steering committee for the uk stem cell bank and for

BANCO NACIONAL DE LÍNEAS CELULARES (TRONCALES)
National Bank of Stem Cell Lines
IMPRESO DE SOLICITUD DE DEPÓSITO DE UNA LÍNEA
Application Form to Deposit a Human Cell Line
Documentos que se acompañan:
Attached documents:
Copia de la autorización de derivación de la línea celular, junto con informe del Comité Ético del
centro de procedencia.
A copy of the authorization for the derivation of the cell line, with the corresponding ethics
committee approval
Copia de cualquier publicación científica relacionada con la derivación y/o caracterización de la
línea.
A copy of any relevant published scientific papers related to the derivation and/or
characterization of the cell line
C. V. del investigador principal (una página; formato libre).
A one page CV for the Principal Investigator
Otros (especificar).
Others (specify)
ANEXO
SECCIÓN 1
Section 1
Información General
General Information
Nombre de la línea:
Name of the line:
VAL-8
Investigador principal:
Principal Investigator:
Carlos Simón Vallés
Origen de la línea celular:
Origin of the cell line
Embrionario
Fetal
Adulto
Embryonic
Fetal
Adult
¿La línea celular ha sido derivada de un embrión con anomalía genética?
Has the cell line been derived from an embryo with genetic anomaly?
NO
SÍ
No
Yes
(especificar)
(specify)
Identificación genética de la línea celular. Método y resultado
Genetic identity of the cell line. Method and result
Fingerprinting
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Los apartados que requieran entrada de texto, deben rellenarse tanto en Castellano como en Inglés
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SECCIÓN 2
Section 2
Datos del Depositante
Applicant Details
Investigador Principal:
Principal Investigator:
Dirección Postal:
Postal address:
Carlos Simón Vallés
Av. Autopista del Saler, 16
Centro de Trabajo:
Institution:
Teléfono (phone): +34 963 28 96 80
Centro de Investigación Príncipe Felipe (C.I.P.F.)
Fax: +34 963 28 97 01
E-mail: [email protected]
SECCIÓN 3
Section 3
Datos de la Línea Celular
Details of Cell Line
Tipo de muestra biológica (especificar estadio embrionario, semanas de gestación,…)
Kind of biological sample (specify embryonic stage, weeks of pregnancy,...)
Embrión humano en estadío de blastocisto en día 5 de desarrollo.
Human embryo, Blastocyst stage on day 5 of development.
Muestra biológica
Biological simple
Fresco
Fresh
Fecha de la obtención de la
muestra biológica
Date of obtaining the biological
sample
Crioconservado
Cryopreserved
Fecha del uso o descongelación (si congelado)
Date used or thawed (if frozen)
29/05/2008
Congelación: 19/05/2003
Recepción: 31/10/2007
Freeze:
19/05/2003
Reception: 31/10/2007
Fecha de la donación del
muestra biológica
Date of donation of the
biological sample
02/07/2005
Descripción general del procesamiento previo del muestra biológica utilizado (cultivo embrionario,
procesamiento muestra fetal o de tejido adulto)
General description of the processing of the biological sample used (embryonic culture, processing of fetal
sample or of adult tissue)
El embrión vitrificado en estadío de blastocisto y donado fue desvistrificado mediante un protocolo con DMSO y etilenglicol.
Posteriormente fue mantenido en cultivo en medio CCM (Vitrolife) desde día 5 hasta día 6 de desarrollo en el que alcanzó el
estadío de Blastocisto cavitado, y después de ser retirada su zona pelúcida con ácido tyrodes, se puso en co-cultivo con
células de Foreskin irradiadas y medio de cultivo hES y bFGF.
The vitrified and donated embryo was thawed following a devitrification protocol with DMSO and ethilenglicol, and was
maintained in CCM medium (Vitrolife), since day 5 of development until day 6 when get the cavited Blastocyst stage, and
after removed the zona pellucid (ZP) with tyrodes acid, was co-cultured with irradiated Foreskin cells and hES medium plus
bBFG.
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En caso de muestra embrionaria, indicar si se utilizaron blastómeros o células de la masa celular interna
y el método de aislamiento utilizado
If of embryonic origin, indicate whether blastomeres or internal cell mass were used, as well as the isolation
method
Se utilizó un blastocisto completo en el cual fue retirada la zona pelúcida con ácido tyrodes.
A complete blastocyst was used in which the zona pellucida was removed with tyrodes acid.
Origen del soporte celular o acelular utilizado para la derivación, así como de los componentes de los
medios de cultivo (si se describen en publicación, indicar además referencia)
Origin of the cellular or cellular free support used in derivation in addition to the components of the culture
mediums (if they are described in a publication, please indicate the reference).
• Soporte cellular /cellular support : human foreskin fibroblasts CCD1112Sk (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA. Nº catálogo:
CRL-2429).
• Componentes del medio para Feeder / Feeder medium components: 90% Iscoves’ Modified Dulbecco´s médium ((ATCC), nº Catálogo: 30-2005) +
10%Fetal Bovine Serum ((Gibco), nº catálogo:10091148).
• Componentes del medio para hESC/ hESC medium components: 80% Knockout DMEM (Gibco/BRL, Paisley, Scotland, UK; nº catálogo 10829-018), 20%
Knockout SERUM Replacement (Gibco/BRL; nº catálogo: 10828-028), 1 mM L-glutamine solution (Sigma, St. Louis, USA ; nº catálogo: G-7513), 1% MEM non
essential amino acids (100x) (Gibco/BRL; nº catálogo: 11140-035), 0.1 mM β-mercaptoethanol (Sigma; nº catálogo: M-7522), 20 ng/ml human recombinant basic
fibroblast growth factor (bFGF) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA ; nº catálogo: 13256-029)
Valbuena D, Galán A, Sánchez E, Poo ME, Gómez E, Sánchez-Luengo S, Melguizo D, García A, Ruiz A, Moreno R, Pellicer A, Simón C. Derivation and
characterization of three new Spanish human embryonic stem cell lines (VAL-3,-4,-5) on human feeder and in serum-free conditions. Reproductive
BioMedicine Online 2006; 13(6):875-86.
Mantenimiento de la línea: Line maintenance
Ratio de pase: Passage ratio 1:2 - 1:3 Método de pase: Passage method
Xenobióticos
Xenobiotics
mecánico / mechanical
si
Yes
no
No
Descripción de las características morfológicas de la línea en cultivo
(forma y tamaño colonias; forma y tamaño células; ratio núcleo/citoplasma; otros)
Description of the morphological characteristics of the line in culture (form and size of the colonies; form and size
of the cells; nucleus/cytoplasm ratio; others)
Morfología característica de células madre: colonias aplanadas, translúcidas y con bordes definidos, con células
homogéneamente dispuestas en monocapa, y ratio núcleo/citoplasma elevado. Se agrupan en colonias de 3000-5000 células.
Characteristic morphology of human embryonic stem cells: flat colonies, translucent, with defined borders, with cells
homogeneusly located in a monolayer, and a high ratio of nucleus/cytoplasm . Colonies with 3000-5000 cells.
Controles microbiológicos realizados (indicar detalladamente)
Microbiological controls carried out (indicate in detail)
El soporte celular fue testado para: bacterias habituales, Mycoplasma, endotoxinas, citomegalovirus, Epstein-Barr, VHB, VHC,
herpes humano 6(A) y 6(B), VIH1, VIH2, HTLV-I/II, parvovirus y transcriptasa reversa. Los resultados fueron negativos. Los
controles fueron realizados por el Instituto Valenciano de Microbiología (IVAMI), entidad homologada por AENOR, ENAC y
Consellería de Sanitat.
La línea fue testada para Micoplasma y patógenos habituales. De forma rutinaria se realizan controles microbiológicos que
aseguran la ausencia de microorganismos en las condiciones de cultivo utilizadas.
Cellular support was tested for: usual bacteria, Mycoplasm, endotoxin, cytomegalovirus, Epstein-Barr, HBV, HCV, human
herpes 6(A) y 6(B), HIV1, HIV2, HTLV-I/II, parvovirus and reverse transcriptase. Results were negative. Controls were done by
the Instituto Valenciano de Microbiología (IVAMI), homologated by AENOR, ENAC and Consellería de Sanitat.
Cell line was tested for Mycoplasm and common pathogens. Routinely, we perform microbiologic controls that ensure the
absence of microorganisms in the culture conditions used.
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Marcadores:
Markers
Método
(ARN/proteínas)
Method
(RNA/proteins)
nº pase
resultado
Passage n.
results
Oct 4 PCR e inmunocitoquímica (ICQ) / PCR and immunocytochemistry ( ICC)
Nanog
PCR e ICQ/ PCR and ICC
Rex 1
Sox 2
SSEA3
ICQ/ICC
SSEA4
ICQ/ICC
TRA-1-60
ICQ/ICC
TRA-1-81
PCR
Telomerasa/Telomerase
ICQ/ICC
Fosfatasa Alk. /Alkaline phosphatase
bandas G / G bands
Cariotipo / Karyotype
Otros / Others
comentarios
comments
7
7
positivo/positive
positivo/positive
indiferenciación/indiferentiation
indiferenciación/indiferentiation
7
7
7
8
7
8, 19
positivo/positive
positivo/positive
positivo/positive
positivo/positive
positivo/positive
46,XX
indiferenciación/indiferentiation
indiferenciación/indiferentiation
indiferenciación/indiferentiation
indiferenciación/indiferentiation
indiferenciación/indiferentiation
femenino normal/normal female
Cripto, Dnmt3b, Gabr, Gdf3
PCR
6
positivos/positives
indiferenciación/indiferentiation
Nfh
PCR
6
negativo/negative
diferenciación /diferentiation
(ectodermo) / (ectoderm)
Ren
PCR
6
negativo/negative
diferenciación /diferentiation
(mesodermo) / (mesoderm)
Amy
PCR
6
negativo/negative
diferenciación /diferentiation
(endodermo) / (endoderm)
Capacidad de diferenciación
Differentiation capacity
In Vitro
In vitro
Ectodermo/ Ectoderm
marcador pase resultado
marker
passage result
tubulin β-III
positivo
positive
tubulin β-III
In vivo/ in vivo
Método:
Method:
Endodermo/Endoderm
Mesodermo/ Mesoderm
marcador pase resultado
marcador pase resultado
marker
passage result
marker
passage result
α-fetoproteina
positivo
actina muscular
positivo
α-fetoprotein
positive
muscle actin
positive
inducción de teratomas
teratomas induction
Resultado: positivo
Result:
positive
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Descripción de las características de diferenciación in vitro
Description of the differentiation characteristics in vitro
Formación de cuerpos embrioides e inmunocitoquímica para marcadores de diferenciación de ectodermo, mesodermo y
endodermo.
Embryoid bodies formation and immunostaining against differentiation markers from ectoderm, mesoderm and endoderm.
Datos de la determinación de pluripotencialidad in vivo o formación de teratomas
Data of the pluripotentiality determination in vivo or teratoma formation
Inyección intratesticular en ratones SCID de colonias de la línea y posterior análisis morfológico de los teratomas. Obtención
de tipos celulares propios de ectodermo, mesodermo y endodermo.
Cell colonies were injected into the testis of SCID mice and afterwards morphologically analyzed for teratoma formation.
Typical tissues from the ectoderm, mesoderm and endoderm were obtained.
Datos de la tipificación HLA
HLA typification data
A*0201
B*07
Cw*03
DQA1*01
DRB1*0103
DQB1*0501
DPB1*0202
A*31
B*40
Cw*07
DQA1*03
DRB1*0404
DQB1*0302
DPB1*0401
Consistencia celular tras 6 pases de congelación y descongelación. Resultados.
Cell consistency alter 6 passages of freezing and thawing. Results.
La línea celular se mantiene estable tras más de 6 pases siguiendo los procedimientos de congelación y descongelación
propios.
The cell line is stable for more than 6 passages following our freezing and thawing protocol.
Valbuena D., Sánchez-Luengo S., Galán A., Sánchez E., Gómez E., Poo ME, Ruiz V, Genbacev O., Krtolica A., Pellicer A.,
Moreno R., Simón C. An Efficient Slow Freezing hESC Cryopreservation Method in Xeno-Free Conditions without the use of
a programmable freezer. Reproductive BioMedicine Online, 2008 ; 17(1) : 127-135.
Pase en el momento del registro
Passage at the time of the recording
¿Ha sido la línea modificada genéticamente?
Has the line been genetically modified?
Sí Yes
No No
¿Se llevó a cabo un análisis clonal?
Has a clonal analysis been carried out?
Sí/ Yes
No
Resultado / Result
Comentarios/ Comments:
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Otras observaciones o información relevantes (a juicio del Investigador Principal):
Other observations or relevant information (to the discretion of the Principal Investigator):
La línea VAL-8 ha producido teratomas en todos los animales inyectados (6 de 6). De ellos, 5 fueros
teratomas inmaduros y 1 maduro.
Otras observaciones o información relevantes (a rellenar por el BNLC):
Other comments or relevant information (to be completed by BNLC)
Seguimiento de la línea (a rellenar por el BNLC):
Follow up of the line (to be completed by BNLC)
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SECCIÓN 4
Declaración
Confirmo que la información contenida en estos impresos es cierta y asumo total responsabilidad sobre la
misma.
I confirm that the information contained in this form is true and I assume total responsibility for it.
Firma en Representación del Centro / Signature in
Representation of the Centre
Firma del Investigador Principal
Signature of the Principal Investigator
(Representante legal del Departamento/Centro)
(Legal Reprentative of the Department/Centre)
Carlos Simón Vallés
Rubén Moreno Palanques
Fecha/ Date: 09/12/2008
Fecha /Date 09/12/2008
Nombre y Cargo de la Persona Representante del Centro:
Name and Position of the Person Representing the Centre:
Rubén Moreno Palanques. Director General.
Dirección Postal:
Postal Address:
Centro de Investigación Príncipe Felipe
Av. Autopista del Saler, 16-3
46012 Valencia
Teléfono /Telephone: +34 963 28 96 80
Fax: +34 963 28 97 01
E-mail: [email protected]
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
ANEXO
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
MORFOLOGÍA DE VAL-8
(A) Blastocisto (40x), (B) morfología típica de una colonia de VAL-8 (10x).
A
B
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
TIPIFICACIÓN HLA DE VAL-8
Llevado a cabo en el pase 7, por el Centro de Transfusiones de la Comunidad Valenciana.
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
MARCADORES INDIFERENCIACIÓN DE VAL-8
Expresión de antígenos de indiferenciación en VAL-8
Inmunocitoquímica para OCT-4 (A), Nanog (B) (R&D, Minneapolis, MN), SSEA-1 (C), SSEA-4 (D), Tra-1-60 (E) y
Tra-1-81 (F) (Chemicon, Temecula, CA). Barra de escala = 100 μm.
A
B
C
D
E
F
Ensayos de actividad de fosfatasa alcalina en VAL-8
Inmunocitoquímica para isoenzima Fosfatasa Alcalina clon TRA 2-54/2J (Chemicon,Temecula,CA) (A) ; DAPI (B);
Fosfatasa Alcalina + DAPI (C). Barra de escala = 100 μm.
A
B
C
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
Expresión de marcadores moleculares de indiferenciación de VAL-8
RT-PCR positiva en pase 6 para Oct-3/4 (1), Nanog (2) Cripto (3), Dnmt3 (4), Gabr (5), y Gdf (6) y negativa para
Nfh (7), Ren (8) y Amy (9). El control interno de expresión utilizado es Gapdh (10).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Determinación de la existencia de actividad telomerasa en VAL-8
La detección de la actividad telomerasa característica de células inmortales se ha realizado mediante una
reacción de PCR utilizando un kit específico (TRAPEZE ® Telomerase Detection Kit; Chemicon, Australia) y tinción
con SYBR® (Molecular probes, USA). El análisis de la actividad telomerasa se realizó sobre células intactas de
VAL-8 en pase 8 (1) y sobre células inactivadas por calor (2)
1
2
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
ESTUDIO DEL CARIOTIPO DE VAL-8
Llevado a cabo en el pase 8, por un laboratorio independiente (IVI Murcia, España).
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
PLURIPOTENCIALIDAD DE VAL-8
Diferenciación espontánea in vitro de VAL-8
Por flotación, en placas de no adhesión, se generan cuerpos embriodes y se mantienen en esas condiciones entre
4 y 7 días. Barra de escala = 1000 μm.
Transcurrido ese tiempo, los cuerpos embrioides se transfieren a placas cubiertas con gelatina 1% para facilitar su
adhesión. Tras 10-14 días, se fijan y se analizan marcadores de diferenciación característicos de (A) ectodermo
(tubulin, β-III), (B) mesodermo (actina muscular) y (C) endodermo (α-fetoproteína). Barra de escala = 50 μm para
(A) y (C) y 20 μm para (B).
A
B
C
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
Diferenciación espontánea in vivo de VAL-8
Para desarrollar los experimentos de diferenciación in vivo de las líneas, se utilizan ratones macho de 8 semanas
de edad, con inmunodeficiencia severa combinada (SCID). Las colonias de células madre utilizadas se aíslan
mecánicamente de la monocapa de feeder. Se inyectan 30 colonias por testículo. La aparición de tumores se
puede detectar por palpación transcurridas 8 semanas de la inyección. El desarrollo de los mismos se mantiene
durante 2-4 semanas más, momento en el que los animales se sacrifican por desnucación cervical.
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
Las muestras son fijadas y enviadas para estudio anatomopatológico por parte de un laboratorio independiente
(CITOPAT, S.L.).
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
Microscópicamente, la búsqueda se orienta hacia la identificación de tejidos fácilmente distinguibles como (A)
entramado fibrilar, (B) osificación endocondral o (C) glándulas. Barra de escala = 100 μm.
A
B
C
Para confirmar la presencia de derivados de las tres hojas embrionarias, se analizan marcadores de diferenciación
característicos de (A) ectodermo (tubulin, β-III), (B) mesodermo (actina muscular) y (C) endodermo (αfetoproteína). Barra de escala = 100 μm.
A
B
C
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE VAL-8
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
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NODO COMUNIDAD VALENCIANA
SOPORTE CELULAR
Ficha técnica y análisis microbiológicos del Feeder utilizado en la derivación y mantenimiento de las
líneas:
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