Pré-projeto de dissertação

UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA
INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
Programa de Mestrado Acadêmico em Engenharia Biomédica
Denise Pereira de Lima Carvalho
TERAPIA FOTODINAMICA NO CONTROLE, DE MICRO-ORGANISMOS
ISOLADOS DE FERIDAS INFECTADAS: ESTUDO IN VITRO
São José dos Campos
2012
Denise Pereira de Lima Carvalho
TERAPIA FOTODINAMICA NO CONTROLE, DE MICRO-ORGANISMOS
ISOLADOS DE FERIDAS INFECTADAS: ESTUDO IN VITRO
Dissertação apresentada ao programa de PósGraduação em Engenharia Biomédica da
Universidade do Vale do Paraíba, como
complementação dos créditos necessários para
obtenção do Título de mestre em Engenharia
Biomédica.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Juliana Ferreira
Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Emilia
Loschiavo Arisawa
São José dos Campos
2012
Angela
C322e
Carvalho, Denise Pereira de Lima
Estudo da Terapia fotodinâmica no controle, de Micro-organismo Isolado de
Feridas Infectadas: estudo in vitro / Denise Pereira de Lima Carvalho. Orientadoras
Profª Dr. Juliana Ferreira; . São José dos Campos 2012.
65 p., 1 Disco laser.: color
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Engenharia
Biomédica do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do
Paraíba, 2012.
1.Terapia fotodinâmica 2. Ferida infectada, 3. Controle microbiano. I
Ferreira, Juliana, Orient. II. Arisawa, Emilia Angela Loschiavo Orient. III. Título.
CDU: 62:61
Autorizo para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta
dissertação, por processos fotocopiadores ou transmissão eletrônica, desde que
citada à fonte.
Assinatura do aluno:_________________________
Data: ____________________________________
DENISE PEREIRA DE LIMA CARVALHO
TERAPIA FOTODINAMICA NO CONTROLE, DE MICRO-ORGANISMOS
ISOLADOS DE FERIDAS INFECTADAS: ESTUDO IN VITRO
Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia
Biomédica, do Programa de Pós-Graduação de Engenharia Biomédica do Instituto de
Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP,
pela seguinte banca examinadora:
Profª Drª Juliana Ferreira (UNIVAP) ____________________________________________
Profª Drª Emilia Angela Loschiavo Arisawa (UNIVAP) _____________________________
Profª Drª Maria Belén Salazar Posso (UNIVAP) ___________________________________
Profª Drª Luciane Dias de Oliveira (UNESP – SJC)_________________________________
Profª Drª Sandra Maria Fonseca da Costa
Diretora do IP&D
São José dos Campos,
de outubro de 2012
Dedico esta dissertação primeiramente a Deus que me iluminou em cada etapa e que
renovou as minhas forças em cada momento de cansaço.
Ao meu marido Ademar Carvalho, por compartilhar comigo todos os momentos de
nossas vidas, bons ou ruins, os momentos passam, o importante é estarmos juntos.
Aos meus filhos Denis e Diogo que com seus beijos e carinho me vigoram a cada dia.
Adoro-te Senhor da Minha vida!
Amo vocês, meu marido e meus filhos!
AGRADECIMENTO ESPECIAL
A Deus por me dar a oportunidade de crescer um pouco mais e realizar mais um
sonho, agradeço inclusive, pelas promessas de tantos outros sonhos que tenho certeza, como
este, também se realizarão.
Ao meu marido que sempre solícito me ajudou durante todo o mestrado.
Aos meus filhos que tiveram muita paciência com a mamãe e me incentivavam a
continuar.
As minhas orientadoras Prof.ª Dr.ª Juliana Ferreira e a Profª. Drª. Emilia Ângela
Loschiavo Arisawa, pelo conhecimento e aprendizado que foram importantes e
imprescindíveis para o desenvolvimento deste trabalho, pela paciência e orientação, obrigada!
A Prof.ª Dr.ª Sônia Khouri, pela grande ajuda e dedicação, sua ajuda foi essencial para
realização deste trabalho, obrigada pela confiança e apoio dispensado.
AGRADECIMENTOS
A Prof.ª Drª. Maria Belén Salazar Posso que tanto admiro, por inúmeras vezes nos
auxiliar quando solicitada com presteza e carinho.
A Prof.ª Drª. Regimar Carla Machado pela amizade e incentivo.
Ao Prof. Dr. Leandro José Raniero, que nos prestou sua importante colaboração na
análise estatística.
A doutoranda Juliana Guerra, às alunas de iniciação científica Fabiana, Camila e
Letícia que sempre nos ajudaram de alguma forma durante os experimentos.
Aos Professores do IP&D que sempre nos apoiaram quando solicitados.
A bibliotecária Rúbia Gravito Gomes, pela disposição de nos auxiliar na busca das
referências do presente trabalho.
Aos funcionários da UNIVAP em especial a D. Ivone e D. Neusa que sempre nos
atenderam com respeito e dedicação.
A todos que de alguma forma nos ajudaram e não foram citados.
Muito obrigada!
“… Mas os que esperam no Senhor
renovam as suas forças, sobem com
asas como águias, correm e não se
cansam, caminham e não se
fatigam.” Isaías 40.31
ESTUDO DA TERAPIA FOTODINAMICA NO CONTROLE, DE MICROORGANISMOS ISOLADOS DE FERIDAS INFECTADAS: ESTUDO IN VITRO
RESUMO
As feridas infectadas tem sido um grande desafio para diversos profissionais da área da saúde,
pois, a infecção é uma das mais frequentes complicações que retardam o processo de
cicatrização. A TFD se refere à administração tópica ou sistêmica de um agente
fotossensibilizador (FS) não tóxico seguida da irradiação com luz visível de comprimento de
onda adequado. O uso da terapia fotodinâmica (TFD) no controle microbiano em feridas pode
ser uma alternativa viável por ser uma terapia tópica, utilizando um corante em baixa
concentração e de baixo custo, possibilitando a absorção pela microbiota local sem os efeitos
indesejáveis de um agente sistêmico. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ação da TFD,
na inativação de micro-organismo isolados de feridas infectadas, in vitro, utilizando como
agentes fotossensíveis o azul de metileno (AM) e o Photodithazine (PDZ). O estudo envolveu
a participação de 06 pacientes, os quais foram submetidos a coleta do material para cultura
das feridas, que deu origem a 11 cepas clínicas. Foram preparadas suspensões para o ensaio,
que foram divididos em: S/T - grupo que não recebeu nenhum tratamento; T1 – Grupo
submetido a TFD com PDZ; T2 – Grupo submetido a TFD com AM; T3 – Grupo submetido à
iluminação na ausência de FS; T4 – Grupo tratado com PDZ na ausência de luz; T5 - Grupo
tratado com AM na ausência de luz. Em nosso estudo foram identificadas as cepas:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus ssp, Pseudomonas ssp, Proteus ssp, Enterobacter ssp,
e Escherichia coli coletada de feridas infectadas, e foram incluídas as cepas: Staphylococcus
aureus (ATCC 14458) e Escherichia coli (ATCC 25922), como cepa controle. Os resultados
demonstram que a TFD com PDZ foi capaz de inibir o crescimento bacteriano em bactérias
Gram positivas, porém, não teve o mesmo efeito em bactérias Gram negativas, já a TFD com
AM demonstrou ser efetiva tanto nas bactérias Gram positivas como Gram negativas, pois foi
capaz de inibir o crescimento bacteriano em ambos os casos.
Palavras-chave: terapia fotodinâmica, ferida infectada, controle microbiano.
STUDY OF PHOTODYNAMIC THERAPY IN CONTROL OF MICRO-ORGANISMS
ISOLATED FROM INFECTED WOUNDS: STUDY IN VITRO
ABSTRACT
An infected wound has been a major challenge for many healthcare professionals, because the
infection is one of the most frequent complications that slow the healing process. GT refers to
the topical or systemic administration of a photosensitizing agent (FS) nontoxic followed by
irradiation with visible light of appropriate wavelength. The use of photodynamic therapy
(PDT) to control microbial wound may be a viable alternative for a topical therapy using a
dye at low concentration and low cost, enabling the absorption site by microbes without the
undesirable effects of a systemic agent. The aim of this study was to evaluate the effects of
PDT, the inactivation of micro-organism isolated from infected wounds, in vitro, using as
photosensitive methylene blue (MB) and Photodithazine (PDZ). The study involved the
participation of 06 patients, who underwent collection of material for culture from the
wounds, which led to 11 clinical strains. Suspensions were prepared for the test, which were
divided into: S / T - the group that received no treatment; T1 - Group underwent PDT with
PDZ, T2 - Group underwent PDT with AM; T3 - Group submitted to the lighting in the
absence of FS; T4 - Group treated with PDZ absence of light; T5 - AM-treated group in the
absence of light. We identified strains: Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp,
Pseudomonas spp, Proteus spp, Enterobacter spp, Escherichia coli. We also included in the
study strains: Staphylococcus aureus (ATCC 14458) and Escherichia coli (ATCC 25922) as
control strains. PDT with PDZ demonstrated in this study to be able to inhibit bacterial
growth in Gram-positive bacteria, but had no significant effect on Gram negative bacteria
which grew up to 100,000 CFU / mL, as with AM PDT proved effective both Gram positive
and Gram negative bacteria, since it was able to inhibit bacterial growth in both cases.
Key words: photodynamic therapy; infected wound; microbial control.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Corte anatômico da pele-estruturas da Derme. ......................................................... 16
Figura 2 - Corte anatômico da pele-estruturas da Derme. ........................................................ 16
Figura 3 - Estrutura molecular do azul de Metileno. ................................................................ 24
Figura 4 - Estrutura química do Photodithazine. ...................................................................... 25
Figura 5 – (A) Limpeza da ferida com solução fisiológica; (B) Coleta do material na própria
seringa com eliminação do ar e vedação; (C) Armazenamento para transporte do material ... 30
Figura 6 - Fluxograma da Análise microbiológica desde a coleta até a identificação dos microorganismos presentes nas feridas.............................................................................................. 31
Figura 7 – Meios de cultura utilizados para confirmação e ou diferenciação de grupos de
micro-organismos, presente nas feridas analisadas. (1) Agar Mac Conkey; (2) Agar Manitol;
(3) Agar Sangue. ....................................................................................................................... 31
Figura 8 - Diferenciação dos grupos de micro-organismo por meio da coloração de Gram –
(A) Observa-se a coloração arroxeada identificando as bactérias Gram positivas e (B)
avermelhada identificando as bactérias como Gram negativa.................................................. 32
Figura 9 - Esquema de identificação de enterobactérias por meio IAL / Rugai ....................... 32
Figura 10 – BioTable – Dispositivo à base de LEDs na região de 660 nm do espectro
eletromagnético. ....................................................................................................................... 34
Figura 11 – Sensibilidade e Especificidade da TFD para as bactérias Gram – positivas ......... 39
Figura 12 – Sensibilidade e Especificidade da TFD para as bactérias Gram - negativas ........ 41
LISTA DE TABELAS
Tabela 1– Número de ensaios nos diferentes grupos experimentais ........................................ 35
Tabela 2 – Adaptação da tabela para cálculo da Sensibilidade e Especificidade para Terapia
fotodinâmica envolvendo bactéria. ........................................................................................... 36
Tabela 3 - Resultado da TFD em bactérias Gram positivas ..................................................... 38
Tabela 4 – Valores de Sensibilidade e Especificidade das Bactérias Gram - positiva ............. 39
Tabela 5 – Resultados da TFD em bactérias Gram negativas. ................................................. 40
Tabela 6 – Valores de Sensibilidade e Especificidade das Bactérias Gram - negativas .......... 41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AM
Azul de metileno
AT
Azul de Toluidina
ATCC
American Type Culture Collection
BHI
Brain Hart Infusion
CNS
Conselho Nacional de Saúde
E. coli
Escherichia coli
FS
Fotossensibilizador
LED
Diodo Emissor de Luz
MRSA
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
PDZ
Photodithazine
RB
Rosa de Bengala
S. aureus
Staphylococcus aureus
TFD
Terapia fotodinâmica
UFC
Unidade formadora de colônia
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 15
1.1 Pele ................................................................................................................................. 15
1.2 Microbiota do corpo humano ......................................................................................... 17
1.3 Ferida............................................................................................................................... 18
1.3.1 Ferida infectada ....................................................................................................... 19
1.3.2 Tratamento e Diagnóstico de Ferida Infectada ........................................................ 20
1.4 Terapia Fotodinâmica ..................................................................................................... 22
1.4.1 Fotossensibilizadores e Corantes ............................................................................. 23
1.4.2 Fonte de luz ............................................................................................................. 25
2 JUSTIFICATIVA .................................................................................................................. 27
3 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 28
4 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................. 29
4.1 Coleta do material para cultura ....................................................................................... 29
4.2 Análise Microbiológica .................................................................................................. 30
4.2.1 Preparo da suspensão das cepas .............................................................................. 33
4.3 Tratamento com Fotossensibilizador .............................................................................. 33
4.4 Fonte de luz .................................................................................................................... 33
4.5 Procedimentos experimentais. ........................................................................................ 34
4.6 Interpretação de dados e análise estatística .................................................................... 35
5 RESULTADO E DISCUSSÃO ............................................................................................ 37
5.1 Determinação do tempo de incubação das amostras ...................................................... 37
5.2 Bactérias Gram - Positivas ............................................................................................. 37
5.3 Bactérias Gram - Negativas ............................................................................................ 39
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 45
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 46
Anexo A: Certificado de aprovação pelo Comitê de Ética....................................................... 52
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 Pele
A pele é o maior órgão do corpo humano, recobre 1, 858 m2 de superfície de um adulto
médio, o que significa cobrir quase todo o corpo com exceção dos orifícios genitais,
alimentares e olhos (JARVIS, 2002; SAMPAIO; RIVITTI, 2007).
Apresenta funções de proteção, minimizando as lesões causadas por agentes químicos,
térmicos e ondas luminosas; previne a penetração de micro-organismo e a perda de água e
eletrólitos originadas no interior do corpo; percepção: a pele contém órgãos neurossensorias
finais para tato, dor, temperatura, absorção e excreção de líquidos, absorção da luz
ultravioleta, metabolização da vitamina D, barreira de proteção que isola e ao mesmo tempo
permite que se relacione com o meio externo, além do papel estético (IRION, 2005; JORGE;
DANTAS, 2005; GUYTON; HALL, 2006).
A epiderme é a camada mais externa da pele, constituída por células epiteliais
(queratinócitos). Estas células são produzidas na camada mais inferior da epiderme (camada
basal ou germinativa) e em sua evolução em direção à superfície sofrem processo de
queratinização ou corneificação, que dá origem à camada córnea, composta basicamente de
queratina, uma proteína responsável pela impermeabilização da pele (SAMPAIO; RIVITTI,
2007). Na epiderme acontece uma renovação celular constante que faz com que as células da
camada córnea sejam gradativamente eliminadas e substituídas por outras (GEORGE;
ALVES; CASTRO, 1985; SAMPAIO; RIVITTI, 2007).
Além dos queratinócitos, encontram-se, também na epiderme os melanócitos,
responsáveis pela produção do pigmento que dá cor à pele (melanina), e as células de defesa
imunológica (células de Langerhans) (GEORGE; ALVES; CASTRO, 1985).
Os anexos cutâneos também são originados na epiderme: unhas, pêlos, glândulas
sudoríparas e glândulas sebáceas. A abertura dos folículos pilossebáceos (pêlo e glândula
sebácea) e das glândulas sudoríparas na pele formam os orifícios conhecidos como poros
(GEORGE; ALVES; CASTRO, 1985).
A derme é responsável pela resistência e elasticidade da pele, sendo constituída por
tecido conjuntivo (fibras colágenas e elásticas envoltas por substância fundamental), vasos
sanguíneos e linfáticos, nervos e terminações nervosas. Os folículos pilossebáceos e glândulas
sudoríparas, originadas na derme, também, apresentam-se na epiderme (Figura 1 e 2)
(GEORGE; ALVES; CASTRO, 1985; SAMPAIO; RIVITTI, 2007).
16
A faixa onde a epiderme e a derme se unem é chamada de junção dermo-epidérmica. A
epiderme nesta área se projeta em direção da derme, formando as cristas epidérmicas. Estas
aumentam a superfície de contato entre as duas camadas, facilitando a nutrição das células
epidérmicas pelos vasos sanguíneos da derme (GEORGE; ALVES; CASTRO, 1985;
SAMPAIO; RIVITI, 2007).
Figura 1- Corte anatômico da pele-estruturas da Derme.
Fonte: Bear; Connors; Paradiso (2008).
Figura 2 - Corte anatômico da pele-estruturas da Derme.
Fonte: Bear; Connors; Paradiso (2008).
17
1.2 Microbiota do corpo humano
O corpo humano é ininterruptamente habitado por vários micro-organismos diferentes,
em sua maioria bactérias que, em condições normais e em um indivíduo sadio, são
inofensivos e podem ajudar o organismo, competindo pelos nutrientes com os microorganismos patogênicos, ou realizando tarefas especiais; por exemplo, na luz intestinal onde
os micro-organismos residentes podem desempenhar várias funções químicas (LANDIS,
2008).
Os micro-organismos predominantes na pele são: bacilos difteróides aeróbios e
anaeróbios; estafilococos aeróbios e anaeróbios não hemolíticos; bacilos Gram - positivos
aeróbios, estreptococos alfa-hemolíticos e enterococos; bacilos coliformes Gram - negativo e
Acinetobacter; fungos e leveduras nas pregas cutâneas; micobactérias não patogênicas em
áreas ricas em secreções sebáceas (LANDIS, 2008).
A probabilidade de infecção varia diretamente com o aumento do número de bactérias
e sua capacidade relativa de causar a doença, conhecida como virulência, enquanto varia
inversamente com a capacidade do hospedeiro para resistir à invasão (LANDIS, 2008).
Portanto, a contaminação bacteriana, pode evoluir para um processo infeccioso (acima de 105
bactérias por g/tec.) conforme as condições da região afetada, que permitem sua proliferação
(FERNANDES; RIBEIRO FILHO; BARROSO, 2000; CAVALCANTI et al. , 2005;
DAVIS, 2005; MICHELIM et al., 2005; TRABULSI; ALTHERTHUM, 2005; IWATSUKI et
al., 2006;).
Desta forma, a infecção é a mais comum das complicações que retardam o processo da
cicatrização das feridas e, implica em uma resposta vascular e celular dos tecidos. Assim a
reparação tecidual ocorrerá após a eliminação completa do processo infeccioso, com a morte
ou inativação dos micro-organismos e remoção do tecido necrótico (FERNANDES;
RIBEIRO FILHO; BARROSO, 2000; CAVALCANTI et al., 2005; DAVIS, 2005).
Compreendendo-se o processo da patogenicidade desse ameaçador agente infeccioso os
profissionais clínicos podem se nortear à seleção e escolha da antibioticoterapia,
minimizando, assim, as chances de seleção de cepas resistentes (e multi-resistentes) aos
antimicrobianos (FERNANDES; RIBEIRO FILHO; BARROSO, 2000; CAVALCANTI. et
al. , 2005; DAVIS, 2005; MICHELIM, et al., 2005; TRABULSI; ALTHERTHUM, 2005;
IWATSUKI, et al., 2006).
Os micro-organismos patogênicos estritos estão sempre associados à causa de doença,
já os micro-organismos patogênicos oportunistas são membros da microbiota normal que
18
quando introduzidos em sítios “desprotegidos” causam doença A microbiota humana é um
dos mecanismos de defesa contra a patogênese bacteriana, e a maioria dos componentes da
microbiota normal é inofensiva a indivíduos sadios, porém, muitas bactérias da microbiota
normal podem agir como oportunistas. Uma das bactérias mais comuns presentes na prática
clínica é Staphylococus aureus (S. aureus) uma vez que costuma colonizar a pele em até 15%
dos seres humanos (TRABULSI; ALTHERTHUM, 2005).
Com o uso cada vez mais difundido, e muitas vezes desnecessário, de antibióticos, as
infecções por S. aureus resistente à Meticilina (MRSA sigla em inglês Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus) têm sido cada vez mais frequentes em todo mundo. A primeira
descrição de MRSA é de 1959, logo após a invenção da meticilina (TRABULSI;
ALTHERTHUM, 2005).
1.3 Ferida
Ferida é a solução de continuidade de um tecido vivo, causada por um trauma físico,
químico, mecânico ou por uma afecção clínica ou fisiológica (GEOVANINI et al., 2007;
JORGE; DANTAS 2005; CESARETTI, 1998). As feridas podem ser classificadas, como
afirma Fernandes, Ribeiro Filho e Barroso (2000) “[...] pela causa, pelo agente e pelo
conteúdo microbiano”. Dessa forma quanto ao agente causal, em: incisas ou cortantes; cortocontusa; perfurante; pérfuro-contusas; lacero-contusas; pérfuro-incisas; escoriações, entre
outras, (SMELTZER; BARE, 2005).
São classificadas também de acordo com o comprometimento tecidual, em quatro
estágios: estágio I, caracterizada pelo comprometimento da epiderme apenas, com formação
de eritema em pele íntegra e sem perda tecidual; estágio II, caracterizada por abrasão ou
úlcera, ocorre perda tecidual e comprometimento da epiderme, derme ou ambas; estágio III
caracterizada por presença de úlcera profunda, com comprometimento total da pele e necrose
de tecido subcutâneo, entretanto a lesão não se estende até a fáscia muscular; estágio IV
caracterizada por extensa destruição de tecido, chegando a ocorrer lesão óssea ou muscular ou
necrose tissular (IRION, 2005; SMELTZER; BARE, 2005).
Também podem ser classificadas quanto ao grau de contaminação: limpas que são as
produzidas em ambiente cirúrgico, sendo que não foram abertos sistemas como o digestório,
respiratório e genito-urinário; limpas-contaminadas que também são conhecidas como
potencialmente contaminadas; nelas há contaminação grosseira, por exemplo: nas ocasionadas
19
por faca de cozinha, ou nas situações cirúrgicas em que houve abertura dos sistemas
contaminados descritos anteriormente; contaminadas são as que tiveram contato com material
como terra, fezes, etc. Também são consideradas contaminadas aquelas em que já se passou
seis horas após o ato que resultou na ferida; infectadas as que apresentam sinais nítidos de
infecção (IRION, 2005; SMELTZER; BARE, 2005).
As feridas podem ser também agudas ou crônicas. As feridas agudas são originadas de
cirurgias ou traumas e a reparação ocorre em tempo adequado, sem complicações; as feridas
são consideradas crônicas quando não cicatrizam em um período de três meses (TAYLOR;
KONCAL; GELBARD, 2008).
As feridas crônicas tem sido de extrema preocupação, pois repercutem em elevados
custos financeiros, além de desagradáveis conseqüências para o doente, apesar do
desenvolvimento de recursos e de tecnologia no tratamento das feridas a incidência e a
prevalência de úlceras crônicas é extremamente alta (FERREIRA et al., 2005; FRANKS,
2007).
Úlcera de pressão é uma lesão que se desenvolve quando se tem uma compressão do
tecido mole entre uma proeminência óssea e uma superfície dura por um período prolongado,
em pacientes críticos hospitalizados e idosos em situações de adoecimento crônicodegenerativo a incidência desse tipo de ferida tem se destacado, tornando-se um problema
sério (COSTA; COSTA, 2007; MEDEIROS; LOPES; JORGE, 2009).
1.3.1
Ferida infectada
As feridas
infectadas
são classificadas segundo o
grau de contaminação
(FERNANDES; RIBEIRO FILHO; BARROSO, 2000) como aquelas em que há nítido
processo infeccioso com retenção de tecido desvitalizado e presença de secreção purulenta
nos sítios manipulados, ou ainda, em procedimentos cirúrgicos em que ocorrem quebras
importantes da técnica asséptica, até pela prévia sujidade.
As feridas infectadas tem sido um grande desafio para diversos profissionais de saúde,
constituindo-se em uma complicação relacionada a diversos fatores locais: contaminação,
presença de corpo estranho, técnica de sutura inadequada, tecido desvitalizado e espaço
morto; e também relacionada a fatores gerais: debilidade, idade avançada, obesidade, anemia,
choque, grande período de internação hospitalar, tempo cirúrgico elevado e doenças
associadas, principalmente a diabetes e doenças imunossupressoras (CANDIDO, 2001)
20
A presença de micro-organismos em uma ferida não indica infecção, a infecção
depende do número de micro-organismos, sua virulência e a resistência do hospedeiro,
portanto, a infecção ocorre quando há um desequilíbrio em favor do agente invasor em
detrimento do hospedeiro (DOW; BROWNE; SIBBALD, 1999; CAVALCANTI, 2005;
IRION, 2005; JORGE; DANTAS, 2005; BORGES et al., 2007; LANDIS, 2008; CUNHA,
2006; MALAGUTTI; KAKIHARA, 2012).
Na presença de infecção há maior destruição de tecido e retardo na reparação, que deve
ser diferenciada de colonização. (LODOVICI, 1994; IRION, 2005; LANDIS, 2008). Ayliffe
et al. (1992) descrevem os seguintes critérios para a identificação de infecção em uma ferida:
cheiro; alterações da cor (tons de amarelo e verde); aumento do exsudato (pus); celulite e
inflamação; tecido frágil de granulação (sangra facilmente); formação de abcesso(s); aumento
do desconforto e da sensibilidade; ferida não-cicatrizante; deterioração e reabertura da ferida;
formação de bolsas ou pontes na base da ferida, sendo, hoje, corroborados por vários autores
(BORGES et al., 2007; IRION, 2005; LANDIS, 2008; CUNHA, 2006; MALAGUTTI;
KAKIHARA, 2010).
A infecção de ferida é um fator determinante de retardo da cicatrização de ferida, além
de desconforto e dor. Cerca de 1 a 2% da população mundial nos países desenvolvidos
desenvolvem feridas crônicas como: úlceras do pé diabético, úlceras por pressão e úlceras de
perna venosa, uma condição associada ao sofrimento do paciente grave, a perda do emprego,
redução na qualidade de vida, e custos elevados para o sistema de saúde (GOTTRUP, 2004).
Saliente-se que as feridas crônicas comumente são acometidas por infecção, provocando
retardamento da cicatrização das feridas, uma das fundamentais razões pelo aumento do risco
de maior morbidade e mortalidade dos pacientes (LANDIS, 2008).
1.3.2
Tratamento e Diagnóstico de Ferida Infectada
Na antiguidade já havia preocupação com o cuidado de ferida infectada, modelada no
papiro de Smith datado de 1700 a.C descrevendo que tais feridas eram tratadas com aplicação
diária de mel em forma de ungüento (KNUTSON et al., 1981; DONAHUE, 1985;
GEOVANINI, et al., 2007). Na tentativa de sobreviver, o homem, se aventurava e lutava
sendo acometido por ferimentos das mais diversas ordens advindos da caça, da defesa de sua
vida frente às agressões da ação de agentes físicos, químicos ou biológicos (GEOVANINI et
al., 2007) com nítidas evidências que na pré-história eram utilizadas plantas ou extratos na
21
forma de cataplasma em feridas abertas e também ingeridas para atuar de maneira sistêmica
como expõe Jorge e Dantas (2003).
No século V a.C., Hipócrates já usava vinagre ou ácido acético como anti-séptico em
ferida. A solução de vinagre ou ácido acético tem sido usado como bactericida contra muitos
micro-organismos Gram - positivos e Gram - negativos os quais, geralmente desenvolvem
resistência rápida a muitos agentes tópicos e sistêmicos, essa abordagem simples, que reduz o
pH local, podem reduzir a carga bacteriana deste micro-organismo na ferida, é eficaz para
feridas superficiais criticamente colonizadas (LANDIS, 2008).
Também Candido (2001) cita Celsius que em 200 d.C classificou os vários tipos de
feridas e descreveu não só os tratamentos, como os sinais e sintomas prodrômicos da
infecção, ou seja: dor, calor, rubor e edema. Ainda discorrendo sobre a história da Medicina
relata o surgimento da penicilina (II Guerra Mundial 1941) como um grande passo para o
controle da infecção, até, finalmente, chegar aos conceitos atuais de manutenção do leito da
ferida úmido, que acelera o processo de cicatrização.
Hoje o tratamento de feridas infectadas tem como principais objetivos: identificação do
organismo infectante; eliminação da infecção da ferida através de agentes antimicrobianos;
remoção de tecido desvitalizado e de exsudato em excesso no leito da ferida e proteção da
pele circundante dos efeitos da maceração (APECIH, 2001; BORGES et al., 2007; CUNHA,
2006; MALAGUTTI; KAKIHARA, 2010). Na presença de indícios clínicos de infecção local
ou sistêmica, como também em feridas que não cicatrizam e em casos de comprometimento
ósseo deve estar indicado a cultura (SANTOS, 2000; DAVIS, 2005).
Com a descoberta do antibiótico julgava-se que o problema com a infecção estivesse
resolvido, contudo, com o aparecimento da resistência bacteriana, percebeu-se que o
antibiótico não acabaria com a infecção por completo (BACELAR; FERREIRA FILHO;
FERRAZ, 1992; APECIH, 2001; CANDIDO, 2001; IRION, 2005; LANDIS, 2008).
Existe uma variedade de recursos terapêuticos que o profissional de saúde poderá lançar
mão para o tratamento das feridas, infectadas ou não, segundo sua avaliação da ferida quanto
à sua natureza, localização e tamanho, selecionando corretamente o tipo procedimento
terapêutico mais apropriado favorecendo a cicatrização da mesma de forma naturalmente
organizada (APECIH, 2001; CUNHA, 2006; MALAGUTTI, KAKIHARA, 2010). Dentre
eles está a Terapia Fotodinâmica.
22
1.4 Terapia Fotodinâmica
A terapia fotodinâmica (TFD) é um tratamento clínico utilizado em diversos tipos de
câncer e outras doenças (RIBEIRO et al., 2005). A TFD se refere à administração tópica ou
sistêmica de um agente fotossensibilizador (FS) não tóxico seguida da irradiação com luz
visível de comprimento de onda adequado. O FS ativado reage com moléculas de oxigênio
presentes nas células, por transferência de elétrons ou hidrogênio, levando à produção de
radicais livres, ou por transferência de energia ao oxigênio, que leva à produção de oxigênio
singleto, os quais causam desordem na parede celular e danos no DNA podendo induzir à
morte celular e à destruição do tecido doente (LAMBRECHTS; AALDERS; MARLE, 2005).
Vários fatores podem influenciar a ação da TFD dentre eles pode-se destacar: pH do
meio na presença de água e de sangue; concentração e tempo de permanência do FS no
organismo; dose de luz utilizada; e comprimento de onda e tempo de exposição à luz
(GARCIA; THEOODORO; ALMEIDA, 2007).
A TFD foi descoberta a mais de cem anos, por meio da observação da morte dos microorganismos quando expostos à luz solar e ao ar, na presença de certos corantes, apresentando
uma alternativa no tratamento de infecções locais contra fungos, bactérias e vírus (RAAB,
1900, Apud MACHADO, 2000).
Inicialmente desenvolvida como uma terapia alternativa para o tratamento de câncer ela
vem sendo amplamente estudada para aplicações em outras áreas, como por exemplo, uma
alternativa para inativação de micro-organismos, podendo ser empregada como tratamento de
sinusite recorrente crônica, periodontite, dermatologia e oftalmologia (FONTANA et al.,
2009; BIEL et al., 2011; DEMINOVA; HAMBLIN, 2011).
A TFD está sendo amplamente empregada no tratamento de micro-organismo, tanto
em estudos laboratoriais como em estudos clínicos, mostrando-se como uma alternativa
importante na área de microbiologia.
O estudo de Almeida (2011) demonstrou efetividade da TFD com AM a 0,1% sobre
feridas cutâneas infectadas por S. aureus e a redução de 93% de UFC/mL após 72 horas e
100% após 7 dias da TFD.
A TFD tem se mostrado mais efetiva em bactérias Gram positivas, as espécies Gram
negativas tem se mostrado significantemente resistentes a muitos fotossensibilizadores usados
em TFD (MAISCH et al., 2005).
A coloração de Gram age como um FS usado em TFD, as espécies Gram positivas
facilmente capturam o corante, portanto morrem facilmente. As espécies Gram negativas
23
possuem uma membrana externa complexa incluindo duas bicamadas lipídicas que funcionam
como uma barreira física e funcional entre a célula e seu ambiente, e as espécies Gram
positivas têm somente uma membrana que é relativamente permeável. Fungos, como Cândida
albicans, possuem uma membrana nuclear, o que os tornam ainda mais resistentes à TFD
podendo representar uma barreira adicional à penetração do FS. Na tentativa de superar essa
resistência tem-se usado fotossensibilizadores compostos por polímeros catiônicos com
administração de peptídeos permeabilizantes (GAD et al., 2004; DEMIDOVA; HAMBLIN,
2005).
A TFD no controle antimicrobiano apresenta como vantagens: ser uma terapia de fácil
execução, por ser terapia tópica utilizando um FS em baixa concentração, possibilitando a
absorção pela microbiota local sem os efeitos indesejáveis de um agente sistêmico
(ALMEIDA et al., 2006).
Outra importante vantagem relacionada à utilização da TFD para o tratamento de
infecções é a possibilidade de inativação de cepas resistentes aos tratamentos convencionais.
Além disso, parece ser improvável que os micro-organismos desenvolvam resistência a TFD,
já que esta envolve a formação de radicais livres oxidativos não específicos (DAHL et. al.,
1989).
1.4.1 Fotossensibilizadores e Corantes
Fotossensibilizadores são substâncias (moléculas) que quando excitadas pela luz
produzem espécies altamente reativas de oxigênio como o oxigênio singleto e outras formas
radicalares (CAVALCANTI, 2005).
Os corantes e fotossensibilizadores: xantenos halogenados tais como Rosa de Bengala
(RB), fenotiazínicos tais como azul de toluidina (AT) e Azul de Metileno (AM), acridinas e
conjugados de clorina (e6), têm sido estudados para erradicação de micro-organismos
(WAINWRINGHT, 2002).
O AM é um corante catiônico da classe fenotiazinas, sua fórmula molecular é
C16H18C1N3S e massa molar 319.85 g/mol, como apresentado na figura 3.
24
Figura 3 - Estrutura molecular do azul de Metileno.
Fonte: Perussi. (2007)
A absorção máxima do AM na região do vermelho do espectro eletromagnético é de
660 nm. Sua efetivida é maior contra bactérias Gram positivas do que Gram negativas. A
carga positiva do AM promove uma ligação eletrostática na superfície da bactéria, causando
um dano inicial a sua parede e possibilitando maior atividade fotodinâmica contra as bactérias
(WAINWRIGHT, 1998).
Diversos FS tem sido estudados para inativação microbiana, dentre eles o Azul de orto
toluidina, Curcumina e o azul de Metileno, sendo o último amplamente estudado como
fotossensibilizador na inativação de bactérias, com resultados positivos e aprovado pelo FDA
(MARTINS, 2007; PELOI et al., 2008; ZOLFAGHARI et al., 2009; PASCHOAL, 2009;
CHOI; LEE; CHAE, 2010).
O Photodithazine (PDZ) é um fotossensibilizador de segunda geração produzida na
Rússia em 1998. É uma clorina modificada (E6), obtida a partir da modificação da estrutura
de uma cianobactéria Spirulina platensis (STRANADKO et al., 2000)
As clorinas são porfirinas hidrofílicas reduzidas, que apresentam forte banda de
absorção na região de 640-700nm (luz vermelha) (WOODBURN et al., 1996). Clorinas e
bacterioclorinas são encontradas em produtos naturais. As clorinas são encontradas na
clorofila-a (presente em algumas espécies de Spirulina) e as bacterioclorinas podem ser
encontradas em bactérias Rhodobacter capsulatus (ZEZELL, 1991). Vários derivados têm
sido estudados, dentre eles a mono-aspartil-clorina-e6 (Npe6), que apresenta duas importantes
propriedades: um alto rendimento quântico de formação de oxigênio singleto (0,70)
(WOODBURN et al., 1996) e uma intensa absorção em comprimentos de onda maiores (650680 nm) (COLUSSI; FEYES; MUKTAR, 1998). Algumas clorinas sintéticas também
apresentam atividade biológica promissora, tais como a meso-tetrakis (m-hidroxifenil) clorina
(m-THPC) e o derivado de benzoporfirina (BPDMA).
A alta eficácia fotodinâmica do PDZ (figura 4) nas células, de acordo com estudos
realizados na Rússia tem relação com sua capacidade de penetração nas células através da
25
membrana biológica (STRANADKO et al., 2000). Estudos in vivo mostraram que este
composto não apresenta toxicidade no escuro, exceto em concentrações muito elevadas
(MENEZES et al., 2005; CORRÊA, 2006). Outra vantagem do PDZ é a rápida eliminação do
organismo, sendo que 94% da eliminação ocorre em 24h e 98% em 48h (MARTINKOVICS,
2002; CORRÊA 2006).
Figura 4 - Estrutura química do Photodithazine.
Fonte: Reshetnickov et al. (2000)
1.4.2 Fonte de luz
A palavra LASER é um acrônimo do inglês "Light Amplification by Stimulated
Emission of Radiation", o que significa "amplificação da luz por emissão estimulada da
radiação". O laser é um dispositivo que foi desenvolvido na década de 60 e apresenta
propriedades importantes, como: concentração elevada de energia, pouca dispersão de energia
à medida que a luz se propaga, coerência, monocromaticidade e colimação (GENOVESE,
2000).
Devido a estas propriedades os equipamentos a laser, permitem melhor controle de
energia específica em estudos experimentais além de apresentarem maior definição na
penetração em tecidos biológicos. Apesar de amplamente utilizado como instrumento de
corte, permitindo vaporização de tecidos, foi somente na década de 90 que o laser se tornou
mais presente na medicina por causa de uma característica que é muito usada pelos físicos que
trabalham com átomos e moléculas: a seletividade.
26
O Diodo Emissor de Luz (Liht emitting diode - LED) é um diodo semicondutor (junção
P-N) capaz de absorver energia elétrica e emitir na forma de luz visível. Este dispositivo é
considerado uma fonte de luz contínua de alta eficiência, baseados nas propriedades de um
semicondutor dopado com duas impurezas diferentes de modo a formar um diodo. Os efeitos
dos LEDs são semelhantes ao do laser, apesar da luz não ser monocromática colimada e nem
coerente (GENOVESE, 2000).
O LED tem como vantagens o tamanho reduzido, fácil manutenção, economia de
energia em relação às lâmpadas convencionais e baixo custo em relação ao laser, tendo sido
considerado como mais uma fonte de luz alternativa em terapias que envolvem luz de baixa
intensidade, tratamentos estéticos e na TFD.
27
2 JUSTIFICATIVA
O controle de micro-organismos tem sido um grande desafio para os profissionais de
saúde. Há uma grande preocupação, principalmente devido à rápida capacidade de evolução e
diversidade de patógenos encontrados. O aparecimento de uma grande variedade de
patógenos resistentes aos antimicrobianos faz com que haja um grande aumento da morbidade
por infecções que eram tratadas no passado. Certos tipos de infecções hospitalares já não
podem mais ser controladas com os tradicionais antibióticos, e, em muitos casos, pacientes
estão indo a óbito (SANTOS, 2004).
Segundo Santos (2004), num grande hospital universitário, demonstrou-se
que as infecções atribuídas a bacteriemia adquiridas naquele hospital
aumentaram o tempo da permanência do paciente na UTI por um período de
8 dias e, o tempo de hospitalização por 14 dias, sendo que as bacteriemias
foram responsáveis por uma taxa de mortalidade de ordem de 35%. Outro
trabalho preconiza que as infecções de feridas cirúrgicas, adquiridas nos
hospitais, aumentam a permanência do paciente na instituição hospitalar em
média 7,4 dias e é também causa de morte.
O Institute of Healthcare Improvement lançou a primeira campanha para evitar, pelo
menos, 100.000 mortes desnecessárias causadas por infecções, falta de protocolos e erros.
Aproximadamente 3.000 hospitais nos Estados Unidos da América participaram da
campanha, compartilhando dados de mortalidade e implementando procedimentos para
melhorar o cuidado da saúde (WACHTER; PRONOVOST, 2006).
O uso de antibióticos em infecções tem sido cada vez mais freqüente e muito difundido
e muitas vezes desnecessário, em todo mundo, tornando-se necessárias o desenvolvimento de
alternativas urgentes para controle microbiológico.
Atualmente, a TFD tem sido amplamente utilizada, e, acredita-se que a TFD possa fazer
uma grande diferença no tratamento das feridas infectadas. A TFD poderá ser usada como
uma alternativa para tratamentos locais de infecção, os antimicrobianos poderão ser utilizados
em infecções mais graves, evitando assim o desenvolvimento da resistência bacteriana e
amenizando os efeitos indesejáveis associados ao uso desses fármacos.
28
3 OBJETIVOS
O objetivo do presente trabalho foi avaliar in vitro, a ação da terapia fotodinâmica, na
inativação de micro-organismo isolados de feridas infectadas, utilizando o corante azul de
metileno e o fotossensibilizador Photodithazine.
Objetivos específicos:
a) Verificar a ação da TFD na redução ou inativação de micro-organismos,
isolados de feridas infectadas;
b) Comparar a ação da TFD utilizando o corante do azul de metileno e o
fotossensibilizador photodithazine na inativação ou redução desses microorganismos.
29
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa da UNESP (Universidade
Estadual Paulista) sob o número 100/2011 (anexo A) e foi executado seguindo diretrizes e
normas regulamentadoras de pesquisa, com seres humanos, conforme resolução nº 196/96 do
Conselho Nacional de Saúde (CNS).
O referencial teórico foi realizado a partir de levantamento na literatura
pertinente sobre o objetivo do estudo, referências existentes em periódicos indexados nos
bancos de dados da Bireme, portal CAPES, Scielo e PubMed. Formulou-se a busca a partir
dos descritores e sinônimos relacionados a terapia fotodinâmica, ferida infectada, controle
microbiano.
O estudo foi realizado com cepas clínicas isoladas de feridas de 06 pacientes de ambos
os sexos que não estavam sob terapia com antibióticos; 2 pacientes apresentavam feridas
crônicas de estase venosa em membro inferior; 1 paciente úlcera mista em membro inferior e
3 pacientes com úlceras por Pressão em região sacra em estágio II e III (IRION, 2005;
SMELTZER; BARE, 2005), provenientes de uma Clínica de Enfermagem de Taubaté, por
meio de uma Carta de Solicitação de Autorização para pesquisa.
Foi utilizado também cepas-padrão de Staphylococcus aureus (ATCC 14458) e
Escherichia coli (ATCC 10799) como cepas controle, proveniente do laboratório de
Microbiologia da Universidade do Vale do Paraíba de São José dos Campos (UNIVAP).
As análises microbiológicas e o tratamento com fotosensibilisador foram realizados no
laboratório de Microbiologia da UNIVAP.
Para análise dos dados foi realizado o teste de Sensibilidade e Especificidade com
objetivo de avaliar o efeito da TFD na redução bacteriana de micro-organismos isolados de
feridas infectadas e comparar a ação da TFD utilizando diferentes agentes fotossensíveis.
4.1 Coleta do material para cultura
Foi realizada a limpeza da ferida com solução fisiológica, em seguida foi aspirado o
material com uma seringa de 1 ml e agulha 40 x12 estéreis. Quando a secreção era
insuficiente, a ferida era umedecida com solução fisiológica a 0,9% em pequena quantidade e
aspirado com a mesma seringa. As áreas com necrose ou pus foram retiradas antes da coleta.
O material foi transportado na própria seringa com eliminação do ar e vedação. Em seguida o
30
material coletado foi armazenado com identificação e horário da coleta e enviado para análise
microbiológica que foi realizada no laboratório microbiologia da UNIVAP. A figura 5 mostra
o procedimento da limpeza da ferida ao armazenamento da amostra.
Figura 5 – (A) Limpeza da ferida com solução fisiológica; (B) Coleta do material na própria seringa com
eliminação do ar e vedação; (C) Armazenamento para transporte do material
(A)
(B)
(C)
4.2 Análise Microbiológica
Foi realizada análise quantitativa para avaliar a contaminação de feridas por microorganismos, o processo desde a coleta até a identificação das bactérias está representado na
figura 6 por meio de um fluxograma.
O material coletado foi depositado em tubos contendo 2 ml de caldo B.H.I. (brain heart
infusion - infusão de cérebro e coração – DIFCO)
Após a incubação por 24 horas a 37º C das amostras coletadas, foi verificado o
crescimento bacteriano através da turvação do caldo de B.H.I. Em seguida, o inóculo
bacteriano foi plaqueado em três meios de cultura diferentes: Ágar sangue (meio rico),
Manitol (meio seletivo) e Mac Conkey (meio seletivo) para confirmação e ou diferenciação de
grupos de micro-organismos, presente nas feridas analisadas (figura 7).
31
Figura 6 - Fluxograma da Análise microbiológica desde a coleta até a identificação dos micro-organismos
presentes nas feridas.
Figura 7 – Meios de cultura utilizados para confirmação e ou diferenciação de grupos de micro-organismos,
presente nas feridas analisadas. (1) Agar Mac Conkey; (2) Agar Manitol; (3) Agar Sangue.
(1)
(2)
(3)
Para identificação das bactérias foram realizadas as técnicas de coloração de Gram e
IAL/Rugai.
A coloração Gram é uma técnica diferencial que permite distinguir os dois principais
grupos de bactérias por microscopia óptica (figura 8). Consiste em expor as células
32
bacterianas à seguinte sequência: Corante primário – violeta de cristal: cora o citoplasma de
púrpura, independentemente do tipo de célula; Mordente – solução de lugol: aumenta a
afinidade entre o violeta de cristal e a célula e forma com o corante um complexo insolúvel
dentro da célula; Agente descolorante – álcool: solvente lipídico; Contrastante – fucsina
básica: cora o citoplasma de vermelho.
O IAL / Rugai é utilizado para identificação de enterobactérias e consiste de nove
provas em apenas um tubo de ensaio: indol (tampa), fermentação da sacarose, fermentação da
glicose, produção de gás, fenilalanina, uréia, H2S, lisina e motilidade, como mostra a figura 9.
Figura 8 - Diferenciação dos grupos de micro-organismo por meio da coloração de Gram – (A) Observa-se a
coloração arroxeada identificando as bactérias Gram positivas e (B) avermelhada identificando as bactérias como
Gram negativa.
(A)
(B)
Figura 9 - Esquema de identificação de enterobactérias por meio IAL / Rugai
33
4.2.1 Preparo da suspensão das cepas
Para o preparo da suspensão bacteriana foi utilizado como referência a escala
nefelométrica de Mc Farland para preparar a suspensão contendo 106 células viáveis/mL de
cada amostra coletada, estas foram identificadas nos tubos como: A2, A4, A5, A6 para as
bactérias Gram positiva; Para os tubos com as bactérias Gram negativa: A1a, A1b, A2, A3,
A4, A5, A6. Para o preparo da solução foi retirado uma colônia do meio seletivo (Agar
Manitol ou Agar Mac Conkey) e colocada em tubo com 2 mL de solução salina (NaCl a
0,9%) e realizada comparação com o tubo nº 5 da escala. Após os frascos foram centrifugados
a 1500 RPM (rotação por minuto) por 20 minutos, desprezando-se o sobrenadante, e depois
suspenso em 2 mL de solução fisiológica a 0,9% esterilizada.
4.3 Tratamento com Fotossensibilizador
Foi preparada a suspensão contendo 106 células viáveis/mL de cada amostra, separada e
identificada em 2 tubos de ensaio diferentes, sendo um tubo identificado como PDZ e outro
como AM, para cada amostra. Os tubos foram centrifugados, o sobrenadante desprezado e
foram adicionados 200 µL de PDZ e AM em seus respectivos tubos, ambos na concentração
de 0,1 mg/mL. Decorrido o tempo de incubação de 24 horas para a suspensão com PDZ e 1
hora para a suspensão com AM, as amostras foram lavadas uma vez com solução salina, o
sobrenadante foi desprezado, e foi adicionado 400 µL de solução salina 0,9%. Em seguida as
amostras foram agitadas no agitador orbital, e distribuídas em 2 placas de microtitulação de
96 poços de fundo plano, esterilizadas e com tampa. Na placa 1 foram distribuídos os grupos
1, 2 e 3 e submetidos a irradiação na placa 2 foram distribuídos os grupos 4, 5 e C sem
irradiação.
4.4 Fonte de luz
Foi utilizado um dispositivo à base de LEDs (Biopdi / Irrad-Lead 660), como mostra a
figura 10, composto por 54 LEDs cada um com 70 mW de potência na região de 660 nm do
espectro eletromagnético. Cada placa de 96 poços foi irradiada com intensidade de 25
mW/cm2 e dose de luz de 50 J/cm2 por 33 minutos.
34
Figura 10 – BioTable – Dispositivo à base de LEDs na região de 660 nm do espectro eletromagnético.
4.5 Procedimentos experimentais.
Os ensaios foram realizados em duplicata e divididos em 6 grupos, sendo:
•
S/T – sem tratamento;
•
TFD/PDZ
•
TFD/AM
•
IRRAD
•
PDZ
•
AM
Inicialmente foi explicado o procedimento ao paciente, em seguida o material foi
coletado e enviado para análise microbiológica e foram identificadas as cepas, foram incluídas
também no estudo as cepas: S. aureus (ATCC 14458) e E. coli (ATCC 10799) como cepas
controle.
O T1 foi submetido à TFD empregando o 0,2 ml de solução com 0,1 mg/ml de PDZ,
em seguida foi incubado na ausência de luz durante 24 horas. Após o período de incubação as
amostras foram irradiadas.
O T2 foi submetido à TFD utilizando 0,2 ml de solução com 0,1 mg/ml de AM, em
seguida foi incubado na ausência da luz durante 1 hora. Após o período de incubação as
amostras foram irradiadas.
O T3 foi irradiado com o equipamento a base de LED em 660 nm, com dose de luz de
50 J/cm2 e intensidade de 25 mW/cm2.
No T4 foi adicionados 0,2 ml de solução com 0,1 mg/ml de PDZ e foi incubado por 24
horas na ausência da luz. No T5 foi adicionado 0,2 ml de solução com 0,1 mg/ml AM e as
amostras foram incubadas por 1 hora na ausência da luz.
35
Após 24 horas dos tratamentos todas as amostras foram plaqueadas em Ágar sangue e
48 após o plaqueamento foram realizadas as análises quantitativas. A tabela 1 mostra os
grupos experimentais e o número de ensaios.
Tabela 1– Número de ensaios nos diferentes grupos experimentais
GRUPOS EXPERIMENTAIS
NÚMEROS DE ENSAIOS (duplicata)
S/T – sem tratamento
13 (x2)
T1 – TFD com PDZ
13 (x2)
T2 – TFD com AM
13 (x2)
T3 – luz
13 (x2)
T4 – PDZ
13 (x2)
T5 - AM
13 (x2)
TOTAL
78 (x2) = 156
Foram realizados ensaios em duplicata com 11 cepas clínicas e 2 cepas ATCC nos 6
grupos experimentais, totalizando 156 ensaios.
4.6 Interpretação de dados e análise estatística
Os dados foram submetidos a análise utilizando o teste de Sensibilidade e
Especificidade. As aplicações para o uso dos testes diagnósticos são: identificar/confirmar a
presença de doença ou situação relacionada a saúde; avaliar a gravidade do quadro clínico;
estimar o prognóstico; monitorar a resposta a uma intervenção.
Para verificação da precisão do teste adotou-se duas medidas: a sensibilidade e a
especificidade. A sensibilidade mede a capacidade do teste em identificar corretamente a
doença (ou situação relacionada a saúde) entre aqueles que a possuem, ou seja, o quão
sensível é o teste. A especificidade mede a capacidade do teste em excluir corretamente
aqueles que não possuem a doença, ou seja, o quão específico o teste é, os resultados são
representados conforme demonstrado na tabela 2.
Um bom resultado do teste possui um alto valor para a sensibilidade e para a
especificidade, pois ele identificará corretamente aqueles que têm a doença e aqueles que não
têm, no caso do presente trabalho identificará corretamente as cepas que têm morrer e aquelas
que não têm.
36
Tabela 2 – Adaptação da tabela para cálculo da Sensibilidade e
Especificidade para Terapia fotodinâmica envolvendo bactéria.
Resultado
Bactéria
Ausente
Presente
Positivo
Verdadeiro Positivo (VP)
Falso Positivo (FP)
Negativo
Falso Negativo (FN)
Verdadeiro Negativo
(VN)
Fonte: Adaptada de: BRASIL ( 2007).
A sensibilidade é a fração dos que obtiveram resposta positiva no teste entre aqueles
que possuem a doença:
A especificidade é a fração dos que obtiveram resposta negativa no teste entre aqueles
que não possuem a doença:
37
5 RESULTADO E DISCUSSÃO
Foram identificadas as cepas: Staphylococcus aureus, Staphylococcus ssp,
Pseudomonas ssp, Proteus ssp, Enterobacter ssp, Escherichia coli. Foram incluídas também
no estudo as cepas: Staphylococcus aureus (ATCC 14458) e Escherichia coli (ATCC 25922)
como cepas controle.
5.1 Determinação do tempo de incubação das amostras
As amostras do T5 foram incubadas em diferentes intervalos de tempo, 1, 3, 5 e 24
horas na ausência de luz. Observou-se que não houve crescimento das cepas bacterianas no
período de 24 e 5, sugerindo, que neste intervalo de tempo, o AM seja tóxico para as células.
No período de 3 e 1 hora verificou-se o crescimento de unidades formadoras de colônia,
entretanto no período de 3 horas observou-se inativação bacteriana.
As amostras do T4 (PDZ) foram incubadas durante 24 horas na ausência de luz e não
foi observada inativação bacteriana, sugerindo que o tempo de incubação com o PDZ não foi
tóxico para as células bacterianas.
Desta forma adotou-se o período de incubação de 1 hora para o AM e 24 horas para o
PDZ.
5.2 Bactérias Gram - Positivas
As bactérias Gram - positivas identificadas nas amostras coletadas foram
Staphylococcus aureus e Staphylococcus ssp.
Observa-se na tabela 3 que os micro-organismos submetidos ao tratamento T1 não
apresentou crescimento bacteriano, mostrando que a TFD utilizando PDZ foi capaz de
eliminar as bactérias Gram positivas. O T2 apresentou redução do crescimento bacteriano,
bem como o T5, entretanto não houve inibição do crescimento bacteriano. Os tratamentos T3,
T4 e S/T apresentaram crescimento acima de 100.000 UFC/mL.
38
Tabela 3 - Resultado da TFD em bactérias Gram positivas
T1
T2
T3
T4
T5
S/T
A2 – S. aureus (cepa clínica)
N/C
2 UFC
100.000
16 UFC
21 UFC
100.000
A4 – Staphylococcus ssp (cepa clínica)
N/C
442.5 UFC
100.000
100.000
100.000
100.000
A5 – S. aureus (cepa clínica)
N/C
N/C
100.000
100.000
N/C
100.000
A6 – S. aureus (cepa clínica)
N/C
N/C
100.000
100.000
1 UFC
100.000
S. aureus ATCC – 14458 (cepa controle) N/C
N/C
100.000
37 UFC
N/C
100.000
Amostras
T1 – TFD – PDZ; T2 – TFD – AM; T3 – Luz; T4 – PDZ; T5 – AM; S/T – sem tratamento; N/C – não
houve crescimento.
Em relação ao tratamento T4 foram observadas reduções de UFC nas cepas da A2 e
ATCC, porém, nas demais (A3, A4, A6) apresentaram crescimento acima de 100.00 UFC,
sugerindo ausência do efeito bactericida sobre as cepas.
O tratamento T5 apresentou redução ou eliminação das cepas de S. aureus, porém, na
espécie de Staphylococcus ssp, não houve eliminação ou redução das UFC/mL.
Em relação aos efeitos isolados do LED (T3), houve crescimento acima de 100.000
UFC/mL sugerindo que a irradiação sem fotossensibilizador estimula a proliferação celular,
induzindo o crescimento das bactérias Gram positivas,
O tratamento controle (S/T) apresentou crescimento acima de 100.000 UFC, como
esperado.
A tabela 4 demonstra os valores de Sensibilidade e Especificidade das bactérias Gram
positivas, para o PDZ e AM. Observa-se que o a TFD com PDZ apresenta 100 % de
Sensibilidade, ou seja, 100% de probabilidade de um resultado positivo, uma vez que todas as
bactérias Gram positivas que deveriam morrer, morreram e 100% de Especificidade, ou seja,
100% de probabilidade de um resultado negativo correto, uma vez que as bactérias Gram
positivas que não deveriam morrer não morreram.
Quanto ao tratamento da TFD com AM a tabela 4 demonstra que a sensibilidade do
AM foi de 80%, portanto, 80% de probabilidade de um resultado positivo, uma vez que 4 das
5 bactérias Gram positivas que deveriam morrer, morreram. A Especificidade do tratamento
com AM foi 92%, ou seja, 92% de probabilidade de um resultado negativo, uma vez que as
bactérias Gram positivas que não deveriam morrer não morreram, portanto, nota-se que 8%
das bactérias Gram positivas que não deveriam morrer, morreram.
39
Tabela 4 – Valores de Sensibilidade e Especificidade das Bactérias Gram - positiva
PDZ
AM
VP: 5
VP: 4
FP: 0
FP: 1
VN: 15
VN: 12
FN: 0
FN: 1
Sensibilidade: 1 – 100%
Sensibilidade: 0,8 – 80%
Especificidade: 1 – 100%
Especificidade: 0,92 – 92%
A figura 11 mostra os resultados de Sensibilidade e Especificidade para o
fotossensilizador PDZ e o corante AM. Pode-se observar que, para as bactérias Gram positivas o PDZ apresentou mais eficiente do que o AM.
Figura 11 – Sensibilidade e Especificidade da TFD para as bactérias Gram – positivas
5.3 Bactérias Gram - Negativas
As bactérias Gram - negativas identificadas nas amostras coletadas foram
Pseudomonas ssp, Proteus ssp, Enterobacter ssp, e Escherichia coli.
Observa-se na tabela 5 que o tratamento T1 não inibiu o crescimento bacteriano,
mostrando que a TFD utilizando PDZ não foi capaz de eliminar as bactérias Gram negativas.
O T2 apresentou inibição do crescimento bacteriano, mostrando a eficiência da TFD com o
40
corante AM como agente bactericida. Os tratamentos T3, T4, T5 e S/T apresentaram
crescimento acima de 100.000 UFC/mL.
Tabela 5 – Resultados da TFD em bactérias Gram negativas.
Amostras
T1
T2
T3
T4
T5
S/T
A1a – Pseudomonas ssp (cepa clínica) 100.000 N/C 100.000 100.000 100.000 100.000
A2 - Pseudomonas ssp (cepa clínica)
100.000
N/C
100.000
100.000
100.000
100.000
A3 – Proteus ssp (cepa clínica)
100.000
N/C
100.000
100.000
100.000
100.000
A4 – Enterobacter ssp (cepa clínica)
100.000
N/C
100.000
100.000
100.000
100.000
A1b - Proteus ssp (cepa clínica)
100.000
N/C
100.000
100.000
100.000
100.000
A2 - Enterobacter ssp (cepa clínica)
100.000
N/C
100.000
100.000
100.000
100.000
A3 – E. coli (cepa clínica)
100.000
N/C
100.000
100.000
100.000
100.000
E. coli ATCC – 25922 (cepa controle) 100.000 N/C 100.000 100.000 100.000 100.000
T1 – TFD – PDZ; T2 – TFD – AM; T3 – Luz; T4 – PDZ; T5 – AM; S/T – sem tratamento; N/C – não
houve crescimento.
Em relação aos efeitos isolados do LED (T3), houve crescimento acima de 100.000
UFC/mL, diversos estudos relataram a proliferação de micro-organismos submetidos somente
a ação da luz (NUSSBAUM; LILGE; MAZZULLI, 2002; COUTINHO et al., 2007; JORI et
al., 2006), o que poderia justificar o crescimento bacteriano do tratamento T3.
O efeito isolado dos fotossensibilizadores na ausência de irradiação não produziu
efeito bactericida e nem bacteriostático, pois houve crescimento a cima de 100.000 UFC/mL
em todos às cepas Gram negativas.
A tabela 6 apresenta os valores de Sensibilidade e Especialidade das bactérias Gram negativas, para a TFD com PDZ e AM. Observa-se que o tratamento com PDZ foi zero, ou
seja, não apresentou resultado positivo ou eliminação das bactérias, uma vez que as mesmas
deveriam morrer e não morreram. Em relação a Especificidade o resultado foi de 0,75, ou
seja, 75% de probabilidade de um resultado negativo, uma vez que as bactérias Gram
negativas que não deveriam morrer não morreram, e 25% das bactérias Gram - negativas que
não deveriam morrer, morreram.
O tratamento com o AM mostrou Sensibilidade foi de 1, ou seja, 100% de
probabilidade de um resultado positivo, uma vez que as bactérias morreram, nota-se que todas
as bactérias Gram negativas que deveriam morrer, morreram. A Especificidade foi também de
1, ou seja, 100% de probabilidade de um resultado negativo, uma vez que as bactérias Gram
negativas que não deveriam morrer não morreram, portanto.
41
Tabela 6 – Valores de Sensibilidade e Especificidade das Bactérias Gram - negativas
PDZ
AM
VP: 8
VP: 0
FP: 08
FP: 0
VN: 24
VN: 24
FN: 8
FN: 0
Sensibilidade: 0 – 0,0%
Sensibilidade: 1 – 100%
Especificidade: 0,75 – 75%
Especificidade: 1 – 100%
A figura 12 mostra os resultados de Sensibilidade e Especificidade para o a TFD com
o fotossensilizador PDZ e o corante AM. Pode-se observar que, para as bactérias Gram
negativas, o AM apresentou grande eficiência, entretanto o PDZ não foi capaz de induzir a
eliminação ou redução das mesmas.
Figura 12 – Sensibilidade e Especificidade da TFD para as bactérias Gram - negativas
O número crescente de bactérias patogênicas resistentes a antibióticos é preocupante,
apesar do avanço nos tratamentos de infecções. Segundo Hamblin e Hasan (2004), poderá
ocorrer o fim de um longo período que inclui os últimos 50 anos, chamado de "era do
antibiótico". As bactérias multiplicam-se de maneira rápida e a presença de uma bactéria que
sofreu mutação na presença de um antibiótico se tornará predominante na população
microbiana. Desta forma o desenvolvimento de novas técnicas antimicrobianas que evitem o
desenvolvimento de resistência bacteriana é muito importante (DEMIDOVA; HAMBLIN,
2005; PERUSSI, 2007).
42
Uma técnica que vem sendo empregada, na inativação de micro-organismos,
principalmente na odontologia é a TFD. Esta tem se apresentado efetiva contra vírus,
bactérias e fungos, podendo ser usada como uma terapia para infecções localizadas
(PERUSSI, 2007).
Com relação à eficiência da inativação bacteriana, sabe-se que bactérias Gram positivas são geralmente mais susceptíveis à TFD e as espécies Gram - negativas são mais
resistentes a muitos fotossensibilizadores comumente usados em TFD de lesões malignas
(MAISCH et al., 2005), concordando com os resultados obtidos.
Essa diferença de respostas de acordo com o fotossensibilizador utilizado pode ser
explicada devido as características estruturais das bactérias Gram positivas e negativas,
principalmente relacionadas à parede celular. As espécies Gram negativas possuem uma
membrana externa, a parede celular formada por peptidoglicano e a bicamada lipídica que
funcionam como uma barreira física e funcional entre a célula e seu ambiente, e as espécies
Gram positivas apresentam a parede celular e membrana citoplasmática que é relativamente
permeável (GAD et al., 2004; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2005; PERUSSI, 2007).
Diversos estudos já demonstraram a efetividade da aplicação da TFD mediada pelo AM
em diferentes linhagens de culturas bacterianas isoladas (FERRO et al., 2006; METCALF et
al., 2006; ARAÚJO et al., 2009). Vários estudos realizados com suspensões bacterianas mais
complexas, com mais de uma espécie bacteriana presente (FONTANA et al., 2009; STREET
et al., 2009), mostraram maior suscetibilidade das bactérias E. coli ao efeito antimicrobiano da
TFD mediada pelo AM, sugerindo a existência de espécies bacterianas com diferentes níveis
de suscetibilidade aos efeitos.
O uso de corantes fenotiazínicos como agentes antimicrobianos tem ação comprovada
por vários estudos. Usacheva, Teichert e Biel. (2001) avaliaram os efeitos da concentração de
0,05 mg/mL dos corantes do grupo das fenotiazinas representados pelo AM e azul de
toluidina (AT), utilizaram o tempo de incubação de 24 horas, na ausência de luz, e irradiada
com intensidade de 50 a 100 mW/cm2 e dose de luz de 10 a 60 J/cm2, na região de 630 e 664
nm do espectro eletromagnético, respectivamente, para a morte de varias espécies inclusive
S. aureus. O estudo demonstrou que a TFD com AM foi mais efetiva que o AT em relação ao
S. aureus, e também que o AM mostrou redução bacteriana significativa em todos os microorganismos estudados tanto na presença como na ausência de luz. No
estudo
de
Miyabe
(2007) a terapia fotodinâmica com o corante AM a 0,1%, mostrou-se eficaz na redução de
todas as cepas de Staphylococcus isoladas de pacientes submetidos a antibioticoterapia
43
prolongada. Em nossos resultados foi observada maior eficácia do AM quando comparado
com o PDZ, tendo o AM sido eficaz tanto para Gram-positivas, quanto para Gram- negativas.
A TFD é a combinação entre fotossensibilizadores e luz em comprimento de onda
específico, induzindo a produção de radicais livres e a consequente citotoxicidade para células
bacterianas. Entretanto, a concentração, o tempo de incubação, o tipo de fotossensibilizador, e
os parâmetros de iluminação, podem influenciar nos resultados da TFD (TEICHERT et al.
2002). Segundo Perussi (2007) a hidrofobicidade e a presença de cargas nos FSs levam a
interação deste com diferentes organelas, deste modo, a ação de um corante positivo pode
ocorrer na mitocôndria e de um corante negativo na membrana celular. Além disso, o
tamanho da célula e estado fisiológico dos micro-organismos também alteram o resultado da
TFD, pois a susceptibilidade a TFD entre bactérias da mesma classificação Gram dependem
de vários fatores como características das barreiras de permeabilidade das membranas,
presença de diferentes enzimas antioxidantes e mecanismos de reparo do DNA
(DEMIDOVA; HAMBLIN, 2005).
Nota-se a ausência de parâmetros pré-definidos para utilização da TFD como uma
técnica antibacteriana, o que torna difícil sua aplicação clínica.
Vários trabalhos na literatura utilizam diferentes tempos de incubação, dose do corante
e parâmetros de iluminação. Zeina et al. (2001) testou os efeitos da TFD com AM na
concentração de 100 ug/mL - em bactérias e fungos (S. aureus, S. pyogenes, C. albicans e C.
minutissimun, P. acnes e S. epidermidis) com intensidades de luz de 1.6, 3.5, 5.5, 12 e 42
mW cm². Foi observado que a cepa de S. aureus respondeu ao tratamento nos primeiros dez
minutos, diminuindo significativamente o número de células viáveis, no entanto todas as
bactérias testadas foram inativadas ou reduzidas pelo tratamento da TFD com o azul de
metileno.
Peloi et al. (2008) testou o efeito da TFD também com AM em cepas de S. aureus, E.
coli e C. albicans utilizando LED vermelho como fonte de irradiação e observaram que a luz
LED vermelha aumenta a eficácia do efeito inibitório da TFD nas células procarióticas e
eucarióticas testadas. Observaram ainda que o AM não apresentou dificuldades em penetrar
na parede celular das bactérias, tanto Gram-positiva, quanto na Gram-negativa, com taxas de
inibição de crescimento de 93,05% para S. aureus (na concentração de 42,2uM), 93,7% de
inibição para E. coli (na concentração de 35,2 uM) após 20 minutos de exposição a Luz.
Zolfaghari et al. (2009) testou o efeito da TFD em animais infectados com S. aureus
resistente a meticilina, com AM como fotossensibilizador na concentração deμg/ml
100
44
irradiados com um laser diodo (665 nm, 200 mW) com dose de luz de 360 J/cm² e observou
diminuição de 25 vezes no número de células viáveis.
Choi, Lee e Chae (2010) testou o efeito do AM em cepa de H. pylori nas
concentrações de 0.02, 0.04, e 0.2 mg/mL com 30 minutos de incubação e 2, 5 e 10 minutos
de irradiação. Observou-se que a diminuição da viabilidade foi diretamente proporcional à
concentração do FS e do tempo de irradiação, sendo que com 0.2 mg/mL e 10 minutos de
irradiação ocorreu a inviabilidade completa das bactérias.
Sabe-se que os corantes fenotiazínicos comerciais, como o AM, têm mostrado a
desvantagem de uma toxicidade no escuro, causando uma diminuição da eficiência
terapêutica. Por outro lado o PDZ por ser uma clorina hidrossolúvel apresenta a capacidade
de penetrar nas células através das membranas biológicas, o que pode justificar os resultados
obtidos neste estudo, pois o PDZ mostrou efetividade nas bactérias Gram positivas enquanto
nas Gram negativas não foi observado ação antimicrobiana, o que pode ser atribuído as
diferenças estruturais destas bactérias.
Observou-se a partir dos ensaios que o AM foi citotóxico sem irradiação para tempos
de incubação acima de 3 horas, uma vez que inibiu o crescimento bacteriano.
O laser ou o PDZ de forma isolada não exerceu nenhuma atividade inibidora do
crescimento bacteriano.
A TFD com AM demonstrou que poderá ser uma alternativa no tratamento de feridas
infectadas tanto com bactérias Gram - positivas como Gram - negativas, podendo assim
minimizar o tempo de reparo tecidual, pois na presença de infecção há maior destruição de
tecido e retardo na reparação.
45
6 CONCLUSÃO
Conclui-se que a TFD com PDZ foi capaz de inibir o crescimento das amostras de
bactérias Gram - positivas isoladas de feridas infectadas, porém, não teve efeito sobre
bactérias Gram - negativas.
A TFD com AM demonstrou ser efetiva tanto em bactérias Gram - positivas como
Gram - negativas isoladas de feridas, pois foi capaz de inibir o crescimento bacteriano em
ambos os casos.
O protocolo da TFD utilizando AM foi mais eficiente em relação ao PDZ, de acordo
com a proposta que foi avaliar e comparar a TFD com diferentes fotossensibilizadores.
46
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Anexo A: Certificado de aprovação pelo Comitê de Ética