Calprotectin

IBD diagnostik jakten på den perfekta markören
Aleksandra M. Havelka
S100 proteinfamilj
Calprotectin
S100 proteinfamilj
• Består av 25 lågmolekylära proteiner, 10-12 kDa
• Proteinerna innehåller en EF-hand motiv (a helix –
loop – a helix)
E-helix
Ca2+
F-helix
Ca2+ krävs för aktivering - konformationsförändring
Calprotectin –S100A8/A9
Heterodimer av S100 A8 och S100 A9
• S100 A8 – calgranulin A
• S100 A9 – calgranulin B
• S100 A12 – calgranulin C
Calprotectin
Calgranulins - myeloid-related proteins
Uttrycks i celler av myeloid ursprung.
Calprotectin –S100A8/A9
Uttrycks ffa i neutrofila granulocyter men finns
även representerad i monocyter, makrofager
epitelceller, eosinofiler och vissa cancer celler.
Dale; Scand J Clin Lab Invest 1990; 50:837-841
Calprotectin
Calcium- och zink-bindande protein
Står för 60 % av proteininnehållet i cytoplasman hos
neutrofila granulocyter
Mätbart i olika kroppsvätskor (blod, likvor, ledvätska
och faeces) vid bakteriella, inflammatoriska och maligna
sjukdomar
Verkar anti-inflammatoriskt och antimikrobiellt
Förhöjda värden av calprotectin
finner man i olika inflammatoriska tillstånd







Reumatoide-, juvenile- och reaktiv arthritis
Glomerulonephritis
Astma
Diabetes melitus type 2
Atherosclerosis-related inflammation
Neurodegenerative diseases
Inflammatory bowel disease (IBD)
Foell et al., Biochem J. 2006; 396:201-2014
Tarmsjukdomar - IBS och IBD
1,5 miljoner svenskar lider av kroniska magtarmbesvär (ffa irritabel kolon - IBS)
55 000 av dessa har inflammatorisk tarmsjukdom
(IBD) – 0,5 - 1%
Varje år insjuknar ca 1500 individer i IBD (i
Sverige)
IBS (Irritable Bowel Syndrome)
Också kallad colon irritabile, känslig tarm, funktionella
tarmbesvär.
Vad beror sjukdomen på?
Störningar i tarmens nervsystem och/eller muskler?
Intolerans eller överkänslighet för olika födoämnen?
Ärftlig sjukdom?
Debut efter tarminfektioner är vanligt.
Hur ställer man diagnos?
Det finns inte några laboratorietester som visar att man har
sjukdomen och det syns heller inte några förändringar på eller i
tarmen. Vid normala calprotectin värden kan man utesluta IBD
Diagnosen ställs på symptom.
Symptom
Magsmärtor
Diarré
Blod i avföringen
Feber
Viktminskning
Trötthet
IBD (Inflammatory Bowel Disease)
IBD - kronisk, periodvis mer aktiv inflammation av
okänd genes
Makroskopiska inflammationer:
IC UC
CD
 Ulcerös colit (UC)
 Chron´s sjukdom (CD)
 Indeterminate colitis (IC) = odifferentierad kolit
Mikroskopiska inflammationer:
 Kollagen och lymfocitär kolit
IBD
IBD är betydligt vanligare i den industrialiserade
västvärlden med en prevalens som närmar sig 1%.
Insjuknandet är vanligast i 20–30 års åldern för
Crohns sjukdom och Ulcerös kolit medan
mikroskopiska koliter företrädesvis debuterar i
medelåldern.
Crohns sjukdom
•förekommer i hela mag-tarmkanalen
•segmentell utbredning
•inflammation i alla vägglager
•förekomst av sår, fistlar eller abscesser.
Ulcerös kolit
•
•
Drabbar rektum och delar av- eller hela
kolon (ändtarmen och grovtarmen)
Inflammationen är begränsad till mucosan
Etiologi och patogenes

Etiologin till IBD är relativt okänd. Kombination av
immunologiska, mikrobiella och yttre faktorer som
bidrar till sjukdomsuppkomst hos en genetisk
predisponerad individ.

Ärftligheten är en stark riskfaktor, särskilt vid Crohns
sjukdom.

Rubbad balans i tarmfloran


Tobaksrökning är en risk-faktor för utveckling av
Crohns sjukdom men verkar minska risken för att
insjukna i Ulcerös kolit
NSAID preparat
Tarmbarriären skyddar oss från antigener
och mikroorganismer i tarmlumen
De flesta genetiska förändringar kan kopplas till
störningar i barriäregenskaper och
epitelväggsfunktion.
Etiologi och patogenes
Genetiska varianter ger dock inte hela förklaringen till
IBD
De flesta personer med NOD2 förändringar blir inte
tarmsjuka
I asiatiska populationer förekommer det knappast
några polymorfier men allt fler insjuknar i IBD
Ca 80% av patienterna har vid diagnostillfället ingen
förstagradssläktning med IBD
Utöver genetisk predisposition behövs det något mer
som utlöser och driver inflammationen
Symptom IBD
Symptom IBS
Magsmärtor
Diarré
Blod i avföringen
Feber
Viktminskning
Trötthet
Magsmärtor
Diarré
Blod i avföringen
Feber
Viktminskning
Trötthet
Hos barn:
Försenad pubertet
Dålig tillväxt
Diagnostik av IBD

Anamnes / status
- vikt, längd,
- nutritionsbedömning

Blodprover
- blodstatus
- SR / CRP, elfores,
- albumin, leverstatus
- yersinia o. Salmonellaserologi
- celiakimarkörer
 Avföringsprov
- Odling (salmonella, shigella, yersinia,
campylobact)
- Toxinbildande clostr. difficile
- Cystor o. maskägg
- Fekalt clprotectin
Diagnostik av IBD - undersökningar
 Gastro- och coloskopi

Tunntarmsröntgen

MRT

Buköversikt vid behov

Ultraljud vid behov

CT vid behov
Skopiundersökning
• Gold standard – diagnos och läkningskontroll
• Invasiv undersökning, ej riskfritt
• Kostsam
• Besvärlig; Laxering, Sövning
Frisk
Crohn`s sjukdom
Ulcerös kolit
Frågeställning:
Kan utredning av IBD förbättras och
underlättas för patienter och sjukvården?
Hur skulle den perfekta markören för IBD se ut?
 Stabil i faeces
 Hög känslighet och specificitet för inflammation i GI trakten
 Kan mätas i små mängder av faeces
 Påverkas ej av födan och läkemedel
 Kan mätas med en enkel, billig och icke invasiv metod
Calprotectin i faeces

Värmeresistent

Resistent mot proteolys


Hållbart i rumstemperatur i 4 - 7 dygn
– provet kan skickas med vanlig post
Kvantitativa metoder används för bestämning av
calprotectin koncentration i faeces
Calprotectin i faeces – Vad är normalt?

Vuxna och barn över 4 år
< 50 mg/kg ( gråzon 50 -100 mg/kg)


Friska spädbarn har högre koncentration
(spädbarn 2-10 veckor har ett medelvärde på 278
mg/kg)
Dag till dag variation: ca 19% coefficient of
variation
Fekalt calprotectin som diagnostiskt hjälpmedel
i praktiken
>2000
Fekalt
calprotectin
(mg/kg)
Avsevärd inflammation
1000
>100 indikerar gastrointestinal inflammation
100
50 - 100 gråzon; Biologisk variabilitet? Sjuk? =>
Penetrera anamnes, symptom / överväg uppföljning
50
<50 mg/kg – Referensvärde hos barn ≥ 4 år
0
Hur ställer man diagnos ?
IBD eller IBS
IBD diagnostik – metoder och
markörer
Scintigrafi med autologa leukocyter, 111Indium eller 99Tc märkta
Högkänslig
Kvantitativ
Korrelerar väl med inflammationsgraden
både vid CD och UC
Nackdelar
Patienten utsätts för strålning
Kostnad
Speciella faciliteter behövs för att genomföra testet
1- eller 4 dygns samling av faeces används
Mätning av kväveoxid (NO) i tarmlumen
Mängden NO är förhöjd i tarmen vid olika inflammatoriska tillstånd.
Man kan studera uttryck av iNOS (inducible NO syntase) i biopsier eller
mäta NO som ansamlas i tarmlumen.
Nackdelar
Invasiv
Ej specifik (högst konc. vid collagenous colitis).
Endoskopi
Gold standard
Nackdelar
Invasiv och kostsam
Magnetisk resonasnstomografi (MR), Datortomografi (CT), Ultraljud
Hur analyseras fekalt calprotectin idag ?
Calprotectin – historik
1980 – Fagerhol och medarbetare publicerar för första gången närvaro av
L1 protein (calprotectin) i neutrofiler
Release and quantification of leukocyte derived protein (L1).
Fagerhol MK, Dale I, Anderson I. , Scand. J. Haematol. 1980; 24:393-8
1983 – L1 isoleras och karakteriseras
Purification and partial characterization of a highly immunogenic human leukocyte protein, the L1
antigen.
Dale I, Fagerhol MK, Naesgaard I., Eur J Biochem. 1983 Jul 15;134(1):1-6.
1992 – ELISA
Roseth et al ”Assessment of the neutrophil-dominating protein calprotectin in feces. A
methodological study.
Scand. J Gasreoenterol. 19992; 27:793-8.
2000 – Improved assay for fecal calprotectin
Ton et al., Improved assay for fecal calprotectin.
Clin. Chem. Acta 2000; 292:41-54
Calprotectin ELISA
RIDASCREEN
Thermo Fisher
SCIENTIFIC
EliA Calprotectin
Test principle
Fluorescence enzyme immunoassay
Coating
Mouse monoclonal antibodies
Cut-off
< 50 mg/kg
Measuring range 15 – 3000 mg/kg
Time to result
2h to 1st result, thereafter
every minute
Hur analyseras fekalt calprotectin idag ?
Väg upp 50 - 150 mg faeces
Behöver man väga?
Ska provet blandas?
Dubbelprov?
Tillsätt rätt volym extraktionsbuffert
Blanda med vortex i 60 sekunder och skaka i 20 minuter
Häll av i ett nytt rör och centrifugera
(10 000 x g i 5 min)
Häll av supernatanten och analysera
Dubbelprov?
Stabilitet?
Snabbtest för calprotectin i faeces
Prevent ID® CalDetect från Preventis
Semi-quantitative immunochromatographic test
40 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Tolkning av resultat
Ingen inflammation
Ingen inflammation
Måttlig inflammation
Höggradig inflammation
41 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
A new rapid home test for faecal calprotectin in ulcerative colitis
M. ELKJAER*, J. BURISCH*, V. VOXEN HANSEN*, B. DEIBJERG KRISTENSEN*, J.-K. SLOTT JENSEN
& P. MUNKHOLM*
Faecal calprotectin measurement in
mg⁄ kg is
appearing on the phone screen 15 s
after the picture has
been sent to the server.
2010 startade EQUALIS ett kvalitetssäkringsprogram
för F-kalprotektin
RESULTAT prov B (mg/kg)
Sammanställning 2010-39
500
Buhlmann ELISA
400
CALPRO ELISA
300
200
mmundiagnostik ELISA
100
Buhlmann-Snabbtest
0
0
10
20
30
40
50
RESULTAT Prov A (mg/kg)
60
70
Sammanställning 2011-43
Prov B Kalprotektin (mg/kg)
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0
20
40
60
80
Prov A Kalprotektin (mg/kg)
BÜHLMANN Elisa
CALPRO Elisa
Immundiagnostik Elisa
Snabbtest - Bühlmann
100
Sammanställning 2012-47
Kalprotektin 2012-47
• Antal deltagare: 42
• Resultat intervall
Prov A: 64 – 355 mg/kg
CV% = 54
Prov B: 261 – 809 mg/kg
CV% = 50
Prov C: 84 -293 mg/kg
CV% = 42
Framtida utmaningar
• Gemensam standardisering av metoder
för analys av calprotectin
• Optimering av snabbtester
• Automatisering av:
• Den pre-analitiska upparbetningen av faecesprover
• Mätningen av calprotectin koncentrationen
= ökad effektivitet och
kortare svarstider
Fekalt kalprotektin
Billig och känslig markör för inflammation i tarmen –
”tarmens CRP-test”
Kan användas som diagnostiskt test (ref.värde <50 mg/kg
från 4 år) för IBD och andra inflammatoriska tillstånd i
tarmen
Underlättar selektion och prioritering av patienter till
koloskopi-undersökning
Möjliga felkällor vid mätning av kalprotektin
• Variga övre luftvägsinfektioner
• Användning av vissa anti-inflammatoriska läkemedel ffa.
NSAID preparat
Förhöjda värden kan även ses vid:
• Bakteriell gastroenterit
• Obehandlad celiaki, esofagit, allergisk enterokolit
• Polyper och adenocarcinom
52 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Hur skulle den perfekta markören för IBD se ut?
Stabil i faeces
Kan mätas i små mängder av faeces
Kan mätas med en enkel, billig och icke invasiv
metod
Påverkas ej av födan och läkemedel
Hög känslighet och specificitet för inflammation i
GI trakten
53 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Hur skulle den perfekta markören för IBD se ut?
Stabil i faeces
Kan mätas i små mängder av faeces
Kan mätas med en enkel, billig och icke invasiv metod
Påverkas ej av födan och läkemedel
Hög känslighet och specificitet för inflammation i GI trakten
Calprotectin är en stabil, känslig, icke invasiv, billig
men OSPECIFIK
markör för inflammation i GI trakten
54 IBD diagnostik - jakten på den perfekta markören
Jakten på den perfekta markören fortsätter
Aleksandra M. Havelka
Tack för
uppmärksamheten !!!