych. Będziemy zamieszczać komunikaty
anonsujące takie naukowe wydarzenia.
Przypominam także o możliwości przedkładania prac
w języku angielskim. Utwórzmy czasopismo dwujęzyczne.
Może kiedyś, w niedalekiej przyszłości, wszystkie prace
prezentowane będą w języku angielskim. Zwiększy to
zasięg czasopisma, a z drugiej strony – przyczyni się do
podniesienia jego punktacji, na czym nam wszystkim
przecież zależy.
Zapraszam Państwa do kreowania kolejnych numerów
FPN, tak aby nasze czasopismo rozwijało się, stanowiło
liczącą się pozycję na rynku wydawniczym, a z drugiej
strony – służyło promocji Państwa osiągnięć i ich
dokumentowaniu.
Jednocześnie, informuję Państwa o zmianie adresu
Redakcji. Aktualny adres Redakcji jest następujący:
43-300 Bielsko – Biała, ul. Wiśniowa 25/2. Adres e-mail
nie uległ zmianie - [email protected]
Z życzeniami sukcesów naukowych w 2009 roku, i jak
zawsze – serdecznymi pozdrowieniami,
Redaktor Naczelny
Prof. dr hab. n. med. Krystyna Olczyk
Farm Przegl Nauk, 2009,1, 5-8
Aktywność transkrypcyjna genów kodujących enzymy
odpowiedzialne za detoksykację ksenobiotyków
u chorych na nowotwór krtani
Transcription activity of genes encoded enzymes responsible
for xenobiotics detoxication at patients with larynx cancer
Piotr Urbaniec1, Jolanta Adamska2, Grażyna Janikowska3,
Robert Kwiatkowski2, Urszula Mazurek2
Katedra i Klinika Laryngologii, 2Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, 3Zakład Chemii Analitycznej,
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
1
Streszczenie
Summary
Określono aktywność transkrypcyjną genów kodujących
białka z rodziny cytochromu P450 biorące udział w procesach detoksykacji ksenobiotyków, których metabolity
mogą inicjować procesy kancerogenezy w krtani. Materiałem do badań były wycinki z guzów nowotworowych
krtani oraz wycinki z makroskopowo zdrowych tkanek
pobranych po resekcji krtani od 25 chorych na nowotwory
regionu głowy i szyi, w których techniką QRT-PCR wyznaczano liczbę kopii mRNA CYP1A1, 1A2, 1B1 i 19A1
w µg całkowitego RNA. Dodatkowo dla genu CYP1A1
analizowano aktywność transkrypcyjną w grupach homo
i heterozygot. W tkance zdrowej dla typu polimorficznego
homozygotycznego CYP1A1 w porównaniu do typu heterozygotycznego obserwowano zwiększoną aktywność
transkrypcyjną genu (p=0,036). Porównując stosunek liczby kopii mRNA CYP1A2; 1B1 oraz 19A1 do mRNAβaktyny w każdym przypadku tkanki nowotworowej krtani
obserwowano większe wartości w porównaniu do tkanki
zdrowej, przy czym różnice istotne statystycznie (p≤0,05)
obserwowano jedynie dla heterozygot 1A1* i 1A2 co sugeruje ich udział w transformacji nowotworowej krtani.
Transcription activity of genes coding enzymes from family of cytochrome P450 which detoxifing xenobiotics, of
which metabolites can devise cancerogenesis processes
in tissue of larynx were qualified. Material to investigations was the segments of larynx cancer and the segments
from macroscopic healthy tissues received after resection
of larynx at patients with cancer in region of head or neck.
Samples of tissues received from 25 patients. Expression
of genes CYP1A1, 1A2, 1B1 and 19A1were measured by
quantitative estimation on RT-QPCR TaqMan technics. For
type of polimorphic homozygotic CYP1A1 was observed
statistical enlarged characteristic (p=0, 036) of gene expression in healthy tissue, contrary to heterozygotic type.
Relation values mRNA CYP1A2 as 1B1 and 19A1 to values mRNA beta-actine in every chance of larynx cancer tissue was greater than for healthy tissues, at what statistical
essential ( p≤ 0,05) only for heterozygotic 1A1* and 1A2.
Observed effects of fall or of height of CYP1A1 expression dependent on type of polimorphic gene (homozygote
or heterozygote), what can enlarged susceptibility of these
patients on cancerogenesis process in investigated tissue.
Transcription activity of CYP1A2 which taking participation also in metabolism of carcinogenic xenobiotics can
enlarge the risk of falling the patients on cancer of larynx,
similarly as described this fact in brest cancer.
Słowa kluczowe: rak krtani, CYP 1A1, CYP1A2, CYP1B,
CYP19A1
Key words: larynx cancer, CYP 1A1, CYP1A2, CYP1B,
CYP19A1
Wprowadzenie
Organizm ludzki poddawany działaniu różnych ksenobiotyków znajdujących się w aerozolu zanieczyszczonego
powietrza, takich jak WWA (wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne) lub inne, wchłania je i poprzez kolejne
reakcje z udziałem enzymów detoksykacyjnych z rodziny
cytochromu P450 (CYP) powstają z nich pochodne o charakterze hydrofilnym, które niejednokrotnie po metabolicznej aktywacji mogą być kancerogenne. Przykładem takim
jest np. benzo(a)piren, który przekształcony z udziałem CYP
do np. 7, 8-dihydrodiolu zapoczątkowuje proces kancerogenezy [1]. Benzo(a)piren (BaP) zaburza również homeostazę steroidową [2]. Indukuje on CYP1A1/2 i 1B1, które
biorą udział nie tylko w jego biotransformacji, ale również
w biosyntezie endogennych hormonów i biotransformacji
egzogennych (estrogeny) [3]. Biotransformacja hormonów
płciowych i ksenobiotyków może mieć taki sam początek,
a mianowicie związki te mogą łączyć się zamiennie z jądrowymi receptorami estrogenowymi (ER) lub progesteronowymi (PR) lub androgenowymi (AR) albo cytoplazmatycznym receptorem węglowodorów aromatycznych (AhR).
5
Farm Przegl Nauk, 2009,1
Dlatego też nazywane one są estrogenami środowiskowymi
lub ksenoestrogenami [4]. W hormonozależnych tkankach
(piersi, jajniki i macica u kobiet a jądra i gruczoł krokowy
u mężczyzn) procesy nowotworzenia mogą być inicjowane
przez ksenoestrogeny, do których należą m.in. WWA oraz
inne węglowodory znajdujące się w dymie papierosowym
[5]. Zamienność tej drogi objawia się zmniejszeniem aktywności aromatazy (CYP19A1) w tych tkankach [6]. Aromataza jest kluczowym enzymem biosyntezy hormonów steroidowych, bierze udział w konwersji androgenów (testosteronu, androstendionu) w estrogeny (estron, 17β-estradiol) [7].
Niezaprzeczalnym jest, że dym papierosowy i zanieczyszczenia środowiskowe przyczyniają się do powstawania raka
krtani [8], najczęstszego nowotworu głowy i szyi, drugiego
po raku płuca nowotworu dróg oddechowych powiązanego
z paleniem tytoniu [9, 10]. Od aktywności transkrypcyjnej
wielu genów zależy stopień osobniczej wrażliwości na kancerogenne pochodne.
Celem tej pracy była ocena różnic aktywności transkrypcyjnej genów z rodziny cytochromu CYP1A1 (homo
i heterozygot), CYP1A2, CYP1B, CYP19A1 uczestniczące
w procesach kancerogenezy wielu nowotworów poprzez
ich udział w metabolizmie ksenobiotyków, w guzach krtani
i tkance prawidłowej,
Ryc. 1. Obraz elektroforegramu przedstawiający A). polimorfizm genu CYP1A1 homozygota i 1A1* heterozygota B)
wynik oceny jakościowej ekstraktów RNA marker wielkości DNA pBR322/HaeIII
Materiały i metody
Profil ekspresji genów kodujących białka cytochromu
P450 i polimorfizm genu CYP1A1 wyznaczano w wycinkach guzów nowotworowych krtani oraz w tkankach ocenionych histopatologicznie jako prawidłowe (kontrola), pobranych od 25 chorych po resekcji krtani, leczonych w II Katedrze i Klinice Laryngologii SAM w Zabrzu (Na pobranie
wycinków otrzymano zgodę komisji biotycznej ŚAM obecnie SUM). Po rozdrobnieniu i mechanicznej homogenizacji
tkanki przy użyciu homogenizatora Polytron® (Kinematyka
AG, Szwajcaria) z homogenatów ekstrahowano genomowy
DNA przy użyciu zestawu Genomic Mini z zastosowaniem
kolumienek (AKOR Laboratories, Polska), zgodnie z protokołem producenta, w celu wyznaczenia polimorforfizmu
genu CYP 1A1 oraz ekstrahowano całkowity RNA z zastosowaniem odczynnika TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, Kalifornia, USA) zgodnie z protokołem producenta,
w celu wyznaczenia aktywności transkrypcyjnej badanych
genów. Otrzymany ekstrakt RNA oczyszczano również
zgodnie z protokołem producenta stosując zestaw RNease–
Free Dnase Set (Qiagen) zawierający DNazę I, bufor RDD
i kolumny Rneasy Mini Spin Column. Po zakończeniu ekstrakcji otrzymane kwasy nukleinowe oceniano jakościowo
techniką elektroforezy agarozowej (ryc.1) oraz jakościowo
metodą spektrofotometryczną z zastosowaniem spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech). Pomiaru dokonano
w kuwetach kwarcowych o drodze optycznej 1 cm. Wynik
pomiaru absorbancji równy 1 (OD) jest charakterystyczny
dla roztworu RNA o stężeniu 40μg/ml lub dla DNA 50 μg/
ml. Oczyszczone ekstrakty były matrycą w ocenie jakościowej i ilościowej profilu stężeń mRNA CYP1A1, 1A2, 1B1
i 19A1 zarówno w guzie, jak i w kontoli. Ilościową ocenę
aktywności transkrypcyjnej genów przeprowadzono techniką RT-QPCR TaqMan z wykorzystaniem starterów i sond
6
Ryc. 2
A) Wynik QRT-PCR (obraz kinetyki RT-PCR) wykonanej
dla każdej próby w trzech powtórzeniach. 1, 2 i 3 – dla
RNA CYP 1A1*; 4, 5 i 6 – dla mRNA kontroli endogennej
β-aktyny oraz 7, 8 i 9 – dla mRNA CYP1A1
B) Krzywa standardowa wykreślona dla wzorca wtórnego
(standardy β-aktyny)
jak i 1B1 oraz 19A1 do do liczby kopii
mRNA β-aktyny w każdym przypadku
tkanki nowotworowej krtani był większy niż dla tkanki zdrowej, przy czym
istotne statystycznie róznice (p≤0,05)
obserwowano jedynie jedynie dla heterozygot 1A1* i 1A2.
Podsumowanie

Obserwowane efekty spadku lub
wzrostu ekspresji CYP1A1 uzależnione
były od typu polimorficznego genu (homozygota, heterozygota), co może łączyć się ze zwiększoną podatnością tych
pacjentów na proces nowotworzenia
w badanej tkance.
Ryc. 3. Profil ekspresji genów kodujących białka z rodziny cytochromu P450

Wykazano istotną statystyczw wycinkach krtani; ca – rak, control – wycinki krtani oceniane
nie
niską
aktywność transkrypcyjną
na podstawie analizy histopatologicznej jako prawiodłowe
CYP1A2, biorącego udział również
w metabolizmie kancerogennych ksehybrydyzacyjnych wyznakowanych barwnikami fluorescennobiotyków,
w tkankach, w których histopatolocyjnymi FAM i TAMRA zaprojektowane i wykonanne przez
gicznie
nie
stwierdzona
obecności komórek nowoAplera. Otrzymane wyniki amplifikacji β-aktyny (kontroli
tworowych.
endogennej) stanowiły podstawę do włączenia wyznaczoneNie wykazano znaczących zmian ekspresji CYP1B1
go profilu stężeń mRNA dla określonego wycinka do analizy
i CYP19A1 w pobranych tkankach, co może świadporównawczej (ryc 2A). Liczbę kopii mRNA wyznaczano
czyć o braku ich udziału w tym przypadku w procena podstawie wyników wzorca β-aktyny (Applera) wykosie nowotworzenia krtani.
rzystywanego przez detektor sekwencji ABI PRISMTM 7700
do automatycznego wykreślenia krzywej standardowej dla
każdej analizy (ryc. 2B), a następnie wyliczał ilość kopii
cDNA badanego mRNA. Otrzymane fragmenty rozdzielono
elektroforetycznie w 10% żelu poliakrylamidowym i wybarwiono solami srebra. Analizę statystyczną otrzymanych
wyników przeprowadzono w programie Statistica 7.0 przy
p ≤ 0,05.
Wyniki
Część eksperymentalną pracy rozpoczęto od wyznaczenia typu polimorficznego genu CYP1A1 w wycinkach
z guzów nowotworowych krtani oraz wycinkach zdrowych
tkanek pobranych po resekcji krtani u chorych na nowotwory regionu głowy i szyi. Otrzymane wyniki wykazały
obecność jednego typu homozygoty CYP1A1 i heterozygoty CYP1A1* (ryc. 1) zarówno w tkankach zdrowych, jak
i nowotworowych. W kolejnym etapie badań dla wszystkich wycinków krtani wyznaczano profil ekspresji genów
CYP1A1, 1A1*, 1A2, 1B1 i 19A1. Miarą aktywności transkrypcyjnej była liczba kopii mRNA danego transkryptu
w 1µg całkowitego RNA. Porównując aktywność transkrypcyjną badanych genów zaobserwowano zwiększoną
statystycznie znamienną (p=0,036) ekspresję genu CYP1A1
w tkance zdrowej dla typu polimorficznego homozygotycznego, odwrotnie niż dla typu heterozygotycznego. W obu
przypadkach nie zaobserwowano statystycznie znamiennej
korelacji (r=0,58 i r=0,11) pomiędzy otrzymanymi wynikami w badanych grupach tkanki zdrowej i nowotworowej.
Takie porównanie charakteryzujące się wysokim stopniem skorelowania danych (r=0,997) otrzymano jedynie dla CYP1A2. Stosunek liczby kopii mRNA CYP1A2,
Piśmiennictwo
1. Tornqvist M., Ehrenberg L. On cancer risk estimation of
urban air polution. Environ. Health Perspect. 1994, 102
(4): 173-182.
2. Chang LW, Chang YC, Ho CC, Tsai MH, Lin P. Increase of carcinogenic risk via enhancement of cyclooxygenase-2 expression and hydroxyestradiol accumulation
in human lung cells as a result of interaction between
BaP and 17-beta estradiol. Carcinogenesis. 2007, 28
(7):1606-12.
3. Patel RD, Hollingshead BD, Omiecinski CJ, Perdew
GH. Aryl-hydrocarbon receptor activation regulates constitutive androstane receptor levels in murine and human
liver. Hepatology. 2007, 46 (1):209-18.
4. Toppari J., Larsen J.C., Christiansen P., Giwercman
A., Grandjean P., Guillette L.J., Jr, B Jégou B., Jensen T.K., Jouannet P., Keiding N., Leffers H., McLachlan J.A., Meyer O., Müller J., Rajpert-De Meyts
E., Scheike T., Sharpe R., Sumpter J., Skakkebaek
N.E. Male reproductive health and environmental
xenoestrogens. Environ. Health Perspect. 1996, 104
(4): 741–803.
5. Liu S., Abdelrahim M., Khan S., Ariazi E., Jordan V.C.,
Safe S. Aryl hydrocarbon receptor agonists directly activate estrogen receptor alpha in MCF-7 breast cancer
cells. Biol Chem. 2006, 387 (9):1209-13.
6. Patel MR, Scheffler BE, Wang L, Willett KL. Effects of
benzo(a)pyrene exposure on klifish (Fundulus heteroclitus) aromatase activities and mRNA. Aquat Toxicol.
2006, 77 (3):267-78.
7
7. Hayes TB, Stuart AA, Mendoza M, Collins A, Noriega N, Vonk A, Johnston G, Liu R, Kpodzo D. haracterization of atrazine-induced gonadal malformations in African clawed frogs (Xenopus laevis) and
comparisons with effects of an androgen antagonist
(cyproterone acetate) and exogenous estrogen (17beta-estradiol): Support for the demasculinization/feminization hypothesis. Environ Health Perspect. 2006,
114 (1):134-41.
8. Gandini S, Botteri E, Iodice S, Boniol M, Lowenfels AB,
Maisonneuve P, Boyle P. Tobacco smoking and cancer: a
meta-analysis. Int J Cancer. 2008, 122 (1):155-64.
9. Bosetti C, Bertuccio P, Levi F, Lucchini F, Negri E, La Vecchia C. Cancer mortality in the European Union, 1970-2003,
with a joinpoint analysis. Ann Oncol. 2008, 19 (4):631-40.
10.Bartsch H, Nair U, Risch A, Rojas M, Wikman H, Alexandrov K. Genetic polymorphism of CYP genes, alone or in
combination, as a risk modifier of tobacco-related cancers.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2000, 9 (1):3-28.
Adres do korespondencji:
Dr hab. Urszula Mazurek
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej
Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Śląski Uniwersytet Medyczny
8
Structure-activity relationship of benzodiazepine derivatives.
Part I. Non-nucleoside reverse transcriptase HIV-1 inhibitors
Piotr Włodno, Elżbieta Brzezińska
Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Medycznej, Wydział Farmaceutyczny
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Elżbieta Brzezińska
Streszczenie
Przeprowadzono analizę ilościowej zależności pomiędzy
strukturą i działaniem (QSAR) 52 pochodnych 4,5,6,7-tetrahydro-imidazolo[4,5,1-jk][1,4]benzodiazepin-2(1H)onu o działaniu hamującym na RT HIV-1. W analizie zastosowano parametry fizykochemiczne badanych związków obliczone z zastosowaniem metody pół-empirycznej
PM3. Zastosowano analizę regresji wielokrotnej (MR),
analizę skupień (CA) i analizę funkcji dyskryminacyjnej
(DFA) w celu wyłonienia grupy zmiennych klasyfikujących pochodne benzodiazepiny zgodnie z poziomem ich
aktywności anty-HIV-1 RT. Dzięki zastosowaniu analizy
MR ustalono istotną rolę parametrów hydrofobowych
i elektronowych badanych związków dla ich aktywności
biologicznej. Istotne równanie regresji wieloczynnikowej
uzyskane w MR może być użyte do przewidywania poziomu aktywności różnych pochodnych benzodiazepiny.
Zależność ta zawiera parametry użyte w metodach CA
i DFA. Analiz DFA i CA wykazały, że parametry: log
P (współczynnik podziału), N-N (odległość pomiędzy
atomami azotu BDZ), Q1 (ładunek elektryczny zgromadzony na atomie azotu N1 BDZ), %PSA (powierzchnia
polarna cząsteczki), HD (liczba wiązań wodorowych)
i V (objętość cząsteczki) są odpowiedzialne za klasyfikację związków jako silnie i słabo działające. Zdolność
przekraczania bariery krew-mózg odgrywa ważną rolę
w tej klasyfikacji. Zastosowane analizy pozwoliły zaproponować zasadę klasyfikacji BDZ wykazujących działanie anty-HIV-1 RT.
Słowa kluczowe: ilościowa zależność pomiędzy struktura i aktywnością; analiza regresji; analiza funkcji dyskryminacyjnej; analiza skupień; pochodne benzodiazepiny
Abstract
A quantitative structure-activity relationship (QSAR)
analysis of 52 4,5,6,7-tetrahydro-imidazo[4,5,1-jk][1,4]
benzodiazepin-2(1H)-one derivatives as RT HIV-1 inhibitors was carried out. The semi-empirical method
PM3 was employed to calculate a set of physicochemical
parameters for investigated compounds. The Multiple
Regression analysis (MR), Cluster Analysis (CA), and
Discriminant Function Analysis (DFA) were employed
to reduce dimensionality and investigate which subset of
variables is effective for classifying the benzodiazepine
derivatives according to their degree of anti- HIV-1 RT
activity. By using the MR we have found the important
role of the hydrophobic and electronic parameters of
investigated benzodiazepines H1-H52 for their activity.
The good multivariate relationship obtained by the use
of MR method can be used for predicting the quantitative
effect of anty-HIV-1 RT activity of different benzodiazepine derivatives. These relationships involved the parameters used in CA and DFA methods. The DFA and CA
methods showed that the parameters log P (partition coefficient), N-N (distance between BDZ nitrogen atoms),
Q1 (electric charge focused on BDZ N1 atom), %PSA
(polar surface area), HD (number of hydrogen bounds)
and V (molecular volume) are responsible for separation
between compounds with higher and lower activity. The
blood-brain barrier permeability plays very important
role in this classification. From used analysis we present a
prediction rule of classifying benzodiazepine derivatives
with anty-HIV-1 RT activity.
Keywords: quantitative structure-activity relationship;
regression, discriminant and cluster analysis, benzodiazepine derivatives
9
Wstęp
W badaniach nad poszukiwaniem nowych substancji
biologicznie czynnych wykorzystywane są tzw. układy wyjściowe – centroidy. Niektóre centroidy, częściej występują
w chemii medycznej i określane są mianem uprzywilejowanych, a ich pochodne wykazują różne kierunki działania. Do
tego typu układów wyjściowych zaliczyć można centroid
benzodiazepinowy. Jest to struktura, na bazie której otrzymano wiele substancji czynnych o bardzo różnorodnym kierunku i zakresie działania. Pochodne benzodiazepiny (BDZ)
zostały odkryte w 1954 roku przez Leo Sternbacha. Pierwsza
pochodna tego układu została opatentowana w 1959 roku,
a wprowadzona do lecznictwa już w roku 1960 pod nazwą
Librium (chlordiazepoksyd) [1]. Zainteresowanie tym lekiem zaowocowało wieloma badaniami. Obecnie zsyntetyzowano już tysiące BDZ, z czego na rynku dostępne są leki
zawierające kilkanaście substancji czynnych o tej budowie.
Są one szeroko stosowane w lecznictwie, jako ligandy receptora benzodiazepinowego w układzie GABA-ergicznym.
Ich działanie przeciwlękowe, miorelaksujące i uspokajające
uważane jest za klasyczne i nazywane diazepamo-podobnym. Badano również inne zastosowania farmakologiczne
pochodnych benzodiazepiny. Wymienić można wiele stwierdzonych efektów biologicznego działania BDZ. Wśród wymienianych znajdują się: związki działające przeciwarytmicznie [2-5]; antagoniści receptora cholecystokininowego
[6-8]: inhibitory odwrotnej transkkryptazy wirusa HIV-1
(NNRTI) [9-12]; antagoniści receptorów α-adrenergicznych
[13,14]; działające na receptory κ-opioidowe [15-18]; muskarynowe [19]; wpływające na ośrodek głodu [20-24];
przeciwlipemiczne [25]. Obecnie znana jest możliwość
zastosowania BDZ w wielu schorzeniach, a prace nad ich
dalszym wykorzystaniem wciąż trwają. Związki te działają
w obrębie centralnego układu nerwowego lub na obwodzie.
Ich zróżnicowane działanie może być spowodowane zarówno uwarunkowaniami farmakodynamicznymi, jak i farmakokinetycznymi. Efekt obserwowany może więc być zależny od właściwości fizykochemicznych determinujących
specyficzną biodostępność (np. umożliwiających pokonanie
bariery krew-mózg). Z powodu wielu kierunków działania i podobieństwa strukturalnego BDZ stanowią ciekawy
materiał badawczy w analizach (Q)SAR. Wnioski płynące
z analizy strukturalnej poszczególnych grup działania BDZ
w wielu przypadkach można uznać za wyczerpujące. Trudno jednak odnaleźć przykłady dociekania podstaw zróżnicowania działania pochodnych benzodiazepiny pomiędzy tymi
grupami. Podobieństwo cech fizykochemicznych związków
w grupach wykazujących określony efekt biologiczny i ich
odrębność pomiędzy grupami może definiować obserwowaną różnorodność działania pochodnych układu benzodiazepiny. Założono, że zróżnicowanie odpowiedzi biologicznej
ma podłoże farmakodynamiczne, ale również farmakokinetyczne. Rozpatrywano więc zarówno siłę działania BDZ
w grupach działania, jak również wpływ na jego ukierunkowanie. Celem pracy było odnalezienie prawidłowości
w ukierunkowaniu działania farmakologicznego pochodnych
o podobnej budowie i obserwacja centroidu benzodiazepinowego, jako niespecyficznego nośnika specyficznej odpowiedzi biologicznej. Niniejsza praca dotyczy badania grupy
10
52 pochodnych 4,5,6,7-tetrahydro-metylimidazolo[4,5,1-jk]
[1,4]benzo-diazepin-2(1H)-onu dla ustalenia charakterystyki strukturalnej wymagań BDZ o działaniu hamującym na
RT HIV-1. Dane strukturalne i o aktywności biologicznej
związków zgromadzono na podstawie prac źródłowych [9,
26-28].
Materiały i metody
Analizowane w pracy BDZ należą do znanej wśród nienukleozydowych inhibitorów HIV-1 RT (NNRTI) grupy
TIBO. Do badań przyjęto 52 związki (H1-H52) pochodzące
z bibliografii [9,26-28]. Strukturę pochodnych i aktywność
podano w Tabeli 1.
Dane o właściwościach fizykochemicznych związków
H1-H52 ustalono metodami obliczeniowymi z zastosowaniem metod pół-empirycznych. Podstawą badania właściwości były struktury związków w minimum energetycznym
(po optymalizacji geometrycznej metodą PM3 bez przeglądu konformacji). Związki opisano zbiorem zmiennych zgromadzonych za pomocą programów HyperChem 7.1, ACDLabs 8.0 (logD i pK): log P - lipofilowość, %PSA – odsetek
powierzchni o charakterze polarnym, N-N – odległość pomiędzy atomami azotu BDZ, HD i HA – liczba donorów
i akceptorów wiązań wodorowych, Q1 i Q2 – ładunek elektryczny na N1 i N4 BDZ, V – objętość cząsteczki, Cl, Br,
F, I – liczba atomów chlorowca, P – polaryzowalność objętościowa, S – pole powierzchni, M – masa cząsteczkowa,
Md – moment dipolowy, eH i eL – energia orbitali HOMO
i LUMO, B1 i B2 – wskażnik przenikania BBB, log D
– współczynnik dystrybucji (dane surowe przedstawiono
w Tabeli 2.).
Analizę statystyczną przeprowadzono z zastosowaniem
programu STATISTICA 7.0, metodami: regresji wielorakiej
(MR); analizy skupień (CA) metodą grupowania k-średnich;
analizy funkcji dyskryminacyjnej (DFA).
Wyniki badań
Analiza regresji wielokrotnej (MR – Multiple Regression)
Przeprowadzono pełną analizę regresji z zastosowaniem
parametrów fizykochemicznych obliczonych metodami
pół-empirycznymi dla związków H1–H52. Wyznaczono
macierz korelacji w poszukiwaniu ścisłych zależności pomiędzy zmiennymi niezależnymi, w celu odrzucenie modeli
regresji wielokrotnej, powstałych z równoczesnym udziałem skorelowanych zmiennych. Następnie prowadzono systematyczną analizę krokową dla zmiennej zależnej – aktywności biologicznej pIC50 z użyciem wszystkich zgromadzonych danych fizykochemicznych – zmiennych niezależnych.
Przeprowadzenie pełnej analizy krokowej wprowadziło do
modelu regresji 14 zmiennych niezależnych. Model ten opisuje 88% (r = 0,94; n = 52) zmienności całkowitej w badanej grupie przypadków aktywnych. Liczba przypadków (52)
nie upoważnia jednak do wprowadzenia 14 zmiennych do
modelu. Ponadto niektóre zmienne wykazywały korelacje
wewnętrzne. Ostatecznie najlepsze równanie po korekcie,
niezawierające skorelowanych danych tłumaczy 83% wariancji całkowitej w grupie przypadków, co nadal wskazuje
na bardzo dobre dopasowanie modelu (r = 0,91) i może mieć
wartość predykcyjną w zakresie aktywności anty-HIV-1 pochodnych benzodiazepiny. Powstały model wyrażony jest
równaniem:
pIC50
=
17,91(±5,90)
+
0,23(±0,24)log
P + 0,16(±0,03)%PSA – 5,74(±1,92)N-N – 0,58(±0,26)
HD – 0,02(±0,01)Q1 – 0,98(±0,31)HA + 2,24(±0,87)V
+ 0,43(±0,26)Cl
r = 0,91; R2 = 0,83; F = 26,611; p <0,0000; n = 52
Przedstawione równania korelacyjne zawiera elementy,
które wskazywane były uprzednio jako istotne dla aktywności anty-HIV-1 RT [29-30] i oparte na strukturze modeli
aktywności anty-HIV-1 RT [31-32] – HD, HA, N-N i Q1.
Przedstawione równanie wykazuje, że zdolność hamowania RT HIV-1 zależy wprost proporcjonalnie od lipofilowości (log P), liczby podstawników halogenowych (Cl)
i odwrotnie proporcjonalnie od liczby tworzonych wiązań
wodorowych (HD, HA), ładunku elektrycznego na atomie azotu N1 układu benzodiazepiny (Q1) i odległości
pomiędzy elektroujemnymi atomami układu zdolnymi do
tworzenia wiązań wodorowych (N-N). Dodatkowym czynnikiem wpływającym wprost proporcjonalnie na efektywność biologiczną obserwowanych przypadków jest wartość
parametru %PSA – odsetek pola powierzchni cząsteczki
zajmowany przez atomy tlenu i azotu połączone z atomami
wodoru. Jako jeden z podstawowych wskaźników zdolności
przenikania związku chemicznego przez barierę krew-mózg
(BBB) powinien posiadać wartość poniżej 16%. Wartości
wskaźnika %PSA związków H1-H52 mieści się w granicach 10,85-32,24% (średnio 15,73%). Te graniczne wartości
powodują, że efektem wpływu podwyższonego PSA może
być poprawa działania. Aktywność biologiczna badanej
grupy przypadków nie jest związana z centralnym układem
nerwowym. Dystrybucja leków w tym kierunku zmniejsza
więc potencjalnie ich stężenie w miejscu działania. Wśród
obecnych w modelu parametrów wymienić można również
inne czynniki wpływające na zdolność przekraczania tej bariery. Są nimi, wymienione już ze względu na dopasowanie
do modelu przestrzennego NNRTI, elementy struktury tworzące wiązania wodorowe HA i HD. Ich ograniczona liczba
sprzyja jednak dostępności do CUN i dla HA (akceptorów
wiązań) powinna być ≤10 oraz dla HD ≤5. W badanej grupie
związków wartość HA wynosi średnio 3,94 i HD 1,13, zaś
dla najlepiej działających przypadków przyjmuje wartości
najniższe, co zgodne jest z założeniami modelu przestrzennego [32]. Można więc stwierdzić, że wartości korzystne dla
zjawiska przenikania nie są preferowane w analizie NNRTI. Dodatkowo czynnik logP jest parametrem bezpośrednio
wykorzystywanym do obliczania teoretycznej wartości log
BB, jako podstawowej miary zdolności przenikania BBB.
Analiza skupień (CA – Cluster Analysis)
Wyniki przeprowadzonej analizy regresji wielokrotnej
związków H1-H52 stały się podstawą badania struktury danych i ich grupowania. Badania te oparto na analizie skupień
(CA) przeprowadzonej przy pomocy algorytmu klasyfikacji
– grupowania metodą k-średnich. Poszukiwano klasyfikacji
przedstawicieli grup BDZ przy założeniu uzyskania podziału na trzy skupienia przypadków reprezentujące poziom aktywności anty-HIV-1 – niski, średni i wysoki. Analiza oparta
została tylko na tych zmiennych (wartości standaryzowane),
których bezpośredni udział w kształtowaniu aktywności
biologicznej został udokumentowany analizą MR. Poniżej
przedstawiono wykres średnich wartości zmiennych dla
każdego skupienia (Ryc.1.) i istotne elementy wyniku analizy wariancji dla tych zmiennych (Tabela 3.):
Ryc. 1. Wykres średnich wartości standaryzowanych
zmiennych grupujących dla skupień 1-3
Badane przypadki utworzyły trzy skupienia: skupienie
1 – o średniej standaryzowanej wartości pIC50 -0,27 (działanie średnie); skupienie 2 – o średniej standaryzowanej wartości pIC50 -0,88 (działanie słabe) oraz; skupienie 3 – o średniej standaryzowanej wartości pIC50 0,93 (działanie silne). Wynik analizy wariancji wskazuje parametry
wyłonione w przebiegu analizy MR, jako kryteria przypisania obiektów do skupień 1-3. Najbardziej wyróżniającymi cechami przypadków należących do grupy silnie
działających (skupienie 3) są większe rozmiary cząsteczki
(S, V, P), większa lipofilowość (log P) i mała liczba donorów wiązań wodorowych (HD) i dodatni ładunek na atomie
azotu (Q1). Są to równocześnie parametry najsilniejszego
rozróżnienia pomiędzy związkami słabo i silnie działającymi (skupienie 2 i 3). Bardzo istotną informację przynosi
miara średniej %PSA dla skupienia 3 (patrz Tabela 3), która
odpowiada wartości surowej powyżej 16%. Potwierdza to
brak preferencji dla przenikania BBB. Dalsze obserwacje
wyników tej analizy dotyczą elementów każdego wydzielonego skupienia (Tabela 4). Dla większej czytelności uzyskanych wyników należy dodać, że kolejność przypadków
H1-H52 odpowiada wzrastającej sile działania.
Analiza funkcji dyskryminacyjnej (DFA – Discriminant
Function Analysis)
Analiza funkcji dyskryminacyjnej prowadzona w niniejszym doświadczeniu służy wyznaczeniu funkcji klasyfikacyjnych, które mogą być wykorzystane do przewidywania
poziomu potencjalnego działania pochodnych BDZ w zakresie hamowania RT HIV-1. Prowadzona tu DFA ma charakter
11
ilościowy. Sposób wyznaczenia zmiennej grupującej oparty
został na wynikach analizy skupień. Badane pochodne H1H52 opisano kodami grupowymi: 1 – średnio działające;
2 – słabo działające i 3 – silnie działające hamująco na RT
HIV-1. Do analizy wprowadzono tylko zmienne niezależne
(standaryzowane) uzyskane z analizy MR i użyte następnie
w analizie grupowania metodą k-średnich CA do wyznaczenia skupień 1-3 (log P, %PSA, N-N, HD, Q1, HA, V, Cl, P
i S). Analizę prowadzono przy użyciu krokowej metody postępującej wyznaczającej zmienne dyskryminujące spośród
wprowadzonych do analizy. Po pięciu kolejnych krokach
analizy i wprowadzeniu 5 zmiennych dyskryminujących do
modelu uzyskano dwie funkcje dyskryminacyjne. Obliczone
funkcje dyskryminacyjne pozwoliły na stworzenie wykresu
rozrzutu przypadków (Ryc. 2).
Ryc. 2. Wykres rozrzutu przypadków H1-H52 na podstawie
średnich zmiennych kanonicznych funkcji dyskryminacyjnej
1 (pierwiastek 1) w stosunku do funkcji dyskryminacyjnej 2
(pierwiastek 2)
Jak widać grupy 1-3 są wyraźnie rozdzielone i stanowią
skupiska przypadków o pewnym rozproszeniu. Mimo obserwowanego rozproszenia kontrola prawdopodobieństwa
a posteriori klasyfikacji związków nie wykazuje błędów
w przyporządkowaniu przypadków (tabeli prawdopodobieństwa nie zamieszczono). Poszczególne przypadki zostały zakwalifikowane do odpowiednich grup z prawdopodobieństwem w granicach r = 0,98-1,00; związki H19
(r = 0,92); H43 (r = 0,91); H32 (r = 0,71). Badanie macierzy klasyfikacji wykazało, że prawdopodobieństwo a priori
jest całkowite. Procent przypadków, które zostały poprawnie sklasyfikowane w każdej grupie przez aktualne funkcje
klasyfikacyjne równe są 100% (Tabela 5).
Na podstawie satysfakcjonujących wyników analizy zaproponowano trzy funkcje klasyfikacyjne charakteryzujące:
Grupę 1 BDZ o umiarkowanym działaniu hamującym
na RT HIV-1
G_1 = 2,8 V + 4,3 HD – 3,2 PSA% – 1,9 N-N – 0,1 Cl
– 1,2 Q1 – 5,9
Grupę 2 BDZ o słabym działaniu hamującym na RT
HIV-1
G_2 = – 5,1 V + 1,8 HD – 0,9 PSA% + 0,8 N-N – 1,2
Cl + 0,4 Q1 – 4,4
12
Grupę 3 BDZ o silnym działaniu hamującym na RT
HIV-1
G_3 = 3,4 V – 3,6 HD + 2,3 PSA% + 0,1 N-N + 1,2 Cl
+ 0,2 Q1 – 4,1
Przedstawione funkcje klasyfikacyjne mogą być wykorzystane jako praktyczne narzędzie klasyfikacji nowych przypadków.
Wnioski
Na podstawie przeprowadzonej analizy zaproponowano
charakterystykę strukturalną pochodnych BDZ o działaniu
hamującym na RT HIV-1. Analiza MR pozwala na ustalenie, że wyższa aktywność pIC50 pochodnych H1-H52 zależna jest od następujących czynników: lipofilowości logP
powyżej 2,55; %PSA powyżej 15,73%; odległość atomów
azotu N-N poniżej 2,90 Å; liczby donorów wiązań wodorowych HD poniżej 1,13; niskiego ładunku dodatniego na
atomie azotu N1 Q1; liczby akceptorów wiązań wodorowych HA poniżej 3,94; V powyżej 275 Å3; obecności podstawników halogenowych Cl (podane wartości graniczne
stanowią średnią arytmetyczną danych surowych w badanej
grupie). Większość tych parametrów wpływa na możliwość
przenikania związków przez barierę krew-mózg. Badane
związki nie wykazywały działania diazepamo-podobnego.
Przeprowadzona analiza MR wskazuje na brak preferencji dla czynników sprzyjających pokonywaniu BBB przez
benzodiazepinowe NNRTI. Analiza skupień pokazuje, że
zmienność niektórych parametrów nie zachowuje trendu
zgodnego z wynikiem analizy regresji, szczególnie w przypadku pochodnych o słabym i średnim działaniu (skupienia
2 i 1). W opisanym przypadku najbardziej widoczne jest to
w odniesieniu do korzystnej wartości ładunku dodatniego
na atomie N1 układu benzodiazepiny. Różnice te dają możliwość obserwacji struktury zmienności kolejnych parametrów
w mniejszych zakresach przypadków. W badaniach licznych
grupa przypadków obserwowane w MR korelacje poszczególnych zmiennych są jedynie trendem wypadkowym zjawiska
w całej grupie. Węższe zakresy obserwacji w CA mogą ujawniać zmienność tego trendu dla kolejnych skupień przypadków
o bardziej sprecyzowanych właściwościach (np. biologicznych). Skupienia te, które podobne są pod względem strukturalnym, mogą charakteryzować się nawet trendem przeciwnym, co nie ujawnia się w badaniu łącznie całej grupy. Jest to
najczęściej spowodowane zbyt małym wpływem średniej wartości zmiennej dla danego skupienia. Tak ujawniona struktura
zmienności całkowitej pomaga uniknąć formułowania zbyt
uogólnionych wniosków i zastosować właściwe wskazówki do dalszych badań. Wyłonione w przebiegu CA skupienia
1-3 – grupy działania średniego, słabego i silnego są podstawą
analizy dyskryminacyjnej. Satysfakcjonujące wynik analizy
dyskryminacyjnej pozwoliły na sformułowanie równań matematycznych, jako praktycznego narzędzia kwalifikowania nowych pochodnych do badań biologicznych. Analizy CA i DFA
całkowicie potwierdzają, że zróżnicowanie odpowiedzi biologicznej w grupie BDZ NNRTI ma podłoże farmakodynamiczne, ale również farmakokinetyczne i zależy w dużej mierze od
zahamowania zdolności przenikania BBB.
Badania wykonano w ramach tematu badawczego
finansowanego przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Nr 502-13-626
Tabela 1.
Pochodne H1-H52 o działaniu hamującym odwrotną transkryptazę wirusa
HIV-1
4,5,6,7-tetrahydroimidazolo[4,5,1-jk]
[1,4]benzodiazepin-2(1H)-on
związek
R1
R2
R3
R4
pIC50
H1
H
O
CH2CO2CH3
5-CH3
3,04
H2
8-NH2
O
CPM
5-CH3
3,07
H3
9-NHCOCH3
O
CPM
5-CH3
3,80
H4
H
O
CH2CH=CHC6H5
5-CH3
3,91
H5
H
O
CH2-2-furanyl
5-CH3
3,97
H6
H
O
CH2CH2CH2CH3
5-CH3
4,00
H7
H
O
CH2CH2CH3
5-CH3
4,05
H8
H
O
CH2CHCH2
5-CH3
4,15
H9
H
O
CH2C(CH=CH2)=CH2
5-CH3
4,15
H10
H
O
CH2C(Br)CH2
5-CH3
4,21
H11
9-NH2
O
CPM
5-CH3
4,22
H12
H
O
CH2CHCHCH3
5-CH3
4,24
H13
H
O
CH2CH2CHCH2
5-CH3
4,30
H14
H
O
2-MA
5-CH3
4,33
H15
H
O
CPM
5-CH3
4,36
H16
H
O
CH2C(C2H5)=CH2
5-CH3
4,43
H17
H
O
CH2CHCHCH3
5-CH3
4,46
H18
H
O
CH2C(CH3)=CHCH3
5-CH3
4,54
H19
H
O
DMA 5-CH3
4,90
H20
8-NCH3
O
CPM
5-CH3
5,18
H21
9-N(CH3)2
O
CPM
5-CH3
5,18
H22
10-OCH3
O
DMA
5-CH3
5,18
H23
8-CONH2
O
DMA
5-CH3
5,20
H24
9-CF3
O
DMA
5-CH3
5,23
H25
10-OCH3
S
DMA
5-CH3
5,33
H26
H
O
DMA
5-CH3
5,48
H27
9-NO2
S
CPM
5-CH3
5,61
H28
10-Br
S
DMA
5-CH3
5,97
H29
8-CH3
O
DMA
5-CH3
6,00
H30
9-CF3
S
DMA
5-CH3
6,31
H31
8-CONH2
S
DMA
5-CH3
6,73
H32
9-Cl
O
DMA
5-CH3
6,74
H33
9-Cl
S
DMA
H
6,80
H34
8-OC2H5
S
DMA
5-CH3
7,02
H35
8-I
O
DMA
5-CH3
7,06
H36
H
S
CPM
5-CH3
7,22
H37
8-CN
S
DMA
5-CH3
7,25
H38
8-I
S
DMA
5-CH3
7,32
H39
8-Br
O
DMA
5-CH3
7,33
H40
8-Cl
S
DMA
H
7,34
H41
H
S
DMA
5-CH3
7,36
H42
9-Cl
S
DMA
5-CH3
7,47
13
H43
8-OCH3 S
DMA
5-CH3
7,47
H44
9-Cl
S
CPM
5-CH3
7,47
H45
8-CCH
S
DMA
5-CH3
7,53
H46
9-F
S
DMA
5-CH3
7,60
H47
9,10-di-Cl
S
DMA
5-CH3
7,60
H48
8-CH3
S
DMA
5-CH3
7,87
H49
8-F
S
DMA
5-CH3
8,24
H50
8-SCH3
S
DMA
5-CH3
8,30
H51
8-Cl
S
DMA
5-CH3
8,37
H52
8-Br
S
DMA
5-CH3
8,52
Tabela 2.
Wartości parametrów fizykochemicznych dla inhibitorów odwrotnej transkryptazy pochodnych 4,5,6,7-tetrahydroimidazolo[4,5,1jk][1,4]
benzodiazepin-2(1H)-onu
Zw.
pIC50
S [Å2]
V [Å3]
logP
R [Å3]
P [Å3]
M
HD
HA
Q1 [C]
Q2 [C]
Md
[D]
H1
3,04
288,39
245,87
0,45
73,18
28,43
275,31
1,00
6,00
0,08
-0,06
2,50
H2
3,07
273,19
241,07
0,49
74,23
28,28
258,32
3,00
5,00
0,08
-0,02
4,14
H3
3,80
315,25
276,53
0,12
82,61
32,04
300,36
2,00
6,00
0,09
-0,02
2,90
H4
3,91
345,85
306,20
3,18
97,25
37,17
319,41
1,00
4,00
0,08
-0,07
3,90
H5
3,97
289,02
258,18
0,16
81,93
30,85
283,33
1,00
5,00
0,08
-0,07
3,82
H6
4,00
292,37
253,94
2,08
76,20
29,54
259,35
1,00
4,00
0,06
-0,07
2,85
H7
4,05
274,05
237,30
1,69
71,59
27,70
245,32
1,00
4,00
0,08
-0,08
3,96
H8
4,15
268,03
232,71
1,02
71,48
27,51
243,31
1,00
4,00
0,08
-0,07
3,89
3,79
H9
4,15
293,24
260,11
1,95
80,41
30,99
269,35
1,00
4,00
0,08
-0,08
H10
4,21
274,39
245,10
1,67
79,02
30,14
322,20
1,00
4,00
0,08
-0,07
5,86
H11
4,22
276,61
241,59
0,49
74,23
28,28
258,32
3,00
5,00
0,09
-0,02
4,09
H12
4,24
267,59
238,85
1,38
77,51
29,35
257,34
1,00
4,00
0,07
0,03
3,43
H13
4,30
268,98
239,57
1,87
76,24
29,35
257,34
1,00
4,00
0,08
-0,08
3,89
H14
4,33
293,39
251,13
1,77
75,77
29,35
257,34
1,00
4,00
0,09
0,01
4,14
H15
4,36
263,39
230,60
1,27
69,53
26,93
243,31
1,00
4,00
0,09
0,03
3,97
H16
4,43
298,26
264,79
2,16
80,37
31,18
271,36
1,00
4,00
0,08
-0,08
3,83
H17
4,46
276,16
243,12
1,38
77,51
29,35
257,34
1,00
4,00
0,06
0,01
3,52
H18
4,54
267,70
246,64
2,35
81,23
31,28
272,37
1,00
4,00
0,06
-0,06
2,96
H19
4,90
296,72
264,60
2,11
80,54
31,18
271,36
1,00
4,00
0,09
-0,07
3,89
H20
5,18
309,36
275,43
1,54
83,96
31,95
286,38
1,00
5,00
0,09
-0,02
4,40
H21
5,18
314,05
275,88
1,54
83,96
31,95
286,38
1,00
5,00
0,09
-0,02
4,34
H22
5,18
325,98
289,07
1,85
87,00
33,65
301,39
1,00
5,00
0,08
-0,07
4,75
H23
5,20
325,92
292,41
0,94
89,12
34,45
314,93
3,00
6,00
0,09
-0,06
3,19
H24
5,23
327,92
288,92
2,99
86,51
32,74
339,36
1,00
4,00
0,09
-0,07
3,88
H25
5,33
337,12
300,41
3,45
95,59
36,82
317,45
1,00
4,00
0,24
-0,08
7,31
H26
5,48
280,33
248,13
1,69
76,12
29,35
257,34
1,00
4,00
0,08
-0,06
3,97
H27
5,61
299,03
261,08
-1,05
84,43
31,93
304,37
1,00
6,00
0,23
-0,03
4,70
H28
5,97
331,06
297,31
4,49
96,75
36,97
366,32
1,00
3,00
0,24
-0,08
6,36
H29
6,00
314,62
280,91
2,57
85,58
33,02
285,39
1,00
4,00
0,08
-0,07
4,14
H30
6,31
343,19
305,35
3,09
91,10
34,75
357,44
1,00
3,00
0,98
-0,11
11,79
H31
6,73
325,06
293,13
3,38
95,71
36,26
315,43
1,00
4,00
0,25
-0,07
4,83
H32
6,74
315,00
278,83
2,62
85,35
33,11
305,81
1,00
4,00
0,08
-0,06
3,41
H33
6,80
301,86
270,23
3,80
89,51
34,44
307,84
1,00
3,00
0,24
-0,07
5,67
H34
7,02
353,63
316,68
3,79
100,33
38,65
331,48
1,00
4,00
0,23
-0,08
7,19
H35
7,06
322,51
292,59
3,36
92,25
36,21
397,26
1,00
4,00
0,09
-0,07
3,17
H36
7,22
276,06
241,70
2,86
78,11
30,09
259,37
1,00
3,00
0,24
-0,04
6,25
H37
H38
7,25
7,32
326,61
333,26
293,58
303,72
3,74
4,96
94,86
101,53
36,20
39,37
312,43
413,32
1,00
1,00
4,00
3,00
0,24
0,24
-0,08
-0,08
2,38
5,59
14
H39
7,33
321,58
293,50
4,42
91,23
34,78
348,28
1,00
4,00
0,05
-0,08
1,99
H40
7,34
307,21
273,37
3,80
89,51
34,44
307,84
1,00
3,00
0,24
-0,07
5,39
H41
7,36
305,26
271,82
3,23
87,54
33,43
285,41
1,00
3,00
0,24
-0,08
6,25
H42
7,47
318,87
285,70
3,75
92,34
35,36
319,85
1,00
3,00
0,24
-0,07
5,70
H43
7,47
330,65
295,69
2,98
94,00
35,90
315,43
1,00
4,00
0,23
-0,07
7,00
H44
7,47
293,20
255,88
3,38
82,92
32,02
293,81
1,00
3,00
0,24
-0,04
5,53
H45
7,53
336,46
303,57
4,35
98,81
37,82
313,46
1,00
3,00
0,24
-0,07
6,43
H46
7,60
312,71
278,42
3,84
89,34
34,25
305,41
1,00
3,00
0,24
-0,08
5,18
H47
7,60
339,19
303,78
4,74
98,73
38,20
356,31
1,00
3,00
0,24
0,07
5,82
H48
7,87
325,75
292,09
4,17
94,16
36,18
301,45
1,00
3,00
0,24
-0,08
6,65
H49
8,24
305,21
274,18
3,37
87,76
33,34
303,40
1,00
3,00
-0,01
-0,03
4,70
H50
8,30
340,09
306,56
3,32
100,45
38,27
331,49
1,00
3,00
0,24
-0,67
6,49
H51
8,37
316,25
285,51
3,75
92,34
35,36
319,85
1,00
3,00
0,24
-0,07
5,44
H52
8,52
327,93
296,76
4,49
96,75
36,97
366,32
1,00
3,00
-0,05
-0,01
5,09
związki
N-N [Å]
eH
[ kcal/mol]
eL
[ kcal/mol]
B1
B2
H1
2,91
-8,74
-0,01
-0,71
H2
2,80
-8,34
0,06
-0,70
H3
2,81
-8,57
-0,24
H4
2,90
-8,75
H5
2,95
H6
H7
logD
Cl
F
Br
I
%PSA
-0,44
1,28
0,00
0,00
0,00
0,00
21,46
-0,44
-0,78
0,00
0,00
0,00
0,00
22,55
-0,80
-0,49
-0,02
0,00
0,00
0,00
0,00
20,52
-0,31
0,10
-0,02
2,81
0,00
0,00
0,00
0,00
10,29
-8,79
0,04
-0,56
-0,23
1,46
0,00
0,00
0,00
0,00
16,86
2,94
-8,90
-0,14
-0,07
-0,02
1,67
0,00
0,00
0,00
0,00
12,17
2,88
-8,75
0,03
-0,13
-0,02
1,14
0,00
0,00
0,00
0,00
12,98
H8
2,89
-8,74
0,02
-0,23
-0,02
1,47
0,00
0,00
0,00
0,00
13,27
H9
2,96
-8,76
0,00
-0,09
-0,02
2,61
0,00
0,00
0,00
0,00
12,13
H10
2,95
-8,90
-0,16
-0,13
-0,02
2,73
0,00
0,00
1,00
0,00
12,97
H11
2,81
-8,31
0,07
-0,70
-0,44
-0,66
0,00
0,00
0,00
0,00
22,27
H12
2,87
-8,24
-0,15
-0,18
-0,02
1,92
0,00
0,00
0,00
0,00
13,30
H13
2,81
-8,74
0,02
-0,10
-0,02
2,04
0,00
0,00
0,00
0,00
13,23
H14
2,85
-8,74
-0,01
-0,12
-0,02
1,79
0,00
0,00
0,00
0,00
12,13
H15
2,86
-8,75
0,03
-0,19
-0,02
0,38
0,00
0,00
0,00
0,00
13,51
H16
2,97
-8,76
0,01
-0,06
-0,02
2,33
0,00
0,00
0,00
0,00
11,93
H17
2,87
-8,23
-0,16
-0,18
-0,02
1,92
0,00
0,00
0,00
0,00
12,88
H18
2,88
-6,20
-1,19
-0,03
-0,02
2,26
0,00
0,00
0,00
0,00
13,29
H19
2,88
-8,90
-0,14
-0,07
-0,02
3,10
0,00
0,00
0,00
0,00
11,99
H20
2,74
-8,32
0,05
-0,20
-0,07
0,59
0,00
0,00
0,00
0,00
12,55
H21
2,79
-8,24
0,11
-0,20
-0,07
0,92
0,00
0,00
0,00
0,00
12,36
H22
2,88
-8,68
0,09
-0,24
-0,17
2,09
0,00
0,00
0,00
0,00
13,75
H23
2,86
-8,92
0,60
-0,88
-0,71
0,83
0,00
0,00
0,00
0,00
24,14
H24
2,88
-9,17
-0,62
0,07
-0,02
3,65
0,00
3,00
0,00
0,00
10,85
H25
2,91
-8,19
-0,69
-0,22
-0,41
2,80
0,00
0,00
0,00
0,00
17,75
H26
2,89
-8,71
0,04
-0,13
-0,02
1,64
0,00
0,00
0,00
0,00
12,69
H27
2,84
-8,79
-1,56
-1,45
-1,00
2,17
0,00
0,00
0,00
0,00
32,24
H28
2,91
-8,36
-0,94
0,07
-0,26
3,63
0,00
0,00
1,00
0,00
15,28
H29
2,86
-8,65
0,06
0,00
-0,02
2,53
0,00
0,00
0,00
0,00
11,31
H30
2,74
-5,88
-2,04
-0,14
-0,26
4,30
0,00
3,00
0,00
0,00
14,74
H31
2,90
-8,65
-0,94
-0,35
-0,54
2,50
0,00
0,00
0,00
0,00
20,82
H32
2,96
-8,68
-0,17
0,01
-0,02
3,17
1,00
0,00
0,00
0,00
11,30
H33
2,81
-8,33
-0,91
-0,03
-0,26
3,50
1,00
0,00
0,00
0,00
16,76
H34
2,89
-8,16
-0,71
-0,17
-0,41
3,50
0,00
0,00
0,00
0,00
16,92
H35
2,85
-8,74
-0,58
0,12
-0,02
3,43
0,00
0,00
0,00
1,00
11,03
H36
2,89
-8,26
-0,77
-0,18
-0,26
1,22
0,00
0,00
0,00
0,00
18,33
H37
2,90
-8,63
-1,33
-0,39
-0,64
3,76
0,00
0,00
0,00
0,00
22,78
H38
2,88
-8,31
-0,90
0,14
-0,26
4,09
0,00
0,00
0,00
1,00
15,18
H39
2,76
-8,37
-0,09
0,28
-0,02
3,18
0,00
0,00
1,00
0,00
11,06
H40
2,92
-8,32
-0,91
-0,03
-0,26
3,69
1,00
0,00
0,00
0,00
16,47
15
H41
2,89
-8,26
-0,76
-0,12
-0,26
3,82
0,00
0,00
0,00
0,00
16,58
H42
2,81
-8,32
-0,90
-0,04
-0,26
3,99
1,00
0,00
0,00
0,00
15,87
H43
2,79
-8,17
-0,85
-0,29
-0,41
2,97
0,00
0,00
0,00
0,00
18,09
H44
2,89
-8,34
-0,92
-0,10
-0,26
2,69
1,00
0,00
0,00
0,00
17,26
H45
2,88
-8,19
-0,84
0,05
-0,26
3,35
0,00
0,00
0,00
0,00
15,04
H46
2,91
-8,37
-0,96
-0,03
-0,26
3,44
0,00
1,00
0,00
0,00
16,18
H47
2,90
-8,38
-1,03
0,11
-0,26
4,40
2,00
0,00
0,00
0,00
14,92
H48
2,89
-8,19
-0,72
0,02
-0,26
3,29
0,00
0,00
0,00
0,00
15,53
H49
2,81
-8,38
-0,94
-0,10
-0,26
3,13
0,00
1,00
0,00
0,00
16,58
H50
2,78
-8,21
-0,84
-0,48
-0,67
3,50
0,00
0,00
0,00
0,00
22,32
H51
2,81
-8,31
-0,90
-0,04
-0,26
3,69
1,00
0,00
0,00
0,00
16,00
H52
2,90
-8,37
-0,94
0,07
-0,26
3,84
0,00
0,00
1,00
0,00
15,43
Tabela 3.
Wyniki analizy wariancji dla zmiennych w modelu i wartości średnich dla każdego skupienia
zmienna
F
p
pIC50
S
V
logP
P
HA
HD
Q1
N-N
Cl
PSA%
54,35542
63,76588
69,51182
38,37724
68,65278
1,64278
21,53544
9,25522
3,12496
5,79882
1,68609
0,000000
0,000000
0,000000
0,000000
0,000000
0,203915
0,000000
0,000389
0,052805
0,005491
0,195811
Średnia 1
skupienia
-0,270097
0,620892
0,586988
-0,218937
0,231819
0,340133
0,868383
-0,492178
-0,617155
-0,371015
-0,455939
Średnia 2
skupienia
-0,88282
-1,06432
-1,07565
-0,84214
-1,03855
0,13447
0,40995
-0,41918
0,31305
-0,37101
-0,02781
Średnia 3
skupienia
0,925338
0,685341
0,711052
0,865097
0,838763
-0,276852
-0,767399
0,604788
-0,004066
0,505929
0,232531
Tabela 4.
Elementy każdego skupienia i ich odległość od środka skupienia
Elementy skupienia
1 o działaniu średnim
16
odległość
Elementy skupienia
2 o działaniu
słabym
odległość
Elementy skupienia
3 o działaniu silnym
odległość
H3
0,996428
H1
0,826443
H25
0,622601
H4
H20
H21
H22
H23
H24
H29
H35
H39
0,800506
0,636572
0,440089
0,349281
1,401729
0,491963
0,427278
0,591008
0,813233
H2
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13
H14
H15
H16
H17
H18
H19
H26
H27
H36
1,374987
0,572766
0,484278
0,349789
0,395729
0,579017
0,447480
1,323457
0,320487
0,511137
0,395197
0,462283
0,670163
0,283501
0,390788
0,481683
0,338070
1,531500
0,861703
H28
H30
H31
H32
H33
H34
H37
H38
H40
H41
H42
H43
H44
H45
H46
H47
H48
H49
H50
H51
H52
0,508992
1,767258
0,519840
0,973703
0,691904
0,679353
0,593641
0,556812
0,637294
0,508636
0,575944
0,598260
0,831838
0,448987
0,444526
1,277764
0,351001
0,799258
0,795917
0,613459
0,767912
Tabela 5.
Macierz obserwowanych i przewidywanych klasyfikacji przypadków w grupach z zastosowaniem modelu
Macierz klasyfikacji Wiersze: obserwowana klasyfikacja Kolumny: Przewidywana klasyfikacja
Procent poprawnie
G_1
G_2
G_3
G_1
100,0000
10
0
0
G_2
100,0000
0
20
0
G_3
100,0000
0
0
22
Razem
100,0000
10
20
22
Elżbieta Brzezińska
Zakład Chemii Analitycznej UM w Łodzi,
ul. Muszyńskiego 1, 90-151 Łódź, tel. 042-677-92-11;
[email protected]
17
RECEPTORY I TRANSPORTERY AMIN BIOGENNYCH W ŁOŻYSKU
W PRZEBIEGU NADCIŚNIENIA INDUKOWANEGO CIĄŻĄ
I CUKRZYCY CIĄŻOWEJ
RECEPTORS AND TRANSPORTERS OF BIOGENIC AMINES
IN PLACENTA COMPLICATED WITH PREGNANCY INDUCED HYPERTENSION
AND PREGNANCY DIABETES
Agnieszka Więcławek1, Helena Sławska2, Justyna Szota1,
Grażyna Janikowska3, Aleksander Owczarek4,
Ewa Plucińska1. Urszula Mazurek1
1
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, 2Katedra i Klinika Ginekologii i Perinatologii,
Zakład Chemii Analitycznej, 4 Zakład Statystyki, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
3
Streszczenie
Patofizjologia nadciśnienia indukowanego ciążą (PIHpregnany induced hypertension) i cukrzycy ciążowej
(GDM- gestational diabetes mellitus) nie została jeszcze w pełni wyjaśniona. Kluczową rolę w rozwoju analizowanych zaburzeń odgrywają aminy biogenne, których transport i sygnalizacja receptorowa odbywają się
w tkance łożyska.
Celem pracy jest ocena aktywności transkrypcyjnej genów kodujących receptory i transportery amin biogennych (adrenaliny, noradrenaliny, dopaminy i serotoniny)
w łożysku w grupie kobiet ciężarnych z rozpoznanym
nadciśnieniem indukowanym ciążą oraz w grupie kobiet
w przebiegu cukrzycy ciążowej w porównaniu do grupy kontrolnej metodą mikromacierzy oligonukleotydowych.
Uzyskane wyniki wykazały, iż znaczące statystycznie
różnice dotyczą ekspresji genów kodujących transporter
NET (norepinephrine transporter) w obu grupach badanych i ekspresji receptora ADR B2 (adrenergic, beta-2-,
receptor) w grupie nadciśnienie ciążowego w stosunku
do grupy kontrolnej. Wyniki te wskazują, iż receptory
i transportery amin biogennych zajmują szczególne miejsce w patogenezie PIH i GDM.
Słowa kluczowe: nadciśnienie ciążowe, cukrzyca ciążowa, transporter noradrenaliny, receptor adrenergiczny,
mikromacierze oligonukleotydowe
18
Summary
The pathophysiology of pregnancy induced hypertension
and pregnancy diabetes is yet not quite explained. Crucial
role in these pathologies plays biogenic amines, which
transport and receptor signalling occurs in placenta tissue.
Aim of his study is transcription activity evaluated of
the genes encoded receptors and transporters of biogenic
amines (epinephrine, norepinephrine, dopamine, serotonin) in placentas women complicated with pregnancy
induced hypertension, pregnancy diabetes, comparison to
control group by using microaray method.
Obtained results suggest, that statistical significance concern genes encoded NET transporters, in both testing
groups, and ADR B2 receptor in pregnancy induced hypertension in comparison to control group
These results indicate that receptors and transporters of
biogenic amines are very important in pathogenesis of
PIH and GDM.
Key words: pregnancy induced hypertension, gestational
diabetes mellitus, norepinephrine transporter, adrenergic
receptor, oligonucleotide microarray
WSTĘP
Istotnymi patologiami, które towarzyszą ciąży są nadciśnienie ciążowe oraz cukrzyca ciążowa. W Polsce rok
rocznie obserwuje się około 30 tysięcy nowych zachorowań
u kobiet ciężarnych na tę postać nadciśnienia, co daje ogółem 5-10% występowanie tej patologii [1]. Z kolei cukrzyca
ciąża wikła około 3-5% ciąż [2].
Nadciśnienie ciążowe zawiera w sobie nadciśnienie tętnicze przewlekłe, które rozwinęło się i zostało rozpoznane
jeszcze przed zajściem w ciąże lub przed 20 tygodniem ciąży, stan przedrzucawkowy i rzucawkę (z białkomoczem),
które zazwyczaj występują po 20 tygodniu ciąży, stan przedrzucawkowy nałożony na przewlekłe nadciśnienie tętnicze
oraz nadciśnienie tętnicze ciążowe wykryte po 20 tygodniu
ciąży bez białkomoczu [3].
Termin nadciśnienie indukowane ciążą jest zbiorczym
terminem zawierającym w sobie nadciśnienie tętnicze ciążowe i stan przedrzucawkowy [4].
Jak pokazują dane literaturowe wśród zaburzeń o charakterze metabolicznym cukrzyca jest najistotniejszym
zaburzeniem tego rodzaju dotykającym kobiety ciężarne
i jeśli zostało ono po raz pierwszy rozpoznane w czasie ciąży określamy je terminem cukrzycy ciążowej –GDM [2].
W tym miejscu należy podkreślić, iż cukrzyca ciążowa
stanowi istotny czynnik predysponujący wystąpienie nadciśnienia indukowanego ciążą [5], czego potwierdzeniem
mogą być wyniki prezentowane w niniejszej pracy.
Wśród licznych spekulacji dotyczących patomechanizmu nadciśnienia indukowanego ciążą sugeruje się, iż tkanka łożyskowa, która jest ważnym miejscem syntezy i metabolizmu amin biogennych, zajmuje miejsce szczególne, tym
bardziej, iż jedynym, w pełni skutecznym na chwilę obecną
sposobem leczenia tej postaci nadciśnienia jest terminach
ciąży [6-9].
Szczególnie istotne w rozwoju PIH są geny kodujące
receptory i transportery amin biogennych, których zmiany
w ekspresji obserwowane są w przebiegu tej postaci nadciśnienia [9-12]. W licznych danych literaturowych spotyka
się skorelowanie występowania nadciśnienia indukowanego
ciążą z obniżoną ekspresją transporterów katecholowych
amin biogennych [9, 13].
Powikłania, które towarzyszom nadciśnieniu indukowanemu ciążą dotyczą zarówno organizmu matki, jak i płodu. Do nich zalicza się: rzucawkę porodową, niewydolność
krążeniowo-oddechową, przedwczesne odklejenie łożyska,
zespół wykrzepiania wewnątrznaczyniowego oraz powikłanie o największej śmiertelności wśród wymienionych
– udar krwotoczny mózgu. Konsekwencje dla płodu wiążą się
w głównej mierze ze zmniejszoną masą urodzeniową (zahamowanie wewnątrzmacicznego rozwoju płodu) na skutek
zmniejszonej łożyskowej perfuzji, a przypadku cukrzycy
ciążowej powikłania koncentrują się wokół nadmiernej
masy urodzeniowej, makrosomii, dystocji barkowej, zespołu zaburzeń oddechowych, żółtaczki, hipoglikemii, czasem
cukrzyca ciążowa prowadzi także do urodzeń martwych
płodów [1, 5].
U kobiet ciężarnych należy pamiętać, iż GDM często
jest stanem na bazie, którego wraz z rozwojem ciąży powstaje PIH [5].
Wobec takiego faktycznego stanu rzeczy poznanie patomechanizmu PIH wydaje się być w pełni uzasadnione.
MATERIAŁ I METODY
Materiał do badań stanowiły fragmenty tkanki łożyska pobrane od kobiet w trakcie zabiegu cięcia cesarskiego. Grupy badane
stanowiły pacjentki z rozpoznanym nadciśnieniem indukowanym ciążą (grupa I, n=6) oraz pacjentki z cukrzycą ciążową (grupa II, n=5). Grupę kontrolną stanowiły kobiety o prawidłowym
przebiegu ciąży pod względem ciśnienia tętniczego i metabolizmu węglowodanów, a cięcia cesarskiego dokonano z powodów
okulistycznych czy też z powodu wąskiej miednicy
Analizę molekularną rozpoczęto od ekstrakcji całkowitego RNA przy użyciu odczynnika TRIZOL (Invitrogen)
i oczyszczonego z wykorzystaniem kolumienek Rneasy Mini
Spin Kolumn i zestawu odczynników RNease–Free Dnase
Set zawierającego DNazę I i bufor RDD (Qiagen). Ocenę jakościową ekstraktów przeprowadzono metodą elektroforezy
agarowej a ilościowo techniką spektrofotometrii, przy użyciu
spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech).
Wyznaczanie transkryptomu przeprowadzono techniką
mikromacierzy oligonukleotydowych z zastosowaniem płytek HGU 133A (Affymetrix) zgodnie z protokołem producenta. Sygnały fluorescencji na płytce odpowiadające 22283
mRNA odczytano przy użyciu skanera Agilent GeneArray
Scanner G2500A (Agilent Technologies, Kalifornia, USA).
Otrzymane wyniki zapisano i zarchiwizowano w programie
Microarray Suite. Analizę porównawczą transkryptomów
przeprowadzono wykorzystując programy komputerowe:
Statistica v.6,0, Excel oraz: Microarray Suite v.5,0, SAM (significance analysis of microarrays), program RMA Express
oraz program do analizy danych QRT–PCR ABI Prism 7000
SDS Software. Typowanie transkryptów różnicujących wycinki łożysk patologicznych od prawidłowych, przeprowadzono zmodyfikowaną do potrzeb danych z mikroamcierzy
metodą statystyczną opracowaną przez Blanda i Altmana
opisaną w 1986 roku. Metoda bazuje na obliczeniu współczynika SLR (signal log ratio) określającego logarytm różnicy intensywności fluorescencji mikromacierzy jednej grupy względem mikromacierzy grupy drugiej
2 bi ,
SLR = b − a = log
i
i
2
2 ai
gdzie, –i-oznacza transkrypt na mikromacierzy A,
–i transkrypt na mikromacierzy B.
Analizę porównawczą zakończono oceną statystyczną
otrzymanych wyników przeprowadzoną w programie SAM,
wykorzystującym analizę wariancji dwóch niezależnych
prób. Wykorzystany test T Studenta został wzbogacony analizą permutacji (parametr Score), natomiast prawdopodobieństwo przypadowości obserwowanych różnic oceniona na
podstawie współczynnik Q. Jest on wyrażony w procentach.
O istotnych statystycznie różnicach decyduje Q<5% parametr
score>3. (przy wzroście wariancji, współczynnik Q maleje).
WYNIKI
Porównanie transkryptomów rozpoczęto od normalizacji wyników w programie RMA Express, mającej na celu
wyeliminowanie różnic w intensywności fluorescencji po-
19
nie ekspresji NET (nadciśnienie/kontrola
p=0.017, cukrzyca/kontrola, p=0.025) w obu
grupach badanych w porównaniu do grupy
kontrolnej oraz obniżenie ekspresji ADRA
B2 (p=0,025) pomiędzy grupą cukrzycy
ciążowej, a grupą kontrolną. Zmiany te
nie dotyczą porównania grupy nadciśnienia względem cukrzycy ciążowej. Dla potwierdzenia zdolności różnicowania NET
i ADRA B2 zastosowano metodę wektorów
nośnych (SVM, suport vector machines),
której rezultaty są wysoce zbieżne z analizą
Blanda-Altmana.
Dyskusja
Problem groźnych w skutkach powikłań, których występowanie w przebiegu
nadciśnienia indukowanego ciążą dotyczy
zarówno organizmu matki, jak i organizmu
dziecka jest jedną z głównych przyczyn
umieralności okołoporodowej kobiet ciężarnych i płodów. Chan i wsp. określają nadciśnienie indukowane ciążą, a szczególnie
stan przedrzucawkowy jako jednostkę choRycina 1
robową wieloukładową dotyczącą wątroby,
Geny związane z aktywnością biologiczną amin biogennych
układu nerwowego, układu krzepnięcia,
NET–transporter dla noradrenaliny, DAT –transporter dla dopaminy, SERT–trannerek, ale przede wszystkim struktury łożysporter dla serotoniny, VMAT1– pęcherzykowy transporter monoamine 1, OCT
ska, które jest istotnym organem odpowie1–3 transportery jonów organicznych , ADRA– receptory adrenergiczne, DRD–
receptory dopaminowe, HTR– receptory serotononowe, PAH– hydroksylaza fenydzialnym za katabolizm oraz syntezę amin
loalaninowa, TH– hydroksylaza tyrozynowa, DDC– dekarboksylaza aminokwasów
biogennych. Badania wskazujące podwyżaromatycznych, MAOA– oksydaza monoaminowa A, COMT– metylotranferazy O–
szony poziom stężenia amin biogennych
katecholowa, DBH– β–hydroksylazy dopaminowa, PNMT – N–metylotransferaza
w przebiegu stanu przedrzucawkowego [15]
fenyloetanoloaminowa, TPH1– hydroksylaza tryptofanu, MAO B– oksydaza mosugerować mogą, iż stan ten, jak i ogólnie
noaminowa B, CYP– cytochrom P–450, ALDH– dehydrogenaza aldehydowa,
AANAT– N – acetylotransferaza serotoniny, ASMT – acetyloserotonino – O –
nadciśnienie indukowane ciążą, może być
metylotransferaza, ASMTL– acetyloserotonino – O – metylotransferaza, AOX1–
związane z nasiloną biosyntezą lub zmniejoksydaza aldehydowa 1
szonym katabolizmem amin biogennych.
Stosunkowo nowo opisywaną w literaturze
funkcję metaboliczną tkanki łożyska przymiędzy analizowanymi mikromacierzami wynikających
pisuje
się
występującym
w tym narządzie transporterom
z różnego czasu przeprowadzenia eksperymentu, czy
amin
biogennych.
Białka
te,
umożliwiają wychwyt krążąteż różnic związanych z poziomem tła fluorescencji
cych
w
osoczu
amin,
dzięki
czemu
utrzymywana jest wedanej mikromacierzy. Następnie z 22283 mRNA dokownątrzmaciczna
równowaga
0.
Nguyen
i wsp. sugerują, że
nano selekcji transkryptów związanych z aktywnością
głównym
mechanizmem
warunkującym
oczyszczanie krwi
biologiczną adrenaliny, noradrenaliny, dopaminy i sez
amin
biogennych
podczas
ciąży
jest
mechanizm
zależny
rotoniny (ryc. 1). Wyboru tych transkryptów dokonano
od
transporterów,
zabezpieczający
płód
przed
szkodliwym
na podstawie zebranych danych literaturowych oraz informacji dostępnych w internetowych bazach danych, a działaniem wysokich stężeń krążących amin biogennych
następnie poszukiwano transkyptów związanych z ak- 0. Tylko całościowe spojrzenie na cząsteczki uczestniczątywnością biologiczną amin biogennych o potencjale ce w aktywności amin biogennych może stanowić podstaróżnicującym łożyska kobiet z nadciśnieniem induko- wę do oceny udziału amin biogennych w zmianach patowanym ciążą oraz cukrzycą ciążową w porównaniu do logicznych indukowanych nadciśnieniem ciążowym.
łożysk pobranych od kobiet o prawidłowym przebiegu W przedstawionej pracy całościowe spojrzenie obejmociąży (grupy kontrolnej). Zastosowana metoda Blanda- wało transkryptom wyznaczony techniką mikromacierzy
Altmana umożliwiła wyłonienie genów różnicujących oligonukleotydowych HGU133A (Affymetrix). Analizą
obie patologie względem grupy kontrolnej. Wśród ana- zostały objęte geny, które kodują białka związane z: translizowanych genów kodujących receptory i transportery portem i metabolizmem amin biogennych oraz geny koamin biogennych znaczące są geny kodujące transporter dujące receptory amin biogennych i białka uczestniczące
dla NEToraz receptor adrenergiczny ADRA 2C i ADR w sygnalizacji komórkowej regulowanej przez aminy
B2 (rys. 2 i 3, tabela 1 i 2). Analiza istotności statystycz- biogenne. Otrzymane wyniki wskazują na znaczący udział
nej testem U-Manna Withneya wykazała znaczące obniże- w obsewrwowanej patologii genów NET i MAOB.
20
PIŚMIENNICTWO
[1] K. Kawecka-Jaszcz W. Lubaszewski.
„Nadciśnienie tętnicze w ciąży.” Przewodnik
Lekarza, 6:120-124, 2003.
[2] Standardy Polskie Towarzystwa Ginekologicznego postępowania u kobiet z cukrzycą,
2005:. www.gpsk.am.poznan.pl
[3] M. Mazanek-Mościcka, K. Kawecka-Jaszcz,
„Podwyższone ciśnienie tętnicze u kobiet w ciąży”. Medycyna Praktyczna, 4: 39-68, 2001.
[4] C.G. Solomon, E.W. Seely. Hypertension in
Pregnancy. Hypertension, 37: 232-239, 2001..
[5] C.l. Bryson, G.N. Ioannou, S.J. Rulyak,
C. Critchlow. Association between gestational
diabetes and pregnancy-induced hypertension.
Am J Epidemiol, 158: 1148-1153, 2003.
[6] J.P. Granger i wsp., Patophysiology of
Pregnancy-Induced Hypertension. Am J Hypertens, 14: 178-185., 2001.
Rycina 2
Typowanie genów różnicujących łożyska kobiet z nadciśnieniem indukowanym [7] P. Ian, S.E. Kjeldsen, I. Eide, N. Norman.
ciążą od łożysk pobranych od kobiet o prawidłowym przebiegu ciąży.
“Adrenaline and Preeclampsia”. Acta Medica
MAOB–transkrypt monoaminooksydazy B, CYP1A1–transkrypt cytochromu Scandinavica. Supplementum,693:29-32., 1985.
P–450, rodziny 1, podrodziny A, polipeptydu 1, ALDH1A2–transkrypt dehydroge[8] S. Tenhola i wsp. “Blood Pressure, serum lipids,
nazy aldehydowej rodziny 1, przedstawiciela A2, CYP19A1–transkrypt cytochromu P–450, rodziny 19, podrodziny A, polipeptydu 1, NET–transkrypt transportera fasting insulin and adrenal hormones in 12-year-old
children born with maternal preeclampsia”. J Clin
dla noradrenaliny, ADRA2C–transkrypt receptora adrenergicznego α 2C.
Endocrinol Metab, 88: 1217-1222, 2003.
[9] B. Bottalico i wsp. “Norepinephrine transporter (NET), serotonin transporter (SERT),
vesicular monoamine transporter (VMAT2)
and organic cation transporters (OCT1, 2 and
EMT) in human placenta from pre-eclamptic
and normotensive pregnancies”. Placenta,
25:518-29, 2004.
[10] T.T .Nguyen i wsp. “Placental biogenic
amine transporters: in vivo function, regulation and pathobiological significance”, Placenta, 20:3-11, 1999.
[11] MA Elwan, T Ishii, N.Sakuragawa “Characterization of dopamine D2 receptor gene
expression and binding sites in human placenta amniotic epithelial cells”, Placenta.,
24:658-63, 2003.
[12] P. Oian. i wsp. “Adrenaline and preecuśredniony sygnał fluorescencji
lampsia”. Acta Medica Scandinavica. Supplementum; 693:29-32, 1985..
Rycina 3
[13] L. Bzoskie i.wsp. “Human placental noGeny różnicujące łożyska pobrane od kobiet z cukrzycą ciążową od łożysk pobrarepinephrine transporter mRNA: expression
nych od kobiet z prawidłowym przebiegiem ciąży.
MAOB–transkrypt monoaminooksydazy B, ALDH1A2–transkrypt dehydrogena- and correlation with fetal condition at birth”.
zy aldehydowa rodziny 1, przedstawiciela A2, CYP19A1–transkrypt cytochromu Placenta. 18::205-210, 1997.
P–450, rodziny 19, podrodziny A, polipeptydu 1, NET–transkrypt transportera dla [14] Manyona LT, Slater DM, Fenske C, Hole D, Choy
noradrenaliny, ADRA2C–transkrypt receptora adrenergicznego α 2C, ADRB2– MJ, Wilson C. A role for noradrenaline in pre-eclapsia:
transkrypt receptora adrenergicznego β2
towards a unifying hypothesis for the pathophysiology, Br J Obstet Gynaecol 1998; 105: 641–648
[15] Bolte AC, van Geijn HP, Dekker GA, Pathophysiology
of preeclampsia and the role of serotonin, Eur J Obstet
Gynecol Reprod Biol 2001; 95: 12–21.
[16] Nguyen TT, Tseng YT, Mc.Gonnigal B et al. Placental
biogenic amine transprters: in vivo function, regulation
andpathobiological sigificance.Placn
21
Grupa transkryptów
Transportery
Metabolizm
Transkrypt
Różnicujący
NET
216611_s_at
MAOB
204041_at
Istotność statystyczna
Test
Test T
U-Manna
(Q)
Withneya (p)
Score
SLR
2 SLR
↑↓
PIH/C
0,02
0
2,9
-0,869
1,615
↓
0,038
8,125
1,88
-1,1
2,14
↓
Tabela 1
Transkrypty różnicujące wśród transkryptów kodujących receptory, transportery oraz związanych z metabolizmem amin biogennych wyznaczone w oparciu o metodę Blanda i Altmana oraz metodę SAM pomiędzy grupą nadciśnienia indukowanego ciążą i grupą kontrolną
Grupa transkryptów
Transportery
Metabolizm
Transkrypt
różnicujący
NET
215303_s_at
MAO B
204041_at
ALDH1A2
207016_s_at
Istotność statystyczna
Test
U-Manna
Test T
Withneya
(Q)
(p)
Score
SLR
2 SLR
↑↓
GDM/C
0,05
0
2,33
-0,999
1,99
↓
0,10
0
3,16
-1,11
2,16
↓
0,05
0
3,63
-1,64
3,12
↓
Tabela 2
Transkrypty różnicujące wśród transkryptów kodująyche receptory, transportery oraz związanych z metabolizmem amin biogennych
wyznaczone w oparciu o metodę Blanda i Altmana oraz metodę SAM pomiędzy cukrzycy ciążowej, a grupą kontrolną
Dr Agnieszka Więcławek
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej
Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Śląski Uniwersytet Medyczny,
41-206 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1
22
The role of natural antioxidants in prevention of civilization diseases
Maria Wojtanowska-Rzytki
Katedra i Zakład Toksykologii
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Sosnowcu
Kierownik placówki: Jerzy Kwapuliński
Streszczenie
Antyoksydanty są to związki chemiczne neutralizujące
wolne rodniki. Wolne rodniki tlenowe powstają fizjologicznie w organizmie z tlenu i pełnią wiele korzystnych
funkcji.
Problem pojawia się wtedy, gdy powstają w nadmiarze.
Dostarczane są one również z zewnątrz a ich źródłem są
zanieczyszczenia środowiska, dym tytoniowy, smażona
żywność, jełczenie tłuszczów. Najbardziej narażone na
nadmiar wolnych rodników są osoby palące papierosy
oraz żyjące w zanieczyszczonym środowisku. Wolne
rodniki mogą uszkadzać komórki oraz sprzyjać rozwojowi takich chorób, jak miażdżyca, choroba niedokrwienna serca, nadciśnienie tętnicze, nowotwory, choroby układu nerwowego, zaburzenia odporności.
W organizmach żywych występują antyoksydanty enzymatyczne i nieenzymatyczne.
Do najważniejszych antyoksydantów zalicza się witaminę: A, C, E, beta-karoten, selen oraz flawonoidy. Substancją utleniającą jest również w organizmie człowieka
koenzym Q10 chroniący szczególnie naczynia krwionośne i serce. Bardzo duże znaczenie mają przeciwutleniacze zawarte w warzywach i owocach, tj. tymianek,
cynamon, porzeczka, imbir, dla których udokumentowano wybitne właściwości ochronne, antymutagenne
i przeciwnowotworowe. Wszystkie wymienione związki mają działanie prewencyjne i chronią geny przed
tlenowymi atakami chemicznych utleniaczy i wolnych
rodników. Podsumowując, warto podkreślić, że właściwe odżywianie jest 10-cio krotnie ważniejszym elementem w porównaniu do reszty środowiskowych czynników ryzyka jeśli chodzi o zachorowalność na choroby
nowotworowe.
Słowa kluczowe: antyoksydanty, wolne rodniki, witaminy, pierwiastki
Abstract
Antioxidants are chemical compounds neutralizing free
radicals. Free oxygen radicals are formed physiologically in the organism from oxygen and have many beneficial functions. The problem arises in the situation
when they are formed in excess. They are also introduced into the organism from the outside and their sources are environmental pollution, cigarette smoke, fried
food, fat rancidity. Smokers and people living in the
polluted environment are most exposed to the excess
of free radicals. Free radicals may be responsible for
cell damage and lead to the development of the diseases
such as atherosclerosis, myocardial ischemia, arterial
hypertension, cancer, diseases of the nervous system or
immunity disturbances.
Enzymatic or non-enzymatic antioxidants are present in
living organisms. Vitamins A, C, E,
beta-carotene, selenium and flavonoids are the most important antioxidants.
Coenzyme Q10 which is produced in the human organism is also an antioxidant. It protects blood vessels
and the heart in particular. Antioxidants present in fruit
and vegetables such as in thyme, cinnamon, currant and
ginger are of great importance since they possess welldocumented considerable protective, antimutagenic and
anti-cancer properties. All the above-mentioned compounds have a preventive activity, protect genes from oxygen attacks of chemical oxidants and free radicals.
In conclusion, it is necessary to stress that proper nutrition is 10 times more important in comparison with the
rest of environmental risk factors as far as the incidence
of cancer is concerned.
Key words: antioxidants, free radicals, vitamins, elements
23
W ostatnich latach coraz częściej obserwuje się duże
zainteresowanie występowaniem antyoksydantów znajdujących się w wielu składnikach pokarmowych oraz ich fizjologiczną rolą.
Bardzo ważnym aspektem zdrowotnym jest utrzymanie
w organizmie równowagi pomiędzy substancjami utleniającymi a przeciwutleniaczami. W sytuacji zaburzenia tej równowagi na korzyść substancji utleniających, funkcje obronne organizmu są w dużym stopniu upośledzone. Zaburzenie
takie określane jest mianem stresu oksydacyjnego. Tlen,
którym oddychamy, ulega w organizmie czteroetapowej redukcji, w wyniku której powstaje cząsteczka wody. Produkty niecałkowitej redukcji cząsteczki tlenu nazwano reaktywnymi formami tlenu. Mogą być to neutralne cząsteczki lub
jony oraz wolne rodniki tlenowe, które bardzo szybko mogą
wchodzić w reakcje z białkami, lipidami, cukrami oraz kwasami nukleinowymi obecnymi w komórkach, prowadząc
do powstania kolejnych produktów wolnorodnikowych.
Jednym z najbardziej aktywnych wolnych rodników jest
rodnik hydroksylowy. Powstające w nadmiarze reaktywne
formy tlenu powodują utlenianie tłuszczów, białek, DNA,
a co za tym idzie mogą przyczynić się do uszkodzenia tkanek.
Toksyczne produkty reakcji utleniania wywierają działanie
cytostatyczne na komórkę, doprowadzają do uszkodzenia
błon komórkowych i aktywują mechanizmy apoptozy. Wysoce reaktywne formy tlenu to niestabilne cząstki chemiczne zwane inaczej wolnymi rodnikami, powstają podczas
procesów przemiany materii w odpowiedzi na bodźce, takie
jak np. promieniowanie UV, zanieczyszczenia powietrza
lub dym tytoniowy. Stale powstające w naszym organizmie
wolne rodniki ulegają procesom rozpadu, przy czym u ludzi
zdrowych są one natychmiast niszczone. Inaczej proces ten
przebiega w starzejącym się organizmie, w którym to wolne rodniki mogą być czynnikami potencjalnie uszkadzającymi komórki organizmu, prowadząc do destrukcji białek
i degeneracji komórek. Do chorób, w których stres oksydacyjny odgrywa kluczową rolę, zalicza się między innymi: choroby układu krążenia, neurodegeneracyjne, choroby zapalne tj. reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzyca,
a także procesy starzenia się. Choroby te wynikają z różnych przyczyn, lecz u podłoża wszystkich leżą zaburzenia równowagi oksydacyjno-antyoksydacyjnej organizmu
w kierunku reakcji utleniania.
Wolne rodniki mogą tworzyć się w organizmie pod
wpływem czynników endogennych, jak i egzogennych.
Powstają one nie tylko pod wpływem czynników fizykochemicznych i biologicznych, lecz także pod wpływem
stresu. W warunkach homeostazy reaktywne formy tlenu
pełnią funkcję mediatorów i regulatorów metabolizmu indukują różnicowanie komórek aktywują wiele genów indukują apoptozę, wpływając na syntezę uwalnianie lub inaktywację śródbłonkowego czynnika aktywującego naczynia, działają rozszerzającą bądź kurcząco na ścianę naczyń
krwionośnych, zwiększają przepuszczalność ścian naczyń
włosowatych, stymulują transport glukozy do komórek
i serotoniny do płytek krwi.
Wpływają także na przekazywanie sygnałów do komórek i wewnątrz komórek, regulują ekspresję genów oraz
mogą stawać się wtórnymi przekaźnikami zarówno w procesie wzrostu, jak i śmierci komórek.
24
Nadmierna produkcja reaktywnych form tlenu oraz
wyczerpanie przez organizm rezerw oksydacyjnych, czyli
„stres oksydacyjny” prowadzi do utlenienia białek, w konsekwencji modyfikuje ich strukturę i zaburza funkcję.
Wysokie stężenie reaktywnych form tlenu wyzwala
i nasila procesy uszkodzenia biocząsteczek. Na poziomie
molekularnym reaktywne formy tlenu powodują degradację
kolagenu zaburzenia syntezy i inaktywację proteoglikanów,
inaktywację enzymów, pęknięcia nici DNA oraz mutacje
prowadzące do zmian nowotworowych.
W komórkach jednak istnieje wiele skutecznych mechanizmów chroniących przed toksycznym działaniem reaktywnych form tlenu. W warunkach homeostazy dzięki działaniu
enzymatycznych i nieenzymatycznych antyoksydantów
nadmiar wolnych rodników jest likwidowany i uszkodzenia
biomolekuł są naprawiane. System obronny organizmu jest
bardzo złożony, ponieważ obejmuje wiele oddziałujących
na siebie substancji endogennych substancji zaprogramowanych genetycznie oraz pochodzących z żywności.
Antyoksydanty to związki chemiczne, które neutralizują wolne rodniki. Rozróżniamy antyoksydanty enzymatyczne i nieenzymatyczne (Vit.A, C, E, betakaroten, selen, bioflawonoidy).Witaminy A, C, E wykazują działanie
przeciwutleniające, obniżają poziom cholesterolu we krwi
hamują, tworzenie zakrzepów żył, obniżają ciśnienie krwi.
Witamina E i betakaroten ze względu na swoją rozpuszczalność w tłuszczach chronią przed utlenianiem lipidy. Witamina C rozpuszczalna w wodzie, spełnia funkcję obronną
we wszystkich płynach ustrojowych. Flawonoidy należą
do związków polifenolowych, występują między innymi
w herbacie, winogronach, cytrusach, czerwonym winie,
mają właściwości antyoksydacyjne.
Również pierwiastki: selen, cynk, miedź, mangan, wchodzące w skład wielu enzymów, hamują procesy prowadzące
do powstania wolnych rodników. Substancją antyutleniającą jest wytwarzany w organizmie koenzym Q10 chroniący
szczególnie naczynia krwionośne i serce.
Niektóre substancje wchodzące w skład przypraw kuchennych tj. tymianek, rozmaryn, goździki, cynamon,
pieprz, imbir są także cennymi antyutleniaczami. Największe właściwości antyoksydacyjne ze względu na obecność
witaminy E ma olej z kiełków pszenicy. Warto wspomnieć
tutaj o ważnych antyoksydantach roślin jadalnych, o udokumentowanym działaniu przeciwnowotworowym: aurapten - sok grejpfrutowy, kwas elagowy - herbata, winogrona, wiśnie, orzechy laskowe, karbazol - liście rozmarynu,
kurkumina - składnik przyprawy Curry, likopen - pomidor,
resweratol - ciemne winogrona i czerwone wino oraz aliksyna - czosnek. System obronny organizmu jest bardzo złożony ponieważ obejmuje wiele oddziałujących na siebie substancji endogennych zaprogramowanych genetycznie oraz
pochodzących z żywności. Niektóre antyoksydanty np.witaminy mogą być stale uzupełniane przez spożywanie odpowiednich produktów, inne jak Koenzym Q10 wytwarzane są
w tkankach lecz na ich zawartość w organizmie może wpływać również sposób odżywiania.
Prawidłowy stan odżywiania organizmu witaminami,
flawonoidami i sładnikami mineralnymi tj. Cu, Mn, Se, Zn
pełni w tych mechanizmach podstawową rolę.
Wśród znanych antyoksydantów bardzo duże znacze-
nie dla człowieka ma selen jako selenocysteina, która pełni
ochronną rolę przed stresem oksydacyjnym. Nieprawidłowy
poziom selenu wiąże się ze wzrostem poziomu ryzyka zachorowania na takie choroby, jak reumatoidalne zapalenie
stawów, kardiomiopatia czy choroby nowotworowe. Selen
redukując ulegające utlenianiu związki zmniejsza produkcję zapalnych prostaglandyn i leukotrienów, bierze udział
w utrzymaniu ciągłości błon komórkowych ochrania produkcję prostacyklin, bierze udział w produkcji aktywnych
hormonów tarczycy. Selen wiążąc metale jest niezbędny do
prawidłowej syntezy testosteronu, zmniejsza także ryzyko
poronień. Hamuje także hamuje ich destrukcyjne działanie
na zdrowe tkanki, dlatego jest tak ważnym pierwiastkiem
dla palaczy oraz dla osób mieszkających w bardzo zanieczyszczonych regionach. Jest niezbędny do optymalnego
działania układu autonomicznego oraz hamuje progresję zakażenia w pełnoobjawowy AIDS.
Istnieją badania pokazujące, iż niedobór selenu może
być czynnikiem ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego oraz sprzyjać rozwojowi chorób nowotworowych.
Selen jest dostarczany do organizmu w postaci organicznej jako selenometionina i selenocysteina oraz nieorganicznej głównie w postaci seleninów i selenianów.
Problem stanowi fakt, iż selen charakteryzuje się bardzo niewielką granicą pomiędzy niedoborem, a dawką toksyczną, czyli posiada niski indeks terapeutyczny. Podawany
w stężeniach powyżej 600 µg/24h jest jednym z najbardziej
toksycznych pierwiastków.
Ostre zatrucie selenem objawia się dusznością, biegunką, częstoskurczem, a nawet śmiercią.
Antyoksydantem działającym w fazie wodnej jest witamina C oraz Koenzym Q 10.
Witamina C pełni szczególną rolę w ochranianiu tkanki
płucnej i ocznej, hamuje peroksydację hemoglobiny. Przewlekłe niedobory tej witaminy sprzyjają powstawaniu miażdżycy oraz sprzyjają rozwojowi procesu kancerogenezy.
Bezsporne jest hamowanie przez witaminę C powstawania
zmian przedrakowych błony śluzowej żołądka oraz działanie ochronne w dysplazji szyjki macicy. Badania epidemiologiczne wykazały że regularne spożywanie kwasu askorbinowego zmniejsza ryzyko występowania nowotworów
żołądka, przełyku oraz nowotworów płuc. Jedną z hipotez
wyjaśniających to działanie jest fakt, iż jako związek donorowy jest akceptorem niesparowanych elektronów, które
to z kolei wywołują uszkodzenia struktur komórkowych,
prowadząc do zapoczątkowania procesów nowotworzenia.
Witamina C pełni więc w organizmie rolę utrzymującą równowagę środowiska wewnątrz i zewnątrzkomórkowego.
Do lipofilnych antyoksydantów zaliczamy tokoferole
czyli witaminę E, która działa kompleksowo z innymi antyoksydantami, tj.koenzym Q10, witamina C i karotenoidy.
Niedobór witaminy E może potęgować stany zapalne
w organizmie, zmiany chorobowe w układzie krwionośnym
zwłaszcza o charakterze miażdżycowym, a także nasilać
procesy nowotworowe.
Są dowody na to, że alfa-tokoferol może hamować stany przedrakowe sutka u kobiet, natomiast w badaniach doświadczalnych wykazano, że witamina E i C hamują tworzenie się nitrozoamin - związków zwiększających ryzyko
zachorowania na raka żołądka. Własności antyoksydacyjne
mają również: betakaroten, likopen oraz luteina. Betakaroten w silniejszym stopniu niż inne karotenoidy zwiększają
funkcje immunologiczne, alfakaroten zaś hamuje proliferację komórek. Wiele wyników badań wskazuje na to, iż spożywanie żywności bogatej w karotenoidy zmniejsza ryzyko
wystąpienia schorzeń sercowo-naczyniowych oraz procesów
nowotworzeni. Likopenowi z kolei przypisywana jest zdolność do zmniejszania ryzyka raka prostaty i szyjki macicy,
natomiast spożywanie warzyw bogatych w luteinę wiąże się
ze zmniejszonym ryzykiem zaćmy i zwyrodnienia plamki
żółtej. Karotenoidy są barwnikami wytwarzanymi wyłącznie przez rośliny. Spośród występujących w przyrodzie
przeszło sześciuset, człowiek spożywa przeciętnie jedynie
około czterdziestu z nich. Niektóre z nich przekształcane są
w organizmie w witaminę A (beta i alfakaroten, kryptoksantyna) inne nie są prowitaminami (luteina, zeaksantyna). Karotenoidy mają działanie ochronne przed promieniami UV.
W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie grupą naturalnych antyoksydantów, zidentyfikowano ich około czterech tysiące, lecz stanowią one zaledwie część z tych, które
występują w naturze. Jednym z nich są flawonoidy, których
źródłem są: owoce, warzywa oraz przyprawy. Związki te
charakteryzują się wieloma właściwościami, do których
należy działanie przeciwzapalne, przeciwalergiczne, przeciwzakrzepowe, przeciwwirusowe i przeciwkancerogenne.
Flawonoidy poprzez hamowanie enzymatycznej i nieenzymatycznej peroksydacji lipidów wpływają korzystnie na
układ sercowo-naczyniowy modyfikują aktywność wielu
enzymów oraz działają ochraniająco na witaminę C i E.
Flawonoidy wykazują zdolność do uszczelniania naczyń
krwionośnych (rutyna), poprzez uszczelnianie śródbłonka naczyń
tętniczych hamują przechodzenie LDL do ściany naczyń. Podobnie jak witamina C, flawonoidy wykazują zdolność do obniżania
ciśnienia krwi. Związki flawonowe wyizolowane z czerwonego
wina hamują proliferację lipidów, natomiast zawarte w warzywach
obniżają wchłanianie zwrotne cholesterolu w dystalnym odcinku
przewodu pokarmowego, zawarte w głogu wykazują dodatnie
działanie chrono-, ino- oraz batmotropowe na serce.
Bardzo ważnym naturalnym przeciwutleniaczem jest
pycnogenol otrzymywany z kory francuskiej sosny śródziemnomorskiej. W jego skład wchodzą: proantocyjanidy,
katechiny, taksifolia oraz kwasy owocowe. Wszystkie składniki pycnogenolu wykazują silne właściwości zwalczające
wolne rodniki. Preparaty pycnogenolu skutecznie uszczelniają naczynia krwionośne, zapobiegają przewlekłym zapaleniom żył oraz tworzeniom się obrzęków w przebiegu
retinopatii cukrzycowej. Pycnogenol okazał się przeciwutleniaczem dużo silniejszym od witamina C i E, a co bardzo
ważne, jest w stanie przywrócić działanie tym witaminom,
nawet gdy nastąpiło już ich utlenienie. Szczególną zaletą
pycnogenolu jest umiejętność zwiększania liczby enzymów
przeciwutleniających w komórkach.
W wyniku tego wolne rodniki powstające w samym środku komórek, jak i te wytwarzane we krwi zostają skutecznie
zneutralizowane. Pycnogenol pobudza produkcję syntetazyenzymu odpowiedzialnego za produkcję NO. Tlenek azotu produkowany w wewnętrznej części komórki naczynia
krwionośnego, hamuje sklejanie płytek krwi co zapobiega
powstawaniu zakrzepów. Rozluźnia naczynia krwionośne
a tym samym zmniejsza ryzyko zawałów serca, normalizuje
25
ciśnienie krwi, nawet w warunkach długiego stresu. Kwasy
owocowe zawarte w pycnogenolu mają działanie rozkurczające dlatego stosowany jest w dolegliwościach menstruacyjnych. Pycnogenol w dużym stopniu redukuje objawy
związane z niewydolnością żylną tj. opuchnięte łydki, skurcze i bóle w dolnych partiach nóg, chroni włókna kolagenu
i elastyny przez co przywraca skórze elastyczność. Zmniejsza intensywność przebarwień skóry, działając jak wewnętrzny filtr, chroni przed promieniowaniem UVA i UVB,
wspomaga działanie systemu odpornościowego.
Pycnogenol dostępny jest w formie tabletek o nazwie
Bio-Pycnogenol. Jedna tabletka zawiera 40 mg tego związku, a dzienna dawka nie powinna przekraczać 1 mg/kg.m.c.
Tabletki należy przyjmować na pełny żołądek aby uniknąć dolegliwości żołądkowo-jelitowych.
Lista chorób w patogenezie, których wolne rodniki odgrywają ważną rolę jest dość długa.
Do najważniejszych z nich można zaliczyć: miażdżycę,
nadciśnienie tętnicze, cukrzycę, nowotwory, stany zapalne
wywołane bakteriami lub innymi patogenami.
Miażdżyca
Głównym zaburzeniem odpowiedzialnym za rozwój
zmian jest kumulacja utlenionych lipoprotein o małej gęstości. Wolne rodniki powodują oksydację lipoproteid oraz
uszkadzają śródbłonek naczyń krwionośnych i w ten sposób
zapoczątkowują cały proces rozwoju blaszki miażdżycowej.
Zatem zdrowe żywienie odgrywa kluczową rolę w profilaktyce choroby niedokrwiennej serca. Jednym z zaleceń jest
ograniczenie spożycia nienasyconych kwasów tłuszczowych, gdyż są one głównym składnikiem odpowiedzialnym
za wzrost stężenia cholesterolu. Główny nacisk należy położyć na zwiększenie spożycia: owoców, warzyw, produktów
pełnoziarnistych oraz ryb. Wzrost dziennego spożycia błonnika pokarmowego o 10 g łączy się z istotnym spadkiem
o 14% występowania chorób wieńcowych. Źródłem rozpuszczalnego błonnika jest: owies, jęczmień warzywa i nasiona roślin strączkowych.
Do związków zmniejszających stężenie cholesterolu
LDL należą sterole i stanole roślinne (nasycone sterole).
Nadciśnienie tętnicze
Jest to choroba związana z zaburzeniami równowagi
między czynnikami zwężającymi i rozszerzającymi naczynia. Substancją kurczącą naczynia jest endotelina natomiast
rozkurczającą tlenek azotu (NO), który działa silnie lecz
krótkotrwale i jest szybko unieczynniany w reakcji z anionorodnikami tlenowymi lub z tlenem. W warunkach stresu
oksydacyjnego nadmierne unieczynnianie śródbłonkowego
czynnika rozszerzającego naczynia może być jedną z przyczyn rozwoju nadciśnienia tętniczego.
Cukrzyca
U chorych na cukrzycę zjawisko stresu oksydacyjnego
występuje na poziomie wielu komórek rozmieszczonych
w różnych tkankach . Może przemawiać za tym stwierdzona
niższa zawartość naturalnych antyoksydantów: witaminy.
26
C, E oraz glutationu. Za powstawanie stresu oksydacyjnego
odpowiedzialne jest przede wszystkim podwyższenie stężenia glukozy.
Ze względu na towarzyszące cukrzycy zmiany skórne sole Cu i Zn są niezwykle ważne w procesach metabolicznych naskórka i skóry właściwej. Miedź bierze udział
w melanogenezie w syntezie kolagenu i neutralizacji wolnych rodników, natomiast cynk wchodzi w skład cząsteczki
insuliny, odgrywa rolę w odczuwaniu smaku i procesach
immunologicznych oraz warunkuje ochronę przeciwrodnikową. Odpowiednia suplementacja może zdecydowanie
wydłużyć okres, w którym nie ma konieczności stosowania leków przeciwcukrzycowych a w rozwiniętej cukrzycy
może wspomagać leczenie.
Nowotwory
Uszkodzenie DNA w komórkach poddanych stresowi
oksydacyjnemu może doprowadzić do mutacji. Odpowiednia dieta bogata w owoce i warzywa zawierające karotenoidy, witaminy, selen, a także flawonoidy wpływa ochronnie
na organizm oraz przyczynia się do obniżenia ryzyka powstawania chorób nowotworowych.
Utrzymanie prawidłowego stanu antyoksydacyjnego
organizmu przez odpowiedni sposób odżywiania ma duże
znaczenie dla zdrowia. Czasami konieczne staje się zastosowanie preparatów witaminowych, należy jednak pamiętać
że mogą one wywierać różne działanie, zależne od dawki,
środowiska i formy izomerycznej. Najwłaściwszym postępowaniem terapeutycznym jest jednoczesne podawanie
wszystkich witamin antyoksydacyjnych w odpowiednich
dawkach, co umożliwia właściwe uzupełnianie się procesów biochemicznych, które prowadzą do zmniejszenia peroksydacji i zahamowania powstawania wolnych rodników
oraz nadtlenków lipidowych. W prewencji chorób degeneracyjnych niekwestionowaną rolę pełni spożycie warzyw
i owoców bogatych w składniki antyoksydacyjne, natomiast
preparaty farmaceutyczne zawierające antyoksydanty powinny stanowić suplementację diety.
Przykładem preparatów wykorzystywanych w tej suplementacji są:
- Bio-Cynk – jedna tabletka zawiera 15 mg glukonianu
cynku. Cynk jest niezbędny do prawidłowego działania
insuliny, hormonu wzrostu i testosteronu. Ochrania komórkę przed szkodliwym działaniem wolnych rodników,
wspomaga funkcję układu odpornościowego organizmu
(profilaktyka przeziębienia).
- Bio-Karoten z witaminą E - kapsułki zwierają 10 mg
Wit. E oraz 6 mg betakaroten stosowany raz dziennie
zmniejszają niekorzystny wpływ wolnych rodników na
organizm.
- Bio-Selen z cynkiem - preparat w postaci tabletek. Połączenie dwóch pierwiastków powoduje zwiększenie
wchłaniania selenu z przewodu pokarmowego a także
optymalizuje działanie przeciwwolnorodnikowe.
Utrzymanie prawidłowego stanu antyoksydacyjnego organizmu należy rozpocząć od najmłodszych lat, co warunkuje utrzymanie dobrego stanu zdrowia przez całe życie.
Do głównych zadań współczesnej farmakologii należy
ustalenie optymalnych wielkości spożycia witamin w prewencji i leczeniu chorób degeneracyjnych. Dokładnego
ustalenia wymaga także dawkowanie innych antyoksydantów zawartych w żywności. Ochronna rola witamin antyoksydacyjnych i flawonoidów dla organizmu jest niekwestionowana, jednak nie można uznać że jest to stu procentowe
panaceum skutecznie zapobiegające metabolicznym chorobom cywilizacyjnym.
Piśmiennictwo:
1. Hercberg i wsp.: MJ. The potential role of antioxidant
vitamins In preventing cardiovascular diseases and cancers;Nutrition 1998 14,no6.513-20.
2. Knekt Pi wsp.:. Is low elenium status a risk factor for
lung cancer? American Journal of Epidemiology 1998
148 no.10 975-82.
3. KuklinskiB,Weissenbacher E,von Appen S.: Coenzyme
Q10 and antioxidants in acute myocardial infarction;8t
Int.Symp.Biomed and Clin.Aspects of CoQ 1993 pp32.
4. Anderson R,:.Roles of vit.C,E and beta-carotene in the
modulation of oxidant stress from cigarettes smoke-activated phagocytes;Am. J. Clin. Nutr.1991.53,no.1 suppl.
Pp 358S-361S.
5. McCarthy M:.Beta-carotene supplements linket to cancer. Lancet 1999 353 pp215.
6. Menkes MS, Comstock GW, Vuilleumier JP:Serum beta-carotene,vitamins A and E,selenium and the risk of
lung cancer.N.Engl J.Med 1996 315:20 pp1250-4.
7. Żbikowska H:Antykancerogenne działanie selen u. Post.
Biol. Kom. 1997,3,315.
8. Ball S.:Antyoksydanty w medycynie i zdrowiu człowieka 2001
9. Przybylski J,:Żyjmy dłużej 2000.
10.Małyszka J,Michalkiewicz S,: Witamina E Nauka i Technika 2001.
11.Steimetz KA, Potter J:Vegetables,fruit and cancer prevention Am.J.Diet Assoc 1996 96,1027-39.
12.Bright-See E: Vitamin C and cancer prevention. Semin
Onc. 1983;10,294-98.
13.Omen G.S,Goodman G.F,Thornquist M,D: Effects of
combination of beta-carotene and vitamin A and lung
cancer and cardovascular disease. N.Engl.J.Med. 1996
334,1150-1156.
14.Łącka B,Grzeszczak W:Rola wolnych rodników tlenowych w patogenezie nadciśnienia samoistnego. Pol.
Arch.Med.Wewn. 1997,98,67-75.
mgr. farm. Maria Wojtanowska-Rzytki
ul.Widokowa 28
44-121 Gliwice
tel. 501-48-64-48 mail:[email protected]
27
Farm Przegl Nauk, 2009,1 28-31
Technologia produkcji kapsułek miękkich
Technology to manufacture soft capsules
Robert Pluta*, Andrzej Jankowski*, Stanisław Han**
* Katedra i Zakład Farmacji Stosowanej, Śląski Uniwersytet Medyczny
** Przedsiębiorstwo Produkcji Farmaceutycznej Hasco-Lek S.A. Wrocław
Streszczenie:
Kapsułki miękkie są to stałe dzielone postaci leku składające się z miękkiej otoczki oraz zamkniętego w niej
wypełnienia. Wypełnienie może występować w postaci
roztworów, zawiesin, past, jak również proszków i granulatów. Kapsułki miękkie są postacią z wyboru w przypadkach leków stosowanych w niskich dawkach, bardzo
silnie działających czy o niskiej temperaturze topnienia.
Celem pracy jest przedstawienie historii kapsułek miękkich, ich budowy, metod produkcji oraz zasad opracowywania ich formulacji.
Słowa kluczowe: Kapsułka miękka, technologia kapsułkowania, żelatyna, plastyfikator
Obecnie, na rynku farmaceutycznym, wśród doustnych
preparatów najpopularniejszą obok tabletek stałą postacią
leku są kapsułki. Zasadniczą zaletą postaci kapsułkowej jest
możliwość ordynowania leku w systemach jedno- i wielozbiornikowych, pozwalających na modyfikację procesu
uwalniania substancji leczniczej z postaci leku. W konsekwencji obserwujemy zmianę efektu farmakodynamicznego stosowanego preparatu. Systemy wielokompartmentowe
spotykamy w postaci kapsułek twardych zawierających
proszki, granulaty, mikrokapsułki, mikrotabletki czy paletki
(z możliwością ich powlekania w celu modyfikacji procesu
uwalniania substancji leczniczej) lub też ich mieszaniny.
Drugą formą kapsułek są kapsułki miękkie, będące jednozbiornikową postacią leku, przeznaczoną do użytku wewnętrznego, także dopochwowo i doodbytniczo, rzadziej
miejscowo w kosmetyce (np. perełki z serum, kapsułki
z olejkiem do kąpieli). Kapsułka miękka składa się z jednoczęściowej otoczki oraz zamkniętej w jej wnętrzu substancji leczniczej w postaci oleju, roztworu, zawiesiny lub
emulsji. Istnieją sposoby wytwarzania kapsułek miękkich
z wypełnieniem w postaci proszków, granulatów czy peletek (4), jednak ze względu na złożoność procesów technologicznych w porównaniu z produkcją kapsułek twardych
mają one marginalne znaczenie.
Kapsułki miękkie są produkowane w szerokim zakresie
kształtów i rozmiarów.
Odpowiednio kondycjonując otoczkę można uzyskać
efekt opóźnionego uwalniania substancji leczniczej.
28
Summary:
Soft capsules are single dosage solid forms comprising a
flexible shell and filling hermetically sealed inside. They
can contain liquids, suspensions, pasty materials and
even powders and granulates. They are formulations of
choice for low dose, highly potent or low melting point
drugs. The aim of this work was to review history of soft
capsules, a capsule shell and fill composition, formulation strategies and manufacturing methods.
Keywords: Soft capsule, encapsulation technology, gelatin, plasticizer
1. Historia
Pierwsze kapsułki miękkie pojawiły się we Francji w latach trzydziestych XVIII wieku (4). Pierwotnym zamysłem
twórców tej postaci leku było maskowanie nieprzyjemnego smaku oraz zapachu składników leczniczych, będących
wtedy głównie pochodzenia naturalnego.
W 1834 r. Francois Mothes i Joseph Dublanc (4) otrzymali prawa patentowe dla kapsułek przygotowywanych
na drodze zanurzenia w roztworze żelatyny skórzanych
woreczków - form wypełnionych rtęcią. Po stwardnieniu
otoczki formy były usuwane, wypełnienie wprowadzano
przy pomocy pipet lub kroplomierzy zaś otwór zamykany
kroplą masy żelatynowej. W roku 1848 Giraud (4) zaprezentował podobną metodę używając do tworzenia otoczki
form metalowych co znacząco poprawiło kształt kapsułek
i ujednoliciło ich objętość.
W dalszym ciągu sam proces formowania otoczki był
długotrwały i na szerszą skalę kosztowny. W międzyczasie
pojawiła się pierwsza oficjalna receptura kapsułek miękkich
zamieszczona w 1866 r. we francuskim Codex Medicametarius (4).
Późniejsze metody wytwarzania, które zakładały użycie
zestawu płaskich matryc, miały podobną, do wyżej opisanych, wydajność. Plastyczną taśmę żelatynową układano na
poziomo położonej matrycy, lek dawkowano w wydrążone
w niej gniazda, a następnie przykrywano drugim arkuszem
żelatynowym.
W roku 1933 Amerykanin Robert P. Scherer (4) zaprezentował metodę stosowaną do dnia dzisiejszego, opartą
na zestawie dwóch obracających się matryc, pozwalającą
na produkcję ciągłą. Kapsułki wytworzone w tym procesie
charakteryzuje jednakowy kształt oraz niewielkie, w porównaniu z wcześniejszymi metodami, różnice mas wypełnień
(rzędu 1-3%). Odmianami metody Scherera są, rozwinięte
w 1948 r. przez Lederle Laboratories, metoda Accogel
(4), pozwalająca na zamykanie wypełnień w postaci stałej oraz metoda z 1949 r. zaprezentowana przez Norton
Company (4).
2. Budowa
2.1. Skład otoczki kapsułki żelatynowej miękkiej.
Masa żelatynowa służąca do produkcji otoczki kapsułki miękkiej składa się z żelatyny, plastyfikatora oraz wody.
Jako składniki dodatkowe stosuje się barwniki, substancje
poprawiające smak i zapach oraz środki konserwujące.
Żelatyna jest naturalną substancją białkową pozyskiwaną z kości i tkanek łącznych zwierząt. Rozpuszczona
w podwyższonej temperaturze tworzy układ koloidalny
– zol liofilowy, który po obniżeniu temperatury przechodzi
w żel. Do produkcji otoczek stosuje się najczęściej żelatynę
wieprzową oraz wołową, rzadziej rybią lub drobiową. W postaci zolu musi ona charakteryzować się odpowiednią lepkością oraz siłą żelową w granicach 150-200 Bloom (6).
Pomimo swoich zalet, z uwagi na ograniczenia religijne
czy etniczne (Muzułmanie, Hindusi, Żydzi) lub na skutek
interakcji ze składnikami wypełnienia, żelatyna może być
zastępowana składnikami żelującymi pochodzenia roślinnego i ich syntetycznymi pochodnymi (karragen, agar czy
skrobia ziemniaczana) (10,13,14,19). W ostatnim czasie pojawiło się nowe zagrożenie związane z zakażeniem prionami, co budzi pewne obawy co do bezpieczeństwa jej stosowania. Producenci zobowiązani są zatem do przestrzegania
wymogów kontroli pochodzenia żelatyny. Zastępuje się też
częściej żelatynę wołową żelatyną innego pochodzenia.
2.2. Plastyfikatory
Plastyfikatory są grupą substancji pomocniczych zapewniających mechaniczną stabilność otoczki żelatynowej,
zarówno w fazie formowania, jak i w gotowym produkcie.
Ich dodatek zapewnia też równomierne rozłożenie napięć
kurczącej się podczas procesu suszenia kapsułki.
W praktyce najczęściej stosowanymi plastyfikatorami
są glicerol (98% lub 86%), sorbitol ciekły niekrystalizujący,
sorbitol ciekły częściowo odwodniony, lekkie łańcuchowe
polietylenoglikole (np. PEG 200) czy glikol propylenowy.
Dopuszczalne jest stosowanie uzasadnionych technologicznie mieszanin plastyfikatorów. Ich doboru dokonuje się
w zależności od zastosowanego składu wypełnienia (2).
Inne substancje dodatkowe dotyczą substancji zmniejszających przejrzystość otoczki, barwniki, substancje konserwujące, substancje poprawiające smak i zapach. Zmniejszenie przejrzystości ma szczególne znaczenie podczas kapsułkowania wypełnień w postaci zawiesin, które po pewnym
czasie mogą ulec precypitacji, wpływając niekorzystnie na
wygląd kapsułki. Substancje barwiące stosowane w produkcji kapsułki żelatynowej dzielimy na rozpuszczalne
w wodzie – nie zmniejszają one transparencji otoczki (błękit
patentowy, czerwień koszenilowa czy żółcień chinolinowa)
oraz te, które używa się w postaci zawiesin zmniejszających
przejrzystość produktu (np. dwutlenek tytanu, tlenki żelaza:
czerwony, czarny, brązowy czy żółty albo gotowe mieszaniny np. Candurin). Do grupy barwników należą również
pigmenty służące do druku napisów lub symboli na gotowej
kapsułce.
Z uwagi na dość wysoką temperaturę osiąganą w trakcie
procesu tworzenia masy żelatynowej (około 70oC) liczba
substancji konserwujących, inkorporowanych w otoczce,
jest ograniczona - w praktyce najczęściej stosowana jest
mieszanina parahydroksybenzoesanu etylu i propylu. Użycie konserwantów ma sens jedynie w przypadku, gdy kapsułki są przechowywane w opakowaniu jednostkowym wielokrotnie otwieranym np. w słoiku. Jeśli kapsułki są pakowane w blistry lub pojedyncze szczelne saszetki i zużywane
w całości po wyjęciu z opakowania, stosowanie środków
konserwujących uważa się za zbędne.
Pomimo że składniki wypełnienia, szczelnie zamknięte
w otoczce, nie wpływają na smak i zapach kapsułki, niekiedy zachodzi potrzeba zamaskowania naturalnych właściwości organoleptycznych samej żelatyny. Możemy zastosować
w tym celu dodatek substancji poprawiających smak i zapach, takich jak np. etylowanilina czy wanilina.
Oprócz modyfikowania zawartości kapsułki, opóźnienie
uwalniania substancji leczniczej z kapsułek można wywołać
przez modyfikacje składu otoczki żelatynowej. Przykładem
takiego działania może być wynik kondycjonowania (hartowania) gotowej kapsułki w aldehydzie mrówkowym w celu
zmniejszenia jej stopnia rozpuszczalności w wodzie (11).
2.3. Wypełnienie
Substancje lecznicze mogą występować w wypełnieniu
kapsułki żelatynowej miękkiej w postaci olejowej, mieszaninie olejów, zawiesiny lub systemów samoemulgujących
lub prekoncentratów mikroemulsji. Wyboru rodzaju wypełnienia dokonuje się w oparciu o następujące kryteria:
- zapewnienie chemicznej stabilności substancji leczniczej,
- podwyższenie poziomu biodostępności składników aktywnych,
- zapewnienie bezpiecznego i skutecznego przebiegu kapsułkowania,
- otrzymanie stabilnego pod względem fizycznym produktu.
Najprostszym w przygotowaniu rodzajem wypełnienia
są substancje lecznicze kapsułkowane bezpośrednio (np.
olej rybi czy lecytyna) oraz mieszaniny olejowe (np. witaminy w postaci płynnej rozpuszczalne w tłuszczach np.
A lub E zmieszane z olejem arachidowym lub sojowym
oczyszczonym albo olej rybi z dodatkiem tokoferolu jako
antyoksydanta).
Produkcja wypełnienia w postaci zawiesiny jest procesem bardziej złożonym. Oprócz leku oraz oleju stanowiącego fazę rozpraszającą, stosuje się substancje pomocnicze
29
zapobiegające sedymentacji w trakcie procesu kapsułkowania. Zalicza się do nich: woski naturalne (wosk pszczeli
żółty, olej palmowy rafinowany), tłuszcze utwardzone (olej
sojowy uwodorniony czy olej kokosowy uwodorniony) oraz
krzemionkę koloidalną.
Podstawowym warunkiem, który musi spełniać wypełnienie w formie zawiesiny, jest zachowanie podczas kapsułkowania odpowiedniej lepkości w temperaturze do 35oC
oraz wielkość cząstek stałych, rozproszonych w układzie,
utrzymująca się poniżej 200 nm (2).
Oprócz olejów, stanowiących fazę rozpraszającą wypełnienia zawiesinowego (olej sojowy rafinowany, olej sojowy
oczyszczony, olej arachidowy) oraz inhibitorów sedymentacji w postaci wosków, stosuje się również surfaktanty
wspomagające wytwarzanie i stabilizujące dyspersję zawieszonych cząstek leku (np. lecytynę) oraz antyoksydanty (tokoferol czy butylohydroksyanizol).
Podstawą hydrofilowych formulacji wypełnień kapsułek
miękkich jest glikol polietylenowy (PEG). Najczęściej stosowane są lekkołańcuchowe formy ciekłe w temperaturze
pokojowej (PEG 400 oraz PEG 600) (5,8). Do formulacji
półstałych używa się mieszaniny polietylenoglikoli ciekłych z formami stałymi, takimi jak PEG 4000 czy PEG
10000(2).
Wypełnienia na bazie glikoli polietylenowych stosuje
się z wyboru w celu zwiększenia biodostępności trudno rozpuszczalnych substancji leczniczych albo w przypadku formulacji zawierających lek bardzo silnie działający, stosowany
w niskich dawkach np. digoksyna (12) lub nifedypina (7).
Najnowszym podejściem do formulacji wsadów kapsułek
miękkich, mającym na celu zwiększenie biodostępności trudno
rozpuszczalnych i trudno wchłanialnych leków oraz zniwelowania osobniczych różnic stężeń w organizmie, są samoemulgujące systemy lipofilne (ang. self-emulsifying drug delivery
systems - SEDDS) oraz prekoncentraty mikroemulsji. Tymi
sposobami opracowano już stabilne formulacje zawierające
cyklosporyny, ibuprofen czy ritonavir (15,18,1,20,21,3).
Substancje lecznicze używane do bezpośredniego kapsułkowania są przenoszone z opakowań oryginalnych do
zbiorników manipulacyjnych. Po uzyskaniu jednorodności,
wsad jest gotowy do etapu kapsułkowania.
Mieszaniny olejowe oraz hydrofilowe płynne są przygotowywane w zbiornikach manipulacyjnych przy użyciu
mieszadła szybkoobrotowego. Zawiesiny substancji leczniczych są wytwarzane w zbiorniku procesowym, gdzie do
schłodzonej mieszaniny wosków i surfaktantów w oleju, dodawane są pod zmniejszonym ciśnieniem substancje lecznicze w postaci proszku. Po etapie intensywnego mieszania
oraz rozdrabniania przy użyciu młyna koloidalnego, gotowy
wsad jest rozładowywany przy pomocy azotu do zbiornika
manipulacyjnego.
3. Elementy produkcji kapsułki żelatynowej miękkiej
w skali przemysłowej
Po zakończeniu suszenia wstępnego kapsułki są rozsypywane na tace i przenoszone do suszarni, gdzie w warunkach niskiej wilgotności oddają resztę zaabsorbowanej
wody. Suszenie prowadzone jest do otrzymania określonej
twardości otoczki kapsułki. Czas trwania suszenia zależy
przede wszystkim od wielkości kapsułki i rodzaju zastosowanego wypełnienia. Wsady hydrofilowe mają tendencję od
kumulowania wody odciągniętej z otoczki, w skutek czego
możemy zaobserwować najpierw szybko postępujący proces
twardnienia otoczki, a następnie powolną, wtórną migrację
wody z wypełnienia do otoczki. Skutkiem tego, przedwcześnie zsypane kapsułki w opakowaniach zbiorczych mają
tendencję do aglomeracji, odkształcania, osłabiania spawu
powstałego w procesie kapsułkowania i w konsekwencji do
pękania otoczki (17).
3.1. Wytwarzanie masy żelatynowej
Do podgrzanej w topielniku do około 75oC mieszaniny
wody, plastyfikatora oraz środków konserwujących, dodawana jest pod zmniejszonym ciśnieniem żelatyna w postaci
suchego granulatu. Całość jest intensywnie mieszana. Po
rozpuszczeniu żelatyny masę odpowietrza się przy użyciu
podciśnienia, a następnie przenosi się do zbiornika manipulacyjnego, przy pomocy sprężonego azotu. Bezbarwną masę
żelatynową barwi się zawiesiną pigmentów w plastyfikatorze, wcześniej ujednoliconą przy pomocy młynka koloidalnego. Zabarwiona masa gotowa do produkcji oczekuje na
etap kapsułkowania w pomieszczeniu dojrzewalni.
3.2. Produkcja wypełnienia
W zależności od rodzaju wypełnienia jego produkcja ma
różny przebieg.
30
3.3. Kapsułkowanie
Proces kapsułkowania odbywa się przy użyciu kaspułkarki. Gorąca masa żelatynowa zostaje rozprowadzona na
powierzchni bębna chłodzącego, tworząc taśmę żelatynową
o ściśle określonej grubości i temperaturze. Dwie w ten sposób wytworzone taśmy żelatynowe łączą się ze sobą, ściskane za pomocą dwóch matryc w formie walców z wydrążonymi w nich gniazdami. W momencie, gdy gniazda matrycy
zaciskają obie taśmy dochodzi do powstania połączenia
– spawu i uformowania otoczki (16). W trakcie tego procesu do tworzącej się otoczki przy pomocy dozownika zostaje
wstrzyknięte wypełnienie w ilości ściśle określonej posuwem pompy dozowania leku. Matryce kontynuując ruch
obrotowy zamykają od góry wypełnioną otoczkę, a świeżo
uformowana kapsułka zostaje wycięta z taśmy i przy pomocy transportera, przeniesiona do bębnów suszących, gdzie
przez następne ok. 2-4 h jest poddawana procesowi suszenia
wstępnego. Na tym etapie usuwana jest większość wody zawarta w otoczce.
3.4. Suszenie
3.5 Sortowanie
Po zakończonym etapie suszenia, kapsułki żelatynowe zostają zsypane z tac suszących na maszynę sortującą.
W trakcie tej czynności następuje też kontrola optyczna produktu. Podczas sortowania odrzucone zostają najpierw kap-
sułki posklejane, pozostałe trafiają na system obracających
się rolek o ściśle ustawionych między sobą odległościach.
Odrzucane są wtedy zbyt małe oraz zbyt duże kapsułki, pozostałe zaś traktowane są jako gotowa postać leku.
Pomimo długiej już historii wytwarzanie kapsułek
miękkich, opracowanie technologii wytwarzania preparatu
z zachowaniem zasad GMP (Dobrej Praktyki Wytwarzania)
jest procesem technologicznie złożonym. Właściwości fizyko-chemiczne substancji czynnej determinują skład wypełnienia (w postaci roztworu olejowego, zawiesiny, emulsji,
prekoncentratu), przez co wpływają pośrednio na rodzaj
zastosowanych substancji pomocniczych do wytworzenia
otoczki. Istotna dla jakości gotowego preparatu jest również
kontrola na poszczególnych etapach produkcji (np. grubość
taśmy żelatynowej, temperatura, czas trwania procesów jednostkowych, wilgotność etc).
Literatura:
1. Gullapalli, R. P.: Ibuprofen-containing softgels. US Patent 6 251 426 - 2001.
2. Fridrun Podczeck, Brian E. Jones: Pharmaceutical Capsules – 2004.
3. Martin Malmsten: Surfactants and Polymers in Drug
Delivery – 2002.
4. James Swarbrick, James C. Boylan: Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. Informa Health
Care, 2004.
5. Gilbert S. Banker, Christopher T. Rhodes: Modern Pharmaceutics. Informa Health Care, 2002.
6. Babel, W.: Gelatine in pharmaceutical applications.
Pharmaceut. Manuf. Packing Sourcer 2000; 6: 63–66.
7. Radivojevich, F., Joss, H. and Dvorsky, S.: Therapeutic
coronary composition in the form of soft gelatine capsules. EP 0 143 857 - 1983.
8. Brox, W.: Soft gelatin capsules and methods for their
production. US Patent 4 744 988. -1988.
9. Brox, W., Zande, H. and Meinzer, A.: Soft gelatin capsu-
le manufacture. EP 0 649 651 – 1993.
10.Draper, P. R., Tanner, K. E., Getz, J. J., Burnett, S. and
Youngblood, E.: Film forming compositions comprising
modified starches and iota-carrageenan and methods for
manufacturing soft capsules using same. International
Patent Application WO 0 103 677 - 1999.
11.Fischer, G.: Gelatin capsules for the controlled release of
the active agent, and process for their preparation. EP 0
240 581 - 1986.
12.Gardella, L. A. and Kesler, H.: Gelatin-encapsulated digoxin solutions and method of preparing the same. US
Patent 4 002 718 - 1977.
13.Menard, R., Tomka, I., Engel, W. D. and Brocker, E.:
Process to manufacture starch-containing shaped bodies,
mass containing homogenized starch and device to manufacture soft capsules. International Patent Application
WO 0 137 817 - 1999.
14.Winston Jr., P. E. Miskiel, F. J. Valli, R. C.: Composition and process for gelatin-free soft capsules.US Patent
5342626 – 1994.
15.Rouffer, M. T.: Self-emulsifying ibuprofen solution and
soft gelatin capsule for use therewith. US Patent 6 221
391 - 2001.
16.Victorov H.,Tacescu T., Calin C. Tacescu D., Marcu L.,
Calin V.: Servo control for capsule making machine. US
Patent 7247010 – 2003.
17.Shah, N. H., Stiel, D., Infeld, M. H., Railkar, A. S., Malick, A. W. and Patrawala, M. : Elasticity of soft gelatin
capsules containing polyethylene glycol 400 – quantitation and resolution. Pharm. Technol. 1992; 3:126–131.
18.Shin, H. J., Choi, N. H., Kim, J. W., Yang, S. G. and
Hong, C. I.: Cyclosporin -containing microemulsion preconcentrate composition. US Patent 6 063 762 - 2000.
19.Gennadios, Aristippos Non-gelatin substitutes for oral
delivery capsules, their composition and process of manufacture. US Patent 6214376 – 2001.
20.Woo, J. S.: Cyclosporin soft capsule composition. EP 0
650 721 – 1995.
21.Woo, J. S.: Cyclosporin-containing soft capsule preparations. International Patent WO 9 748 410 – 1997.
Robert Pluta
Katedra i Zakład Farmacji Stosowanej,
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, e-mail [email protected]
31
Telmisartan – wyjątkowy wśród sartanów aktywator
receptora PPAR-γ
Telmisartan – unique among sartans,
activator of PPAR-γ receptor
Beata Joanna Kocięcka
Marek Kocięcki
Jerzy A. Pałka
Zakład Chemii i Analizy Leków Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
Kierownik: Jerzy A. Pałka
Streszczenie:
Telmisartan należy do rodziny leków nazywanych blokerami receptora angiotensyny II (ARB), które są stosowane w leczeniu nadciśnienia tętniczego. ARB blokują
zdolność angiotensyny II do skurczu naczyń. Istnieją różnice pomiędzy ARB, takimi jak: losartan, walsartan, irbesartan, kandesartan, eprosartan, olmesartan czy telmisartan w zakresie absorpcji, dystrybucji i wydalania leków.
Oprócz blokowania układu renina-angiotensyna (RAA),
telmisartan jako jedyny z nich jest aktywatorem PPAR-γ,
regulatora insulino-wrażliwości, mediatorów zapalenia,
metabolizmu węglowodanów i lipidów. Wielofunkcyjne
działanie telmisartanu może przynieść korzyści w leczeniu chorób układu sercowo-naczyniowego, zespołu metabolicznego lub cukrzycy oraz innych schorzeń związanych z zaburzeniem aktywacji PPAR-γ.
Słowa kluczowe: układ renina-angiotensyna, antagonista
receptora angiotensyny II, aktywator receptora PPARγ,
telmisartan
Wstęp
Jednym z najważniejszych układów neurohormonalnych
człowieka jest układ RAA (renina-angiotensyna-aldosteron). Głównym ogniwem układu RAA jest angiotensyna II,
peptyd, który powstaje z angiotensyny I w obecności enzymu konwertującego zwanego ACE (Angiotensin converting
enzyme). Angiotensyna II, podobnie jak inne biologicznie
czynne peptydy, działa poprzez odpowiednie receptory. Do
tej pory znaleziono następujące receptory dla angiotensyna
II: AT1, AT2, AT3 i AT4. Zasadnicze znaczenie w rozwoju nadciśnienia tętniczego ma aktywacja receptora AT1, co
powoduje następstwa w naczyniach (skurcz mięśniówki),
w nerkach (zatrzymanie sodu i wody w organizmie) oraz oddziaływuje na inne układy neurohormonalne, przez uwalnianie aldosteronu, wazopresyny, adrenaliny i endoteliny [1, 2].
Podwyższone stężenie angiotensyny II zaburza metabolizm glukozy i nasila procesy aterogenzy. Działanie
32
Abstract
Telmisartan is a member of a family of drugs called angiotensin receptor blockers (ARBs), used in the pharmacotherapy of hypertension. ARBs block the ability
of angiotensin II to constrict blood vessels. There are
some differences between the ARBs, such as losartan,
valsartan, irbesartan, candesartan and telmisartan in respect to absorption, distribution and excretion. In addition to blocking the Renin-Angiotensin System (RAS),
telmisartan in a unique way acts as a selective modulator
of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma
(PPAR-γ), a regulator of insulin sensitivity, inflammatory cytokines, metabolism of carbohydrates and lipids.
Multifunctional action of telmisartan may provide benefit in the management of cardiovascular disease, metabolic syndrome or diabetes and other diseases related to
disturbances in activation of PPAR-γ.
keywords: renin-angiotensin system, angiotensin II receptor antagonist, modulator of peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma, telmisartan
angiotensyny II polega na aktywacji oksydazy NAD(P)H,
czemu towarzyszy wzrost produkcji wolnych rodników. Nasilenie stresu oksydacyjnego skutkuje zwiększoną ekspresją
ICAM/VCAM i nasileniem procesów prozapalnych w ścianie naczyń, co powoduje dysfunkcję śródbłonka. Kolejnym
niekorzystnym aspektem wzrostu stężenia angiotensyny jest
wpływ na wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne związane z kinazą tyrozynową. Poza tym angiotensyna II zwiększa tkankowy przepływ krwi i podnosi aktywność układu
współczulnego [3, 4, 5, 6].
Wykazanie zależności pomiędzy wzrostem aktywności układu RAA a rozwojem nadciśnienia tętniczego dało
podstawy do opracowania leków mogących obniżyć tę aktywność. Obecnie istnieją możliwości wpływania na układ
RAA wykorzystując następujące grupy leków [1]:
• Inhibitory reniny, blokujące powstawanie angiotensyny I,
• Inhibitory konwertazy (ACE-I), blokujące przekształcenie angiotensyny I w II,
• Anatagoniści receptora angiotensyny (sartany), blokujące wybiórczo receptor AT1,
• Antagoniści aldosteronu.
Sartany – ogólna charakterystyka
Antagoniści receptora AT1 dla angiotensyny II są coraz częściej stosowane w leczeniu nadciśnienia tętniczego.
Swoją popularność sartany zawdzięczają dużej skuteczności
hipotensyjnej oraz bardzo dobrej tolerancji.
Sartany zalecane są u chorych na nadciśnienie tętnicze
[7]:
• współistniejące z cukrzycą, nefropatią w przebiegu cukrzycy, białkomoczem, przewlekłą chorobą nerek,
• współistniejące z przerostem lewej komory serca,
• współistniejące z niewydolnością serca,
• w przypadku nietolerancji inhibitora konwertazy spowodowanej kaszlem.
Jednocześnie sartany przeciwwskazane są:
• u pacjentek w ciąży,
• w przypadku obustronnego zwężenia tętnic nerkowych,
• zwężenia tętnicy nerkowej jedynej nerki.
Grupa antagonistów receptora AT1 nie jest jednolita.
Między poszczególnymi sartanami występują różnice dotyczące budowy chemicznej, działania farmakologicznego
i właściwości farmokinetycznycznych, co przejawia się odmiennościami w zakresie działania hipotensyjnego. Obecnie
w Polsce zarejestrowanych jest 7 sartanów [8].
Charakterystyczną częścią cząsteczki większości sartanów jest pierścień imidazowy z ugrupowaniem bifenylometylowym, podstawiony tetrazolem lub kwasem karboksylowym. Taką budowę chemiczną wykazują: losartan, irbesartan, kandesartan, olmesartan i walsartan (otwarty pierścień
imidazolowy). Odmienną budowę ma telmisartan. Bardziej
przypomina on pioglitazon, niż sartany. Reszta bifenylowa
podstawiona jest grupą karboksylową (zamiast tetrazolowej)
a benzimidazol nie jest podstawiony resztą heterocykliczną.
Odmiennościami w budowie tłumaczy się specyficzne właściwości niektórych sartanów. Telmisartan wykazuje działanie na
receptory PPARγ (żaden inny sartan w dawkach terapeutycznych nie posiada takiej zdolności). Eprosartan – hamuje układ
współczulny, a walsartan działa przeciwpłytkowo [8, 9].
Sartany są najczęściej antagonistami kompetycyjnymi
(konkurencyjnymi), tzn. wiążą się w tych samych miejscach
receptora AT1, co angiotensyna II (agonista), a niektóre
z nich oprócz tego mogą wiązać się też w innym miejscu, co
czyni je nieusuwalnymi z połączeń z receptorem (irbesartan,
kandesartan, olmesartan, walsartan i telmisartan) [8].
Poszczególne sartany różnią się od siebie właściwościami famakodymicznymi. Mogą występować zarówno
w formie aktywnej (eprosartan, irbesartan, telmisartan, walsartan), jak i pro-leku (kandesartan, olmesartan), czy też
aktywnego metabolitu (losartan). Zaburzenia konwersji
w wątrobie mogą istotnie wpływać na aktywność leku. Kolejną cechą różniącą jest dostępność biologiczna. Większość
z nich można przyjmować bez względu na posiłek, z wyjątkiem walsartamu i eprosartanu [8].
Ważnym parametrem farmakokinetycznym jest pozorna
objętość dystrybucji, czyli zdolność do przenikania z krwi
do tkanek. Im wyższa objętość dystrybucji, tym lek wykazuje większą penetrację do tkanek. Największą pozorną objętość dystrybucji ma telmisartan [8.
Inną cechą różniącą poszczególne sartany jest ich
odmienna zdolność do interakcji z innymi lekami oraz
szybkość metabolizmu. Najczęściej ulegają one przemianom przy udziale cytochromu P450 (losartan, irbesartan
i kandesartan). Ma to wpływ na skuteczność terapii, choć
Ryc. 1. wzór strukturalny losartanu
Ryc. 2. wzór strukturalny kandesartanu
Ryc. 3. wzór strukturalny irbesartanu
Ryc. 4. wzór strukturalny olmesartanu
33
Ryc. 5. wzór strukturalny walsartanu
Ryc. 6. wzór strukturalny eprosartanu
Ryc. 7. wzór strukturalny telmisartanu
(IL6, VCAM, ICAM, MCP1, działa protekcyjnie na komórki trzustki oraz ma korzystny wpływ na homeostazę (obniżając stężenie PAI-1) [10, 11, 12, 13, 14].
Telmisartan oddziaływuje na receptory AT1 na 2 sposoby. Po pierwsze, jak pozostałe sartany, blokuje receptor
AT1, a po drugie przez wpływ na PPARγ zmniejsza ekspresję AT1 w komórkach mięśni gładkich naczyń. Podobnie,
pobudzenie PPARγ powoduje wzrost stężenia adiponektyny, hormonu peptydowego produkowanego przez adipocyty, który pełni rolę ochronną w procesach aterogenezy.
Wykazano także korzystny wpływ telmisartanu na rozwój
przewlekłych powikłań w przebiegu cukrzycy. Jak widomo
w tych procesach kluczową rolę odgrywa proces nieenzymatycznej glikacji białek, czego produktem są tzw. końcowe produkty glikacji (AGE). Mają one swoje receptory – RAGE, których aktywacja nasila produkcję wolnych
rodników, stres oksydacyjny i procesy zapalne. Aktywacja
PPARγ przez telmisartan zmniejsza ekspresję receptorów
RAGE, a także hamuje uwalnianie mediatorów zapalenia
[15, 16].
W przeciwieństwie do klasycznych tiazolidynodionów,
telmisartan jest częściowym agonistą receptora PPARγ.
Przez to siła jego oddziaływania na ekspresję genów jest
znacznie mniejsza, z drugiej zaś strony, inaczej niż klasyczne tiazolidynodiony, nie wywołuje on wzrostu masy ciała,
co tłumaczy się blokadą receptora AT1, hamowaniem retencji sodu oraz korzystnym wpływem na metabolizm lipidów
[14, 17, 18].
Warto też wspomnieć o agonistycznym działaniu telmisartanu na receptor AT2. Pobudzenie tego receptora powoduje wzrost syntezy NO i działa antymitotycznie [19,20].
Właściwości farmakokinetyczne
telmisartanu [21]
Ryc. 8. wzór strukturalny pioglitazonu
w mniejszym stopniu na bezpieczeństwo terapii zwłaszcza
w przypadku polipragmazji [8]. Istnieją też pewne różnice
w sposobie eliminacji poszczególnych sartanów, zwłaszcza
w przypadku chorych z zaburzoną funkcja nerek, gdzie preferuje się telmisartan, walsartan i irbesartan [8].
Telmisartan
Telmisartan jest selektywnym antagonistą receptora angiotensyny II (AT1), ale wykazuje też zdolności do przyłączania się w innych miejscach receptora AT1, co powoduje
trwałość wiązania. Telmisartan poza działaniem hipotensyjnym wykazuje również właściwości wazoprotekcyjne i antydiabetogenne. Zawdzięcza to swojej budowie chemicznej
– mimo, iż zalicza się do sartanów, to ma strukturę cząsteczki pioglitazonu, czyli tiazolidynodionu. To powoduje, że
telmisartan aktywuje receptor aktywowany proliferatorem
peroksysomów gamma (PPARγ). Aktywacja PPARγ łączy
się ze zwiększeniem insulinowrażliwości, nasila obwodowe zużycie glukozy, zmniejsza stężenie wolnych kwasów
tłuszczowych w mięśniach i w wątrobie, poprawia profil lipidowy, podwyższając stężenie HDL, zwiększa produkcję
adiponektyny, hamuje uwalnianie mediatorów zapalnych
34
1. Wchłanianie
Telmisartan szybko wchłania się z przewodu pokarmowego. Jego średnia wartość biodostępności bezwzględnej
wynosi ok. 50%. Stężenie leku w osoczu jest prawie jednakowe niezależnie od tego czy lek przyjęto z pokarmem,
czy też na czczo, różnica w biodostępności wynosi ok. 6%.
W przypadku ciężkiego uszkodzenia wątroby wykazano
zwiększenie biodostępności bezwzględnej nawet o 100%.
2. Dystrybucja
Telmisartan wiąże się z białkami osocza (> 99,5%),
głównie z albuminami i kwaśną alfa-1- glikoproteiną. Średnia objętość dystrybucji wynosi ok. 500 litrów. (460-520 l)
3. Metabolizm
Telmisartan jest metabolizowany i inaktywowany
w procesie sprzęgania z kwasem glukuronowym. Jakkolwiek cytochrom P-450 nie jest odpowiedzialny za metabolizm telmisartanu to jednak obserwowano wzrost stężenia
digoksyny i warfaryny u stosujących te leki łącznie z telmisartanem [22].
4. Eliminacja
Telmisartan jest prawie całkowicie wydalany w postaci
niezmienionej z kałem (>98%), a pozostała część z moczem.
Nie wykazano, by telmisartan stosowany w dawkach terapeutycznych ulegał kumulacji mającej znaczenie kliniczne.
Okres półtrwania w fazie eliminacji wynosi > 20 godzin.
Okres ten nie ulega zmianie u pacjentów z niewydolnością
nerek i wątroby.
Po podaniu I dawki działanie hipotensyjne zaczyna się
w ciągu 3 godzin, stopniowo narastając. Hamowanie angiotensyny II trwa 24 godziny. Maksymalne obniżenie ciśnienia
występuje po upływie 4-8 tygodni leczenia. W przypadku
nagłego odstawienia leku nie występuje zjawisko odbicia,
a ciśnienie powraca stopniowo w ciągu kilku dni.
Telmisartan – badania kliniczne
Badania zakończone:
DETAIL – (Diabetes Expose to Telmisartan and Enalapril) - porównanie skuteczności telmisartanu z enalaprilem.
Telmisartan wykazał się taką samą skutecznością, jak enalapril w hamowaniu progresji niewydolności nerek u chorych
z cukrzycą typu 2 z współistniejącym nadciśnieniem tętniczym [23].
Badania w toku
ONTARGET – (ONgoing Telmisartan Alone and in
Combination With Ramipril Global Endpoint Trial) - ocena
skuteczności w zapobieganiu powikłaniom narządowym, takim jak udar mózgu, nagły zgon sercowy, zawał serca oraz
hospitalizacja z powodu niewydolności serca. W badaniu
porównuje się terapię telmisartanem vs ramiprilem oraz telmisartanem skojarzonym z ramiprilem [24, 25].
TRANSCEND – (Telmisartan Randomized AssessmeNt
Study in aCE iNtolerant Subjects With Cardiovascular Disease) - ocena skuteczności telmisartanu u pacjentów, którzy
nie tolerują inhibitorów ACE, a jednocześnie są zagrożeni
wysokim ryzykiem udaru mózgu lub hospitalizacji z powodu niewydolności serca [24, 25].
PROFESS – (Prevention Regimen For Effectively Avoiding Second Strokes) - celem badania jest porównanie telmisartanu vs placebo w prewencji wtórnej udarów mózgu
i w tej samej grupie analiza skuteczności klopidogrelu vs
preparatu złożonego o przedłużonej formie uwalniania
(kwas acetylosalicylowy z dipirydamolem) [26, 27].
Wykaz skrótów:
AT1 receptor - Angiotensin II receptor (receptor angiotensynowy typu 1)
RAA – Renin angiotensin aldosterone system (Układ renina-angiotensyna- aldosteron)
ACE - Angiotensin converting enzyme (Enzym konwertujący angiotensynę)
NADP - Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (Fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego)
VCAM - Vascular cell adhesion molecule (Cząsteczka adhezji komórkowej naczyń)
ICAM - Intercellular adhesion molekule (Cząsteczka adhezji międzykomórkowej)
PPAR - Peroxisome proliferator-activated receptors (Receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów)
IL6 - Interleukin-6 (Interleukina 6)
MCP1 - Monocyte chemotactic protein-1 (Czynnik chemotaktyczny monocytów)
PAI-1 – Plasminogen activator inhibitor-1 (Inhibitor aktywatorów plazminogenu typu 1)
AGE – Advanced glication end products (Końcowe produkty glikacji)
RAGE - Receptor for AGE (Receptor dla AGE)
DETAIL – (Diabetes Expose to Telmisartan and Enalapril)
ONTARGET – (ONgoing Telmisartan Alone and in Combination With Ramipril Global Endpoint Trial)
TRANSCEND – (Telmisartan Randomized AssessmeNt
Study in aCE iNtolerant Subjects With Cardiovascular
Disease)
PROFESS – (Prevention Regimen For Effectively Avoiding
Second Strokes)
Piśmiennictwo
1. Janiszewski M, Mamcarz A. Wielopoziomowa blokada
układu renina-angiotensyna-aldosteron – co to oznacza
w praktyce. Kardioprofil 2007; 54-61.
2. Szczepańska-Sadowska E.: Fizjologiczne i patofizjologiczne znaczenie receptorów dla angiotensyn. Januszewicz A, Januszewicz W, Rużyłło W. Antagoniści receptora
angiotensyny II w leczeniu chorób układu sercowo-naczyniowego. Medycyna Praktyczna. Kraków 2006, 57-73.
3. Rajagopalan S i wsp.: Angiotensin II-mediated hypertension in the rat increases vascular superoxide production via membrane NADH/NADPH oxidase activation.
Contributions of vasomotor tone. J Clin Invest 1996; 97:
1916-1923.
4. Ogihara T i wsp.: Angiotensin II-induced insulin resistance is associated with enhanced insulin signaling. Hypertension 2002; 40: 872-879.
5. Folli F i wsp.: Crosstalk between insulin and angiotensin II signaling systems. Exp Clin Endocrinol Diabetes
1999; 107: 133-139.
6. Narkiewicz K. Patofizjologia układu autonomicznego w
cukrzycy. Medycyna Praktyczna. Kraków 2004, 107.
7. Januszewicz A. Antagoniści receptora angiotensyny II
w praktyce klinicznej. Medycyna Praktyczna. Kraków
2004, 50.
8. Filipiak K, Spławiński J, Opolski G.. Sartany – czy
wszystkie takie same?. Terapia i Leki 2006; 1: 5–16.
9. Kurtz TW, Pravenec M. Antidiabetic mechanisms of angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin
II receptor antagonists: beyond the renin-angiotensin
system. J Hypertens 2004; 22: 2253-2261.
10.Rosen ED, Spiegelman BM. PPARgamma: a nuclear regulator of metabolism, differentiation and cell growth. J
Biol Chem 2001; 276: 37731-37734.
11.Berger J, Moller DE. The mechanisms of action of
PPARs. Annu Rev Med 2002; 53: 409-435.
12.Picard F, Auwerx J. PPAR(gamma) and glucose homeostasis. Annu Rev Nutr 2002; 22: 167-197.
13.Walczak R, Tontonoz P. PPARadigms and PPARadoxes:
expanding roles for PPARgamma in the control of lipid
metabolizm. J Lipid Res 2002; 43: 177-186.
35
14.Benson SC. i wsp.: Identification of telmisartan as a
unique angiotensin II receptor antagonist with selective PPAR{gamma}-modulating activity. Hypertension
2004; 43: 993-1002.
15.Yamagishi S, Imaizumi T. Diabetic vascular complications: pathophysiology, biochemical basis and potential
therapeutic strategy. Curr Pharm Des 2005; 11: 2279-2299.
16.Nakamura K. i wsp.: Telmisartan inhibits expression of a
receptor for advanced glycation end products (RAGE) in
angiotensin-II-exposed endothelial cells and decreases
serum levels of soluble RAGE in patients with Essentials hypertension. Microvascular Research 2005; 70:
137-141.
17.Kurtz TW, Pravenec M. Antidiabetic mechanisms of angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin
II receptor antagonists: beyond the rennin-angiotensin
system. J Hypertens 2004; 22: 2253-2261.
18.Zanchi A. i wsp.: Effects of the peroxisomal proliferators- activated receptor-gamma agonist pioglitazone on
a renal and hormonal responses to salt in healthy man. J
Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 1140-1145.
19.Kajihara N. i wsp. Angiotensin II type 1 Receptor Antagonist Protects Ventricular and Coronary Endothelial
Function After 24-hour Heart Preservation. J Heart Lung
Transplant 2005; 24(12): 2211-2217.
20.Kuzemczak M. Antydiabetogenne i wazoprotekcyjne działanie telmisartanu zależne od blokady receptora
AT1. kardiolog.pl 2007-04-02.
21.MICARDIS (telmisartan), www.fda.gov/medwatch,
06-27-2006.
22.McClellan KJ, Markham A.: Telmisartan Drugs 1998;
56: 1039-44. 4.
23.Barnett AH. i wsp. Angiotensin-receptor blockage versus converting-enzyme inhibition in type 2 diabetes and
nephropathy. N Engl J Med 2004; 351: 1952-1961.
24.Teo K. i wsp. Rationale, design, and baseline characteristics of 2 large, simple randomized trials evaluating
telmisartan, ramipril, and their combination in high-risk
patients: the Ongoing Telmisartan Alone and in Combination with Ramipril Global Endpoint Trial/Telmisartan Randomized Assessment Study in ACE Intolerant
Subjects with Cardiovascular Disease (ONTARGET/
TRANSCEND) trials. Am Heart J 2004; 148: 52-61.
25.Sleight P. The ONTARGET/TRANSCEND Trial Programme: baseline data. Acta Diabetol. 2005;42 Suppl 1:
S50-6.
26.http://www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00153062
(18.09.2006).
27.http://www.profess-study.com/com/homepage.jsp
(18.09.2006).
Jerzy Pałka
Zakład Chemii i Analizy Leków Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku,
ul. Kilińskiego 1, 15-089 Białystok, tel. (085) 748 5706,
e-mail: [email protected]
36
Wpływ amidynowego analogu melfalanu na indukcję apoptozy
w komórkach fibroblastów skóry ludzkiej
oraz w komórkach raka piersi MCF-7 i MDA-MB 231
Induction of apoptosis by an amidine analogue of melphalan in cultured normal
human skin fibroblasts, MDA-MB 231 and MCF-7 breast cancer cells
Katarzyna Sosnowska1, Krzysztof Bielawski2, Katarzyna Winnicka1,
Małgorzata Rusak3, Anna Bielawska2
Zakład Farmacji Stosowanej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
Zakład Syntezy i Technologii Środków Leczniczych Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
3
Zakład Diagnostyki Hematologicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
Katarzyna Winnicka – Kierownik Zakładu Farmacji Stosowanej
Krzysztof Bielawski – Kierownik Zakładu Syntezy i Technologii Środków Leczniczych
Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
1
2
Streszczenie
Skuteczność leków alkilujących z grupy iperytów azotowych w leczeniu niektórych chorób nowotworowych
skłania do poszukiwania takich sposobów ich modyfikacji, aby wyeliminować lub ograniczyć niepożądane efekty
ich działania. Jednym z aktualnie sprawdzanych sposobów
osiągnięcia tego celu są badania nad amidynowymi pochodnymi iperytów azotowych wiążącymi się z wybranymi sekwencjami zasad nukleotydowych DNA.
Celem pracy było zbadanie zdolności nowej amidynowej
pochodnej melfalanu (AB2) do indukcji apoptozy w komórkach raka piersi MCF-7 i MDA-MB 231 oraz w komórkach fibroblastów skóry ludzkiej. Indukcję apoptozy
oceniano przez pomiar aktywacji kaspazy-3 metodą „Western blot” oraz przez pomiar ekspresji fosfatydyloseryny
metodą cytometrii przepływowej.
W wyniku przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono,
że amidynowy analog melfalanu (AB2) silniej indukował
proces apoptozy w porównaniu ze związkiem macierzystym w komórkach raka piersi MCF-7 i MDA-MB 231.
Ponadto wykazano, że amidynowy analog melfalanu
(AB2) indukował proces apoptozy w komórkach raka piersi MDA-MB 231 poprzez aktywację kaspazy-3.
Słowa kluczowe: Melfalan, Rak gruczołu sutkowego,
Apoptoza
Wstęp
Apoptoza, zwana inaczej programowaną śmiercią komórki, jest procesem niezbędnym do utrzymania homeostazy tkanek poprzez eliminowanie pojedynczych komórek,
które upośledzałyby funkcjonowanie tkanek [1]. Prawidłowy rozwój organizmów wielokomórkowych, ich organów
i tkanek wymaga precyzyjnej kontroli wielkości populacji
biologicznie aktywnych komórek. Osiągane jest to poprzez
regulację i wzajemne oddziaływanie procesów proliferacji
Abstract
Although the nitrogen mustards remain important as components in a variety of multidrug protocols, they have a
number of drawbacks due to their high chemical reactivity
and low affinity for DNA. Targeting nitrogen mustards to
DNA by attachment of a DNA minor groove binding carrier such as amidine group reduces the loss of active drug
due to reaction with other cell components and makes it
possible to direct the alkylation both sequence specifically
and regiospecifically.
The main purpose of the present study was to define the
apoptic action of an amidine analogue of melphalan (AB2)
in cultured normal human skin fibroblasts, MDA-MB 231
and MCF-7 breast cancer cells. Apoptosis was determined
by assessment of phosphatidylserine exposure by Annexin
V-FITC and an activation of caspase-3 by Western blot
analysis.
Induction of apoptosis by an amidine analogue of melphalan (AB2) in both MDA-MB 231 and MCF-7 breast cancer
cells was stronger than by the parent drug. We also demonstrated that amidine analogue of melphalan (AB2) induces
apoptosis in MDA-MB-231 cells by activating caspase-3.
Keywords: Melphalan, Breast cancer, Apoptosis
i apoptozy [2]. Programowana śmierć komórki może być
spowodowana działaniem czynników fizycznych, chemicznych lub też biologicznych [3]. Wszystkie te czynniki dzieli się na wewnętrzne i zewnętrzne. Przykładem czynników
wewnętrznych są: cytokiny, zmiany stężenia hormonów (np.
glikokortykoidów), deficyt czynników wzrostowych czy też
zmiany w przebiegu cyklu komórkowego. Do grupy czynników zewnętrznych zalicza się: promieniowanie UV, niedobór tlenu lub składników pokarmowych, infekcje wirusowe,
szok termiczny, leki cytostatyczne oraz wolne rodniki tle-
37
nowe [4]. Programowana śmierć komórki jest również fizjologiczną odpowiedzią na wiele czynników, takich jak na
przykład nieodwracalnie uszkodzone cząsteczki DNA czy
zmienione patologicznie komórki [1]. Proces ten powoduje
morfologiczne zmiany w komórce obejmujące: zagęszczanie chromatyny jądrowej, obkurczanie komórki, związane
z utratą wody oraz oddzielanie się fragmentów komórki
w postaci ciałek apoptotycznych otoczonych błoną plazmatyczną [5]. Podczas apoptozy nie dochodzi do dezintegracji błony cytoplazmatycznej i uwolnienia całej zawartości
komórki do przestrzeni międzykomórkowej, co ma miejsce
w przypadku nekrozy. Ponadto, podczas początkowej fazy
śmierci komórki, zachowana zostaje większość funkcji błony cytoplazmatycznej. Zmienia się jednak jej skład w wyniku przemieszczenia fosfatydyloseryny z części wewnętrznej
dwuwarstwy lipidowej do jej zewnętrznej części. Wydzielane przez komórkę w procesie apoptozy ciałka apoptotyczne, w skład których wchodzą upakowane fragmenty jądra,
elementy cytoplazmy otoczone fragmentami błony cytoplazmatycznej, zostają fagocytowane między innymi przez
makrofagi [6, 7].
Apoptoza jest procesem wymagającym dostarczania
energii oraz przebiegającym z udziałem metabolizmu komórkowego obejmującego aktywację genów oraz syntezę
RNA i białek [7]. Zapoczątkowanie apoptozy może następować poprzez zewnętrzne lub wewnętrzne szlaki zależne
od miejsca inicjującego aktywację procesu śmierci komórkowej. Szlak zewnętrzny zapoczątkowuje wiązanie się ligandu apoptotycznego, złożonego z trzech podjednostek
z odpowiadającym mu receptorem, znajdującym się w obrębie błony cytoplazmatycznej. W ten sposób dochodzi do
konformacyjnej zmiany receptora, która uaktywnia kaskadę białek przekaźnictwa sygnałowego wewnątrz komórki,
w tym licznych kaspaz [8, 9]. Wewnętrzny szlak aktywacji
apoptozy rozpoczyna wiązanie się aktywowanych białek,
należących do rodziny proapoptotycznych białek Bcl-2, tj.
białek Bax i Bak do zewnętrznej membrany mitochondrium,
co prowadzi do uwolnienia cytochromu c. Kolejny etap aktywacji apoptozy, to tworzenie kompleksu przez cytochrom
c i białko Apaf-1. Kompleks ten aktywuje kaspazę-9, która
z kolei przyczynia się do aktywacji kaspazy-3, w wyniku
czego dochodzi do inicjacji procesu apoptozy [10].
Zaburzenia mechanizmów sygnalizacji w przebiegu
apoptozy, spowodowane np. uszkodzeniami genetycznymi,
przyczyniają się do wystąpienia oporności komórek nowotworowych na chemioterapię. Upośledzenie procesu apoptozy wiązane jest obecnie między innymi z patogenezą nowotworów złośliwych [11, 12]. Tezę tę potwierdzają najnowsze
badania z zakresu terapii nowotworów dotyczące wykorzystania mechanizmów regulujących apoptozę [13-15].
Leki alkilujące pochodne iperytu azotowego, to jedna
z najstarszych grup leków przeciwnowotworowych, która
nadal stosowana jest w chemioterapii nowotworów [16].
Pochodne iperytu azotowego są jedno- lub dwufunkcyjnymi związkami alkilującymi, które reagują z DNA, RNA,
białkami powodując wielostronne zakłócenia procesów życiowych komórki. Oddziaływanie tej grupy leków z DNA
polega przede wszystkim na alkilacji atomów azotu N-7 guaniny, a w mniejszym stopniu na alkilacji atomów azotu N-3
adeniny. Leki te mogą łączyć się z pojedynczym miejscem
38
w cząsteczce DNA (z wykorzystaniem tylko jednej reszty
alkilującej) lub tworzyć wiązania krzyżowe pomiędzy parami zasad należącymi do dwóch nici spirali DNA oraz parami
zasad należącymi do tej samej nici DNA [17].
Uszkodzenia DNA powodowane przez leki alkilujące
stanowią sygnał do aktywacji komórkowych enzymów naprawiających DNA lub też indukcji procesu apoptozy [18].
Liczne badania wskazują na rolę transkrypcyjnego czynnika
AP-1, a w szczególności jego podjednostki c-Jun, w indukcji
apoptozy przez leki alkilujące [19-22]. Leki te stanowią silne induktory ekspresji genu c-jun, kodującego białko c-Jun,
a więc tym samym przyczyniają się do aktywacji białka
c-Jun [20, 23]. Ponadto związki alkilujące przyczyniają się
do aktywacji szlaku kinaz z grupy MAPK, tj. JNK (c-Jun
amino-terminal kinases) i p38, między innymi w komórkach
JURKAT, PC12 i w fibroblastach [20, 23, 24]. Substratem
dla JNK jest białko c-Jun oraz inne czynniki transkrypcyjne
[20, 25]. Pomimo tego, że aktywacja JNK stanowi wspólny
punkt w mechanizmie regulującym proces apoptozy, to rola
tych kinaz może być różna w zależności od rodzaju bodźca
uruchamiającego apoptozę lub rodzaju komórek, w których
ma miejsce aktywacja JNK [26].
Ze względu na liczne cechy niekorzystne leków alkilujących pochodnych iperytu azotowego podejmuje się próby
poszukiwania sposobów modyfikacji tych związków. Jednym z nich jest dołączenie do pochodnych iperytu azotowego cząsteczek nośników, wykazujących powinowactwo
do DNA [27-30]. W ten sposób, zwiększając stężenie leku
w otoczeniu cząsteczek DNA, można uzyskać większą aktywność substancji czynnej, która w mniejszym stopniu
oddziałuje z innymi składnikami komórki. Ponadto, odpowiednio dobrany nośnik może zmieniać specyficzność,
wyjściowej pochodnej iperytu azotowego, w stosunku do
sekwencji czy obszaru dotychczasowego miejsca wiązania
z DNA [31]. Dotychczasowe doniesienia pokazują, że połączenie związków wiążących się z DNA w małym rowku
z pochodnymi iperytu azotowego, prowadzi do wzrostu ich
cytotoksyczności in vitro oraz wzrostu właściwości przeciwnowotworowych in vivo [31, 32].
Jednym z przedstawicieli leków alkilujących, z grupy
iperytu azotowego, posiadającym dwie grupy funkcyjne jest
melfalan. Poszukuje się takich sposobów modyfikacji tego
leku, aby wyeliminować lub ograniczyć niepożądane efekty
jego działania. W tym celu dokonaliśmy syntezy amidynowej pochodnej melfalanu (AB2) (chlorowodorek 3-4-(bis(2chloroetylo)amino)fenylo)-2-(2-(4-[(N-izopropylo)amidyno]fenylo) furano-5-karboksyamido) propionianu metylu)
(Ryc. 1). Amidynowy analog melfalanu (AB2) wykazał wyższą cytotoksyczność oraz silniej hamował biosyntezę kolagenu i aktywność prolidazy w porównaniu ze związkiem
macierzystym w komórkach raka piersi MCF-7 i MDA-MB
231 [33]. Amidynowa pochodna melfalanu (AB2) wykazała także silniejszą niż melfalan zdolność do hamowania
ekspresji receptora IGF-I, receptora β1-integrynowego oraz
MAP-kinaz ERK1 i ERK2 w badanych liniach komórek raka
piersi. Ponadto stwierdzono, że amidynowa pochodna melfalanu (AB2), w przeciwieństwie do wolnego leku, wiąże się
w wąskiej bruździe DNA, wykazuje zwiększone powinowactwo do sekwencji poly(dA-dT)2 oraz posiada zdolność
do hamowania aktywności topoizomeraz I i II [33].
mieniono na pożywkę DMEM, która nie zawierała czerwieni fenolowej i płodowej surowicy bydlęcej (FBS). W ciągu
kolejnych 24 godzin wzrostu komórek pokrywały one co
najmniej 80% powierzchni każdego „oczka” płytki. Tak
przygotowane komórki (między 8 a 14 pasażem) inkubowano przez 24 godziny z badanymi związkami i używano do
dalszych doświadczeń.
1.3. Estrogenoniezależne komórki raka piersi MDA-MB
231
Komórki raka piersi MDA-MB 231 hodowano w taki
Rycina 1. Wzór strukturalny chlorowodorku 3-(4-(bis(2- sam sposób, jak komórki MCF-7. Jedyną różnicę stanowi
chloroetylo)amino)fenylo)-2-(2-(4-[(N-izopropylo)amidyno]
wymóg hodowli komórek MDA-MB 231 w atmosferze
fenylo)furano-5-karboksyamido)propionianu metylu – AB2
pozbawionej CO2 oraz zastosowanie pożywki Leibowitz L
Celem niniejszej pracy było zbadanie zdolności nowej 4386, która nie zawiera wapnia. Do dalszych badań wykoamidynowej pochodnej melfalanu oraz melfalanu do induk- rzystywano komórki między 8 a 10 pasażem, które inkubocji apoptozy w komórkach raka piersi MCF-7 i MDA-MB wano przez 24 godziny z badanymi związkami i używano
do dalszych doświadczeń.
231 oraz w fibroblastach skóry ludzkiej.
Materiały i metody
1.4. Fibroblasty skóry ludzkiej
1. Materiały
Fibroblasty skóry ludzkiej hodowano w podłożu DMEM
(Dulbecco`s minimal essential medium) z dodatkiem 10%
płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mmol/dm3 glutaminy,
50 U/cm3 penicyliny i 50 µg/cm3 streptomycyny w temperaturze 370C, w atmosferze zawierającej 5% CO2. Stosując bezwapniowy bufor fosforanowy z dodatkiem 0,05%
trypsyny i 0,02% EDTA przenoszono komórki z butelek
„Costar” do 6-oczkowy płytek „Costar” (Sigma, USA).
Policzone w hemocytometrze komórki nanoszono w ilości
1 x 105 komórek w 1 ml pożywki hodowlanej na każde
„oczko”. Co 48 godzin dokonywano wymiany pożywki na
świeżą. Pomiędzy czwartym a szóstym dniem wzrostu fibroblasty osiągały stan inhibicji kontaktowej i były używane do
dalszych doświadczeń. Tak przygotowane komórki (między
8 a 14 pasażem) inkubowano przez 24 godziny z badanymi
związkami i używano do dalszych doświadczeń.
1.1. Odczynniki
Melfalan zakupiono w firmie Fluka Chemie AG (Szwajcaria), natomiast monoklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiej kaspazie-3 w firmie Calbiochem z San Diego
(USA). Nitrocelulozę, Tween 20, roztwór mleka beztłuszczowego oraz TEMED pozyskano z firmy Bio-Rad Laboratories (USA). Wzorzec mas cząsteczkowych SeeBlue Plus 2
Pre-Stained Standard został zakupiony w firmie Invitrogen
Casus (USA). Glutaminę, penicylinę oraz streptomycynę
pozyskano z firmy Quality Biologicals Inc (USA), natomiast płodową surowicę bydlęcą (FBS) i podłoże DMEM
(Dulbecco`s minimal essential medium) kupiono w firmie
Gibco (USA). Buforowy roztwór soli fosforanowej bez
wapnia i magnezu (PBS), odczynnik Sigma-Fast BCIP/NBT
(błękit 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanonitrotetrazolo
wy), pożywkę Leibowitz L 4386, kity do badania apoptozy: Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit, przeciwciało
przeciwko mysiej IgG znakowane alkaliczną fosfatazą, dodecylosiarczan sodu (SDS), glicynę, tris[hydroksymetylo]
aminometan (Tris) oraz błękit bromofenolowy zakupiono
w firmie Sigma (USA).
1.2. Estrogenozależne komórki raka piersi MCF-7
Komórki raka piersi MCF-7 hodowano w podłożu
DMEM (Dulbecco`s minimal essential medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mmol/dm3
glutaminy, 50 U/cm3 penicyliny, 50 µg/cm3 streptomycyny
w temperaturze 370C, w atmosferze zawierającej 5% CO2.
Komórki liczono w hemocytometrze i przenoszono w ilości
1 x 106 komórek na „oczko” w 1ml pożywki hodowlanej
z butelek „Costar” (Sigma, USA), w których prowadzono hodowlę, do 6-oczkowych płytek „Nunc” (Wiesbaden,
Niemcy). Do przenoszenia komórek wykorzystywano bezwapniowy bufor fosforanowy z dodatkiem 0,05% trypsyny
i 0,02% EDTA. Po 48 godzinach pożywkę hodowlaną wy-
2. Metody
2.1. Ocena indukcji apoptozy przez pomiar aktywacji kaspazy-3 metodą „Western blot”
Badanie wykonano metodą „Western blot” dokonując
w pierwszej kolejności elektroforetycznego rozdziału białek w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS-u (opis
metody w punkcie 2.2). Po zakończonym rozdziale elektroforetycznym żele zrównoważono przez pięciominutową
inkubację w 20% (v/v) metanolowym roztworze zawierającym 25 mmol/dm3 Tris i 0,2 mol/dm3 glicyny. Białka
przenoszono na nitrocelulozę o porach 0,2 µm korzystając
z zestawu Multiphor II. Proces ten prowadzono godzinę
wykorzystując napięcie prądu 100 mA. Niespecyficzne wiązania nitrocelulozy zablokowano poprzez poddanie jej działaniu 5% beztłuszczowego mleka w TBS-T przez 1 godzinę
w pokojowej temperaturze, przy jednoczesnym wolnym
mieszaniu. Pierwszym przeciwciałem, z którym inkubowano nitrocelulozę, było przeciwciało przeciwko ludzkiej kaspazie-3, zastosowane w celu oceny zawartości tego białka.
Po godzinnej inkubacji z przeciwciałem, w stężeniu 1: 5000
39
w 5% roztworze mleka beztłuszczowego w TBS-T, nitrocelulozę płukano (1 x 20 minut, 3 x 5 minut), a następnie
poddano dalszej godzinnej inkubacji z drugim przeciwciałem przeciwko mysiej IgG, znakowanej alkaliczną fosfatazą
w stężeniu 1 : 5000 w TBS-T w celu wykrycia kaspazy-3. Ponownie delikatnie płukano nitrocelulozę pięć razy w buforze
TBS-T (1 x 20 minut, 4 x 5 minut) i poddano działaniu odczynnika Sigma-Fast BCIP/NBT (błękit 5-bromo-4-chloro3-indylofosforanonitrotetrazoliny) w celu wybarwienia immunoreaktywnego białka znakowanego fosfatazą alkaliczną.
Nitrocelulozę fotografowano w świetle widzialnym wykorzystując zestaw do wizualizacji żeli firmy Syngen (USA).
2.2. Elektroforetyczny rozdział białek na żelu poliakryloamidowym w obecności SDS-u
Zastosowano 10% żel rozdzielający i 6% żel zagęszczający oraz mieszaninę 1,92 mol/dm3 glicyny, 0,25 mol/
dm3 Tris-u i 1% SDS-u jako buforu elektrodowego. Żel rozdzielający otrzymano przez zmieszanie 0,4% SDS-u i 1,5
mol/dm3 Tris-HCl-u o pH 8,8, natomiast żel zagęszczający
powstał przez zmieszanie 0,4% SDS-u i 0,5 mol/dm3 TrisHCl-u o pH 6,8. Próbki rozpuszczano w buforze, w skład
którego wchodziły: 0,125 mol/dm3 Tris-HCl o pH 6,8, 3%
SDS, 20% glicerol i 0,1% błękit bromofenolowy. Rozdział
przeprowadzono wykorzystując aparat Mini-PROTEAN 3
firmy Bio-Rad Laboratories. Próby 10-20 µl zawierające
30 µg białka były nanoszone na żel i poddawane godzinnej
elektroforezie przy natężeniu prądu 100 mA na żel. Następnie żel poddano transferowi na nitrocelulozę. Do badania
wykorzystano następujące standardy mas cząsteczkowych,
wchodzące w skład zestawu SeeBlue Plus 2 Pre-Stained
Standard, firmy Invitrogen Casus: miozyna (191 kDa), fosforylaza b (97 kDa), albumina surowicy bydlęcej (64 kDa),
dehydrogenaza glutaminianowa (51 kDa), dehydrogenaza
alkoholowa (39 kDa), anhydraza węglanowa (28 kDa), mioglobina (19 kDa), lizozym (14 kDa).
2.3. Ocena indukcji apoptozy przez pomiar ekspresji fosfatydyloseryny metodą cytometrii przepływowej
łano apoptozę poprzez dodanie 3% formaldehydu. Kontrolę
pozytywną wykonano jako trzy próby. Pierwsza zawierała
komórki kontrolne oraz jodek propidyny, druga – komórki
kontrolne i aneksynę V-FITC, a trzecia – komórki kontrolne oraz jodek propidyny i aneksynę V-FITC. Po dodaniu
2 µl 3% formaldehydu komórki wstawiano na 10 minut do
lodówki, aby wywołać apoptozę. Kontrolę negatywną stanowiły komórki kontrolne, które nie zostały poddane działaniu żadnego czynnika. Komórki z prób kontrolnych oraz
komórki poddane działaniu badanych związków (106 komórek/cm3), zawieszone w dołączonym do zestawu buforze,
poddano dalszym badaniom. Pobierano po 200 µl zawiesiny
z każdej badanej próbki i przenoszono ją do probówek. Do
każdej próbki dodawano po 2 µl aneksyny V-FITC oraz 10
µl jodku propidyny i umieszczano je na 10 minut w ciemnym miejscu, w temperaturze pokojowej. Tak przygotowaną
zawiesinę komórek analizowano w cytometrze przepływowym EPICS XL-MCL, firmy Beckman Coulter (USA), przy
długości fali wzbudzania 488 nm. Ustawiono odpowiednio
wielkość szczeliny i analizowano zieloną fluorescencję znakowanej aneksyny V-FITC przy 540 nm oraz czerwoną fluorescencję jodku propidyny przy długości fali 650 nm.
Wyniki i dyskusja
Proces apoptozy związany jest z aktywacją wielu kaspaz,
pośród których kluczową rolę odgrywa kaspaza-3. Kaspaza
ta bierze udział, między innymi we fragmentacji chromatyny oraz tworzeniu ciałek apoptotycznych podczas poszczególnych etapów apoptozy, a także jest istotnym substratem
dla kaspazy-9 [35, 36]. Należy zauważyć, że kaspaza-3 (32
kDa) należy do grupy kaspaz wykonawczych i zostaje aktywowana poprzez przecięcie łańcucha białkowego na dwie
podjednostki: większą o masie 17 kDa i mniejszą o masie
12 kDa. Aktywność kaspazy-3 rośnie w komórkach apoptotycznych i nekrotycznych, w porównaniu do komórek
prawidłowych. Degradacja kaspazy-3, czyli jej aktywacja
przez różne czynniki, jest dowodem indukcji procesu apoptozy w komórkach [37]. Za pomocą metody „Western blot”
sprawdzony został wpływ amidynowej pochodnej melfalanu (AB2) i związku macierzystego na ekspresję tej kinazy
(Ryc. 2). Zauważono, że oba związki przyczyniały się do
indukcji apoptozy w komórkach raka piersi MDA-MB 231
oraz w fibroblastach skóry ludzkiej. W komórkach MDAMB 231 silniej ekspresję kinazy-3 pobudzała amidynowa
pochodna melfalanu (AB2), natomiast w fibroblastach melfalan. Z uwagi na brak kaspazy-3 w komórkach raka piersi
MCF-7 do badania nie użyto tej linii komórek.
Doświadczenie to przeprowadzono wykorzystując metodę z użyciem aneksyny V znakowanej izotiocyjanianem
fluoresceiny (Annexin V-FITC), tworzącej kompleksy z fosfatydyloseryną w obecności jonów wapnia. Kompleksy te
oznaczano używając cytometru przepływowego EPICS XLMCL firmy Beckman Coulter (USA).
Komórki raka piersi MCF-7, MDA-MB 231 i fibroblasty skóry ludzkiej inkubowano 24
godziny w inkubatorze zapewniającym
odpowiednie warunki, w temperaturze
370C wraz z pożywką zawierającą różne stężenia badanych związków. Po zakończonej inkubacji usuwano medium,
dodawano dołączony w zestawie bufor
i zawieszano w nim komórki. Wykonano dwie próby kontrole, tj. pozytywną Rycina 2. Ekspresja kaspazy-3 metodą „Western blot” w komórkach raka piersi
i negatywną, w celu kalibracji aparatu. MDA-MB 231 oraz w komórkach fibroblastów skóry ludzkiej inkubowanych przez
24 godziny z badanymi związkami (20 µM). Do badania użyto ekstrakt komórek
Kontrola pozytywna stanowiła wzorzec
kontrolnych i inkubowanych z badanymi związkami zawierający 30 µg białka.
komórek kontrolnych, u których wywo- Przedstawiono reprezentatywny wynik z trzech eksperymentów.
40
Rycina 3. Wpływ melfalanu i jego amidynowej pochodnej
(AB2) na indukcję apoptozy w komórkach raka piersi MCF-7
inkubowanych przez 24 godziny z badanymi związkami
(20 µM). Wyniki przedstawiono jako wartości średnie ± S.D.
uzyskane z trzech eksperymentów wykonanych w dwóch
próbach, p<0,05.
(AB2) na indukcję apoptozy w komórkach raka piersi MDA-MB
231 inkubowanych przez 24 godziny z badanymi związkami
(20 µM). Wyniki przedstawiono jako wartości średnie ± S.D.
uzyskane z trzech eksperymentów wykonanych w dwóch
próbach, p<0,05.
(AB2) na indukcję apoptozy w komórkach fibroblastów
skóry ludzkiej inkubowanych przez 24 godziny z badanymi
związkami (20 µM). Wyniki przedstawiono jako wartości
średnie ± S.D. uzyskane z trzech eksperymentów
wykonanych w dwóch próbach, p<0,05.
Wpływ badanego związku (AB2) i związku macierzystego – melfalanu na indukcję apoptozy zbadany został również
przy użyciu metody wykorzystującej wiązanie fosfatydyloseryny z aneksyną V, stosując cytometr przepływowy firmy
Becton Dickinson i oprogramowanie CellQuest. Fosfolipidy tworzące błonę komórkową rozmieszczone są asymetrycznie w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie membrany.
W części zewnętrznej dwuwarstwy lipidowej znajduje się
najwięcej fosfatydylocholiny i sfingomieliny, natomiast
w części wewnętrznej dwuwarstwy lipidowej przeważa
fosfatydyloseryna. Za transport fosfatydyloseryny do wewnętrznej części dwuwarstwy lipidowej odpowiada enzym
transferaza aminofosfolipidowa, zależna od ATP i jonów
Mg2+. Podczas wczesnej apoptozy stan równowagi pomiędzy
fosfolipidami zostaje zaburzony, a fosfatydyloseryna ulega
przemieszczeniu z wewnętrznej części błony do zewnętrznej
i wyeksponowaniu na powierzchni [7]. Wykorzystując duże
powinowactwo aneksyny V do fosfatydyloseryny można
użyć, jako znacznika komórek apoptotycznych, aneksyny
V znakowanej izotiocyjanianem fluoresceiny (aneksyna
V-FITC). Po 24-godzinnej inkubacji komórek raka piersi
MCF-7, MDA-MB 231 i fibroblastów z melfalanem i jego
analogiem (AB2) zbadano w jakim stopniu pobudzają one
apoptozę. W przypadku linii komórek MCF-7 uzyskano następujące wyniki: kontrola – 7% komórek apoptotycznych
i 0,5% komórek nekrotycznych, komórki poddane działaniu
melfalanu – 20% komórek apoptotycznych i 2% komórek
nekrotycznych, komórki poddane działaniu AB2 – 35% komórek apoptotycznych i 8% komórek nekrotycznych (Ryc.
3). W badanej linii komórek MDA-MB 231 uzyskano wyniki: kontrola – 8% komórek apoptotycznych i 2% komórek nekrotycznych, komórki poddane działaniu melfalanu – 32% komórek apoptotycznych i 8% komórek nekrotycznych, komórki poddane działaniu AB2 – 54% komórek
apoptotycznych i 18% komórek nekrotycznych (Ryc. 4).
Natomiast w badaniach przeprowadzonych na fibroblastach
uzyskano następujące wyniki: kontrola – 5% komórek apoptotycznych i 1% komórek nekrotycznych, komórki poddane
działaniu melfalanu – 35% komórek apoptotycznych i 6%
komórek nekrotycznych, komórki poddane działaniu AB2 –
16% komórek apoptotycznych i 2,5% komórek nekrotycznych (Ryc. 5).
Wykonane badania pozwoliły na stwierdzenie, że amidynowy analog melfalanu (AB2) silniej indukował proces apoptozy, w porównaniu ze związkiem macierzystym,
w komórkach raka piersi MCF-7 i MDA-MB 231. Natomiast
w komórkach fibroblastów skóry ludzkiej proces apoptozy
bardziej pobudzał melfalan. Silniejsza indukcja apoptozy
przez amidynowy analog melfalanu (AB2) w badanych komórkach nowotworowych koreluje z uzyskanymi wynikami badań dotyczącymi wpływu analogu melfalanu (AB2)
na ekspresję receptora IGF-I i MAP-kinaz ERK1 i ERK2
[33, 34]. Ostatnie badania dowodzą, że w regulacji procesu
apoptozy mogą uczestniczyć także kinazy MAP (mitogen-activated protein kinases) poprzez receptor TNF (tumor
necrosis factor) oraz w mniejszym stopniu przez receptor
CD95 (Fas, TNF receptor superfamily members) i TRAIL
(TNF-related apoptosis-inducing ligand) [38-40]. Wzrost
ekspresji MAP-kinaz ERK1 i ERK2 obserwuje się w wyniku pobudzenia receptorów IGF-I. Kinazy MAP pobudzają
wzrost i różnicowanie komórek, indukują czynniki transkrypcyjne, a także upośledzają apoptozę, umożliwiając tym
samym degradację białek zewnątrzkomórkowych (większa
produkcja proteaz) oraz powodują nasilenie procesów po-
41
wstawania przerzutów [41, 42]. Zahamowanie przekaźnictwa sygnałowego zależnego od receptora IGF-I, na drodze
blokowania tego receptora lub obniżenia jego ekspresji, prowadzi do obniżenia proliferacji komórek nowotworowych
i wzmożenia procesu apoptozy [43, 44]. Amidynowa pochodna melfalanu (AB2) silniej niż melfalan hamowała
ekspresję podjednostek α (130 kDa) i β (95 kDa) receptora IGF-I w komórkach MCF-7 i MDA-MB 231, natomiast
w fibroblastach skóry ludzkiej silniejszym inhibitorem receptora IGF-I okazał się melfalan [33]. Nowy analog melfalanu wykazał także zdolność do hamowania ekspresji
MAP-kinaz ERK1 i ERK2 w komórkach raka piersi MCF-7
i MDA-MB 231 [33]. Indukcja apoptozy przez pochodną
melfalanu (AB2) w komórkach nowotworowych może być
zatem wynikiem hamowania ekspresji MAP-kinaz ERK1 i
ERK2 oraz receptora IGF-I.
Piśmiennictwo:
1. Reed JC. Mechanisms of apoptosis, Am J Pathol 2000;
157: 1415-1430.
2. Wallace-Brodeur RR, Lowe SW. Clinical implications of
p53 mutations,. Cell Mol Life Sci 1999; 55: 64-75.
3. Sikora E. Mechanizmy śmierci programowanej komórek
(apoptozy). Postepy Biochem 1994; 40: 150-160.
4. Sen S. Programmmed cell death: concept, mechanism and
control. Biol Rev Camb Philos Soc 1992; 67: 287-319.
5. Kerr FJ, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in
tissue kinecitics. Brit J Cancer 1972; 26: 239-257.
6. Fadok VA, Chimini G. The phagocytosis of apoptotic
cells. Immunology 2001; 13: 365-372.
7. Sulejczak D. Apoptoza i metody jej identyfikacji. Postepy Biol Kom 2000; 27: 527-568.
8. Aggarwal BB. Signaling pathways of the TNF super-family: a double-edged sword. Nat Rev Immunol 2003; 3:
745-756.
9. Chan FK i wsp.: A domain in TNF receptors that mediates ligand-independent receptor assembly and signaling
and signaling. Science 2000; 288: 2351-2354.
10.Schattenberg JM, Galle PR, Schuchmann M. Apoptosis
in liver disease. Liver Int 2006; 26: 904-911.
11.Heer I, Klaus-Michel D. Cellular response and apoptosis
in cancer therapy. Blood 2001; 98: 2603-2614.
12.Zőrnig M i wsp.: Apoptosis regulators and their role in tumorigenesis. Biochim Biophys Acta 2001; 1551: F1-F37.
13.Dąbrowska M. Znaczenie apoptozy w patogenezie
i przebiegu białaczek. Diagn Lab 2000; 36: 265-280.
14.Tsutsui ST i wsp.: Prognostic significance of the coexpression of p53 protein and c-erbB2 in breast cancer,.
Am J Surg 2003; 185: 165-167.
15.Watanabe J i wsp.: Clinical evaluation of p53 mutations
in urothelial carcinoma by IHC and FASSAY. Urology
2004; 63: 989-993.
16.Lawley PD, Phillips DH. DNA adducts from chemotherapeutic agents. Mutat Res 1996; 355: 13-40.
17.Souliotis VL, Dimopoulos MA, Sfikakis PP. Gene-specific formation and repair of DNA monoadducts and interstrand cross-links after therapeutic exposure to nitrogen
mustards. Clin Cancer Res 2003; 9: 4465-4474.
42
18.Evan G, Littlewood T. A matter of life and cell death.
Science 1998; 281: 1317-1322.
19.Kolbus A i wsp.: c-Jun-dependent CD95-L expression is
a rate-limiting step in the induction of apoptosis by alkylating agents. Mol Cell Biol 2000; 20: 575-582.
20.van Dam H i wsp.: Heterodimer formation of cJun and
ATF-2 is responsible for induction of c-jun by the 243
amino acid adenovirus E1A protein. EMBO J 1993; 12:
479-487.
21.Hai TA, Curran T. Cross-family dimerization of transcription factors Fos/Jun and ATF/CREB alters DNA
binding specificity. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:
3720-3724.
22.Ham J i wsp.: A c-Jun dominant negative mutant protects
sympathetic neurons against programmed cell death.
Neuron 1995; 14: 927-939.
23.Wilhelm D i wsp.: The level of intracellular glutathione
is a key regulator for the induction of stress-activated
signal transduction pathways including Jun N-terminal
protein kinases and p38 kinase by alkylating agents. Mol
Cell Biol 1997; 17: 4792-4800.
24.Le-Niculescu H i wsp.: Withdrawal of survival factors
results in activaction of the JNK pathway in neuronal
cells leading to fas ligand induction and cell death. Mol
Cell Biol 1999; 19: 751-763.
25.Weitzman JB. JNK. Curr Biol 2000; 10: R290.
26.Weston CR, Davis RJ. The JNK signal transduction pathway. Curr Opin Gen Dev 2002; 12: 14-21.
27.Bartulewicz D i wsp.: Synthesis, molecular modelling,
and antiproliferative and cytotoxic effects of carbocyclic
derivatives of distamycin with chlorambucyl moiety. Eur
J Med Chem 2001; 36,: 461-467.
28.Denny WA. DNA-intercalating ligands as anti-cancer
drugs: prospects for future design. Anticancer Drug Des
1989; 4: 241-263.
29.Gourdie TA i wsp.: DNA-directed alkylating agents. 1.
Structure-activity relationships for acridine-linked aniline mustards: consequences of varying the reactivity of
the mustard. J Med Chem 1990; 33: 1177-1186.
30.Mattes WB, Hartley JA, Kohn WK. DNA sequence selectivity of guanine-N7 alkylation by nitrogen mustards.
Nucleic Acids Res 1986; 14: 2971-2987.
31.Denny WA. DNA minor groove alkylating agents. Curr
Med Chem 2001; 8: 533-544.
32.Cozzi P. The discovery of a new potential anticancer
drug: a case history. Il Farmaco 2003; 58: 213-220.
33.Bielawski K i wsp.: Novel amidine analogue of melphalan as a specific multifunctional inhibitor of growth and
metabolism of human breast cancer cell. Biochem Pharmacol 2006; 72: 320-331.
34.Bielawska A, Bielawski K, Anchim T. Amidine analogues of melphalan: synthesis, cytotoxic, activity, and DNA
binding properties. Arch Pharm Chem Life Sci 2007;
340: 251-257.
35.Jänicke RE i wsp.: Caspase-3 is required for DNA fragmentation and morphological changes associated with
apoptosis. J Biol Chem 1998; 273: 9357-9360.
36.Blanc C i wsp.: Caspase-3 is essential for pro-caspase-9
processing and cisplatin induced apoptosis of MCF-7
breast cancer cells. Cancer Res 2000; 60: 4386-4390.
Farm Przegl Nauk, 2009,1,
37.Earnshow WC, Martins LM, Kaufmann SH. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and
functions during apoptosis. Annu Rev Biochem 1999;
68: 383-424.
38.Shrivastava P i wsp.: Reactive nitrogen species-induced
cell death requires Fas-dependent activation of c-Jun Nterminal kinase. Mol Cell Biol 2004; 24: 6763-6772.
39.Liu H, Lo CR, Czaja MJ. NF-κB inhibition sensitizes
hepatocytes to TNF-induced apoptosis through a sustained activation of JNK and c-Jun. Hepatology 2002; 35:
772-778.
40.Vivo C, Liu W, Broaddus VC. c-Jun N-terminal kinase contributes to apoptotic synergy induced by tumor
necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand plus
DNA damage in chemoresistant, p53 inactive mesothelioma cells. J Biol Chem 2003; 278: 25461-25467.
41.Butler AA i wsp.: Insulin-like growth factor-I receptor
signal transduction: at the interface between physiology
and cell biology. Comp Biochem Physiol 1998; B 121:
19-26.
42.Maxwell A, Lawson DM. The ATP-binding site of type
II topoisomerases as a target for antibacterial drugs. Curr
Top Med 2003; 3: 283-303.
43.Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signaling
cascades. Nature 2001; 410: 37-40.
44.Maloney EK i wsp.: An anti-insulin-like growth factor-I
receptor antibody that is a potent inhibitor of cancer cell
proliferation. Cancer Res 2003; 63: 5073-5083.
Katarzyna Sosnowska
Zakład Farmacji Stosowanej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku,
15-222 Białystok, ul. Mickiewicza 2C, tel. (085) 748 56 16,
43
Wydalanie siarczanów chondroityno-dermatanowych z moczem
w przebiegu procesu fizjologicznego starzenia się ustroju.
Siarczany chondroityno-dermatanowe w diagnostyce
i farmakoterapii
Urinary excretion of chondroitin-dermatan sulfates in the course of physiological aging.
Chondroitin-dermatan sulfates in diagnostic and pharmacotherapy
Agnieszka Jura-Półtorak1, Krystyna Olczyk1, Magda Fijołek2
Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Laboratoryjnej, Wydział Farmaceutyczny
z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
2
Samodzielny Publiczny Zakład Opieki Zdrowotnej Zespół Szpitali Miejskich w Chorzowie
Kierownik Katedry: Krystyna Olczyk
1
Streszczenie
Starzenie się ustroju, uszkodzenia urazowe prowadzą
do degradacji chrząstki stawowej i następowych zmian
zwyrodnieniowych stawów.
Choroba zwyrodnieniowa stawów jest jedną z najczęstszych degeneracyjnych chorób stawów.
Laboratoryjna diagnostyka choroby zwyrodnieniowej
stawów oparta na analizie specyficznych markerów biochemicznych obecnych w płynach ustrojowych, może
być przydatna we wczesnym rozpoznaniu choroby,
monitorowaniu postępu zmian degeneracyjnych w stawach, czy monitorowaniu sposobu leczenia.
W leczeniu farmakologicznym choroby zwyrodnieniowej stawów znajdują zastosowanie leki, tzw. wolno
działające – SYSADOA (SYmptomatic Slow Acting
Drugs for OsteoArthritis), do których zalicza się siarczan chondroityny, siarczan glukozoaminy, kwas hialuronowy, diacereinę, czy wyciąg fitosteroli i kwasów
tłuszczowych z owoców awokado i nasion soi.
U podstaw procesu starzenia się ustroju leżą strukturalno-czynnościowe zmiany zachodzące zarówno
w komórkach, jak i składnikach macierzy pozakomórkowej tkanki łącznej. Wspomniane zaburzenia wiążą się
prawdopodobnie z jakościowymi i ilościowymi zmianami komponentów macierzy pozakomórkowej tkanki
łącznej, w tym – glikozoaminoglikanów, tj. siarczanów
chondroityno-dermatanowych, siarczanów heparanu,
heparyn, siarczanów keratanu oraz kwasu hialuronowego. Siarczany chondroityny są głównymi glikozoaminoglikanami chrząstki stawowej.
Wykazano, iż całkowita zawartość glikozoaminoglikanów, jak i poszczególnych ich frakcji ulega wraz
z wiekiem obniżeniu w większości tkanek i narządów.
Jednakże, zmiany wydalania siarczanów chondroitynodermatanowych – dominującej frakcji moczu – w funkcji wieku, nie zostały do końca poznane.
44
Za cel niniejszej pracy przyjęto ocenę wydalania glikozoaminoglikanów chondroitynowo-dermatanowych
z moczem w przebiegu procesu starzenia się ustroju.
Materiał do badań stanowiły próbki moczu pozyskane
od 63 zdrowych osób, obojga płci, w tym 34 kobiet i 29
mężczyzn, w wieku od 16 do 62 lat. Ocenę zawartości
siarczanów chondroityno-dermatanowych w próbkach
moczu dokonano przy użyciu testu diagnostycznnego
Blyscan Assay Kit, firmy Biocolor Ltd. Northern Ireland.
Stwierdzono, iż zawartość siarczanów chondroitynodermatanowych w moczu osób zdrowych nie jest wartością stałą i ulega obniżeniu w procesie fizjologicznego
starzenia się ustroju. Zaobserwowane zjawisko stanowi
wyraz postępującej wraz z wiekiem przebudowy komponentów macierzy pozakomórkowej tkanek, w tym
proteoglikanów i glikozoaminoglikanów.
Słowa kluczowe: choroba zwyrodnieniowa stawów,
starzenie się ustroju, mocz, siarczany chondroitynodermatanowe
Abstract
Aging process leads to degradation of articular cartilage
and the progressive degenerative joint disease. Osteoarthritis is one of the most common type of degenerative
joint diseases.
Laboratory analysis of specific biochemical markers seems to be suitable to detect initial stages of degenerative
joint disease and monitoring of disease progression and
treatment.
Symptomatic slow-acting drugs in treatment of osteoarthritis (SYSADAO) include chondroitin sulfate, glucosamine sulfate, hyaluronic acid, diacerein, avocado and
soya unsaponifiables.
The physiological aging is related to the progressive and
irreversible molecular and functional changes of both
cells and extracellular matrix components, such as glycosaminoglycans (GAGs).
It is also known that the total content of glycosaminoglycans and particular types of GAGs, such as chondroitin-dermatan sulfates, heparan sulfates, heparin,
keratan sulfate and hyaluronic acid are being reduced in
most of tissues and organs during the aging process. Nevertheless, age-related changes in urinary chondroitindermatan sulfates excretion are not well known, as yet.
The aim of the study was to evaluate the chondroitindermatan sulfates urinary excretion in the course of
physiological aging.
Study was carried out on 63 healthy individuals, of both
sex, aged from 16 to 62 years. The chondroitin-dermatan sulfates concentration in urine was assayed by the
Blyscan diagnostic test kit (Biocolor Ltd., Ireland).
It was found that urinary chondroitin-dermatan sulfates
excretion decreases with age. This phenomenon may result from age related remodeling of extracellular matrix
components including proteoglycans and glysoaminoglycans.
Key words: osteoarthritis, chondroitin-dermatan sulfates, urine, ageing process
Wstęp
W przebiegu fizjologicznego starzenia się ustroju dochodzi do strukturalno-czynnościowych zmian składników
macierzy pozakomórkowej tkanki łącznej, obejmujących
białka włókniste – kolagen i elastynę, glikoproteiny, w tym
– proteoglikany (PGs), oraz heteropolisacharydy, w tym –
glikozoaminoglikany (GAGs) [1-3]. Te ostatnie makromolekuły – to nierozgałęzione heteropolisacharydy, zbudowane z powtarzających się disacharydowych podjednostek,
złożonych z reszt N-acetylowanej D-galaktozoaminy lub Dglukozoaminy albo reszt N-siarczanowanej D-glukozoaminy
oraz reszt kwasu D-glukuronowego i/lub L-iduronowego
bądź reszt galaktozy [4-6]. Różnice w budowie chemicznej
łańcuchów glikozoaminoglikanowych stały się podstawą ich
podziału na glikozoaminoglikany chondroityno-dermatanowe (chondroityno-4-siarczany, chondroityno-6-siarczany
i siarczany dermatanu), glikozoaminoglikany heparanowe (heparyny i siarczany heparanu), glikozoaminoglikany
keratanowe (siarczany keratanu) oraz – kwas hialuronowy [4-10]. Omawiane glikany spełniają w tkankach wiele
funkcji, uczestnicząc m. in. w procesach proliferacji, różnicowania, adhezji i migracji komórek, czy też mineralizacji
kości. Ponadto, wpływają na spoistość, elastyczność i stopień uwodnienia macierzy pozakomórkowej oraz regulują
jej przepuszczalność dla obciążonych ładunkiem cząsteczek
[4-10].
Glikozoaminoglikany chondroityno- (CS) i dermatanosiarczanowe (DS) są szeroko rozpowszechnione w tkankach, gdzie występują w formie – połączeń z białkami – proteoglikanów [4,5,7]. Proteoglikany chondroityno- i dermatanosiarczanowe spotyka się przede wszystkim w macierzy
pozakomórkowej, jak również we wnętrzu komórek i na ich
powierzchni [4,5,7]. Omawiane związki występują głównie
w chrząstkach, kościach, ścięgnach, jak również w skórze,
ścianach naczyń krwionośnych oraz pępowinie [7]. Proteoglikany chondroityno- i dermatanosiarczanowe mogą posiadać dodatkowo przyłączone łańcuchy siarczanów heparanu, np. betaglikan, czy syndekan, lub siarczanów keratanu,
np. agrekan [7,10-12]. Ostatni z wymienionych jest najważniejszym proteoglikanem chrząstki, zawierającym ponad
100 łańcuchów siarczanów chondroityny oraz 20 – 50 łańcuchów siarczanów keratanu [11,12]. Siarczany chondroityny stanowią około 80% wszystkich glikozoaminoglikanów
obecnych w chrząstce stawowej [10]. W przebiegu procesu starzenia się zmniejsza się w chrząstce zawartość tych
GAGs na korzyść siarczanów keratanu [10,13], powodując
m.in. obniżenie się odporności tej tkanki na odkształcenia
w wyniku działania znacznych sił fizycznych, co może prowadzić – w przypadku urazów mechanicznych – do degradacji chrząstki, jak również i następowych zmian zwyrodnieniowych u osób starszych.
Choroba zwyrodnieniowa stawów (ChZS) jest przewlekłą, postępującą chorobą układu ruchu, charakteryzującą się
niszczeniem chrząstki stawowej, uszkodzeniem warstwy
podchrzęstnej kości oraz – tworzeniem się wyrośli kostnych, tzw. osteofitów [10,14-19]. U podstaw patogenezy
tego schorzenia leży m.in. zaburzenie równowagi przemian
metabolicznych składników macierzy pozakomórkowej
chrząstki, w tym PGs/GAGs, w kierunku nasilonego katabolizmu tych makromolekuł m.in. przez metaloproteazy, których aktywność pobudzona jest zwiększoną syntezą cytokin
prozapalnych, w tym IL-1 i TNF-α [14].
Celem leczenia – zarówno niefarmakologicznego, jak i
farmakologicznego – choroby zwyrodnieniowej stawów jest
zniesienie lub zmniejszenie bólu, utrzymanie sprawności
stawu, zminimalizowanie inwalidztwa oraz poprawa jakości
życia pacjenta [14,15,20-23]. W leczeniu farmakologicznym ChZS znajdują zastosowanie leki objawowe z różnych
grup, m.in. leki przeciwbólowe, niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), glikokortykosteroidy, jak również leki,
tzw. wolno działające – SYSADOA (SYmptomatic Slow Acting Drugs for OsteoArthritis) [14,15,20,22]. Do tych ostatnich należą siarczan chondroityny, siarczan glukozoaminy,
kwas hialuronowy, diacereina (kwas 4,5-diacetooksy-9,10antrachinono-2-karboksylowy) oraz – preparaty pochodzenia roślinnego, w tym niezmydlające się składniki olejów
pochodzących z owoców awokado i soi w połączeniu z witaminą E, określane nazwą piaskledina, czy wyciągi z kłącza imbiru [14,21-23].
Leki z grupy SYSADOA, a w szczególności siarczan
chondroityny i siarczan glukozoaminy zmniejszają objawy ChZS, wpływając na metabolizm chrząstki oraz działają chondroprotekcyjnie, poprzez stymulację syntezy PGs/
GAGs i hamowanie produkcji cytokin prozapalnych [2024].
W terapii choroby zwyrodnieniowej stawów zazwyczaj
stosuje się siarczan chondroityny i siarczan glukozoaminy
jednocześnie, wykorzystując ich działanie synergistyczne [22-24]. Wykazano, iż wspomniane związki hamują
w hodowlach komórkowych chondrocytów, zależną od
IL-1 syntezę COX-2 oraz PGE2 [22]. Ponadto siarczan glu-
45
kozoaminy wykazuje działanie przeciwzapalne
niezależne od COX-2, poprzez inhibicję aktywności białek z grupy NF-kB, obniżanie wydzielania
cytokin prozapalnych oraz hamowanie aktywacji
i degranulacji neutrofilów [22]. W badaniach klinicznych wykazano, że doustne podanie siarczanu
chondroityny (400 – 1200 mg/dobę) oraz siarczanu
glukozoaminy (1500 mg/dobę) wpływa na zmniejszenie dolegliwości związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów, spowolnienie jej rozwoju
oraz poprawę czynności stawów [22,24]. Jednakże
w porównaniu z NLPZ efekt działania zarówno
siarczanu chondroityny, jaki siarczanu glukozoaminy pojawia się później, ale utrzymuje się nawet
po odstawieniu leku [22,24].
Rycina 1. Zmiany stężenia siarczanów chondroityno-dermatanowych
Współczesna diagnostyka ChZS powinna opie- w moczu osób zdrowych, w przedziale wiekowym od 16 – 62 lat
rać się zarówno na wykonaniu badań obrazowych,
jak również diagnostycznych badań laboratoryjcytów oraz stężenie hemoglobiny, stężenie białka, glukozy,
nych [10]. Badania obrazowe, takie jak radiogramy, rezo- cholesterolu całkowitego, triacylogliceroli oraz aktywność
nans magnetyczny, czy ultrasonografia [10], nie pozwalają amylazy) oraz w moczu (badanie ogólne, stężenie kreatynina wykrycie minimalnych zmian patologicznych w struktu- ny) pozwoliły na wyłączenie z badań osób, u których wartorze chrząstki stawowej, monitorowanie przebiegu i leczenia ści ocenianych parametrów odbiegały od wartości referenchoroby zwyrodnieniowej stawów. Z kolei, laboratoryjna cyjnych.
diagnostyka choroby zwyrodnieniowej stawów, oparta na
Uzyskany materiał biologiczny podzielono na sześć
analizie specyficznych markerów biochemicznych oznacza- grup, odpowiadających kolejnym dekadom życia osób
nych we krwi, płynie stawowym czy też moczu, jest uzupeł- badanych, obejmującym lata od: 11-20 (dekada II), 21-30
nieniem badań obrazowych i może być przydatna zarówno – (dekada III), 31-40 (dekada IV), 41-50 (dekada V), 51-60
we wczesnym rozpoznaniu tej choroby, ocenie jej progresji, (dekada VI), 61-70 (dekada VII). Wszystkie osoby, których
prognozowaniu postępu zmian degeneracyjnych w stawach, próbki moczu wykorzystano do badań, stanowiących cel nijak również – w monitorowaniu skuteczności leczenia. Do niejszej pracy wyraziły zgodę na wykonanie dodatkowych
wspomnianych swoistych wskaźników biochemicznych, badań biochemicznych, w pochodzącym od nich materiale
odzwierciedlających metabolizm chrząstki, w diagnostyce biologicznym.
laboratoryjnej ChZS należą m. in.: C-, N- końcowe telopepNa przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji
tydy kolagenu typu II (CtxII, NtxII), oligomeryczne białko Bioetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katomacierzy chrząstki (COMP), siarczany keratanu, siarcza- wicach.
ny chondroityny, czy epitopy siarczanów chondroityny
Z próbek moczu wszystkich badanych osób, izolowano
(CS846), znajdujące się na agrekanie [10,16]. Biologicz- i oczyszczano glikozoaminoglikany [25]. Całkowitą zawarnym materiałem do laboratoryjnych badań diagnostycznych tość GAGs w próbkach moczu oszacowano za pomocą zeChZS jest płyn stawowy, krew oraz mocz [10,16].
stawu diagnostycznego Blyscan Assay Kit, firmy Biocolor
Jak wynika z wcześniejszych badań naszego Zespo- Ltd. Northern Ireland [25]. Następnie, w próbkach GAGs
łu oraz danych literaturowych, dominującą frakcję GAGs zdegradowano – za pomocą kwasu azotowego III – siarczaosocza i moczu stanowią siarczany chondroityny [1,9-11]. ny heparanu i heparyny, w wyniku czego otrzymano główną
Jednakże, zmiany stężenia tej heterogennej glikozoamino- frakcję glikozoaminoglikanów moczu – siarczany chondroglikanowej frakcji moczu – w funkcji wieku – nie zostały ityno-dermatanowe. Do oznaczeń zawartości siarczanów
w pełni poznane. Stąd też, za cel niniejszej pracy przyjęto chondroityno-dermatanowych w próbkach moczu wykorzyocenę wydalania glikozoaminoglikanów chondroityno-der- stano również test diagnostyczny Blyscan Assay Kit, firmy
matanowych z moczem w przebiegu procesu starzenia się Biocolor Ltd. Northern Ireland [25]. Absorbancję próbek
ustroju.
badanych i wzorcowych odczytano przy długości fali 655
nm, przy użyciu czytnika ELISA – Jupiter, firmy Biogenet.
Materiał i metodyka badań
Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej, obejmującej: eliminację wyników wątpliwych testem Q-Dixona,
Materiał do badań stanowiły próbki pierwszego, poran- sprawdzenie normalności rozkładu danej cechy testem Shanego moczu, pozyskane od 63 zdrowych osób, obojga płci, piro-Wilka, wyznaczenie wartości średnich, odchyleń stanw tym 34 kobiet i 29 mężczyzn, w wieku od 16 do 62 lat, dardowych, jednoczynnikową analizę wariancji, określenie
poddających się okresowym badaniom kontrolnym w Za- istotności różnic wartości średnich pomiędzy badanymi grukładzie Diagnostyki Laboratoryjnej Szpitala Miejskiego pami, w oparciu o test najmniejszych istotnych różnic oraz
w Pszczynie.
określenie istotności różnic wartości średnich, pomiędzy
Wyniki rutynowych oznaczeń hematologicznych i bio- badanymi grupami, w oparciu o test t-Studenta. Obliczenia
chemicznych we krwi (wartość OB i wartość wskaźnika he- przeprowadzono za pomocą modułu statystycznego Micromatokrytowego, liczba erytrocytów, leukocytów i trombo- soft Excel 2003.
46
Kobiety
Mężczyźni
wynika z ryciny 3, siarczany chondroityny stanowią
od 64% w VI dekadzie życia do 87% w IV dekadzie
życia, całkowitej puli glikozoaminoglikanów moczu osób zdrowych.
Analiza porównawcza procentowej zawartości
siarczanów chondroityno-dermatanowych w całkowitej puli GAGs wykazała statystycznie istotne
różnice pomiędzy dekadami życia: III i VI, IV i VI
oraz V i VI (ryc. 3).
Kobiety i mężczyźni
a
Dyskusja
W przebiegu procesu starzenia się ustroju dochodzi
do postępujących zmian molekularnych
*
i funkcjonalnych, obejmujących zarówno komórki,
jak i składniki macierzy pozakomórkowej [3,26].
DEKADA II
DEKADA III
DEKADA IV
DEKADA V
DEKADA VI DEKADA VII
Jak wskazują dotychczasowe badania, w przebiegu
fizjologicznego procesu starzenia się ustroju
Rycina 2. Stężenie siarczanów chondroityno-dermatanowych w moczu
dochodzi
do sukcesywnego obniżania się całkowiosób zdrowych w kolejnych dekadach życia (wartości średnie± SD)
tej puli glikozoaminoglikanów, jak również zmian
1 – istotność statystyczna różnic w wydalaniu siarczanów chondroityno-dermatanowych zawartości poszczególnych typów tych makrocząw moczu w odniesieniu do osób z III, V i VI dekady życia.
steczek, w większości tkanek i narządów [13,27a – istotność statystyczna różnic pomiędzy średnimi stężeniami siarczanów
chondroityno-dermatanowych w moczu kobiet i mężczyzn w obrębie IV dekady 31]. W tkance chrzęstnej stwierdzono znaczne
obniżenie się zawartości siarczanowanych glikozożycia.
* – nie porównywano średnich wartości stężeń siarczanów chondroityno- aminoglikanów, w tym siarczanów chondroityny,
dermatanowych pomiędzy grupą kobiet i mężczyzn ze względu na małą liczebność z jednoczesnym wzrostem zawartości siarczanów
osób obu badanych grup.
keratanu i niesiarczanowanego GAGs – kwasu hialuronowego [19,32]. Ponadto, w „starzejącej się”
Wyniki
tkance chrzęstnej dochodzi do zmian strukturalnych w obrębie łańcuchów siarczanów chondroityny, a przejawiających
Stwierdzono, że w przebiegu fizjologicznego starzenia się wzrostem stopnia ich siarczanowania [33]. Opisano rówsię ustroju wydalanie siarczanów chondroityno-dermata- nież zjawisko redukcji wraz z wiekiem ilości fibroblastów
nowych z moczem ulega zmianie. Wydalanie tych glika- chrząstki stawowej syntetyzujących PGs/GAGs [34].
nów wzrasta od końca II do IV dekady życia, gdzie osiąga
Wyrazem zachodzącym z wiekiem ilościowych, jak równajwyższą wartość [ryc.1]. Następnie, stężenie siarczanów nież i jakościowych zmian glikozoaminoglikanów w tkanchondroityno-dermatanowych stopniowo obniża się, osią- kach jest stężenie tych glikanów w płynach ustrojowych,
gając wartość minimalną w VI dekadzie życia [ryc.1]. Dy- w tym w płynie stawowym, surowicy krwi czy też w monamikę zmian stężenia siarczanów chondroityno-dermata- czu.
nowych w moczu osób zdrowych w różnym wieku zobrazoW diagnostyce wielu schorzeń, w tym mukopolisacharywano na rycinie 1.
Średnie wartości stężeń siarczanów chondroityno-dermatanowych w moczu osób zdrowych,
z uwzględnieniem płci, w poszczególnych dekadach
życia przedstawiono na rycinie 2. Jak wynika z ryciny 2, do największego wzrostu stężenia siarczanów
chondroityno-dermatanowych w moczu dochodzi
u osób w wieku 31 – 40 lat (IV dekada życia). Ponadto, stwierdzono w IV dekadzie życia, statystycznie istotne różnice w stężeniu siarczanów chondroityno-dermatanowych w moczu kobiet i mężczyzn
(ryc. 2).
Analiza porównawcza wartości stężeń siarczanów chondroityno-dermatanowych, właściwych dla
poszczególnych dekad życia wykazała statystycznie
istotne różnice w wydalaniu tych glikanów, pomiędzy dekadami: III i IV, IV i V oraz IV i VI (ryc. 2). Rycina 3. Procentowy udział siarczanów chondroitynodermatanowych
Procentowy udział siarczanów chondroityno- w moczu osób zdrowych w kolejnych dekadach życia, względem
dermatanowych w moczu osób zdrowych w kolej- całkowitej puli glikozoaminoglikanów
nych dekadach życia, względem całkowitej puli glikozoaminoglikanów, przedstawiono na rycinie nr 3. Jak 1 – istotność statystyczna różnic względem osób z III, IV i V dekady życia
*
47
doz i mukolipidoz [35,36], w chorobach nerek [35,37], bądź
też w chorobach reumatycznych [17,18,35,38,39], coraz
większe znaczenie wydaje się mieć oznaczanie wydalania
całkowitej puli glikozoaminoglikanów, jak i również poszczególnych typów tych glikanów w moczu. I tak, np. stężenie siarczanów keratanu, w płynie stawowym, surowicy
krwi lub moczu może odzwierciedlać stopień uszkodzenia
chrząstki stawowej w przebiegu choroby zwyrodnieniowej
stawów [17,18,40]. Z kolei, u osób z nawracającym zapaleniem wielochrząstkowym obserwuje się zmniejszone stężenie siarczanów chondroityny w moczu [38].
Przeprowadzona w niniejszej pracy ocena wydalania
siarczanów chondroityno-dermatanowych z moczem wykazała, iż w trakcie fizjologicznego starzenia się organizmu,
stężenie omawianych makrocząsteczek u osób po 40. roku
życia ulega sukcesywnemu obniżeniu. Wyniki niniejszej
pracy w znacznym stopniu korespondują z rezultatami badań
Lee i wsp. [37]. Wspomniani badacze [37] wykazali zmniejszające się wraz z wiekiem wydalanie zarówno siarczanów
chondroityny, jak i siarczanów dermatanu, stwierdzając jednocześnie najwyższe wydalanie tych związków u osób w II
dekadzie życia. Badania Manley’a i wsp. [41] oraz Michelacci i wsp. [42] wykazały zwiększone wydalanie z moczem
siarczanów chondroityny u dzieci (1 – 15 lat), w stosunku
do ilości tych związków stwierdzonych w moczu u osób dorosłych (16 – 92 lat). Jednocześnie, w przeciwieństwie do
wyników niniejszej pracy, u cytowanych badaczy [41,42]
nie wykazano – zachodzących wraz z wiekiem – zmian
w wydalaniu siarczanów chondroityny z moczem u osób dorosłych. Zastosowany w niniejszej pracy podział pozyskanego materiału biologicznego – zgodnie z dekadami życia na
sześć grup wiekowych wydaje się lepiej obrazować zmiany
metabolizmu komponentów macierzy pozakomórkowej,
w tym glikozoaminoglikanów chondroityno-dermatanowych tkanki łącznej, w przebiegu fizjologicznego starzenia,
niż podział materiału biologicznego tylko na dwie grupy
– grupę dzieci i dorosłych, jak to miało miejsce w badaniach
Manley i wsp. [41] oraz Michelacci i wsp. [42].
Dane literaturowe dotyczące stężenia siarczanów chondroityny w moczu są zróżnicowane [8,35]. Prawdopodobnie
związane jest to ze stosowaniem różnych metod analitycznych, sposobem i czasem zbiórki moczu (z pierwszej porannej mikcji lub dobowej zbiórki moczu), oraz – sposobem
przedstawiania wyników (µmol/24 godz., mg/L moczu czy
µg/mg kreatyniny) [8,35]. Opisywane różnice sprawiają, że
zawartość siarczanów chondroityny przedstawiana jest jako
stanowiąca od 50 – 80% całkowitej ilości GAGs w prawidłowym moczu u osób dorosłych, do 92% u dzieci [8,35,37].
Podobnie, według danych literaturowych [8,35,37] glikozoaminoglikany heparanowe stanowią od 20% do 30%, siarczany dermatanu od 1% do 5%, siarczany keratanu – 1%
i kwas hialuronowy – 1% całkowitych GAGs w moczu.
W niniejszej pracy wykazano, iż siarczany chondroitynodermatanowe stanowią od 64% do 87% całkowitej puli glikozoaminoglikanów moczu osób zdrowych, stanowiąc tym
samym dominującą frakcję glikanów prawidłowego moczu.
Wyniki niniejszej pracy wskazują znaczne podobieństwo do
rezultatów wcześniej cytowanych prac [37,42], gdzie siarczany chondroityny stanowiły od 62% do 80% wszystkich
glikozoaminoglikanów obecnych w moczu osób zdrowych.
48
Na ilość wydalanych glikozoaminoglikanów – w tym
siarczanów chondroityno-dermatanowych z moczem mają
wpływ zarówno czynniki środowiskowe, jak i fizjologiczne [8,35,43-45]. Zaobserwowano, że wydalanie GAGs
z moczem wykazuje rytm dobowy, zmieniając się również
w zależności od pory roku [44]. I tak, stopień wydalania
glikozoaminoglikanów z moczem jest o 10 – 15% większy
w godzinach rannych niż wieczornych [8,35,44]. Z kolei,
maksymalne stężenie GAGs w moczu stwierdza się wiosną
i latem, co może być związane ze stymulacją metabolizmu
kości, nasiloną syntezą witaminy D3 [8,35]. Ponadto opisano, iż wydalanie GAGs z moczem zależy od płci i nasila się
wraz ze wzrostem objętości tkanki łącznej [45]. Dowiedziono
także, że metabolizm komponentów macierzy pozakomórkowej tkanki łącznej, w tym PGs/GAGs znajduje się pod znacznym wpływem układu hormonalnego [8]. I tak, np. estradiol
pobudza fibroblasty do syntezy składników macierzy pozakomórkowej, w tym GAG [35]. Z drugiej strony, istotny wpływ
na zwiększenie wydalania glikozoaminoglikanów z moczem
ma m.in. progesteron i hormon wzrostu [35,46].
Obserwowany, w niniejszej pracy, profil wydalania siarczanów chondroityno-dermatanowych z moczem
w procesie fizjologicznego starzenia wydaje się znacznie
korespondować z metabolizmem tkanki kostnej. Należy
jednakże zaznaczyć, iż wspomniane glikozoaminoglikany
nie są dominującym składnikiem kości. W dynamice zmian
masy tkanki kostnej można wyróżnić trzy etapy: wzrostu,
konsolidacji – intensywnej przebudowy oraz inwolucji [4850]. W pierwszym etapie, masa tkanki kostnej zwiększa się
stopniowo do około 20. roku życia [48-50]. Kolejny okres
– konsolidacji szkieletu kostnego – trwa 10 – 15 lat i kończy się uzyskaniem, tzw. szczytowej masy kostnej około 30.
– 35. roku życia [48-50]. Szczytowa masa kostna u mężczyzn jest około 10 – 20% większa niż u kobiet [48-50],
co ma decydujące znaczenie dla odporności mechanicznej
kości i ryzyka występowania osteoporozy [48-50]. Ostatni
etap, inwolucyjny rozpoczyna się w wieku około 40 lat, gdzie
ubytek tkanki kostnej wynosi około 3 – 15% na 10 lat [48-50].
W niniejszej pracy, w przeciwieństwie do badań Kaznowskiej-Bystryk i wsp. [47] oraz Lee i wsp. [37], stwierdzono w grupie mężczyzn z dekady IV – w stosunku do
grupy kobiet z tej dekady – wyższe stężenie siarczanów
chondroityny w badanym materiale biologicznym. Obserwowane statystycznie istotne różnice w stężeniu siarczanów chondroityno-dermatanowych w moczu osób w wieku
31 – 40 lat, z uwzględnieniem płci, prawdopodobnie mogą
być związane z różnicą w wielkości masy kostnej u kobiet
i mężczyzn w tym okresie [48-50].
Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, iż
zawartość siarczanów chondroityno-dermatanowych w moczu osób zdrowych nie jest wartością stałą i ulega sukcesywnemu obniżeniu w procesie fizjologicznego starzenia się
ustroju, co świadczy o postępującej wraz z wiekiem przebudowie macierzy pozakomórkowej tkanki łącznej.
Monitorowanie profilu stężenia siarczanów chondroityny w płynach ustrojowych, m.in. w moczu, może w znaczący sposób uzupełnić diagnostykę obrazową wielu schorzeń
układu ruchu, w tym choroby zwyrodnieniowej stawów,
podczas kwalifikacji pacjentów do określonego sposobu leczenia.
SIARCZAN CHONDROITYNY
– MECHANIZMY DZIAŁANIA
NA CHRZĄSTKĘ STAWOWĄ
STYMULUJE SYNTEZĘ SKŁADNIKÓW CHRZĄSTKI
STAWOWEJ de novo:
↑
 Proteoglikanów
 Kwasu hialuronowego
 Kolagenu typu II
REDUKUJE DEGRADACJĘ CHRZĄSTKI STAWOWEJ
OBNIŻAJĄC:
↓
Apoptozę
NO
Reaktywne formy tlenu
Agrekanazy 1 i 2
Elastazę
Metaloproteinazy (MMP-3, MMP-9, MMP-13,
MMP-14)
 Katepsynę B
 N-acetyloglukozoaminidazę






REDUKUJE STAN ZAPALNY OBNIŻAJĄC:
↓






COX-2
IL-1 β
TNF-α
NF-kB
Fosfolipazę A2
PGE2
Tabela I. Mechanizmy działania siarczanu chondroityny
– leku z grupy tzw. SYSADAO, na chrząstkę stawową [wg
24, 51, zmodyfikowano].
Standardowe leczenie farmakologiczne ChZS opiera
się głównie na stosowaniu leków o działaniu objawowym,
w tym przeciwbólowych albo niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Jednakże, zastosowanie siarczanów chondroityny w chorobie zwyrodnieniowej stawów – jako endogennych składników chrząstki stawowej – może nie tylko
zmniejszyć objawy, ale również zapobiec zmianom strukturalnym stawów, opóźniając tym samym rozwój wspomnianej choroby. Ponadto, stosowanie u pacjentów zarówno
siarczanu chondroity, jak i siarczanu glukozoaminy zalecają
Wytyczne American College of Rheumatology na każdym
etapie leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów (Tab. I)
[15].
Diagnostyka laboratoryjna, jak i skuteczne leczenie choroby zwyrodnieniowej stawów wymagają dalszych badań
nad molekularnymi i komórkowymi podstawami metabolizmu chrząstki stawowej, a zwłaszcza nad przemianami
składników macierzy pozakomórkowej tej struktury.
Piśmiennictwo
1. Komosińska-Vassev K.B. i wsp.: Age-related changes
of plasma glycosaminoglycans. Clin Chem Med. 2008,
46: 219-224.
2. Sames K.: The role of proteoglycans and glycosaminoglycans in aging. Hamburg: Karger, Basel – Hamburg.
1994, str. 1-103.
3. Bailey A.J.: Molecular mechanisms of ageing in connective tissues. Mech Ageing Dev 2001, 122: 735-755.
4. Taylor K.R., Gallo R.L.: Glycosaminoglycans and their proteoglycans: host-associated molecular patterns
for initiation and modulation of inflammation. FASEB
J 2006, 20: 1075-1077.
5. Głowacki A. i wsp.: Glikozoaminoglikany – struktura
i funkcje. Post Biochem 1995, 41: 139-148.
6. Winsz-Szczotka K., Komosińska-Vassev K., Olczyk
K.: Metabolizm glikozoaminoglikanów w przebiegu
choroby Gravesa-Basedowa. Postępy Hig Med Dośw
2006, 60: 184-191.
7. Koźma E.M. i wsp.: Proteoglikany – struktura i funkcje.
Post Biochem 1997, 43: 158-171.
8. Daroszewski J., Rybka J., Gamian A.: Glikozoaminoglikany w patogenezie i diagnostyce oftalmopatii Gravesa. Post Hig Med. Dośw 2006, 60:370-378.
9. Gandhi N.S., Mancera R.L.: The structure of glycosaminoglycans and their interactions with proteins. Chem
Biol Drug Des 2008, 72: 455-482.
10.Zeyland J. i wsp.: Budowa i zastosowanie wybranych glikozoaminoglikanów. Medycyna Wet 2006, 62: 139-144.
11.Malejczyk J.: Budowa i immunologia tkanki chrzęstnej.
Acta Clinica 2001, 1: 15-22.
12.Marczyński W.: Patologia chrząstki stawowej – dynamika zmian, zapobieganie. Wiad Lek 2007, 1-2: 53-59.
13.Fortuniak J. i wsp.: Rola glikozoaminoglikanów w procesie degeneracji krążków międzykręgowych. Neurol
Neuroch Polska 2005, 39: 324-327.
14.Kucharz E.J.: Zachowawcze leczenie choroby zwyrodnieniowej stawów. Terapia 2007, 12:21-26.
15.Frąckowiak T.: Farmakoterapia chorób reumatycznych.
Farmacja Polska 2008, 64: 367-378.
16.Lis K.: Biochemiczne wskaźniki choroby zwyrodnieniowej stawów. Ann Acad Med. Siles 2008, 62:
123-130.
17. Belcher C. i wsp.: Synovial fluid chondroitin and keratan sulphate epitopes, glycosaminoglycans, and hyaluronan in arthritic and normal knees. Ann Rheum Dis
1997, 56:299-307.
18. Sharif M. i wsp.: The relevance of chondroitin and keratan sulphate markers in normal and arthritic synovial
fluid. Br J Rheumatol 1996, 35:951-957.
19. Squires G.R. i wsp.: The pathobiology of local lesion
development in aging human articular cartilage and molecular matrix changes characteristic of osteoarthritis.
Arthritis Rheum 2003, 48: 1261-1270.
20. Stanisławska-Biernat E., Filipowicz-Sosnowska A.:
Leczenie choroby zwyrodnieniowej stawów w świetle
współczesnych danych. Terapia 2003, 10: 27-30.
21. Stanisławska-Biernat E., Filipowicz-Sosnowska A.: Leczenie choroby zwyrodnieniowej stawów. Przew Lek
2004, 11: 62-70.
22. Pazdur J.: Choroba zwyrodnieniowa stawów – postępowanie terapeutyczne. Przew Lek 2003, 6: 77-82.
23. Dudek A., Raczkiewicz-Papierska A., Tłustochowicz
W.: Ocena skuteczności leczenia siarczanem glukozoamniy w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Pol Merk
Lek 2007, 129: 204-207.
24. Clegg D.O. i wsp.: Glucosamine, chondroitin sulfate,
and the two in combination for painful knee osteoarthritis. N Engl J Med 2006, 8: 795-808.
49
25. Blyscan. Sulfated glycosaminoglycan Assai. Manual.
Biocolor Ltd., Ireland 1994.
26. Robert L.: Aging of connective tissues: from genetic to epigenetic mechanisms. Biogerontology 2000,
1:123-131.
27. Brown C.T. i wsp.: Age-related changes of scleral hydration and sulfated glycosaminoglycans. Mech Ageing
Dev 1994, 77: 97-107.
28. Cechowska-Pasko M., Pałka J.: Age-dependent changes
in glycosoaminoglycans content in the skin of fasted
rats. A possible mechanism. Exp Toxic Pathol 2000, 52:
127-131.
29. Rada J.A. i wsp.: Proteoglycans composition in the human sclera during growth and aging. Invest Ophthalmol
Vis Sci 2000, 41: 1639-1648.
30. Curwin S.L., Roy R.R., Vailas A.C.: Regional and age
variations in growing tendon. J Morphol 1994, 221:
309-320.
31. Olczyk K.: Age-related changes in collagen of human
intervertebral disks. Gerontology 1992, 38: 196-204.
32. DeGrot J. i wsp.: Age-related decrease in proteoglycans
synthesis of human articular chondrocytes: the role
of nonezymatic glycation. Arthritis Rheum 1999, 42:
1003-1008.
33. Roughley P.J., Mort J.S.: Aging and the aggregating
proteoglycans of human articular cartilage. Clin Sci
1986, 71: 337-344.
34. Bobacz K. i wsp.: Chondrocyte number and proteoglycans synthesis in the aging and osteoarthritis human articular cartilage. Ann Rheum Dis 2004, 63: 1618-1622.
35. Kaznowska-Bystryk I., Chlebuś D.: Wydalanie glikozoaminoglikanów (GAG) z moczem – znaczenie diagnostyczne. Diagn Lab 2000, 36: 93-101.
36. Gallegos-Arreola M.P. i wsp.: Urinary glycosaminoglycan excretion in healthy subjects and in patients
with mucopolysaccharidoses. Arch Med Res 2000,
31: 505-10.
37. Lee E-Y. i wsp.: Isolation, identification, and quantitation of urinary glycosaminoglycans. Am J Nephrol
2003, 23: 152-157.
38. Passos C.O., Onofre G.R., Martins R.C.: Compositions of urinary glycosoaminoglycans in a patient
with relapsing polychondritis. Clin Biochem 2002,
35: 377-381.
39. Alwan W.H. i wsp.: Glycosaminoglycans in horses with
osteoarthritis. Equine Vet J 1991, 23:44-47.
40. Vynios D.H., Karamanos N.K., Tsiganos C.P.: Advances
in analysis of glycosaminoglycans: its application for
the assessment of physiological and pathological states
of connective tissues. J Chromatogr B Analyt Technol
Biomed Life Sci 2002,781: 21-38.
41. Manley G., Severn M., Hawksworth J.: Excretion patterns of glycosaminoglycans and glycoprotein in normal human urine. J Clin Path 1968, 21: 339-345.
42. Michelacci Y.M., Glashan R.Q., Schor N.: Urinary
excretion of glycosaminoglycans in normal and stone
forming subjects. Kidney Int 1989, 36: 1022-1028.
43. Maroclo M.V. i wsp.: Urinary glycosaminoglycan
excretion during the menstrual cycle in normal young
women. J Urol 2005, 173:1789-1792.
44. Hesse A., Wuzel H., Vahlensieck W.: Significance of
glycosaminoglycans for the formation of calcium oxalate stones. Am J Kidney Dis 1991, 17: 414-419.
45. Poulsen J.H.: Urine and tissue glycosaminoglycans
and their interrelations. Dan Med Bull 1986, 33: 75-96.
46. Daroszewski J. i wsp.: The use of glycosaminoglycan
excretion measurements in the assessment of the organic complication in acromegaly. Pol J Endocrinol 2001,
52: 347-352.
47. Kaznowska-Bystryk I., Solski J.: Excretion of glycosaminoglycans with urine health population with respect
to age and gender. Ann Univ M Curie-Skłodowska Lublin-Polonia 2007, 1: 194-198.
48. Ho A.Y., Kung A.W.: Determinants of peak bone mineral density and bone area in young women. J Bone
Miner Metab 2005, 23: 470-475.
49. Rabijewski M., Papierska L., Zgliczyński W.: Etiopatogeneza, rozpoznawanie i leczenie osteoporozy u mężczyzn. Pol Merk Lek 2008, 139: 76-80.
50. Lorenc R.S., Karczmarewicz E.: Znaczenie wapnia i witaminy D w optymalizacji masy kostnej oraz zapobieganiu i leczeniu osteoporozy u dzieci. Pediat Współcz
2001, 3: 105-109.
51. du Souich P.: Chondroitin sulfate possesses novel mechanisms of action. Structure of chondoitin sulfate influence its absorption, according to a number of studies.
Orthopedics today 2006. www.orthosupersite.com/
view.asp?rID=16710.
mgr Agnieszka Jura-Półtorak
Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Laboratoryjnej
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląski Uniwersytet Medyczny
ul. Jedności 8
41-200 Sosnowiec
50
Regulamin redagowania prac
w „Farmaceutycznym Przeglądzie Naukowym”
1. FPN zamieszcza prace oryginalne doświadczalne , kliniczne i poglądowe, z zakresu nauk farmaceutycznych, medycznych i nauk pokrewnych.
2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłać w formie elektronicznej na adres: fpn@
kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dyskietce 3,5” lub dysku CD-ROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego (z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji.
Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko pierwszego autora i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny
tworzyć osobne zbiory. Nie należy umieszczać rycin i
fotografii w plikach tekstowych. Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word, Word Perfect.
Preferowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor: CMYK,
rozdzielczość 300 dpi.
3. Prace podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych każdorazowo przez Redaktora Naczelnego.
Zachęca się autorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcja zastrzega sobie prawo dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu
z autorem).
4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie
była uprzednio publikowana ani nie została wysłana
do redakcji innego czasopisma oraz – zgodę Kierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie publikacji w czasopiśmie.
5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, które są przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, muszą mieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.
6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji redakcji.
7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw
autorskich do wydrukowanych prac (w tym prawo do
wydania drukiem, na nośnikach elektronicznych CD
i innych oraz w Internecie). Dopuszcza się natomiast
drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.
8. Instrukcja dla autorów
8.1. Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie na białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnego odstępu między wierszami oraz
marginesem 2,5 cm.
8.2. Strona tytułowa powinna zawierać: tytuł lub stopień naukowy, imię i nazwisko (imiona i nazwiska)
autorów w pełnym brzmieniu, tytuł pracy w języku
polskim i angielskim, nazwę placówki naukowej,
oraz tytuł lub stopień naukowy, imię i nazwisko
kierownika placówki naukowej, skąd pochodzi praca. U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz
adres, telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za
korespondencję, dotyczącą manuskryptu.
8.3. Druga strona manuskryptu powinna zawierać
streszczenie (150-250 słów w języku polskim
i angielskim), w którym należy podać krótkie
wprowadzenie, cel badania, podstawowe procedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych, metody badań), główne wyniki oraz
wnioski. Pod streszczeniem należy umieścić słowa
kluczowe w języku polskim i angielskim, zgodnie
z Medical Subject Headings Index Medicus.
8.4. Oryginalne prace powinny być podzielone na rozdziały, według schematu: wstęp, materiał i metody, wyniki badań, dyskusja oraz wnioski.
8.5. Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności
cytowania w tekście pracy. Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z Index Medicus. Każda
pozycja – pisana od nowego wiersza, powinna być
opatrzona numerem oraz zredagowana zgodnie
z niżej podanym przykładem:
· czasopismo naukowe:
Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic
multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:
557-67.
Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.
Komosińska-Vassev K i wsp.: Graves’ disease-associated
changes in the serum lysosomal glycosidases activity and
the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;
331: 97-102.
· wydawnictwo zbiorowe:
Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia
Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie
PZWL. Warszawa 1994, 59-69.
· monografia:
Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław
2004.
Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych, powinny być oznaczone cyframi arabskimi.
Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach oryginalnych do 20 pozycji, w poglądowych do 30
i w pozostałych do 10.
8.6. Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe
i kolorowe) powinny być umieszczone w osobnej
kopercie, ponumerowane, opatrzone nazwiskiem
autora i tytułem pracy, z zaznaczeniem „góra”,
„dół”. Opisy rycin należy podać na oddzielnej
stronie z numerami ilustracji podanymi cyframi
arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane, należy zaopatrzyć w pisemną zgodę
Wydawcy na ponowną publikację.
8.7. Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie,
należy ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułami umieszczonymi nad tabelą. Opisy
tabel należy podać na oddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframi rzymskimi.
8.8. Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej
wynosi 10, pozostałych – 5 stron.
Adres Redakcji:
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
43-300 Bielsko-Biała
ul. Wiśniowa 25/2
tel: 033/816 28 99
Farmaceutyczny
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
Index Copernicus 2,51
Prosimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literami
o dokonanie wpłat na poczcie lub w banku.
Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu.
Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeraty otrzymająPaństwo po około 2 tygodniach
od dokonania wpłaty.
Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeraty
i Kolportażu:
Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiego
TEL. 033 817 38 99
WYDAWCA
Nr rachunku odbiorcy:
0
PRENUMERATA
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
ODBIORCA:
kwota:.......................................................................................
wpłacający:..............................................................................
.................................................................................................
.................................................................................................
Zamawiam
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
Nr ............
Nr rachunku odbiorcy:
0
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
ODBIORCA:
kwota:.......................................................................................
wpłacający:..............................................................................
.................................................................................................
.................................................................................................
Zamawiam
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
Nr ............
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY

Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transcription

Similar documents

msze św. - intencje mszalne - gazetka-parafialna

ZESZYTY NAUKOWE UNiWErSYTETU prZYrOdNicZEgO WE

WIADOMOŚCI LEKARSKIE 2004, LVII, 9–10 402 Nr 9–10 SPIS TREŚCI

ZESZYTY NAUKOWE UNiWErSYTETU prZYrOdNicZEgO WE

ASP.NET MVC 4. Programowanie

LI - Zeszyty Naukowe Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu

Aspekty medyczne, psychologiczne, socjologiczne i ekonomiczne