Angiogenesis and anti-angiogenesis

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Les colloques de L’Institut Servier
ISBN 978-2-918172-24-6
10 HP 001 BA
Angiogenèse et anti-angiogenèse
9 7 8 2 9 1 8 172246
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Photocomposition et impression : Jouve
Imprimé en France
Dépôt légal : août 2009
ISBN : 978-2-918177-24-6
Les colloques de L’Institut Servier
Angiogenesis and anti-angionenesis
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l’in st itut
ser vier
Président : Docteur Jacques Servier
Comité permanent
Docteur Laurent Perret
Docteur Alain Le Ridant
Madame Béatrice Guardiola-Lemaître
Comité scientifique
Président : Professeur Pierre Godeau
Membres : Professeurs Jacques Barrat, Marie-Germaine Bousser,
Jean-Marie Brogard, Janine Chanteur, Bernard Devulder, Camille Francès,
Jean-François Giudicelli, Michel Haguenau, Lucien Israel, Henri Lôo,
Roger Luccioni †, Charles Joël Menkès, Jean-Pierre Michel, Gérard Milhaud,
Yves Pouliquen, Jacques Rochemaure, Michel Safar, Robert Slama
Auteurs
Janine Chanteur
Professeur Emérite de Philosophie Morale et Politique de l’Université
Paris IV (Sorbonne), Paris, France
Pierre Corvol
INSERM U833, Collège de France, Paris, France
Anne Eichmann
INSERM U833, Collège de France, Paris, France
Joseph Emmerich
INSERM U428 et Hôpital Européen Georges Pompidou, Paris, France
Pierre Godeau
Président de l’Institut Servier, Paris, France
Bernard Lévy
INSERM U689, Hôpital Lariboisière, Paris, France
Philippe Menasché
Hôpital Européen Georges Pompidou, Département de Chirurgie
Cardiovasculaire, Université Paris Descartes, Faculté de Médecine,
INSERM U633, Paris, France
Jean-Jacques Mourad CHU Avicenne, APHP et Université Paris XIII, Bobigny, France
Michel Pâques
UMPC, University College London, Royaume Uni
Jacques Pouysségur Institut de Biologie du Développement et Cancer, CNTS-UME 6543,
Université de Nice, Centre Antoine Lacassagne, Nice
Olivier R ixe National Cancer Institute, Medical Oncology Branch, Bethesda, USA ;
PNES (Programme National d’Excellence Spécialisée) Rein, Institut
National du Cancer, France
José-Alain SahelCHNO des Quinze-Vingt, Institut de la Vision UMRS-INSERM, Paris,
France
Jean-Sébastien Silvestre INSERM U689, Hôpital Lariboisière, Paris, France
Gérard T obelem
IVS, Hôpital Lariboisière, Paris, France
Sommaire
Introduction
Pierre Godeau . ........................................................................................................... 15
Hommage à Roger Luccioni
Pierre Godeau . ............................................................................................................ 18
Bases moléculaires de l’angiogenèse physiologique et pathologique
Pierre Corvol ............................................................................................................... 20
Angiogenèse et neurogenèse
Anne Eichmann ............................................................................................................ 27
Angiogenèse post-ischémique : aspects expérimentaux, perspectives thérapeutiques
Bernard Lévy, Jean-Sébastien Silvestre ....................................................................... 34
Thérapie génique et cellulaire dans l’artériopathie des membres inférieurs
Joseph Emmerich ......................................................................................................... 48
La thérapie cellulaire en pathologie cardiaque
Philippe Menasché . ..................................................................................................... 59
Sur la symbolique de l’angiogenèse et de l’anti-angiogenèse
Janine Chanteur . ......................................................................................................... 66
Hypoxie et progression tumorale : nouvelles approches thérapeutiques
Jacques Pouysségur ..................................................................................................... 70
État des lieux des anti-angiogéniques en cancérologie
Olivier Rixe .................................................................................................................. 79
Anti-angiogenèse et pathologie oculaire, dégénérescence maculaire liée à l’âge
José-Alain Sahel, Michel Paques ................................................................................. 86
Les vaisseaux tumoraux : une cible thérapeutique majeure
Gérard Tobelem . .......................................................................................................... 94
Limites et complications des traitements anti-angiogéniques
Jean-Jacques Mourad................................................................................................... 100
Contents
Introduction
Pierre Godeau............................................................................................................... 109
Tribute to Roger Luccioni
Pierre Godeau . ............................................................................................................ 111
Molecular bases of physiological and pathological angiogenesis
Pierre Corvol ............................................................................................................... 113
Angiogenesis and neurogenesis
Anne Eichmann ............................................................................................................ 119
Postischemic angiogenesis: experimental aspects and therapeutic perspectives
Bernard Lévy, Jean-Sébastien Silvestre ....................................................................... 125
Gene and cell therapy in peripheral arterial disease
Joseph Emmerich ......................................................................................................... 138
Cell therapy in cardiac disease
Philippe Menasché . ..................................................................................................... 148
On the symbolism of angiogenesis and anti-angiogenesis
Janine Chanteur . ......................................................................................................... 155
Hypoxia and tumur progression: new therapeutic approaches
Jacques Pouysségur ..................................................................................................... 158
An appraisal of anti-angiogenics in oncology
Olivier Rixe .................................................................................................................. 167
Anti-angiogenesis and eye disease; age-related macular degeneration
José-Alain Sahel, Michel Paques ................................................................................. 173
Tumur blood vessels: a major therapeutic target
Gérard Tobelem . .......................................................................................................... 180
Limitations and complications of anti-angiogenic treatments
Jean-Jacques Mourad .................................................................................................. 186
Introduction
Pierre Godeau
Le concept d’angiogenèse et d’anti-angiogenèse est probablement l’une des avancées
majeures de notre évaluation des processus physiopathologiques mais c’est également un progrès dans nos connaissances du développement physiologique. C’est
pourquoi nous avions prévu, il y a bientôt 4 ans, de consacrer à ce thème l’un des
colloques de L’Institut Servier, d’autant plus qu’il concerne la plupart des disciplines
médicales et entre dans ce qu’il est désormais d’usage de désigner comme un thème
transversal.
Si l’intérêt éventuel d’un traitement anti-angiogénique du cancer a été évoqué il
y a déjà 37 ans (1971) par Folkman, c’est dans les 5 dernières années que se sont
multipliés des essais thérapeutiques dans deux domaines opposés :
––usage des médications pro-angiogéniques dans les pathologies ischémiques, essentiellement ischémie critique des membres inférieurs et pathologie coronaire avec, en
outre, un espoir jusqu’ici non conἀrmé de bloquer les processus de resténose après
angioplastie et/ou mise en place de stents ;
––emploi de médicaments anti-angiogéniques dans le traitement du cancer avec déjà
trois médicaments disponibles : bévacizumab (Avastin®), sorafenib, imitinib. Des
succès indiscutables ont été obtenus notamment dans le cancer du rein métastatique
mais également, bien que moins spectaculaires, dans le cancer colo-rectal, le cancer
du poumon non à petites cellules et le carcinome hépatocellulaire. L’activité des
agents anti-angiogéniques en monothérapie n’est donc pas nulle mais c’est couplée
à la chimiothérapie qu’elle s’avère la plus intéressante.
Le mécanisme de l’angiogenèse est le suivant : elle agit aussi bien en pathologie
que chez l’adulte sain en réveillant les cellules endothéliales quiescentes, permettant
une néovascularisation. Un exemple est celui de l’exercice musculaire prolongé où
l’hypoxie locale, résultant de l’augmentation de la consommation locale d’oxygène,
est compensée par une capillarogenèse.
Le VEGF (vascular endothelial growth factor) intervient aussi bien en physiologie, comme facteur de croissance vasculaire embryonnaire et postnatale,
qu’en pathologie, notamment dans le développement de l’angiogenèse tumorale.
Cependant, le système VEGF est complexe, comportant plusieurs isoformes et
au moins deux récepteurs dont un récepteur soluble qui joue un rôle stabilisant
15
Pierre Godeau
frénateur. En outre, le système VEGF est sous la dépendance du facteur transcriptionnel induit par l’hypoxie – HIF1 (hypoxia-inducible factor) notamment. Les
récepteurs du VEGF ayant une activité tyrosine kinase, cette particularité laisse
entrevoir d’autres possibilités de recherche physiopathologique et thérapeutique.
Les rapports du VEGF avec les activateurs du plasminogène sont également un
point important : l’interaction possible avec des phénomènes thrombotiques ne
peut être ignorée.
Par ailleurs, il ne faut pas mettre sur le même pied, dans le domaine de la néovascularisation, l’angiogenèse, l’artériogenèse et la vasculogenèse [1]. Enἀn, l’angiogenèse n’est pas indépendante de la lymphogenèse ni de la neurogenèse.
Si la thérapeutique anti-angiogénique est, dans l’ensemble, bien tolérée, notamment
absente de toute myélotoxicité, elle n’en comporte pas moins des effets secondaires
cardiovasculaires et rénaux (hypertension artérielle, protéinurie) liés en partie au
moins à la baisse de la production de monoxyde d’azote sous anti-VEGF, et on peut
craindre des effets fâcheux chez des sujets coronariens ou atteints d’artériopathie des
membres inférieurs. À l’inverse, si les agents anti-angiogéniques sont prometteurs et
en cours d’évaluation dans la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire
liée à l’âge, en bloquant la néovascularisation, on pouvait craindre a contrario un
effet nocif des pro-angiogéniques utilisés en pathologie vasculaire ischémique chez
des patients atteints de l’une de ces pathologies oculaires. Il semble toutefois que la
non-perméabilité des milieux oculaires aux traitements administrés à distance ou
par voie systémique les mette à l’abri. Le revers de la médaille est que les résultats
positifs obtenus par les anti-angiogéniques nécessitent actuellement leur utilisation
par voie intravitréenne [2].
Reste un inconvénient majeur du traitement anti-angiogénique : son efἀcacité à
court terme sur la croissance tumorale en bloquant les cellules endothéliales activées
par le VEGF et en respectant l’endothélium normal dont les cellules sont quiescentes
se maintient-elle à long terme ? Rien n’est moins sûr du fait de facteurs multiples :
mutation des récepteurs des facteurs de croissance les rendant insensibles aux inhibiteurs, stratégie de survie des cellules tumorales échappant au traitement, intervention
d’autres facteurs de croissance tumorale non identiἀés [3].
C’est pourquoi, dans l’état actuel de nos connaissances, les facteurs anti-angiogéniques ne doivent pas faire « cavalier seul » mais s’inscrivent en association et
en complément des traitements classiques, notamment de la chimiothérapie et de la
radiothérapie.
Nous espérons qu’au cours de cette journée dont l’organisation a été préférentiellement élaborée par Pierre Corvol, nos connaissances encore préliminaires de ce vaste
domaine de l’angiogenèse bénéἀcieront d’une mise à jour et d’une réḀexion mieux
étayée sur les perspectives d’avancées thérapeutiques prometteuses mais encore
insufἀsamment validées.
16
Introduction
Bibliographie
1
2
3
Simons M. Angiogenesis. Where do we stand now? Circulation 2005 ; 111 : 1556-66.
Corvol P. VEGF, anti-VEGF et pathologies. Bull Acad Nat Med 2008 ; 192 : 289-302.
Kerbel RS. Tumor angiogenesis. N Engl J Med 2008 ; 358 : 2039-49.
17
Le colloque de l’Institut Servier consacré à l’angiogenèse et l’anti-angiogenèse a
été préparé depuis 3 ans en collaboration avec Roger Luccioni et je voudrais à cette
occasion évoquer la mémoire de celui qui fut mon ami depuis près de 30 ans et qui
nous a malheureusement quittés le 9 avril 2008, 1 mois avant son 74e anniversaire.
Interniste et cardiologue, chef de service au CHU Nord de Marseille depuis 1979,
professeur titulaire depuis 1981 et professeur à la classe exceptionnelle depuis 1997,
Roger eut une carrière scientiἀque brillante matérialisée par près de 500 publications, ce qui lui a valu l’estime de ses pairs et le privilège d’exercer les fonctions de
vice-doyen de la faculté de médecine de Marseille depuis 1997.
Mon propos n’est pas de détailler ici sa carrière hospitalo-universitaire mais
de partager avec vous quelques aspects de la personnalité si attachante de Roger.
J’évoquerai tout d’abord son sens de l’amitié, de la ἀdélité à ses amis et à ses élèves
s’inscrivant dans la plus pure tradition corse où la parole donnée n’est jamais remise
en question et l’engagement réciproque en amitié est en quelque sorte sacré. Au cours
des longues années où j’ai eu l’honneur de présider la 53e section du Conseil national des Universités, se sont renforcés les liens qui nous unissaient. J’ai pu apprécier
particulièrement l’esprit de synthèse, la qualité de jugement de Roger et son sens de
l’équité évaluant avec objectivité et bienveillance sans mesquinerie mais également
sans complaisance injustiἀée les candidats aux postes de PUPH se présentant devant
notre juridiction.
Le deuxième trait marquant du caractère de Roger est son attachement à sa famille.
Sa compagne, Anne-Marie d’Estienne d’Orves, mère de ses deux dernières ἀlles,
Marie-Dominique et Julie nées en 1986 et 1987, formait avec Roger un couple exemplaire et les problèmes de santé qui les éprouvèrent tour à tour et auxquels j’ai participé comme ami et conseiller médical furent résolus par une attitude courageuse,
active, combative et dynamique que seule une profonde entente pouvait engendrer.
Mais il n’est pas possible de ne pas évoquer également d’autres qualités de Roger,
sans doute moins connues du milieu scientiἀque.
Roger s’intéressait au football et j’ai souvenir d’une réunion de la Société de
cardiologie, plus précisément de la ἀliale Thérapeutique qu’il présidait, et qui se
déroulait à Ajaccio le jour de la ἀnale de la coupe d’Europe gagnée par l’OM. Roger,
responsable de cette réunion scientiἀque, nous ἀt bénéἀcier de la transmission télévisée de ce match. Adjoint au maire de Marseille, il se devait de marquer son soutien
au club marseillais, mais j’ai appris à cette occasion qu’en 1950, comme junior,
18
il avait été champion de Provence et était resté ἀdèle à cet engagement sportif de
l’adolescence.
En réalité, l’aspect le plus étonnant de la personnalité de Roger est sa profonde
culture musicale. Roger fut en effet un contrebassiste renommé, lié à l’histoire du
jazz à Marseille depuis son adolescence. Créateur en 1956 de la revue Jazz Hip,
concerts, rencontres musicales et tournées, enregistrements de plusieurs albums et
musiques de ἀlm ont marqué son activité non seulement de contrebassiste au sein
d’un trio mais également de compositeur. En 2006, malgré ses multiples occupations
et un état de santé déjà préoccupant, un nouvel album avec ce trio intitulé Douces
pluies marquait la pérennité de l’activité de jazzman de Roger.
En 2006, lors d’une séance décentralisée de l’Académie nationale de médecine
à Marseille, le maire Jean-Claude Gaudin, qui connaissait mes liens amicaux avec
Roger, m’avait conἀrmé combien il appréciait l’activité de Roger chargé de la culture
à la mairie de Marseille et, parallèlement, son inquiétude concernant son état de
santé.
Avec Roger Luccioni, l’Institut Servier perd l’un des membres les plus actifs et les
plus prestigieux de son conseil scientiἀque. Chevalier de l’ordre national du Mérite,
chevalier de l’ordre des Palmes académiques et de l’ordre des Arts et Lettres, il
nous avait fait bénéἀcier il y a 1 an d’un remarquable exposé lors du colloque sur
la dépendance fonctionnelle, exposé particulièrement brillant dont nous ne savions
pas que c’était sa dernière participation ofἀcielle aux manifestations de l’Institut
Servier.
La minute de silence que je vous propose d’observer nous permettra de nous
recueillir en souvenir de notre ami disparu.
Professeur Pierre Godeau
19
Bases moléculaires de l’angiogenèse
physiologique et pathologique
Pierre Corvol
Fo rm at ion des
vaisse aux s angu ins
Le développement du système vasculaire durant l’embryogenèse se déroule en deux
phases distinctes, la vasculogenèse et l’angiogenèse. Lors de la vasculogenèse, des
cellules progénitrices se différencient en cellules endothéliales à partir de cellules
mésenchymateuses puis s’assemblent en un réseau vasculaire primitif. L’angiogenèse,
qui fait suite à la vasculogenèse, permet l’extension et le remodelage de ce réseau
aἀn d’établir un système circulatoire mature et fonctionnel.
Chez l’adulte sain, l’angiogenèse intervient principalement au cours du cycle
ovarien et de la grossesse. Elle participe également au développement d’une circulation collatérale lors de l’exercice physique. On parle alors d’artériogenèse. En conditions pathologiques, l’angiogenèse est impliquée dans les phénomènes de croissance
tumorale, dans des affections oculaires comme la dégénérescence maculaire liée à
l’âge et la rétinopathie diabétique, dans la cicatrisation de blessure ou dans des maladies inḀammatoires comme la polyarthrite rhumatoïde ou le psoriasis [1].
Const ru ct ion d’un nouve
au vaisse au : vas cu logenèse
La vasculogenèse aboutit à la formation d’un plexus capillaire primitif. Sous l’action
du VEGF (vascular endothelial growth factor), des cellules progénitrices nommées
angioblastes, situées dans le stroma, donnent naissance à des cellules endothéliales. Celles-ci s’organisent pour former des tubes capillaires primitifs d’une section
habituellement constituée de 3 cellules. Le plexus capillaire primitif est, à ce stade,
incapable de réagir aux variations de Ḁux sanguin.
Les chercheurs ont longtemps pensé que la phase de vasculogenèse ne concernait
pas l’adulte. En réalité, les cellules progénitrices, logées notamment dans la moelle
osseuse, peuvent être activées par des facteurs de croissance, des cytokines ou des
hormones qui vont relancer la prolifération, la différenciation et la mobilisation de
ces cellules pour contribuer à l’élaboration de nouveaux vaisseaux. Ce processus,
qui a été récemment décrit, est à la base de nouvelles modalités thérapeutiques, dites
20
pro-angiogéniques, employées en thérapie cellulaire. Celles-ci sont actuellement
étudiées en cardiologie et pourraient permettre de restaurer l’intégrité des vaisseaux
ischémiques au cours de l’infarctus du myocarde et de l’artérite des membres inférieurs [1].
Remode lage vas cu laire du rése au capillaire p rim it if :
ang iogenèse et
arté riogenèse
L’angiogenèse et l’artériogenèse constituent une phase de remodelage vasculaire du
réseau capillaire primitif issu de la phase de vasculogenèse.
Le processus est sous le contrôle de différents facteurs abondamment étudiés dans
la littérature médicale parce qu’ils constituent autant de pistes pour les thérapeutiques pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques. C’est ainsi que l’angiopoïétine 1,
le PDGF (platelet derived growth factor), le TGF-β (transforming growth factor β)
et le PlGF (placenta growth factor) notamment interviennent dans le recrutement,
la migration et l’organisation du vaisseau mature qui va ἀnalement être capable de
vasodilatation ou de vasoconstriction, de façon à pouvoir réguler les Ḁux sanguins. Il
importe de souligner que l’organisation du réseau vasculaire est sous contrôle génétique et hémodynamique à la fois. Le Ḁux sanguin participe en effet de façon active
à la formation des vaisseaux et à la différenciation en artères et veines. Ainsi, sous
l’effet du Ḁux sanguin traversant les vaisseaux, les cellules endothéliales conduisent
les cellules mésenchymateuses environnantes à proliférer, migrer et se différencier
en cellules périvasculaires pour les capillaires et en cellules musculaires lisses pour
les artères et les veines [1].
M é can isme d’ act ion du VEG F
On ne peut pas évoquer le VEGF sans rendre hommage à Jean Plouet qui, avec
Napoleone Ferrara, a découvert ce facteur de croissance en 1988 à San Francisco.
Jean Plouet est malheureusement décédé en 2008. Je tiens à rappeler ici que son
rôle dans la découverte du VEGF est resté insufἀsamment reconnu en dehors de la
communauté médico-scientiἀque française.
Le VEGF joue un rôle central dans l’angiogenèse. C’est une cytokine à action
paracrine, ce qui signiἀe que ce facteur agit sur les cellules endothéliales adjacentes
des cellules où a lieu sa synthèse. L’interaction du VEGF avec ses récepteurs exprimés par les cellules endothéliales déclenche une série de réactions qui vont aboutir à
la création d’un nouveau vaisseau à partir du vaisseau parental.
Dans un premier temps, le VEGF provoque la perte de contact entre les cellules endothéliales et les péricytes, et la perméabilité vasculaire augmente (le VEGF
avait été initialement nommé « vascular permeability factor » par Dvorac). Cette
perméabilisation libère du sérum et des protéines plasmatiques qui vont contribuer à
21
Pierre Corvol
la formation d’une matrice extracellulaire dans laquelle le néovaisseau pourra s’intégrer. La membrane basale du vaisseau parental est ensuite détruite sous l’effet de
collagénases, de protéases et de l’activateur du plasminogène. Des cellules endothéliales sont alors libérées et leur prolifération conduit à la formation d’un nouveau
vaisseau bourgeonnant à partir du vaisseau parental [1].
VEG F et ré cepteu
rs du VEG F
La famille des VEGF se compose des VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D et du
PlGF.
L’effet des VEGF est médié par 3 récepteurs tyrosine kinase nommés VEGFR-1,
VEGFR-2 et VEGFR-3. Le proἀl de liaisons des VEGF à ces récepteurs n’est pas
spéciἀque :
––le VEGFR-1 lie VEGF-A, VEGF-B et PlGF ;
––le VEGFR-2 lie VEGF-A, VEGF-C et VEGF-D ;
––le VEGFR-3 lie VEGF-C et VEGF-D [2, 3].
Les récepteurs VEGFR-1 et VEGFR-2 sont essentiellement retrouvés dans le compartiment vasculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules endothéliales. Nous
avons vu que ces facteurs jouent un rôle central dans la physiologie et la pathologie du
système vasculaire, en particulier la vasculogenèse et l’angiogenèse, deux mécanismes
qui aboutissent à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins orientés dans la direction d’un stimulus angiogénique. Or, le VEGFR-2 interagit avec une protéine, la neuropiline 1, qui a elle-même la sémaphorine pour ligand. Le terme même de neuropiline
indique que cette molécule a été découverte dans le système nerveux. Elle y intervient
dans des processus de guidage qui présentent la particularité intéressante d’être partagés par les vaisseaux sanguins et par les nerfs. Le terme sémaphorine souligne que ce
ligand guide comme un sémaphore le vaisseau dans son trajet.
Le récepteur VEGFR-1 a, quant à lui, une structure proche de celle du récepteur
VEGFR-2 mais il se caractérise par sa capacité à être clivé pour donner une partie
soluble, circulante, qui se comporte comme un anti-VEGF. Ce récepteur 1 soluble
est un VEGF-trap capable d’inactiver le VEGF circulant ou avoisinant les cellules
endothéliales. Il interviendrait dans des phénomènes d’angiogenèse-anti-angiogenèse ἀnement régulés, lors de la grossesse par exemple, pour commander l’arrêt de
l’angiogenèse. Des faits cliniques plaident ainsi en faveur d’un excès de VEGFR-1
dans la toxémie gravidique où il entraînerait une ischémie placentaire en inactivant
le VEGF et en raréἀant le réseau vasculaire.
Le système vasculaire lymphatique est contrôlé par les VEGF-C et D et leur récepteur VEGFR-3, soit un autre système de VEGF que dans le compartiment vasculaire.
L’organisation générale de ce contrôle est cependant assez parallèle et on peut légitimement escompter que des stratégies anti-VEGF spéciἀques pourront être mises en
œuvre pour, notamment, éviter la dissémination métastatique par voie lymphatique.
22
Eff ets ce llu laires et
int race llu laires du VEG F
L’activation de son récepteur par le VEGF entraîne toute une série d’événements
cellulaires et intracellulaires. Au niveau intracellulaire, le VEGF intervient dans la
production du monoxyde d’azote (NO). Son inhibition entraîne ainsi une élévation de
la pression artérielle par la diminution de la production endothéliale de NO, qui est un
agent vasodilatateur tonique, et, donc, par une élévation du tonus vasoconstricteur.
Les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules progénitrices sont également concernés par le VEGF. Ainsi, ce facteur provoque la prolifération et la migration des cellules endothéliales, sur lesquelles il exerce également un effet antiapoptotique. Il inhibe les cellules dendritiques et mobilise les cellules progénitrices des
cellules endothéliales.
S t ratég ies ant i-VEG F
Le VEGF peut être inhibé par des anticorps anti-VEGF, le VEGFR-1 soluble, un
aptamère ou des inhibiteurs des tyrosines kinases du VEGF (ἀg. 1) [4]. Un aptamère,
le pegaptanib, est ainsi d’ores et déjà employé dans le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Les inhibiteurs des tyrosines kinases du VEGF, qui ont
l’avantage de pouvoir être administrés par voie orale, sont déjà utilisés dans le traitement anticancéreux et probablement promis à un bel avenir.
Aptamère
VEGF-R1
soluble
VEGF
Domaine lgG-like
TKI
Domaine
Tyrosine-kinase
Ac anti-VEGF
VEGF-R2
Innibiteurs
TK
du VEGFR
TKII
Signalisation cellulaire
Figure 1. Stratégies anti-VEGF (Reproduit avec l’autorisation de Corvol et Postel-Vinay [4]).
23
Pierre Corvol
Cet éventail de stratégies anti-VEGF soulève la question du choix thérapeutique
et, plus particulièrement, de sa spéciἀcité. Un anticorps permet d’être extrêmement spéciἀque et pourra permettre d’agir précisément sur le VEGF-A et non sur
les VEGF-B, C ou D. En revanche, un inhibiteur des tyrosines kinases pourra agir
sur plusieurs récepteurs à activité tyrosine kinase. Avantage ou inconvénient ? Ces
tyrosines kinases pouvant être impliquées dans la prolifération cellulaire, il peut être
intéressant de disposer d’un inhibiteur poly-tyrosines kinases, poly-récepteurs de
croissance. La question reste donc ouverte.
Eff ets du
VEG F : plé io t rop iq ues
Les fonctions du VEGF sont extrêmement variées et son rôle en physiologie et en pathologie humaine est considérable. Il intervient en pathologie tumorale, inḀammatoire et
sur la plaque athéromateuse. Ainsi, celle-ci est microvascularisée et, expérimentalement
du moins, une thérapeutique anti-VEGF exerce un effet de stabilisation de la plaque.
Si le VEGF intervient dans la croissance vasculaire, il agit également au niveau
du système nerveux à la façon d’un facteur neurotrophique. En outre, il est impliqué
dans la croissance du cartilage, dans l’angiogenèse ovarienne, dans l’organisation et
la fonction glomérulaire [5].
Rô le de l’hypo x ie d ans l’ang iogenèse
La vie dépend de l’oxygène. Au Permien, il y a 250 millions d’années environ, la
pression partielle d’oxygène dans l’atmosphère était environ deux fois plus importante qu’actuellement. Alors qu’aujourd’hui seuls de petits organismes comme les
insectes peuvent se permettre d’être dépourvus de système vasculaire et d’assurer
leurs besoins par la simple diffusion de l’oxygène, l’élévation de la pression d’oxygène qui régnait au Permien a favorisé l’existence de libellules géantes sans réseau
vasculaire de près de 1 mètre d’envergure.
L’oxygène est bien la clé de l’existence. Véhiculé par le système vasculaire, il diffuse à
partir des vaisseaux dans les tissus environnants. Cependant, la pression partielle d’oxygène s’effondre rapidement à distance du vaisseau. Cette situation d’hypoxie nécessitait
la mise en place de réponses cellulaires adaptées et coordonnées. Celles-ci reposent sur
un facteur essentiel, le facteur induit par l’hypoxie (HIF, hypoxia-inducible factor) qui en
est le chef d’orchestre et qui coordonne les réponses à l’hypoxie au niveau cellulaire et à
celui de l’organisme entier. En situation hypoxique, il fait passer la cellule d’un métabolisme aérobie à un métabolisme anaérobie beaucoup moins efἀcace en termes de rendement énergétique mais essentiel pour la survie cellulaire. L’HIF va également déclencher
la formation de nouveaux vaisseaux qui vont pouvoir apporter l’oxygène dans des territoires hypoxiques. Enἀn, ce même HIF va entraîner une vasodilatation des vaisseaux pour
véhiculer de plus grandes quantités d’hémoglobine, accroître l’érythropoïèse… [6].
24
À ce jour, on dénombre une centaine de gènes environ qui sont activés et une autre
centaine qui sont réprimés sous l’effet de HIF.
Réve il ang iogén iq ue en p at ho log ie tumo rale
La croissance tumorale dépend de la néoformation de vaisseaux pour assurer l’approvisionnement en oxygène et en nutriments et l’évacuation des déchets du métabolisme. La néovascularisation pathologique se développe sous l’effet de conditions
hypoxiques et notamment sous le contrôle du VEGF et de son récepteur VEGFR-2.
C’est en 1971 que Judah Folkman a énoncé l’idée de bloquer l’angiogenèse pour priver
la tumeur d’oxygène. Ce raisonnement lumineux a eu l’énorme mérite de faire travailler
des chercheurs d’horizons très différents sur ce thème. Après les premiers succès vient
à présent le temps, comme d’usage, des remises en question. Ainsi, des chercheurs ont
émis l’hypothèse que les anti-angiogéniques provoqueraient en réalité la régression des
vaisseaux tumoraux dont on sait qu’ils sont caractérisés par un réseau vasculaire désorganisé, instable, une perméabilité accrue, des shunts artérioveineux… En revanche,
ils permettraient une « normalisation » de la vascularisation. Les anti-angiogéniques
feraient régresser les vaisseaux tumoraux anarchiques et peu efἀcaces pour favoriser sa
réorganisation et permettraient ainsi une meilleure pénétration des médicaments cytotoxiques et une meilleure sensibilité à la radiothérapie qui est très dépendante d’une
bonne oxygénation. Ce phénomène expliquerait pourquoi chez l’homme, contrairement
à la souris, un anti-VEGF seul n’a jamais montré d’effet antitumoral (ἀg. 2).
Vaisseaux cancéreux
Tissu normal
Tissu cancéreux
Traitement
anti-angiogénique
Vascularisation normale
Réseau vasculaire organisé, stable
Perméabilité contrôlée
Présence de péricytes quiescents
Flux sanguin régulé
Vaisseaux tumoraux
Régression
des vaisseaux
tumoraux
"Normalisation"
de la vascularisation
(meilleur apport
des anti-cancéreux,
sensibilité accrue
à la radiothérapie)
Réseau vasculaire désorganisé, instable
Perméabilité accrue
Élévation de la pression interstitielle
Shunts artério-véneux
Insuffisance de péricytes
Flux sanguin non régulé
Figure 2. Vascularisation tumorale et traitement anti-angiogénique (Reproduit avec l’autorisation de
Corvol et Postel-Vinay [4]).
25
Pierre Corvol
Bibliographie
1
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Anne Eichmann
Le réseau vasculaire est le premier des grands systèmes à se mettre en place durant l’ontogenèse. Au cours de son développement, les vaisseaux sanguins se dirigent avec précision vers leur cible pour réaliser un arbre vasculaire extrêmement stéréotypé. Comment
l’embryon parvient-il à former un système aussi complexe et aussi structuré alors qu’il
atteint une longueur totale de 80 000 km chez l’homme adulte ? Nous espérons qu’en
approfondissant notre connaissance des mécanismes à l’œuvre, nous pourrons parvenir
à une meilleure maîtrise des nombreuses maladies qui affectent le réseau vasculaire.
Les rése aux vas cu laire et ne
rveux sont ét
ro itement
liés
Il y a 500 ans, Vesalius dessinait, à la lueur des chandelles, l’arbre vasculaire humain.
L’anatomiste belge avait déjà remarqué que celui-ci était totalement superposable à ce
deuxième arbre que forme le système nerveux (ἀg. 1). Ces deux systèmes, qui pour
l’un irrigue tout le corps et pour l’autre contrôle sa motricité et son système sensoriel, doivent interagir de façon étroite. Ainsi, les nerfs ont des besoins en oxygène et
en nutriments et ils sont, pour cette raison, recouverts d’un dense réseau vasculaire.
De la même façon, la motricité et le maintien du tonus vasculaire nécessitent une
innervation et les artères sont par conséquent entourées d’un ἀn réseau de nerfs postganglionnaires sympathiques.
Les deux systèmes ont par ailleurs en commun de se ramiἀer dans tout l’organisme
pour transmettre une information directionnelle, le Ḁux artériel et veineux dans le
système vasculaire et les voies motrices et sensorielles dans le système nerveux. De
plus, ils sont tous deux composés de deux types de cellules intimement associés, les
cellules endothéliales et les cellules de la paroi vasculaire dans le système vasculaire,
les neurones et les cellules gliales dans le système nerveux.
Facteu rs de cro iss an ce vas cu laire et déve
du système ne
rveux
loppement
Si les systèmes vasculaire et nerveux présentent des interactions anatomiques et
fonctionnelles, ils ont également en commun des voies moléculaires de signalisation
qui permettent leur développement harmonieux. L’intervention des facteurs de crois27
Anne Eichmann
Figure 1. Ces représentations, datant de 1543, montrent que l’anatomiste belge Vesalius avait déjà
remarqué que les arbres vasculaire (à gauche) et nerveux (à droite) humains sont superposables.
sance vasculaire dans le développement du système nerveux a été observée chez une
souris dans laquelle l’élément de réponse à l’hypoxie dans le promoteur du VEGF
avait été délété : les chercheurs avaient eu la surprise de voir l’animal développer une
sclérose très proche de la sclérose latérale amyotrophique humaine. De nombreuses
études ont par la suite montré que le VEGF exerce une action neurotrophique. Notre
contribution à ce domaine, en collaboration avec Jean-Léon Thomas de l’U 711 de
l’INSERM, a été d’étudier un facteur de croissance apparenté au VEGF, le VEGF-C,
qui intervient dans le développement neural.
VEG F-C et déve
et ne rveux
loppement des systèmes
vas cu laire
Le VEGF-C et son récepteur, le VEGFR-3, interviennent dans le développement des
vaisseaux lymphatiques. Le rapporteur LacZ inséré dans le gène VEGFR-3 colore
en bleu tous les vaisseaux qui expriment ce récepteur. Il a permis de montrer sa
28
présence au niveau du réseau vasculaire lymphatique, alors qu’il n’est pas exprimé
dans les veines. Le récepteur VEGFR-3 est ainsi spéciἀque des vaisseaux lymphatiques. L’emploi du rapporteur LacZ a également permis de montrer que ce récepteur est présent au niveau du cerveau de souris adultes. Le cerveau étant dépourvu
de système lymphatique, le récepteur est donc également exprimé par des populations de neurones, et ce constat rendait très probable une action du VEGF-C sur le
système nerveux. De fait, nous avons montré in vitro que des progéniteurs de neurones d’embryon exprimant le récepteur VEGFR-3 se divisent et prolifèrent lorsqu’ils
sont soumis à une stimulation par le VEGF-C [1]. Ce dernier, qui est exprimé dans
les deux systèmes, régule vraisemblablement des voies parallèles du développement
neural et du développement vasculaire. Cette observation soulève la question d’un
éventuel impact neurologique des traitements anti-angiogéniques.
La cro iss an ce des
capillaires est gu
idée p ar l’hypo x ie
Comment le guidage des capillaires est-il assuré ? La rétine de la souris est un
modèle extrêmement précieux pour l’étude de la vascularisation. Elle a notamment
permis de montrer que l’angiogenèse est conditionnée par l’hypoxie. Celle-ci attire
les vaisseaux par une expression accrue du VEGF, alors que l’apport d’oxygène la
diminue en une boucle de rétrocontrôle qui dirige la couverture vasculaire et donc
l’oxygénation des tissus.
Si nous nous intéressons plus particulièrement à l’extrémité des capillaires qui
pénètrent dans les territoires hypoxiques, nous constatons qu’elle est constituée d’une
cellule endothéliale spécialisée, la tip-cell, qui se distingue par sa capacité à étendre
de très nombreux ἀlopodes, c’est-à-dire de petites structures riches en actine pouvant
se polymériser et se dépolymériser. La tip-cell présente également la caractéristique
d’exprimer les plus forts taux du récepteur VEGFR-2. Elle va par conséquent avoir
la plus forte réponse au VEGF et, pour cette raison, elle constitue probablement une
cible préférentielle des traitements anti-angiogéniques.
La tip-cell gu ide la prog ress ion des
capillaires
Au niveau de la rétine, la formation du capillaire s’effectue selon un gradient de VEGF
allant du plus élevé dans la région hypoxique au plus faible dans la région normoxique. Lorsqu’elle est située à proximité de la région hypoxique, la tip-cell forme des
ἀlopodes alors que les cellules situées derrière forment la lumière du capillaire et
assurent l’apport en sang, en oxygène et en nutriments. Pourquoi ces deux types de
cellules se comportent-ils de manières différentes ? Il a été montré qu’une mutation
d’un gène ligand de Notch, nommé Dll4 (delta-like ligand 4), perturbe la sélection
des tip-cells. Chez les animaux Dll4 hétérozygotes, chaque cellule endothéliale va se
comporter en tip-cell et étendre des ἀlopodes. Cela signiἀe que chacune des cellules
29
Anne Eichmann
endothéliales a la possibilité d’évoluer en tip-cell mais que, en conditions normales,
cette potentialité est abolie par l’action de Dll4 sur son récepteur Notch exprimé par
la cellule adjacente.
La s ign alis at ion de lt a-N o t ch cont rô le la fo rm at ion
de tip-cells
Schématiquement, le VEGF produit par les cellules hypoxiques se lie à son récepteur
VEGFR-2 sur la tip-cell. Il a été montré que cette liaison induit l’expression de Dll4
par la tip-cell. Dll4 va se lier à son ligand Notch exprimé par les cellules situées à
l’arrière de la tip-cell. L’action de Notch va ensuite moduler l’expression du VEGF
récepteur dans cette cellule de façon à abaisser sa sensibilité au VEGF. Sept articles
publiés à la ἀn des années 2006 et 2007, dont un par notre équipe, arrivent à la même
conclusion : la signalisation delta-Notch supprime la formation des tip-cells [2-8].
Ce qui est tout à fait remarquable, c’est que cette voie de signalisation opérationnelle
chez l’embryon l’est également au niveau des vaisseaux tumoraux. De cette observation découle l’idée de bloquer la vascularisation tumorale en générant un nombre
excessif de tip-cells pour empêcher la formation d’un réseau vasculaire structuré.
Si m ilarités ent
re tip-cell et cône de
cro iss an ce axon al
La tip-cell présente de remarquables similarités avec une structure terminale de l’axone
nommée cône de croissance (ἀg. 2). Tout comme le vaisseau, l’axone possède à son
extrémité une structure motrice étendant des ἀlopodes qui vont polymériser et dépolymériser pour guider l’axone vers une cible distante dans l’organisme. On connaît
actuellement quatre familles de ligands et de récepteurs qui guident les axones vers leur
cible. Ces ligands sont les éphrines, les sémaphorines, les slits et les nétrines qui vont
se lier à des familles de récepteurs exprimés par les ἀlopodes de l’axone et provoquer
ainsi l’attraction ou la répulsion du cône de croissance. Il est tout à fait remarquable que
parmi les quatre familles de récepteurs aux facteurs de guidage des axones, plusieurs
s’expriment également au niveau des cellules endothéliales, y compris au niveau des
tip-cells. C’est notamment le cas du récepteur Eph4 et de son ligand l’éphrine B2, des
récepteurs plexine-D1 et neuropiline qui lient les sémaphorines, de robo4, un membre
des récepteurs aux slits et d’UNC5B pour la nétrine [9-14] (ἀg. 3).
Imp licat ion de mo lé cu les de gu idage axon al
de type nét
rine et de
leu r ré cepteu r UN C5B
dans la mo rphogenèse du système
vas cu laire
Nous nous sommes particulièrement intéressés à un récepteur de la nétrine, l’UNC5B.
La nétrine est un facteur de guidage de la croissance neuronale bifonctionnel, ce
qui signiἀe qu’elle est aussi bien capable d’attirer que de repousser les neurones. Elle
30
Figure 2. La tip-cell endothéliale de la rétine de souris (à gauche) comme le cône de croissance axonal
(à droite) étendent des ἀlopodes qui vont guider le néovaisseau ou l’axone vers une cible distante dans
l’organisme.
Uninjected
Netrin-1
Figure 3. La nétrine-1 promeut la rétraction des ἀlopodes et inhibe la croissance des vaisseaux exprimant UNC5B [12, 13].
31
Anne Eichmann
se lie en effet à deux types de récepteurs différents, les récepteurs DCC, qui sont de
type attractif, et les récepteurs UNC5, qui sont de type répulsif.
Au niveau du système vasculaire, nous avons montré que le récepteur UNC5B est
exprimé par les cellules endothéliales. Des embryons knockout qui ont une délétion
du récepteur UNC5B présentent une arborisation accrue du réseau vasculaire, ce qui
est compatible avec le caractère répulsif ou inhibiteur de ce récepteur [12]. Lorsque
les tip-cells endothéliales d’embryon normal sont traitées par le ligand du récepteur,
la nétrine, l’extension des ἀlopodes est inhibée. En revanche, lorsque l’UNC5B est
délété, le capillaire n’est plus repoussé ni même attiré par la nétrine. Par conséquent,
la nétrine, qui est une molécule de guidage axonal, et son récepteur UNC5B interviennent dans la morphogenèse du système vasculaire. L’UNC5B agit en tant que
récepteur répulsif au niveau du réseau vasculaire et empêche la formation d’un excès
de bourgeonnements angiogéniques et de branchements. La littérature scientiἀque
fait par ailleurs état d’actions de type attractif pour la nétrine. Ce ligand serait donc
bifonctionnel au niveau du système vasculaire, tout comme il l’est au niveau du
système nerveux.
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1
32
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33
Angiogenèse post-ischémique : aspects
expérimentaux, perspectives thérapeutiques
Bernard Lévy, Jean-Sébastien Silvestre
Les organismes unicellulaires et ceux dont la taille ne dépasse pas les capacités de
diffusion des gaz et des substances solubles n’ont pas de système cardio-vasculaire.
La vie cellulaire est alors uniquement dépendante des concentrations de gaz et de
solutés dans le liquide environnant la cellule ou le micro-organisme. L’embryon du
mammifère ne se compose, au tout début de son évolution, que d’un amas de cellules
avasculaires. Cependant, le développement d’un réseau vasculaire capable de transporter Ḁuides et gaz nécessaires à la vie cellulaire apparaît rapidement pendant la
croissance de l’embryon. On appelle « vasculogenèse » les événements embryologiques initiaux commençant par la migration de précurseurs endothéliaux (angioblastes)
qui se différencient et forment, localement, des tubules de cellules endothéliales qui
se réunissent eux-mêmes en plexus vasculaires peu ou pas organisés. La croissance,
la différenciation et l’organisation de ces plexus en réseaux vasculaires fonctionnels
constituent l’« angiogenèse ». Ce processus est caractérisé par le bourgeonnement
de cellules endothéliales à partir des extrémités et des parois latérales des vaisseaux
préexistants. On observe également une division longitudinale de vaisseaux formant
deux tubes parallèles qui évoluent ensuite indépendamment. Ces étapes initiales de
vasculogenèse puis d’angiogenèse aboutissent à la formation d’un réseau essentiellement de type capillaire. Ce n’est qu’ensuite que les éléments de plus gros calibre
(artérioles, veinules, et anastomoses artérioveineuses) sont constitués par l’apparition de cellules musculaires lisses (myogenèse) puis de la matrice extracellulaire
qui consolide les structures vasculaires. On observe en même temps l’apparition de
péricytes autour des capillaires. Les artères de résistance puis de conductance sont
formées en dernier lieu par le développement de la média puis de l’adventice. Les
propriétés contractiles des cellules musculaires vasculaires apparaissent en dernier
lieu, l’ensemble de ces événements étant regroupé sous le terme d’artériogenèse.
Ces processus complexes nécessitent une coordination et des régulations précises
de multiples facteurs activateurs et inhibiteurs qui interagissent avec de nombreux
types cellulaires, vasculaires et extravasculaires. Ces mécanismes de régulation sont
probablement très différents d’un organe à l’autre et constituent des réseaux qui sont
eux-mêmes très différenciés. Il y a, par exemple, de nombreuses distinctions anato34
miques, histologiques et fonctionnelles entre les réseaux vasculaires hépatiques,
cutanés et cérébraux.
Nous nous limiterons, dans ce chapitre, à présenter les éléments fondamentaux de
la néogenèse vasculaire déclenchée par un contexte pathologique tel que l’ischémie
tissulaire.
Prin cipaux mé can ismes de
post -is chém iq ue
la néo vas cu laris at ion
L’importance relative des différents processus, vasculogenèse, angiogenèse et artériogenèse, dans le déclenchement de la néovascularisation associée à l’ischémie reste
à déἀnir [1]. Néanmoins, les trois processus agissent sans doute de concert pour
établir un réseau vasculaire fonctionnel. Ainsi, il est probable que l’artériogenèse
permet une augmentation importante du Ḁux dans la zone lésée mais que le développement de nouveaux capillaires (angiogenèse) évite une destruction tissulaire
massive du territoire ischémié. Enἀn, même si les stimuli initiaux diffèrent probablement, vasculogenèse, angiogenèse et artériogenèse partagent les mêmes facteurs de
croissance, chimiokines et protéases, qui peuvent activer et moduler différemment
ces trois mécanismes.
Angiogenèse post-ischémique
Le principal inducteur de l’angiogenèse est l’hypoxie qui implique notamment une
activation d’HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1).
HIF et VEG F-A
L’HIF-1 est un facteur de transcription nucléaire qui se lie à des éléments de réponse à
l’hypoxie situés dans la région régulatrice de nombreux gènes. L’injection intramusculaire d’un plasmide codant pour HIF-1α réduit la taille de l’infarctus et augmente
la néovascularisation du myocarde ischémique [2]. L’administration d’HIF-1α accroît
également le Ḁux sanguin régional, le score angiographique et la densité capillaire
dans un modèle d’ischémie du membre inférieur chez le lapin [3]. L’HIF-1 régule
notamment l’expression du gène codant pour le VEGF-A [4] qui, une fois sécrété,
va se lier à ses récepteurs à activité tyrosine kinase, VEGFR-1 et VEGFR-2, situés à
la surface des cellules endothéliales et musculaires lisses vasculaires. L’activation de
ses récepteurs déclenche de multiples voies de signalisation à l’origine de la stimulation de l’angiogenèse. Le VEGF-A peut activer la prolifération et la survie cellulaire
par des mécanismes dépendants de la phosphatidylinositol 3’-kinase/Akt [5-7]. Akt
pourrait contribuer à la réaction angiogénique en inhibant le processus apoptotique
ou en phosphorylant l’enzyme de synthèse du monoxyde d’azote (NOS) de type
endothélial (NOSe) à l’origine d’une activation soutenue, indépendante du calcium,
35
de l’enzyme. La NOSe joue également un rôle clé dans la néovascularisation postischémique. Les souris déἀcientes pour la NOSe présentent une altération de la
néogenèse vasculaire dans la zone ischémiée [8]. Le NO contribue également directement à l’effet du VEGF. Dans le modèle d’ischémie périphérique chez la souris,
la réponse angiogénique au VEGF requiert la présence de la NOSe [8]. De même,
dans le cœur infarci, l’induction de l’angiogenèse est dépendante de la production
de NO [9]. Finalement, l’administration par thérapie génique de la NOSe promeut la
néovascularisation dans la patte ischémique de rat, soulignant ainsi l’importance du
NO dans le processus de néogenèse vasculaire [10].
E spèces radicalaires de l’oxygène
Les espèces radicalaires de l’oxygène (RLO, radicaux libres de l’oxygène), dont
l’anion superoxyde, le peroxyde d’hydrogène, le radical hydroxyle et les dérivés
nitrés comme le NO et le peroxynitrite, sont des espèces biologiquement actives qui
stimulent de multiples voies de signalisation par leur potentiel d’oxydoréduction
[11-13]. Chacune de ces espèces provient de réactions chimiques ou enzymatiques
spéciἀques. Les NADPH oxydases représentent une source prédominante de RLO
dans le vaisseau [11, 12, 14]. Dans les cellules endothéliales, les NADPH oxydases
sont constituées de 2 sous-unités membranaires, gp91phox (ou Nox 2) et p22phox, et de
2 composants cytosoliques, p47phox et p67phox. La petite protéine G Rac-1 est également nécessaire pour une activité totale de l’enzyme. Rac-1 et gp91phox jouent un rôle
majeur dans l’effet du VEGF-A sur la prolifération des cellules endothéliales [15].
De même, des souris invalidées pour la gp91phox présentent une altération de la
néovascularisation post-ischémique soulignant également l’implication des RLO
dans l’effet pro-angiogénique du VEGF-A dans le territoire ischémié [16, 17].
Autres VEG F
L’expression d’autres membres de la famille des VEGF est également induite par
l’hypoxie. Par exemple, le PlGF (placenta growth factor), qui se lie au récepteur
VEGFR-1, active la néovascularisation dans le tissue ischémique [18]. L’expression
du VEGF-B est également augmentée dans la zone ischémiée et un traitement par
un plasmide codant pour l’une des deux isoformes du VEGF-B, le VEGF-B167
ou le VEGF-B186, déclenche une revascularisation thérapeutique chez des souris
avec une ischémie du membre inférieur [19]. Dans un modèle d’explants aortiques,
les explants provenant de souris surexprimant le VEGF-B167 ou le VEGF-B186
dans les cellules endothéliales se développent fortement, suggérant un rôle direct
du VEGF-B dans le processus angiogénique [20]. Le VEGF-C (ou VEGF-2) a été
décrit comme un ligand spéciἀque pour les récepteurs endothéliaux de type tyrosine kinase, VEGFR-2 et VEGFR-3. In vitro, le VEGF-C a un effet mitogénique et
chimiotactique dose dépendant sur les cellules endothéliales, plus particulièrement
36
sur les cellules endothéliales microvasculaires. Le VEGF-C stimule la libération de
NO par les cellules endothéliales et augmente la perméabilité vasculaire. Enἀn, l’expression constitutive de VEGF-C chez l’animal adulte facilite l’angiogenèse dans un
modèle d’ischémie périphérique [21].
Protéines « angiomatrices »
De nombreux autres facteurs (facteurs de croissance, facteurs de transcription,
hormones, protéines kinases) ont le potentiel de moduler l’angiogenèse. De plus,
le nombre de facteurs affectant la néogenèse vasculaire augmente de jour en jour ;
certains d’entre eux présentent pourtant un intérêt particulier. Ainsi, plusieurs
protéines de la matrice extracellulaire sont associées à l’endothélium vasculaire et
activent l’angiogenèse par un mécanisme dépendant des intégrines mais en l’absence d’addition exogène de facteurs de croissance. Parmi ces protéines « angiomatrices », il a été démontré que la protéine Del-1 (developmental endothelial
locus-1) active l’angiogenèse et la néovascularisation post-ischémique en se ἀxant
à l’intégrine αvβ5 sur l’endothélium quiescent, et par ce biais, augmente l’expression du facteur de transcription Hox D3 et l’intégrine αvβ3 [22, 23]. De même,
l’analogue de Del-1, la lactadhérine, est exprimé dans les cellules vasculaires et, en
interagissant avec l’intégrine αvβ3, module la voie de signalisation dépendante de
VEGF/VEGFR-2. Enἀn, la lactadhérine interagit avec les intégrines αvβ3 et αvβ5,
et, par un mécanisme dépendant d’Akt, est capable d’activer le développement de
nouveaux vaisseaux dans un contexte ischémique en l’absence d’addition exogène
de VEGF-A [24].
Artériogenèse post-ischémique
L’artériogenèse représente la croissance des artères collatérales à partir des anastomoses artério-artériolaires préexistantes. Certains groupes ont assimilé l’artériogenèse postnatale dans le contexte ischémique au développement de vaisseaux
collatéraux (ou collatéralisation) et les deux termes peuvent être utilisés indifféremment. L’artériogenèse est induite par un mécanisme indépendant de l’hypoxie qui
semble reposer sur les modiἀcations des forces hémodynamiques qui apparaissent
dans les vaisseaux collatéraux consécutivement à une augmentation du Ḁux. Cette
augmentation du débit vasculaire provient de la différence de pression entre les
artérioles préexistantes connectées en amont du point d’occlusion et celles en aval.
L’artériogenèse se traduit par une activation et une migration des cellules pariétales
et un remodelage de la paroi vasculaire.
Rôle des forces de cisaillement
L’augmentation chronique des forces de cisaillement dépasse les restrictions anatomiques des vaisseaux collatéraux et restaure complètement la conductance des colla37
térales. Les forces de cisaillement activent les voies de signalisation dépendantes
de Ras-ERK, Rho et du NO [25, 26]. La réponse primaire physiologique aux forces
de cisaillement est une activation des cellules endothéliales et un grand nombre de
gènes sont connus pour être contrôlés par des éléments de réponse aux forces de
cisaillement localisés dans leur promoteur [27]. Parmi ceux-ci, les forces de cisaillement augmentent l’expression des gènes codant pour des cytokines activatrices ou
chimioattractantes. Le MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) est augmenté
au niveau des sites artériogéniques et la collatéralisation est accrue par un traitement
avec du MCP-1 [28]. De même, l’atrophie musculaire est aggravée dans le membre
inférieur ischémié de souris invalidées pour le récepteur CCR-2 de MCP-1. L’analyse
morphométrique montre également une réduction du diamètre des vaisseaux collatéraux dans ces conditions [29]. De plus, l’ischémie induite par une ligature de l’artère
fémorale augmente le nombre de cellules inἀltrées exprimant le récepteur CXCR-3
et le niveau d’expression de ses ligands CXCL-9 et 10. Enἀn, le score angiographique et la perfusion tissulaire sont diminués dans le membre inférieur ischémique de
souris invalidées pour CXCR-3 [30].
Rôle des cellules inἀammatoires
L’augmentation de l’expression des cytokines chimioattractantes active l’inἀltration
des cellules inḀammatoires dans le territoire ischémié.
Ainsi, la migration des macrophages est sous le contrôle de la ἀxation de MCP-1
sur son récepteur CCR-2. Le niveau de monocytes est directement corrélé avec l’intensité de la néovascularisation [31]. CXCL-9 et CXCL-10, de par leur interaction
avec leur récepteur CXCR-3, attirent les lymphocytes T qui modulent également
la néogenèse vasculaire post-ischémique. Des souris nude déἀcientes en lymphocytes T ou des souris déἀcientes en lymphocytes CD4+ présentent une altération
de la néovascularisation post-ischémique [32, 33]. De plus, l’absence de lymphocyte CD8 diminue l’expression de l’interleukine 16 (IL-16) et réduit le recrutement
des lymphocytes T CD4+ au niveau des zones d’artériogenèse. L’administration
exogène de lymphocyte T CD8 restaure un taux d’IL-16 important, un nombre
adéquat de lymphocytes T CD4+ et, de fait, active le développement de vaisseaux
collatéraux [34]. On peut donc proposer le schéma suivant : en réponse à une occlusion vasculaire, les lymphocytes T CD8 s’inἀltrent au niveau des zones d’artériogenèse et recrutent les lymphocytes T CD4 par la production d’IL-16. Les lymphocytes T CD4 contrôlent alors le développement de vaisseaux collatéraux en partie en
activant le recrutement de macrophages qui libèrent des facteurs artériogéniques. En
effet, la présence des cellules inḀammatoires est associée à la libération locale de
nombreuses molécules pro-artériogéniques comme des cytokines, l’interleukine 2 et
le TNF-α (tumor necrosis factor alpha), des facteurs de croissance comme le VEGF
et des métalloprotéases (MMP) [28, 35].
38
Des cytokines comme l’interleukine 1β augmentent également l’activité d’HIF-1α,
dénotant ainsi un rôle transactivateur d’HIF-1α dans le processus inḀammatoire[36].
Au cours de la réaction inḀammatoire,des cytokines anti-inḀammatoiressont produites et modulent l’intensité de l’inḀammation. La néovascularisation est augmentée
dans le membre inférieur ischémié de souris déἀcientes pour la cytokine anti-inḀammatoire IL-10 [37]. Cet effet est bloqué par un traitement avec un inhibiteur des
métalloprotéases, malgré une activation persistante du VEGF-A [38]. L’inἀltration
des leucocytes dans le cœur infarci et la collatéralisation sont diminuées chez des
souris invalidées pour l’activateur du plasminogène de type urokinase ou pour la
métalloprotéase de type 9 [39]. De même, des souris déἀcientes en MMP-9 présentent une réduction de la collatéralisation dans un modèle d’ischémie du membre
inférieur, soulignant le lien étroit entre cellules inḀammatoires, métalloprotéases et
artériogenèse [40].
V asculogenèse post-ischémique
La néovascularisation post-ischémique ne dépend pas uniquement des processus
angiogénique et artériogénique mais implique également les progéniteurs circulants
de cellules vasculaires provenant de la moelle osseuse. En réponse à une ischémie
tissulaire, les précurseurs des cellules endothéliales sont mobilisés de la moelle
osseuse vers la circulation périphérique et migrent vers le tissu ischémique. Le recrutement des cellules progénitrices endothéliales (EPC, endothelial progenitor cells)
exprimant CXCR-4 est médié par l’hypoxie et le facteur de transcription HIF-1α qui
active l’expression de SDF-1 (stroma-derived factor 1) [41]. Les cellules mononucléées ou les EPC provenant d’animaux hétérozygotes pour CXCR-4 présentent une
diminution de l’expression de CXCR-4 et de leur capacité à stimuler la reperfusion
tissulaire chez des souris nude [42]. L’hypoxie locale libère également des facteurs
solubles chimioattractants pour les EPC circulantes. Un candidat potentiel est le
VEGF dont le niveau est accru par l’hypoxie et qui induit SDF-1 dans les structures vasculaires et périvasculaires [43]. Les chimiokines et les plaquettes permettent
également la capture des EPC au niveau des zones de lésions vasculaires [30, 44, 45].
Une fois qu’elles sont recrutées, l’arrêt des EPC sur l’endothélium activé par
l’ischémie découle de l’activité des molécules d’adhésion présentes à la surface des
cellules vasculaires comme l’intégrine β2 et la sélectine de type L [46-48]. Après
leur recrutement et leur adhésion au niveau de l’endothélium activé par l’ischémie,
les EPC exercent leurs effets bénéἀques sur la néogenèse vasculaire par des mécanismes différents (ἀg. 1).
Il a d’abord été suggéré que les progéniteurs s’incorporaient dans le site de néovascularisation où la différenciation en cellules endothéliales se terminait [49-51].
Cependant, la relative contribution des EPC à la vasculature est très variable et
semble dépendre du modèle expérimental, du type et du sous-type de progéniteurs ou
39
4
Lumière
vasculaire
Progéniteur
PSGL-1
2
β2
Potentiel paracrine
VEGF
MCP-1
HGF
PIGF
NO
CXCR4
Sélectine
3
Potentiel de
différenciation
SDF-1
ICAM-1
C.endothéliales
Membrane
basale
Molécules
chimiottractantes
Nécrose/Apoptose
1
Signal de homing
VEFG-A, PIGF
Ischémie
Figure 1. Après leur adhésion à l’endothélium activé, les cellules progénitrices vasculaires pourraient
déclencher la néogenèse vasculaire par deux mécanismes principaux : leur capacité à se différencier
en cellules endothéliales et leur potentiel paracrine de libération de facteurs pro-angiogéniques et proartériogéniques.
encore de la méthode d’isolement des EPC [52-55]. Certains travaux expérimentaux
suggèrent même que ces progéniteurs ne s’incorporent pas dans les néocapillaires
mais agissent en tant que cellules de soutien. Ainsi, les progéniteurs médullaires
s’accumulent autour des vaisseaux collatéraux et se différencient en ἀbroblastes,
leucocytes et péricytes qui produisent plusieurs facteurs de croissance et chimiokines [53]. La libération de SDF-1 par les plaquettes favorise la mobilisation et le
recrutement des progéniteurs CXCR-4+/VEGFR-1+ autour des structures vasculaires
qui dès lors promeuvent le développement de vaisseaux collatéraux [56]. De même, le
VEGF induit la nostocytose (homing) des cellules mononucléées myéloïdes et permet
leur positionnement périvasculaire et leur rétention par l’activation de SDF-1 [43].
Enἀn, les progéniteurs dérivés de sang de cordon humain peuvent se différencier
en progéniteurs endothéliaux précoces et tardifs. Les EPC précoces expriment des
marqueurs de la lignée monocytaire et présentent un fort potentiel paracrine de
libération de facteurs pro-angiogéniques alors que les EPC tardifs expriment des
marqueurs endothéliaux et possèdent de vraies capacités vasculogéniques [57].
40
Ainsi, le rôle premier des progéniteurs pourrait être de libérer des facteurs angiogéniques et artériogéniques et de contribuer à la genèse vasculaire par des effets paracrines. Enἀn, les cellules progénitrices possèdent également un potentiel vasoactif
susceptible de participer à l’amélioration de la perfusion tissulaire dans le territoire
ischémié [58].
Pe rspe ct ives t hé rapeut iq ues
Les trois principaux processus, vasculogenèse, angiogenèse et artériogenèse, caractérisent le remodelage tissulaire consécutif à des pathologies vasculaires ischémiques
chroniques ou aiguës. Ils constituent la cible des stratégies d’angiogenèse thérapeutique proposées pour élaborer un traitement alternatif chez des patients présentant
des artériopathies des membres inférieurs ou des maladies coronaires. De nombreuses stratégies d’angiogenèse thérapeutique fondées sur l’administration de facteurs
de croissance, de cellules souches, de molécules pharmacologiques ou de protéines de la matrice extracellulaire ont été proposées et présentent des potentialités
plus ou moins intéressantes. Cependant, celles actuellement testées dans des essais
cliniques sont fondées sur l’administration de facteurs de croissance ou de cellules
progénitrices.
Facteurs de croissance
Les essais cliniques sont essentiellement fondés sur l’administration de VEGF-A
et du facteur de croissance des ἀbroblastes 1 ou 2 (FGF, ἀbroblast growth factor).
L’échec des études VIVA, FIRST et TRAFFIC suggèrent que l’administration intravasculaire de protéines est insufἀsante pour induire une néovascularisation thérapeutique [59-61]. Cela est sans doute lié au mode d’administration (intraveineux ou intracoronaire) et au choix d’injecter des protéines dont la demi-vie tissulaire est courte.
Au contraire, les essais REVASC et Euroinject-1, fondés sur des stratégies de transfert de gènes codant pour différentes isoformes de VEGF-A directement dans la zone
ischémique, montrent des résultats intéressants sur la fonction cardiaque [62, 63].
Les essais précliniques ont prouvé l’efἀcacité de différents facteurs de croissance
pour stimuler la néogenèse vasculaire dans des modèles d’ischémie cardiaque ou du
membre inférieur mais en utilisant des animaux jeunes, sans facteurs de risque cardiovasculaire associés. L’induction d’une réponse pro-angiogénique similaire chez des
patients âgés, sans autres alternatives thérapeutiques avec des lésions athéromateuses marquées, constitue un déἀ thérapeutique clairement plus marqué. La sélection
des patients candidats à un stent ou à un pontage pourrait permettre d’augmenter
l’efἀcacité et la faisabilité des thérapies pro-angiogéniques et de considérer l’angiogenèse thérapeutique comme une thérapie complémentaire à la revascularisation
chirurgicale conventionnelle. De même, le choix des patients présentant des signes
41
d’angor ou de claudication pourrait signer la présence de tissus ischémiques mais
encore viables et donc potentiellement capables de répondre à la revascularisation
thérapeutique [64]. Enἀn, l’administration de plusieurs facteurs de croissance avec
des cibles cellulaires distinctes serait susceptible d’activer simultanément plusieurs
processus impliqués dans la néogenèse vasculaire. Ainsi, il a été démontré que la
co-administration de FGF et de PDGF-BB (platelet derived growth factor BB) ou de
VEGF-A et de PlGF était beaucoup plus efἀcace que l’injection d’un seul facteur de
croissance dans des modèles d’angiogenèse dans la cornée ou d’ischémie cardiaque
et périphérique [65, 66].
Cellules progénitrices
Même si de nombreux travaux expérimentaux suggèrent la présence de progéniteurs
vasculaires dans d’autres tissus comme le cœur, le tissu adipeux ou dans le sang,
l’administration de précurseurs d’origine médullaire constitue la base des thérapies
cellulaires pro-angiogéniques [67, 68]. Ainsi, l’injection de progéniteurs endothéliaux provenant de la moelle osseuse restaure le Ḁux cutané et la densité capillaire
dans des modèles expérimentaux d’ischémie cardiaque ou de membre inférieur chez
le rongeur [69, 70]. L’injection d’EPC humaines augmente également la formation de
nouveaux vaisseaux sanguins dans le territoire infarci [71]. Enἀn, des études récentes ont suggéré que les cellules mononucléées provenant de la moelle osseuse sans
différenciation ni puriἀcation en EPC étaient capables de favoriser le développement
vasculaire dans le territoire ischémié [71, 72]. L’administration de cellules mononucléées médullaires provenant d’animaux contrôles est également efἀcace dans des
modèles expérimentaux de diabète et d’hypercholestérolémie [73, 74]. Ces thérapies
cellulaires sont actuellement testées au niveau clinique dans de petites cohortes de
patients. Une implantation autologue de cellules mononucléées médullaires dans le
membre ischémié de patients souffrant d’une maladie artérielle périphérique ou de
thrombo-angiopathie oblitérante améliore la vascularisation et le processus cicatriciel [75, 76]. Cependant, un certain nombre de ces patients présentent des effets
secondaires ou transitoires [76]. De même, la transplantation intracoronaire de cellules mononucléées médullaires dans le myocarde de patients ayant une ischémie aiguë
augmente la perfusion et la fonction du tissu ischémié [77-79]. Dans ce contexte
également, certaines études montrent des effets transitoires, voire pas d’effets, soulignant ainsi la nécessité de poursuivre l’analyse de l’efἀcacité thérapeutique de ces
stratégies fondées sur l’administration de cellules souches [80, 81]. En particulier,
la plupart des facteurs de risque cardiovasculaires comme le diabète, l’hypertension
artérielle ou l’hypercholestérolémie réduisent le potentiel thérapeutique des cellules
progénitrices adultes, notamment d’origine médullaire [17, 73, 82]. Ainsi, il apparaît
crucial de mettre au point des stratégies restaurant la fonction des cellules progénitrices. Par exemple, un prétraitement des EPC par l’éphrine B2 aboutit à l’augmentation
42
de l’expression de PSGL-1, un ligand des sélectines, et ainsi à une amélioration de la
capacité des EPC à migrer vers le territoire ischémique et à activer le développement
vasculaire dans un modèle d’ischémie du membre inférieur chez la souris [83]. De
même, une bithérapie fondée sur l’administration conjointe de deux types de cellules progénitrices, les EPC et les cellules progénitrices musculaires lisses (SMPC,
smooth muscle progenitor cells), présente une meilleure efἀcacité thérapeutique que
chacun des types cellulaires injecté séparément. Les SMPC libèrent en effet de l’angiopoïétine-1 qui va se ἀxer sur son récepteur Tie-2 localisé à la surface des EPC et
améliorer leur survie et leur propension à former des structures vasculaires [84].
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47
T hérapie génique et cellulaire
dans l’artériopathie des membres inférieurs
Joseph Emmerich
L’ischémie critique des membres inférieurs (ICMI), qui est la forme la plus sévère
de l’artériopathie oblitérante des membres inférieures (AOMI), se manifeste par des
douleurs au repos résistantes aux antalgiques et évoluant depuis plus de 15 jours
ou par des troubles trophiques. La viabilité du membre est toujours menacée et le
pronostic général des patients est également compromis avec une mortalité autour de
50 % à 5 ans [1, 2]. La Transatlantic Inter-Society Consensus (TASC), qui a récemment déἀni l’ICMI, souligne que « la notion d’ICMI implique la notion de chronicité
et doit être distinguée de l’ischémie aiguë des membres » [3, 4]. L’évaluation hémodynamique par la mesure de l’indice de pression systolique (IPS) est fondamentale
pour quantiἀer de façon objective la perfusion des membres inférieurs. Il est recommandé d’utiliser la mesure de la pression absolue à la cheville qui, pour déἀnir une
ICMI, doit être inférieure à 70 mmHg et/ou une pression du gros orteil inférieure à
30 mmHg et/ou une pression d’oxygène transcutanée (TcPO2) comprise entre 30 et
50 mmHg. Dans ces conditions, le sauvetage chirurgical ou endoluminal du membre
s’impose mais il n’est pas toujours réalisable, faute d’axe receveur utilisable ou au
décours d’interventions chirurgicales multiples. L’ICMI est souvent associée à des
occlusions diffuses du lit artériel avec absence de vascularisation distale. Dans cette
dernière situation, qui représente de 20 à 30 % des cas, le traitement médical reste la
seule ressource thérapeutique avant l’amputation [5]. Le consensus de la TASC estime
que de 10 à 30 % des patients avec ICMI seront décédés dans les 6 mois et que de 25
à 35 % devront subir une amputation majeure [6]. La mortalité péri-opératoire d’une
amputation est de 5 à 10 % pour les amputations de la jambe et de 15 à 20 % pour les
amputations au-dessus du genou. Cette situation, assez fréquente, constitue un échec
thérapeutique car aucun autre traitement n’a fait la preuve de son efἀcacité.
Les traitements comme la stimulation cordonale postérieure ou l’implantation d’un
stimulateur sous-cutané ne sont plus actuellement recommandés par le consensus de
la TASC dans le traitement de l’ICMI. Ce consensus considère également qu’il n’y a
pas sufἀsamment de preuves en faveur de la sympathectomie lombaire [3].
La prostacycline et ses dérivés ont été utilisés initialement par perfusion intraartérielle puis intraveineuse dans plusieurs essais thérapeutiques. L’étude randomi48
sée la plus importante avec un dérivé de la prostacycline, l’étude ICAI, a conduit à
proposer un traitement par perfusion de dérivés de la prostacycline chez les patients
avec ICMI et un membre viable chez lesquels une revascularisation est impossible,
particulièrement quand l’alternative est une amputation [6]. Malheureusement, si
une efἀcacité transitoire apparaît au bout de 1 mois elle ne persiste plus au bout de
6 mois.
En prenant en compte les données précédentes sur le traitement médical de l’ICMI
sans possibilité de revascularisation, on peut raisonnablement énoncer qu’aucune
des possibilités thérapeutiques actuelles ne permet d’améliorer les patients et d’assurer le sauvetage de leur jambe en ischémie critique, lorsque les possibilités de
revascularisation ne sont pas possibles [7].
T HÉ RAPIE GÉN IQUE
L’angiogenèse thérapeutique ou la possibilité pour le patient de développer un réseau
vasculaire suppléant est une solution possible, actuellement évaluée pour éviter
l’amputation en cas d’ischémie critique chronique. L’angiogenèse physiologique
est induite par des facteurs de croissance tels que le VEGF (vascular endothelium
growth factor) ou le FGF (ἀbroblast growth factor). L’administration de ces facteurs
sous forme de protéines recombinantes est difἀcile. En effet, en raison de leur demivie très courte, ils doivent être utilisés à fortes doses et leur efἀcacité est alors limitée
par une mauvaise tolérance et un risque d’effets secondaires systémiques. La thérapie génique permet l’introduction et le transfert de gènes codant pour les facteurs de
croissance angiogéniques dans les cellules musculaires d’un patient atteint d’AOMI.
Les cellules transfectées vont alors produire de faibles taux de ces protéines angiogéniques, mais de façon soutenue et pendant une période variant de 1 à 2 semaines.
Deux types de vecteurs sont utilisés en clinique : les vecteurs viraux (adénovirus)
et les vecteurs non viraux (utilisation de plasmides nus ou de plasmides encapsulés
dans des liposomes).
À la suite des travaux d’Élisabeth Nabel qui ont démontré la faisabilité de la thérapie génique à visée vasculaire au début des années 1980, la thérapie génique s’est
développée depuis 1996 en utilisant plusieurs approches différentes [8]. Les recherches ont mis en évidence des facteurs de croissance vasculaire comme le VEGF qui
ont été utilisés dans des essais de phase I pour promouvoir une angiogenèse en cas
d’ischémie critique des membres inférieurs [9, 10]. Ces essais ont utilisé la thérapie génique à l’aide d’adénovirus ou de plasmides nus codant pour le VEGF ou le
FGF-1.
L’approche intra-artérielle a été initialement utilisée mais la dilution systémique des
produits de thérapie génique et la présence d’une athérosclérose diffuse en a limité
l’efἀcacité. Pour cette raison, l’injection intramusculaire est actuellement préférée. Il
a été démontré que l’injection intramusculaire d’un plasmide nu est réalisable et que
49
Joseph Emmerich
celui-ci restait sous forme non réplicative et ne s’intégrait pas au génome, limitant le
risque de mutagènes [11].
Les résultats décrits montrent une efἀcacité clinique qui est difἀcile à apprécier du fait de l’absence d’essais randomisés en aveugle disponibles à ce jour. Le
consensus de la Transatlantic Conference on clinical trial guidelines in peripheral
arterial disease recommande que les événements à analyser dans des essais randomisés soient la disparition complète de la douleur sans antalgiques, la cicatrisation
complète et la fréquence des amputations [12].
Jusqu’ici, aucune étude publiée ne répond à ces critères et si une augmentation
de la collatéralité semble obtenue, cela ne signiἀe pas qu’elle soit sufἀsante pour
l’obtention d’une guérison de l’ICMI. De plus, l’arrêt prématuré de l’expression de
facteurs de croissance pourrait conduire à une régression de la néovascularisation
initialement obtenue [13]. Les résultats des principaux essais de thérapie génique
dans l’ischémie critique sont résumés dans le tableau 1. Au total, un peu plus de
300 patients ont été inclus dans des essais de phase I et II. Aucun effet délétère grave
n’a été rapporté à ce jour sur des suivis cliniques qui restent cependant faibles.
T ableau 1. Revue des essais de thérapie génique dans l’ischémie critique des membres inférieurs.
Auteur
(année)
T raitement
N ombre de patients
S uivi
Résultats
Traités
Témoins
Plasmide VEGF165
intra-artériel
(hydrogel de
polymères)
1
–
12 semaines Augmentation
des collatérales
(angiographie)
Œdème transitoire.
Baumgartner Plasmide VEGF165
(1998)
intramusculaire
9
–
6 mois
Augmentation
des collatérales
(angiographie) et de
l’IPS.
Isner
(1998)
Plasmide phVEGF165
6
–
?
Augmentation
des collatérales
(angiographie),
amélioration de l’IPS.
Makinen
(2002)
Adénovirus VEGF
intra-artériel
Plasmide/liposome
VEGF intra-artériel
(en association avec
angioplastie)
18
19
2 ans
17
19
Adénovirus VEGF intraartériel.
Augmentation
des collatérales
(angiographie), pas de
différence de l’IPS.
Pas de différence
dans les événements
cliniques.
Isner
(1996)
(à suivre)
50
(suite)
Auteur
(année)
T raitement
Comerota
(2002)
Shyu
(2003)
N ombre de patients
S uivi
Résultats
Traités
Témoins
Plasmide FGF-1
intramusculaire
51
–
6 mois
Réduction des ulcères,
augmentation de l’IPS
et de la TcPO2.
Adénovirus VEGF165
intramusculaire
24
–
6 mois
Augmentation
des collatérales
(angiographie) et de
l’IPS.
Réduction des douleurs
de repos et cicatrisation
des ulcères.
Rajagopalan Adénovirus VEGF121
(2003)
intramusculaire
33
72
6 mois
Patients sans ICMI
mais avec claudication
intermittente.
Pas d’amélioration de la
distance de marche ou
de l’IPS.
Shyu
(2003)
Plasmide VEGF165
intramusculaire, 2
séries d’injection à 1
mois d’intervalle
21
–
6 mois
Amélioration des
douleurs et de l’IPS.
Cicatrisation des ulcères
et augmentation des
collatérales (angio IRM).
Motyas
(2005)
Adénovirus 5FGF-4
intramusculaire
10
3
12 semaines Augmentation
des collatérales
(angiographie).
Impossible de donner
de conclusion sur
l’efἀcacité car étude
de petit taille et dosage
trop bas.
Kusumanto
(2006)
VEGF165
intramusculaire
27
27
100 jours
Pas de réduction
signiἀcative de la
fréquence d’amputation,
mais amélioration de
la douleur, du soin des
ulcères.
Marui
(2007)
bFGF (biodegradable
gelatin hydrogel)
7
–
4-24
semaines
Amélioration du
périmètre de marche,
de l’IPS à 4 pas à 24
semaines.
34
7
12 mois
Faisabilité du traitement,
pas de corrélation entre
IPS et pronostic.
Rajagopalan Adénovirus HIF-1α
(2007)
intramusculaire
IPS : indice de pression systolique ; TcPO2 : pression transcutanée d’oxygène.
51
Joseph Emmerich
La seule étude randomisée est l’étude TALISMAN qui est en cours de publication [14]. Elle a comparé l’injection de NV1FGF en 4 séances thérapeutiques à
15 jours d’intervalle à une injection de placebo chez des sujets ayant une ICMI associée à des ulcères ou une gangrène. Le résultat est positif avec une réduction du
risque d’amputation chez les patients ayant reçu la thérapie génique. Cent vingtcinq patients ont été randomisés pour recevoir soit 4 mg de plasmides codant pour
du FGF-1 pendant 4 semaines, injections espacées de 2 semaines, soit un placebo
(sérum salé). L’injection de plasmide codant pour le FGF-1 a réduit de 50 % le risque
d’amputation et de 37 % le risque d’amputation majeure. Ce bénéἀce s’est associé
à une tendance à une diminution de la mortalité. Ces résultats intéressants devraient
être conἀrmés par une nouvelle étude en cours de réalisation, l’étude TAMARIS,
compte tenu du fait que les événements qui sont sortis positivement dans l’étude
TALISMAN étaient déἀnis comme secondaires dans le schéma de l’étude.
T HÉ RAPIE CE LLU LAIRE
La découverte en 1997, par Asahara, des précurseurs circulants des cellules endothéliales chez l’homme adulte a révolutionné le concept d’angiogenèse postnatale [15].
De nombreux travaux ont conἀrmé l’existence de ces précurseurs, leur origine médullaire et leur aptitude à s’intégrer dans des structures vasculaires dans deux types de
modèles : l’angiogenèse tumorale et la revascularisation d’un tissu ischémique. Les
cellules souches endothéliales adultes sont une source potentielle pour la régénération de l’endothélium dans le système cardiovasculaire et seraient un produit idéal de
thérapie cellulaire autologue. On parle dans ce cas de vasculogenèse.
Des nombreux essais sur des modèles précliniques d’ischémie ont utilisé la thérapie
cellulaire pour induire une angiogenèse thérapeutique par intégration à un nouveau
réseau vasculaire et/ou par sécrétion de facteurs de croissance [16]. La thérapie cellulaire présente plusieurs avantages par rapport à la thérapie génique décrite précédemment. Tout d’abord, elle a recours à l’utilisation de cellules autologues, prévenant
ainsi tout risque de rejet. Elle prévient également le risque théorique de pathologies
induites par la thérapie génique, liées soit directement à l’action du facteur de croissance codé par le plasmide injecté, soit à une insertion du plasmide, malgré toutes
les précautions prises. Les cellules utilisées ont une origine médullaire et correspondent à des « cellules souches » dont les conditions de différenciation sont encore
mal connues. Deux types de cellules ont été utilisés dans des essais précliniques :
les cellules endothéliales circulantes (PEC, progéniteurs endothéliaux circulants)
dites précoces, ou encore appelées CFU-Hill, d’origine monocytaire (CD14+), et les
PEC dites tardives ou « outgrowth endothelial cells » (CD14–) [17]. Si ces cellules peuvent induire une angiogenèse in vivo sur des modèles animaux, seules les
cellules mononucléées de la moelle osseuse (BMMNC, bone marrow mononuclear
cells) ou les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMNC, peripheral blood
52
mononuclear cells), après stimulation par le G-CSF (granulocyte colony-stimulating
factor), ont été utilisées chez l’homme dans des essais cliniques de phase I et II.
Après des travaux encourageants chez l’animal, la première étude a été réalisée chez
l’homme en 2002 par injection intramusculaire de cellules mononucléées médullaires autologues chez des patients en ischémie critique chronique des membres inférieurs [18]. Un premier groupe de 25 patients avec ischémie unilatérale avait reçu
des cellules médullaires dans le membre malade et du sérum physiologique dans le
membre inférieur controlatéral. Les résultats étant très positifs, un second groupe
de 22 patients avec ischémie bilatérale a été randomisé entre cellules médullaires et
cellules mononucléées d’origine sanguine, ces dernières servant de témoin. Au bout
de 24 semaines, une amélioration signiἀcative de tous les paramètres cliniques a été
notée chez les patients traités par cellules médullaires et une néoangiogenèse a été
objectivée sur les artériographies des membres inférieurs. La tolérance a été parfaite.
Depuis, d’autres séries utilisant ce même procédé ont été publiées avec des résultats
similaires. Ces études sont résumées dans le tableau 2. À l’heure actuelle, plus de
600 thérapies cellulaires ont été effectuées chez l’homme, plus de la moitié des cas
étant rapportés dans des publications provenant d’Asie. Actuellement en France, 3
essais ouverts sont en cours dans cette indication à partir de cellules autologues
mononucléées médullaires (Amiens, Nantes, Reims, Grenoble, Paris-Hôpital européen Georges-Pompidou, Marseille). Un essai national randomisé en double aveugle
(étude BALI) a débuté aἀn de démontrer si cette approche thérapeutique est réellement efἀcace sur les événements cliniques majeurs : amputations et mortalité.
Huang et al. [19] ont publié une autre approche qui repose sur l’utilisation de
PBMNC après leur mobilisation par l’injection sous-cutanée de 600 µg/j de G-CSF
pendant 5 jours. Au cinquième jour de stimulation, environ 300 ml de PBMNC ont
été recueillis et concentrés, puis injectés dans la jambe ischémique dans 40 sites pour
un total de 3 × 109 PBMNC. Les auteurs ont randomisé 28 patients avec un diabète
et ICMI pour recevoir des PBMNC ou un traitement conventionnel avec suivi de
3 mois. Les principaux symptômes (douleurs et ulcères) ont été signiἀcativement
améliorés chez les 14 patients traités. Aucune amputation n’a dû être effectuée dans
le groupe traité contre 5 chez les témoins (p = 0,007). Cette étude suggère que la
transplantation autologue de PBMNC, après stimulation par le G-CSF, pourrait aussi
être une procédure sûre et efἀcace de l’ICMI. Elle a l’avantage de ne pas nécessiter
d’anesthésie générale ni de ponction de moelle osseuse.
Dans une étude anatomopathologique à partir des patients traites par thérapie
cellulaire dans notre centre, nous avons récemment démontré in vivo chez l’homme
le développement d’une néovascularisation importante par cette approche thérapeutique. L’analyse immunohistochimique des échantillons d’amputation des patients
ayant reçu une thérapie cellulaire est comparée avec celle des témoins, amputés
pendant la même période et appariés selon l’âge et le sexe. Chez 3 patients, on a
53
Joseph Emmerich
T ableau 2. Revue des essais de thérapie cellulaire dans l’ischémie critique des membres inférieurs.
Auteur
(année)
T raitement
(nombre
de cellules)
Injection
N ombre
de patients
S uivi
Résultats
TateishiYuyama
(2003)
BMMNC
IM, mollet
(0,7-2,9 × 109) 40 × 0,75 ml
45
24 semaines Augmentation des
collatérales (angiographie),
de l’IPS et de la TcPO2.
Higashi
(2004)
BMMNC
(1,6 ±
0,3 × 109)
IM, mollet
40 × 0,75 ml
7
24 semaines Augmentation des
collatérales (angiographie),
de l’IPS et de la TcPO2 et
vasomotricité.
Huang
(2004)
PBMNC
(3 × 109)
IM, cuisse,
5
mollet et pied
Saigawa
(2004)
BMMNC
IM
(6,04 ±
7
1,58 × 10 /kg)
8
4 semaines
Corrélation entre
amélioration de l’IPS et le
nombre de cellules CD34+
dans le produit de thérapie
cellulaire.
Huang
(2005)
PBMNC
(3 × 109)
IM, mollet
40 × 0,75 ml
14 traités,
14 témoins
(essai
randomisé)
3 mois
Augmentation de l’IPS et
de la perfusion.
78 % de cicatrisation dans
le groupe actif contre 39 %.
Yang
(2005)
PBMNC
IM pied et
mollet
62
6 mois
Amélioration des douleurs
dans 87 % des cas.
Cicatrisation des ulcères.
TcPO2 et IPS améliorés.
Kim
(2006)
BMMNC
stimulées
6 injections
intraosseuses
tibiales
27
20 mois
Amélioration modérée des
douleurs.
Cicatrisation de 13/17
ulcères.
Collatérales augmentées.
Gu
(2006)
BMMNC
stimulées
IM, intraartérielle ou
les deux
35
5 mois
Amélioration des douleurs
dans 90 % des cas.
Cicatrisation de 10 % des
ulcères.
Amélioration IPS, TcPO2.
Durdu
(2006)
BMMNC
IM pied,
28
mollet, avantbras
20 mois
Cicatrisation dans 83 %
des cas.
Amélioration douleurs.
Collatérales visibles sur
artériographie.
Miyamoto BMMNC
(2006)
(3,5 × 109)
IM mollet,
pied
8
12 mois
1 décès inexpliqué, 4 issues
défavorables.
Saito
(2007)
IM
14
24 semaines Réduction de la douleur
au repos, amélioration des
ulcères.
BMMNC
12 semaines Augmentation de l’IPS
et de la perfusion (laserDoppler).
BMMNC : cellules mononucléées médullaires ; PBMNC : cellules mononucléées du sang périphérique
après stimulation par du G-CSF ; IM : intramusculaire ; IPS : indice de pression systolique.
54
observé une angiogenèse active au niveau de la partie distale de la jambe ischémique
mais pas dans le muscle de la jambe. Tous les nouveaux vaisseaux sont positifs aux
marqueurs endothéliaux (CD31, CD34, facteur de von Willebrand) et négatifs aux
marqueurs lymphatiques (podoplanin). Les marquages immunohistochimiques pour
Ki 67 et c-kit ont montré une prolifération endothéliale élevée dans les vaisseaux
néoformés [20].
M ALAD IE DE BUE RGE R
La thérapie cellulaire ainsi que la thérapie génique ont aussi été utilisées chez les
sujets présentant la maladie de Buerger. Cette dernière est une inḀammation occlusive et segmentaire des artères et des veines, caractérisée par une thrombose et une
recanalisation des vaisseaux atteints. Cette maladie inḀammatoirenon athéromateuse
touche les artères de petit et moyen calibres ; le diagnostic est posé en s’appuyant
sur des critères cliniques, ceux publiés par Olin en 2000 [21] : un âge inférieur à
45 ans, une consommation présente ou passé de tabac, la présence d’ischémie aux
extrémités distales (membres inférieurs et/ou supérieurs). Chez les patients avec une
maladie de Buerger, il est difἀcile d’obtenir une revascularisation chirurgicale car
l’atteinte est toujours très distale. Ainsi, en dehors de l’arrêt du tabac, les thérapies
dont nous disposons à ce jour sont peu efἀcaces et ne garantissent pas une réponse
prolongée ou une guérison complète.
Isner et al. [22] ont conduit une étude clinique de phase I pour démontrer l’efἀcacité et la tolérance de l’injection intramusculaire de VEGF165 chez 6 patients avec
une maladie de Buerger. Les résultats ont montré que si la thérapie est mise en place
avant le développement d’une gangrène, alors les patients peuvent obtenir une cicatrisation complète des ulcères et éviter l’amputation. Toutefois, cette étude n’avait
pas de groupe témoin.
La thérapie cellulaire a été réalisée au cours d’une étude pilote chez 8 patients avec
maladie de Buerger, diagnostiqués selon les critères d’Olin [23]. Le traitement a eu
recours à des cellules mononucléées prélevées à partir de la moelle osseuse avec un
suivi de 4 ans : les résultats ont montré une amélioration prolongée des symptômes
d’ischémie.
Cependant, l’intérêt principal de cet essai est d’avoir mis en évidence la possibilité
de développement de réseaux vasculaires secondaires dans cette population particulière de malades. En effet, un patient est décédé 20 mois après l’administration de
la thérapie ; il n’avait pas de facteurs de risque cardiovasculaires et avait arrêté de
fumer avant d’être inclus dans l’essai. On ne peut donc exclure que ce décès soit lié
à la thérapie cellulaire pratiquée, la mortalité coronaire étant rare dans la maladie de
Buerger des sujets jeunes.
Ainsi, l’injection de BMMNC chez des souris invalidées pour le gène de l’apolipoprotéine E peut faciliter le développement des lésions d’athérosclérose, l’angioge55
Joseph Emmerich
nèse étant nécessaire au développement de la plaque intimale [24]. D’autres études
seront nécessaires pour évaluer l’innocuité du traitement chez ce type de patients.
Con clus ion
À ce jour, aucune des études publiées sur la thérapie génique ou cellulaire ne permet
de conclure de façon déἀnitive sur l’efἀcacité et la tolérance de cette thérapeutique
innovante. La réponse à cette question nécessitera la réalisation d’études de plus
grande envergure, randomisées et prenant comme événement primaire la diminution
de la fréquence des amputations majeures.
Si ces approches concernant de nouvelles possibilités thérapeutiques de l’AOMI
ouvrent des perspectives passionnantes, elles soulèvent également de nombreuses
questions.
Quelles cellules doit-on utiliser ? Plusieurs autres travaux s’intéressent aux cellules
mésenchymateuses, adipocytaires et aux cellules souches embryonnaires.
Quel doit être le rythme des injections ? Par quelle voie ?
Faut-il combiner la thérapie génique à la thérapie cellulaire (transfection des cellules utilisées par un gène d’intérêt) ?
L’innocuité est-elle vraiment garantie sur le court terme mais aussi sur le long
terme avec le risque théorique de stimuler le développement de cancers latents ou
d’aggraver l’athérosclérose ?
Par ailleurs, l’ischémie critique avec troubles trophiques étant le stade ultime de
l’AOMI, qui est grevée d’une morbi-mortalité élevée, on peut se demander s’il s’agit
du meilleur moyen de valider ces thérapies visant à stimuler l’angiogenèse. Peut-être
serait-il plus pertinent de s’intéresser aux patients ayant seulement des douleurs de
repos ou de combiner la thérapie génique ou cellulaire à la réalisation de pontages
distaux ou d’angioplasties chez des sujets ayant un meilleur pronostic. Une autre
approche plus récente concerne la réalisation de vaisseaux artiἀciels. Cette approche
innovante représente également une voie de recherche pour les patients opérables
mais n’ayant plus de matériel autologue pour que ce geste soit réalisé ce geste [25].
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58
Philippe Menasché
Les possibilités de greffes de cellules dans le cœur suscitent de grands espoirs. Visant
à redonner une fonctionnalité à des territoires myocardiques devenus akinétiques à la
suite d’un infarctus, la thérapie cellulaire en cardiologie est déjà une réalité clinique
attestée par le grand nombre d’essais cliniques actuellement en cours.
Th é rapie ce llu laire de l’in farctus du my
o carde
La dilatation excessive du ventricule gauche après un infarctus est l’un des plus puissants facteurs prédictifs du risque de décès [1]. L’un des objectifs majeurs des thérapies cellulaires est donc de parvenir à une réduction du remodelage du ventricule
gauche, plus efἀcace que les traitements actuels de l’infarctus comme la revascularisation au stade aigu par angioplastie, la thrombolyse, les stents… Les performances
de ces traitements étant particulièrement élevées, le déἀ est à l’évidence ambitieux.
É valuation de la thérapie cellulaire
La procédure de thérapie cellulaire est aujourd’hui parfaitement standardisée.
Un cathéter est introduit dans l’artère qui a été reperméabilisée quelques heures
ou quelques jours plus tôt et des cellules mononucléées de la moelle osseuse du
patient y sont injectées. Le choix de ces cellules est déterminé par leur disponibilité immédiate et par leur petite taille qui garantit la sécurité de l’injection intracoronaire [2].
L’intervention a été récemment évaluée par une méta-analyse portant sur 13 essais
contrôlés incluant 811 patients. La fraction d’éjection ventriculaire gauche était
améliorée de façon statistiquement signiἀcative de 3 % (p = 0,0007). S’il est modeste,
le bénéἀce de la thérapie cellulaire n’est donc pas nul. En revanche, aucun effet notable sur le remodelage ventriculaire n’a été observé [3].
Certains en ont conclu que la thérapie cellulaire est et restera inefἀcace. En réalité,
ces résultats apparemment négatifs sont extraordinairement positifs par la masse
d’informations qu’ils nous ont apportée. Ils ont en particulier permis d’identiἀer les
facteurs responsables de ces mauvais résultats. Il est dès lors possible de commencer
à travailler de façon plus pertinente.
59
Philippe Menasché
Facteurs d’échec ou de réussite liés à la procédure d’administration
Quels sont les facteurs qui peuvent expliquer les bénéἀces limités de la thérapie
cellulaire ? Certains d’entre eux tiennent à la procédure utilisée. Par exemple, il a été
montré que le minutage (timing) de l’administration des cellules entre en ligne de
compte. L’adressage (homing) des cellules varie beaucoup selon que l’injection a été
effectuée 1 heure ou 24 heures après l’épisode aigu de l’infarctus. Des études cliniques tentent actuellement de préciser le moment optimal d’administration et cette
question devrait donc être clariἀée. La dose de cellules administrées est sans doute
également un élément de réussite signiἀcatif. La méta-analyse montre ainsi que la
fraction d’éjection ventriculaire est d’autant plus améliorée que le nombre de cellules injectées est élevé. Il existe donc un effet dose et la posologie peut certainement
être optimisée (ἀg. 1) [3].
Fonctionnalité cellulaire altérée
L’altération de la fonctionnalité cellulaire est probablement un écueil beaucoup plus
ardu. Il a été montré, sur un modèle animal de patte ischémique, que l’administration de
cellules de moelle osseuse prélevées sur un sujet sain améliore l’ischémie alors que des
cellules provenant d’un sujet avec cardiopathie ischémique sont sans effet. Nous sommes
dans une situation similaire lorsque nous tentons d’améliorer des coronariens par l’injection de cellules de moelle non fonctionnelles en raison de leur maladie coronaire.
Étude
ou sous-catégorie
n
CSMO
Moyenne (ET)
01 < 10(7) cellules
22
Meluzin LD (2006)
3,00 (4,69)
Sous-total (IC à 95 %)
22
Test d'hétérogénéité : non applicable,
Test d'effet global : Z = 0,71 (p = 0,48)
Meluzin HD (2006)
02 < 10(8) cellules
Ge (2006)
10
58,60 (9,90)
Lunde (2006)
1,20 (7,50)
44
5,00 (4,69)
Meluzin HD (2006)
22
35
Li (2007)
57,10 (7,80)
14
Penicka (2007)
45,00 (9,00)
125
Test d'hétérogénéité : x2 = 15,69. df = 4 (p = 0,003). I 2 = 74,5 %
107
108
03 < 10(9) cellules
7,00 (6,20)
20
Huang (2006)
Janssens (2004)
3,40 (6,90)
30
Kang (2006)
25
5,10 (9,10)
Schachinger (2006)
95
5,50 (7,30)
Suarez de Lezo (2007)
10
20,00 (8,00)
180
Test d'hétérogénéité : x2 = 9,51 df = 4 (p = 0,05) I 2 = 57,9 %
109
1010
04 < 10(10) cellules
Meyer (2006)
30
30
Test d'hétérogénéité : non applicable
Test d'effet global : Z = –3,16 (p = 0,002)
6,70 (6,50)
Total (IC à 95 %)
357
Test d'hétérogénéité : x2 = 31,46. df = 11 (p = 0,0009). p = 65,0 %
Test d'effet global : Z = –3,00 (p = 0,002)
n
22
22
Sans CSMO
Moyenne (ET)
Poids
%
EMP
IC à 95 %
EMP
IC à 95 %
1,00 (–1,77, 3,77)
1,00 (–1,77, 3,77)
2,00 (4,69)
10,50
10,50
10
44
22
35
10
121
53,30 (3,50)
4,30 (7,10)
2,00 (4,69)
52,60 (5,70)
47,00 (7,00)
4,83
9,95
10,50
9,66
4,93
39,86
5,30
–3,10
3,00
4,50
–2,00
1,51
(–1,21, 11,81)
(–6,15, –0,05)
(0,23, 5,77)
(1,30, 7,70)
(–8,41, 4,41)
(–1,96, 4,98)
20
30
25
92
10
177
4,50 (3,99)
2,20 (7,30)
–0,20 (8,60)
3,00 (6,50)
6,00 (10,00)
9,60
8,92
6,75
12,03
3,65
40,95
2,50
1,20
5,30
2,50
14,00
3,60
(–0,73, 5,73)
(–2,39, 4,79)
(0,39, 10,21)
(0,52, 4,48)
(6,06, 21,94)
(1,04, 6,16)
30
30
0,70 (8,10)
350
–10
–5
En faveur d'un traitement sans CSMO
0
5
8,69
8,69
6,00 (2,28, 9,72)
6,00 (2,28, 9,72)
100,00
2,74 (0,98, 4,50)
10
En faveur d'un traitement par CSMO
CSMO : cellules souches provenant de la moelle osseuse ; EMP : écart moyen pondéré.
Figure 1. Amélioration de la fraction d’éjection ventriculaire gauche en fonction de la quantité de
cellules administrées. (Reproduit avec autorisation de Martin-Rendon, et al. [3]).
60
Il serait possible de tester les cellules avant injection, mais la procédure serait alors
trop longue, lourde et coûteuse pour pouvoir être utilisée en routine. Une deuxième
stratégie serait de disposer de stocks de cellules, nécessairement allogéniques mais
préalablement testées et fonctionnelles. Nous disposerions alors d’un produit prêt à
l’emploi se rapprochant d’un médicament classique. Le problème du rejet subsiste,
mais il pourrait être contourné par l’emploi de cellules souches mésenchymateuses
(CSM) si le « privilège immunologique » qui leur est attribué est conἀrmé.
Q uel mode d’administration des cellules ?
Comment administrer les CSM allogéniques ? La voie intraveineuse est a priori la
plus séduisante : l’accès est simple, dénué de risque, mais les cellules sont captées
par la moelle, la rate et le poumon avant de parvenir au cœur. Le cathétérisme endoventriculaire gauche serait à cet égard plus efἀcace, mais son utilisation quelques
heures après un infarctus du myocarde peut comporter des risques. Reste la voie
intracoronaire : des études récentes chez l’animal menées en vue d’évaluer l’impact
de la dose administrée et du traitement antithrombotique associé ont montré que des
CSM du tissu adipeux ou de la moelle administrées par injection intracoronaire ont
bien un effet thérapeutique sur la fonction cardiaque. Ces études ont en outre levé
certaines craintes quant au risque d’occlusion des capillaires par les CSM dont la
taille est deux fois plus importante que celle des cellules mononucléées [4-6].
Si ces résultats sont conἀrmés et validés, nous aurons fait un grand pas sur la voie
de la mise au point d’un produit de thérapie cellulaire fonctionnellement efἀcace,
pouvant être aisément conservé et utilisable en urgence.
L’adressage des cellules injectées reste très insufḀsant
Après injection par voie intracoronaire, environ 3 % seulement des cellules administrées sont retrouvées dans le cœur. Différentes techniques ont été élaborées pour
tenter d’améliorer cet adressage insufἀsant. Certaines de ces approches sont fondées
sur la biologie comme la manipulation des tissus hôtes en vue de provoquer l’ampliἀcation des signaux d’adressage. Des améliorations techniques simples sont
également imaginées, comme un cathéter qui, au lieu de libérer les cellules dans la
lumière du vaisseau, les distribue autour, ce qui semble un moyen efἀcace d’améliorer le nombre de cellules qui vont véritablement pénétrer dans le parenchyme
myocardique.
U ne amélioration trop modeste de la fraction d’éjection ventriculaire
La méta-analyse des essais randomisés évaluant le bénéἀce de l’administration de
cellules de moelle osseuse dans les suites d’infarctus du myocarde a montré qu’elle
ne procurait qu’une amélioration très modeste de la fraction d’éjection ventriculaire.
Ce résultat a été interprété par certains comme la preuve déἀnitive de l’échec de
61
Philippe Menasché
cette technique. Il serait utile à ce propos de se souvenir que les études évaluant des
médicaments comme les bêtabloquants ou les inhibiteurs de l’enzyme de conversion (IEC) ont eu des résultats comparables alors que personne ne conteste plus que
ces produits sauvent des vies. Ainsi, en 2004, l’étude CAPRICORN (Carvedilol
post-infarct survival control in left ventricular dysfunction) évaluant les effets d’un
bêtabloquant, le carvedilol, sur le remodelage ventriculaire gauche après un infarctus
du myocarde aigu avait conclu à une amélioration de 4 % seulement de la fraction
d’éjection ventriculaire gauche [7]. En 2007, une méta-analyse des effets des IEC a
également abouti à des résultats du même ordre de grandeur [8].
Il est donc encore tout à fait prématuré d’afἀrmer que la thérapie cellulaire en
pathologie cardiaque n’a pas d’avenir.
Th é rapie ce llu laire de l’insu ffis an ce card iaq ue
Avec 5 millions de malades, l’insufἀsance cardiaque est la première cause d’hospitalisation aux États-Unis. En France, on dénombre chaque année 150 000 nouveaux
cas dont 10 000 formes graves, la prise en charge de la maladie comptant pour 3 %
du budget de la santé. Malgré les nombreux progrès thérapeutiques, les décès d’origine cardiovasculaire restent fréquents chez ces patients. La thérapie cellulaire de
l’insufἀsance cardiaque vise à régénérer les cicatrices post-infarctus akinétiques.
Trois essais contrôlés randomisés ont été menés en vue d’évaluer l’intérêt de l’administration de myoblastes squelettiques dans cette indication. Les cellules étaient
injectées via un cathéter endoventriculaire dans deux études. Les résultats ont été
positifs pour l’une et négatifs pour l’autre. Dans la troisième étude, la transplantation cellulaire chirurgicale effectuée en complément d’un pontage coronaire n’a
pas davantage réussi à atteindre son objectif principal. Cet essai – intitulé MAGIC
(myoblast autologous grafting in ischemic cardiomyopathy) – a été mené sur des
effectifs de patients relativement importants (120 malades randomisés dans 5 pays).
Il a été lancé en vue d’étudier l’effet de l’injection de myoblastes dans les cicatrices
d’infarctus sur la fonction cardiaque. Celle-ci a été effectivement améliorée chez les
patients traités mais pas davantage que dans le groupe placebo.
Il faut toutefois relever que le groupe traité avec la plus forte dose de myoblastes
a présenté une diminution signiἀcative des volumes télédiastolique et télésystolique
du ventricule gauche (p < 0,05). La thérapie cellulaire a donc eu un effet sur le remodelage ventriculaire, mais celui-ci est resté trop faible pour permettre l’amélioration
de la fonction cardiaque (ἀg. 2) [9].
Les essais menés avec des cellules de moelle osseuse n’ont pas donné de meilleurs
résultats qu’avec les myoblastes. Le proἀl de sécurité de la thérapie cellulaire cardiaque paraît satisfaisant hormis quelques inquiétudes quant à une augmentation possible du risque d’arythmies ventriculaires dont l’interprétation reste complexe en raison
de la multiplicité des facteurs en cause. Tous les malades de l’essai MAGIC ont été
62
20
VTD correlée à la (ml/m2) :
modifications à 6 mois de l'inclusion
*p < 0,05
10
0
n = 25
–12,6 (–19,4 ; 0)
n = 29
5,9 (–11,8 ; 15,2)
n = 27
– 3,9 (–17,0 ; 12,6)
-10
NS
-20
Dose élevée
Faible dose
Placebo
VTD : volume télédiastolique ; SC : surface corporelle.
Les données sont exprimées sous forme de médianes et d’intervalles interquartiles.
Figure 2. Évolution des volumes télédiastoliques ventriculaires gauches. (Reproduit avec autorisation
de Menasché, et al. [9]).
implantés avec un déἀbrillateur. Il a donc été possible d’effectuer une surveillance
objective des arythmies ventriculaires laquelle n’a pas fait apparaître de différence
signiἀcative entre les groupes traités et le groupe placebo.
D omaines d’amélioration : les cellules
Deux voies d’amélioration sont possibles, la première pouvant être qualiἀée de
conservatrice et la seconde d’agressive. L’option conservatrice admet l’impossibilité
de régénérer les lésions d’infarctus pour exploiter au mieux les effets paracrines des
cellules greffées en sélectionnant les plus efἀcaces. Ces effets paracrines potentiels
sont la stimulation de l’angiogenèse, un effet anti-apoptose, un remodelage de la
matrice extracellulaire conduisant à une augmentation de l’élasticité des tissus cicatriciels et à une réduction de la ἀbrose, et un sauvetage des cardiomyocytes dont les
dégâts sont réversibles.
Quelles sont les populations de cellules admissibles ? Les fractions CD34+ et
CD133+ des cellules souches hématopoïétiques ou les cellules souches mésenchymateuses sont dotées d’un effet paracrine. Une étude récente a ainsi montré que le
milieu sécrété par ces cellules sufἀsait pour diminuer l’apoptose ainsi que la taille de
63
Philippe Menasché
l’infarctus et améliorer la fonction ventriculaire gauche. C’est probablement cet effet
paracrine qui explique le bénéἀce obtenu par la thérapie cellulaire sur le remodelage
ventriculaire dans l’étude MAGIC.
La deuxième option, dite agressive, garde l’ambition de générer de nouveaux
cardiomyocytes à partir de cellules souches. Les plus attractives parmi les cellules candidates seraient les cellules souches cardiaques, mais elles ne semblent être
présentes que chez les nourrissons, durant les premiers mois de la vie. Les cellules
souches embryonnaires, pluripotentes, semblent en revanche être des candidates de
choix. Dans notre groupe, l’équipe de Michel Pucéat a élaboré un procédé de préorientation de ces cellules vers un phénotype cardiaque, puis de sélection des seuls
progéniteurs cardiaques. Des essais menés dans un modèle animal d’infarctus ont
ensuite montré que ces cellules deviennent des cardiomyocytes fonctionnels. Les
cellules souches induites pluripotentes, ou iPS, sont les derniers progéniteurs potentiels [10].
Leur principal avantage est qu’elles proviennent du malade lui-même, mais il
faut garder à l’esprit que l’utilisation de produits autologues pose en réalité de réels
problèmes logistiques, notamment lorsque l’objectif est de pouvoir traiter un grand
nombre de patients.
Amélioration du transfert et de la pérennité des cellules
Le transfert par injection à l’aide d’une seringue est associé à la perte de 80 % des
cellules administrées. L’utilisation de systèmes d’injection contrôlés par ordinateur améliorant la précision des cibles pourrait permettre des progrès substantiels.
L’incorporation de cellules dans un biomatériau favoriserait également une meilleure
rétention. Dans notre expérience, des techniques alternatives, faisant appel à des
patchs en collagène cellularisé ou à des feuilles de cellules restant jointives entre
elles grâce à la matrice extracellulaire, se sont avérées plus efἀcaces que l’injection
conventionnelle.
Par ailleurs, les populations de cellules administrées subissent une mortalité considérable dans les jours suivant l’injection [11, 12]. Les raisons de cette mort cellulaire
sont à présent mieux connues. Elles sont dues à l’inḀammation, à l’ischémie et à
l’apoptose provoquée par le détachement de la matrice extracellulaire, et ces constatations fournissent autant de voies de recherche pour tenter d’optimiser la survie du
greffon cellulaire.
Con clus ion
Le choix des cellules devrait être déterminé par l’indication clinique. Les différents
types de cellules, qu’elles soient adultes ou embryonnaires, sont efἀcaces dans
certains cas et le sont moins dans d’autres. Il faut donc partir des malades et des
maladies pour effectuer le choix le plus adapté.
64
L’amélioration des techniques de transfert/survie est aussi importante que l’identiἀcation de la « meilleure » cellule. Cela n’a en effet aucun sens d’avoir une cellule,
aussi efἀcace soit-elle, si l’on reste incapable de la placer là où on le souhaite et de
l’y maintenir en vie. Cette survie implique que les cellules soient apportées avec leur
support vasculaire et leur matrice extracellulaire.
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1
65
S ur la symbolique de l’angiogenèse
et de l’anti-angiogenèse
Janine Chanteur
En marge des recherches scientiἀques qui ont permis de connaître l’angiogenèse et
l’anti-angiogenèse et de tenter d’en acquérir la maîtrise, nous allons nous pencher
quelques instants sur la symbolique que l’on peut dégager de ces processus. Cette
réḀexion va nous conduire à condamner deux erreurs qui menacent le travail des
chercheurs car elles imprègnent l’état d’esprit contemporain.
Il s’agit, d’une part, du respect inconditionnel de la nature sacralisée et, d’autre
part, de l’alignement absurde de l’animal sur l’homme. Ces convictions et la propagande outrée qui en font la promotion sont redoutables : elles tentent d’arrêter les
recherches en cours, en se servant de justiἀcations morales fallacieuses, pseudophilosophiques ou prétendues scientiἀques. Le recours à la réalité de l’angiogenèse
et de l’anti-angiogenèse montre combien les afἀrmations passionnelles ne reposent
ni sur la raison ni, d’ailleurs, sur le sentiment ; elles mobilisent au contraire l’arbitraire et la sensiblerie.
L’ang iogenèse et
la s acralis at ion de
la n atu re
On sait que l’angiogenèse, phénomène « naturel », assure la croissance de l’embryon et le développement normal de l’individu jusqu’à l’âge adulte. Elle intervient
aussi, entre autres, dans la cicatrisation des blessures, phénomène également « naturel ». Ainsi, sa fonction est-elle indispensable et ne pose pas problème quand elle se
déroule normalement. Dans cette perspective, elle participe à l’aspect, que certains
ont dit « lumineux », de la nature au service de l’harmonie de la vie.
À l’opposé, l’angiogenèse, quand elle se développe de façon anarchique mais tout
aussi « naturelle », produit encore de la vie, mais une vie dont on peut dire qu’elle
progresse « contre la vie ». En assurant la multiplication des cellules cancéreuses,
elle leur permet de dévorer les cellules saines et de se répandre dans l’organisme
grâce aux vaisseaux sanguins qu’elle fabrique ou qu’elle détourne à leur proἀt. Ce
phénomène est également naturel mais, en tant que tel, il est mortel si l’on n’intervient pas. La voracité des cellules cancéreuses est comparable à l’attitude des vainqueurs qui tuaient les vaincus en leur imposant une inanition totale.
66
Que penser alors de la « nature » qui témoigne à la fois d’un élan de vie dont on
s’émerveille à juste titre et qui est capable, dans le même élan, d’apporter la mort par
prolifération d’une vie envahissante et déréglée ? Ce phénomène « naturel » peut non
seulement causer la mort de ce dont il se nourrit mais encore se suicider par la même
occasion. Il faut d’ailleurs souligner que le qualitatif « naturel » n’est pas synonyme
de « normal », bien qu’il arrive, à tort, de prendre l’un pour l’autre : « naturel »
exprime le fait brut tel qu’il se présente sans intervention humaine, « normal » est
un jugement qui a une connotation juridique ou scientiἀque, voire morale. Les deux
mots, d’ailleurs, n’ont pas du tout la même étymologie.
Faut-il donc continuer à fantasmer sur la perfection de ce qui est naturel, quelles
qu’en soient les manifestations, ou accepter de revenir à l’ambiguïté, voire l’ambivalence, de la nature, dont les hommes ne portent pas la responsabilité, bien qu’ils
puissent, par des conduites fâcheuses, accélérer et même provoquer des dégâts ?
L’écologie est une idée louable qu’il est important de respecter et de mettre en pratique, sauf lorsque, d’« idée », elle devient « idéologie » et que ses ardents défenseurs
ne s’aperçoivent pas qu’il ne s’agit plus d’écologie bienfaisante mais d’un véritable
jeu avec la mort. Rappelons un jugement porté par Alfred de Vigny sur la nature, à
la fois trop sévère et cependant réaliste : dans son poème, La maison du berger, il
personniἀe la nature et la fait se déἀnir elle-même : « On me dit une mère et je suis
une tombe. » Elle est plutôt, comme l’angiogenèse et beaucoup d’autres phénomènes
« naturels », les deux à la fois…
S’il est indiscutablement nuisible et condamnable d’empoisonner l’air des villes,
la terre ou l’eau des océans, des Ḁeuves et des rivières avec certains produits toxiques, il l’est tout autant de faire de la nature une « idole », décidant de la vie ou de
la mort des hommes. L’essence de l’idole est de se nourrir de ceux qui l’encensent.
Mais le pire, c’est que l’idolâtre est souvent à lui-même sa propre idole : il est sûr
de connaître la vérité qu’il s’acharne à propager en cherchant à éliminer toutes les
objections. Rappelons-nous Greenpeace et ses émules qui ressusciteraient volontiers
l’obscurantisme. Mutatis mutandis, on peut dire d’un cancer qu’il a cet orgueil et
cette ténacité.
L’ang iogenèse et
la s acralis at ion des
an im aux
L’étude du phénomène de l’angiogenèse avait permis de décrypter un processus
contre lequel la thérapie dont on disposait alors n’était pas toujours sufἀsante. Après
avoir compris la façon dont la nature procédait pour développer les cellules cancéreuses, l’« idée » vient, dans les années 1970, d’empêcher ces dernières de se multiplier en les privant d’apport sanguin. La découverte des médicaments nécessaires à
l’anti-angiogenèse fut rendue possible par l’expérimentation sur l’animal, en l’occurrence sur des souris.
67
Janine Chanteur
Or, sans se préoccuper le moins du monde de la guérison de malades condamnés,
avant les succès de la recherche, des associations de défense des animaux crient
au massacre des souris ou d’autres animaux indispensables à la recherche, sous le
prétexte et sans doute, hélas, avec la conviction que l’animal a autant le droit de
vivre que l’homme. On sait que certaines thérapies (médicamenteuse ou autres)
ne peuvent être découvertes et mises au point sans la recherche sur l’animal et, en
conséquence, être utilisées légalement sur l’homme sans avoir été expérimentées
sur les animaux. Des mesures très strictes encadrent toute expérimentation de cette
nature et préviennent les abus. Cependant, les associations irréductibles ne se gênent
pas pour interrompre les expérimentations dans les laboratoires, en commettant des
délits graves et même des crimes contre la personne des chercheurs, pour défendre
les animaux. La zoolâtrie contemporaine constitue une nouvelle forme d’idolâtrie,
celle de l’animal, au détriment de l’homme.
L’affection pour l’animal, l’intérêt qu’on lui porte sont des attitudes normales
et même morales. En revanche, la préférence hystérique de l’animal par rapport à
l’homme relève de la pathologie. Ce n’est pas, d’ailleurs, parce que l’homme est
un « animal raisonnable », comme nous le déἀnissons depuis Aristote, qu’il faut le
préférer à l’animal mais bien parce qu’il est seul capable de distinguer entre le bien
et le mal et de reconnaître l’existence d’un « prochain » qu’il faut aider à guérir s’il
en a besoin. L’animal, même s’il a des germes de raison, ce que personne ne nie, ne
se fait jamais un « devoir » de lutter contre les atteintes biologiques de ses congénères ou de relever un ennemi blessé. Notons, de plus, que ces germes de raison ne lui
permettent ni d’inventer ni de progresser.
CON CLUS ION
En conclusion, il reste que sacriἀer l’être vivant et sensible qu’est l’animal est un
acte grave et difἀcile à admettre. Cependant, si l’homme est le vivant le plus accompli, en dépit de sa trop fréquente méchanceté il est également le seul à éprouver à
la fois l’obligation de dépasser ses limites, de reconnaître la précarité de ses succès
toujours provisoires et d’accepter la certitude de sa propre mort.
Et c’est bien cette « ἀnitude » de la condition humaine qui, en nous faisant un
devoir de soigner l’homme « avant » de considérer la vie de l’animal, nous empêche
de sortir tout à fait de la contradiction entre l’expérimentation sur l’animal et l’intérêt qu’on lui porte. C’est pourquoi il nous faut tout mettre en œuvre pour sauver
notre prochain, en faisant à l’animal aussi peu de mal qu’il est possible. C’est dire
que nous devons tendre au bien, de tout notre être, en sachant que nous ne pourrons
jamais y parvenir absolument. C’est donc avec courage et modestie, en dehors d’un
quelconque dogmatisme, qu’il faut agir en faveur des hommes, sans nous cacher la
contradiction qui subsiste entre soigner l’animal et se servir de lui. La perfection
morale est un « horizon » vers lequel nous devons tendre, sans jamais pouvoir l’at68
teindre – au moins en cette vie. Telle est la rudesse de la condition humaine, c’est sa
faiblesse, c’est sa misère, mais c’est aussi son indiscutable valeur.
Ces deux aberrations – sacralisation de la nature et sacralisation de l’animal – sont,
me semble-t-il, remarquablement dénoncées par la considération de l’angiogenèse,
phénomène naturel qui fait vivre mais peut tuer, et de l’anti-angiogenèse, qui est une
espérance magniἀque due au génie de l’homme pour sauver l’homme.
69
Hypoxie et progression tumorale :
nouvelles approches thérapeutiques
Jacques Pouysségur
Ang iopoïét ines et VEG F-A : deux acteu rs clés
de la néo vas cu laris at ion
Parmi le large éventail de facteurs angiogéniques, le VEGF-A et les angiopoïétines
représentent deux acteurs majeurs de la néovascularisation. Pour rappel, la signalisation du récepteur Tie-2 tyrosine kinase par l’angiopoïétine 1 stimule le recrutement des
péricytes. La voie Notch activée au sein des cellules endothéliales maintient cellesci en quiescence par le blocage de la voie cycline D-Cdk4. Lorsque la formation de
néovaisseaux est rendue nécessaire, par exemple lors d’une réparation tissulaire ou
du développement d’une tumeur, l’angiopoïétine 2, un antagoniste naturel de l’angiopoïétine 1, va « éteindre » la signalisation du récepteur Tie-2 en déplaçant l’angiopoïétine 1. Cette action va induire la déstructuration des capillaires en place permettant aux
cellules vasculaires endothéliales de devenir réactives au VEGF-A et, donc, d’assurer
les étapes de base : migration et division assurant la néovascularisation [1].
La baisse de tens ion d’o xygène (
hypo x ie) est
le s ign al
En effet, le couple angiopoïétine 2 et VEGF-A est induit par l’hypoxie et la néovascularisation se produit donc là où il y a déἀcit d’oxygène. Le régulateur clé de la
réponse cellulaire à l’hypoxie est le facteur HIF (hypoxia inducible factor), découvert il y a une quinzaine d’années par le groupe de Semenza [2]. L’application d’un
stress hypoxique à des cultures de cellules (de Caenorhabditis elegans à l’homme)
provoque l’induction rapide d’une sous-unité HIF-1α. Celle-ci migre dans le noyau
pour s’associer à son partenaire HIF-1β constituant le facteur de transcription HIF-1
assurant, par l’induction de gènes variés, la survie des cellules. Ce processus est
extrêmement rapide et peut être observé dans les 10 minutes qui suivent le stress
hypoxique. De la même façon, la levée de l’hypoxie arrête le processus par la disparition de la protéine HIF-1α qui possède une demi-vie inférieure à 5 minutes en
normoxie.
70
D es senseu
rs d’o xygène
cont ribuent à
et à l’in act ivat ion d’HIF-1 α
la dest ru ct ion
L’étude des mécanismes de régulation d’HIF-1α, notamment de la part du groupe
de P. Ratcliffe à Oxford, a révélé le rôle clé joué par un ensemble d’hydroxylases.
L’inactivation d’HIF-1α implique 3 enzymes HIF prolyl-hydrolase (PHD1, 2 et 3),
PHD2 étant l’enzyme responsable du faible niveau d’HIF-1α en normoxie. Ces PHD
sont de véritables senseurs d’oxygène, c’est-à-dire des enzymes capables de détecter et de lire la pression d’oxygène au sein d’une cellule, dans son noyau et dans
son cytoplasme. Ces enzymes ont 2 cofacteurs, l’oxygène et le 2-oxoglutarate. En
situation de normoxie, la PHD2 va hydroxyler 2 résidus proline situés au niveau du
domaine de transactivation N-TAD. Les résidus proline hydroxylés sont alors reconnus par la protéine pVHL (von Hippel-Lindau), sous-unité d’un complexe multiprotéique possédant une activité ubiquitine ligase, qui transfère plusieurs ubiquitines sur
son substrat. La chaîne de polyubiquitine est reconnue par le système catalytique du
protéasome qui dégrade alors rapidement HIF-1α.
Le Km pour l’oxygène de ces enzymes est assez élevé, donc toute baisse d’oxygène
à partir de 20 % se traduit par une baisse de l’activité des PHD induisant une stabilisation concomitante d’HIF-1α. L’HIF-1α est stabilisé et la protéine peut donc induire
les gènes qui vont participer au programme génétique d’adaptation à l’hypoxie.
En outre, la fraction de l’HIF-1α qui pourrait échapper au protéasome est inhibée
par un autre senseur d’oxygène, l’HIF asparaginyl-hydroxylase (FIH), qui hydroxyle
l’asparagine située au niveau du domaine de transactivation C-TAD, empêche ainsi
la ἀxation d’un coactivateur général de transcription (p300) et interdit l’induction
des gènes qui en dépendent.
L’activité de l’HIF-1α est ainsi régulée par 2 senseurs de l’oxygène cellulaire, PHD
et FIH, qui sont dépendants non seulement de la pO2 cellulaire mais également des
niveaux de 2-oxoglutarate.
La bifon ct ion alité d’HIF-1 α con fè re une p lus g rande
soup lesse d’ adapt at ion face à l’hypo x ie
Nous nous sommes interrogés sur la signiἀcation physiologique de la présence de
2 domaines de transactivation sur HIF-1α et nous avons pu montrer que N-TAD et
C-TAD induisent des groupes de gènes différents. Cette observation ne relève pas de
la seule curiosité académique ; elle présente un réel intérêt physiologique. Les cellules
situées à proximité d’un capillaire sont, dans des conditions de pression d’oxygène
élevée, les 2 senseurs d’oxygène, PHD2 et FIH sont l’un et l’autre actifs et HIF-1α est
donc dégradé et/ou inhibé. Le gradient d’oxygène intracellulaire s’abaissant à mesure
que l’on considère des populations de cellules plus éloignées du capillaire, PHD2 et
FIH tendent à être inactivées et HIF-1α à être stabilisé. Cependant, la PHD2 est la
première des deux hydrolases à être inactivée lorsque la baisse de la pO2 intracellu71
Jacques Pouysségur
laire reste modérée. Seul le domaine de transactivation C-TAD reste bloqué par une
activité FIH très afἀne pour l’oxygène. Dans ces conditions, seuls les gènes induits par
le C-TAD s’exprimeront, par exemple le gène dit proapoptotique BNIP-3. Lorsque la
cellule se trouve dans un état plus hypoxique, les domaines N-TAD et C-TAD sont tous
deux « libérés » et l’ensemble du répertoire des gènes contrôlés par HIF-1 sera induit.
Nous sommes donc en présence de 2 senseurs d’oxygène dotés d’afἀnités différentes pour l’oxygène, qui agissent sur 2 domaines de transactivation distincts et apportant des réponses différenciées à des conditions d’oxygénation différentes (ἀg. 1).
Sur le plan physiologique, ce double mode de contrôle confère à la cellule une plus
grande souplesse d’adaptation aux valeurs de la pO2 cellulaire [3, 4].
dégradation
inactivation
protéasome
Senseurs
d'oxygène
Figure 1. Senseurs d’oxygène et régulation de HIF-1α.
HIF-1, un facteu r de la su rv ie ce llu laire
L’inactivation de la PHD2 induite par la baisse de la pO2 se traduit par l’induction
du gène bnip-3. La protéine BNIP-3 a d’abord été décrite comme induisant la mort
cellulaire. Sachant que le gène bnip-3 est induit dans des conditions de baisse modérée de la pression d’oxygène n’entraînant pas de mort cellulaire, il nous était difἀcile
d’adhérer pleinement à cette notion. Pourquoi HIF-1, qui est un facteur de survie,
induirait-il un gène de mort cellulaire ? En réalité, nous avons établi que les produits
des gènes bnip-3 et de leur cousin bnip-3L, tous deux induits par HIF-1 et exprimés
au niveau mitochondrial, induisent l’autophagie [5]. Lorsque les conditions nutritionnelles baissent, la cellule peut survivre en engageant un processus d’autolyse
contrôlé assurant des nutriments, en attendant que les conditions nutritives revien72
nent. Nous sommes donc ici en présence d’un processus de survie et, fait remarquable, la baisse de la pO2 qui constitue le signal de déclenchement de la néovascularisation va également déclencher le processus d’autophagie. La baisse de pression de
l’oxygène intracellulaire signale une diminution générale des apports en nutriments
à laquelle la cellule répond par l’induction d’un processus autophagique lui permettant de pallier, jusqu’à un certain point, une carence nutritionnelle (ἀg. 2).
Vaisseau
Figure 2. HIF-1 : une molécule de survie pour les cellules subissant un stress hypoxique. Tumeur d’un
adénocarcinome colique humain (LS174) implanté chez la souris Nude. On détecte ici l’anhydrase
carbonique CAIX, un marqueur induit par HIF (l’anticorps anti-CAIX apparaît en clair). Ce marquage
coïncide avec l’expression de HIF-1α. Il est d’autant plus détecté que l’on s’éloigne du vaisseau situé
au centre de la ἀgure.
HIF-1 est imp liq ué d ans la régu lat ion du pH
int race llu laire tumo ral
Depuis les travaux pionniers du siècle dernier par Otto Warburg, on sait que la majorité des cellules cancéreuses utilisent la glycolyse même en présence d’oxygène.
Il s’agit d’un processus de transformation du glucose en pyruvate, le sous-produit
ἀnal étant l’acide lactique. Ce système, qui ne produit que 2 molécules d’adénosine
triphosphate (ATP) par molécule de glucose, est peu efἀcace. De plus, l’accumulation d’acide lactique diminue localement le pH, ce qui peut se révéler toxique et
73
Jacques Pouysségur
impose la mise en œuvre de mécanismes de régulation du pH. On sait depuis peu
que l’expression d’HIF-1 est capitale dans ce « switch » métabolique et qu’HIF-1 est
directement impliqué dans la régulation du pH intracellulaire [3].
Bien que l’hypoxie soit le principal facteur d’induction d’HIF-1α, d’autres stimuli
sont capables d’augmenter le niveau de ce facteur de transcription dans certains
types cellulaires. Ainsi, même en présence d’oxygène, des conditions oncogéniques
comme une délétion de PTEN, une activation constitutive de la phospho-inositide
3 kinase (PI3K) activant la voie Akt se traduisent par l’augmentation de l’activité
HIF-1. De plus, des mutations du processus de déstabilisation d’HIF-1α ont été identiἀées dans plusieurs types de tumeurs humaines (vhl, sdh, idh1…), conduisant à
l’activation d’HIF en conditions de normoxie. HIF-1, par l’induction de la kinase
PDK1, supprime l’activité pyruvate déshydrogénase et, par l’induction de LDH-A,
va en quelque sorte « forcer » le métabolisme glycolytique, un processus générateur d’ATP nécessitant une consommation exagérée de glucose [7]. Ce métabolisme
aberrant est largement utilisé actuellement dans le diagnostic en FDG-PET (F-18
Ḁuorodeoxyglucose positron emission tomography) qui permet de visualiser l’accumulation de l’analogue non métabolisé du glucose. Au-delà, nous sommes convaincus qu’une meilleure connaissance de ce métabolisme aberrant du glucose conduira
à des exploitations en thérapeutique anticancéreuse (ἀg. 3).
Figure 3. Métabolisme aberrant du glucose des cellules cancéreuses. Accumulation de Ḁuoro-déoxyglucose dans un cancer du poumon métastasé visualisé par FDG-PET. (Reproduit avec l’aimable autorisation de Beer, et al. [6]).
74
Comment les ce llu les des m amm ifè res cont rô lent e lles le pH int race llu laire ?
Si la régulation du pH intracellulaire est bloquée, la glycolyse et sa production d’ATP
seront également stoppées par un rétrocontrôle. Si la cellule est strictement dépendante de la glycolyse pour sa fourniture énergétique, cette action provoquera une
mort par nécrose.
Quels sont les systèmes de régulation du pH intracellulaire identiἀés ? L’échangeur
sodium-protons est le régulateur de pH universel. Il utilise le gradient « entrant » de
sodium pour extraire les protons du milieu intracellulaire. Cet échangeur, activé à
pH acide, est une cible de tous les facteurs de croissance. Tous les mitogènes sont
capables d’augmenter l’afἀnité pour le site H+ régulateur permettant à la cellule en
prolifération d’imposer un pH intracellulaire plus alcalin. L’acide lactique, qui est
également un facteur d’acidiἀcation du milieu intracellulaire, est extrait de la cellule
par les cotransporteurs lactate-protons MCT1 et MCT4. Les anhydrases carboniques, surtout celles induites en condition hypoxique, comme on le verra plus loin,
sont également des enzymes pouvant jouer un rôle clé dans l’adaptation des cellules
à un micro-environnement acide.
Pour appréhender l’impact de l’acidose sur l’incidence tumorale, nous avons, à
partir de ἀbroblastes, isolé et étudié un ensemble de mutants affectés dans certaines
des étapes du métabolisme : des mutants déἀcients en phospho-glucose isomérase
(pgi–) et donc ne produisant plus d’acide lactique, des mutants déἀcients en respiration (res–) et donc totalement dépendants de la glycolyse et générant, de ce fait, beaucoup d’acide lactique, enἀn des mutants déἀcients en échangeur Na +/H+ (nhe1–).
Pour résumer, il apparaît clair que la perte de l’échangeur Na+/H+ (nhe1–) affecte
surtout la tumorigénicité des cellules produisant beaucoup d’acide lactique. Les cellules
pgi– forment des tumeurs normalement même en l’absence d’échangeur Na+/H+ (nhe1–).
Ce résultat très important apportait la « preuve de concept » validant les régulateurs de
pH des tumeurs à haute glycolyse comme cibles potentielles anticancers [3].
Cont rô le du pH int race llu laire : q ue lle t radu ct ion
clin iq ue ?
Les cellules tumorales en conditions hypoxiques sont condamnées à tirer leur énergie de la glycolyse et, en conséquence, produisent de grosses quantités d’acide lactique. Si la régulation du pH intracellulaire est inactivée, il se produit un effondrement
rapide du développement tumoral.
Cette observation peut-elle avoir une traduction clinique et nous offrir de nouvelles
thérapeutiques ?
À côté de l’échangeur Na+/H+ (nhe1–), l’anhydrase carbonique (carbonic anhydrase, CA) pourrait être l’une de ces nouvelles cibles. Nous connaissons environ
75
Jacques Pouysségur
1800
Volume tumoral (mm 3)
1600
1400
1200
1000
800
600
LS-shCA9
- DOX
LS-shCA9
+ DOX
LS-shCA9/CA12-
- DOX
LS-shCA9/CA12-
+ DOX
45 %
LS174
Adénocarcinome du côlon
85 %
400
200
0
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
Nombre de jours après l'injection de cellules
Figure 4. CAIX et CAXII sont des cibles potentielles pour des thérapeutiques anticancéreuses.
13 isoformes d’anhydrases carboniques, mais nous nous intéressons plus particulièrement aux anhydrases carboniques IX (CAIX) et XII (CAXII) qui sont fortement
induites par HIF-1 et que l’on retrouve dans la plupart des tumeurs d’origine épithéliale humaine.
Ces anhydrases carboniques sont localisées au niveau de la membrane plasmique.
Leur domaine catalytique, situé hors de la cellule, catalyse l’hydratation du CO2,
cette réaction aboutissant à la libération de bicarbonate et d’un proton (H2O + CO2 =
HCO3– + H+). Le bicarbonate est rapidement repris par la cellule tandis que le proton
reste dans le domaine extracellulaire. La présence de CAIX ou de CAXII va donc
contribuer à l’acidose que l’on retrouve dans la plupart des tumeurs solides, tandis
que la recapture du bicarbonate devrait permettre le maintien d’un pH intracellulaire
plus alcalin autorisant le fonctionnement de la glycolyse et de la synthèse protéique
dans un environnement acide très hostile (ἀg. 4).
La CAIX indu ite p ar l’hypo x ie p romeut
des ce llu les tumo rales
la su rv ie
Nous avons essayé de comprendre quel bénéἀce les cellules tumorales tirent de
l’expression de CAIX et si cette dernière peut constituer une cible thérapeutique.
En normoxie, ni HIF-1α ni CAIX ne sont exprimés, alors qu’ils le sont fortement
en conditions hypoxiques. Nous avons fait une expérience très simple. Nous avons
76
apporté du gaz carbonique à une suspension de ἀbroblastes et la mesure de pH extracellulaire a montré une acidiἀcation progressive du milieu de culture. La même
expérience menée avec les ἀbroblastes exprimant la CAIX a induit une acidiἀcation
très brutale, dans les 5 secondes suivant l’apport de CO2, du milieu de culture. De
manière plus intéressante, les cellules exprimant CAIX et incubées à des pH acide
(6,5-7,0) présentaient un pH intracellulaire de 0,4 à 0,2 unité pH plus alcalin que
celui des cellules contrôle. Une telle différence a des implications considérables sur
le taux de glycolyse et le métabolisme de l’ATP et nous avons montré in vitro que les
cellules sans CAIX perdent leur viabilité dans des conditions très acides qui reproduisent l’environnement acide des tumeurs.
L’expression de CAIX et de CAXII procure-t-elle un avantage aux cellules tumorales in vivo ? Dans un modèle murin de carcinome du côlon humain, nous avons
inactivé la CAIX au moyen d’une petite molécule, d’ARN interférence, dont l’expression peut être contrôlée par la doxycycline. La suppression de l’expression de
la CAIX par l’ajout de doxycycline dans l’eau de boisson entraînait une diminution
de 45 % du développement tumoral. Cette diminution restait donc modeste, mais il
est apparu que la réduction de l’expression de la CAIX entraînait une forte surexpression de l’anhydrase carbonique cousine, la CAXII. Nous avons créé des cellules dépourvues de CAXII mais conservant CAIX. Le développement tumoral de
ces cellules était comparable à celui de la lignée témoin. L’utilisation de la doxycycline, qui permet d’abolir l’expression de CAIX, a entraîné une réduction tumorale
de 85 %. Par conséquent, il apparaît bien que les anhydrases carboniques CAIX et
CAXII induites dans les zones hypoxiques de nombreuses tumeurs constituent des
cibles thérapeutiques pertinentes [8].
Les t ranspo rteu rs mono carbo xy liq ues,
cibles t hé rapeut iq ues po tent ie lles ?
Nous avons vu que les anhydrases carboniques ne sont pas les seuls agents impliqués
dans la régulation du pH intracellulaire. Ce processus met en jeu notamment les
transporteurs d’acide lactique MCT1 et MCT4. Les cellules ἀbroblastiques n’expriment que MCT1. Son inhibition, par un inhibiteur spéciἀque mis au point par
AstraZeneca, dans des cultures ἀbroblastiques placées en conditions hypoxiques
abolit leur viabilité et, in vivo, chez la souris nude, réduit d’un facteur 10 le volume
tumoral. Cependant, de nombreuses cellules cancéreuses, comme les cellules tumorales épithéliales, possèdent simultanément MCT1 et MCT4. Nous avons donc
mimé cette situation en introduisant dans les ἀbroblastes la forme MCT4 humaine.
Lorsque ces cellules sont placées en conditions hypoxiques, le blocage de MCT1 n’a
plus aucun effet sur la viabilité, démontrant le rôle déterminant de MCT4 dans le
fonctionnement de la glycolyse et donc de la survie des cellules. Il paraît donc que
le MCT4 constitue une cible potentielle pour de nouvelles thérapeutiques anticancé77
Jacques Pouysségur
reuses car ce transporteur est absolument indispensable au maintien de la glycolyse
dans un grand nombre de tumeurs sous hypoxie. L’approche future envisagée est une
double inactivation MCT1/MCT4 en ciblant la chaperonne commune à ces deux
transporteurs : la basigine ou CD147.
Con clus ion
Nous sommes convaincus qu’une stratégie visant le métabolisme glycolytique
exacerbé des tumeurs est une approche nouvelle offrant des potentiels thérapeutiques
peu explorés. Nous avons analysé ici le ciblage de la régulation du pH intracellulaire
des tumeurs. Nous avons vu que plusieurs systèmes de contrôle du pH sont utilisés
par les cellules. Leur contribution respective pour chaque type de tumeur devra être
analysée en étude préclinique chez la souris. Ces modèles permettront de proposer les meilleures associations possibles de drogues ciblant le pH intracellulaire de
manière à effondrer l’ATP intracellulaire dans des conditions ayant peu d’impact
sur les tissus sains. Le métabolisme cellulaire a eu ces lettres de noblesse au siècle
dernier ; nous entrons aujourd’hui dans une nouvelle phase où la physiologie cellulaire et la génétique moléculaire apportent une nouvelle lumière sur le métabolisme
des tumeurs. De nouvelles pistes thérapeutiques sont en pleine exploration.
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Olivier Rixe
Les anti-angiogéniques ont véritablement modiἀé le métier de cancérologue en le
rapprochant de celui des internistes et des spécialistes d’organes qui traitent des
pathologies du rein, de la peau, du vaisseau ou du tube digestif. Les effets secondaires des anti-VEGF, comme les toxicités hématologiques, dermatologiques ou rénales,
nous ont fait entrer dans une cancérologie transversale. Ils nous ont amenés à élargir
notre champ d’action et à faire en permanence de la médecine comparée, comme en
témoignent les communications de cet ouvrage.
N éo- ang iogenèse
tumo rale : la cible p harm aco log iq ue
ne se lim ite p as au VEG F
Les thérapeutiques ciblant le VEGF devaient représenter une cible unique « idéale ».
En réalité, plus nos connaissances progressent, plus nous devons admettre que les
choses sont bien plus complexes que nous ne l’avions imaginé. Certes, le VEGF est
une voie essentielle qu’utilisent les cellules tumorales pour stimuler la prolifération
vasculaire. Cependant, il existe d’autres facteurs pro-angiogéniques, identiἀés ou
restant encore à découvrir, qui interviennent soit directement de la cellule tumorale
à la cellule endothéliale, soit indirectement via l’environnement péritumoral et la
cellule stromale [1].
Avec un certain retard vis-à-vis de nos collègues cardiologues, nous commençons
à nous intéresser aux précurseurs médullaires et à leur importance dans le système
vasculaire tumoral et péritumoral. Réduire la cible pharmacologique au VEGF est
une erreur. Nous disposons aujourd’hui de médicaments soit très « purs », ciblant le
VEGF, soit très « impurs », des drogues « sales », qui vont s’adresser à plusieurs des
facteurs clés du réseau angiogénique [2]. Les outils ciblant le VEGF et son récepteur
dont nous disposons sont des anticorps monoclonaux anti-VEGF, comme le bévacizumab, des récepteurs solubles comme le VEGF Trap, ou encore des molécules
qui vont inhiber la partie fonctionnelle des récepteurs au VEGF (ἀg. 1). Des essais
thérapeutiques portant sur ces petites molécules, plus ou moins spéciἀques et ayant
un spectre plus ou moins large, sont quotidiennement publiés.
79
Olivier Rixe
VEGF
PDGF
Sorafénib
Sunitinib
Cascade de transduction du signal
Perméabilité vasculaire, survie,
prolifération et migration cellulaire
R-1
VEGFR-2
Sunitinib
Sorafénib
GF
GF
VE
PDGFR
VE
Sunitinib
Sorafénib
R-
3
Angiogenèse
Vasculogenèses
Angiogenèse
Lymphangiogenèse
Sunitinib
Péricyte
GFR
Sorafénib
PD
ki
t
Cellule endothéliale
Cellule
tumorale
Raf
MEK
Ek
Tumeur
Stimulation autocrine
Angiogenèse
Pression interstitielle tumorale
prolifération
Survie
Figure 1. Sites d’action des anti-angiogéniques.
Le réel avantage de molécules ciblant spéciἀquement le VEGF par rapport à
des molécules qui auront des actions collatérales beaucoup plus larges (dont tous
les « ib » : sunitinib, sorafénib, axitinib, pazopanib…) reste encore aujourd’hui à
préciser.
80
Les act ions des
ant i-VEG F restent m
al connues
En réalité, nous ignorons à peu près tout de ce que nous faisons lorsque nous donnons
un anti-VEGF. Certes, la raréfaction du système vasculaire est clairement reliée à la
régression du volume tumoral. Il a été montré, chez la souris, que l’utilisation d’un
antirécepteur au VEGF de type 2 permet une réduction volumétrique tumorale tout
à fait superposable à la raréfaction vasculaire [3]. Cependant, le champ d’action des
anti-VEGF paraît bien plus large. Un effet antitumoral direct est très probable. Le
sunitinib a ainsi une action antitumorale in vitro sur des cultures cellulaires, donc en
l’absence de tout système vasculaire. Récemment, il a également été montré que les
cellules de la tumeur peuvent mobiliser des cellules normales de la moelle osseuse
et provoquer leur migration jusqu’aux régions prémétastatiques et, ainsi, préparer
ce nouvel environnement à la greffe tumorale [4]. La tumeur émettrait un signal par
l’intermédiaire des VEGFR-1 et VEGFR-2 et préparerait des « niches » aux éventuelles tumeurs secondaires en les rendant adhérentes. Ces cellules médullaires vont
se loger sur des poumons, des foies et de l’os sains et vont, secondairement, attirer les
cellules tumorales pour permettre leur prolifération et le développement secondaire
de métastases. Ce phénomène médié par VEGFR-1 et VEGFR-2 peut constituer un
autre point d’impact pharmacologique important, ce qui expliquerait la réduction des
nouvelles métastases en présence des inhibiteurs de ces récepteurs.
Les VEGF seraient aussi impliqués dans des phénomènes d’immunosuppression
observés dans l’environnement tumoral. Le VEGF produit par les cellules tumorales inhibe la maturation des cellules dendritiques dans l’environnement tumoral et
celles-ci seraient ainsi incapables d’induire les réponses lymphocytaires T effectrices
antitumorales.
La démonst rat ion de
a été é clat ante
la valid ité du
con cept ant i-VEG F
Les outils thérapeutiques anti-VEGF efἀcaces sont apparus dans les années 2000
avec, parmi les plus puissants, le sunitinib. L’étude de phase 1 de cet agent a été menée
en France [5]. L’un des premiers patients traités était atteint d’un cancer métastatique
du rein. Les métastases pulmonaires de ce malade ont régressé quasi complètement.
La preuve du concept anti-VEGF était faite ! Une telle efἀcacité antitumorale dès la
phase 1 reste assez exceptionnelle en cancérologie.
La phase 2 a été menée de l’autre côté de l’Atlantique avec le schéma mis au point
à l’Institut Gustave-Roussy : 4 semaines de traitement donné par voie orale, suivies
de 2 semaines d’arrêt [6]. La présentation des résultats au congrès de l’American
Society of Clinical Oncology (ASCO) en 2005 a été saluée par une ovation debout
(standing ovation). Les lésions avaient régressé chez 42 % des 60 patients traités.
Alors que leur tumeur rénale était considérée comme résistante à tout médicament,
81
Olivier Rixe
elle se révélait sensible dans presque 1 cas sur 2, avec une durée de réponse d’environ
14 mois et une médiane de survie d’environ 2 ans. Le médicament a été approuvé,
sur la base de cette étude menée chez seulement 60 patients, aux États-Unis par la
Food and Drug Administration (FDA) d’abord, puis par les autorités européennes, ce
qui a été ensuite conἀrmé par une large étude de phase 3 [7]. Ainsi, le sunitinib a été
comparé à l’un des traitements standard de la maladie métastatique. Son administration a permis un doublement de la survie sans progression. La médiane de survie
est passée de 21 mois dans le groupe standard interféron à 26 mois dans le groupe
sunitinib. La faiblesse de l’écart entre les deux groupes de traitement s’explique
notamment par le passage au sunitinib de patients initialement sous interféron, ce qui
tend à rapprocher les deux courbes de survie.
U n fo rt impact su r la su rv ie s ans p rog ress ion
Parallèlement, nous avons mis au point, à l’hôpital de la Pitié-Salpêtrière, un autre
anti-VEGF, l’axitinib [8, 9]. Avec cet agent également, des résultats signiἀcatifs ont
été observés dès la phase 1 dans plusieurs types tumoraux et, notamment, dans le
cancer du rein métastatique. L’axitinib est une molécule qui présente l’intérêt d’inhiber très spéciἀquement les récepteurs au VEGF des types 2 et 3 et elle a donc très
peu d’activité sur les autres récepteurs impliqués dans l’angiogenèse ou sur d’autres
tyrosines kinases. Nous avons traité 50 patients et obtenu 44 % de réponses objectives et des rémissions complètes qui ont pu persister au-delà de 4 ans de traitement.
Les études ont é
choué à démont
re r un béné fice
su r la pro long at ion de la su rv ie
La stratégie thérapeutique dans le cancer du rein a été totalement bouleversée par
ces quelques essais, incluant des études clés également menées avec le bévacizumab
et le sorafénib. En 1980, les recommandations pour la prise en charge d’un cancer
du rein préconisaient l’utilisation de la progestérone, de cytotoxiques (vinblastine)
et, surtout, d’immunothérapie par interféron et interleukine 2. Les résultats thérapeutiques restaient cependant plus que modestes. L’arrivée des anti-angiogéniques a
complètement modiἀé les recommandations et, aujourd’hui, 80 % des patients ayant
un cancer du rein sont, ou seront, traités par un traitement dirigé contre les facteurs
de croissance vasculaire.
Cela étant, quel est réellement l’impact des traitements anti-VEGF en termes de
prolongation de la survie ? Sur l’ensemble des études de phase 3 publiées sur le
cancer du rein utilisant les traitements anti-angiogéniques, une seule a montré un
bénéἀce sur la survie d’environ 6 mois avec le sunitinib par rapport au traitement
de référence (interféron). Les autres études sont positives en termes de survie sans
récidive.
82
Élab o rat ion de nouve
lles st ratég ies t hé rapeut iq ues
Les cancérologues ont mis au point deux stratégies différentes. L’une d’elles fait appel
à des monothérapies utilisant des inhibiteurs du récepteur au VEGF dans le cancer
du rein et dans l’hépatocarcinome. Les études randomisées sont positives avec un
impact sur la survie sans progression assez modeste (de 1 à 3 mois) dans l’hépatocarcinome et plus important dans le cancer du rein. Dans les autres tumeurs (les cancers
du sein, du poumon ou du côlon), les anti-VEGF ont été employés en association
avec les traitements conventionnels et en particulier la chimiothérapie. Ces essais
ont montré une synergie entre la chimiothérapie et le bévacizumab, phénomène qui
reste aujourd’hui assez mal expliqué. Cette action sur la plupart des tumeurs, comme
celles du côlon, du poumon ou du sein, a été démontrée, les taux de réponses étant
plus élevés qu’avec la chimiothérapie seule, mais l’impact reste assez modeste en
termes de survie sans progression et de survie globale. D’autres indications dans les
tumeurs plus ou moins orphelines sont en cours d’élaboration. Des études de phase 2
concernant les tumeurs thyroïdiennes et les tumeurs neuro-endocrines carcinoïdes
du pancréas ont été publiées récemment. Des taux de réponses signiἀcatifs ont été
obtenus et des essais de phase 3 sont donc en cours. Le bévacizumab est actuellement évalué dans le glioblastome.
La q uest ion des p hénomènes de
ant i-ang iogén iq ues
rés ist an ce aux agents
Ces thérapeutiques anti-angiogéniques permettent-elles des survies à long terme ?
Clairement, la réponse est : très peu ! L’essai de phase 2 sur l’axitinib est l’un
des seuls dans lequel des patients sont toujours vivants au bout de plus de 4 ans.
L’amélioration des taux de réponses obtenus avec les thérapeutiques anti-angiogéniques ne s’est pas réellement traduite par des réponses complètes et de réelles
améliorations des pourcentages de survie à long terme. Quelle en est la raison ?
Les mécanismes de résistance aux anti-angiogéniques font aujourd’hui l’objet de
nombreuses publications.
Il existe deux types de résistances aux traitements anti-VEGF [10] : les résistances
intrinsèques, dans lesquelles le malade ne va pas répondre au traitement anti-angiogénique, et les résistances acquises où, après une phase de raréfaction vasculaire, ce
réseau va se remettre à proliférer et à s’étendre. Les mécanismes en cause paraissent
extrêmement hétérogènes. Ainsi, le phénomène d’évasion vasculaire à un traitement
anti-VEGF correspond à une réactivation de l’angiogenèse tumorale indépendante
du VEGF, associée à une induction médiée par l’hypoxie d’autres facteurs pro-angiogéniques incluant des membres de la famille des facteurs de croissance des ἀbroblastes (FGF, ἀbroblast growth factor). Le traitement par des inhibiteurs du FGF
entraîne, de nouveau, la raréfaction vasculaire. En conséquence, cibler la voie VEGF
83
Olivier Rixe
va déréprimer d’autres voies comme la voie FGF, qui va constituer un mécanisme
d’échappement signiἀcatif.
Un autre mécanisme de résistance met en jeu une sous-population de cellules
souches de la lignée myéloïde. Ces cellules vont inἀltrer la tumeur et la rendre résistante aux anti-VEGF. Il faut souligner que ces cellules sont très sensibles à la chimiothérapie, ce qui pourrait expliquer la synergie d’action obtenue avec l’association
d’un anti-VEGF et d’un cytotoxique.
V e rs une ident ificat ion des p at ients pouv
d’un t raitement
ant i-ang iogén iq ue
ant béné ficie r
Nous n’avons toujours pas la capacité d’identiἀer les patients qui vont répondre au
traitement anti-angiogénique. L’ampliἀcation de l’EGFR et les mutations de KRAS
permettent d’identiἀer les malades répondeurs à l’erlotinib. L’herceptine est efἀcace
dans 40 % des cas chez les patientes montrant une ampliἀcation du gène HER2.
L’imatinib n’est actif que chez des malades atteints d’une tumeur stromale surexprimant c-kit associée à certaines mutations parfaitement identiἀées. Pourtant, nous
sommes aujourd’hui incapables d’identiἀer les anomalies du récepteur au VEGF qui
permettraient de prédire l’activité des anti-VEGF.
Certains facteurs, essentiellement cliniques, peuvent toutefois être associés à
la réponse au traitement. Ainsi, les patients faisant une hypertension artérielle au
décours d’un traitement par l’axitinib tendent à avoir une meilleure survie que les
autres patients. L’apparition de l’hypertension artérielle (élévation de la diastolique)
est ainsi un facteur associé à l’efἀcacité du traitement anti-angiogénique, sans doute
indirectement associé à une meilleure biodisponibilité du médicament chez ces
patients [8, 11].
Quelles sont les perspectives des traitements anti-angiogéniques ? Devront-ils être
associés ? Leur spectre devrait-il être élargi ? Devraient-ils être utilisés plus précocement, notamment en adjuvant ? Est-il possible d’identiἀer des sous-groupes de patients
répondeurs ? Faudrait-il également cibler les voies VEGF indépendantes ? Les médecins de différentes disciplines médicales comme la cardiologie et la cancérologie ont
des interrogations communes comme le démontrent les présentations de ce colloque.
L’avenir de l’utilisation clinique de ces molécules réside dans l’identiἀcation de
facteurs prédictifs de la réponse à ce traitement ciblé qui permettra d’améliorer l’indice thérapeutique de ces molécules.
Bibliographie
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2
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85
Anti-angiogenèse et pathologie oculaire,
dégénérescence maculaire liée à l’âge
José-Alain Sahel, Michel Paques
N éo vas cu laris at ion o cu laire
La néovascularisation rétinienne est connue de longue date. Dès 1948, Michaelson,
un ophtalmologiste de l’Université de Jérusalem, a postulé l’existence d’un facteur x,
libéré par le tissu hypoxique et stimulant la formation de néovaisseaux dans des
pathologies ischémiques comme le diabète et les occlusions veineuses. Michaelson
avait également évoqué la possibilité, dans l’avenir, de bloquer ce facteur x dès lors
qu’il serait identiἀé [1].
M éd iateu rs de la néo vas cu laris at ion o cu laire
L’hypothèse de Michaelson a été conἀrmée plus de 40 ans après avec l’identiἀcation
du VEGF (vascular endothelial growth factor) dans la pathologie oculaire. Le VEGF
n’est toutefois pas le seul facteur à intervenir dans les phénomènes de néovascularisation et dans l’orchestration de ce processus. Par exemple, l’équipe de Chemtob, à
Montréal, a tout récemment montré que l’accumulation de succinate dans la rétine
hypoxique agit comme un puissant médiateur de l’angiogenèse et que cet agent est
notamment impliqué dans la rétinopathie diabétique ischémique. Le succinate agit
par l’intermédiaire de son récepteur, le GPR-91 (G protein-coupled receptor-91),
les effets de ce dernier étant eux-mêmes médiés par les cellules ganglionnaires de la
rétine qui, en réponse à l’augmentation des niveaux de succinate, régulent la production de nombreux facteurs de croissance et, en particulier, du VEGF [2].
Plus généralement, on considère aujourd’hui qu’il existe un équilibre entre des
facteurs pro-angiogéniques, au premier rang desquels le VEGF, le PDGF (plateletderived growth factor), le FGF-2 (ἀbroblast growth factor-2) et des facteurs antiangiogéniques naturels, en particulier le PEDF (pigment epithelial-derived factor),
qui est notamment synthétisé par l’épithélium pigmentaire.
86
D égéné res cen ce m acu laire liée à l’âge : mé can ismes
Nous nous intéresserons ici plus particulièrement à la dégénérescence maculaire
liée à l’âge (DMLA). Cette pathologie fréquente touche 1,5 million de personnes en
France, un dixième d’entre elles étant considérées comme aveugles. Jusqu’au début
des années 2000, l’arsenal thérapeutique restait très restreint dans cette indication
et se limitait, pour l’essentiel, au laser utilisé dans des formes très particulières de
la maladie, concernant moins de 8 % des patients, dans lesquelles des néovaisseaux
apparaissent en dehors de la macula.
Le mécanisme conduisant à la formation des néovaisseaux dans la DMLA est
moins bien élucidé que dans l’ischémie diabétique ou dans les occlusions veineuses.
Le rôle d’une inḀammation locale semble de plus en plus évident à la lumière des
nombreuses études génétiques mettant en évidence le rôle du polymorphisme de
facteurs du complément dans la prédisposition à la maladie. Plusieurs mécanismes
coexisteraient, parmi lesquels l’ischémie joue un rôle assez obscur. Une hypothèse
aujourd’hui admise, mais restant à conἀrmer, postule qu’un niveau donné de VEGF
permettrait de maintenir la structure et la fonction de la circulation choriocapillaire
dans la rétine normale puis, avec le vieillissement, l’accumulation de débris dans la
rétine viendrait faire obstacle à la diffusion de l’oxygène vers les photorécepteurs, ce
qui entraînerait une hypoxie, une augmentation de la synthèse de VEGF contribuant
à la néo-angiogenèse.
N éo vas cu laris at ion cho roïd ienne d ans la DM LA
La DMLA débute par un soulèvement de la macula. L’angiographie en Ḁuorescéine ou au vert d’indocyanine permet de révéler la présence de néovaisseaux dont
l’exsudation alimente l’œdème maculaire. La maladie a ainsi deux composantes,
la prolifération néovasculaire et l’hyperperméabilité vasculaire qui lui est consécutive, les néovaisseaux étant à l’origine d’exsudations et d’hémorragies dans la région
maculaire.
Il semble que l’efἀcacité des thérapeutiques utilisées dans la DMLA soit davantage
liée à leur action sur la perméabilité vasculaire qu’à leur effet anti-angiogénique
proprement dit. Il faut à ce propos se souvenir que le VEGF est également dénommé
vascular permeability factor. L’expérience clinique indique qu’en termes d’amélioration de la fonction maculaire, il est très probable que la cible principale des antiVEGF soit la perméabilité vasculaire.
La forme exsudative de la maladie nous intéresse plus particulièrement. Les formes
atrophiques de la maladie sont également fréquentes, mais elles sont caractérisées
par l’involution des vaisseaux et, donc, par un processus pathologique à l’opposé de
ce qui est observé dans la forme exsudative [3].
87
Avan cées t hé rapeut iq ues face à la néo vas cu laris at ion
o cu laire
Les néovaisseaux n’apportent pas une réponse adaptée à l’ischémie. En raison de
leur situation ectopique, ils n’ont pas d’effet signiἀcatif sur l’oxygénation du tissu
ischémique. En revanche, ils sont responsables de complications sévères, cécitantes,
essentiellement par ἀbrose et rétractation secondaire.
Il était donc logique de cibler ces néovaisseaux dans une perspective thérapeutique. Historiquement, le laser a surtout été employé dans la rétinopathie diabétique
pour obtenir l’ablation du tissu ischémique (panphotocoagulation rétinienne). Cette
intervention est une forme d’amputation, elle procède au sacriἀce du tissu en vue de
limiter la synthèse de VEGF et des facteurs pro-angiogéniques, mais elle est réalisée
au détriment des neurones qui sont détruits.
Ce traitement est donc très peu satisfaisant, mais les anti-VEGF constituent-ils
pour autant une alternative optimale ? Si le VEGF intervient dans le développement des néovaisseaux, il joue également un rôle déterminant dans les processus
physiologiques de vascularisation. Ainsi, dans l’œil adulte, les récepteurs au VEGF
sont exprimés sur l’endothélium, mais également dans les cellules de la rétine, qu’il
s’agisse de l’épithélium pigmentaire ou des photorécepteurs. Le VEGF y a un effet
pro-inḀammatoire et il est probable qu’il intervienne dans le maintien de la trophicité de la choriocapillaire. Enἀn, il a été montré que le VEGF a un rôle neuroprotecteur [4, 5]. Les anti-VEGF pourraient en conséquence avoir un effet toxique sur
les neurones de la rétine avec une altération de l’électrorétinogramme, et donc de
la fonction visuelle, ce qui pourrait, sans que cela soit établi de manière irréfutable,
poser problème dans le cas de traitements itératifs et à long terme.
E xp lo rat ion des e
ffets du
VEG F au n ive au de l’œ il
Le rôle du VEGF au niveau de la rétine a notamment été exploré par l’étude des
conséquences de son injection intra-oculaire. Les effets de cette intervention sont
variables selon les espèces. Chez le rat, elle ne se traduit pas tant par la formation de
néovaisseaux que par une dilatation du calibre vasculaire et par une très importante
diffusion. Le principal effet du VEGF est donc ici une augmentation de la perméabilité des vaisseaux qui pourrait être liée à un effet pro-inḀammatoire. Chez le singe,
en revanche, le VEGF entraîne la formation de néovaisseaux [6, 7].
Le rôle du VEGF en pathologie a notamment été exploré en France par les équipes
de Malecaze et de Plouet, et, aux États-Unis, par l’équipe d’Aiello qui ont montré
l’augmentation des taux de VEGF dans différentes pathologies, et plus particulièrement dans la rétinopathie diabétique (ἀg. 1), ce phénomène étant moins évident dans
la DMLA [8, 9]. Les nombreux travaux qui ont montré que le blocage du VEGF
entraînait une inhibition de la néovascularisation sont à l’origine de l’élaboration des
stratégies anti-VEGF en ophtalmologie au cours des dernières années [10-12].
88
30
VEGF (ng/ml de l’échantillon)
25
20
15
10
5
0
Absence de
pathologie
proliférative
Absence
de RDP
RDP quiescente
Diabète
RDP active
Quiescente
Active
Néovascularisation de l’iris
Active
OAVCR
OAVCR : occlusion active de la veine centrale de la rétine ; RDP : rétinopathie diabétique périphérique.
Figure 1. Augmentation des taux de VEGF intravitréen au cours de la rétinopathie diabétique humaine.
(Reproduit avec l’aimable autorisation d’Aiello, et al. [9]).
S t ratég ies ant i-VEG F
La DMLA, l’œdème maculaire et la néovascularisation prérétinienne sont les principales indications des anti-VEGF. L’administration par voie intraveineuse est possible, mais la voie intravitréenne est le plus souvent employée. Cette dernière est
aujourd’hui effectuée en routine en injections mensuelles. Les thérapeutiques ayant
déjà obtenu leur AMM ou encore à l’étude ciblent les ARN qui vont coder pour
le VEGF, le VEGF lui-même, ses récepteurs ou la voie d’activation de la tyrosine
kinase [13].
Les médicaments actuellement approuvés en ophtalmologie sont le pegaptanib
sodique et le ranibizumab. Ce dernier est un fragment du bévacizumab qui serait
doté d’une pénétration oculaire et d’une afἀnité améliorée. Les essais cliniques
ont principalement montré une diminution de la diffusion et, donc, une réduction
de l’œdème maculaire. Surtout, le traitement par le ranibizumab stabilise l’acuité
visuelle et permet même une amélioration chez à peu près un tiers des malades.
Incontestablement, ce traitement a représenté une évolution thérapeutique majeure
89
Vairation moyenne de l'acuité
visuelle ± ES (lettres)
en permettant une stabilisation ou une amélioration de l’acuité visuelle chez 90 %
des patients dans une indication où les ophtalmologistes étaient jusqu’alors relativement impuissants (ἀg. 2) [14].
La tolérance du ranibizumab paraît bonne, même si le risque d’accident vasculaire
cérébral n’est pas totalement nul.
15
10
+6.6
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24 mois
+21.5
lettres*
-5
-10
-15
*p < 0,01
Vairation moyenne de l'acuité
visuelle ± ES (lettres)
-14.9
Ranibizumab 0,5 mg, 1 injection/mois (n = 240)
Injection simulée, 1 injection/mois (n = 238)
12
+11.3
8
4
0
0
1
24
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 mois
-4
-8
-9.5
+20.8
lettres*
*p < 0,01
-12
PDT. 1 injection tous les 3 mois si nécessaire (n = 143)
Ranibizumab 0,5 mg, 1 injection/mois (n = 139)
Figure 2. Stabilisation et amélioration de l’acuité visuelle avec le ranibizumab dans la DMLA. (Reproduit avec l’aimable autorisation de Rosenfeld, et al. [14]).
VEG F Tra p : blo cage sé le ct if ou non sé
le ct if ?
Le VEGF Trap est un récepteur soluble du VEGF actuellement en phase 3 de son
développement. Non spéciἀque, il lie toutes les formes du VEGF et serait, in vitro,
140 fois plus efἀcace que le ranibizumab. Son principal intérêt est de permettre un
espacement considérable des doses.
La question du choix du blocage sélectif versus non sélectif du VEGF a été largement débattue, notamment en regard des fonctions physiologiques importantes du
facteur angiogénique. Les études expérimentales ont montré que si le blocage du seul
90
VEGF-165 reste sans effet sur la vascularisation physiologique, le blocage global
par le ranibizumab en pourrait revanche être associé à des effets indésirables sur la
vascularisation [15, 16]. Le pegaptanib est un aptamère spéciἀque à haute afἀnité
pour le VEGF-165 qui a été approuvé en ophtalmologie. Son efἀcacité a été démontrée vis-à-vis de l’absence de traitement avec un bénéἀce en termes d’acuité visuelle.
Cependant, ce traitement ne permet qu’un ralentissement de la perte visuelle alors
que le blocage pan-VEGF stoppe la perte visuelle, voire améliore l’acuité visuelle. Le
pegaptanib n’a, par conséquent, pas eu le succès de l’approche pan-VEGF en ophtalmologie. Cela pourrait s’expliquer par l’effet anti-œdémateux du ranibizumab.
Un article très récent, paru dans Cancer Research, fait état d’une forme de
VEGF-165, le 165 b, qui serait anti-angiogénique. Le blocage du VEGF-165 pourrait
donc avoir un double effet, pro-angiogénique et anti-angiogénique simultanément, et
son ciblage souffrirait ἀnalement d’un manque de spéciἀcité [17, 18].
Aut res st ratég ies ant i-ang iogén iq ues
Différentes stratégies anti-angiogéniques sont en cours d’élaboration. Des essais
cliniques évaluent les inhibiteurs de la tyrosine kinase. Une forme topique d’un antagoniste du VEGF, un Src kinase, a fait l’objet d’investigations, mais il s’est avéré être
à l’origine de lésions de la cornée qui semblent en limiter beaucoup l’intérêt, sauf à
améliorer la pharmacocinétique.
L’ophtalmologie a été l’une des premières disciplines à utiliser les ARN interférents. Des essais ont montré un bénéἀce par rapport à l’absence de traitement, mais
celui-ci restait modéré en regard de ce qui est obtenu avec les anti-VEGF.
Une phase 3 actuellement en cours évalue leur intérêt dans une approche de stabilisation, en relais des anti-angiogéniques. Les ARN interférents sont toutefois controversés. Il semble qu’ils entraînent une inhibition non spéciἀque de la néovascularisation par l’intermédiaire de la voie Toll R3. Les récepteurs Toll R3 sont présents dans
les cellules de l’épithélium pigmentaire et leur activation par les ARN interférents
pourrait être associée à une mort cellulaire. Les ARN interférents pourraient ainsi
avoir des effets non spéciἀques sur l’épithélium pigmentaire.
Aut res v o ies t hé rapeut iq ues et
de t raitement
aut res mod alités
Des approches alternatives sont actuellement envisagées comme, par exemple, la
thérapie génique par l’AdPEDF (adénovecteur porteur du gène du PEDF). Des
études chez l’animal ont montré que l’expression accrue de PEDF dans l’œil pourrait
empêcher l’angiogenèse.
Il a également été envisagé d’utiliser des traitements combinés. Ainsi Friedlander,
du Scripps Research Institute, a proposé d’attaquer le processus angiogénique sur
91
trois niveaux simultanément. Il préconise d’intervenir sur le déclenchement du
processus de néo-angiogenèse à l’aide d’un aptamère anti-VEGF, de faire appel
aux intégrines αvß3 et αvß5 pour s’opposer à la prolifération des néovaisseaux
et, enἀn, d’utiliser un facteur soluble, le T2-TrpRS, inhibant la maturation des
néovaisseaux.
Con clus ion
L’utilisation des anti-angiogéniques est aujourd’hui entrée en pratique courante en
ophtalmologie, ce qui représente une avancée majeure. Chaque jour, des centaines
de patients reçoivent une injection d’anti-VEGF. Il demeure que ces traitements sont
coûteux, longs et que nous en ignorons les conséquences à long terme. De plus, les
formes atrophiques restent incurables et nous plaçons de grands espoirs dans les
essais cliniques actuellement en cours et dans la mise au point de la prévention des
complications de la maladie.
Bibliographie
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93
Les vaisseaux tumoraux : une cible
thérapeutique majeure
Gérard Tobelem
U n v is ionn aire, un con cept
L’angiogenèse, c’est-à-dire la croissance des vaisseaux, est un processus essentiel
du développement embryonnaire et de la réparation tissulaire. Un déséquilibre de ce
processus est observé dans de nombreuses pathologies, dans les cancers tout d’abord
mais aussi au cours de pathologies inḀammatoires, ischémiques, infectieuses et
immunologiques.
L’angiogenèse moderne commence en 1971 avec Judah Folkman qui va consacrer
toute sa vie, jusqu’à sa mort récente le 14 janvier 2008, aux recherches sur l’angiogenèse. Ce chirurgien de formation, professeur à Harvard et directeur du Programme
de biologie vasculaire au Children’s Hospital de Boston, va affronter pendant de très
nombreuses années le scepticisme de la communauté médicale et scientiἀque tant
son hypothèse de 1971 est avant-gardiste [1]. Il faut reconnaître qu’il s’agissait alors
d’une simple hypothèse résultant davantage d’une vision que de travaux solidement
étayés. La vision de Folkman : un rêve pour l’époque !
Un tissu cancéreux est un tissu comme un autre qui a besoin de nutriments et
d’oxygène véhiculés par les vaisseaux sanguins pour croître, se multiplier et essaimer. C’est sur ce constat qu’a émergé la notion d’« angiogenèse dépendance » des
tumeurs. Accompagnant la progression tumorale d’un stade dormant vers un stade
invasif de croissance et de dissémination métastatique, les vaisseaux subiraient
un changement phénotypique, le fameux « switch angiogénique ». Dès lors, inhiber l’angiogenèse apparaît très naturellement, en tout cas pour Folkman le visionnaire, comme une nouvelle stratégie thérapeutique anticancéreuse qui consiste tout
simplement à affamer le cancer en le privant de sa vascularisation. Ainsi naît, avec
ce pionnier, le premier concept de thérapeutiques ciblées dans le cancer, une stratégie qui aujourd’hui se développe formidablement. Si, pendant près de deux décennies, l’angiogenèse n’intéresse qu’un petit nombre d’initiés, il n’en est plus de même
aujourd’hui avec l’approche anti-angiogénique des cancers qui est entrée dans la
pratique thérapeutique quotidienne des cancérologues, des ophtalmologistes et bientôt d’autres spécialistes.
94
Quatre ans avant sa mort brutale (très probable un accident coronaire ischémique),
Folkman a pu voir avec satisfaction que son rêve était devenu réalité. Les vaisseaux
tumoraux sont aujourd’hui une cible majeure dans le traitement des cancers. Les
indications se multiplient dans les cancers colorectaux, du sein, du poumon et du
rein. De même, les molécules enregistrées se multiplient et de très nombreuses autres
sont en phase de développement préclinique et clinique. Ce domaine est devenu
un domaine clé pour l’industrie pharmaceutique et biotechnologique. Le nombre
d’équipes académiques travaillant sur les mécanismes moléculaires et cellulaires de
l’angiogenèse est aujourd’hui légion. Cette mobilisation est à la hauteur des enjeux,
tant de questions persistent sur le plan de la recherche fondamentale comme sur le
plan thérapeutique. Les cibles s’afἀnent et les approches anti-angiogéniques sont
de plus en plus complexes. Une meilleure compréhension des caractéristiques des
vaisseaux tumoraux est aujourd’hui à l’origine d’une recherche translationnelle très
prometteuse.
Q ue lles sont
tumo raux ?
les caracté rist iq ues des néo
vaisse aux
Désorganisés, de distribution anarchique, perméables et fragiles, les néovaisseaux
tumoraux sont profondément anormaux. Leur survie est sous la dépendance d’une
présence continue de VEGF (facteur de croissance angiogénique) qui est à l’origine
de leur prolifération et de l’augmentation de perméabilité. Leur couverture péricytaire est plus faible. Il en résulte une augmentation de pression interstitielle intratumorale ce qui, d’une part, favorise l’essaimage de cellules tumorales vers le courant
sanguin ou lymphatique, c’est-à-dire les métastases, et, d’autre part, défavorise l’accès des chimiothérapies vers les cellules tumorales. L’hypoxie, qui est présente au
sein de la tumeur, induit davantage d’instabilité génétique et sélectionne les cellules tumorales les plus malignes. Ainsi, les vaisseaux tumoraux sont profondément
anormaux en termes de phénotype, de marqueurs et d’hémodynamique. Ils sont le
siège d’un remodelage important. Ils sont certes augmentés en nombre, la densité
capillaire est effectivement accrue dans la plupart des cancers, mais ils sont surtout
qualitativement différents des vaisseaux normaux. Nous l’avons montré [2, 3] dans
un modèle d’hépatocarcinome murin, d’autres équipes également [4]. En résumé, on
peut dire que les vaisseaux tumoraux expriment de façon très importante une spéciἀcation artérielle, les cellules endothéliales angiogéniques sont en effet Notch 4,
Dll4 et éphrine B2 positives, autant de marqueurs normalement présents (et à un
moindre degré) seulement sur les cellules endothéliales artérielles. Le remodelage
vasculaire est ἀnalement la résultante de l’hyperstimulation par le VEGF, facteur
d’autant plus exprimé que l’hypoxie au sein de la tumeur est forte. Il y a donc une
cascade que nous avons pu préciser sur notre modèle d’hépatocarcinome murin mais
95
Gérard Tobelem
aussi in vitro sur des cultures de cellules endothéliales : VEGF → Notch 4 → Dll4 →
éphrine B2. Ce remodelage induit des modiἀcations du Ḁux sanguin. Nous avons pu
ainsi montrer par écho-Doppler, dans ce modèle, qu’une augmentation de la vitesse
du Ḁux de l’artère hépatique précédait la diffusion du carcinome [5]. Au total, ces
modiἀcations phénotypiques, ces changements d’expression de marqueurs moléculaires et ces perturbations hémodynamiques traduisent le profond remodelage vasculaire survenant dans la vasculature tumorale.
Q ue ls sont les app ro ches t hé rapeut iq ues
ant i-ang iogén iq ues ?
Ces approches sont aujourd’hui de trois types. On peut inhiber la croissance des
néovaisseaux tumoraux, les détruire ou, et c’est une troisième approche émergente,
les rendre encore plus anormaux. La première stratégie fait appel aux anti-angiogéniques proprement dits [6, 7] et la deuxième à une classe de produits appelés vascular
disrupting agents (VDA) [8]. Ces deux groupes diffèrent par leur cible, leur mécanisme d’action et peut-être par leurs indications et leurs schémas d’administration.
La troisième approche, la plus récente, consiste à bloquer Dll4 [9-12].
Les anti-angiogéniques auront pour cible principale le VEGF et/ou ses récepteurs
compte tenu du rôle majeur de ce facteur de croissance dans le remodelage vasculaire. Ils sont maintenant mieux connus, certains d’entre eux sont de plus en plus
présents dans la pratique quotidienne des cancérologues. Il est vrai qu’en accord avec
la théorie initiale de Folkman, on attendait des anti-angiogéniques qu’ils inhibent la
croissance des néovaisseaux tumoraux, voire qu’ils détruisent les néovaisseaux existants. La dépendance des cellules endothéliales vis-à-vis du VEGF pour leur survie
renforçait cette attente. D’un autre côté, l’augmentation d’hypoxie qui en devait en
résulter aurait pu rendre encore plus difἀcile l’accès des chimiothérapies au sein de
la tumeur. Or, il n’en a rien été. D’une part, les anti-VEGF stricts, le bévacuzimab
par exemple, ne semblent pas efἀcaces en monothérapie vis-à-vis de la tumeur et,
d’autre part, leur association avec les chimiothérapies potentialise l’efἀcacité de ces
dernières. En fait, l’effet de ces anti-angiogéniques et notamment des anti-VEGF
est certes d’inhiber la croissance des néovaisseaux tumoraux mais aussi, et ceci était
plus inattendu, de normaliser la vasculature tumorale. Il s’agit d’un concept mis au
point par Jain [13, 14] et conἀrmé par d’autres équipes, dont la nôtre. La privation de
VEGF induite par un anticorps, un composé piège ou un inhibiteur de ses récepteurs
induit une réversion du phénotype artériel anormal des cellules endothéliales angiogéniques. Il en résulte une normalisation hémodynamique, une meilleure oxygénation des cellules tumorales et, donc, de plus grandes accessibilité et sensibilité aux
traitements anticancéreux classiques (chimiothérapie ou radiothérapie). Si le produit
anti-angiogénique n’a pour cible exclusive que le VEGF (c’est le cas par exemple du
bévacizumab), son utilisation en monothérapie sera peu efἀcace car seule la combi96
naison avec une chimiothérapie et/ou une autre thérapeutique ciblée pourra avoir
une activité antitumorale signiἀcative. Par ailleurs, tant que persistent des cellules
tumorales, il paraît logique de poursuivre cette stratégie thérapeutique pour enrayer
toute nouvelle reprise d’activité angiogénique.
Les VDA, deuxième classe d’anti-angiogéniques, sont encore en cours de mise
au point. Ils sont donc moins bien connus. Ce groupe comprend deux types de
molécules :
––d’une part les agents de liaison à la tubuline (sur le site de ἀxation de la colchicine
à la sous-unité β de la tubuline), qui dépolymérisent les microtubules et désorganisent ainsi le cytosquelette de la cellule endothéliale ; ils agissent également sur la
VE-cadhérine en interférant avec les contacts cellule endothéliale-cellule endothéliale, la molécule type de cette catégorie étant la combrestatine phosphate A4 ;
––d’autre part les analogues de Ḁavonoïdes, qui induisent des lésions apoptotiques de
la cellule endothéliale, la molécule type étant le DMXAA (5,6-dimethylxanthenone4-acetic acid).
Les VDA détruisent donc les vaisseaux tumoraux établis en ciblant les cellules
endothéliales immatures et les péricytes de ces vaisseaux. En effet, les cellules endothéliales sont hautement dépendantes de leur cytosquelette de tubuline pour leurs
mobilité, invasion, attachement, alignement et prolifération. Les VDA vont donc
induire une rupture du cytosquelette et des liaisons cellule-cellule. Il en résulte une
désorganisation destructrice, un véritable collapsus des néovaisseaux, plus d’hypoxie
et donc de nécrose tissulaire en aval des vaisseaux détruits. Mais si cette cytotoxicité
se manifeste au centre de la tumeur, il semble persister en périphérie une véritable couronne de cellules tumorales viables dont le support nutritionnel est assuré
par diffusion passive à partir des vaisseaux normaux adjacents. Cette couronne peut
représenter un contingent important de cellules cancéreuses susceptibles de repartir
en croissance. En principe, les cellules endothéliales activées sont plus sensibles
aux VDA mais les premières études cliniques semblent montrer qu’un endothélium
vasculaire normal peut également être affecté. Il en résulte des effets secondaires
cardiaques et neurologiques signiἀcatifs. Il faut donc attendre les résultats des études
de phase 2 en cours pour savoir si le rapport bénéἀce/risque est favorable.
La troisième approche est encore plus récente. Le Dll4 induit par le VEGF se
ἀxe à Notch et est en retour un régulateur négatif du VEGF limitant ainsi l’hyperangiogenèse anormale qui résulte de l’hyperexpression de VEGF. Son inhibition
produit un effet paradoxal d’augmentation de la néoangiogenèse et de réduction de
la masse tumorale. En fait, bloquer Dll4 revient à laisser s’emballer la voie du VEGF,
ce qui augmente le nombre de néovaisseaux mais aussi leurs anomalies. Le résultat
est donc plus de néovaisseaux non fonctionnels sans Ḁux sanguin directionnel et, en
conséquence, plus d’hypoxie tumorale. L’inhibition de Dll4 crée plus d’« anormalisation » vasculaire au sein de la tumeur et l’angiogenèse imparfaite ainsi induite
97
Gérard Tobelem
s’accompagne d’une régression tumorale. Cette approche in vitro et in vivo chez
l’animal semble très prometteuse et complémentaire des autres stratégies, notamment en cas de résistance au blocage de VEGF. Ainsi, l’utilisation d’anticorps antiDll4 ou de Dll4 soluble (le Dll4 soluble encombre le récepteur Notch sans déclencher
la cascade de signalisation et empêche le Dll4 endogène d’y accéder) a montré une
activité antitumorale solide sur de nombreux modèles.
Faut -il alo rs no rm alise r, dét ru ire ou « ano rm alise r »
les vaisse aux tumo raux ?
Actuellement, seuls les anti-angiogéniques (et notamment l’inhibition du VEGF) ont
fait la preuve de leur efἀcacité dans plusieurs indications. La mise au point clinique
des VDA n’est pas encore achevée et on ne peut donc pas sans risque parier sur leur
avenir en tant que médicaments. Quant aux bloqueurs de Dll4, la question se pose
de savoir quel sera leur proἀl de tolérance avant de vériἀer si la preuve du concept
physiopathologique se conἀrme chez des malades cancéreux.
La stratégie anti-angiogénique aujourd’hui s’impose, même si de nombreuses
questions demeurent sans réponses sur les produits de cette classe thérapeutique :
quelle dose, quelles combinaisons, quel régime d’administration, quelle durée de
traitement, quels marqueurs d’efἀcacité ou de résistance primaire ou acquise, quels
effets au long cours ? Il reste encore beaucoup à établir ou à démontrer. Parmi ces
questions, celle sur le régime d’administration est cruciale. Si l’on suit le concept
élaboré par Jain sur la fenêtre de normalisation, une autre séquence d’administration que celle qui consiste à donner anti-angiogénique et chimiothérapie en même
temps serait-elle plus efἀcace ? Ne faudrait-il pas, en effet, d’abord normaliser les
vaisseaux tumoraux par une administration première de l’anti-VEGF puis, dans un
délai à déterminer (12 heures, 24 heures, 48 heures ?), administrer dans un deuxième
temps la chimiothérapie de référence ? Une autre question cruciale est celle de l’importance du bénéἀce réel apporté aux malades. L’impact est encore faible mais le
palliatif d’aujourd’hui n’est-il pas un investissement pour le curatif de demain ?
En fait, des interrogations de même nature se posent pour les VDA. D’après les
études précliniques et les premières phases cliniques, il paraît peu probable que les
VDA soient actifs en monothérapie. La persistance de la couronne tumorale viable
en est vraisemblablement responsable. Dès à présent, l’option d’une combinaison
avec la chimiothérapie (peut-être d’ailleurs à faible dose, de type métronomique) est
donc prise. Des premiers résultats de phase 2 sont encourageants. Mais, là encore,
se pose la question du régime : les deux traitements en même temps ou décalés ?
Une autre option pourrait associer VDA et anti-angiogéniques. En effet, l’introduction d’un anti-angiogénique après un VDA a du sens pour compléter l’inhibition
de croissance et pour maintenir les cellules tumorales viables restantes en phase de
dormance puisque privées de néo-angiogenèse.
98
Et ἀnalement, à la question : « Normaliser, détruire ou “anormaliser” ? », c’est
peut-être la réponse : « Les trois ! », mais pas forcément en même temps, qui sera la
bonne combinaison de stratégies pour franchir un pas supplémentaire vers plus de
survies. Et pour donner plus de vie au rêve de Folkman !
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99
Limites et complications des traitements
anti-angiogéniques
Jean-Jacques Mourad
Les médicaments anti-angiogéniques (bévacizumab, sunitinib, sorafénib) sont de
plus en plus utilisés dans le traitement des cancers avancés du côlon, du sein, du
poumon, du foie et du rein. Leur mécanisme d’action passe par l’inhibition d’un
facteur pro-angiogénique, le VEGF (vascular endothelial growth factor). Les effets
secondaires de cette inhibition sont assez mal connus des médecins.
U n rô le impo rt ant d ans le m aint ien de
m icro circu lat o ire
l’homéost
as ie
L’absence de VEGF est létale ou provoque des anomalies majeures durant l’embryogenèse et le développement. Chez l’adulte, en revanche, ce facteur était réputé n’intervenir que dans le cycle menstruel, la cicatrisation et la croissance des cheveux. On
pouvait donc penser qu’un anti-VEGF agirait essentiellement sur les circulations à
gros renouvellement (turnover), la circulation tumorale notamment (ἀg. 1) [1].
Âge
Embryogenèse/
développement postnatal
Vasculogenèse
Maintien de l’homéostasie vasculaire
Pathogenèse à l’âge adulte
Angiogenèse
Angiogenèse
Rétinopathies
prolifératives
Yeux
VEGF+
Angiogenèse
VEGF–
Âge adulte
Absence
de VEGF
Létale
Formation
Formation du plexus
du système choroïde
hyaloïde
Inhibition
partielle
du VEGF
Cicatrisation
Reins Cycle de la
Cœur
Tumeurs
reproduction Croissance
Trachée Cerveau Poumons
des
cheveux
Inhibition
partielle du VEGF
DévelopInhibitionde Absence de
couche
pement
la formation
chorioanormal
du plexus
capillaire
des poumons choroïde
et des vaisseaux (in vitro)
pulmonaires
Inhibition
du VEGF
Inhibition
du VEGF
Diminue Perte de Élargissement
le réseau cellules
de l’espace
capillaire alvéolaires
aérien
muqueux
pulmonaire
Inhibition
du VEGF
DMLA
Œdème
maculaire néovasculaire
Inhibition
du VEGF
Prolongation StabiRéduit
de la survie lisation l’épaissisde la
sement
vision maculaire
Inhibition
du VEGF
Réduction
de la NVC
Stabilise
ou
améliore
la vision
DMLA : dégénérescence maculaire liée à l’âge ; NVC : néovascularisation choroïdienne
Figure 1. VEGF : un rôle clé dans l’homéostasie vasculaire. (Reproduit avec l’autorisation de Bhisitkul
[1]).
100
Pourtant, les essais cliniques et la pharmacovigilance ont permis de mettre rapidement en évidence des complications spéciἀques à ces traitements. Le VEGF joue un
rôle important dans le maintien de l’homéostasie circulatoire, en particulier à l’échelon microcirculatoire, et son inhibition entraîne une diminution de la densité capillaire plus ou moins importante selon le tissu auquel on s’intéresse [2]. La régression
capillaire est ainsi signiἀcative au niveau du pancréas, de la thyroïde, des surrénales,
de l’hypophyse, du plexus choroïde et des villosités intestinales. L’importance de la
régression est dose dépendante et atteint 68 % au niveau de la thyroïde [2].
In hibit ion du VEG F et p ro té inu rie
Produit par les podocytes, le VEGF est un puissant modulateur de la perméabilité
capillaire agissant par l’induction de la fenestration des capillaires glomérulaires.
Son inhibition est associée à une perte des fenestrations faisant le lit de dysfonctions glomérulaires avec, en particulier, l’apparition de protéinuries [2] (ἀg. 2). Cette
complication, fréquemment associée à la prise d’un anti-VEGF, est dose dépendante
et habituellement réversible à l’arrêt du traitement.
Capillaires glomérulaires
A
Témoin
B
Ad-sVEGFR-1 14d
sVEGR : récepteur soluble du VEGF.
Figure 2. Perte des fenestrations capillaires associée à l’inhibition du VEGF. (Reproduit avec l’autorisation de Kamba, et al. [2]).
In hibit ion du VEG F et risq ue hype rtens if
La complication la plus fréquemment associée au traitement anti-angiogénique est
l’hypertension artérielle (HTA). Selon une revue récente de la littérature médicale,
elle est présente chez un quart des patients recevant du bévacizumab avec un risque
relatif variant entre 4 et 7 vis-à-vis des témoins [3]. Il faut toutefois préciser que les
essais thérapeutiques utilisent les critères usuels de la classiἀcation NCI-CTCAE
(common terminology criteria for adverse events of the National Cancer Institute)
qui ne reprennent aucune des recommandations internationales de diagnostic et de
prise en charge de l’HTA.
101
Jean-Jacques Mourad
Les premiers essais qui ont étudié le risque hypertensif associé au bévacizumab ont
montré un effet dose-effet toxique. Il est présent quelles que soient les modalités de l’inhibition du VEGF et il a également été démontré avec le sorafénib [3]. Des tableaux cliniques associés à l’HTA, comme la leuco-encéphalopathie postérieure réversible associée à
une HTA sévère, ont été rapportés, mais ils restent heureusement exceptionnels [4-8].
M é can ismes de
au t raitement
l’apparit ion d’une H
T A se cond aire
Les mécanismes physiopathologiques explicatifs ont été peu étudiés. Ce n’est qu’en
2006 qu’a été publié un premier article s’interrogeant sur les raisons de la survenue d’une hypertension chez les patients qui reçoivent des anti-angiogéniques. Ses
auteurs émettaient l’hypothèse que des modiἀcations hormonales étaient en cause,
mais ne sont pas parvenus à le démontrer [9].
En réalité, on sait que les résistances périphériques jouent un rôle central dans le
mécanisme de l’hypertension et que celles-ci sont pour l’essentiel localisées dans la
microcirculation. Il a ainsi été démontré que des phénomènes de raréfaction artériocapillaire interviennent de façon décisive dans l’installation d’une HTA et qu’ils apparaissent à des stades extrêmement précoces de l’histoire naturelle des hypertendus.
Avec le Pr Bernard Lévy du Laboratoire d’imagerie de Lariboisière, nous avons
lancé une étude en vue de déceler une éventuelle association entre la survenue d’une
HTA et un phénomène de raréfaction capillaire chez les patients qui reçoivent un
traitement anti-angiogénique. Après 6 mois de traitement par le bévacizumab, une
élévation des chiffres tensionnels a été observée chez tous les patients inclus (n = 18).
Surtout, leur exploration à l’aide d’une technique de vidéocapillaroscopie pleine peau
au niveau du doigt a montré une diminution dose-dépendante de la densité capillaire
(tableau 1 et ἀg. 3) [10, 11]. Nos observations ont été confortées par une étude aboutissant aux mêmes résultats avec un inhibiteur de la tyrosine kinase, le télatinib [12].
Dans cette même étude, l’utilisation du laser-Doppler nous a également permis
d’établir l’existence d’une dysfonction endothéliale majeure avec inhibition totale de
la vasodilatation induite par la pilocarpine associée à la prise de bévacizumab [11].
T ableau 1. Évolution de la densité capillaire de la peau du dos des doigts avec le bévacizumab (d’après
Mourad, et al. [11]).
n = 18
Ligne de base
6 mois
p (test de S tudent)
PAS (mmHg)
129 ± 13
145 ± 17
0,0001
PAD (mmHg)
75 ± 7
82 ± 7
0,0001
Densité capillaire initiale
84 ± 13
75 ± 12
0,0001
Densité capillaire maximale
90 ± 13
81 ± 11
0,0001
PAS : pression artérielle systolique ; PAD : pression artérielle diastolique.
102
Réduction de la densité capillaire
observée à 6 mois (nbre de cap/mm2)
25
20
R2 = 0,43 p = 0,008
15
10
5
0
0
2000
3000
4000
1000
Dose cumulée de bévacizumab
5000
Figure 3. Effet dose-dépendant du bévacizumab sur la réduction de la densité capillaire cutanée.
(Reproduit avec l’aimable autorisation de Mourad, et al. [11]).
hype rtens ion : facteu r préd ict if de l’act iv ité
du t raitement
Un travail présenté à l’American Society of Clinical Oncology (ASCO) de 2005
a cependant apporté de nouveaux éléments susceptibles d’attirer l’attention des
cancérologues sur la question de l’hypertension associée à la prise d’anti-angiogéniques : il montrait que la survie de patients recevant du bévacizumab et de la
gemcitabine en traitement d’un cancer du pancréas était corrélée de manière signiἀcative à l’élévation précoce des chiffres tensionnels (p = 0,007) [13]. L’HTA apparaît
ainsi comme un marqueur précoce d’activité et d’efἀcacité antitumorale du bévacizumab (tableau 2).
T ableau 2. Taux de survie en fonction de la survenue d’une HTA précoce (d’après Friberg, et al. [13]).
Cohortes
n
S urvie (mois)
IC à 95 %
Sans HTA
40
8,7
7,3-9,7
HTA précoce
6
13,7
9,6-inἀni
Tous patients admissibles
46
9,0
7,7-10,5
103
Jean-Jacques Mourad
Le Pr Olivier Rixe a également publié, en 2007, une étude montrant que l’apparition d’une HTA était signiἀcativement associée à une meilleure réponse au sunitinib
chez des patients atteints d’un cancer du rein métastatique. L’apparition d’une HTA
de grade 3 selon la classiἀcation NCI-CTCAE chez 22 % des patients était associée
à une meilleure réponse au traitement anti-angiogénique [14]. Enἀn, ces résultats
viennent d’être conἀrmés par une étude incluant des patients traités par le bévacizumab, souffrant de cancer du côlon métastatique. Un tiers des patients environ
présentait une HTA. Or, des taux de réponses de 75 % et une médiane de survie de
13,7 mois ont été obtenus chez les patients hypertendus contre respectivement 32 %
et 8,7 mois chez les normotendus [15].
V e rs des re comm and at ions
La question d’un risque accru d’hypertension iatrogène est-elle réellement cruciale
quand le traitement en cause permet un gain d’espérance de vie ? Dans les faits,
les cancérologues ne s’en sont vraiment préoccupés qu’à partir du moment où la
Food and Drug Administration (FDA) a interdit l’utilisation du bévacizumab en cas
d’HTA ou de protéinurie importante.
Cette décision a cependant pu avoir des répercussions signiἀcatives sur la mise
en œuvre des traitements, une hypertension artérielle et/ou une protéinurie pouvant
retarder l’administration du traitement anti-angiogénique.
Pour cette raison, des recommandations pour la prise en charge de l’hypertension artérielle et de la protéinurie chez les patients devant recevoir des anti-VEGF
viennent d’être élaborées par différentes sociétés savantes (Société de néphrologie,
Société française d’hypertension artérielle, Association pédagogique nationale des
enseignants de thérapeutique et Fédération francophone de cancérologie digestive). L’essentiel de ces recommandations peut être résumé en quatre points [16] :
––il n’y a pas lieu de retarder l’administration d’une première dose d’un traitement
anti-angiogénique en raison de l’existence d’une HTA observée en ambulatoire ou
de chiffres de pression artérielle élevés constatés en hôpital de jour (hors urgence
hypertensive, exceptionnelle) ou d’une protéinurie (hors protéinurie massive,
exceptionnelle) ;
––un patient devant recevoir une première administration d’un traitement anti-angiogénique doit en bénéἀcier dans l’immense majorité des cas, quelle que soit sa pression artérielle le jour où il est admis pour recevoir ce traitement ;
––il n’y a pas lieu d’administrer un traitement antihypertenseur oral ou par voie
veineuse avant administration d’un traitement anti-angiogénique, même si les chiffres de pression artérielle mesurés à cette occasion sont élevés ;
––le patient devant recevoir une première administration d’un traitement anti-angiogénique n’a pas de raison particulière de présenter une urgence hypertensive, exceptionnelle. Celle-ci, si elle existe, doit être prise en charge par une équipe spécialisée.
104
Fondamentalement, l’objectif est d’éviter qu’une chimiothérapie planiἀée soit
reportée au prétexte qu’une pression artérielle systolique est jugée trop élevée alors
que ces patients seront probablement de bons répondeurs. La mesure de la pression
artérielle est fréquemment effectuée sur le site de la chimiothérapie, c’est-à-dire dans
des conditions non satisfaisantes, et il est préférable que les patients puissent bénéἀcier d’une mesure au domicile. Nous tentons actuellement de promouvoir l’automesure tensionnelle au domicile, sans le stress de l’hôpital de jour en cancérologie.
Bibliographie
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105
© 2009 Wolters Kluwer Health. All rights reserved
Introduction
Pierre Godeau
The concept of angiogenesis and anti-angiogenesis is probably one of the most
important advances in our assessment of physiopathological processes and also an
example of progress in our understanding of physiological development. It is for this
reason that the decision was made nearly 4 years ago to devote one of the Institut
Servier meetings to this topic, particularly as it covers the majority of medical disciplines and can be considered as what is nowadays known as a transversal theme.
Although the potential use of an anti-angiogenic treatment for cancer was ἀrst
mentioned by Folkman nearly 37 years ago (1971), it is in the last 5 years that therapeutic trials in two opposing domains have multiplied:
––use of pro-angiogenic medications in ischemic disease, mainly critical lower-limb
ischemia and coronary disease, with the as yet unconἀrmed hope of blocking the
process of restenosis after angioplasty and/or stent implantation;
––use of anti-angiogenic therapies in the treatment of cancer, with three drugs
currently available: bevacizumab (Avastin ®), sorafenib, imitinib). Particularly in
metastatic renal cancer, the achievements are unquestionable, with successful albeit
less spectacular results in colorectal cancer, non-small cell lung cancer, and hepatocellular carcinoma. Although the activity of anti-angiogenic agents in monotherapy
is not to be discounted, it proves most interesting when coupled with chemotherapy.
The mechanism of angiogenesis is as follows: it functions just as well in disease
situations as in healthy adults by awakening quiescent endothelial cells, thus promoting neovascularisation. An example is that of extended muscular exercise where
local hypoxia, resulting from an increase in local oxygen consumption, is compensated by capillarogenesis.
VEGF (vascular endothelial growth factor) performs as well in physiology, as an
embryonic and postnatal vascular growth factor, as it does in different pathologies,
especially in the development of tumor angiogenesis. The VEGF system is however
complex, and comprises several isoforms and at least two receptors, including a
soluble receptor which plays an inhibitory stabilising role. In addition, the VEGF
system is dependent on a transcriptional hypoxia-inducible factor, HIF1. The VEGF
receptors have a tyrosine kinase activity, a feature which foresees additional possibilities for pathophysiological and therapeutic research. The link between VEGF and
109
Pierre Godeau
plasminogen activators is also an important feature: the possible interaction with
thrombotic phenomena must not be ignored.
Within the ἀeld of neovascularisation, the processes of angiogenesis, arteriogenesis, and vasculogenesis should not be put on the same level [1]. Lastly, angiogenesis
is not independent of lymphogenesis or neurogenesis.
Although anti-angiogenic therapy is generally well tolerated, and notably devoid of
myelotoxicity, it is nevertheless associated with cardiovascular and renal side effects
(arterial hypertension, proteinuria), related at least in part to the reduced nitrogen
monoxide production observed during anti-VEGF treatment, and potentially serious
side effects are known to occur in coronary patients or those with peripheral arterial
disease. On the other hand, even though the neovascularisation inhibitor effects of
anti-angiogenic agents appear promising and are currently being studied in diabetic
retinopathy and age-related macular degeneration, the potential risk of a counter
effect from pro-angiogenic agents used in vascular ischemic disease in patients with
one of these ocular diseases cannot be ignored. The non-permeability of the ocular
environment in remotely or systemically administered treatments would however
appear to provide protection from such effects although the downside of the positive
results observed with anti-angiogenic agents is that they currently require intravitreal
injection [2].
One major disadvantage of anti-angiogenic treatment remains: by inhibiting endothelial cells activated by VEGF and by respecting the normal endothelium, including
quiescent cells, these agents are known to provide short-term efἀcacy against tumor
growth, but can this effect be maintained over the long term? Numerous factors indicate that nothing is less certain: mutation of growth factor receptors rendering them
insensitive to inhibitors, the survival strategy of tumor cells that escape treatment,
and the intervention of other unidentiἀed tumor growth factors [3].
It is for this reason that, with our present level of knowledge, anti-angiogenic
factors must not be left to “go it alone”, but rather be used in combination with and
as a supplement to traditional treatments, namely chemotherapy and radiotherapy.
We hope that during the course of the day, which has largely been organised by
Pierre Corvol, our still basic understanding of the vast domain of angiogenesis will
beneἀt from an update and from reḀexion built on the perspectives of promising,
though still insufἀciently validated, therapeutic advances.
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Tribute to Roger Luccioni
For the last 3 years Roger Luccioni had been helping to organise the Institut Servier
Symposium on Angiogenesis and Anti-angiogenesis, and I would like to take this opportunity to pay tribute to my friend of nearly 30 years who sadly passed away on 9th April
2008, a month before his 74th birthday. Cardiologist, Specialist and Head Physician at
the CHU Nord in Marseille since 1979 and full Professor since 1981, he taught the
classe exceptionnelle from 1997. Roger had a brilliant scientiἀc career, backed by
almost 500 publications, earning the respect of his peers. He had the honour of holding
the position of Vice Dean of the Faculty of Medicine in Marseille from 1997.
I will not dwell on his hospital and university career here, but would like to share
with you some facets of Roger’s engaging personality. First, his sense of friendship
and loyalty to his friends and alumni were in the purest Corsican tradition, where the
spoken word is above suspicion and friendship is considered a sacred bond. During
the many years I was privileged to chair the 53rd Section of the National University
Board, our friendship deepened. I particularly appreciated Roger’s Ḁair for synthesis,
his sound judgment and sense of fairness. He assessed our PU-PH applications [for
University Professor & Hospital Consultant posts] with objectivity and benevolence,
never subservient or petty-minded.
Roger’s second marked attribute was his devotion to his family. He and AnneMarie d’Estienne d’Orves, mother of his two youngest daughters, Marie-Dominique
and Julie (born in 1986 and 1987) formed an exemplary couple. The health problems
they both suffered in turn, and which I witnessed as friend and medical adviser, were
overcome with courage, optimism and determination which only a genuine bond can
achieve.
But it is impossible for me not to mention Roger’s other sides which are likely to
be less familiar to scientiἀc circles.
Roger was very keen on football. I remember one meeting of the Cardiology Society
(or rather of the therapeutic subsidiary he chaired) which was held in Ajaccio on the
day that Olympique de Marseille won the European Cup. Roger, who was in charge
of this scientiἀc meeting, arranged for us to watch the match on TV. As Deputy
Mayor of Marseille, he was duty bound to show support for the Marseille FC, but I
found out while I was there that as a Junior player in 1950, he became champion of
Provence and had remained a football fan ever since.
Actually, the most surprising aspect of Roger’s personality is his impressive musical culture. Since his teens he was a well-known double-bass player on the Marseille
111
Pierre Godeau
jazz scene. In 1956 he founded the Jazz Hip review, and not only as a double-bass
player but also as a composer, was involved in concerts, music circles and tours,
producing several albums and composing ἀlm music. In 2006, despite his hectic
lifestyle and already worrying state of health, Roger’s trio brought out a new album
entitled Douces pluies, reḀecting his enduring passion for jazz.
In 2006, at a meeting of Marseille’s National Academy of Medicine, Mayor JeanClaude Gaudin, who knew of our friendship, told me how much he admired what
Roger was doing as Head of Culture for the city of Marseille, but also expressed
concern about his state of health.
With the death of Roger Luccioni, the Institut Servier has lost one of its Scientiἀc
Board’s most energetic and prestigious members. He was made Knight of the National
Order of Merit for France, and was awarded several academic distinctions (Chevalier
de l’ordre des Palmes académiques and Chevalier de l’ordre des Arts et Lettres). At
last year’s meeting, he presented an outstandingly brilliant paper at the Functional
Dependence Symposium, although sadly we were unaware that it was to be his last
ofἀcial contribution to an Institut Servier event.
I would like to request a minute’s silence to mark our respect for our departed
friend.
Professor Pierre Godeau
112
Molecular bases of physiological
and pathological angiogenesis
Pierre Corvol
BLOOD VESSEL FORMATION
Development of the vascular system during embryogenesis occurs in two distinct
stages: vasculogenesis and angiogenesis. During vasculogenesis, progenitor cells
differentiate into endothelial cells from mesenchymal cells, then assemble and form
a primitive vascular network. Angiogenesis, which follows vasculogenesis, extends
and reshapes the primitive network in order to establish a mature and functional
circulatory system.
In healthy adults, angiogenesis occurs mainly during the ovarian cycle and pregnancy. It also contributes to the development of collateral circulation during physical
exercise, in which case it is referred to as arteriogenesis. In pathological conditions,
angiogenesis is involved in tumor growth, in ocular disorders, such as age-related
macular degeneration and diabetic retinopathy, in wound healing, and in inḀammatory diseases, such as rheumatoid arthritis or psoriasis [1].
NEW VESSEL CONSTRUCTION: VASCULOGENESIS
Vasculogenesis results in the formation of a primitive capillary plexus. Due to the
action of VEGF (vascular endothelial growth factor), progenitor cells, called angioblasts, which are located in the stroma, give birth to endothelial cells. These endothelial cells organise to form primitive capillary tubes of a section usually made up of
3 cells. At this stage, the primitive capillary plexus is unable to react to variations in
blood Ḁow.
For a long time researchers thought that the phase of vasculogenesis did not occur
in the adult organism. In reality, progenitor cells, particularly those housed in bone
marrow, can be activated by growth factors, cytokines or hormones which promote
the proliferation, differentiation and mobilisation of cells in order to develop new
vessels. This recently described process is at the root of new therapeutic regimens,
known as pro-angiogenic regimens, which are used in cell-based therapies. They
113
Pierre Corvol
are currently being studied in the context of cardiology and could be used to restore
ischemic vessels during myocardial infarction and lower limb arthritis [1].
VASCULAR REMODELLING OF THE PRIMITIVE CAPILLARY
NETWORK: ANGIOGENESIS AND ARTERIOGENESIS
Angiogenesis and arteriogenesis together make up the phase of vascular remodelling
of the primitive capillary network emerging from vasculogenesis.
This process is controlled by different factors which have been widely studied in
medical literature; as such, they comprise different directions for the development
of pro-angiogenic or anti-angiogenic treatments. Angiopoietine 1, PDGF (platelet
derived growth factor), TGF-β (transforming growth factor β), and P1GF (placenta
growth factor) are involved in the recruitment, migration, and organisation of mature
vessels that will ultimately be capable of vasodilation or vasoconstriction in such a
way as to regulate blood Ḁow. It is important to point out that the organisation of the
vascular network is controlled by both genetic and hemodynamic parameters. Blood
Ḁow participates actively in vessel formation and in the differentiation into arteries and veins. In this way, inḀuenced by the blood Ḁow traversing the vessels, the
endothelial cells lead the surrounding mesenchymal cells to proliferate, migrate, and
differentiate into perivascular cells, for capillaries, and into smooth muscular cells,
for arteries and veins [1].
MECHANISM OF ACTION OF VEGF
It is impossible to mention VEGF without paying tribute to Jean Plouet who, with
Napoleone Ferrara, discovered this growth factor in San Francisco in 1988. Sadly,
Jean Plouet died in 2008 and his role in the discovery of VEGF is still poorly recognised outside the French medico-scientiἀc community.
VEGF plays a central role in angiogenesis. It is a cytokine with paracrine action,
which means that the factor acts on endothelial cells adjacent to cells where synthesis takes place. The interaction of VEGF with its receptors, expressed by endothelial
cells, triggers a series of reactions which lead to the creation of a new vessel from
the parent vessel.
Initially, VEGF causes a loss of contact between endothelial cells and pericytes,
and vascular permeability increases (VEGF was initially named vascular permeability factor by Dvorac). This permeabilisation releases serum and plasma proteins
which contribute to the formation of an extracellular matrix into which the new
vessel is integrated. The basal membrane of the parent vessel is then destroyed by the
effects of collagenases, proteases, and plasminogenic activators. Endothelial cells
are released and their proliferation leads to the formation of a new vessel sprouting
from the parent vessel [1].
114
VEGF AND VEGF RECEPTORS
The VEGF family is made up of VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D and P1GF.
The effect of VEGF is mediated by 3 tyrosine kinase receptors named VEGFR-1,
VEGFR-2 and VEGFR-3. The binding proἀle of VEGF to these receptors is not
speciἀc:
––VEGFR-1 binds VEGF-A, VEGF-B and P1GF;
––VEGFR-2 binds VEGF-A, VEGF-C and VEGF-D;
––VEGFR-3 binds VEGF-C and VEGF-D [2, 3].
VEGFR-1 and VEGFR-2 receptors are mainly found in the vascular compartment
of the plasma membrane in endothelial cells. We have seen that these factors play
a central role in the physiology and pathology of the vascular system, in particular
vasculogenesis and angiogenesis, two mechanisms which result in the formation of
new blood vessels directed toward an angiogenic stimulus. VEGFR-2 interacts with
neuropilin 1, a protein that itself has semaphorin as a ligand. The very term neuropilin indicates that the molecule was discovered in the nervous system. There it takes
part in guidance processes which have the interesting characteristic of being shared
by both blood vessels and nerves. The term semaphorin emphasizes that this ligand
guides the vessel on its journey, like a semaphore.
The structure of the VEGFR-1 receptor is similar to that of the VEGFR-2 receptor,
but is characterised by its capacity to split and yield a circulating, soluble part, which
acts as an anti-VEGF. This soluble receptor 1 is a VEGF-trap capable of inactivating
neighbouring or circulating VEGF endothelial cells. It would appear to have a role
in the ἀnely regulated angiogenesis—anti-angiogenesis processes, during pregnancy
for example, to order angiogenesis to come to a halt. Clinical evidence supports the
hypothesis of an excess of VEGFR-1 in gravidic toxaemia where it would appear
to bring about placenta ischemia by inactivating VEGF and rarefying the vascular
network.
The lymphatic vascular system is controlled by VEGF-C and D and their receptor
VEGFR-3, which is a separate VEGF system from that found within the vascular
compartment. The general organisation of this control is nonetheless relatively similar and it is legitimate to presume that speciἀc anti-VEGF strategies could be implemented, especially to prevent metastases spreading via the lymphatic system.
CELLULAR AND INTRACELLULAR EFFECTS OF VEGF
Activation by VEGF of its receptor leads to a whole series of cellular and intracellular events. At the intracellular level, VEGF plays a part in the production of nitrogen
monoxide (NO). VEGF inhibition leads to an elevation in arterial pressure by reducing the endothelial production of NO, a tonic vasodilator agent, and thus, increasing
vasoconstrictor tonus.
115
Pierre Corvol
Macrophages, dendritic cells, and progenitor cells are also affected by VEGF, which
causes the proliferation and migration of endothelial cells, upon which it also has an
antiapoptotic effect. It inhibits dendritic cells and mobilises progenitor endothelial
cells.
ANTI-VEGF STRATEGIES
VEGF can be inhibited by anti-VEGF antibodies, soluble VEGFR-1, an aptamer, or
VEGF tyrosine kinase inhibitors (ἀg. 1) [4]. Pegaptanib, an aptamer, is already used
in the treatment of age-related macular degeneration. The VEGF tyrosine kinase
inhibitors, which have the advantage of being administered orally, are already used
in anticancer treatments and, in all probability, have a promising future.
The range of anti-VEGF strategies raises the question of therapeutic choice and,
more particularly, of its speciἀcity. An antibody is extremely speciἀc and will act
speciἀcally on VEGF-A, but not on VEGF-B, C or D. On the other hand, a tyrosine
kinase inhibitor will act on several receptors with tyrosine kinase activity. Is this an
advantage or a disadvantage? Tyrosine kinases may be involved in cell proliferation
and it may prove interesting to have an inhibitor capable of targeting poly-tyrosine
kinases and poly-growth receptors. The question remains open.
Aptamer
VEGF-R1
soluble
VEGF
lgG-like domain
TKI
Tyrosine-kinase
domain
Ac anti-VEGF
VEGF-R2
VEGFR
TK
inhibitors
TKII
Cell signalling
Figure 1. Anti-VEGF strategies (reproduced with permission from Corvol and Postel-Vinay [4]).
116
PLEIOTROPIC VEGF EFFECTS
VEGF has extremely varied functions including an important role in physiology and
human disease states; its involvement in tumor development, inḀammationand atherosclerosis has been demonstrated. In experimental conditions, anti-VEGF treatment has
been shown to have a stabilising effect on the microcirculation of the plaque.
VEGF contributes to vascular growth and also acts on the nervous system as a
neurotrophic factor. It is involved in cartilage growth, ovarian angiogenesis, and
glomerular organisation and function [5].
ROLE OF HYPOXIA IN ANGIOGENESIS
Life relies on oxygen. In the Permian age, approximately 250 million years ago,
the partial pressure of oxygen in the atmosphere was approximately twice as high
as it is today. Nowadays, only small organisms such as insects can survive without
a vascular system, ensuring their requirements by the simple diffusion of oxygen.
However, because of the elevated oxygen pressure during the Permian age, there
were giant dragonḀies with wingspans of approximately 1 metre, but that had no
vascular network.
Oxygen is the key to our existence. It is transported by the vascular system and
disseminated via the vessels into the surrounding tissues, and yet the partial oxygen
pressure rapidly decreases as it moves away from the vessel. This hypoxic state
requires the intervention of adapted and co-ordinated cellular responses that are
guided by one essential factor, HIF (hypoxia-inducible factor), which conducts and
co-ordinates the responses to hypoxia within the cells and throughout the entire organism. In a hypoxic situation, HIF passes cells from aerobic metabolism to anaerobic
metabolism; this is far less efἀcient in terms of energy production but essential for
cell survival. HIF also activates the formation of new vessels which supply oxygen
to hypoxic territories. Finally, the same HIF causes vasodilation of the vessels thus
improving distribution of haemoglobin and increasing erythropoiesis, etc [6].
At the present time, approximately one hundred genes are known to be activated by
the effect of HIF and a similar number repressed.
ANGIOGENIC AWAKENING IN TUMOR PATHOLOGY
Tumor growth depends on the formation of new vessels to ensure oxygen and nutriment supply, and also the evacuation of metabolic waste. Pathological neovascularisation develops in hypoxic conditions and particularly under the control of VEGF
and its receptor VEGFR-2.
It was in 1971 that Judah Folkman presented the idea of blocking angiogenesis to
deprive tumors of oxygen. The enormous advantage of this inspired hypothesis was
that researchers from very varied horizons began studying this ἀeld. Following the
117
Pierre Corvol
Cancerous vessels
Normal tissue
Cancerous tissue
Anti-angiogenic
treatment
Normal vascularisation
Organised stable vascular network
Controlled permeability
Presence of quiescent pericytes
Regulated blood flow
Tumor vessels
Regression
of tumor
vessels
“Normalisation”
of vascularisation
(Improved distribution
of anti-cancer treatments,
increased sensitivity to
radiotherapy)
Disorganised unstable vascular network
Increased permeability
Elevated interstitial pressure
Arterio-venous shunts
Pericyte insufficiency
Non-regulated blood flow
Figure 2. Tumor vascularisation and anti-angiogenic treatment (reproduced with permission from
Corvol and Postel-Vinay [4]).
initial success, the usual doubts and questions have arisen. Scientists have suggested
that in reality, anti-angiogenic agents probably cause tumor vessels, which are
known to be characterised by a disorganised, unstable vascular network, increased
permeability, and arterioveinous shunts, to regress. On the other hand, they would
appear to “normalise” vascularisation. It has been suggested that anti-angiogenic
agents cause anarchic and inefἀcient tumor vessels to regress, thus promoting their
reorganisation, which in turn improves not only penetration of cytotoxic drugs but
also sensitivity to radiotherapy, which is highly dependent on good oxygenation.
This would explain why, in contrast to mice, anti-VEGF therapy alone has never
demonstrated an a ntitumor effect in man (ἀg. 2).
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Anne Eichmann
The vascular system is the ἀrst of the major systems to develop during ontogenesis.
During its development, the blood vessels extend to precisely speciἀed targets, resulting in a highly stereotyped vascular tree. How does the embryo form such a complex
and structured system that reaches a total length of 80 000 km in adult humans? We
hope that by increasing our knowledge of the mechanisms at work, we can achieve a
better understanding of the numerous diseases affecting the vascular system.
THE VASCULAR AND NERVOUS NETWORKS ARE CLOSELY RELATED
Five hundred years ago, Vesalius drew the human vascular tree by candlelight. The
Belgian anatomist had already observed that it was totally superimposable on a
second tree forming the nervous system (ἀg. 1). These two systems, one which irrigates the entire organism and the other which controls its sensory-motor systems,
must interact closely. Nerves need oxygen and nutrients and are therefore covered
by a dense vascular network. Similarly, motility and the maintenance of vascular
tonicity require innervation. Thus, the arteries are surrounded by a ἀne network of
post-ganglionic sympathetic nerves.
Both systems also branch throughout the body to convey directional information:
the arterial and venous Ḁow of the vascular system and the motor and sensory pathways of the nervous system. In addition, they are both composed of two types of
intimately associated cells: endothelial cells and vascular wall cells in the vascular
system, and neurons and glial cells in the nervous system.
VASCULAR GROWTH FACTORS AND DEVELOPMENT
OF THE NERVOUS SYSTEM
The vascular and nervous systems not only interact anatomically and functionally,
they also have molecular signaling pathways in common that enable their coordinated development. The intervention of vascular growth factors in nervous system
development has been observed in mice in which the response element to hypoxia
in the VEGF promoter was deleted. Researchers were surprised to observe that the
sclerosis that the animal developed was very similar to human amyotrophic lateral
119
Anne Eichmann
Figure 1. These drawings, dating from 1543, show that the Belgian anatomist Vesalius had already
observed that the vascular (left) and nervous (right) trees are superimposable.
sclerosis. Numerous subsequent studies have shown that VEGF has a neurotrophic
action. Our contribution to this area, in collaboration with Jean-Léon Thomas of
INSERM U711, concerns the study of a growth factor called VEGF-C, which is
related to VEGF, and is involved in neural development.
VEGF-C AND THE DEVELOPMENT OF NERVOUS AND VASCULAR
SYSTEMS
VEGF-C and its receptor, VEGFR-3, are involved in the development of lymphatic
vessels. The LacZ reporter inserted in the VEGFR-3 gene colours all the vessels that
express this receptor blue. This reporter showed that the VEGFR-3 receptor is present
in the lymphatic vascular system, but is not expressed in the veins. The VEGFR-3
receptor is, therefore, speciἀc to the lymph vessels. The use of the LacZ reporter has
also shown that this receptor is present in the brain of adult mice. As the brain has
no lymphatic system, the receptor is expressed by neuron populations. This ἀnding
120
probably explains the action of VEGF-C on the nervous system. In fact, we have
shown in vitro that the progenitors of embryonic neurons expressing the VEGFR-3
receptor divide and proliferate when subjected to VEGF-C stimulation [1]. VEGF-C
is expressed in both neural and vascular systems and most likely regulates the parallel paths of neural and vascular development. This observation raises the possibility
that anti-angiogenic treatments could have a neurological impact.
CAPILLARY GROWTH IS GUIDED BY HYPOXIA
How is capillary guidance assured? The mouse retina is an extremely valuable
model for studying the vascular system. It has helped to demonstrate that angiogenesis is dependent on hypoxia. Hypoxia attracts vessels by increasing the expression
of VEGF, whereas oxygen decreases VEGF in a feedback loop that directs vascular coverage and oxygenation of the tissue. If we look speciἀcally at the capillary
extremity which penetrates the hypoxic areas, we observe that it is composed of
specialized endothelial cells, tip-cells, which are distinguished by their ability to
extend several specialized ἀlopodia, i.e. small actin-rich structures that can polymerize and depolymerize. The tip-cell also expresses the highest levels of the VEGFR-2
receptor. It will therefore have the greatest response to VEGF, and for this reason, it
is probably a preferential target for anti-angiogenic treatment.
THE tip-cell GUIDES capillaRY PROGRESSION
In the retina, capillary formation occurs according to a VEGF gradient, which is
highest in the hypoxic region and lowest in the normoxic region. When close to the
hypoxic region, the tip-cell forms ἀlopodia while the cells located at the rear form
the capillary lumen and provide the blood, oxygen and nutrient supply. Why do these
two types of cells behave in different ways? It has been shown that a mutation of a
Notch gene ligand, Dll4 (delta-like ligand 4), disrupts the selection of tip-cells. In
Dll4 heterozygous animals, each endothelial cell behaves like a tip-cell and extends
ἀlopodia. This means that each of the endothelial cells has the potential to evolve
into a tip-cell but, under normal conditions, this potential is inactivated by the action
of Dll4 on the Notch receptor expressed by the adjacent cell.
delta-Notch SIGNALING contrOls the formation OF tipcells
Schematically, VEGF produced by hypoxic cells binds to its VEGFR-2 receptor on
the tip-cell. It has been shown that this binding induces expression of Dll4 by the tipcell. Dll4 will then bind to the Notch ligand expressed by cells located at the rear of
the tip-cell. The action of the Notch ligand will then modulate the expression of the
121
Anne Eichmann
VEGF receptor in the cell to reduce its sensitivity to VEGF. Seven articles published
in late 2006 and 2007, including one by our team, reached the same conclusion: deltaNotch signaling suppresses the formation of tip-cells [2-8]. Remarkably, this signaling pathway, which is operational in the embryo, is also operational in tumor vessels.
This observation suggests the possibility of blocking tumor vasculature by generating
an excessive number of tip-cells to prevent the formation of a vascular structure.
SimilaritIES BETWEEN THE tip-cell AND THE axonal GROWTH
CONE
The tip-cell shows remarkable similarities with a terminal structure of axons called
the axonal growth cone (ἀg. 2). Like the vessel, the axon has a motility structure at
its extremity that extends ἀlopodia, which polymerize and depolymerize to guide the
axon to a remote target in the body. We currently know of four families of ligands
and receptors that guide axons to their target. These ligands are the ephrins, the
semaphorins, the slits and the netrins and they bind to families of receptors expressed
by the axon ἀlopodia and attract or repulse the growth cone. It is remarkable that
Figure 2. The endothelial tip-cell in the mouse retina (left) and the axonal growth cone extending ἀlopodia (right) will guide the neo-vessel or axon to a remote target in the organism.
122
amongst the four receptor families that guide axons, several are also expressed in
endothelial cells and in tip-cells. In particular, this is the case for the Eph4 receptor
and its ligand B2 ephrin, for the plexine-D1 receptors and neuropilin which bind the
semaphorins, for robo4, a member of the slit receptors, and for the netrin receptor,
UNC5B [9-14 ] (ἀg. 3).
Uninjected
Netrin-1
Figure 3. Netrin-1 promotes the retraction of ἀlopodia and inhibits the growth of blood vessels
expressing UNC5B [12, 13].
INVOLVEMENT OF NETRIN AXONAL GUIDANCE MOLECULES AND
THEIR UNC5B RECEPTOR in VASCULAR SYSTEM MORPHOGENSIS
We are particularly interested in the netrin receptor UNC5B. Netrin is a guidance
factor in bifunctional neuronal growth, meaning that it can both attract and repel
neurons. It binds to two different types of receptors, the attractive DCC receptors and
the repulsive UNC5 receptors. In the vascular system, we have shown that the UNC5B
receptor is expressed by endothelial cells. Knockout embryos that have a deletion of
the UNC5B receptor show increased arborization of the vascular network, which is
compatible with the dual repulsive/inhibitive nature of this receptor [12]. When the
endothelial tip-cells of normal embryos are treated with the ligand receptor netrin,
ἀlopodia extension is inhibited. However, when UNC5B is deleted, the capillary is
no longer repelled or even attracted by netrin. Netrin is therefore an axon guidance
molecule and its UNC5B receptor is involved in the morphogenesis of the vascular
system. UNC5B acts as a repulsive receptor in the vascular network and prevents the
formation of an excess of angiogenic sprouting and branching. Scientiἀc literature
supports attractive-type actions for netrin. This ligand is therefore bifunctional in
both the vascular and the nervous systems.
123
Anne Eichmann
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Postischemic angiogenesis: experimental aspects
and therapeutic perspectives
Unicellular organisms and organisms small enough to rely on the diffusion of gases
and soluble substances do not possess a cardiovascular system. Cell life in such organisms depends solely on the concentration of gases and solutes in the liquid surrounding the cell or microorganism. At the very start of its development, the mammalian
embryo consists of only a cluster of nonvascular cells. However, the development
of a vascular network capable of transporting the Ḁuids and gases necessary for
cell life develops rapidly during embryonic growth. “Vasculogenesis” is the term
that deἀnes the initial embryonic events starting with the migration of endothelial
precursors (angioblasts), which then differentiate and develop locally into tubules of
endothelial cells that form the loosely organized or nonorganized vascular plexus.
“Angiogenesis” is the growth, differentiation and organization of the vascular plexus
into a functional network. This process is characterized by endothelial cells budding
from the extremities and the lateral walls of the existing vessels. Longitudinal division of vessels forms two parallel tubes that then develop independently. These initial
stages of vasculogenesis and angiogenesis lead to the formation of a network mainly
composed of capillaries. It is not until after this stage that the larger-sized elements
(arterioles, venules and arteriovenous anastomosis) are formed by smooth muscle
cells (myogenesis) and the extracellular matrix that strengthens the vascular structures. At the same time, pericytes appear around the capillaries. Finally resistance
arteries and conductance arteries are formed by the development of the media and
then the adventitia. The contractile properties of vascular muscle cells develop last.
All of these events are grouped under the term “arteriogenesis”.
These complex processes require coordination and speciἀc regulation of multiple
activation and inhibition factors which interact with many vascular and extravascular
cell types. These regulatory mechanisms are probably very different from one organ
to another and form very different networks. For example, several anatomical, histological and functional distinctions exist between the vascular networks of the liver,
skin and brain.
This chapter focuses on introducing the basic elements of vascular neogenesis as
triggered in a pathological context, such as ischemia.
125
PRINCIPAL MECHANISMS OF POSTISCHEMIC
NEOVASCULARIZATION
The relative importance of the different processes of vasculogenesis, angiogenesis
and arteriogenesis in the onset of neovascularization associated with ischemia has
yet to be deἀned [1]. However, the three processes undoubtedly act together to establish a functional vascular network. It is likely that arteriogenesis allows a signiἀcant
increase in Ḁow in the injured area and the development of new capillaries (angiogenesis) avoids massive tissue destruction in the ischemic area. Finally, although the
initial stimuli probably differ, vasculogenesis, angiogenesis and arteriogenesis are
activated and modulated, albeit differently, by the same growth factors, chemokines
and proteases.
Postischemic angiogenesis
Hypoxia is the main cause of angiogenesis, which involves HIF-1 (hypoxia-inducible
factor 1) activation.
HIF and VEGF-A
HIF-1 is a nuclear transcription factor that binds to elements of the hypoxia
response in the regulatory region of several genes. Intramuscular injection of a
plasmid encoding HIF-1α reduces infarct size and increases neovascularization
of the ischemic myocardium [2]. Administration of HIF-1α also increases the
regional blood Ḁow, the angiographic score and the capillary density in a hindlimb
ischemia model in rabbits [3]. HIF-1 regulates, in particular, the expression of the
gene coding for VEGF-A [4], which, once secreted, binds to the tyrosine kinase
receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 located on the surface of endothelial cells and
vascular smooth muscle cells. Activation of these receptors triggers multiple signaling pathways which are responsible for stimulating angiogenesis. VEGF-A can
activate cell proliferation and survival by mechanisms dependent on phosphatidylinositol 3’-kinase/Akt [5-7]. Akt may contribute to the angiogenic response
by inhibiting the apoptotic process or by phosphorylating endothelial nitric oxide
synthase (eNOS) so that its activity is sustained independent of calcium. eNOS
also plays a key role in postischemic neovascularization. Mice lacking eNOS show
altered vascular neogenesis in the ischemic area [8]. NO also contributes directly
to the VEGF effect. In the peripheral ischemia model in mice, the angiogenic
response to VEGF requires the presence of eNOS [8]. Similarly, in the infarcted
heart, induction of angiogenesis is dependent on the production of NO [9]. Finally,
the administration of eNOS-+ by gene therapy promotes neovascularization in the
ischemic rat paw, highlighting the importance of NO in the vascular neogenesis
process [10].
126
Oxygen radical species
Oxygen radical species (OFRs, oxygen free radicals), including superoxide anion,
hydrogen peroxide, hydroxyl radical and nitrates, such as NO and peroxynitrite, are
biologically active species stimulating multiple signaling pathways by their redox
potential [11-13]. Each of these species is derived from speciἀc chemical or enzyme
reactions. NADPH oxidases are a predominant source of OFRs in blood vessels
[11, 12, 14]. In endothelial cells, NADPH oxidases are composed of two membrane
subunits, gp91phox (or Nox 2) and p22phox, and two cytosolic components, p47phox and
p67phox. The small G protein, Rac-1, is also necessary for complete enzyme activity.
Rac-1 and gp91phox play a major role in the effect of VEGF-A on endothelial cell
proliferation [15]. Mice lacking gp91phox display an altered post-ischemic neovascularization, further emphasizing the involvement of OFRs in the VEGF-A proangiogenic effect in the ischemic area [16, 17].
Other VEGFs
Hypoxia also induces the expression of other members of the VEGF family. For
example, PlGF (placenta growth factor), which binds to the VEGFR-1 receptor, activates neovascularization in ischemic tissue [18]. The expression of VEGF-B also
increases in the ischemic area and treatment with a plasmid encoding one of the
two VEGF-B isoforms, VEGF-B167 or VEGF-B186, triggers therapeutic revascularization in mice with hindlimb ischemia [19]. In an aortic explants model, the
explants from mice overexpressing VEGF-B167 or VEGF-B186 in the endothelial cells develop strongly, suggesting a direct role for VEGF-B in the angiogenic
process [20]. VEGF-C (or VEGF-2) has been described as a speciἀc ligand for the
endothelial tyrosine kinase receptors, VEGFR-2 and VEGFR-3. In vitro, VEGF-C
has a dose-dependent mitogenic and chemotactic effect on the endothelial cells,
particularly the microvascular endothelial cells. VEGF-C stimulates the release of
NO by the endothelial cells and increases vascular permeability. Finally, the constitutive expression of VEGF-C in the adult animal facilitates angiogenesis in a peripheral ischemia model [21].
“Angiomatrix” proteins
Many other factors (growth factors, transcription factors, hormones and protein
kinases) have the potential to modulate angiogenesis. Furthermore, the number of
factors known to affect vascular neogenesis is increasing daily and some of these
factors are particularly interesting. Several extracellular matrix proteins are associated
with the vascular endothelium and activate angiogenesis by an integrin-dependent
mechanism, but in the absence of the exogenous addition of growth factors. Among
these “angiomatrix” proteins it has been demonstrated that the Del-1 (developmental
endothelial locus-1) protein activates post-ischemic angiogenesis and neovasculari127
zation by binding integrin αvβ5 to the quiescent endothelium, which subsequently
increases the expression of the transcription factor Hox D3 and integrin αvβ3 [22,
23]. Similarly, the Del-1 analogue, lactadherin, is expressed in vascular cells and, by
interacting with integrin αvβ3, modulates the VEGF/VEGFR-2-dependent signaling pathway. Finally, lactadherin interacts with integrins αvβ3 and αvβ5, and, by a
mechanism dependent on Akt, is able to activate the development of new vessels in
an ischemic area in the absence of the exogenous addition of VEGF-A [24].
Postischemic arteriogenesis
Arteriogenesis is the growth of collateral arteries from preexisting arterioarteriolar
anastomoses. Some research groups have compared ischemic postnatal arteriogenesis and the development of collateral vessels (or collateralization); both terms can
be used synonymously. Arteriogenesis is induced by a hypoxia-independent mechanism, which appears to be based on changes in hemodynamic forces that occur in
the collateral vessels following an increase in Ḁow. This increase in the vascular Ḁow
arises from the pressure difference between the preexisting arterioles upstream from
the point of occlusion and those downstream. Arteriogenesis results from the activation and migration of parietal cells and a remodeling of the vascular wall.
The role of shear stress
Chronic increases in shear stress exceed the anatomical restrictions of the collateral
vessels and restore full collateral conductance. Shear stress activates the signaling
pathways that are dependent on Ras-ERK, Rho and NO [25, 26]. The primary physio
logical response to shear stress is endothelial cell activation and a large number of
genes are known to be controlled by shear stress response elements located in their
promoters [27]. Among these are genes coding for enhancer cytokines or chemoattractants which have their expression increased by shear stress. Shear stress increases
MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) at arteriogenic sites and collateralization is increased by treatment with MCP-1 [28]. Similarly, mice lacking the
CCR-2 receptor for MCP-1 have increased muscle atrophy in hindlimb ischemia.
Morphometric analysis shows a reduction in the diameter of collateral vessels under
these conditions [29]. Furthermore, ischemia induced by ligation of the femoral
artery increases the number of inἀltrated cells expressing the CXCR-3 receptor and
the level of expression of its ligands, CXCL-9 and 10. Finally, mice lacking CXCR-3
with hindlimb ischemia have lower angiographic scores and less tissue perfusion
[30].
The role of inἀammatory cells
The increased expression of chemoattractant cytokines activates the inἀltration of
inḀammatory cells into the ischemic area.
128
The migration of macrophages is controlled by the binding of MCP-1 to its
CCR-2 receptor. The monocyte level correlates directly with the rate of neovascularization [31]. CXCL-9 and CXCL-10 attract T cells through interaction with their
CXCR-3 receptor. These T cells also modulate post-ischemic vascular neogenesis.
Post-ischemic néovascularisation is less effective in nude mice lacking T cells or
mice lacking CD4+ cells [32, 33]. Moreover, the absence of CD8 cells decreases the
expression of interleukin 16 (IL-16) and reduces the recruitment of CD4+ T cells in
arteriogenic areas. Exogenous administration of CD8 T cells restores a signiἀcant
IL-16 titer, an adequate number of CD4+ T cells thus activating the development of
collateral vessels [34]. These data suggest the following mechanism: in response
to a vascular occlusion, CD8 T cells inἀltrate arteriogenic areas and recruit CD4
T cells by producing IL‑16. CD4 T cells then partially control the development of
collateral vessels by activating the recruitment of macrophages that release arteriogenic factors. Indeed, the presence of inḀammatory cells is associated with the local
release of several proarteriogenic molecules, such as cytokines, interleukin-2, TNF-α
(tumor necrosis factor alpha), growth factors such as VEGF and metalloproteinases
(MMP) [28, 35].
Cytokines such as interleukin-1β also increase HIF-1α activity, indicating a transcriptional role for HIF-1α in the inḀammatory process [36]. During the inḀammatory reaction, anti-inḀammatory cytokines are produced and modulate the inḀammation intensity. Neovascularization increases in hindlimb ischemia in mice lacking
the anti-inḀammatory cytokine IL-10 [37]. This effect is blocked by treatment with
a metalloproteinase inhibitor, despite the continued activation of VEGF-A [38].
Leukocyte inἀltration of the infarcted heart and collateralization are reduced in
mice lacking the urokinase-type plasminogen activator or MMP-9 [39]. Similarly,
mice lacking MMP-9 show reduced collateralization in a hindlimb ischemia model,
emphasizing the close relationship between inḀammatory cells, arteriogenesis and
metalloproteinases [40].
Postischemic vasculogenesis
Postischemic neovascularization not only depends on angiogenic and arteriogenic
processes, but also on circulating vascular progenitor cells from the bone marrow.
In response to tissue ischemia, endothelial precursor cells are mobilized from bone
marrow into peripheral circulation and migrate to the ischemic tissue. Hypoxia and
the transcription factor HIF-1α, which activates the expression of SDF-1 (stromalderived factor 1), mediate the recruitment of endothelial progenitor cells (EPCs)
expressing CXCR-4 [41]. Mononuclear cells or EPCs from animals heterozygous
for CXCR-4 show a decreased expression of CXCR-4 and a decreased ability to
stimulate tissue reperfusion in nude mice [42]. Local hypoxia also releases chemoattractant soluble factors for circulating EPCs. A potential chemoattractant candidate
129
is VEGF. The VEGF level is increased by hypoxia and it induces SDF-1 in vascular
and perivascular structures [43]. Chemokines and platelets can also capture EPCs
in areas of vascular lesions [30, 44, 45]. Once recruited, the adhesion of EPCs on
the ischemia-activated endothelium is a result of the activity of adhesion molecules
on the surface of endothelial cells, such as integrin β2 and L-selectin [46-48]. After
their recruitment and adhesion to the ischemia-activated endothelium, EPCs promote
vascular neogenesis through various mechanisms (ἀg. 1).
Initially, it was suggested that the progenitors were incorporated into the neovascularization site where the differentiation into endothelial cells ended [49-51].
However, the relative contribution of EPCs to the vasculature is highly variable and
seems to depend on the experimental model, the type and subtype of the progenitors,
and the method of EPC isolation [52-55]. Some experiments even suggest that these
progenitors are not incorporated into the neocapillaries, but instead act as support
cells. Therefore, bone marrow progenitors accumulate around collateral vessels and
differentiate into ἀbroblasts, leukocytes and pericytes, which produce several growth
factors and chemokines [53]. The release of SDF-1 by platelets promotes the mobi-
4
Vascular
lumen
Progenitor
PSGL-1
2
β2
Paracrine potential
VEGF
MCP-1
HGF
PIGF
NO
CXCR4
Selectin
Adhesion
3
Differentiation
potential
SDF-1
ICAM-1
Endothelial cells
Basal
membrane
Chemoattractant
molecules
Necrosis/apoptosis
1
VEGF-A, PIGF
homing signal
Ischemia
Figure 1. After their adhesion to the activated endothelium, vascular progenitor cells can trigger vascular neogenesis by two main mechanisms: through differentiating into endothelial cells and through a
paracrine potential to release proangiogenic and proarteriogenic factors.
130
lization and recruitment of CXCR-4+/VEGFR-1+ around the vascular structures,
which leads to the development of collateral vessels [56]. Similarly, VEGF induces
mononuclear myeloid cell nostocytosis (homing) and allows their perivascular positioning and retention by the activation of SDF-1 [43]. Finally, progenitors derived
from human umbilical cord blood can differentiate into early and late endothelial
progenitors. Early EPCs express monocytic lineage markers and have a strong potential paracrine role in the release of proangiogenic factors, whereas late EPCs express
endothelial markers and have vasculogenic capabilities [57].
Therefore, the primary role of progenitors could be to release angiogenic and
arteriogenic factors and to contribute to vascular genesis through paracrine effects.
Finally, progenitor cells also have a vasoactive potential, which is likely to play a role
in the improvement of tissue perfusion in the ischemic area [58].
THERAPEUTIC PERSPECTIVES
The three main processes (i.e. vasculogenesis, angiogenesis and arteriogenesis) characterize tissue remodeling in response to chronic or acute ischemic vascular disease.
These processes are the target of alternative angiogenic therapeutic strategies for
patients with peripheral arterial disease or coronary disease. Many angiogenic therapeutic strategies based on the administration of growth factors, stem cells, pharmacological molecules or extracellular matrix proteins have been proposed. Although
these strategies have varying potential, those currently being tested in clinical trials
are based on the administration of growth factors or progenitor cells.
Growth factors
Clinical trials involving growth factors are primarily based on the administration of
VEGF-A and ἀbroblast growth factor (FGF) 1 or 2. The failure of the VIVA, FIRST
and TRAFFIC studies suggests that intravascular administration of proteins is insufἀcient to induce therapeutic neovascularization [59-61]. This is undoubtedly related
to the route of administration (intravenous or intracoronary) and choosing to inject
proteins with short tissue half lives. REVASC and Euroinject-1 studies, however, are
based on strategies that transfer genes coding for different VEGF-A isoforms directly
into the ischemic zone. These studies have shown promising results in cardiac function [62, 63]. Preclinical trials have proven the efἀcacy of different growth factors on
vascular neogenesis stimulation in hindlimb or cardiac ischemia models using young
animals without any associated cardiovascular disease risk factors. Inducing a similar
proangiogenic response in elderly patients with pronounced atherosclerotic lesions and
who have no therapeutic alternatives, is a more signiἀcant therapeutic challenge. The
selection of patients who are candidates for a stent or a bypass could increase the efἀcacy and feasibility of proangiogenic therapies and therapeutic angiogenesis could be
131
developed as a complementary therapy to conventional surgical revascularization. For
similar reasons, patients could be selected with symptoms of angina or claudication
as these could signal the presence of ischemic, but still viable tissue that is potentially
capable of responding to revascularization therapy [64]. Finally, the administration
of several growth factors with distinct cellular targets could simultaneously activate
the multiple processes involved in vascular neogenesis. Studies have demonstrated
that coadministration of FGF and PDGF-BB (platelet derived growth factor BB) or
VEGF-A and P1GF is far more effective than the injection of a single growth factor in
cornea or cardiac and peripheral ischemia angiogenesis models [65, 66].
Progenitor cells
Although many experiments suggest the presence of vascular progenitors in other
tissues, such as the heart, adipose tissue or blood, the administration of precursors of
bone marrow origin is the basis for proangiogenic cell therapies [67, 68]. Injection
of endothelial progenitor cells from bone marrow restores the Ḁow and the capillary
density of the skin in hindlimb and cardiac ischemia experimental models in rodents
[69, 70]. Likewise, injection of human EPCs increases the formation of new blood
vessels in the infarcted area [71]. Recent studies have suggested that mononuclear
cells from bone marrow without EPC differentiation or puriἀcation were able to
promote vascular development in the ischemic area [71, 72]. The administration of
bone marrow mononuclear cells from control animals is also effective in experimental models of diabetes and hypercholesterolemia [73, 74]. These cellular therapies are
currently being tested clinically in small cohorts of patients. Autologous implantation
of bone marrow mononuclear cells in the ischemic limb of patients with peripheral
arterial disease or thromboangiitis obliterans improves vascularization and the scarring process [75, 76]. However, a number of these patients have shown side effects or
transient effects [76]. Similarly, intracoronary transplantation of bone marrow mononuclear cells into the myocardium of patients with acute ischemia increases perfusion
and the function of the ischemic tissue [77-79]. Some studies of intracoronary transplantation have also shown transient effects or no effect, underscoring the need for
further analysis of the therapeutic efἀcacy of these stem cell strategies [80, 81]. One
particular issue is that most cardiovascular risk factors, such as diabetes, hypertension or hypercholesterolaemia, reduce the therapeutic potential of adult progenitor
cells, particularly those from bone marrow [17, 73, 82]. Therefore, the development
of strategies for restoring progenitor cell function is essential. For example, pretreatment of EPCs by ephrin B2 results in increased expression of PSGL-1, a selectin
ligand, which improves the ability of EPCs to migrate to the ischemic area and activate vascular development, as shown in a hindlimb ischemia model in mice [83].
Similarly, dual therapy based on the joint administration of two types of progenitor
cells, CBS and smooth muscle progenitor cells (SMPCs), has a better therapeutic
132
effect than when each cell type is injected separately. SMPCs release angiopoietin-1,
which binds to its Tie-2 receptor located on the surface of EPCs, improving EPC
survival and their propensity to form vascular structures [84].
Bibliography
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137
Gene and cell therapy in peripheral arterial
disease
Joseph Emmerich
Critical lower-limb ischemia (CLLI), the most severe form of peripheral arterial
occlusive disease (PAOD), includes symptoms of rest pain resistant to analgesics
lasting more than 15 days, or trophic disorders. The viability of the limb is threatened
and the general prognosis for patients is also compromised with a mortality rate of
around 50% at 5 years [1, 2]. The TransAtlantic InterSociety Consensus (TASC),
which recently deἀned CLLI, highlighted that “CLLI implies the notion of a chronic
condition and must be differentiated from acute limb ischemia” [3, 4]. Assessment
of hemodynamic parameters, by measuring systolic blood pressure index (SBPI), is
fundamental in order to objectively quantify lower limb perfusion. Measurement of
absolute ankle pressure is recommended; to conἀrm CLLI it must be <70 mmHg
and/or big toe pressure must be <30 mmHg and/or transcutaneous oxygen pressure
(TcPO2) must be between 30-50 mmHg. In these conditions, limb salvage through
surgical or endoluminal means is imperative, but not always feasible, due to the lack
of an exploitable recipient route or due to multiple surgical interventions. CLLI is
often associated with diffuse occlusions of the arterial bed with no distal vascularisation. In the latter situation, which represents 20 to 30% of cases, medical treatment remains the only therapeutic possibility before resorting to amputation [5].
The TASC consensus estimates that 10 to 30% of patients with CLLI will die within
6 months and that 25 to 35% will undergo a major amputation [6]. Peri-operative
mortality of amputation ranges from 5 to 10% for leg amputations and 15 to 20% for
amputations above the knee. This happens relatively frequently and is a demonstration of therapeutic failure since to date, no alternate treatment has been shown to be
effective.
The TASC consensus no longer recommends such treatments as posterior cord
stimulation or subcutaneous stimulation in the treatment of CLLI; the consensus also
judges the evidence in favour of lumbar sympathectomy to be inadequate [3].
Several therapeutic trials have studied the use of prostacyclin and its derivatives,
initially by intra-arterial administration and then by intravenous administration. The
results of the ICAI study, the largest randomised trial using a prostacycline derivative, lead to recommending the infusion of prostacyclin derivatives in CLLI patients
138
with a viable limb, in whom revascularisation was impossible, particularly when the
alternative was amputation [6]. Although treatment was shown to be effective after 1
month, the effect was transitory and unfortunately had disappeared after 6 months.
Considering the aforementioned data in the medical treatment of CLLI, where
revascularisation is not a viable option, it is reasonable to state that none of the
currently available treatments can lead to signiἀcant improvement in patients and
ensure leg salvage in critical ischemia [7].
GENE THERAPY
One possible solution that is currently being assessed with a view to avoiding amputation in cases of chronic critical ischemia, may be found in therapeutic angiogenesis,
i.e., the possibility of developing a substitute vascular network. Growth factors, such
as VEGF (vascular endothelium growth factor) or FGF (ἀbroblast growth factor)
induce physiological angiogenesis. However, administering these factors in the form
of recombinant proteins is a difἀcult undertaking. These factors have a very short
half-life and must therefore be used at high doses. Efἀcacy is thus limited due to the
poor tolerability and the risk of systemic side effects at these doses. Gene therapy
allows the insertion and transfer of genes coding for angiogenic growth factors in
the muscle cells of patients with PAOD. The transfected cells then steadily produce
low concentrations of these angiogenic proteins over a period of 1 to 2 weeks. Two
types of vectors are used in clinical practice: viral vectors (adenovirus) and non-viral
vectors (use of bare plasmids or liposome-encapsulated plasmids).
In the early 1980s, Elizabeth Nabel demonstrated the feasibility of gene therapy
as a treatment for vascular lesions and since 1996 gene therapy has been developed
via various different approaches [8]. Research has lead to the discovery of vascular
growth factors, such as VEGF, which have been used in phase 1 trials to promote
angiogenesis in CLLI [9, 10]. These trials have used gene therapy with adenovirus or
bare plasmids coding for VEGF or FGF-1.
The factors were initially administered intra-arterially, but systemic dilution of the
gene transfer and diffuse atherosclerosis limited the efἀcacy. Intramuscular injection
is currently the preferred delivery method. Intramuscular injection of a bare plasmid
has been shown to be feasible; it remains in a non-replicative form, and does not
integrate with the genome, thereby limiting mutagenic risk [11].
The results described demonstrated clinical efἀcacy; however, the lack of
blinded, randomised trials available at this time must be taken into consideration.
The Transatlantic Conference on Clinical Trial Guidelines in Peripheral Arterial
Disease recommends that randomised trials need to focus on such events as the
complete disappearance of pain without analgesics, complete healing, and amputation frequency [12].
139
Joseph Emmerich
To date, no published study has fulἀlled these criteria and, although it seems a
positive association has been found, it is not yet sufἀcient for a complete recovery from CLLI. In addition, premature interruption of the expression of the growth
factor could lead to a regression of the new vascularisation [13]. The results from
the main gene therapy trials in critical ischemia are summarised in Table 1. A total of
just over 300 patients have been included in phase I and II trials. To date, no serious
adverse effects have been reported in the clinical follow-up of this relatively small
number of patients.
The only randomised study was TALISMAN, published in 2008 [14]. In subjects
with CLLI associated with ulcers or gangrene, the study compared the injection of
Table 1. Review of gene therapy trials in critical lower-limb ischemia.
Author
(year)
Treatment
Number of patients
Follow-up
Results
Treated
Control
1
–
12 weeks
Increase in collaterals
(angiogram).
Transient oedema
Baumgartner Plasmid VEGF165
(1998)
intramuscular
9
–
6 months
(angiogram) and SBPI
Isner
(1998)
Plasmid phVEGF165
6
–
?
(angiogram),
improvement in SBPI
Makinen
(2002)
Adenovirus VEGF
intra-arterial
Plasmid/liposome
VEGF intra-arterial
(in combination with
angioplasty)
18
19
2 years
17
19
Adenovirus VEGF
intra-arterial.
(angiogram), no
difference in SBPI.
No difference in clinical
events
Comerota
(2002)
Plasmid FGF-1
intramuscular
51
–
Shyu
(2003)
Adenovirus VEGF165
intramuscular
Isner
(1996)
Plasmid VEGF165
intra-arterial
(polymer hydrogel)
Rajagopalan Adenovirus VEGF121
(2003)
intramuscular
140
6 months
Reduction of ulcers,
increase in SBPI and
TcPO2
(angiogram) and SBPI.
Reduction of pain at rest
and healing of ulcers
24
–
6 months
33
72
6 months
Patients without CLLI
but with intermittent
claudication.
No improvement in
walking distance or
SBPI
Author
(year)
Treatment
Number of patients
Treated
Control
Follow-up
Results
Shyu
(2003)
Plasmid VEGF165
intramuscular, 2
series of injections
with 1 month interval
21
–
6 months
Improvement in pain
and SBPI.
Healing of ulcers and
increase in collateral
Ḁow (angio MRI)
Motyas
(2005)
Adenovirus 5FGF-4
intramuscular
10
3
12 weeks
(angiogram). Impossible
to come to a conclusion
on the efἀcacy because
the study was too small
and the dosage too low
Kusumanto
(2006)
VEGF165
intramuscular
27
27
100 days
No signiἀcant reduction
in amputation frequency,
but improvement in
pain, care of ulcers
Marui
(2007)
bFGF (biodegradable
gelatin hydrogel)
7
–
4-24 weeks
Increased walking
perimeter, improvement
in SBPI, to 4 steps at 24
weeks
34
7
12 months
Feasibility of treatment,
no correlation between
SBPI and prognosis
Rajagopalan Adenovirus HIF-1α
(2007)
intramuscular
CLLI: critical lower limb ischemia; SBPI: systolic blood pressure index; TcPO2: transcutaneous
oxygen pressure
NV1FGF, in 4 treatment sessions at 15-day intervals, to the injection of a placebo. The
results are positive, with a reduction in the risk of amputation in patients receiving
gene therapy. One hundred and twenty-ἀve patients were randomised to either 4 mg
of plasmids coding for FGF-1, for 4 weeks, with the injections at 2 weekly intervals,
or a placebo (saline solution). Injection of the plasmid coding for FGF-1 reduced the
risk of amputation by 50% and the risk of major amputation by 37%. Alongside these
beneἀts, there was a trend towards a reduction in mortality. The TAMARIS study
currently in progress, is expected to conἀrm these interesting results, particularly
because the positive outcomes from the TALISMAN study have been deἀned as
secondary variables in the TAMARIS study design.
CELL THERAPY
In 1997, Asahara discovered the circulating endothelial progenitor cells in human
adults and this revolutionised the concept of postnatal angiogenesis [15]. Several
141
Joseph Emmerich
trials have conἀrmed the existence of these progenitors, their medullary origin, and
their ability to penetrate vascular structures in two models: tumor angiogenesis and
revascularisation of ischemic tissue. Adult endothelial stem cells are a potential
source for endothelium regeneration in the cardiovascular system and would be ideal
for use in autologous cell therapy. This is the process known as vasculogenesis.
Many pre-clinical trials on ischemia models have used cell therapy to induce therapeutic angiogenesis by integration with a new vascular network and/or by the secretion of growth factors [16]. Cell therapy offers several advantages over gene therapy.
First of all, autologous cells are used, thus potentially eliminating the risk of rejection. Additionally, the theoretical risk of gene therapy-induced diseases is reduced.
Such diseases may be either directly linked to the action of the growth factor coded
by the injected plasmid or to the insertion of the plasmid itself (despite all necessary
precautions). The cells used are “stem cells” of medullary origin and the conditions
for their differentiation are still not clearly understood.
Two types of cells have been used in pre-clinical trials: circulating endothelial cells (EPC, endothelial progenitor cells) of monocyte origin (CD14+), known
as early cells but also called CFU-Hill, and EPCs known as late or outgrowth
endothelial cells (CD14–) [17]. Though these cells can induce angiogenesis in vivo
in animal models, only bone marrow mononuclear cells (BMMNC) or peripheral
blood mononuclear cells (PBMNC), after stimulation by G-CSF (granulocyte
colony-stimulating factor), have been used in phase I and phase II clinical trials
in humans. After encouraging results in animal models, the ἀrst study was carried
out in humans in 2002; it used intramuscular injection of medullary autologous
mononuclear cells in patients with chronic critical lower limb ischemia [18]. A
ἀrst group of 25 patients with unilateral ischemia were injected with the medullary
cells in the affected limb and saline solution in the contralateral lower limb. As
these results were very encouraging, a second group of 22 patients with bilateral
ischemia was randomised to medullary cells or blood mononuclear cells, the latter
treatment group being the control group. After 24 weeks, a signiἀcant improvement in all clinical parameters was noted in patients treated with medullary cells
and neo-angiogenesis was conἀrmed on lower limb arteriograms. The treatment
was very well tolerated. Several other studies using the same procedure have since
been published with similar results, a summary of which is shown in Table 2. At
present, more than 600 cell-based therapies have been carried out in humans, with
more than half of the cases reported in publications from Asia. In France, 3 openlabel trials in this indication are currently underway using medullary autologous
mononuclear cells (Amiens, Nantes, Reims, Grenoble, Paris [Hôpital Européen
Georges-Pompidou], Marseilles). A randomised, double-blind, trial (the BALI
study) has been undertaken in France to assess the efἀcacy of this therapeutic
approach on major clinical events including amputation and mortality.
142
Table 2. Review of trials in cell therapy in critical lower-limb ischemia.
Author
(year)
Treatment
(number of
cells)
Injection
Number of
patients
Follow-up
Results
TateishiYuyama
(2003)
BMMNC
IM, calf
45
(0,7-2,9 × 109) 40 × 0,75 mL
24 weeks
(angiogram), SBPI and
TcPO2
Higashi
(2004)
BMMNC
(1,6 ±
0,3 × 109)
IM, calf
7
40 × 0,75 mL
24 weeks
(angiogram), SBPI and
TcPO2 and vasomotricity
Huang
(2004)
PBMNC
(3 × 109)
IM, thigh,
calf and foot
5
12 weeks
Increase in SBPI and
perfusion (laser-Doppler)
Saigawa
(2004)
BMMNC
IM
(6,04 ±
1,58 × 107/kg)
8
4 weeks
Correlation between SBPI
improvement and the
number of CD34+ cells in
the cell therapy product
Huang
(2005)
PBMNC
(3 × 109)
IM, calf
14 treated,
3 months
40 × 0,75 mL 14 control
(randomised
trial)
Increase in SBPI and
perfusion.
78% healing in active
group vs. 39%
Yang
(2005)
PBMNC
IM, foot and
calf
6 months
Pain improvement in 87%
of cases.
Ulcer healing. TcPO2 and
SBPI improved
Kim
(2006)
BMMNC
stimulated
6 intraosseous 27
injections,
tibia
20 months
Moderate pain
improvement.
Healing de 13/17 ulcers.
Increased collaterals
Gu
(2006)
BMMNC
stimulated
IM, intraarterial or
both
5 months
Improvement of pain in
90% of cases.
Healing of 10% of ulcers.
Improvement SBPI, TcPO2
Durdu
(2006)
BMMNC
IM, foot, calf, 28
forearm
20 months
Healing in 83% of cases.
Pain improvement.
Collateral visible on
arteriogram
Miyamoto BMMNC
(2006)
(3,5 × 109)
IM, calf, foot 8
12 months
1 unexplained death,
4 unfavourable outcomes
Saito
(2007)
IM
24 weeks
Reduction of rest pain,
improvement in ulcers
BMMNC
62
35
14
BMMNC: bone marrow mononuclear cells; PBMNC: peripheral blood mononuclear cells after
stimulation by G-CSF; IM: intramuscular; SBPI: systolic blood pressure index.
143
Joseph Emmerich
Huang et al. [19] published a study on a different approach, using PBMNC that
are mobilised by subcutaneous injection of G-CSF at a dose of 600 µg/day for
5 days. On the ἀfth day of stimulation, a sample of approximately 300 mL of
PBMNC was taken and concentrated, then injected into 40 sites on the ischemic
leg for a total injected dose of 3 × 109 PBMNC. The authors randomised 28 patients
with diabetes and CLLI to either PBMNC or conventional treatment, with a follow
up of 3 months. There was a signiἀcant improvement in the main symptoms (pain
and ulcer) in the 14 treated patients. No amputation was performed in the treatment group compared with 5 amputations in the control group (p = 0.007). This
study suggests that the autologous transplantation of PBMNC, after G-CSF stimulation, could also be an effective and reliable procedure for CLLI. An advantage
of this procedure is that neither general anaesthesia nor bone marrow puncture is
required.
A recent anatomopathological study carried out at our centre on patients treated
by cell therapy, demonstrated considerable neovascularisation in vivo. The immuno
histochemical analysis of amputation samples from patients treated with the cell
therapy was compared to that of control patients, amputated during the same time
period and matched according to age and sex. In 3 patients that received cell therapy,
active angiogenesis was observed in the ischemic leg at the distal level, but not in the
leg muscle. All new vessels were positive for endothelial markers (CD31, CD34, von
Willebrand factor) and negative for lymphatic markers (podoplanin). The immunohistochemical markings for Ki 67 and c-kit showed raised endothelial proliferation
in the newly formed vessels [20].
BUERGER’S DISEASE
Cell therapy and gene therapy have both been used in subjects with Buerger’s disease,
which is an occlusive and segmental inḀammation of arteries and of veins, characterised by thrombosis and recanalisation of affected vessels. This non-atheromatous
inḀammatory disease affects small and medium-caliber arteries; diagnosis is made
according to the clinical criteria published by Olin in 2000 [21]: less than 45 years of
age, present or past tobacco consumption, presence of ischemia in distal extremities
(lower and/or upper limbs). In patients with Buerger’s disease, surgical revascularisation can prove difἀcult because the affected area is systematically distal. Therefore,
with the exception of tobacco cessation, the currently available treatments show
limited efἀcacy and cannot guarantee a long-term response or complete recovery.
Isner et al. [22] conducted a phase I clinical study to show the efἀcacy and tolerability of intramuscular injection of VEGF165 in 6 patients with Buerger’s disease.
The results showed that if the treatment was initiated before gangrene developed,
ulcers were seen to heal completely and no amputations were necessary. However,
this study did not have a control group.
144
Cell therapy was used in a pilot study in 8 patients with Buerger’s disease, diagnosed according to Olin’s criteria [23]. The treatment used bone marrow mononuclear cells with a 4 year follow-up: the results demonstrated a long term improvement in ischemic symptoms.
However, the main advantage of this trial was that it highlighted the possibility of
developing a secondary vascular network in this particular population. It must be
noted that one patient died 20 months after treatment administration; this patient did
not have any cardiovascular risk factors and had given up smoking before inclusion
in the trial. The possible relation between this death and the cell therapy administered
cannot be excluded, coronary mortality being a rare occurrence in young subjects
with Buerger’s Disease.
The injection of BMMNC in apolipoprotein E knockout mice is likely to promote
the development of atherosclerotic lesions, because angiogenesis is necessary for the
development of intima-media plaques [24]. Further studies are necessary to assess
treatment safety in patients with this disease.
CONCLUSION
To date, no studies on gene or cell therapy have reached an authoritative conclusion
on the efἀcacy or tolerability of these innovative treatments. Addressing such questions requires randomised trials on a larger scale, with the reduction in the frequency
of major amputation as the primary endpoint.
Although these new treatment possibilities for PAOD have opened up some fascinating perspectives, they have also raised many questions.
Which cells should be used? Several studies are currently investigating mesenchymal cells, adipocytes, and embryonic stem cells.
At what frequency should the injections be given and which delivery route should
be used?
Is it necessary to combine gene therapy and cell therapy (transfection of the cells
used by the gene in question)?
Is short-term and long-term safety really guaranteed, given the theoretical risk of
stimulating the development of latent cancers or aggravating atherosclerosis?
Furthermore, critical ischemia with trophic disorders is the ἀnal stage of PAOD
and is associated with a high rate of morbimortality; therefore, a better means of
assessing treatments aimed at stimulating angiogenesis may well exist. A more
appropriate approach may be to focus on patients with rest pain only or to combine
gene or cell therapy with distal bypasses or angioplasty in subjects with a better
prognosis. Another recent innovative approach involves developing artiἀcial vessels.
This technique represents a new angle of research for the management of operable
patients but who no longer possess the autologous material necessary for surgical
intervention [25].
145
Joseph Emmerich
Bibliography
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147
Philippe Menasché
The possibilities offered by cell grafts in the heart give rise to a great deal of hope.
With the objective of giving renewed functionality to myocardial territories that have
become akinetic following infarction, cell therapy in cardiology is already proving
to be a clinical reality, attested to by the large number of currently ongoing clinical
trials.
CELL THERAPY IN MYOCARDIAL INFARCTION
Excessive left ventricular dilatation after infarction is one of the strongest predictive factors of the risk of death [1]. One of the main objectives of cell therapy is to
achieve greater reduction in left ventricular remodelling than that obtained with the
currently available treatments of myocardial infarction, such as revascularisation by
angioplasty during the acute stage, thrombolysis, and stents, etc. Considering the
high success rate of these existing approaches, the challenge is evidently an ambitious one.
Assessment of cell therapy
Nowadays the procedure for cell therapy is perfectly standardised. A catheter is
inserted into the artery, which was repermeabilised some hours or days earlier, and
mononuclear bone marrow cells of the patient are injected. These cells are chosen
because they are immediately available and also small in size, thus ensuring the
safety of the intracoronary injection [2].
A meta-analysis of 13 controlled trials including 811 patients recently assessed
this procedure. Left ventricular ejection fraction showed a statistically signiἀcant
improvement of 3% (p = 0.0007). Though modest, the beneἀt derived from cell therapy is not a negligible one. In contrast, no notable effect on ventricular remodelling
was observed [3].
Some have concluded from the meta-analysis that cell therapy is and will remain
ineffective. In reality, however, these apparently negative results are extraordinarily
positive due to the mass of information which they have brought to light. In particular, they have led to the identiἀcation of the factors responsible for the poor results,
thus opening the way to more appropriate angles of research.
148
Factors of success or failure related to delivery procedure
What are the factors which may explain the limited beneἀts derived from cell therapy?
Some have to do with the procedure used. For example, it was shown that the timing
of cell delivery must be taken into consideration. Additionally, cell homing can vary a
great deal depending on whether the injection was performed 1 hour or 24 hours after
the acute stage of the myocardial infarction. Clinical studies are currently seeking to
identify the optimal moment for cell administration; this question is thus likely to be
clariἀed. The dose of cells administered is also undoubtedly a key factor to success.
The meta-analysis has thus shown that the greater the number of cells injected, the
more signiἀcant the improvement in ventricular ejection fraction. Success is therefore
dose-dependent and the dosage can certainly be optimised (ἀg. 1) [3].
Impaired cell function
Impaired cell function is probably a far more arduous stumbling block. In an animal
model of leg ischemia, it has been shown that administration of bone marrow cells
taken from a healthy subject improved the ischemia, while cells from a subject with
ischemic heart disease had no effect. The situation is similar when coronary patients
are treated with the injection of marrow cells, rendered non-functional as a result of
the coronary disease.
Study
or sub-category
107
n
BMSC
Mean (SD)
01 <10(7) cells
22
Meluzin LD (2006)
3.00 (4.69)
Subtotal (95% CI)
22
Test for heterogeneity: not applicable
Test for overall effect: Z = 0.71 (p = 0.48)
Meluzin HD (2006)
02 <10(8) cells
Ge (2006)
10
58.60 (9.90)
Lunde (2006)
1.20 (7.50)
44
5.00 (4.69)
Meluzin HD (2006)
22
35
Li (2007)
57.10 (7.80)
14
Penicka (2007)
45.00 (9.00)
125
Subtotal (95% CI)
Test for heterogeneity: x2 = 15.69. df = 4 (p = 0.003). I2 = 74.5%
108
109
03 <10(9) cells
7.00 (6.20)
20
Huang (2006)
Janssens (2004)
3.40 (6.90)
30
Kang (2006)
25
5.10 (9.10)
Schachinger (2006)
95
5.50 (7.30)
Suarez de Lezo (2007)
10
20.00 (8.00)
Subtotal (95% CI)
180
Test for heterogeneity: x2 = 9.51. df = 4 (p = 0.05). I2 = 57.9%
1010
04 <10(10) cells
Meyer (2006)
30
Subtotal (95% CI)
30
Test for heterogeneity: not applicable
Test for overall effect: Z = –3.16 (p = 0.002)
6.70 (6.50)
Total (95% CI)
357
Test for heterogeneity: x2 = 31.46. df = 11 (p = 0.0009). p= 65.0%
Test for overall effect: Z = –3.00 (p = 0.002)
n
No BMSC
Mean (SD)
Weight
%
WMD (random)
95% CI
WMD (random)
95% CI
1.00 (–1.77, 3.77)
1.00 (–1.77, 3.77)
22
22
2.00 (4.69)
10.50
10.50
10
44
22
35
10
121
53.30 (3.50)
4.30 (7.10)
2.00 (4.69)
52.60 (5.70)
47.00 (7.00)
4.83
9.95
10.50
9.66
4.93
39.86
5.30
–3.10
3.00
4.50
–2.00
1.51
(–1.21, 11.81)
(–6.15, –0.05)
(0.23, 5.77)
(1.30, 7.70)
(–8.41, 4.41)
(–1.96, 4.98)
20
30
25
92
10
177
4.50 (3.99)
2.20 (7.30)
–0.20 (8.60)
3.00 (6.50)
6.00 (10.00)
9.60
8.92
6.75
12.03
3.65
40.95
2.50
1.20
5.30
2.50
14.00
3.60
(–0.73, 5.73)
(–2.39, 4.79)
(0.39, 10.21)
(0.52, 4.48)
(6.06, 21.94)
(1.04, 6.16)
30
30
0.70 (8.10)
8.69
8.69
6.00 (2.28, 9.72)
6.00 (2.28, 9.72)
100.00
2.74 (0.98, 4.50)
350
–10
–5
Favors no BMSC
0
5
10
Favors BMSC
BMSC: bone marrow stem cells; CI: 95% conἀdence interval; WMD: weighted mean difference.
Figure 1. Improvement of left ventricular ejection fraction in myocardial infarction patients according
to quantity of cells administered. (Reproduced with permission from Martin-Rendon, et al.[3]).
149
Philippe Menasché
The cells could be tested before the injection, but the procedure would then prove
too long, too complex and too costly for routine use. A second strategy would be to
have stocks of cells at our disposal; these would be allogeneic but already tested and
proven functional beforehand. The product would then be “ready-to-use” just like
a traditional drug. The problem of rejection persists, but this could be avoided by
using mesenchymal stem cells (MSC) if the “immunological advantage” currently
attributed to them is conἀrmed.
Which delivery route for these cells?
What is the best way to administer allogeneic MSCs? Theoretically, the intravenous route is the most appealing: access is simple and without risk, but before they
reach the heart the cells are captured by the marrow, the spleen, and the lung. In this
respect, left endocardial delivery would be more effective, but this method is not
without risk when used a few hours after myocardial infarction. The alternative is
the intracoronary route: recent animal studies conducted to assess the impact of the
dose administered and associated antithrombotic treatment showed that MSCs from
adipose tissue or marrow delivered by intracoronary injection are indeed beneἀcial
to cardiac function. In addition, these studies have proved reassuring with regard to
formerly existing concerns about the risk of capillary occlusion by MSCs which are
twice as large as mononuclear cells [4-6].
If these results are conἀrmed and validated, we will have made a big step forward
in the development of a functionally effective cell therapy, which can be easily stored,
and used in emergencies.
Homing of injected cells remains inadequate
After intracoronary injection, only approximately 3% of the cells administered are
found in the heart. Different techniques have been developed with a view to improving this rate. Some of these are based on biological approaches, such as the manipulation of host tissue to trigger ampliἀcation of the homing signal. A number of simple
technical improvements have also been considered, such as a catheter which, rather
than releasing the cells within the vessel lumen, distributes them around it, which
would appear to be an effective way of increasing the number of cells that actually
penetrate into the myocardial parenchyma.
Inadequate improvement in ventricular ejection fraction
The meta-analysis of randomised trials that assessed the beneἀt of administering bone
marrow cells following myocardial infarction showed only a very modest improvement in ventricular ejection fraction. Some have interpreted this result as conclusive
proof of the failure of this technique. It is useful to remember that studies of drugs
such as beta-blockers or angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors showed
150
similar results, whereas nowadays, no-one contests the capacity of these drugs to
save lives. For example, in 2004, the CAPRICORN (Carvedilol post-infarct survival
control in left ventricular dysfunction) study evaluating the effects of carvedilol,
a beta-blocker, on left ventricular remodelling following acute myocardial infarction only demonstrated a 4% improvement in left ventricular ejection fraction [7].
In 2007, a meta-analysis of the effects of ACE inhibitors also revealed similar
ἀgures [8].
It is therefore still too soon to claim that cell therapy in cardiac pathology has no
future.
CELL THERAPY in HEART FAILURE
With 5 million people affected, heart failure is the ἀrst cause of hospitalisation in
the United States. In France, 150 000 new cases are reported every year, 10 000 of
which are serious forms; 3% of the healthcare budget is spent on patient management. Despite recent progress in terms of treatment of heart failure, cardiovascular
deaths are still frequent in these patients. Cell therapy for heart failure aims to
regenerate post infarction akinetic scars. Three randomised controlled trials were
conducted to study administration of skeletal myoblasts in this indication. In two
studies, the cells were injected via an endoventricular catheter. The results were
positive for one and negative for the other. In the MAGIC (Myoblast Autologous
Grafting in Ischemic Cardiomyopathy) study, surgical cell transplantation was
performed in addition to coronary bypass but did not succeed in reaching its
primary endpoint [9]. This trial included a relatively large number of patients (120
randomised patients in 5 countries). It was conducted to study the effects on cardiac
function of injecting myoblasts into infarction scars. Although cardiac function was
indeed improved in the patients treated, there was no difference between this and
the placebo group.
It is however interesting to note that the group treated with the highest dose of
myoblasts showed a signiἀcant reduction in left ventricular end systolic and diastolic
volumes (p < 0.05). Therefore, although cell therapy was indeed shown to have an
effect on ventricular remodelling, it was insufἀcient to improve cardiac function
(ἀg. 2) [9].
Trials conducted with bone marrow cells have not shown any better results than
those with myoblasts. The safety proἀle of cardiac cell therapy would appear to be
satisfactory except for a number of concerns regarding a possible increase in the risk
of ventricular arrhythmia; interpretation nevertheless remains complex because of
the diversity of causal factors. The patients in the MAGIC study underwent cardioverter deἀbrillator implantation. Objective monitoring of ventricular arrhythmias
was therefore possible, and this showed no signiἀcant difference between treatment
and placebo groups at the 6-month study point.
151
Philippe Menasché
20
EDV indexed to BSA (mL/m2):
6-month change from baseline
*p < 0.05
10
0
n = 25
-12.6 (-19.4, 0)
n = 29
5.9 (-11.8, 15.2)
n = 27
-3.9 (-17.0, 12.6)
-10
NS
-20
Median and IQR
High dose
Low dose
Placebo
EDV: end diastolic volume; BSA: body surface area.
The data are expressed as medians and interquartile intervals.
Figure 2. Six-month change from baseline in indexed end diastolic volume in heart failure patients
according to quantity of cells administered. (Reproduced with permission from Menasché, et al.[9]).
Areas for improvement: cells
There are two potential courses of improvement: the ἀrst can be qualiἀed as conservative and the second as aggressive. The conservative option recognises the unfeasibility
of regenerating damage caused by the infarction and focuses on optimal exploitation
of the paracrine effect of grafted cells by selecting the most effective. The potential
paracrine effects include stimulation of angiogenesis, an anti-apoptotic effect, remodelling of the extracellular matrix (which increases the elasticity of scar tissue and
reduces ἀbrosis) and salvaging cardiomyocytes (since damage is reversible).
Which types of cells are involved? The CD34+ and CD133+ fractions of hemato
poietic stem cells or mesenchymal stem cells possess a paracrine effect. One recent
study showed that these cells secrete sufἀcient mediators to reduce apoptosis and
therefore the extent of the infarction, thus improving left ventricular function. It is
probably this paracrine effect that explains the beneἀts on ventricular remodelling
reported with cell therapy in the MAGIC study.
With the aggressive option, we are faced with the challenge of generating new
cardiomyocytes from stem cells. Cardiac stem cells would appear to be the most
152
appealing candidates but only exist in infants, during the ἀrst months of life. On the
other hand, pluripotent embryonic stem cells would appear to be the best candidates.
In our group, Michel Pucéat and colleagues have developed a process whereby these
cells are pre-oriented towards a cardiac phenotype; subsequently, cardiac progenitors
alone are selected. Trials carried out in an animal model of infarction subsequently
showed that these cells indeed become functional cardiomyocytes. The induced
pluripotent stem cells, or iPS, are the latest potential progenitors [10] but their potential clinical use is still fraught with several limitations.
The main advantage of these cells is that they originate in the patient himself.
However, autologous products do create considerable logistical problems, particularly when large numbers of patients are to be treated.
Improving delivery and survival of cells
Eighty per cent of the cells administered are likely to be lost when they are injected
via a syringe. Computer-controlled injection systems improve precision and may
lead to better results. The incorporation of cells in biomaterials could also favour
better retention. In our experience, alternative techniques using cellularised collagen
patches or sheets of cells held together by the extracellular matrix proved to be more
effective than conventional injection.
Furthermore, the populations of administered cells are subjected to considerable
mortality in the days following the injection [11, 12]. The reasons for this cellular death are now better known, and include inḀammation, ischemia, and apoptosis
caused by the detachment of the extracellular matrix. These ἀndings provide a plethora of research paths in order to attempt optimisation of cell graft survival.
CONCLUSION
The choice of cells should be determined by clinical indication. Different types of
cells, whether adult or embryonic, may be effective in certain cases but less so in
others. It is therefore necessary to take into consideration the patient and the speciἀc
disease in order make the most appropriate choice of cells.
The improvement of transfer/survival techniques is as important as the identiἀcation of the “best” cell. Indeed, it is of no beneἀt to have highly effective cells if we
are incapable of delivering them where they are needed and keeping them alive once
delivered. Cell survival may require that the cells are delivered with their vascular
support and extracellular matrix.
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2
154
On the symbolism of angiogenesis
and anti-angiogenesis
Janine Chanteur
Departing slightly from scientiἀc research, which has brought to light the process of
angiogenesis and anti-angiogenesis and is striving to master it, let us dwell brieḀy on
its underlying symbolism. Such reḀection highlights two lamentable misjudgements
which have entered contemporary mindsets and are jeopardising research work.
One is the unquestioning veneration of the sacredness of Nature and the other is the
absurd notion that Man and animals are equals. Such convictions, and the outrageous
propaganda used to publicise them, are genuinely appalling – activists are attempting
to halt scientiἀc research on fallacious moral grounds based on pseudo philosophical or purportedly scientiἀc arguments. In the light of the reality of angiogenesis and
anti-angiogenesis, these impassioned assertions have neither rhyme nor reason, and
stem from arbitrary ideas and misguided sentimentality.
angiogenEsIS AND THE SACREDNESS OF nature
Angiogenesis is considered a “natural” phenomenon, ensuring the growth of embryos
and normal human development through till adulthood, and also helping to heal
bodily wounds (also a “natural” process). It thus plays a vital role and encounters
no difἀculties when functioning normally. This life force belongs to the so-called
“bright” side of Nature, which labours to promote harmony.
In contrast, when angiogenesis evolves in an anarchic (although equally “natural”)
fashion, it produces a form of life which can be considered to work “against” Life.
As such, it encourages the proliferation of cancerous cells, helping them devour
healthy cells and spread throughout the body via blood vessels that it either creates or
hijacks. Although this is also a natural process per se, it is potentially lethal if there
is no outside intervention. The voracity of cancer cells may be likened to latter-day
conquerors who starved their captives to death.
So how can we come to terms with Nature, which is so admirably capable of
promoting Life yet which, with equal verve, can cause death by actively encouraging an invasive, anarchic form of life? This “natural” phenomenon not only kills
what feeds it, but may also commit suicide. It should be noted that “natural” is not
155
Janine Chanteur
synonymous with “normal” although the terms are sometimes (mistakenly) used
interchangeably. “Natural” denotes how things are without any human intervention,
whereas “normal” is a value judgement with legal, scientiἀc, even moral overtones.
Incidentally, the two words have very different etymological roots.
Should we, therefore, continue to fantasise about the perfection of what is “natural”
regardless of how it manifests itself? Or revert to the notion of the ambiguity (even
ambivalence) of Nature for which Man is not responsible, even though his wrongdoing may worsen or even cause damage. Ecology is a laudable idea and worthy of
respect, except when the “idea” veers towards “ideology” and its adepts fail to see
that it has moved beyond well-intentioned ecology and into toying with Death. Alfred
de Vigny made a harsh yet realistic comment in his poem La maison du berger where
a personiἀed Nature deἀnes itself thus: “On me dit une mère et je suis une tombe” [I
am known as Mother Nature, yet I am a tomb]. In fact, like angiogenesis and many
other “natural” phenomena, it is both at the same time.
Although it is undoubtedly harmful and worthy of condemnation to pollute the air in
our cities and pour toxic substances into the soil, oceans or rivers, it is equally wrong
to worship Nature and give it power of life or death over Mankind. An idol by deἀnition lives off those who worship it. However, the worst thing is that the idolatrous
often worship themselves - convinced they hold the Truth, zealously propagating it
and attempting to crush any opposition. Think of Greenpeace and its emulators who
would love to bring back obscurantism. Mutatis mutandis – cancer itself can claim
as much arrogance and tenacity.
angiogenEsIS AND THE worshiping OF ANIMALS
Research into angiogenesis revealed a process which treatments at the time were not
always able to control. Once it was understood how Nature produced cancer cells,
the idea came up in the 70”s to prevent them from multiplying by depriving them of
their blood supply. Anti-angiogenetic drugs were discovered, thanks to experimentation on animals (on mice in this instance).
Animal rights activists, without giving the slightest thought to curing the terminally ill ahead of the medical breakthrough, vociferously condemned the massacre of mice and other animals vital to research, on the pretext (and, alas, doubtless
sincerely convinced) that animals have the same rights to live as Man. It is widely
known that certain treatments, pharmacological or otherwise, cannot be identiἀed or
developed without experimention on animals, and thus be legally used on humans
without animal testing. Stringent regulations govern any experiments of this sort and
are designed to prevent abuse. However, hardcore activists have no qualms about
disrupting laboratory experiments, committing criminal offences and even physically
assaulting research workers in order to defend animal rights. Contemporary zoolatry
is a new form of idolatry – it is the worship of animals to the detriment of Man.
156
On the symbolism of angiogenesis and anti-angiogenesis
Affection and concern for animals is normal, even laudable. However, a hysterical
preference for animals over people verges on the pathological. It is not because Man
is a “thinking animal” (the classic deἀnition since Aristotle) that we should prefer
Man to animals, but because we alone are capable of distinguishing between Good
and Evil, and of acknowledging the existence of “neighbours” who we should help
to cure when necessary. Even if animals have some powers of reason (an undeniable
fact), they never consider it their “duty” to treat the ailments of their peers or retrieve
a wounded enemy. It should be noted, moreover, that these glimmers of intelligence
have not resulted in any inventions or their advancement.
CONCLUSION
To conclude, it still remains that to sacriἀce living, feeling animals is a serious act
and one that is hard to face. However, although Man is the most consummate of
beings (despite his all too frequent acts of evil), he is also alone in wishing to surpass
himself while recognising the ever precarious nature of his achievements and accepting the inevitability of his own death.
It is the ἀnite nature of the human condition that makes us consider caring for our
fellow men more important than an animal”s life, yet prevents us from totally ignoring the contradiction between affection for animals and using them in experiments.
This is why we should strive to save our neighbour while doing as little harm to
animals as possible. In other words, we should make every effort to do good in the
knowledge that we will never achieve total success. This is why we should work for
the beneἀt of Man with courage and modesty and dismissing any form of dogmatism, without ignoring the underlying contradiction between caring for animals and
making use of them. We should set our sights on moral perfection, even if we are
unable to achieve it, in this life at least. It is a reḀection of the harshness, weakness
and misery of the human condition, but also its undeniable value.
To me, treating both Nature and animals as sacred are exposed as blatant aberrations if one considers angiogenesis, a natural life-giving process which can also prove
lethal, and anti-angiogenesis which, thanks to human ingenuity, offers a wonderful
opportunity to save our fellow human beings.
157
Hypoxia and tumor progression:
new therapeutic approaches
Jacques Pouysségur
AngiopoIEtins AND VEGF-A: TWO KEY PLAYERS
in NEOVASCULARIZATION
Among the wide range of angiogenic factors, VEGF-A and angiopoietin are two major
players in neovascularization. We know that signaling by the Tie-2 tyrosine kinase
receptor when bound by angiopoietin 1 stimulates the recruitment of pericytes. The
Notch pathway activated in endothelial cells maintains these cells in quiescence by
blocking the cyclin D-Cdk4 pathway. When neovessel formation is required, for example in tissue repair or tumor development, angiopoietin 2, a natural antagonist of angiopoietin 1, “turns off ” the Tie-2 receptor signaling by displacing angiopoietin 1. This
process breaks down the structure of the existing capillaries, which allows vascular
endothelial cells to become responsive to VEGF-A and, subsequently, the basic steps
of migration and division thus ensuring neovascularization [1].
decreaseD oxygen pressure (hypoxia) is the signal
for NEOVASCULARIZATION
Angiopoietin 2 and VEGF-A are induced by hypoxia, and neovascularization
occurs when there is oxygen deἀciency. The key regulator of the cellular response
to hypoxia is the HIF factor (hypoxia inducible factor) which was discovered some
15 years ago by the Semenza group [2]. The application of hypoxic stress in cell
cultures (from a wide variety of species ranging from Caenorhabditis elegans to
humans) causes the rapid induction of an HIF-1α subunit. HIF-1α migrates into the
nucleus and associates with HIF-1β, forming the transcription factor HIF-1, which
ensures cell survival by inducing transcription of various genes. This process is
extremely fast and can be observed within 10 minutes of inducing hypoxic stress.
Similarly, increasing oxygen supply stops the process by preventing the further
release of HIF-1α protein, which has a half life of less than ἀve minutes under
normoxic conditions.
158
Hypoxia and tumor progression: new therapeutic approaches
OXYGEN SENSORS CONTRIBUTE TO THE DESTRUCTION
AND THE INACTIVATION of HIF-1α
The study of HIF-1α regulatory mechanisms, particularly by P. Ratcliffe’s group in
Oxford, has revealed the key role played by a group of hydroxylases. Inactivation of
HIF-1α involves three HIF prolyl-hydrolase enzymes (PHD1, 2 and 3), PHD2 being
the enzyme responsible for the low levels of HIF-1α under normoxic conditions.
These PHD enzymes are genuine oxygen sensors, and as such are capable of detecting and reading the oxygen pressure within a cell’s nucleus and cytoplasm. They
have two cofactors, oxygen and 2-oxoglutarate. Under normoxic conditions, PHD2
hydroxylizes two proline residues located in the N-TAD transactivation domain. The
hydroxylated proline residues are then recognized by the pVHL (von Hippel Lindau)
protein, which is a subunit of a multiprotein complex with ubiquitin ligase activity
that transfers several ubiquitins onto its substrate. The polyubiquitin chain is recognized by the proteasome catalytic system, which then rapidly degrades HIF-1α.
The Km for oxygen of these enzymes is relatively high, so that a greater than 20%
decrease in oxygen levels results in a decrease in PHD activity, inducing the concomitant stabilization of HIF-1α. The stabilized HIF-1α protein can induce genes that
then participate in the genetic response to hypoxia.
In addition, the fraction of HIF-1α that escapes the proteasome is inhibited by
another oxygen sensor, HIF-asparaginyl hydroxylase (FIH). FIH hydroxylates asparagine located in the C-TAD transactivation domain, which prevents the binding of a
general transcription coactivator (p300) and prohibits the introduction of dependent
genes.
HIF-1α activity is regulated by two cellular oxygen sensors, PHD and FIH, which
are dependent not only on cellular pO2 but also on 2-oxoglutarate levels.
HIF-1α bifUnctionality confErs greater flexibility
for adaptation to hypoxic conditions
We examined the physiological signiἀcance of the presence of two transactivation
domains on HIF-1α and have been able to show that N-TAD and C-TAD induce
different groups of genes. This observation is of both academic and physiological
interest. Under high oxygen pressure in cells located near a capillary, both oxygen
sensors, PHD2 and FIH, are activated and HIF-1α is degraded and/or inhibited. The
intracellular oxygen gradient drops in cell populations further away from the capillary, PHD2 and FIH tend to be inactivated and HIF-1α is stabilized. However, PHD2
is the ἀrst of the two hydrolases to be inactivated when the decrease in intracellular pO2 is moderate. Only the C-TAD transactivation area remains blocked by FIH
activity which is highly sensitive to oxygen. Under these conditions, only the genes
induced by C-TAD are expressed, such as the proapoptotic gene BNIP-3. When the
159
Jacques Pouysségur
instability
inactivation
proteasome
Oxygen
sensors
Figure 1. Oxygen sensors and HIF-1α regulation.
cell becomes more hypoxic, both N-TAD and C-TAD areas are “freed” and the entire
gene repertoire controlled by HIF-1 is induced.
Therefore, two oxygen sensors with different afἀnities for oxygen are present. These
sensors act on two distinct transactivation domains and provide various responses to
different oxygenation conditions (ἀg. 1).
On a physiological level, this dual mode of control gives the cell greater Ḁexibility
when adapting to cellular pO2 values [3, 4].
HIF-1, A FACTOR IN CELL SURVIVAL
Inactivation of PHD2, induced by the decrease in pO2, results in the induction of
the bnip-3 gene. Initially, the BNIP-3 protein was thought to induce cell death.
However, it has become difἀcult to support this simple view because the bnip-3 gene
is induced when oxygen pressure is moderately decreased and it does not cause cell
death. Why would HIF-1, which is a survival factor, induce a gene for cell death? In
fact, we found that the gene products of bnip-3 and its family member bnip-3L, both
induced by HIF-1 and expressed in the mitochondria, induce autophagy [5]. When
nutritional conditions decline, the cell can survive by initiating a controlled autolysis
process, which supplies nutrients until adequate nutritional conditions return. This
is, therefore, a survival process and it is remarkable that a decrease in pO2, the signal
triggering neovascularization, also triggers the autophagic process. The decrease in
intracellular oxygen pressure signals the general reduction of nutrients to which the
160
Vessel
Figure 2. HIF-1: a survival molecule for cells under hypoxic stress. Human colon adenocarcinoma (LS174)
tumor implanted in a nude mouse. Carbonic anhydrase CAIX, a marker induced by HIF, is detected (antiCAIX antibodies appear as the light coloured mesh-work.). This marker coincides with the expression of
HIF-1α. It is detected more frequently in cells further from the vessel in the center of the ἀgure.
cell responds by the induction of an autophagic process, which enables it to compensate, to some extent, for a nutritional deἀciency (ἀg. 2).
HIF-1 IS INVOLVED IN THE REGULATION OF INTRACELLULAR
TUMORal PH
Since the pioneering work in the last century by Otto Warburg, we know that most
cancer cells use glycolysis, even in the presence of oxygen. This process transforms
glucose into pyruvate, the ἀnal byproduct of which is lactic acid. This system, which
produces only two adenosine triphosphate (ATP) molecules per glucose molecule,
is inefἀcient. In addition, the accumulation of lactic acid decreases the pH locally,
which can be toxic and require the implementation of pH regulation mechanisms. We
have recently found that the expression of HIF-1 is crucial in this metabolic “switch”
and that HIF-1 is directly involved in the regulation of intracellular pH [3].
Although hypoxia is the main factor in HIF-1α induction, other stimuli are able
to increase the level of this transcription factor in certain cell types. For example, in
161
Jacques Pouysségur
Figure 3. Aberrant glucose metabolism in cancer cells. Accumulation of Ḁuoro-deoxyglucose in a case
of metastatic lung cancer visualised by FDG-PET (Reproduced with permission from Beer, et al. [6]).
oncogenic conditions, such as those caused by the deletion of PTEN, HIF-1 activity can be increased even in the presence of oxygen, as a result of the Akt pathway
being activated by the constitutive activation of phospho-inositide 3 kinase (PI3K).
Furthermore, mutations in the HIF-1α destabilization process have been identiἀed in
several types of human tumor (vhl, sdh, idh1, etc.), leading to the activation of HIF
under normoxic conditions. HIF-1 induces the kinase PDK1, which prevents pyruvate dehydrogenase activity, and which, by induction of LDH-A, somehow “forces”
glycolytic metabolism, a process of ATP generation requiring an excessive consumption of glucose [7]. This aberrant metabolism is currently widely used in FDG-PET
(F-18 Ḁuorodeoxyglucose positron emission tomography) diagnostics that detect
the accumulation of the non-metabolized analogue of glucose. Beyond that, we are
convinced that improved knowledge of this aberrant glucose metabolism will lead to
better cancer therapy management (ἀg. 3).
HOW DO MAMMALIAN CELLS CONTROL INTRACELLULAR PH?
If intracellular pH regulation is blocked, glycolysis and glycolytic ATP production
will also be blocked by a feedback mechanism. If the cell is strictly dependent on
glycolysis for its energy supply, this action will cause cell death by necrosis.
162
Which intracellular pH regulatory systems have been identiἀed? The sodiumproton exchanger is a universal pH regulator. It uses the sodium “inward” gradient
to extract protons from the intracellular medium. This exchanger, activated at acidic
pH, is the target of all growth factors. All mitogens are able to increase the afἀnity for the H+ regulatory site, allowing cell proliferation to impose a more alkaline
intracellular pH. Lactic acid, which is also a factor in acidiἀcation of the intracellular
medium, is extracted from the cell by the lactate-proton cotransporters MCT1 and
MCT4. The carbonic anhydrases, especially those induced under hypoxic conditions,
as discussed below, are also enzymes that can play a key role in the adaptation of
cells to an acidic micro-environment.
To understand the impact of acidosis on tumor incidence, we isolated and studied a
series of ἀbroblast mutants from different metabolic steps: mutants lacking phosphoglucose isomerase (pgi–), which no longer produce lactic acid, mutants lacking respiration (res–) and, as a consequence, are totally dependent on glycolysis and generate
high levels of lactic acid, and ἀnally mutants lacking the Na+/H+ (nhe1–) exchanger.
In summary, the loss of the Na+/H+ (nhe1–) exchanger particularly affected the
tumorigenicity of cells producing high levels of lactic acid. The pgi– cells formed
tumors normally, even in the absence of the Na+/H+ (nhe1–) exchanger. These important results provide “proof of concept”; tumor cell pH regulators with high glycolysis
are potential anticancer targets [3].
Control of intracellular pH: WHAT is the CLINICAL
TRANSLATION?
Under hypoxic conditions, tumor cells are forced to draw their energy from glycolysis and, consequently, produce large quantities of lactic acid. If the regulation of
intracellular pH is inactivated, tumor development rapidly collapses.
Could this observation be translated into a clinical beneἀt by providing new therapeutic targets?
In addition to Na+/H+ (nhe1–), carbonic anhydrase (CA) could be one of these new
targets. We know approximately 13 isoforms of carbonic anhydrases, but we are
particularly interested in carbonic anhydrase IX (CAIX) and XII (CAXII), which are
strongly induced by HIF-1 and can be found in most human epithelial tumors.
The carbonic anhydrases are localized in the plasma membrane. Their catalytic
domain, located outside the cell, catalyses the hydration of CO2 which releases bicarbonate and a proton (H2O + CO2 = HCO3– + H+). Bicarbonate is rapidly taken up by
the cell while the proton remains in the extracellular domain. The presence of CAIX or
CAXII contributes to the acidosis that is found in most solid tumors, while the uptake
of bicarbonate should help maintain a more alkaline intracellular pH, allowing glycolysis and protein synthesis to take place in a very hostile acidic environment (ἀg. 4).
163
Jacques Pouysségur
1800
Tumor volume (mm3)
1600
1400
1200
1000
800
600
LS-shCA9
- DOX
LS-shCA9
+ DOX
LS-shCA9/CA12-
- DOX
LS-shCA9/CA12-
+ DOX
45%
LS174
colon adenocarcinoma
85%
400
200
0
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
Days after cell injection
Figure 4. CAIX and CAXII are potential targets for anticancer therapeutics.
CAIX INDUCED BY HYPOXIA PROMOTES THE SURVIVAL
OF TUMOR CELLS
We have attempted to understand what beneἀt tumor cells derive from the expression of CAIX and if CAIX could be a therapeutic target. Under normoxic conditions,
neither HIF-1α nor CAIX are expressed, although they are strongly expressed under
hypoxic conditions. We carried out a very simple experiment involving the addition
of carbonic gas to a suspension of ἀbroblasts. We measured extracellular pH and
demonstrated the progressive acidiἀcation of the culture medium. The same experiment using ἀbroblasts expressing CAIX induced very abrupt acidiἀcation of the
culture medium within ἀve seconds of CO2 injection. Interestingly, the cells expressing CAIX and incubated at acidic pH (6.5-7.0) demonstrated an intracellular pH of
0.4 to 0.2 pH units more alkaline than that of the control cells. Such a difference has
considerable implications for the rate of glycolysis and ATP metabolism. We showed
in vitro that cells without CAIX lose their viability under highly acidic conditions
that mimic the acidic environment of tumors.
Can the expression of CAIX and CAXII be advantageous to tumor cells in vivo?
In a mouse model with human colon carcinoma, we inactivated CAIX using a
small RNA molecule (RNA interference) whose expression can be controlled by
doxycycline. The inhibition of CAIX expression by adding doxycycline to drinking
water caused a 45% decrease in tumor development. This decrease was modest, but
164
it appeared that reducing CAIX expression led to strong overexpression of CAXII,
another carbonic anhydrase. We created cells lacking CAXII, but retaining CAIX.
The development of these tumor cells was comparable to that of the control line,
however inhibiting CAIX with doxycycline in these cells led to an 85% reduction
of the tumor. Therefore, it appears that the carbonic anhydrases CAIX and CAXII
that are induced in hypoxic areas of many tumors are relevant therapeutic targets
[8].
are monocarboxylic transporters potential
thErapeutic targets?
We have seen that carbonic anhydrases are not the only agents involved in the regulation of intracellular pH. This process involves, in particular, the lactic acid transporters MCT1 and MCT4. Fibroblastic cells only express MCT1. A speciἀc MCT1
inhibitor developed by AstraZeneca in ἀbroblast cultures made the cells unviable
in hypoxic conditions and, in vivo, in nude mice, reduced the tumor volume by a
factor of 10. However, many cancer cells, such as epithelial tumor cells, have both
MCT1 and MCT4. We therefore mimicked this situation by introducing the human
MCT4 form into ἀbroblasts. When these cells were placed under hypoxic conditions, blocking MCT1 had no effect on viability, demonstrating the crucial role
of MCT4 in the functioning of glycolysis and cell survival. MCT4 would therefore appear to be a potential target for new anticancer therapies because this transporter is crucial for the maintenance of glycolysis in a large number of tumors under
hypoxic conditions. The future approach currently being considered is a MCT1/
MCT4 double inactivation, targeting basigin (or CD147), the common chaperone
of these two carriers.
Conclusion
We are convinced that a strategy targeting the exacerbated glycolytic metabolism
of tumors is a new approach offering relatively unexplored therapeutic potential. In
this paper, we have analyzed the potential to target the intracellular pH regulation of
tumors. Several pH control systems are used by cells and their relative contributions
in each tumor type should be analyzed in a preclinical study in mice. These models
will allow the development of the best drug combinations targeting intracellular pH
in order to prevent intracellular ATP production while having little impact on healthy
tissue. The high proἀle of cellular metabolism in the last century has now entered
a new phase where cellular physiology and molecular genetics provide new insight
into tumor metabolism. These new therapeutic approaches are currently being thoroughly explored.
165
Jacques Pouysségur
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Olivier Rixe
Anti-angiogenics have brought about a real change in the oncologist’s profession,
aligning it more closely with those of specialists in internal medicine and those
of individual organs who treat diseases of the kidneys, skin, blood vessels and the
gastro-intestinal tract. Adverse effects of anti-VEGF treatments, such as haematological, dermatological or renal toxicity, have taken us into the realm of multidisciplinary oncology. We have been obliged to broaden the scope of our activities and
add comparative medicine to our regular arsenal, as the reports contained in this
study will show.
TUMOR NEO-ANGIOGENESIS: DRUG TREATMENT FOCUSED ON
MORE THAN JUST VEGF
Treatments focusing on VEGF had to aim at an “ideal” single target. In reality, the
more we learn, the more we are obliged to admit that matters are far more complicated than we had imagined. While it is true that VEGF is an essential path used
by tumor cells to stimulate vascular proliferation, there are nonetheless other proangiogenic factors that have been identiἀed – or that still remain to be identiἀed
– whose path of action is either direct, from the tumor cell to the endothelial cell, or
indirect, via the peritumoral environment and the stromal cell [1].
Despite a certain delay compared to our colleagues in cardiology, we have begun to
take an interest in bone marrow precursors and their importance within the tumoral
and peritumoral vascular system. It is a mistake to restrict the target of drug treatment
to VEGF alone. We now have drugs that are either very “clean”, that target VEGF,
or very “unclean”, viz. “dirty” drugs, that focus on several of the key factors in the
angiogenic network [2]. The tools at our disposal that target VEGF and its receptor
are monoclonal anti-VEGF antibodies such as bevacizumab, soluble receptors such
as the VEGF Trap, and drugs that inhibit the functional part of the VEGF receptors
(ἀg. 1). Trials focusing on these small molecules that are more-or-less speciἀc and
have a more-or-less broad spectrum of activity are published every day.
The real advantage offered by drugs that speciἀcally target VEGF compared to
those with a much wider collateral action (including all the “ibs”: e.g. sunitinib,
sorafenib, axitinib, pazopanib, etc) has yet to be determined.
167
Olivier Rixe
VEGF
PDGF
Sorafenib
Sunitinib
signal transduction cascade
vascular permeability, cell survival,
proliferation, migration
R-1
VEGFR-2
Sunitinib
Sorafenib
GF
GF
VE
PDGFR
VE
Sunitinib
Sorafenib
R-
3
angiogenesis
vasculogenesis
angiogenesis
lymphangiogenesis
Sunitinib
pericyte
FR
PDG
Sorafenib
ki
t
endothelial cell
tumor cell
Raf
MEK
Ek
tumor
autocrine stimulation
angiongenesis
tumor interstitial pressure
proliferation
survival
Figure 1. Sites of action of anti-angiogenics.
ACTIONS OF ANTI-VEGF STILL POORLY UNDERSTOOD
In reality, our understanding of what happens when we administer an anti-VEGF
is extremely limited. It is true that the rarefaction of the vascular system is clearly
linked to regression in tumor volume. It has been shown that the use of a type 2 antiVEGF receptor in mice reduces tumor volume to an extent that is entirely compara168
ble to that of vascular rarefaction [3]. However, the scope of action of anti-VEGFs
would appear to be much broader. It is highly probable that they have a direct antitumor action. For instance, sunitinib has an anti-tumor action in vitro against cell
cultures, thus in the absence of any vascular system. It has also recently been shown
that tumor cells are capable of mobilising normal bone marrow cells and causing
them to migrate to premetastatic niches, thus preparing this new environment for the
tumor to take hold [4]. The tumor supposedly releases a signal by way of VEGFR-1
and VEGFR-2 and prepares these niches for potential secondary tumors by making
them adhesive. These bone marrow cells settle on healthy lungs, liver and bone and
then, attract tumor cells to enable them to proliferate and allow secondary metastases
to develop. This phenomenon mediated by VEGFR-1 and VEGFR-2 may constitute
a further important drug impact point, which would explain the reduction in new
metastases when inhibitors of these receptors are used.
VEGFs thus also appear to be implicated in the immunosuppression phenomena
that are observed in the tumor environment. VEGF produced by tumor cells inhibits
the maturing of dendritic cells in the tumor environment, and these cells then appear
to be unable to induce anti-tumor effector T-lymphocyte responses.
startling demonstration of validity of THE anti-vegf
concept
Effective anti-VEGF treatment tools were developed during the early 2000s, with
sunitinib being one of the most powerful. The phase 1 study for this drug was
performed in France [5]. One of the ἀrst patients treated was suffering from a metastatic renal carcinoma. His lung metastases regressed almost completely, which was,
in itself, proof that the anti-VEGF concept was valid. However, this level of efἀcacy
in treating tumors from as early as phase 1 is quite exceptional in oncology.
Phase 2 was performed on the other side of the Atlantic, with the regimen that was
developed at the Institut Gustave-Roussy: four weeks of treatment p.o. followed by
two weeks off [6]. A standing ovation was given when the results were presented
at the American Society of Clinical Oncology (ASCO) in 2005. The lesions had
regressed in 42% of the 60 patients treated. Although their renal tumors had been
considered as being resistant to any form of medication, they proved sensitive in
almost one case out of every two, with their response lasting about 14 months and a
median survival period of two years. On the basis of this study that was conducted
in only 60 patients, the drug was approved by the Food and Drug Administration
(FDA) in the US in the ἀrst instance, and then by the European authorities; this was
subsequently conἀrmed by an extensive phase 3 study [7], which compared sunitinib
with one of the standard treatments for metastatic disease. This drug has doubled
the duration of progression-free survival. The median survival period changed from
21 months in the standard interferon group to 26 months in the sunitinib group. The
169
Olivier Rixe
small difference between the two treatment groups can be explained in particular by
the change to sunitinib by patients initially treated with interferon, which tends to
bring the two survival curves into alignment.
MAJOR IMPACT ON PROGRESSION-FREE SURVIVAL
At the same time, at the Pitié-Salpêtrière hospital, we were working on another antiVEGF, axitinib [8, 9]. Signiἀcant results were also observed with this agent as from
phase 1 in various types of tumor, particularly in metastatic renal carcinoma. The
particular interest of axitinib is that it very speciἀcally inhibits types 2 and 3 VEGF
receptors and therefore has very little effect on the other receptors involved in angiogenesis or on other tyrosine kinases. We treated 50 patients, with objective responses
in 44%; full remissions persisted beyond four years.
STUDIES HAVE FAILED TO DEMONSTRATE A BENEFIT IN TERMS
OF PROLONGED SURVIVAL
The treatment strategy for renal carcinoma was completely overturned by these few
trials, including key studies also performed with bevacizumab and sorafenib. In
1980, guidelines for treatment of renal carcinoma advocated the use of progesterone,
cytotoxics (vinblastine) and particularly immunotherapy using interferon and interleukin-2. However, the results of treatment were still unremarkable. The arrival of the
anti-angiogenics turned these recommendations around completely, and now 80% of
patients with renal carcinoma are – or will be – given treatment that directly targets
the vascular growth factors.
What is the real impact however, of anti-VEGF treatments in terms of prolonged
survival? Of all of the phase 3 studies published on renal carcinoma using antiangiogenic treatments, only one showed a survival beneἀt of about six months
achieved with sunitinib compared to the reference treatment (interferon). The other
studies have shown positive results with regard to survival without relapse.
DEVELOPMENT OF NEW TREATMENT STRATEGIES
Oncologists have developed two different strategies. One makes use of a singletreatment approach with VEGF receptor inhibitors in renal carcinoma and hepatocarcinoma. The results of randomised studies are positive, with a relatively modest
impact on progression-free survival (one to three months) in the case of hepatocarcinoma, and longer for renal carcinoma. For other tumor types (breast, lung or
colon cancer), anti-VEGFs have been used in combination with conventional treatment, chemotherapy in particular. These trials revealed a synergy between chemotherapy and bevacizumab. The exact mechanism of action however, is still not fully
understood. Although this activity has been demonstrated for most tumors, includ170
ing those affecting the colon, lung or breast, and with response rates greater than
those observed with chemotherapy alone, the impact remains moderate in terms of
progression-free survival and overall survival. Other indications for largely “orphan”
tumors are currently being developed. Phase 2 studies on thyroid tumors and neuroendocrine carcinoid tumors of the pancreas have recently been published. Signiἀcant
response rates have been achieved and phase 3 trials are therefore being carried out.
Bevacizumab is currently being assessed in the treatment of glioblastoma.
THE QUESTION OF RESISTANCE TO ANTI-ANGIOGENIC AGENTS
Do these anti-angiogenic treatments increase long-term survival? The response is
clearly “very little”. The phase 2 trial of axitinib is one of the few in which patients are
still alive after more than four years. The improvement in response rates achieved with
anti-angiogenic treatments has not really translated into complete responses and real
improvements in long-term survival rates. What is the reason behind this? Mechanisms
of resistance to anti-angiogenics are currently the subject of numerous publications.
There are two types of resistance to anti-VEGF treatment [10]: intrinsic resistance,
in which the patient does not respond to anti-angiogenic treatment at all, and acquired
resistance, where, following an initial phase of rarefaction, the vascular network
once again begins to proliferate and spread. The mechanisms involved would appear
to be highly variable. The phenomenon by which vessels escape anti-VEGF treatment therefore equates to a reactivation of tumor angiogenesis that is independent
of VEGF and associated with hypoxia-mediated induction of other pro-angiogenic
factors, including members of the ἀbroblast growth factor (FGF) family. Treatment
with FGF inhibitors reinitiates vascular rarefaction. As a consequence, targeting the
VEGF pathway will derepress other pathways such as that of FGF, which will constitute a signiἀcant escape mechanism.
Another resistance mechanism involves a sub-population of stem cells in the myeloid
line. These cells inἀltrate the tumor and render it resistant to anti-VEGFs. It must be
emphasised that these cells are highly sensitive to chemotherapy, which could explain
the synergy of action achieved by associating an anti-VEGF with a cytotoxic.
TOWARDS IDENTIFICATION OF PATIENTS LIKELY TO BENEFIT
FROM ANTI-ANGIOGENIC TREATMENT
We are still unable to identify patients who will respond to anti-angiogenic treatment.
EGFR ampliἀcation and KRAS mutations make it possible to identify patients who
will respond to erlotinib. Herceptin is effective in 40% of patients with an ampliἀcation of the HER2 gene. Imatinib is active only in patients suffering from a stromal
tumor with c‑kit overexpression in association with particular mutations that have
been fully identiἀed. Nonetheless, we are still unable to identify the anomalies in the
VEGF receptor that would enable us to predict anti-VEGF activity.
171
Olivier Rixe
Even so, certain factors (mainly clinical) can be related to a treatment response.
For example, patients who develop hypertension during treatment with axitinib tend
to have a better survival rate than others. The onset of hypertension (elevated diastolic levels) is therefore a factor that is related to the efἀcacy of an anti-angiogenic
treatment, probably indirectly associated with improved bioavailability of the drug
in these patients [8, 11].
What are the future prospects for the various types of anti-angiogenic treatment?
Should they be used in combination? Should their spectrum of activity be broadened? Should they be used at an earlier stage, particularly as adjuvant treatment? Is
it possible to identify sub-groups of patients who are likely to respond to treatment?
Should the independent VEGF pathways also be targeted? As the presentations at
this meeting showed, physicians from different medical disciplines such as cardiology and oncology have similar questions.
The future of these drugs in clinical use lies in identifying factors that will predict
the response to this targeted treatment, which will make it possible to improve their
therapeutic index.
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172
Anti-angiogenesis and eye disease;
age-related macular degeneration
OCULAR NEOVASCULARISATION: THE INITIAL CONCEPTS
In 1948, Michaelson, an ophthalmologist at the University of Jerusalem, postulated
the existence of a factor released by the hypoxic retina and stimulating vessel growth
in the context of vascular development and diseases. Michaelson also raised the
possibility of blocking this factor x at some stage in the future, once it had been
identiἀed [1].
MEDIATORS OF OCULAR NEOVASCULARISATION
Michaelson’s hypothesis was conἀrmed more than 40 years later, when VEGF (vascular
endothelial growth factor) was identiἀed as a major player in neovascular eye diseases.
As for any biological process, it is becoming clear that VEGF is not the sole mediator
involved in the angiogenic process. More generally, it is currently thought that there
is a balance between pro-angiogenic factors, chieḀy VEGF, PDGF (platelet-derived
growth factor), FGF-2 (ἀbroblast growth factor-2) and natural antiangiogenic factors,
particularly PEDF (pigment epithelium-derived factor), which is synthesised by the
pigmented epithelium in particular. Recently, Chemtob et al. in Montreal showed
that the accumulation of succinate in the hypoxic retina acts as a powerful mediator of angiogenesis and that this agent is involved in ischaemic diabetic retinopathy.
Succinate acts by way of its receptor, GPR-91 (G protein-coupled receptor 91), the
effects of which are themselves mediated by retinal ganglion cells which, in response
to an increase in succinate levels, regulate the production of numerous growth factors,
VEGF in particular [2].
AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION: MECHANISMS
OF NEOVASCULARISATION
Our chief focus here is age-related macular degeneration (ARMD). This common
condition affects 1.5 million people in France, one-tenth of whom are deemed to
173
be blind. Until the early 2000s, very few treatment options existed and these were
essentially limited to laser treatment, which was applied in very speciἀc forms of
the disease, covering fewer than 8% of patients, in whom the neovessels appeared
outside the macula.
The mechanism leading to the formation of neovessels in ARMD has not been
explained as clearly as it has in diabetic ischaemia or venous occlusion. The role
played by local inḀammation appears increasingly evident in the light of the many
genetic studies highlighting the role of complement factor polymorphism in predisposition to this disease. Among the different mechanisms that would appear to co-exist,
ischaemia plays a relatively obscure part. One hypothesis that has now been accepted
though is still to be conἀrmed, suggests that a given level of VEGF would appear
to maintain the structure and function of choriocapillary circulation in the normal
retina. Then, as the subject ages, the accumulation of debris in the retina inhibits
oxygen distribution toward the photoreceptors, and this in turn leads to hypoxia, with
an increase in VEGF synthesis contributing to neo-angiogenesis.
CHOROIDAL NEOVASCULARISATION IN ARMD
ARMD begins with a thickening of the macula. Fluorescein or indocyanine green
angiography reveals the presence of neovascularisation with exudates that feed the
macular oedema. There are thus two elements making up the disease: neovascular
proliferation and the vascular hyperpermeability that follows it. The neovascularisation is the cause of the exudation and haemorrhages in the region of the macula.
The efἀcacy of drug therapy used in ARMD would appear to be related to their
action on vascular permeability as well their anti-angiogenic effect per se. Indeed,
it is interesting to note that VEGF is also known as vascular permeability factor.
Clinical experience has shown that, in terms of improving macular function, the
main target of anti-VEGFs is very likely to be vascular permeability.
Our particular interest lies in the exudative form of this disease. Its atrophic forms
are also common, but are characterised by involution of the vessels and thus a pathological process that is the opposite of that observed in the exudative form [3].
ADVANCES IN TREATMENT IN RESPONSE TO OCULAR
NEOVASCULARISATION
Neovessels do not provide an effective response to ischaemia. Their ectopic location
means that they do not have a signiἀcant effect on the oxygenation of ischaemic
tissue. They are however, responsible for severe, blinding complications, essentially
as a result of ἀbrosis and secondary retraction.
With a view to identifying treatment options, it was therefore reasonable to target
new vessels. Historically, lasers have been used mainly in diabetic retinopathy for
174
ablation of ischaemic tissue (retinal panphotocoagulation). This procedure is a form
of amputation, involving sacriἀcing the tissue so as to limit the synthesis of VEGF
and pro-angiogenic factors, but is performed to the detriment of the neurons that are
destroyed in the process.
Although this form of treatment cannot be considered satisfactory, does this mean
nevertheless that anti-VEGFs are an ideal alternative? VEGF does play a part in
the process of neovascularisation but also has a key role in the physiological processes of vascularisation. Thus, in the adult eye, the VEGF receptors are expressed on
the endothelium, but also in the retinal cells, regardless of whether they involve the
pigmented epithelium or photoreceptors. VEGF has a pro-inḀammatory effect and it
is probably involved in ensuring that the choriocapillaries remain trophic. Lastly, it has
been shown that VEGF plays a neuroprotective role [4, 5]. Anti-VEGFs could therefore
have a toxic effect on the retinal neurons, with consequent changes in the electroretinogram and thus in visual function, which could pose a problem for both long-term and
repeated treatment, although this has not been established beyond doubt.
INVESTIGATION INTO EFFECTS OF VEGF ON THE EYE
The role played by VEGF in the retina has been investigated mainly by way of examining the consequences of intra-ocular injection. The effects of this treatment vary
from one species to another. In rats, for instance, it results less in the formation of
neovessels than in vascular dilation and very marked diffusion. The main effect of
VEGF in this case is thus increased vascular permeability, which may well be related
to a pro-inḀammatory effect. In monkeys, on the other hand, VEGF leads to the
formation of neovessels [6, 7].
Investigation into the pathological role of VEGF has been conducted principally
by Malecaze et al. and Plouet et al. in France, and by Aiello et al. in the US, who
demonstrated the increase in VEGF concentrations in different pathologies, and
particularly in diabetic retinopathy (ἀg. 1), while this phenomenon was less evident
in ARMD [8, 9]. The numerous studies showing that blocking VEGF resulted in the
inhibition of neovascularisation have formed the basis for the development of antiVEGF strategies in ophthalmology in recent years [10 – 12].
ANTI-VEGF STRATEGIES
Macular oedema and preretinal neovascularisation are the main indications for antiVEGFs in ARMD. Intravenous administration is possible, but the intravitreal method
is most commonly used, and is currently performed on a routine basis in the form
of monthly injections. The drugs that have already been registered for commercial
use, or are still being studied, target RNA that codes for VEGF: VEGF itself, VEGF
receptors or the tyrosine kinase activation pathway [13].
175
30
VEGF (ng/mL of sample)
25
20
15
10
5
0
No Proliferative
Disease
No PDR
Quiescent PDR
Active PDR
Diabetes Mellitus
Quiescent
Active
Iris Neovascularization
Active
CRVO
CRVO: central retinal vein occlusion; PDR: peripheral diabetic retinopathy.
Figure 1. Concentrations of immunoreactive VEGF in ocular Ḁuids from patients undergoing intra
ocular surgery. (Reproduced with permission from Aiello, et al. [9]).
Pegaptanib sodium and ranibizumab are currently approved for use in ophthalmology. Ranibizumab is a fragment of bevacizumab that appears to offer better penetration of the eye with enhanced afἀnity. Clinical trials have chieḀy shown a reduction in diffusion, and thus a reduction in the macular oedema. Above all, treatment
with ranibizumab stabilises visual acuity and has even been shown to improve it in
approximately one third of patients. This treatment has without doubt been a major
step forward in terms of treatment: visual acuity is stabilised or even improved in
90% of patients whereas until recently, ophthalmologists were relatively powerless in
this indication (ἀg. 2) [14]. Tolerability of ranibizumab would appear to be satisfactory, even though the risk of stroke remains.
VEGF TRAP: SELECTIVE OR NON-SELECTIVE BLOCK?
The VEGF Trap is a soluble VEGF receptor that is currently in phase 3 of clinical
development. It is a non-speciἀc receptor that binds all forms of VEGF and appears,
176
Mean change in visual
acuity ± S.E. (letters)
15
10
+6.6
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24 months
-5
-10
-15
*p < 0.01
-14.9
Ranibizumab 0.5 mg, 1 injection/month (n = 238)
Sham injection, 1 injection/month (n = 238)
Mean change in visual
acuity ± S.E. (letters)
12
+21.5
letters*
+11.3
8
4
0
0
1
24
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 months
-4
-8
-9.5
+20.8
letters*
*p < 0.01
-12
PDT, 1 injection every three months if necessary (n = 143)
Ranibizumab 0.5 mg, 1 injection/month (n = 139)
Figure 2. Stabilisation and improvement in visual acuity with ranibizumab in ARMD. (Reproduced
with permission from Rosenfeld, et al. [14]).
in vitro, to be 140 times more effective than ranibizumab. Its main appeal lies in
permitting a considerable interval between doses.
The question of whether to opt for selective or non-selective VEGF blocking has
been widely debated, particularly with regard to the important physiological functions of the angiogenic factor. Experimental studies have shown that, although blocking VEGF-165 alone may be ineffective against physiological vascularisation, the
overall inhibition provided by ranibizumab could, conversely, be associated with
undesired effects on vascularisation [15, 16]. Pegaptanib is a speciἀc aptamer with
a strong afἀnity for VEGF-165 that has been approved for ophthalmological use. Its
efἀcacy has been demonstrated versus no treatment at all, with a beneἀt in terms of
visual acuity. However, this treatment only slows the loss of vision, whereas “panVEGF” blocking stops it entirely, and in some cases even improves visual acuity. As
a consequence, pegaptanib has not enjoyed the same success as the “pan-VEGF”
approach in ophthalmology. This may be explained by the anti-oedema effect of
ranibizumab.
177
A recent article in Cancer Research reported data relating to VEGF-165b, a sub-type
of VEGF-165, which appears to have anti-angiogenic effects. Inhibition of VEGF-165
could therefore have a double effect, simultaneously pro- and anti-angiogenic, and
targeting this factor may well prove difἀcult due to a lack of speciἀcity [17, 18].
OTHER ANTI-ANGIOGENIC STRATEGIES
Various anti-angiogenic strategies are currently being developed. Clinical trials
are under way to assess tyrosine kinase inhibitors. A topical form of an Src kinase
inhibitor, a VEGF antagonist, has been studied but was found to cause corneal
lesions, which greatly reduces its appeal, except from the perspective of improved
pharmacokinetics.
Ophthalmology was one of the ἀrst disciplines to use interfering RNAs. Trials
have shown a beneἀt compared to no treatment at all, though this remains slight in
comparison to what is achieved with anti-VEGFs. A phase 3 trial, currently under
way, is assessing their use from the perspective of stabilisation, as follow-on treatment from anti-angiogenics. Nonetheless, interfering RNAs remain controversial.
They appear to bring about a non-speciἀc inhibition of neovascularisation by means
of the Toll R3 pathway. Toll R3 receptors are present in the pigmented epithelial cells
and activation by interfering RNAs could be associated with cell death. Interfering
RNAs could thus have non-speciἀc effects on the pigmented epithelium.
OTHER MEANS AND PATHWAYS OF TREATMENT
Alternative approaches are currently under consideration, such as gene therapy using
AdPEDF (Adenovector Pigment Epithelium-Derived Factor). Animal studies have
shown that increased expression of PEDF in the eye could prevent angiogenesis.
The concept of using combined treatments has also been raised. Friedlander, of the
Scripps Research Institute, thus suggested attacking the angiogenic process simultaneously at three levels. He suggests intervening on the triggering of the process
of neo-angiogenesis using an anti-VEGF aptamer, drawing on the αvβ3 and αvβ5
integrins to counter neovessel proliferation and, lastly, using T2-TrpRS, a soluble
factor that inhibits neovessel maturation.
CONCLUSION
Anti-angiogenics are nowadays an integral part of everyday ophthalmological practice, and this must be considered as a major step forward. Every day, hundreds of
patients are given anti-VEGF injections. These treatments are, however, still costly
and lengthy, and the long-term consequences are not known. Moreover, the atrophic
forms of ARMD remain incurable. Great hopes are therefore placed in the clinical
trials currently under way and also in our ability to prevent the complications of this
disease.
178
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179
Tumor blood vessels: a major therapeutic target
Gérard Tobelem
a visionary, a concept
Angiogenesis, the growth of new blood vessels, is an essential process in embryonic
development and tissue repair. This process is deregulated in various pathological
conditions, notably cancer, but also during inḀammatory, ischemic, infectious and
immunological diseases.
Modern angiogenesis began in 1971 with Judah Folkman who devoted his whole
life, up until his recent death on 14 January 2008, to research in the ἀeld of angiogenesis. He originally trained as a surgeon, then went on to become professor at Havard
and Director of the Vascular Biology Program at Boston Children’s Hospital. For
many years however, Folkman was confronted with scepticism from the medical and
scientiἀc community as a result of his avant-garde hypothesis published in 1971 [1].
One has to recognise that at the time, it was no more than a hypothesis resulting more
from a “vision or a revelation” than from robustly supported research. Folkman’s
vision: a dream in that era!
Cancerous tissue is like any other tissue in that it needs nutrients and oxygen
carried by blood vessels in order to grow, multiply and expand. In light of this
observation, the notion of the “angiogenesis dependence” of tumors arose.
Accompanying tumor progression from a dormant stage to one of invasive
growth and metastatic dissemination, blood vessels were thought to undergo a
phenotypic change, the famous “angiogenic switch”. From then on, at least for
Folkman the visionary, inhibiting angiogenesis appeared quite naturally as a new
anti-cancer therapeutic strategy consisting quite simply of starving the cancer
by depriving it of blood vessels. Thus, with this pioneer, the ἀrst concept of
targeted therapeutics for cancer was born, a strategy which today is undergoing
tremendous development. Although for nearly two decades, only a small number
of initiated scholars were interested in angiogenesis, it is no longer the case
today with the anti-angiogenesis approach to the management of cancer now well
accepted into the daily clinical practice of oncologists, ophthalmologists and
soon other specialists too.
180
Four years before his sudden death (very probably an ischemic heart attack), Folkman
was able to see with satisfaction that his dream had become reality. Today, tumor
blood vessels are a major target for cancer treatment and indications are becoming
increasingly more common in colorectal, breast, lung, and kidney cancers. Likewise,
the number of registered drugs is increasing, and many others are in pre-clinical
and clinical development phases. This has become a key area of research for pharmaceutical and biotechnology industries. There are now vast numbers of academic
research groups working on the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis.
This mobilisation reḀects the stakes: there are many questions remaining regarding
fundamental research as well as therapeutic aspects. Targets are more clearly deἀned
and anti-angiogenetic approaches are becoming more and more complex. A better
understanding of the characteristics of tumor blood vessels is today at the origin of
some very promising translational research.
what are the characteristics of tumor neovessels?
Tumor neovessels are extremely abnormal: they are disorganised, anarchically
distributed, permeable and fragile. To survive, they require continual presence of
VEGF (vascular endothelial growth factor) which is necessary for their proliferation
and also for the increase in their permeability. Their pericyte coverage is weakened.
Consequently, there is an increase in the intratumoral interstitial pressure which, on
one hand, promotes the spreading of tumor cells to the blood or lymphatic system,
i.e. metastasis, and, on the other hand, hinders access by chemotherapy to the tumor
cells. Hypoxia, which is present within the tumor, induces further genetic instability
and selects the most malignant tumor cells. Thus, tumor blood vessels are profoundly
abnormal in terms of phenotype, markers and haemodynamics. They are at the heart
of a major remodelling process. Certainly they are more abundant than normal blood
vessels, with capillary density being increased in many cancers, but they are above
all qualitatively different from normal blood vessels. We have demonstrated this
in a murine hepatocarcinoma model [2, 3], as have other research groups [4]. In
summary, we can say that tumor blood vessels express a signiἀcant arterial speciἀcation: angiogenic endothelial cells are positive for Notch 4, Dll4 and ephrin-B2, markers which are normally only present (and to a lesser extent) on arterial endothelial
cells. Vascular remodelling is in fact the result of hyperstimulation by VEGF, which
is expressed even more greatly when the hypoxia inside the cell is increased. Thus,
there is a cascade which we were able to clarify in our murine hematocarcinoma
model, and also in vitro in endothelial cell cultures: VEGF → Notch 4 → Dll4 →
ephrin-B2. This remodelling brings about modiἀcations in blood Ḁow. Indeed, using
Doppler ultrasonography, we were able to demonstrate in this model that an increase
in blood Ḁow velocity in the hepatic artery precedes carcinoma diffusion [5].
Altogether, these phenotypic modiἀcations, changes in the expression of molecular
181
Gérard Tobelem
markers, and haemodynamic disruptions result in the profound vascular remodeling
which occurs in the tumoral vasculature.
what are the anti-angiogenic therapeutic STRATEGIES?
There are currently three approaches: the growth of new vessels can be blocked,
neovessels can be destroyed or, and this is an emerging approach, they can be made
even more abnormal. Genuine anti-angiogenics are used for the ἀrst strategy [6, 7],
and molecules known as vascular disrupting agents (VDA) are used for the second
[8]. These two groups have different targets, different mechanisms of action, and
possibly even different therapeutic indications and methods of administration. The
third and most recent approach, involves blocking Dll4 [9-12].
Given the major role of this growth factor in vascular remodelling, the main target
of anti-angiogenics is VEGF and/or its receptors. Anti-angiogenics are now more
clearly understood, and some of them are more and more widely used in oncologists’
daily clinical practice. In line with Folkman’s initial theory, it was expected that antiangiogenics would inhibit the growth of new tumoral blood vessels, or even destroy
existing neovessels. The fact that endothelial cells rely on VEGF for their survival gave
further hope to this expectation. On the other hand, the resulting increase in hypoxia
would have made it even more difἀcult for chemotherapies to gain access to the tumor.
Yet, this did not occur. On one hand, strict anti-VEGFs, such as bevacuzimab, did not
appear to be effective against tumors when used alone; on the other hand, associating
them with standard chemotherapy enhanced the effect of the chemotherapy. In fact,
although these anti-angiogenics, and anti-VEGFs in particular, are expected to inhibit
the growth of tumor neovessels, they have also been shown to normalise tumor vasculature, and this was an unexpected effect. This concept was developed by Jain [13, 14],
and conἀrmed by other research groups, including ours. The loss of VEGF brought
about by an antibody or a binding compound which inhibits its receptors causes the
angiogenic endothelial cells to revert to a normal arterial phenotype. The result is
haemodynamic normalisation, improved oxygenation of the tumor cells, and therefore
enhanced accessibility for and sensitivity to classic anti-cancer treatments (chemotherapy or radiotherapy). If the anti-angiogenic treatment exclusively targets VEGF (as is
the case for bevacizumab, for example) it will demonstrate limited efἀcacy when used
as a monotherapy because signiἀcant anti-tumor activity is only seen when they are
used in combination with chemotherapy and/or another targeted drug. Furthermore, as
long as the tumor cells persist, it seems logical to pursue this therapeutic approach in
order to prevent any new resurgence of angiogenic activity.
VDAs, the second class of anti-angiogenics, are still being developed. They are
therefore less well understood. This group is made up of two types of molecules:
––Firstly, tubulin-binding agents (at the colchicine binding site of the tubulin β sub-unit),
which depolymerize microtubules, thus disrupting the cytoskeleton of the endothelial
182
cell. They also act on VE-cadherin by interfering in endothelial cell-endothelial cell
contacts; the chief molecule in this category is combrestatin A4 phosphate;
––Secondly, Ḁavanoid analogues, which cause apoptotic lesions in endothelial cells;
the classic example of a molecule in this class is DMXAA (5,6-dimethylxanthenone4-acetic acid).
VDAs destroy established tumor blood vessels by targeting the immature endothelial cells and pericytes of these blood vessels. In reality, endothelial cells are highly
dependent on their tubulin cytoskeleton for mobility, invasion, attachment, alignment and proliferation. VDAs therefore bring about a rupture of the cytoskeleton and
cell-cell contacts. This results in destructive disorganisation, a veritable collapse of
the neovessels, greater hypoxia and therefore more tissue necrosis downstream of the
destroyed blood vessels. But while this cytotoxicity occurs in the centre of the tumor,
in the periphery a veritable crown of viable tumor cells seem to persist; passive
diffusion from adjacent normal blood vessels ensures their nutritional support. This
crown can represent a large contingent of cancerous cells which are likely to start
growing again. In principle, these activated endothelial cells are more sensitive to
VDAs, but initial clinical studies seem to show that a normal vascular endothelium
can also be affected. This results in signiἀcant cardiac and neurological side effects.
We must therefore wait for the results of ongoing phase 2 studies to determine if the
risk/beneἀt ratio is favourable.
The third approach is even more recent. Dll4, which is activated by VEGF, binds
to Notch, and in return negatively regulates VEGF, thus limiting the abnormal hyperangiogenesis which arises from the over-expression of VEGF. Its inhibition produces
a paradoxical effect whereby angiogenesis increases and tumoral mass is reduced. In
fact, blocking Dll4 is equivalent to letting the VEGF pathway spiral out of control;
this increases the number of neovessels, but also their abnormalities. As a result,
there is an increased number of non-functional new blood vessels without directional
blood Ḁow, and therefore more tumoral hypoxia. The inhibition of Dll4 creates more
vascular abnormalities within the tumor, and the imperfect angiogenesis which is
thus induced is accompanied by regression of the tumor. This approach appears very
promising in vitro and in vivo in animal models, and also to complement other strategies, notably in cases of resistance to VEGF blocking. Thus, the use of anti-Dll4
antibodies or soluble Dll4 (soluble Dll4 blocks the Notch receptor without triggering
the signalling cascade and prevents endogenous Dll4 from accessing it) has demonstrated robust antitumor activity in numerous models.
sO Should we normalise, destroy or “abnormalise”
tumor blood vessels?
Currently, only anti-angiogenics (notably VEGF inhibitors) have demonstrated
proven efἀcacy in several therapeutic indications. The clinical development of VDAs
183
Gérard Tobelem
is not yet completed and so we cannot gamble on their future as therapeutic drugs
without taking risks. As for Dll4 blockers, the most important question is to determine their tolerability before verifying if the proof of pathophysiological concept is
conἀrmed in cancer patients.
Anti-angiogenic strategies are today a realistic option, even though numerous questions remain regarding the drugs in this therapeutic class: which dose, which combinations, which administration regimen, what treatment duration, what are the markers of
efἀcacy or primary or acquired resistance, what are the long-term effects? Much has
yet to be conἀrmed or demonstrated. Amongst these questions, that of the administration regimen is crucial. If the concept concerning the window of normalisation elaborated by Jain is followed, would it not be more effective to use a different sequence of
administration than that of giving the anti-angiogenic and chemotherapy at the same
time? Should we not ἀrst of all normalise tumor blood vessels through an initial administration of anti-VEGF, and then, after a given period (12 hours, 24 hours, 48 hours?),
administer the reference chemotherapy? Another crucial question is that of the importance of the real beneἀt given to patients. The impact is still weak, but surely, the palliative treatment of today is an investment for the curative treatment of tomorrow.
In reality, the same sorts of questions exist with regard to VDAs. According to
preclinical studies and initial clinical phases, it seems unlikely that VDAs will be
effective as a monotherapy. The persistence of the viable tumoral crown is probably
the reason for this. The option of a combination with chemotherapy (possibly low
dose metronomic chemotherapy) has therefore already been adopted. The ἀrst phase
2 results are encouraging. But again, there is the question of the regimen: should
both treatments be used concomitantly or should they be staggered? Another option
could be to associate VDAs and anti-angiogenics. Indeed, initiating treatment with
an anti-angiogenic after a VDA makes sense in addition to the growth inhibition
and to maintain the remaining viable tumor cells in a dormant stage since they are
deprived of angiogenesis.
And ἀnally, the right answer to the question “normalise, destroy or abnormalise?”
is perhaps “all three!”, though not necessarily at the same time; all three would make
up the right combination of strategies to help us take another step forward towards
improved survival. And also to make Folkman’s dream live on!
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185
Limitations and complications of anti-angiogenic
treatments
Jean-Jacques Mourad
Anti-angiogenic drugs (bevacizumab, sunitinib, sorafenib) are becoming more
and more widely used in the treatment of advanced colon, breast, lung, liver and
kidney cancers. Their mechanism of action is based on inhibition of VEGF (vascular endothelial growth factor), a pro-angiogenic factor. The side effects of this
inhibition are not clearly understood by doctors.
an important role in maintaining microtubular
homeostasis
A lack of VEGF is lethal or causes major anomalies during embryogenesis and
development. In adults, on the other hand, it was thought that this factor was only
involved in the menstrual cycle, wound healing, and hair growth. It was therefore
thought that an anti-VEGF would mainly act on blood vessels with high turnover,
notably tumor blood vessels (ἀg. 1) [1].
However, clinical trials and pharmacovigilance have rapidly identiἀed speciἀc
complications associated with these treatments, demonstrating that VEGF plays
Age
Embryogenesis/
postnatal development
Adulthood
VasculogenèseVasculogenesis
Angiogenesis
vascular maintenance
Angiogenesis
Proliferative
retinopathies
Eyes
VEGF+
Angiogenesis
VEGF–
Adult pathogenesis
Hyaloid
system
formation
Partial VEGF
VEGF
deficiency inhibition
Choroid
system
formation
Heart
Partial VEGF
inhibition
absence of
Lethal Abnormal
inhibition
pulmonary of choroidal choriocapillaris
vessels and formation
lung
(in vitro)
development
Wound
Kidneys Reproductive
cycle
healing
Hair
Trachea Brain Lungs
growth
VEGF
inhibition
VEGF
inhibition
Reduces Alveolar Enlarges air
capillaries cell loss
spaces
in mucosa
Tumors
VEGF
inhibition
Macula Neovascular
oedema
AMD
VEGF
inhibition
VEGF
inhibition
CNV Maintains
Prolongs Maintains Reduces
or
survival
vision macular reduction
improves
thickening
vision
AMD: age-related macular degeneration; CNV: choroidal neovascularization.
Figure 1. VEGF: a key role in vascular homeostasis. (Reproduced with permission from Bhisitkul [1].)
186
an important role in the maintenance of circulatory homeostasis, especially in the
microcirculation, and that inhibition of VEGF brings about a decrease in capillary
density, with the magnitude of this decrease depending on the tissue in question [2].
Signiἀcant capillary regression can be seen in the pancreas, thyroid, adrenal glands,
pituitary gland, choroid plexus, and intestinal villi. The extent of this regression is
dose-dependent and reaches 68% in the thyroid.
VEGF inhibition and proteinuria
VEGF is produced by podocytes, and is a strong modulator of capillary permeability;
it acts by inducing fenestration of the glomerular capillaries. VEGF-inhibition is
associated with a loss of fenestration, thus bringing about glomerular dysfunction with, in particular, the apparition of proteinuria [2] (ἀg. 2). This complication,
frequently associated with the use of anti-VEGFs, is dose-dependent and usually
reversible after treatment is discontinued.
Renal glomerular capillaries
A
Control
B
Ad-sVEGFR-1 14d
sVEGR: soluble VEGF receptor.
Figure 2. Loss of capillary fenestration associated with VEGF inhibition. (Reproduced with permission from Kamba, et al. [2]).
VEGF inhibition and risk of hypertension
The most common complication associated with anti-angiogenic treatments is arterial hypertension. A recent review of medical literature reported hypertension in a
quarter of patients on bevacizumab with the relative risk varying between 4 and
7 compared to controls [3]. It is however worth noting that clinical trials use the
usual NCI-CTCAE (National Cancer Institute - Common Terminology Criteria for
Adverse Events) which do not contain any of the international recommendations
for the diagnosis or management of hypertension. The ἀrst trials to study the risk
of hypertension associated with bevacizumab demonstrated a toxic dose-response
effect. It is present regardless of the method of VEGF inhibition, and has also been
187
Jean-Jacques Mourad
demonstrated with sorafenib [3]. Clinical manifestations associated with hypertension, such as reversible posterior leukoencephalopathy associated with severe hypertension, have been reported, but fortunately remain rare [4-8].
mechanisms of onset of secondary hypertension
associated with anti-angiogenic treatment
The pathophysiological mechanisms underlying this effect have not been widely
studied. It was only in 2006 that the ἀrst article examining the reasons for the occurrence of hypertension in patients receiving anti-angiogenics was published. The
authors hypothesised that the cause was hormonal modiἀcations, but were nevertheless unable to demonstrate this [9].
In reality, we know that peripheral resistance, essentially localised in the microcirculation, plays a central role in the mechanism of hypertension. It has been demonstrated that arterial-capillary rarefaction plays a decisive role in the development
of hypertension, and that it appears at a very early stage in the natural history of
hypertensive patients.
In partnership with Professor Bernard Lévy from the Lariboisière imaging laboratory, we carried out a study with the aim of detecting a possible association between
hypertension and capillary rarefaction in patients receiving anti-angiogenic treatment. After 6 months of bevacizumab treatment, an increase in blood pressure was
observed in all the patients included (n = 18). In particular, intravital videocapillaroscopy of the ἀnger demonstrated a dose-dependent decrease in capillary density
(table 1 and ἀg. 3) [10, 11]. Our observations were consolidated by another study,
which found the same results with telatinib, a tyrosine kinase inhibitor [12].
In the same study, using laser Doppler Ḁowmetry, we were able to establish the
existence of major endothelial dysfunction with total inhibition of pilocarpineinduced vasodilation associated with bevacizumab treatment [11].
Table 1. Change in dorsal ἀnger skin capillary density following treatment with bevacizumab (from
Mourad et al. [11]).
n = 18
Baseline
6 months
p (Student’s t-test)
SBP (mmHg)
129 ± 13
145 ± 17
0.0001
DBP (mmHg)
75 ± 7
82 ± 7
0.0001
Basal capillary density
84 ± 13
75 ± 12
0.0001
Maximal capillary density
90 ± 13
81 ± 11
0.0001
SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure
188
Reduction of capillary density observed
at 6 months (n° capillaries/mm2)
25
20
R2 = 0.43; p = 0.008
15
10
5
0
0
2000
3000
4000
1000
Cumulative dose of bevacizumab
5000
Figure 3. Dose-dependent effect of bevacizumab on the reduction of cutaneous capillary density.
(Reproduced with permission from Mourad, et al. [11]).
hypertension: a predicitve factor of the activity
of anti-angiogenic treatment
A study presented at the American Society of Clinical Oncology (ASCO) in 2005
however, provided new evidence likely to draw the attention of oncologists to the
question of hypertension related to treatment with anti-angiogenic agents: it showed
a signiἀcant correlation between survival of patients receiving bevacizumab and
gemcitabine for pancreatic cancer and an early increase in blood pressure (p = 0.007)
[13]. Thus, hypertension seems to be an early marker of the anti-tumoral activity and
efἀcacy of bevacizumab (table 2).
In 2007, Professor Olivier Rixe also published a study showing that hypertension was signiἀcantly associated with an improved response to sunitinib in patients
Table 2. Survival rates according to early hypertension status (from Friberg, et al. [13]).
Cohort
n
Survival (months)
95% CI
No HTA
40
8.7
7.3-9.7
Early HTA
6
13.7
9.6-inἀnity
All admissible patients
46
9.0
7.7-10.5
189
Jean-Jacques Mourad
with metastatic renal cancer. The presence of grade 3 hypertension, according to the
NCI-CTCAE classiἀcation, in 22% of patients was associated with a more notable response to anti-angiogenic treatment [14]. These results have recently been
conἀrmed by a study of patients with metastatic colon cancer treated with bevacizumab. Around one third of patients developed hypertension. A response rate of
75% and median survival of 13.7 months were observed in the hypertensive patients
compared to 32% and 8.7 months respectively in normotensive patients [15].
establishing guidelines
Is the question of an increased risk of iatrogenic hypertension really crucial when
the treatment in question leads to an increase in life expectancy? In reality, oncologists only really began to consider this issue once the Food and Drug Administration
(FDA) banned the use of bevacizumab in patients with hypertension or signiἀcant
proteinuria.
This decision may well have had signiἀcant repercussions on treatment implementation, with hypertension and/or proteinuria delaying the initiation of anti-angiogenic
therapy.
For this reason, guidelines for the management of hypertension and proteinuria
in patients requiring anti-VEGFs have recently been established by various scholarly Societies in France (Société de Néphrologie, Société Française d’Hypertension
Artérielle, Association Pédagogique Nationale des Enseignants de Thérapeutique,
and Fédération Francophone de Cancérologie Digestive). The main message of
these guidelines can be summarised in four points [16]:
––the existence of ambulatory hypertension or raised blood pressure ἀgures reported
in an outpatient setting (except for rare cases of acute hypertension), or proteinuria
(except for rare cases of massive proteinuria) does not justify postponing the ἀrst
dose of an anti-angiogenic agent;
––patients who are due to receive their ἀrst dose of anti-angiogenic treatment should
continue to receive this treatment in the vast majority of cases, regardless of their
blood pressure readings the day they are admitted for treatment;
––there is no reason to administer an oral or IV antihypertensive medication prior
to initiating anti-angiogenic treatment, even if blood pressure on that occasion is
elevated;
––there is no particular reason to suspect that patients due to receive their ἀrst dose of
anti-angiogenic treatments will present exceptional acute hypertension. If this does
occur however, they should be managed in a specialist unit.
Fundamentally, the aim is to avoid delaying programmed chemotherapy on the
pretext that the systolic blood pressure is elevated, because these patients are likely
to respond well to treatment. Blood pressure is frequently monitored in the location
where the chemotherapy is performed, i.e. in non-satisfactory conditions. Ambulatory
190
blood pressure monitoring should be the preferred approach. We are currently trying
to promote self-measurement of blood pressure at home, thus avoiding the stress of
the oncology outpatient department.
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Angiogenesis and anti-angiogenesis

Transcription

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Etude de la dissolution de la silice biogénique des agrégats - Tel