BIOalternatives

016
GUIDE 2014
Article d’auteur / Author article
Tests in vitro d’efficacité :
Les tests in vitro à l’usage de l’industrie cosmétique ont connu un très
fort développement ces vingt dernières années. Plusieurs centaines,
voire plus d’un millier de protocoles sont aujourd’hui utilisés. Le
choix du bon test est donc bien très complexe et une connaissance
insuffisante de la physiologie cutanée peut conduire à l’échec.
Quelques conseils pour un choix éclairé du test idéal.
Le produit à tester
● Solubilité
La plupart des tests sont réalisés
en phase aqueuse : tampons pour
tests biochimiques, milieu de culture
pour tests sur cellules. D’autres tests
sont réalisés par application topique
à la surface de tissus reconstruits
ou d’explants de peau humaine.
Concernant les ingrédients, il s’agit
tout d’abord de connaître leur solubilité
en phase aqueuse. Si l’ingrédient est
hydrosoluble, la plupart des tests en
phase aqueuse sont réalisables. S’il
n’est pas directement soluble en phase
aqueuse, il est possible de tenter de
le solubiliser dans le diméthylsulfoxide
(DMSO) ou l’éthanol, généralement à
1 % ou 0,1 % (p/v ou v/v) puis de diluer
cette solution dans la phase aqueuse.
Il est alors important de vérifier que
le composé reste soluble après cette
dilution. Il faut également noter que la
concentration maximale en DMSO ou
en éthanol supportée par la plupart des
cellules est inférieure ou égale à 1 %
voire à 0,1 % pour certaines cellules.
Ce qui aura pour conséquence
d’obtenir une concentration finale en
composé qui pourra être inférieure
à 0,0001 % ! Si le composé n’est
pas non plus solubilisable via le
DMSO ou l’éthanol, il est possible
de tenter de le faire véhiculer par
de l’albumine délipidée. En effet
The in vitro tests used in the cosmetics industry have undergone a
period of very significant development over the past twenty years,
meaning that there are now several hundred, if not more than a
thousand, protocols to choose from. Choosing the right test is
therefore a very complex matter, and an insufficient knowledge of the
physiology of the skin, can result in failure. Here we offer some advice
on choosing the right test.
A N A LYS E S
&
TE S T S
/
TE S T I NG
A ND
A NA LY S I S
In vitro efficacy tests: some
Guide 2014
Product to be tested
● Solubility
The majority of tests are performed in
the aqueous phase - buffers biochemical
tests, culture medium for tests on cells.
Other tests are performed by means of
topical application to the surface of
reconstructed tissue or human skin
explants. As far as ingredients are
Expression
Cosmétique
concerned, it is important, first and
foremost, to be aware of their solubility
in the aqueous phase. If the ingredient is
water-soluble, most tests in the aqueous
phase can be performed. If it is not
directly soluble in the aqueous phase,
it is possible to attempt to solubilise it
in dimethyl sulfoxide (DMSO) or ethanol,
generally at a concentration of 1%
or 0.1% (w/v or v/v), before diluting
this solution in the aqueous phase.
It is important to then check that the
compound remains soluble after this
dilution. It is also important to note
that the maximum DMSO or ethanol
concentration the majority of cells can
withstand is less than or equal to 1%,
or even as little as 0.1% for certain cells,
meaning that the final concentration
in the compound obtained could be
Author article / Article d'auteur
GUIDE 2014
017
des clés pour bien choisir
les groupements hydrophobes de
l’albumine peuvent fixer les composés
lipophiles, les maintenir ainsi en
solution et les transporter jusqu’aux
cellules. Toutefois il est complexe,
mais pas impossible, de déterminer
quelle quantité de composé a été
réellement fixée et transportée. Si
aucune de ces solutions ne permet
la solubilisation du composé, seule
une application topique à la surface
de tissus reconstruits ou d’explants
de peau humaine est envisageable. Ce
sera le cas de nombreux produits finis
émulsionnés par exemple.
● Toxicité annexe
Toute molécule est potentiellement
toxique, selon sa concentration,
même l’eau ! Il s’agira donc de
déterminer la toxicité intrinsèque
des composés à l’essai (voir plus
loin). Cependant, des ingrédients
peuvent avoir été préparés avec des
conservateurs et les produits finis
contiennent presque toujours des
conservateurs et pour certains des
tensio-actifs, molécules fortement
toxiques ou lytiques pour les cellules.
Ces molécules associées au composé
d’intérêt peuvent donc conduire à
fortement diluer la solution pour éviter
cette toxicité, que nous nommerons
« annexe », au risque de perdre
l’activité du composé à l’essai, trop
dilué. Pour les tests dans lesquels le
composé est dilué dans le milieu de
culture, donc en contact direct avec
les cellules, il est conseillé, quand cela
est possible, de tester des produits
sans conservateurs ni tensio-actifs.
Ce problème peut également être
rencontré avec les composés testés
par application topique sur des tissus
reconstruits dont la différenciation est
incomplète (tissu jeune). L’application
topique, y compris de produits finis
contenant des conservateurs et
des tensio-actifs, sur des explants
de peau est généralement moins
problématique, ou dans le cas
contraire des problèmes d’intolérance
in vivo sont à craindre !
Le choix du modèle
● Tests biochimiques
Bien que le choix soit plus simple que
celui des cellules ou tissus, la réalisation de tests biochimiques, parfois
dits in tubo, nécessite de prendre
quelques précautions. En effet, si
l’évaluation de l’effet est réalisée par
mesure de la densité optique, il est
nécessaire, avant même de commencer l’essai de vérifier que le composé
n’interfèrera pas avec la mesure. Un
composé trouble en solution a toutes
les chances de rendre l’essai impossible. De même, un composé autofluorescent peut perturber une mesure
d’activité basée sur la fluorescence.
A ND
TE S T S
/
TE S T I NG
renders the compound soluble, the only
remaining option is topical application
to the surface of reconstructed tissue or
human skin explants, as will be the case
of many emulsified finished products,
for example.
&
remain that way in solution and transport
them to the cells. It is, however, difficult,
but not impossible, to determine how
much of the compound has actually
been fixated and transported by means
of this process. If none of these solutions
A N A LYS E S
less than 0.0001%! If the compound is
no longer soluble by means of DMSO
or ethanol, it is possible to attempt to
disseminate it using delipidated albumin.
Indeed, hydrophobic albumin groups can
fixate lipophilic compounds, ensure they
A NA LY S I S
of the keys for a good choice
The global information on cosmetics & fragrances
Guide 2014
018
GUIDE 2014
Article d’auteur / Author article
FIGURE 1 :
ÉPIDERME HUMAIN RECONSTRUIT,
IMMUNOMARQUAGE DE LA
TRANSGLUTAMINASE K (EN VERT) ET
COLORATION DES NOYAUX
(EN ROUGE).
RECONSTRUCTED HUMAN EPIDERMIS,
TRANSGLUTAMINASE K IMMUNOSTAINING (IN
GREEN) AND NUCLEI STAINING (IN RED).
A N A LYS E S
&
TE S T S
/
TE S T I NG
A ND
A NA LY S I S
● Tests cellulaires
Le choix du modèle cellulaire est bien
sûr primordial et dépend de l’effet recherché, de la technique d’analyse
qui sera utilisée mais aussi de la nature et de la solubilité du composé
à l’essai. Ainsi, pour la recherche
Guide 2014
● Additional toxicity
Any molecule is potentially toxic,
depending on its concentration - even
water! It is therefore important to establish
the inherent toxicity of a compound at the
test stage (see below). Certain ingredients
may, however, have been prepared with
preservatives and finished products almost
always contain preservatives or, in the case
of certain surfactants, molecules that are
highly toxic or lytic where the cells are
concerned. These molecules, combined
with the compound in question, can
therefore result in the solution being heavily
diluted to prevent this toxicity, which we
will refer to as “additional,“ at the risk of
overly diluting the solution and losing the
efficacy of the compound at the test stage.
In the case of tests in which the compound
is diluted in the culture medium, and
therefore in direct contact with the cells,
it is recommended, where possible, to
test products without any preservatives
or surfactants. This problem might also
be encountered with compounds tested
by means of topical application on
reconstructed tissue that has not yet been
fully differentiated (young tissue). Topical
Expression
Cosmétique
d’effets d’ingrédients hydrosolubles
ou solubilisables en phase aqueuse
via un solvant, les cellules cultivées
en monocouches sont adaptées et
permettent un contact direct entre
les molécules à l’essai et les cellules
cibles. De plus, ce modèle s’affranchit du problème de passage de
la barrière cutanée, problème qui
devra être résolu grâce à la formulation finale. Cependant, certaines
caractéristiques physiologiques des
cellules ne s’expriment que dans les
modèles 3D. C’est le cas de certains
marqueurs protéiques de différenciation des kératinocytes, ou de certains
lipides, notamment des céramides
typiques de la différenciation, terminale. Selon les techniques d’analyses
sélectionnées, la quantité de cellules
ou de tissus nécessaire sera très variable ; le format de culture devra être
adapté, plaques de culture à 6, 12,
24, 48 ou 96 puits.
Les composés totalement
hydrophobes ou les produits finis
contenant des conservateurs ou
des tensio-actifs seront déposés à
la surface de modèles 3D (épiderme
ou peau reconstruits, explants de
peau humaine). Là aussi, selon les
techniques d’analyses sélectionnées,
la quantité de tissus nécessaire
sera très variable ; le format de
culture devra être adapté, peau ou
tissus reconstruits de 0,5 à 3 cm de
diamètre.
application, including that of finished
products containing preservatives and
surfactants, to skin explants is generally
less problematic, or otherwise might lead
to problems of in vivo intolerance!
effect, the analysis technique that will be
used and the nature and solubility of the
compound at the test stage. When investigating the effects of ingredients that are
water-soluble or can be solubilised in the
aqueous phase by means of a solvent,
for example, cells cultivated in monolayer
cultures are well suited and allow for direct contact between the molecules being
tested and the target cells. Furthermore,
this model overcomes the issue of passing
through the cutaneous barrier, a problem
that will need to be resolved with the final
formulation. Certain physiological characteristics of the cells, however, are only
expressed in 3D models, as is the case of
certain keratinocyte differentiation protein
markers and certain lipids, and notably the
ceramides typical of terminal differentiation. The amount of cells or tissue required
will vary greatly depending on the chosen
analysis technique and the culture format
will need to be adapted accordingly, with
6, 12, 24, 48 or 96-well culture plates.
Completely hydrophobic compounds and
finished products containing preservatives
or surfactants will be applied to the surface
of 3D models (reconstructed epidermis or
Choice of model
● Biochemical tests
Although the choice is more straightforward than with cells or tissue, performing biochemical tests, sometimes known
as in tubo tests, does require a number
of precautionary measures to be taken.
Indeed, whilst the effects are assessed by
measuring optical density, it is important
to check that the compound will not interfere with the measurement before initiating the test. A compound that is vague
or problematic in solution is highly likely
to make the test impossible. Likewise, an
autofluorescent compound can disrupt
a fluorescence-based measurement of
efficacy.
● Cell tests
The choice of cell model is, of course,
essential and depends on the desired
Les techniques d’analyse
● Dosages Elisa
Très souvent le dosage ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbant
Assay) permet de quantifier les
molécules secrétées dans le milieu de
culture par les cellules. Les marqueurs
d’inflammation comme les cytokines,
les chimiokines, les prostaglandines
et les leukotriènes par exemple, sont
généralement dosés par Elisa, mais
c’est aussi le cas des protéines de la
matrice extracellulaire (pro-collagène,
Author article / Article d'auteur
GUIDE 2014
019
tropoélastine, fibronectine, etc.). Il est
également possible d’utiliser cette méthode
de dosage pour la quantification de molécules
intracellulaires, après lyse des cellules. Basée
sur la détection de la molécule d’intérêt par un
anticorps spécifique, cette technique simple
peut être toutefois sujette à des artéfacts et les
kits devront être qualifiés dans les règles de l’art.
Tout changement de fournisseur entraînera la
qualification du nouveau kit.
● Microscopie
Les immuno-marquages à l’aide d’anticorps spécifiques révèlent, en microscopie, la localisation des
protéines cibles dans ou à la surface de cellules,
ou encore les protéines déposées et organisées
à la surface du support de culture. Ces anticorps
sont couplés à une molécule fluorescente ou à une
enzyme dont la présence sera révélée par la précipitation de son substrat. L’analyse d’image permet
ensuite de quantifier l’intensité du marquage. Des
sondes fluorescentes introduites dans les cellules
permettent également de révéler des évènements
comme la production de radicaux libres, la libération de calcium ou la communication intercellulaire
(Figure 1).
A NA LY S I S
skin or human skin explants). Here, too, the amount
of tissue required will vary greatly depending on the
chosen analysis technique and the culture format will
need to be adapted, using skin or reconstructed tissue
of 0.5-3cm diameter.
A ND
Analysis techniques
A N A LYS E S
&
TE S T S
/
TE S T I NG
● Elisa dosages
In many cases, the Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay) dosage makes it possible to quantify the
molecules secreted by the cells in the culture medium.
Inflammation markers such as cytokines, chemokines,
prostaglandins and leukotrienes, for example, are generally dosed by Elisa, as is also the case of the proteins
in the extracellular matrix (pro-collagen, tropoelastin,
fibronectin, etc.). It is also possible to use this dosing
method to quantify intracellular molecules after cell
lysis. This basic technique uses a specific antibody to
detect the molecule in question but can, however, be
subject to artifacts and kits will need to be approved
as compliant. Any change of supplier will require the
new kit to be approved.
● Microscopy
Immunostaining using specific antibodies indicates
the location of target proteins in or on the surface of
the cell, or even proteins deposited and arranged on
The global information on cosmetics & fragrances
Guide 2014
020
GUIDE 2014
Article d’auteur / Author article
FIGURE 2 :
WESTERN BLOT & COLORATION AU
BLEU DE COOMASSIE.
WESTERN BLOT & COOMASSIE BLUE
STAINING.
A N A LYS E S
&
TE S T S
/
TE S T I NG
A ND
A NA LY S I S
● Electrophorèse et Western Blot
L’analyse des protéines est souvent
réalisée par électrophorèse. Les
extraits cellulaires sont dissociés et
déposés dans les puits d’un gel de
polyacrylamide. Un champ électrique
est appliqué et les protéines, chargées
négativement, migrent en direction de
Guide 2014
the surface of the culture medium, by
means of microscopy. These antibodies
are combined with a fluorescent molecule
or an enzyme, the presence of which will
be indicated by the precipitation of the
corresponding substrate. It is then possible to use image analysis technology
to quantify the intensity of the staining.
Fluorescent probes inserted into the cells
also help identify occurrences such as the
production of free radicals, the release of
calcium and intercellular communication
(Figure 1).
● Electrophoresis and Western Blot
Protein analysis is often carried out by
means of electrophoresis, whereby cell
extracts are separated and deposited in
wells of a polyacrylamide gel. An electric
field is then applied and the negatively
charged proteins migrate towards the
anode through the links in the gel, at
a speed that varies according to their
size, and are eventually separated. The
proteins can then be identified by means
of Coomassie blue staining, for example
(Figure 2). In any case, the variety of
proteins in a complete cell extract is such
that it can be very complex to distinguish
Expression
Cosmétique
l’anode. En fonction de leur taille, elles
migrent plus ou moins vite à travers
les mailles du gel et sont finalement
séparées. Les protéines peuvent ensuite
être révélées par coloration au bleu de
Coomassie par exemple (Figure 2).
Toutefois, la variété de protéines est telle
dans un extrait cellulaire total, qu’il peut
être très complexe de les distinguer les
unes des autres. L’électrophorèse est
donc souvent suivie par un transfert
des protéines sur une membrane de
nitrocellulose et celle-ci est incubée
en présence de l’anticorps spécifique
de la protéine d’intérêt. L’anticorps
sera ensuite détecté à l’aide d’un
anticorps secondaire couplé à une
enzyme de type phosphatase alcaline
(colorimétrie) ou peroxydase de raifort
(luminescence). Il existe d’autres
méthodes d’électrophorèse, notamment
l’électrophorèse en veine liquide qui
permet d’automatiser l’analyse et
donc de passer de très nombreux
échantillons. Enfin, l’électrophorèse en
gel d’agarose est plus particulièrement
réservée à l’analyse de l’ADN et de
l’ARN.
them from one another. Electrophoresis
is therefore often followed by a transfer
of proteins on a nitrocellulose membrane
and the latter incubated in the presence
of the specific antibody to the protein
in question. The antibody will then be
detected using a secondary antibody
combined with an enzyme such as alkaline
phosphatase (colorimetry) or horseradish
peroxidase (luminescence). There are
other electrophoresis methods, notably
liquid vein electrophoresis, which helps
automate the analysis and therefore to
test a large number of samples. Agarose
gel electrophoresis, meanwhile, is more
specifically reserved for DNA and RNA
analysis.
determine the number of strands of the
mRNA in question that were present
in the sample. In studies designed to
establish the effects of products on
the physiology of the cell, however, it is
more common to compare the treated
sample signal with the control sample
signal, in which case we talk about the
relative value. Such PCR techniques are
highly beneficial when you know what
genes are to be studied. The number
of genes that it is possible to study in
parallel is also limited. Conversely, the
DNA chip technique can now be used
to analyse the effects of a product on the
expression of the genome as a whole.
The Affymetrix technique, for example,
uses nearly 50,000 probes, which covers
virtually the entire human genome. The
power of this technique is phenomenal
but generates just as phenomenal an
amount of data, with each experimental
point providing 50,000 pieces of data!
A number of software programmes
have been developed to help classify
and interpret the results, meaning
that gene expression analysis is now
a powerful means of exploring the
biological properties of a product. In any
● Gene expression
Since the very first public publication
on the PCR (Polymerase Chain
Reaction) by Kary Mullis in 1986, a
number of other gene expression
analysis techniques have been
developed. We mention, here,
only the most recent and the most
widely used. The PCR has evolved
significantly and is now said to be
quantitative since it helps to precisely
● Expression des gènes
Depuis la première publication publique
sur la PCR (Polymerase Chain Reaction)
par Kary Mullis en 1986, bien d’autres
techniques d’analyse d’expression des
gènes ont été développées. Nous ne citerons que les plus récentes et les plus
utilisées. La PCR a beaucoup évolué et
est aujourd’hui dite quantitative car elle
permet de déterminer avec exactitude
le nombre de brins de l’ARNm d’intérêt
qui étaient présents dans l’échantillon.
Toutefois, dans les études d’effets de
produits sur la physiologie des cellules,
il est plus fréquent de comparer le signal
des échantillons traités avec le signal des
échantillons témoins ; on parle alors de
valeur relative. Ces techniques de PCR
sont de grand intérêt lorsque l’on sait
quels sont les gènes à étudier. Le nombre
de gènes qu’il est possible d’étudier en
Author article / Article d'auteur
available, the techniques to be used
and of course the budget available.
With this in mind, it is essential to take
the time to reflect when it comes to
creating the protocol that will offer the
greatest chance of success and providing the person leading the study
with as much information as possible
regarding the product, the anticipated
properties and the reasons thereof, and
any existing benefits. ■
A NA LY S I S
PhD, directeur
général et cofondateur.
PhD, Managing
Director and CoFounder
A ND
The choice of in vitro test should take
into account a large number of factors
that will depend upon the nature of the
product tested, the biological models
BIOALTERNATIVES
TE S T I NG
Conclusion
Alain
Deguercy
/
recommended that what has been
observed in terms of gene expression
be confirmed where the proteins are
concerned (Figure 3).
Le choix d’un test in vitro relève de
nombreux paramètres dépendants de
la nature du produit testé, des modèles
biologiques disponibles, des techniques
utilisables et bien sûr du budget alloué.
C’est pourquoi, il est impératif de prendre
le temps de la réflexion pour construire le
protocole qui offrira le plus de chance de
succès et de communiquer au directeur
d’étude qui conduira le projet un maximum d’informations sur le produit, les propriétés attendues et pourquoi celles-ci, et
les bénéfices déjà connus. ■
TE S T S
case, it is important to bear in mind that
a messenger RNA can be present in the
cells without being expressed as proteins
(control system), meaning that even if
the expression of the gene is increased,
there will still not be any more proteins.
Likewise, an enzyme can be synthesised
but not activated. The increase in the
expression of the corresponding gene
will not, therefore, result in any increase
in enzyme activity. It is therefore highly
Conclusion
&
FIGURE 3 :
EXEMPLE D’ANALYSE « FULL
GENOME » SELON LA MÉTHODE
AFFYMETRIX.
EXAMPLE OF A “FULL GENOME“ ANALYSIS
USING THE AFFYMETRIX METHOD.
génome humain. La puissance de cette
technique est phénoménale mais génère
une quantité tout aussi phénoménale de
données. Chaque point expérimental
fournit 50 000 données ! Des logiciels ont
été développés pour aider au classement
et à l’interprétation des résultats.
L’analyse de l’expression des gènes est
donc un puissant moyen d’exploration
des propriétés biologiques des produits.
Toutefois, il faut bien garder à l’esprit qu’un
ARN messager peut être présent dans les
cellules mais sans être traduit en protéines
(système de contrôle), ce qui veut dire que
même si l’expression du gène est augmentée, il n’y aura pas pour autant plus
de protéines. De même, une enzyme peut
être synthétisée mais pas activée. L’augmentation de l’expression du gène correspondant ne se traduira donc pas par une
augmentation de l’activité enzymatique.
Ainsi, il est très fortement recommandé
de confirmer au niveau protéique ce qui
a été observé au niveau de l’expression
des gènes (Figure 3).
021
A N A LYS E S
parallèle est également limité. À l’inverse,
la technique des puces à ADN permet
aujourd’hui d’analyser les effets d’un
produit sur l’expression de l’ensemble
du génome. Par exemple, la technique
Affymetrix utilise près de 50 000 sondes,
ce qui couvre pratiquement l’intégralité du
GUIDE 2014
The global information on cosmetics & fragrances
Guide 2014