Altération de la physiologie des poissons - Archimer

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THESE
PRESENTÉE A
L'UNIVERSITE DE LA ROCHELLE
ECOLE DOCTORALE GAY LUSSAC
Par Caroline VIGNET
POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR
SPECIALITÉ: PHYSIOLOGIE, BIOLOGIE DES ORGANISMES, POPULATIONS, INTERACTIONS
Altération de la physiologie des poissons exposés à des
hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)
Comportement et reproduction
Directeur de thèse: Xavier COUSIN
Co-directrice: Marie-Laure BÉGOUT
Soutenance tenue le : 11 février 2014
Devant la commission d'examen formée de :
M. Jérôme Cachot
M. Olivier Kah
M. Ludovic Dickel
Mme Hélène Thomas-Guyon
M. François Brion
M. Xavier Cousin
Mme Marie-Laure Bégout
Professeur, Université Bordeaux 1
Directeur de recherche, CNRS
Professeur, Université de Caen
Maitre de conférence, Université de La Rochelle
Chargé de recherche, INERIS
Chargé de recherche INRA mis à disposition de l'IFREMER
Chargé de recherche IFREMER
Président du Jury
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Directeur de thèse
Co-directrice (Invitée)
THESE
PRESENTÉE A
L'UNIVERSITE DE LA ROCHELLE
ECOLE DOCTORALE GAY LUSSAC
Par Caroline VIGNET
POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR
SPECIALITÉ: PHYSIOLOGIE, BIOLOGIE DES ORGANISMES, POPULATIONS, INTERACTIONS
Altération de la physiologie des poissons exposés à des HAP
Ontogénèse et intégrité fonctionnelle
Directeur de thèse: Xavier COUSIN
Co-directrice: Marie-Laure BÉGOUT
Soutenance tenue le : 11 février 2014
Devant la commission d'examen formée de :
M. Jérôme Cachot
M. Olivier Kah
M. Ludovic Dickel
Mme Hélène Thomas-Guyon
M. François Brion
M. Xavier Cousin
Mme Marie-Laure Bégout
Professeur, Université Bordeaux 1
Directeur de recherche, CNRS
Professeur, Université de Caen
Maitre de conférence, Université de La Rochelle
Chargé de recherche, INERIS
Chargé de recherche INRA mis à disposition de l'IFREMER
Chargé de recherche IFREMER
Président du Jury
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Directeur de thèse
Co-directrice (Invitée)
A ma famille
REMERCIEMENTS
En premier lieu, je tiens à remercier sincèrement Xavier Cousin et Marie-Laure
Bégout, pour avoir accepté de m'encadrer durant trois ans et avoir partagé cette aventure avec
moi. Lorsque j’étais en classe de terminale, si l’on m’avait dit que je ferais une thèse, je n’y
aurais jamais cru, moi qui voulais faire des études courtes ! Vous m’avez laissé faire ce que je
souhaitais tous en m’épaulant quand j’en avais besoin, et pour cela, je vous remercie.
Je remercie également les membres du jury, qui ont accepté d’évaluer mon travail de
thèse. Les deux rapporteurs, Ludocvic Dickel et Olivier Kah, ainsi que les examinateurs,
Hélène Thomas-Guyon, François Brion et Jérome Cachot, qui ont accepté de prendre de leur
temps pour terminer cette aventure avec moi, je les en remercie.
Merci à toutes les personnes qui ont pris part à mes comités de thèses, François Brion,
Christel Lefrançois et David Benhaïm pour leurs conseils et leurs visions extérieures qui
m’ont permis d’avancer et de prendre du recul sur mon sujet.
Je remercie également toutes les personnes du laboratoire qui m’ont aidé d’une
manière ou d’une autre à avancer dans cette thèse. Tous d’abord tous le personnel du
laboratoire EX et plus particulièrement Thierry Burgeot et Farida Akcha, qui on suivi ma
progression tout au long de cette thèse et qui m’ont accueilli au sein de leurs effectifs.
Ensuite, je pense bien sûr, en premier lieu, à Laura Lyphout, pour avoir géré une
bonne partie des expositions, de tubes, pour tous les coups de main que tu m’as apportés en
manip, les millions de tubes que nous avons pesé/rempli/repesé, les nombreux paniers que
nous avons fabriqué, les nombreuses biométries ou on s’est bien marrée (surtout une qui me
fait encore rire en y repensant), tous les bons fou rires, les petites histoires, et les bonnes
bouffes, et surtout, je te remercie de ne pas avoir tués tous les poissons avant la date prévus,
car sans toi m’a thèse ne serait rien (une thèse sur les poissons sans poissons c’est pas top)!!
Je remercie également Cathy Haget qui a pris le relai depuis.
Je pense aussi à Didier Leguay pour avoir construit, réparé, et inventé toutes sortes de
systèmes géniaux, pour les quelques sorties piscines (j’en ai manqué beaucoup, mais ce n’est
pas de ma faute si mes manips tombaient à chaque fois pendant la pause de midi). Merci bien
sûr pour tes blagues de tous les jours.
Je remercie aussi Lucette Joassard, pour tout ce que tu as fait pour moi, toutes les
qPCR, les extractions, et toute la biologie moléculaire. Je te remercie aussi pour ton francparler et ta gentillesse, qui m’ont beaucoup touché et beaucoup apporté.
Je remercie aussi les autres membres du labo, Sébastien pour nos discussions
Ethovision, Sandie pour ton amitié qui va me manquer, ton aide précieuse, tes corrections et
tes petits gâteaux du goûter, Annick, Céline, Joëlle et Anne pour votre compagnie le midi.
Joëlle pour ta réactivité des remboursements de missions et surtout pour mon retour de
Glasgow. Pour cela, je ne te remercierai jamais assez. Anne pour ta bonne humeur, ton
coucou quotidien dans mon bureau et ton caractère bien trempé qui m’ont fait plusieurs fois
sursauter pendant ma rédaction. Béné, notamment pour ton aide précieuse lors de la rédaction
de la partie budget du nouveau chapitre de thèse. Gaby et Sylvie pour leur gentillesse avec
moi et avec Ewen lors du voyage à Madère.
Je remercie également mes stagiaires pour leur aide et leur bonne humeur. Tout
d’abord Tiphaine Guionnet, ma mini K, avec qui j’ai passé 5 mois géniaux entre fous rires,
sorties, petites histoires et travail bien sûr. Ô toi qui ne supportais pas de tuer des poissons et
qui en a sauvé un, Hydrocarbure, qui vit toujours avec toi. Toi qui avais peur d’attraper les
aliments contaminés aux HAP avec des gants mais qui fumait comme un pompier. Toi qui
crois que j’habite rue des Soulards alors que le nom est impasse Soulard (je sais, ce n’est pas
très glorieux mais ce n’est pas moi qui ai choisi le nom de ma rue). Merci pour ton efficacité
dans le travail. Ensemble nous avons bien avancé. Je n’oublie pas Julien Bisson, avec qui
nous avons bien ri aussi. Ensuite, je remercie Laura Frère et Manon Goubeau, toutes les deux
arrivées en même temps au labo, et qui m’ont bien aidé. Nous avons passé de supers moments
et je suis hyper fière de vous deux. Laura, tu poursuis en thèse à Brest sur les microplastiques
et je te souhaite que ta thèse se déroule aussi bien que la mienne. Je remercie aussi Ali Saleh
et Tatiana Colchen, avec qui j’ai passé de très bons moments. Tous autant que vous êtes,
petits stagiaires plus grands que moi, je vous respecte, je vous remercie et je vous aime fort.
Je voudrais remercier à nouveau Marie-Laure et Xavier, pour m’avoir soutenu lorsque
je leur ai annoncé que j’étais enceinte. Merci d’être venus me voir à la maternité, cette
attention m’a beaucoup touchée. Et les smoothies de chez Ernest sont un délice! Ce n’est
qu’une petite chose parmi tant d’autres, mais je sais que si vous n’aviez pas été contents pour
moi, ma thèse aurait pu être beaucoup moins facile. Je vous remercie pour toute votre aide et
tous les conseils que vous m’avez donné tout au long de ce travail. Merci aux bons moments
partagés pendant les biométries. Je pense que tous les mercis du monde ne suffisent pas, et
comme m’a dit Xavier un jour alors que je disais merci à chaque fois qu’il me donnait un
poisson à disséquer et que nous en avions 80 à faire, « tu ne vas pas me dire merci à chaque
poisson ». Alors je n’en dis plus qu’un, MERCI.
Je tiens aussi à remercier Pierre-Guy Sauriau qui m’a donné envie de poursuivre dans
cette voie au cours de mon stage de master 1. Merci à Floranne Le Bihanic, avec qui j’ai passé
un excellent séjour à Cracovie et à Berlin, et je la félicite pour sa thèse. Je remercie Carolina
Di Paolo, que j’ai rencontré à Berlin, puis à Cracovie, avant d’aller à Glasgow. Je la remercie
pour son aide et j’admire son parcours, que je trouve impressionnant. Je remercie Hélène
Budzinski et Karyn Le Menach pour avoir fournis et enrobés les sédiments et aliments du
projet qui ont servi de base a toute ma thèse. Un grand merci à Thibaut Larcher pour m’avoir
formé sur l’histologie des gonades (même si je sais qu’il reste beaucoup de travail). Ces deux
semaines passées à Nantes ont été très enrichissantes pour moi, et j’espère aussi avoir pu
t’aider un peu en stat. Je remercie également Blandine Davail pour sa collaboration et Laure
Bally-Cuif et son équipe pour m’avoir fait parvenir des poissons AB et TU parisiens. Je
remercie François Ramade pour ses conseils. Enfin, je souhaite remercier Joanne Parrott, avec
qui, je l’espère, je vais avoir la chance de travailler bientôt pour poursuivre mon travail en
écotoxicologie et améliorer mon anglais ainsi que celui de mon Yannick et de notre fils.
Comme elle me l’a souvent dit, "fingers crossed". Je remercie également Louisa pour avoir
pris très grand soin de gnompom ainsi que monsieur et madame Boesch pour avoir soutenu
Yannick dans la poursuite de ses études.
Comment écrire ces remerciements sans avoir une profonde pensée pour tous mes
poissons, qui ont donnés leur vie pour la recherche. Je vous ai fait naître, bichonné, nourri,
contaminé et aussi fait mourir (avec regrets bien sûr). La plupart des gens pensent que ce que
je fais est cruel, mais je sais que vous étiez braves et je vous assure que votre mort n’a pas été
vaine. Vous êtes devenus les héros de mes publications et j’espère que vous aurez la chance
d’être cités souvent. Merci donc aux 15528 embryons TU, aux 1800 embryons AB, aux 600
embryons transgéniques (cyp, vasa et ngn1) qui ont été exposés par voies trophiques et aux
5886 embryons AB qui ont été exposés par voie sédimentaire. Je n’oublie pas tous les autres
que je n’ai pas compté.
Je souhaite également remercie l’Ifremer et la région Poitou Charentes, car si j’ai pu
faire cette thèse, c’est aussi grâce à eux. Travailler à l’Ifremer était un rêve d’enfant pour moi,
et c’est avec tristesse que je le quitte aujourd’hui mais je ne perds pas espoir d’y revenir un
jour. J’ai également apprécié la magnifique vue sur l’ile de Ré tous les matins en arrivant au
travail. Je remercie également la Rochelle, cette belle ville qui va aussi me manquer. Je sais
bien que si j’avais fait ma thèse dans un endroit beaucoup moins sympa, le nombre de
visiteurs par an, très élevé durant ces 3 années, aurait été beaucoup plus bas.
Je tiens à remercier tous les membres du jury de la conférence FSBI, qui s'est tenue à
Norwich en juillet 2012, pour m'avoir accordé le prix de la meilleure présentation orale. Cette
distinction m'a permis d'avoir bien plus confiance en moi et en mon travail. Je remercie aussi
la famille Hunter pour m'avoir hébergé et aidé pour l'anglais durant cette conférence.
Je voudrais également remercier mes amis, ceux que j’ai rencontré ici et ceux que
j’avais avant et qui le sont toujours. En premier lieu, je voudrais dire merci à Alexis. Je pense
qu’il mérite cette première place pour avoir été omniprésent durant mes 5 années passées ici,
du master à la thèse. Je te dis merci pour avoir squatté de nombreuses semaines chez moi,
pour tes paris a la noix, tes blagues, tes deux cerveaux, ton indécision qui m’étonne encore,
nos soirées, ton amour pour mes gâteaux aux fruits rouges et ma tarte au citron, et les belles
vidéos que tu nous as laissé.
Je remercie ensuite Aude et Raph pour nos belles soirées palet, karaoké… Merci pour
la joie que vous procurez à mon fils qui quand il vous voit et s’écrie APERO (grenadine et
préfou, bien sûr)…Aude, merci pour tes cours sur les recalés de SEGPA, ton cousin qui nous
fait toujours rire et ton Puy du Fou (qui finalement est vraiment top). Raph, je te remercie
pour tes burgers, tes produits nettoyants pour les voitures qui me font toujours beaucoup rire
et surtout pour ton humour. Aurélie, alias Marie-Germaine pour nos trajets LR/St-é. Pour
avoir offert à Ewen le calendrier de l’avant Kinder. Depuis il dort hyper bien, car pas de gros
dodo, pas de chocolat….Ester pour ton vin rouge et tes petites blagues. Toutes les 4, nous
avons fait un master au top et continué nos supers week-ends par la suite. Je remercie aussi
Grégoire, qui a été mon voisin de maison, pour toutes nos discussions lors de nos
soirées/apéros/repas, ton amour pour mes gâteaux aux chocolats, ton franc-parler et tes petits
plats. Merci à vous tous pour tous les supers moments que nous avons passé à La Rochelle.
Vous allez beaucoup beaucoup me manquer. Mais ne vous leurrer pas, je reviendrais, enfin on
reviendra….
Je remercie tous mes amis de Saint-Etienne qui sont venus me voir et/ou que je vois
régulièrement. Agathe et Lilian, mes deux biologistes acharnés, Antoine F., mon spécialiste
des voitures, Laura DC, mon héroïne qui a une joie de vivre débordante malgré la vie, tu me
fait rêver chaque fois que je te vois, Barbara pour ta cuisine plus que succulente et nos petits
week-ends que j’aime, Moutmout, pour tes allemands et ton surnom qui est top, Math, pour
tes réflexions de filles et ta gentillesse immense, Sylvain pour ton monde illusoire dans lequel
tu es le seul à vivre, Mathie et Antoine pour vos fous rires, Julie pour ton emploi du temps
overbooké, mais tu trouves toujours un petit moment pour que l’on se voit et j’adore ça,
Nicolas, pour ton humour et surtout pour avoir accepté d’être le parrain de mon fils, ce qui me
rend très fière car tu assures, Deborah, pour ton accueil à chaque fois au top et les bons
moments passés ensemble. Je n’oublie pas la bande des 4, Stéphanie, David, Christophe et
Antoine C., qui sont venus passer des supers week-ends chez nous. On sait quand vous arrivez
mais jamais quand vous repartez et j’adore ça. Merci aussi à Christophe pour ce succulent
repas face à la mer... Célie et Hubert, mes amis mariés les premiers, Violaine, qui est né le
même jour, dans la même ville, la même année mais une heure avant moi et son Greg,
Albane, mon amie de vacances que je n’oublie pas, Clémence et Pauline, mes amies de
maternelle à qui je tiens toujours autant. Je vous aime tous très fort et je sais que sans vous,
cette thèse ne serait pas la même. Car même loin, vos textos, appels, mails etc. m’ont
vraiment boosté à fond.
Je tiens à remercier vivement Marie Vincente, la super nounou d’Ewen, qui lui a
apporté bien plus que ce que peut apporter une simple nounou. Tu lui as appris tant de choses
et tu fais maintenant partie de sa vie. Tu vas va beaucoup lui manquer (et à nous aussi), et tes
«crottes» aux chocolats aussi, je te rassure. Je remercie aussi Christophe, son mari, et ses
enfants, Gaëlle et Loulou. La réussite de ma thèse est en partie la vôtre, et je suis ravie que
nous soyons devenus amis.
Même si mes amis m’apportent beaucoup de bonheur, je ne serais rien sans ma
famille, et mes premiers remerciements familiaux vont bien sûr à mes parents. Mon Papa,
mon Jack Gyver qui m’a installé une super cuisine, construit des étagères sur mesure, fait de
bons petits plats, qui est le plus fort de tous les papas du monde et un papi gâteau. Ma
Maman, pour son aide lors de tous les déménagements, ses bons petits plats, son ménage
(madame aspirateur), et pour être une maman géniale et une mamie plus que gaga. Merci à
vous pour vos visites régulières à La Rochelle et pour les corrections de fautes.
Mes sœurs bien sûr, Charlotte et Margaux, ainsi que les futurs tontons de mon fils
(j’espère), Lilian et Flo, pour leurs textos, toutes les corrections de Charlotte en matière
d’orthographe, les blagues de Margaux, leurs invitations à Lyon (même si on est supportrices
des verts), et tous les bons moments passés en famille. Merci à mon Papi et son kilo de sucre
mangé en une semaine, son amour pour la confiture et ses petits-enfants. Merci à ma Mamie,
pour son amour infini pour moi, sa petite fille préférée (ce n’est pas un secret, tout le monde
le sait), et pour les petits jouets qu’Ewen adore retrouver dans ton placard. Tous les deux à 94
et 92 ans, vous êtes indépendants et vous avez fêté vos 70 ans de mariage l’an dernier. Je n’ai
qu’une chose à dire, je vous admire. Merci à Jean-François et à Mimi pour la pizzeria, la
chambre d'hôte privée, très bonne, pas chère et toujours au top sur la route entre La Rochelle
et Saint-Etienne. Merci à Domi et Marie-Hélène pour nos week-ends chez vous toujours au
top. Merci à Tante Pépée pour sa petite phrase devenue culte dans la famille « que les bons
anges t’accompagnent ». Merci à ma filleule Audrey, qui fête cette année ses 18 ans et dont je
suis très fière. Je pense aussi bien sûr à tous les autres membres de ma famille, que je ne peux
citer car mes remerciements sont déjà très longs et ma famille est très grande, mais je ne vous
oublie pas. Je remercie aussi toutes les familles Salanon pour leur volume sonore des repas de
famille, les Lanne et les Collomb, Biard, Raimond, Bourlier, Viale et Vignet pour tout.
J’ai également une pensée pour ma tatie, ma grand-mère, mon grand-père et toutes les
autres personnes qui sont parties trop tôt et qui me manquent. Je vous aime tous.
Mes dernières pensées vont bien entendu à Yannick et Ewen, pour m’avoir supportée,
soutenue, encouragée, bizouillée…. durant ces années. Je remercie Yannick pour avoir passé
l’aspirateur (il avait l’air d’y tenir mais c’est vrai). Merci aussi de vouloir poursuivre avec moi
cette aventure, même si c’est au bout du monde. Votre soutien m’a été d’une grande aide et
m’a permis de prendre du recul sur ma thèse et sur mon travail, afin de savoir profiter des
moments de travail mais aussi et surtout des moments en famille. Cet équilibre qui est le
mien, je vous le dois. Grâce à vous, j’ai été moins stressée, même si je sais, Yannick, que tu
ne seras pas forcément d’accord avec moi.
Je remercie aussi les petits plaisirs de la vie qui m’ont donné le sourire tout au long de
ces 3 ans, comme les bonnes soirées entre copains, les vacances en famille, mon lit, la bonne
bouffe, le bon vin, les éclats de rire, lire une histoire à Ewen, la belle vue sur l’ile de Ré, les
vacances…. Je tiens aussi à signaler que cette thèse a été réalisé sans une goutte de café…oui
oui c’est possible!
Je termine ces longs remerciements en vous remerciant tous, car sans vous,
cette thèse n’est rien, alors vraiment, MERCI, MERCI, MERCI.
"Un petit poisson
Une bell' Caroline
S'aimaient d'amour tendre
Et pour mieux s'entendre
Pour mieux le comprendre,
Elle se mit à l'eau !
Ô Danio rerio !
Mon petit poisson !
Tes écailles cachent des trésors.
Grâce à toi, j'explore plus encore
Les arcanes des plaisirs de l'esprit.
Mon avenir se glisse dans ton sillage :
De belles heures, pleines et entières,
A étudier, à t'étudier.
Ô Danio rerio !
Mon petit poisson,
Tu es une exigeante obsession !
Un petit poisson
Une bell' Caroline
S'aimaient d'amour tendre
Et pour mieux s'entendre
Pour mieux le comprendre
Elle en fit son favori !
Elle est comme ça, Caroline !
Viva Carolina ! Viva bella !
Baisers !
Françoise Vignet-Gagnoulet
Liste des publications
Accéptées:
-Vignet, C., Bégout, M., Péan, S., Lyphout, L., Leguay, D. and Cousin, X. (2013). "Systematic
screening of behavioral responses in two zebrafish strains." Zebrafish. Sep;10(3):36575. . DOI : 10.1089/zeb.2013.0871.
-Péan, S., Daouk, T., Vignet, C., Lyphout, L., Leguay, D., Loizeau, V., Bégout, M.-L. and
Cousin, X. (2013). "Long-term dietary-exposure to non-coplanar PCBs induces
behavioral disruptions in adult zebrafish and their offspring." Neurotoxicology and
Teratology(0). DOI : 10.1016/j.ntt.2013.07.001.
-Vignet C., Devier M-H., Le Menach K., ,Lyphout L., Poyier J., Cachot J., Budzinski H., Bégout
M-L., Cousin X. (2014). Long-term disruption of growth, reproduction and behavior after
embryonic exposure of zebrafish to PAHs-spiked sediment. ESPR. DOI :
10.1007/s11356-014-2585-5
-Vignet C., Le Menach K., Mazurais D., Lucas J., Perrichon P., Le Bihanic F., Devier M-H.,
Lyphout L., Frère L., Begout M-L., Zambonino-Infante J-L., Budzinski H., Cousin X.
(2014). Chronic exposures to pyrolytic and petrogenic mixtures of PAHs through diet
produce physiological disruptions in zebrafish - Part I: Survival and growth. ESPR. DOI :
10.1007/s11356-014-2629-x
-Vignet C., Le Menach K., Lyphout L., Guionnet T., Frère L., Leguay D., Budzinski H., Cousin
X., Bégout M-L. (2014). Chronic exposures to pyrolytic and petrogenic mixtures of
PAHs through diet produce physiological disruptions in zebrafish - Part II : Behavior.
ESPR. DOI : 10.1007/s11356-014-2762-6
-Larcher T.,Vignet C., Perrichon P., Ledevin M., Le Menach K., Lyphout L., Landi L.,
Clérandeau C., Le Bihanic F., Ménard D., Burgeot T., Akcha F., Cachot J., Cousin X.
(2014). Carcinogenic but no genotoxic effects detected following chronic trophic
exposure of zebrafish to 3 fractions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs).
ESPR. DOI : 10.1007/s11356-014-2923-7
En préparation:
-Vignet C., Joassard L., Le Menach K., Goubeau M., Lyphout L., Brion F., Kah O., Chung B-C.,
Budzinski H., Cousin X., Begout M-L. Behavioral disruption in two successive
generations after exposure of a founder generation to three environmentally mixtures of
PAHs.
-Vignet C., Larcher T., Joassard L., Le Menach K., Guionnet T., Lyphout L., Ledevin M.,
Goubeau M., Budzinski H., Begout M-L., Cousin X. Chronic exposures to pyrolytic and
petrogenic mixtures of PAHs through diet produce physiological disruptions in
reproduction of zebrafish
1
Congrès:
Communication orale:
-Vignet C., Le Menach K., Péan S., Lyphout L., Leguay D., Budzinski H., Bégout M.-L. &
Cousin X. (2013) Long term effects of an early exposure to PAHs on zebrafish
behavioural responses. 23 rd SETAC Europe Annual Meeting - 12-16 May 2013 –
Glasgow.
-Vignet C., Guionnet T., Le Menach K., Lyphout L., Budzinski H., Begout M-L., Cousin X.
Long term effects of an early exposure and continuous exposure to pyrolitic PAHs on
zebrafish behavioural responses . Congrès YES Cracovie, fevrier 2013.
-Vignet C., Le Menach K., Lyphout L., Leguay D., Budzinski H., Begout M-L., Cousin X. Long
term effects of polycyclic aromatic hydrocarbons on zebrafish behavioural and
reproduction. Congrès Ecology and behaviour. Strasbourg, Avril 2013.
-Vignet C., Le Menach K., Péan S., Lyphout L., Leguay D., Budzinski H., Bégout M-L. and
Cousin X. Long term effects of
an early exposure to PAHs on zebrafish behavioural
responses. Congrès FSBI Norwich, juillet 2012. Prix de la meilleure communication
orale
-Péan S., Daouk T., Vignet C., Lyphout L., Leguay D., Loizeau V., Cousin X., Bégout M-L..
Long-term food-exposure to PCB mixtures induces behavioural disruptions in adult
zebrafish and their offspring. Congrès FSBI Norwich, juillet
2012
-Vignet C., Péan S., Lyphout L., Bégout M-L., Cousin X. Systematic screening of behavioral
responses in two zebrafish strains, congres EFOR, Paris 10 et 11 janvier 2012.
-Daouk T., Vignet C., Pottier J., Loizeau V., Bégout M.L., Cousin X. (2010) Long-term exposure
to PCB - contaminated diet: effects on zebrafish development and reproduction – 9th
International Congress on the Biology of Fish – Barcelona – 5-9 july 2010.
Poster:
-Vignet C., Le Menach K., Péan S., Lyphout L., Leguay D., Budzinski H., Bégout M.-L. &
Cousin X. (2012) Long term
effects of an early exposure to PAHs on zebrafish
behavioural responses. 6th SETAC World Congress / 22 nd Europe Annual Meeting - 2024 May 2012 – Berlin.
-Cousin X., Daouk T., Péan S., Vignet C., Larcher T., Roupsard F., Lyphout L., Leguay D.,
Loizeau V., Bégout, M.-L., Long-term food-exposure to PCB mixtures induces
reproductive and behavioural disruptions in zebrafish. . 6th
SETAC World Congress
/ 22 nd Europe Annual Meeting - 20-24 May 2012 – Berlin.
2
-Daouk T., Pean S., Viquelin L., Vignet C., Lyphout L., Roupsard F., Leguellec A.-M., Akcha F.,
Menard D., Burgeot T.,
Begout M.-L., Loizeau V., Cachot J., Budzinski H., Cousin
X. (2010) GénérationPOP – Effet d'une exposition précoce d'embryons de poissons aux
polluants organiques persistants et conséquence sur la population par étude
des effets
sur plusieurs générations – Colloque de restitution des projets financés par EC2CO –
Toulouse – 23-25 novembre 2010.
-Daouk T., Vignet C., Pottier J. , Cachot J., Vicquelin L., Akcha F., Budzinski H., Cousin X.
(2010) Evaluation of PAH toxicity on zebrafish embryos using a sediment-contact assay
– Fish biology – Barcelona – 5-9 july 2010.
Page personnel:
https://www.researchgate.net/profile/Vignet_Caroline
3
4
Sommaire
Liste des publications ........................................................................................................................ 1
Liste des figures: ............................................................................................................................... 8
Liste des tableaux ............................................................................................................................ 11
Liste des abréviations et sigles ........................................................................................................ 12
INTRODUCTION ........................................................................................................................... 19
I Les polluants .............................................................................................................................. 19
1) Les polluants organiques persistants (POP) .......................................................................... 23
2) Toxicité ................................................................................................................................. 26
3) Les polluants en milieu aquatique......................................................................................... 28
4) Persistance et bioaccumulation ............................................................................................. 29
5) Toxicologie et écotoxicologie ............................................................................................... 30
II Les HAP ................................................................................................................................... 31
1) Structures et propriétés physico-chimiques .......................................................................... 31
2) Origine et émissions .............................................................................................................. 33
3) Devenir dans le milieu naturel .............................................................................................. 35
4) Règlementation ..................................................................................................................... 35
III Voies de contamination ........................................................................................................... 37
1) La voie respiratoire ............................................................................................................... 37
2) La voie cutanée ..................................................................................................................... 38
3) La voie alimentaire ............................................................................................................... 38
4) Biotransformation et excrétion ............................................................................................. 39
IV Effets connus des HAP ........................................................................................................... 41
1) Toxicité des composés individuels ....................................................................................... 41
2) Toxicité en mélange .............................................................................................................. 45
3) La survie................................................................................................................................ 46
4) Les malformations et la croissance ....................................................................................... 47
5) Métabolisme et osmorégulation ............................................................................................ 47
6) Le comportement .................................................................................................................. 48
7) La reproduction ..................................................................................................................... 49
V Plan et objectifs de la thèse ...................................................................................................... 50
1) Projet ConPhyPOP ................................................................................................................ 50
2) Objectifs de la thèse .............................................................................................................. 51
5
MATERIELS ET METHODES ...................................................................................................... 55
I Fractions étudiées....................................................................................................................... 55
1) La fraction pyrolytique ......................................................................................................... 55
2) La fraction pétrogénique "fuel lourd" ................................................................................... 56
3) La fraction pétrogénique "pétrole brut" ................................................................................ 57
4) Caractérisation des fractions ................................................................................................. 58
5) Composition des fractions..................................................................................................... 59
6) Contamination du sédiment et des aliments.......................................................................... 61
II Modèle d'étude ......................................................................................................................... 62
1) Le poisson zèbre (Danio rerio) ............................................................................................. 62
2) Stades de vie ......................................................................................................................... 64
3) Reproduction : de la mise en place jusqu'à la ponte ............................................................. 66
4) Expériences en laboratoire .................................................................................................... 67
III Lignées de poisson zèbre (article 1) ........................................................................................ 69
IV Voies et périodes d'expositions ............................................................................................... 95
1) Exposition par sédiment-contact ........................................................................................... 95
2) Exposition par voie trophique ............................................................................................... 98
V Organisation des analyses phénotypiques .............................................................................. 100
1) Survie et Croissance ............................................................................................................ 103
2) Comportement..................................................................................................................... 106
3) Reproduction ....................................................................................................................... 114
4) Transfert maternel ............................................................................................................... 115
VII Validation de la méthode ..................................................................................................... 118
1) Taille des puits et des bacs .................................................................................................. 118
2) Caractérisation de l'anxiété ................................................................................................. 121
RESULTATS : EFFETS D'UNE EXPOSITION AUX HAP A LONG TERME......................... 127
I Effets des HAP après une exposition sur le sédiment à 3 HAP individuels (article 2) ........... 127
II Effets des HAP sur la croissance et la survie (article 3) ......................................................... 153
III Effets des HAP sur le comportement (article 4) ................................................................... 188
IV Effets des HAP sur la reproduction (article 5) ...................................................................... 222
V Effets des HAP sur la descendance (article 6) ....................................................................... 241
VI Etudes complémentaires (article 7) ....................................................................................... 266
DISCUSSION GENERALE ......................................................................................................... 305
6
I Influence des facteurs abiotiques et biotiques ......................................................................... 305
1) Les facteurs abiotiques ........................................................................................................ 306
2) Les facteurs biotiques ......................................................................................................... 308
I Impact des HAP au niveau moléculaire et cellulaire ............................................................... 311
1 Régulation et expression ...................................................................................................... 311
2) Neurobiologie, bases moléculaires des altérations comportementales ............................... 313
3) Reproduction, bases moléculaires des altérations gonadiques ........................................... 315
II Impact des HAP au niveau individuel .................................................................................... 317
1) Altération de la croissance et de la survie ........................................................................... 318
2) Altérations comportementales ............................................................................................ 323
4) Altérations au niveau de la reproduction et transfert maternel ........................................... 327
III Impact des HAP : pertinence écologique .............................................................................. 330
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ........................................................................................ 337
BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................ 339
7
Liste des figures:
Figure 1 : Pollution visuelle en France à Juillan. ............................................................................ 19
Figure 2 : Carte du monde des éclairages nocturnes. ...................................................................... 20
Figure 3 : Espèces invasives : la tortue de Floride, la grenouille taureau et le poisson rouge. ....... 20
Figure 4 : Carte de la densité des antennes-relais dans les grandes villes. ..................................... 21
Figure 5 : Carte comparative de la fonte du glacier au Groenland entre 1992 et 2002. .................. 22
Figure 6 : Carte européenne du dioxyde d'azote, taux de NO2 sur l’Europe. ................................. 23
Figure 7 : Schéma de concentration lors d'une pollution aigüe (rouge) et une pollution chronique
(jaune) au cours du temps avec les seuils de toxicité (noir). ................................................... 25
Figure 8 : Illustration des effets d'une pollution au court d'un temps : avant la pollution, à court
terme et à long terme. .............................................................................................................. 26
Figure 9 : Illustration des effets de contaminants de la molécule jusqu'à l'écosystème à court,
moyen et long terme. ............................................................................................................... 27
Figure 10 : Sources de pollution du milieu aquatique ..................................................................... 29
Figure 11 : Bioaccumulation et de la bioamplification. .................................................................. 30
Figure 12 : Liste des 16 HAP prioritaires selon l'USEPA............................................................... 32
Figure 13 : Caractéristique structurale des HAP ayant un potentiel cancérogène. ......................... 33
Figure 14 : Carte du monde de la quantité d'émissions dans l'atmosphère des 16 HAP prioritaires
en T par an. .............................................................................................................................. 34
Figure 15 : Schéma général de la biotransformations des HAP. ..................................................... 40
Figure 16 : Les 8 tâches du projet ConPhyPoP et objectifs ou fonctions étudiés (fushia). ............. 51
Figure 17 : Objectifs de la thèse. ..................................................................................................... 52
Figure 18 : Localisation du site de prélèvement du sédiment PY en mars 2010 sur la Seine, en aval
de la ville de Rouen. ................................................................................................................ 56
Figure 19 : Site du naufrage de l'Erika et dispersion du pétrole sur les côtes françaises. ............... 57
Figure 20 : Répartition des réserves mondiales de pétrole en 2007 entre l'Asie, l'Amérique du
Nord, l'Amérique du Sud et Centrale, l'Afrique, l'Europe et l'Eurasie et le Moyen Orient..... 58
Figure 21 : Caractérisation de l'origine des 3 fractions utilisées selon les rapports
luoranthène/pyrène et phénanthrène/anthracène. .................................................................... 59
Figure 22 : Composition des 3 fractions. ........................................................................................ 60
Figure 23 : Classification du poisson zèbre et répartition géographique (Spence et al., 2008) ...... 63
Figure 24 : Prédateurs naturels du poisson zèbre Channas spp à gauche et Xenentodon cancila à
droite........................................................................................................................................ 63
Figure 25 : Dimorphisme sexuel chez le poisson zèbre. ................................................................. 64
Figure 26 : Cycle de développement du poisson zèbre. .................................................................. 66
Figure 27 : Evolution des gonades et apoptose lors de la mise en place de la reproduction. ......... 67
Figure 28 : Illustration de l'exposition par sédiment contact. ......................................................... 96
8
Figure 29 : Protocole de contamination par sédiment-contact. ....................................................... 97
Figure 30 : Illustration des tubes de stockage de l'aliment contaminé. Un tube par concentration et
par granulométrie. ................................................................................................................... 98
Figure 31 : Protocole de contamination par alimentation. .............................................................. 99
Figure 32 : Stades testés et tests réalisés lors de l'exposition par sédiment contact. ..................... 101
Figure 33 : Stades testés et tests réalisés lors de l'exposition par voie alimentaire. ...................... 102
Figure 34 : Suivi de croissance de la naissance à 9 mpf. .............................................................. 103
Figure 35 : Dispositif expérimental de coloration à la calcéine en vue d'étudier la calcification des
vertèbres et de la morphologie de la mâchoire. ..................................................................... 105
Figure 36: Logos utilisés dans l'explication du déroulement des protocoles de comportement ... 106
Figure 37 : Planning et dispositif expérimental de la locomotion 24h en vue zénithale de
l’acclimatation des poissons jusqu’à la fin des 24 heures de vidéo. ..................................... 107
Figure 38 : Disposition des 4 conditions parmi les différentes sessions dans l'ordre des tests pour
éviter un effet du bac entre les sessions. ............................................................................... 108
Figure 39: Planning et dispositif expérimental du stress lumineux en vue zénithale à la suite du
suivi de locomotion jusqu’à la remise en bac des poissons. ................................................. 108
Figure 40: Planning et dispositif expérimental de la locomotion 24h en vue frontale de
l’acclimatation jusqu’à la fin des 24 heures. ......................................................................... 109
Figure 41: Planning et dispositif expérimental du stress lumineux en vue frontale à la suite du
suivi de la locomotion jusqu’à la remise en bac.................................................................... 110
Figure 42 Dispositif expérimental du labyrinthe en T de l’acclimatation jusqu’à la fin du test. .. 111
Figure 43: Dispositif expérimental du labyrinthe en Z de l’acclimatation jusqu’à la fin du test. . 112
Figure 44: Dispositif expérimental de l'évaluation de l'anxiété de l’acclimatation à la remise en
bac. ........................................................................................................................................ 113
Figure 45: Dispositif expérimental d'étude de la reproduction en bac ou en couple. ................... 114
Figure 46: Analyse histologique des ovaires. Calcul des surfaces totales et nécrotiques et
comptage des stades folliculaires. ......................................................................................... 115
Figure 47: Dispositif expérimental de la locomotion 72 heures chez les larves entre 4 et 7 jpf de
l'acclimatation en plaque 24 puits jusqu'à la fin des 72 heures de vidéo. ............................. 116
Figure 48 : Dispositif expérimental de la réponse à un stress lumineux chez les larves de
l'acclimatation en plaque 24 puits à l'arrêt de la vidéo après 15 min d'enregistrement. ........ 117
Figure 49 : Protocole expérimental d'exposition à l'EE2 pour analyser l'expression de l'aromatase
dans le cerveau à 6 jpf. .......................................................................................................... 118
Figure 50 : Influence de la taille du bac sur la locomotion. .......................................................... 120
Figure 51 : Effets de molécules anxiolytiques et anxiogéniques sur le comportement des poissons.
............................................................................................................................................... 123
Figure 52 : Distribution moyenne totale d'aliment pour chacune des 4 granulométries utilisées :
<125 µm, entre 125 et 315 µm, entre 315 et 500 µm et >500 µm. ....................................... 187
Figure 53 : Résultats du test d’apprentissage. ............................................................................... 220
9
Figure 54 : Illustration de l'un des challenges majeurs de l'écotoxicologie d'après Hinton (Hinton
et al., 2005). ........................................................................................................................... 305
Figure 55 : Variables pouvant influencer la réponse aux polluants. ............................................. 306
Figure 56 : Vue ventrale de têtes de larves de Sebastiscus marmoratus traitées après éclosion avec
0.01% de DMSO (control) .................................................................................................... 319
Figure 57 : Vue latérale de têtes de poissons zèbre à 6 mpf après exposition par voie alimentaire à
la fraction HO pris au grossissement x6.3 de la loupe binoculaire. ...................................... 319
Figure 58 : Altération des vertèbres chez le poisson zèbre après exposition aux HAP par voie
alimentaire. a) Vertèbres chez un poisson contrôle. b) Réduction du nombre de vertèbres chez
les poissons exposés à la fraction HO. c) Déformation de l'épine dorsale d'un poisson adulte
exposé aux HAP PY par voie alimentaire. ............................................................................ 320
Figure 59 : Cas d'une exophtalmie. ............................................................................................... 323
Figure 60 : Changements histologiques après une exposition à long terme au nTiO2 chez le
poisson zèbre. ........................................................................................................................ 328
Figure 61 : Acquisition et allocation de l'énergie chez le poisson. ............................................... 331
Figure 62 : Principales fonctions affectées lors d'une contamination aux HAP en milieu aquatique.
............................................................................................................................................... 333
10
Liste des tableaux
Tableau 1 : Classification de la dangerosité des HAP selon 3 organisations. ................................. 36
Tableau 2 : Concentrations visées et obtenues dans le cadre de la contamination par sédiment .... 61
Tableau 3 : Concentrations utilisées dans le cadre de la contamination par aliment ...................... 62
Tableau 4: Récapitulatif des résultats de l'article 2 ....................................................................... 128
Liste des sources
Figure 1: http://www.ladepeche.fr/article/2009 /02/06/536399
Figure 2: http://jcboulay.free.fr/astro/sommaire/image_jour/pollution/page_pol_lum.htm
Figure 3: http://fr.maieutapedia.org/wiki/Tortue_de_Floride
Figure 3:http://www.grenouilles.free.fr/especes/Grenouilletaureau_d_afrique_australe.php
Figure 3: http://www.animauxdico.com/poisson-rouge.html
Figure 4: http://www.coteyvelines.fr/files/2013/10/Antennes-relais-carte-nationale-630x0.jpg
Figure 5: http://www.neomansland.info/2007/10/pnue-tat-de-lenvironnement-1987-2007
Figure 6: (http://www.futura-sciences.com/magazines/environnement/infos/actu/d/developpementdurable-carte-pollution-atmospherique-dioxyde-azote-4601/)
Figure 7et Figure 8: http://sierm.eaurmc.fr/sdage/documents/guide-technique-sdage-7.pdf.
Figure 9:
http://envlit.ifremer.fr/var/envlit/storage/documents/dossiers/pollutionchimique/conta_c33.htm
Figure 11: http://www.seathos.org/what-is-bio-magnification/
Figure 18: http://www.histgeo.ac-aix-marseille.fr/webphp/carte.php?num_car=1505&lang=fr
Figure 19: http://www.affaire-erika.org/impacts.html
Figure 20: http://www.bertrandbarre.com/diffenergie_fr_petrole.htm
Figure 24: http://www.seriouslyfish.com/species/channa-sp-fire-and-ice/
Figure 24: http://www.seriouslyfish.com/species/xenentodon-cancila/
Figure 26: http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/devo_03.html
Figure 61: http://fanequeiro. wordpress.com/2013/05/23/a-deep-review-on-fish-energy-allocationstrategies/
Tableau 1: (http://www.cancer-environnement.fr/284-Classification-des-HAP.ce.aspx)
11
Liste des abréviations et sigles
5-HT
Sérotonine
AB
Lignée sauvage de poissons zèbre
ADN
Acide DésoxyriboNucléique
AHH
Aryl hydroxylase hydrocarbons
AhR
Aryl hydrocarbon receptor
ANR
Agence Nationale de la Recherche
Ant
Anthracène
AMR
Rythme métabolique actif
API
Américan Petroleum Institute
ATP
Adénosine triphosphate
B[a]A
Benzo[a]anthracène
B[a]P
Benzo[a]pyrène
BRENT
Brut de le mer du Nord
Chry
Chrysène
CHP
Chloropyrifos
CIRC
Centre International de Recherche contre le Cancer
ConPhyPoP
Contamination et Physiologie des Poissons exposés à des Polluants
cyp191a1:GFP Lignée transgénique de poissons zèbre
D1R
Récepteur à la dopamine
DCE
Directive Cadre sur l'Eau
DL50
Dose Létale 50
E2
Œstradiol
E3
Milieu dans lequel les larves sont placées. Composition 5 mM NaCl, 0,17 mM
KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4
EE2
17 α-éthinylœstradiol
EFSA
Autorité Européenne de Sécurité des Aliments
12
EH
Epoxyde hydrolase
EROD
Ethoxyresorufin-O-deethylase
ETOH
Ethanol
F0
Première génération de poissons
F1
Deuxième génération de poissons, issu de F0
F2
Troisième génération de poissons, issu de F1
Fluo
Fluoranthène
FTOH
Fluoretelomer
GFP
Green Fluorecscent Protein
GLM
Modèle Linéaire Généralisé
GST
Glutathion-S-transférase
HAP
Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques
HBCD
Hexabromocyclododécane
hpf
Heures post fécondation
HO
Fraction aromatique de fuel lourd provenant de l'Erika utilisée dans cette étude
IFREMER
Institut Français de la Recherche pour l'Exploitation de la MER
INRA
Institut Nationale de la Recherche Agronomique
J
Jour
jpf
jour post fécondation
KH
Constante de Henry
Koc
Coefficient de partage carbone organique-eau
Kow
Coefficient de partage octanol-eau
LC50
Concentration létale 50
LDH
Lactate déshydrogénase
LED
Diode électroluminescente
LEMA
Laboratoire d'Ecotoxicologie des Milieux Aquatiques
LIENSs
LIttoral ENvironnement et Sociétés
13
LO
Fraction aromatique de pétrole brut provenant de l'Arabian light utilisée dans
cette étude
LPGP
Laboratoire de Physiologie et de Génomique des Poissons
LPTC
Laboratoire de Physico et de Toxico Chimie des systèmes naturels
M
Masse molaire
MDI
Laboratoire des Macrophages et Développement de l'Immunité
MES
Matière En Suspension
MA+MP
Méthylanthracène + Méthylphénanthrène
MN
Méthylnaphtalène
mpf
mois post fécondation
nTiO2
Nanoparticule de dioxide de titane
O2
Oxygène
PBDE
Polybromodiphényléther
PCB
Polychlorobiphényles
Phe
Phénanthrène
POP
Polluants Organiques Persistants
PY
Fraction pyrolytique provenant de la Seine utilisée dans cette étude
Pyr
Pyrène
qPCR
Réaction en chaine quantitative par polymérase
REACH
Enregistrement, évaluation, autorisation et restriction des produits chimiques
RFP
Red Fluorescent Protein
SMR
Rythme métabolique standard
TCDD
Tetrachlorodibenzo-p-dioxine
TU
UMR
Unité Mixte de Recherche
USEPA
United State Environmental Protection Agency
UV
Ultra violet
14
VTG
Vitellogénine
WIK
WTI
West Texas Intermediate
ZIRC
Zebrafish Internationnal Ressource Stock Center
ZFIN
The Zebrafish Model Organism Database
15
16
17
18
INTRODUCTION
I Les polluants
Les mots "pollution" et "polluant" sont des termes très employés dans notre quotidien. Ils
font souvent écho dans notre esprit à la seule pollution chimique. Le mot pollution est défini
comme une "dégradation de l'environnement par des substances, des déchets ou des nuisances
diverses". Il existe donc de nombreux types de pollution, qui ont également un impact sur notre
environnement. Ces pollutions peuvent présenter une dangerosité plus ou moins importante. Elles
peuvent affecter le système sensoriel en perturbant les modes de communications. Par exemple, la
pollution sonore, visuelle ou lumineuse. D'autres peuvent aussi altérer les capacités, comme c'est
le cas pour la pollution de l'air ou la pollution par les ondes. Par ailleurs, ces pollutions peuvent
impacter l'écosystème, comme lors de la pollution d'un milieu par des espèces invasives et de la
pollution thermique.
La pollution visuelle (Figure 1) est omniprésente dans notre environnement. Elle peut se
traduire par des exploitations humaines peu gracieuses, telles que les forages, ou encore les
nombreux déchets jonchant les sols des rues ou flottant dans les rivières.
Figure 1 : Pollution visuelle en France à Juillan.
La pollution lumineuse est différente de la pollution visuelle. C'est un sujet de plus en plus
pris en compte par la population. L'éclairage des routes et des villages et les enseignes lumineuses
ont aujourd'hui été réduits, même si la carte mondiale des éclairages nocturnes reste
impressionnante (Figure 2). Il existe plusieurs types d'éclairage, à plus ou moins large diffusion et
à plus ou moins large spectre (visible et UV), qui peuvent avoir une influence sur le comportement
des animaux (Bird et al., 2004; Davies et al., 2013).
19
Figure 2 : Carte du monde des éclairages nocturnes.
La pollution sonore, par exemple, constitue un réel problème pour les habitants vivant à
proximité d'un environnement très bruyant, comme un aéroport par exemple. Cette pollution à un
impact écologique, puisqu'elle perturbe aussi les animaux. La communication chez les oiseaux
(Proppe et al., 2013) ou l'altération de la reproduction chez certaines espèces de grenouilles
(Troïanowski et al., congrès Ecology and Behaviour, Strabourg Avril 2013) en sont deux
exemples concrets.
L'arrivée de manière accidentelle ou non de nouvelles espèces dans notre environnement
peut parfois entraîner des conséquences importantes à long terme. Cela constitue également une
forme de pollution. Ces espèces, qui sont au départ des animaux de compagnie ou des espèces
exogènes, se retrouvent dans un environnement nouveau auquel elles s'adaptent parfois très bien.
Ces espèces peuvent menacer les populations endémiques, notamment en l'absence de prédateurs.
La tortues de Floride (Cadi et al., 2004), la grenouille taureau (Ficetola et al., 2007) ou encore le
poisson rouge (Winandy and Denoël, 2013) sont quelques exemples souvent cités (Figure 3).
Figure 3 : Espèces invasives : la tortue de Floride, la grenouille taureau et le poisson rouge.
20
L'augmentation de la population humaine et les progrès spectaculaires de la technologie
ont conduit à une augmentation du nombre d'antennes et d'ondes. Les ondes électromagnétiques,
par exemple, sont utilisées pour les téléphones portables. Elles sont présentes partout, parfois très
proches de nous. De nombreuses antennes sont installées dans les villes pour répondre à la
demande (Figure 4). En effet, la plupart des personnes se déplacent avec leur mobile dans leur
poche. Par conséquent, le bas du corps et notamment l'appareil reproducteur est constamment
soumis à ces ondes. Ces ondes pourraient expliquer en partie la baisse de la fécondité observée
chez les hommes depuis quelques années. Elle a en tout cas pu être mise en évidence chez le rat
(Kesari et al., 2011). L'augmentation du nombre d'antennes émétrices fait l'objet de recherches
spécifiques. A titre d’exemple, l'agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de
l'environnement et du travail (anses) vient de lancer un appel à projet sur le sujet.
Figure 4 : Carte de la densité des antennes-relais dans les grandes villes.
L'énergie et l'indépendance énergétique représentent des enjeux de plus en plus importants
à l'heure actuelle. Les centrales électriques et nucléaires se sont développées rapidement et ont de
gros besoins en eau. Cette dernière est utilisée pour le refroidissement. L'eau est en général
pompée directement dans le point d'eau le plus proche et rejetée à la sortie. La température est
alors augmentée de quelques degrés Celsius et peut provoquer des perturbations de la vie animale
et végétale environnantes (Arieli et al., 2011).
21
Le réchauffement climatique résultant de l'activité humaine contribue également à des
modifications de températures (Figure 5). Les régions polaires sont très touchées par ce
réchauffement et la fonte de glaces entraîne une hausse du niveau de la mer à l'échelle mondiale
de plus de 1 mètre (Bellard et al., 2013). Le réchauffement climatique constitue l’un des grands
enjeux politiques à l’heure actuelle.
Figure 5 : Carte comparative de la fonte du glacier au Groenland entre 1992 et 2002.
La pollution de l'air (Figure 6) peut, par exemple, être liée au mode de chauffage, aux
aérosols, aux transports, à l'agriculture, à l'incinération des déchets et aux industries. Ce sont, entre
autres, des métaux lourds, des aérosols, des dioxydes de soufre, des composés azotés, des
chlorofluorocarbures bromées ou non ou des polluants organiques persistants (POP) qui sont
présents dans l'atmosphère. La pollution de l'air est amplifiée par le développement des industries,
de la population mondiale et du réchauffement climatique. En effet, elle peut être d'origine
anthropique et/ou naturelle. Cette pollution peut entraîner des conséquences sur l'environnement
et/ou sur la santé. Les microparticules, relarguées dans notre environnement aérien entraînent des
morts prématurées tous les ans (Peel et al., 2013). D'important progrès ont tout de même été
réalisés ces dernières années. En effet, les émissions liées aux voitures, par exemple, tendent à
diminuer avec l'installation de filtres à particules et de pots catalytiques par les constructeurs. Les
émissions varient également selon les saisons. En hiver, par exemple, l'abaissement de la
température entraîne une augmentation de la mise en route des chauffages individuels, et par
conséquent une augmentation du nombre des particules émises dans l'atmosphère.
22
Figure 6 : Carte européenne du dioxyde d'azote, taux de NO2 sur l’Europe.
Crédits ESA. Les couleurs chaudes indiquent les zones les plus polluées, contrairement aux
couleurs froides.
Les pollutions chimiques, les plus connues et les plus impressionnantes, sont en général
issues de pollutions accidentelles. Bien qu'elles causent d'importants dégâts, la principale source
des pollutions chimiques est chronique et issue de multiples origines. Tous ces polluants se
retrouvent ensuite dans notre environnement. Dans le cadre de ce travail, nous allons dans un
premier temps identifier les principales sources de contamination aux polluants chimiques de
l'environnement. Puis, nous expliquerons leurs propriétés de toxicité, de persistance, de
bioaccumulation et de mobilité. Enfin, nous recontextualiserons les polluants dans le milieu
aquatique et présenterons les notions de l'écotoxicologie.
1) Les polluants organiques persistants (POP)
Les POP regroupent un grand nombre de polluants partageant des propriétés communes :
la toxicité, la persistance dans l'environnement, la bioaccumulation et la mobilité, c'est à dire une
capacité des polluants à être dispersés. Ils comprennent plusieurs grandes familles comme les
dioxines, les polychlorobiphényles (PCB), les polybromodiphényléther (PBDE) et les
hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP).
23
Les dioxines sont des sous-produits issus des processus de fabrications industrielles. Les
PCB, qui sont aujourd'hui interdits, ont été massivement utilisés il y a quelques années, car ils
présentaient des propriétés très intéressantes en termes de stabilité, d'inflammabilité et d'isolant.
Les PBDE sont principalement utilisés pour leurs propriétés ignifugeantes. Ils présentent une
structure moléculaire et des propriétés physico-chimiques similaires à celles des PCB. La suite de
notre étude se focalisera sur les HAP. Nous y reviendrons plus en détails par la suite.
Tous ces POP sont hydrophobes et lipophiles, ce qui se traduit par un stockage dans les
tissus adipeux. Certains sont également métabolisables, c'est-à-dire qu'ils sont pris en charge par
l'organisme pour être dégradés en une autre molécule dans le but d'être éliminés.
Il existe deux de pollutions : les pollutions dites aigües et les pollutions dites chroniques
(Figure 7 et Figure 8).
Les pollutions aigues constituent une pollution accidentelle provoquant une exposition
courte à des concentrations élevées. Il est impossible de prédire le moment, le lieu et les
circonstances de l'accident, ainsi que la nature et les quantités de polluants déversés. Enfin, on ne
connaît pas non plus les conséquences qu'elle aura à court, moyen et long terme. Cette exposition
peut entraîner la mort des organismes directement exposés (Figure 8). Les catastrophes d'origine
anthropique sont des pollutions accidentelles qui entraînent des conséquences catastrophiques sur
la faune et la flore. Au niveau mondial, les catastrophes nucléaires qui ont le plus marquées les
esprits et qui ont encore des conséquences aujourd’hui sont Tchernobyl, et plus récemment
Fukushima. En France, l’une des pollutions accidentelles les plus connues est le naufrage de
l'Erika au large des côtes bretonnes, mais il en existe malheureusement beaucoup d'autres.
Les pollutions chroniques sont définies par une exposition longue des organismes à une
concentration faible du polluant. Elle peuvent provenir d'émissions répétées ou continues du
polluant, en faible quantité mais de manière constante. Le polluant peut alors se concentrer dans
l'organisme au cours du temps et/ou entraîner un dysfonctionnement de l'organisme à de faibles
concentrations à long terme.
24
Figure 7 : Schéma de concentration lors d'une pollution aigüe (rouge) et une pollution
chronique (jaune) au cours du temps avec les seuils de toxicité (noir).
La pollution peut, par exemple, provenir de rejets agricoles. En effet, l'augmentation de
l'utilisation des pesticides et autres produits pour les cultures ces dernières années explique en
partie la provenance de ces contaminants.
L’agriculture intensive et la généralisation des monocultures conduisent à une fragilité des
espèces cultivées. Les monocultures présentent de gros avantages en termes de rendement. Mais,
lorsqu’un parasite ou un nuisible spécifique à ce type de culture pénètre dans un champ, les dégâts
sont considérables. Les pesticides, répandus en grandes quantités, permettent en partie d'enrayer le
problème.
Les rejets urbains ont également été identifiés comme une source de polluants.
L’incinération des déchets en est un bon exemple. L'incinération augmente avec la croissance de
la population mondiale, de l'urbanisation et du confort moderne. L’incinération de fond de jardin,
à plus faible échelle, est aussi source d'émission de polluants dans l’atmosphère.
Les rejets industriels apparaissent comme une autre source de production et de libération
de polluants. Les mauvaises combustions, la découverte de nouvelles molécules de synthèse, et la
demande croissante de productivité liée à l'augmentation de la population mondiale sont des
sources potentielles de rejets industriels supplémentaires. Enfin, une source de pollution liée aux
catastrophes naturelles comme le volcanisme intensif ou les feux de forêts a été identifié. Dans ce
cas précis, certains pays et certaines régions du monde sont plus exposés que d’autres. Mais, on
sait que les vents et les courants entraînent des polluants d’un bout à l’autre de la planète.
25
a
b
Figure 8 : Illustration des effets d'une pollution au court d'un temps : avant la pollution, à
court terme et à long terme.
a) cas d'une pollution accidentelle aigüe. b) cas d'une pollution chronique.
La contamination peut donc être de deux types, chronique ou aigüe, mais les sources de
contaminations sont très nombreuses. Aujourd'hui, une prise de conscience générale émerge
autour des sources de pollutions d’origine anthropique, des conséquences possibles sur
l'environnement et sur la santé humaine.
2) Toxicité
Une substance est dite toxique pour l'organisme lorsqu'elle devient nocive pour celui-ci.
La toxicité dépend de la molécule elle-même. Par exemple, dans le cas des molécules
extrêmement toxiques, les effets seront importants à très faibles doses, et la dose de non toxicité
aura un seuil très faible. A l'inverse, une molécule présentant des effets modérés aura un seuil de
toxicité plus élevé.
26
La toxicité d’un contaminant ou d’un mélange de contaminants peut varier selon de
nombreuses variables. Par exemple, l’âge, le sexe, le type de contamination (chronique ou aigüe)
ou encore les facteurs physico-chimiques du milieu (température, conductivité, pH…) peuvent
influencer la toxicité. Les effets vont pouvoir être visibles au niveau moléculaire, cellulaire,
organique, individuel, populationnel, communautaire et enfin écosystémique (Figure 9). En
fonction de la quantité de polluant et de la toxicité de ceux-ci, les effets peuvent être visibles à
toutes ces échelles de manière plus ou moins rapide.
Figure 9 : Illustration des effets de contaminants de la molécule jusqu'à l'écosystème à court,
moyen et long terme.
Les perturbations détectées au niveau moléculaire permettent de comprendre les
mécanismes liés à la toxicité d'un ou plusieurs contaminants sur les organismes. La toxicité peut
être évaluée, par exemple, grâce à la mesure des cassures de l’ADN par le test des COMET
(Akcha et al., 2003), les dosages des métabolites (Sheng et al., 2010), le test EROD (Couillard et
al., 2011), ou encore l'altération de l'expression de gènes. Au niveau cellulaire, la toxicité peut se
traduire par l’apoptose (Deng et al., 2009), qui reflète la mort cellulaire. Lorsque les organes sont
27
touchés, on peut mettre en évidence une augmentation de la taille pour certains, ou, au contraire,
une atrophie pour d’autres (Incardona et al., 2004). La toxicité peut être mise en évidence au
niveau de l’individu. Par exemple chez les poissons, des déformations de type malformation de la
mâchoire (Li et al., 2011), courbure de la colonne, ou encore exophtalmie peuvent être observées
facilement, parfois dès le début de la contamination (Carls et al., 1999). Lorsqu’une population est
atteinte, certains problèmes mis en évidence peuvent entraîner une réduction de la reproduction
(Fonds et al., 1995), ou des déséquilibres de sex-ratio (Chikae et al., 2004). Dans les cas les plus
extrêmes, les altérations peuvent mettre en danger la pérennité de la population. Le fait qu’une
population de poissons ait des problèmes au niveau de la reproduction réduit le nombre
d’individus potentiellement reproducteurs. De plus, si les poissons présentent des troubles du
comportement, notamment en réponse de fuite face à un prédateur, il se peut que cette population
de poissons diminue et/ou disparaisse. La place sera prise par une autre espèce, plus résistante face
à ce polluant. Ce dernier aspect peut avoir des conséquences graves sur l’écosystème et aller
jusqu’à entraîner son déséquilibre fonctionnel.
3) Les polluants en milieu aquatique
Une fois émis, les polluants se retrouvent plus ou moins rapidement dans le milieu
aquatique. En effet, d'après Eisler et al., le déversement est la première cause de pollution du
milieu marin pour les HAP (170.000T). Puis viennent les dépôts atmosphériques (50.000T), les
rejets des eaux usées (4.400T), les eaux de ruissellement (2.940T) et enfin la biosynthèse (2.700T)
(Eisler, 1987) (Figure 10).
28
Dépôts atmosphériques
Eaux usées
Ruissellements
Déversements
Biosynthèses
Figure 10 : Sources de pollution du milieu aquatique
4) Persistance et bioaccumulation
La persistance dans l'environnement exprime le temps pendant lequel le composé demeure
dans le milieu avant d'être dégradé, en substance supposée moins dangereuse ou entièrement
éliminée. Les POP résistent aux mécanismes de dégradations biologiques naturelles et présentent
une durée de vie importante dans l'environnement. Les PCB, par exemple, interdits dans les
années 1980, il y a plus de 30 ans, sont, à l'heure actuelle toujours détectés dans notre
environnement (Kožul et al., 2011).
Les POP ne sont pas seulement persistants, ils sont aussi bioaccumulables, c'est-à-dire que
leur concentration dans l'organisme augmente avec le temps en raison d'un apport permanent. Ce
processus peut devenir problématique. En effet, il conduit à des concentrations toxiques, alors que
les concentrations environnementales sont faibles (Figure 11) (Berends et al., 1997; Petersen and
Kristensen, 1998). La concentration dans l'organisme augmente également le long de la chaîne
trophique, il s’agit de la bioamplification (Figure 11). Les POP sont particulièrement
bioaccumulés dans les faibles niveaux trophiques (León et al., 2013) du fait de leurs propriétés
lipophiles.
29
Figure 11 : Bioaccumulation et de la bioamplification.
Partie haute: la bioaccumulation qui concentre un polluant au cours du temps. Partie basse : la
bioamplification qui augmente la concentration d'un polluant au sein de la chaine alimentaire.
Les POP peuvent être très mobiles grâce à leur semi-volatilité. Ces composés s'adsorbent
sur des particules dans l'atmosphère, ce qui leur permet de parcourir d'importantes distances. En
effet, on retrouve ces molécules jusque dans les zones les plus reculées de la planète comme
l'Antarctique (Weber and Goerke, 2003) ou l'Arctique (Fisk et al., 2001) où aucune source
présente localement ne peut être à l'origine de cet apport. Les polluants se volatilisent dans les
régions les plus chaudes, sont transportés dans l'atmosphère, puis, dans les régions les plus froides,
ils se condensent et se déposent. Cette dispersion atmosphérique est également responsable de la
dispersion des POP dans les milieux aquatiques.
5) Toxicologie et écotoxicologie
La toxicologie constitue la science traitant des substances toxiques, de leurs effets sur
l'organisme et de leur identification. Elle étudie la toxicocinétique et les mécanismes d'actions des
molécules. Les analyses les plus connues en toxicologie sont les calculs de DL50 (dose létale 50)
qui correspondent à la dose où 50% des organismes exposés sont morts. Ces doses étudiées en
toxicologie et correspondant au DL50 sont souvent très éloignées de celles présentes dans
30
l'environnement. L'étude de ces contaminants à des doses environnementales ne correspond donc
pas à la définition de la toxicologie. Le terme d'écotoxicologie est apparu en 1969 et peut être
considéré comme un prolongement de la toxicologie. C'est l'étude du devenir et des effets des
polluants dans un écosystème, associée à l'évaluation des risques liés à ce ou ces polluants.
L'écotoxicologie étudie l'émission, l'entrée, la dispersion et la biodisponibilité des polluants dans
le milieu. Elle évalue les effets à différentes échelle (Figure 9). Cette s'est au départ beaucoup
basée sur la présence et/ou l'effet d'un unique composé dans le milieu, sans facteurs de stress
autres que le composé. Puis l'introduction de facteurs multistress (température, salinité,
luminosité, etc.) ont fait leur apparition. Depuis quelques années, l'étude des composés en mélange
s'est également développée. Ces nouvelles variables ont donné un nouvel essor à l'écotoxicologie.
II Les HAP
Dans cette partie, nous nous focaliserons sur les HAP. Dans un premier temps, nous
détaillerons leurs structures et leurs propriétés physico-chimiques, puis nous exposerons leurs
origines et le niveau d’émissions mondiales de ces molécules. Nous analyserons leur évolution
dans le milieu naturel avant de décrire leurs mécanismes de dégradation. La réglementation pour
les HAP sera présentée.
1) Structures et propriétés physico-chimiques
Les HAP sont des molécules organiques neutres apolaires composées d'atomes de carbone
qui forment des cycles benzéniques et d'atomes d'hydrogène. Ces cycles peuvent aller de 2 à 10
(Hylland, 2006). Leur formule chimique est de type CnHm. On dénombre aujourd'hui plus de 130
HAP différents. Seize HAP ont été classés prioritaires (Figure 12) par l'Agence de Protection de
l'Environnement Américaine (USEPA) car ils sont abondants dans l'environnement ou très utilisés
par l'industrie. Certains sont potentiellement cancérigènes pour l'homme. Ils possèdent entre 2 et 6
cycles benzéniques et présentent des configurations différentes (Figure 12).
31
Figure 12 : Liste des 16 HAP prioritaires selon l'USEPA.
Ces HAP sont regroupés selon leurs nombre de cycles. Modifié d'après Tarantini (Tarantini, 2009)
Leurs caractéristiques (toxicité, capacité d'adsorption, mobilité...) sont déterminées par la
structure physique de la molécule. Parmi les 16 HAP prioritaires, certains sont plus cancérigènes
que d'autres. Les HAP ayant moins de 4 cycles benzéniques sont généralement pas ou peu
cancérigènes, ce qui n'est pas le cas lorsqu'on est en présence de molécules présentant 4 à 6 cycles.
En effet, les molécules possédant un plus grand nombre de cycles ont, pour certaines, des
configurations en région baie ou région fjord qui leur confèrent une structure particulière (Figure
13). Ces régions sont constituées par des structures angulaires formées par les cycles benzéniques
et représentent une gêne stérique de part leur forme, c'est-à-dire un encombrement physique. La
présence de l’une de ces régions rend possible une dégradation de ces composés en favorisant les
réactions d’oxydation.
32
Figure 13 : Caractéristique structurale des HAP ayant un potentiel cancérogène.
Molécules à région baie comme le benzo[a]pyrène et d'autres à région fjord comme le
dibenzo[a,l]pyrène. (Tarantini, 2009)
Les HAP sont des POP. Ils possèdent donc une mobilité non négligeable, comme le groupe
auquel ils appartiennent. Leur répartition dans l'environnement dépend de leur solubilité dans
l'eau, de la constante de Henry, KH (ratio des concentrations dans l'air et dans l'eau à l'équilibre),
du coefficient de partage octanol/eau, Kow (estime la migration du composé vers les lipides) et du
coefficient de partage du carbone organique, Koc (capacité du composé à se lier à la matière
organique du sol ou du sédiment). Les HAP avec un petit nombre de cycles ont une masse molaire
faible et un Kow faible. Ils ont généralement une solubilité plus élevée que les HAP avec une
masse molaire et un Kow élevé. C’est notamment le cas du naphtalène (MM:128 g/mol; Kow:3.23.4), qui a deux cycles et qui est plus soluble que le benzo[a]pyrène qui en a 5 (MM:252g/mol;
Kow: 6.1-6.3). Les HAP ayant une masse molaire importante sont généralement davantage
biodisponibles dans l'environnement (Hylland, 2006).
2) Origine et émissions
Les HAP peuvent être de diverses origines : pyrolitiques, pétrogéniques, diagéniques et
biogéniques. Dans l'atmosphère, les HAP pyrolitiques, associés à des particules, sont de loin les
plus nombreux. Ils apparaissent suite à la combustion incomplète de la matière organique, par
exemple, en lien avec la combustion du pétrole pour le chauffage individuel ou par des industriels.
Ils entrent dans le milieu aquatique en s'adsorbant sur des particules, la matière en suspension
(MES), ce qui réduit leur biodisponibilité. Ils sont généralement constitués de molécules à forts
poids moléculaires et présentent peu de dérivés alkylés (HAP avec un groupe CH3 sur au moins un
cycle). Les HAP pétrogéniques proviennent des matières fossiles des sous-sols telles que le gaz, le
pétrole ou le charbon. Les activités portuaires constituent une source de déversement importante.
Ils se retrouvent dans l'environnement également suite à des déversements accidentels de type
33
marée noire. Les HAP pétrogéniques sont principalement composés de HAP légers et de dérivées
alkylés. Ils sont généralement plus hydrophobes et biodisponibles dans le milieu que les HAP
pyrolitiques, car ils s'adsorbent moins sur les MES. Les HAP diagéniques sont issus du processus
de transformation dans les sols et les sédiments. Les HAP biogéniques sont produits par les
organismes (Hylland, 2006). Certaines plantes comme les conifères peuvent créer, par exemple,
du phénanthrène ou du chrysène (Hansen et al., 2003), présent dans la résine.
Ces différents types de HAP sont émis dans l'environnement via deux voies principales. La
première est une voie chronique qui est vraie pour les HAP pyrolitiques et pétrogéniques. Elle se
fait via une exposition à des sources diffuses. La deuxième est une exposition accidentelle, qui
concerne : les HAP pétrogéniques dispersés dans l'atmosphère lors de marées noires par exemple,
et les HAP pyrolitiques lors d'important feux de forêt ou d'éruptions volcaniques de grande
ampleur.
Quelles que soient leurs origines, les émissions de HAP étaient en constante augmentation.
En effet, en 1987, Eisler estimait les émissions dans l'atmosphère à 50.000T/an (Eisler, 1987),
alors qu'en 2004, soit 17 ans après, Zhang & Tao les jaugeaient à 520.000T/an, soit environ 10
fois plus (Zhang and Tao, 2009). Le dernier bilan paru cette année prévoit une stagnation voire
d'une légère baisse dans les années à venir (Shen et al., 2013).
Figure 14 : Carte du monde de la quantité d'émissions dans l'atmosphère des 16 HAP
prioritaires en T par an.
Les zones claires indiquent les pays ou les émissions de HAP sont faibles et les plus foncées les
pays où le taux d'émissions est très important (Zhang and Tao, 2009)
34
Les HAP proviennent de sources différentes selon les pays. En 2004, ils étaient
principalement issus de la combustion de biofuel (57%), de feux sauvages (17%) et des produits
usuels (7%) (Zhang and Tao, 2009). Ils peuvent également provenir de la combustion de résidus
de culture, de feux de forêt ou de la déforestation, de véhicule à moteur ou encore de la production
de fuel. Les 3 composés principalement émis au niveau mondial sont le naphtalène (45%),
l'acénaphtylène (17.1%) et le phénanthrène (10.6%). Tous ces composés possèdent 2 ou 3 cycles
(Shen et al., 2013).
Les pays qui relarguent les plus importants taux d'émissions sont situés dans des zones très
industrialisées, ou sont des pays émergents (Figure 14). Les pays asiatiques représentent 53.5%
des émissions mondiales (Chine (106.000T) et Inde (67.000T) principalement), puis arrivent
ensuite le Brésil, l'Indonésie, le Nigéria, etc (Shen et al., 2013). Ces mêmes auteurs observent un
ralentissement des émissions.
3) Devenir dans le milieu naturel
Une fois présents dans le milieu, l'évolution des HAP est différente selon les lieux (León et
al., 2013), les saisons (Cailleaud et al., 2007; León et al., 2013), et les espèces animales présentes
(León et al., 2013). Les HAP sont présents dans l'air mais certains peuvent aussi être présents dans
l'eau et dans les sédiments. En effet, une petite fraction est dissoute et une autre part est adsorbée
sur des MES. Ces MES sédimentent et les HAP se concentrent dans le sédiment qui devient un
véritable réservoir. Les contaminations moyennes se situent aux alentours de 10 µg/g (Baumard et
al., 1998; Cachot et al., 2006) et peuvent aller jusqu'à 50 ng/g dans certains endroits (Benlahcen et
al., 1997). Les HAP pyrolitiques et pétrogéniques, qui sont hydrophobes, sont très présents dans le
sédiment. Ils peuvent alors être absorbés par l'organisme et deviennent alors biodisponibles. Cette
dernière peut être augmentée par les courants et les dragages par exemple (Cailleaud et al., 2009).
Une fois biodisponibles, les HAP peuvent entrer dans la chaîne trophique. Le devenir dans le
milieu naturel est donc une variable difficile à évaluer car elle est multifactorielle.
4) Règlementation
Nous avons vu précédemment que ces molécules sont émises à grande échelle sur notre
planète. L'encadrement des rejets de ces HAP représente un point capital pour la protection
environnementale. L'Agence de Protection de l'Environnement Américaine (USEPA) n'est pas la
seule à avoir déclaré ces molécules dangereuses. D'autres classements ont été mis en place,
notamment par le Centre International de Recherche contre le Cancer (CIRC), qui a établi une
35
répartition en 3 groupes. Le groupe 1 correspond aux substances cancérogènes avérées, le groupe
2 rassemble les substances probablement (groupe 2A) et possiblement (groupe 2B) cancérogènes
et le groupe 3 les substances inclassables quant à leur cancérogénicité. L'Autorité Européenne de
Sécurité des Aliments (EFSA) a elle aussi édité une classification des HAP. Cette dernière ne
comprend pas les molécules de moins de 4 cycles, plus le fluoranthène et le pyrène (4 cycles). En
revanche, certains HAP non classifiés par l'USEPA font leur apparition, comme le
dibenzo[a,l]pyrene, le benzo[j]fluoranthène, le dibenzo[a,h]pyrène, le dibenzo[a,i]pyrène et le 5méthylchrysène. Ces différences de classification sont présentées dans le Tableau 1.
Tableau 1 : Classification de la dangerosité des HAP selon 3 organisations.
L'Agence de protection de l'environnement américaine (USEPA), le Centre international de
recherche contre le cancer (CIRC) et l'Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA).
36
Il convient de nuancer ces classifications, car elles tiennent uniquement compte des
composés parents. Elles occultent les métabolites ou les dérivés alkylés (excepté le 5methylchrysène qui est pris en compte par le CIRC et l'EFSA) qui peuvent être tout aussi nocifs.
Toutes ces classifications sont efficaces que si elles sont appuyées par des réglementations.
La réduction des tests sur les animaux fait également partie des nouvelles réglementations. La
directive REACH (enregistrement, évaluation, autorisation et restriction des produits chimiques),
entrée en vigueur en 2007, ainsi que la directive cadre sur l'eau (DCE), qui arrivent à échéance en
2015, imposent des objectifs clairs : faire l'état des lieux des polluants dans l'environnement d'une
part, et contrôler et réduire les molécules émises d'autre part. Limiter l'usage des produits
contenants des HAP, par exemple l'huile et les pneumatiques, est une des recommandation.
III Voies de contamination
Les contaminants sont présents dans notre environnement dans l'air, l'eau et le sédiment. Ils
pénètrent dans les organismes via la voie respiratoire, la voie cutanée et la voie alimentaire. Ils
sont ensuite biotransformés et excrétés.
1) La voie respiratoire
A l'heure actuelle, les émissions de polluants dans l'atmosphère sont importantes (Shen et
al., 2013; Zhang and Tao, 2009). Des mesures de HAP journalières confirment la présence de ces
composés dans l'air (Buet, 2002).
Il a été démontré que, chez des mammifères soumis à une pollution aérienne aux HAP
pendant 10 semaines, une modification de l'expression des gènes dans les poumons était avérée.
Ces gènes étaient impliqués dans la synthèse de lipides, le métabolisme, la mort cellulaire et la
mobilité cellulaire. Le nombre de gènes altérés était très important à 3 semaines, puis diminuaient
avec le temps. Ce résultat suggère une réponse adaptative. Malgré tout, certains gènes semblaient
être altérés durablement (Rowan-Carroll et al., 2013).
Dans le milieu marin, une exposition aux HAP dissous chez l'huître, entraîne une
diminution du métabolisme quand le milieu est fortement contaminé et une augmentation lorsque
le milieu est faiblement contaminé (Kim et al., 2007). L'auteur émet l'hypothèse que l'huître
adopte une stratégie active liée, peut être, à la détoxification en milieu faiblement contaminé. En
revanche, le mollusque adoptera une stratégie passive, en réduisant son absorption en nourriture et
en O2 en milieu fortement contaminé.
37
2) La voie cutanée
L'absorption par la voie cutanée passe par la peau et les muqueuses. La peau est soumise à
de nombreuses attaques qui peuvent la fragiliser ou l'abîmer comme par exemple les
rayonnements UV (Charron et al., 2000).
Chez les poissons, la respiration est cutanée au début de la vie. Puis, la respiration
branchiale prend le relais (Nüsslein-Volhard and Dahm, 2002). La surface de respiration est plus
importante. Face à des contaminants, le poisson est vulnérable à ce stade. En effet, des études ont
montré que les larves étaient plus sensibles que les juvéniles, eux-mêmes plus sensibles que les
adultes chez les poissons et les invertébrés marins en présence de polluants (Hutchinson et al.,
1998).
Malgré tout, un contact direct avec des HAP, par exemple lors d'une marée noire, peut
entraîner une irritation de la peau et des yeux (Baars, 2002). Ce cas a été observé chez des
personnes qui aidaient à nettoyer les plages. Chez les poissons, une exposition d'œufs sur sédiment
contaminé augmente le nombre de malformations. L'exposition altère le taux d'éclosion et la
croissance (Colavecchia et al., 2004).
3) La voie alimentaire
La voie alimentaire est une voie qui mène les contaminants rapidement dans l'estomac et
les intestins. Chez les poissons, c'est la principale voie d'exposition aux HAP (Johnson et al.,
2007; Yanagida et al., 2012).
L'absorption de HAP par voie alimentaire peut entraîner des troubles, entre autres, pour les
parents ou les descendants chez les rats (Crépeaux et al., 2012, 2013), chez les souris (Kim et al.,
2011), chez les crabes (Dissanayake et al., 2009) et chez les isopodes terrestres (Van Brummelen
et al., 1996). Des troubles du même ordre ont été identifiés après une contamination alimentaire
aux PCB chez les poissons (Daouk et al., 2011; Péan et al., 2013; Weber and Goerke, 2003).
L'accumulation des HAP dépend de la concentration en contaminants dans les proies. On
observe que, dans un même milieu, différents organismes n'adoptent pas la même stratégie face à
un même mélange de HAP. On sait que les organismes ayant une capacité de biotransformation,
comme par exemple les poissons, accumulent préférentiellement des HAP à faible poids
moléculaire. En revanche, les moules, qui ont une capacité de biotransformation réduite, mangent
majoritairement des HAP à fort poids moléculaire (Baumard et al., 1998). Ces réponses varient
38
selon le comportement alimentaire, le niveau trophique et l'habitat. Les concentrations retrouvées
dans les animaux peuvent varier en fonction du lieu, comme par exemple chez les mollusques
(Arias et al., 2009).
4) Biotransformation et excrétion
La biotransformation est un processus visant à rendre le xénobiotique plus hydrophile et
donc plus facilement excrétable. Ces réactions ont pour but de diminuer les effets de la molécule
mère.
Les organismes disposent de mécanismes de défense qui leur permettent d'éliminer les
xénobiotiques. C'est le cas pour les HAP qui peuvent être métabolisés par certains organismes,
c'est-à-dire qu'une fois entrée dans l'organisme, la molécule parent sera transformée en une autre
molécule, appelé métabolite, qui pourra être éliminée. Cette métabolisation se réalise en deux
phases :
1) Une phase de fonctionnalisation (Figure 15) par des cyp P450, complexe enzymatique
impliqué dans la lutte et l'élimination des molécules étrangères à l'organisme, ayant une activité
mono-oxygénase, comme par exemple cyp1a1 qui se traduit par l'ajout d'un oxygène sur une
liaison carbone-carbone (C-C). D'autres enzymes interviennent dans cette voie, entraînant la
production de plusieurs métabolites aux propriétés différentes.
2) Une phase de conjugaison (Figure 15) avec l'ajout d'un groupement glutathion par une
molécule Glutathion S-transférase (GST) qui rend la molécule hydrophile et donc excrétable.
Ce processus peut être répété et entraîner plusieurs types de métabolites (Figure 15),
comme par exemple pour le naphtalène, le phénanthrène, le fluoranthène, le pyrène, le chrysène et
le benzo[a]pyrène. Ces différences entre les nombreux métabolites issus d'une même molécule de
départ s’expliquent par la position variable du groupement ajouté suite à cette réaction. Certains
métabolites sont réactifs par rapport à l'ADN ou aux protéines.
39
Figure 15 : Schéma général de la biotransformations des HAP.
Modifié d'après la figure d’Alain Botta, Biotransformations des HAP et des nitro-HAP ; influence
du polymorphisme génétique des enzymes métaboliques. GST : Glutathion S-transférase. EH :
époxyde hydrolase. AHH : aryl hydroxylase hydrocarbons
Ce mécanisme est très important dans le processus de dégradation et d'excrétion de ces
molécules. Les métabolites sont généralement produits dans le foie, où ils sont présents en fortes
concentrations, puis dirigés vers la bile avant de passer dans le tube digestif pour être excrétés. Le
métabolite du naphtalène est le plus concentré dans le foie, puis vient ensuite celui du fluorène
(Aas et al., 2000). Cette voie d'excrétion est généralement utilisée pour doser la contamination
effective d'une espèce suite à une exposition. Il est donc important de comprendre que les
composés parents ne sont pas les seuls présents dans les organismes contaminés. Le dosage d'un
composé parent seul, peut s'avérer faible, car il a été en grande partie ou totalement métabolisé par
l'organisme.
L'excrétion des HAP conduit à une élimination définitive du contaminant. Elle peut se faire
par le rein dans l'urine chez les humains et chez les rats par exemple (Brzeźnicki et al., 1997; Viau
et al., 1999). L'élimination des contaminants peut se faire par les fèces, comme par exemple les
mécanismes d'excrétion d'ammoniac chez l'huître (Kim et al., 2007) qui augmentent avec la
40
contamination. Chez les mammifères, la décontamination par le lait maternel (Crépeaux et al.,
2012) est assez répandue. Chez les ovipares, la décontamination par le biais des œufs n'est pas
volontaire (Pereira et al., 2009). Néanmoins, c'est un moyen de pouvoir éliminer plus ou moins
totalement les contaminants présents dans le corps par ce biais, le problème étant bien entendu le
transfert maternel vers la descendance.
Chez l'homme, des chercheurs ont mis en évidence une décontamination par les phanères.
La nicotine, par exemple, très présente chez les fumeurs, est retrouvée dans les cheveux et
éliminée lorsque les cheveux sont coupés (Appenzeller et al., 2012).
L'importance de ces voies de contamination et d'excrétion varie selon le mode de vie, l'âge
et l'environnement de l'organisme concerné.
IV Effets connus des HAP
Nous analyserons la toxicité de ces composés de manière individuel, puis en mélange. Par
la suite, nous présenterons un inventaire des effets connus des HAP, tout d'abord de manière
individuelle, puis en mélange, avant de s'intéresser aux effets sur différentes fonctions ou
processus à différents niveau d'échelle ou d'organisation.
1) Toxicité des composés individuels
Les HAP représentent un facteur important de contamination dans l'environnement mais
aussi un risque pour la santé humaine. En effet, les dangers liés aux HAP varient selon leur
toxicité d'une part, et les nombreuses sources d'exposition d'autre part.
Il a d’ailleurs été prouvé que des effets cancérigènes et mutagènes liés à un composé
individuel de HAP étaient avérés. Un grand nombre d'effets ont été recensés (Hansen et al.,
2003). En effet, la génotoxicité et la tumoriginèse observées chez les poissons sont liées à la
présence des métabolites. Au-delà de la génotoxicité, il existe de nombreux autres effets, observés
par exemple au niveau du comportement, de la reproduction et de la croissance.
Le benzo[a]pyrène par exemple, qui est très étudié, entraîne une diminution du poids
(Chikae et al., 2004) et de la croissance (Van Brummelen et al., 1996), une augmentation du
rapport gonado-somatique (GSI) chez le médaka japonais, (Oryzias latipes) (Chikae et al., 2004),
des cassures de l'ADN chez l'huître (Crassostrea gigas) (Wessel et al., 2007), des adduits à l'ADN
chez le poisson zèbre et sur des cellules de foie humaine (HepG2) (Miranda et al., 2006; Tarantini,
2009). Des effets tératogènes notamment sur le coeur de la sardine (Clupea pallasi) (Incardona et
41
al., 2008) et du poisson zèbre (Hicken et al., 2011; Incardona et al., 2004)ont été observés ainsi
qu'une anémie chez la rascasse (Sebastes schlegeli) (Kim et al., 2008). Le benzo[a]pyrène affecte
la reproduction d'isopodes (Oniscus asellus et Asellus porcellio scaber) (Van Brummelen et al.,
1996) il s'accumule dans les ovocytes chez le poisson chat (Ictalurus punctatus) (Montverdi and
Di Giulio, 2000), il perturbe l'expression de l'aromatase (enzyme nécessaire à la conversion
d'androgène comme la testostérone en œstrogène) chez les femelles de choquemort (Fundulus
heteroclitus) (Patel et al., 2006) et inhibe la synthèse de testostérone et d'œstradiol chez le flet
(Platichthys flesus L.) (Rocha Monteiro et al., 2000).
La toxicité d'un composé peut être amplifiée ou réduite par des facteurs endogènes et
exogènes. Par exemple, chez les poissons, l'hypoxie (Matson et al., 2008), l'origine géographique
et l'histoire de vie des poissons (Diekmann and Nagel, 2005), et/ou les différents composés de
HAP (Djomo et al., 1996) peuvent entraîner des variations. Le temps de pénétration dans
l'embryon de poisson et le temps de dépuration peut varier considérablement. Par ailleurs, les
effets produits par ces molécules, testées de manière individuelle, ne suivent pas forcément une
relation dose effet (Chikae et al., 2004).
L'étude de ces composés individuels a permis d'aider à comprendre une partie des
mécanismes impliqués dans la toxicité des HAP. Il a été montré que la liaison de certains HAP,
par exemple le B[a]P avec le Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) entraîne l’activation de celui-ci et
sa translocation dans le noyau. Sans le HAP, l’AhR reste dans le cytoplasme. Une fois dans le
noyau, le complexe HAP-AhR régule l'expression de certains gènes. C'est le cas par exemple du
gène cyp1a, dont la transcription est activée par ce complexe. L'activité de l'AhR, qui régule les
enzymes intervenant dans le processus de métabolisation de xénobiotique. Cette activité explique
l'induction de l'expression des gènes comme les CYP, qui augmenterait en présence de HAP
possédant 4 ou 5 cycles (Barron et al., 2004; Billiard et al., 2002; Ohura et al., 2007). Cependant,
le rôle des AhR dans la toxicité des HAP est très complexe et présenterait des différences de
sensibilité selon les espèces (Jönsson et al., 2009). Chez le poisson zèbre, les effets
embryotoxiques des HAP sont partiellement médiés par la voie de signalisation des AhR (Billiard
et al., 2006). Le blocage des AhR2 entraînerait une médiation de la toxicité (King-Heiden et al.,
2012; Prasch et al., 2003). L'inhibition des AhR bloquerait l'expression des cyp1a dans
l'endothélium et protégerait l'animal contre l'induction de la toxicité par les xénobiotiques, et
notamment la formation d'œdèmes péri-cardiaque ainsi que des déformations crâniennes. (Billiard
et al., 2006; Incardona et al., 2005). Plusieurs xénobiotiques sont des ligands du AhR, par exemple
42
la dioxine ou le PCB126 (Carney et al., 2006 ; Grimes et al., 2008). Ceci explique la convergence
des phénotypes observés après une exposition à ces composés.
Au-delà de ce rôle dans la médiation de la toxicité des HAP, plusieurs rôles ont été mis en
évidence pour l'AhR, notamment au cours du développement embryonnaire. Ainsi, il a été montré,
que l’activation de l’AhR par des ligands endogènes participe à la régulation cellulaire,
l’activation des protéines kinase en cascade pour la mitose et la mobilisation des réserves de
calcium (Puga et al., 2009). Il pourrait également être impliqué dans les cycles cellulaires,
l’apoptose (Puga et al., 2009), la reproduction (Hernández-Ochoa et al., 2009), le maintien de
l’homéostasie et le développement embryonnaire (Kawajiri and Fujii-Kuriyama, 2007). L’AhR est
capable d’interférer dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques ou les cytokines
et les facteurs de croissance sont impliqués (Gomez-Duran et al., 2009; Haarmann-Stemmann et
al., 2009)
Au niveau de l’immunité, il a été montré que des agonistes de l’AhR influencent la
différenciation et la fonction des lymphocytes T (Anderson et al., 2013). Mais une activation
persistante de l’AhR entrainerait une diminution du nombre de lymphocytes T dans le thymus
(Hao and Whitelaw, 2013). L’AhR jouerait également un rôle dans la maturation des cellules qui
régulent l’activité des macrophages, des cellules dendritiques, des neutrophiles et influencerait
l’infection par des virus (Hao and Whitelaw, 2013). L'AhR jouerait donc un rôle dans l’immunomodulation (Hao and Whitelaw, 2013)
Il existe des connexions entre le rythme circadien et l’AhR qui affectent le processus
physiologique (Anderson et al., 2013 ; Garrett and Gasiewicz, 2006; Mukai et al., 2008 ; Qu et al.,
2007; Shimba and Watabe, 2009; Tischkau et al., 2011; Xu et al., 2010). L’horloge circadienne et
le complexe AhR influence des processus physiologiques cruciaux comme la maintenance de
l’homéostasie et participent à la régulation de processus physiologiques et pathophysiologiques
(Anderson et al., 2013). En effet, certaines maladies sont associées aux changements de régulation
circadienne et aux fonctions AhR comme Alzheimer par exemple. (Anderson et al., 2013).
L’exposition à des activateurs endogènes de l’AhR modifie la fonction de celui-ci. Si le système
est régulé par hormone, cela pourrait expliquer que certains tissus (seins, prostate) soit plus
sensibles et augmentent le risque de cancers (Anderson et al., 2013). Le promoteur de l’AhR serait
hyper méthylé dans les cellules cancéreuses ce qui serait corrélé avec la survie (Anderson et al.,
2013)
43
En ce qui concerne la reproduction, l'AhR est impliqué à plusieurs niveaux.
Des altérations ont pu être mises en évidence au niveau de la méiose des cellules
germinales. Ainsi il a été montré qu’une exposition à des HAP supprime l’initiation et
l’achèvement méiotique des cellules germinales primordiales de poulet et entrainent l’apoptose de
ces cellules et que cet effet nécessitait la participation du AhR (Ge et al., 2012).
L’AhR aurait un rôle dans la régulation de la biosynthèse de E2 (Hernández-Ochoa et al.,
2009).De manière plus précise, l’AhR aurait un rôle dans les fonctions physiologiques incluant les
fonctions ovariennes, l’établissement d’un environnement optimum pour la fécondation, la
maintenance de la grossesse et le nourrissage des embryons et la régulation de la fertilité
(Hernández-Ochoa et al., 2009). Il contribuerait également à réguler l’ovulation chez les adultes et
la croissance des follicule dans les stades tardifs de la folliculogénèse. L’AhR serait impliqué dans
le fonctionnement normal de l’utérus et dans le développement du vagin. (Hernández-Ochoa et al.,
2009) et jouerait un rôle essentiel pour une grossesse chez les mammifères (Hernández-Ochoa et
al., 2009). En effet, l’activation de l’AhR serait indispensable dans le processus d’ovulation, il
serait impliqué dans la régulation du corpus luteum.
Au niveau de la reproduction, il a également été montré qu’une exposition au TCDD
entrainait, via l’AhR, une inhibition des récepteurs aux œstrogènes ainsi qu’une diminution, chez
les animaux exposés, du poids de l’utérus chez les femelles et du poids des testicules chez les
males (Brunnberg et al., 2011). L’AhR influencerait la maturation des organes reproducteurs des
deux sexes (Brunnberg et al., 2011) mais une réponse différentielle est toutefois mise en évidence
selon le sexe (Brunnberg et al., 2011; Norman Haldén et al., 2011). Ces altérations seraient liées
au fait qu’AhR2, activé par la liaison de la TCDD inhiberait l'expression des gènes codant la VTG
en interagissant avec les récepteurs aux estrogènes (Bugel et al., 2013). Au niveau fonctionnel, la
diminution de l'expression de vtg1 se traduit par une réduction du nombre d'oocytes contenant de
la VTG entrainant une diminution de la maturation des ovaires avec une augmentation du nombre
de folicules atrétiques et une diminution de la proportion des ovocytes contenant de la VTG
(Norman Haldén et al., 2011). Au niveau moléculaire, il a été montré que l'interaction entre AhR
et ER serait modulée par HSP90 (Chang et al., 2014). En effet, la protéine chaperonne HSP90
régule les interactions ligands-récepteurs parce que certains récepteurs libres sont incapables de
lier leurs ligands sans l’assistance du complexe HSP90. (Chang et al., 2014). D’autre part, la
diminution du nombre d’œufs observé dans de nombreux cas d’expositions à des xénobiotiques
pourrait être liée à un effet plus général du toxique lié au système endocrinien (Norman Haldén et
44
al., 2011). L’AhR jouerait un rôle dans la croissance des follicules en régulant la production
d’hormone stéroïdes (Hernández-Ochoa et al., 2009) et la régulation de l’expression des
récepteurs d’hormones sexuels seraient une fonction intrinsèque de l’AhR (Ohtake et al., 2008).
La réglementation vise uniquement les composés de manière individuelle, et il est
extrêmement difficile d'attribuer directement la cause d'une maladie à un composé. Dans
l'environnement, les composés sont toujours présents en mélange et il est difficile voire impossible
de prédire la toxicité d'un mélange sur la base de sa composition.
2) Toxicité en mélange
Les HAP sont toujours présents en mélange. Il en existe différentes sortes : les mélanges
entre familles de composés (ex:HAP, PCB, PBDE...) ou les mélanges de composés d'une même
famille. Le mélange de composés peut être lié à une contamination chronique. Des études ont été
réalisées directement dans le milieu naturel pour essayer d'évaluer l'impact de ces mélanges sur les
animaux.
Dans le milieu aquatique, une étude menée sur l'influence des polluants sur la mue des
crabes (Mothershead Ii and Hale, 1992) a mis en évidence des accumulations plus importantes des
HAP en période de mues. Dans une autre étude, chez les poissons cette fois, Barbee et al. ont
exposé des saumons en cage au-dessus de sédiments naturellement contaminés, continuellement
remis en suspension par le courant. Les 16 HAP prioritaires ont été retrouvés dans les analyses, et
les dommages à l'ADN des poissons situés près de la source de contamination étaient plus
importants que chez ceux situés plus loin (Barbee et al., 2008).
Dans une troisième étude, des lésions tissulaires chez les téléostéens (Myers et al., 1994)
ont été révélées après une exposition à des sédiments naturels contaminés issus du Pacifique.
D'autres études ont été réalisées en milieu aquatique suite à l'échouage de certains bateaux,
comme par exemple l'Exxon Valdez en 1989. L'impact de ce mélange sur les œufs de poissons a
été mesuré (Carls et al., 1999) après une exposition par sédiment contact de 16 jours. Une
diminution du taux de survie, de la taille des larves, de l'activité de nage des larves, une
augmentation des malformations, des œdèmes de type péri cardiaque ou du sac vitellin et de
malformations de la colonne vertébrale ont été observées (Carls et al., 1999).
Mieux comprendre l'effet d'une molécule seule était indispensable pour pouvoir ensuite
mieux interpréter les effets de mélanges. En effet, certaines molécules en mélange peuvent avoir
45
un effet inhibiteur ou, au contraire, être encore plus toxiques. La toxicité des composés en
mélange constitue l’un des grands enjeux actuels et à venir. Même si de plus en plus d'études vont
en ce sens, il s’agit néanmoins d’un travail de longue haleine car la composition des mélanges est
infinie.
3) La survie
La survie constitue une variable couramment utilisée. Cette variable a permis de mettre au
point des tests standardisés en toxicologie tels que les calculs de DL50 (dose létale) ou de LC50
(concentration létale). Bien que protégés dans leurs chorions, les œufs de poissons puis les larves
sont particulièrement exposés car, dans la plupart des cas, ils sont incapables de fuir les zones
contaminées durant leurs premiers stades de vie (Frantzen et al., 2012). C'est au cours du
développement, lors de la mise en place de tous les organes et systèmes, que les contaminants
peuvent passer cette barrière. Ils peuvent agir sur le développement et entraîner de lourdes
conséquences à long terme.
Une exposition à des HAP peut entraîner une diminution de la survie chez les organismes
aquatiques lors d'expositions aigües. Ainsi, il a été constaté une diminution de la survie après une
exposition précoce chez le saumon (Oncorhynchus gorbuscha) à des HAP dissous (Carls and
Thedinga, 2009).
Dans le cas d'exposition chronique dès les stades précoces, des effets similaires peuvent
être observés. Une altération de la survie a été constatée chez le saumon (Oncorhynchus
gorbuscha) exposé à du pétrole brut (Heintz et al., 1999), chez le vairon (Feathed minnow)
exposé à des sédiments contaminés (Colavecchia et al., 2004), chez Chanos chanos et le capelan
(Mallotus villosus) exposés aux HAP dissous (anthracène, B[a]P, pyrène et fuel lourd) (Frantzen
et al., 2012; Palanikumar et al., 2013). La crevette (Palaemonetes pugio), exposée par l'aliment au
pyrène, présente également une réduction de la survie (Oberdörster et al., 2000).
Dans d'autres études, la survie n'est pas affectée par les HAP. C'est le cas par exemple
chez des isopodes terrestres, où l'administration par voie orale n'entraîne pas d’effets importants
sur la survie (Van Brummelen et al., 1996). Celle-ci n'est pas non plus affectée après une
exposition au BaP chez le choquemort (Fundulus heteroclitus) (Dong et al., 2008).
Les HAP peuvent affecter la survie dans certains cas, et pas dans d'autre. Cette variable
extrême n'est peut-être pas la plus sensible pour toutes les espèces ou tous les types d'exposition.
46
4) Les malformations et la croissance
Les HAP induisent des malformations lors du développement. Ils entraînent par exemple
une diminution de la minéralisation du squelette chez le bar (Dicentrarchux labrax) (Danion et al.,
2011), des déformations craniofaciales chez la rascasse (Sebastiscus marmoratus) (Shi et al.,
2012). Des malformations de la mâchoire (Li et al., 2011 ) chez ce même poisson ainsi que chez
le poisson zèbre (Incardona et al., 2004) ont également été observés. Le nombre d'œdèmes se
retrouve également augmenté chez la rascasse (Sebastes schlegeli), le saumon (Oncorhynchus
gorbuscha) (Carls and Thedinga, 2009; Jee et al., 2006) et le médaka (Orizyias latipes) (Le
Bihanic et al., Submitted ), ainsi que l'occurrence d'hémorragies chez la truite (Oncorhynchus
mykiss) (Sundberg et al., 2005).
L'impact des HAP sur la croissance se traduit fréquemment par une réduction de la taille
et/ou du poids (Carls and Thedinga, 2009; Gilliers et al., 2012; Gundersen et al., 1996). Cette
réduction de la croissance est observée quel que soit le mode d'administration des HAP, les
concentrations utilisées et la durée d'exposition (Kim et al., 2008; Moles and Rice, 1983;
Palanikumar et al., 2013). La diminution du poids est souvent proportionnelle à la contamination
(Moles and Rice, 1983). Malheureusement, ce ne sont pas les seuls dommages visibles. Une
diminution des réserves lipidiques peut être observée et se traduire par une diminution des
réserves énergétiques (Gilliers et al., 2012; Meador et al., 2006).
5) Métabolisme et osmorégulation
Au niveau du métabolisme, une étude issue de ce même projet a caractérisé les taux
métaboliques standard ("standard metabolic rate", SMR) et actif ("actif metabolic rate", AMR)
chez les poissons exposés à un mélange de type pyrolytique. Aucune différence n'a été observée,
que ce soit au stade juvénile ou au stade adulte, chez les poissons directement contaminés ou chez
la descendance (Lucas et al., submitted).
En revanche, des altérations au niveau des performances de nages en tunnel sont observées
dans une autre étude, après une exposition de 48 heures du poisson zèbre adulte à de faibles
concentrations de HAP (Hicken et al., 2011).
Dans le cadre d'une étude sur les HAP, des poissons ont été exposés à la fraction soluble
d'un mélange issu d'un pétrole brut. Des lésions structurales et des différences morphologiques
sont remarquées sur la branchie (Agamy, 2013a). Ces différences seraient liées à un métabolisme
qui viserait à réduire le contact avec le polluant, et qui, pour cela, réduirait la surface branchiale et
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l'apport d'oxygène. Une réduction de l’absorption de l’oxygène pourrait compromettre le
métabolisme du poisson (Agamy, 2013a).
Des problèmes d’osmorégulation après une exposition de Sebastiscus marmoratus à des
HAP dissous ont pu être observés (Li et al., 2011). Les HAP inhiberaient l'activité Na+/K+ de
manière dose dépendante et joueraient un rôle dans l'osmorégulation.
6) Le comportement
La réponse comportementale d'un animal suite à une exposition à un stress et/ou à un ou
des contaminants est de plus en plus étudiée (Ali et al., 2011b; Chen et al., 2011; Egan et al.,
2009; López-Patiño et al., 2008; Sackerman et al., 2010).
Le comportement permet de discriminer un grand nombre de variables intégratrices des
changements induits par les HAP. On peut évaluer l’activité de nage, mais aussi d’autres aspects
comme la léthargie, l’anxiété, la communication sociale, le comportement alimentaire, la réponse
de fuite, l’apprentissage ou le comportement reproducteur.
On observe une activité de nage réduite chez la dorade (Sparus aurata), après une
exposition de 4 jours a des HAP dissous (Correia et al., 2007): le phénanthrène, le fluorène, le
pyrène, ou les 3 (Gonçalves et al., 2008). Une augmentation de la léthargie et une réduction du
nombre de montées à la surface ont également été constatées après une exposition à des HAP
dissous chez cette espèce (Correia et al., 2007; Gonçalves et al., 2008).
Ces variables peuvent en outre servir à évaluer les effets neurotoxiques d’un contaminant.
La réduction des interactions sociales suite à une exposition au phénanthrène (Gonçalves et
al., 2008) est avérée.
La capacité à capturer des proies après une exposition de salmonidés (Salminus
brasiliensis) au naphtalène et au phénanthrène est réduite (Carvalho et al., 2008). Cette altération
de l'efficacité de capture est importante (46% pour les contrôles et 13% pour les exposés) chez
cette même espèce. Elle pourrait être en partie expliquée par le fait que le phénanthrène réduirait
la vision (Carvalho et al., 2008). D'autres espèces de poissons sont concernées par ces altérations.
Par exemple, chez Leiostomus xanthurus Lacépède, qui mange du sable pour récupérer ses proies
cachées à l'intérieur, doit augmenter le nombre de ses attaques pour attraper autant de nourriture
que les contrôles lorsque le sédiment est contaminé avec des HAP (diesel) (Hinkle-Conn et al.,
1998).
48
La réponse de fuite, en présence de fluoranthène, a été mise en évidence chez des poissons
contrôles (Farr et al., 1995). Les poissons sont placés dans un aquarium à double flux. Un flux
d’eau contrôle et un flux d’eau contenant du fluoranthène sont présents. Les poissons n’ayant
jamais été exposés fuient le fluoranthène. En revanche, les poissons ayant été préalablement
exposés à une forte dose de fluoranthène ne fuient plus la molécule (Farr et al., 1995).
Les capacités d'apprentissage et d'exploration se trouvent diminuées après une exposition à
des HAP. Par exemple, la discrimination d'un objet familier est altérée chez la souris (Sheng et al.,
2010) exposée au BaP. Dans le même registre, une exposition par voie alimentaire de la mère à un
mélange contenant les 16 HAP prioritaires de l’USEPA conduit à une altération du comportement
à la génération suivante, notamment en environnement nouveau (Crépeaux et al., 2012).
Le comportement reproducteur peut également être perturbé. L'aptitude d'un mâle à trouver
une femelle peut être altérée (Krång, 2007), comme c'est le cas chez des amphipodes par exemple.
7) La reproduction
Les HAP sont des molécules lipophiles qui sont transportées et qui se retrouvent dans les
ovaires via la vitellogénine (Montverdi and Di Giulio, 2000) et/ou la lipovitelline (Lee, 1993). Ils
peuvent également entraîner une inhibition de la synthèse de vitellogénine, comme cela a déjà été
montré chez la truite après une exposition au β-naphtoflavone (Anderson et al., 1996). Cette
exposition compromet la maturation des ovaires et provoque une augmentation de l'apoptose dans
les cellules gonadiques (Marty et al., 1997). Ces polluants entraînent, par exemple, une inhibition
de la reproduction chez les crevettes exposées au pyrène (Oberdörster et al., 2000). Une
diminution de la fécondité, du nombre de cycles reproducteurs et de la survie des larves (Kime,
1995) est observée chez différentes espèces de poissons. Chez les moules, les gamètes sont
déformées et elles sont présentes en nombre réduit (Eertman et al., 1995).
Les femelles ne sont pas les seules à être touchées. En effet, la qualité du sperme du mâle
peut également être altérée après une exposition à du benzo[b]fluoranthène, comme c'est le cas
chez des souris exposées via le lait maternel (Kim et al., 2011). La qualité du sperme est réduite,
et on observe également une augmentation de l'apoptose testiculaire.
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V Plan et objectifs de la thèse
Cette thèse s'inscrit dans le projet ANR ConPhyPOP qui a débuté en janvier 2010.
1) Projet ConPhyPOP
Le projet ConPhyPOP (Contamination et Physiologie des Poissons exposés à des
Polluants) est un projet de recherche fondamentale financé par l’Agence nationale de la recherche
(ANR) qui regroupe 8 partenaires : l’IFREMER, l'Université de Bordeaux avec les Laboratoires
de Physico et Toxico-Chimie des systèmes naturels (LPTC) et des Maladies Rares : Génétique et
Métabolisme (MRGM), l’Université de La Rochelle avec l'UMR LIENSs, l'Université du Havre
avec le Laboratoire d’Ecotoxicologie des Milieux Aquatiques (LEMA), le laboratoire
Macrophages et Développement de l'Immunité de l’Institut Pasteur (MDI), l'INRA avec l’Oniris
(UMR703) et le Laboratoire de Physiologie et de Génomique des Poissons (LPGP) de Rennes.
Ce projet avait pour objectif de caractériser les effets physiologiques d'une exposition à des
fractions de HAP à différents âges et durant tout le cycle de vie des poissons. Les effets d'une
fraction pyrolytique et de deux fractions pétrogéniques ont été évalués sur différentes variables
réparties en 8 tâches (Figure 16). Les poissons ont été analysés à différents stades de vie ainsi que
la descendance. Les expositions ont été réalisées principalement par voie trophique et de manière
chronique. Quelques-unes ont été réalisées par voie sédimentaire pendant une période
correspondant au développement de l'embryon. Dans les deux cas, le but recherché était de
caractériser les effets à long terme d'une exposition. Le Danio rerio constitue le principal modèle
utilisé pour cette étude. Les indicateurs pertinents seront généralisés dans une étude comparative
entre les embryons de médaka et de truite arc-en-ciel, deux espèces couramment utilisées pour les
tests de toxicité.
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Figure 16 : Les 8 tâches du projet ConPhyPoP et objectifs ou fonctions étudiés (fushia).
T1 : contamination, T2 : exposition des poissons, T3 : biodisponibilité, bioaccumulation et
biotransformation, T4 : ontogénèse, T5 : intégrité fonctionnelle, T6 : reproduction et transfert
maternel, T7: génotoxicité et tumorigénèse et T8 : test de toxicité embryonnaire
2) Objectifs de la thèse
Cette thèse a été proposée de manière à répondre à un certain nombre de questions et
d'objectifs (Figure 17) :
- Caractériser et comparer les effets d'une exposition à 3 fractions de HAP au niveau de la
croissance, de la survie, du comportement, de la reproduction et du transfert maternel (Figure 16
fushia).
- Essayer de comprendre les mécanismes et l'impact de ces effets au niveau moléculaire,
individuel et populationnel pour replacer l'étude dans un contexte environnemental.
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- Mélanges de HAP représentatifs de l'environnement
- Exposition via le sédiment ou l’aliment
- Exposition précoce de courte durée
- Exposition chronique
- Effets à long termes tout au long du cycle de vie
Immunité
Comportement
Métabolisme
Osmorégulation
Reproduction
Population
Malformations
Croissance
Génotoxicité
Tumorigénèse
Survie
individuelle
Figure 17 : Objectifs de la thèse.
Sept variables ont été choisies pour étudier les effets de 3 fractions (PY, HO et LO) et l’impact éventuel sur la population et la survie
individuelle. Les variables avec un fond plein sont celles qui ont été étudiées en profondeur dans cette thèse, les autres variables ont fait l’objet
de travaux dans le cadre du projet ConPhyPoP.
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53
54
MATERIELS ET METHODES
Dans ce chapitre, les fractions utilisées, puis le modèle d'étude choisi seront présentés. Par
la suite, une pré-sélection de la lignée de poisson zèbre sera faite, ainsi que le choix du mode
d’exposition. Puis une présentation de la mise en place des tests sera détaillée. Enfin, il nous a
paru important d’avoir un point de contrôle du caractère anxiogènique ou anxiolytique de nos
molécules qui nous permette de valider notre méthode : c’est ce qui va être présenté dans la
dernière partie de ce chapitre.
I Fractions étudiées
Dans le cadre de cette thèse, nous avons utilisé des fractions d'origines différentes : une
origine pyrolytique et deux origines pétrogéniques.
1) La fraction pyrolytique
La fraction pyrolytique a été extraite à partir d’un sédiment prélevé dans la Seine. En effet,
la Seine et son estuaire sont des sites très pollués et donc étudiés pour leur forte contamination
(Cailleaud et al., 2009; Fernandes et al., 1997). La proximité de Paris, les nombreuses villes et
industries bordant ce fleuve, ainsi que la forte activité agricole et urbaine (qui représente environ
25% de l'activité nationale) font subir à ce fleuve une forte pression anthropique constante.
Lors de l'échantillonnage, les deux premiers centimètres de la couche oxique de sédiment
ont été prélevés car c'est la couche la plus concentrée en HAP (Wilcock et al., 1996). Le
prélèvement a eu lieu dans la zone intertidale, sur la commune de Oissel (GPS : 46°11’55.65’’N et
1°12401.54’’O), située en aval de la ville de Rouen en Mars 2010 (Figure 18).
La marée va jusqu'à Poses (Figure 18) (Guezennec and Dupont, 1998) et le sédiment a été
prélevé à marée descendante. Cependant ce site n'est pas soumis à des variations de la salinité. En
effet, l'influence saline s'arrête au niveau de Cadebec-en-Caux, bien avant Oissel (Figure 18). Le
sédiment est de type vaseux à cet endroit. Ce site a été choisi car il est suivi depuis plusieurs
années. Une embryotoxicité même à de faibles concentrations a été observée à Oissel (Cachot et
al., 2006). Des études ont montré que les concentrations en B[a]P présentes dans les animaux
induisaient des dommages à l'ADN importants (Akcha et al., 2003; Cachot et al., 2006).
55
Le Havre
Rouen
Oissel
Yville
-surSeine
Poses
Paris
Figure 18 : Localisation du site de prélèvement du sédiment PY en mars 2010 sur la Seine,
en aval de la ville de Rouen.
L'extraction et la purification de la fraction aromatique réalisées à partir du sédiment
prélevé constitueront la fraction pyrolytique (PY) dans cette étude. Ce travail d’analyse chimique
et de dopage du sédiment a été réalisé au Laboratoire de Physico-Toxico Chimie de
l’environnement de Bordeaux 1 (LPTC). Il représente une part très importante du projet, qui a été
déterminante pour les expositions réalisées au cours de ce travail de thèse.
2) La fraction pétrogénique "fuel lourd"
La fraction appelée fuel lourd dans cette étude provient du pétrole déversé suite à
l'échouage de l'Erika le 11 décembre 1999. Une avarie est à l'origine de cette catastrophe. Le
bateau, pris dans une tempête, se brise en deux et coule dans les eaux internationales, à une
trentaine de milles au sud de la pointe de Penmarc'h (Finistère, France). Le tonnage déversé est
estimé à 20 000T. Il a été impossible d'utiliser du dispersant chimique, car les propriétés physicochimiques de ce fuel lourd ne le permettaient pas. Le pétrole a été en partie contenu et pompé, et le
reste a dérivé et s'est échoué le long des côtes françaises (Figure 19).
56
Figure 19 : Site du naufrage de l'Erika et dispersion du pétrole sur les côtes françaises.
Sources : nappes (préfecture de Brest), trait de côte (esri) et observations côtières
Cette fraction est un fuel lourd, et, dans le cadre de notre étude, la fraction aromatique a
été purifiée. Elle sera appelée HO pour "heavy oil" par la suite.
3) La fraction pétrogénique "pétrole brut"
Cette fraction est issue du pétrole brut Arabian light, qui sert de référence pour le brut au
Moyen Orient au même titre que le West Texas Intermediate (WTI) sert de référence en Amérique
du Nord et le brut de la Mer du Nord (BRENT) en Europe. Ce pétrole est considéré comme un
pétrole léger car il a un degré de viscosité et de gravité (API) supérieur à 31.1 (classification mise
place par l'American Petroleum Institute). Ce pétrole a été choisi car il représente la plus grosse
part des réserves mondiales de pétrole.Il est donc susceptible d'être l’un des plus utilisés (Figure
20). Pour notre étude, la fraction aromatique de ce pétrole a été extraite. Elle sera nommée LO
pour "light oil" par la suite.
57
Figure 20 : Répartition des réserves mondiales de pétrole en 2007 entre l'Asie, l'Amérique
du Nord, l'Amérique du Sud et Centrale, l'Afrique, l'Europe et l'Eurasie et le Moyen Orient.
4) Caractérisation des fractions
Pour caractériser une fraction, il existe des règles. Celles-ci permettent, grâce à la
composition de la fraction et le rapport de quelques composés, de dire si la fraction est plutôt
d'origine pyrolytique ou pétrogénique.
Si on utilise le rapport phénathrène/anthracène [Phe/Ant] ainsi que le ratio
fluoranthène/pyrène [Fluo/Pyr], on peut avoir une caractérisation de la fraction. Lorsque [Phe/Ant]
est inférieur à 10 et que [Fluo/Pyr] est supérieur à 1, on est en présence d'une fraction pyrolytique.
En revanche, lorsque le rapport [Phe/Ant] est supérieur à 10 et que [Fluo/Pyr] est inférieur à 1,
c'est une fraction pétrogénique (Figure 21).
Dans un cas intermédiaire, nous serons en présence d'une fraction mixte avec un aspect
pyrolitique ou pétrogenique plus ou moins prononcé. Le rapport chrysène/benzo[a]anthracène
[Chr/BaA] peut aider à la caractérisation en cas de doute. Si [Chr/BaA] est inférieur à 1, c'est une
fraction pyrolytique, sinon elle est plutôt pétrogénique (Benlahcen et al., 1997; Cailleaud et al.,
2007; Soclo et al., 2000).
58
Figure 21 : Caractérisation de l'origine des 3 fractions utilisées selon les rapports
luoranthène/pyrène et phénanthrène/anthracène.
Les trois fractions utilisées sont conformes à cette classification (Figure 21). En effet, la
fraction PY présente un rapport moyen [Phe/Ant] de 1.87 et [Fluo/Pyr] de 1.17, caractéristique
d'une fraction pyrolytique. La fraction LO a un rapport moyen [Phe/Ant] de 82.1 et [Fluo/Pyr] de
0.14. Cette fraction présente donc les caractéristiques d'une fraction pétrogénique. Dans le cas de
notre troisième fraction, HO, le rapport moyen de [Phe/Ant] est de 6.23 et [Fluo/Pyr] est de 0.20.
Cette fraction se retrouve donc dans la case mixte (Figure 21). Afin de déterminer l'origine
principale, nous appliquons le troisième rapport, chrysène/benzo[a]anthracène [Chr/BaA], qui
donne une moyenne de 1.94. Ce dernier rapport étant supérieur à 1, cette fraction présente des
caractéristiques plutôt pétrogéniques.
5) Composition des fractions
Après avoir validé le fait que les fractions sont bien conformes aux extraits initiaux, nous
allons maintenant décrire plus en détails leur composition (Figure 22). Les composés ont été
répartis en 7 groupes. Les 5 premiers groupes rassemblent les composés parents selon leurs
nombres de cycles aromatiques. Nous avons donc les groupes suivants : 2, 3, 4, 5 et 6 cycles.
59
Cependant, les composés parents se retrouvent parfois affublés de groupement alkylé sur l'un de
leur cycle. Ces réactions sont souvent liées à une réaction en chaine avec des produits de réactions
non maîtrisés. Dans le cadre de notre étude, nous étudierons deux dérivés du naphtalène, 4 dérivés
du phénanthrène et 2 dérivés de l'anthracène. Plus précisément, ce sera le 1-méthylnaphtalène, le
2-méthylnaphtalène,
le
1-méthylphénanthrène,
le
2-méthylphénanthrène,
le
3-
méthylphénanthrène, le 9-méthylphénanthrène, le 1-méthylanthracène et le 2-méthylanthracène
qui seront analysés en deux groupes : les méthylnaphtalène (MN) et les méthylanthracène +
méthylphénanthrène (MA+MP).
100%
90%
80%
MA+MP
70%
MN
60%
6R
50%
5R
40%
4R
30%
3R
20%
2R
10%
0%
PY
HO
LO
Figure 22 : Composition des 3 fractions.
Les molécules non méthylées sont représentées en gris, nuancées du plus clair (pour les composés
présentant 2 cycles) jusqu'au gris très foncé (pour celles ayant 6 cycles). Les composés méthylés
sont indiqués en orange clair pour les MN et orange plus foncé pour les MA+MP (Fig 24).
MA+MP ont été considérés ensemble car on ne peut pas les séparer pour les identifier.
Les 3 fractions utilisées dans cette étude présentent des origines et des compositions très
différentes.
La fraction PY est principalement composée de HAP avec 3, 4 et 5 cycles benzéniques
(87%). C'est aussi la fraction qui a le plus de molécules à 6 cycles (5%). En revanche, elle
présente très peu de composés méthylés (5%) et de composés à 2 cycles benzéniques (3%).
La fraction HO est composée d'un grand nombre de méthylés qui la caractérise à 46%. Elle
présente une proportion équilibrée de molécules à 2 et 3 cycles (respectivement 11 et 12%) et
60
moitié moins de HAP à 4 cycles que la fraction PY (23%). Les HAP à 5 et 6 cycles sont
faiblement représentés (8%).
La fraction LO est principalement composée de méthylés (59%) et de HAP à 2 cycles
(28%). Les molécules de 3, 4 et 5 cycles sont très peu représentés dans cette fraction (13%) et il
n'y a pas de composé à 6 cycles.
Ces trois fractions présentent un taux de composés HAP (de 41 à 95%) et de HAP
méthylés (de 5 à 59%) très variables, et seront donc représentatifs de mélanges de HAP différents.
6) Contamination du sédiment et des aliments
Des expositions ont été réalisées selon deux modalités représentatives de situations
environnementales. Dans un premier temps, l'enrobage d'un sédiment propre de référence a été
effectué. Pour des raisons pratiques et en raison des difficultés rencontrées lors de ces enrobages,
un mélange de 3 HAP individuels a été utilisé plutôt que les fractions décrites précédemment. La
concentration visée est 3 fois plus élevée que celle relevée dans le sédiment prélevé à Oissel, à
savoir 10 µg/g pour les 16 HAP indicateurs de l'USEPA (Tableau 2).
Tableau 2 : Concentrations visées et obtenues dans le cadre de la contamination par
sédiment
Contrôle
3X visée
3X
rendement obtenu (%)
Phénanthrène
3 0.2
2700-2800
2126 57.6
69
Pyrène
4 0.8
2300-2400
1649 58.9
77
Benzo[a]pyrène
1 0.1
1200-1300
633 69
76
La seconde modalité d'exposition a été réalisée par voie trophique. Dans ce cas, les trois
fractions présentées précédemment ont été utilisés pour enrober de l'aliment. Trois concentrations
ont été utilisés : 0.3X, 1X et 3X. Elles seront nommées conditions par la suite. La dose visée pour
la concentration 1X correspond à ce qui est mesuré dans les mollusques de l'estuaire de la Seine et
est égal à 5 µg/g d'aliment en poids sec pour les 16 HAP indicateurs de l'USEPA (Tableau 3).
61
Tableau 3 : Concentrations utilisées dans le cadre de la contamination par aliment
Mixture
Concentration Σ[16 EPA PAH]
Total PAHs concentration
PY food
1X
4505 ± 1527
5816 ± 1433
HO food
1X
1887 ± 130
4663 ± 360
LO food
1X
2739 ± 231
6726 ± 278
II Modèle d'étude
A l'heure actuelle, de nombreuses espèces de poissons, d'eau douce ou marine, sont
particulièrement étudiées dans un contexte écotoxicologique ou non, pour des raisons
économiques et/ou pratiques. En effet, en France, la sole (Solea solea) (Wessel et al., 2010), le
saumon (Oncorhynchus gorbuscha), la dorade (Sparus aurata) et le bar (Dicentrarchus labrax)
(Benhaim, 2011; Danion et al., 2011) sont des espèces marines très suivies sur la côte Atlantique.
Selon les pays, leurs situations géographiques et les habitudes alimentaires, les études vont
également plutôt porter sur le saumon (Oncorhynchus gorbuscha) (Moles and Rice, 1983; Rice et
al., 2001), sur le vairon tête de boule (Fathead minnow) (Pimephales Promelas) (Colavecchia et
al., 2004; Farr et al., 1995) ou sur la morue (Gadus morhua) (Aas et al., 2000). Dans le cas des
poissons d'eau douce, la truite (Oncorhynchus mykiss) est un poisson très étudié (Anderson et al.,
1996; Cotter and Rodnick, 2006). Pour la recherche fondamentale, c'est au médaka japonais
(Oryzias latipes) (Chikae et al., 2004; Farwell et al., 2006; Horng et al., 2009; McElroy et al.,
2006; Mueller and Neuhauss, 2010), au killifish (Fundulus heteroclitus) (Patel et al., 2006), et au
poisson zèbre (Danio rerio) (Alexandre et al., 2010; Dickmeis et al., 2007; Parichy, 2006; Wan et
al., 2006; Zhdanova, 2006) que les études sont consacrées.
Dans le cadre de notre étude, nous avons choisi le poisson zèbre comme modèle, en raison
de son cycle de vie rapide et maîtrisé, et de la transparence de ses œufs notamment. Dans un
premier temps, nous verrons sa classification, ses origines et son mode de vie. Dans un second
temps, les différents stades de vie de ce poisson seront décrits. Par la suite nous nous intéresserons
à sa reproduction, puis aux expériences de laboratoire déjà réalisées avec ce poisson.
1) Le poisson zèbre (Danio rerio)
Le poisson zèbre est un téléostéen de la famille des Cyprinidés, qui regroupe le plus grand
nombre d'espèces d'eau douce (Meyer et al., 1993) (Figure 23). Ce poisson d’eau douce a été mis
62
en avant par George Streisinger, qui est considéré comme le père fondateur de la recherche sur la
génétique et sur le développement du poisson zèbre. Il sera suivi dans cette voie par Charles
Kimmel et Monte Weterfield, qui avec leur équipe de l'université de l'Orégon, vont participer à
l’essor du poisson zèbre comme modèle de recherche.
Embranchement
Cordés
Sous classe
Actinoptérygiens
Ordre
Cypriniformes
Famille
Cyprinidae
Genre et espèce
Danio rerio
Figure 23 : Classification du poisson zèbre et répartition géographique (Spence et al., 2008)
Ce poisson est originaire d'Asie et plus particulièrement des affluents du Gange et du
Brahmapoutre (Figure 23). On le trouve majoritairement dans le nord-est de l’Inde, au Bengladesh
et au Népal. Il vit dans les eaux peu profondes, à débit et profondeur faibles. Il est souvent associé
aux rizières où il régule les populations de moustiques présentes dans ces milieu humides en
mangeant leurs œufs (Spence et al., 2008).
Il est omnivore, et mange du zooplancton, des insectes, du phytoplancton, des algues
filamenteuses, des plantes vasculaires, des spores, des œufs et des détritus. Ce poisson se nourrit
également de ses propres œufs et de ses juvéniles (Spence et al., 2008). Il mesure
approximativement 3 cm à l'âge adulte et vit environ 4 ans. Dans le milieu naturel, il possède des
prédateurs (Spence et al., 2008) qui sont présentés en Figure 24.
Figure 24 : Prédateurs naturels du poisson zèbre Channas spp à gauche et Xenentodon
cancila à droite.
63
A l’âge adulte, il présente un dimorphisme sexuel (Figure 25). La femelle a un ventre plus
bombé que le mâle. Ce dernier possède une couleur jaune plus marquée. La présence de rayures
horizontales sur son corps ont fait de lui une espèce d'ornementation pour les aquariophiles. En
milieu naturel, le poisson zèbre présente une reproduction saisonnière en mousson d'été. En
laboratoire, maintenu dans des conditions estivales, il peut se reproduire toute l'année (Lawrence,
2007).
Figure 25 : Dimorphisme sexuel chez le poisson zèbre.
2) Stades de vie
Le comportement reproducteur est déclenché par l'allumage de la lumière. La femelle
libère les ovocytes qui seront fécondés par le mâle. Les œufs pondus sont protégés par un chorion
assez fin et leur développement présentent 8 périodes distinctes (Kimmel et al., 1995).
0 et 0:45 heures post fécondation (hpf). C'est la phase zygote durant laquelle la fertilisation
active les mouvements du cytoplasme.
0:45 à 2:15 hpf. Phase de clivage (Figure 26). La première division (stade 2 cellules)
apparaît environ 45 minutes après la fécondation. Puis on assiste à une division toutes les 15
minutes environ.
2:15 à 5:15 hpf. Phase de blastula qui apparaît au bout de 6 divisions, c'est-à-dire une fois
le stade 64 cellules atteint. C'est au cours de cette phase que débute l’épibolie. C'est un processus
de recouvrement du vitellus par l'embryon. A ce stade, on ne distingue plus les cellules.
64
5:15 à 10 hpf. Période de gastrulation (Figure 26). Les axes embryonnaires se mettent en
place. Cette période prend fin lorsque l’épibolie est complète et que le bourgeon caudal est formé.
10 à 24 hpf. La période de segmentation au cours de laquelle se mettent en place les
somites et des ébauches d'organes. Le bourgeon caudal devient proéminent et les premiers
mouvements du corps sont visibles. A ce stade, il s’agit de contractions saccadées et non
coordonnées.
24 à 48 hpf. La phase de pharyngula se met en place avec le développement des arcs
pharyngiaux, l’apparition de la pigmentation et de la circulation sanguine grâce à la carotide et à la
veine cardinale.
48 à 72 hpf. C'est la période d'éclosion (Figure 26). Les branchies, la mâchoire et les
nageoires se développent.
Apres 3 jours post fécondation (jpf), la période larvaire débute. C'est la dernière période du
développement. La croissance continue rapidement mais la morphogénèse est complète et le
poisson est formé (Kimmel et al., 1995; Nüsslein-Volhard and Dahm, 2002). La respiration et la
vision sont fonctionnelles mais immatures. Les premières cellules gonadiques apparaissent à 72
hpf. La larve mesure alors approximativement 3,5 mm. Cette période dure 27 jours pendant
lesquels la larve grandira jusqu’à 7 mm. La bouche s’ouvre à 4/5 jpf et 4 bandes de pigments noirs
apparaissent (dorsalement, latéralement, ventralement et sur le sac vitellin). Une réponse optique
est observée à 72 hpf et à 4 jpf le système visuel est égal à celui des adultes (Nüsslein-Volhard and
Dahm, 2002). La mise en place du système olfactif se fait à 4 jpf. Un début de réponse d’équilibre
est visible à 4 jpf. Le goût apparaît à 5 jpf et le système gustatif est très élaboré. Au départ, les
embryons respirent grâce à la respiration cutanée exclusivement. Puis la respiration branchiale
prend le relais petit à petit jusqu’à devenir complètement mature et indispensable à 21 jours.
Après un mois d'élevage, les alevins atteignent environ 1 cm. Ce sont des juvéniles.
Aux alentours de 3 ou 4 mois post fécondation, les animaux sont matures et capables de se
reproduire (Figure 26). Ce développement rapide permet de réaliser des études transgénérationnelles qui ne peuvent pas être étudiées chez beaucoup d’espèces aussi facilement.
65
Figure 26 : Cycle de développement du poisson zèbre.
3) Reproduction : de la mise en place jusqu'à la ponte
Les poissons zèbres naissent hermaphrodites avec une gonade dite "ovary-like". Cette
gonade est composée de cellules germinales de stade I et II (Kallivretaki et al., 2007; Maack and
Segner, 2003). Vers 24 jours post fécondation (jpf), la gonade se différencie pour devenir mâle ou
femelle et se développer. Chez les poissons qui vont devenir mâles, Uchida et al. ont montré une
apoptose cellulaire très importante entre 23 et 33 jpf (Uchida et al., 2002). Chez les femelles, on
observe comparativement moins d'apoptose. Autour de 7 semaines après fécondation, on note la
présence de spermatocytes, puis les semaines suivantes, l'apparition des spermaties (Figure 27).
66
Figure 27 : Evolution des gonades et apoptose lors de la mise en place de la reproduction.
La largeur de chaque diamant représente le nombre de cellules en apoptose gonadique. Modifié
d'après (Uchida et al., 2002). Dpf: day post fertilization.
Une fois la maturité atteinte, la reproduction dépend de la disponibilité en nourriture
(Spence et al., 2008) mais aussi des paramètres physico chimiques du milieu (Lawrence, 2007).
Maintenus dans des conditions idéales de température et nourris ad libitum, ces poissons seront
capables de se reproduire de manière régulière. En effet, une femelle peut pondre entre 50 et 300
œufs par semaine durant une période totale environ égale à 1 an (Lele and Krone, 1996; Spence et
al., 2008).
4) Expériences en laboratoire
Depuis G. Streisinger, le génome du poisson zèbre a été entièrement séquencé et de
nombreux laboratoires se sont mis à utiliser le poisson zèbre. On compte à ce jour 875 laboratoires
inscrit dans la base ZFIN (http://zfin.org/).
Cet organisme modèle, robuste, est facilement élevé à moindre coût en laboratoire. Il a su
trouver sa place dans le monde de la recherche. Sa maturité relativement rapide (aux alentours de
3 mois post fécondation (mpf)) et la transparence de ses œufs et de ses larves aux stades les moins
avancés, représente un gros avantage pour étudier le développement qui peut être suivi étape par
étape simplement sous une loupe binoculaire (Kimmel et al., 1995).
67
A l'heure actuelle, ce poisson est devenu un modèle d'étude connu et reconnu au même
titre que la souris, le rat ou encore la drosophile. Il est utilisé dans un grand nombre de domaines.
Ce modèle est employé en biologie du développement et dans le domaine de la génétique,
par exemple. Les progrès ont été en partie réalisés sur ce poisson. Il est ajourd'hui possible
d'inactiver un gène en injectant des oligonucléotides morpholinos spécifiques à un gène
(Nasevicius and Ekker, 2000).
L'utilisation de mutants, est, là aussi, très répandue. Un crible suite à une mutagénèse a
permis d'identifier 4264 mutants dont 894 ont été assignés à 372 gènes impliqués dans le
développement de différentes structures (Brand et al., 1996; Haffter et al., 1996; Van Eeden et al.,
1996). La fonction de certaines protéines et même de certains organes sera mieux comprise grâce
à ces mutants (Brand et al., 1996; Camarata et al., 2009; Weinberg et al., 1996). La plupart d’entre
eux ne sont toutefois pas viables à l'état homozygote. Certains de ces poissons sont mutés sur le
gène de la maladie, tel que, par exemple, sauternes (sau) et yquem (yquem), pour suivre et
caractériser les troubles hématopoïétiques, les problèmes rénaux (Dooley and Zon, 2000), ou les
problèmes cardiovasculaires. En effet, pour le dernier cas, on sait que le cœur du poisson zèbre est
similaire au cœur humain après trois semaines de gestation (Warren and Fishman, 1998).
Les lignées transgéniques sont également utilisées, notamment afin d’étudier le
développement d'organes comme le pancréas (Wan et al., 2006) ou certains types cellulaires
comme des neurones (Higashijima, 2008). Ces lignées transgéniques présentent un intérêt pour un
type de recherches spécifiques. Elles expriment une protéine fluorescente (ex : GFP) qui permet
sous contrôle de promoteurs tissus spécifiques, de visualiser, par exemple chez les cyp19a1b:gfp,
l'expression dans les cellules gliales du cerveau dans les larves ou les cellules germinales chez les
vasa (Fan et al., 2008).
Dans le domaine du comportement, le poisson zèbre est utilisé à tous les âges (MacPhail et
al., 2009; Péan et al., 2013). Par exemple, il est décrit dans des études comme étant utilisés pour
des tests de discrimination de lignées (de Esch et al., 2012; Spence et al., 2011), de réponse
comportementale face à un contaminant (Darland and Dowling, 2001), de caractérisation des
mutations (Brockerhoff et al., 1995), de caractérisation et de réponse au stress (Champagne et al.,
2010), ou d'études du rythme circadien (Del Pozo et al., 2011) entre autres.
En neurologie, des études ont été réalisé sur la latéralité (Barth et al., 2005), sur la
formation du cerveau (Brand et al., 1996) et sur les neurotransmetteurs (Buske and Gerlai, 2011;
68
Scerbina et al., 2012). D'autres, sur la distribution des cellules gliales (Lucini et al., 2010) ou
encore l'expression de divers gènes (Pan et al., 2012) se sont développées.
Le développement d'un grand nombre d'outils rend le poisson zèbre très efficace dans un
domaine comme l'écotoxicologie. C'est ainsi que les lignées transgéniques ont permis de mettre en
évidence des mécanismes de toxicologie, par exemple grâce à l'utilisation de la lignée
transgénique cyp19a1b:gfp (Brion et al., 2012). Ces lignées auraient également une application en
tant qu'indicateurs d'expositions à un contaminant (Carvan III et al., 2000). Les mutants et les
morphants ont contribué à la compréhension de mécanismes, comme par exemple celui de l'AhR
(Knecht et al., 2013; Prasch et al., 2003). Le séquençage du génome a ouvert les portes de
l'analyse d'expressions de gènes en présence des HAP (Holth et al., 2008) et a permis de mettre en
avant une tératogénicité (Matson et al., 2008). Avec l'aide du comportement, la neurotoxicité des
composés peut également être estimée (Cachat, 2013; Egan et al., 2009) et la maîtrise de la
reproduction permet d’évaluée la reprotoxicité des composés (Baudiffier, 2012; King Heiden et
al., 2009). Enfin, le cycle de vie court du poisson zèbre permet de mesurer les effets
transgénérationels (Lucas et al., submitted; Péan et al., 2013)
III Lignées de poisson zèbre (article 1)
Au-delà des lignées mutantes ou transgéniques, il existe dans le monde quelques dizaines
de lignées de poisson zèbre dites "sauvages". Les fondateurs de ces lignées ont été prélevés dans le
milieu naturel ou simplement achetés en animalerie. Par la suite, les lignées ont été établies en
général en sélectionnant des caractères tels que robustesse et fertilité et notamment en comparant
des lignées.
Parmi ces lignées sauvages on trouve les lignées WIK, TU et AB, qui sont couramment
utilisées. La comparaison du comportement des individus de ces lignées de laboratoire avec celui
des lignées plus récemment établies, sans sélection spécifique, a mis en évidence des différences
(Anchelin et al., 2011; Coe et al., 2009; Lockwood et al., 2004; Loucks and Carvan III, 2004;
Maack et al., 2003; Ninkovic and Bally-Cuif, 2006; Sackerman et al., 2010). Ceci indique que la
sélection réalisée volontairement ou non sur les lignées de laboratoires a conduit à la sélection de
certains traits comportementaux. La marque de la domestication progressive de ces lignées est
observée avec, par exemple, la diminution de comportements tels que la fuite.
La lignée TU (ZFIN ID : ZDB-GENO-990623-3) existe depuis les années 1990. Elle a été
établie à Tübingen en Allemagne après avoir été achetée dans une animalerie. La lignée AB (ZFIN
69
ID : ZDB-GENO-960809-7) est issue de deux souches, A et B croisées en 1970 à Eugene et
provenant d’une écloserie en Floride. En 1991, après 70 générations, Georges Streisinger et
Charline Walker, au sein de la Zebrafish Internationnal Ressource Stock Center (ZIRC) en Orégon
aux Etats-Unis, ont établi une lignée dérivée de la première et nommé starAB, aujourd'hui appelée
AB.
Dans notre laboratoire, nous possédons deux types de lignées sauvages, AB et TU, qui ont
fait l’objet d’une étude plus poussée présentée ci-après. Nous possédons également quelques
lignées transgéniques qui ont été utilisées dans le cadre de ce projet; les cyp19a1b:gfp et les vasa.
Les poissons zèbres sauvages sont couramment utilisés dans les tests comportementaux.
Mais, le terme sauvage n'est pas une description précise et correspond à différentes lignées (par
exemple AB, TU, WIK et lignées récemment acclimatées). Des études antérieures ont comparé les
caractéristiques physiologiques, comportementales ou métaboliques des différentes lignées de
poisson-zèbre (les populations autochtones sauvages contre les souches de type sauvage de
laboratoire). AB et TU sont deux lignées largement utilisées, mais au moins une étude a démontré
des différences de comportement entre elles (Ninkovic and Bally-Cuif, 2006). Pour choisir la
lignée la plus appropriée pour nos expériences, nous avons réalisé de manière systématique des
tests comportementaux de poissons AB et TU. Nous avons analysé l'activité basale de la
locomotion et des réponses à un challenge de lumière/obscurité chez les larves et les adultes.
Ensuite, nous avons testé le comportement exploratoire et le conditionnement à la couleur chez les
adultes. Ces tests ont été réalisés à plusieurs âges pour évaluer différents processus
comportementaux.
Des différences ont été observées pour tous les tests, les lignées affichant un
comportement différent selon les tests. Au niveau des larves, les TU ont affiché un plus large
éventail d'activités que les larves AB lors de l'apparition du comportement locomoteur. Chez les
adultes, les TU étaient plus réactifs aux transitions lumineuses et avaient une locomotion plus
rapide dans le labyrinthe en T. Les poissons AB avaient un rythme circadien moins contrasté mais
ont obtenu de meilleurs résultats dans l'apprentissage des
couleurs. Les réponses
comportementales sont spécifiques à la lignée et il faut en tenir compte pour concevoir des
expériences de comportements.
70
Systematic screening of behavioural responses in two zebrafish strains
Caroline Vigneta, Marie-Laure Bégoutb, Samuel Péanb, Laura Lyphoutb, Didier Leguayb and
Xavier Cousina,c
a
Ifremer, Laboratoire d'Ecotoxicologie, Place Gaby Coll, BP 7, 17137 L’Houmeau, France
b
Ifremer, Laboratoire Ressources Halieutiques, Place Gaby Coll, B.P. 7, 17137 L’Houmeau,
France
c
INRA LPGP, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes, France
Corresponding author: Xavier Cousin
Ifremer, Laboratoire d'Ecotoxicologie, Place Gaby Coll, BP 7, 17137 L’Houmeau, France
Tel: +33 5 46 50 06 21
Fax: +33 5 46 50 06 50
[email protected]
Abstract
Wild-type zebrafish are commonly used in behavioural tests but the term wild-type is not a
precise description, and corresponds to many different strains (e.g. AB, TU, WIK and others).
Previous studies compared the physiological, behavioural or metabolic characteristics of different
zebrafish strains (indigenous wild-type populations versus laboratory wild-type strains). AB and
TU are widely used but at least one study has demonstrated behavioural differences between them.
To choose the most appropriate strain for our experiments, we systematically screened behavioural
responses of AB and TU fish in several assays. We analysed locomotion activity and responses to
a light/dark challenge in adults and larvae, and exploratory behaviour and colour conditioning in
adults. Differences were observed for all tests, the strains displaying particular behaviour
depending on the tests. As larvae, TU displayed a wider activity range than AB larvae at the onset
of locomotor behaviour; as adults, TU were more reactive to sudden light transitions and
recovered swimming activity faster in T-maze or homebase release in novel tank tests, whereas
AB fish had more contrasted circadian rhythms and performed better in colour learning. Strainspecific behaviour should be considered when designing experiments using behaviour.
71
Introduction
Quantitative behaviour analysis is now considered to be a good indicator of organism
responses. Indeed, behavioural responses can be used to evaluate effects of a wide set of stimuli or
stressors (e.g. chemicals, particular situations) in studies of pharmacology, toxicology and
ecotoxicology, and/or in cognition or neurobiology. The use of model fish species, such as medaka
or zebraﬁsh, has developed exponentially over the last decade and their use in these contexts is
now widely accepted (Champagne et al.; Creton, 2009; Norton and Bally-Cuif, 2010; Steenbergen
et al., 2011). These model species have the advantage that they allow the combined analysis of an
individual’s physiology and molecular mechanisms (Hill et al., 2005; Hinton et al., 2005;
Spitsbergen and Kent, 2003). Furthermore, in the particular context of ecotoxicology, individual
responses correspond to the interface between ecological factors and toxicity mechanisms, making
individual behaviour a particularly relevant and integrative indicator of the effects of pollutants
(Blechinger et al., 2007; Hinton et al., 2005; Linney et al., 2004; MacPhail et al., 2009; Scherer,
1992).
Most published papers report the use of wild-type (WT) strains of zebrafish. This general
term includes numerous strains with variously long laboratory breeding histories (e.g. AB, TU,
TL, WIK, and TM1) and also fish obtained from commercial suppliers (e.g. Scientific Hatcheries
and pet-shops) or directly from the wild, such as Nadia, Gaighatta, and Bangladesh (Benner et al.,
2010; Drew et al., 2012; Moretz et al., 2007a; Oswald and Robison, 2008; Robison and Rowland,
2005; Soffker et al., 2012; Spence et al., 2011; Zala et al., 2012). Only genetically defined
laboratory lines (including AB and TU) will be thereafter named strains while fish obtained from
the wild or commercially available for which no information on genetics is available, will be
respectively named wild or commercial populations. Several reports, mostly comparing laboratory
strains to wild-caught and/or commercial populations, revealed differences in behaviours (BarbaEscobedo and Gould, 2012; Benner et al., 2010; Coe et al., 2009; Dlugos and Rabin, 2003; Drew
et al., 2012; Egan et al., 2009; Lockwood et al., 2004; Mahabir et al., 2013; Moretz et al., 2007a;
Moretz et al., 2007b; Ninkovic and Bally-Cuif, 2006; Oswald and Robison, 2008; Robison and
Rowland, 2005; Sackerman et al., 2010; Scerbina et al., 2012; Soffker et al., 2012; Spence et al.,
2011; Vital and Martins, 2011; Winter et al., 2008; Zala et al., 2012). Indeed, laboratory strains
display evidence of domestication, including a loss of shoaling and anti-predator behaviours (see
for example the work of Robison's group (Moretz et al., 2007a; Robison and Rowland, 2005)).
72
We report an analysis of the behavioural differences between two well-established
laboratory strains, AB and TU. Our aim was to identify which is more suitable for behavioural
tests run in an ecotoxicology context. We monitored spontaneous swimming activity and activity
rhythm expression and recorded responses in challenging, exploration and learning situations to
detect possible differences between strains. Several well-established behavioural assays and ageand size-matched individuals from both strains were used.
Larvae and adult fish were subjected to four different behavioural challenges:
spontaneous
swimming activity was measured over 48 hours for adults and 72 hours for larvae (from 4-7 days
post fertilisation (dpf)). Reactivity was evaluated by applying a sudden dark change at the end of
locomotion recording for adults and in a specific test for 5 dpf larvae. Exploration in a novel tank
and responses in T-maze challenges, and colour learning in association with food presentation
were studied in adults.
Materials and methods
This study was conducted with the approval of the Animal Care Committee of France under
the official licence of M.-L. Bégout (17-010).
Fish strains, rearing and larvae production
We used two common laboratory strains: the AB strain (ZFIN ID: ZDB-GENO-960809-7)
derived from individuals crossed in 1970 in Eugene (Oregon, USA); and the TU strain (ZFIN ID:
ZDB-GENO-990623-3) which was established in the 90's in Tubingen (Germany). These strains
have been established in our laboratory for 6 years as large batches of individuals from Amagen
platform (Gif/Yvette, France) and Pasteur Institute fish facility (Paris, France). We used 3-12
month-old adult and 4-7 dpf larvae. Adults were maintained at 27°C in a controlled 14 hour
light/10 hour dark (14:10) photoperiod in the same rack and were fed ad libitum twice a day with
pellets (INICIO Plus 0.5, Biomar, France) between 9:00 and 9:30 in the morning and 16:30 and
17:30 in the afternoon and once with artemias (INVE) between 11:30 and 12:30. Eggs were
obtained by random pairwise mating of zebrafish. One adult male and one female were placed
together the evening before eggs were required in spawning boxes (AquaSchwarz, Germany).
Eggs were collected in the morning and the fertilisation rate assessed within two hours of
collection: only spawn with rate above 80% were kept. At the same time, spawn were sorted to
remove faeces, and dead or unfertilised embryos. To provide as homogeneous and similar
incubation conditions as possible, 50 embryos from each spawn were transferred to E3 medium.
73
All analyses with larvae were performed using a mix of an equal number of embryos (10 to 40
embryos depending on assays) from five spawns and were repeated in three independents assays.
Embryos and larvae were maintained at 28°C in Petri dishes in an incubator with the same
photoperiod as adults. After hatching, chorions were removed manually and larvae were fed with
artemias from 5 dpf onward.
Behavioural experiments
Behavioural experiments were performed using 4 or 5 dpf larvae, depending on the test
(see below) and 3-12 month-old adult males in a dedicated room kept at 27°C ± 1°C, with a 14:10
photoperiod synchronised with the rearing room so as to minimize unwanted correlated effects.
Daylight started at 08:30 and there were no twilight transition periods.
48-h swimming activity protocol and light/dark challenge in adults.
The purpose of these experiments was to monitor circadian activity rhythm (48-h
swimming activity) as well as photomotor responses used as an indicator of complex phenotypes
of stress and anxiety. For each session, fish from each strain were placed randomly (to avoid tank
position and session bias) in 12 3-L tanks (24.5 × 15 × 13.5 cm, AquaBox® 3, Aqua Schwarz
GmbH, Göttingen, Germany) filled with 1.5 L of system water. Tanks were placed in three rows
with four tanks in each and were isolated from neighbouring tanks by opaque walls. We ran three
sessions and the water was changed after each session. A camera was placed above the tanks,
which were on top of an infrared backlight device (IR floor 1 × 1 m, Noldus, The Netherlands) to
monitor horizontal movements. During the day, the room was lit with two halogen spotlights
(Philips 80 W) and IR lights were on. At night, the spotlights were turned off, and only IR light
from the floor was used for recordings of fish movements. The fish were placed in their tanks at
17:00 the day before the experiment, for one night of acclimatisation. Recording started the next
day at 12:30 and lasted 48 h. At the end of the 48-h recording, fish activity was further recorded
for 1 h (Light on-1), then they were challenged with a sudden darkness (15 min, Light off) and
video recordings continued for 1 h30 (Light on-2).
For both protocols, 18 fish of each strain were recorded and challenged and the dependent
variable measured was swimming path length (distance travelled, cm).
72-h swimming activity setup in larvae
74
This method was used in order to monitor the onset of swimming activity as well as the
expression of circadian activity rhythm in larvae. In order to obtain a higher level of activity, we
have selected 24-well plates rather than higher-throughput 48- or 96-well plates after Padilla et al.
(2011).
Three dpf larvae (10 AB and 10 TU) were individually transferred by the end of the day,
ca. 17:00, to the wells of a 24-well plate (Krystal 24, opaque (white) clear bottom micro-plate),
where they were arranged in a mixed design (larvae from both strains were studied at the same
time to avoid any trial effect) and visually isolated from each other. The four corner wells were
left empty because video acquisition suffered distortion. The 24-well plates were kept overnight in
an incubator with a cover placed on top of the plate to reduce evaporation. The following day (4
dpf), two hours before the challenge, the well plate was transferred to the video acquisition room
and placed on top of a size-matched infrared floor, which allowed the larvae to be filmed under
both light and dark conditions. A three-way switch permitted filming in the light or dark with
constant IR lighting. The entire apparatus was enclosed within a lightproof and temperaturecontrolled box (hereafter called the ‘larvae-box’). The recording of larval swimming activity
started at 12:00 and was continued for 72 h. The dependent variable measured was the distance
travelled (cm), and was recorded for 30 larvae per strain.
Light/dark challenge in 5 dpf larvae
This challenge was used to monitor the photomotor response. In larvae it is a classically
used test in a wide range of studies from basic research to applied drug screening. The same
protocol and the same material were used for this experiment except that larvae were acclimatised
in the 24-well plates at 4 dpf and tested at 5 dpf. These experiments were conducted between
13:00 and 18:00 hours, corresponding to the most stable activity period for zebrafish larvae
(MacPhail et al., 2009). Larvae were challenged in a dark context (5 min Light off) under two
conditions (with or without an acclimatisation period):
With acclimatisation in the larvae-box (Protocol 1, P1): the plates were transferred to the
video acquisition room at 11:30 and larvae were acclimatised in the larvae-box for two hours
before tests began at 13:30. Video recordings were made over three periods: before (2 h, Light on1), during (5 min, Light off), and after light off (2 h, Light on–2). The experiment was stopped at
17:35 and only one plate per day was recorded.
- Without acclimatisation in the larvae-box (Protocol 2, P2): the experiment was again started at
11:30 but one plate was transferred every 20 minutes to the room and left for 2 hours on a back75
lighted Plexiglas plate beside the larvae-box. Recordings started at 13:30 for the first plate after its
transfer to the larvae-box. Video recordings were made over three 5-min periods: before (5 min,
Light on-1), during (5 min, Light off), and after light off (5 min, Light on–2) and up to 10 plates
per day were processed, compatible with a high-throughput challenge procedure.
The dependent variable measured was the distance travelled (cm) and was recorded for 40
(P1) or 100 (P2) larvae per strain.
Exploration in a novel environment in adults
In addition to providing information on the exploratory ability of the fish, the swimming
characteristics recorded during exploration are giving indications as to how fish cope with this
novel environment. Two experimental models were used: a T-maze and a novel tank challenge.
The T-maze was slightly adapted from (Cousin et al., 2012) and comprised: i) a shallow area, with
a water depth of 5 cm, composed of the base of the T (46 cm long), and two arms (one leading to
the deep area and one in the opposite direction (total length of these two arms was 66 cm) and ii) a
deep area, which was 15 cm deep (10 cm water depth), 23 cm wide and 23 cm long, containing
marbles and plastic grass and was considered to be a favorable zone. Fish were individually
acclimatized in a 1 L aquarium at 16:00 on day 1 and challenged on day 2 between 8:00 and
18:00. Fish were placed in the start area of the maze and swimming characteristics recorded for 5
minutes. Twenty fish were challenged per strain and the dependent variables measured were
latency to first exit from start area (s), time spent in each area (s) and distance travelled (cm) per
minute.
The novel tank challenge was performed after 2 hours of acclimatization in the room in 1 L
aquarium. Fish were transferred to a novel tank (trapezoid 1.5 L tank; Aquatic Habitats, Apopka,
FL; sizes in cm: height 15.2 × width 7.1 x length 27.9 at top and 22.5 at bottom) and filmed for 6
minutes as previously described (Blaser and Gerlai, 2006). Twelve fish were challenged per strain.
For space occupancy analysis, tanks were separated into two zones: the top zone including one
third of the volume and the bottom zone including two-thirds; the dependent variable measured
was the time spent in each zone per minute.
Colour learning by adult zebrafish
The purpose of this test was to evaluate conditioned learning in both strains by using a
colour preference test. In the fish rearing facility, six 20 L glass aquariums on one rack were
selected; three housed 15 TU adult males and three housed 15 AB adult males. For each strain,
76
two tanks were subjected to coloured light conditioning; the third tank was a control. Fish were
fed normally with pellets according to the schedule described previously. For conditioned tanks, a
green light, located in front of the tank was switched on during 10 sec and 2 mL of artemias were
distributed 2 sec after light-on. Distribution and conditioning were made once a day and artemias
concentration was high enough to allow all fish in the tank to have their share. This operation was
repeated daily for 15 days. The experiments were performed on days 16 to 20.
Fish were tested in a behavioral apparatus inspired by Risner et al. (2006)(Risner et al.,
2006) and hereafter called the ‘colour-test box’. It was 45 cm long and 32 cm wide, and was
composed of two main areas: home area and chamber area. Its walls were made of white opaque
Komatex® and its bottom was made of transparent Plexiglass®. It was placed on a size-matched
IR floor lit by 2 IR spot lights (28 LEDs-12 Lux, Ref. 203900, SimRadio, France). The home area
was 32 cm wide and 30 cm long and had black masking material on its walls to prevent light
scatter. The chamber area was separated into three open chambers by opaque Komatex® dividers
so the visual stimulus could be presented to each chamber independently. The chamber area was
15 cm wide and 32 cm long and each of the three chambers was 15 cm wide and 10 cm long. The
back wall of each individual chamber was made of diffusing Plexiglas. Three different LED spots
with each a on/off switch and a remote control for choosing the light colour, either green or blue
(LED RGB 3W), were positioned behind the back wall. The colours were chosen according to
Mueller and Neuhauss (Mueller and Neuhauss, 2012). The colour-test box was filled with 12 L of
system water and placed in a dedicated room kept at 27°C and lighted with one halogen spotlight
(Philips 80 W). A camera was installed above the box (in top view) and allowed recording the fish
in all areas.
Fish were subjected to two tests at the time of the day corresponding to conditioning (11:3012:30). In the first test (test 1), they were gently individually placed in the start zone of the home
area and recorded until the end of the test. After two minutes one randomly picked chamber was
lit in green for 30 s, and the two remaining chamber remained under ambient light. In the second
test (test 2), the same protocol was used except that when the green light was on, an additional
randomly picked chamber was lit in blue for the same 30 s duration. The variable measured was
the time spent in each area and chamber; 15 control fish and 30 conditioned fish of each strain
were challenged.
Data recording and analysis
Videos for the swimming activity, T-maze exploration and novel tank experiments with
77
adults were recorded with an analogue camera ICD-48E (Ikegami) and 2.7–13.5 mm lens
(Fujinon) linked to a PC with an acquisition card and Ethovision XT software (Noldus, The
Netherlands). Videos for the larvae locomotion and adults colour learning experiments were
recorded using a digital DMK31AU03 camera (The Imaging Sources, Germany) and 1.4–12.5 mm
lens (Fujinon) using IC-Capture software (The Imaging Sources, Germany).
For all experiments, EthoVision software was used for track extraction and analysis. Data
were acquired by EthoVision at 25 frames per second, and variables (distance travelled, time spent
in each area) were nested for further treatments every 30-min for locomotion in adults (48-h) and
in larvae (72-h), or every 1-min for adults and every 30-s period for larvae for light/dark challenge
experiments.
Statistical analysis
The results reported in text and all figures are means ± SEM. All fish used in these
experiments (except the ones in the colour learning test) were anaesthetized in benzocaïne (SigmaAldrich; 50 mg/L in water from a 100 g/L stock solution in ethanol) at the end of the challenge
and were measured for mass and length, differences between strains were tested using one-way
ANOVA. In cases AB and TU differed in mass and/or length, the effects of differences were
resolved by comparing all variables relating to swimming activity in a repeated measures analysis
of covariance, ANCOVA. Fish strain (AB and TU) was taken as a between-subject factor and
body mass or length as a covariate and showed no significant interaction with strain whatever the
test used.
For the 48-h or 72-h swimming activity experiments, transition periods induced an
exacerbated pattern; therefore, it was necessary to analyse these 30-min “Light off” and
“Light on” periods immediately following the light change separately. Remaining day and night
periods were divided into blocks of six or seven 30-min periods. Within each period, ANOVA
tests were used to compare the distances travelled between the different strains. Distance travelled
was also compared between day-time and night-time, excluding the transitional half-hour periods,
using ANOVA. For light/dark challenge experiments, distances travelled were compared over
three periods of 15 min each for adults and 5 min each for larvae: before (Light on–1), during
(Light off) and after light off (Light on–2), in both cases, repeated-measure ANOVA (RMANOVA) was used followed by Newman-Keuls post-hoc tests. For T-maze tests, latency to first
exit of start area, time spent by fish in the three areas of interest (shallow, start and deep sections),
78
occupation of different zones and distance travelled were compared between strains with ANOVA
tests. The same statistical tests were used to compare occupation of the upper and bottom zones in
the novel tank test. For both assays a ‘discretisation per minute’ was performed to analyse any
temporal evolution of distance travelled (T-maze) and top zone occupancy (novel tank) using RMANOVA followed by Newman-Keuls post-hoc tests. Finally, the time spent in the different
chambers during colour challenge was compared between strains using ANOVA. All statistical
analyses were performed with Statistica 9.0 software (Statsoft, Tulsa, OK, USA) and significance
of results was ascertained at p < 0.05.
Results
48-h swimming activity in adults and 72-h swimming activity in larvae: spontaneous activity
In 6-month adults and for both strains mass were homogeneous (AB = 178.4 ± 6.8 mg,
TU = 160.7 ± 6.4 mg, F(1,
TU = 2.29 ± 0.02 cm, F(1,
36)=
36)=
3.58, p= 0.066) but length differed (AB = 2.37 ± 0.03 cm,
5.06, p= 0.031), diurnal activity, evaluated as distance travelled,
was the highest in the morning, then decreased to a minimum at midday before increasing again in
the afternoon. Nocturnal activity followed a similar U-shape albeit the distance moved was shorter
than during daytime (Figure 1 A). Differences were observed for last day- and night-time blocks
with AB fish being more active than TU fish at the end of the day and the opposite at the end of
the night (Figure 1 B). The distance travelled by AB fish during the day was greater than that by
TU fish (ANOVA F(1,35)=5.87; p=0.021; Figure 1 C), such that the cumulated distances travelled
indicated that AB fish were diurnal, and that this was not the case for TU fish.
79
Distance travelled in cm/30 min
A
15000
AB
TU
10000
5000
0
Day 1
B
15000
Night 1
Day 2
Night 2
C
AB
200000
10000
*
#
5000
AB
TU
Distance travelled in cm/phase
TU
Day 3
#
*
#
*
150000
Aa Ba
Ab Aa
Day
Night
100000
50000
0
0
Day 1
off
Night 1
on
Day 2
off
Night 2
on
D3
Figure 1 : Daily spontaneous activity of adult zebrafish. (A) Locomotor activity nested per 30min period. (B) Cumulated locomotor activity per block of six or seven 30-min periods. The
greyscale background indicates the light status / period of the day. (C) Locomotor activity during
daytime and nighttime periods. (Mean ± SEM; * p<0.05; # p<0.1; in C, upper case letters indicate
significant differences between strains within periods and lower case letters indicate significant
differences between periods within strains; n=18 per strain).
For both strains, larval activity increased until 4 dpf, reached a plateau at 5 dpf and then
decreased until the end of the experiment (Figure 2 A). During night periods, activity decreased to
a minimum similar for all three nights and both strains. The activity of TU larvae was higher than
that of AB larvae for almost all daytime periods. AB larvae became more active than TU larvae
during most night periods after 5 dpf (Figure 2 B). Cumulated distance travelled for all day and all
night periods indicated that larvae of both strains were clearly diurnal, and confirmed that TU
larvae were both more active than AB larvae during the day (ANOVA F(1,60)=31.36; p<0.001) and
displayed a more contrasted activity between day and night (Figure 2 C).
80
A
600
AB
TU
500
400
300
200
100
0
4 dpf
Night 1
5 dpf
Night 2
C
600
AB
500
TU
400
*
*
* *
*
*
#
300
#
*
*
*
200
#
#
#
* *
100
* *
0
20000
AB
TU
Distance travelled in cm/phase
B
6 dpf
Night 3
7d
Aa Ba
15000
10000
Ab Ab
5000
0
4d
off
N1
on
5 dpf
off
N2
on
6 dpf
off
N3
on
Day
Night
Figure 2 : Spontaneous activity of larvae over 72-h. (A) Locomotor activity nested per 30-min
period. (B) Cumulated locomotor activity per block of 6-7 half hours. The greyscale background
indicates the light status / period of the day. (C) Locomotor activity during daytime and nighttime
periods. (Mean ± SEM; * p<0.05; # p<0.1; in C, upper case letters indicate significant differences
between strains within periods and lower case letters indicate significant differences between
periods within strains; n=30 per strain).
Light/dark challenge
Light/dark challenge was applied to both adults (after the 48-h activity recording; Figure 3)
and larvae (at 5 dpf; Figure 4 and Figure 5).
In 6-month old adults (same fish as above) and for both strains, the light change produced
an immediate and sustained increase in activity which lasted throughout the following dark period.
The subsequent Light on-2 elicited an additional increase of activity which decreased rapidly
afterwards (Figure 3 A). For both strains, the various periods appeared significantly different from
each other except in the case of Light off/Light on-2 comparison for AB strain (Figure 3 B). The
only difference between strains was during the dark period, when TU fish showed more activity
than AB fish (RM-ANOVA F(3,18)=5.34; p=0.004).
81
A
800
Distance travelled in cm/min
AB
TU
600
400
200
0
Light on-1
B
4000
AB
L. off
Light on-2
Ab Bb
TU
3000
Aa Aa
Ab Aa
2000
1000
0
Light on-1
Light off
Light on-2
Figure 3 : Light/dark challenge with adult fish. (A) Locomotor activity was recorded for one
hour before a sudden dark period lasting 15 minutes (grey shadowing). The fish were recorded for
the following 1h30. (B) Locomotor activity during 15-min periods was used for statistical
analyses. (Mean ± SEM; in B, upper case letters indicate significant differences between strains
within periods and lower case letters indicate significant differences between periods within
strains; n=18 per strain).
Two protocols were used for larvae: with (P1) or without (P2) an acclimatization period in the
Larvae-box.
For the duration of the P1 test as a whole, TU larvae were less active than AB larvae. For
both strains, Light off produced a synchronization of activity and larvae started with a similar
activity levels. Activity of AB larvae progressively increased during Light on-2 and reached a
plateau identical to that during Light on-1 period approximately 30 minutes after Light off; the
activity increase for TU larvae during the corresponding period was limited (Figure 4 A). When
82
considering periods of equivalent duration (Figure 4 B), ANOVA analysis indicated that for both
strains, activity during dark period was significantly higher than preceding and following light
periods (ANOVA F(2,40)=11.98; p<0.001 for AB larvae and F(2,40)=12.65; p<0.001 for TU larvae).
This analysis also showed that, within each period, there was no difference between TU and AB
strains (Figure 4 B).
A
10
AB
Distance travelled in cm/30 s
TU
8
6
4
2
Light on-1
L. off
Light on-2
B
120
Distance travelled in cm/5min
AB
100
80
TU
Ab Ab
Aa Aa
Aa
Aa
60
40
20
0
Light on-1
Light off
Light on-2
Figure 4 : Light/dark challenge with larvae – protocol P1. (A) Locomotor activity was recorded
for the two hours before a sudden dark period lasting 5 minutes (grey shadowing). The fish were
recorded for a further 2 hours. (B) Locomotor activity during 5-min periods was used for
statistical analyses. (Mean ± SEM; in B, upper case letters indicate significant differences between
strains within periods, and lower case letters indicate significant differences between periods
within strains; n=40 per strain).
83
Using a shorter alternative procedure, P2, dark challenge did not elicit any specific response
although the subsequent Light on-2 was associated with the classical decrease in activity (Figure
5). Statistical analysis indicated that TU larvae were less active than AB larvae during Light on-1
and Light off periods but not during Light on-2 (RM-ANOVA F(3,200)=6.52; p<0.001;Figure 5 B).
B
A
12
120
AB
Distance travelled in cm/ 30 s
8
6
4
2
TU
Aa Ba
TU
10
AB
Aa Ba
100
Ab
80
Ab
60
40
20
0
0
Light on-1
Light off
Light on-2
Light on-1
Light off
Light on-2
Figure 5 : Light/dark challenge with larvae – protocol P2. (A) Locomotor activity was recorded
for 15 minutes consisting of light on/light off/light on periods, each of 5 min. (B) Locomotor
activity during 5-min periods was used for statistical analyses. (Mean ± SEM; in B, upper case
letters indicate significant differences between strains within periods and lower case letters
indicate significant differences between periods within strains; n=100 per strain).
T-maze – exploration behaviour and novel environment
For this experiment with 12-month adults, mass were different (AB = 409.0 ± 24.0 mg,
TU = 343.7 ± 16.9 mg, F(1, 40)= 4.93, p= 0.032) but showed no interaction with strain and length
were homogeneous (AB = 2.97 ± 0.05 cm, TU = 2.88 ± 0.03 cm, F(1, 40)= 2.19, p= 0.146). Similar
numbers of fish of the two strains reached the deep area (18 and 16 of 20 for AB and TU strains,
respectively) and the mean latency before reaching this zone was not significantly different
(ANOVA F(1,34)=1.92; p=0.176). This is in agreement with the observation that first exit from start
area did not differ between strains (ANOVA F(1,40)=1.45; p=0.236; Figure 6 A). Over the total
duration of the challenge, TU fish tended to spend more time than AB fish in the start area
(ANOVA F(1,40)=32.85; p=0.058), although residence time in other areas were not different
(Figure 6 B). Monitoring of locomotor activity in the shallow area showed a gradual increase of
TU fish activity which became significantly higher than AB fish activity from minute 3 (Figure 6
C; RM-ANOVA F(5,40)=2.93; p=0.027; Newman-Keuls post-hoc test Min-1 p=0.653; Min-2
p=0.397; Min-3 p=0.024; Min-4 p=0.003; Min-5 p=0.004).
84
A
B
200
AB
TU
AB
TU
30
150
Time in sec
Time in sec
C
500
Distance travelled in cm/min
40
20
10
100
#
50
0
TU
*
*
*
Min-3
Min-4
Min-5
300
200
100
0
0
Start exit
400
AB
Start
Shallow
Deep
Min-1
Min-2
Figure 6 : Exploratory behaviour in a T-maze device. (A) Time to first exit from the start zone.
(B) Total time spent in T-maze areas (start, deep and shallow). (C) Distance travelled nested in 1min bouts. (Mean ± SEM; * p<0.05; # p<0.1; n=20 per strain).
Novel tank – comparison of homebase behaviour
For this experiment in 3-month old adults, both mass and length were different:
(AB = 145.1 ± 17.6 mg, TU = 285.6 ± 31.4 mg, F(1,
24)=
14.97, p<0.001; AB = 2.03 ± 0.09 cm,
TU = 2.45 ± 0.07 cm, F(1, 24)= 14.35, p<0.001) but showed no interaction with strain. To compare
anxiety levels between adults of the two strains, we used the novel tank diving test (Figure 7 A).
Fish from both strains spent most of the time in the bottom zone of the tank but in both cases, time
spent by fish in top zone increased over time. Discretisation of value per minute indicated that for
most Min- periods, TU fish spent more time than AB fish in top zone (Figure 7 B; RM-ANOVA
F(6,24)=1.7; p=0.165; Newman-Keuls post-hoc test Min-1 p=0.018; Min-2 p=0.020; Min-3
p=0.105; Min-4 p=0.069; Min-5 p=0.020; Min-6 p=0.009).
85
A
B
AB
90%
100%
80%
70%
70%
60%
60%
50%
50%
40%
40%
30%
30%
bottom
20%
20%
top
10%
10%
0%
TU
90%
80%
40
*
AB
TU
Time in top zone in sec
100%
bottom
#
30
20
*
*
*
10
top
0%
0
Min-1
Min-2
Min-3
Min-4
Min-5
Min-6
Figure 7 : Novel tank challenge. (A) Mean zone occupancy during 6 minutes for AB and TU
fish. (B) Top zone residence time nested in 1-min bouts. (Mean ± SEM; * p<0.05; # p<0.1; n=12
per strain).
Colour learning
Fish were subjected to coloured light conditioning during 15 days by associating feeding
with artemias with a green light, as described in Methods section and two colour preference place
tests were performed within the next 5 days to evaluate their learning abilities. In test 1,
conditioned fish of both strains spent significantly more time in the green chamber than in control
chambers (ANOVA F(1,45)=13.89; p<0.001 for AB fish and F(1,45)=4.89; p=0.032 for TU fish;
Figure 8 A). In the second test, designed to differentiate colour conditioning from light
conditioning, only conditioned fish were used. AB fish spent significantly more time in the green
zone than in other zones (ANOVA F(2,30)=6.16; p=0.003) but this was not the case for TU fish
(ANOVA F(2,30)=0.15; p=0.859) (Figure 8 B)
A 20
B
Control
Controlfish
fish
*
green
20
Conditioned
fishfish
Conditionned
blue
a
10
5
no stimulus
15
*
Time in sec
Time in sec
15
10
b
b
a
a
a
5
0
0
AB
TU
AB
TU
Figure 8 : Colour conditioning. (A) Time spent in green chamber versus zones with no stimulus:
the value is higher for conditioned fish than control fish for both strains (Mean ± SEM; * p<0.05;
n=15 for control fish for both strains, n=30 for AB and TU conditioned fish). (B) Time spent in
green chamber versus blue or no light chamber for AB and TU conditioned fish (Mean ± SEM;
different letters indicate significant differences between colours within strains, n=30 for each
strain).
86
Discussion
The increasing use of zebrafish, and in particular for behavioural assays, in various fields
of research is such that a detailed knowledge of elements which can be sources of differences
between replicates is required. In addition, assays using behavioural endpoints relying on natural
behaviour are very diverse thereby increasing the difficulties of interpretation and comparison
between studies. Several experiments using laboratory strains and WT populations have indicated
that behavioural responses vary according to the strain used. Consequently, the fish strain could be
an important source of variation between assays. We therefore conducted a systematic comparison
of the behaviour of two widely used laboratory WT strains: AB and TU.
We assessed the natural behaviour of adults and larvae in the absence of challenges: we
monitored locomotor activity over long periods of time including two or more night periods.
Adults of both strains displayed U-shaped actograms, with the tops of the U corresponding to
transition periods (between day and night and between night and day) and the bottom of the U to
the middle of the day and night periods. Discretisation of the activity led to identification of
differences between the two strains. Comparing daily and nocturnal activity revealed that a diurnal
pattern for AB fish whereas the activity of TU fish was more evenly distributed. In the case of
larvae, both strains were clearly diurnal with 5 to 10 times more activity during day periods than
night periods over 72 h of recording. For both strains, there was a large increase in activity during
the fourth dpf. In the case of the AB strain, activity plateaued from the end of 4 dpf whereas for
TU larvae, the increase continued until 5 dpf. This overall shape of the activity profile is
consistent with the development of larvae standing on their side until 4 dpf and then inflating their
swim-bladder around 5 dpf (Goolish and Okutake, 1999). At this same stage, the larvae start
feeding. A combination of swimming and feeding behaviours presumably, therefore, explains the
surge of activity observed at 4-5 dpf. This change in daily activity has previously been described
for WT populations (Colwill and Creton, 2011). The development of locomotor behaviour
parallels the maturation of serotoninergic neurons (Brustein et al., 2003), and the application of
exogenous dopamine inhibits the initiation of swimming at 5 dpf (Thirumalai and Cline, 2008). A
large increase in the activity of larvae between 3 dpf and 5 dpf has also been reported by
Thirumalai et al. (2008) (Thirumalai and Cline, 2008) but Prober et al. (2006) who monitored
larvae from 5 dpf to 7 dpf found no such increase (Prober et al., 2006). Note, however, that
Thirumalai et al. used 5 cm-diameter Petri dishes whereas Prober et al. used 96-well plates, and
this methodological difference can cause large differences in the behaviour of larvae (Padilla et
87
al., 2011); also, Prober et al. (2006) recorded activity as seconds of activity over 10 min rather
than true distance travelled (Prober et al., 2006). Prober et al. observed a decrease in activity by
the end of 5 dpf and during 6 dpf. This observation is in agreement with Experiment 2 reported by
Colwill et al.(Colwill and Creton, 2011) and the findings by MacPhail et al. (2009) for the
influence of experimental conditions on larval behaviour at 6 dpf (MacPhail et al., 2009).
MacPhail et al. also reported that the variability measured decreased along with activity level
during the day. These various observations were used to identify the afternoon, 6 dpf, as the
preferred time period to perform individual larval behavioural assays. Similarly, we observed a
stabilisation of activity level by the end of 6 dpf as well as a reduction in variability. In MacPhail's
study, there is no indication of the strain used. Note that we found TU to have significantly higher
diurnal activity than AB. We are unaware of any previous demonstration of differences in
spontaneous locomotor activity between larvae of different strains, although various short assays
at different ages have been described (Colwill and Creton, 2011; de Esch et al., 2012).
Long-duration assays are useful for analysing the expression of natural patterns and
divergence from them under experimental situations. However, they are not suitable for mass
screening because they are mostly low throughput. Consequently, alternative, shorter procedures
have been developed to trigger responses, and several such assays have been described for both
larvae and older fish.
The light/dark challenge is straightforward, and is therefore widely used to trigger
behavioural responses in larvae. We found that light transition also produced strong pulses of
activity in adults, so we assessed responses of fish at both stages. As expected, adults of both
strains displayed a strong reaction to light changes, with a significant increase in activity during
light-off. The TU strain displayed a larger response, with a 3-fold increase versus a 2-fold increase
for AB fish. In the case of larvae, several protocols have been used with different step numbers
and duration, with and without acclimatisation, and different well sizes (Ali et al., 2011; de Esch
et al., 2012; Padilla et al., 2011). We used two protocols, P1 with a 2h acclimatisation step inside
the larvae-box, and P2 without acclimatisation. Using P1 protocol, we observed the expected
increase in larval activity associated with the light-off switch for both strains, and the expected
subsequent decrease. These findings are in agreement with previously reported data (de Esch et
al., 2012; MacPhail et al., 2009; Padilla et al., 2011) and no differences were observed between
strains. Because P1 only allowed assessment of 1 plate (20 larvae) per day, we also assessed P2
which allows a higher throughput. However, in P2 tests, and for both strains, the light-off switch
did not elicit the expected increase in activity, although the following light-on induced the
88
expected decrease in activity. AB larvae were more active than TU larvae during all three periods,
the difference being particularly high for Light on-1 and Light off periods. Differences between
laboratory strains in a similar assay have recently been reported: 5 dpf AB larvae were more active
than TL larvae during dark periods. We observed no change in activity between Light on-1 and
Light off periods, and this is not consistent with previous reports for similar assays; this
discrepancy is probably because in our protocol, activity monitoring started after an
acclimatisation period in the light as in one the study by Ali et al. (Ali et al., 2011) and not in the
dark as was the case in several other studies (de Esch et al., 2012; MacPhail et al., 2009; Padilla et
al., 2011). However, Ali and collaborators (2011) used 96-well plates whereas we used 24-well
plates which have been shown to elicit higher activity (Padilla et al., 2011).
Many tests have been developed to assess several adult behaviours in challenged
situations. We chose to use well-established tests to assess responses to light stimuli, and
exploratory and novel environment behaviours. The T-maze device was used to assess
exploration: other than TU fish spending more time in the start area, no differences were observed
in exploratory behaviour between strains. The locomotor activity of TU fish significantly
increased over the 5-min duration of the test. A parallel can be made with the vertical position in
the novel tank test in which TU fish displayed an early home base release with a significant
increase in time spent in the upper zone over the test-duration and significantly higher stay
duration in the upper zone than AB fish. Home base occupancy has been described to be an
indicator of anxiety (Egan et al., 2009; Stewart et al., 2010; Stewart et al., 2012) and we have also
found an association between homebase release and hyperactive behaviour (Péan, 2012).
Our various findings suggest that adult TU fish were more active in a novel environment
and that AB fish displayed a more anxious behaviour. Similar differences have been described in a
report comparing a WT population with strains selected for particular phenotypes (albino, leopard
and long-fin): commercial WT fish displayed less anxious behaviour than mutant fish (Egan et al.,
2009); the authors pointed out that this behavioural difference should be taken in to account when
setting up experimental protocols and choosing strains. Our study extends this point to laboratory
strains widely used in research. Our data suggest that to obtain the most significant results, the
more anxious AB strain should be favoured for evaluations of anxiolytic drugs/manipulations in
adults, and that the TU strain should be favoured for evaluations of anxiogenic
drugs/manipulations. For investigations involving rhythm monitoring and/or long-term behaviour
in which contrasted circadian activity is required, the AB strain should clearly be favoured over
the TU strain because it displays a robust diurnal rhythm. Finally, for assays involving colour
89
conditioning, the choice will depend on the complexity of tests: adult fish of both strains are
efficiently conditioned by green colour as assessed by a green/no light shuttle box test. However,
for three-colour choice protocols (green/blue/no light), the AB strain may be more appropriate
because they showed preference for colour used for conditioning whereas TU fish did not. This
difference in response to conditioning between AB and TU strains is in agreement with the results
of a conditioning preference place test (Ninkovic and Bally-Cuif, 2006).
Several studies have reported behavioural differences between laboratory strains and
commercial or wild-caught populations (Oswald and Robison, 2008; Robison and Rowland,
2005), including differences in behavioural activities (Egan et al., 2009; Lockwood et al., 2004;
Moretz et al., 2007a; Moretz et al., 2007b), thigmotaxis (Lockwood et al., 2004), social behaviour
including (aggression, shoaling and reproduction)(Barba-Escobedo and Gould, 2012; Benner et
al., 2010; Dlugos and Rabin, 2003; Maack et al., 2003; Mahabir et al., 2013; Moretz et al., 2007a;
Moretz et al., 2007b; Ninkovic and Bally-Cuif, 2006; Soffker et al., 2012; Zala et al., 2012),
boldness with or without contamination (Dlugos and Rabin, 2003; Lockwood et al., 2004; Loucks
and Carvan III, 2004; Wright et al., 2003) and conditioning or learning new tasks (Ninkovic and
Bally-Cuif, 2006; Spence et al., 2011; Vital and Martins, 2011; Zala et al., 2012). However, these
studies comparing laboratory strains and WT populations clearly differ from ours in which two
laboratory strains were compared. Also, several previous studies used commercial populations,
and their genetic background was not known. Nevertheless, they indicate that different genetic
backgrounds can lead to behavioural differences, as already been demonstrated for other fish and
other species (Kopp, 2001; Wright et al., 2006). Laboratory strains have, since their establishment,
been subject to classical selection based on zootechnical criteria, and in particular robustness and
fertility. Such directed selection processes are often accompanied by a relaxation of selection
pressure on other previously essential criteria, for example predator avoidance. This explains why
independent domestication events may lead to convergent phenotypes for some criteria (e.g.
robustness and fertility) but not others, like behaviour (see (Moretz et al., 2007b) and this work).
In summary, using a large palette of behavioural monitoring methods, including long-term
and challenge assays, we demonstrate that zebrafish strains AB and TU, widely used in research,
display some similar and some divergent behaviours. Similar and different behaviours were
observed for both larval and juvenile/adult stages. Since zebrafish behavioural tests, including
simple monitoring of the locomotor activity of larvae, are being increasingly used in diverse
disciplines, care should be taken to select appropriate strains, and in particular for work involving
large-scale screening (Kokel and Peterson, 2008, 2011; Rihel and Schier, 2012). The recent report
90
that maturation of shoaling differs between AB and TU strains and is associated to differences in
dopamine and serotonin levels in the brain of developing fish shed light on possible mechanisms
underlying such inter-strain behavioural differences (Mahabir et al., 2013).
Acknowledgments
Thanks to Kaspar Müller and Stefan Neuhauss for sharing unpublished data on fish colour
preference. This work was performed with the financial support Agence Nationale pour la
Recherche [CES- 2009-002 ConPhyPoP to X.C.]. Funds from the Région Poitou-Charentes and
from l'Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer (Ifremer) supported C.V. and
S.P. during their PhD researches.
Disclosure Statement
There are no competing financial interests.
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94
Au début des expositions par voie sédimentaire, la lignée AB a été choisie car c'est la plus
utilisée dans la littérature. Toutes les expositions sur sédiment ont été réalisées avec cette lignée.
Dans l'intervalle, la comparaison présentée ci dessus a été réalisée et nous avons choisi d'utiliser la
lignée TU pour l'exposition par voie alimentaire, car les réponses comportementales présentaient
une différence plus grande que les AB, notamment chez les larves.
IV Voies et périodes d'expositions
Les HAP étant des composés hydrophobes, les deux voies d’exposition qui nous
semblaient les plus pertinentes étaient une exposition précoce par sédiment dans un premier cas, et
une exposition par voie alimentaire dans un deuxième. Ces deux types d’exposition reflètent le
mode de vie de ce poisson. En effet, lorsque l’œuf est pondu, il se dépose sur le sol et y reste après
la phase d’éclosion (48 à 72 hpf), jusqu'à la mise en place de la nage (environ 96 hpf) et le
gonflement de la vessie natatoire. A 5 jpf, la bouche de la larve est ouverte et celle-ci peut
commencer à se nourrir de manière autonome.
1) Exposition par sédiment-contact
L'exposition par sédiment contact va nous permettre d'étudier les effets à long terme d'une
exposition pendant tout le développement de l'embryon. Le B[a]P, le pyrène et le phénanthrène
ont été enrobés sur un sédiment de type sable prélevé dans une gravière à Yville-sur-Seine et
utilisé comme sédiment de référence (Vicquelin et al., 2011). Le sédiment a été lyophilisé et pilé
dans un mortier pour obtenir de fines particules homogènes comme décrit dans Vicquelin et al.
(Vicquelin et al., 2011). La solution de HAP a été additionnée au sédiment grâce à un solvant, le
dichlorométhane pour obtenir les concentrations théoriques indiquées dans le Tableau 2. Le
sédiment témoin a été préparé de la même façon en excluant les HAP. Les poissons sauvages de la
lignée AB ont été mis à pondre en couple la veille de l'exposition. Le matin suivant, les pontes ont
été récoltées aux alentours de 9h. Avant cette heure, les boîtes de Pétri sont remplies de 3g de
sédiment. Un panier en plastique préalablement thermoformé est déposé sur le sédiment (Figure
28).
95
Figure 28 : Illustration de l'exposition par sédiment contact.
Trois grammes de sédiment dans une boîte de Pétri et le panier thermoformé à droite.
A 9h, les pontes sont récoltées puis triées et au moins 5 pontes présentant un taux de fécondation
supérieur à 90% sont mélangées dans une grande boîte de Pétri. Trente embryons fécondés sont
ensuite disposés sur le panier posé sur le sédiment. Environ 3 mL de E3 (composition 5 mM NaCl,
0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) sont ajoutés. Le liquide ne doit pas toucher le
couvercle une fois la boîte fermée. Les boîtes sont ensuite mises à l'étuve à 28°. Les œufs
disposent de la même photopériode que les adultes en salle d'élevage. La contamination a lieu
entre le jour 0 et le jour 4 (Fig 37). Pour chaque exposition, nous avons réalisé des incubations sur
le sédiment contrôle et sur le sédiment enrobé avec les 3 HAP. Chaque jour, les morts sont
comptés et retirés. Au bout de ces 4 jours, les larves nageuses sont transférées en eau propre et
l'alimentation classique avec deux doses de poudre et une dose d'artémias peut débuter (Figure
29).
96
Figure 29 : Protocole de contamination par sédiment-contact.
Flèche indiquant les conditions d'élevage en haut et de nourrissage en bas. Contamination durant 96 hpf (PAH), représentée en rouge, puis
transfert en eaux propres (clean water). Les granulométries d'aliments ont été adaptées en fonction de l'âge des poissons.
97
Les larves séjournent en bac de 1L entre le jour 4 et le jour 12, puis elles sont transférées
en bac de 3L au jour 12. Ces deux contenants ne possèdent pas de renouvellement d'eau
automatique et celui-ci s'effectue de manière manuelle une fois par jour. Au jour 27, les poissons
sont placés en bac de 10L dans les colonnes d'élevage. Les granulométries de poudre d'aliment
non contaminé augmentent avec l'âge.
2) Exposition par voie trophique
Dans un deuxième temps, une exposition à de l'aliment contaminé a été mise en place
(Figure 30).
Figure 30 : Illustration des tubes de stockage de l'aliment contaminé. Un tube par
concentration et par granulométrie.
Dans cette étude, les poissons sauvages TU sont mis à pondre en couple la veille de
l'exposition. Le matin suivant, les pontes sont récoltées aux alentours de 9h. Elles sont triées et au
moins 5 pontes sont mélangées dans une grande boîte de Pétri. Cinquante embryons fécondés sont
disposés dans chaque boîte. Nos expériences sont réalisées avec 4 concentrations (contrôle, 0.3X,
1X et 3X) en triplicat. Pour chaque exposition, nous remplissons donc 12 boîtes de Pétri plus 2
boîtes "réserves". Au jour 3, les chorions sont retirés (Figure 31). Après 5 jours de développement
en boîte de Pétri, les poissons présentant des œdèmes ou des malformations sont retirés. Ils sont
remplacés par ceux issus des deux boîtes réserves mais élevés dans les mêmes conditions.
L'expérience débute donc avec 50 embryons bien formés par condition. L'alimentation trois fois
par jour (2 fois de la poudre contaminée et une fois des artémias stade A0 saines) débute au jour 5
(Figure 31).
98
Figure 31 : Protocole de contamination par alimentation.
Flèche indiquant les conditions d'élevage en haut et de nourrissage en bas. Au niveau de l'élevage, les poissons sont élevés en boîte de Pétri, puis
en bac de 1L, puis en tubes et enfin en bac de 10L. Contamination de 5 jpf (D5) jusqu'au prélèvement (représenté en surlignage). Les
granulométries d'aliments contaminés ont été adaptées en fonction de l'âge des poissons.
99
Entre le jour 5 et le jour 20, les larves sont nourries avec une granulométrie inférieure à
125 µm. Puis, à partir du jour 15, de l'aliment entre 125 et 315 µm est distribué et ce jusqu'au jour
35. Au jour 30, la poudre entre 315 et 500 µm débute pour finir au jour 55. La plus grosse
granulométrie (>500 µm) commence à être distribuée au jour 50 et sera donnée jusqu'à la fin de la
vie des poissons (Figure 31). Dans le même temps, les changements de bacs s'enchaînent de la
manière suivante : les 50 larves sont transférées en bac de 1L au jour 5, puis elles sont placées en
tube dans des bacs de 10L au jour 12, ce qui réduit l'espace de nage et permet de ne pas épuiser les
larves. Au jour 27, elles seront libérées du tube dans le grand bac de 10L (Figure 31).
Dans les deux cas de contamination, les bacs de larves sont identifiés depuis les boîtes de
Pétri jusqu'au prélèvement des poissons avec la même étiquette. Cette dernière rappelle la date de
naissance, la lignée, la condition et le numéro de réplicat. Ce système implique que lorsque les
poissons changent de contenant, l'étiquette est déplacée en même temps qu'eux. De plus, pour que
les niveaux de contamination soit rapidement identifiables sur les aquariums, un code couleur a
été mis en place dès le départ. Le contrôle a une étiquette verte, le 0.3X jaune, le 1X orange et le
3X rouge. Ce code couleur sera conservé tout au long de ce manuscrit. Dans le cas de la
contamination par sédiment, les poissons contaminés ont une étiquette rouge.
La voie alimentaire représente la plus grande partie de ce travail de thèse. En effet, les
difficultés rencontrées lors des expositions via le sédiment et le manque de résultats significatifs
obtenus par les partenaires du projet ont poussé à développer davantage la voie alimentaire. Cette
voie représente le cas d'une contamination chronique. Nous avons donc utilisé nos trois fractions
de HAP dans ce dernier cas (PY, HO et LO).
V Organisation des analyses phénotypiques
Lors de ces différentes expositions, les effets à long terme d'une exposition ont été mesurés
à plusieurs stades de vie pour essayer de comprendre au mieux l'impact des contaminants à
différentes étapes du cycle de vie des poissons. Des fonctions de comportements, de
reproductions, de croissances et de survies ont été analysées. Le déroulement de ces analyses est
présenté ci-après, tout d'abord chez les juvéniles (F0 et F1) et adultes F0, puis chez les larves F1.
Ces analyses ont été réalisées après une exposition par sédiment contact (Figure 32) et par voie
trophique (Figure 33).
100
Tests
comportementaux
F0
Experiences
Reproduction
Croissance
PAH
4 jpf
1 mpf
2 mpf
3 mpf
6 mpf
9 mpf
Tests
comportementaux
F1
5 jpf
Figure 32 : Stades testés et tests réalisés lors de l'exposition par sédiment contact.
Flèche indiquant les expériences en haut et l'âge en bas. Contamination durant 96 hpf (PAH), représentée en rouge. Suivi de la croissance entre 3
et 8 mpf et de la reproduction entre 3 et 6 mpf. Tests comportementaux réalisés à 6 mpf chez les F0 et à 5 jpf chez les F1.jpf: jour post
fécondation. mpf: mois post fécondation.
101
Tests
comportementaux
F0
Tests
comportementaux
Experiences
Reproduction
Croissance
5 jpf
1 mpf
2 mpf
3 mpf
6 mpf
9 mpf
Tests
comportementaux
Tests
comportementaux
F1
5 jpf
1 mpf
2 mpf
Tests
comportementaux
F2
5 jpf
Figure 33 : Stades testés et tests réalisés lors de l'exposition par voie alimentaire.
Flèche indiquant les expériences en haut et l'âge en bas. Contamination représentée en rouge. Suivi de la croissance entre 3 et 9 mpf et de la
reproduction entre 3 et 9 mpf. Tests comportementaux réalisés à 2 et 6 mpf chez les F0 et à 5 jpf et 2 mpf chez les F1. jpf: jour post fécondation.
mpf: mois post fécondation.
102
La majorité des tests présentés dans ce manuscrit ont permis de conserver les poissons
vivants. Les poissons ayant servi au suivi de croissance, de survie, de reproduction et de
comportement à 6 mpf ont ensuite été utilisés pour l'histologie. Les tests statistiques ont été
réalisés à l'aide du logiciel Statistica et des modèles linéaires généralisés (GLM) ont en général été
appliqués. Dans le cas contraire, cela est indiqué.
1) Survie et Croissance
a) Suivi de survie et de croissance
La croissance et la survie nous permettent d'évaluer l'impact des polluants sur la capacité
des poissons à survivre, grossir et grandir. Pour chaque fraction de HAP utilisée dans le cadre de
cette thèse, une série de poisson, c'est à dire un triplicat de conditions (nous avons 4 conditions
donc 12 bacs), a été suivi de manière plus importante que les autres. En effet, lors de chaque
exposition, les poissons ont été exposés par séries. Une série correspond donc à un triplicat de
conditions : contrôle, 0.3X, 1X et 3X. Ces poissons ont été comptés, mesurés et pesés
régulièrement. Les poissons sont mis à jeun le jour précédant les biométries.
Figure 34 : Suivi de croissance de la naissance à 9 mpf.
Le matin, ils sont pêchés bac par bac puis transférés dans la salle où se situe la balance. Ils
sont anesthésiés en groupe puis pesés et mesurés de manière individuelle. Ils sont sexés
morphologiquement lorsque cela est possible (Figure 34). Ensuite ils sont placés dans un bac de
réveil puis retournent dans leur aquarium d'origine après nettoyage de ce dernier.
Dans le cadre de l'exposition par le sédiment, la croissance a été mesurée entre 3 et 8 mois
post fécondation (mpf). Lors de l'exposition par voie alimentaire, le suivi de croissance mensuel a
débuté au troisième mois post fécondation et s'est poursuivi jusqu'à 9 mpf.
b) Etude de la calcification des vertèbres et de la mâchoire
La coloration à la calcéine a été adaptée d'après les travaux de Du et al. (Du et al., 2001).
La calcéine est un chromophore de formule brute C30H26N2O13. Elle pénètre facilement et
rapidement dans l'embryon de poisson zèbre et elle se lie spécifiquement au calcium. Une solution
à 0.2% est préparée à partir de 2 g de poudre de calcéine et 1L d'eau désionisée. Du NaOH est
103
ensuite ajouté pour retrouver un pH neutre. Les larves de 15 jpf, qui ont été exposées aux 3
fractions de HAP pendant 10 jours, sont immergées 10 minutes dans la solution de calcéine à
0.2%. Elles sont ensuite rincées dans du E3 et disposées sur des lames creuses dans de la
methylcellulose à 3% (Figure 35). Cette coloration nous a permis de faire des comptages de
vertèbres et des calculs de longueur et d'angle de la morphologie de la mâchoire.
104
Ponte en
couple
Récolte des
œufs
50 embryons
par boite
Début
alimentation
5 jpf
Fin
expérience
15 jpf
calcéine
10 min
Rinçage
Prise de vue
latérale
Comptage
vertèbre
Prise de vue
ventrale
Mesure
distance et
angle
Figure 35 : Dispositif expérimental de coloration à la calcéine en vue d'étudier la calcification des vertèbres et de la morphologie de la
mâchoire.
Points 1 et 2 : axe de la mâchoire. 3 et 4 : points de la mâchoire antérieure. 5 et 6 : points de la mâchoire postérieure. Calcul des angles (1-2.3, 12.4, 1-2.5 et 1-2.6) et des longueurs (2-3, 2-4, 2-5, 2-6).
105
Deux photos ont été prises pour chaque poisson. La première a été réalisée en vue latérale
au grossissement 6.3 de la loupe binoculaire. Le poisson est entièrement dans le champ. La
deuxième a été prise en vue ventrale au grossissement 32 de la loupe binoculaire et seule la
mâchoire a été photographiée. Les photos ont été analysées avec le même protocole que Xiong
(Xiong et al., 2008) (Figure 35).
2) Comportement
Pour la réalisation des tests comportementaux, une salle dédiée à l'éthologie a été utilisée.
Seul le test de l'apprentissage des couleurs a été réalisé dans une autre salle pour des raisons
pratiques. La salle d’éthologie est maintenue à 28°C, ce qui correspond aux conditions de la salle
d'élevage des poissons. Le cycle jour/nuit est lui aussi calqué sur celui de la salle d'élevage et
correspond à 14h de jour (de 8h30 à 22h30) et à 10h de nuit (de 22h30 à 8h30). Toutes les
expériences sont réalisées avec un rétro-éclairage infrarouge, invisible pour l'homme comme pour
les poissons, plus une source de lumière visible LED pour les expériences réalisées en journée.
L'analyse vidéo s'est faite avec Ethovision XT 7 et 8. Tous les trackings vidéo sont ensuite
de nouveau analysés et visionnés pour une meilleure analyse et surtout pour une vérification
d'éventuelles erreurs de tracking. Les données sont ensuite exportées en format texte et importées
sous Excel pour les analyses.
Chez les poissons exposés par sédiment contact, le seul stade testé chez les F0 (génération
de poisson directement en contact avec les HAP) est le stade adulte à 6mpf (Figure 32). Le stade
juvénile n'a pas été pris en compte car nous ne disposions que d'une série de poissons. La quantité
de poissons disponibles n'était pas suffisante et comme la question principale était de caractériser
les effets à long terme d'une exposition précoce, nous avons préféré tester les poissons à 6mpf.
Chez les poissons contaminés par voie alimentaire, les études comportementales ont été réalisées
au stade juvénile à 2mpf et au stade adulte à 6 mpf. Les logos utilisés pour détailler ces tests sont
présentés en Figure 36.
Début de la vidéo
Phase de jour/de lumière
Fin de la vidéo
Phase de nuit/de noir
Figure 36: Logos utilisés dans l'explication du déroulement des protocoles de comportement
106
a) La locomotion vue zénithale
La locomotion pendant 24 heures a été analysée chez ces poissons. L’objectif de ce test est
d’évaluer le temps de nage effectif et l’activité de nage des poissons en conditions normales, c'està-dire sans aucun stress extérieur. C'est la locomotion basale que nous voulons évaluer dans ce
cas. La vue zénithale nous permet de mesurer la distance parcourue par le poisson dans le plan
horizontal. Ce test a été réalisé pour l'exposition par voie sédimentaire et par voie orale et la
photopériode a été synchronisée avec celle de la salle d'élevage. Le matin du jour 0 (J0), les bacs
de 3L sont installés, comme sur la Figure 37, et sont remplis avec 1.5L d'eau prélevée en salle
d'élevage. Les poissons sont ensuite acclimatés de manière individuelle aux alentours de 17h le
jour 0 (J0) dans le bac dans lequel ils seront filmés (Figure 37). Ils sont visuellement isolés de
leurs congénères par des plaques de Komatex® blanches.
Figure 37 : Planning et dispositif expérimental de la locomotion 24h en vue zénithale de
l’acclimatation des poissons jusqu’à la fin des 24 heures de vidéo.
A 12h30 le jour 1 (J1), l'enregistrement est lancé. Les poissons sont laissés libres sans
aucun stress extérieur pendant 24 heures. A la fin des 24 heures, l'enregistrement est stoppé
(Figure 37). La distance parcourue (en cm) et le temps d’immobilité (en sec) sur 24 heures sont
mesurés.
Les poissons sont à chaque fois disposés de manière à ce que l'ordre de passage diffère
pour les conditions entre chaque session. Par exemple, dans le cas des poissons contaminés par
l'aliment, les 4 conditions sont à chaque fois testées simultanément dans l'ordre présenté en Figure
38.
107
Figure 38 : Disposition des 4 conditions parmi les différentes sessions dans l'ordre des tests
pour éviter un effet du bac entre les sessions.
Ainsi, à la fin du test, des individus de toutes les conditions ont été filmé à chaque place
possible. Cette configuration nous permet de réduire au maximum l'effet position du bac lors du
test.
b) Réponse photomotrice en vue zénithale
L’objectif de ce test est d’évaluer, l’impact d’un stress lumineux sur l’activité de nage des
poissons. Ce test a été réalisé pour l'exposition par voie sédimentaire. A la fin de la vidéo 24h,
l'enregistrement est immédiatement remis en route sans aucune intervention dans les salles (Figure
39). A 13h30, c'est à dire 1h après le début de la vidéo, la lumière est éteinte pendant 15 minutes,
soit jusqu'à 13h45. A ce dernier horaire, la lumière est allumée à nouveau pour une période de
1h30. Cette période permet d'étudier la récupération des poissons après le stress.
Fin
locomotion
24heures
12h30
Lancement
de la vidéo
en mode jour
13h30
Mise au
noir
13h45
Allumage
15h15
Arrêt de la
vidéo
Biométrie
Remise en
bac
Figure 39: Planning et dispositif expérimental du stress lumineux en vue zénithale à la suite
du suivi de locomotion jusqu’à la remise en bac des poissons.
A la fin de ces deux premiers tests, la salle est rouverte et les poissons sont
individuellement endormis dans la benzocaïne (150µL dans 250 mL). Ils sont ensuite pesés (mg)
et mesurés (mm) (Figure 39). La distance parcourue (en cm) et le temps d’immobilité (en sec) en
réponse à un stress lumineux en pleine journée sont mesurés.
108
c) La locomotion vue frontale
L’objectif de ce nouveau test, est, comme pour la locomotion en vue zénithale, d’évaluer le
temps passé dans la partie haute, la partie moyenne et la partie basse du bac sans aucun stress. Le
protocole est le même que celui de la locomotion 24h en vue zénithale à l'exception des bacs qui
sont disposés l'un au dessus de l'autre au lieu d'être côte à côte. Ils sont visuellement isolés les uns
des autres (Figure 40). Ce test a été réalisé uniquement pour l'exposition par voie sédimentaire et
par voie orale et la photopériode a été synchronisée avec celle de la salle d'élevage.
Figure 40: Planning et dispositif expérimental de la locomotion 24h en vue frontale de
l’acclimatation jusqu’à la fin des 24 heures.
Le temps passé dans chaque zone (en min) sur 24 heures est mesuré.
d) Réponse photomotrice en vue frontale
Comme précédemment, l’objectif de ce test est d’évaluer la position du poisson dans la
hauteur d’eau de l’aquarium avant, pendant et après un stress lumineux. Le même protocole que
celui du test équivalent en vue zénithale a été utilisé ici (Figure 41). Ce test a été réalisé
uniquement pour l'exposition par voie sédimentaire.
109
15 min
Fin
locomotion
24heures
12h30
Lancement
de la vidéo J0
13h30
Mise au
noir
13h45
Allumage
15h15
Arrêt de la
vidéo J1
Biométrie
Remise en
bac
Figure 41: Planning et dispositif expérimental du stress lumineux en vue frontale à la suite
du suivi de la locomotion jusqu’à la remise en bac.
La position du poisson dans le bac (en sec) en réponse à un stress lumineux est la variable
mesurée dans ces deux derniers cas. Les trois mêmes zones que celle définies lors de la nage 24h
frontale sont utilisées.
e) Le labyrinthe en T
L’objectif du labyrinthe en T est d’évaluer le potentiel d’exploration des poissons dans un
environnement nouveau. Le T-Maze est une arène en T composée de 3 zones principales. Il a été
adapté du protocole de Norton et Bally-Cuif (Norton and Bally-Cuif, 2010). La première zone est
appelée "zone Shallow". Elle correspond à la zone en T du labyrinthe et est caractérisée par une
faible profondeur (5 cm d'eau) et des parois étroites (Fig 47). Au sein de cette zone, la zone "Start"
se trouve à la base du T. Elle est alternativement placée à droite et à gauche de la zone "Shallow".
La zone "Shallow" (Figure 42) mène d'un coté à une impasse, et de l'autre, à la dernière zone
nommée zone "Deep". La zone « Deep » est caractérisée par des parois foncées et la profondeur
d'eau est égale à 10 cm. En outre, le fond de la zone "Deep" est agrémenté de billes, d'herbe
synthétique et d'un tunnel pouvant servir d'abri. Cette zone est considérée comme une zone refuge
(Figure 42). Ce test a été réalisé sur les poissons exposés par voie sédimentaire et sur les poissons
PY exposés par voie alimentaire.
110
Figure 42 Dispositif expérimental du labyrinthe en T de l’acclimatation jusqu’à la fin du
test.
Le poisson est acclimaté la veille de manière individuelle aux alentours de 17h dans un bac
de 1L. Le lendemain matin, celui-ci est péché et immédiatement placé à l'extrémité de la zone
"Start". Tous les poissons sont filmés en continu pendant la durée du test qui est de 5 minutes. Par
la suite, ils sont replacés à la fin du test dans leur bac respectif (Figure 42).
Le temps passé dans chacune des 3 zones (en sec), le temps de sortie de la zone "Start" (en
sec) ainsi que le temps de latence pour arriver en zone "Deep" (en sec) sont les trois principales
variables d’intérêt mesurées de ce test et présentées dans ce manuscrit.
f) Le labyrinthe en Z
L’objectif du labyrinthe en Z, comme celui en T, est d’évaluer la capacité des poissons
dans un environnement nouveau. Le maze en Z est aussi un test de capacité d'exploration chez le
poisson mais il se présente un peu différemment du précédent. Il nous semblait plus adapté à de
l'exploration que le labyrinthe en T, qui a été créé pour de l'apprentissage. Il a été adapté de
Chapman et al. (Chapman et al., 2010). Le labyrinthe peut être découpé de plusieurs manières. Il
peut être partagé en 16 cases numérotées de 1 à 16, ou en 3 parties nommées "start" (case
d'acclimatation + case de sortie), partie proximale qui correspond aux cases 1 à 8 et partie distale
qui correspond aux cases 9 à 16. Le poisson est acclimaté de la même façon que précédemment,
111
mais, lorsqu'il est péché, il est placé dans la zone figurée en noir (appelée case d'acclimatation)
présentée dans la Figure 43. Après 2 minutes d'acclimatation, la porte de la zone d'acclimatation
est ouverte.
Acclimatation
en bac de 1L
5 minutes dans
le labyrinthe en
Z après
première sortie
Pêche du
poisson
1
Case de
sortie
1
2
3
Pêche du
poisson
Acclimatation
en bac de 1L
4
16
Partie
proximale
Partie
distale
Figure 43: Dispositif expérimental du labyrinthe en Z de l’acclimatation jusqu’à la fin du
test.
Les 5 minutes d'exploration commencent à partir du moment où le poisson est sorti
entièrement de cette zone noire, lorsqu'il est dans la case de sortie (Figure 43). A la fin de ce
temps, le poisson est repêché et remis dans son bac d'acclimatation. Ce test a été réalisé sur les
poissons exposés par voie alimentaire au mélange aux fractions HO et LO, ainsi que sur les F1 du
mélange PY à 2 mpf.
Le temps passé dans chacune des 3 zones (partie "start", partie proximale et partie distale
en sec), le temps de sortie de la zone d'acclimatation (en sec) ainsi que le score du poisson (de 1 à
16 correspondant à la case atteinte qui se trouve le plus loin de la case départ) (Figure 43) sont les
trois principales variables analysées de ce test et présentées dans ce manuscrit.
g) Test d'anxiété
L’objectif de ce test d'anxiété, réalisé dans le dispositif appelé "novel tank", est d’évaluer
la position verticale du poisson dans un environnement nouveau pour évaluer son degré d'anxiété
(Egan et al., 2009). Ce test a été réalisé sur les poissons exposés par voie alimentaire. La
particularité de ce test, est qu'il étudie l’exploration verticale sur un temps court. Il permet de
mettre en évidence un déplacement vertical du poisson. Ce challenge se déroule dans un aquarium
112
de 1,5L qui contient une hauteur d’eau de 12 cm, d’une longueur à la base de 22 cm et au sommet
de 28 cm. Ce bac est subdivisé en deux zones d’aire égale : 1 zone haute ("top") et une zone basse
("bottom") séparées virtuellement par une ligne horizontale (Figure 44). La zone « bottom » est
considérée comme une zone refuge.
Figure 44: Dispositif expérimental de l'évaluation de l'anxiété de l’acclimatation à la remise
en bac.
Le poisson est acclimaté la veille de manière individuelle aux alentours de 17h dans un bac
de 1L. Le lendemain matin, celui-ci est testé dans le labyrinthe le matin, puis immédiatement
après, il est replacé dans son pondoir qui lui a été attribué la veille. Dans l’après midi, entre 13:30
et 17:00, le poisson est pêché dans son bac d’acclimatation et immédiatement placé dans le "novel
tank". Il est filmé en continu pendant 6 minutes suivant le protocole d’Egan et al. (Egan et al.,
2009). A la fin de ce temps, le poisson est repêché dans le bac, puis endormi à l’aide de
benzocaïne (150µL dans 250mL). Il est systématiquement pesé et mesuré avant d’être réveillé et
remis en place dans son bac d’élevage (Figure 44).
Le temps passé dans chacune des 2 zones ("top" et "bottom" en sec), la distance parcourue
(en cm/min) et le temps d'immobilité (en sec) sont extraits à l’aide du logiciel Ethovision XT, et
analysés pour chaque minute.
113
3) Reproduction
a) Caractérisation fonctionnelle
Le suivi de la reproduction nous permet d'estimer l'impact du polluant sur le poisson luimême, mais aussi sur la population entière. A partir de 3 mpf, nous avons cherché à déterminer
l'âge de la première ponte en récoltant les œufs des poissons dans les bacs d'élevage. A cet effet
des pondoirs sont placés la veille en fin d'après-midi. Le lendemain matin, la lumière s'allume à
8:30 et les pondoirs sont collectés à 9:30, soit 1 h après l'allumage (Figure 45). De même que,
lorsque les poissons sont plus vieux et pondent mieux, des pontes en couples ont été réalisées,
chez les poissons PY et HO exposés par voie trophique. Les poissons sont alors placés la veille
deux par deux dans des pondoirs de 1L. La ponte est récoltée le lendemain matin. Dans les deux
cas, les poissons sont isolés de leurs œufs par une grille pour éviter le cannibalisme. Les pontes
sont collectées à l'aide d'une épuisette et placées en boîtes de Pétri. Les œufs sont ensuite triés. Les
œufs fécondés sont gardés pour d'autres expériences alors que les non fécondés sont retirés et jetés
(Figure 45). Ce test a été réalisé sur les poissons exposés par voie sédimentaire et alimentaire.
J0 mise
en bac
J1 9h30
Récolte
des œufs
Tri et
comptage
J0 mise
en couple
Figure 45: Dispositif expérimental d'étude de la reproduction en bac ou en couple.
Les pontes sont ensuite caractérisées en fonction de la qualité de ponte, classées par
tranche de 20%. La tranche allant de 0 à 20% pour les pontes ayant un taux de fécondation très
faible et jusqu'à la tranche entre 80 à 100% pour les pontes présentant un excellent taux de
fécondation, qui représente pour le poisson zèbre, la classe habituelle.
114
Le nombre d'œufs fécondés est normalisé en fonction du nombre de femelles présentes
dans le bac ainsi que le nombre de sollicitations.
b) Histologie des ovaires
L'histologie des ovaires nous permet de mieux comprendre les résultats obtenus avec la
reproduction. Cette analyse a été réalisée uniquement sur les poissons exposés par voie
alimentaire. A 9 mpf dans le cas des PY et des LO et à 7 mpf dans le cas des HO, les poissons sont
euthanasiés par surdose d'anesthésique. Le ventre est incisé par l'anus et sur environ 1 cm en
direction du cœur. Ils sont stockés dans du formol 4% et envoyés au laboratoire d'histopathologie
de l'ONIRIS à Nantes. Là bas, ils sont inclus dans de la paraffine, et des coupes standardisées sont
réalisées (Figure 46). Elles sont colorées avec la technique de l'hématoxyline éosine et fixées.
Dans un premier temps, la surface totale de l'ovaire est détourée sur 3 lames par poissons. La
surface nécrotique si l'ovaire en présente une est également calculée (Figure 46) et le pourcentage
de surface nécrotique est analysé.
Figure 46: Analyse histologique des ovaires. Calcul des surfaces totales et nécrotiques et
comptage des stades folliculaires.
Dans un deuxième temps, le nombre de follicules de chaque stade (I, II, III et IV) est
comptabilisé sur 2 lames par femelles (Figure 46) et la proportion de nombre de ces follicules est
calculée.
4) Transfert maternel
Chez les larves F1, c'est à dire n'ayant jamais été en contact direct avec les contaminants
mais étant issues de parents contrôles ou contaminés, des tests comportementaux, des analyses
morphologiques ainsi que la quantification d'expression de l'aromatase dans le cerveau ont été
réalisées.
115
a) La locomotion vue zénithale
La locomotion en vue zénithale chez les larves permet, comme chez les adultes, d'évaluer
la distance parcourue en locomotion basale (Vignet et al., 2013). Ce test a été réalisé sur les
poissons F1, issus de poissons exposés par voie alimentaire à la fraction LO et PY. A 3 jpf, tout
juste écloses, les larves sont placées de manière individuelle dans des plaques 24 puits à parois
blanches opaques et à fond transparent. La plaque est ensuite placée dans la boite de test réglée sur
la même photopériode que l'étuve et la salle d'élevage (14h jour/10h nuit).
Figure 47: Dispositif expérimental de la locomotion 72 heures chez les larves entre 4 et 7 jpf
de l'acclimatation en plaque 24 puits jusqu'à la fin des 72 heures de vidéo.
A 12h le lendemain, la vidéo est lancée pour 72 heures non stop avec le logiciel Ethovision
XT. Cette expérience représente 4 jours et 3 nuits d'enregistrement (Figure 47). A la fin de ces 72
heures, la vidéo est arrêtée et enregistrée. L'analyse de ces vidéos est semi automatique. En effet,
le logiciel suit la larve seule mais il faut vérifier tout au long de l'analyse que celle-ci est détectée
correctement. Toutes les vidéos réalisées ont donc été visionnées en entier. Après le test, les larves
sont replacées dans leurs conditions d'élevage standard.
b) Réponse photomotrice en vue zénithale
En complément de la locomotion, comme pour les adultes, une réponse à un changement
lumineux est également évaluée chez les larves. Nous n'avons pas réalisé de tests
comportementaux sur les animaux au stade larve (5 jpf) exposés par voie sédimentaire directement
car nous étions limités en quantité de sédiment pour exposer les poissons. Une partie de la
116
descendance a été élevée et nous avons pu réaliser des tests comportementaux chez les F1
(poissons qui n'ont jamais été en contact avec les contaminants mais qui sont issus de parents
contaminés (F0)) à 5 jpf (Figure 32). La principale différence entre les adultes et les larves sur ce
test est le moment où il est réalisé (MacPhail et al., 2009). En effet, chez les adultes, ce test est
lancé juste après les 24 heures de locomotion basale alors que chez les larves, ce test est appliqué
à 5 jpf sur des larves différentes de celles du test précédent. Le même dispositif que pour la
locomotion chez les larves est utilisé.
A 4 jpf, les larves sont placées de manière individuelle dans les puits et laissées pour la
nuit à l'étuve (Figure 48). Le lendemain matin, lorsque les embryons ont 5 jpf, la plaque est
transférée 2 heures avant le début de l'expérience dans la salle de manipulation sur une plaque
rétroéclairée, afin de s'habituer à la lumière diffusée par le dessous lors du test. Ce test a été réalisé
sur les poissons F1, issus de poissons exposés par voie sédimentaire et alimentaire à toutes les
fractions. De plus, ce test a également été appliqué aux larves PY F2.
Figure 48 : Dispositif expérimental de la réponse à un stress lumineux chez les larves de
l'acclimatation en plaque 24 puits à l'arrêt de la vidéo après 15 min d'enregistrement.
En début d'après-midi, la première plaque est transférée dans la boîte d'expérience, et,
après 10 min d'acclimatation (10 min à la lumière pour les PY et 5 min à la lumière puis 5 min au
noir pour les HO et LO pour suivre un protocole similaire à celui sur le médaka utilisé dans le
même projet (Le Bihanic et al., submitted-b)), l’enregistrement est lancé (Figure 48). Il va
117
permettre d'analyser les 5 premières minutes à la lumière, puis les 5 minutes de noir et les 5
minutes de récupération après la phase sombre (Figure 48).
c) Etude de l'expression de l'aromatase dans le cerveau et exposition à
l'ethinylœstradiol (EE2)
Des poissons de la lignée transgénique cyp19a1b GFP (ZFIN ID: ZDB-GENO-110126-4)
ont été exposés par voie trophique de la même façon que les TU (Figure 31) et les analyses ont été
réalisées sur leur descendance. A partir de 3 mpf, les poissons sont mis à pondre en bac. Les œufs
sont ensuite récoltés. Les œufs fécondés sont séparés des non fécondés. Trente œufs fécondés sont
disposés par bécher avec 30 mL de E3 (Figure 49). Quand cela était possible, 5 concentrations
d’EE2 ont été utilisées pour chaque concentration de HAP : un contrôle et 4 concentrations de
EE2 (0.005; 0.017; 0.05 et 0.17 nM) (Brion et al., 2012). Ce test a été réalisé sur les poissons F1,
issus de poissons exposés par voie alimentaire à toutes les fractions. Les béchers sont ensuite
incubés à l'étuve à 28°C, réglée avec la même photopériode que la salle d'élevage.
Figure 49 : Protocole expérimental d'exposition à l'EE2 pour analyser l'expression de
l'aromatase dans le cerveau à 6 jpf.
Au sixième jour après fécondation, les larves vivantes sont anesthésiées avec la benzocaïne
(150µL dans 250 mL) et placées sur le ventre sous le microscope à fluorescence (Figure 49)
(Brion et al., 2012). Tous les cerveaux de larves sont pris en photos à l'objectif x10. Les images
sont ensuite analysées avec Image J.
VII Validation de la méthode
1) Taille des puits et des bacs
Avant de commencer nos tests comportementaux sur une activité de nage, nous nous
sommes interrogés sur la taille du contenant. Nous nous sommes demandés si la taille du bac avait
118
un impact sur l’activité de nage du poisson. Cette question a déjà été posée dans le cas de la
locomotion, même en test court, chez les larves de poisson zèbre. En effet, une étude de Padilla et
al. teste la différence de distance parcourue chez des larves de 6 jpf placées dans des plaques de
24, 48 et 96 puits (Padilla et al., 2011). Le résultat indique que, quelle que soit la phase lumineuse
(lumière ou noir), la distance parcourue est relativement faible dans les plaques 48 et 96 puits
(entre 0 et 5 cm parcouru en 20 min le jour et entre 5 et 10 cm/20min en phase de noir). En
revanche, les larves testées dans les plaques de 24 puits nagent plus (entre 5 et 15 cm/20min en
phase lumineuse et entre 15 et 25 cm/20min en phase de noir). La discrimination de différence
d'activité locomotrice sera donc plus grande si on utilise des plaques 24 puits. C'est par conséquent
ce que nous avons retenu dans nos tests avec les larves.
Nous nous sommes posé la même question pour les juvéniles à 2 mpf et a fortiori pour les
adultes à 6 mpf. Nous avons comparé leur activité dans des bacs de 3 volumes différents. Des bacs
de 1L (195 x 80 x 95 mm AquaSchwarz, Germany), des bacs de 3L (245 × 150 × 135 mm,
AquaBox® 3, Aqua Schwarz GmbH, Göttingen, Germany), et des bacs de 10L (Ehret,
Polycarbonate PC 3108, type III cage, 265 x 150 x 240 mm) ont été utilisés. Chaque bac était
rempli d'eau à la moitié de sa capacité totale pour éviter tout risque de saut de la part des poissons,
soit respectivement des volumes utiles de 0.5, 1.5 et 5 L.
La veille du début de l'expérience, les poissons de 6 mpf, de sexe males et de mensurations
équivalentes (taille ≈ 2.8 cm et poids ≈ 255 mg) sont acclimatés aux alentours de 17h00 dans le
dispositif. Les conditions sont similaires à celles décrites dans le protocole de la Figure 37.
Chaque poisson est seul dans son bac et visuellement isolé de ses congénères pour ne pas biaiser
l'expérience. Le lendemain, à 12h30, l'enregistrement vidéo est lancé pour une durée totale de 24h.
Après ces 24 heures, les poissons sont remis dans leurs bacs d'élevage. A la fin de l'expérience, 11
poissons ont été testés en bac de 1L, 9 en bac de 3L et 8 en bac de 10L.
Les résultats de cette expérience sont présentés en Figure 50, où les données brutes sont
représentées avec un point toutes les 30 minutes. Sur cette figure, on note que les poissons qui
nagent dans les bacs de 1L ont toujours une activité inférieure aux autres. Les poissons testés en
bac de 3 et 10L présentent une activité de nage similaire le premier jour. En revanche, pendant la
période de nuit, les poissons évoluant dans le plus grand volume parcourent plus de distance que
leurs congénères testés en volume inférieur.
119
Figure 50 : Influence de la taille du bac sur la locomotion.
La phase de nuit est représentée en grisé sur toutes les figures. Poissons en bac de 1L en bleu clair,
poissons en bac en 3L en bleu turquoise et poissons en bac de 10L en bleu foncé. a) Distance
parcourue toutes les 30 minutes. b) Distance parcourue groupée par période de 6 ou 7 demiheures, excepté pour les changements lumineux qui représentent une demi-heure. c) Distance
parcourue groupée par période de jour et de nuit.
Les Figure 50 b et c présentent les mêmes données mais regroupées pour les analyses
statistiques. La Figure 50 b exprime les données groupées en période de 6 ou 7 demi-heures.
Seules les phases de changement de lumière (passage du jour à la nuit et inversement) ont été
conservées en une seule demi-heure, car ces deux périodes représentent des pics d’activité
spécifiques. On observe globalement une activité de nage, donc une distance parcourue, plus
faible pour les poissons testés en petit volume. Cette distance augmente ensuite avec la taille du
bac. Cette tendance est vraie de jour comme de nuit.
Un test statistique de type GLM a été appliqué sur les données groupées par périodes
(Figure 50 b). La taille des bacs et les périodes ont été utilisées en tant que facteur fixe, alors que
120
la session et le numéro de poisson ont été intégrés en facteurs aléatoires. Chaque facteur a été testé
indépendamment puis l'interaction entre les deux facteurs fixes a été analysée. Seuls les résultats
concernant les facteurs fixes seront présentés ici. Un effet période (F=12.23; p<0.001) et un effet
taille de bac (F=6.44; p=0.002) ont été mis en évidence. En revanche, il n'y a pas d'interaction
significative entre ces deux facteurs. Les poissons qui nagent dans le petit volume (bac 1L) nagent
significativement moins (p=0.006) que ceux qui nagent dans un grand volume (bac 10L). En
revanche, les poissons analysés dans un volume intermédiaire (bac 3L) ne présentent pas de
différence ni avec les poissons testés dans 1L, ni avec ceux testés dans 10L.
La Figure 50 c représente les données réparties en 2 groupes : la période de jour versus la
période de nuit. La Figure 50 c nous informe que l'activité moyenne de nage en période de nuit est
plus faible qu'en période de jour, et ce, quelle que soit la taille du bac. On retrouve également une
tendance à l'augmentation de la distance parcourue avec l'accroissement du volume dans lequel le
poisson peut nager. Le même test statistique que précédemment a été appliqué avec les mêmes
facteurs. Dans ce cas, nous avons pu mettre en évidence un effet période (F=11.15; p=0.002), mais
nous n'avons pas trouvé d'effet du bac ni d'interaction significative.
Pour les bacs de 1L, on peut tester jusqu'à 18 bacs à la fois en une session de 24h alors que
pour les 10L, on ne peut tester que 4 bacs. En faisant le choix de garder des bacs de 3L, nous
pouvons analyser 12 poissons par série de 24h et obtenir une mesure de l'activité de nage correcte.
En effet, celle ci n'est pas différente de celle obtenue en bac de 10L. Suite à cette expérience, nous
avons choisi de tester les poissons dans des bacs de 3L remplis à la moitié de leur capacité.
2) Caractérisation de l'anxiété
Dans le cadre de cette thèse, nous souhaitions utiliser certains tests pour caractériser
l’anxiété chez des poissons contaminés. Le test du "novel tank" a été mis au point dans ce but
(Cachat, 2013; Egan et al., 2009). Il fait partie des tests utilisés dans cette étude. Cachat (2013) a
montré dans sa thèse, que, au cours des 6 minutes de test, des poissons zèbres exposés à certaines
molécules par balnéation quelques minutes avant le test, pouvaient montrer des inhibitions ou des
amplifications des réponses de stress. Un poisson adulte contrôle présente une forte anxiété au
début du test et occupe préférentiellement la partie inférieure du bac. Puis, au fur et à mesure que
le temps passe, le poisson est moins anxieux et le temps passé dans la zone haute du bac augmente
(Figure 51 a). Si l’on analyse l’évolution du temps passé en zone haute chez les poissons contrôle,
on voit une augmentation quasiment linéaire au cours du temps. Ce comportement est modulé par
un traitement avec un anxiolytique ou un anxiogène.
121
Dans le cas présent, nous avons utilisé, à l’instar de Cachat (2013), la nicotine et la
fluoxétine comme molécules anxiolytiques. La nicotine imite l'action de l'acétylcholine
(neurotransmetteur naturel). Elle entraîne une libération de dopamine qui augmente la sensation de
plaisir. Dans le cas d'une exposition aiguë, comme c'est le cas dans notre étude, la libération de
dopamine entraîne un bien-être chez le poisson et diminue son niveau d'anxiété (Cachat, 2013;
Sackerman et al., 2010). Les effets à long terme sont différents puisque la nicotine entraîne une
inactivation des récepteurs nicotiniques et crée un effet de manque.
La fluoxétine est un modulateur de la sérotonine. C'est aussi la molécule active du prozac.
Chez un patient déprimé, la sérotonine est libérée mais elle ne se fixe pas sur le récepteur. Elle est
recapturée par le neurone pré-synaptique. La fluoxétine est un inhibiteur sélectif de la recapture de
la sérotonine, c'est-à-dire qu'elle diminue cette recapture par le neurone pré-synaptique. La
sérotonine reste donc piégée plus longtemps dans la fente. Ce mécanisme compense le faible taux
de sérotonine libéré et diminue ainsi le niveau d'anxiété (Cachat, 2013; Richendrfer et al., 2012).
Nous avons utilisé la caféine comme molécule anxiogénique, comme dans la thèse de
Cachat (2013). La caféine agit comme un stimulant du système nerveux en bloquant les récepteurs
adénosines qui ont pour but de limiter la libération de neurotransmetteurs excitateurs. La caféine
peut provoquer des symptômes tels que l'insomnie, la confusion, l'augmentation de la vigilance,
une augmentation de la contraction musculaire ou l'arythmie cardiaque. Quel que soit l'âge du
poisson zèbre et la concentration (50, 100 ou 250 mg/L), les effets anxiogéniques de cette
molécule ont été mis en évidence dans plusieurs études (Cachat, 2013; Egan et al., 2009; Schnörr
et al., 2012).
Nous avons voulu vérifier que nous obtenions les mêmes effets dans notre laboratoire avec
notre matériel, pour ensuite, valider ce que l’on pourra mettre en évidence avec des poissons
exposés aux HAP. Nous avons mesuré les variables suivantes : le temps passé en zone haute par
minute, le temps d’immobilité (en sec) et la distance parcourue (en cm/6min).
Nous avons testé 15 poissons issus de la lignée TU par condition. Ces poissons ont été
acclimatés la veille en groupe de 15. Le matin suivant, les poissons étaient pêchés et contaminés
de manière individuel par balnéation : pendant 5 minutes pour la fluoxétine à 1 mg/L et pendant
20 minutes pour la caféine à 250 mg/L et la nicotine à 5 mg/L. Immédiatement après la balnéation,
le poisson est transféré dans le "novel tank" et le protocole expliqué en Figure 44 est appliqué. A
la fin de cette durée, le poisson est anesthésié dans de la benzocaïne (150µL dans 250 mL) pour
être pesé (en mg) et mesuré (en cm). Les résultats de ce test sont présentés en Figure 51.
122
60
Control
*
Caffeine
Fluoxetine
Nicotine
a
*
50
Time in sec
40
30
20
10
0
Min-1
Min-2
Min-3
Min-4
250
150
100
50
b
*
200
Time in sec
Min-5
Min-6
1600
c
1200
*
800
400
0
0
Control
Caffeine
Fluoxetine
Nicotine
Control
Caffeine
Fluoxetine
Nicotine
Figure 51 : Effets de molécules anxiolytiques et anxiogéniques sur le comportement des
poissons.
Poissons contrôle en vert, poissons exposés à la caféine en marron, poissons exposés à la
fluoxétine en bleu clair et poissons exposés à la nicotine en bleu foncé. a) Temps passé en zone
haute par minutes. b) Temps d'immobilité durant 6 minutes. c) Distance parcourue en cm pendant
les 6 min. Différences significatives par rapport au contrôle signalées par une étoile.
Lorsqu'on regarde le temps passé en zone "top", on remarque que le poisson contrôle y
passe peu de temps les deux premières minutes. Puis, la durée augmente au fur et à mesure du test
(Figure 51a). Lorsque le poisson est exposé à la caféine, on observe que le temps passé dans cette
même zone est à peu près constant, comme pour les poissons exposés à la fluoxétine. A l'inverse,
dans le cas des poissons exposés à la nicotine, le temps passé en zone haute est très élevé au départ
puis diminue avec le temps. On observe l'effet inverse de celui du contrôle. Le test statistique
(GLM) nous indique un effet de la condition (F=11.04; p<0.001) et un effet de l'interaction entre
la condition et le temps (F=2.93; p<0.001). La différence de temps passé en zone haute est mise en
avant par le post test lors des minutes 1 et 2, où les poissons exposés à la nicotine restent
significativement plus dans cette zone que les contrôles (Min-1 : p <0.001; Min-2 : p =0.001).
123
Dans un deuxième temps, nous avons mesuré le temps d'immobilité du poisson pendant
toute la durée du test (6 min). Sur 360 secondes de test, les poissons non exposés restent un peu
plus de 20 sec immobiles (Figure 51b). Une différence du temps d’immobilité entre les conditions
a été mise en évidence (F=10.22; p<0.001). Les poissons contaminés avec un anxiogénique
(caféine) ont un temps d'immobilité très supérieur aux autres (plus de 160 s ; p<0.001).
Enfin, nous avons regardé la distance totale parcourue durant les 6 minutes de test. Comme
pour le temps d'immobilité, on note un effet de la condition (F=10.22; p<0.001) et les poissons
exposés à la caféine nagent significativement moins que les contrôles (p<0.001). Ces deux
derniers résultats sont bien évidemment liés car un poisson qui reste longtemps immobile passe
moins de temps à nager et parcourt moins de distance.
Les résultats observés dans le cadre de ce test sont similaires à ceux obtenus dans le cadre
de la thèse de Cachat (Cachat, 2013). Notre méthode et notre matériel sont donc validés pour
pouvoir réaliser la suite de nos expériences avec des mélanges de molécules plus complexes.
124
125
126
RESULTATS : EFFETS D'UNE EXPOSITION AUX HAP A LONG TERME
Tout au long de ce travail de thèse, l'objectif était d'identifier les effets à long terme des
HAP en mélanges représentatifs de situations environnementales sur des fonctions ou processus
importants pour la survie de l’espèce. La survie, la croissance, la reproduction et le comportement
du poisson zèbre ont été analysé. Deux types de voies de contaminations, présentées
précédemment, ont été mises en place. Dans un premier temps, nous avons tenté de caractériser les
effets à long terme d'une exposition courte, effectuée pendant le développement embryo-larvaire
(entre 0 et 96 hpf). Cette expérience sera l'objet du premier article accepté présenté dans les
résultats. Dans un deuxième temps, nous avons opté pour une contamination chronique par voie
alimentaire avec les 3 fractions de HAP présentées précédemment. L’étude de l’effet de ces 3
fractions a fait l'objet de 4 articles. Dans chaque article, les effets des trois fractions ont été étudiés
en parallèle. Un premier article accepté, qui décrit en détail les expositions et leurs effets sur les
variables de survie et de croissance sera présenté, puis un second, accepté0 également, traitera des
aspects comportementaux chez les poissons directement exposés. Un troisième, en préparation,
abordera le volet reproduction et enfin, le quatrième, en préparation également, analysera les effets
observés sur la descendance.
I Effets des HAP après une exposition sur le sédiment à 3 HAP individuels
(article 2)
Dans le cadre de ConPhyPOP, l'exposition par voie sédimentaire représentait le premier
volet de ce projet. Ces embryons ont été exposés aux HAP pendant le développement embryolarvaire. Ces expositions devaient permettre de mieux comprendre les effets de ces molécules en
mélange sur le développement du poisson zèbre et les contaminations à long terme. Elles avaient
pour objectif d'évaluer les effets d'une exposition précoce à des HAP. Ceux-ci étant des composés
lipophiles, nous avons choisi d'enrober du sédiment naturel avec un mélange de 3 HAP. Des doses
environnementales, mesurées sur du sédiment de la baie de Seine (Vicquelin et al., 2011) ont été
utilisées. Le sédiment a été enrobé avec du phénanthrène, du pyrène et du benzo[a]pyrène. Ces
trois HAP possèdent respectivement 3, 4 et 5 cycles aromatiques. Au cours de cette expérience,
208 expositions de 30 embryons chacune, soit 6280 embryons au total ont été réalisées par cette
voie pour tous les partenaires du projet. Une série a servi à réaliser l'étude présentée ci-après. Des
embryons exposés 96 hpf ont ensuite été transférés en eau propre et élevés jusqu'à 6 mois post127
fécondation (mpf). Durant cette période, la croissance, la survie, la reproduction et le
comportement ont été évalués.
Aucune différence de mortalité n'a été observée sur les poissons directement exposés. En
revanche, une diminution de la croissance a été observée, avec une réduction de la longueur à 8
mpf et une diminution du poids à 5 et 8 mpf. Les poissons contaminés ont également tendance à
pondre moins que les poissons contrôles, bien que cette différence ne soit pas significative. En
revanche, la survie des larves issues de ces poissons exposés est significativement plus faible que
celles des larves issues de poissons contrôles. Au niveau du comportement, plusieurs tests se
basant sur la locomotion ont été réalisés. Certains évaluant la locomotion basale, d'autres la
locomotion sous forme de challenge en réponse à un stress ont été mis en place. Des différences,
au niveau de la réponse photomotrice notamment, ont pu être observées chez les adultes
directement exposés aux stades embryonnaires ainsi que chez leurs descendants.
Ces 3 HAP ont été choisis en raison de leur abondance dans les fractions de types
pyrolitiques. D’autre part, ils possèdent 3, 4 et 5 cycles et sont donc représentatifs de la variété des
HAP présents dans ce mélange. Toutes les variables mesurées nous indiquent qu'une exposition
courte pendant une période critique du développement peut avoir des effets visibles sur le long
terme, y compris sur la reproduction.
Tableau 4: Récapitulatif des résultats de l'article 2
Variables mesurées
Poissons exposés comparés aux contrôles
Métabolites
↑
Survie
-
Croissance
↓
Reproduction
Tendance à la↓
Comportement F0
↓
Comportement F1
↑ activité de nage post challenge
128
Long-term disruption of growth, reproduction and behavior after embryonic exposure of
zebrafish to PAHs-spiked sediment.
Caroline Vigneta, Marie-Hélène Devierb, Karyn Le Menachb, Laura Lyphoutc, Jérémy Potiera,
Jérôme Cachotb, Hélène Budzinskib, Marie-Laure Bégoutc, Xavier Cousina,d*
a Ifremer, Laboratoire d’Ecotoxicologie, Place Gaby Coll, BP7, 17137 L’Houmeau, France
b University of Bordeaux 1, EPOC, UMR CNRS 5805, 33405 Talence, France
c Ifremer, Laboratoire Ressources Halieutiques, Place Gaby Coll, BP7, 17137 L’Houmeau, France
d INRA LPGP, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes, France
* Corresponding author: Xavier Cousin – [email protected]
Tel +33 5 46 50 06 21 – Fax +33 5 46 50 06 50
Abstract
A natural sediment spiked with three individual PAHs (pyrene, phenanthrene and
benzo[a]pyrene) was used to expose zebrafish embryos and larvae during 4 days. The total PAH
concentration was 4.4 µg.g-1 which is in the range found in sediment from contaminated areas.
Quantification of metabolites in larvae after exposure confirmed the actual contamination of
larvae and indicated an active metabolism especially for pyrene and benzo[a]pyrene. After a
transfer in clean medium, larvae were reared to adulthood and evaluated for survival, growth,
reproduction and behavior. Measured endpoints revealed a late disruption of growth (appearing at
5 months) and a trend toward a lower reproductive ability. Adults of embryos exposed to sediment
spiked with PAHs displayed lethargic and/or anxiety-like behaviors. This latter behavior was also
identified in offspring at larval stage. All together these effects could have detrimental
consequences on fish performances and contribution to recruitment.
Keywords: Danio rerio, polycyclic aromatic hydrocarbon, lifecycle, anxiety-like behavior,
offspring
Introduction
129
Among organic pollutants, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) constitute a diverse
family of molecules made of the association of at least two aromatic rings. PAHs emission in the
environment is directly linked to human activity and increased over the last decades (Shen et al.,
2013). PAHs are produced during the incomplete combustion of organic matter and are naturally
abundant in oils. PAHs are always present in the environment as complex mixtures, the
composition of which depends on contribution from pyrolytic or petrogenic sources. Pyrolytic
mixtures are characterized by higher levels of heavy PAHs such as benzo[a]pyrene (BaP) while
petrogenic mixtures contain lesser amounts of heavy PAHs and greater amounts of light PAHs and
alkylated-PAHs (Latimer and Zheng, 2003). Pyrolytic PAHs are emitted in the atmosphere and
deposited in water or soils (Shen et al., 2013). Petrogenic PAHs can be directly discharged in
water in case of oil spill or as a result of naval or offshore oil drilling activities or natural oil leaks.
They can also be released on soils as a consequence of human activities. Soil deposited PAHs can
enter water compartment after runoff (Hylland, 2006; Latimer and Zheng, 2003). Because they are
hydrophobic molecules, PAHs in water are associated with suspended particulate matter to end
into sediments (Hylland, 2006). Monitoring networks have documented PAHs concentrations of
up to 50 μg g-1 dry weight (dw) in sediment from various affected aquatic ecosystems even if
concentration of highly contaminated areas is rather in the 10 μg.g-1 range (Baumard et al., 1998;
Benlahcen et al., 1997; Cachot et al., 2006; Johnson et al., 2007; Varanasi et al., 1993; Yanagida et
al., 2012). Sediment therefore constitutes a major sink for hydrophobic pollutants and can act as
secondary sources for aquatic systems contamination (Hylland, 2006).
In both freshwater and marine ecosystems, a number of fish lay their eggs on sediments or
gravel in river or seabed, including smelt, salmonids, capelin and some minnows. Some others,
such as killifish, even bury their eggs in sediment. Analytical assessment of PAHs transfer through
the chorion has been demonstrated when embryos are exposed directly through water (Hornung et
al., 2007) or to a spiked sediment (Cachot et al., 2007; Djomo et al., 1996; McElroy et al., 2006).
There are therefore high probabilities that embryos developing on PAHs contaminated sediment
become contaminated and hence affected during embryonic development when several
ontogenetic processes are occurring. Such fish early life stages (ELS) are very sensitive to
modification of their environment. A large number of organic xenobiotics e.g. dioxins, PCBs,
PBDEs have been experimentally reported to disrupt embryonic development (Carney et al., 2006;
Costa and Giordano, 2007; Hornung et al., 1996; McClain et al., 2012; Usenko et al., 2011; Xiong
et al., 2008). This is also the case for aqueous exposure to individual PAHs or oil mixtures (Carls
et al., 2008; He et al., 2012; Hendon et al., 2008; Incardona et al., 2009; Incardona et al., 2005;
Incardona et al., 2004; Incardona et al., 2006; Shi et al., 2012), through contact with a spiked- or
130
natural sediment (Cachot et al., 2007; Debruyn et al., 2007; Le Bihanic et al., Submitted-b; Le
Bihanic et al., Submitted-c; Yang et al., 2010) or sediment affected by oil spills (Debruyn et al.,
2007; Frantzen et al., 2012; Hicken et al., 2011; Hose et al., 1996; Incardona et al., 2009).
Numerous studies have described effects of PAHs on development of embryonic or larval stages,
including oedema, altered development of the heart and the jaw (Carls et al., 1999; Debruyn et al.,
2007; Heintz et al., 1999; Incardona et al., 2004; Li et al., 2011; Marty et al., 1997; Shi et al.,
2012). However, very few publications have reported consequences of exposures of ELS of fishes
to PAHs on later stages of development. Indeed only a prolonged (or delayed) reduction of growth
(Cachot et al., 2007; Carls et al., 1999; Heintz et al., 1999) and reduction of aerobic capacity in
adults (Hicken et al., 2011) after exposure of the ELS stage to PAHs have been reported.
In order to evaluate the late consequences of an early and short exposure to PAHs on fish
physiological variables, we have exposed zebrafish ELS to a spiked sediment with a mixture of 3
PAHs used at environmental concentrations : Pyrene (Pyr), phenanthrene (Phe) and
benzo[a]pyrene (BaP) are abundant PAHs in contaminated river sediments where they represent
20 to 27% of total quantified PAHs (Cachot et al., 2006). They are also representative of PAHs
variety as of ring number, from 3 to 5. After exposure, larvae were transferred to a clean medium
and reared until reproduction. Growth was monitored as well as reproduction and behavior in
adults. Behavior of offspring was also monitored at larval stage.
This study was conducted under the approval of the Animal Care Committee of France,
under the official licence of M.-L. Bégout (17-010).
Sediment spiking and chemical characterisation
The reference sediment was collected in March 2010 at Yville-sur-Seine (Seine-Maritime,
France) in a former gravel pit. This site was chosen because sediment was previously shown to be
marginally contaminated by organic and metallic pollutants (Cachot et al., 2006) and exposure to
this sediment did not produce measurable toxic effects on fish embryos or at latter stage (Cachot et
al., 2007). The sediment was freeze-dried and then ground in a mortar to obtain a thin
homogeneous particulate matter as described in (Vicquelin et al., 2011). The freeze-dried
reference sediment was spiked with Pyr, Phe and BaP solutions (Sigma-Aldrich, France) in
dichloromethane (solvent) in order to obtain theoretical concentrations of 2750 ng.g-1 dw of
131
sediment for Phe, 2350 ng.g-1 dw for Pyr and 1250 ng.g-1 dw for BaP. Sediment spiking and
subsequent characterisation were performed as described in (Vicquelin et al., 2011). Control
sediment was prepared from the same freeze-dried sediment treated as indicated above, including
solvent but excluding PAHs solutions.
Fish strains, rearing, embryo production and exposure
We used one common laboratory strain: the AB strain (ZFIN ID: ZDB-GENO-960809-7)
derived from individuals crossed in 1970 in Eugene (Oregon, USA). This strain has been
established in our laboratory for 6 years as large batches of individuals originating from Amagen
platform (Gif/Yvette, France) and Pasteur Institute fish facility (Paris, France). Adults were
maintained at 27°C in a controlled 14 hour light/10 hour dark (14:10) photoperiod in the same
rack and were fed ad libitum twice a day with pellets (INICIO Plus 0.5, Biomar, France) between
9:00 and 9:30 in the morning and 16:30 and 17:30 in the afternoon and once with artemias (INVE)
between 11:30 and 12:30. Eggs were obtained by random pairwise mating of zebrafish. One adult
male and one female were placed together in spawning boxes the evening before eggs were
required (AquaSchwarz, Germany). Eggs were collected in the morning and the fertilisation rate
assessed within two hours of collection: only spawns with a fertilisation rate above 80% were
kept. At the same time, spawns were sorted to remove faeces, and dead or unfertilised embryos. A
minimum of 5 spawns were mixed and 30 eggs were distributed for each replicate on a Nytex
thermoformed basket at 4 hours post fertilization (hpf) and inserted in a 3 cm diameter Petri dish
containing 3 g dw of sediment and 4 ml of E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM
CaCl2, 0.33 mM MgSO4).
Exposures were repeated as independent triplicates hence providing each time 3 replicate
tanks (hereafter called ‘replicate of origin’ in the data analysis). A total of 17 triplicates were
produced over a three months period, for both Control and Exposed treatments, using 110 spawns
issued from 250 spawning pairs. All these replicates were used to monitor survival, lethal and
sublethal endpoints as listed in Table 1 in (Lammer et al., 2009). Out of the 17 triplicates; one
triplicate of each condition (Control and Exposed) was used for metabolites quantification and two
triplicates of each condition kept for rearing and further analyses. Embryos and larvae were
further maintained at 28°C in Petri dishes in an incubator with the same light/dark cycle as adults.
After hatching, chorions were removed manually. Exposure was continued until 96 hpf, thereafter;
larvae were transferred in clean E3 medium in a new Petri dish. At 5 (days post fertilization) dpf,
larvae were transferred from Petri dish to 1L tanks (spawning box without inserts; AquaSchwarz,
132
Germany) containing 100 mL of E3 solution. System water was then progressively added (150 ml
each day) until tanks were full. At 30 dpf larvae were then transferred in a dedicated rack and
reared until the adult stage. Larvae were fed with plain artemias (INVE) and dry food (grinded to
appropriate size from INICIO Plus 0.5 mm, Biomar, France) from 5 days post fertilisation (dpf)
onwards. This generation is hereafter called F0.
Metabolites quantification after exposure
At the end of exposure, 30 larvae were euthanized with a lethal dose of benzocaine
(250 mg.l-1) collected in microtubes. A maximum of liquid was removed and tubes frozen in liquid
nitrogen. Larvae were grinded in acetate buffer at pH 5 and metabolites were quantified in whole
larvae according to published protocol (Devier et al., 2013; Le Du-Lacoste et al., 2013).
Survival and growth of F0 fish
Larvae and fish death was monitored daily. Fish growth was monitored monthly starting at
3 months post fertilisation (mpf, age factor in the downstream analysis) onward. Fish were
anaesthetized for 1 min in benzocaine (50 mg.l-1) and individual standard length (from the tip of
the head to the beginning of caudal fin rays; cm, to the nearest mm) and body mass (g, to the
nearest mg) were measured. Fish were sexed when possible (on the basis of morphological clues).
Reproduction of F0 fish
Reproduction was monitored 2-3 times a week during 5 weeks starting at 3 mpf. Spawns
were obtained by placing a spawning box (AquaSchwartz, Göttingen, Germany) within each tank
starting at 3 mpf in the late afternoon. Spawning boxes were inspected the next morning and eggs
were collected. Number of fertilized eggs were counted and normalized by the number of female
in each tank and by the number of time spawning boxes were introduced into the tank (hereafter
named spawning request). Survival of F1 offspring larvae was monitored over 10 days.
Behavioural experiments
Behavioural experiments were performed using 6 month-old adult F0 males and 5 dpf F1
larvae (offspring), in a dedicated room kept at 27°C ± 1°C, with a 14:10 photoperiod synchronised
with the rearing room so as to minimize unwanted correlated effects. Daylight started at 08:30 and
133
there were no twilight transition periods. At the end of each recording session, adult fish were
anaesthetized for 1 min in benzocaine (50 mg.l-1) and individual standard length (cm) and body
mass (g) were measured.
24-h swimming activity and photomotor response in F0 adults.
Fish from each treatment were randomly placed at each session in 3-L tanks (24.5 × 15 ×
13.5 cm, AquaBox® 3, AquaSchwartz, Göttingen, Germany) filled with 1.5 L of system water, to
avoid tank position and session bias. The 12 tanks were isolated from neighboring tanks by
opaque walls. The set-up was placed on top of an infrared apparatus (IR floor 1 × 1 m, Noldus,
The Netherlands). During the day, the room was lit with two halogen spotlights (Philips 80 W,
illumination of 30 lx. near the tank). During the night, the spotlights were turned off and infrared
light from the floor was used to record fish movements (illumination <1 lx. near the tank). Fish
were placed in their tanks at 17:00 the day before the experiment, for one night of acclimatization.
Recording started the next day at 12:30 and lasted 24 h. For one session, the camera was placed
above the tanks to monitor horizontal movements. For the other session, the camera was placed in
front of the tanks to record vertical movements. For this side view; the tanks were placed on a
four-level shelf in front of the vertically placed IR floor. Swimming path length (top view) and
time spent in each third of the tank section (side view) were measured. We challenged 12 control
fish and 8 exposed fish from each of the three experimental replicate and different fish were used
for top and side monitoring. The water was changed after each session.
In addition to the 24-h swimming activity measurement, these experiments were designed
to monitor photomotor responses used as an indicator of complex phenotypes of stress and
anxiety. At the end of the 24-h recording, fish activity was further recorded for 1 h (Light on-1),
then they were challenged with a sudden dark period (15 min, Light off) and video recordings
continued for an additional period of 1h30 (Light on-2). Swimming path length (top view) and
time spent in each third of the tank section (side view) were measured. For both protocols, 36
control and 24 exposed fish were recorded.
Photomotor response in F1 5 dpf larvae
At 17:00 the day before the challenge (4 dpf), single larvae were transferred to the cells of
a 24-well plate (Krystal 24, opaque wall and clear bottom micro-plate) where they were arranged
in a mixed design and visually isolated from each other. Equal number of larvae from each
treatment was introduced in each plate to avoid any trial effect. The 24-well plates were kept
134
overnight in the breeding incubator. The following day, two hours before the challenge, well plate
was transferred to the video acquisition room and placed on top of a size-matched infrared floor,
which allowed the larvae to be filmed under both light and dark conditions (Vignet et al., 2013).
The 15-min challenge included three 5-min periods: Light on–1 (70 lx.), Light off (<1 lx.) and
Light on–2. Challenges were conducted between 14:00 and 18:00, the most stable activity period
in zebrafish larvae (MacPhail et al., 2009). Constant IR lighting was maintained during filming
using a three-way switch. The apparatus was enclosed within a lightproof and temperaturecontrolled box. Distance travelled (cm) was recorded for 200 larvae issued from control fish and
180 larvae issued from exposed fish.
Videos for the swimming activity and photomotor response done with adults were recorded
with an analogue camera ICD-48E (Ikegami) and 2.7–13.5 mm lens (Fujinon) linked to a PC with
an acquisition card and Ethovision XT 8.5 software (Noldus, The Netherlands). Videos for the
larvae locomotion were recorded using a digital DMK31AU03 camera (The Imaging Sources,
Germany) and 1.4–12.5 mm lens (Fujinon) using IC-Capture software (The Imaging Sources,
Germany).
For all experiments, EthoVision XT software was used for track extraction and analysis. Data
were acquired by EthoVision at 25 frames per second, and variables (distance travelled, time spent
in each area) were nested for further treatments every 30-min for locomotion in adults (24-h),
every 1-min in adults and every 30-s in larvae during the photomotor challenge.
Statistical analysis,
Statistical analyses were realized with Statistica 9.0 (Statsoft, Tulsa, OK, USA) software.
Unless otherwise mentioned, the results reported in text and all figures are means ± SEM. General
linear model (GLM) was applied in each case.
Growth in length and mass was analyzed with treatments and age as fixed factors, and replicate of
origin and fish individuals as random factors. Interaction between treatment and age was
evaluated. The normalized number of eggs and survival over 10 days were analyzed with
treatment and developmental time (for survival only) as a fixed factor and replicate of origin as a
random factor.
For 24-h locomotion activity and photomotor response, distance travelled and vertical positioning
were analyzed with periods (day vs. night; Light on-1, Light-off and Light on-2) and treatments as
135
fixed factors, replicate of origin, fish individuals as random factors and mass as covariable.
Interaction between period and treatment was analyzed.
All statistical analyses were carried out at a 95% level of significance and only fixed factor and
interaction are presented in the text. Post hoc tests were with Newman-Keuls in each case.
Results
Sediment, fish exposure and growth
PAHs concentrations measured in spiked sediment are reported in Table 1. Spiking
efficiencies for all 3 individual PAHs are in the range [69-77%] (Table 1).
Table 1: Chemical contamination characterization of sediments used
Sediment
Phe
Pyr
BaP
Control
Actual concentration
3.1 ± 0.2
3.5 ± 0.8
0.6 ± 0.1
Targeted concentration
2750
2350
1250
Spiked
Actual concentration
2126.1 ± 57.6 1648.6 ± 58.9 632.5 ± 32.9
Spiking efficiency (%)
77
70
51
-1
Concentration are given in ng.g dry weight (dw). For actual concentrations values are mean ± SD;
n=3 replicates.
Total PAHs concentration was 4407 ± 139 ng.g-1 dw for spiked sediment which was more
than 600-fold greater than the concentration measured in the control sediment (7.3 ± 1 ng.g-1 dw).
Sediment particulate organic carbon content was 0.14% dw. Quantification of metabolites
indicated a significant increase of 4-OH-Phe, 1-OH-Pyr and 3-OH-BaP in exposed larvae resulting
in a six fold increase of the total concentration of hydroxylated metabolites from 585.5 ± 499.2
ng.g-1 wet weight to 3801.6 ± 1593.7 ng.g-1 wet weight (p<0.05;Table 2).
Table 2 : Metabolites quantification in larvae
2+3 OH-Phe
1+9 OH-Phe 4 OH-Phe 3OH-Fluo
1 OH-Pyr
1 OH-Chrys 9 OH-BaP 3 OH-BaP
∑ OH-HAP
Control
248.5 ± 218.3
94.1 ± 95.2
<LD
<LD
240.7 ± 193.3
<LD
<LD
<LD
585.5 ± 499.2
Exposed
82.6 ± 38.8
81.8 ± 45 24.8 ± 13.1
<LD
<LQ
1.3 ± 0.4 123.9 ± 49.5 3801.6 ± 1593.7
3485.6 ± 1452.9
LD
Sum of OH-Phe: 0.2
0.7
0.7
0.7
Sum of OH-BaP: 0.7
LQ
Sum of OH-Phe: 0.5
2.0
2.0
2.0
Sum of OH-BaP: 2.0
Concentration in ng.g-1 wet weight; mean ± SD; n=3 replicates of 30 larvae. Numbers in bold indicate significant difference between Control and Exposed
larvae (p<0.05). LD: detection limit and LQ: quantification limit.
Neither death nor morphological disruptions were recorded during or after embryo-larval
exposure with an identical survival rate of 96% between 0 and 4 dpf for both treatments (n=17
triplicates – 51 replicates). Fish body mass was significantly different between control and
exposed groups (F=19.22; p<0.001; Figure 1 a) and post-hoc analysis indicated that body mass of
136
exposed fish was inferior compared to control fish at 5 mpf (control: 0.219 ± 0.004 g; exposed:
0.203 ± 0.006 g; p<0.05) and 8 mpf (control: 0.270 ± 0.004 g; exposed: 0.245± 0.007 g; p<0.001).
At 8 mpf, it was possible to sex the fish unambiguously for both treatments; therefore, body mass
was analysed separately for each sex at 8 mpf.
In the case of males, there was no difference between treatments (control: 0.270 ± 0.006 g;
exposed: 0.255 ± 0.013 g; p=0.18) but body mass of exposed females was lower than the one of
control females (control: 0.270 ± 0.006 g; exposed: 0.240 ± 0.008 g; p<0.05). Body length was
significantly different between treatments (F=8.32; p<0.01; Figure 1 b) and post-hoc analysis
revealed a trend for reduction in 5 mpf exposed fish which then became significant at 8 mpf
(control: 2.53 ± 0.02 cm; exposed: 2.46 ± 0.03 cm; p<0.05) without difference between sex.
Reproduction
No difference was observed for spawning onset. The mean number of fertilized eggs per
female and spawning request was 2.36 ± 0.4 for control females and 1.42 ± 0.3 eggs for exposed
females which was close to a significant difference (p=0.06). Offspring developed without
significant morphological disruptions whatever the treatment. Survival rates of offspring larvae
showed a significant effect of treatment (F=5.00; p<0.05) and developmental time (F=13.7;
p<0.001) but no interaction between those two factors was observed. Survival rates at hatching (72
hpf) were 80.1 ± 5.6 % and 75.2 ± 6.2 % for offspring of control and exposed parents respectively
and these rates decreased respectively to 61.8 ± 8.1 % and 65.0 ± 6.7 % at 10 dpf.
137
Figure 1 : Evolution of fish body mass (a) and standard length (b) over time between control
fish (green bars) and exposed fish (red bars). At 3 mpf n=126 control fish and 74 exposed fish,
123 and 69 at 4 mpf, 77 and 49 at 5 mpf and 71 and 49 at 8 mpf. Values are mean ± SEM; *
indicates significant difference at p < 0.05 and # indicates significant difference at p < 0.1).
Locomotion and photomotor responses in top view
Circadian activity was monitored during 24-h (Figure 2 a) and showed the classical
alternation of activity during day and night. Comparison of diurnal and nocturnal activities (Figure
2 b) revealed the expected higher diurnal activity for both treatments (period effect in GLM;
F=14.37; p<0.01).
138
Figure 2 : Horizontal swimming activity of 6 month-old fish in relation to the photoperiod.
(a) 24-h evolution of mean distance travelled (cm/30-min) in relation to time of the day and (b)
distance travelled averaged per period (day vs. night). Values are mean ± SEM; n=36 control and
n=24 exposed fish; * indicates significant difference at p < 0.05 and # indicates significant
difference at p < 0.1).
Evaluation of photomotor response performed after the 24-h activity monitoring is
presented in Figure 3 a. Analysis of the distance travelled for each 15-min periods (Figure 3 b)
showed the expected pattern with an increase of activity during Light-off (period effect; F=77.87;
p<0.001). Fish activity was similar for both treatments during the two Light-on periods whereas
exposed fish activity was reduced compared to control fish during the Light-off period (p=0.048).
139
Figure 3 : Photomotor response of 6 month-old fish in top view. (a) Distance travelled
recorded during one hour before a 15-min light off period (grey shadowing) followed by an
additional 1h30 monitoring. (b) Focus on 15-min periods before, during and after the light off
period. Values are mean ± SEM; n=36 control and n=24 exposed fish; * indicates significant
difference at p < 0.05.
Locomotion and photomotor response in side view
Circadian vertical positioning of fish showed the expected pattern with a preference for the
bottom zone during the day compared to the night when fish spent most of the time in the upper
zone (Figure 4). This was revealed by time spent in upper zone which was higher during the night
than the day (F=505.54; p<0.001), the same applied for the complementary variable, time spent in
lower zone. A significant difference was also observed for time spent in upper (and lower) zone
between treatment (F=12.90; p<0.001) but there was no interaction between period and treatment.
140
Figure 4 : Vertical swimming position of 6 month-old fish in relation to the photoperiod over
24-h. Evolution of mean time spent (s/30 min) in each third of the tank in relation to time of the
day for (a) control fish and (b) exposed fish. Values are mean ± SEM; n=36 control and n=24
exposed fish.
Evaluation of photomotor response performed after the 24-h activity monitoring showed a
pattern similar to the one observed over the 24-h: fish spent more time in the top zone during
light-off (F=137.97; p<0.001; Figure 5). There was however no difference between treatments.
141
Figure 5 : Photomotor response of 6 month-old fish in side view. Distance travelled per 15-min
periods before, during and after the light off period. Values are mean ± SEM; n=36 control and
n=24 exposed fish.
Statistical differences were found in periods (F=211.52, p<0.001) and in interaction
between treatment and period (F=4.46; p<0.05; Figure 6). The post-hoc test indicated that distance
travelled by larvae from exposed fish was higher than distance travelled by larvae from control
fish during Light on-2 (p<0.01).
Figure 6 : Photomotor response of 5 dpf offspring larvae. Distance travelled per 5-min periods
before, during and after a light off period. Values are mean ± SEM; n=200 larvae issued from
control fish and n=180 larvae issued from exposed fish; * indicates significant difference at p <
0.05.
142
Discussion
As a sink for most hydrophobic pollutants, including PAHs, sediments often represent a
secondary source of pollution for these compounds. This necessitates considering this
compartment of the aquatic ecosystem for ecotoxicological assessment. However, direct
assessment of sediment toxicity faces some difficulties mainly because of their physico-chemical
properties which can interfere with bioassays (for example granulometry or organic matter). In
this context, the use of alternate methods has been developed relying on spiking a natural or
artificial reference sediment which have both advantages and drawbacks which will not be
discussed here (Hollert et al., 2003; Kosmehl et al., 2006; Le Bihanic et al., Submitted-c;
Vicquelin et al., 2011). In the present study, natural sediment was chosen to evaluate long-term
consequences of a sediment-contact exposure during embryonic and first days of larval stages. For
this purpose, natural reference sediment was spiked with three individual PAHs abundant in
sediment contaminated with PAHs from pyrolytic origin. Concentrations obtained in sediment
(sum < 5 µg.g-1) after spiking was in the range of concentrations measured in contaminated areas
(Baumard et al., 1998; Benlahcen et al., 1997; Cachot et al., 2006; Yanagida et al., 2012). Our
exposure method can therefore be considered, in terms of compounds, concentration and route of
exposure, as a simplified version of environmental exposure.
Quantification of metabolites confirmed an effective exposure to PAHs of larvae and indicated
that PAHs metabolism was activated within the duration of exposure. This is in agreement with
the early activation of in vivo Cyp1a activity in developing zebrafish larvae upon exposure to βnaphtoflavone (Otte et al., 2010) or dioxin (Mattingly and Toscano, 2001).
The absence of acute mortality both during exposure and the following days combined
with the absence of morphological defects is indicative of no acute toxicity. This is contradictory
with results obtained after waterborne exposure to these individual PAHs which provoked, among
other phenotypes, oedema, heart and vascular defects (Incardona et al., 2004; Incardona et al.,
2006; Incardona et al., 2011). Besides a different exposure route, it is to note that, in order to
investigate mechanisms involved in these phenotypes emergence, concentrations used by these
authors for BaP, Pyr and Phe were high, in the [5-10 mg.L-1] range. Our results are however in
agreement with results obtained after embryo-larval exposure of medaka to an artificial sediment
spiked with BaP at a similar concentration [1736 ng.g-1 dw] (Le Bihanic et al., Submitted-c). A
delayed effect on survival was however observed after exposure of medaka embryos (10 days of
exposure) to a sediment spiked with a pyrolytic extract (Cachot et al., 2007).
143
Growth inhibition has been reported both after aqueous (Moles and Rice, 1983; Schuler et
al., 2007) and diet exposure of juveniles fish to PAHs (Gundersen et al., 1996; Jee et al., 2006;
Kim et al., 2008; Meador et al., 2006; Vignet et al., In revision; Wang et al., 1993; Wu et al.,
2003). Short acute exposure of embryos have also induced reduction of larvae size (Billiard et al.,
1999; Incardona et al., 2006; Le Bihanic et al., Submitted-a; Le Bihanic et al., Submitted-b). To
our knowledge, there are however very few reports of delayed effects of an ELS exposure to
PAHs on fish growth. A reduction of growth has been reported after a short waterborne exposure
of sole juveniles to fuel oil n°2 (Gilliers et al., 2012). In addition, a long-term exposure performed
with pink salmon eggs incubated on gravel spiked with Alaska North Slope crude oil showed an
early and prolonged growth reduction of larvae and juveniles (Heintz et al., 1999). Because of
salmon biology, it is worth mentioning that in this case, exposure lasted 8 months compared to 4
days in our experiment.
PAHs have been shown to affect reproduction in aquatic organisms (Nicolas, 1999; Vignet,
2014) and several endocrine disruption clues have been reported (Hoffmann and Oris, 2006;
Monteiro et al., 2000; Seruto et al., 2005). The late consequences on reproduction of an early
exposure are however not known. Here, we described a tendency for a reduction in the number of
eggs obtained per female and spawning request, number which still was in the range of what has
been described under similar spawning conditions with or without exposure to chemicals (Paull et
al., 2008; Roex et al., 2001). Besides possible disruption in reproduction regulation, the decrease
observed here may also be related to the reduced growth of exposed female fish. Survival over 10
days was also slightly affected. Further, there are evidences that embryonic exposure to BaP can
lead to a reduction of brain aromatase expression (Dong et al., 2008) and this finding provides
molecular support for an early endocrine disruption. This particular result should be further
investigated.
As a whole, behavioral tests suggested a reduction of locomotor activity and an increase of
anxiety in exposed fish. This is in agreement with previous reports of behavioral disruption after
exposure to various PAHs. The novelty provided here resides in the exposure itself. Indeed in
most cases waterborne exposures have been performed with juvenile stages (Almeida et al., 2012;
Correia et al., 2007; Goncalves et al., 2008; Gravato and Guilhermino, 2009; Oliveira et al., 2012)
and only a few at earlier stages. For example, a waterborne exposure of Salminus brasiliensis
larvae to phenanthrene produced a reduction of larvae ability to capture prey, in particular when
exposure was performed immediately after hatching (Carvalho et al., 2008). Closer to the
144
exposure procedure we used, it has been reported that Pacific herrings eggs exposed to weathered
oil showed other disruptions such as a reduction of larvae swimming ability (Carls et al., 1999).
Finally, an exposure of medaka embryos by contact with an artificial sediment spiked with
benzo[a]anthracene also produced a reduction of larval activity after a photomotor challenge (Le
Bihanic et al., Submitted-d). Here behavior was evaluated in adults, 6 months after exposure. Our
results therefore indicate that early exposure to PAHs is able to promote persistent disruptions.
This has already been demonstrated with other compounds such as silver, PBDE or dioxin (Marit
and Weber, 2012; Powers et al., 2011; Timme-Laragy et al., 2006). From a mechanistic point of
view this later case is of particular interest since some PAHs, in particular large one such as BaP,
are known to trigger the same molecular pathway as dioxin by activating the aryl hydrocarbon
receptor (AhR) (Barron et al., 2004; Carvan III et al., 2000). In this later study, zebrafish larvae
were exposed immediately after hatching, from 2 to 4 dpf to dioxin and swimming abilities were
assessed 3 months later using a swimming tunnel and both Ucrit (maximum speed reached before
fish exhaustion) and oxygen consumption rate were monitored. For a dioxin concentration of 0.1
ng.L-1, the authors reported a decrease of Ucrit and an increase of oxygen consumption for fish
resting and swimming at maximum speed (Marit and Weber, 2012). The authors proposed that
these effects may be due to behavioral adaptations limiting swimming abilities, failure to mobilize
triglyceride stores or vascular deformities limiting blood flow to the periphery (Marit and Weber,
2012). Further on this mechanistic approach, monoamines, including serotonin and dopamine are
also involved in the control of a wide number of biological processes (see reviews (Hoglund et al.,
2005; Overli et al., 2005)) and embryonic disruption of monoamine systems can lead to delayed
behavioral disruption (Dennis et al., 2013; Shabanov et al., 2005; Silva et al., 2013). BaP and a
prototypic AhR agonist, β-naphtoflavone, were able to disrupt dopaminergic and serotonergic
systems in brain of rainbow trout as revealed by an increase of these neurotransmitters turnover
(Gesto et al., 2008; Gesto et al., 2009). This provides a molecular framework for delayed
behavioral disruption consecutive to an early exposure to PAHs. This hypothesis also fits with the
increase of anxiety-like behavior observed in adults zebrafish after an exposure to silver in the
same time windows as the one used for PAHs exposure presented here (Powers et al., 2011).
For larvae, it has been proposed that an increase of locomotor activity specially in the outer
zone of the well provoked by a "light-to-dark" transition is indicative of anxiety (Schnorr et al.,
2012). The authors also indicated that this increase is hardly enhanced by anxiogenic drugs and
they suggest this to be due to a "ceiling effect" which can be bypassed using an incomplete
darkness (Schnorr et al., 2012). In our experimental design a total darkness was applied to
offspring larvae and therefore we did not observe an increase of activity during the dark period but
145
it was the case in the following light period. The mechanisms underlying the transmission of this
anxiety-like behavior to offspring remains unknown and these findings call for more
investigations.
Taken together, these observations indicated that an early exposure of fish embryos to a
contaminated sediment was able to produce long term consequences on several physiological traits
which may have detrimental consequences on their performance and their ability to contribute to
recruitment. These results highlight the need to link the findings about PAH contamination in
sediments and their effects on fish to the European Water Framework Directive, since the
recruitment of information is of high significance for its successful implementation.
Acknowledgements
We thank Didier Leguay (Ifremer, Laboratoire Ressources Halieutiques) for his help. This
study was supported financially by the ANR project ConPhyPoP (CES 09_002) and CPER A2E.
This later project is co-financed by the European Union with the European fund of regional
development. A doctoral grant was received from the Région Poitou-Charentes and from l’Institut
Français de Recherche pour l’Exploitation de la Mer (C.V.). This work was part of the LABEX
COTE cluster of excellence "Continental to coastal ecosystems".
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assay, comet assay and zebrafish embryo test. Toxicology in Vitro 24, 2003-2011.
152
II Effets des HAP sur la croissance et la survie (article 3)
Le deuxième volet du projet ConPhyPOP consistait à exposer des poissons par voie
alimentaire dès le premier repas. L’alimentation représente une voie de contamination aux HAP
très importante chez les poissons (Johnson et al., 2007). Après l’éclosion puis l’ouverture de la
bouche, les larves de poissons cherchent activement leur nourriture tout en épuisant leurs réserves
vitellines. Chez le poisson zèbre, l’alimentation exogène débute vers 5 jours.
L’exposition a donc commencé le matin du cinquième jour post fécondation, puis les
poissons étaient nourris 3 fois par jour la semaine (poudre contaminée matin et soir et artémias le
midi) et une fois par jour le week-end (poudre contaminée) en utilisant différentes granulométries
adaptées à la taille des larves.
Les expositions à 3 fractions différentes ont été réalisées en utilisant une fraction
pyrolitique (PY) contenant un grand nombre de HAP lourds, et deux fractions pétrogéniques. La
première fraction pétrogénique est issue du fuel lourd contenu dans l'Erika au moment du
naufrage. Elle sera notée HO pour "heavy oil". Cette fraction est principalement composée de
HAP moyens (3 et 4 cycles) et de composés alkylés. La seconde fraction pétrogénique utilisée est
issue du pétrole brut Arabian light, elle sera nommée LO pour "light oil". Elle est principalement
composée de HAP alkylés et de molécules à 2 cycles. Les aliments ont été enrobés avec ces 3
fractions à 4 concentrations: 0, 0.3X, 1X et 3X en visant 5µg. g-1 (pour les 16 HAP indicateurs de
l'USEPA) pour la concentration intermédiaire 1X. Cette concentration a été choisie car elle est
représentative des concentrations relevées dans les mollusques de la baie de Seine. Les 3
expositions ont été réalisées successivement.
De nombreuses variables ont été évaluées dans le cadre du projet ConPhyPoP. Dans cet
article sont présentées la caractérisation des fractions choisies et l'évaluation de l’exposition des
poissons après 10 jours d'expositions. La concentration des métabolites est différente entre toutes
les fractions et entre les concentrations au sein d'un même mélange (0.3X, 1X et 3X) confirmant
que les larves ont été efficacement exposées.
La survie a été suivie de manière systématique. Ainsi plus de 33000 poissons ont été suivis
de leur naissance jusqu'à leur mort. Dans cet article, seuls les poissons ayant été menés jusqu'à 1
mpf ou plus ont été pris en compte pour la survie. Ce calcul de la survie représente environ 15000
poissons, soit la moitié des poissons exposés, mais aucune différence significative n'a pu être mise
en évidence à 1 mpf. Un triplicat de poissons par fraction et par dose a été suivi jusqu'à 9mpf. La
153
survie des poissons exposés au HO-3X a été significativement diminuée à partir de 3 mpf et la
contamination de ces poissons a dû être arrêtée à 7 mpf car la survie était critique. Ils ont été
sacrifiés pour des analyses histologiques.
Le suivi de la croissance a été réalisé de deux façons : sur les larves à 15 jours puis de
façon mensuelle à partir de 2 ou 3 mpf. A 15 jours, les larves LO-3X, après seulement 10 jours
d’exposition, ont une taille significativement inférieure à celle des larves contrôles. Cette
réduction de la taille est associée à une réduction du nombre de vertèbres calcifiées qui est
observée chez les larves HO-3X et LO-3X. La morphologie de la mâchoire est également réduite
chez les larves des 3 fractions.
Par la suite, pour chaque fraction, un suivi de taille et de poids a été réalisé sur la série de
poissons menée à 9 mpf. Ces mesures révèlent une réduction significative de ces deux variables
pour les 3 fractions avec un effet dose. A 9 mpf, un effet sexe a pu être mis en évidence. En effet,
les mâles sont plus affectés que les femelles chez les HO et les LO. Ces différences de croissances
peuvent s’expliquer chez les larves par la modification de la morphologie de la mâchoire. Cette
modification peut avoir des conséquences à long terme. De plus, l’analyse de l’activité et/ou de
l’expression d’enzyme digestive montre que cette activité est réduite chez les PY. Elle est
largement affectée chez les HO. Chez les LO, seuls les LO-3X présentent une activité phosphatase
alcaline réduite.
Des similitudes ont pu être mises en évidence au niveau des effets. Un effet dose a pu être
mis en évidence au niveau du dosage des métabolites ou lors des mesures de croissance sur les
adultes. En revanche, seul le HO-3X présente des différences au niveau de la survie. Seuls les
larves exposées aux fractions HO et LO présentent des déformations de la mâchoire. En
considérant l'ensemble des variables analysées, il a été observé que le HO induisait des effets plus
importants que le LO, lui-même plus toxique que le PY.
154
Variables mesurées
PY
HO
LO
Métabolites larves
↑↑
↑
-
Survie
-
↓
-
Croissance
↓
↓
↓
Malformations
+
++
++
Enzymes digestives
↓↓
↓
↓
155
Chronic dietary exposure to pyrolytic and petrogenic mixtures of PAHs causes physiological
disruption in zebrafish - Part I: Survival and growth
C. Vigneta, K. Le Menachb, D. Mazuraisc, J. Lucasa,d, P. Perrichona, F. Le Bihanicb, M-H. Devierb, L.
Lyphouta,e, L. Frèree, M-L. Bégoute, J-L. Zambonino-Infantec, H. Budzinskib, X. Cousina,f*
a Ifremer, Laboratoire d'Ecotoxicologie, Place Gaby Coll, BP7, 17137 L’Houmeau, France
c Ifremer, Unit Funct Physiol Marine Organisms, UMR 6539 LEMAR, 29280 Plouzané, France.
d UMR 7266 Littoral Environnement Sociétés (LIENSs), Institut du Littoral et de l’Environnement - 2rue
Olympe de Gouges, 17000 La Rochelle, France
e Ifremer, Laboratoire Ressources Halieutiques, Place Gaby Coll, BP7, 17137 L’Houmeau, France
f INRA LPGP, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes, France
* Corresponding author : Xavier Cousin – [email protected]
Tel +33 5 46 50 06 21 – Fax +33 5 46 50 06 50
Abstract
The release of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) into the environment has
increased very substantially over the last decades leading to high concentrations in sediments of
contaminated areas. To evaluate the consequences of long-term chronic exposure to PAHs,
zebrafish were exposed, from their first meal at 5 days post fertilisation until they became
reproducing adults, to diets spiked with three PAH fractions at three environmentally relevant
concentrations with the medium concentration being in the range of 4.6-6.7 µg.g-1 for total
quantified PAHs including the 16 US-EPA indicator PAHs and alkylated derivatives. The
fractions used were representative of PAHs of pyrolytic (PY) origin or of two different oils of
differing compositions, a heavy fuel (HO) and a light crude oil (LO). Fish growth was inhibited by
all PAH fractions and the effects were sex-specific: as determined with 9 month-old adults,
exposure to highest PY inhibited growth of females; exposure to highest HO and LO inhibited
growth of males; also, highest HO dramatically reduced survival. Morphological analysis
indicated a disruption of jaw growth in larvae and malformations in adults. Intestinal and
pancreatic enzyme activities were abnormal in 2 month-old exposed fish. These effects may
contribute to the poor growth. Finally, our results indicate that PAH mixtures of different
compositions, representative of situations encountered in the wild, can promote lethal and
sublethal effects which are likely to be detrimental for fish recruitment.
Keywords: Danio rerio, lifecycle, polycyclic aromatic hydrocarbon, heavy oil, light crude oil,
alkylated PAH, jaw, digestion
156
Introduction
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are a diverse family of compounds containing at
least two aromatic rings. There are two major types of PAHs, petrogenic and pyrogenic, which
enter the environment through different routes. Petrogenic PAHs are abundant in oils and enter the
aquatic environment due to harbour activity or as a consequence of oil spills. Pyrolytic PAHs
result from the incomplete combustion of organic matter, including fossil fuel; they enter aquatic
environments through the deposition of atmospheric emissions directly on water or on ground
followed by soil runoff. The release of PAHs into the environment is directly linked to human
activity and has increased over the last decades. For example, the amount of PAH emitted into the
atmosphere has increased from under 50 000 tons in 1987 (Eisler, 1987), to over 500 000 tons in
2004 (Zhang and Tao, 2009). PAHs are hydrophobic molecules, and are found associated with
suspended particulate matter in water, such that they tend to accumulate in sediments;
consequently, sediments constitute major sinks and can also act as secondary sources for aquatic
systems contamination (Hylland, 2006). Monitoring networks have documented PAH
concentrations of up to 50 μg g-1 dry weight (dw) in sediment from various affected aquatic
ecosystems although the concentrations in highly contaminated areas is more commonly in the
range of 10 μg.g-1 (Baumard et al., 1998; Benlahcen et al., 1997; Cachot et al., 2006; Johnson et
al., 2007; Varanasi et al., 1993; Yanagida et al., 2012). In all cases, PAHs are present as very
complex mixtures and can be associated with metallic and/or other organic compounds. PAHs
mixtures of pyrolytic and petrogenic origin differ in their composition. Pyrolytic mixtures
generally include more heavy PAHs, such as benzo[a]pyrene (BaP), whereas petrogenic mixtures
contain more light PAHs and more alkylated PAHs, mainly C1-C3 derivatives. Also, oils from
different geographic origins display different compositions, and composition is also affected by
the degree of refining.
The concentration of PAH in the biota varies depending on the surrounding concentration
and trophic level: in particular, the biota lower down the food chain may be exposed to high levels
of PAHs in sediment or suspended particles. For example, the total concentration of 16 PAHs used
as indicators by the US Environmental Protection Agency (US-EPA) in the copepod Eurytemora
affinis in the Seine Estuary is in the 0.2-3.9 µg.g-1 range (Cailleaud et al., 2007) and in mussels
can be as high as 1.6 µg.g-1 (Le Goff et al., 2006). In the case of acute accidental exposure, the
concentration in mussels can be even higher, for example 3.0 µg.g-1 after the Erika oil spill
(Jeanneret et al., 2002) and 14.4 µg.g-1 after Exxon Valdez oil spill (Payne et al., 2008). PAHs
bioaccumulate in parts of the lower levels of the food chain as many of the organisms involved
157
have poor metabolisation activities; consequently, food is an important route of exposure. This has
been demonstrated by the high concentrations of PAHs found in the stomachs of fish caught in
contaminated areas (Johnson et al., 2007; Varanasi et al., 1993; Yanagida et al., 2012).
PAHs toxicity has long been documented (see (Hylland, 2006) for a review). Mechanistic
analyses based on individual compounds have been very useful to identify the underlying
molecular pathways, in particular the involvement of the aryl hydrocarbon receptor (AhR). They
have also demonstrated that not all PAHs elicit the same responses. For example, different PAHs
bind AhR with affinities ranging over several orders of magnitude (Barron et al., 2004; Billiard et
al., 2002; Ohura et al., 2007). Combinations of individual PAHs may lead to synergistic or no
effects depending on the PAHs used (Billiard et al., 2008; Timme-Laragy et al., 2007), suggesting
that PAHs may exert effects through several pathways and not only, or even necessarily, through
AhR activation. The toxicity of smaller PAHs (characterised by a lower octanol water partition
coefficient, log Kow < 5.2) is believed to be mediated by a narcotic mechanism induced by cell
membrane disruption and accumulation of these small PAHs in the lipid bilayer (Sverdrup et al.,
2002).
Findings for wild-caught animals after oil spills and from experiments using oils, PAH
mixtures or individual compounds, indicate that the growth of both freshwater and marine fish is
inhibited by these agents. Growth inhibition has been reported both after aqueous (Moles and
Rice, 1983; Schuler et al., 2007b) and diet exposure of juveniles (Kim et al., 2008; Meador et al.,
2006; Wang et al., 1993; Wu et al., 2003). Embryonic exposure can have consequences on
subsequent growth (Carls et al., 1999; Heintz et al., 1999). However, most experimental models of
acute exposure have involved high dose and short duration. Both data from the field and
experimental analyses reveal disruptions of jaw ontogenesis during embryonic development
related to the blue sac disease (Carls et al., 1999; Debruyn et al., 2007; Heintz et al., 1999;
Incardona et al., 2004; Li et al., 2011; Marty et al., 1997; Shi et al., 2012). The experimental
exposure of fish embryos to individual PAHs or oil mixtures has led to the identification of some
of the underlying mechanisms (Incardona et al., 2005; Incardona et al., 2006). It has also been
observed that short-term exposure of seabass juveniles to light cycle oil disrupts vertebral bone
quality (Danion et al., 2011a).
The ontogeny of the digestive functions in developing fish larvae is a key determinant of
the physiological status of the future juvenile (Pittman et al., 2013; Zambonino-Infante et al.,
2008). Paradoxically, how this ontogenic process could be affected by PAHs has not been studied.
It is not known to what extent the adverse physiological effects of PAHs observed in juveniles are
158
due to impairment of the digestive functions, although the developmental course of the digestive
capacities parallels the course of the body growth rates (Buddington and Diamond, 1992).
We exploited the short lifecycle of zebrafish to perform long-term exposure to PAHs. Fish
were exposed from the first meal (5dpf) and for the 9 following months, i.e. from larvae to
reproducing adults. Three complex mixtures of PAHs representative of environmental situations,
were used to spike the food: a pyrolitic (PY) fraction from sediment sampled in the Seine Estuary;
and two petrogenic fractions, one from a heavy oil "Erika" (HO) and one from a light crude oil
"Arabian light" (LO). We analyzed consequences of this exposure on survival, growth, jaw and
bone morphology and digestive enzyme capacities.
This study was conducted with the approval of the Animal Care Committee of France
PAH fraction preparation
Sediment was collected in Oissel (GPS: 46°11’55.65’’N and 1°12401.54’’O; downstream
from Rouen, in the Seine Estuary, France) at low tide from the intertidal area. Contaminants were
extracted with Accelerated Solvent Extraction (ASE300, Dionex) using 34 mL cells with 13-14g
of sediment per cells according to the following method: Heat: 5min, Static: 5min, Flush (%):
60vol, Purge: 60s, Number of cycles: 2, Pressure: 100bar, Temperature: 100°C, Solvent: 100%
dichloromethane. The two oils were dissolved in pentane to induce asphaltene precipitation
(Mazeas and Budzinski, 2001; Mazeas and Budzinski, 2002). The sediment extract and the two
pentane extracts were then reconcentrated using a Vacuum Evaporation System (Rapidvap,
Labconco, Kansas city, USA). All three extracts were then purified using alumina columns
(preparative liquid chromatography) and eluted with dichloromethane (Acros Organics, Thermo
Fisher Scientific, Geel, Belgium). After another re-concentration step, aliphatic fractions obtained
after elution on silica columns with pentane were discarded and aromatic fractions were obtained
using pentane/dichloromethane (65/35, v/v) as solvents (Mazeas and Budzinski, 2001; Mazeas and
Budzinski, 2002). Atlantic Labo (Bruges, France) provided the pentane solvent. Finally, samples
were re-concentrated and the final fractions kept in dichloromethane (stored at -20 °C) for spiking
experiments. All the steps were gravimetrically controlled in order to prevent PAH losses and also
159
to be able to express results in terms of quantity of the initial material (i.e. sediment or
petroleums). Fraction composition is detailed in Supplementary table 1.
Food preparation
Zebrafish were exposed from their first meal (5 dpf) onward and exposure continued up to
age 9 months. Spiked size-graded food pellets were used. The food pellets obtained from the
supplier were 0.5 mm in diameter (INICIO Plus 0.5, Biomar, France); these pellets were ground
and used to prepare food pellets of four sizes: ≤125µm, 125-315µm, 315-500µm and ≥500µm. For
pellets of all sizes and for all fractions used, the spiking procedure was similar other than vessel
and solution volumes being adapted to the quantity of food to be spiked. The method described by
Vicquelin et al. (2011) was used for spiking. The three types of aromatic fractions were dissolved
in dichloromethane. Briefly, the adequate amount of dry food was placed in a round-bottom glass
flask and immerged in dichloromethane. Then, aromatic fractions obtained from the natural
sediment from Seine estuary and the two petroleum were added with quantities in relation with
amount needed to reach the target final concentration. Solvent evaporation was performed using a
rotavapor (RV10 Basic, VWR International) equipped with a heating water bath (HB10 Basic,
VWR International) set at 45 °C until the food was visually completely dry. Potentially remaining
traces of organic solvent were eliminated leaving the food overnight at room temperature and in
darkness under an extractor hood. Finally, spiked food of each treatment was divided into several
aliquots. The experimental chemical contamination of the food with regards to PAH
contamination was characterized. Three concentrations 0.3X, 1X and 3X were used with the 1X
concentration corresponding to the Σ[16 EPA PAH] at 5µg.g-1 food, representative of the
concentrations found in mollusks in the Seine Estuary. Control diets were prepared at the same
time as spiked diets with exactly the same procedure with the exception of fraction addition. Diets,
including Control diets, were analyzed before being used (see Table 1 and Supplementary
Material Table 2 for details of the composition). Diets are named according to the origin of the
fraction and its concentration: the 1X pyrolytic fraction diet is thus PY-1X.
160
Table 1 : Summarized PAHs concentration for produced diets in ng.g-1 of food (mean ± SD;
n=4-7)
Mixture
Concentration
Σ[16 EPA PAH]
PY food
Solv.
0.3X
1X
3X
Solv.
0.3X
1X
3X
Solv.
0.3X
1X
3X
28 ± 5
1343 ± 499
4505 ± 1527
15073 ± 4285
39 ± 30
698 ± 460
1887 ± 130
5947 ± 217
33 ± 26
1053 ± 63
2739 ± 231
8335 ± 854
HO food
LO food
Spiking efficiency
(%)
81
90
100
42
38
40
63
55
56
MeNaph
MePhe
13 ± 14
21 ± 7
61 ± 17
178 ± 60
6±2
300 ± 20
657 ± 52
2113 ± 202
5±1
878 ± 38
2183 ± 197
6282 ± 1465
6±3
65 ± 19
204 ± 54
668 ± 157
2±2
530 ± 324
1448 ± 144
4122 ± 581
2±2
640 ± 35
1804 ± 67
4957 ± 731
Total PAHs
concentration
55 ± 12
1763 ± 468
5816 ± 1433
18151 ± 4983
47 ± 33
1633 ± 71
4663 ± 360
14317 ± 813
40 ± 29
2572 ± 96
6726 ± 278
19574 ± 1945
Fish rearing and exposure
We used TU strain (ZFIN ID: 76 ZDB-GENO-990623-3) which has been established in
our platform (PEP – http://wwz.ifremer.fr/pep) for 6 years as large batches of individuals
originating from the Amagen platform (Gif/Yvette, France) and the Pasteur Institute fish facility
(Paris, France). Adults were maintained at 27°C under a controlled 14 hour light/10 hour dark
(14:10) photoperiod. Water was a mix of reverse osmosis-treated water and tap water, both being
filtered beforehand through dust and charcoal filters, to obtain a pH of 7.5 ± 0.5 and a conductivity
of 300 ± 50 µS.cm-1. Ammonia, nitrites, and nitrates were monitored weekly and remained within
recommended ranges (Lawrence, 2007). Eggs were obtained by random pairwise mating of
zebrafish placed together in spawning boxes the evening before collection (AquaSchwarz,
Germany). Eggs were collected in the morning of day 0 (D0) and the fertilisation rate assessed
within two hours of collection: only spawns with rate above 80% were kept. At the same time,
spawns were sorted to remove faeces and dead and unfertilised embryos. To provide as
homogeneous and similar incubation conditions as possible, a minimum of five spawns were
mixed and 50 embryos randomly sampled and transferred to as many Petri dishes as required for
all conditions on D1 (24 hpf). Petri dishes were filled with E3 solution (5mM NaCl, 0.17mM KCl,
0.33mM CaCl2, 0.33mM MgSO4). This study was part of a larger project which required a large
number of exposure batches. For this reason it was not possible to perform simultaneously
exposures to all three fractions. As a consequence, exposures to different fractions were performed
successively. This is the case for batches which were used for the present work: exposure to PY
started 2011/11/9, exposure to HO started 2012/07/19 and to LO on 2012/08/30. All exposures
were performed in triplicate. Embryos and larvae were maintained at 28°C in Petri dishes in an
161
incubator with the same photoperiod as for adults. After hatching, chorions were removed
manually. On D5, larvae (N=50) were transferred into 1L tanks (spawning box without inserts;
AquaSchwarz, Germany) containing 100 mL of E3 solution. Dead or abnormally developed larvae
were removed and replaced with larvae from reserve Petri dishes. Between D6 and D11, larvae
were maintained in the 1L tanks and 150 mL of water was added every day. In the case of the last
exposures, with LO diets, we improved manual cleaning in 1L tank and in the meantime reduced
water renewal to improve water quality and to minimize larval disturbance (days 6-11). In parallel
the quantity of distributed food was slightly increased from D6 to D27. On D12, larvae were
placed in a Plexiglas© cylinder of 15 cm in diameter and 17 cm in height with the bottom end
closed with a 500 µm-pore mesh cloth and transferred into 10L rearing tanks (Ehret,
Polycarbonate PC 3108, type III cage, 265x150x240) placed in the flow-through exposure rack
with a water-dripping system and air bubbling into the cylinder. Cylinders were removed on D27
and the juveniles were then freed into the 10L tanks. In the flow-through system, water was
automatically added every hour leading to an exchange rate of 180-200mL/hour/tank
corresponding to daily renewal of approximately 40% of the water. Outflow water was collected
and treated with activated charcoal before being discharged into the sewer (Disposorb,
Chemviron, France). Tanks were manually cleaned daily from D5 to D27 and thereafter as
necessary; in particular, dead fish were removed and counted.
From D5 onward, fish were fed twice a day with size-adapted food and once a day with A0
artemia. The size of the food pellets provided was increased as the fish aged (at some ages fish
received two sizes of pellets): ≤125µm between D5 and D20, 125-315 µm between D15 and D30,
315-500 µm between D25 and D55 and ≥500µm from D50. One food vial was used for each tank
and weighted before and after use to measure rations. The ration was ad libitum until the first
biometric measures (2 or 3 months post fertilisation (mpf)); thereafter, the quantity of food
provided was 2% of the biomass in each tank, with the exception of the PY spiked food, for which
the ration was 5% at 2 mpf and then reduced to 2% at 3 mpf. Rations were then adapted after each
biometry on a monthly basis.
Metabolites quantification
On a specific batch and after 10 days of exposure, triplicates of 30 larvae per fractions and
concentrations were euthanized with a lethal dose of benzocaine (250 mg.L-1) and collected in
microtubes. A maximum of liquid was removed and tubes frozen in liquid nitrogen. Larvae were
162
grinded in acetate buffer at pH 5 and metabolites were quantified in whole larvae according to
published protocol (Devier et al., 2013; Le Du-Lacoste et al., 2013).
Fish survival and growth monitoring
Survival rates were assessed on a daily basis from D5 to D27 and then at each biometric
analysis. Fish growth was monitored on a monthly basis from 2 to 3 mpf onward. Fish were
anaesthetized for 1 min with benzocaïne (50mg.L-1) and individual standard length (mm, to the
nearest mm) and body mass (mg, to the nearest mg) were measured, and sex recorded when
possible (on the basis of morphological clues).
Larval morphology
Calcified structures were stained by immersing live larvae in calcein as described in (Du et
al., 2001). Briefly larvae were transferred into neutralised calcein solution (0.2% in water; SigmaAldrich) in Petri dishes for 10 minutes; they were then rinsed three times in water and allowed to
stand for 10 min. Larvae were then euthanized in benzocaïne (250 mg.L-1) and mounted on
depression glass slides with methyl-cellulose (3%) and imaged using a dissecting microscope with
a green fluorescence filter. Calcified vertebrae were manually counted and jaw landmark
coordinates as defined by (Xiong et al., 2008) obtained using ImageJ (Schneider et al., 2012).
Digestive enzyme studies
Samples of 20 to 30 fish were collected in triplicate 2mpf from each experimental group,
killed by anaesthesia, immediately frozen in liquid nitrogen and kept at -80°C pending dissection
and assays.
Following exposure to HO and LO, a significant effect on larval growth was observed, so
we sampled the fish after a nutritional challenge (one week of starvation, followed by refeeding
for 2 days) to evidence the digestive capacities better.
Fish were dissected on a glass slide maintained at 0°C: the intestine and a segment
containing pancreas (and also, inevitably, a crude mixture of liver, heart and stomach tissue) were
dissected. Protocols for the homogenisation of the pancreatic segments and intestine, protein
assays, and enzymatic procedures for amylase, trypsin, alkaline phosphatase (AP) and leucinealaninepeptidase (leu-ala) were as described in Zambonino-Infante et al. (1997). Enzyme activities
are expressed as specific activities, i.e. units per mg of protein.
163
Statistical analyses were performed with Statistica 9.0 software (Statsoft, Tulsa, OK,
USA). A general linear model (GLM) was applied separately for each fraction and the factors
considered are indicated below for each variable. For distributed food, food size and
concentrations were tested as fixed factors and replicates as random factors. For larval and adult
survival, diet was tested as fixed factor and replicates as random factors, with the age of fish as an
additional fixed factor for adults. To evaluate growth (body mass and length) diet and age were
tested as fixed factors, and replicates and fish as random factors. Sex was added as a fixed factor
for body mass and length at 9 mpf. To evaluate larval morphology, diet was tested as fixed factor,
and replicates and fish as random factors. Digestion enzyme activities were analyzed using oneway ANOVA, with the effects of each diet considered separately. All statistical analyses were
carried out at a 95% level of significance and only fixed factors and the interaction between them
are presented in the text. Newman-Keuls post hoc tests were performed in each case.
Results
Diets and fish exposure
The concentration for the 16 US-EPA PAHs in 1X diets were PY-1X: 4505 ± 1527, LO1X: 2739 ± 231 and HO-1X: 1887 ± 130 ng.g-1 (Table 1). With reference to the 5 µg.g-1 targeted
concentration for the 16 US-EPA PAHs for 1X diets, the spiking efficiencies for the three
fractions were between 38 and 100%. The best efficiency was obtained with the PY fraction [81100%]. Efficiencies for HO fraction were around 40% [38-42%] and for LO fractions around 58%
[55-63%]. The spiked diets also included other PAHs than the 16 US-EPA PAHs, for example 2ring
methylated
PAHs
(methylnaphtalenes;
MN)
and
3-ring
methylated
PAHs
(methylphenanthrenes and methylanthracenes; MP+MA). The total concentration of PAHs was
similar in the three 1X diets 5816 ± 1433, 4663 ± 360 and 6726 ± 278 ng.g-1 dw for PY, HO and
LO respectively. These concentrations were hundredfold the one in Control diets. The fraction
compositions differed in the relative proportion of PAHs, MN and MP+MA (Table 2).
164
Table 2 : Relative proportions (%) of PAHs and alkylated PAHs in PY, HO and LO
fractions (n=1) and diets (mean ± SD ; n=3). PAHs: sum of non-alkylated PAHs; MN:
methylnaphtalenes; MP+MA: methylphenanthrenes and methylanthracenes
PAHs
MN
MP+MA
PY
94
2
4
Fractions
HO
51
16
32
LO
27
46
27
PY
95 ± 0
1±0
4±0
Diets
HO
55 ± 1
14 ± 1
31 ± 2
LO
41 ± 1
33 ± 1
26 ± 1
The proportions of these compounds differed accordingly in diets reflecting the fraction
composition for PY and HO diets. However, the PAH proportions were higher and MN
proportions lower in the LO diet than expected from the composition of the LO fraction. The PY
diet contained a high proportion of high molecular weight PAHs — 82% were 4-6 ring
compounds — and very few methylated derivatives (5%; Figure 1 and supplementary table 2).
Figure 1 : Comparison of the proportions of PAHs compounds in PY, HO and LO diets
based on ring numbers and substitutions. Non-substituted compounds are grouped by the
number of rings (2R to 6R). Substituted compounds are grouped as 2-rings methylnaphtalenes
(MN) and 3- methylphenanthrenes and methylanthracenes (MP+MA). The number indicated after
the ; indicates the proportion of each class in the diet.
The two oil diets contained small amounts of high molecular weight PAHs: 31%, mainly
4-ring compounds in the HO diet and only 6% in the LO diet. The oil diets contained abundant
methylated PAHs: 43% for the HO diet and 55% for the LO diet. The HO diet contained twice as
much 3-ring than 2-ring methylated PAHs whereas in LO diet these two categories were present in
similar amounts. The same results were found for all diet concentrations and pellet sizes (not
shown). Quantification of hydroxylated metabolites (OH-PAHs) was performed on 15 dpf larvae
to confirm fish exposure (Table 3). A global dose-dependent increase of metabolites was observed
with some specificities. The sum of OH-PAHs of HO-3X and LO-3X was similar to those for 1X
165
concentration. For PY, metabolites increase with PAHs concentration in diet. A more detailed
analysis revealed that these differences are driven by different metabolites depending on the
mixture (Table 3). The concentration of 2-OH-biphenyl is significantly higher in LO-1X compared
to control. For PY and HO mixture, the concentration of 1-OH-pyrene and the sum of OH-BaP
metabolites was higher in 3X larvae than in the control.
Table 3 : Hydroxylated metabolite concentrations in 15 dpf larvae in ng.g-1 of tissue (mean ±
SD; n=3)
To verify that differences in growth and survival were not due to uneven food distribution,
we compared cumulated food distributed, for each granulometry and each diet, during the first
three month of exposure. Whatever the mixture used, there was no difference in the ration
distributed to the various experimental groups (PY: F=0.09; p=0.96; HO: F=0.27; p=0.85; LO:
F=0.05; p=0.98). Thereafter, the food ration was adapted according to biometry as indicated.
Survival
Survival was monitored daily from 5 to 27 dpf. For all diets, the pattern was similar with
high survival rates during the first 5 days of exposure (5-10 dpf) followed by a high rate of
mortality ending at 15 dpf. After this peak, mortality remained low until 30 dpf. No early
difference was observed between controls and fish exposed to any of the tested diet ; this
suggested that the mortality during this period was not a consequence of the exposure. A technical
improvement of breeding and feeding methods is responsible for the higher survival rate of the
fish in the LO (~80%) than PY and HO (~50%) experiments (see Material and methods section).
Survival was monitored until age 9 months (Table 4). There was a low rate of mortality
throughout the time course for all diets and PAH concentrations, with the exception of the HO
diet. Indeed, the survival of fish fed with the H0-3X diet was compromised from 3 mpf: survival
rate of 38% versus 48% for control fish at 3 mpf, and 17% at 6 mpf versus 47% for control fish.
Because of this high mortality, and to avoid losing all HO-3X fish before analysis at late time
166
points, these fish and 25 fish exposed to the two other HO concentrations and the Control were
sampled at 6 months of age.
Table 4 : Number of fish (top rows) and survival (as percentage; bottom rows) of juveniles and
adults exposed to PAH diets (survival: mean ± SEM; n=3)
Growth
In all cases, growth on PAH diets was slower than control growth, and the effect was dose
dependent, affecting both body mass and length (Table 5Table 5 and Table 6). By 4 mpf, control
fish weighed significantly more (355 ± 122 mg) than fish fed PY-1X (309 ± 135 mg, p=0.042) and
PY-3X (268 ± 137 mg; p<0.001). The difference was even larger at older ages (table 5). For HO
diets, the body mass of fish fed HO-1X and HO-3X was significantly lower than controls at all
ages considered. The body masses of fish exposed to each of the three LO concentrations were
significantly lower than control fish starting at 3 mpf. By 9 mpf, it was possible to identify the sex
of fish unambiguously for all diets and concentrations. For PY fish, a significant effect of diet
(F=132.69; p<0.001) and sex (F=15.30; p<0.001) was observed but without interactions between
both factors. Males on PY diets were not different from control males for any of the three
concentrations. However, PY-1X and PY-3X females had a lower body mass than control females.
For HO fish, there were only significant diet effects (F=7.21; p<0.001) and interaction between
diet and sex (F=4.15; p<0.05). Within each gender, body mass of males on PY diets were reduced
compared to control values in a dose-dependent manner but no differences were observed for
females. Finally, for LO fish, both diet and sex effects were significant (F=12.36; p<0.001 and
F=15.01; p<0.001 respectively) as well as interaction (F=7.89; p<0.001). As for HO, within each
gender, male body mass was reduced from control values in a dose-dependent manner and LO0.3X females had lower body mass than control.
167
Table 5 : Body mass of juveniles and adults exposed to PAH diets (mg; mean ± SEM; n see
table 3)
The findings for standard length were generally similar to those for body mass, although
there were some differences (Table 6). PY fish were shorter than controls: at 2 mpf body length of
PY-3X fish was 1.7 ± 0.4 cm whereas that of controls was 2.0 ± 0.3 cm (p<0.001) and at 4 mpf
body length of PY-1X fish was 2.5 ± 0.4 cm and that of controls was 2.6 ± 0.2 cm (p=0.009). PY1X and PY-3X fish were shorter than control fish at later time points. HO-3X fish were shorter
than other fish from 3 mpf onward and HO-1X were significantly shorter than controls only at 9
mpf. The pattern of length differences between LO fish and control was similar to that for body
mass differences. At 9 mpf, no gender difference in length was observed for PY and HO diets. For
LO fish, both diet and sex effects were significant (F=17.62; p<0.001 and F=4.34; p<0.05
respectively) as well as interaction (F=7.71; p<0.001). Within each gender, female body length
was shorter for 0.3X and 3X compared to Control and 1X; and for male, body mass was reduced
from control values in a dose-dependent manner.
Table 6 : Standard length of juveniles and adults exposed to PAH diets (mm; mean ± SEM; n
see table 3)
Jaw morphology and calcification pattern
Jaw morphology was assessed in larvae using specific landmarks allowing the
measurement of anterior and posterior lengths and angles (Figure 2 a-b). The anterior length of
PY-3X jaws was greater than that in controls. The jaws in HO-3X and LO-3X fish were shorter
than controls (both anterior and posterior length; Figure 2 a-d). The geometry of PY-3X jaws also
differed from controls with a more acute angle of the anterior part (Supplementary figure 1). The
calcification of vertebrae appeared more homogeneous, although the number of calcified vertebrae
was slightly smaller, in HO-3X and LO-3X larvae than control larvae (Figure 2 e-g). The
168
morphology of PY-3X larvae was not different from that of control. We also determined the
standard length of larvae: LO-3X larvae were 17% shorter than control larvae (Figure 2 h); the
lengths of PY and HO larvae, whatever the diet concentration, did not differ from those of the
control larvae.
Head and jaw morphology was also analyzed in 3X adults (at 4 mpf; Supplementary figure
2). Morphology of Control and PY-3X fish was normal while in the case of HO-3X and LO-3X
diets more than 85% of fish presented head and jaw morphology disruptions and more than 75%
of fish presented exophthalmia.
Figure 2 : Jaw and vertebral column anomalies assessed in 15 dpf larvae after exposure to
PY, HO and LO diets. Jaw morphology was evaluated, after calcein staining, by measuring
distances between several landmarks positioned. Representative pictures are presented for Solvent
control (a) and HO-3X (b). Length of anterior (c) and posterior (d) part of the jaw is presented for
Solvent control and 3X for all three diets. Representative pictures used to count the number of
stained vertebrae are presented for Solvent control (e) and HO-3X (f). Number of vertebrae
counted on larvae for Solvent control and 3X for all three diets (g). Length of larvae (h). (mean ±
SEM; in c, d and g * indicates conditions significantly different from their respective Solvent
control; p < 0.05; in h different letters indicate significantly different conditions; p < 0.05; n is
indicated in each bar).
Digestive enzymes
Specific activities of leucine-alanine peptidase (leu-ala) and amylase in PY fish were
assayed at 2 mpf (Figure 3), and in PY-3X fish were 40% and 45% lower, respectively, than in
controls.
169
Figure 3 : Specific activities of amylase and leucine-alanine peptidase (leu-ala) in 2 mpf fish
exposed to PY mixture. (mean ± SD; different letters indicate significant differences with
Solvent control; p < 0.05; n = 3).
The specific activities for trypsin, leu-ala and alkaline phosphatase for HO and LO fish
were determined after nutritional challenge (Table 7). The recovery of enzyme activities after a
starvation period seemed to be adversely affected by prior exposure to HO, and this effect tended
to be greater at higher doses; the differences for trypsin were smaller than those for leu-ala or
alkaline phosphatase. Exposure to the LO diet only affected the recovery of alkaline phosphatase
and only at the highest dose (LO-3X).
170
Table 7 : Specific activities (mUnit.mg -1 protein; mean ± SD; n=3) of trypsin, leucine-alanine
peptidase and alkaline phosphatase in fish exposed to HO and LO diets, after a nutritional
challenge (one week starvation “unfed” followed by 2 days refeeding “fed”).
Discussion
PAH-contaminated diets and exposure to the PAH-contaminated diets
The three diets used in this study had a similar total amounts of PAHs (at each of the three
concentrations used) but were prepared from different fractions, and thus had different
compositions consistent with the fraction used. The PAH composition of PY was representative of
pollution observed in industrial and anthropized areas (mainly of pyrolytic origin), and those of
HO and LO were clearly petrogenic (Latimer and Zheng, 2003). The analysis of PAHs metabolites
was in agreement with diets PAH contents with more heavy PAH metabolites (1-OH-pyrene and
OH-BaP) in PY larvae than in HO and a concentration for these metabolites in LO larvae not
different when compared to control larvae. LO mixture contained high proportion of low
molecular weight PAHs and therefore only 2-OH-biphenyl was significantly higher in exposed
compared to Control larvae. The low amount of low molecular weight metabolites compared to
the high amount of parent PAHs has already been observed after experimental exposure of cod
juveniles to naphtalene through diet (Grung et al., 2009). Other compounds may have been copurified in the fractions used, including nitrogen, oxygen and sulfur derivatives of PAHs. With
171
reference to the 16 US-EPA indicator PAHs, the 1X concentration of the preparations we used
(PY-1X: 4505 ± 1527; LO-1X: 2739 ± 231; and HO-1X: 1887 ± 130 µg.g-1 dw) were in the range
of the target concentration (1X) of 5 µg.g-1 dw which is found in copepods and bivalves in
contaminated areas (Cailleaud et al., 2007; Jeanneret et al., 2002; Le Goff et al., 2006; Payne et
al., 2008). Thus, diets used for these studies displayed various and contrasted compositions which
could be considered as mimicking some environmental situations.
Survival
In our experimental system, exposure to PAH mixtures had no significant effect on larval
survival whatever the mixture used; this indicates that preparations used did not trigger acute
lethal toxicity. This contrasts with observations that waterborne embryonic exposure of pink
salmon (Oncorhynchus gorbuscha) to PAH or PAH mixtures leads to mortality (Heintz et al.,
1999) and that waterborne early exposure of eggs or embryos of pacific herring (Clupea pallasi)
can lead to delayed mortality at larval stages (Carls et al., 1999). Moreover, the same three
aromatic fractions as the ones used in the present paper though diets, were also tested by direct
exposure of medaka embryos (Oryzias latipes) using a sediment-contact assay at three different
environmental concentrations (Le Bihanic et al., Submitted-a). Acute effects were observed on
larvae after exposure to both petrogenic fractions. Several hypotheses can be proposed to explain
these differences. This may be related to species specific sensitivity as this has been demonstrated
for dioxin (Elonen et al., 1998) even if a more recent work has demonstrated similar responses for
zebrafish and four other commonly used fish species (fathead minnow (Pimephales promelas),
medaka (Oryzias latipes), rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and bluegill sunfish (Lepomis
macrochirus)) in embryo toxicity tests performed with 143 different compounds (Lammer et al.,
2009). In the above mentioned studies, exposures were performed through water or sediment
which present several toxicokinetics differences with diet exposure. First, especially in the case of
waterborne exposure, organisms are abruptly exposed to the toxic (in the range of µg.L-1 or µg.g-1
in the studies mentioned above). In the case of diet exposure, the concentration of PAHs is similar
but the amount of distributed feed is low, especially at larval stages, leading to a low and
progressive level of exposure. The second point is that a recent study has demonstrated that
waterborne exposure to PCBs leaded to a strong increase of PCBs body concentrations between
hatching and first feeding, which may result in early physiological disruptions (Foekema et al.,
2012). This may be a reason why freshly-hatched larvae are extremely sensitive to pollutants
172
(Hutchinson et al., 1998; Woltering, 1984), and may partly explain the absence of acute mortality
reported here, since exposure started at the larval stage but 2 to 3 days after hatching.
Survival was then monitored for 9 months, to document the long-term effects of chronic
exposure. We did not observe any modification of survival rates for any of the mixtures, except
for HO-3X. Numerous reports describe sub-lethal effects of exposure to PAHs, but there have
been few studies of long-term survival after early exposure. Nevertheless, one-month exposure of
milkfish (Chanos chanos) to high doses (>3 µg.L-1 of anthracene or >1.4 of BaP) has been shown
to be associated with mortality (Palanikumar et al., 2013). Also, a short acute exposure of sole
(Solea solea) juveniles to Fuel-oil No.2, an oil similar to the HO-3X mixture we used, produced a
long-lasting increase of the risk of mortality (Gilliers et al., 2012). This suggests that this mixture
is more toxic than the others used. However, the absence of mortality – except for HO-3X – in our
experimental model is in agreement with several previous reports (Meador et al., 2006; Wu et al.,
2003; Yuen et al., 2007).
Growth and digestive enzymes
Growth was assessed after 10 days of exposure (body length in larvae) and later on a
monthly basis starting at 2-3 mpf (body length and mass in juveniles and adults). All PAH
fractions used caused a dose-dependent slowing of growth. The use of several fractions in the
present study allowed identifying differences between them. For PY diets, larvae and juveniles
growth was not affected. In adults for which it was possible to identify sex, body mass was lower
for PY-1X and PY-3X females compared to control females but no difference was observed for
males. In the case of petrogenic fractions, larvae and juvenile growth was affected and in adults
the body mass was lower for HO-3X and LO-3X males but not females. The evolution in time
revealed that differences were stable for PY but tended to decrease for HO and LO diets. Taken
together, these results are in agreement with previous reports of fish exposure to PAH or PAHs
mixtures through various routes (water or food), and for various durations (1 day to several
months) and concentrations (Gilliers et al., 2012; Gundersen et al., 1996; Kim et al., 2008; Meador
et al., 2006; Moles and Rice, 1983; Palanikumar et al., 2013; Schuler et al., 2007a).
In order to identify possible mechanisms, the activity of gut digestive enzymes has been
monitored in juveniles after 2 months of exposure. Because an early decrease of growth was
observed for HO and LO, these analyses were performed after a nutritional challenge for these
diets. A decrease of digestive enzymes activity was observed for PY-1X and PY-3X. As far as we
know, no previous study has examined the effects of PAHs on fish gut digestive enzyme activities.
173
Meador et al. (2006) reported, in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha), a dose-dependent
decrease in lipase and amylase activity in blood after exposure to artificial PAH mixtures designed
to mimic those found in the stomach of field-collected fish: both enzymes were assayed in the
blood although they are produced by the liver. Their expression was nevertheless impaired in fish
exposed to PAHs, and this effect may also apply to digestive enzymes.
As for PY exposition, the digestive enzyme activities after the nutritional challenge
paralleled the growth impairment observed in HO-1X, HO-3X and LO-3X fish. During starvation,
the digestive enzymes activities decline and, after refeeding, recovered rapidly; the extent of the
recovery is tightly linked to the digestive status of the animal (Zambonino-Infante et al., 1992;
Zambonino-Infante et al., 1996). The digestive capacities of fish exposed to the HO and LO
mixtures were affected in a dose-dependent manner: the higher the dose, the lower the digestive
enzymatic rehabilitation. This may have dramatic consequence in the wild where feeding is not
continuous over time and starvation periods occur.
The impairment of digestive enzyme capacity may, to a large extent, explain the inhibition
of fish growth. It is to note that the impairment of the digestive capacities by the PY mixture
observed at 2mpf preceded detection of the negative effect on fish growth, which was only
observed at a later stage. This contrast with the situation observed after exposure to oils with a
coincidence of both phenotypes. This suggests that in the case of PY, digestive enzymes
disruption may lead to a delayed and progressive degradation of growth.
Jaw morphology
We observed jaws abnormalities in juveniles and adults exposed to PAHs. PAHs have
previously been shown to disrupt jaw development in embryos and calcification in juveniles
(Debruyn et al., 2007; Incardona et al., 2004; Li et al., 2011; Shi et al., 2012). It is therefore
plausible that early jaw disruptions may impair feeding abilities as this has been proposed for cod
larvae exposed to produced water (Meier et al., 2010). Indeed, jaw morphology was modified in
all larvae whatever the mixture to which they were exposed. In the case of the PY mixture, there
was elongation of the anterior part of the jaw, manifest as both increased length and decreased
width, with respect to controls; exposure to the oil mixtures led to shortening of the jaw but no
modification of the geometry. These results indicated that exposure to PAHs affects jaw growth.
During embryogenesis, neural crest cells originating from the dorsal part of the neural plate
migrate to populate the pharyngeal arches, and then cells from the first pharyngeal arch further
migrate and condense to form the jaw skeleton (Kimmel et al., 1995). This succession of events
174
takes place during the first days of development and jaw morphology is established by 5 dpf,
which corresponds to the date when the exposure started in the present study. Our results thus
indicate that jaw morphology can also be disrupted when exposure starts after jaw ontogenesis. In
the case of LO, larval body size was also reduced, so we cannot rule out the possibility that jaw
abnormalities are a consequence of growth inhibition rather than its cause. Nevertheless, these
results indicate that growth was disrupted very early and was already detectable after 10 days.
Early jaw morphological defects observed in larvae were compensated for PY but persisted in
adults exposed to HO and LO fractions, strengthening the hypothesis that these morphological
disruptions likely contributed to growth decrease, at least for HO and LO. Even if we did not
observe an effect on survival in this otherwise optimized experimental system, the early
morphological defects could have dramatic consequences on survival of larvae and later stages in
the wild.
Differences between the mixtures studied, and ecotoxicological consequences
Each mixture had dose-dependent effects that differed depending on the mixture used.
Considering the whole set of variables analyzed, the HO mixture appeared to be the most toxic,
followed by LO and PY. This finding is in agreement with what has been observed with the same
mixtures after sediment-contact exposure of medaka and trout embryos (Le Bihanic et al.,
Submitted-a; Le Bihanic et al., Submitted-b; Le Bihanic et al., Submitted-c). Although they had
roughly similar total PAH contents, the mixtures differed in the proportions of the various PAHs.
It is therefore difficult to relate observed toxicity to a particular group of compounds or to predict
the toxicity of a mixture on the basis its composition. However, it is likely that alkylated
compounds, and in particular MP and MA, are responsible for a large part of the toxicity of these
mixtures, acting in synergy with high molecular weight PAHs. This is in agreement with other
findings for experimental exposure of zebrafish, medaka, trout and seabass (Danion et al., 2011b;
Danion et al., 2011c; Hawkins et al., 2002; Hodson et al., 2007; Hogan et al., 2010; Incardona et
al., 2009; Sundberg et al., 2005) and suggest that further investigation of alkylated derivatives
would be informative. Recent analyses of other derivatives, and particularly hydroxy- or
hydroxyalkylated PAH derivatives (Fallahtafti et al., 2012; Knecht et al., 2013), also indicate the
need for additional long-term studies to provide information about their toxicity in an
ecotoxicological perspective. Finally, our results indicate that PAH mixtures of different
compositions, representative of situations encountered in the wild, can promote lethal and
175
sublethal effects, both on larvae and at latter stages, which are likely to be detrimental for fish
recruitment.
Conclusion
As part of the ConPhyPoP project, we exposed zebrafish, from their first meal and for at
least 9 months, to mixtures of PAH fractions similar to those found in the environment. This
prolonged duration of exposure allowed effects on physiological functions to be assessed during
larval and juvenile stages and in adults. We studied diverse functions including growth,
reproduction, behavior, tumorigenesis, metabolism (respiratory, digestive), osmoregulation and
immunity. This comprehensive study was performed to obtain an integrated and as complete as
possible knowledge of the physiological consequences of a long-term exposure to various PAHs
fractions. Here, we report exposure procedures, including the composition of the PAH mixtures
used, and the consequences on survival and growth. We have also identified some potential
mechanisms for the effects of these contaminants. In this first report we observed that the different
fractions had different effects and thresholds for effects on fish, suggesting differential
involvement of these compounds in the toxicity of the mixtures. In this experimental model
representative of environmental situations, long-term and chronic exposure to each of the three
mixtures led to growth disruption, and in the case of HO to decreased fish survival. These effects
could be due to developmental jaw defects and/or digestive enzyme dysfunctions; they both have
detrimental consequences on fish performance and contribution to recruitment.
Acknowledgements
We thank Didier Leguay, Cathy Haget, Manon Goubeau and Tiphaine Guionnet for their
help. This study was supported financially by the ANR project ConPhyPoP (CES 09_002) and
CPER A2E. This project is co-financed by the European Union with the European fund of
regional development.. Doctoral grants were received from the Région Poitou-Charentes (C.V.
and J.L.), from l’Institut Français de Recherche pour l’Exploitation de la Mer (C.V. and P.P), from
Conseil Général de Charente Maritime (P.P.) and from the Ministère de l’Enseignement de
Supérieur et de la Recherche (F.L.B.). This work was part of the LABEX COTE cluster of
excellence continental to coastal ecosystems.
176
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Supplementary Material Table 1 : PAHs concentration in used aromatic fractions (µg.g -1of
fraction; mean ± SD)
PAHs
Naphthalene
acenaphthylene
Acenaphthene
Fluorene
Phenanthrene
Anthracene
Fluoranthene
Pyrene
benzo[a]anthracene
triphenylene + chrysene
benzo[b]naphto[2,1-d]thiophene
benzo[b]fluoranthene+benzo[k]fluoranth
ene+benzo[j]fluoranthene
benzo[e]pyrene
benzo[a]pyrene
Perylene
indeno(1,2,3-cd)pyrene
dibenz(ah)anthracene +
dibenz(ac)anthracene
benzo[ghi]perylene
Sum PAHs
Ring #
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
4
PY
7.8 ± 0.5
4.8 ± 0.4
2.8 ± 0.3
4.7 ± 0.4
26.4 ± 2.5
14.5 ± 1.1
55.7 ± 4.8
49.5 ± 4.3
33.6 ± 2.8
39.9 ± 3.5
9.6 ± 0.6
HO
88.5
0.4
34.9
59.8
280.7
38.8
23.2
137.6
112
275.5
154.4
LO
133.2 ± 4
15.8 ± 1.9
16 ± 7.3
38.4 ± 1.1
60.5 ± 4
1.1 ± 0.5
0.3 ± 0.2
4.5 ± 0.4
2 ± 0.4
12 ± 0.6
21.6 ± 0.5
4
76.8 ± 6.8
59.9
2 ± 0.2
5
5
5
5
32.2 ± 2.9
33 ± 3.1
13.3 ± 1.3
32 ± 2.4
92.2
56.5
30
5.3
4.5 ± 0.5
0.6 ± 0.2
1.1 ± 0.1
ND
5
9.3 ± 0.7
17.1
ND
6
29.5 ± 2.4
475.5 ± 40.7
93.1
1560
1.2 ± 0.2
315 ± 10.2
2-methylnaphthalene
1-methylnaphthalene
Sum methylnaphthalenes
2
2
4.9 ± 0.5
2.7 ± 0.3
7.6 ± 0.8
311.9
187.4
499.3
247.1 ± 7.3
281.6 ± 14.2
528.7 ± 19.7
3-methylphenanthrene
2-methylanthracene
9-methylphenanthrene + 1methylanthracene
Sum methylphenanthrenes
3
3
3
4.9 ± 0.4
6.6 ± 0.5
2.9 ± 0.2
227.3
291.5
83.6
52.5 ± 7.3
55.1 ± 1.9
41 ± 10.8
3
5.8 ± 0.6
190.7
100.5 ± 13.3
3
3.5 ± 0.4
20.8 ± 1.9
182.1
975.2
67.6 ± 15
316.7 ± 12.4
504 ± 42.1
3034.5
1160.3 ± 35.1
Total PAHs
ND: not detectable. Value without SD indicated the compound was quantified in only one sample.
183
Supplementary Material Table 2 : Detailed concentration of individual PAHs in produced diets (ng.g -1 food; mean ± SD; n=4-7)
PY
Ring #
Control
naphthalene
acenaphthylene
acenaphthene
fluorene
dibenzo[b,d ]thiophene
phenanthrene
anthracene
fluoranthene
pyrene
benzo[a]anthracene
benzo[b ]naphto[2,1-d ]thiophene
benzo[b]fluoranthene+benzo[k]fluo
ranthene+benzo[j]fluoranthene
benzo[e ]pyrene
benzo[a]pyrene
perylene
benzo[ghi]perylene
Sum PAHs
2
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
4
HO
1X
56 ± 14
35 ± 6
29 ± 7
42 ± 8
34 ± 5
291 ± 60
159 ± 41
523 ± 182
447 ± 160
581 ± 221
744 ± 290
156 ± 70
3X
157 ± 74
114 ± 23
89 ± 24
137 ± 28
102 ± 26
895 ± 213
482 ± 165
1782 ± 353
1496 ± 311
1671 ± 763
2144 ± 1032
472 ± 230
Control
6±6
1±0
2±1
2±1
2±3
8±4
1±0
3±3
3±3
1±0
1±0
5±3
0.3X
15 ± 7
11 ± 2
14 ± 12
14 ± 3
11 ± 1
95 ± 21
49 ± 13
130 ± 28
112 ± 24
171 ± 75
215 ± 91
52 ± 26
4
5
5
5
5
2±1
1±0
1±0
1±0
0±0
273 ± 72
109 ± 29
118 ± 33
37 ± 9
123 ± 41
868 ± 220
346 ± 86
373 ± 95
121 ± 27
349 ± 89
2740 ± 674
1084 ± 286
1168 ± 346
390 ± 83
1188 ± 265
5
6
2±2
0±0
34 ± 6
32 ± 11
87 ± 27
1670 ± 448
2-methylnaphthalene
1-methylnaphthalene
2
2
8±9
4±6
12 ± 15
15 ± 3
8±2
23 ± 5
43 ± 8
22 ± 5
65 ± 13
2-methylanthracene
3
3
3
2±1
2±0
0±0
17 ± 3
19 ± 5
8±2
3
3
1±0
1±0
7±3
14 ± 4
12 ± 3
70 ± 15
55 ± 12
1763 ± 468
Total PAHs
LO
1X
120 ± 16
3±1
74 ± 19
99 ± 8
166 ± 11
418 ± 32
70 ± 2
44 ± 2
227 ± 19
172 ± 11
336 ± 21
186 ± 8
3X
405 ± 73
13 ± 13
190 ± 17
312 ± 25
546 ± 54
1279 ± 51
220 ± 10
145 ± 18
709 ± 64
543 ± 29
1073 ± 79
573 ± 36
Control
4±1
1±0
27 ± 26
2±1
0±0
6±3
0±0
2±1
1±0
0
ND
0
0.3X
37 ± 6
3±1
46 ± 23
34 ± 2
54 ± 3
152 ± 7
22 ± 1
17 ± 1
80 ± 3
57 ± 4
108 ± 8
56 ± 4
2.4
ND
0±0
0±0
ND
32 ± 2
56 ± 3
ND
ND
ND
110 ± 8
173 ± 11
108 ± 6
56 ± 4
ND
0.3
0±0
39 ± 30
ND
ND
880 ± 28
116 ± 39
62 ± 21
178 ± 60
4±1
2±0
6±2
47 ± 11
60 ± 13
25 ± 6
149 ± 31
175 ± 41
78 ± 18
49 ± 12
37 ± 11
218 ± 41
165 ± 56
100 ± 28
668 ± 157
108 ± 43
301 ± 106
268 ± 67
893 ± 191
5532 ± 1383 17305 ± 4798
5816 ± 1433 18151 ± 4983
3±1
1±0
23 ± 21
2±1
0±0
6±4
0±0
2±1
2±0
0
ND
0
0.3X
161 ± 21
15 ± 1
37 ± 26
79 ± 1
443 ± 8
178 ± 7
2±1
2±2
13 ± 2
4±1
30 ± 1
66 ± 1
1X
315 ± 183
46 ± 2
67 ± 68
232 ± 2
1161 ± 18
492 ± 10
4±1
1±1
18 ± 2
14 ± 2
98 ± 4
194 ± 9
3X
1110 ± 472
136 ± 19
90 ± 30
677 ± 55
3489 ± 208
1438 ± 86
42 ± 54
15 ± 17
73 ± 28
49 ± 28
320 ± 62
588 ± 30
363 ± 18
536 ± 26
342 ± 10
172 ± 14
ND
2.4
ND
0±0
0±0
ND
6±0
17 ± 0
ND
ND
ND
20 ± 1
52 ± 1
4±1
5±1
ND
66 ± 7
160 ± 10
17 ± 3
13 ± 1
ND
34 ± 2
146 ± 10
2558 ± 169
113 ± 6
481 ± 12
8082 ± 305
0.3
0±0
33 ± 26
ND
ND
1053 ± 63
3±1
12 ± 0
2739 ± 231
11 ± 1
42 ± 12
8335 ± 854
137 ± 13
86 ± 8
223 ± 20
396 ± 32
261 ± 20
657 ± 52
1259 ± 118
854 ± 84
2113 ± 201
4±1
2±0
5±1
420 ± 19
458 ± 19
878 ± 38
1036 ± 96
1147 ± 102
2183 ± 197
2982 ± 725
3300 ± 739
6282 ± 1465
1±0
1±0
ND
126 ± 24
149 ± 11
ND
326 ± 47
400 ± 28
ND
934 ± 160
1172 ± 166
409 ± 32
1±0
1±0
ND
114 ± 14
121 ± 2
ND
319 ± 38
340 ± 16
ND
850 ± 156
915 ± 124
32 ± 8
1±0
0±0
2±2
137 ± 20
73 ± 8
530 ± 34
360 ± 85
227 ± 15
1448 ± 144
990 ± 206
617 ± 71
4122 ± 581
1±0
1±0
2±2
283 ± 29
122 ± 4
640 ± 35
798 ± 42
348 ± 14
1804 ± 67
2226 ± 394
956 ± 97
4957 ± 731
47 ± 33
1633 ± 71
4663 ± 360
14317 ± 813
40 ± 29
2572 ± 96
6726 ± 278
19574 ± 1945
ND: not detectable.
184
Supplementary Figure 1
185
Résultats supplémentaires
Nous avons essayé de standardiser au maximum les distributions d'aliment entre les
conditions pour garantir le fait que les différents niveaux de croissance n'étaient pas dus à des
différences de distribution. Pour ce faire, chaque aquarium avait son propre tube d'aliment. Pour
chaque granulométrie, les tubes individuels étaient pesés au début et à la fin de leur utilisation. Les
données des 476 tubes PY, 388 tubes HO et 322 tubes LO ont été compilées en Figure 52. La plus
grosse granulométrie (>500 µm) représente la quantité d'aliment la plus distribuée. Au départ, les
poissons mangent très peu. L’uniformité de la quantité distribuée a été validée par les statistiques
(GLM), qui révèlent l’absence de différence entre les conditions (Contrôle = 0.3X = 1X = 3X)
pour toutes les fractions. Des différences sont observées entre les fractions. En effet, lors de
l'exposition PY, un plus grand nombre de poissons a été produit par rapport aux autres fractions,
en particulier des poissons de moins de 1 mois, ce qui explique la moyenne plus haute de la
quantité d'aliment donné. Au niveau des fractions HO et LO, les rations ont été augmentées pour
les doses 315<µm<500, car les poissons contaminés étaient très petits et présentaient des
difficultés pour ingérer l'aliment de la granulométrie supérieure.
186
Figure 52 : Distribution moyenne totale d'aliment pour chacune des 4 granulométries
utilisées : <125 µm, entre 125 et 315 µm, entre 315 et 500 µm et >500 µm.
a) Distribution pour la fraction PY. b) Distribution pour la fraction HO. c) Distribution pour la
fraction LO.
187
III Effets des HAP sur le comportement (article 4)
L'effet de ces contaminants sur le comportement des poissons directement exposés a été
évalué. Dans un premier temps il était souhaitable d'estimer les effets neurotoxiques de ces 3
fractions, et, dans un second temps, d'évaluer si cette classification de toxicité serait conservée en
utilisant d'autres variables. Le comportement constitue un indicateur intégrateur pertinent qui est
de plus en plus utilisé dans la littérature. Il permet de déceler certains effets, notamment
neurotoxiques, liés aux polluants. En effet, le comportement individuel correspond à une interface
entre les facteurs écologiques et les mécanismes de toxicité. Dans le cas de notre étude, il était
intéressant d'étudier différentes sortes de réponses comportementales à la suite d'une
contamination chronique longue (2 mpf) et très longue durée (6 mpf). En outre, les altérations
comportementales peuvent avoir des conséquences sur l'aptitude des poissons à survivre dans leur
milieu ou à se reproduire. Dans cet article, nous évaluerons les altérations comportementales chez
les poissons exposés par voie trophique, comme cela a été présenté dans l'article 2.
Nous avons choisi d'étudier le comportement à deux stades de vie bien distincts : à 2 mois
post-fécondation (mpf) qui représente la période juvénile, et à 6 mpf, qui illustre la période adulte.
Les mêmes tests ont été réalisés aux deux âges, mais à chaque fois sur des poissons naïfs. Dans le
cadre de cet article, seuls les résultats à 2 mpf et la locomotion à 6 mpf sont présentés dans les
graphiques. Les résultats et les statistiques des poissons à 6 mpf sont inscrits dans le texte.
Le stress de réponse photomotrice permet d'évaluer le niveau d'anxiété des poissons. Des
différences au niveau de la distance parcourue pour HO ainsi qu’une augmentation du temps
d'immobilité pour les HO et les PY ont été observées à 2 mpf. Ce test a également été réalisé à 6
mpf.
Par la suite, deux tests de réponse à un environnement nouveau ont été effectués à 2 et 6
mpf. Le premier test a été réalisé dans un labyrinthe, le second test est celui du "novel tank". Là
encore, des différences sont apparues, principalement chez les HO. Les poissons contaminés
semblent globalement plus anxieux. Ils mettent plus de temps à débuter le test du labyrinthe et
explorent une plus petite surface de celui-ci. Ils passent également la plus grande partie du test du
"novel tank" dans la partie la plus basse du bac.
A 6 mpf, un test d'activité basale a été mené. Le résultat indique que le temps d'immobilité
chez les HO et les LO est moins important en période de jour, mais aussi en période de nuit pour
certains HO (1X et 3X). Cette diminution de l'immobilité en nage basale est cohérente avec l'état
188
d'anxiété observé à 2 mpf dans tous les autres tests. En effet, l’anxiété peut être visible lorsque le
poisson nage de manière très rapide, avec des mouvements erratiques et qui se traduit par une
hyperactivité.
D'une manière générale, les effets à 2 mpf sont plus importants que ceux observés à l'âge
adulte. En outre, comme pour l'étude précédente concernant la croissance et la survie, un effet
graduel des fractions HO>LO>PY est établi. Ces effets au niveau du comportement semblent
révéler une anxiété plus importante des poissons contaminés. Ils diminuent leurs capacités à
explorer un environnement nouveau.
Variables mesurées
Locomotion
24 h
PY
HO
LO
Distance
-
-
-
Immobilité
-
↓↓
↓
Tendance ↓
Réponse
photomotrice
Distance
-
Tendance ↓
Immobilité
↑
↑
Maze
Exploration
↓
↓↓
-
Novel Tank
Anxiété
↑
↑
↑
189
Chronic dietary exposure to pyrolytic and petrogenic mixtures of PAHs causes physiological
disruption in zebrafish - Part II: Behavior
C. Vigneta, K. Le Menachb, L. Lyphouta,c, T. Guionneta, L. Frèrec, D. Leguayc, H. Budzinskib, X.
Cousina,d, M-L. Bégoutc,*
a Ifremer, Laboratoire d'Ecotoxicologie, Place Gaby Coll, BP7, 17137 L’Houmeau, France
c Ifremer, Laboratoire Ressources Halieutiques, Place Gaby Coll, BP7, 17137 L’Houmeau, France
* Corresponding author: Marie-Laure Bégout – [email protected]
Tel +33 5 46 50 06 21 – Fax +33 5 46 50 06 50
Abstract
In the last 10 years, behavior assessment has been developed as an indicator of neurotoxicity and
an integrated indicator of physiological disruption. Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)
release into the environment has increased in recent decades resulting in high concentrations of
these compounds in the sediment of contaminated areas. We evaluated the behavioral
consequences of long-term chronic exposure to PAHs, by exposing zebrafish to diets spiked with
three PAH fractions at environmentally relevant concentrations. Fish were exposed to these
chemicals from their first meal (5 days post fertilization) until they became reproducing adults (at
6 months old). The fractions used were representative of PAHs of pyrolytic (PY) origin and of two
oils differing in composition (a heavy fuel oil (HO) and a light crude oil (LO)). Several tests were
carried out to evaluate circadian spontaneous swimming activity, responses to a challenge
(photomotor response), exploratory tendencies and anxiety levels. We found that dietary PAH
exposure was associated with greater mobility, lower levels of exploratory activity and higher
levels of anxiety, particularly in fish exposed to the HO fraction and, to a lesser extent, the LO
fraction. Finally, our results indicate that PAH mixtures of different compositions, representative
of situations encountered in the wild, can induce behavioral disruptions resulting in poorer fish
performance.
Keywords: Danio rerio, polycyclic aromatic hydrocarbon, heavy oil, light crude oil, anxiety-like
behavior, photomotor responses, maze, novel tank.
190
Introduction
Xenobiotics are increasingly being released into the environment as a result of human
activities. The compounds of one particular group of xenobiotics, persistent organic pollutants
(POPs) persist in the environment, have lipophilic properties and are very stable chemically,
making the bioaccumulation of these molecules highly likely. Aquatic compartments, including
sediment, often constitute the ultimate reservoir of these compounds, so fish may be exposed to
POPs at various stages in their lives.
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) constitute a large and diverse family of POPs
formed by the association of several aromatic rings. This family of molecules also includes PAH
derivatives with alkyl, nitrogen, sulfur or oxygen substitutions. PAHs and their derivatives are
produced during the combustion of organic matter (pyrolytic PAHs) and are present in oils
(petrogenic PAHs). Pyrolytic PAHs are released into the atmosphere, leading to their deposition
on water and soil. PAHs deposited on soil can enter water compartments through runoff.
Petrogenic PAHs may be discharged directly into water as a result of oil spills or naval or offshore
oil drilling activities (Latimer and Zheng, 2003). PAHs are also introduced into the environment
through natural processes, such as oil leaks or diagenesis. In all cases, PAHs are present in the
form of complex mixtures containing large amounts of individual PAHs and derivatives. The
composition of mixtures of PAHs depends on their origin. Pyrolytic mixtures contain a high
proportion of heavy PAHs, such as benzo[a]pyrene (BaP), and few alkylated PAHs, whereas
petrogenic mixtures contain a smaller proportion of heavy PAHs, with a higher proportion of light
PAHs and larger amounts of alkylated PAHs (Benlahcen et al., 1997; Budzinski et al., 1997;
Latimer and Zheng, 2003; Neff, 1979; Yunker et al., 2002). The release of PAHs into the
environment has increased in recent decades (Eisler, 1987; Shen et al., 2013; Zhang and Tao,
2009). Indeed, monitoring networks have documented PAH concentrations of up to 50 μg.g-1 dry
weight (dw) in sediment from various affected aquatic ecosystems, although the concentrations in
highly contaminated areas were mostly found to be in the 10 μg.g-1range (Baumard et al., 1998;
Benlahcen et al., 1997; Cachot et al., 2006; Johnson et al., 2007; Varanasi et al., 1993; Yanagida et
al., 2012). The concentration of PAHs in the biota depends on the concentration of these
molecules in the immediate surroundings and trophic level. For example, the total concentration of
the 16 PAHs used as indicators by the US Environmental Protection Agency (US-EPA) in the
copepod Eurytemora affinis in the Seine Estuary has been reported to be in the 165–3866 ng.g-1
dw range (Cailleaud et al., 2007) and, in mussels, this concentration may reach 1600 ng.g-1 dw (Le
191
Goff et al., 2006). In cases of acute accidental exposure, the concentration in mussels may be even
higher, with values reaching 3000 ng.g-1 dw reported after the Erika oil spill (Jeanneret et al.,
2002) and of 14350 ng.g -1 dw recorded after the Exxon Valdez oil spill (Payne et al., 2008). PAHs
accumulate in animals located at lower levels of the food chain because they are poorly
metabolized in these species. Food is thus an important source of exposure, as demonstrated by the
high concentrations of PAHs found in the stomachs of fish caught in contaminated areas (Johnson
et al., 2007; Varanasi et al., 1993; Yanagida et al., 2012).
There is growing evidence to suggest that POPs can act as neurotoxicants, particularly in
cases of early exposure (Ottinger et al., 2013; Scott and Sloman, 2004). Only a few studies have
described the behavioral disruptions following PAH exposure in fish. In most cases, this was
achieved by waterbone exposure of juveniles to single compound (Almeida et al., 2012; Correia
et al., 2007; Goncalves et al., 2008; Gravato and Guilhermino, 2009; Oliveira et al., 2012). One
study also reported additive effects for a mixture of three PAHs (Goncalves et al., 2008). These
studies have generally concluded that PAHs cause lethargy, resulting in a decrease in the
swimming activities of exposed fish.
Early stages are considered to be more sensitive than later stages, but the number of studies
focusing on early stages (embryo-larval stage) is even smaller. For example, brief exposure of
medaka embryos to sediment spiked with benzo[a]anthracene has been shown to reduce larval
activity after a photomotor challenge in medaka (Le Bihanic, personal communication). Finally,
the exposure of Pacific herring eggs to weathered oil has several adverse effects, including a
decrease in the ability of the larvae to swim (Carls et al., 1999). We have shown that the brief
exposure (from 4 to 96h post fertilization) of zebrafish embryos to a mixture of benzo[a]pyrene,
pyrene and phenanthrene leads to lower levels of locomotor activity and/or the induction of
anxiety-like behavior in adults (Vignet et al., 2014a). These findings are consistent with
observations showing that exposure to PAHs is associated with several types of neurobehavioral
disruption, including anxiety and attention disorders, in humans and rodents (Bouayed et al., 2009;
Edwards et al., 2010; Jedrychowski et al., 2003; Perera et al., 2012; Saunders et al., 2001, 2003;
Tang et al., 2008; Xia et al., 2011). It has also recently been shown that perinatal exposure to a
mixture of 16 PAHs induces anxiety-related behavior in adult rats (Crépeaux et al., 2012, 2013).
192
Quantitative behavior analysis is now considered to be a good indicator in studies of
pharmacology, toxicology, ecotoxicology and in cognition or neurobiology (Ali et al., 2011a; Ali
et al., 2011b; Champagne et al., 2010). The use of model fish species, such as medaka and
zebrafish, has developed exponentially over the last decade, and the use of these species in this
context is now widely accepted (Champagne et al., 2010; Creton, 2009; Norton and Bally-Cuif,
2010; Steenbergen et al., 2011). Studies of fish behavior as a means of investigating the
neurotoxic effects of compounds and the underlying mechanisms of toxicity are becoming
increasingly common. Fish have been used as models of human disorders in studies on
compounds such as alcohol (Gerlai et al., 2000; MacPhail et al., 2009) and for the testing of drugs
to treat anxiety (Champagne et al., 2010; Egan et al., 2009; Maximino et al., 2010). In the
particular context of ecotoxicology, individual responses correspond to the interface between
ecological factors and toxicity mechanisms, making individual behavior a particularly relevant and
integrative indicator of the effects of pollutants (Bailey et al., 2013; Hinton et al., 2005; MacPhail
et al., 2009).
We report here the effects of long-term dietary exposure to three environmental mixtures
of PAHs in zebrafish, in a dose-response study with three concentrations. Fish were fed diets
spiked with mixtures approximating relevant environmental concentrations, from their first meal
at 5 days post fertilization (dpf). We analyzed several behavioral traits, including locomotion,
exploration and anxiety, successively in two-month-old juveniles and six-month-old adults. In
addition to measuring behavioral toxicity and evaluating the neurotoxicity of PAHs in a model
species, we also evaluated the potential ecological consequences for fish populations.
Materials and Methods
Preparation of PAH-contaminated diets
Three aromatic fractions were used for exposure experiments: i) a pyrolytic fraction (PY)
extracted from sediments collected from a polluted site of the Seine Estuary (Oissel, France) and
ii) two petrogenic fractions obtained from Erika fuel (heavy oil; HO) and Arabian Light crude oil
(LO). PAHs were extracted as previously described (Cachot et al., 2006). Zebrafish were exposed
from their first meal (at 5 dpf) onward, through spiked food pellets. The food pellets obtained
from the supplier were 0.5 mm in diameter (INICIO Plus 0.5, Biomar, France); these pellets were
ground and used to prepare age-appropriate food pellets of four sizes: ≤125 μm, 125-315 μm, 315500 μm and ≥500 μm (Vignet et al., 2014b). Three concentrations, 0.3X, 1X and 3X, were used,
193
with the 1X concentration corresponding to the Σ[16 EPA PAH] at 5 μg.g-1 dw food,
representative of the concentrations found in mollusks in the Seine Estuary. The names of the diets
indicate the origin of the fraction and its concentration. For example, the 1X pyrolytic fraction diet
was named PY-1X. For each exposure, a control treatment was included, corresponding to the
plain food treated as for the spiked food with dichloromethane, the carrier solvent used for PAH
spiking.
Fish exposure
This study was conducted with the approval of the French Animal Care Committee under
the official license held by M.-L. Bégout (17-010).
We used the zebrafish wild-type TU strain (ZFIN ID: 76 ZDB-GENO-990623-3), which
was established at our platform (PEP – http://wwz.ifremer.fr/pep) six years ago from large batches
of individuals originating from the Amagen platform (Gif/Yvette, France) and the Pasteur Institute
fish facility (Paris, France). The exposure procedures are described in detail in the article by
Vignet et al. (2014b). Briefly, eggs were obtained by the random pairwise mating of zebrafish
placed together in spawning boxes (AquaSchwarz, Germany) overnight. Eggs were collected the
next morning and the rate of fertilization was assessed within two hours of collection: only spawns
with a fertilization rate greater than 80 % were retained. We ensured that incubation conditions
were as homogeneous as possible, by mixing at least five spawns and then randomly sampling 50
embryos and transferring them to as many Petri dishes as required for the planned number of
treatments. Exposure experiments with PY, HO and LO were carried out successively (PY in year
one of the project, HO and LO in year two, see details in Vignet et al. (2014b)) and all exposures
were performed in triplicate. Embryos and larvae were maintained at 28°C, in clean medium, in
Petri dishes in an incubator subjected to the same photoperiod as for adults. From 5 dpf onwards,
each replicate were reared in separate 1-liter tanks. After 12 days, they were transferred to 10-liter
tanks in a flow through system with water renewal, the daily rate of which was increased with age,
reaching 40% after one month. Standard water quality and rearing methods were used (Lawrence,
2007; Vignet et al., 2014b). From 5 dpf onwards, the fish were fed twice daily with size-adapted
spiked pellets and once daily with plain Artemia nauplii. The fish were allowed ad libitum access
to the food pellets from 5 dpf until the first biometric measurements were taken: at 2 months postfertilization (mpf) for HO and LO and at 3 mpf for PY. Thereafter, the quantity of food provided
was equivalent to 2 % of the biomass in each tank, with the exception of the PY-spiked food, for
which we provided ~5 % of the biomass in the tank until 3 mpf when we decreased to 2 %.
194
Rations were adapted on a monthly basis, following biometric measurements. This led to
differences in growth between the control fish, which were heavier and longer for PY (at 6 mpf,
body mass (mg):707 ± 22; body length (mm): 31.1 ± 0.3) than for HO and LO (body mass (mg):
HO = 265 ± 7 ; LO = 246 ± 6; body length (mm): HO = 25.2 ± 0.2 ; LO = 24.3 ± 0.2) as described
in detail in Vignet et al. (2014b). These differences in body size may partly account for the
differences in behavioral responses observed between control PY and control HO/LO fish.
Behavioral experiments
Behavioral experiments were performed with two-month-old undifferentiated juveniles and
six-month-old adult males and female (in equal proportions, except for HO-3X, for which it was
not possible to distinguish between the sexes on the basis of phenotype). Different sets of animals
were used for each behavioral test, except for the photomotor response in adults, which was
coupled with the 24-h swimming activity test, and the maze test, which was coupled with the
novel tank test, these tests being performed consecutively on the same day (see below for the
detailed protocol). HO-3X fish were not tested at the age of six months in the Z-maze and novel
tank tests, because of their low survival (Larcher et al., In revision ; Vignet et al., 2014b). Tests
were carried out in a dedicated room maintained at 27°C ± 1°C, with a 14:10 photoperiod
synchronized with that of the rearing room so as to minimize unwanted correlated effects. The
light was switched on at 08:30 and there were no twilight transition periods.
24-h swimming activity in adults
At each session and for each fraction, six-month old fish exposed to each concentration
were randomly placed in 3-liter tanks (24.5 × 15 × 13.5 cm, AquaBox® 3, AquaSchwartz,
Göttingen, Germany) filled with 1.5 liters of system water, to avoid tank position and session bias.
The 12 tanks (3 fish per concentration) were isolated from neighboring tanks by opaque walls.
They were placed on top of an infrared apparatus (IR floor 1 × 1 m, Noldus, The Netherlands).
During the day, the room was lit with two LED spotlights (LED Technology Master LEDSPOT
16W 2700K, illumination of 30 lux near the tanks). During the night or dark period, the spotlights
were turned off and infrared light from the floor was used to record fish movements (illumination
<1 lux near the tanks). Fish were placed in the tanks at 17:00 on the day before the experiment, to
allow them to acclimate overnight. Video recordings began the next day at 12:30 and lasted 24 h.
We tested 12 fish for each concentration. We ran four sessions for each fraction (PY, HO and LO)
and the water was changed after each session.
195
Photomotor response in juveniles and adults
We used the same setup to monitor photomotor responses, as an indicator of complex
phenotypes of stress and anxiety (Vignet et al., 2013). We recorded swimming activity for 1 h
(Light on-1) and then challenged the fish by subjecting them to a sudden dark period (15-min,
Light off), continuing the video recordings for an additional 1.5 h (Light on-2). The photomotor
response was monitored after one night of acclimation, beginning at 12:30 for two-month-old fish
or at the end of the 24-h recording for six-month-old fish. For both tests, the dependent variables
measured were swimming path length (distance traveled; cm) and time spent immobile (time; s).
We tested 12 fish for each concentration. We ran four sessions for each fraction (PY, HO and LO)
and the water was changed after each session.
Exploration of a new environment— maze challenges
In addition to providing information about the ability of fish to explore their environment,
the swimming characteristics recorded during exploration provide information about the ways in
which fish cope with this novel environment. Two experimental setups were used: maze
challenges (a T-maze or a Z-maze) and a novel tank challenge.
The T-maze was used for PY fish (in year one of the project). This maze was adapted
slightly from that described by Ninkovic and Bailly-Cuif (2006) and comprised a shallow area,
with a water depth of 5 cm, consisting of the stem of the T (46 cm long), and its two arms (one
leading to a deep area and one in the opposite direction). The total length of the arms was 66 cm.
The deep area was 15 cm deep (water depth of 10 cm), 23 cm wide and 23 cm long, and it
contained marbles and plastic grass, and was therefore considered to be a favorable area (Ninkovic
and Bally-Cuif, 2006). Fish were individually transferred into a 1-liter aquarium at 16:00 on Day 1
and were challenged on Day 2, between 9:00 and 11:00. Fish were placed in the start area of the
maze and their swimming characteristics were recorded for 5 minutes. We tested 12 fish per
concentration and the dependent variables measured were time to the first exit from start area; in
s), the time spent in each area (start, shallow, deep; in s), individual success or failure to reach the
deep area and time to first entry into the deep area (s).
For the HO and LO mixtures, in year two of the project, a Z-maze (70 x 45 x 15 cm)
adapted from that described by Chapman et al. (2010) was preferred over the T maze. We decided
to use the Z-maze for these experiments because it is more suitable than the T-maze for the
196
evaluation of exploration (Chapman et al., 2010), the T-maze being more appropriate for
assessments of learning, which was not the main focus of this experiment. The Z-maze consisted
of a refuge zone and four arms (see figure 1 in Chapman et al. 2010). Each arm was divided
virtually into four quarters of equal size, referred to as quadrants. The maze thus consisted of 16
quadrants. Fish were individually placed in a 1-liter aquarium at 16:00 on Day 1 and challenged
on Day 2, between 9:00 and 11:00. Fish were introduced into the refuge zone (equivalent to 3
quadrants, covered with a black slab and ending in a sliding door). The start area thus consisted of
these three covered quadrants and the adjacent one. The next two arms formed the close area
(close to the refuge zone) and the last two arms formed the distant area. The fish were left for two
minutes in the refuge zone and the door was then opened. Fish activity was recorded in the five
minutes following the first excursion of the fish from the refuge zone (detection in the first
quadrant of the close area). The variables measured were the time taken to leave the refuge (time
to first exit from the refuge zone; in s), the time spent in each area (start, close, distant; s) during
the trial and individual success or failure to reach quadrant 16 (the farthest from the refuge zone).
We also determined the number of quadrants into which the fish ventured within the maze (16
indicating that the fish reached the end of the maze), as an index of individual tendency to explore
(Chapman et al. 2010). We converted these data into proportions for statistical analysis. We tested
12 fish per fraction and per concentration.
Exploration of a new environment— the novel tank challenge
The novel tank challenge was performed from 14:00 to 16:00 on the same day as the maze
exploration test (which was performed from 9:00-11:00). Between tests, the fish were individually
kept in the 1-liter aquarium in the same room. The fish were tested in the same chronological
order in both tests. Fish were transferred to a novel tank (trapezoid 1.5-liter tank; Aquatic
Habitats, Apopka, FL; size in cm: height 15.2 × width 7.1 x length 27.9 at the top and 22.5 at
bottom) and filmed for six minutes from the side. We tested 12 fish per fraction and concentration.
For space occupancy analysis, tanks were separated into two areas as previously described (Egan
et al., 2009): a “top” area corresponding to one half of the volume and a “bottom” area
corresponding to the other half. The dependent variables measured were time spent in each area
(top, bottom; in s) per minute, total distance traveled (cm) and time spent immobile (s).
197
For swimming activity, maze exploration and novel tank experiments, videos were
recorded with an analog ICD-48E camera (Ikegami) and a 2.7–13.5 mm lens (Fujinon), linked to a
PC with an acquisition card and Ethovision XT software (Noldus, The Netherlands). In all
experiments, EthoVision XT software was used for track extraction and analysis. Data were
acquired by EthoVisionXT at a rate of 25 frames per second, and variables were nested for further
analysis, every 30 minutes for the 24-h swimming tests on six-month-old fish and every minute
during the photomotor response test (distance traveled in cm and time spent immobile; in s). In
photomotor response tests, the distance traveled was also summed over 15-minute periods (Light
on-1, Light-off, Light on-2). Nesting was carried out every five minutes (duration of the test) in
maze experiments and every one or six minutes in novel tank experiments (distance traveled in
cm, time spent in top area in s, and time spent immobile in s). For assessments of the time spent
immobile, we used the mobility detection function of EthoVision XT, which has a lower threshold
for separating immobility from mobility, and an upper threshold for separating mobility from
highly mobile. The lower threshold was set at 20% for assessments of immobility, indicating that
a change of no more than 20% in the pixels of a detected object between two consecutive samples
would be considered to indicate immobility (see EthoVision XT Reference Manual).
Statistical analyses were carried out with Statistica 9.0 (Statsoft, Tulsa, OK, USA)
software. Generalized linear models (GLM) were applied in each case, for statistical assessment of
the effect of PAH concentration on measurements of locomotor activity, photomotor response, the
tendency to explore and the anxiety level. For each fraction (PY, HO or LO), we tested
concentration (control, 0.3X, 1X and 3X) and period (day vs. night in 24-h locomotion; Light on1, Light-off, Light on-2 during the photomotor response test; min-1 to 6 in the novel tank test) or
area (start, shallow and deep in the T-maze; start, close or distant in Z-maze; top in the novel tank
test) as fixed factors. Fish and session were treated as random factors in this repeated measures
analysis, to overcome the problem of pseudoreplication. Sex was also treated as a fixed factor in
analyses of six-month-old fish. Body mass was tested as a covariable, but was never found to have
a significant effect. We also analyzed the interaction between concentration and period.
Throughout the results section, we report only significant fixed factor or interaction effects.
Individual successes or failures to reach the deep area (T-maze) or quadrant 16 (Z-maze) were
compared between concentrations in chi2 tests followed by two-tailed paired Fisher’s exact tests
198
(Control vs. each concentration). The proportion of the maze explored was subjected to arcsine
transformation before GLM analysis. All statistical tests were carried out at the 5% significance
level. Newman-Keuls post hoc tests were carried out in each case. The results are reported in the
text and figures as means ± SEM.
Results
This work is part of a larger program including analyses of the changes in several
physiological variables following exposure to the diets described here. Chemical analyses of the
fractions, diets and metabolites are presented elsewhere (Vignet et al., 2014b). Briefly, the PY
fraction contained a high proportion of heavy PAHs and almost no methylated derivatives. The
HO fraction contained moderate levels of heavy PAHs and methylated derivatives. The LO
fraction contained low levels of heavy PAHs and a high level of alkylated derivatives. The
concentrations of the 16 US-EPA PAHs in 1X diets were PY-1X: 4505 ± 1527, LO-1X:
2739 ± 231 and HO-1X: 1887 ± 130 ng.g-1dw. The total concentration of PAHs (including
methylated derivatives) measured in the 1X diets were: 5816 ± 1433, 4663 ± 360 and 6726 ± 278
ng.g-1dw for PY, HO and LO, respectively. The quantification of hydroxylated metabolites in
15 dpf larvae confirmed that the fish had effectively been exposed, and the results obtained were
consistent with diet composition (Vignet et al., 2014b).
24-h locomotion in adults
In six-month-old adults, we assessed 24-h locomotion and compared the distance traveled
between the day and night periods (Figure 1 a-c). No differences were observed between the day
and night periods for PY and LO, whereas fish exposed to HO displayed significantly higher
levels of activity during the day than during the night (F=10.23, p<0.001). Concentration and sex
had no significant effect and there was no significant interaction between fixed factors. During
both day and night periods, the fish remained immobile for about 50-60% of the total time (Figure
1 d-f).
199
Figure 1 : Swimming activity of 6-month-old fish as a function of photoperiod, for each
fraction: PY, HO and LO. (a, b, c) Mean distance traveled (cm/30 min) averaged per period (day
vs. night). (d, e, f) Mean time spent immobile (s/30 min) averaged per period (day vs. night).
Values are means ± SEM; n=12 fish per fraction and concentration; * indicates a significant
difference at p< 0.05.
For fish on PY diets, the time spent immobile was greater during the day than during the
night (F=44.84; p<0.001), but neither concentration nor sex had any significant effect on this
variable and no significant interactions were detected. A similar pattern, with longer periods of
immobility during the day than during the night, was observed for fish on HO diets (F=46.43;
200
p<0.001) but, in this case, a difference was also observed between concentrations (F=13.24;
p<0.001) and there was a significant interaction between period and concentration (F=3.09;
p<0.01). Indeed, fish on HO diets spent less time immobile during the day than control fish, for
HO-1X and HO-3X (p<0.05 and p<0.001 respectively), whereas fish on the HO-3X diet spent less
time immobile than the control fish during the night (p<0.001). Sex had no effect. Fish on LO
diets were less immobile during the day than control fish (F=119.63; p<0.001) and significant
differences were observed between concentrations (F=5.25; p<0.01), but there was no interaction
and no effect of sex. In this case, all fish fed LO diets spent a significantly shorter time immobile
during the day than the control fish.
Photomotor response in juveniles and adults
GLM analyses revealed significant differences in the photomotor response between
periods, for two-month-old PY fish (F=16.95; p<0.001; Figure 2 a) with higher levels of activity
during and after the dark challenge. There was a trend for PY-3X juveniles to display a smaller
increase in activity during the dark period, but there was no significant difference between
concentrations, whatever the period (Figure 2 a, focus graph). In six-month-old fish, similar
significant differences between periods (F=42.33; p<0.001) were observed, but with no effect of
concentration or sex (data not shown).
Two-month old fish spent more time immobile before the challenge than after the
challenge (Figure 2b; period effect F=64.63, p<0.001). A concentration effect (F=3.36, p<0.05)
was observed (PY-1X fish spent more time immobile during Light on-1, p<0.05) but no
significant interaction was detected. For six-month-old fish, we observed only a similar period
effect (F=214.82, p<0.001, data not shown).
In two-month-old fish exposed to the HO fraction, there were significant differences
between periods (F=7.26; p<0.001; Figure 2c), with greater locomotion during and after the
challenge, but no significant concentration effect or interaction was detected. Similar results were
obtained for six-month-old fish (data not shown), with significant differences between periods
(F=55.94;p<0.001) and between concentrations (F=3.73; p<0.05), and there was a significant
interaction between period and concentration (F=2.23; p<0.05), with H0-3X fish displaying lower
levels of locomotor activity during the dark period (p<0.001) and the following Light on-2 period
(p<0.05).
201
Figure 2 : Photomotor response of 2-month-old fish, for each fraction: PY, HO and LO. (a,
c, e) Distance traveled (cm/min) over one hour, before a 15-min lights-off period (gray
shadowing) followed by an additional 1.5 h of monitoring. The superimposed view shows the
distance traveled summed per 15-minute period before, during and after the lights-off period. (b,
d, f) Time spent immobile (s/15 min) per 15-minute period before, during and after the lights-off
period. Values are means ± SEM; n=12 fish per fraction and concentration; * indicates a
significant difference at p< 0.05.
A period effect on the time spent immobile was observed in two-month-old fish (Figure
2d; F=6.40, p<0.01), with a small decrease during and after the challenge. There was no
concentration effect but a significant interaction between period and concentration was detected
(F=3.14, p<0.001): HO-3X fish spent more time immobile during the period in which the light
was switched off (p<0.05). For six-month-old fish, a period effect was observed, with the same
pattern as for two-month-old fish (F=104.04, p<0.001, data not shown), together with a
concentration effect (F=7.36, p<0.001) and a significant interaction (p<0.001): HO-3X fish spent
less time immobile than control fish during the Light on-1 and Light on-2 periods (p<0.01). A sex
202
effect (F=6.85, p<0.01) was also detected, with males spending less time immobile
(262.51 ± 28.88 s) than females (322.44 ± 35.19 s). No other significant interaction was detected.
The locomotor activity of two-month-old LO-3X fish was lower than that of fish fed other
concentrations of LO (concentration effect, F=12.68; p<0.001) throughout the photomotor
response challenge, with no difference in the distance traveled whatever the light period for LO3X (Figure 2e). A period effect was seen for other fish (F=3.42; p<0.05), but there was no
significant interaction. Similar responses were observed for six-month-old LO-3X fish, with lower
levels of activity (data not shown) and a significant difference between periods (F=31.54;
p<0.001), together with a sex effect (F=6.19, p<0.05): female fish were less active
(1611 ± 98.58 cm / 15 min) than male fish (1843 ± 106.95 cm / 15 min) with no other significant
interactions detected.
Two-month-old fish (Figure 2f) spent more time immobile before the challenge (period
effect F=18.10, p<0.001) but there was no concentration effect and no significant interaction. Sixmonth-old fish also spent more time immobile before the challenge (period effect F=67.85,
p<0.001, data not shown) and there was a concentration effect for fish of this age (F=4.70,
p<0.01): LO-1X and LO-3X fish spent less time immobile during Light on-2 (p<0.001 and p<0.05
respectively), but no significant interaction was detected. A sex effect was found (F=15.54,
p<0.001) with males spending less time immobile (217.51 ± 23.85 s) than females
(276.21 ± 26.09 s). No other significant interactions were observed.
Exploration of a novel environment
We investigated the exploration of the T-maze (PY diets) and the Z-maze (HO and LO
diets) in two- and six-month-old fish (data not shown for the six-month-old fish).
For all three diets, there was a trend towards a dose-dependent increase in the time taken to
leave the start area, but a significant difference between concentrations was observed only for fish
fed HO diets (F=5.27; p<0.01) with fish on the HO-3X diet taking almost twice as long to exit the
start area for the first time as the other fish fed HO (p<0.01;Figure 3). A significant sex effect was
observed for LO fish (F=7.73, p<0.01), with males leaving the start area earlier (36.12 ± 38.34 s)
than females (58.42 ± 40.23 s). No other significant interactions were measured.
203
Figure 3 : Maze exploration by 2-month-old fish for each fraction: PY, HO and LO. (a) Time
(s) to first exit from the start area in the T-maze (PY fraction). (b, c) Time (s) to first exit from the
start area in the Z-maze (HO and LO fractions, respectively). Values are means ± SEM; n=12 fish
per fraction and concentration; different letters indicate significant differences at p< 0.05.
In the T-maze challenge, whatever the concentration, two-month-old fish spent more time
in the shallow area than in the other two areas (F=21.36; p<0.001; Figure 4 a). No other
interactions were measured. Similar results were obtained for six-month-old fish (F=10.20,
p<0.001; data not shown).
For fish on the HO diet, differences were observed in the time spent in the various areas
(F=14.70; p<0.001; Figure 4 b) and there was a significant interaction between area and
concentration (F=2.83; p=0.013): a dose-dependent decrease in the time spent in the distant area
was observed, with HO-3X fish spending only a quarter the time spent by control fish in this area
(p<0.05). A significant difference in the time spent in the various areas was observed in six-month
old fish (F=8.13; p<0.001; HO-3X fish not tested) and post hoc tests revealed that this difference
204
was due to less time being spent in the start area. There was no effect of sex and no other
interaction.
Two-month-old fish on LO diets spent more time in the close area than control fish
(F=10.65; p<0.001; Figure 4 c) but no difference between concentrations and no interactions were
observed. No differences were observed with six-month-old adults.
Figure 4 : Maze exploration by 2-month-old fish for each fraction: PY, HO and LO. (a) Total
time spent (s) in the start, shallow and deep areas of the T-maze (PY fraction). (b, c) Total time
spent (s) in the start, close and distant areas of the Z-maze (HO and LO fractions, respectively).
Values are means ± SEM; n=12 fish per fraction and concentration; different letters indicate
significant differences at p< 0.05.
We evaluated the exploratory tendencies of the tested fish further, by analyzing individual
success or failure to reach the deep zone (T-maze) or quadrant 16 (the farthest away from the start
area in the Z-maze; Figure 5 a). For two-month-old fish on PY diets, success in reaching the deep
zone depended on concentration (chi2=8.0, p<0.05), with 0.3X and 3X diets giving similar results
205
to those obtained for control fish and lower scores obtained for the 1X diet (only half the fish
reached the deep area). The success of HO fish in reaching the farthest area of the maze also
depended on concentration (chi2=16.6, p<0.001): higher success rates were obtained for control
and 0.3X fish than for 1X and 3X fish. Success rates were similar for all fish fed LO diets (6 to 9),
regardless of concentration.
Figure 5 : Maze exploration by 2-month-old fish for each fraction: PY, HO and LO.(a)
Proportion of individuals successfully reaching the deep zone of the T-maze or the farthest
quadrant (16) of the Z maze. (b) Time (s) to first entry into the deep area of the T-maze (PY) or
the farthest quadrant of the Z-maze (HO, LO). (c) Proportion of Z-maze explored in HO and LO
fish. Values are means ± SEM; the numbers of fish reaching the deep area or quadrant 16 per
fraction and concentration are indicated on the bars; different letters indicate significant
differences at p< 0.05.
For each fraction, we focused our analyses on fish reaching the deep zone or quadrant 16.
Whatever the fraction, the time taken by two-month-old fish to reach the deep zone or quadrant 16
was not affected by the exposure, although fish fed PY or HO fish tended to take longer to reach
these zones than control fish (Figure 5 b). In six-month-old fish, a significant concentration effect
206
was shown only for HO (F=3.75, p<0.05): control fish took significantly less time to reach
quadrant 16 than fish fed the 0.3X and 1X diets. A sex effect was observed for LO fish (F=10.95,
p<0.01), with males taking half the time to reach quadrant 16 (77.46 ± 14.60 s) than females
(150.55 ± 17.71 s). No other interactions were observed.
For the Z-maze, the tendency to explore, analyzed by determining the most distant
quadrant reached, decreased significantly with increasing dose in HO fish (F=4.50; p<0.01, Figure
5 c), with HO-1X fish reaching a significantly lower-numbered quadrant than 0.3X fish (p<0.05),
with a further halving of the quadrant number reached for HO-3X fish (p<0.001). A similar
tendency for a decrease in exploratory tendency with increasing dose was observed in six-monthold fish (F=5.17; p<0.05; data not shown). No significant effect was detected for LO fish.
Novel tank test
In all cases, regardless of the fraction and concentration considered, the proportion of time
spent in the top area increased with time during the six-minute challenge (p<0.001; Fig. 6). In
two-month-old fish fed PY, the time spent in the top area increased significantly over time
(F=19.49, p<0.001) and concentration effects were observed (F=5.15; p<0.001; Figure 6 a), with
PY-3X fish spending less time in the top area than control fish (p<0.05), but no interactions were
observed. The distance traveled and the time spent immobile were similar for all concentrations
(Figure 6 b-c). In six-month-old fish, the same increase in the time spent in the top area over time
was observed (F=19.50; p<0.001), together with similar differences between concentrations
(F=3.14; p<0.05), with six-month-old PY-1X fish spending less time than control fish in the top
area (p<0.05). No sex effects or other interactions were detected.
In two-month-old HO fish, significant differences over time (F=10.21; p<0.001) and
between concentrations (F=21.93, p<0.001) were observed during the six-minute challenge, with
HO-1X and HO-3X fish spending less time in the top area than control fish (p<0.001, for both
concentrations). For six-month-old HO fish, only time was a significant factor (F=3.90; p<0.01),
with fish showing the same pattern as two-month-old fish. The distance traveled was also
significantly lower for two-month-old HO-3X fish than for fish on other HO diets (F=7.41;
p<0.001), and these fish tended to spend longer periods of time immobile (p=0.078). In tests on
six-month-old fish, significant differences were observed only for the time spent in the top area at
207
different times (F=3.90; p<0.01), with fish displaying the same pattern as two-month-old fish. No
effect of sex and no interactions were detected.
Figure 6 : Novel tank challenge in 2-month-old fish for each fraction: PY, HO and LO. (a, d,
g) Mean time spent (s) per minute (Min-1 to Min-6) in the top area of the novel tank. (b, e, h)
Total distance traveled (cm) over the 6-minute challenge. (c, f, i) Total time spent immobile (s)
over the 6-minute challenge. Values are means ± SEM; n=12 fish per fraction and concentration;
different letters and * indicate significant differences at p< 0.05.
In two-month-old LO fish, we observed an effect of time (F=7.44, p<0.001) and of
concentration (F=2.88; p<0.05), with LO-3X fish spending less time in the top area than control
fish. LO-3X also traveled shorter distances than control fish (F=4.44, p<0.01; post-hoc p<0.01)
and there was no significant difference in time spent immobile between concentrations. In sixmonth-old fish, we detected effects of time (F=12.32, p<0.001) and concentration on the time
spent in the top area (F=2.64; p<0.05): contaminated fish spent less time in the top area than
control fish. There was also a sex effect (F=6.35, p<0.05), with males spending more time in the
top area (22.71 ± 17.64 s) than females (18.79 ± 16.15 s). No other significant interactions were
detected.
208
Discussion
In this study, we exposed fish to three PAH mixtures through diet, beginning at the first
meal (5 dpf), and continuously thereafter (Vignet et al., 2014b). This exposure route was chosen
because it is a major contamination pathway for fish in natural conditions (Johnson et al., 2007;
Varanasi et al., 1993; Yanagida et al., 2012). The three mixtures used were extracted aromatic
fractions with different compositions, representatives of different mixtures encountered in the
environment. PY was characterized by a high proportion of heavy PAHs and a very low
proportion of alkylated PAHs. LO contained a high proportion of alkylated PAHs and a low
proportion of heavy PAHs, whereas HO had intermediate proportions of both groups of PAHs.
The total concentration of PAHs was in the 4.6-6.7 µg.g-1 dw range for the intermediate 1X
concentration. This concentration was close to the targeted concentration of 5 µg.g-1 dw, reported
in copepods and bivalves in chronically contaminated areas (Cailleaud et al., 2007; Jeanneret et
al., 2002; Le Goff et al., 2006; Payne et al., 2008), but lower than concentrations occasionally
found after accidental pollution incidents, such as the 14.4 µg.g-1 measured in mussels after the
Exxon Valdez oil spill (Payne et al., 2008). The levels of exposure used in this study were,
therefore, representative of different situations occurring in the environment. Heavy metals and
other organic pollutants (e.g. PCBs) have been shown to modify behavior. Aromatic fractions
were prepared with methods excluding the copurification of heavy metals. PCBs are copurified
with PAHs, but there are no PCBs in petrogenic fractions. For the PY fraction extracted from
Oissel sediment, previous reports have indicated the presence of PCBs at very low concentrations
(∑PCBs = 70 ng.g-1and dioxin-like congener CB118 = 8.4 ng.g-1 (Cachot et al., 2006)). We
therefore conclude that the behavioral defects reported here are essentially due to the PAHs
present in the different fractions.
Our results for the set of variables studied here indicate that all three fractions caused
behavioral disruptions. The pattern of disruption was similar, but there were clear differences
between fractions in terms of the severity of the disruptions observed. The HO fraction was the
most deleterious, followed by the LO and PY fractions. These results suggest that alkylated PAHs
play an important role in triggering behavioral disruption, as the LO fraction (mostly alkylated
PAHs) was more toxic than the PY fraction (heavy PAHs). The higher toxicity of the HO fraction
than of the other two fractions suggests a possible additive effect of heavy and alkylated PAHs.
Major advances have been made in the identification and characterization of behavioral
disruptions in zebrafish larva, juveniles and adults, in terms of basic traits, such as stress or
209
anxiety levels, and more complex traits, such as social interactions and learning abilities (Arthur
and Levin, 2001; Bailey et al., 2013; Cachat et al., 2010a; Champagne et al., 2010; Egan et al.,
2009; Norton and Bally-Cuif, 2010; Steenbergen et al., 2011; Stewart et al., 2012). Tests and
variables for evaluating the disruption of these traits have also been defined. These tests have also
been used to evaluate the effects of exposure to environmental pollutants on fish behavioral
responses per se or as an integrated indicator of physiopathological disruptions (Baraban et al.,
2005; He et al., 2011; Kusch et al., 2008; Levin et al., 2003; Levin et al., 2011; Nakayama et al.,
2005; Pean et al., 2013; Saili et al., 2012; Schmidt et al., 2005; Timme-Laragy et al., 2006).
There have been few studies of the consequences of PAH exposure for fish behavior. Most
of the studies published to date were performed after brief waterborne exposure to a single PAH or
a simple mixture of individual PAHs. In these studies, the variables monitored were swimming
ability (Almeida et al., 2012; Gravato and Guilhermino, 2009; Oliveira et al., 2012) or behavioral
traits evaluated in groups (Correia et al., 2007; Goncalves et al., 2008). Exposure to single
compounds has been shown to lead to a decrease in swimming ability, evaluated in a device
similar to a swim-tunnel, and the variables considered in these studies were resistance to a counter
current flow and/or swimming velocity (Almeida et al., 2012; Gravato and Guilhermino, 2009;
Oliveira et al., 2012). These effects are of the utmost importance in an ecological context, because
the disruption of swimming ability may greatly impair the ability of the fish to find and capture
preys or to avoid predators. However, these effects may have a number of causes not related to
behavior per se; such as an impaired energy budget or respiration. In the studies focusing on
behavioral traits, both swimming ability and social interactions were monitored (Correia et al.,
2007; Goncalves et al., 2008). In these cases, monitoring was performed on groups of fish and the
authors concluded that locomotor activity decreased after exposure to fluorene, pyrene or
phenanthrene, or to a mixture of these three PAHs and that social interactions decreased after
exposure to phenanthrene (Correia et al., 2007; Goncalves et al., 2008). In these group studies, it is
difficult to identify the behavioral disruptions affecting individual fish, due to potential
interactions between fish reflecting group structure or hierarchy. Nevertheless, all these articles
concluded that exposure led to a decrease in swimming activity, which was presented as a
lethargy-mediated effect of the tested PAHs.
The protocols used here monitored individual behavior, and were chosen for the evaluation
of several behavioral traits: circadian spontaneous swimming activity, response to a light
challenge, exploration ability and behavioral response to a novel environment. The tests used and
210
the variables extracted could also be used for the evaluation of integrative traits, such as anxiety
level. Hence, our results can be analyzed in terms of two groups of broad effects. Firstly, control
fish spent more than half the time [57-72%] immobile, during both the day and night periods,
whereas the proportion of time spent immobile was significantly lower for HO-3X fish (~20% of
the time, during both periods) and for HO-1X and LO-0.3X, LO-1X and LO-3X fish during the
day period (< 40% of the time). Thus, the contaminated fish had shorter resting times and
therefore, probably, a greater demand for energy. They also traveled a similar distance to control
fish, suggesting a more continuous low swimming speed. Alternatively, these fish may have been
displaying bouts of high activity due to "erratic" movements, indicative of anxiety (Cachat et al.,
2010b; Egan et al., 2009).
This second interpretation would be consistent with the second group of effects observed.
Behavioral responses in mazes or the novel tank were characterized by a delay in exit from the
refuge zone, lower levels of exploration (in mazes; HO-1X and HO-3X) and less time spent in the
top area (in the novel tank; PY-3X, HO-1X, HO-3X and LO-3X). All these findings indicate an
increase in anxiety (Cachat et al., 2010b; Egan et al., 2009; Stewart et al., 2010; Stewart et al.,
2011). High cortisol concentrations are often considered an indicator of anxiety/stress (Alsop and
Vijayan, 2008; Cachat et al., 2010b). An increase in cortisol concentration has been observed in
trout after exposure to BaP and a prototypic AhR agonist, β-naphthoflavone (Gesto et al., 2008;
Tintos et al., 2008), and in three-spined stickleback after exposure to produced water (Knag and
Taugbol, 2013). These findings are consistent with exposure to PAHs triggering anxiety. Further
studies, with the inclusion of anxiolytic and anxiogenic drugs with the different fractions and
concentrations, together with cortisol determinations in the water, would be useful for testing this
hypothesis (Felix et al., 2013).
In addition to these principal findings, we also found that some responses were weaker in
adult fish than in juveniles, suggesting that the sensitivity of these tests is greater in juveniles,
which should be preferred for such studies. Sex effects were also occasionally observed;
suggesting that the sex of the fish tested should also be taken into account whenever possible.
A strong induction of tumorigenesis has been reported in fish exposed to all three fractions
tested here (Larcher et al., In revision), and some of the behavioral disruptions identified here
could be a consequence of this. However, no tumors were found in the nervous system of the fish,
ruling out a direct effect of tumors on behavior. It remains possible that a global failure of
211
metabolism due to tumor development hinders the expression of some types of behavior.
However, respiratory metabolism was evaluated for both PY- and HO-exposed fish and no effect
of exposure was detected (Julie Lucas, personal communication). This suggests that no such
mechanism is involved in the onset of behavioral disruptions described here.
In the framework of this project, we obtained several lines of evidence for endocrine
disruption, such as a shift in the timing of hormone expression or spawning disruption
(unpublished results). Steroid hormones regulate reproductive and non-reproductive behavior and,
as a consequence, endocrine disruption modifies individual or social behavior in fish (Belanger et
al., 2010; Filby et al., 2012; Oliveira et al., 2009; Saaristo et al., 2010; Salierno and Kane, 2009;
Soffker et al., 2012; Stacey, 2003) and other species (Ottinger et al., 2013; Panzica et al., 2007). It
is therefore tempting to suggest that the endocrine disruption activity of the fractions tested
contributed to the behavioral modifications described here.
However, the mechanisms underlying these behavioral disruptions remain largely
unknown. Monoamines, including serotonin and dopamine, are involved in the control of a wide
number of biological processes (see reviews (Hoglund et al., 2005; Overli et al., 2005)). BaP and
β-naphthoflavone disrupt dopaminergic and serotonergic systems in the brain of rainbow trout, as
revealed by an increase in the turnover of these neurotransmitters (Gesto et al., 2008; Gesto et al.,
2009). In addition, as experimental exposure began early in this study (5 dpf), at a time at which
neurogenesis was still underway and the nervous system was maturing (Kastenhuber et al., 2010;
McGraw et al., 2012; Souza and Tropepe, 2011), the phenotypes observed may reflect this early
disruption. Similar effects have been demonstrated following the embryonic disruption of
monoamine systems (Dennis et al., 2013; Shabanov et al., 2005; Silva et al., 2013) or early
exposure to silver or cadmium (Kusch et al., 2008; Powers et al., 2011). Such a delayed effect has
also been demonstrated in zebrafish, following the exposure of embryos or larvae to PAH
mixtures (Vignet et al., 2014a), in rat, after perinatal exposure (Crépeaux et al., 2012) and after the
exposure of Pacific herring embryos to weathered crude oil(Carls et al., 1999).
These results establish parallels between the effects of chronic exposure in fish and the
neurobehavioral disruptions observed in humans and rodents after exposure to PAHs (Bouayed et
al., 2009; Crépeaux et al., 2012, 2013; Edwards et al., 2010; Jedrychowski et al., 2003; Perera et
al., 2012; Saunders et al., 2001, 2003; Tang et al., 2008; Xia et al., 2011). In addition to
confirming findings for humans, studies of this kind provide an opportunity to decipher the
212
underlying mechanisms. Finally, this study provides support for the use of behavioral endpoints in
the framework of environmental quality assessment.
In conclusion, behavioral disruptions have been observed in zebrafish, after chronic, longterm dietary exposure to PAHs. These disruptions, indicative of an increase of anxiety, may have
detrimental consequences in terms of the performance of the exposed fish, their ability to survive
and to explore their environment and, hence, their ability to contribute to next generation.
Furthermore, the severity of the disruption depended on the mixture used, with the HO and LO
fractions having a more severe effect than PY. More behavioral analyses, associated with
molecular research, are required to identify the mechanisms underlying the observed disruption
and the particular toxicity of alkylated PAHs.
Acknowledgements
We thank Manon Goubeau for helping to carry out the experiments. This study received
funding from the ANR project ConPhyPoP (CES 09_002) and CPER A2E. This second project is
jointly funded by the European Union and the European Fund for Regional Development. A PhD
grant was provided by the Région Poitou-Charentes and l’Institut Français de Recherche pour
l’Exploitation de la Mer (C.V.). This work was part of the LABEX COTE cluster of excellence
"Continental to coastal ecosystems".
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219
Résultats supplémentaires
En parallèle de ces tests comportementaux réalisés sur les 3 fractions, nous avons pu,
seulement pour la fraction PY, réaliser un test d'apprentissage mis au point dans le cadre des
comparaisons de lignées (Vignet et al., 2013). Le protocole de conditionnement a été cependant
légèrement modifié. Les poissons ont été conditionnés deux semaines entières avec une
distribution par jour à la lumière verte et non trois fois par jour comme exposées dans ma
publication précédente. A la fin de ces deux semaines, 15 poissons par condition ont été testés.
Deux tests ont été réalisés, comme dans Vignet et al. (Vignet et al., 2013 307). Dans le test 1,
aucune différence statistique n’a été trouvée entre les poissons conditionnés et les poissons non
conditionnés, ni entre les contrôles et les 3X (Figure 53a).
Conditioned fish
Green
a
15
10
5
0
Control
3X
Time spend in each area during stimuli
Time spend in green area during stimuli
Uncondistioned fish
Blue
No stimulus
b
15
10
5
0
Control
3X
Figure 53 : Résultats du test d’apprentissage.
a) Test numéro 1 entre les poissons conditionnés et les non conditionnés. n=15 poissons par
conditions, moyenne+SEM. b) Test numéro 2 avec uniquement les poissons conditionnés soumis à
un test de discrimination des couleurs. n=15 poissons par traitements, moyenne+SEM.
Majuscules: comparaison entre le contrôle et 3X pour chaque couleur. Minuscules : comparaison
au sein d'une condition pour les 3 couleurs.
Dans le deuxième test, le GLM révèle une différence de temps passé devant chaque
couleur (F=5,40 ; p=0,006). Le post test de Newman Keuls nous indique que les poissons passent
significativement plus de temps devant la lumière verte que devant la lumière bleue. En revanche,
les poissons passent autant de temps devant la lumière verte que devant la zone sans stimulus.
Néanmoins, aucune différence entre les conditions n’a été trouvée. Ces absences de réponses
peuvent être liées au choix de la lignée. En effet, ce résultat est conforme à ce que nous avons
220
montré pour la lignée TU dans Vignet et al. (Vignet et al., 2013). Il n'est donc pas possible
d’évaluer l’impact de la contamination PY sur la capacité d'apprentissage.
221
IV Effets des HAP sur la reproduction (article 5)
Le troisième grand volet de ce travail de thèse porte sur la reproduction qui a été étudiée à
différents niveaux : le niveau fonctionnel dans un premier temps, puis le niveau individuel et enfin
le niveau moléculaire. Le suivi a été fait sur des poissons contaminés de manière chronique avec 3
fractions de HAP (PY, HO et LO).
Au niveau fonctionnel, le suivi de reproduction a commencé aux alentours de 3 mpf et s'est
poursuivi longuement. Tout d'abord, les poissons ont été sollicités dans leurs aquariums où les
œufs étaient récupérés régulièrement. Le nombre total d'œufs et le nombre d'œufs fécondés étaient
comptabilisé à chaque fois et étaient normalisés par rapport au nombre de femelles présentes dans
le bac. Les femelles contrôles pondent plus d'œufs par ponte que les femelles les plus contaminées
pour les 3 fractions. Dans le même temps, nous avons pu observer une réduction de la proportion
de sollicitations fructueuses avec un effet-dose allant jusqu’à une quasi-absence (PY) ou absence
totale (HO et LO) de ponte pour la concentration 3X pour les pontes en bac. Par la suite, ces
mêmes poissons, excepté les LO, ont été sollicités en couple. Nous avons observé les mêmes
effets qu'en bac.
Au niveau individuel, des coupes histologiques ont été réalisées sur des poissons de 7 mpf
pour les poissons HO, et de 9 mpf pour les poissons PY et LO. Les mâles et les femelles ont été
inclus dans la paraffine, puis des coupes standardisées ont été réalisées et analysées à l'ONIRIS à
Nantes. Pour chaque poisson, 3 coupes différentes ont été prises en compte pour avoir une
évaluation globale de l'état du poisson. Des cas d'hypoplasies testiculaires ont été observés chez
les mâles HO-3X (42.9%) et également, quoique avec une incidence plus faible, chez les mâles
HO-1X (6.4%) et LO-3X (7.4%). En revanche, chez les PY, aucune hypoplasie testiculaire n'a été
mise en évidence. Concernant les femelles, un premier travail de comptage des stades folliculaires
(stade I, II, III et IV) a été réalisé sur ces mêmes coupes histologiques. Dans ce cas, deux lames
par poisson ont été analysées. Les femelles PY présentent un nombre similaire de follicule de
stade I (environ 30%) et de stade IV (environ 40%). Toutefois, les follicules de stade IV sont
proportionnellement moins représentés chez les PY-3X que chez les poissons contrôles. Dans le
cas des fractions HO et LO, le stade I est le plus représenté chez tous les poissons, et on observe
une réduction importante du nombre de stades III et IV indiquant un blocage de maturation
ovocytaire. En parallèle, l'aspect global des ovaires a été analysé et la surface nécrotique a été
détourée sur chaque ovaire de poisson. Une différence significative au niveau des PY-3X indique
une augmentation de la surface nécrotique chez ces poissons (12% de plus que chez les contrôles).
222
Ces analyses histologiques ont permis d'expliquer l'absence de ponte chez les HO-3X et
chez les LO-3X par un arrêt de la maturation ovocytaire. Chez les PY-3X, l'augmentation
significative de la surface nécrotique chez ces poissons pourrait en partie expliquer la diminution
significative du nombre de pontes observées.
Au niveau moléculaire, nous avons analysé l'expression de gènes dans les gonades et les
niveaux d'hormones circulantes. Sur tous les poissons à 9 mpf (exceptés les HO-3X, qui ont été
stoppés avant et sur lesquels les analyses de gènes n'ont pas été faites), les ovaires et les testicules
ont été prélevés pour réaliser des analyses d'expression de gènes par qPCR. Au niveau des
testicules, 4 gènes ont été testés. Ils sont impliqués dans la stéroïdogénèse (cyp17a1 et hsd11b3) et
dans la spermatogénèse (amh et spag8). Au niveau des gènes impliqués dans la stéroïdogénèse,
hsd11b3 ne présente aucune altération mais cyp17a1 est surexprimé chez les LO-1X alors qu'il est
sous-exprimé chez les PY-0.3X, HO-0.3X et HO-1X. Pour les gènes impliqués dans la
spermatogénèse, amh est surexprimé chez les LO-0.3X et LO-1X alors que spag8 est sousexprimé chez les PY-0.3X et PY-1X.
Au niveau des ovaires, 5 gènes ont été quantifiés. Les premiers (esr1, esr2a et esr2b) sont
des récepteurs aux œstrogènes impliqués dans la régulation de l'axe hypothalamus-hypophysegonade. Le gène esr1 est surexprimé chez les PY-1X ainsi que chez les HO-0.3X. Le gène esr2a
est également surexprimé chez les HO-0.3X et HO-1X. Le dernier gène, esr2b, est sous-exprimé
chez les LO-1X et n'a pas pu être quantifié chez les HO. Ensuite cyp19a1a, qui est sur exprimé
chez les HO-0.3X et cyp1a qui est sur exprimé chez les PY-1X mais sous exprimé chez les LO-3X
ont été analysés. La testostérone, l'œstradiol et la vitellogénine (VTG) ont été dosés dans le sang
chez les poissons à 2 et 3 mpf. Ces mesures n'ont pas révélé de grandes différences, mais plutôt
des tendances chez les poissons contaminés. Ces mesures auraient peut-être dû être réalisées au
même stade que les autres analyses, c'est-à-dire à 9 mpf. Les analyses au niveau moléculaires nous
permettent de mettre en évidence une sous-expression des gènes étudiés chez les mâles PY et HO
et chez les femelles LO, ainsi qu’une surexpression des gènes étudiés chez les mâles LO et chez
les femelles PY et HO. Les mécanismes d'actions moléculaires de ces 3 fractions sur la
reproduction seraient donc différents.
Lors de ces expériences, nous avons suivi la reproduction des plus jeunes stades jusqu'à
l'âge adulte, et nous avons pu observer des effets à tous les niveaux (fonctionnel, individuel et
moléculaire). L'impact de ces fractions sur la reproduction est vrai dans les 3 cas. Bien que nous
ayons observé les mêmes conséquences, en l’occurrence une forte diminution voire une absence
223
de ponte pour les 3 fractions, nous avons pu mettre en évidence des causes et des mécanismes
différents.
Variables mesurées
PY
HO
LO
Pontes
↓
↓↓↓
↓↓
Histologie ovaires
++
++
++
Histologie testicules
-
++
+
Hormones
Vitellogénine
Gènes
Modifications indicatrices d'une perturbation endocrinienne –
mécanismes restant à expliciter
224
Manuscrit en préparation
Reproductive disruption in zebrafish exposed to three PAHs mixtures revealed different
mechanisms
C. Vigneta, T. Larcherb,c, B. Davaild, L. Joassarde, K. Le Menachd, T. Guionnete,
L. Lyphouta,e, M. Ledevinb,c, M. Goubeaua, H. Budzinskid, M-L. Bégoute, X. Cousina,f*
a Ifremer, Ecotoxicology Laboratory, Place Gaby Coll, BP7, 17137 L’Houmeau, France
b INRA UMR703, APEX, Oniris, F-44307 Nantes, France
c LUNAM Université, Oniris, École nationale vétérinaire, agro-alimentaire et de l'alimentation Nantes-Atlantique, F44307 Nantes, France
d University of Bordeaux 1, EPOC, UMR CNRS 5805, 33405 Talence, France
e Ifremer, Fisheries laboratory, Place Gaby Coll, BP7, 17137 L’Houmeau, France
f INRA LPGP, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes, France
Tel +33 5 46 50 06 21 – Fax +33 5 46 50 06 50
225
Introduction
Among xenobiotics, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) form a diverse family of
compounds containing at least two aromatic rings. PAHs are increasingly emitted in the
environment as a consequence of human activities (Shen et al., 2013; Zhang and Tao, 2009).
There are two major types of PAHs, petrogenic and pyrolytic, which enter the environment
through different routes. Petrogenic PAHs are abundant in oils and enter the aquatic environment
due to harbour activity or as a consequence of oil spills. Pyrolytic PAHs result from the
incomplete combustion of organic matter, including fossil fuel; they enter aquatic environments
through the deposition of atmospheric emissions directly on water or on the ground followed by
soil runoff. Because PAHs are hydrophobic molecules, they are found associated with suspended
particulate matter in water, such that they tend to accumulate in sediments; consequently,
sediments constitute major sinks and can also act as secondary sources for aquatic systems
contamination (Hylland, 2006). Monitoring networks have documented PAH concentrations of up
to 50 μg g-1 dry weight (dw) in sediment from various affected aquatic ecosystems although the
concentrations in highly contaminated areas is more commonly in the 10 μg.g-1 range (Baumard et
al., 1998; Benlahcen et al., 1997; Cachot et al., 2006; Johnson et al., 2007; Varanasi et al., 1993;
Yanagida et al., 2012). The concentration of PAH in the biota varies depending on the surrounding
concentration and trophic level: in particular, the biota at low food chain level may be exposed to
high levels of PAHs in sediment or suspended particles. For example, the total concentration of 16
PAHs used as indicators by the US Environmental Protection Agency (US-EPA) in the copepod
Eurytemora affinis in the Seine Estuary can reach 3.9 µg.g-1 (Cailleaud et al., 2007) and in mussels
can be as high as 1.6 µg.g-1 (Le Goff et al., 2006). In the case of acute accidental exposure, the
concentration in mussels can be even higher, for example 3.0 µg.g-1 after the Erika oil spill
(Jeanneret et al., 2002) and above 14 µg.g-1 after Exxon Valdez oil spill (Payne et al., 2008). Fish
can be exposed to PAHs through several routes including the trophic route which has been shown
to be an important route (Johnson et al., 2007; Varanasi et al., 1993; Yanagida et al., 2012).
Reproduction is a key function to any species survival whereas at the same time it is a
target of thousands of xenobiotics. Reproduction disruption may be the results of hormonal
modification in the case of endocrine disruptors compounds or of other pathways (e.g. behavior).
Additional complexity is due to the fact that reproduction is the ultimate step of a long-term
process, from germ-cells migration in embryos to gametes maturation in reproducing adults, and
that all these steps can be disrupted all lifelong and eventually result in reproduction failure.
Complexity is also due to the fact that in the environment, xenobiotics are present as complex
226
mixtures of individual compounds combining pro- and anti-estrogenic properties. PAHs have been
shown to interfere with reproduction in fish and other animals including invertebrates (Horng et
al., 2010; Seruto et al., 2005; Tilghman Hall and Oris, 1991; Tollefsen et al., 2011). From a
mechanistic point of view, many elements remain unclear however, PAHs have been shown to
produce endocrine disruption in fish revealed by disruption of circulating steroid hormones level
in males and females (Arukwe et al., 2008; Evanson and Van Der Kraak, 2001; Monteiro et al.,
2000; Seruto et al., 2005). These results converge to define PAHs as having an anti-estrogenic
activity.
In order to evaluate reprotoxicity of environmental PAHs mixtures, zebrafish were exposed
from the first meal (5 days post fertilization (dpf)) and for the 9 following months, i.e. from larvae
to reproducing adults. Three complex mixtures of PAHs representative of environmental
situations, were used to spike the food: a pyrolitic (PY) fraction from sediment sampled in the
Seine Estuary; and two petrogenic fractions, one from a heavy oil "Erika" (HO) and one from a
light crude oil "Arabian light" (LO). We analyzed consequences of this exposure on reproduction
evaluated at functional, organ and molecular levels.
Material and methods
PAH-contaminated diet preparation
Three aromatic fractions were used for exposures: i) A pyrolytic fraction (PY) extracted
from sediments collected in a polluted site of the Seine Estuary (Oissel, France) and ii) two
petrogenic fractions obtained from Erika fuel (heavy oil; HO) and Arabian Light crude oil (LO).
PAHs extractions were performed as previously described (Cachot et al., 2006). Zebrafish TU
strain (ZFIN ID: 76 ZDB-GENO-990623-3) was used and larvae were exposed from their first
meal (at 5 dpf) onward using spiked food pellets (Vignet et al., In revision). Three concentrations,
0.3X, 1X and 3X were used with the 1X concentration corresponding to the Σ[16 EPA PAH] at
5 μg.g-1 dw food, representative of the concentrations found in mollusks in the Seine Estuary.
Diets are named after the origin of the fraction and its concentration: 1X pyrolytic fraction diet
will be named: PY-1X. For each exposure, a fourth control treatment was included corresponding
to the plain food treated as spiked-food with dichloromethane which was used as carrier solvent
for PAHs spiking.
227
Reproduction monitoring:
Onset of spawning was determined by placing a spawning box (AquaSchwartz, Germany)
in the bottom of each tank from 4 to 6 month post fertilization (mpf) in PY fish, from 4 to 7 mpf in
HO and from 5 to 9 in LO fish. After this first period, reproduction of PY fish from 8 to 10 mpf
and HO (without HO-3X) fish from 8 to 10 mpf was assessed using pairwise mating in a spawning
box (AquaSchwartz, Germany) outside of the tank. Generally, spawning occurs the following
morning progressively after a few minutes of light illumination. One hour later, spawning boxes
were removed from the aquarium and eggs were collected, cleaned, sorted (into fertilized or none
fertilized), and counted.
Histological analysis
Fish were sampled at 9 mpf for all diets except for HO which were sampled at 7 mpf
because of high mortality in HO-3X condition. Control fish were systematically sampled in
parallel. Fish were euthanized with a lethal dose of benzocaine (250 μg.L-1 of a 10% solution in
100% ethanol; Sigma-Aldrich) and fixed in 4% buffered formalin after ventral incision of the
abdomen for larger individuals (Daouk et al., 2011). After 24 h of fixation, fins, most scales and
the caudal peduncle were carefully removed and samples were dehydrated in graded ethanol
solutions and embedded in paraffin. Step sectioning was performed as already published
(Spitsbergen et al., 2000). Serial sagittal step sections were cut from the left side of the fish. Four
step sections from each fish were mounted on glass slides, 1 from eye anterior chamber level, 1
from eye posterior chamber level, 1 just medial to the eye, and 1 at the midline. Sections were
routinely stained with haematoxylin-eosin-saffron (HES). A first histological analysis was
performed on gonads to identify lesions. The second step consisted in follicle staging. All oocytes
present on mid-level section and on sections medial to the eye were counted along with
identification of their morphological stage using middle magnification (Koç et al., 2008).
Individual frequencies of each type of follicles were calculated using ratio of the total ovarian
area.
qPCR analysis
Tissues were sampled on animal euthanized as above and immediately frozen in liquid
nitrogen and stored at -80 °C until used. Total RNAs were extracted using Trizol Reagent
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) following the manufacturer’s instructions. Total RNA
concentration was quantified by spectrophotometry at 260 nm. Furthermore, purity of RNAs was
228
verified by measuring the A260/A230 nm and A260/A280 nm ratios. To remove the possibility of
genomic DNA contamination, RNA sample was digested by RNase-free DNase I (Promega
Madison, USA) and then purified. First-strand cDNA was synthetized from a total of 1 µgRNA
using reaction mix including 500 ng of oligo(dT)15, 250 ng of random hexamerprimers (Promega,
Madison, USA) using M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, USA) following
manufacturer‘s instructions. Reaction was incubated for 1 h at 42 °C and inactivated by heating
for 15 min at 70°C. The cDNA mixture was stored at – 20°C until a real-time PCR analysis. PCR
primers were designed with Primer3 software (Rozen and Skaletsky, http://bioinfo.ut.ee/primer30.4.0/). Real-time PCR reactions were performed using Fast SYBR Green Master Mix 5X
(Applied Biosystems, USA) and in a StepOnePlus instrument (Applied Biosystems, USA)
following the manufacturer’s instructions. Genes expression were quantified from the threshold
cycle (CT) number and normalized to four housekeeping genes (eef1, βactin, g6pd and gapdh).
Gene expressions were analyzed using REST-2009 software (Qiagen, http://www.REST.de.com).
Statistical analyses were performed with Statistica 9.0 (Statsoft, Tulsa, OK, USA)
software. GLM was applied in each case. In all tests, within each fraction (PY, HO or LO),
concentration (Control, 0.3X, 1X and 3X) and follicles stages (I to IV) were tested as fixed factor
and fish as random factor. Interaction between concentrations and stages was also analyzed.
Fertilization rates frequencies was calculated per classes (20% wide) and Chi2 analysis performed
to compare eggs fertilization as well as spawning success, between concentrations using Prism 6.0
(Graphpad).
All statistical analyses were carried out at a 95% level of significance and only the fixed
factor and the interaction between them are presented in the text. Post hoc test were performed
with Newman-Keuls in each case. The results reported in text and all figures are means ± SEM.
Results
This work is part of a larger program that included analysis of modification of several
physiological variables following exposure to the same diets. Chemical analysis of fractions, diets
and metabolites are presented elsewhere (Vignet et al., In revision). Briefly, PY fraction was
characterized by a high proportion of heavy PAHs and almost no methylated derivatives. HO
fraction contained moderate levels of heavy PAHs and methylated derivatives. LO fraction
contained very low level of heavy PAHs and a high level of methylated ones. Total concentration
229
of PAHs (included methylated) was similar in the three 1X diets: 5.8 ± 1.4, 4.7 ± 0.4 and 6.7 ± 0.3
µg.g-1 dw for PY, HO and LO respectively. Quantification of hydroxylated metabolites in dietary
exposed 15 dpf-larvae confirmed an effective exposure of fish and results were consistent with
diet composition (Vignet et al., In revision).
Reproduction monitoring
Several reproductive variables were assessed. In a first step, group spawns were monitored
directly in breeding tanks starting at 4 mpf for PY and HO fish and at 5 mpf for LO fish. Results
are summarized in Table 1. A significant number of spawns were obtained for all conditions but
3X concentration for all three fractions with only one spawn obtained for PY-3X over 87 assays
and none for HO-3X and LO-3X. The success rate of spawning was significantly reduced after
exposure to for all three PAHs fractions (Chi2; P<0.001). In more details, this rate was reduced for
all fractions and all concentrations compared to their respective control (p<0.05) except for HO0.3X (p=0.81).
Table 1 : Summary of mass spawning monitoring
PY
Control 0.3X 1X 3X
HO
LO
Control 0.3X 1X 3X
Control 0.3X 1X 3X
Males
19
31 36 43
46
39 47 ND
31
55 25 27
Females
63
39 44 38
25
30 24 ND
37
29 37 25
Assays
87
87 87 87
37
37 37 19
53
53 53 53
Spawns
60
43 35 1
19
17 0 0
41
29 25 0
Eggs (total)
6880
29214836 48
1065
582 0 0
6254
24981307 0
Eggs (fert.)
5144
19273673 37
476
582 0 0
4894
1656 670 0
Fert.
(%)
74.8
66.0 76.077.1
88.1
81.8 -
78.3
66.3 51.3 -
rate
-
ND: not determined because of the small size of those fish. Spawns row indicates the number of
successful spawns. Numbers in bold indicate success rates significantly different from Control
group (p<0.05).
The cumulative number of eggs spawned was monitored over time (Figure 1 A-C). Spawns were
further qualified by comparing the number of fertilized eggs after normalisation to the number of
successful assays and the number of females in the tank (Figure 1 D-F).
230
Figure 1 : Monitoring of mass-spawning. Cumulated number of fertilized eggs over-time (A-C)
and number of fertilized eggs normalized to the number of spawning events and the number of
females in each tank (D-F) are presented for fish exposed through diet to PY (A, D), HO (B, E)
and LO (C, F). In D-F mean ± SEM. Different letters indicate significant difference (p < 0.05).
The number of fertilized eggs spawned per female and spawning events were significantly
reduced for fish exposed to petrogenic diets for 1X and 3X concentrations. The 0.3X being
intermediate. In the case of PY-3X, only a trend was obtained (p=0.078) using the GLM analysis
despite the fact that only one spawn was obtained with a hundred fold reduction of the number of
fertilized eggs per female per spawn.
Spawns mean fertilization rates ranged from 66.0 to 77.1 % for PY fraction, from 81.8 to
88.1 for HO fraction and from 51.3 to 78.3 for LO fraction with a trend to follow a dose-effect
decrease for this latter fraction . When classified according to their fertilization rates in 20% wide
classes (Figure 2), this trend was confirmed (overall Chi2=18.48; p=0.02). LO-0.3X spawns
tended to have a lower quality compared to Control (Chi2=7.17; p=0.13) while LO-1X spawn
quality was significantly reduced compared to Control (Chi2=14.60; p=0.006). GLM analysis
indicated that these trends and differences were due to the reduction of spawns number in class
80-100% for LO-0.3X and LO-1X (p=0.09 and p=0.05 respectively).
231
Figure 2 : Spawns quality. Mass-spawns obtained from adults exposed to PY(A), HO (B) and
LO (C) diets were classified according to their fertilization rates (see insert in B). In C, different
letters indicate significant difference (p < 0.05).
To increase the probability of getting spawns in the highly contaminated fish and to
further qualify reproduction the same analysis was latter performed on pair-spawning (
Table 2). Unfortunately, for technical reasons, we were unable to perform this analysis for LO
fraction after the same exposure duration as for other fractions. In addition because of low survival
after exposure to HO-3X, fish were sampled at 7 mpf and were not available anymore for this
analysis. Fish were also sampled in other concentration of this fraction at the same time resulting
in an important reduction in fish numbers.
232
Table 2 : Summary of pairwise spawning monitoring
PY
HO
Control
0.3X
1X
3X
Control
0.3X
1X
Males
14
28
29
33
33
24
28
Females
47
51
47
37
5
16
14
Assays
70
138
145
172
41
47
44
Spawns
31
48
48
19
23
29
4
Eggs (total)
3587
7641
1105
632
3388
3278
141
Eggs (fert.)
2252
5238
4211
387
2664
2706
94
Fert. rate (%)
62.8
68.6
61.1
35
78.6
82.5
66.7
Spawns row indicates the number of successful spawns. Numbers in bold indicate success rates
significantly different from Control group (p<0.05).
In the case of PY control couples, successful spawns represented 44% of assays. This rate
was not significantly decrease for PY-0.3X and PY-1X (~34%) but significantly decreased (11%;
Fisher test; p<0.0001) for PY-3X. It is to note however that 19 spawns were obtained for this
concentration. In the case of HO, successful spawns represented 56 and 62% of assays for control
and HO-0.3X. For HO-1X exposed fish, this rate was significantly reduced (9%; Fisher test;
p<0.0001).
Global fertilization rates were similar compared to their respective control for all
concentration with the exception of PY-3X which seem to be reduced. However, classification of
individual spawns according to their fertilization rates revealed differences (not shown ;
Chi2=73.47 ; p<0.0001). Paired tests confirmed the difference between PY-3X and its Control
(Chi2=16.28 ; p<0.005). In the case of HO exposed fish the too small number of spawns prevented
the use of Chi2 test because of too many classes with no observation.
Histological analysis
Histological analyses were performed to assess gonad structure and morphology. These
analyses were performed at 9 mpf for PY and HO exposed fish and at 7 mpf for HO because of
HO-3X low survival.
Ovaries overall structure was affected in most female exposed but these disruptions
differed depending on the fraction (Figure 3).
233
Figure 3 : Ovary morphology. Representative pictures of ovaries sampled from Control
displaying all stages of follicule maturation, PY-3X with two distinct well-delineated areas, HO3X and LO-3X females, both with a large majority of follicles of the first stages of maturation.
The dotted line delimits the caudal area occupied by guosht cells in PY-3X ovary.
.
Ovaries from control females presented an even distribution of follicles at all stages of
maturation. All stages of follicles were also found in ovaries from females exposed to PY-3X diet
in the cranial part of the ovary but large caudal areas displayed abnormal apearance with clear
staining. In these ghost areas, the outline of the cells remained visible, but with no visible nucleus
and only a few cytoplasmic structures. The surface percentage of these degenerating areas increase
with PY concentration (Figure 4; F=4.81; p=0.007). This kind of area was not found in ovaries
from HO-3X and LO-3X females.
234
Figure 4 : Surface of degenerating areas in PY female ovaries. The surface of degenerating
areas is represented as a percentage of total ovarian surface. Percentage of total surface, mean ±
SEM. Different letters indicate significant difference (p < 0.05).
Figure 5 : Follicles distribution according to their stage. Follicles were classified according to
their maturation : pre-vitellogenic stages (F1 and F2), post-vitellogenic stage (F3) and mature
follicles (F4). Percentage of follicles in each class, mean ± SEM. Different letters indicate
significant difference compared to the relative control (p < 0.05).
235
Ovaries from females exposed to petrogenic fractions presented a significantly reduced
number of maturing follicles (Figure 3). To quantify this disruption, follicles were quantified
according to their stage (Figure 5). In PY ovaries at 9 mpf (Figure 5 A), a slight increase in the
proportion of F1 was observed in PY-0.3X ovaries. On the contrary a slight reduction of F4 was
observed for PY-0.3X and PY-3X fish. More important disruptions were observed in HO and LO
females. A significant increase of F1 was observed in HO-3X and LO-3X and to a lesser extent in
LO-0.3X. On the contrary a slight decrease of F1 was observed in HO-0.3X and LO-1X. The
percentage of some intermediate follicles was increased, F2 for HO-0.3X and HO-1X as well as
F3 for LO-1X or decreased F3 for HO-1X. The case of F4 is clearer with a significant decrease of
mature follicles in ovaries from HO-1X, HO-3X and LO-3X.
Testis structure and morphology has also been analysed at the same age. Testicular
hypoplasia (Figure 6 A,B) has been observed in males exposed to HO-1X (n=3; 6.4% of analysed
males), in HO-3X (n=9; 42.9%) as well as in LO-3X (n=2; 7.4%). In addition to these functional
disruptions, some seminoma have been identified in 1X or 3X concentrations in all fractions while
none has been found in control fish. These very invasive tumors were described in more details in
Larcher et al. (Larcher et al., Submitted). Finally, one ovotestis has been identified in HO-3X
treatment (Figure 6 C).
Figure 6 : Testis functional disruptions. Testicular hypoplasia revealed by the low number of
spermatocytes and spermatids observed in HO-3X (A) or their absence with the only presence of
spermatogonia observed in HO-3X (B). Ovotestis observed in HO-3X with coexistence of
immature follicles (arrowhead) and spermatogonias (arrow).
Steroid hormone pathway analysis
Testosterone, estradiol and vitellogenin (Vtg) have been quantified in blood of males and
females at 2 mpf in HO and LO and at 3 mpf for all three fractions and revealed few differences
because of high inter-individual variability. However some trends can be extracted.
236
No difference was observed in testosterone concentrations measured in PY and HO fish
whatever the sex. In LO fish, an increase in testosterone was observed in both females LO-0.3X
(p<0.05) and LO-3X (p<0.05) at 3 mpf.
No difference was observed in estradiol concentrations measured in PY and HO fish
whatever the sex. In LO females estradiol level was increased at 3 mpf in females LO-0.3X
(p<0.05) and LO-3X (p<0.05) and males LO-1X (p<0.01). In addition, increase of estradiol level
for 3 mpf LO-0.3X was just above significance threshold for males (p=0.09).
There was no difference of Vtg level in PY females or males whatever the concentration.
For HO exposed fish an increase of Vtg level was observed between 2 and 3 mpf (F=10.47;
p=0.003). The same increase was observed between 2 and 3 mpf in LO males (F=15.10;
p=0.0002). A decrease of Vtg was observed in females exposed to LO-3X (p<0.05) and a trend
was observed for LO-1X (p=0.09).
Gene expression analysis
Expression of genes encoding estrogens receptors (esr1, esr2a and esr2b) and ovarian
aromatase (cyp19a1a) was assessed in ovaries sampled at 9 mpf. About estrogens receptors, esr1
gene is up-regulated in ovaries of PY-1X (p<0.05) and HO-0.3X (p<0.05) while esr2a is upregulated in HO-0.3X (p<0.01) and HO-1X (p<0.05). On the contrary, esr2b is down-regulated in
LO-1X (p<0.05) and just above significance threshold for LO-3X (p=0.053).
Ovarian
aromatase is also up-regulated in ovaries of PY-1X (p<0.05) and HO-0.3X (p<0.05) but downregulated in ovaries of LO-3X.
In testis, genes expression have been monitored for two genes involved in steroidogenesis
pathway (cyp17a1 and hsd11b3) and two genes indicator of spermatogenesis (amh and spag8). In
testis of exposed fish, spag8 is down-regulated in PY-0.3X (p<0.01) and PY-1X (p<0.01) while
cyp17a1 is down-regulated in PY-0.3X (p<0.01), HO-0.3X (p<0.01) and H0-1X (p<0.01). On the
contrary cyp17a1 is up-regulated in L0-1X (p<0.01) as well as amh in L0-0.3X (p<0.05) and L01X (p<0.01) and just above significance threshold for LO-3X (p=0.065).
Discussion
Endocrine disruption
Taken together, molecular analysis suggest that long-term exposure to all PAHs fractions
tested produced endocrine disruption both in juveniles and adults. Because of the small number of
237
samples available it is not possible to unequivocally conclude on underlying mechanisms and
effects. However some convergent clues suggest that PY and HO fractions have estrogenic and/or
anti-androgenic activities as indicated by the activation of esr (PY and HO) and ovarian aromatase
(PY) expression in ovaries and the repression of cyp17a1 (PY and HO) and spag8 (PY) in testis.
On the contrary LO fraction would have an androgenic and/or anti-estrogenic activity as indicated
by the down regulation of esr2b and cyp19a1a and Vtg in ovaries as well as the induction of
testosterone in females, and the activation of amh and cyp17a1 in testis. In this context, the
increase of estradiol levels in both female and male fish is striking.
Des éléments de discussion supplémentaires sot présentés en discussion générale.
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239
240
V Effets des HAP sur la descendance (article 6)
Une partie des œufs issus de ces poissons contaminés a été conservée afin d’évaluer les
effets transmis à la descendance. Ces œufs n'ont jamais été en contact direct avec les HAP
autrement que par le transfert de la mère à l'œuf via le vitellus. Cette génération F1 était
dépendante des pontes de la génération F0 et de leur abondance. En raison de l'altération de la
reproduction des poissons HO et LO, seules les larves 0.3X et quelques larves 1X ont pu être
testées. Dans le cas de la fraction PY, toutes les doses ont pu être étudiées. Dans ce dernier cas, les
analyses ont été réalisées chez les larves et les juvéniles. Nous avons également analysé le
comportement des larves F2 pour cette fraction PY. En parallèle, une exposition de poissons
transgéniques cyp19a1b:GFP a été réalisée dans les mêmes conditions en vue d’évaluer une
altération de la signalisation œstrogénique dans le cerveau des larves F1.
Dans un premier temps, nous avons analysé l'effet maternel au niveau individuel. Dans un
deuxième temps, c'est au niveau moléculaire que ce potentiel transfert a été considéré.
Un test de réponse photomotrice, similaire à celui appliqué aux adultes, a été réalisé à 5 jpf
pour toutes les fractions. Une hyperactivité chez les larves PY-3X et une hypoactivité chez les
HO-0.3X ont été révélées dans les trois périodes. Il y a ensuite eu un suivi d'activité basale
pendant 72 heures, entre 4 et 7 jpf. Cette expérience a été réalisée pour toutes les conditions chez
les PY, et chez les LO jusqu'au 1X. La même hyperactivité que lors du challenge court en réponse
à un stress a été observée chez les PY-3X. Chez les LO, une diminution de l'activité en phase de
jour pour les 0.3X et les 1X a été observée.
Par la suite, le niveau d'anxiété des poissons F1-PY à 2mpf a été évalué dans le test "novel
tank", révélant une hyperactivité chez les poissons F1-PY-3X qui parcourent significativement
plus de distance que les poissons contrôles et passent également plus de temps en zone haute,
suggérant des mouvement erratiques perpetuels.
Les poissons F1-PY ont été mis à pondre et les larves ont été utilisées pour évaluer la
persistance des altérations comportementales en utilisant le PMR sur les larves F2 à 5 jpf. Seules
les larves PY-1X F2 présentent une différence d'activité par rapport aux larves contrôles, avec une
activité inférieure pendant la phase de jour. Cette expérience révèle un effet lié aux HAP chez les
F2-PY-1X différent de celui observé chez les F1, suggérant des mécanismes différents.
Au niveau moléculaire, l'analyse de l'expression de transgène dans le cerveau a été réalisée
avec ou sans pré-exposition à l'EE2 aux concentrations 0.006, 0.017, 0.05 et 0.17mM. Aucun effet
241
n'a pu être mis en évidence chez les HO et les LO, pour lesquels seule la descendance 0.3X a été
analysée. Une diminution de l'induction de l'expression après une exposition à 0.05 mM d'EE2
chez les PY 0.3X, 1X et 3X a été révélée. En l’absence d’EE2, le niveau de fluorescence entre les
conditions ne présente aucune différence significative. La diminution de l'expression de
l'aromatase dans le cerveau suggère le transfert maternel d'une activité anti-œstrogénique. Chez les
mammifères et les oiseaux, un parallèle est établi entre l'expression de l'aromatase et un niveau
élevé d'œstradiol dans le cerveau des mâles ainsi qu’un niveau plus faible chez les femelles. Il a
également été démontré que la manipulation précoce du niveau d'œstradiol était capable de
modifier à long terme le comportement, notamment reproducteur, indiquant un rôle important de
l'œstradiol dans le comportement. Il est possible que l'activité anti-œstrogénique, révélée par la
modification de la cinétique d'une action de l'aromatase par l'EE2 chez les larves F1-PY, soit
impliquée dans les modifications comportementales observées chez les juvéniles.
L’analyse de l'expression des gènes esr1, esr2a, esr2b et vtg1 et cyp19a1b va également
être réalisée sur ces larves après exposition à l’EE2, mais les analyses sont en cours.
Des effets sur la descendance, même après une exposition à faible dose, ont été observés
au niveau individuel et au niveau moléculaire.
Variables mesurées
PY
HO
↑ 3X
↓
Jour
↓ 0.3X ↑ 3X
ND
↓
Nuit
-
ND
-
↓ à 0.05 nM
Tendance ↓ à
0.05 nM
-
↓ anxiété 3X
ND
ND
↓ 1X lumière
ND
ND
Rép. Photo. F1
Locomotion
72 heures F1
Aromatase
Novel Tank F1
Rép. Photo. F2
2 mpf
LO
242
Manuscrit en préparation
Larval behavioral disruption in offspring of zebrafish exposed through diet to three
environmentally relevant mixtures of PAHs and long term effects of a pyrolytic mixture.
C. Vigneta, L. Joassardb, K. Le Menacha, M. Goubeaua, L. Lyphoutb, H. Budzinskic,
M-L. Bégoutb, X. Cousina, d*
a Ifremer, Ecotoxicology Laboratory, Place Gaby Coll, BP7, 17137 L’Houmeau, France
b Ifremer, Fisheries laboratory, Place Gaby Coll, BP7, 17137 L’Houmeau, France
c University of Bordeaux 1, EPOC, UMR CNRS 5805, 33405 Talence, France
Tel +33 5 46 50 06 21 – Fax +33 5 46 50 06 50
243
Introduction
Xenobiotics are increasingly emitted in the environment as a consequence of human
activities. Among xenobiotics, a group of compounds, the persistent organic pollutants (POPs),
share common characteristics: they are persistent in the environment, have lipophilic properties
and high chemical stability, which confer them a strong capacity for bioaccumulation. As aquatic
compartments, including sediments, often constitute an ultimate reservoir for these compounds,
fish could be exposed at various life stages to POPs. Besides such direct exposure, POPs can be
transmitted from parents to offspring, through blood during gestation and milk and induce
physiological effects in the post-natal period for mammals. For a recent review see (Crépeaux et
al., 2012, 2013; Palanza et al., 2008; Wormley et al., 2004). For egg-laying species, exposure
occurs through yolk (e.g. for PCBs see (Bodiguel et al., 2009; Daouk et al., 2011)). In addition to
this indirect parental exposure route, physiological disruption in parents can also have
consequences in offspring such as the alteration of signaling molecule and/or hormonal transfer:
for example the transmission of elevated cortisol levels in fish eggs after parental stress experience
has been shown to have physiological and behavioral consequences in juveniles (Auperin and
Geslin, 2008; McCormick et al., 1998).
Further, there is a growing body of evidence that POPs can act as neurotoxicant especially
in the case of early exposure (Ottinger et al., 2013; Scott and Sloman, 2004). This has been
demonstrated in various animal species and there are strong correlations in humans between
concentration of some POPs, especially in cord blood and latter cognition deficiencies or
behavioral disruptions (Edwards et al., 2010; Jedrychowski et al., 2003; Letcher et al., 2010;
Perera et al., 2012; Sagiv et al., 2010; Stewart et al., 2000; Tang et al., 2008).
Among POPs, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) constitute a wide family of
compounds formed by the association of several aromatic rings. In addition, there are also PAHs
derivatives substituted with alkyl groups, nitrogen, sulfur or oxygen. PAHs and their derivatives
are produced during organic matter combustion (pyrolytic PAHs) or present in oils (petrogenic
PAHs). In all cases PAHs are present as complex mixtures of large amount of individual PAHs
and derivatives. PAH mixtures composition differs depending on their origin. Pyrolytic mixtures
are characterized by high levels of heavy PAHs such as benzo[a]pyrene (BaP) and few alkylated
PAHs while petrogenic mixtures contain less heavy PAHs but more light ones and higher amount
of alkylated PAHs (Benlahcen et al., 1997; Budzinski et al., 1997; Latimer and Zheng, 2003; Neff,
1979; Yunker et al., 2002). PAHs release into the environment has increased over the last decades
244
(Eisler, 1987; Shen et al., 2013; Zhang and Tao, 2009). Monitoring networks have documented
PAH concentrations of up to 50 μg.g-1 dry weight (dw) in sediment from various affected aquatic
ecosystems although the concentrations in highly contaminated areas is more commonly in the
10 μg.g-1 range (Baumard et al., 1998; Benlahcen et al., 1997; Cachot et al., 2006; Johnson et al.,
2007; Varanasi et al., 1993; Yanagida et al., 2012). The concentration of PAH in the biota varies
depending on the surrounding concentration and trophic level. For example, the total
concentration of 16 PAHs used as indicators by the US Environmental Protection Agency (USEPA) in the copepod Eurytemora affinis in the Seine Estuary is in the 165–3866 ng.g-1 dw range
(Cailleaud et al., 2007) and in mussels it can be as high as 1600 ng.g-1 dw (Le Goff et al., 2006). In
the case of acute accidental exposure, the concentration in mussels can be even higher, for
example 3 000 ng.g-1 dw after the Erika oil spill (Jeanneret et al., 2002) and 14 350 ng.g-1 dw after
Exxon Valdez oil spill (Payne et al., 2008). PAHs bioaccumulate in parts of the lower levels of the
food chain, in which organisms have poor PAH metabolisation activities; consequently, food is an
important exposure route. This has been demonstrated by the high concentrations of PAHs found
in the stomachs of fish caught in contaminated areas (Johnson et al., 2007; Varanasi et al., 1993;
Yanagida et al., 2012).
Few studies have described the behavioral disruptions consecutive to an exposure to PAHs
in fish. In most cases, exposure have been performed using waterborne exposure of juveniles to
unique compounds (Almeida et al., 2012; Correia et al., 2007b; Goncalves et al., 2008; Gravato
and Guilhermino, 2009; Oliveira et al., 2012). In addition, one study has also described additive
effects when using a mixture of three PAHs (Goncalves et al., 2008). The general conclusion of
these studies is that PAHs produced lethargy revealed by a decrease of exposed fish swimming
ability. More recently two studies have reported behavioral disruption in zebrafish exposed to
PAHs. In a first study, embryo and larvae were exposed during 4 days to a sediment spiked with
three individual PAHs at a final concentration of 4.4 µg.g-1 and long-term behavioral disruptions
were observed in juveniles and adults (Vignet et al., Submitted). In a second study, fish were
continuously exposed through diet to three mixtures of PAHs starting at the first meal (5 days post
fertilization; dpf). In this study several behavioral disruptions have been observed indicative of the
induction of an anxiety-like syndrome (Vignet et al., Submitted).
Besides such direct consequences of exposures through water, sediment or food, the
question of the consequences in fish in the next generation is of utmost importance particularly
when building on current mammalian literature underlining several neurotoxicological defects due
to maternal exposure to PAHs (Crépeaux et al., 2012, 2013). Indeed, several mechanisms may be
245
envisioned including a transfer of PAHs and their metabolites to eggs which can result in a very
early exposure of developing embryos and/or transmission of biased signaling molecule such as
testosterone or cortisol as cited above, resulting in a degraded ovocytes quality and finally an
epigenetic imprinting.
Mechanisms underlying behavioral disruptions after PAHs exposure remain generally unknown.
Several pathways have been proposed including disruption in cortisol, neurotransmitters and
estrogen pathways. The later hypothesis of estrogen disruption is interesting if we consider the fact
that PAHs are suspected to disrupt endocrine regulation and it is now documented that early
estrogenic imprinting drives several organ development, gender-specific brain development and
associated behaviors (Stocco, 2012).
In the present study, we have analyzed behavioral responses of the offspring of dietary
exposed fish. Founding generations (F0) have been exposed through diet to three complex
mixtures of PAHs representative of environmental situations: a pyrolitic fraction and two
petrogenic fractions. The behavior of their offspring (F1) was analyzed at larval and juvenile
stages. In addition behavior of PY-F2 larvae has also been monitored. The possible endocrine
disruption effects of PAHs were explored by measuring the brain estrogenic activity using a
cyp19a1b–GFP transgenic line expressing GFP under the control of brain aromatase promoter
(Tong et al., 2009). This gene has two major characteristics: (i) it is only expressed in radial glial
progenitors in the brain of fish and (ii) it is exquisitely sensitive to estrogens (Brion et al., 2012).
Material and Methods
This study was conducted under the approval of the Animal Care Committee of France,
Fish rearing ad offspring production
We used the common laboratory TU strain (ZFIN ID: ZDBGENO-990623-3), which was
established in the 90’s in Tubingen and in our platform (PEP – http://wwz.ifremer.fr/pep) 6 years
ago as large batches of individuals originating from the Amagen platform (Gif/Yvette, France) and
the Pasteur Institute fish facility (Paris, France). For the assessment of brain glial cell aromatase
expression we used a transgenic line cyp19a1b (Tong et al., 2009). Both lines were contaminated
through diet following the protocol described in Vignet et al. (in revision, chapitre Résultats, II)
with three PAHs fractions and reared until adulthood for offspring production. We used i) A
pyrolytic fraction (PY) extracted from sediments collected in the polluted site of the Seine Estuary
246
(Oissel, France) and ii) two petrogenic fractions obtained from Erika fuel (heavy oil; HO) and
Arabian Light crude oil (LO). PAHs extractions were performed as previously described (Cachot
et al., 2006). Zebrafish were exposed from their first meal (at 5 dpf) onward and exposed using
spiked food pellets. Three concentrations, 0.3X, 1X and 3X were used with the 1X concentration
corresponding to the Σ[16 EPA PAH] at 5 μg.g-1 dw food, representative of the concentrations
found in mollusks in the Seine Estuary. Diets are named after the origin of the fraction and its
concentration: 1X pyrolytic fraction diet will be named: PY-1X. For each exposure, a fourth
control treatment was included corresponding to the plain food treated as spiked-food with
dichloromethane which was used as carrier solvent for PAHs spiking. Control and exposed fish
were maintained at 27°C in a controlled 14-h light/10-h dark (14:10) photoperiod and were fed at
2 (HO and LO) or 3% (PY) ration twice a day with pellets between 9:00 and 9:30 in the morning
and 16:30 and 17:30 in the afternoon and once with plain artemia (INVE) between 11:30 and
12:30.
When the onset of spawning was confirmed in 4 month-old PY and HO, 5 month-old LO
(Vignet et al, chapitre Résultats III) and 3 month-old fish for cyp19a1b-GFP, eggs were obtained
by random pairwise mating and F1 offspring production was obtained from most treatments but in
variable numbers (see after). Briefly, one adult male and one female were placed together at 17:00
the evening before eggs were required in spawning boxes (AquaSchwarz, Germany). Eggs were
collected in the morning and the fertilization rate assessed within 2 h of collection. At the same
time, spawns were sorted to remove feces, and dead or unfertilized embryos. Embryos from
different spawns were kept separately and used in different challnges or for rearing. Embryos and
larvae were maintained at 28°C in Petri dishes in an incubator with the same photoperiod as
adults. After hatching, chorions were removed manually and larvae were either used for
behavioral experiments or for PY only were fed with artemias and size-graded plain pellets from 5
dpf onward until fish reached sexual maturity. PY-F1 adult fish were then used to produce
offspring (PY-F2) by placing a spawning box (AquaSchwartz, Germany) in the bottom of each
tank, eggs collection and treatment followed the same protocol as above.
Behavioral experiments
We used 4-7 days old F1 larvae issued from PY, LO and HO parents, 2 month old sex
undifferentiated F1 fish issued from PY parents and 5 days old larvae issued from PY-F1 fish for
behavioral tests. Tests were done in a dedicated room kept at 27°C ± 1°C, with a 14:10
247
photoperiod synchronized with the rearing room so as to minimize unwanted correlated effects.
Daylight started at 08:30 and there were no twilight transition periods.
At 17:00 the day before the challenge (4 dpf), single larvae were transferred to the cells of
a 24-well plate (Krystal 24, opaque wall and clear bottom micro-plate) where they were arranged
in a mixed design and visually isolated from each other, the four corner wells were left empty
because video acquisition suffered distortion. Within each fraction (because exposure were not
done at the same time), an equal number of larvae from each treatment (control, 0.3X, 1X and 3X)
was introduced in each plate to avoid any trial effect. The 24-well plates were kept overnight in
the breeding incubator. The following day, two hours before the challenge, well plate was
transferred to the video acquisition room and placed on top of a size-matched infrared floor, which
allowed the larvae to be filmed under both light and dark conditions (Vignet et al., 2013a). After a
10-min acclimation period, the 15-min challenge included three 5-min periods: Light on–1 (70
lx.), Light off (<1 lx.) and Light on–2. Challenges were conducted between 14:00 and 18:00, the
most stable activity period in zebrafish larvae (MacPhail et al., 2009). Constant IR lighting was
maintained during filming using a three-way switch. The apparatus was enclosed within a
lightproof and temperature-controlled box. Distance travelled (cm) was recorded for 82 Control,
51 0.3X, 68 1X and 60 3X larvae issued from PY fish; 121 Control and 97 0.3X issued from HO
fish; 61 Control and 61 0.3X issued from LO fraction (no 1X and 3X larvae were obtained in
sufficient number synchronously for HO and LO) In F2 PY, 74 control, 55 0.3X, 84 1X and 75 3X
were tested.
Seventy-two-hour swimming activity setup in F1 larvae
This method was used to monitor the onset of the swimming activity as well as the
expression of the circadian activity rhythm in larvae. The same microplate preparation was done
(see previous section) except that single larvae were three dpf larvae. The following day (4 dpf ), 2
h before the challenge, the well plate was transferred to the video acquisition room under the same
conditions as described above. The recording of the larval swimming activity started at 12:00 and
was continued for 72 h. The dependent variable measured was the distance travelled (cm), and was
recorded for 27 Control, 21 0.3X, 20 1X and 15 3X larvae issued from PY ; 23 Control, 24 0.3X
and 23 1X larvae issued from LO.
248
Novel tank test
The novel tank challenge was performed in 2-month old offspring issued from PY parents.
After 2 hours of acclimatization in the room in 1 L aquarium, fish were transferred to a novel tank
(trapezoid 1.5 L tank; Aquatic Habitats, Apopka, FL; sizes in cm: height 15.2 × width 7.1 x length
27.9 at top and 22.5 at bottom) and filmed for 6 minutes in side view. Twelve fish were challenged
per concentration. For space occupancy analysis, tanks were separated into two areas according to
Egan et al. (2009): the top area including one half of the volume and the bottom area including the
other half; the dependent variable measured was the time spent in each area (top, bottom; s) per
minute.
Behavioural data recording and analysis
Videos for the photomotor response, the 72-h swimming activity setup and the novel tank
test were recorded with an analogue camera ICD-48E (Ikegami) and 2.7–13.5 mm lens (Fujinon)
linked to a PC with an acquisition card and Ethovision XT 8.5 software (Noldus, The
Netherlands).
For all experiments, EthoVision XT software was used for track extraction and analysis.
Data were acquired by EthoVision at 25 frames per second, and variables were nested for further
treatments every 30-s in larvae during the photomotor challenge (distance travelled, cm), every
30-min for the 72-h swimming activity setup (distance travelled, cm) and every 1-min (time spent
in the top and bottom area, s) in the novel tank test with 2-month old juveniles.
Aromatase expression in vivo
Embryos exposed to the EE2 (ethinyl estradiol) were issued from cyp19a1b-GFP
transgenic parents exposed though diet to the 3 same PAH fractions. At 4-5 hours post
fertilization, 30 fertilized eggs were placed in beakers with 30 ml of E3, a control and four
concentrations of EE2 were used: 0.005; 0.017; 0.05 and 0.17 nM. Between 1 and 5 replicates
were done depending on fractions and concentrations due to eggs availability and no eggs were
available for HO and LO 1X and 3X. The beakers were incubated at 28°C with the same
photoperiod as adults. On day 6 after fertilization, larvae were anaesthetized with benzocaine (15
µL of a 10% stock solution in 100% ethanol was diluted in the beaker containing 30 ml of E3) and
were placed in methylcellulose at 3% under a fluorescence microscope (Brion et al., 2012). All the
larvae were observed in dorsal view and each was photographed using an Olympus BX41
microscope and a fluorescence source (EXFO, XCite series 120 Q) equipped with a DMK
249
31AU03 color camera and IC-Capture software (The Imaging Sources, Germany). All
photographs were taken using the same parameters: only the head was photographed using X10
objective, with a 774 ms exposure time and maximal intensity (gain at 500). Fluorescence
quantification was realized using the ImageJ software. For each picture taken (61 to 384 larvae
depending on fractions and concentrations, see supplementary table 1), the integrated density was
measured, i.e. the sum of the gray-values of all the pixels within the region of interest.
Statistical analyses were performed with Statistica 9.0 (Statsoft, Tulsa, OK, USA)
software. GLM was applied in each case. In all tests, within each fraction (PY, HO or LO),
concentration (control, 0.3X, 1X and 3X) and period (days vs. night in larvae photomotor and 72-h
swimming activity setup tests; light on-1, Light-off, Light on-2 during the photomotor response
test; min-1 to 6 in novel tank test) or areas (in novel tank test) were tested as fixed factor and fish
and session as random factor. Interaction between concentration and period was also analyzed. All
statistical analyses were carried out at a 95% level of significance and only the fixed factor and the
interaction between them are presented in the text. Post hoc test were performed with NewmanKeuls in each case. The results reported in text and all figures are means ± SEM.
Results
Results obtained for the F0 exposure have been described in previous articles (Vignet et
al., In revision-a; Vignet et al., In revision-b) and will not be detailed here. However, some
information is important for this article understanding and will be briefly recalled here. PAH
mixtures were different in terms of individual PAHs and alkylated PAHs proportions but total
PAHs concentrations were dosed in the 4.7-6.7 µg.g-1 dw range for the intermediate concentration
(1X) and PAH metabolites quantification revealed an effective exposure. Several physiological
effects were observed including F0 behavioural disruptions and depended on the mixture used,
with an increasing severity as follow: PY<LO<HO. One of the effects was a disruption of
reproduction. This was particularly severe for 1X and 3X concentrations of LO and HO mixtures
with very few eggs produced after exposure to 1X and none after exposure to 3X. A direct
consequence of these disruptions is that results reported here mainly dealt with PY exposure (all
concentrations) and LO-0.3X and HO-0.3X. The second consequence is that only PY F2 offspring
were produced.
250
The photomotor response (PMR) of Control larvae followed the expected pattern which
was a clear increase (~60%) of distance travelled during the Light off period compared to the
previous period (Light on-1). Activity during the following light on period (Light on-2) then
decreased to reach levels observed during Light on-1 period (Figure 1).
In the case of the PY mixture (Figure 1 A, B), F1 larvae distance travelled was
significantly modified. This was revealed by a significant period effect (F=37.02; p<0.001) and a
difference between concentrations (F=5.05; p=0.002). Indeed, whereas larvae issued from PY0.3X and PY-1X parents displayed the same PMR as larvae issued from Control parents, larvae
issued from PY-3X parents had a higher level of activity whatever the light period and showed
almost no increase during Light off.
For larvae issued from HO parents, there was a significant difference between periods for
distance travelled (F=73.97, p<0.001; Figure 1 C) and a significant difference was also observed
between concentrations (F=40.56; p<0.001). Activity of larvae issued from HO-0.3X parents was
significantly reduced during both light on periods compared to larvae issued from Control parents.
They nonetheless displayed the usual pattern with a significant activation during the light off
period (p<0.001; Figure 1 D).
In the case of larvae issued from LO parents (Figure 1 E, F), a difference between periods
was observed for distance travelled (F=20.79; p<0.001) but no significant difference was observed
between concentrations (p=0.14 ; Figure 1 F).
Seventy-two-hour swimming activity setup in F1 larvae
The spontaneous activity of larvae was monitored during 72 hours starting from 4 dpf and
included day and night periods. During day periods, distance travelled by larvae issued from
Control parents increased progressively during day 4 to reach a maximum during day 5 and then
decreased to a low level during day 6. Conversely, during night periods, activity was strongly
reduced.
Circadian spontaneous swimming activity of larvae issued from PY parents showed the
same general pattern whatever the concentration to which parents were exposed (Figure 2 A)
resulting in significant differences between periods (F=365.11; p<0.001). Some differences
between concentrations were noteworthy (interaction period x concentration; F=3.89; p=0.011) in
251
particular the decrease in activity of larvae issued from PY-0.3X during all day periods. This
resulted in a significant decrease of total distance travelled during diurnal periods (Figure 2 B). On
the contrary activity of larvae issued from PY-3X parents increased especially during day periods
5 to 7 dpf (Figure 2 A). This resulted in a significant increase of total travelled distance during
diurnal periods (Figure 2 B). The diurnal activity of PY-1X offspring was intermediate between
PY-0.3X and PY-3X and at the level of Control offspring. No difference was observed between
concentrations for nocturnal periods (Figure 2 B).
15
Control
0.3X
1X
A
80
5
40
0
15
0
120
HO
C
5
0
15
LO
80
0
120
E
5
40
Light off
Light on-2
3X
B
a a
a b
ab a a b
a a a b
D
HO
a b
a b
LO
80
Light on-1
1X
40
10
0
0.3X
PY
10
10
Control
120
3X
Distance travelled in cm/ 5 min
PY
0
Light on-1
a
b
F
Light off
Light on-2
Figure 1 : Photomotor response of 5 dpf offspring larvae. Distance travelled per 5-min periods
before, during and after a light off period for larvae issued from PY (A in details, B averaged per
5-min periods), larvae issued from HO (C in details, D averaged per 5-min periods) and larvae
issued from LO (E in details, F averaged per 5-min periods). Values are mean ± SEM; n=82
Control, n=51 0.3X, n=68 1X and n=60 3X for larvae issued from PY fish; n=121 Control and
n=97 0.3X for larvae issued from HO fish; n=61 Control and n=61 0.3X for larvae issued from LO
fraction; letters indicate significant difference at p < 0.05.
Circadian spontaneous swimming activity of larvae issued from LO parents presented the
above described pattern for larvae issued from Control parents (not shown). Whatever the
concentration a clear higher diurnal activity was observed with a significant difference between
periods (F=102.52, p<0.001; Figure 2 C) and a significant interaction between concentrations and
periods (F=4.21; p=0.017). Diurnal swimming activity of larvae issued from LO-0.3X and LO-1X
252
parents was significantly reduced compared to offspring of Control parents (F=21.00; p<0.001;
Figure 2 C).
800
Control
A – PY
1X
3X
600
400
200
0
4 dpf
0.3X
400
Night-1
5 dpf
Night-2
6 dpf
Night-3
7 dpf
400
B – PY
C – LO
Control
0.3X
200
200
1X
3X
0
a
b
a
Day
c
Night
0
a
b
b
Day
Night
Figure 2 : Seventy-two-hour swimming activity setup in F1 larvae. Evolution of distance
travelled (cm/30min) for PY larvae in relation to time, values are means for graph readability (A);
Averaged distance travelled for day and night periods, values are mean ± SEM for larvae issued
from PY (B) and for larvae issued from LO (C); n=27 Control, 21 0.3X, 20 1X and 15 3X for
larvae issued from PY ; n=23 Control, n=24 0.3X and n=23 1X for larvae issued from LO; letters
indicate significant difference at p < 0.05.
Novel tank test - 2 month old PY offspring
Juveniles spent most of the time in the bottom area, however, the time spent in top area
increased over time (F=12.51; p<0.001; Figure 3) and was different between concentrations
(F=7.35; p<0.001). Post-hoc tests revealed that larvae issued from PY-3X parents spent more time
in top area compared to larvae issued from Control parents (p=0.008).
The PMR of F2 larvae issued from Control parents followed the same pattern as
described for F1 larvae (Figure 4 A, B) with a significant difference between periods (F=61.32;
p<0.001). A significant difference was also observed between concentrations (F=5.79; p<0.001).
Distance travelled by PY-1X F2 larvae was lower than that of Control F2 larvae during both light
on periods (p<0.001 for L1 and p=0.047 for L2; Figure 4 B).
253
Control
40
0.3X
1X
3X
Time spent in top are (s)
30
20
10
0
Min-1
Min-2
Min-3
Min-4
Min-5
Min-6
Figure 3 : Novel tank challenge in 2 month-old individuals issued from PY fish. Mean time
spent (s) per minute (Min-1 to Min-6) in the top area of the novel tank. Values are mean ± SEM;
n=74 control, n=55 0.3X, n=84 1X and n=75 3X for larvae issued from PY fish.
Aromatase expression in larvae brain
To evaluate estradiol regulation in larvae brain, a transgenic line was used expressing
GFP under the control of brain aromatase (cyp19a1b) promoter (Tong et al., 2009). F0 transgenic
fish were exposed as described before and offspring monitored for GFP expression. Basal activity
(in the absence of EE2 stimulation) was similar between all tested offspring compared to their
respective control (inserts in Figure 5). Incubation of embryos and larvae in EE2 increased GFP
level in a dose dependent manner for all diets (PY; F=175.27; p<0.001; HO; F=8.87; p<0.001 and
LO; F=23.09; p<0.001). Post-hoc tests revealed a significant reduction of GFP induction by EE2
for PY offspring (concentration 0.3X-3X) for a EE2 concentration of 0.05 nM. This inhibition was
43% for PY-0.3X offspring and 33% for PY-1X and PY-3X offspring. At the highest
concentration used for EE2 (0.17 nM) an inhibition was only observed for PY-0.3X offspring
(37%; Figure 5 A). A strong reduction of GFP expression was observed in the brain of HO-0.3X
larvae (-74%) for an EE2 concentration of 0.05 nM but because of a high variation in Control
larvae this was not significant (Figure 5 B). In the case of LO offspring, none of the LO-0.3X
offspring survived to an EE2 exposure at a concentration above 0.017 nM. At lower
concentrations, no difference was observed between Control and LO-0.3X offspring (Figure 5 C).
254
15
Control
0.3X
1X
3X
A
10
5
0
120
PY-F2
Control
PY-F2
0.3X
1X
3X
B
80
40
0
a
a
b
Light on-1
ab
a
Light off
ab
b ab
Light on-2
Figure 4 : Photomotor response of 5 dpf larvae issued from F1-PY. Distance travelled per 5min periods before, during and after a light off period (A in details, B averaged per 5-min
periods). Values are mean ± SEM; n=82 Control, n=51 0.3X, n=68 1X and n=60 3X for larvae
issued from F1-PY fish; letters indicate significant difference at p < 0.05.
Discussion
In descendants exposed only via maternal transfer, both at a very early age (larvae at five
dpf), and persisting into the juvenile stage (2 mpf fish), we found some significant different
behavioral responses within the diets contamination range attained (see Vignet et al., Chapitre
Résultats II). To our knowledge, this is the first time that effects of PAHs exposure have been
monitored in the offspring of chronically contaminated fish. Further, this work has ecological
relevance as the PAHs mixtures used are representative of those found to occur in European
coastal areas (Cachot et al., 2006). PY fraction was characterized by a high level of heavy PAHs
and a very low level of alkylated PAHs. LO contained a high level of alkylated PAHs and a low
level of heavy PAHs while HO was intermediate for both groups of PAHs. The behavioral
255
deviations reported here revealed different effects depending on the fraction but some effects are
to similar to those reported in other studies of directly exposed fish (Almeida et al., 2012; Correia
et al., 2007a; Goncalves et al., 2008; Gravato and Guilhermino, 2009; Oliveira et al., 2012).
At five days, most larvae organs are developed (Kimmel et al., 1995; Rubinstein, 2003),
and they already show a complex behavioral repertoire (Ali et al., 2011; Champagne et al., 2010;
Rihel et al., 2010). Assays performed at this stage conform to ethical requirements (compliance to
the 3R rule, as tests at this stage and in this species are considered to be in vitro; (Strahle et al.,
2011)). Although light information processing involves complex mechanisms (Fernandes et al.,
2012), the visual motor response test used to assess behavior of larvae is considered robust. and
better than other methods for revealing defective brain function, aberrant nervous system
development and locomotor defects caused by toxic compounds (Ali et al., 2012; Kokel et al.,
2010; Rihel et al., 2010). Different activity levels observed in larvae might be the consequence of
several non-exclusive events. For example, developmental defects could be caused by i) exposure
of embryos and larvae to HAPs after maternal transfer to the egg, ii) alteration of oocyte quality in
response to maternal reaction after exposure to PAHs or iii) epigenetic imprinting of gametes
which can modify their development or physiology. Of these notions, there is no evidence for our
first suggestion as we have shown that dietary PAHs metabolites were not present in zebrafish 5
days old larvae suggesting no PAH parent’s compounds or metabolites transfer to eggs (Perrichon
et al., In preparation). The second hypothesis will be further discussed in light of the results
obtained with the cyp19a1b–GFP transgenic line used to evaluate brain aromatase expression.
Finally, we attempted to explore the epigenetic hypothesis by starting transgenerational work with
the analyses of some transmission of effects shown at the second generation.
256
6
Control
0.02
0.3X
1X
A
3X
0.01
4
0
Number of fluorescent pixels in million
2
0
6
a b b b
a b a a
0.02
B
0.01
4
0
2
0
6
0.02
4
C
0.01
0
2
0
Control
0.006
0.017
0.05
EE2 concentration (nM)
0.17
Figure 5 : Brain aromatase expression in number of fluorescent pixels extracted from
images of the head region of larvae issued from cyp19a1b–GFP line exposed through diets to
PY fish (A), HO (B) and LO (C) fractions in relation to EE2 concentration (nM). Letters
indicate significant difference at p < 0.05, detailed number of picture taken per fraction and
concentration is given in supplementary material table 1.
Here, after acclimatization to the environment for two hours without disturbance,
locomotor activity levels stabilized and the first period of recording (5 min in duration, Light on–
1) reflected basal activity. The larval activity level of PY progeny was higher than that of control,
0.3X and 1X progeny. These differences remained during the change from light to dark
conditions. Activity was stimulated in larvae issued from 3X fish but at a similar level all along
the test. Larvae issued from HO fish showed a typical response to the dark challenge but displayed
lower activity than control (only 0.3X larvae could be tested). Larvae issued from LO fish showed
a typical response to the dark challenge. In all cases, except larvae issued from PY-3X fish, PMR
pattern was not altered (i.e. larvae responded to the dark phase by an increased activity) which
highlight the subtil nature of undergone changes. F2 larvae issued from PY-F1 also showed the
normal PMR pattern, but here concentration effects were only seen during light phases with
257
lethargy for 1X concentration and intermediate responses for 3X concentration.
We monitored the locomotor activity over long periods of time, including three night
periods, because long-duration assays are useful for analyzing the expression of natural patterns
and divergence from them under experimental situations. Larvae issued from our experimental
fish (control or contaminated) were clearly diurnal with 5 to 10 times more activity during day
periods than night periods over 72 h of recording. There was a large increase in the activity during
the fifth day consistent with our earlier strain screening (Vignet et al., 2013b). Overall, larvae
issued from PY fish differed from larvae issued from control fish with a significant hypoactivity in
0.3X fish and hyperactivity in 3X fish. Larvae issued from LO fish also showed hypoactivity at
both concentrations tested (0.3X and 1X). Such differences mostly appeared after day 4 and this
overall shape of the activity profile is consistent with the development of larvae standing on their
side until 4 dpf, and then inflating their swim-bladder around 5 dpf. The development of
locomotor behavior hence parallels the maturation of serotoninergic neurons (Brustein et al.,
2003) and the application of exogenous dopamine inhibits the initiation of swimming at 5 dpf
(Thirumalai and Cline, 2008). Thus, the different activity profile observed during the fifth day
could be related to signalling pathway altered as also observed during the PMR where larvae
issued from 3X fish also showed hyperactivity in day 6.
The "novel diving tank test" may be used to explore stress and anxiety in juvenile or adult
zebrafish (Egan et al., 2009; Levin et al., 2007; Sackerman et al., 2010). A significant correlation
between increased use of the lower tank section and an anxious or stressed state has been recorded
in such studies. This state may be induced by different known anxiogenic drugs (such as caffeine)
or relieved by anxiolytic ones (such as fluoxetine or nicotine), and was confirmed by cortisol
assays (Egan et al., 2009; Levin et al., 2007). This novel tank test was also used to test known
endocrine disruptor molecules and their early imprinting action on the brain circuit that regulates
stress reactions such as 17-estradiol which increased anxiety like behavior (Reyhanian et al.,
2011; Volkova et al., 2012). The observed positioning mostly in the top area of the novel tank of
fish issued for 3X parents therefore suggests a decrease of stress and/or anxiety in these fish, such
weakened homebase behavior and/or a loss of behavioral inhibition along with the hyperactivity
observed in larvae might both be leading to increased predation risk and hence have consequences
at the population level.
Mechanisms behind still need to be confirmed but could indeed be due to early brain
imprinting as we showed, at least in larvae issued from PY exposed adults, a brain anti-estrogenic
258
activity which demonstrated an endocrine disruption effect of such an environmental dose of
dietary PAHs in zebrafish. Such decreased estradiol synthesis has a documented effect on brain
sexual development and, as demonstrated in mammals, also has consequences on activity and
anxiety levels (Panzica et al., 2007). The reasons explaining such aromatase expression decrease
could either be due to a lack of estrogen receptor and/or to a transcription defect in relation with
specific epigenetic methylation processes.
Further, comparing prenatal and perinatal exposures reveals some differences. When
zebrafish eggs were incubated during their first 4 days with a mix of 3 individual compounds
(Vignet et al. sumitted, Chapitre Résultats I), measured endpoints revealed (besides a late
disruption of growth and a trend for a lower reproductive ability) behavioral disruptions
suggesting lethargic and/or anxiety-like behaviors. This latter behavior was also identified in
offspring at larval stage. Here, in the case of prenatal exposure with different mixtures, larvae
issued from 3X-PY fish showed hyperactivity and a lower anxiety levels. Such contrasted results
cannot be directly compared since mixtures differed but they echo the findings of Crépeaux et al.
(2012, 2013) who highlighted different consequences on adult male rats’ behavior and regional
brain metabolism depending on whether exposure to 16 PAH mixture was exclusively prenatal or
perinatal. Indeed, as mentioned earlier several mechanisms such as developmental alterations or
genetic imprinting, could explain both early and late behavioral disruptions in F1 fish as also
demonstrated after parental PCBs exposure where a similar persistence during aging was
suggested in our fish model (Pean et al., 2013). It is thus possible that zebrafish, exposed to
environmental PAHs mixtures through diet, could also serve as a model to improve the
understanding of the mechanisms underlying the appearance of behavioral disorders. In line with
early brain imprinting, further analyses should be conducted to evaluate the potential relationship
between PAHs and the concentration of neurotransmitters (such as dopamine and serotonin) which
are also regulating behavioral repertoire as shown in trout after PAHs injection (Gesto et al., 2008;
Gesto et al., 2009) or in rats after PCBs perinatal exposure (Boix et al., 2011).
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Vignet, C., Bégout, M.-L., Péan, S., Lyphout, L., Leguay, D., Cousin, X. (2013a) Systematic
Vignet, C., Begout, M.L., Pean, S., Lyphout, L., Leguay, D., Cousin, X. (2013b) Systematic
Vignet, C., Devier, M.H., Le Menach, K., Lyphout, L., Potier, J., Cachot, J., Budzinski, H.,
Bégout, M.-L., Cousin, X. (In revision-a) Long-term disruption of growth, reproduction
and behaviour after embryonic exposure of zebrafish to PAHs-spiked sediment.
Frère, L., Bégout, M.-L., Zambonino-Infante, J.L., Budzinski, H., Cousin, X. (In revisionb) Chronic exposures to pyrolytic and petrogenic mixtures of PAHs through diet produce
physiological disruptions in zebrafish - Part I : Survival and growth
Vignet, C., Le Menach, K., Lyphout, L., Guionnet, T., Frère, L., Leguay, D., Budzinski, H.,
Cousin, X., Bégout, M.-L. (Submitted) Chronic exposures to pyrolytic and petrogenic
263
mixtures of PAHs through diet produce physiological disruptions in zebrafish - Part II :
Behavior.
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PAHs in the Fraser River basin: a critical appraisal of PAH ratios as indicators of PAH
source and composition. Organic Geochemistry 33, 489-515.
264
Supplementary material Table 1: Number of larvae photographed per fraction and
concentration.
PY
HO
LO
Control
0.006 nM
0.017 nM
0.05 nM
0.17 nM
Control
87
72
73
94
58
0.3X
61
26
49
23
26
1X
59
69
67
56
41
3X
88
58
65
49
72
Control
20
19
20
14
19
0.3X
18
15
9
13
22
Control
21
17
22
14
16
0.3X
22
14
25
0
0
265
VI Etudes complémentaires (article 7)
Un certain nombre de HAP ont une activité génotoxique qui peut conduire au
développement de tumeurs. Dans le cadre de ce projet, la tumorigénicité a été évaluée sur les
poissons exposés. J'ai participé à cette étude dont les résultats principaux vont être présentés ici.
Toutes les fractions de HAP entraînent des troubles prénéoplasiques et néoplasiques chez
les animaux exposés à long terme. Les tissus cibles sont presque exclusivement d'origine
épithéliale. L'épithélium du canal biliaire est le tissu le plus affecté par l'exposition chronique à
toutes les fractions de HAP. Les cellules germinales semblent être le second tissu affecté.
Un plus grand nombre de tumeurs a été observé avec l'augmentation des concentrations de
HAP et de la durée d'exposition. Les plus graves effets cancérigènes ont été induits par
l'exposition alimentaire au HO par rapport à l'exposition à LO ou PY (respectivement 45 %, 30 %
et 7 % après 9 à 10 mois d'exposition à la concentration 1X). A 3 mpf, des effets cancérigènes ont
été détectés après exposition à la fraction LO, y compris pour la concentration la plus faible. Le
même phénomène a été observé pour la fraction PY.
Aucun dommage à l'ADN, d'augmentation de l'activité de l'EROD, ou de résultats
révélateurs au niveau des micronoyaux n’ont été détectés dans le sang après une exposition
chronique aux HAP. Une mesure effectuée dans le foie ou dans la bile, qui sont des sites de
bioactivation et de lésion, aurait probablement été plus révélatrice.
266
Chronic dietary exposure of zebrafish to PAH mixtures results in carcinogenic but not
genotoxic effects
T. Larcher1,2,*, P. Perrichon3,4,5,§, C. Vignet3,§, M. Ledevin1,2, K. Le Menach6, L. Lyphout3, L.
Landi6, C. Clerandeau6, F. Lebihanic6, D. Ménard7, T. Burgeot7, H. Budzinski6, F. Akcha7, J.
Cachot6, X. Cousin3,8
1 INRA UMR703, APEX, Oniris, F-44307 Nantes, France
2 LUNAM Université, Oniris, École nationale vétérinaire, agro-alimentaire et de l'alimentation Nantes-Atlantique, F44307 Nantes, France
3 IFREMER, Laboratoire d’écotoxicologie, F-17137 L’Houmeau, France
4 Université de la Rochelle, Littoral environnement et sociétés (LIENSs), F-17042 La Rochelle, France
5 Fédération de recherche en environnement pour le développement durable, FR-3097, Université de La Rochelle,
CNRS, IFREMER, F-17000 La Rochelle, France
6 Université de Bordeaux, EPOC UMR 5805, F-33405 Talence, France
7 IFREMER, Laboratoire d’écotoxicologie, F-44311 Nantes, France
8 INRA LPGP, Campus de Beaulieu, F-35042 Rennes, France
§
These authors contributed equally to this work
*
Corresponding author: Thibaut Larcher
Phone: +33 2 40 68 78 74; Fax: +33 2 40 18 00 02; email: [email protected]
Abstract
PAHs are ubiquitous contaminants that can be present at high levels as mixtures in polluted
aquatic environments. Many PAHs are potent mutagens and several are well-known carcinogens.
Despite numerous studies on individual compounds, little is known about the toxicity of PAHs
mixtures that are encountered in environmental situations. In the present work, zebrafish were
continuously fed from 5 days post-fertilization to 14 months post-fertilization (mpf) with a diet
spiked with fractions of either pyrolytic (PY), petrogenic light oil (LO), or petrogenic heavy oil
(HO) origin at 3 concentrations. A decrease in survival was identified after 3 mpf in fish fed with
the highest concentration of HO or LO but not for PY. All PAH fractions caused preneoplastic and
neoplastic disorders in long-term exposed animals. Target tissues were almost exclusively of
epithelial origin, with the bile duct epithelium being the most susceptible to chronic exposure to
all PAH fractions, and with germ cells being the second most responsive cells. Significantly
higher incidences of neoplasms were observed with increasing PAH concentration and exposure
duration. The most severe carcinogenic effects were induced by dietary exposure to HO compared
267
to exposure to LO or PY (respectively 45 %, 30 % and 7 % after 9 to 10 months of exposure to an
intermediate concentration of PAHs). In contrast, earliest carcinogenic effects were detected as
soon as 3 mpf after exposure to LO, including the lowest concentration, or to PY. PAH
bioactivation and genotoxicity in blood was assessed by EROD activity quantification and comet
and micronuclei assays, respectively, but none of these were positive. Chronic dietary exposure of
zebrafish to PAH mixtures results in carcinogenotoxic events that impair survival and physiology
of exposed fish.
Keywords
polycyclic aromatic hydrocarbon, zebrafish, carcinogenesis, genotoxicity, neoplasia, carcinoma,
toxicological pathology
268
Introduction
Persistent organic pollutants (POP) are contaminants of natural or anthropic origin
including several chemical families such as dioxins, polychlorinated biphenyls (PCBs),
polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and polyaromatic hydrocarbons (PAHs). PAHs are
commonly classified into low molecular weight (LMW) or high molecular weight (HMW) PAHs,
based on their molecular structure and their number of rings. Differences in the structure and size
of individual PAHs result in substantial variability in their physical, chemical and toxicological
properties.
Because of increasing human activity, PAHs are emitted at an ever-growing level and their
concentration in the environment has considerably increased over recent decades (Shen et al.,
2013). They are widespread contaminants present in the environment as complex fractions of
dozens of individual PAHs. They may be generated mainly by three processes: combustion of
organic matter (pyrolytic origin), release of petroleum (petrogenic origin), or to a lesser extent
diagenesis (degradation of the organic matter) (Neff, 1979). Once formed, PAHs may enter
aquatic environment through the spillage of petroleum, industrial discharges, atmospheric fallout,
and urban runoff (Neff, 1979) .Pyrolytic PAHs mainly enter in the aquatic environment via the
atmosphere, associated with particles that reduce their bioavailability. In contrast, petrogenic
PAHs can be directly discharged in the aquatic environment. In polluted environments, bivalves
accumulate high levels of PAHs via their filtering activity (Hylland, 2006; Rocher et al., 2006).
Fish are exposed through water, through contact with contaminated sediments and by feeding. In
molluscs and fish, some HMW PAHs can be metabolized into reactive compounds with DNAbinding activity (Fernández-Tajes et al., 2011; Le Goff et al., 2006). These metabolic processes
are activated through the aryl-hydrocarbon receptor (AhR) pathway, in particular through
induction of cytochrome P450 1A (cyp1a) (Billiard et al., 2002; Otte et al., 2010).
Long-term exposures to sublethal concentrations of PAHs have been shown to
dramatically impair survival and physiology of exposed fish and their progeny (White et al.,
1999). Some PAHs are potent mutagens (Mersch-Sundermann et al., 1992), and many are wellknown carcinogens both in laboratory and environmental conditions (Hawkins et al., 1990; Myers
et al., 1991). Elevated prevalence of hepatic neoplasms has therefore frequently been reported in
fishes from heavily PAH-contaminated environments (Baumann, 1989). Additionally, their major
role is suspected in the aetiology of human cancer following
exposure to cigarette smoke, urban air pollution, coal combustion, and certain occupational
situations (Mastrangelo et al., 1996; Warshawsky, 1999).
269
Various small aquarium fish, like zebrafish, have been utilized as carcinogenesis models (Stanton,
1965). In comparison to many rodent species (Ward, 1981), advantages of zebrafish include
heightened sensitivity to carcinogens with a very low background tumour rate (Reddy et al.,
1999a). Due to their short generation time, studies can be conducted near the life span of the
individuals in about 12 months (Hawkins et al., 2003), an invaluable advantage in long-term
studies that involve environmentally realistic exposures. The potential of zebrafish as a model for
cancer research has been emphasized by the demonstrated similarities of transcriptome profiles
between carcinogen-induced tumours in zebrafish and human cancer (Lam et al., 2006). Other
advantages include small size of adults that is compatible with a complete histological
examination of all organs and tissues in a few sections without bias of a selective tissue sampling.
While individual prototypical compounds like dimethyl-benz[a]anthracene (DMBA) and
benzo[a]pyrene (BaP) have been intensely researched to date, there is a need to study mixtures of
PAHs currently encountered in environmental situations under tightly controlled experimental
conditions. Most previous laboratory studies in fish were conducted with dissolved PAHs
(Jonsson et al., 2004) or PAHs in sediments (Cachot et al., 2007). Dietetary exposure to PAHs has
been rarely explored to date (Rice et al., 2000; Wessel et al., 2010), especially when considering
carcinogenic effects. In this context, Spitsbergen et al. (Spitsbergen et al., 2000a) chose to explore
the long-term carcinogenic effects of high concentrations of one model PAH, DMBA, regarded as
one of the most potent known PAHs together with dibenzo[def,p]chrysene.
The aim of this study was to document carcinogenetic and genotoxic effects induced under
environmentally relevant conditions of PAH exposure in terms of mixtures (composition and
concentration), and kinetics (from the first meal and maintained afterwards).
PAH-contaminated diet preparation
Three aromatic fractions were used for exposures: i) a pyrolytic fraction (PY) extracted
from sediments collected from a polluted site in the Seine Estuary (Oissel, France), and ii) two
petrogenic fractions obtained from Erika fuel (heavy oil; HO) and Arabian light crude oil (LO).
PAH extractions were performed as previously described (Cachot et al., 2007; Letellier et al.,
1997). Briefly, contaminants were extracted from sediment by accelerated solvent extraction
(ASE300, Dionex). The two oils were dissolved in pentane to induce asphaltene precipitation
(Mazeas and Budzinski, 2001, 2002). The sediment extract and the two pentane extracts were then
reconcentrated using a vacuum evaporation system (Rapidvap, Labconco, Kansas city, USA). All
270
three extracts were then purified using alumina columns (preparative liquid chromatography) and
eluted with dichloromethane (Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, Geel, Belgium). After
another re-concentration step, aliphatic fractions obtained after elution on silica columns with
pentane were discarded and aromatic fractions were obtained using pentane/dichloromethane
(65/35, v/v) as solvents (Mazeas and Budzinski, 2001, 2002). Finally, samples were reconcentrated and the final fractions kept in dichloromethane (stored at -20 °C) for spiking
experiments. PAH concentrations of the three fractions were reported by Vignet et al.((Vignet et
al., In press); supplementary table 1).
Diets were prepared using the commercial diet INICIO Plus 0.5 (Biomar, France). INICIO
Plus 0.5 is made of fish oil and flour and some plants extracts. According to producer its
composition is as follows: raw proteins 58 %, raw lipids 15 %, non-nitrogenous extract 10.6 %,
raw cellulose 0.4 %, ashes 11 % and total phosphorous 1.6 %. Vitamin A (9000 U.I/kg), vitamin E
(350 mg/kg) and vitamin C (1000 mg/kg) were added. Food pellets were ground to obtain ageadapted pellets and spiked with PAH fractions. Three concentrations, 0.3X, 1X and 3X, were used
with the 1X concentration corresponding to 5 µg.g-1 for the sum of concentration of 16 indicator
PAHs selected by the US Environmental Protection Agency (US-EPA). This 1X concentration
was representative of that found in molluscs in the Seine Estuary (Rocher et al., 2006). Diets were
named after the origin of the fraction and its concentration: 1X pyrolytic fraction diet was named:
PY-1X.
Fish exposure and sampling
This study was conducted with the approval of the Animal Care Committee of France
under the official licence of M.-L. Bégout (17-010). We used zebrafish wild type TU strain (ZFIN
ID:
76
ZDB-GENO-990623-3),
which
was
established
at
our
laboratory
(PEP –
http://wwz.ifremer.fr/pep) six years ago as large batches of individuals originating from the
Amagen platform (Gif-sur-Yvette, France) and the Pasteur Institute fish facility (Paris, France).
Detailed exposure procedures are described by Vignet et al. (Vignet et al., In press).
Briefly, eggs were obtained by random pairwise mating of zebrafish placed together in spawning
boxes the evening before collection (AquaSchwarz, Göttingen, Germany). Eggs were collected the
next morning and the fertilisation rate assessed within two hours of collection: only spawns with
rates above 80 % were kept. To provide as homogeneous and similar incubation conditions as
possible, a minimum of five spawns were mixed and 50 embryos randomly sampled and
transferred to as many Petri dishes as required for all conditions. Exposures to PY, HO and LO
271
fraction spiked-diet were performed independently and successively in triplicates. For each
exposure, a fourth control condition was included corresponding to the plain food treated as
spiked-food with dichloromethane, used as carrier solvent for PAHs spiking. Embryos and larvae
were maintained at 28 °C in Petri dishes in clean medium in an incubator with the same
photoperiod as for adults. From 5 days post-fertilisation (dpf), larvae from each replicate were
reared in separated 1 L-tanks and transferred after 12 days in 10 L-tanks in a flow-through system
with a water renewal increasing with age and reaching a daily rate of 40 % after 1 month. Starting
at 5 dpf, fish were fed twice a day with size-adapted food and once a day with uncontaminated
Artemia nauplii. The size of the food pellets provided was increased as the fish aged. The ration
was ad libitum from 5 dpf until the first biometric measures (2 or 3 months post-fertilisation
(mpf)); thereafter, the quantity of food provided was 2 % of the biomass in each tank, with the
exception of the PY-spiked food, for which the ration was 5 % at 2 mpf and then reduced to 2 % at
3 mpf. Biomass was monitored on a monthly basis as described previously (Vignet et al., In
press). Rations were then adapted after each biometric analysis.
In the case of samplings dedicated to comet, EROD and micronuclei assays, fish were
starved overnight and day of sampling as described below. In the case of genes expression
monitoring in larvae, a specific feeding procedure was used as described below.
Survival monitoring
Survival was monitored daily from 5 to 30 dpf and then on a monthly basis as described by
Vignet et al. (Vignet et al., In press). The present study focused on fish older than 3 mpf and
survival was calculated as a percentage of the starting number of fish for each exposure.
Histopathological evaluation
Fish were sampled at 3 mpf and 9-10 mpf for all diets except for HO-3X for which the last
sampling was 7 mpf. Additional samplings were performed at 7 mpf for HO-0.3X and HO-1X and
at 14 mpf for PY diets. Control fish were systematically sampled in parallel. Fish were euthanized
with a lethal dose of benzocaine (250 µg.L-1; Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) and
fixed in 4 % formalin after ventral incision of the abdomen for larger individuals (Daouk et al.,
2011). A histopathological evaluation was performed on a total of 760 fish from 3 mpf to 14 mpf
(mean sex ratio of 0.52) (Table 1). The principles of step sectioning adult zebrafish have already
been published (Spitsbergen et al., 2000b). After 24 h of fixation, fins, most scales and the caudal
peduncle were carefully removed and samples were dehydrated in graded ethanol solutions and
272
embedded in paraffin. Serial sagittal step sections were cut from the left side of the fish. Four step
sections from each adult fish were mounted on glass slides, 1 from eye anterior chamber level, 1
from eye posterior chamber level, 1 just medial to the eye, and 1 at the midline. Sections were
routinely stained with haematoxylin-eosin-saffron (HES). Additional sections were stained with
Ziehl-Neelsen acid-fast stain for mycobacteriosis, Hall’s bilirubin stain and Picrosirius red stain
for collagen.
Table 1 : Incidence of preneoplastic and neoplastic lesions in zebrafish dietary exposed to
4concentrations and 3 fractions of PAHs
Immunochemistry assays were performed using i) a mouse anti-cytokeratin (CK) antibody
(Dako, Glosdrup, Denmark; 1:500) for cells of epithelial origin or ii) a mouse Proliferating Cell
Nuclear Antigen (PCNA) antibody (clone PC10, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA; 1:3000) as a
proliferation marker. Briefly, paraffin-embedded sections were deparaffinised and subjected to
antigen retrieval respectively in Tris-EDTA pH 9.0 buffer (Zytomed Systems GmbH, Berlin,
Germany) (98 °C, 40 min) and in boiling 10 mM citrate buffer (pH=6.0) for 20 min. Endogenous
peroxidase activity was inhibited by incubating the samples in 3 % H2O2 in water for 10 min. The
sections were then incubated for 30 min with 10 % normal goat serum (Dako). Primary antibody
was incubated in 2 % BSA (Sigma, St. Louis, USA) for 1 hour at 37 °C and revealed using
273
successively biotinylated secondary antibody (Dako, 1:300), streptavidin-peroxidase complex
(Dako, 1:300) and 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB, Dako).
All lesions were reported by a skilled pathologist certified by the European College of
Veterinary Pathology. A minimum of four tissue sections per fish were observed to ensure the
observation of all tissues and organs. Due to the high occurrence of bile duct abnormalities, a
semi-quantitative scoring was performed for all fish except those for which none bile ducts were
visible on the all four sections. A score reflecting biliary pericanalar fibrosis (0, no lesion; 1, some
collagen deposit of less than 5 µm thick; 2, collagen deposit of less than 10 µm thick; 3, severe
continuous collagen deposit; 4, fibrodysplasia) and a score reflecting severity of the bile duct
epithelium lesions (0, no lesion; 1, hyperplasia; 2, dysplasia; 3, epithelio-mesenchymal transition;
4, carcinoma) were attributed.
Comet assay
For measurement of DNA strand breaks by the alkaline comet assay, 2 mpf-fish were
sampled from each control and assay tank (3 fish per tank) to assess the level of DNA damage in
erythrocytes. Due to the small size of the fish, whole fish head was sampled and placed directly
into 500 µL of a freezing medium. The freezing medium made of RPMI 1640 supplemented with
DMSO 20 % and SVF 25 % was then withdrawn in a 1 mL cryotube and stored in liquid nitrogen
prior to analysis.
According to a previously described protocol (Akcha et al. 2003), two slides per fish were
prepared with 10 µL of sample mixed with 75 µL of low melting point agarose (LMP). Once the
last LMP agarose layer was deposited and polymerised, the slides were immersed in an ice-cold
lysis buffer (2.5 M NaCl, 0.1 M EDTANa2, 0.01 M Tris base, 1 % N-sarcosinate, 10 % DMSO,
1 % Triton X-100, pH=10) for 1 h at room temperature in the dark. DNA unwinding was then
performed by pre-incubating the slides in electrophoresis buffer (0.3 M NaOH, 0.001 M EDTA,
pH=13) for 20 min at room temperature in the dark. DNA migration was performed in the same
buffer for 12 min at 23 V (390 mA, E=0.66 V.cm−1). Slides were then washed, dehydrated and
dried. Just before analysis, 75 µL of Gel Red (1:10,000) were spread on the slide for at least 1 h at
4 °C for coloration. Slides were then analysed using an optical fluorescence microscope (Olympus
BX60, x40) fitted to a CDD camera (Luca-S, Andor Technology) and an image analysis system
(Komet 6, Kinetic Imaging Ltd.). The percentage of DNA present in the comet tail was calculated
for each observed nucleus (50 nuclei per slide).
274
Micronuclei assay
Micronuclei (MN) assay was performed on haemocytes from eight to nine month-old
zebrafish. Twelve to fifteen fish (four to five per replicate) from each control and assay tank were
individually analysed. For HO, because of the high fish mortality observed in the highest
concentration, only control, 0.3X, and 1X concentrations were examined.
Fish were anesthetised by immersion for 10 min in benzocaine solution (50 mg.L-1).
Caudal peduncle was cut using a clean razor blade and between 1 and 5 µl of blood were collected
from the caudal vein with a clean and heparinised 10 µl-micropipette tip. Blood (1 µl) was then
smeared on a clean slide, air dried and then fixed in absolute ethanol for 15 min. Just before
reading, slides were stained with 40 µL acridine orange solution (0.003 % in PBS) and covered
with a glass slip. Reading was conducted using an epifluorescent microscope at 400x
magnification (Olympus, Rungis, France). Micronucleated cell frequency was manually recorded
from 1,000 cells per slide using blind review by a single observer. A cell was considered
micronucleated if MN was round shaped, distinct from main nucleus, less than third of the size of
the main nucleus, and with a similar green staining to the main nucleus (Hayashi et al. 1998).
Non-isolated, stacked, more than bi-nucleated or orange-red stained cells were not taken into
account.
EROD activity
EROD activity was measured for 3 to 4 individual 2 mpf-fish per tank, according to a
previously published protocol (Burgeot and Menard, 2004). Briefly, whole fish were crushed in a
Potter cylinder with 5 volumes of phosphate buffer. After centrifugation for 20 min at
9000 G, the kinetic of resorufin formation was measured on the supernatant fraction after addition
of 7-ethoxyresorufin (2 μM) and NADPH (0.25 mM) in a 96-well micro-plate with a
spectrofluorimeter (TECAN Safire, Lyon, France). Proteins were measured by the Bradford
method and results were expressed as fmol/min/mg protein.
Kinetics of cyp1a and ahr2 genes expression
To assess whether a rapid metabolization of PAHs that would minimize genotoxicity
occurred after each meals, we characterized the kinetics of ahr2 and cyp1a expression in relation
with time of dietary exposure to PAH mixtures. A specific starvation/feeding assay was then
performed with PY-3X diet: at 13 dpf, larvae were transferred in clean water (without food) and a
275
24 h starvation period was carried out. At 15 dpf (30 min after the onset of light), one part of
larvae was fed again and pools of 20 larvae were sampled after 1, 2, 4, 6, 8, 10 and 24 hours postrefeeding (hprf). Before this diet, 20 larvae were sampled to establish the basal level of cyp1a and
ahr2 at 0 hprf. The remaining part of larvae was kept starved and sampled after 10 and 24 h. As a
control, an assay with the control diet was performed in parallel. Finally, larvae were euthanized,
pooled, transferred in liquid nitrogen and stored at -80 °C until analysis.
Total RNA was extracted from larvae samples using Trizol® Reagent (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) with successive chloroform/ethanol purifications following manufacturer’s
instructions. Then, first-strand cDNA was synthetized with a standard reverse transcription
procedure from total 1 µg of RNA using M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison,
USA) according to manufacturer’s instructions. Finally, real-time PCR reactions were performed
in sterile 96-wells PCR plates with StepOnePlus™ instrument (Applied Biosystems®, Life
Technologies, USA) using reaction fraction based on the Fast SYBR® Green Master Mix 5X
(Applied Biosystems®), and primers at 600 nM. The thermal cycling conditions were following:
10 min at 95 °C (activation), 15 s at 95 °C (denaturation), 40 s at 60 °C (hybridization) and 30 s at
72 °C (annealing) for 40 cycles. Gene’s expression levels of cyp1a and ahr2 were quantified by a
comparative method from threshold cycle (CT) number and normalized from three housekeeping
genes (eef1, g6pd and β-actin). Primer sequences of target genes were designed with Primer3
software (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/; Table 2).
Table 2 : Specific primer sequences for target genes measured by real-time PCR
Unless otherwise mentioned, reported results are means ± SEM. All statistical analyses
were carried out at a 95% level of significance. Differences in survival were assessed within each
diet using Log-rank (Mantel-Cox) test using Prism (Graphpad) software. Statistical analyses of
histopathological results were performed with Statistica 9.0 software (Statsoft, Tulsa, OK, USA).
A GLM model was applied with age or PAH fraction tested as fixed factors, replicate, tank
and gender as random ones. Only results for fixed factors and for the interaction between them are
presented in the text. Post-hoc tests were performed using Newman-Keuls in each case. No tank
276
effect was detected and an individual effect was only detected on tumour incidence at 3 mpf and
on presence of epithelium dysplasia in LO-exposed fish. Global incidences, i.e. proportion of fish
presenting duct epithelium dysplasia, pericanalar fibrosis or duct carcinomas, were analysed using
chi-square test.
Raw comet data were Ln transformed to reach normality and then analysed by a one wayANOVA with Statistica Software. For micronuclei assay, comparisons of mean frequency were
performed using one-way ANOVA after checking for normal distribution of data (Shapiro-Wilk’s
test on 1 % residues) and variance homogeneity (Levene’s test).
Gene expression data were analysed with a Relative Expression Software Tool REST-2009©
(Qiagen, http://www.REST.de.com). At 0 hprf, PY-3X data was given in relative expression ratio
compared to the control condition. For other analysed times, relative expression of the fed larvae
was compared to that of the starved ones.
Results
This work is part of a larger program that included analysis of other effects following
exposure to the same diets. Chemical analysis of fractions, diets and metabolites are presented
elsewhere (Vignet et al., In press). Briefly, PY fraction was characterized by a high proportion of
heavy PAHs and almost no substituted derivatives. HO fraction contained moderate levels of
heavy PAHs and alkylated derivatives. LO fraction contained low level of heavy PAHs and a high
level of alkylated ones. The content of PAHs in the diet reflected the composition of PAHs in the
different fractions (Supplemental table 2). The concentration of the 16 US-EPA PAHs in 1X diets
were PY-1X: 4,505 ± 1,527, LO-1X: 2,739 ± 231 and HO-1X: 1,887 ± 130 ng.g-1dry weight, and
the total concentration of PAHs (included alkylated ones) was similar in the three 1X diets:
5816 ± 1433, 4663 ± 360 and 6726 ± 278 ng.g-1for PY, HO and LO respectively. Quantification of
hydroxylated metabolites in 15 dpf-larvae confirmed fish contamination and results were
consistent with diet composition.
Mortality
Survival was assessed separately for each PAH fraction using Log-rank (Mantel-Cox) test
(Figure 1). No difference was observed between concentrations for PY fraction (Chi-square
value=0.80; p=0.849). For HO and LO diets, survival curves were different between
concentrations (respectively Chi-square value=36.30; p<0.0001 and Chi-square value=13.86;
p=0.003). In the absence of a post-hoc test, it was difficult to separate differences for LO diet. In
277
the case of HO, survival of fish exposed to HO-3X was clearly than in other treatment groups
starting at 3 mpf. Due to the high mortality observed in fish fed with HO-3X fraction, we decided
to anticipate the sampling of fish fed with HO to 7 mpf instead of the 9 mpf initially planned in
order to avoid the risk of the complete loss of a treatment group. All HO-3X remaining fish and 25
fish from other HO concentrations were then sampled at 7 mpf to allow comparisons.
278
Figure 1: Survival of adults after exposure to PAH fractions. Kaplan-Meier survival plots
are presented indicating survival rates for each fraction and concentration. Note that because
of the high mortality occurring in the HO exposure, all the remaining HO-3X fish were sampled
for histology analysis, at 6 mpf. This explains why the curve stops at 180 days. Log-rank (MantelCox) test indicated significant differences for HO survival rates (Chi-square value=36.30;
p<0.0001) and LO (Chi-square value=13.86; p=0.003) but not PY (Chi-square value=0.80;
p=0.849)
279
Global incidence of preneoplastic and neoplastic lesions
A total of 264, 258 and 238 fish fed during 3 to 14 months with a diet containing
respectively PY, HO or LO at 4 concentrations (3 PAH concentrations and one control condition),
were examined microscopically after sectioning and HES staining. Liver was the primary target
organ in PAH contaminated zebrafish with recorded lesions in hepatocytes and bile duct epithelial
cells. In addition to liver, neoplasia also occurred in testis, intestine and pancreas, although at a
relatively low frequency (Table 1).
Some dissimilarity regarding tumour incidences were identified between PAH fractions (Figure 2,
left panel). Neoplasm incidences significantly increased with time of exposure to HO and LO
(respectively F=11.92; p<0.001 and F=27.26; p<0.001) but not to PY (Figure 2), and with
concentration of PY (F=5.07; p=0.002), HO (F=11.34; p<0.001), and LO (F=18.57; p<0.001).
There was an interaction between time and concentration in HO (F=3.09; p=0.010) and in LO
(F=8.06; p<0.001). Considering in more details the evolution of carcinogenesis, at 3 mpf, we
observed neoplasms in PY-3X, LO-0.3X, -1X and -3X (Table 1) with a significant effect of the
concentration (F=6.45; p<0.001) but not of the fraction. At this time point, the number of tumour
was significantly higher in PY-3X than in HO-3X (p=0.015). Due to the high mortality recorded
all along the study in the HO-3X group, experiment was stopped in this group at 7 mpf, a time
when neoplasm incidence had reached 33 % (8 out of 24). At 9 mpf, all concentrations considered,
17 % (5 out of 29) and 72 % (21 out of 29) of fish exposed to PY and LO respectively displayed
neoplasm compared to 4 % (3 out of 82) in the control fish groups. An effect of the fraction
(F=9.13; p<0.001), of the concentration (F=18.08; p<0.001) and an interaction between
concentration and fraction (F=6.18; p<0.001) were identified at this time point. In the absence of
data for HO-3X group at 9 mpf, we demonstrated a significant carcinogenic effect for HO-1X and
LO-3X diets compared to control (p=0.003 and p<0.001) and a higher carcinogenic effect for LO3X compared to PY-3X and for HO-1X compared to PY-1X (respectively p<0.001 and p=0.002).
The carcinogenic effect of LO-1X was intermediate and could not be differentiated statistically
from that of PY-1X or from HO-1X.
280
Figure 2 : Neoplasm incidence (left panel) and biliary epithelium mean score (right panel) of
zebrafish exposed to various concentrations and fractions of PAHs. Mean scores are mean ±
SD. Different letters indicate that values differ significantly (p <0.05)
281
Nature of preneoplastic lesions
- Hepatocellular alteration foci
For consistency, only foci of cellular alteration (FCA) of more than 10 hepatocytes were
considered and classified upon their staining with HES as eosinophilia, clear cell and basophilic
foci (Figure 3). 5.5 % (11 out of 199), 5.0 % (9 out of 180) and 2.8 % (5 out of 176) FCA were
identified after PY, HO or LO exposure, respectively, all concentrations considered (Table 1). The
global incidence in control groups was 2.2 % (4 out of 182). No significant effect of gender, age or
type of fraction could be identified on FCA incidences. Clear cell foci were globally more
frequent (60 % of all observed FCA) and consisted of pale, finely vacuolated hepatocytes with
granular cytoplasm. Eosinophilic foci (24 % of all FCA) appeared as round or irregular sharply
delineated foci of hypereosinophilic slightly enlarged hepatocytes. Basophilic foci (16 % of all
FCA) appeared round and consisted of clusters of smaller hepatocytes with hyperbasophilic or
amphophilic cytoplasm.
Figure 3 : Hepatic parenchyma of zebrafish exposed to various concentrations and fractions
of PAHs. (a) Normal hepatic parenchyma of a control fish exposed to control. (b) Clear cell foci
of cellular alteration (FCA) in a fish exposed to PY-0.3X, 14 mpf. (c) Eosinophilic FCA in a fish
exposed to PY-3X, 9 mpf. (d) Basophilic FCA in a fish exposed to LO-3X, 3 mpf. (a-d)
Haematoxylin-Eosin-Saffron. Bars = 100 µm (a, b, c) or 50 µm (d)
- Biliary epithelium lesions
A systematic scoring of biliary epithelium lesions was performed. Bile duct epithelium
appeared normally (score=0) as a monolayered cylindrical or cuboidal epithelium with a very low
proliferation activity as assessed by PCNA labelling (Figure 4, a-b). Bile duct hyperplasia
(score=1) was a common finding in all zebrafish and consisted of an increased number of welldifferentiated bile ducts with a typical epithelium displaying higher number of mitosis than in
normal ducts (Figure 4, d-e). The number of fish displaying hyperplastic bile ducts was stable
between 3 and 9-10 months in control groups (34 % for both time points) while the number of fish
with a higher score slightly increased from 3 to 18 %. In contaminated fish, the number of fish
with a score of 1 slightly decreased from 34 % to 26 % during this time period, with a parallel
282
global increase from 24 % to 62 % in the number of fish with a higher score. Microscopically,
dysplastic epithelium (score=2) appeared as a multi-layered and irregularly stratified epithelium
and consisted of cells displaying pleomorphic, anisocytosis, anisokaryosis and high nucleocytoplasmic ratio (Figure 4, g). Number of mitotic cells was focally increased (Figure 4, h). In
some samples displaying a dysplastic and highly proliferative duct epithelium, a few cells
appeared elongated with loose intercellular bounds (Figure 4, j-k). They reached individually the
pericanalar stroma through the basal membrane (Figure 4, l) that is highly evocative of epitheliomesenchymal transition (score=3). A mean biliary epithelium score was calculated for each group
(Figure 2, right panel). No significant effect of the fraction could be detected at 3 mpf in fish
exposed to PY and HO but score of fish exposed to LO-1X and LO-3X were significantly
increased compared to control. At 7 mpf, a significant effect of the exposure to HO was identified
for all concentrations compared to control. From 9 mpf, the mean score ranged between 0.1 and
1.2 in control animals and contrasted with the ones calculated in exposed animals, ranging
between 1.3 and 3.4 (Figure 2). At 9-10 mpf, a significant effect of the fraction (F=10.19;
p<0.001), and the concentration (F=38.83, p<0.001) was demonstrated with an interaction
between both factors (F=2.32; p=0.044). The relative potency could be summarized as follow:
LO-3X > PY-3X, HO-1X> PY-1X and LO-1X > PY-1X (p<0.001, p=0.002 and p=0.002
respectively) while potency of HO-1X and LO-1X could not be distinguished. At 14 mpf, an effect
of PY was identified for all concentrations compared to control.
- Cholangiofibrosis
Bile duct epithelium lies normally on a basal membrane surrounded by scant connective
tissue (Figure 4, c). In our study, the amount of connective tissue around bile ducts was frequently
increased as evidenced in HES sections (Figure 4, left panel) and this thickening was associated
with the presence of several fibroblasts with a large euchromatic and nucleolated nucleus
indicative of their active state. The collagenous nature of this densified tissue was confirmed with
a specific Picrosirius red stain (Figure 4, right panel). The number of fish displaying mild to
marked pericanalar fibrosis in control groups increased with time from 15 % at 3 mpf to 43 % at
9-10 mpf. Pericanalar fibrosis also increased following exposure to all contaminated diets from
between 11 and 55 % to between 37 and 100 % at the same time points (Table 1). Significant
effects of both the fraction, the concentration and an interaction between them were identified at
3 mpf (F=3.52, p=0.031; F=3.81, p=0.011; F=2.24, p=0.041, respectively) and 9-10 mpf (F=14.28,
p<0.001; F=25.47, p<0.001; F=2.87, p=0.015, respectively). Pericanalar fibrosis was shown to be
associated with bile duct epithelium dysplasia (Chi-squared test, p<0.001).
283
284
Figure 4 : Bile duct of zebrafish exposed to various concentrations and fractions of PAHs. A
semi-quantitative score (0 to 4) was attributed for each fish regarding bile duct epithelial lesions
(left panel) and proliferation activity (middle panel). A second score (0 to 4) reflected the
pericanalar amount of connective tissue (right panel). Contrasting with the normal appearance of
bile ducts (a-c), hyperplastic ducts appeared with numerous mitotic cells (d, open arrowhead and
e), sometimes surrounded with a thickened layer (*) of connective tissue (f). Dysplastic ducts were
multi-layered with cellular atypias (g) and with a mild proliferation activity (h). During epitheliomesenchymal transition, some epithelial cells appeared elongated, loosely attached to other
epithelial cells (j-k, arrowhead) and disrupting basal membrane (l, arrowhead). Bile duct
carcinomas (m) were composed of clusters and cords of neoplastic cells (arrowheads), sometimes
with tubular differentiation. The proliferation activity was very high (n). Neoplastic cells were
scattered in an abundant collagenic stroma (n, *). (left panel) Haematoxylin-Eosin-Saffron.
(middle panel) Immunolabelling of the Proliferating Cell Nuclear Antigen. (right panel)
Picrosirius red. (a-o) Bars = 10 µm
Neoplastic lesions
The nature of the 94 observed tumours is indicated in Table 1. The vast majority of
tumours were of epithelial origin except one chondroma and one intestinal stromal tumour, both of
mesenchymal origin and originating in these two cases from the intestinal wall (Table 1). Most
tumours (91 out of 94) were malignant, with visible infiltration of peripheral tissues in 50 % of
cases. These tumours are described below. Only 3 tumours were classified as benign, always
consisted of a well-demarcated mass slightly compressing peripheral tissues and were identified as
a chondroma, an adenoma of endocrine pancreas origin and a pneumatic duct adenoma.
- Duct carcinoma
Nodular proliferation of duct cells was observed in liver or more rarely in pancreas (Figure
4 and Figure 5). According to their common duct epithelium origin, we chose to indifferently call
these two neoplasms “duct carcinoma” in this report, without considering their hepatic or
pancreatic primary site. This name should more properly reflect their very similar appearance and
their high propensity to infiltrate peripheral tissues that sometimes precluded identification of the
tissue origin of the tumour. Duct cells proliferation and transformation most frequently occurred in
the anterior area of the liver near the emergence of the common bile duct. The early very invasive
behaviour and the abundance of atypias were indicative of their carcinomatous nature.
285
Figure 5 : Duct carcinoma of zebrafish exposed to various concentrations and fractions of
PAHs. (a) Bile duct carcinoma (black arrowhead), also called cholangiocarcinoma, in the liver (L)
of a fish exposed to PY-3X, 14 mpf. The tumour breached parietal peritoneum (arrows) and
infiltrated peripheral tissues. The neoplastic cells sometimes formed tubules (black arrowhead) in
a loose connective stroma rich in inflammatrory cells. Note the normal adjacent bile duct (open
arrowhead). (b) Pancreatic duct carcinoma (black arrowhead) in a fish exposed to LO-0.3X,
9 mpf. (c) Bile duct carcinoma in the liver of a fish exposed to HO-3X, 7 mpf. Cytoplasm of
neoplastic cells was positive for cytokeratin, indicative of their epithelial origin. Some isolated
neoplastic cells could be identified (arrow). (a, b) Haematoxylin-Eosin-Saffron. (c) Pancytokeratin
immunohistolabelling. Bars = 100 µm (a, b) or 50 µm (c)
Duct carcinomas formed large tumours, without significant increase in the mean size of
tumours from 3 to 14 mpf. Neoplasms were composed of disorganized clusters of atypical,
variably sized, branching and tortuous ductules and ducts often admixed with abundant
proliferating dense collagenous or myxoid stroma (Figure 4, m and o and Figure 5, a). Lining of
neoplastic epithelium was usually simple, but in some regular instance was irregularly stratified
with occasional extension through the basement membrane. Neoplastic cells could either be
cohesive and polygonal, reminiscent of their epithelial origin, or isolated and elongated with fine
cytoplasmic processes. The proliferation activity was very high (Figure 4, n). A spindle cell
proliferation around ducts was frequently associated, sometimes making it difficult to distinguish
between proliferating neoplastic ducts and a highly cellular stroma. Special staining and
immunohistochemical analysis confirmed the presence of scattered epithelial cells in the stroma,
isolated, in little clusters or forming small ductules with a collapsed lumen (Figure 5, c).
Neoplasm infiltration first occurred in the surrounding parenchyma and larger tumours in
the liver additionally extended through the hepatic capsule and invaded directly of adjacent tissues
and organs, including intestine, pancreas and spleen. The only observed form of distant metastasis
was transcoelomic after fragmentation of the primary tumour into the peritoneal cavity with
occasional implantation and invasion into abdominal fat, pancreas and peritoneal wall. No
vascular emboli or distant metastasis in tissues away from the pleuroperitoneal cavity could be
observed.
Duct carcinomas were observed in control and exposed fish from 3 to 14 mpf. Global
286
incidences ranged between 0 and 3.2 % in control fish compared to incidences of 7.4 %, 14.6 %
and 23.4 % in fish exposed to PY, HO and LO, respectively, with a significant effect of the
fraction (Chi-squared test; p=0.012, p<0.001 and p<0.001, respectively).
- Seminoma
In the present study, seminomas were the second most commonly found tumour with 7
occurrences. These tumours were observed in fish exposed to PAHs at 1X and 3X concentrations
all fractions considered. Fish age at the time of observation ranged from 3 to 9 mpf. Seminoma
were not observed in non-exposed fish and no significant difference of incidence could be
identified between the 3 PAH fractions. These neoplasms were often very large, always exhibiting
a very aggressive behaviour, invading large parts of the body cavity and infiltrating abdominal
tissues. The tumours were solid with only a few lobules containing spermatocytes and spermatids
(Figure 6). A severe inflammatory infiltration was frequently associated.
Figure 6 : Spermatocytic seminoma in a zebrafish exposed to PY-1X, 9 mpf. HaematoxylinEosin-Saffron. Bar = 50 µm
Sporadic findings
Other lesions included developmental lesions of the heart, the eyes and the organs of
reproduction. These results that were not directly related to the carcinogenic study will be reported
elsewhere (Lucas et al., Submitted; Vignet et al., In press). Some inflammatory lesions,
287
predominantly macrophage aggregates and granulomas, were sporadically found in the body
cavity or in the ovary. Embryonic nephrons that stained more basophilic than mature ones were
infrequently and undifferentially observed in exposed and control fish. Hamartoma of the
pseudobranch were observed in 2 fish, and occurred near the normal pseudobranch. This was a
well-differentiated redundant pseudobranchial tissue.
Genotoxic effects
Genotoxicity was evaluated at 2 mpf using comet assays to assess repairable DNA
damages and at 9 mpf using MN assay to assess non-repairable DNA damages.
Due to the small size of the fish exposed to the HO and LO diets at 2 mpf, blood was very
difficult to collect and, as a consequence, the number of nuclei available on the slides was too low
to detect statistically significant difference (data not shown). By applying the comet assay in fish
fed with the PY-contaminated diet, no difference in the extent of DNA damage was observed
compared to the control group (p=0.37), regardless of concentration (Figure 7).
Figure 7 : Mean tail DNA value as an indicator of DNA fragmentation level in fish exposed
to various concentrations of a pyrolytic fraction (N=12 to 15 in each group)
Micronuclei analysis was performed on blood cells of adult zebrafish fed for 9 months with
PY-, LO- or HO-contaminated diets (Figure 8). MN frequency ranged between 0.07 and 0.33 ‰
with no significant difference (ANOVA, p>0.05) between fractions. A relatively high interindividual variability was observed.
288
Figure 8 : Micronuclei frequency (‰) in haemocytes of adult zebrafish fed with PAHcontaminated diet for 9 months. No significant differences were observed between treatment
groups (ANOVA, p>0.05, N=3)
Metabolism activation and kinetics
No significant effect of the exposure to PAHs on EROD activity was detected (Tukey test)
except between control group and fish fed with diet containing HO-0.3X (p=0.020), in which
EROD activity was increased (fold-change=1.9; Table 3).
Table 3 : Mean EROD activity in whole fish exposed to 4concentrations and 3 fractions of
PAHs (N=3 to 4 in each group)
To investigate the possible consequence of sampling procedure on comet and EROD assays,
the kinetics of cyp1a and ahr2 expression after feeding were analysed on PY-3X larvae.
Expression of cyp1a was measured following a 24 h starvation period (0 hprf) of larvae exposed to
PY-3X and of control larvae (Figure 9). At 0 hprf, cyp1aexpressionwas only slightly up-regulated
in PY-3X fish (fold-change=1.3; p<0.001). This expression was highly up-regulated in refed PY3X larvae compared to starved PY-3X larvae from 2 to 8 hprf (fold-change ranged between 5.5
289
and 11.3; p<0.001). No significant difference was observed in expression levels at 10 hprf
(p=0.177). At 24 hprf, cyp1a expression was not different from the basal level (0 hprf) (p=0.325).
Figure 9 : Expression kinetics of genes in 16 dpf larvae exposed to PY-3X spiked diet
demonstrating an induction of cyp1a levels (a) and a repression of ahr2 levels (b) following
nutritional/starvation assay. Data are given in relative expression mean ± SEM. * denote
significant differences as compared to control condition at t0 and their respective starved condition
for other analysis time (p<0.001). Stars placed at the top of markers indicate an up-regulation and
below, a down-regulation
Regarding expression of ahr2, no significant change in transcript abundance was observed
after a contaminated refeeding from 0 to 4 hprf (p=0.346, p=0.325, p=0.825 and p=0.325) and
from 10 to 24 hprf (p=0.830 and p=0.177). However, ahr2 expression was 0.9-fold repressed in
refed PY-3X larvae at 6 and 8 hprf respectively (p<0.001).
290
Discussion
Despite numerous toxicological studies focusing carcinogenetic effects of individual
PAHs, little is known about effects of long-term dietetary exposure to PAHs as mixtures
containing hundreds of molecules that are effectively encountered in environmental situations. In
this aim, the use of wild-caught fish is not fully satisfying as many other factors could intefere.
The aim of the present study was to document in controled experimental conditions carcinogenic
and genotoxic effects induced by exposure to environmentally relevant mixtures of PAHs from the
first meal and maintained afterwards.
Neoplasm incidences
In order to exhaustively describe here all preneoplastic and neoplastic lesions and
characterize the full range of carcinogen responsiveness of all tissues, serial step sections of the
entire body of exposed and control zebrafish were observed microscopically. To date, descriptive
studies of chemically induced tumours in zebrafish have frequently omitted to report complete
data concerning fish strain, fish age or spectrum of investigated tissue. Additionally, naturally
occurring tumours in zebrafish have only been identified in a few published works (Smolowitz et
al., 2002; Spitsbergen et al., 1997; Spitsbergen et al., 2012). This information would be useful to
compare results between carcinogenesis studies. Reported incidences of spontaneous neoplasia in
zebrafish colonies must therefore be taken cautiously but always seems to be relatively low,
evaluated to approximately 1 % (Spitsbergen et al., 1997). An incidence of 4 % was found in our
control fish, which is also a low basal level in the context of a distinct genetic background. Indeed
albeit being established as TU colony, some sporadic leopard or longfin phenotypes were
observed suggesting that some Tupfel (TL) genetic background has been introduced at some time.
After chronic exposure of seven or more months to PAH fractions, incidences of neoplasia
ranged from 17 % to 72 % with the lowest carcinogenic effect observed with the PY fraction and
the highest with the HO one. A clear concentration-effect relationship was additionally
demonstrated for all tested fractions. As a comparison with two of the most potent PAHs
characterized to date, a maximal incidence of 23 % of zebrafish developing neoplasia was reported
after dietary exposure to 1,000 ppm of DMBA for 12 weeks from 2 months of age (Spitsbergen et
al., 2000b) and no increase of the incidence with time. In the present study, the carcinogen
exposures started during the very early highly sensitive stages in the life of zebrafish whereas
previous dietary studies published by Spitsbergen et al. (Spitsbergen et al., 2000b) did not begin
291
exposures until fish were juveniles of two months of age. Medaka or even trout are believed to be
more sensitive to carcinogenic effects under similar conditions retaining carcinogen sensitivity in
dietary studies begun later in life (Reddy et al., 1999a).
Effect latency
Several times of exposure were documented here for the first time. The survival was
decreased as soon as 3 mpf in the high concentration group of fish exposed to HO, confirming the
already observed higher toxicity of this fraction (Le Bihanic et al., 2014a; Le Bihanic et al.,
2014b; Vignet et al., In press). Effect on survival was detected later, at 5 mpf, in fish exposed to
LO and no effect on survival was identified in fish exposed to PY. Regarding tumours, neoplasms
were observed as soon as 3 mpf only after exposure to the highest level of PY or LO.
Target tissues and cells
In the few published data, the most commonly reported spontaneous neoplasms in
zebrafish are epithelial, including seminoma, adenoma of exocrine pancreas and hepatocellular
adenoma and less frequently intestinal adenocarcinoma (Smolowitz et al., 2002; Spitsbergen et al.,
2000b). In our study, a large majority of neoplasms were tumours of epithelial origin and
corresponded mainly to duct carcinomas and to seminomas. Mesenchymal tumours were very few
as previously reported (Spitsbergen et al., 2000b).
Our study identified liver as the main target organ after a chronic dietary exposure to
PAHs. This is in accordance with other reports identifying liver tumours (including those derived
from hepatocellular, bile duct, blood vessel and Kupffer cells) as predominant following exposure
of various fish species to DMBA or BaP (Bailey et al., 1996; Bailey et al., 1984; Bunton, 1996;
Fong et al., 1993; Hendricks et al., 1985; Reddy et al., 1999b; Wills et al., 2012). Rare gastric
tumours were additionally observed with lower incidence in rainbow trout (Fong et al., 1993) and
similarly, very few intestinal tumours were recorded here in the agastric zebrafish. In PAHcontaminated sites, a high prevalence of hepatic preneoplastic or neoplastic lesions was also
reported in mummichog (Fundulus heteroclitus) (Vogelbein et al., 1990), North American winter
flounders (Pleuronectes americanus) and European flounders (Platichthys flesus) (Cachot et al.,
2013; Murchelano and Wolke, 1985, 1991).
The predominance of duct carcinomas of hepatic origin described here contrasts with the
neoplasm incidences reported by Spitsbergen et al. (Spitsbergen et al., 2000b) in juvenile zebrafish
dietary exposed to DMBA from 2 mpf for 4 months (500 to 1,000 ppm). In this last study,
292
intestinal and gill neoplasms were identified with respective incidences of 7 and 4 %. Only three
duct carcinomas, originating from the pancreas, and no liver neoplasm were observed. The main
distinctive parameters of this study, which were age of onset of exposure and nature of the PAH,
may explain the discrepancy in target tissues (Spitsbergen et al., 2000a). However, the influence
of the genetic background of our fish colony and the aquaculture systems used in our facility
cannot be ruled out as a contributing factor to these differences either. Indeed, as indicated
previously, it is likely that some TL genetic background contaminated the TU line used in this
study. The TL line, which has been shown to have a high rate of spontaneous bile duct hyperplasia
as observed here (Kent et al., 2012; Spitsbergen et al., 2012) may have a higher sensitivity to
biliary neoplasia upon exposure to carcinogens than the wild-type line used by Spitsbergen et al
(Spitsbergen et al., 2000a). In liver, in addition to bile duct tumours, FCA were sporadically seen
in our study but their generally low incidence precludes any correlation with the exposure to
PAHs. No liver adenoma or hepatocarcinoma was observed although FCA is considered to
represent a morphological appearance associated with the progression of hepatic neoplasia in
rodents and fish (Boorman et al., 1997; Hendricks et al., 1995; Hobbie et al., 2012; Thoolen et al.,
2010). In mummichog subjected to acute aqueous expositions to BaP, incidences of both FCA and
hepatocellular carcinomas have been described to be increased (Wills et al., 2012).
The histologic appearance of tumours in zebrafish is similar to that of the human
counterpart, including increased frequency of mitosis and atypical nuclei (Goessling et al., 2007).
A comparison of the human and zebrafish genomes reveals the conservation of cancer-relevant
oncogenes, tumour suppressor genes, and cell cycle genes (Amatruda et al., 2002). The histologic
similarity and genetic conservation suggests that the genetic mechanisms underlying
carcinogenesis in zebrafish may be highly similar to those in humans. A recent study compared
the gene expression signatures in chemically induced liver tumours in zebrafish to human
hepatocellular carcinoma (Lam et al., 2006). Another study analysed deregulation of genes
involved in cell cycle, apoptosis, DNA repair, and metastasis in zebrafish liver tumours and
revealed that the genetic changes in both species were significantly correlated (Goessling et al.,
2007).
Carcinogenesis mechanisms
The carcinogenic mechanisms implicated in duct tumour progression were not elucidated
here despite several investigations. In particular no evidences of repairable or irreversible DNA
damages were observed. Unfortunately, genotoxic effects were only documented in haemocytes
293
due to their higher accessibility for sampling using comet and micronucleus assays. We cannot
rule out 1) the occurrence of DNA damages such as DNA-adducts and 2) that DNA damages may
have occurred in other tissues, particularly in bile ducts whose cells displayed preneoplastic
lesions correlated to the fraction and the dose of exposure and from which most neoplasms
derived. Indeed, PAHs are known to be bioavailable and quickly metabolized by fish hepatic
enzymes as confirmed here by the kinetic of cyp1a expression after feeding, or as shown by other
studies, by the rapid production of biliary PAH-metabolites after exposure (Le Dû-Lacoste et al.,
2013; Wessel et al., 2010). Among these metabolites, 3-hydroxybenzo[a]pyrene is believed to be
one of the most genotoxic (Aas et al., 2000; Brinkmann et al.; Le Dû-Lacoste et al., 2013;
Ruddock et al., 2003). Several studies have also reported the genotoxicity of compounds such as
nitrogen-, sulfur- and/or oxygen-containing PAHs or their alkyl substituted analogues (Binet et al.,
2002; Burczynski and Penning, 2000; Francioni et al., 2007; Ramos de Rainho et al., 2013).
Albeit having different composition, all three fractions tested had a significant genotoxic
potential suggesting the involvement of different compounds. In the case of the PY-contaminated
diet, genotoxicity may have been driven by high molecular weight PAHs such as BaP, and of
which metabolites were quantified in larvae exposed to this diet (Vignet et al., In press).
Regarding the LO-contaminated diet, genotoxicity should rather be due to the high level of
alkylated PAHs as genotoxicity of these compounds and their metabolites have already been
documented (Burczynski and Penning, 2000; Francioni et al., 2007). As for HO-contaminated diet,
it displayed high levels of both heavy PAHs, including BaP, and methylated ones. Additionally
the role of compounds that were not quantified here cannot be excluded as contributing factors as
some recent studies identified previously uncharacterized polar contaminants such as nitro-PAHs,
aromatic amines and sulfur compounds as important contributing factors to the mutagenicity of
PAH fractions (Amat et al., 2004; Di Giorgio et al., 2011; Wahidulla and Rajamanickam, 2010).
Regarding other compounds, aromatic fractions were prepared with methods excluding the copurification of heavy metals, and thus, contribution of heavy metals to the observed effects can be
excluded. PCBs and some other organic compounds are copurified with PAHs, but there were no
PCBs in the petrogenic fractions. For the PY fraction extracted from Oissel sediment, previous
reports indicated that PCBs were present at very low concentrations (∑PCBs=70 ng.g-1 and
dioxin-like congener CB118=8.4 ng.g-1 (Cachot et al., 2006). We therefore concluded that the
carcinogenic effects reported here were primarily due to the PAHs present in the different
fractions.
The chronic exposure of bile duct cells to some of these compounds may be responsible for
their higher rate of proliferation depicted in the present study but also for the formation of DNA
294
base oxidation or DNA adducts resulting in the induction of neoplasms originating from these
specific cells. Noteworthy, genotoxicity assessed by the comet assay was demonstrated to be
higher in trout larvae exposed for 10 days to HO fractions compared to larvae exposed to LO or
PY fractions (Le Bihanic et al., 2014b). This result would be in accordance with the higher
carcinogenic potency of the HO fraction highlighted in the present study.
Direct alteration to DNA is not the sole mechanism of chemical carcinogenesis and a large
number of chemicals can produce cancer in animal models (as well as in humans) without any
genotoxic effect. It is now assumed that the multistage carcinogenic process can result from an
increase in cellular proliferation (Cohen and Arnold, 2011; Winn et al., 2000). Although some
PAH-metabolites are well-known DNA-reactive carcinogens at high levels, our results at lower
levels suggest that some PAHs might chronically increase the duct cell proliferation rate. In
accordance with this hypothesis, induction of TGF-β1 expression after dimethylnitrosamine
exposure in some liver cells, including preductular epithelial cells, has been recently described in
Medaka. TGF-β1 expression results in collagenous matrix deposition, spindle cell proliferation
and hepatocellular and biliary carcinomas (Hobbie et al., 2012). In accordance to this work, we
found some collagenous deposits around bile ducts of fish exposed to PAHs eliciting a progressive
thickening of the pericanalar space. Other mechanisms, like epigenetic alterations and DNA
methylation alterations, may have also contributed to carcinogenesis without DNA-adduct
formation by specific silencing of tumour suppressor gene expression or by aberrant activation of
tumour-promoting genes(Oliveira et al., 2007; Pogribny and Beland, 2013).
Taken together these results indicated that chronic dietary exposures of zebrafish to
environmentally relevant doses and mixtures of PAHs elicited carcinogenic events with a high
frequency and in a narrow range of tissues. Due to their invasive behaviour, tumour growth had
detrimental effects on adult fish survival. Despite their very contrasted compositions, pyrolytic
and petrogenic mixtures were similar regarding the array of induced preneoplastic and neoplastic
lesions suggesting shared carcinogenic mechanisms.
Acknowledgements
We thank Lucette Joassard, Julie Lucas and Didier Leguay for their help in zebrafish
maintenance. This study was supported financially by the agence nationale de la recherche in the
frame of the project ‘ConPhyPoP’ (CES 09_002). Doctoral grants were received from the région
Poitou-Charentes (C.V.), from l’institut français de recherche pour l’exploitation de la mer and
295
conseil général de Charente Maritime (P.P.) and from the ministère de l’enseignement supérieur
de la recherche (F.L.).
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300
Supplementary Table 1: PAHs concentration in used aromatic fractions (µg.g -1of fraction;
mean ± SD)
PAHs
Naphthalene
acenaphthylene
Acenaphthene
Fluorene
Phenanthrene
Anthracene
Fluoranthene
Pyrene
benzo[a]anthracene
benzo[b]naphto[2,1-d]thiophene
benzo[b]fluoranthene+benzo[k]fluor
anthene+benzo[j]fluoranthene
benzo[e]pyrene
benzo[a]pyrene
Perylene
benzo[ghi]perylene
Sum PAHs
Ring #
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
4
PY
7.8 ± 0.5
4.8 ± 0.4
2.8 ± 0.3
4.7 ± 0.4
26.4 ± 2.5
14.5 ± 1.1
55.7 ± 4.8
49.5 ± 4.3
33.6 ± 2.8
39.9 ± 3.5
9.6 ± 0.6
HO
88.5
0.4
34.9
59.8
280.7
38.8
23.2
137.6
112
275.5
154.4
LO
133.2 ± 4
15.8 ± 1.9
16 ± 7.3
38.4 ± 1.1
60.5 ± 4
1.1 ± 0.5
0.3 ± 0.2
4.5 ± 0.4
2 ± 0.4
12 ± 0.6
21.6 ± 0.5
4
76.8 ± 6.8
59.9
2 ± 0.2
5
5
5
5
32.2 ± 2.9
33 ± 3.1
13.3 ± 1.3
32 ± 2.4
92.2
56.5
30
5.3
4.5 ± 0.5
0.6 ± 0.2
1.1 ± 0.1
ND
5
9.3 ± 0.7
17.1
ND
6
29.5 ± 2.4
475.5 ± 40.7
93.1
1560
1.2 ± 0.2
315 ± 10.2
2-methylnaphthalene
1-methylnaphthalene
2
2
4.9 ± 0.5
2.7 ± 0.3
7.6 ± 0.8
311.9
187.4
499.3
247.1 ± 7.3
281.6 ± 14.2
528.7 ± 19.7
2-methylanthracene
3
3
3
4.9 ± 0.4
6.6 ± 0.5
2.9 ± 0.2
227.3
291.5
83.6
52.5 ± 7.3
55.1 ± 1.9
41 ± 10.8
3
5.8 ± 0.6
190.7
100.5 ± 13.3
3
3.5 ± 0.4
20.8 ± 1.9
182.1
975.2
67.6 ± 15
316.7 ± 12.4
504 ± 42.1
3034.5
1160.3 ± 35.1
Total PAHs
ND: not detectable. Value without SD indicated the compound was quantified in only one sample.
301
Suppplementary Table 2: Detailed concentrations of individual PAHs in produced diets (ng.g -1 food; mean ± SD; n=4-7)
PY
Ring #
Control
naphthalene
acenaphthylene
acenaphthene
fluorene
dibenzo[b,d ]thiophene
phenanthrene
anthracene
fluoranthene
pyrene
benzo[a]anthracene
benzo[b ]naphto[2,1-d ]thiophene
benzo[b]fluoranthene+benzo[k]fluo
ranthene+benzo[j]fluoranthene
benzo[e ]pyrene
benzo[a]pyrene
perylene
benzo[ghi]perylene
Sum PAHs
2
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
4
HO
1X
56 ± 14
35 ± 6
29 ± 7
42 ± 8
34 ± 5
291 ± 60
159 ± 41
523 ± 182
447 ± 160
581 ± 221
744 ± 290
156 ± 70
3X
157 ± 74
114 ± 23
89 ± 24
137 ± 28
102 ± 26
895 ± 213
482 ± 165
1782 ± 353
1496 ± 311
1671 ± 763
2144 ± 1032
472 ± 230
Control
6±6
1±0
2±1
2±1
2±3
8±4
1±0
3±3
3±3
1±0
1±0
5±3
0.3X
15 ± 7
11 ± 2
14 ± 12
14 ± 3
11 ± 1
95 ± 21
49 ± 13
130 ± 28
112 ± 24
171 ± 75
215 ± 91
52 ± 26
4
5
5
5
5
2±1
1±0
1±0
1±0
0±0
273 ± 72
109 ± 29
118 ± 33
37 ± 9
123 ± 41
868 ± 220
346 ± 86
373 ± 95
121 ± 27
349 ± 89
2740 ± 674
1084 ± 286
1168 ± 346
390 ± 83
1188 ± 265
5
6
2±2
0±0
34 ± 6
32 ± 11
87 ± 27
1670 ± 448
2-methylnaphthalene
1-methylnaphthalene
2
2
8±9
4±6
12 ± 15
15 ± 3
8±2
23 ± 5
43 ± 8
22 ± 5
65 ± 13
2-methylanthracene
3
3
3
2±1
2±0
0±0
17 ± 3
19 ± 5
8±2
3
3
1±0
1±0
7±3
14 ± 4
12 ± 3
70 ± 15
55 ± 12
1763 ± 468
Total PAHs
LO
1X
120 ± 16
3±1
74 ± 19
99 ± 8
166 ± 11
418 ± 32
70 ± 2
44 ± 2
227 ± 19
172 ± 11
336 ± 21
186 ± 8
3X
405 ± 73
13 ± 13
190 ± 17
312 ± 25
546 ± 54
1279 ± 51
220 ± 10
145 ± 18
709 ± 64
543 ± 29
1073 ± 79
573 ± 36
Control
4±1
1±0
27 ± 26
2±1
0±0
6±3
0±0
2±1
1±0
0
ND
0
0.3X
37 ± 6
3±1
46 ± 23
34 ± 2
54 ± 3
152 ± 7
22 ± 1
17 ± 1
80 ± 3
57 ± 4
108 ± 8
56 ± 4
2.4
ND
0±0
0±0
ND
32 ± 2
56 ± 3
ND
ND
ND
110 ± 8
173 ± 11
108 ± 6
56 ± 4
ND
0.3
0±0
39 ± 30
ND
ND
880 ± 28
116 ± 39
62 ± 21
178 ± 60
4±1
2±0
6±2
47 ± 11
60 ± 13
25 ± 6
149 ± 31
175 ± 41
78 ± 18
49 ± 12
37 ± 11
218 ± 41
165 ± 56
100 ± 28
668 ± 157
108 ± 43
301 ± 106
268 ± 67
893 ± 191
5532 ± 1383 17305 ± 4798
5816 ± 1433 18151 ± 4983
3±1
1±0
23 ± 21
2±1
0±0
6±4
0±0
2±1
2±0
0
ND
0
0.3X
161 ± 21
15 ± 1
37 ± 26
79 ± 1
443 ± 8
178 ± 7
2±1
2±2
13 ± 2
4±1
30 ± 1
66 ± 1
1X
315 ± 183
46 ± 2
67 ± 68
232 ± 2
1161 ± 18
492 ± 10
4±1
1±1
18 ± 2
14 ± 2
98 ± 4
194 ± 9
3X
1110 ± 472
136 ± 19
90 ± 30
677 ± 55
3489 ± 208
1438 ± 86
42 ± 54
15 ± 17
73 ± 28
49 ± 28
320 ± 62
588 ± 30
363 ± 18
536 ± 26
342 ± 10
172 ± 14
ND
2.4
ND
0±0
0±0
ND
6±0
17 ± 0
ND
ND
ND
20 ± 1
52 ± 1
4±1
5±1
ND
66 ± 7
160 ± 10
17 ± 3
13 ± 1
ND
34 ± 2
146 ± 10
2558 ± 169
113 ± 6
481 ± 12
8082 ± 305
0.3
0±0
33 ± 26
ND
ND
1053 ± 63
3±1
12 ± 0
2739 ± 231
11 ± 1
42 ± 12
8335 ± 854
137 ± 13
86 ± 8
223 ± 20
396 ± 32
261 ± 20
657 ± 52
1259 ± 118
854 ± 84
2113 ± 201
4±1
2±0
5±1
420 ± 19
458 ± 19
878 ± 38
1036 ± 96
1147 ± 102
2183 ± 197
2982 ± 725
3300 ± 739
6282 ± 1465
1±0
1±0
ND
126 ± 24
149 ± 11
ND
326 ± 47
400 ± 28
ND
934 ± 160
1172 ± 166
409 ± 32
1±0
1±0
ND
114 ± 14
121 ± 2
ND
319 ± 38
340 ± 16
ND
850 ± 156
915 ± 124
32 ± 8
1±0
0±0
2±2
137 ± 20
73 ± 8
530 ± 34
360 ± 85
227 ± 15
1448 ± 144
990 ± 206
617 ± 71
4122 ± 581
1±0
1±0
2±2
283 ± 29
122 ± 4
640 ± 35
798 ± 42
348 ± 14
1804 ± 67
2226 ± 394
956 ± 97
4957 ± 731
47 ± 33
1633 ± 71
4663 ± 360
14317 ± 813
40 ± 29
2572 ± 96
6726 ± 278
19574 ± 1945
ND: not detectable
302
303
304
DISCUSSION GENERALE
Dans notre étude, les effets d'une exposition à 3 fractions de HAP ont été caractérisés et
comparés au niveau de la croissance, de la survie, du comportement, de la reproduction et du
transfert maternel. L’objectif est d'évaluer la pertinence écologique des résultats obtenus après
avoir évalué les effets à différents niveaux d'organisation. Dans un premier temps, nous
discuterons de l’importance de la standardisation des facteurs biotiques et abiotiques dans une
étude telle que la nôtre. Nous nous intéresserons ensuite à l'effet des HAP au niveau moléculaire et
cellulaire, puis au niveau individuel, avant d'analyser en dernier lieu les conséquences au niveau
de la population. D’après le schéma (Figure 54) tiré de Hinton et al. (Hinton et al., 2005), ce plan
va suivre une pertinence écologique croissante.
Figure 54 : Illustration de l'un des challenges majeurs de l'écotoxicologie d'après Hinton
(Hinton et al., 2005).
De l'environnement à la molécule : effort porté sur la détermination des mécanismes d'action des
contaminants. De la molécule à l'environnement : effort porté sur la pertinence écologique
d'évaluer l'effet de contaminants.
I Influence des facteurs abiotiques et biotiques
Dans le cadre de notre étude, nous avons cherché à caractériser au mieux notre système
(article 1) et à standardiser au maximum les conditions d'élevage (article 2 et 3) pour réduire les
biais induits par des variables présentées en Figure 55. En effet, il a été montré que les facteurs
biotiques et abiotiques pouvaient avoir une influence sur les poissons testés, mais également
interférer avec les variables mesurées (Figure 55) et masquer l’effet réel du polluant.
305
Stimuli chimiques
Age
Aliment
Température
Oxygène
Taille du bac
Lumière
Elevage
Lignée
Figure 55 : Variables pouvant influencer la réponse aux polluants.
Facteurs abiotiques : la température, la lumière, l'élevage, l'oxygène et la taille du bac. Facteurs
biotiques : la lignée, l'âge, l'aliment et les stimuli chimiques.
Tous ces facteurs biotiques et abiotiques ont été optimisés au maximum pour cette étude,
afin que le seul effet mesuré soit bien celui des contaminants.
1) Les facteurs abiotiques
Les facteurs abiotiques que nous allons étudier sont la température, la lumière, les
conditions d'élevage et la taille du bac lors des expériences.
a) La température
Maintenir une température constante pour toutes les expositions est capitale. En effet, dans
d'autres études, il a été montré que ce facteur pouvait par exemple avoir une influence sur les
stades précoces chez la sole (Blanco-Vives et al., 2010), sur le rythme cardiaque chez le poisson
zèbre (Barrionuevo and Burggren, 1999), ou, a posteriori, augmenter la sensibilité aux
contaminants chez le saumon (Oncorhynchus gorbuscha)(Carls and Thedinga, 2009). Dans notre
étude, la température d'élevage ainsi que la température dans les salles d'expérimentation a
toujours été maintenue à 28°C.
b) La lumière
Les cycles jour/nuit (photopériode) ont été harmonisés et synchronisés entre la salle
d'élevage, les salles d'expérimentation et l'étuve où sont placées les larves jusqu'à 5 jpf. La
306
photopériode a été réglée de façon à avoir 14 heures de jour et 10 heures de nuit. Une
harmonisation entre les salles, dès les plus jeunes stades, est très importante. On sait que, chez le
poisson zèbre, le rythme circadien est robuste après 6 jpf si les poissons sont exposés à partir de 3
jpf à ce même cycle. Les mécanismes liés à la synchronisation des fonctions sont cependant
opérationnels dès les deux premiers jours du développement (Weger et al., 2013). On sait
également que chez les souris, les modifications de cycles jour/nuit imposées aux animaux selon
les laboratoires pourraient expliquer en partie les différences de résultats observés entre des
laboratoires (Kopp, 2001; Munn et al., 2011). Lors de nos expériences, les larves ont été exposées
à ce cycle dès leur naissance et les expériences comportementales ont débuté à 4 jpf, toujours avec
le même cycle. De plus, le niveau d’activité varie pendant la journée (Padilla et al., 2011). C’est
pour cette raison que nos tests ont été réalisés à heure fixe.
c) L’élevage
Parmi les facteurs de l'élevage, le manque d'oxygène peut en effet avoir une influence sur
la structure des branchies, par exemple chez la carpe (Cyprinus carpio) (Hattink et al., 2005). En
revanche, il est avéré que les œufs de poisson zèbre sont capables de résister à une anoxie 24
heures sans séquelles au début de leur développement (Mendelsohn et al., 2009; Padilla and Roth,
2001). Passé ce délai, 100% des œufs meurent (Shang and Wu, 2004). L'hypoxie influence
également le rythme cardiaque du poisson zèbre (Barrionuevo and Burggren, 1999). Elle peut par
ailleurs s'additionner aux effets toxiques d’un polluant (Küster and Altenburger, 2008). Les
embryons de saumon rose (Oncorhynchus gorbuscha) stressés par une exposition à l'hypoxie sont,
par exemple, plus sensibles aux HAP (Carls and Thedinga, 2009). Ils sont plus sensibles aux
chocs, présentent des œdèmes et des anémies, des déformations au niveau des yeux et de la
colonne vertébrale (Carls and Thedinga, 2009). Dans notre élevage, les aquariums sont disposés
en circuit ouvert, avec un changement d'eau automatique pendant une minute toutes les heures de
jour comme de nuit, ce qui permet de renouveler 30% du volume d'eau en 24 heures. En parallèle,
des aérateurs sont installés dans chaque bac pour assurer une bonne oxygénation de l'eau. Chez les
larves en boîte de Pétri, le renouvellement d'eau journalier est manuel. Les conditions d'élevage en
général peuvent biaiser les expériences comportementales, comme les capacités d'apprentissage,
ou encore la réponse dans le "novel tank", si les poissons ont été élevés en groupe ou seuls (Parker
et al., 2012b). En effet, les poissons zèbre élevés en environnement complexe (avec des plantes,
des cailloux...) apprennent plus rapidement que ceux élevés en environnement simple (Spence et
al., 2011). Dans notre cas, les poissons ont tous été élevés en environnement simple.
307
d) La taille du bac
La dernière variable abiotique recensée ici qui perturberait les résultats est la taille de
l'aquarium d'expérimentation pour les adultes. Dans le cas des larves, ces tests avaient déjà été
effectués pour les plaques micropuits (Padilla et al., 2011). Des tests ont été réalisés et sont
présentés dans la section Matériels et méthodes (III, 1). Ils ont montré que la taille du bac
influençait la distance totale parcourue. Plus le bac est grand, plus la distance parcourue est
importante. Le choix des bacs de 3L représentait un compromis entre l’activité et la capacité
analytique.
2) Les facteurs biotiques
Les facteurs biotiques qui vont nous intéresser ici sont la lignée, l'âge, l'alimentation et les
stimuli chimiques.
a) La lignée
On sait que le choix de la lignée peut influencer les réponses (Robison and Rowland, 2005).
Des différences sont également observées pour les réponses comportementales après une carence
alimentaire (Benner et al., 2010) et dans la réponse au stress (Oswald and Robison, 2008). Ces
spécificités des lignées ne sont pas limitées aux seuls poissons. En effet, chez les souris, des
différences similaires ont été mises en avant (Munn et al., 2011). Dans notre étude, la lignée AB a
été utilisée pour les expositions sur sédiments car c’est la lignée la plus utilisée dans la littérature
(Lockwood et al., 2004; López-Patiño et al., 2008; Ninkovic and Bally-Cuif, 2006; Pather and
Gerlai, 2009). Comme nous l'avons présenté en étude préliminaire (Vignet et al., 2013), les lignées
de poissons présentent des différences comportementales importantes. C’est pour cette raison que
nous avons décidé de réaliser une étude comparée entre les deux lignées présentes au laboratoire,
les AB et les TU. A l’issue de cette étude, nous avons sélectionné la lignée TU pour les réponses
plus marquées lors des tests de locomotion 72 heures chez les larves, de stress lumineux à tous les
âges et du temps passé en zone haute dans le "novel tank" chez les adultes. Toutes les expositions
au sédiment ont été réalisées sur la lignée AB et toutes les expositions à l’aliment ont été faites sur
la lignée TU. En parallèle et en complément, une exposition alimentaire a été accomplie sur des
lignées AB, et les mêmes tests de comportement, de croissance et de reproduction ont été faits aux
mêmes âges que pour les TU. La conjugaison entre les AB-PY et les TU-PY semble indiquer des
différences au niveau du comportement et de la reproduction. Ces résultats sont en cours
d’analyses.
308
b) L’âge
Les poissons ont tous été testés pour les différentes variables aux mêmes âges : au stade
juvénile à 2 mpf pour les poissons exposés par voie alimentaire, et au stades adulte à 6 mpf pour
les 2 voies de contamination. Puis, les tests effectués sur la descendance ont été réalisés chez les
larves à 5 jpf pour le stress lumineux pour les 2 voies de contamination et entre 4 et 7 jpf pour la
locomotion basale chez les descendants des PY et LO. Nous avons observé une réponse graduelle
à la contamination selon l'âge. Par exemple, pour les réponses comportementales, les différences
étaient plus marquées chez les juvéniles de 2 mpf que chez les adultes à 6 mpf. En revanche,
lorsque l'on s'intéresse à la croissance, les différences dans le cas des PY apparaissent tardivement,
à 4 mpf, alors que dans le cas des fractions HO et LO, ces différences sont visibles dès 3 mpf. Une
augmentation des effets est observée au niveau de la croissance, contrairement au comportement
où les effets s'atténuent. Elle peut être liée à une perte de plasticité comportementale et/ou à une
plus grande résilience physiologique.
c) L’alimentation
Les distributions d'aliments ont été standardisées en fonction de l'âge des poissons. Tous les
animaux ont débuté leur contamination au jour 5 après fécondation, et ont changé de
granulométrie aux mêmes âges pour les nombreuses séries produites avec les trois fractions. Il en
a été de même pour les poissons exposés sur sédiment et nourris avec de l'aliment non contaminé
par la suite. La contamination des poissons exposés par voie trophique a été réalisée avec un
aliment enrobé de trois fractions différentes, mais réalisé à partir du même aliment de départ plus
ou moins broyé selon les granulométries ciblées.
La composition initiale de l'aliment peut influencer les réponses comportementales plus tard si
des carences, non liées aux contaminants, sont détectées. Ce cas a déjà été mis en avant avec le
sélénium, métal indispensable au fonctionnement du cerveau, qui induirait une altération de la
position verticale moyenne dans la colonne d’eau (Benner et al., 2010). Les poissons exposés par
voie sédimentaire ont été nourris avec le même aliment de base. Les quantités d'aliments
distribuées ont été identiques pour toutes les concentrations d'une même fraction tout au long de
l'expérience. En effet, celles-ci ont été systématiquement pesées et les quantités distribuées
comparées statistiquement. Dans notre étude, les poissons ont été nourris à satiété jusqu'au stade
juvénile, puis les PY ont disposé d'une ration quotidienne de 5% de leur biomasse à 2 mpf puis de
2% à partir de 3 mpf. Les HO et les LO ont été nourris ad libitum jusqu’à 3 mpf, puis ils ont
disposé d'une ration quotidienne de 2% de leur biomasse par la suite. Ces différences de
309
distribution ont été la conséquence de contraintes expérimentales (limite dans la disponibilité de la
fraction) et également du retour d’expérience après la première exposition PY. Elles peuvent
permettre d’expliquer l’augmentation du taux de survie chez les larves LO par rapport au PY et au
HO, ainsi que les différences de croissance PY> HO-LO.
Dans une autre étude, il a été montré que les poissons exposés à des HAP ingèrent moins de
nourriture que les autres au début de la contamination, puis une reprise progressive se met en
place par la suite (Moles and Rice, 1983). Le rythme d'alimentation serait donc réduit
(Palanikumar et al., 2013). Dans notre cas, nous n'avons pas observé un tel phénomène. Les
différences entre les espèces sont réelles. Malgré cela, on sait qu'une exposition chronique entraîne
moins de différences de réponse entre les espèces qu'une exposition aiguë (Moles, 1998). Ces
poissons ont été élevés dans le but de faire des expériences, notamment comportementales, et
réduire leur alimentation pourrait augmenter la variabilité individuelle (Oswald and Robison,
2008). Il a été montré que les poissons à jeun répondaient différemment par rapport aux poissons
rassasiés (Farr et al., 1995). Etant donné la difficulté à estimer la satiété de tous les poissons, nous
avons choisi, comme dans l'étude de Farr, et dans un souci de standardisation, de tester les
réponses comportementales de tous nos poissons à jeun.
L'alimentation constitue une variable importante à standardiser. Il existe en outre des
comportements alimentaires différents. En effet, les poissons au régime, c'est-à-dire nourris une
seule fois par jour, voient leur temps de latence pour se nourrir et la variabilité individuelle de ce
temps diminuer. En revanche, si les poissons sont manipulés en plus d'être au régime, alors on
augmente le temps de latence et la variabilité individuelle (Oswald and Robison, 2008). Mais audelà de cet exemple, on sait que la contamination peut aussi avoir un impact sur l'efficacité de
capture des proies (Couillard et al., 2011), réduire l'énergie potentiellement disponible pour les
poissons et influencer ainsi les résultats des tests comportementaux. Pour minimiser les aléas liés à
la distribution de nourriture, celle ci était réalisées aux mêmes heures chaque jour.
d) Les stimuli chimiques
Les phéromones, les prédateurs et les poissons précédemment stressés dans le même bac
peuvent influencer le résultat des expériences (Sorensen and Stacey, 2004). Dans notre étude,
l'odeur de prédateur n'a pas été utilisée, mais il a été montré que l'insécurité via l'odeur d'un
prédateur (Luca and Gerlai, 2012) peut avoir une influence sur la réponse comportementale. Dans
le cadre des tests comportementaux, l'eau a été systématiquement changée entre les poissons lors
des expériences qui le permettaient.
310
I Impact des HAP au niveau moléculaire et cellulaire
L'effet des HAP aux niveaux moléculaire et cellulaire sera développé dans ce paragraphe.
Au départ, nous nous intéresserons aux effets au niveau du métabolisme des HAP, des métabolites
et des cytochromes. Par la suite, nous étudierons les altérations au niveau neurobiologique, avant
de terminer par la reproduction.
1 Régulation et expression
Dans notre étude, nous avons mis en avant une sur-expression de cyp1a dans les ovaires
des HO-0.3X. Ce gène est impliqué dans le métabolisme des xénobiotiques. Pour les autres
conditions, nous n'avons pas observé de différence significative. Une partie des mécanismes
d'actions des HAP sont relativement bien décrits. En effet, on sait que la liaison du HAP entraîne
l’activation du AhR (Aryl Hydrocarbon Receptor) et sa translocation dans le noyau. Sans le HAP,
l’AhR reste dans le cytoplasme. Une fois dans le noyau, le complexe HAP-AhR peut réguler
l'expression des gènes cibles. C'est le cas par exemple du gène cyp1a, dont la transcription est
activée par ce complexe. L'activation de cette expression peut être analysée par l'activité EROD
(Ethoxyresorufin-O-deethylase). L'activité de l'AhR, qui régule les enzymes intervenant dans le
processus de métabolisation de xénobiotique, comme par exemple les cytochromes P450,
augmente en présence de HAP possédant 4 ou 5 cycles (Barron et al., 2004; Billiard et al., 2002;
Ohura et al., 2007).
Cependant, le rôle des AhR dans la toxicité des HAP est très complexe et présenterait des
différences de sensibilité selon les espèces (Jönsson et al., 2009). L'absence de cyp1a constituerait
une protection contre les HAP (Billiard et al., 2008). L'inhibition des AhR2 bloquerait l'expression
des cyp1a dans l'endothélium et protégerait l'animal contre l'induction de la toxicité par les
dioxines, et notamment la formation d'œdèmes du cœur ainsi que des déformations crâniennes.
(Billiard et al., 2006). Cyp1a jouerait donc un grand rôle de médiation dans la toxicité des HAP
pendant les jeunes stades du poisson zèbre (Billiard et al., 2006).
Dans notre étude, nous n’avons pas observé de variation de l’activité EROD, mais nous
avons mis en évidence une sur-expression des cyp1a dans les ovaires des HO-0.3X uniquement.
L'induction de l'activité EROD a déjà été observée chez d’autres espèces. Par exemple, on constate
une induction de l'activité de cyp1a après une exposition d'œufs de saumon rose sur des graviers
contaminés suite à la marée noire de l'Exxon Valdez (Marty et al., 1997; Rice et al., 2001), après
une exposition aiguë au pyrène sur des bars (Almeida et al., 2012) ou encore, après une exposition
311
au rétène (Fragoso et al., 2006). L’activité EROD augmente également chez le poisson zèbre
exposé à la fraction soluble des HAP issue des fractions HO et LO (Perrichon et al., submitted-b).
En revanche, cette activité n'est pas différente chez les larves issues de parents contaminés par
voie alimentaire (Perrichon et al., submitted-a). Elle n’est peut-être pas le meilleur indicateur à
prendre en considération. Par exemple, chez les plies (Pleuronectes platessa) et les dragonnets
lyre (Callionymus lyra) de la baie de Seine, on observe une variation de l'activité EROD selon la
saison. L'induction d'EROD est plus forte en période de reproduction, c'est-à-dire en été (Galgani
et al., 1991). Cette induction peut également varier avec la salinité, comme cela a été décrit après
une exposition au benzo[a]pyrène chez le poisson zèbre (Hsu and Deng, 1996) et à du pétrole brut
chez la truite (Ramachandran et al., 2006). De plus, une exposition à des particules ou à des
sédiments entraînera des différences d'induction de l'activité EROD (Fragoso et al., 2006). Une
réduction de cette activité après une exposition à du β-naphtoflavone chez le poisson zèbre
(Matson et al., 2008) a déjà été révélée.
Après exposition à la fraction PY, une augmentation significative de métabolites, de
l’ordre de 45 fois plus élevée, a été observée chez les poissons PY-3X par rapport aux poissons
PY-contrôle, pour les métabolites du pyrène et du benzo [a]pyrène. Les mêmes métabolites que
dans la fraction PY sont retrouvés dans la fraction HO, mais en quantité moins importante. En
effet, on trouve environ 4.6 fois moins de métabolites du pyrène dans les poissons de la condition
HO-3X que dans ceux de la condition PY-3X et environ 2.5 fois moins de métabolites du BaP.
Dans le cas de la fraction LO, aucun métabolite lié à l'un des 16 HAP classés prioritaires par
l'USEPA n'a été trouvé. Dans les 3 cas, aucun métabolite du naphtalène n’est retrouvé. En effet, ce
HAP très peu lourd est rapidement éliminé (Grung et al., 2009). La fraction PY étant très chargée
en composés lourds (HAP de 3, 4 et 5 cycles), il est logique que l’on retrouve un grand nombre de
métabolites de B[a]P (5 cycles) et de pyrène (4 cycles) dans les poissons exposés à cette fraction.
La fraction HO est composée pour moitié de HAP alkylés et pour une autre moitié de HAP non
alkylés. Les métabolites sont donc retrouvés en moins grande quantité que dans la fraction PY. En
revanche, dans la fraction LO, composée principalement de HAP légers et de composés alkylés,
on ne retrouve pas les métabolites de pyrène et de B[a]P. Dans notre cas, les métabolites ont été
dosés après 10 jours de contamination, les poissons ne pouvaient pas être sexés à ce stade. Ce
paramètre aurait pu être intéressant. Il a été observé que les métabolites biliaires des HAP sont
plus présents chez les mâles que chez les femelles chez le flet (Platichthys flesus), la perche
(Perca fluviatilis) et la loquette (Zoarces viviparus) collectés en mer Baltique (Vuorinen et al.,
2006). Notre dosage a été réalisé sur la larve entière. Chez les adultes, il est possible de doser les
312
métabolites dans différents organes ou tissus. On sait par exemple qu'une exposition aiguë au
pyrène sur des bars entraîne une augmentation des métabolites dans la bile, dans le foie qui est le
site principal de métabolisation des xénobiotiques, dans le cerveau et dans les muscles (Almeida et
al., 2012).
La biotransformation des HAP en métabolites actifs entraîne des cassures à l'ADN et une
génotoxicité (Wessel et al., 2010). Dans le cadre de cette étude, aucune différence significative n'a
été observée au niveau de l'ADN chez les PY pour les tests des comètes et des micronoyaux. Le
test des comètes n'a pas pu être effectué chez les HO et les LO en raison de la trop petite taille des
poissons. Cette variable n'a pas non plus été analysée sur les poissons contaminés par voie
sédimentaire. En revanche, on sait que le sédiment contenant des HAP est une source de
contamination qui entraîne des dommages à l'ADN (Bihari et al., 2006). Ces altérations peuvent se
traduire par des adduits, ou des cassures. Les HAP induisent des adduits à l'ADN importants chez
certaines espèces exposées par voie aqueuse. Certains adduits, par exemple, ont été observés dans
l'intestin, dans le foie ou dans le cerveau du poisson zèbre après une exposition au benzo[a]pyrène
(Hsu and Deng, 1996) ou au β-naphtoflavone (Jönsson et al., 2009). Les poissons PY à 2 mpf ne
présentaient pas d'adduit à l'ADN ; pourtant, chez des moules (Dreissena polymorpha) exposées
de manière naturelle dans la Seine, lors d'une exposition proche de la composition de notre
fraction PY, des adduits ont été identifiés (Le Goff et al., 2006). Par la suite, dans cette même
étude, des moules contrôles ont été exposées aux mêmes HAP et ont développé des adduits à
l'ADN en 5 jours (Le Goff et al., 2006). Des adduits ont également été décelés chez des souris
exposées à des HAP par voie aérienne après 3 semaines de contact (Rowan-Carroll et al., 2013).
Des différences au niveau de l'ADN semblent pouvoir être observées selon les espèces. Les HAP
ne sont malheureusement pas les seuls contaminants à induire ce genre de dégâts (Nogueira et al.,
2009). Une étude plus précoce des dommages à l'ADN aurait peut-être été informative. En effet,
des réparations à l'ADN sont possibles, notamment après une exposition aux HAP (Kienzler et al.,
2013).
2) Neurobiologie, bases moléculaires des altérations comportementales
Dans le cadre de notre étude, nous avons étudié l'expression de l'aromatase dans le
cerveau des larves F1 issus de poissons transgéniques cyp19a1a-GFP contaminés. Les larves
étaient préalablement exposées à différentes concentrations d'EE2. Une diminution de l'expression
de l’aromatase chez toutes les larves PY par rapport au contrôle a été observée à la concentration
0.05nM d’EE2. Pour les autres fractions, seuls les poissons issus des poissons contrôles et des
313
poissons 0.3X ont pu être testés, mais les différences ne sont pas significativement différentes. On
sait que l'induction de l'aromatase dans le cerveau peut varier selon le xénobiotique appliqué
(Brion et al., 2012). En revanche, Patel et al. ont observé une augmentation de l'aromatase dans le
cerveau après une exposition au benzo[a]pyrène de Fundulus heteroclitus en hiver (Patel et al.,
2006). Dans une autre étude avec le même poisson exposé au fadrozole, une diminution de
l'aromatase dans le cerveau chez les femelles a été observée (Dong et al., 2008). Dans le cadre
d'une contamination au benzo[a]pyrène, on observe une diminution de cyp19a1b. Pourtant, on sait
que cyp19a1b est détectable dans le cerveau des 3 jpf. La diminution de cette expression est
mesurée dans le télencéphale ventral et dans l'hypothalamus (Dong et al., 2008). Dans notre étude,
la fraction PY est celle qui contient le plus de HAP lourds, et donc de B[a]P. La présence de B[a]P
pourrait expliquer en partie la différence significative observée chez les PY à 0.05 nM. Cette
différence n’a pas été retrouvée pour les autres fractions entre les larves contrôles et les 0.3X.
Au niveau du cerveau, des neurotransmetteurs sont présents. Dans le cadre de notre étude,
les cerveaux ont été prélevés pour les analyses de sérotonine et de dopamine. Mais les dosages,
qui ne peuvent pas se faire au laboratoire, sont en prévision après la mise en place d’une
collaboration avec un laboratoire spécialisé. Ces neurotransmetteurs ont pour rôle d'assurer le
transfert d'un message d'un neurone à l'autre. Chez les poissons contrôles, le neurotransmetteur
majeur associé au comportement et au système moteur est la dopamine (Irons et al., 2013;
Thirumalai and Cline, 2008). Lorsqu'on bloque les circuits dopaminergiques avec une neurotoxine
chez des larves de 3 jpf, on constate une augmentation importante de la nage (Thirumalai and
Cline, 2008). La sérotonine (5-HT) est le neurotransmetteur majeur qui contrôle l'agression.
Lorsqu'un animal a beaucoup de 5-HT, alors il est timide (Norton and Bally-Cuif, 2010). La
contamination entraîne un stress, et l’on sait que le taux de sérotonine peut être très affecté après
un stress prolongé (Gesto et al., 2008). L’effet des HAP sur ces neurotransmetteurs pourrait nous
aider à interpréter les effets observés lors des tests comportementaux au niveau de la locomotion
et de l’anxiété. Ces effets pourraient également nous aider à mieux comprendre les mécanismes
de réponse mis en place lors de ces tests. En effet, on sait que les HAP peuvent faire varier la
dopamine et la sérotonine dans le cerveau. Ils altèrent la réponse au stress chez les poissons (Gesto
et al., 2008). Dans une étude, des dosages ont aussi été réalisés après une exposition à une drogue
(SCH23390). La dopamine diminue lorsque la concentration augmente. Les poissons contrôles ont
plus de sérotonine que les autres. Enfin, D1R (récepteur à la dopamine) pourrait altérer le
comportement social et se traduirait par une locomotion anormale en présence d'un stimulus
(Scerbina et al., 2012).
314
3) Reproduction, bases moléculaires des altérations gonadiques
Dans notre étude, nous observons une sur-expression des gènes impliqués dans la
régulation de l'axe hypothalamus-hypophyse-gonades dans les ovaires des poissons HO. Le même
phénomène a été observé chez les femelles PY-1X. Une sous-expression des gènes dans les
testicules impliqués dans la spermatogénèse est observée chez les poissons PY-0.3X, alors qu'une
sur-expression est à noter chez les LO-0.3X et les LO-1X. Une altération de ces gènes peut se
traduire par des problèmes de fertilité. Des différences d'expressions de gènes ont été décrites dans
d’autres études. Les mécanismes d’actions de ces 3 fractions semblent être différents. PY et HO
paraissent avoir des mécanismes proches alors que LO semble entraîner des altérations différentes.
Dans le cadre de notre étude, nous avons réalisé des dosages d'œstrogène, de testostérone
et de vitellogénine dans le sang des mâles et des femelles à 3 mpf. Les hormones font partie des
nombreux stimuli chimiques qui circulent dans l'organisme. Elles ont pour mission de circuler
dans tout l'organisme et de réguler les différentes parties de celui-ci en interagissant avec des
cellules cibles. Les œstrogènes et les androgènes font partie des hormones sexuelles.
Au niveau de l'œstradiol, les femelles et les mâles PY de toutes les conditions présentent
un taux basal beaucoup plus élevé que les autres. Cette différence peut en partie être expliquée par
la taille et le poids plus importants de ces poissons PY par rapport aux poissons des autres
fractions au même âge. Pour les 3 fractions, aucune différence significative pour les mâles comme
pour les femelles n’a pu être mise en avant. Pourtant, il a été démontré que la production
d'œstradiol (E2) diminue avec des expositions au phénanthrène (3 cycles), au chrysène (4 cycles)
et au benzo[a]pyrène (5 cycles) chez le flet (Rocha Monteiro et al., 2000). Dans ce cas, les HAP
inhibent la synthèse d’E2, ce qui affecte le succès reproducteur des poissons qui vivent dans des
eaux contaminées (Rocha Monteiro et al., 2000). Au vu de la composition de nos fractions, la
fraction PY, qui possède le plus de HAP lourds, serait être la plus susceptible d'engendrer ce type
d’altération. Or, dans le cas présent, aucune différence n’a été observée.
Au niveau de la testostérone, aucune différence significative n’a été mesurée pour tous les
sexes et toutes les conditions, excepté chez les femelles LO où l’on observe une augmentation de
la testostérone avec la contamination. Les HAP peuvent avoir une influence sur la production de
ces hormones. En effet, une étude sur le flet décrit une production de testostérone diminuée par le
phénanthrène (3 cycles) et le chrysène (4cycles) (Rocha Monteiro et al., 2000). Les HAP inhibent
315
la synthèse de testostérone ce qui affecte le succès reproducteur des poissons qui vivent en eaux
contaminées (Rocha Monteiro et al., 2000).
La balance hormonale entre œstrogènes et androgènes constitue un facteur important dans
la différenciation sexuelle (Larsen and Baatrup, 2010), et les contaminants peuvent influencer le
taux de ces hormones. Par exemple l'alcool 8:2 fluorotelomer (FTOH) induit une augmentation de
testostérone et d'œstradiol chez les femelles alors qu'il entraîne une diminution de la testostérone
mais une augmentation des œstradiols chez les mâles (Liu et al., 2010). Ce résultat induit une
diminution du nombre d'œufs et de la quantité de sperme (Liu et al., 2010) chez le poisson zèbre.
Nous savons que l'aromatase ou Cyp19 (présente dans le cerveau et les gonades) est
responsable de la conversion des androgènes (testostérone) en œstrogènes. Chez les téléostéens,
cyp19a1b est exprimé dans le cerveau et cyp19a1a dans les ovaires (Dong et al., 2008). De plus,
l'expression de cyp19 est sensible aux œstrogènes et xéno-œstrogènes. On sait que les œstrogènes
synthétiques sont 37 à 49 fois plus puissants que les naturels (Brion et al., 2012). Dans le cadre de
notre étude, nous avons observé une sur-expression de cyp19a1a dans les ovaires des poissons
PY-1X et une sous-régulation chez les LO-3X. Patel et al. ont constaté une altération de
l'aromatase gonadique après une exposition au benzo[a]pyrène de Fundulus heteroclitus (Patel et
al., 2006) et Dong et al. ont observé le même phénomène après une exposition au fadrozole (Dong
et al., 2008). Ce gène pourrait être impliqué dans l'apparition d'hyperplasie et de tumeurs.
L'augmentation de la testostérone chez les femelles LO pourrait en partie être expliquée
par la sous-expression de cyp19a1a, révélée chez les femelles LO-3X. En effet, la sous-expression
de ce gène entraîne une moindre conversion des androgènes en œstrogènes et pourrait avoir pour
conséquence une augmentation de la testostérone. Chez les femelles HO-3X, nous avons observé
une absence de vitellogénine dans les ovaires. Or la synthèse de vitellogénine dans le foie est
activée par les œstrogènes. Si ce gène est sous-exprimé, il se peut que le taux de testostérone soit
élevé, que celui d'œstrogène soit faible et que la synthèse de vitellogénine ne soit pas activée. Au
contraire, cette sous-expression chez les PY-1X révèle peut-être une augmentation de cette activité
pour compenser l'effet du contaminant. Chez des poissons zèbre exposés à des HAP dissous, des
différences au niveau de l'expression des gènes du système reproducteur, nerveux, respiratoire et
immunitaire (Holth et al., 2008) ont été observées. Les mêmes types d'altérations ont été mises en
avant chez des souris exposées par voie aérienne à des HAP (Rowan-Carroll et al., 2013). Dans
cette étude, l'auteur suggère toutefois une réponse adaptative de certains gènes.
316
Chez les mâles, cyp17a1 est sous-exprimé chez les PY-0.3X, les HO-0.3X et les HO-1X, et
il est sur-exprimé chez les LO-1X. Cyp17a1 est impliqué dans la stéroïdogénèse (Baudiffier,
2012). Sa sous expression pourrait diminuer la synthèse d'androgènes chez les PY et les HO, et au
contraire sa sur-expression chez les LO pourrait l'augmenter, comme cela a déjà été mis en
évidence après une exposition au clotrimazole (Baudiffier, 2012). D’autre part, aucune différence
n'a pu être mise en avant avec le gène hsd11b3.
La vitellogénine joue également un rôle dans le transport des contaminants. Dans notre
étude, nous n'avons pas observé de métabolites présents dans les œufs des poissons contaminées,
mais, chez les femelles directement exposées, la vitellogénèse semblait être arrêtée chez les
femelles exposées aux fractions HO et LO. Chez le crabe, le mécanisme d'action du transfert de
ces contaminants a été décrit (Lee, 1993). Une femelle nourrie avec un produit radioactif pendant
une exposition courte (3 et 6 jours) se retrouve avec 8 à 16% de ces xénobiotiques dans
l'hépatopancréas. Puis 0.2 à 6% des xénobiotiques présents dans l'hépatopancréas se retrouvent
dans les ovaires. Les xénobiotiques transiteraient par les gouttelettes de lipides. Dans
l'hépatopancréas, les xénobiotiques et leurs métabolites sont présents, mais, dans les ovaires, seuls
les composés parents sont retrouvés (Lee, 1993). Ceux-ci transiteraient par le biais de la
lipovitelline, qui représente 80 à 90% des protéines de l'ovocyte et qui permet d'apporter à
l'embryon les protéines et les lipides nécessaires à son bon développement. Le transport des
contaminants par la vitellogénine (Lee, 1993; Montverdi and Di Giulio, 2000) serait un facteur
déterminant dans le transfert maternel. Ce mécanisme de décontamination est efficace pour la
mère (Daouk et al., 2011).
Dans notre étude, nous avons mis en évidence quelques altérations au niveau moléculaire,
notamment au niveau de l’expression et de la régulation des gènes dans le cerveau et dans les
gonades. Les dosages de sérotonine et de dopamine que nous ne possédons pas encore devraient
également nous aider par la suite. Ces modifications subtiles, peuvent tout de même avoir des
répercussions importantes. C'est ce que nous allons essayer d'analyser par la suite.
II Impact des HAP au niveau individuel
Après les effets au niveau moléculaire et cellulaire qui ont été étudiés précédemment,
l’évaluation des effets au niveau individuel sera présentée ici. Les effets observés à l’échelle
individuelle au niveau de la croissance et de la survie, puis du comportement, et enfin de la
reproduction seront discutés, puis l’influence de ces effets sur les variables mesurés sera analysée.
317
1) Altération de la croissance et de la survie
a) Le développement
Dans notre étude, seuls les poissons exposés par voie sédimentaire peuvent s’être
retrouvés dans le cas où des contaminants traversent le chorion. Les métabolites ont été quantifiés
dans ces poissons. Des métabolites de faible nombre de cycles (fluoranthène) ont été retrouvés
dans notre étude. On sait que certains composés chimiques traversent facilement ce chorion. C'est
par exemple le cas de l'atrazine (Wiegand et al., 2000), de l'éthanol (Ali et al., 2011a) ou du
Bisphénol A (Saili et al., 2012). Dans une étude concernant les HAP, du fluoranthène a été enrobé
sur du sédiment, naturel et artificiel, et mélangé à d'autres POP. Les œufs ont été directement
exposés 48 heures. Des effets sublétaux ont été caractérisés dans tous les cas (Zielke et al., 2011),
ce qui nous laisse penser qu'une partie de ces molécules traverse bien le chorion (Le Bihanic et al.,
Submitted ; Vicquelin et al., 2011). Cela a été mis en évidence dans les cas des HAP (Djomo et
al., 1996; Hornung et al., 2007; Hornung et al., 2004).
Dès la naissance et jusqu'à environ 10 jpf, les poissons zèbre disposent d'un vitellus qui
leur sert de réserves nutritives. Dans cette thèse, c'est un organe qui n'a pas bénéficié d'une étude
approfondie. L’embryon puise dans ce sac au début de sa vie, ceux sont ses réserves nutritives, et
cela constitue aussi la première voie d'exposition des embryons aux contaminants (Nye et al.,
2007). Des œdèmes, qui peuvent entraîner une malabsorption des réserves, sont observés après
une exposition aux HAP dissous comme le phénanthrène, mais aussi avec le dibenzothiophène,
souvent présent dans les pétroles lourds (Correia et al., 2007; Incardona et al., 2004). Chez le
saumon et le médaka, c'est également suite à une exposition aux HAP dissous que des œdèmes de
ce type apparaîssent (Carls and Thedinga, 2009; Farwell et al., 2006). Ces altérations peuvent,
pendant la période de développement, entraîner des effets qui apparaissent à plus long terme.
b) La calcification de la mâchoire
Les effets des HAP en mélange sur la mâchoire du poisson zèbre après 10 jours de
contamination, soit à 15 jpf ont été étudiés ici. Une réduction des distances inter-maxillaires pour
les trois fractions ainsi que pour les angles antérieurs pour les PY-3X ont été observées. Li et al.
parviennent au même constat avec une réduction de ces distances chez Sebastiscus marmoratus
après une exposition au phénanthrène de 6 jours (Li et al., 2011) (Figure 56). Les malformations
cranofaciales ont été montrées chez des larves de différentes espèces suite à des expositions au
2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) chez le poisson zèbre (Henry et al., 1997; King
318
Heiden et al., 2009; Wannemacher et al., 1992; Xiong et al., 2008) ou à des HAP dissous chez le
médaka (Oryzias latipes) (Farwell et al., 2006).
Figure 56 : Vue ventrale de têtes de larves de Sebastiscus marmoratus traitées après éclosion
avec 0.01% de DMSO (control)
(A) et 1 mg/L de phénanthrène (B) pendant 8 jours. Abreviations : ep-ethmoid plate
(Neurocranium), sy-symplectic (Hyoid arch), mc-Meckel’s cartilage (lower jaw), ch-ceratohyal
(one of hyoid arch), cb-ceratobranchial (branchial arches). Echelle égale à 100 mm. D'après (Li et
al., 2011).
Ces malformations, décelées très tôt chez les larves, persistent jusqu'à l'âge adulte. Nous
avons également pu observer ce type de malformation plus tardivement, particulièrement chez nos
poissons HO, juste avant leur prélevement, à 7 mpf (Figure 57). Des altérations similaires mais
moins prononcées ont été observées chez les LO.
a
b
c
Figure 57 : Vue latérale de têtes de poissons zèbre à 6 mpf après exposition par voie
alimentaire à la fraction HO pris au grossissement x6.3 de la loupe binoculaire.
a) poisson contrôle. b) poisson HO-1X et c) poisson HO-3X présentant une déformation de la
mâchoire.
Les malformations de la mâchoire ne sont donc pas létales, puisque nous les avons
observées précocement à 15 jpf et que nous les retrouvons à 6 mpf, mais elles peuvent être
handicapantes pour le poisson, notamment pour se nourrir. Les C'est peut-être l’un des paramètres
qui joue sur la croissance et la survie de ces poissons.
319
c) Calcification des vertèbres
Lors de cette étude, nous avons comptabilisé les vertèbres calcifiées à 15 jpf, soit après 10
jours de contamination, comme pour la mâchoire. D'importantes différences ont été mises en avant
lors de cette étude chez les HO et les LO. Après seulement 10 jours de contamination, un retard de
développement des vertèbres était déjà visible (Figure 58 a et b). La minéralisation a déjà été
proposée comme biomarqueur chez d'autres espèces. En effet, chez le bar, les os sont moins
minéralisés chez les poissons exposés aux HAP que chez les poissons contrôle (Danion et al.,
2011). Le retard de minéralisation n'est pas le seul effet observé. Les poissons exposés présentent
des déformations du squelette et de l'épine dorsale, qui se courbe (Carls and Thedinga, 2009;
Farwell et al., 2006; Incardona et al., 2004).
Figure 58 : Altération des vertèbres chez le poisson zèbre après exposition aux HAP par voie
alimentaire. a) Vertèbres chez un poisson contrôle. b) Réduction du nombre de vertèbres chez les
poissons exposés à la fraction HO. c) Déformation de l'épine dorsale d'un poisson adulte exposé
aux HAP PY par voie alimentaire.
Ces déformations sont persistantes car elles sont visibles à l’âge adulte (Figure 58 c) et
peuvent entraîner des difficultés pour l’alimentation, le comportement, notamment l’activité de
nage, ou encore la reproduction.
d) L’osmorégulation
Des problèmes d'osmorégulation ont été observés chez les poissons HO et les LO lorsque la
contamination augmente, que ceux-ci soit en challenge osmotique (c'est-à-dire dans de l'eau
désionisée) ou non. En revanche, chez les poissons PY, des différences d'osmorégulation n'ont été
observées qu'en situation de challenge osmotique. Des modifications dues aux taux d'enzymes et
de protéines ont déjà pu être observées après une exposition à des HAP. C’est le cas du saumon
après une exposition par l'aliment (Oncorhynchus tshawytscha) (Meador et al., 2006). L'altération
du taux d'albumine, impliquée dans le maintien de la pression osmotique, pourrait modifier
l'osmorégulation en présence de HAP. L'activité ATPasique Na+/K+ serait inhibée avec les
320
contaminants et entrerait en jeux dans les mécanismes toxicologiques qui induisent des œdèmes et
des modifications de développement au niveau du squelette (Li et al., 2011). Des problèmes
d'osmorégulation dans les branchies ont également pu être mis en évidence après une exposition
au phénanthrène chez la dorade (Sparus aurata) (Correia et al., 2007). Dans le projet ConPhyPOP,
les branchies ont été étudiées en histopathologie,
mais aucune altération n'a été cependant
décelée. En revanche, chez le poisson lapin (Siganus canaliculatus), une exposition à un mélange
de type HO entraîne une rupture de l'épithelium des filaments des branchies (Agamy, 2013b). Une
exposition à un pétrole Arabian light, similaire à notre fraction LO, engendre une diminution de la
longueur des branchies, de la largeur des lamelles et du diamètre du sinus central. Ces différences
sont liées à une stratégie de diminution de contact avec le polluant. Tous ces changements
entraînent une réduction de la surface des branchies et diminueraient l’apport en O2, ce qui
pourrait avoir pour conséquence des dysfonctionnements (Agamy, 2013a), une diminution du
métabolisme respiratoire lié en partie à une réduction de la captation de l'oxygène et impacter la
survie. Il faut signaler que, dans ces études, les expositions ont été faites par voie aqueuse.
e) Le système digestif
Dans notre étude comme dans d'autres, les analyses histopathologiques ont identifié le foie
comme l'organe cible le plus touché par ces expositions (Ungerer and Thomas, 1996). Dans notre
étude, des nodules et des tumeurs ont été observés sur cet organe et plus rarement dans le
pancréas. Des lésions au niveau des hépatocytes et des cellules épithéliales du canal biliaire ont été
observées. Le foie occupe trois fonctions principales : une fonction de synthèse (glucides, lipides,
protéines), une fonction de stockage (vitamines et glycogène) et une dernière fonction d'épuration.
Cette dernière fonction fait qu'il est particulièrement exposé aux contaminants. Après une
contamination, le taille du foie peut augmenter de manière importante (Jee et al., 2006). Dans
d'autre cas, on peut observer une nécrose des hépatocytes et du pancréas (Henry et al., 1997) qui
se trouve à proximité.
L’étude des enzymes digestives chez les PY montre une réduction de l'activité de ces enzymes.
Les HO et les LO ont été soumis à un jeun d'une semaine pour évaluer la reprise de l'activité des
enzymes digestives. Celle-ci est largement affectée chez les HO. Chez les LO, seuls les LO-3X
présentent une activité phosphatase alcaline réduite. Une réduction de l’activité de la lipase et de
l’amylase a été décrite par Meador et al.(Meador et al., 2006) après une exposition de saumon
royal à une mixture de HAP. Ces altérations au niveau du système digestif entraînent une moins
bonne assimilation des aliments ingérés.
321
f) La croissance et la survie
Nous avons observé un fort impact des trois fractions sur la croissance individuelle. Le
poids et la taille ont été affectés avec chacune d'entre eulles. Chez certaines espèces, comme des
isopodes terrestres, l'administration par voie orale de 5 HAP n'entraîne pas de fort impact sur la
croissance (Van Brummelen et al., 1996). Cependant, dans d'autres études, il a déjà été montré que
la croissance pouvait être très touchée. Dans ces cas, la croissance est réduite, comme par
exemple, après des expositions aux herbicides ou aux insecticides (Ensenbach and Nagel, 1995),
au TCDD (Wannemacher et al., 1992) ou aux HAP (Gilliers et al., 2012; Gundersen et al., 1996;
Kim et al., 2008; Spitsbergen et al., 2000).
Dans notre étude, nous avons observé une diminution de la survie chez les poissons adultes
les plus contaminés, notamment dans les fractions HO. Chez les larves, on sait que 48 heures
d'exposition à un sédiment sont suffisantes pour évaluer l'embryotoxicité de celui-ci et voir
l'impact direct sur la survie (Hollert et al., 2003). Dans le cas d'une contamination aux HAP, les
poissons zèbre sont plus sensibles quand ils sont exposés 3 semaines aux stades alevins que
lorsqu’ils sont exposés 60 heures à 2 mois post-éclosion (Spitsbergen et al., 2000). La survie peut
en outre être réduite lors d'une exposition à des doses environnementales de HAP (Diekmann and
Nagel, 2005; Heintz et al., 1999; Oberdörster et al., 2000; Spitsbergen et al., 2000). La survie des
œufs sur du sédiment contaminé est influencée surtout par la matière organique (Höss et al.,
2010). La concentration de HAP dans les œufs peut augmenter vite pendant les premières 24
heures (Djomo et al., 1996) ou lors d'une période critique pendant laquelle les animaux sont plus
fragiles, comme par exemple lors d’une mue chez le crabe (Mothershead Ii and Hale, 1992). Les
composés les moins lourds pénètrent plus facilement que les autres (Djomo et al., 1996). D'autres
types de contaminants affectent aussi la survie comme des insecticides/bactéricides/herbicides
(Ensenbach and Nagel, 1995; Nagel et al., 1991; Zhou et al., 2009), du TCDD (King Heiden et al.,
2009), des nanoparticules (Wang et al., 2011) ou de l'EE2 (Nash et al., 2004). La survie est
multifactorielle, et comme nous l’avons vu précédemment, elle ne se résume pas à la mortalité
immédiatement mesurée. En effet, chez le saumon, la réduction des lipides suite à une exposition
aux HAP réduit donc les réserves énergétiques et peut avoir un impact directe sur la survie
(Meador et al., 2006).
322
2) Altérations comportementales
a) Le système visuel
Dans cette étude, nous avons constaté des cas fréquents d'exophtalmie (données non
publiées) sur les contaminations les plus fortes dans les fractions HO et LO (Figure 59). En
revanche, quelques rares cas de dysplasies rétiniennes avec probablement des troubles de la vision
associés, ont été vus chez au moins 2 poissons (10%) exposés à la fraction PY-1X à 3 mpf. Le
poisson zèbre a une bonne résolution spatiale et un bon contraste visuel (Mueller and Neuhauss,
2010). Après 24 hpf, les photorécepteurs sont tous mis en place et deviennent multiples entre 4 et
8 jpf, soit juste au début de l'alimentation (Branchek and Bremiller, 1984). Après cela, le poisson
zèbre est capable de discriminer les lignes verticales et horizontales (Colwill et al., 2005). Les
poissons possèdent des ganglions ON et OFF impliqués dans la réponse à un stimulus visuel
(Emran et al., 2007). Ils voient également les couleurs entre 320 et 640 nm et possèdent des cônes
de types S, M et L (Risner et al., 2006). Malgré tout, les poissons zèbre ont une préférence visuelle
pour les faibles longueurs d'ondes.
a b
Figure 59 : Cas d'une exophtalmie.
a) poisson contrôle. b) poisson HO-3X présentant une exophtalmie sur l'œil gauche.
Des yeux anormaux présentant des exophtalmies ont été observés après une exposition à
l'éthanol (Ali et al., 2011b), ainsi que des déformations chez les embryons de saumon après une
contamination aux HAP (Carls and Thedinga, 2009). Un retard de développement des yeux après
une exposition au sédiment de la rivière Yangtzé (Wu et al., 2009) vient alourdir le bilan. Enfin,
les HAP induiraient une accélération des troubles de la vision (Wang et al., 2009). Ces troubles de
la vision pourraient entraîner des perturbations dans la perception de la lumière ou dans la
discrimination de formes ou de couleurs. Dans ce cas, le comportement, la recherche de nourriture
ou d'un partenaire sexuel pourraient s'avérer compliqué. En revanche, lors de notre étude, pas ou
très peu d'anomalies rétiniennes ont été décelées lors de l'examen histopathologique, ce qui ne
veut pas dire qu'il n'y ait pas de défaillance visuelle chez nos poissons.
323
b) La vessie natatoire
La vessie natatoire a une fonction de maintien de l'équilibre du poisson dans l'eau. Elle
aide à la flottaison et joue un rôle dans les mouvements verticaux des poissons et dans leurs
capacités auditives (Bang et al., 2002). Dans le projet, lors de l'élevage des poissons avec les 3
aliments en simultané, nous avons observé que les poissons HO-3X et LO-3X en particulier
étaient constamment dans la partie inférieure du bac, voire posés sur le fond, même pendant la
distribution de nourriture (données non publiées). Des comportements similaires ont déjà été mis
en évidence suite à une contamination au TCDD (Wannemacher et al., 1992). La vessie natatoire
étant capitale dans le maintien de la position chez les poissons, nous avons émis l'hypothèse que,
peut-être, elle serait impliquée dans cette position profonde permanente des poissons.
c) Comportement
Dans le cadre de notre étude, nous avons observé une altération de la distance parcourue
chez les poissons juvéniles et adultes les plus contaminés. Le comportement a été très souvent
évalué par la distance parcourue par le poisson. C'est la variable la plus fiable pour rendre compte
de l'activité (de Esch et al., 2012). Il existe quatre types de réponses locomotrices à une exposition
à des produits chimiques : une réponse avec une locomotion en augmentation constante, une
réponse en diminution constante, une réponse en augmentation au départ, puis avec une
diminution ensuite et pas de réponse (Ali et al., 2011b).
Dans notre étude, la distance parcourue n’a pas été la seule variable évaluée. En effet, il
existe beaucoup d'autres tests (Ali et al., 2011c) qui permettent de rendre compte effets tels que la
neurotoxicité, en évaluant par exemple l'anxiété, l'apprentissage ou la sociabilisation.
Dans de nombreux cas, les HAP entraînent une réduction de l'activité de nage (Gonçalves
et al., 2008; Hicken et al., 2011), même à de faibles concentrations. Ce résultat correspond à
certaines de nos observations. On sait que sans contamination, une augmentation de la locomotion
est observée juste avant la ponte et ce pendant 5 heures (Blanco-Vives and Sánchez-Vázquez,
2009), ce qui correspond à nos données de nage chez des poissons contrôle (Vignet et al., 2013) et
aux données observées dans le cadre de cette étude. Dans certains cas, une privation du sommeil
en fin de nuit peut entraîner une augmentation de la locomotion le jour (Zhdanova, 2006). Cette
réduction de la locomotion peut éventuellement être induite par les HAP.
Lors de l'étude de l'activité locomotrice 72 heures chez les larves, une différence d'activité
entre le jour et la nuit a été mise en évidence. La locomotion chez les larves se met en place à 4 jpf
324
et tend à augmenter jusqu'à 7 jpf (Colwill and Creton, 2011; Vignet et al., 2013). Nos données
sont conformes à celles énoncées ci-dessus. Une nage moins importante au début du test (à 4jpf)
est mesurée, puis une très forte activité le jour et une activité relativement faible la nuit sont
observées. Les larves F1, issues de parents contaminés, ont révélé une baisse de l'activité pour
celles nées de parents PY-0.3X et, au contraire, une augmentation de l'activité pour celles nées de
parents PY-3X. Une réduction de l'activité chez celles nées de parents LO a été mise en évidence
par rapport au contrôle. On sait qu’une exposition de larves de poisson zèbre à l'éthanol affecte la
locomotion (Ali et al., 2011a; Chen et al., 2011; Lockwood et al., 2004). Elle entraîne une
augmentation de l'activité à faible concentration (Gerlai et al., 2000; Irons et al., 2010; MacPhail
et al., 2009). Cependant, lorsque la concentration est trop élevée, une diminution voire un arrêt de
l'activité est constaté (Gerlai et al., 2000; Irons et al., 2010; MacPhail et al., 2009). Dans le cas des
larves F1 nées de parents PY, l'effet inverse a été observé. L'activité basale peut être altérée par
d'autres
molécules
comme
la
6-hydroxydopamine
et
la
1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-
tetrahydropyridine (Anichtchik et al., 2004), la cocaïne (López-Patiño et al., 2008), les PCB 126
(Couillard et al., 2011), le diazepam ou la caféine (Schnörr et al., 2012), le bisphénol A (Saili et
al., 2012) ou les PDBE (Chen et al., 2012) et être diminuée chez les larves malformées (Padilla et
al., 2011). Selon la fraction utilisée, des effets contrastés pourraient être à relier avec des
mécanismes d’action différents
Au niveau de l'exploration, nous avons utilisé le labyrinthe (le maze en anglais). Les
poissons contaminés lors de notre étude présentent des capacités d'exploration réduites. Dans le Zmaze, nous avons constaté que les poissons contaminés mettaient plus de temps à sortir de la zone
de départ, qui est noire, que les poissons contrôle. Une étude a montré que les poissons non
stressés avaient une préférence pour les zones éclairées alors que les poissons stressés de manière
mécanique n'en avait plus (Champagne et al., 2010). Le niveau de la "luminosité" de la case départ
peut aussi entraîner des différences de réponse. En effet, une étude montre que des juvéniles non
contaminés placés en zone noire mettent peu de temps pour aller en zone blanche, alors qu’à
l'inverse, quand le départ est en zone blanche, ils mettent significativement plus de temps à aller
explorer la zone sombre (Steenbergen et al., 2011). Dans notre étude, la seule expérience qui
présente un tel contraste est le Z-maze. En effet, le départ se fait en zone sombre, et, ensuite,
l’exploration se déroule en zone claire. Dans tous les cas, les poissons non contaminés ont
tendance, parfois de manière significative, à sortir plus vite de cette zone que les autres. De plus,
le maze est fréquemment utilisé comme un outil d'apprentissage (Sison and Gerlai, 2010). Dans
notre cas, il a plutôt été utilisé pour caractériser le comportement exploratoire dans un nouvel
325
environnement. D'autres études, notamment chez le rat, ont montré une altération des capacités
d'exploration après une exposition via la mère aux HAP (Crépeaux et al., 2012, 2013), une telle
approche serait à envisager dans le futur.
L'anxiété a été évaluée dans le "novel tank" et une élévation de l'anxiété a pu être observée
avec l'augmentation de la contamination. Un poisson anxieux est un poisson figé, présentant des
battements d'opercules rapides et réalisant des mouvements erratiques (Maximino et al., 2010).
Les effets révélés dans notre étude sont conformes à ceux réalisés dans des expériences utilisant le
"novel tank" et des HAP. Dans ces autres études, une augmentation de la léthargie est également
observée (Gonçalves et al., 2008). Mais tous les HAP n'induisent pas les mêmes effets. D'autres
molécules ont montré des effets similaires (Hallgren et al., 2011).
D'autres traits de caractère n'ont pas été évalué mais pourraient intervenir au niveau de la
variabilité individuelle liée à l'anxiété comme la timidité et la curiosité, qui ont une part de
composante génétique (Wright et al., 2003). Il en est de même pour l'agressivité chez les poissons,
qui est variable. Elle peut être augmentée par un mélange de deux lignées dès leurs plus jeune âge,
entraînant par exemple une cohabitation forcée (Moretz et al., 2007). Elle peut diminuer dans
certains cas, par exemple en présence de fluoxétine (Norton et al., 2011). Malgré tout, ces traits de
caractère sont importants pour le poisson. Par exemple, chez le poisson zèbre, plus le mâle est
agressif et audacieux, plus il se reproduit (Ariyomo and Watt, 2012). Une augmentation de
l'anxiété peut avoir des conséquences négative sur les chances de reproduction.
Enfin, au niveau de l'apprentissage, nous n'avons pas vraiment réussi à discriminer
clairement si oui ou non les poissons contaminés avaient des capacités de mémoire altérées. Nos
résultats lors de l'apprentissage d'une couleur, n’ont pas montré de différences significatives. Il a
été prouvé que la réponse peut-être lignée-spécifique (Vignet et al., 2013; Vital and Martins,
2011) et que des centaines de gènes sont impliqués dans l'apprentissage et la mémoire (Gerlai,
2010). D'autre part, pour obtenir une augmentation du nombre de réponses correctes, il faut
augmenter le nombre de répétitions du même test. Les juvéniles apprennent à un rythme supérieur
ou égal aux adultes. Ils retiennent 10 jours au moins ce qu'ils ont appris et on obtient un bon
résultat après 20 jours d'apprentissage (Williams et al., 2002). Les animaux aquatiques sont
capables d'apprendre des tâches compliquées (Parker et al., 2012a), de mémoriser un parcours
(Alves et al., 2007) ou de discriminer deux formes relativement proches en quelques jours
(Siebeck et al., 2009). Dans notre cas, les poissons ont été pêchés et placés directement dans le
dispositif de test, avec seulement 2 minutes d’acclimatation. Dans le cas de la lignée TU, il se peut
326
qu’un temps d’acclimatation plus long soit nécessaire. En effet, chez les poissons stressés, la
mémoire spatiale et les apprentissages sont affectés (Gaikwad et al., 2011) et il a été montré que
les HAP altèrent la mémorisation (Saili et al., 2012; Sheng et al., 2010).
4) Altérations au niveau de la reproduction et transfert maternel
a) Le système reproducteur
Dans notre étude, l'histologie a été réalisée à 7mpf pour les HO et à 9 mpf pour les autres
(PY et LO). On sait que les composés hydrophobes sont lipophiles et se stockent
préférentiellement dans les ovaires (Ungerer and Thomas, 1996). Bien que les femelles HO-1X et
HO-3X et les femelles LO-3X présentent des gonades non matures sur les coupes histologiques,
on peut néanmoins affirmer que ce sont bien des individus différenciés femelles avec un ovaire
non mature, car le stade gonade hermaphrodite a été dépassé (Fenske and Segner, 2004; Maack et
al., 2003). Nous sommes en présence de femelles avec des ovaires possédant des follicules de
stades I et II pour les plus atteintes. Nous avons constaté un seul cas de poisson intersexué à 7 mpf
chez un HO-3X, comme on peut l'observer fréquemment après une exposition à de l'EE2 (Nash et
al., 2004). En effet, si l'analyse est réalisée trop tôt ou si les gonades sont étudiées trop jeunes, on
ne peut pas affirmer avec certitude le fait que l'on se trouve en présence d'un cas d'intersexualité
ou d'un cas de différentiation en testicules retardés suite à une exposition aux polluants (Maack
and Segner, 2003). Une diminution ou disparition du nombre de follicules de type IV et une
augmentation de ceux de type I ont également été observés dans les cas d'exposition à des
nanoparticules (Figure 60) ou des PCB (Daouk et al., 2011; Wang et al., 2011). Les polluants
peuvent également influencer la différenciation sexuelle (King Heiden et al., 2009).
Chez les mâles, les testicules ont été analysés en histologie aux mêmes âges que les
femelles. Aucun problème n’a été observé chez les PY. En revanche, des cas d'hypoplasies
testiculaires ont été mis en évidence chez les mâles HO-3X, mais aussi, quoique avec une
incidence plus faible, chez les mâles HO-1X (6.4%) et LO-3X (7.4%).
La maturation incomplète des ovaires ainsi que les problèmes observés au niveau
histologique entraînent une réduction du nombre de pontes.
327
Figure 60 : Changements histologiques après une exposition à long terme au nTiO2 chez le
poisson zèbre.
A gauche : sections représentatives d'ovaire contrôle (haut) et d'ovaire traité avec 0.1 mg/L de
nTiO2 (bas). Echelle 200µm. A droite : pourcentage moyen des différents stades de
développement des follicules présents (Wang et al., 2011)
b) Reproduction et transfert maternel
Dans le cadre de notre projet, la reproduction a été affectée de manière extrêmement
importante. Elle a précédemment été décrite et caractérisée chez le poisson zèbre sans
contaminants (Darrow and Harris, 2004). Les trois fractions utilisées ont eu des effets similaires
avec une diminution, voire un arrêt de la reproduction, mais elles semblent avoir des modes
d'action différents. Incardona et al. ont montré que le pyrène, le chrysène et le benzo[a]anthracène
avaient des modes d'actions divergents dans un même organisme (Incardona et al., 2006). Les
poissons 3X-PY qui présentaient une morphologie externe normale n'ont presque pas pondu.
Aucun œuf n’a été obtenu des poissons HO et LO 3X. Les poissons HO et LO 1X se sont
reproduits plus tardivement. La reproduction et la survie d'une espèce sont assurées lorsque toutes
les conditions favorables sont réunies (Lawrence, 2007). En l'absence de contamination, la ponte
est synchronisée avec le cycle de lumière auquel est exposé le poisson (Blanco-Vives and
Sánchez-Vázquez, 2009). Si ce cycle est modifié, le cycle de ponte change (Blanco-Vives and
Sánchez-Vázquez, 2009). La fécondité est positivement corrélée à l'âge en milieu non contaminé
(Marchand et al., 2004). En effet, chez les poissons zèbre sains, on peut espérer une ponte tout les
1.9 jours à 12 mpf et tous les 2.7 jours à 15 mpf (Eaton and Farley, 1974). Mais lorsque le milieu
est contaminé, la fécondité est positivement corrélée au rythme de croissance ainsi qu'aux facteurs
328
de conditions (Marchand et al., 2004). Dans certains cas, comme après une exposition à l'EE2, on
observe une diminution du comportement reproducteur chez les poissons zèbre mâles exposés
(Colman et al., 2009). En règle générale, les femelles sont plus attirées par les mâles alors que les
mâles sont indifféremment attirés par les mâles ou les femelles (Turnell et al., 2003). Les femelles
semblent avoir un rôle important dans le choix du partenaire lors de la reproduction.
Au cours de la contamination, beaucoup de poissons étaient très rouges suite à des
problèmes d'hémorragies. Cette couleur de peau pourrait représenter un frein à la reproduction
pour les autres poissons du bac. En effet, nous savons que les poissons non contaminés ne restent
pas indifférents devant ceux qui les entourent. Les couleurs affectent leurs préférences. Par
exemple, un poisson zèbre rouge, qui n'existe pas dans la nature, n'attire pas beaucoup ses
congénères. A l'inverse, un poisson très jaune attirera beaucoup l'attention. L'hypothèse mise en
avant expliquerait la couleur jaune comme un signe de bonne santé et de maturité pour la
reproduction (Saverino and Gerlai, 2008). En effet, les pigments des téléostéens jouent un rôle
dans le comportement de groupe, dans la reconnaissance du partenaire sexuel et dans le choix de
celui-ci (Parichy, 2006; Spence and Smith, 2008).
Dans notre étude, les poissons les plus contaminés présentaient des ovaires contenant
presque exclusivement des follicules de stades I et II . En outre, une diminution de la production
des œufs a été observée dans notre étude après une contamination aux HAP. Dans d'autres cas, une
diminution du nombre d’œufs a été constatée après une exposition au TCDD (King Heiden et al.,
2009; Wannemacher et al., 1992) aux nanoparticules (Wang et al., 2011), à l'EE2 (Filby et al.,
2012; Larsen et al., 2008; Nash et al., 2004), aux organochlorés (Roex et al., 2001) ou aux PCB
(Daouk et al., 2011). Des soles directement exposées dans le milieu naturel voient leur production
d’œufs et leur capacité à produire des œufs réduites (Casillas et al., 1991; Johnson et al., 1998).
Mais ce phénomène n'est pas exclusif aux poissons. En effet, chez la crevette exposée au pyrène, il
a été montré que les mâles étaient très affectés par le contaminant et avaient des difficultés à se
reproduire (Oberdörster et al., 2000). Il en est de même chez la moule où les HAP affectent les
gamètes qui sont réduites et déformées (Eertman et al., 1995). Dans notre cas, nous avons
également mis en avant une augmentation du nombre de follicules immatures. D'autres ont obtenu
le même résultat après une exposition au TCDD (Wannemacher et al., 1992), aux nanoparticules
(Wang et al., 2011) ou aux PCB (Daouk et al., 2011).
329
Les contaminants en général, et les HAP en particulier, induisent de nombreuses altérations
au niveau individuel sur certains organes et fonctions associées. Ces altérations ont aussi des
répercussions sur les réponses comportementales individuelles.
III Impact des HAP : pertinence écologique
Les effets des HAP ont été observés aux niveaux moléculaire, cellulaire et individuel. Ils
peuvent également avoir un impact à un niveau écologique.
Les HAP ont, comme nous l’avons montré, de larges conséquences sur la santé des
poissons. On observe une réduction de la croissance (Hinkle-Conn et al., 1998) (Vignet et al.,
articles 2 et 3), une augmentation du nombre de mutations (Driever et al., 1996), de tumeurs et des
lésions tissulaires notamment (Larcher et al., article 7). Dans le milieu naturel, l'alimentation est la
première source de contamination chez les poissons (Yanagida et al., 2012). Les poissons
contaminés ont plus de mal à se nourrir, ils sont moins rapides et ils ingèrent des proies plus
faciles à attraper, parfois malades ou fortement contaminées. Lorsque quelques individus
seulement sont touchés, les effets sont faibles, mais, ces conséquences seront beaucoup plus
importantes si toute la population est affectée.
Dans nos travaux (Vignet et al., article 3), nous avons d’une part montré une diminution de
l’activité enzymatique, qui peut entraîner une baisse de l'assimilation des aliments ingérés. D’autre
part, nous avons mis en évidence le fait que les animaux contaminés sont susceptibles de manger
des proies de moins bonne qualité. Ils sont alors à même d’accéder à un nombre de calories
disponibles plus faible (Moles and Rice, 1983) et d’avoir des réserves lipidiques réduites (Gilliers
et al., 2012). De ce fait, le pourcentage de nourriture consommé converti en réserve est
considérablement abaissé chez les poissons exposés (Palanikumar et al., 2013). La population est
affaiblie car les individus qui la composent ont accumulé moins d’énergie. Cette énergie non
ingérée ne pourra pas être allouée aux fonctions non vitales comme la croissance ou la
reproduction (Figure 61). En effet, les mécanismes de détoxification ont un coût pour l'organisme.
Ils entraînent une diminution de l'énergie allouée à la croissance, à la reproduction et diminuent
l'énergie disponible dans les muscles, ce qui a un impact direct sur la locomotion (Marchand et al.,
2004).
330
Figure 61 : Acquisition et allocation de l'énergie chez le poisson.
En raison de leur santé fragile et de la diminution d'énergie dans les muscles qui peuvent
altérer, entre autre, la réponse de fuite, les poissons contaminés sont aussi des proies plus faciles.
Ils sont mangés plus aisément par les prédateurs car la dépense d’énergie pour les attraper est
réduite par rapport à un poisson en pleine santé. La contamination passe alors de la proie au
prédateur (Hinkle-Conn et al., 1998), et c’est la chaîne alimentaire entière qui peut en pâtir. Ces
poissons contaminés peuvent avoir des conséquences dramatiques s’ils sont consommés par des
hommes. Par exemple, en Ontario (Canada), un site internet avec les consommations mensuelles
recommandées
pour
chaque
espèce
a
été
mis
en
place
pour
les
populations
(http://files.ontariogovernment.ca/moe_mapping/mapping/SportFish/FR/advisories. html).
La locomotion est également modifiée par les HAP (Le Bihanic et al., submitted-b)
(Vignet et al. article 1, Vignet et al. article 4 et Vignet et al. article 6). Cette altération peut
entraîner un épuisement de l’énergie des poissons lié à une augmentation permanente de l’activité
sans phase de repos. Dans d’autres cas, la locomotion est réduite car l’anxiété est augmentée. Les
poissons explorent moins et ont plus de difficultés à attraper leurs proies (Carvalho et al., 2008).
La prise de risque s’en trouve modifiée et peut aller jusqu’à faire adopter à la population un
comportement totalement contre nature. Par exemple, une nage en groupe désorganisée si les
molécules altèrent le comportement social, comme c'est le cas pour les HAP (Gonçalves et al.,
2008). Dans d’autre cas, la prise de risque peut pousser les poissons à opter pour un comportement
"inconscient" et mettre la population en position de danger, notamment face aux prédateurs.
Les HAP ont aussi des effets au niveau des gonades. Ils affectent la maturation des
gonades, réduisent le nombre d’œufs pondus, entraînent des déformations au niveau des gamètes
(Eertman et al., 1995) et réduisent le taux de fécondation. Mais avant cela, le comportement
reproducteur peut être altéré (Krång, 2007) et le sex-ratio peut également être influencé par les
HAP (Krång, 2007), comme par exemple chez les amphipodes. En conséquence de ces
331
modifications, le nombre d’œufs, le taux de fécondation et le succès reproductif sont diminués
(Meador et al., 2006; Oberdörster et al., 2000). De plus, un transfert maternel aux œufs des HAP
peut avoir lieu. Ce phénomène a été mis en évidence chez des oiseaux (Pereira et al., 2009). En
milieu naturel, les œufs sont ensuite soumis à la prédation, aux conditions climatiques, aux
pathogènes et à la sélection naturelle. Ils sont également soumis aux HAP dissous qui pénètrent
dans l'œuf (Djomo et al., 1996) dans le cas d'organismes aquatiques et qui peuvent altérer
l'éclosion (Fallahtafti et al., 2012; Frantzen et al., 2012). Ils rencontrent par ailleurs des problèmes
de développement liés aux HAP déjà présents dans l'œuf, via le transfert maternel (Casillas et al.,
1991; Holth et al., 2008).
La diminution de la reproduction peut entraîner une baisse de la fécondité de la population.
Si les larves sont de moins bonne qualité, alors il y aura aussi une altération de la survie
(Diekmann and Nagel, 2005; Heintz et al., 1999; Oberdörster et al., 2000; Spitsbergen et al.,
2000), qui peut aller jusqu'à la disparition de l’espèce. Cette disparition peut être accélérée si ces
animaux subissent, en plus d’une pression chimique, une pression d’exploitation forte. Pour
sauvegarder certaines espèces, des tests sont même en cours pour pratiquer des fécondations in
vitro (FIV) avec des œufs de poissons (Poleo et al., 2001) à des fins de repeuplement. Sans mesure
de protection, on peut assister à un déséquilibre de l’écosystème avec une prolifération des proies
et une disparition des prédateurs ou vice-versa. En effet, la contamination dépend en grande partie
du régime alimentaire (Henry et al., 2004), et si les prédateurs ne parviennent pas à se nourrir
d’une autre espèce, ils sont voués à la disparition. Dans d’autres cas, une autre espèce, similaire à
celle impactée, peut alors prendre la place. Cette nouvelle espèce, plus tolérante et/ou plus
résistante, occupera la même niche écologique. Tous ces effets au niveau de la population et de
l'écosystème sont liés entre eux.
En effet, lors de ce travail, nous avons identifié plusieurs variables que les HAP pouvaient
impacter : la santé du poisson, la croissance, la digestion, la prédation, l'énergie absorbée,
transformée et/ou consommée, le comportement, la reproduction et la survie (Figure 62).
332
HAP individuels
ou en mélanges
Immunité
Comportement
Métabolisme
Osmorégulation
Reproduction
Population
Recrutement
Malformations
Croissance
Génotoxicité
Tumorigénèse
Survie
individuelle
Figure 62 : Principales fonctions affectées lors d'une contamination aux HAP en milieu aquatique.
Les flèches partent de la fonction étudiée : celles en trait plein montrent les effets démontrés dans le cadre des travaux réalisés dans cette thèse et
le consortium ConPhyPoP, celles en trait pointillé montrent des effets suspectés. Les fonctions sur fond coloré sont celles qui ont été plus
particulièrement étudiées dans le cadre de cette thèse.
333
334
335
336
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Dans le cadre de ce projet, de nombreux effets à long terme suite à une exposition aux
HAP ont été démontrés. Tous les objectifs de la thèse qui étaient fixés au départ ont été atteints.
Au cours de cette étude, il a été mis en évidence que les effets des HAP sur l'environnement sont
conséquents, et que l'impact de ces effets se situe à tous les niveaux.
Une contamination relativement courte, mais durant les premiers stades du développement,
induit des effets à long terme au niveau du comportement des F0 et des F1. Les poissons ont bien
été exposés, puisque l'étude des métabolites s'est révélée positive. Les effets observés chez les
adultes plus de 6 mois après l'exposition, alors qu'ils n'ont jamais été remis en contact avec un
quelconque contaminant, laissent présager des conséquences de plus grande ampleur dans le
milieu naturel, où les poissons seront forcément soumis à d'autres facteurs de stress naturels ou
chimiques au cours de leur vie. De plus, dans l'environnement, les mélanges retrouvés sont encore
plus complexes que ceux que nous avons testés. Certains concentrent une multitude de HAP, mais
aussi des PCB, des PBDE et des métaux lourds par exemple.
La réalisation d'une exposition chronique par voie alimentaire à 3 fractions de HAP a
montré une gradation des effets selon la fraction utilisée (PY<LO<HO). Cette gradation a été
identifiée dans tous les tests, aussi bien au niveau de la survie, de la croissance, de la reproduction
que du comportement. Cette gradation des effets a également été retrouvée lors d'exposition par
voie sédimentaire chez le médaka et chez la truite (Le Bihanic et al., submitted-a). Dans le cadre
d'une future étude, étudier les poissons après une période de décontamination permettrait peut-être
d'observer des phénomènes d'amélioration de l'état général des poissons et une atténuation des
effets sur la génération F1.
Il serait également envisageable de combiner ces deux voies de contamination et
d'imaginer un dispositif de contamination précoce à une fraction par voie sédimentaire durant le
stade œuf, puis, par la suite, d'enrober cette même fraction à de l'aliment et de nourrir les poissons
précédemment exposés à du sédiment avec cette nourriture. Cette combinaison des deux voies de
contamination serait en accord avec ce qui se passe dans les milieux aquatiques naturels.
Lors de ce travail de thèse, une première approche, principalement au niveau individuel, a
été mise en place et/ou développée selon les expériences. Une fois ce travail réalisé, il serait
intéressant d’approfondir certains tests comportementaux, par exemple au niveau des altérations
337
possibles de l'apprentissage. Par ailleurs, les poissons ont tous été challengés de manière
individuelle, aucun test de groupe n'a été réalisé. A l'avenir, avec les progrès constants des
logiciels d’analyse vidéo, il sera sans doute possible de suivre un groupe de poisson de manière
plus automatisée. Si les poissons sont marqués, il serait intéressant d'envisager de mettre un
poisson contaminé dans un groupe de poissons non contaminés et inversement pour étudier la
cohésion sociale du groupe et le comportement de nage. Dans le cas de ce dernier test, toutes les
combinaisons sont possibles quant au nombre de poissons contrôle et de poissons contaminés.
D'autres tests de groupe peuvent être envisagés, comme un test de prise de risque, où les poissons
sont installés dans un bac séparé en deux par une cloison opaque. Le passage entre les deux parties
du bac est possible par un petit trou. Les poissons sont placés d'un coté du bac et on comptabilise
le temps de sortie de chaque poisson. Ces indications étayeraient les données sur les effets des
HAP en mélanges sur le volet interaction avec les traits de personnalité..
Par la suite, il serait intéressant de comprendre les mécanismes qui entraînent les réponses
comportementales observées, notamment grâce à l'utilisation de molécules anxiolytiques et
anxiogéniques qui seraient administrées aux poissons contaminés et aux poissons contrôle afin
d’explorer l’altération des neurotransmetteurs, par exemple. De plus, ces dosages de métabolites à
tous les stades de vie, et pas seulement après 10 jours de contamination, pourraient être réalisés.
Cette analyse permettrait de voir si les métabolites sont toujours les mêmes au cours du temps et
en quelle proportion ils sont présents.
Au niveau de la reproduction, une analyse à tous les échelles a été réalisée. Cependant, des
informations complémentaires, notamment au niveau hormonal et moléculaire, pourraient aider à
renseigner les mécanismes sous-jacents aux observations phénotypiques. Des analyses plus
approfondies sur la descendance permettraient également de mieux comprendre les effets transgénérationnels.
Enfin, les études ont été réalisées sur 3 espèces de poissons dans le cadre du projet
ConPhyPoP, mais, il serait intéressant d'étudier d'autres espèces, situées à des niveaux différents
dans la chaîne alimentaire pour permettre une vision encore plus globale des effets au niveau
environnemental.
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Résumé:
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des polluants organiques persistants qui sont
présents en mélange complexe dans l’environnement et notamment dans les milieux aquatiques. Ils s’adsorbent
sur les particules en suspension, s’accumulent dans les sédiments et dans les premiers maillons de la chaîne
trophique. L’objectif de cette étude était de mesurer les effets à long terme d’une contamination par des HAP
chez un modèle de vertébrés : le poisson zèbre. Dans un premier temps, des embryons ont été exposés pendant
les 4 premiers jours de leur développement sur du sédiment naturel enrobé de 3 HAP individuel (phénanthrène,
pyrène et benzo[a]pyrène) puis transférés et élevés en eau propre. Dans un deuxième temps, des poissons ont été
exposés par voie alimentaire tout au long du cycle de vie et dès le premier repas à 3 fractions de HAP à doses
environnementales enrobées sur les aliments : une fraction pyrolytique (PY) extraite d’un sédiment échantillonné
dans la Seine et deux fractions pétrogéniques (un fuel lourd (HO) provenant de l’Erika et un pétrole brut type
Arabian light (LO)). Les effets à long terme sur la croissance, la survie, la reproduction et le comportement ont
été évalués à différents âges. Ces effets ont pu être observés à plusieurs échelles, i.e. de la molécule, aux tissus et
organes puis à l’échelle de l’individu. Globalement, chez les poissons contaminés, la croissance est ralentie, la
survie larvaire diminuée chez les HO, la fonction reproduction est altérée fortement à la fois au niveau hormonal,
tissulaire et phénotypique ainsi que les réponses comportementales léthargiques ou hyper-réactives selon les cas.
L’exposition par voie sédimentaire a révélé des effets visibles lorsque les individus atteignaient 6 mois
soulignant l’existence d’effets tardifs, notamment sur les réponses comportementales, d’une exposition très
précoce y compris chez la descendance. Quant à l’exposition par voie alimentaire, elle a montré une gradation
des effets. Toutes fonctions confondues, les résultats obtenus permettent d'établir une hiérarchie dans la toxicité
des fractions étudiées : PY < LO ≈ HO.L'approche multi-échelle utilisée dans ce travail a permis, en partant
d'informations acquises au niveau moléculaire, tissulaire et individuel, d'aboutir à une compréhension intégrée
des conséquences qu'une exposition à des HAP peut avoir sur l'aptitude à la survie des poissons dans leur milieu
naturel ainsi qu'à leur capacité à participer au renouvellement des générations futures.
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are persistent organic pollutants (POPs) which are found in
complex mixtures in the environment including aquatic ecosystems. They adsorb on particles, accumulate in
sediment and in the first link of the food web. The aim of this study was to measure long term effects of PAH
scontamination on a vertebrate model: the zebrafish. In a first study, embryos were exposed on natural sediment
spiked with 3 individual PAH (phenanthrene, pyrene and benzo[a]pyrene) during the first four days of their
development. In a second study, to evaluate the consequences of long-term chronic exposure to PAHs, zebrafish
were exposed, from their first meal (5 days post fertilisation) until they became reproducing adults, to diets
spiked with three PAHs fractions at environmentally relevant concentrations (0.3X, 1X and 3X; with the 1X
concentration being in the range of 4.6-6.7 μg.g-1 for total quantified PAHs). The fractions used were
representative of PAHs of pyrolytic (PY) origin or of two different oils of differing compositions (a heavy fuel
(HO) and a light crude oil (LO)). Long term effects on growth, survival, reproduction and behavior were
evaluated at different ages. Effects were observed at molecule, tissue, organ and individual scales. In general, for
contaminated fish, growth was reduced, larval survival decreased in HO, and reproduction was strongly impaired
at hormonal, tissue and phenotypic levels, and behavioral responses were lethargic or hyperactive depending on
fractions and stages. Sediment exposure still revealed visible effects when fish were 6 month old. These results
hereby showed significant late effects, especially in behavioral responses after an early exposure, including in
larvae issued from contaminated fish. In spiked diets contaminated fish, we observed a gradation of effects.
Combining all functions, we established of hierarchy in toxicity in the studied fractions: PY < LO ≈ HO. Finally,
our results gathered at a multiscale from molecule, to tissue and individuals, indicate that PAH mixtures of
different compositions, representative of situations encountered in the wild, can promote lethal and sublethal
effects which are likely to be detrimental for fish survival and recruitment into future generations
Mots clefs/ Key words: Danio rerio, lifecycle, polycyclic aromatic hydrocarbon, heavy oil, light crude oil,
alkylated PAH, lifecycle, delayed effect, anxiety-like behavior, offspring, photomotor responses, maze, novel
tank.
360

Altération de la physiologie des poissons - Archimer

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