Agarose- Gel-Elektrophorese

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AgaroseGel-Elektrophorese
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I n f o & m o r e
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Agarose-Gel-Elektrophorese • AppliChem © 2009
2 Puffer-Systeme
28
2.1 TAE-Puffer
2.2 TBE-Puffer
2.3 MOPS-Elektrophorese-Puffer (10X)
2.4 BPTE-Elektrophorese-Puffer (10X)
2.5 Alkalischer Agarose-Gel-Elektrophorese-Puffer (10X)
2.6 TAFE-Elektrophorese-Puffer
2.7 TPE-Elektrophorese-Puffer
2.8 TTE-Elektrophorese-Puffer
2.9 Low-Molarity Conductive Media
28
29
30
31
32
32
33
34
34
3 Trennkapazität
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4 Farbstoffe
36
4.1 Nukleinsäure-Farbstoffe-Übersicht
4.2 Protein-Farbstoffe-Übersicht
36
38
5 Glossar
40
6 Verwandte Produkte
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1.1 Agarose: Die chemische Struktur und ihre Eigenschaften
1.2 Die Alternativen: Stärke- und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
1.3 Anwendungen: Agarose in der Gel-Elektrophorese
1.4 Native und denaturierende Agarose-Gel-Elektrophorese
1.5 Modifikationen der Agarose-Gel-Elektrophorese
1.6 Isolierung von Nukleinsäuren aus der Agarose-Gel-Matrix
1.7 Agarosen: Auswahlkriterien
1.8 Die Charakteristika der AppliChem-Agarosen
1.9 Anwendungstipps
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2
I
1 Das Trennmedium Agarose
und Alternativen dazu © 2009 AppliChem • Agarose-Gel-Elektrophorese
1
e
1
as Trennmedium Agarose
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und Alternativen dazu
1.1 Agarose: Die chemische Struktur und ihre Eigenschaften
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s
Agarose wird aus den Zellwänden ausgewählter Rotalgen (Rhodophyceae) gewonnen. Dazu wird
Agaropektin, ein „Klebstoff“ der Zellwand aus verzweigten, vielfach modifizierten und geladenen
Polysacchariden, entfernt. Nach der weiteren chemischen Modifizierung erhält man eine sehr reine
Abb. 1.1: Agarose ist aus
1,3-glycosidisch verbundenen
Einheiten von 1,4-glycosidisch
verknüpfter β-D-Galacto
pyranose und 3,6-Anhydro-αL-Galactopyranose aufgebaut.
A
g
a
Agarose mit den erwünschten elektrophoretischen Eigenschaften: Das lineare, ungeladene Molekül
zeigt wenig Interaktion mit anderen Molekülen wie Proteinen und Nukleinsäuren. Diese Eigenschaft
spiegelt sich in geringen Elektroendoosmose (EEO)-Werten wieder.
Die durchschnittliche relative Molekularmasse von Agarose beträgt etwa 120.000. Wenn die
Agarose geschmolzen wird, verflechten sich in den Gelen die langen unverzweigten AgaroseMoleküle zu Helizes, die wiederum Suprafasern ausbilden (‘polymerisieren’ Abb. 1.2). Das so
entstandene Agarose-Netzwerk bildet Poren mit 100 bis 300 nm Durchmesser (Brown 1988). Die
Porengröße wird durch die Agarose-Konzentration bestimmt. Neben dem Puffersystem ist sie der
entscheidende Parameter für das Trennvermögen von Agarose-Gelen (siehe Tabelle Trennkapazitäten
im Abschnitt 3). Die Grenzen des Auflösungsvermögens ergeben sich aus dem kleinsten
Porendurchmesser; Agarose-Gele liefern gute Auftrennung bei Nukleinsäuren >50 Basenpaare
(bp). Kleinere Nukleinsäuren trennt man meist auf Polyacrylamid-Gelen auf (siehe Abschnitt 1.2).
Die Maximalgröße von auftrennbarer DNA liegt bei etwa 25.000 bp. Auch größere Moleküle werden
noch auf Agarose getrennt. Dazu werden aber Anpassungen des Elektrophorese-Protokolls mit
wechselnden Spannungsfeldern notwendig (siehe hierzu auch Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE)
im Abschnitt 1.3.4).
Agarose wird in der Regel als feines Pulver geliefert. Die Löslichkeit der Agarosen ist nicht gleich.
Manche lösen sich besser, manche schlechter, vor allem wenn sie in höheren Konzentrationen
2
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s
eingesetzt werden. Speziell Low Melt Agarosen müssen zum Teil autoklaviert werden, damit sie
überhaupt in Lösung gehen. Wenn die Agarose zum Auflösen autoklaviert wird, ist darauf zu achten,
dass sie sich nicht in einer Lösung mit einem pH-Wert niedriger als pH 5,5 befindet, da sie dann
hydrolysiert. Als Folge wird das Gel nicht fest! Die Lösung muss also gepuffert sein – reines Wasser
kann nicht verwendet werden. Aufgrund des niedrigen Gelierpunktes empfiehlt es sich die Gele
bestimmter Low Melt Agarosen vor Gebrauch für mindestens eine Stunde, manchmal auch über
Nacht bei +4°C zu lagern, da dadurch bei der Elektrophorese eine maximale Auflösung erreicht
wird. Selbst der Gellauf ist dann am besten im Kühlraum durchzuführen, damit sie sich nicht wieder
verflüssigt.
[1]Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) 1995 Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York.
[2] Brown, T.A. (1998) Molecular Biology Labfax, 2nd ed., Vol. 1. Academic Press, London
o
Literatur
A
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a
Abb. 1.2: Lineare AgaroseMoleküle lagern sich
zu Doppelhelizes und
miteinander verwobenen
Suprafasern zusammen
und bilden die Gelmatrix.
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[3]Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
© 2009 AppliChem • Agarose-Gel-Elektrophorese
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A l t e r n a t i v e n
1.2 Die Alternativen:
Stärke- und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
Leider kommt man im Labor selten mit nur einer Gelmatrix aus, da nicht alle Anwendungen mit
einer Matrix durchzuführen sind. Jede Methode hat ihre Stärken und Schwächen. Weitere Matrizes
zur Trennung von Makromolekülen sollen hier nur kurz vorgestellt werden: Stärke und
Polyacrylamid.
1.2.1 Die Stärke-Gel-Elektrophorese taucht in den allgemeinen, molekularbiologischen
Methodenbüchern von heute gar nicht mehr auf. Die Zonen-Elektrophorese mit Stärke-Gelen wurde
zur Trennung von Serumprotein eingeführt (Smithies 1955).
Hydrolysierte Kartoffelstärke wird zu 10-15 % (w/v) in konzentriertem Puffer gelöst und nach
Erhitzen zu einer 0,5-1 cm dicken Gelmatrix gegossen. Die Herstellung der Gele ist etwas auf
wändiger, zudem gelten die Ergebnisse als schlecht reproduzierbar. Stärke-Gele sind brüchig und
weniger transparent als Agarose- oder Polyacrylamid-Gele. Allerdings sind Gele aus der über
wiegend naturbelassenen Stärke eine enzymfreundliche Matrix und werden in der Aufreinigung von
Enzymen und Serumprotein weiterhin verwendet. Auch für Zymogramme, bei denen der ProteinNachweis auf dem Nachweis der Enzymaktivitäten im Gel beruht, werden Stärke-Gele verwendet
(z.B. Silva et al. 2008).
Die ursprüngliche Methode nach Smithies wurde vielfach modifiziert; z.B. eine zweidimensionale,
vertikale Variante (Poulik & Smithies 1958). In Kombination eröffnen die Eigenschaften von Stärke,
Agarose und Polyacrylamid zusätzliche Möglichkeiten. In der Literatur finden sich zahlreiche
Beispiele für solche kombinierten Systeme, beispielsweise Stärke-PAGE oder in-Gel Tests (Fontanini
et al. 2007).
1.2.2 Die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) ist eine vielseitige und die am weitesten
verbreitete Methode zur Trennung von Peptiden und Proteinen sowie für Nukleinsäuren. PA-Gele
werden durch die Polymerisation von Acrylamid-Monomeren zu langen Ketten und deren
Quervernetzung mittels bifunktionalen Molekülen (Cross-Linkern), wie Bisacrylamid (N,N'Methylenbisacrylamid), hergestellt. Ammoniumpersulfat (APS) dient als Initiator der Polymerisation
von Acrylamid, TEMED katalysiert die Bildung freier Radikale des Initiators.
Das Ergebnis der Poylmerisation von Acrylamid und Cross-Linkern ist eine definierte Matrix mit
regelmäßiger Porengröße. Die Porendurchmesser werden durch die Gesamtkonzentration an
Acrylamid und durch das Verhältnis von Acrylamid zu Cross-Linker, welches den Vernetzungsgrad
bestimmt, eingestellt.
4
N,N‘-Methylenbisacrylamid
Aussschnitt aus der chemischen Struktur einer Polyacrylamid-Matrix.
Die PAGE findet in zwei grundsätzlich unterschiedlichen Variationen Anwendung:
1.PA-Gele für die native Gel-Elektrophorese bestehen aus Polyacrylamid und Puffer ohne Zusatz
von denaturierenden Substanzen. Damit bleiben Sekundärstruktur und Strukturen höherer
Ordnung während der Elektrophorese weitgehend erhalten.
2.Gele mit Zusätzen, die Moleküle während der Trennung im denaturierten Zustand erhalten,
werden als denaturierende Gele bezeichnet. Beispielsweise wird die Analyse sehr kleiner RNA
und Einzelstrang-DNA in Harnstoff-haltigen PA-Gelen durchgeführt. Harnstoff unterbricht die
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen der Nukleinsäuren und ermöglicht damit
die Trennung von Oligonukleotiden nahezu ausschließlich nach ihrer Masse ohne den Einfluss
der Struktur. Vielfach wird auch mit Agarosen denaturierende Gel-Elektrophorese von RNA
durchgeführt (siehe 1.4).
Literatur
[1]Fontanini, D. et al. (2007) J. Agric. Food Chem. 55, 4334-4339. Simplified electrophoretic assay for human salivary
alpha-amylase inhibitor detection in cereal seed flours.
[2]Hames, B.D. (1990) Kapitel 3 in Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach 2nd ed. (Hames, B.D. &
Rickwood, D. eds.) IRL Press
[3]Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
Bacteriophage T4.
[4]Ogden, R.C. & Adams, D.A. (1987) Methods Enzymol. 152, 61-87. Electrophoresis in agarose and acrylamide gels.
[5]Poulik, M.D. & Smithies, O. (1958) Biochem. J. 68, 636-643. Comparison and combination of the starch-gel and
filter-paper electrophoretic methods applied to human sera: two-dimensional electrophoresis.
[6]Silva, C.A., et al. (2008) Genet. Mol. Res. 7, 791-805. Isoenzyme electrophoretic patterns in discus fish (Symphysodon
aequifasciatus Pellegrin, 1904 and Symphysodon discus Heckel, 1840) from the Central Amazon.
[7]Smithies, O. (1955) Biochem. J. 61, 629-641. Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum
proteins of normal human adults.
A l t e r n a t i v e n
Acrylamid
5
A n w e n d u n g
1.3 Anwendungen: Agarose in der Gel-Elektrophorese
Die Vielfalt der zu trennenden Biomoleküle erfordert entweder eine Vielfalt an Techniken oder eine
flexible Technik. Gerade die Agarose hat hier viel zu bieten. Durch die Auswahl einer Agarose mit
entsprechenden chemisch-physikalischen Eigenschaften und gleichzeitiger Variation des
Puffersystems und der Agarose-Konzentration, können ein sehr breites Spektrum an Methoden
abgedeckt und enorme Unterschiede in den Trenneigenschaften erzielt werden. Dies gilt sowohl für
die Auftrennung von Proteinen, als auch für Nukleinsäuren. Agarosen sind grundsätzlich eher für
die Auftrennung größerer Moleküle geeignet, wobei auch bei höheren Konzentrationen gute
Ergebnisse für kleinere Fragmente erzielt werden.
1.3.1 Analytische Gele dienen in der Regel dem Sichtbarmachen von Unterschieden im
Wanderungsverhalten der Moleküle im Gel. Man will wissen, wie groß zum Beispiel ein
Nukleinsäure-Fragment ist. Die Fragestellung bei Nukleinsäuren heißt häufig: Hat man das richtige
Fragment in einen Vektor kloniert?! Die Größe wird durch Vergleich mit den Banden eines
Größenstandards ermittelt. Die Fragmentgrößen des Standards, auch Marker genannt, sind
bekannt.
1.3.2 Präparative Gele werden dann eingesetzt, wenn man ein Molekül aufreinigen möchte. Eine
Mischung von Fragmenten wird elektrophoretisch aufgetrennt und gezielt die Bande mit dem
gewünschten Fragment aus dem Gel herausgeholt. Hierfür gibt es verschiedene Techniken: Nach
dem Ausschneiden oder Ausstanzen der Bande wird die Nukleinsäure durch Elektroelution, Verdau
der Agarosematrix durch β-Agarase oder Schmelzen der Agarose in Natriumiodid und anschließen-
der Bindung der Nukleinsäure an eine Silikamatrix, gereinigt (s.u.).
1.3.3 Manipulationen von Nukleinsäuren im Gel ersparen Zeit. Diese „In-gel applications“ werden nach Verflüssigung der Gelmatrix ohne deren Beseitigung durchgeführt. Bei den angewendeten
Temperaturen schmilzt die DNA nicht. Zu den Einsatzgebieten zählen enzymatische Verdaus, 'Nick
translation', Ligationen und DNA-Markierungen. Geeignet sind demnach Agarosen mit einem niedrigen Schmelzpunkt.
1.3.4 Die Gel-Elektrophorese im gepulsten Feld (englisch: Pulsed Field Gel Electrophoresis;
PFGE) ist eine Technik zur verbesserten Auftrennung besonders großer DNA-Moleküle (>20 kb).
Da in der normalen Gel-Elektrophorese Moleküle nach deren Länge aufgetrennt werden, ist eine
Trennung sehr großer Moleküle praktisch nicht möglich. Daher wurde diese Technik modifiziert:
Das elektrische Feld wird während des Gellaufs geographisch geändert, weshalb sich Moleküle neu
ausrichten müssen. Kleinere Moleküle schaffen dies einfach schneller als große.
1.3.5 Zur Identifizierung eines Individuums wird die Technik des ‘DNA typing’ eingesetzt. Im
menschlichen Genom, das von Mensch zu Mensch um weniger als ein Tausendstel variiert, sind
variable Regionen vorhanden, in denen sich die Unterschiede „häufen“. Statt das Genom oder Teile
davon zu sequenzieren, vergleicht man mehrere dieser Regionen und kann so ein individuelles
Profil eines jeden Menschen erstellen.
6
M
pDNA
pDNA
M
Abb. 1.3: Agarose-Gel auf einem Gelträger
nach der Elektrophorese.
Marker-DNA (M) und unbekannte Proben
von Plasmid-DNA (pDNA) wurden getrennt
und mit Ethidiumbromid gefärbt.
Die dunklen Banden werden durch die so
genannten ‘tracking dyes’ Bromphenolblau
bzw. Xylencyanol hervorgerufen. Sie erleichtern die Orientierung bezüglich der bereits
zurückgelegten Laufstrecke.
Abb. 1.4: Beispiel eines
DNA-Markers; hier:
AppliChem DNA Ladder
100 bp (Artikel-Nr. A3470).
Fragmentlängen und Massen
der einzelnen Fragmente
sind definiert und erlauben
die Abschätzung der Größe
und Masse einer
unbekannten Probe.
A n w e n d u n g
1.3.6 Kapillarelektrophorese wird in Kapillaren/Glasröhrchen durchgeführt und nicht im
Flachbett, wie die übliche Agarose-Gel-Elektrophorese. Ziel ist eine teilweise Automatisierung.
1.3.7 Bei der Immun-Elektrophorese macht man sich die Bildung von Markromolekülen,
bestehend aus vielfachen Antigen-Antikörper-Einheiten, zunutze. Diese präzipitieren, wenn das
Mengenverhältnis Antigen-Antikörper richtig eingestellt wurde.
1.3.8 Blotting ist im engeren Sinne keine elektrophoretische Anwendung. Mit dieser Technik
werden Moleküle, die zuvor im Agarose-Gel aufgetrennt wurden, auf eine andere Matrix (BlottingMembran) im elektrischen Feld oder durch den Flüssigkeitsstrom im Kapillar-Blot übertragen.
1.3.9 In der Zell- und Gewebekultur werden feste oder halbfeste Kulturmedien eingesetzt.
Hierbei kann Agarose den häufig verwendeten Agar ersetzen. Einsatzgebiete sind die Pflanzenzüchtung,
dreidimensionale Zell- und Gewebekulturen, einschließlich der Klonierung von Hybridomazellen,
der Herstellung von Pflanzenprotoplasten und dem viralen Plaque-Asssay.
7
nativ+denaturiert
1.4 Native und denaturierende Agarose-Gel-Elektrophorese
In der Regel werden Nukleinsäuren unter nicht-denaturierenden (= nativen) Bedingungen aufgetrennt. D.h. bei der elektrophoretischen Auftrennung spielen Ladungsverhältnisse, Größe und Form
des Moleküls eine Rolle.
Eine spezielle Ausnahme bildet die RNA in der Agarose-Gel-Elektrophorese. Als einzelsträngiges
Molekül ist sie in der Lage durch intramolekulare Basenpaarungen eine Sekundärstruktur auszubilden, die die Auftrennung nach Molekülgröße verfälscht. Daher wird die RNA entweder durch Zugabe von Formaldehyd/Formamid oder deionisiertem
Glyoxal/DMSO denaturiert. Formaldehyd bildet instabile Schiff-Basen mit der Iminogruppe des Guanosin,
weshalb Formaldehyd im Ladepuffer und im Gel
vorhanden sein muss. Es wird meist in einer
Endkonzentration im Gel von 2,2 M zugegeben. Der
Ladepuffer enthält neben Formaldehyd auch
Formamid (z.B. Ref. 1 Seite 4.9.3).
Formaldehyd-haltige Gele werden unter
dem Abzug gegossen! Achtung, die
Dämpfe sind schädlich. Die Gele sind
weniger stabil als nicht-denaturierende
Agarose-Gele. Die hohe FormaldehydKonzentration im
Gel gewährleistet, dass während des gesamten langen Gellaufes (ca. 5 h) die Denaturierung der RNA erhalten bleibt. Für
kürzere Läufe (2-3 h) kann die Konzentration bis auf 0,4 M reduziert werden (2).
Die Denaturierung in DMSO (50-60 %)/Glyoxal (0,88-1,2 M) erfolgt erst vor dem
Laden. Dies ist möglich, weil die RNA glyoxyliert wird und diese Verbindungen bei
pH-Werten unter 7,0 stabil sind. Achtung: Oxidationsprodukte des Glyoxal würden die RNA schädigen. Daher muss es immer deionisiert eingesetzt werden.
Welche der beiden Denaturierungsmethoden ist vorzuziehen? Die RNA-Banden
sind nach Glyoxal-Behandlung schärfer als mit Formaldehyd. Allerdings lässt sich
Formaldehyd leichter von der RNA entfernen, was für den eventuell folgenden
Northern-Blot von Vorteil ist. Der Gesundheitsaspekt im Fall von Formaldehyd
nimmt an Bedeutung zu!
Geht es bei der RNA-Auftrennung nur darum, eine RNA-Isolierung zu prüfen, genügen
oft auch native Agarose-Gele ohne entsprechende Zusätze. Ribosomale RNAUntereinheiten werden klar getrennt.
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Guanin
Schiff-Base
Formaldehyd
Guanosin
Schiff-Base
Literatur
[1]Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995) Current
Protocols in Molecular Biology. Seite 4.9.1 ff Suppl. 67. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York. (Analyse
von RNA durch Northern und Slot Blot Hybridisierung).
[2]Goda, S.K. & Minton, N.P. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 3357-3358. (Einfache Methode für Gel-Elektrophorese und
Northern-Blotting von RNA.)
[3]Rave, N. et al. (1979) Nucleic Acids Res. 6, 3559-3567 (Identifizierung der Prokollagen-mRNA nach Transfer aus
Formaldehyd-Agarose-Gelen.)
[4]Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Seite 7.28. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. (Auftrennung von RNA entsprechend der Größe; Protokolle
5 und 6).
nativ+denaturiert
Formaldehyd
9
M o d i f i k a t i o n
1.5 Modifikationen der Agarose-Gel-Elektrophorese
Neben den zuvor beschriebenen Standard-Anwendungen, gibt es auch Modifikationen, die an
spezielle Erfordernisse angepasst wurden. Im Folgenden werden einige dieser wahrscheinlich eher
selteneren Anwendungen vorgestellt.
1.5.1 Polyvinylpyrrolidon-Agarose-Gel-Elektrophorese: Ziel dieser Modifikation ist die
Isolierung von PCR-amplifizierbarer DNA aus Bodenproben. Der Zusatz von Polyvinylpyrrolidon
(PVP) zur Agarose-Matrix bremst die Wanderung von denaturierenden Huminsäuren mit phenolischen Gruppen aus der Probe so stark, dass sie nicht mehr mit den Nukleinsäuren wandern. Auch
das phenolische Bromphenolblau wird zurückgehalten, während Xylencyanol unverändert wandert.
PVP in einer Konzentration über 0,5 % hemmt die PCR.
Laufbedingung
Laufpuffer
Low Melt Agarose
PVP
5 V/cm (über Nacht)
TAE oder TBE (sind gleichwertig)
1,25 % (w/v)
2 % (w/v)
Young, C.C. et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59(6), 1972-1974
1.5.2 ‘Electrophoretic Mobility Shift Assay’ (EMSA) mittels Agarose-Gel-Elektrophorese:
Eigentlich werden EMSAs nur in 3,5 %-5 % Polyacrylamid-Gelen durchgeführt, weil kleine DNAFragmente und kleinere Proteine im Agarose-Gel nicht gut zu trennen sind. Eine Alternative stellen
gemischte Agarose-Polyacrylamid-Gele dar. In dieser Publikation wird beschrieben, dass die
Immobilisierung von Synergel™, einem chemisch-modifizierten Galactomannan, in der AgaroseMatrix zu einer großen Verbesserung der Auflösungskapazität des Agarose-Gels führt. Bis zu 30 bp
kleine DNA-Fragmente, gebunden an den Glucocorticoid-Rezeptor, konnten getrennt werden.
Laufbedingung
Laufpuffer
Agarose
Synergel™
Vorlauf 70 V für 45 min. bei +4°C
Auftrennung 70 V für 3 h bei +4°C
0,5X TBE
1,2 %
1,2 %
Chandrasekhar, S. et al. (1998) BioTechniques 24, 216-218
10 Agarose-Gel-Elektrophorese • AppliChem © 2009
Laufbedingung
Laufpuffer
Agarose (resolve)
Agarose (stacking)
15 V/cm konstant Volt
1X TBE-SDS (89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, 0,1 % SDS)
7 % (w/w)
1 % (w/w)
Wu, M. & Kusukawa, N. (1998) BioTechniques 24, 676-678. SDS Agarose Gels for Analysis of Proteins. [Für das Resolving
Gel kann Agarose IMG Art.-Nr. A2121 – und für das Stacking Agarose MP Art.-Nr. A1091 eingesetzt werden.]
A
M o d i f i k a t i o n
1.5.3 SDS-Agarose-Gel-Elektrophorese für Proteine: Die klassische SDS-PAGE für die
Auftrennung von Proteinen lässt sich auch mit Agarosen durchführen. Dazu wird eine hochauf
lösende Agarose (Resolving Gel) mit einer Agarose mit hoher Gelstärke (Stacking Gel) kombiniert.
Sowohl die Sensitivität bei Färbung mit Coomassie®, als auch die Transfereffizienz beim Blotten sind
bei SDS-Agarose besser, als bei der klassischen SDS-PAGE (Wu & Kusukawa 1998).
11
I s o l i e r u n g
1.6 Isolierung von Nukleinsäuren aus der Agarose-Gel-Matrix
1.6.1 Elektroelution
Die Technik der Elektroelution erlaubt grundsätzlich die Isolierung aller DNA-Fragmentgrößen aus
Agarose-Gelen, aber besonders die Isolierung großer DNA-Fragmente (≥2 kb), da so gut wie keine
Scherkräfte auf die DNA wirken. Dazu wird das gewünschte DNA-Fragment aus dem Gel ausgeschnitten, in einen Dialyse-Schlauch überführt und dieser mit TAE-Puffer gefüllt. Der gefüllte
Dialyse-Schlauch wird in die mit TAE-Puffer gefüllte Gelkammer gelegt. Man lässt die DNA im elektrischen Feld in den TAE-Puffer wandern.
Protocols in Molecular Biology. Seite 2.6.1 ff Suppl. 59. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York.
(Isolierung und Analyse großer DNA Restriktionsfragmente aus Agarose-Gelen).
1.6.2 β-Agarase (Artikel-Nr. A4712)
(EC 3.2.1.81 aus Pseudomonas atlantica)
Wie wahrscheinlich für jedes polymere Naturprodukt, gibt es auch Enzyme die Agarose verdauen
können. Üblicherweise wird dafür rekombinante β-Agarase aus Pseudomonas atlantica verwendet. Das Enzym verdaut spezifisch das Polysaccharidgerüst der Agarose, bestehend aus 1,3-verknüpfter β-D-Galactopyranose und 1,4-verknüpfter 3,6-Anhydro-α-L-Galactopyranose, zu
Neoagaro-Oligosacchariden. Die Technik des Agarose-Verdaus ermöglicht besonders die Isolierung
großer DNA-Fragmente (≥10 kb), da so gut wie keine Scherkräfte auf die DNA wirken, die ansonsten bei allen anderen Isolierungstechniken auftreten. Die DNA bzw. RNA lässt sich durch AlkoholPräzipitation einfach isolieren. β-Agarase ist im pH-Bereich zwischen 5,0-8,5 aktiv, das Optimum
liegt bei 6,0. Die optimale Temperatur liegt bei 40-42°C. Eine Agarase-Einheit verdaut 100 µl (ca.
100 mg) geschmolzener 1%iger low melt-Agarose bei 42°C innerhalb von 30 Minuten in 1X TBEPuffer. Die Erhöhung der Temperatur auf 45°C beschleunigt zwar die Reaktion, senkt aber die
Stabilität. Über 50°C wird das Enzym schnell inaktiviert. Die so erhaltenen Nukleinsäuren können
für viele weitere Versuche wie z.B. Restriktionsendonuklease-Verdau, Ligation, Markierung,
Sequenzierung, Amplifikation etc. verwendet werden. Um eine Kopräzipitation der AgaroseOligosaccharide zu vermeiden, sollte die Präzipitation bei Raumtemperatur mit Ammoniumacetat
(statt Natriumacetat) ausgeführt werden. Dabei ist allerdings zu beachten, dass Ammonium-Ionen
bereits in Konzentrationen über 7 mM die Polynukleotidkinase hemmen. Falls die isolierte DNA
phosphoryliert werden soll, muss Natriumacetat verwendet werden.
Folgende AppliChem-Agarosen sind für den Verdau mit β-Agarase geeignet: A2121 Agarose IMG,
A2119 Agarose Low Melt 3, A3762 Agarose Low Melt Large DNA grade.
[1]Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (1995). Current
Protocols in Molecular Biology. Suppl. 59. Seite 2.6.6-2.6.7. John Wiley & Sons, New York.
[2]Morrice, L.M. et al. (1983). Eur. J. Biochem. 135, 553-558. β-Agarase I and II from Pseudomonas atlantica.
Purification and some properties.
[3]Sambrock, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition; Seite 5.33-5.35. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Protokoll zum Verdau der Agarose
1.Zur Ermittlung des Gewichtes des Agarose-Stückes wird zunächst das leere Reaktionsgefäß
gewogen und erst dann mit dem Agarosestück, um den Differenzbetrag
zu ermitteln.
2.Für die Isolierung der Nukleinsäure wird die Bande möglichst präzise
aus dem Agarose-Gel geschnitten und in dem 1,5 ml Reaktionsgefäß
bei bis zu 70°C vollständig geschmolzen.
Achtung: Höhere Temperaturen können zum
Schmelzen der DNA führen. Es sollten pro Ansatz
nicht mehr als 200-500 mg Agarose eingesetzt werden.
Nicht vollständig geschmolzene Agarose wird auch nicht
vollständig hydrolysiert.
3.Das Reaktionsgefäß wird dann für ca. 10 Minuten in einem
Wasserbad bei 40-42°C inkubiert, um auf die für den Verdau optimale Reaktionstemperatur einzustellen.
4.Durch Zugabe von einer Einheit der β-Agarase pro 100 µl (ca. 100 mg) geschmolzener Agarose,
wird die Agarose 30 Minuten bei 40-42°C verdaut. Wenn höhere Agarose-Konzentrationen verwendet wurden, wird die Menge an Agarase proportional erhöht.
Reinigung der DNA (große Fragmente)
1.Fragmente größer als 30 kb müssen besonders vorsichtig behandelt werden, um mechanische
Zerstörung durch Scherkräfte zu vermeiden. Deshalb werden nach dem Verdau durch Agarase
unverdaute Kohlenhydrate für ca. 10 Minuten bei 15000 x g abzentrifugiert.
2.Oligosaccharide und Agarase werden durch Dialyse entfernt. Die DNA kann aber auch in der
geschmolzenen Agarose weiter bearbeitet werden.
P r o t o k o l l
Literatur
13
P r o t o k o l l
Reinigung der DNA (kleine Fragmente)
1.DNA-Fragmente kleiner als 30 kb können durch Ethanol-Präzipitation von der verdauten
Agarose abgetrennt werden. Zur hydrolysierten Agarose wird Salz zugegeben: Entweder
Ammoniumacetat (Endkonzentration 2,5 M) oder Natriumacetat (Endkonzentration 0,3 M).
Achtung: Um eine Kopräzipitation von Agarose-Oligosacchariden zu vermeiden, sollte die
Präzipitation bei Raumtemperatur mit Ammoniumacetat statt Natriumacetat ausgeführt werden.
Dabei ist allerdings zu beachten, dass Ammonium-Ionen bereits in Konzentrationen über 7 mM
die Polynukleotidkinase hemmen. Wenn also die isolierte DNA phosphoryliert werden soll, muss
Natriumacetat verwendet werden.
2.Nach Salzzugabe wird 5 Minuten auf Eis inkubiert und dann bei 15000 x g für 10 Minuten
abzentrifugiert.
3.Der Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß transferriert und entweder 1 Volumen
Isopropanol oder 2-3 Volumina Ethanol zugegeben. Vorsichtig mischen und für mindestens
30 Minuten bei 0°C bis 22°C inkubieren.
4.Bei 15000 x g für 15 Minuten zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet trocknen.
Die DNA wird in Abhängigkeit von der weiteren Behandlung in einem geeigneten Puffer gelöst.
Folgende AppliChem-Agarosen sind für den Verdau mit β-Agarase geeignet: A2121 Agarose IMG,
A2119 Agarose Low Melt 3, A3762 Agarose Low Melt Large DNA grade
β-Agarase zeigt in verschiedenen Puffern eine hohe Aktivität:
150 %
Alternativ:
Alternativ:
120 %
Alternativ:
120 %
Alternativ:
100 %
Alternativ:
50 mM Bis-Tris, pH 6,5
1 mM EDTA
100 mM Bis-Tris, pH 6,5 (Ref. 2)
10 mM EDTA
Filtersterilisieren; unbegrenzt haltbar bei Raumtemperatur
10 mM Tris, pH 7,6 (Ref. 1)
5 mM EDTA, pH 8,0
0,1 M NaCl
90 mM Tris-Phosphat (TPE-Puffer)
2 mM EDTA
40 mM Tris-Acetat (TAE-Puffer)
1 mM EDTA
45 mM Tris-Borat (TBE-Puffer)
1 mM EDTA
Ethidiumbromid bis zu einer Konzentration von 5 µg/ml hemmt Agarase nicht!
P r o t o k o l l
1.6.3 Natriumiodid
Als Bestandteil eines DNA-Isolierungskits (AppliChem Art.-Nr. A3421,0300), bestehend aus einer
Glaspulver-Suspension (Glasmilch), einer Natriumiodid-Lösung (6 M) und einem Wasch
lösungskonzentrat, wird Natriumiodid zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Agarose eingesetzt.
Das Reinigungsprinzip beruht auf der Bindung der Nukleinsäure an die Glaspartikel (Silika-BatchVerfahren) nach Schmelzen der Agarose in Natriumiodid. Fragmente mit einer Größe von über 300
Basenpaaren werden mit einer Effizienz von über 80 % isoliert. Mit abnehmender Fragmentgröße
nimmt auch die Effizienz ab.
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen: Die DNA-Bande von Interesse wird aus dem
Agarose-Gel möglichst genau ausgeschnitten und in der Natriumiodid-Lösung bei 55°C geschmolzen.
Zur geschmolzenen Agarose wird Glaspulver-Suspension zugegeben und 5 Minuten inkubiert.
Danach werden die Glaspartikel durch kurze Zentrifugation pelletiert und dreimal mit Waschpuffer
gewaschen. Die DNA wird mit Wasser oder TE-Puffer von den Glaspartikeln eluiert.
Protokoll für die DNA-Isolierung aus Agarose mit Glaspulver
(DNA Isolation Kit Art.-Nr. A3421)
1.Die DNA-Bande wird aus dem Ethidiumbromid-gefärbten Gel mit einer Rasierklinge unter
UV-Licht (312 nm) ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß transferriert.
2.Zu dem Gel-Stück wird das entsprechend dreifache Volumen an 6 M NaI-Lösung zugegeben.
Falls TBE als Laufpuffer verwendet wurde, wird ein ½ Volumen an 3 M Natriumacetat-Lösung
(pH 5,2) und 4,5 Volumina an NaI-Lösung, bezogen auf das Volumen des Gelstückes, zugegeben. Die Endkonzentration von NaI sollte mindestens 4 M sein.
Für 2-5 Minuten bei 55°C inkubieren, den Inhalt des Reaktionsgefäßes mischen und es für
weitere 1-2 Minuten zurück in das Wasserbad stellen. Jetzt sollte das Agarose-Gelstück vollständig aufgelöst sein.
3.Zur Agarose : DNA : NaI-Lösung wird jetzt die Glaspulver-Suspension gegeben. Es werden 6 µl
gut-gemischter Suspension für die ersten 2 µg DNA eingesetzt und zusätzlich je 1 µl für jede
weitere 0,5 µg DNA.
Gut mischen und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Alle 1-2 Minuten mischen. Um
die Bindungseffizienz für Fragmente kleiner als 1000 bp zu erhöhen, bei 55°C inkubieren.
4.Für 10 Sekunden in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit abzentrifugieren und
den Überstand verwerfen.
5.Das Glaspellet mit Waschpuffer waschen. Dabei 50 Volumina Waschpuffer bezogen auf das
ursprüngliche Glaspulver-Volumen verwenden. Das Glaspellet durch Auf- und Abpipettieren
oder durch vorsichtiges Schnalzen des Gefäßes resuspendieren. Achtung: Sehr vorsichtig pipettieren, wenn mit großen DNA-Stücken (>15 kb) gearbeitet wird.
15
P r o t o k o l l
6. Den Waschschritt zweimal wiederholen.
7.Nach Entfernen des Überstandes des letzten Waschschrittes, das Gefäß nochmal kurz abzentrifugieren und soviel Waschpuffer wie möglich mit einer Mikropipette entfernen.
8.Das Glaspellet in 1-2 Volumina sterilem, destilliertem Wasser oder TE-Puffer (10 mM Tris pH
7,5-8,0; 1 mM EDTA) suspendieren – Volumina bezogen auf das ursprüngliche GlaspulverVolumen, das für die Isolierung eingesetzt wurde. Für 3-5 Minuten bei 55°C unter gelegentlichem Mischen eluieren.
9.In der Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 30-45 Sekunden zentrifugieren.
Vorsichtig den DNA-haltigen Überstand in ein neues Reaktionsgefäß transferrieren. Die DNAAusbeute kann um 10-15 % erhöht werden, wenn eine zweite zusätzliche Elution durchgeführt
wird.
Literatur
[1]Sambrook, J. & Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd
Edition. Seite 1.32-34. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
[2]Vogelstein, B. & Gillespie, D. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619. Präparative
und analytische Reinigung von DNA aus Agarose.
1.6.4 Crush & Soak
1.In ein 1,5 ml Reaktionsgefäß wird mit einer Nadel ein Loch in den Boden gestochen. In dieses
Reaktionsgefäß wird das Gel-Stück mit der zu isolierenden DNA gegeben und das Ganze in ein
zweites 1,5 ml Reaktionsgefäß gestellt. In einer Tischzentrifuge wird das Gelstück durch das
kleine Loch im Boden in das untere Reaktionsgefäß zentrifugiert und dabei zerkleinert
("crush").
2.Zum zerkleinerten Gelstück werden 500 µl TE-Puffer gegeben und über Nacht bei 37°C geschüttelt.
3.In ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß wird ebenfalls mit einer Nadel ein
Loch in den Boden gestochen. Dieses Reaktionsgefäß wird bis auf die
Hälfte mit Glaswolle vollgestopft und dann in ein zweites 1,5 ml
Reaktionsgefäß gestellt. Auf die Glaswolle wird das über Nacht geschüttelte zerkleinerte Gelstück gegeben und in einer Tischzentrifuge kurz
durch die Glaswolle zentrifugiert.
9. Pellet in 20 µl TE-Puffer resuspendieren.
1.6.5 Nukleinsäure-Nachweis auf der EtBr-Agarose-Platte
Wer kurz testen will, ob er nach einem Nukleinsäure-Reinigungsschritt überhaupt DNA in seiner
Lösung hat, kann 1 µl auf eine Ethidiumbromid-Platte auftragen. Zur Herstellung der Platte werden
10 ml 1 % Agarose + 1 µl 10 mg/ml EtBr in eine Petrischale gegossen. Nach dem Festwerden
(Erkalten), mit Parafilm abdichten und in Alufolie einpacken. Umgedreht – Deckel nach unten – im
Kühlschrank lagern. Die Stellen, auf die DNA-Lösung aufgetropft wurde, makieren; am einfachsten
ein Raster mit Filzstift auf den Boden zeichnen und benutzte Felder auskreuzen. Die Platte kann im
Prinzip so lange verwendet werden, bis sie eingetrocknet ist. Zum Betrachten jeweils kurz auf den
UV-Tisch legen. Manchmal ist der 1 µl gut investiert, denn, wenn man aus irgendwelchen Gründen
die DNA verloren hat, braucht man nicht weiterarbeiten und erspart sich zum Beispiel beim
Klonieren leere Agarplatten, weil evtl. gar kein Insert oder Vektor vorhanden war.
P r o t o k o l l
4.Die aufgefangene DNA wird jetzt mit dem doppelten Volumen an Isopropanol gefällt.
ca. 500 µl Probe
+ 50 µl 3 M NaOAc pH 7,4
+ 4 µl Acrylamid-Carrier (DNA-PrecipitAid Art.-Nr. A6587,0001)
+ 1 ml Isopropanol
5. ca. 1 Stunde auf Eis (aus Erfahrung reichen meist schon 10 Minuten)
6. 10 Minuten bei 13.000 rpm in der Tischzentrifuge abzentifugieren
7. Pellet mit 80 % Ethanol waschen
8. SpeedVac® trocknen
17
Auswahlkriterien
1.7 Agarosen: Auswahlkriterien
„Wer die Wahl hat, hat die Qual“. Das muss nicht sein, denn aufgrund der speziellen Eigenschaften
jeden Agarose-Typs, können diese entsprechenden Anwendungen zugewiesen werden. Je höher
konzentriert eine Agarose zum Beispiel eingesetzt wird, desto geringer ist deren Transparenz.
Diese spielt aber insofern eine große Rolle, da das zu isolierende Molekül mittels Färbung (oder
im Fall von DNA auch ‘UV shadowing’) sichtbar gemacht werden muss. Die Nachweisgrenze steigt
mit zunehmender Agarose-Konzentration. Schmelzpunkt bzw. Geltemperatur sind besonders für
‘low melt’ Agarosen wichtig. Je niedriger der Schmelzpunkt, desto einfacher verflüssigt sich die
Agarose, desto einfacher werden die aufgetrennten Moleküle freigsetzt. Im direkten Zusammenhang
wird häufig die Gelstärke gesehen. Je höher diese ist, desto besser lässt sich ein „gegossenes“,
verfestigtes Gel hantieren. ‘low melt’ Agarosen zerbrechen aufgrund der niedrigen Gelstärken
leicht. Es sollte daher immer auf die Konzentrationsangabe, bei der dieser Parameter bestimmt
wurde, geachtet werden. Die Elektroendoosmose ist das Maß der Wechselwirkung zwischen
Molekül (Protein, Nukleinsäuren) und Matrix (Agarose). Mit wenigen Ausnahmen liegen die
Art.-Nummer
Bezeichnung
A2114
A2115
A2116
A2117
A2118
A2119
A2120
A3762
A2121
A2122
A1091
Low
EEO
High
EEO
Medium
EEO
Special
EEO
Low
Melt S
Low
Melt 3
Low
Melt 4
Low
Melt
Large
DNA
grade
IMG
SMG
MP
Anwendung
Analytische Trennung
≥1000 bp
Analytische Trennung
≤1000 bp
Präparative
Elektrophorese
PFGE
DNA typing
Blotting
Hohe Auflösung
In-gel Anwendungen
KapillarElektrophorese
Gewebe/Zellkultur
Immuno
Elektrophorese
Agarase-Verdau
18 Besondere Eignungen für bestimmte Anwendungen sind hervorgehoben.
Agarosen für die Gel-Elektrophorese – Übersicht
Art.-Nr.
Bezeichnung
EEO
Geltemperatur
(1,5 % Gel)
Anwendung
A2114
Agarose low EEO
(Agarose Stamdard)
0,09-0,13
36 ± 1,5°C
Nukleinsäure-Auftrennung – analytisch,
präparativ (besonders Fragmente ≥1000 bp),
Blotting; Konzentration 0,8-2%
A2115
Agarose high EEO
0,23-0,26
36 ± 1,5°C
Auftrennung von Serumproteinen,
Immunoelektrophorese,
Counterimmunoelektrophorese
A2116
Agarose medium
EEO
0,16-0,19
36 ± 1,5°C
Nukleinsäure-Auftrennung; Auftrennung von
Serumproteinen, Immunoelektrophorese
A2117
Agarose special EEO
≥0,3
36 ± 1,5°C
Immunoelektrophorese, besonders Counter
immunoelektrophorese
A2118
Agarose Low Melt S
≤0,12
17°C
Kapillarelektrophorese, Klonierungsexperimente
in der Gewebekultur (z.B. Hybridome,
Pflanzenprotoplasten, „viral plaque assay“ etc.);
Nukleinsäure-Auftrennung/Manipulation im Gel
A2119
Agarose Low Melt 3
≤0,12
24-28°C
Präparative Elektrophorese von Nukleinsäuren
(DNA/RNA) und Proteinen; „viral plaque assay“;
Gewebekultur
A2120
Agarose Low Melt 4
≤0,12
24-31°C
Kapillarelektrophorese; analytische DNA-Gele
(besonders Fragmente ≤500 bp);
hohe Gelstärke für low melt Agarose,
sehr transparent bei hoher Konzentration
A3762
Agarose Low Melt
Large DNA grade
≤0,12
24-28°C
analytische und präparative DNA-Gele
(besonders große DNA-Fragmente ≥1000 bp);
enzymatische Manipulationen im geschmolzenen
Gel (z.B. Verdau, Ligation, PCR, etc.),
ideal für den Verdau durch β-Agarase
A2121
Agarose IMG
≤0,12
≤30°C
analytische DNA-Gele (besonders Fragmente
≤1000 bp); Blotting
A2122
Agarose SMG
≤0,12
≤36,5°C
analytische DNA/RNA-Gele
(Fragmente 100-1000 bp); Blotting
A1091
Agarose MP
≤0,12
≤36°C
analytische und präparative NukleinsäureElektrophorese von 0,4-2 % sehr gute Trennung
(entsprechend 100 bp-50 kb); Blotting
Auswahlkriterien
Werte für fast alle Agarosen unter 0,12. Ein weiteres, durchaus bedeutendes Auswahlkriterium, ist
die Verdaubarkeit durch β-Agarase, wenn große Nukleinsäuremoleküle aus der Matrix isoliert
werden sollen (geringe Scherkräfte!).
19
Charakteristika
1.8 Die Charakteristika der AppliChem-Agarosen
Agarose low EEO (Agarose-Standard) (Artikel-Nr. A2114)
Diese Agarose besitzt einen sehr niedrigen EEO-Wert und zeichnet sich durch eine niedrige DNAbindende Aktivität aus. Sie wird besonders für die Herstellung präparativer und analytischer Gele
(z. B. Kontrolle eines Restriktionsenzymverdaus) mit einer sehr guten Auftrennung von NukleinsäureFragmenten größer als 1000 bp empfohlen. Sie ist auch für Blot-Experimente (z.B. Northern,
Southern,…) geeignet und kann in Konzentrationen zwischen 0,8 % und 2 % in allen üblichen
Puffersystemen verwendet werden.
Die Agarosen mit den Bezeichnungen low EEO, medium EEO, high EEO und special EEO unterscheiden sich hauptsächlich in ihren EEO-Werten. Diese Werte sind bei der Trennung von Makromolekülen
sehr wichtig, besonders bei der Auftrennung von Proteinen. Diese vier Agarosen können mitein
ander gemischt werden, wenn man andere als die durch die einzelne Agarose vorgegebenen EEOWerte erreichen möchte.
A2114
DNasen/RNasen/Proteasen
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
nicht nachweisbar
≤0,5 %
0,09-0,13 (EEO)
≤7 %
Gelstärke (1 %)
Gelstärke (1,5 %)
Geltemperatur (1,5 %)
Schmelzpunkt
Sulfat
≥1200 g/cm2
≥2500 g/cm2
36 ±1,5°C
88 ± 1,5°C
≤0,2 %
Agarose medium EEO (Artikel-Nr. A2116)
Die Agarose medium EEO wird für die Elektrophorese von Serumproteinen und für Anwendungen
in der Immunoelektrophorese empfohlen. Sie ist auch für die elektrophoretische Auftrennung von
Nukleinsäuren geeignet. Sie besitzt eine niedrige DNA-Bindung, ist aber im Gegensatz zur Agarose
low EEO nicht für Blotting-Experimente geeignet.
Die Agarosen mit den Bezeichnungen low EEO, medium EEO, high EEO und special EEO unterscheiden sich hauptsächlich in ihren EEO-Werten. Diese Werte sind bei der Trennung von Makromolekülen
sehr wichtig, besonders bei der Auftrennung von Proteinen. Diese vier Agarosen können mitein
ander gemischt werden, wenn man andere als die durch die einzelne Agarose vorgegebenen EEOWerte erreichen möchte.
20 A2116
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
nicht nachweisbar
≤0,5 %
0,16-0,19 (EEO)
≤7 %
Gelstärke (1 %)
Gelstärke (1,5 %)
Schmelzpunkt
Sulfat
≥750 g/cm2
≥2000 g/cm2
36 ± 1,5°C
88 ± 1,5°C
≤0,25 %
A2115
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
nicht nachweisbar
≤1,1 %
0,23–0,26 (EEO)
≤7 %
Gelstärke (1 %)
Gelstärke (1,5 %)
Schmelzpunkt
Sulfat
≥750 g/cm2
≥1000 g/cm2
36 ± 1,5°C
88 ± 1,5°C
≤0,25 %
Agarose special EEO (Artikel-Nr. A2117)
Die Agarose special EEO wird besonders für die Counterimmunoelektrophorese und für
Anwendungen in der Immunoelektrophorese (besonders IgG und IgM) empfohlen.
Die Agarosen mit den Bezeichnungen low EEO, medium EEO, high EEO und special EEO unter
scheiden sich hauptsächlich in ihren EEO-Werten. Diese Werte sind bei der Trennung von
Makromolekülen sehr wichtig, besonders bei der Auftrennung von Proteinen. Diese vier Agarosen
können miteinander gemischt werden, wenn man andere als die durch die einzelne Agarose vor
gegebenen EEO-Werte erreichen möchte
A2117
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
nicht nachweisbar
≤1,5 %
≥0,3 (EEO)
≤7 %
Gelstärke (1 %)
Gelstärke (1,5 %)
Schmelzpunkt
Sulfat
≥700 g/cm2
≥1100 g/cm2
36 ± 1,5°C
88 ± 1,5°C
≤0,3 %
Agarose Low Melt S (Artikel-Nr. A2118)
Die Agarose Low Melt S wird besonders für die Kapillarelektrophorese, für die Klonierung von
Hybridomazellen und Gewebezellen, für die Herstellung von Pflanzenprotoplasten, für den
sogenannten ‘viral plaque assay’ und den 'verankerungsunabhängigen Wachstumsversuch' empfohlen. Sie besitzt eine niedrige DNA- Bindungkapazität und ist für die Herstellung hochprozentiger
Gele empfehlenswert. Die Verwendung aller Puffersysteme ist möglich. Der niedrige Schmelzpunkt
(≤60°C) erlaubt die schonende Gewinnung von Nukleinsäuren unterhalb deren Schmelzpunkt. Die
Charakteristika
Agarose high EEO (Artikel-Nr. A2115)
Die Agarose high EEO ist für die Elektrophorese von Serumproteinen und für Anwendungen in der
Immunoelektrophorese und der 'Counterimmunoelektrophorese' geeignet.
Die Agarosen mit den Bezeichnungen low EEO, medium EEO, high EEO und special EEO unter
scheiden sich hauptsächlich in ihren EEO-Werten. Diese Werte sind bei der Trennung von
Makromolekülen sehr wichtig, besonders bei der Auftrennung von Proteinen. Diese vier Agarosen
können miteinander gemischt werden, wenn man andere als die durch die einzelne Agarose vor
gegebenen EEO-Werte erreichen möchte.
21
Charakteristika
niedrige Geltemperatur (≤17°C) ermöglicht verschiedene Manipulationen von DNA im Gel (z.B.
enzymatischer Verdau, Ligation, DNA-Markierung, ‘Nick Translation’, usw.), da bei den ent
sprechenden Temperaturen das Gel im flüssigen Zustand vorliegt. Die DNA muss nicht vorher extra
aus einem Gelstück isoliert werden.
Achtung: Die Agarose Low Melt S soll in Gelkonzentrationen höher als 1,2 % angewendet werden,
da bei niedrigeren Gelkonzentrationen die Gele sehr zerbrechlich sind und kaum hantiert werden
können. Da der Gelpunkt unterhalb der Raumtemperatur liegt, müssen Gele über Nacht bei +4°C
gelieren.
A2118
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
nicht nachweisbar
≤0,3 %
≤0,12 (EEO)
≤7 %
Gelstärke (1 %)
Gelstärke (1,5 %)
Schmelzpunkt (1,5 %)
Sulfat
≥100 g/cm2
≥350 g/cm2
≤17°C
≤60°C
≤0,14 %
Agarose Low Melt 3 (Artikel-Nr. A2119)
Die Agarose Low Melt 3 wird besonders für die präparative Elektrophorese von DNA und RNA, aber
auch von Proteinen empfohlen. Sie ist auch für den sogenannten 'viral plaque assay' und
Anwendungen in der Gewebekultur geeignet. Sie besitzt eine niedrige DNA-Bindungskapazität und
ist für die Herstellung hochprozentiger Gele empfehlenswert. Die Verwendung aller Puffersysteme
ist möglich. Der niedrige Schmelzpunkt (≤65,5°C) erlaubt die schonende Gewinnung von
Nukleinsäuren unterhalb deren Schmelzpunkt. Die niedrige Geltemperatur (24-28°C) ermöglicht
verschiedene Manipulationen von DNA im Gel (z.B. enzymatischer Verdau, Ligation, DNAMarkierung, ‘Nick Translation’, usw.), da bei den entsprechenden Temperaturen das Gel im flüssigen Zustand vorliegt. Die DNA muss nicht vorher extra aus einem Gelstück isoliert werden.
Achtung: Aufgrund des niedrigen Gelpunktes empfiehlt es sich die Gele vor Gebrauch für eine
Stunde bei +4°C zu lagern, da dadurch bei der Elektrophorese eine maximale Auflösung erreicht
wird. Wenn die Agarose zum Auflösen autoklaviert wird, ist darauf zu achten, dass sie sich nicht in
einer Lösung mit einem pH-Wert unter pH 5,5 befindet, da sie dann hydrolysiert (Gel wird nicht
fest!). Die Lösung muss also gepuffert sein – reines Wasser kann nicht verwendet werden.
22 A2119
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
nicht nachweisbar
≤0,3 %
≤0,12 (EEO)
≤7 %
Gelstärke (1 %)
Gelstärke (1,5 %)
Sulfat
≥300 g/cm2
≥550 g/cm2
24–28°C
≤65,5°C
≤0,12 %
A2120
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
nicht nachweisbar
≤0,3 %
≤0,12 (EEO)
≤7 %
Gelstärke (3 %)
Gelstärke (5 %)
Geltemperatur (3 %)
Sulfat
≥500 g/cm2
≥1000 g/cm2
24–31°C
≤75°C
≤0,11 %
Charakteristika
Agarose Low Melt 4 (Artikel-Nr. A2120)
Die Agarose Low Melt 4 wird besonders für die Kapillarelektrophorese und für analytische DNAGele empfohlen. Sie besitzt eine niedrige DNA-Bindungskapazität, ist auch bei hohen
Gelkonzentrationen (5 %) sehr transparent und kann mit allen Puffersystemen verwendet werden.
Die für eine 'Low Melting Point'-Agarose sehr hohe Gelstärke (≥500 g/cm2; 3 % Gel) minimiert das
Risiko des Zerbrechens des Geles beim Hantieren sehr stark. Diese Agarose wird besonders für die
Auftrennung von DNA-Fragmenten mit weniger als 500 Basenpaaren empfohlen, gerade im Bereich
der Größe von Primern. Bei einer Konzentration von 3 % erreicht man eine zur Elektrophorese von
DNA-Fragmenten im 8%igen Polyacrylamidgel vergleichbare Auflösung – und das bei einfacherer
Handhabung und ohne die Giftigkeit des Acrylamids.
Achtung: Die Agarose Low Melt 4 besitzt eine sehr hohe Viskosität. Zur Herstellung von Gelen mit
einer Konzentration ≤3 % ist das Erhitzen in einer Mikrowelle ausreichend. Für die Herstellung von
Gelen mit einer Konzentration von 4 %-5 %, aber auch allen anderen Konzentrationen, ist die
Erhitzung im kochenden Wasserbad empfehlenswert. Bei Konzentrationen ≥5 % empfiehlt es sich
die Agarose im Autoklaven (121°C; 15 Minuten) zu lösen. Die mechanischen Eigenschaften und die
Trennfähigkeit werden dadurch nicht verändert.
Um eine höchstmögliche Auflösung mit Agarose Low Melt 4-Gelen zu erzielen, muss die Gelierung
der Gele bei +4°C über Nacht bzw. bis zu 20 Stunden durchgeführt werden. Die Verwendung dieser
Agarose in Blotting-Experimenten wird nicht empfohlen.
23
Charakteristika
Agarose Low Melt Large DNA grade (Artikel-Nr. A3762)
Diese Agarose ist eine „low melting point“-Agarose mit einer sehr hohen Trennkapaziät für große
DNA-Fragmente (≥1000 bp). Im geschmolzenen Gel können enzymatische Manipulationen vor
genommen werden (z.B. Verdau, Ligation, PCR. usw.). Eine Extraktion der DNA ist daher nicht
notwendig. Agarose Low Melt Large DNA grade ist hervorragend für den Verdau mit β-Agarase
geeignet. Große DNA-Fragmente können dadurch besonders schonend isoliert werden. Sie wird im
analytischen und präparativen Bereich eingesetzt.
A3762
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
nicht nachweisbar
≤0,4 %
≤0,12 (EEO)
≤7 %
Gelstärke (1 %)
Verdau durch Agarase
Sulfat
≥250 g/cm2
24–28°C
≤65,5°C
entspricht
≤0,1 %
Agarose IMG (Artikel-Nr. A2121)
Die Agarose IMG verfügt über einen intermediären Schmelzpunkt (≤70°C; 1,5 % Gel) und Gelpunkt
(≤30°C; 1,5 % Gel) und einer niedrigen DNA-Bindungskapazität. Ihre Anwendung empfiehlt sich
besonders für analytische DNA-Gele mit Fragmentgrößen ≤1000 Basenpaaren, wie zum Beispiel
PCR-Produkte, kleine DNA-Fragmente nach Restriktionsenzymverdau und DNA-Fragmenten in
Mutationsanalysen. Diese Agarose ist auch für Blotting-Experimente mit DNA-Fragmenten
≤600 Basenpaare geeignet. Sie ist bei hohen Gelkonzentrationen (3-4,5 %) sehr transparent und
kann mit allen Puffersystemen verwendet werden. Die hohe Gelstärke (≥500 g/cm2; 1,5 % Gel)
minimiert das Risiko des Zerbrechens des Geles beim Hantieren sehr stark.
Achtung: Zur Herstellung von Gelen mit einer Konzentration ≥3 % ist das Erhitzen im kochenden
Wasserbad oder im Autoklaven (121°C; 15 Minuten) empfehlenswert. Die mechanischen
Eigenschaften und die Trennfähigkeit werden dadurch nicht geändert.
Um eine höchstmögliche Auflösung mit Agarose IMG-Gelen zu erzielen, muss das Gel vor Gebrauch
für 30 Minuten bei +4°C gekühlt werden.
24 A2121
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
nicht nachweisbar
≤0,35 %
≤0,12 (EEO)
≤7 %
Gelstärke (1,5 %)
Gelstärke (3 %)
Sulfat
≥500 g/cm2
≥1500 g/cm2
≤30°C
≤70°C
≤0,11 %
Gel) gegenüber vergleichbaren Agarosen minimiert das Risiko des Zerbrechens des Geles beim
Hantieren sehr stark und erlaubt auch die Herstellung von Gelen mit einer Konzentration ≤1 % bei
hervorragender Auflösung.
A2122
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
nicht nachweisbar
≤0,35 %
≤0,12 (EEO)
≤7 %
Gelstärke (1,5 %)
Gelstärke (4 %)
Sulfat
≥2000 g/cm2
≥4250 g/cm2
≤36,5°C
≤89°C
≤0,11 %
Agarose MP (Artikel-Nr. A1091)
Die Agarose MP besitzt eine hohe Gelstärke und ist in der Molekularbiologie zur Auftrennung von
Proteinen und Nukleinsäuren (z.B. in der PFGE) einsetzbar. Sie lässt sich sehr leicht in der
Mikrowelle auflösen. Aufgrund ihrer hohen Gelstärke kann sie in sehr niedrigen (bis 0,4 %) oder
hohen (ca. 2 %) Konzentrationen in allen Puffersystemen verwendet werden. Bei der Auftrennung
hoch-molekularer DNA (bis ca. 50 kb lineare DNA; ca. 0,4 %iges Gel) ist die Agarose dem
Acrylamid weit überlegen. Aber selbst im Bereich von nur 100 Basenpaaren erzielt man mit Agarose
MP (~2%iges Gel) gute Ergebnisse. Durch entsprechende Wahl der Agarose MP- Konzentration
können praktisch alle DNA-Fragmentgrößen aufgetrennt werden. Die DNA-Bindungskapazität ist
sehr niedrig. Agarose MP ist für Blotting-Experimente und präparatives Arbeiten hervorragend
geeignet.
A1091
Asche
Elektroendoosmose
Feuchtigkeit
Gelpunkt
nicht nachweisbar
≤0,25 %
≤0,12 (EEO)
≤7 %
36 ± 1,5°C
Gelstärke (1 %)
Gelstärke (1,5 %)
pH (1 %)
Schmelzpunkt
Sulfat
≥1800 g/cm2
≥3200 g/cm2
5,0–6,0
88 ± 1,5°C
≤0,12 %
Charakteristika
Agarose SMG (Artikel-Nr. A2122)
Die Agarose SMG verfügt über einen Standardschmelzpunkt (≤89°C; 1,5 % Gel) und Standardgelpunkt
(≤36,5°C; 1,5 % Gel). Ihre Anwendung empfiehlt sich besonders für analytische DNA/RNA-Gele mit
Fragmentgrößen von 100-1000 Basenpaaren (bei einer Gelkonzentration von 2-5 %). Diese
Agarose ist auch für Blotting- Experimente geeignet. Bei einer Gelkonzentration von 4 % können
DNA-Fragmente von ca. 150-2200 Basenpaare im Southern-Blot transferriert werden. Sie besitzt
eine niedrige DNA-Bindungskapazität und ist auch bei hohen Gelkonzentrationen sehr transparent
und kann mit allen Puffersystemen verwendet werden. Die hohe Gelstärke (≥2000 g/cm2; 1,5 %
25
Tipps & Tricks
1.9 Anwendungstipps
1.9.1 Zur Herstellung eines Geles wird die Agarose meist im Laufpuffer erhitzt und zum Schmelzen
gebracht. Dafür bedient man sich eines Wasserbades oder heute häufiger der Mikrowelle. Da der
Aufwärmvorgang in der Mikrowelle sehr schnell geht, muss man ständig dabeibleiben, um ein
Überkochen zu verhindern. Achtung: Siedeverzüge. Wenn man die sich lösende, heiße Mischung
leicht schwenkt, kocht sie häufig stark auf! Immer geeignete Hitze-resistente Handschuhe tragen.
1.9.2 Gel vor dem Gießen auf ca. 50°C-55°C abkühlen lassen, am einfachsten unter fließendem
Leitungswasser. Erst dann EtBr zugeben.
1.9.3 Gelläufe über Nacht brauchen hohe Pufferkapazität, daher 1X TBE.
Gelläufe bei hohen Volt-Zahlen (>60 V) ebenso.
Pufferzirkulation ist ebenfalls eine Lösung, um die Pufferkapazität aufrechtzuerhalten.
1.9.4 Höhere Volt-Zahlen reduzieren die Auflösung.
1.9.5 Dünnere Kämme erhöhen die Auflösung, ebenso kleinere Volumina beim Beladen des Gels.
Große DNA-Mengen führen zum Schmieren (= überladen).
1.9.6 Ethidiumbromid, anwesend während des Gellaufes, kann zu verändertem Laufverhalten der
DNA führen. Wenn dies als Problem bei der aktuellen Anwendung betrachtet wird, empfiehlt sich
die Färbung nach dem Gellauf in 0,5-1 µg/ml Ethidiumbromid.
1.9.7 Ethidiumbromid-Färbung (0,5-1 µg/ml) nach dem Gellauf liefert einen besseren Kontrast,
wenn das Gel in Wasser für ca. 30 Minuten auch wieder entfärbt wird. Eine Verringerung der
Ethidiumbromid-Konzentration hat u.U. einen vergleichbaren Effekt.
1.9.8 Gelläufe bei zu hohen Temperaturen können DNA zum Schmelzen bringen.
1.9.9 Wenn zu wenig Laufpuffer in die Gelkammer gefüllt wird, kann das Gel während des Laufes
austrocknen. Der Puffer soll wenigstens 1 mm über dem Gel stehen.
1.9.10Wenn ganze Plasmide geladen werden, sind in der Regel mehrere Banden zu beobachten:
supercoiled Plasmide sind am kleinsten „gepackt“ und wandern am schnellsten, „aufgewundene“
Plasmide (‘relaxed‘ oder ‘nicked‘) wandern langsamer als ‘supercoiled‘. U.U. bilden sich Katenane
(Plasmide sind wie Kettenglieder zusammenhängend und können ein leiterförmiges Bild auf dem
Gel ergeben, ähnlich eines Größenstandards). Linearisierte Plasmid-DNA (open chain DNA) wandert etwas langsamer als die ‘supercoiled’ Form des selben Plasmids.
1.9.11Hohe Salzkonzentrationen in der Puffer-/DNA-Lösung verlangsamen die Wanderung.
1.9.12Wenn die Geltaschen nach der EtBr-Färbung wie ein Weihnachtsbaum leuchten, ist das in
der Regel chromosomale, bakterielle DNA, die zu groß war, um in das Gel zu wandern oder dort
ausgefallen ist.
1.9.13Der mit EtBr anfärbbare Schmier, der weit vor der bakteriellen DNA im Gel läuft, ist RNA.
Diese kann durch RNase-Behandlung in der Probe entfernt werden.
1.9.15Einige DNA-Gel-Extraktionsmethoden funktionieren nicht mit TBE. In diesen Fällen TAELaufpuffer verwenden.
1.9.16Es empfiehlt sich den Erlenmeyer-Kolben mit der Agarose und dem Puffer zu wiegen, bevor
die Agarose-Lösung in der Mikrowelle erhitzt wird. Je länger erhitzt wird, desto mehr Flüssigkeit
geht verloren. Diese (= Wasser) kann auf der Waage einfach nachgefüllt werden.
1.9.17Luftblasen, die sich in der Agarose beim Gießen bilden, können mit einer Pipettenspitze
zerstört werden oder, falls das nicht geht, an den Rand manövriert werden, wo sie u.U. weniger oder
gar nicht stören.
1.9.18Bromphenolblau läuft ungefähr bei 300 bp und Xylencyanol bei ca. 4 kb DNA. Es sollte
bedacht werden, dass DNA-Fragmente durch die Farbstoffe quasi verdeckt und dadurch
„unsichtbar“ werden. Abhilfe verschaffen Ladepuffer, die nur die eine, nicht störende „tracking
dye“ enthalten. Beide Farbstoffe wandern (bei pH ca. 8) wie die DNA zur Anode.
1.9.19Wenn beim Anschalten des Power Supply's keine Luftblasen an den Elektroden aufsteigen,
wurde möglicherweise Wasser statt Laufpuffer eingefüllt! Es findet dann auch keine Wanderung/
Auftrennung der Moleküle statt.
Wird versehentlich unverdünnter (konzentrierter) Puffer verwendet, heizt sich das Gel stark auf
und kann schmelzen.
1.9.20Lineare DNA wandert ungefähr invers proportional zum log10 ihres Molekulargewichtes.
1.9.21Besonders bei der Handhabung von präparativen Gelen gilt: die UV-Licht-Exposition auf
dem Leuchttisch möglichst kurz halten, da UV-Licht die Bildung von Pyrimidin-Dimeren begünstigt,
die in der Folge zu Mutationen oder Strangbrüchen führen können.
1.9.22Hohe Salzkonzentrationen in der Probe verschlechtern die Auflösung im Agarose-Gel: Viele
DNA-Manipulationen werden unter Hochsalzbedingungen durchgeführt. Ein direkter Auftrag des
Probenansatzes führt dann im Agarose-Gel zu einer schlechten Auftrennung. Hierfür gibt es eine
einfache Abhilfe: Ha et al. haben zum einen die Proben nach dem Auftragen auf das Gel 30 Minuten
in den Geltaschen ruhen lassen, bevor der Gellauf gestartet wurde. In dieser Zeit diffundieren die
Salze in den umgebenden TBE-Puffer. Ausserdem wurde die TBE-Konzentration von den üblichen
0,5X oder 1X auf 2X erhöht.
Ha, W.-Y. et al. (1999) BioTechniques 26, 425-426
1.9.23Langzeit-Lagerung von DNA in Agarose-Gelen: Nach dem Gel-Lauf und der EthidiumbromidFärbung wird das Gel/Gelstück einfach in 70 % Ethanol gelegt und kann bei Raumtemperatur
gelagert werden. Das Gel muss vor dem nächsten Betrachten neu gefärbt werden, da EtBr in den
Ethanol diffundiert. Die DNA-Banden bleiben unverändert im Gel erhalten, wahrscheinlich einfach
durch eine Ethanol-Fällung.
Jacobs, D. & Neilan, B. A. (1995) BioTechniques 19, 892-894
Tipps & Tricks
1.9.14Hochprozentige Agarose-Gele (>3 %), hergestellt aus Standard-Agarosen, verlieren an
Flexibilität und sind mitunter brüchig.
27
Puffer-Systeme
2
Puffer-Systeme
Neben dem Agarose-Typ ermöglicht die Pufferwahl weitere Variationsmöglichkeiten und
Optimierungen von Anwendungen. Die sicher bekanntesten Agarose-Gel-Elektrophorese-Puffer
sind TAE- und TBE-Puffer, die die meisten Anwendungen abdecken. Es stehen außerdem spezielle
Puffer zur Verfügung. Dieser Abschnitt liefert Puffer-Rezepturen und einige Erläuterungen dazu. Bei
der Information „Laufbedingung“ in V/cm bezieht sich die Angabe „cm“ auf den Abstand zwischen
den Elektroden.
2.1 TAE-Puffer
TAE-Puffer ist heute DER Elektrophorese-Puffer für Agarose-Gele. Ursprünglich wurde er jedoch für
die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese mit geringfügig anderer Zusammensetzung entwickelt
(40 mM Tris; 20 mM NaOAc; 2 mM EDTA · Na2; pH 7,8 bei 5°C mit Essigsäure; Ref. 1). Natriumacetat
wurde zur Stabilisierung der Sekundärstruktur der RNA eingesetzt. Da bei der Einstellung des pHWertes mit Salzsäure während der Elektrophorese durch Elektrolyse Hypochlorit entstehen kann,
wurde als Anion Acetat gewählt (1). Die Zugabe von EDTA zu den Elektrophorese-Puffern minimiert
eine Aggregation von Nukleinsäuren durch Magnesium-Ionen. Heute verwendet man den Puffer in
leicht modifizierter Form (40 mM Tris-Acetat; 1 mM EDTA · Na2 (~pH 8,5)). TAE hat eine niedrigere
Pufferkapazität als TBE und TPE, allerdings wandert doppelsträngige, lineare DNA 10 % schneller
bei gleicher Auflösung durch TAE als durch TBE oder TPE. ‘Supercoiled’ DNA wird in TAE besser
aufgetrennt als in TBE. Für lange Gelläufe sollte daher der Puffer rezirkuliert werden. TAE hat
gegenüber TBE einen weiteren Vorteil. Er interagiert nicht mit der Agarose und in der präparativen
Nukleinsäure – Agarose-Gel-Elektrophorese ist dadurch die Ausbeute an Nukleinsäuren hoch (2).
Normalerweise verwendet man den Puffer in der Arbeitskonzentration 1X (seltener 0,5X). TAE wird
bei Raumtemperatur gelagert.
Laufbedingung: 1-10 V/cm
(Laufbedingung Minigel: 5-20 V/cm)
50X TAE-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 3)
2 M Tris (242 g/L)
1 M Essigsäure (57,1 ml/L Eisessig)
0,05 M EDTA-Na2 (100 ml von 0,5 M EDTA pH 8)
Der finale pH-Wert des 1X Puffers liegt bei ca. 8,5.
(nach Ref. 4)
2 M Tris (242 g/L)
1 M Essigsäure (57,1 ml/L Eisessig)
0,1 M EDTA-Na2 · 2H2O (37,2 g/L)
Protocols in Molecular Biology. Suppl. 40 Seite A.2.5. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York.
[2]Loening, U.E. (1967) Biochem. J. 102, 251-257 The fractionation of high-molecular-weight Ribonucleic acid by
polyacrylamide-gel electrophoresis.
[3]Ogden, R.C. & Adams, D.A. (1987) Methods Enzymol. 152, 61-87 Electrophoresis in agarose and acrylamide gels.
[4]Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Seiten 5.8 und A1.17. Cold
2.2 TBE-Puffer
TBE-Puffer wird als Elektrophorese-Puffer für Polyacrylamid-Gele und Agarose-Gele verwendet.
TBE hat eine höhere Pufferkapazität als TAE, allerdings wandert doppelsträngige, lineare DNA bei
gleicher Auflösung 10 % schneller durch TAE als durch TBE. ‘Supercoiled’ DNA wird besser in TAE
als in TBE aufgetrennt. Normalerweise verwendet man den Puffer in der Arbeitskonzentration 1X
für Polyacrylamid-Gele und 0,5X für Agarose-Gele. Für ‘band shifts’ (gel mobility shift assay) wird
Abb. 2.2: Struktur und Reaktionsschema von Borsäure
ebenfalls 0,5X TBE eingesetzt. Für die präparative Agarose-Gel-Elektrophorese mit anschließender
Isolierung von Nukleinsäuren ist grundsätzlich von der Verwendung von TBE-Puffer abzuraten, da
dieser Puffer mit der Agarose interagieren kann und die Ausbeute an Nukleinsäuren dadurch sehr
schlecht ist (2). Die Zugabe von EDTA zu den Elektrophorese-Puffern minimiert eine Aggregation
von Nukleinsäuren durch Magnesium-Ionen und andere schwerere Metallionen.
TBE wird meistens als 10X oder 5X Konzentrat hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert. Bei
langer Lagerung bildet sich besonders im 10X Konzentrat, stärker als im 5X Konzentrat, meist ein
Präzipitat. Filtration mit einem 0,22 µm Filter verzögert die Präzipitat-Bildung.
Puffer-Systeme
Abb. 2.1: Struktur und Reaktionsschema von Tris (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)
29
Puffer-Systeme
(Laufbedingung Minigel: 5-20 V/cm)
10X TBE-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 3,4)
0,89 M Tris (108 g/L)
0,89 M Borsäure (55,3 g/L)
0,02 M EDTA-Na2 (40 ml von 0,5 M EDTA pH 8)
Der finale pH-Wert des 10X Puffers liegt bei ca. 8,3.
Protocols in Molecular Biology, Suppl. 40, Seite A.2.5. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York.
[2] Ogden, R.C. & Adams, D.A. (1987) Methods Enzymol. 152, 61-87. Electrophoresis in agarose and acrylamide gels.
[3]Peacock, A.C. & Dingman, C.W. (1968) Biochemistry 7, 668-674. Molecular weight estimation and separation of
ribonucleic acid by electrophoresis in Agarose-Acrylamide composite gels.
[4]Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seiten 5.8 und A.1.17.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
2.3 MOPS-Elektrophorese-Puffer (10X)
Der Laufpuffer (1X) wird in denaturierenden Formaldehyd-enthaltenden Agarose-Gelen und in
Gelen Glyoxal/DMSO-behandelter RNA eingesetzt. Allerdings hat er eine relativ niedrige
Pufferkapazität und wird inzwischen häufig durch den neueren BPTE-Puffer abgelöst. Dieser Typ
von RNA-Gel hat relativ lange Laufzeiten (4-5 h). Während des Gellaufes baut sich ein pH-Gradient
auf. Im pH-Bereich >8,0 würde Glyoxal von der RNA dissoziieren. Daher sollte während des
Gellaufes der MOPS-Laufpuffer zirkulieren oder alle 30 Minuten im Puffertank durchmischt werden
(1, 2).
Abb. 2.3: Struktur und Reaktionsschema von MOPS (3-Morpholinopropansulfonsäure)
10X MOPS-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 1)
0,2 M MOPS (pH 7,0)
20 mM Natriumacetat
10 mM EDTA (pH 8,0)
(nach Ref. 2)
0,4 M MOPS (pH 7,0)
100 mM Natriumacetat
10 mM EDTA (pH 8,0)
(Lagerung 3 Monate bei +4°C)
1]Ausubel, F.A., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (eds.) (2001) Current
Protocols in Molecular Biology, Suppl. 67, Seite 4.9.15. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York.
[2]Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seite 7.32. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
2.4 BPTE-Elektrophorese-Puffer (10X)
Der BPTE-Laufpuffer wird für die Trennung von RNA im Agarose-Gel eingesetzt. Die Mischung
zweier Puffersubstanzen mit ähnlichem pKa-Wert führt zu einem stabileren Laufpuffer, der nicht
mehr rezirkuliert werden muss. Er soll damit das relativ giftige Formaldehyd-System ablösen.
Laufbedingung: 5 V/cm
10X BPTE-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 1, 2)
100 mM PIPES
300 mM Bis-Tris
10 mM EDTA (pH 8,0)
Der finale pH-Wert des 10X Puffers liegt bei ca. 6,5. Nach der DEPC-Behandlung autoklavieren.
[1]Burnett, W.V. (1997) BioTechniques 22, 668-671. Northern Blotting of RNA Denatured in Glyoxal Without Buffer
Recirculation.
[2]Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seite 7.28. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Puffer-Systeme
MOPS-Lösungen werden beim Autoklavieren oder bei Lagerung unter Lichteinfluss leicht gelblich,
ohne jedoch an Qualität zu verlieren. Erst wenn sich die Lösungen dunkel verfärben, sollten sie
nicht mehr verwendet werden.
31
Puffer-Systeme
2.5 Alkalischer Agarose-Gel-Elektrophorese-Puffer (10X)
Dieses Puffersystem ist eigentlich veraltet. Dennoch gibt es Anwendungen, bei denen dieser einfache
Puffer gute Ergebnisse liefert. Er zählt zu den denaturierenden Systemen, da die WasserstoffbrückenBildung in der doppelsträngigen DNA unterbunden wird. Anwendung findet er heute noch bei der
Längenbestimmung der DNA in DNA-RNA-Hybriden und der von ‘first’ und ‘second strand’ cDNAs
(1). Aufgrund des hohen pH-Wertes ist Bromphenolblau als ‘tracking dye’ ungeeignet. Stattdessen
wird Bromkresolgrün eingesetzt. Alkalische Agarose-Gele heizen sich stärker auf und werden daher
bei niedrigerer Stromstärke laufen gelassen. Es kann eine teilweise basische Hydrolyse der Agarose
auftreten, die die DNA im Gel ungleichmäßig laufen lässt. Um dies zu verhindern, sollte das Gel vor
dem Start auf Raumtemperatur abgekühlt sein.
Laufbedingung: < 3,5 V/cm
10X Alkalischer Agarose-Gel-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 1)
500 mM NaOH (50 ml/L 10 N NaOH)
10 mM EDTA (20 ml/L 0,5 M EDTA pH 8,0)
Der 10X Puffer wird direkt vor Gebrauch mit Wasser auf 1X verdünnt.
[1] Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seiten 5.36 und A1.17. Cold
2.6 TAFE-Elektrophorese-Puffer
TAFE steht für 'transverse alternating field electrophoresis'. Wie bei der 'Pulsed-field Gel
Electrophoresis' (PFGE) wird das elektrische Feld umgeschaltet und die DNA wandert im wechselnden elektrischen Feld quasi hin und her. Entscheidend ist dafür die Puls-Länge. Je länger der Puls
anhält, desto größere Fragmente können getrennt werden. Alternativen zum 1X TAFE-Puffer sind
der GTBE-Puffer, TBE mit Zusatz von Glycin, oder einfach 0,5X TBE.
Abb. 2.4: Struktur und Reaktionsschema von Glycin
Der pH-Wert der Tris-Lösung wird mit Essigsäure auf 8,2 eingestellt.
GTBE-Gel-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 2)
50 ml 10X TBE-Puffer (Endkonz. 0,5X)
50 ml 2 M Glycin (Endkonz. 0,1 M)
900 ml Wasser
Der Puffer wird bei Raumtemperatur gelagert.
Protocols in Molecular Biology, Suppl. 51 Seite 2.5B.1. Greene Publishing & Wiley-Interscience, New York.
[2]Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seiten 5.74 und A1.18.
2.7 TPE-Elektrophorese-Puffer
TPE-Puffer hat ähnliche Eigenschaften wie TBE-Puffer und damit eine wesentlich höhere
Pufferkapazität als TAE. Allerdings wandert doppelsträngige, lineare DNA 10 % langsamer bei gleicher Auflösung durch TPE als durch TAE. Die Trennkapazität ist für kleine DNA-Moleküle besser in
TPE und TBE als in TAE, für große Fragmente ist es genau umgekehrt (1). Der Puffer wird als 1X
(1) oder 0,5X (2) Lösung eingesetzt.
10X TPE-Gel-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 1)
900 mM Tris
900 mM Phosphat
20 mM EDTA
108 g Tris
15,5 ml Phosphorsäure 85 % (1,679 g/ml)
40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)
[1]Li, T.-K. et al. (2003) Cancer Res. 63, 8400-8407. Characterization of ARC-111 as a Novel Topoisomerase I-Targeting
Anticancer Drug.
[2]Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seiten 5.8 und A1.17.
Puffer-Systeme
TAFE-Gel-Elektrophorese-Puffer (nach Ref. 1)
20 mM Tris-acetat (pH 8,2)
0,5 mM EDTA (die freie Säure verwenden!)
33
Puffer-Systeme
2.8 TTE-Elektrophorese-Puffer
Tris-Taurin-EDTA-Puffer ist eine Alternative zu TBE, wenn Borsäure zum Problem wird. Taurin hat
einen ähnlichen pKa-Wert wie Borsäure. Warum Borsäure austauschen? Borsäure kann mit Glycerin
negativ-geladene Ester bilden, die in der Elektrophorese zur Anode wandern. Glycerin wird den
meisten Enzympräparationen in relativ hoher Konzentration (bis 50 %) zugesetzt, um ein Einfrieren
während der Lagerung zu vermeiden. Außerdem enthalten verschiedene Ladepuffer Glycerin, um
die Dichte der zu ladenden Lösung zu erhöhen. Allerdings dürfte dieses Problem primär bei empfindlichen Sequenziergelen eine Rolle spielen, wenn die Glycerin-Konzentration 8 % in der Probe
überschreitet (1).
20X TTE-Gel-Elektrophorese-Puffer
1,78 M Tris
570 mM Taurin
10 mM EDTA
216 g/L Tris
72 g/L Taurin
2 g/L EDTA-Na2
[1] Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Seiten 12.108 und 13.90.
2.9 Low-Molarity Conductive Media
Das Problem vieler Elektrophorese-Puffer ist die relativ hohe Ionenkonzentration, die während des
Gel-Laufes zur starken Aufheizung und zum Schmelzen des Agarose-Gels führen kann. Zusätzlich
sind die Laufzeiten ziemlich lang. In einem Versuch diese beiden Probleme, Temperatur und
Laufzeit, zu verbessern, wurde im Laufpuffer für DNA-Agarose-Gele die Puffersubstanz Tris einfach
durch Natrium ersetzt und EDTA weggelassen. Für RNA-Gele wurde der MOPS-Puffer und EDTA
durch Li-Ionen ersetzt. Im Ergebnis konnte eine Auftrennung von nur 1 bp bei 35 bp bzw. 36 bp
Oligos erzielt werden.
Laufbedingung: 29 V/cm (DNA)
Laufbedingung: 40 V/cm (RNA)
1X DNA Puffer (nach Ref. 1)
1 mM Lithium-Borsäure oder
10 mM Natrium-Borsäure (für DNA 100 bp-5 kb) oder
5 mM Lithiumacetat (für DNA >3,0 kb)
0,5X RNA Puffer (nach Ref. 1)
5 mM Natrium-Borsäure (pH 6,0) oder Lithiumacetat
[1] Brody, J.R. et al. (2004) BioTechniques 37, 598-602.
Ultra-fast high-resolution agarose electrophoresis of DNA
and RNA using low-molarity conductive media.
Trennkapazität
Trennkapazität
3
Alle AppliChem-Agarosen zeigen aufgrund der hohen chemischen Reinheit sehr gute Auflösungs
vermögen und Trennkapazitäten in der Gel-Elektrophorese.
Als Faustregel gilt: bei geeigneter Agarosekonzentration und Pufferbedingungen sind 4 %
Fragmentlängen-Unterschiede zu identifizieren. Die folgende Tabelle gibt Aufschluss über geeignete
Gelkonzentrationen.
Beispiel: 1,5 % Agarose Standard (A2144) in TBE-Puffer wird zur Trennung von dsDNA mit
Fragmentlängen von etwa 1000 bp verwendet. Dann sind noch Unterschiede von 40 bp leicht zu
identifizieren.
1X TAE-Puffer
Agarose-Konzentration [%]
Trennbereich (bp)
Agarose Low EEO (Agarose Standard) A2114
20000 – 1000
0,6
12000 – 500
0,8
8000 – 300
1,0
6000 – 200
1,2
3500 – 100
1,5
2000 – 50
2,0
Agarose MP A1091
40000 – 3000
0,3
22000 – 2000
0,5
15000 – 1000
0,8
10000 – 400
1,0
5000 – 200
1,8
Agarose Low Melt 4 A2120
500 – 80
3,0
300 – 30
4,0
200 – 10
5,0
Agarose SMG A2122
2500 – 700
2,0
1200 – 500
3,0
700 – 100
4,0
250 – 30
5,0
Agarose IMG A2121
1500 – 100
2,0
1000 – 50
3,0
500 – 20
4,0
300 – 10
5,0
Agarose Low Melt Large DNA grade A3762
20000 – 500
0,75
16000 – 300
1,00
10000 – 250
1,25
5000 – 200
1,50
2500 – 100
1,75
1500 – 50
2,00
1X TBE-Puffer
Trennbereich (bp)
15000 – 1000
10000 – 500
7000 – 250
5000 – 200
3000 – 100
2000 – 50
20000 – 2000
12000 – 1500
9000 – 1000
6000 – 500
3000 – 200
300 – 50
100 – 10
< 100
1500 – 500
800 – 100
500 – 50
250 – 20
1200 – 100
700 – 40
200 – 20
< 100
12000 – 500
8000 – 300
4000 – 200
3000 – 150
2000 – 100
1000 – 50
35
F a r b s t o f f e
4
Farbstoffe
4.1 Nukleinsäure-Farbstoffe-Übersicht
Art.-Nr.
A1398
Bezeichnung
Acridinorange ◆
DNA/RNA-Farbkomplex
dsDNA/RNA grüne Fluoreszenz; ssDNA/RNA rote Fluoreszenz
A1001
DAPI
A1151
Ethidiumbromid•
spez. Bindung an AT-Basenpaare; Interkalation in GC-Basenpaare;
weißlich-blaue Fluoreszenz
Interkalation
A0691
A2388
A5595
A1402
Kristallviolett
Malachitgrünoxalat
DNA-Dye Methylenblau
Methylenblau
DNA (purpurrot)
DNA
DNA
RNA-Färbung im sauren pH-Bereich
A1403
A0581
A3918
Methylgrün
Methylorange
Nilblau
spez. Bindung an AT-reiche Sequenzen; DNA (grün)
DNA-Interkalator (blau)
A2261
A1406
A3944
Propidiumiodid
Pyronin Y
Silbernitrat
DNA-Interkalator; keine Aufnahme in lebende Zellen
DNA/RNA (rot)
DNA (braun)
A1400
Stains all
RNA (blau-violett)
DNA (blau)
• Es sind verschiedene ready-to-use-Lösungen erhältlich!
A1152 Ethidiumbromid-Lösung 1 % BioChemica
A2273 Ethidiumbromid-Lösung 0,07 % „dropper-bottle“
◆ Acridinorange wird hauptsächlich für die Färbung von ssDNA und RNA eingesetzt.
▲Wird häufiger in der histochemischen DNA-Färbung eingesetzt. Auch Enzymnachweise im Gel
(z.B. DNase im Polyacrylamid-Gel) findet man in der Literatur.
✶ eingesetzt hauptsächlich als „tracking dye“ und als „counter-dye“.
✤eingesetzt hauptsächlich für den Nachweis von anorganischem Phosphat (= Nachweis einer
ATPase-Aktivität)
Hinweis
Nicht alle Nukleinsäure-Farbstoffe werden auch in der Agarose-Gel-Elektrophorese eingesetzt.
Sensitivitäten (Nachweisgrenzen) beziehen sich daher nicht immer auf Färbungen in AgaroseGelen.
Abkürzungen
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid)
NaOAc (Natriumacetat)
PBS (Phosphate-buffered saline)
TX DNA (Triple Helix DNA)
Sensitivität
50 ng
empfohlene Konzentration
30 µg/ml
365 nm / 450 nm
70 ng
260-360 oder
546 nm / 590 nm
590 nm
626 nm
0,5 ng
0,1 µg/ml in PBS oder andere
wässrige Lösung
0,2–0,5 µg/ml
10 ng
1 µg/ml
✤
297 nm / 672 nm
40 ng
40–80 ng
638 nm
630 nm / 673 nm
530 nm / 625 nm
488-530 nm / 565-574 nm
RNA (lmax. 600 nm)
DNA (lmax. 620 nm)
0,0025 % in 0,1x TAE-Puffer
0,2 % in 0,4 M NaOAc/0,4 M
Essigsäure
▲
1 µg/ml
10 ng
0,0005 %
Agarose 40 ng; getr. 1 µg/ml
Gele 4 ng
n.a.
1 µg/ml
✶
0,05 % oder 1 µg/ml
Agarose 2,5 ng ds
DNA
dsDNA (5–10 ng)
0,005 %
TX DNA 3 ng
Stammlösung
10 mM Salzlösung oder 1 mg/ml in
dest. Wasser (6 Monate bei 2–8°C)
10 mg/ml in Wasser; 2-8°C
z.B. 200X
0,25 % in Wasser
1 µg/ml in 0,25X TAE-Puffer pH 8,0
2–8°C oder RT
0,1 % in Formamid; 5,6 mg/10 ml in
50 % Dioxan; frisch ansetzen
F a r b s t o f f e
Anregung/Emission
490 nm / 525 nm
37
F a r b s t o f f e
4.2 Protein-Farbstoffe–Übersicht
Art.-Nr. Bezeichnung
A2176
Bismarckbraun R
Bemerkung
zur Erhöhung der Sensitivität von
CBB R-250-Färbung
Absorptionsmaxima
lmax. 468 nm
A0822
Coomassie® Brillant Blau färbt auch Ampholyte im IEF-Gel!•
G-250
Coomassie® Brillant Blau färbt auch Ampholyte im IEF-Gel!
R-250
Eosin Y
reversible Färbung
A1346
Eriochromschwarz T
A1401
Fast Green FCF
A2385
Kongorot
Farbkomplex im sauren pH-Bereich lmax. (pH 8,3) 615; (MeOH) 620 nm
lmax. (mit Protein) 635 nm
Färbung im sauren pH-Bereich
A2388
Malachitgrünoxalat
Phosphatase-Nachweis im Gel
A1405
Nilrot
Ponceau S
saurer Diazofarbstoff
A7808
A3930
Proteo-Dye RuBPS
Rhodamin B ◆
A3972
A1400
Silbernitrat
Stains all••
A3480
A1092
Zink-Imidazol
lmax. mit Protein 549 nm,
ohne Protein 555 nm
560 nm
lmax. (H2O) 517–823 nm
lmax. 617 nm
560 nm
braun
färbt verschiedene Proteintypen in
unterschiedlichen Farben
reverse Färbung
lmax. für BSA 515 nm
✤ nur in Verbindung mit Coomassie®!
◆Nachweis auch von Phosphoproteinen: Bildung eines
unlöslichen Phosphat-Komplexes
(Sensitivität: 0,1 nM)
•Allen, R.E. et al. (1980) Anal. Biochem. 104, 494-498. Staining Protein in Isoelectric Focusing
Gels with Fast Green.
••färbt zum Beispiel Sialoglycoproteine und Phosphoproteine blau, fast alle anderen Proteine
rot.
Abkürzungen
BSA (Bovine Serum Albumin)
CBB (Coomassie® Brillantblau)
MeOH (Methanol)
RuBPS (Ruthenium(II)tris(bathophenanthrolindisulfonat))
TCA (Trichloressigsäure)
10 ng
empfohlene Konzentration
Stammlösung
Coomassie® Brillant Blau R-250 (0,2 % w/v) Lösungsmittel MeOH : Esigsäure : Wasser (40:7:53)
Bismarckbraun R (0,05 % w/v)
Farbstoffe in getrennten Lösungen, dann 1:0,75
gemischt (v/v)
80 ml der Stammlösung werden erst vor
0,1 % w/v CBB in 2 % w/v Phosphorsäure, 10 % w/v
Gebrauch mit 20 ml MeOH gemischt.
Ammoniumsulfat (nicht filtrieren!)
0,1 % in 20 % MeOH, 10 % Essigsäure
ähnlich CBB R-250
0,25 % (w/v) in 0,1 N NaOH
10 ng
0,01 %
400 ng
0,25 % (w/v) in 10 % Essigsäure bis
1 % (w/v) in 7 % Essigsäure
0,1 % (w/v) in 0,2 M Acetat-Puffer (pH 3,5)
< 0,5 ng
weniger sensitiv als
CBB
Färbelösung täglich frisch ansetzen; kann für mehrere
Gele verwendet werden
0,02 % in 40 % MeOH / 7 % Essigsäure; in
Kombination mit Rhodamin B
1 % (w/v) in dest. Wasser
Färbelösung = 3 Vol. Lsg.1 + 1 Vol. Lsg.
2 (3 Wochen stabil; jeweils vor Gebrauch
filtrieren)
Lösung 1: 0,15 g Malachitgrünoxalat in 300 ml
Wasser;
Lösung 2: 4,2 g Ammoniummolybdat-Tetrahydrat in
100 ml 5 N HCl
vor Gebrauch frisch ansetzen
2–5 ng
10 ng
0,1–0,5 % in 3 % TCA oder 1 ml Eisessig ad
100 ml Wasser
1 µM
0,01 %
2–5 ng
wie CBB
0,005 %
5 ng
500 ng
10–20 ng SDS-PAGE
40–80 ng native PAGE
1 mM
0,02 % in 40 % MeOH / 7 % Essigsäure; in
Kombination mit Eriochromschwarz T
0,1 % in Formamid oder 5,6 mg/10 ml in 50 %
Dioxan; frisch ansetzen
F a r b s t o f f e
Sensitivität
25 ng ✤
39
r
5
Glossar
a
Gelstärke (engl. Gel strength): mechanische Stabilität eines ausgehärteten Gels unter definierten
Bedingungen. Die maximale Belastbarkeit pro Fläche wird ausgedrückt in g/cm². Die Gelstärken
für Agarosen liegen typischerweise zwischen 250 g/cm² (wenig stabil) bis 3200 g/cm² (sehr
stabil und reißfest). Agarose-Qualitäten mit hohem Schmelzpunkt sind in der Regel stabiler als
solche mit niedrigem Schmelzpunkt.
s
Geltemperatur (engl. Gelling temperature): aufgeschmolzene Agarose verfestigt sich zur
Gelmatrix nahe der Geltemperatur. Anmerkung: einzelne, hochauflösende Agarose-Qualitäten
zeigen ihr optimales Auflösungsvermögen erst nachdem das Gel längere Zeit bei 4°C gekühlt
wurde.
s
Hysterese, hier: unterschiedliche Temperaturen bei denen Agarose flüssig oder fest wird –
abhängig vom Zustand aus dem das Gel kommt. Beispielsweise schmilzt Standard-Agarose bei
88°C, im Temperaturbereich zwischen 36–88°C bleibt sie flüssig und wird erst in der Nähe der
Geliertemperatur von ca. 36°C wieder fest. Ein ausgehärtetes Gel bleibt dagegen bis zum erneuten
Aufschmelzen fest. So kann also Agarose bei z.B. 45°C – abhängig von der Vorbehandlung –
flüssig oder fest sein.
l
o
Schmelzpunkt (engl. Melting point): Man unterscheidet Agarose-Typen mit niedrigem oder
normalem Schmelzpunkt. Standard-Agarose hat einen normalen Schmelzpunkt von ca. 88°C.
Agarosen mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP, low melting point) weisen typischerweise einen
Schmelzpunkt bei <65°C auf. Intermediäre Schmelzpunkte können durch Mischen beider
Qualitäten erreicht werden.
Präparative Gele werden häufig mit LMP-Agarosen durchgeführt, um eingeschlossene Moleküle
bei geringeren Temperaturen möglichst schonend aus der Matrix zu trennen ohne gleichzeitig die
DNA aufzuschmelzen.
G
Elektroendoosmose (EEO): ein Grenzflächenphänomen, welches die Bewegung einer
Flüssigkeit relativ zu einer geladenen Oberfläche in einem elektrischen Feld beschreibt. Die EEO
spielt nur bei sehr dünnen Flüssigkeitsschichten oder sehr kleinen Kapillaren wie den Poren
eines Agarosegels eine Rolle. In der Praxis sind Agarosen mit geringen Werten
(EEO <0,12) für die Trennung von Nukleinsäuren gefragt.
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A1417 TBE-Puffer (5X)
A3843 TPE-Puffer (10X)
A3435 TPE-Puffer (1X)
Ladepuffer
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A2571 Ladepuffer DNA II
A6307 Ladepuffer DNA II b
A3147 Ladepuffer DNA III
A3481 Ladepuffer DNA IV
A3476Ladepuffer DNA VIII
(für Glyoxal/DMSO-RNA-Gele)
A5212 Ladepuffer X (PCR)
DNA-Größenstandards
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A5216 DNA Ladder 100 bp plus
A5207 DNA Ladder 1 kb
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A5223 DNA Marker Phage Lambda Hind III
A5194 DNA Marker Phage Lambda Sty I
A5229 DNA Marker pBR322 - Hae III
A5235 DNA Marker pUC19 - Msp I
A6430 DNA Ladder 1 kb concatamer (lyophylisiert)
A2667 DNA Ladder 1 kp (lyophylisiert)
A3470 DNA Ladder 100 bp (lyophylisiert)
A3302 DNA Ladder 100 bp equalized (lyophylisiert)
A3982 DNA Ladder 250 bp (lyophylisiert)
A3660 DNA Ladder Mix 100-5000 (lyophylisiert)
A4406 DNA Marker pBR322 -– Hae III (lyophylisiert)
A6927 DNA Marker pBR328 Mix (lyophylisiert)
A5589DNA Marker Phage Lambda Hind III
(lyophylisiert)
A4412 DNA Marker Phage Lambda-BstE II (lyophylisiert)
A3996 DNA Marker pUC19-Msp I (lyophylisiert)
A7215 DNA Marker quick-run (lyophylisiert)
A7222 DNA Marker quick-run extended (lyophylisiert)
Farbstoffe
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A2273 Ethidiumbromid-Lösung 0,07 % „dropper bottle“
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Lösung (nicht giftiger DNA-Farbstoff)
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A3640 Bromophenolblau-Natriumsalz
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A6794 Proteo-Dye Green-Fluo
A6803 Proteo-Dye Red-Fluo
A7808 Proteo-Dye RuBPS
Transfermembranen
A5237Reprobe Nitrocellulose supported 0,22 μm
A5242Reprobe Nitrocellulose supported 0,45 μm
A5250Pure Nitrocellulose unsupported 0,22 μm
A5239Pure Nitrocellulose unsupported 0,45 μm
A4399 Pure Nylon Neutral Transfermembran 0,22 μm
A5248 Pure Nylon Neutral Transfermembran 0,45 μm
A5255 Reprobe Nylon Positiv-geladen 0,45 μm
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Agarose- Gel-Elektrophorese

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