AG GVO DNA-Extraktion Validierung

Extraktion von DNA für die Untersuchung gentechnischer
Veränderungen mittels PCR:
Leitfaden zur Einzellabor- und Ringversuchsvalidierung von Verfahren sowie der Qualitätskontrolle von extrahierter DNA
1
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Einleitung
Dieses Dokument wurde von der § 64 LFGB-Arbeitsgruppe „Entwicklung von Methoden zur
Identifizierung von mit Hilfe gentechnischer Verfahren hergestellter Lebensmittel“ erarbeitet
und beschreibt ein allgemeines Konzept zur Einzellabor- und zur Ringversuchsvalidierung
von Extraktionsverfahren, mit denen DNA isoliert und für eine PCR-basierte Untersuchung
gentechnischer Veränderungen in Lebensmitteln bereitgestellt wird. Das Konzept kann auch
zur Methodenvalidierung bei Futtermitteln oder sonstigen pflanzlichen Materialien (z. B.
Saatgut, Blätter) eingesetzt werden.
Des Weiteren wird die Vorgehensweise bei der Qualitätskontrolle von extrahierter DNA beschrieben, die aus einer Untersuchungsprobe gewonnen wird.
Durch die Validierung des Verfahrens und die Eignungsprüfung extrahierter DNA kann festgestellt werden, ob die Methode bei bestimmten Fragestellungen eingesetzt werden kann
(z. B. Einhaltung von Grenzwerten für die Kennzeichnung gentechnisch veränderter Lebensund Futtermittel).
Das Konzept baut auf den allgemeinen Grundsätzen der Amtlichen Methode L 00.00-119 [1]
sowie den Anforderungen des Europäischen Netzwerks der GVO-Laboratorien (ENGL) [2]
auf.
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Die im Folgenden beschriebenen Ansätze zur Validierung von Extraktionsverfahren wurden
unter dem Titel „Guidelines for validation of DNA extraction methods applied in subsequent
PCR analysis of food and feed products for the presence of genetically modified material“ im
Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit veröffentlicht [3] und werden an
dieser Stelle in deutscher Sprache zur Verfügung gestellt.
2
Kurzbeschreibung
BVL_FO_04_0022_000_V1.1
Die Eignungsprüfung extrahierter DNA für die GVO-Analytik besteht i. d. R. aus mehreren,
gegebenenfalls aufeinander folgenden Arbeitsschritten:
•
DNA-Konzentrationsbestimmung (photometrisch oder fluorimetrisch)
•
Bewertung der Fragmentierung (Gelelektrophorese)
•
Prüfung auf PCR-Inhibitoren (real-time PCR)
•
Bestimmung der Menge amplifizierbarer Kopien an Spezies-DNA (real-time PCR)
Die Validierung eines DNA-Extraktionsverfahren erfolgt zunächst im Einzellabor, anschließend kann eine zusätzliche Validierung im Ringversuch sinnvoll sein. Hierzu werden aus
identischen Untersuchungsmaterialien mit der gewählten Methode DNA-Extrakte gewonnen
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und unter Wiederholbedingungen (im Einzellabor) bzw. unter Vergleichsbedingungen (im
Ringversuch) mittels real-time PCR die amplifizierbaren Kopienzahlen an Spezies-DNA bestimmt.
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Begriffe
3.1
Untersuchungsmatrix
Alle Stoffe, die mit dem Analyt in der Probe vorhanden sind. Jede Untersuchungsmatrix hat
generell eine allgemeine Bezeichnung, die eine Klassifizierung der Materialien erlaubt.
3.2
Untersuchungsmaterial
Zu untersuchendes Material einer Matrix, die aber aus unterschiedlichen Herstellungsstufen
stammen kann; z. B. native und modifizierte Stärken.
3.3
Untersuchungsprobe
Aus dem Untersuchungsmaterial entnommene Einzelprobe, die für die Extraktion verwendet
wird (= Einwaage).
3.4
Absolute Nachweisgrenze (NGabs)
Die absolute Nachweisgrenze ist die geringste Menge der Zielsequenz, die mit einem Nachweisverfahren in einer Untersuchungsprobe zuverlässig nachgewiesen werden kann. Die
Angabe erfolgt als Kopienzahl [4].
3.5
Praktische Nachweisgrenze (NGprakt)
Die praktische Nachweisgrenze ist die geringste relative Menge der Zielsequenz, die bei einer bekannten Anzahl von Kopien des Genoms der taxonomischen Zielgruppe in einer konkreten Probe nachgewiesen werden kann [4, modifiziert].
4
Allgemeine Arbeitsschritte zur Eignungsprüfung von extrahierter DNA
Die Menge, Integrität und Reinheit der extrahierten DNA beeinflussen das Resultat der PCRAnalyse und damit auch das Untersuchungsergebnis und sollten deshalb kontrolliert werden.
Im Folgenden werden die allgemeinen Arbeitsschritte beschrieben, die bei Einzellabor-, Interlabor- oder Ringversuchsvaliderungen eine Eignungsprüfung von DNA-Extrakten hinsichtlich der genannten Leistungsmerkmale ermöglichen. Die Eignungsprüfungen sollten bei gleicher DNA-Konzentration durchgeführt werden, d.h. mit der DNA-Menge, die später auch für
die PCR-Analyse als Arbeitslösung eingesetzt wird.
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4.1
Bestimmung der DNA-Konzentration
Die DNA-Konzentration von DNA-Extrakten kann spektrophotometrisch (OD 260) nach der
Amtlichen Methode L 00.00-119, Anhang B.1 [1] oder fluorimetrisch mit Hilfe der PicoGreenMethode [5] (z. B. mittels Quant-iT PicoGreen dsDNA Quantitation Kit, Molecular Probes)
bestimmt werden.
Hinweis: Eine möglichst exakte DNA-Quantifizierung ist nur in Abwesenheit von RNA möglich.
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Berechnet werden von mindestens 3 Messwerten die Mittelwerte und Standardabweichungen der DNA-Konzentrationen sowie gegebenenfalls die mittlere Extraktionseffizienz in µg
DNA pro Gramm Einwaage.
Hinweis: Die Extraktionseffizienz kann für den Vergleich von Extraktionsmethoden hilfreich
sein.
Für die Berechnung der DNA-Konzentration wird davon ausgegangen, dass 1 OD 260 einer
Konzentration von 50 µg/mL doppelsträngiger (ds) DNA entspricht.
4.2
Bestimmung der DNA-Fragmentierung
Die Fragmentierung von DNA-Extrakten kann z. B. mittels Gelelektrophorese (z. B. Agarosegel-Elektrophorese nach der Amtlichen Methode L 00.00-119 Anhang B.2 [1]) überprüft und
dokumentiert werden.
Zu dokumentieren sind Hinweise auf mögliche Degradation der DNA. Allerdings kann ein erhöhter Anteil von DNA geringer Größe (< 1 000 Basenpaare) auch Matrix-bedingt sein.
4.3
Prüfung auf PCR-Inhibitoren
Eine Möglichkeit der Prüfung auf PCR-Inhibitoren stellt die Herstellung einer Verdünnungsreihe der extrahierten DNA und anschließende Bestimmung des Ct-Wertes für jede Verdünnung mittels real-time PCR dar. Amplifiziert werden Spezies-spezifische DNA-Abschnitte,
siehe z. B. Methode nach § 64 LFGB, L 00.00-105, Anhang A bzw. C [6], bei komplexen
Matrices können auch DNA-Sequenzen ausgewählt werden, die eine universelle Amplifikation (z. B. Pflanzen generell) erlauben.
Die Leistungskriterien und weitere Details zur Durchführung sind in 4.6 sowie 5.1.1. beschrieben. Abweichungen von dieser Beziehung weisen auf PCR-Inhibitoren, auf nicht homogene DNA-Lösungen oder auf eine zu geringe oder zu große DNA-Menge hin.
Hinweis: Weitere Möglichkeiten zur Prüfung auf PCR-Inhibition sind die Amplifikation einer
Kontrollsequenz (IPC – internal positive control) im gleichen PCR-Ansatz oder parallele Reaktionsansätze mit Zugabe einer definierten Menge einer bestimmten
Zielsequenz, die nicht im DNA-Extrakt vorkommt (gespikte Reaktion) [4, 7].
4.4
Bestimmung der Menge amplifizierbarer Kopien an Spezies-DNA
Die Menge PCR-amplifizierbarer Kopien einer Zielsequenz, die in einer extrahierten DNA
enthalten ist, kann über die real-time PCR-basierte Quantifizierung der Kopien einer für die
jeweilige Spezies ausgewählten Referenz-DNA-Sequenz bestimmt werden.
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Jeder DNA-Extrakt wird im Doppelansatz mittels real-time PCR mit einem für die taxonomische Zielgruppe spezifischen Verfahren [7] untersucht, ebenso jede Verdünnungsstufe einer
DNA-Standardreihe.
Hinweis: Die Kopienzahlbestimmung kann auch mit Methoden der digitalen PCR (z. B.
durch droplet digital PCR [8]) erfolgen.
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4.4.1
Standard-DNA für die Kalibrierung
Zur Quantifizierung mit real-time PCR wird eine DNA-Standardreihe verwendet. Hierzu kann
genomische DNA, Plasmid-DNA oder ein synthetischer DNA-Standard (Hybrid-Amplikons,
Oligonukleotide) eingesetzt werden. Besonders geeignet sind zertifizierte Referenzmaterialien (z. B. Plasmid-DNA ERM-AD 413 für das Mais-hmg-System).
Im Falle der Verwendung genomischer DNA sollte gut charakterisiertes Material eingesetzt
werden. Die Berechnung der Kopienzahlen der Spezies-DNA in der DNA-Stammlösung erfolgt auf Basis der z. B. fluorimetrisch bestimmten DNA-Konzentration (in ng/µl) und der
Masse des haploiden Genoms (Tabelle 1). Die für die Berechnung verwendeten Daten sind
zu dokumentieren.
Es wird eine DNA-Lösung (Stammlösung) verwendet, die beispielsweise entsprechend Tabelle 2 weiter mit Wasser oder 0,2x TE-Puffer verdünnt wird.
Tabelle 1: Masse des haploiden Genoms verschiedener Spezies [9], [10], [11]
Spezies
Masse des haploiden Genoms (in pg)
Baumwolle
2,33
Gerste
5,55
Kartoffel
1,8
Lachs
3,27
11
Leinsamen
0,70
10
Luzerne
1,57
Mais
2,6
Papaya
0,39
Raps
1,15
Reis
0,5
Soja
1,13
Weichweizen
17,33
Zuckerrübe
1,25
9
10
9
9
9
9
10
10
10
10
10
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Tabelle 2: Beispiel für die Herstellung einer Standard-DNA-Verdünnungsreihe für die
Kalibrierung
1
Verdünnungsstufe
Herstellung
Nominale Kopienzahl (cp)
der Zielsequenz
(pro 5 µl)
1
DNA-Lösung
(mit 0,2x TE1 entsprechend eingestellt)
50 000
2
10 µl (50 000 cp/5 µl) + 40 µl 0,2 x TE
10 000
3
10 µl (10 000 cp/5 µl) + 40 µl 0,2 x TE
2 000
4
10 µl (2 000 cp/5 µl) + 40 µl 0,2 x TE
400
5
10 µl (400 cp/5 µl) + 40 µl 0,2 x TE
80
0,2x TE-Puffer, enthaltend Tris-HCl c = 2 mmol/l1, EDTA c = 0,2 mmol/l, pH 8,0. Der pH-Wert wird mit Salzsäure oder
Natriumhydroxid-Lösung auf pH = 8,0 eingestellt.
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4.4.2 Auswertung
Für die Auswertung sind folgende Daten und Ergebnisse zu dokumentieren:
•
verwendetes real-time PCR-Gerät und Mastermix
•
Beschreibung der untersuchten Proben, Zahl der durchgeführten PCR-Tests pro Extrakt (falls abweichend von Standard = 2)
•
eventuelle Abweichungen vom Durchführungsprotokoll
•
gemessene Ct-Werte der DNA-Standardreihe und Proben-Extrakte (Baseline- und
Threshold-Einstellungen notieren)
•
Ergebnisse für die negative Extraktionskontrolle und die PCR-Reagenzienkontrolle
Die erhaltenen Ct-Werte für die jeweiligen Verdünnungsstufen der DNA-Standardreihe werden gegen die logarithmierten Kopienzahlen der Verdünnungen aufgetragen. Als Anhaltspunkt für die Auswertung können die folgenden Anforderungen an quantitative Verfahren herangezogen werden: Die ermittelte Steigung der Standardreihe sollte zwischen -4,1 und -3,1
(entsprechend einer PCR-Effizienz von 75 bis 110 %) liegen, das ermittelte Bestimmtheitsmaß R2>0,98 betragen.
Für den untersuchten DNA-Extrakt und die Verdünnungen dieses DNA-Extrakts wird der
gemessene Ct-Wert zur Berechung der mittleren Kopienzahl über die Standardreihe herangezogen.
4.5
Bestimmung der praktischen Nachweisgrenze
Als Kriterium für die Eignung einer Extraktionsmethode in der Praxis kann zusätzlich die
praktische Nachweisgrenze (NGprakt) herangezogen werden [4]. Hierzu wird die absolute
Nachweisgrenze (NGabs) der Nachweismethode für die zu untersuchende gentechnisch veränderte Zielsequenz herangezogen [4].
Beträgt beispielsweise die NGabs für die gentechnisch veränderte Zielsequenz 10 Kopien,
wird zu dieser angenommenen Kopienzahl die in der Probe bestimmte Kopienzahl der für die
Spezies gewählten Referenz-DNA-Sequenz ins Verhältnis gesetzt:
NG prakt (%) =
NG abs Transgen × 100
gemessene Kopien Referenz - DNA - Sequenz (Probe)
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Liegt im Falle eines negativen Befundes die NGprakt in dem jeweiligen DNA-Extrakt beispielsweise über dem zurzeit geltenden EU-Kennzeichnungsschwellenwert von 0,9 % für zugelassene gentechnisch veränderte Lebensmittel und Futtermittel, wäre in diesem Fall die analytische Prüfung auf kennzeichnungspflichtige Anteile im Bereich des Schwellenwertes nicht
möglich.
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4.6
Leistungskriterien zur Bewertung der Eignungsprüfung
Die Eignung der extrahierten DNA kann anhand folgender Leistungskriterien bewertet werden:
•
Für Untersuchungsmaterialien bzw. Untersuchungsproben einer bestimmten Matrix
sollten in der Regel mittlere Kopienzahlen (pro PCR-Ansatz) ≥ 10 000 für die Referenz-DNA-Sequenz erhalten werden. Bei Matrices, aus denen erfahrungsgemäß wenig Ziel-DNA der jeweiligen Spezies extrahiert werden kann, sind jedoch mindestens
1 000 Kopien der Referenz-DNA-Sequenz erforderlich, um bei einer absoluten Nachweisgrenze von 10 Kopien eine praktische Nachweisgrenze von 1 % zu ermöglichen
(siehe Tabelle 3).
•
Mit der extrahierten DNA sollte keine PCR-Inhibition festgestellt werden. Die Differenz
zwischen dem Mittelwert der gemessenen Ct-Werte der unverdünnten DNA und dem
aus den Verdünnungsstufen extrapolierten Ct-Wert für die Stammlösung sollte <0,5
sein.
Wenn nur die unverdünnte DNA eine Inhibition zeigt, können unter Umständen niedrigere
DNA-Konzentrationen für die Untersuchung verwendet werden. Es können weiterhin die unter 4.4.2 genannten Kriterien (berechnete Steigung zwischen -4,1 und -3,1 und Bestimmtheitsmaß R2>0,98) für die Verdünnungsreihe herangezogen werden.
•
Wenn eine DNA-Fragmentierung vorliegt, sollte diese einer Amplifikation der Zielsequenz nicht entgegenstehen. Liegen größtenteils Fragmente vor, die kleiner als das
Amplikon sind, ist davon auszugehen, dass die Amplifikation beeinträchtigt ist.
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Tabelle 3: Beispiel der Wirkung des DNA-Gehaltes auf die praktische Nachweisgrenze
Kopien einer taxonspezifischen DNA-Sequenz
absolute Nachweisgrenze
praktische Nachweisgrenze
100 000
10 Kopien
0,01 %
10 000
10 Kopien
0,1 %
1 000
10 Kopien
1%
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5
Validierung von DNA-Extraktionsverfahren
Im Folgenden werden allgemeine Hinweise und Anforderungen an die Durchführung und
Auswertung von Einzellabor-, Interlabor- oder Ringversuchsvalidierungen von DNAExtraktionsmethoden beschrieben.
Anmerkung: Bei der Auswahl eines Extraktionsverfahrens ist die Matrix-bedingte Zusammensetzung der Untersuchungsprobe und die für die nachfolgenden Anwendungen erforderliche Ausbeute, Integrität und Reinheit der Nukleinsäure zu berücksichtigen [1].
Die Sicherstellung der Homogenität und des effizienten Aufschlusses der Untersuchungsprobe sind Voraussetzungen für die erfolgreiche und reproduzierbare Extraktion von DNA.
5.1
Einzellabor-Validerung
Zur Bestimmung der Leistungsmerkmale eines DNA-Extraktionsverfahrens wird folgende
Vorgehensweise empfohlen: Materialien von sechs verschiedenen Untersuchungsmatrices
werden ausgewählt. Bei DNA-Extraktionsverfahren, die nur bei bestimmten Matrices eingesetzt werden sollen (z. B. Stärke), werden stattdessen sechs Untersuchungsmaterialien dieser Matrix ausgewählt.
Eines dieser sechs Materialien wird repräsentativ ausgewählt und daraus an zwei verschiedenen Tagen mit einer adäquaten Anzahl von Untersuchungsproben (z. B. sechs Einwaagen
pro Tag) im selben Labor durch dieselben Bearbeiter mit derselben Geräteausrüstung Extraktionen durchgeführt [2].
Aus den weiteren fünf Materialien wird DNA aus jeweils drei Untersuchungsproben pro Material einfach extrahiert. Es werden somit insgesamt mindestens [(5 x 3) + (2 x 6)] = 27 Extraktionen durchgeführt.
Die Einwaage ist genau zu protokollieren (z. B. drei signifikante Stellen).
Anmerkung: Die Einzellabor-Validierung kann zum Interlabor-Vergleich zusätzlich in ein bis
zwei weiteren Laboren im gleichen Umfang mit dem identischen Untersuchungsmaterial durchgeführt werden.
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5.1.1
Überprüfung der extrahierten DNA
a)
Von allen extrahierten DNA-Lösungen sind die Konzentration (siehe 4.1) sowie ggf. die
Fragmentierung (siehe 4.2) zu bestimmen. Insbesondere bei prozessierten Untersuchungsmaterialien ist die Bestimmung der Fragmentierung optional.
b)
Es werden von allen – bis auf die im nachfolgenden Satz beschriebene Ausnahme – extrahierten DNA-Lösungen Tests auf Inhibition durchgeführt. Bei dem Material, welches
mindestens zwölffach extrahiert wurde, werden drei Extrakte ausgewählt. Im Falle des
Inhibitionstests mit Verdünnungsreihen werden pro DNA-Lösung mindestens drei Verdünnungsstufen hergestellt.
Dazu wird die extrahierte DNA jeweils mittels Wasser oder 0,2x TE zu den Stufen 1:4,
1:16 sowie 1:64 verdünnt. Die unverdünnte DNA sowie die mindestens drei zusätzlichen
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Verdünnungen werden mittels real-time PCR jeweils einfach untersucht (= mindestens [6
x 3 x 4] = 72 PCR-Reaktionen).
c)
Zuletzt wird aus jeder extrahierten DNA-Lösung die Menge amplifizierbarer Kopien an
Spezies-DNA entsprechend 4.4 bestimmt.
Die Überprüfungen sollten bei gleicher DNA-Konzentration durchgeführt werden, d. h. mit der
DNA-Menge, die später auch für die PCR-Analyse als Arbeitslösung eingesetzt wird.
5.2
Ringversuchsvalidierung
Die Ringversuchsvalidierung einer Extraktionsmethode erfolgt in erster Linie über die Quantifizierung der PCR-amplifizierbaren Kopien der Spezies-DNA mittels real-time PCR (siehe
Abschnitt 4.4).
Der Ringversuch ist so zu planen, dass von mindestens acht teilnehmenden Laboren aus einer repräsentativen Zahl von Untersuchungsmaterialien einer oder mehrerer Matrices mit der
zu validierenden Extraktionsmethode die DNA extrahiert wird.
Zur Validierung von Extraktionsverfahren, die universell bei möglichst vielen Untersuchungsmatrices angewendet werden sollen, sollten im Ringversuch Materialien aus mindestens fünf repräsentativen Matrices eingesetzt werden. In diesem Falle reicht i. d. R. ein Untersuchungsmaterial pro Matrix aus.
Die DNA-Konzentration aller Extrakte wird von den Laboren bestimmt (siehe Abschnitt 4.1).
Bei der Herstellung der Proben ist die Homogenität der Untersuchungsmaterialien vorab zu
prüfen, z. B. entsprechend der in 5.1. beschriebenen Vorgehensweise (sechs Extraktionen
pro Untersuchungsmaterial, ggf. an zwei Tagen durchgeführt).
Untersuchungsproben sollten so beschaffen sein, dass mit der extrahierten DNA mindestens
1 000 Kopien der Referenz-DNA-Sequenz in der PCR gemessen werden können.
Die PCR-basierte Quantifizierung der amplifizierbaren Kopien der Spezies-DNA kann zentral
durch ein Labor oder durch die teilnehmenden Labors selbst erfolgen.
Dazu wird eine Standard-DNA-Lösung verwendet, die entsprechend Tabelle 1 in Abschnitt
4.4 weiter mit Wasser oder 0,2x TE verdünnt wird.
Bei PCR-Messung der Extrakte durch die teilnehmenden Labors sollte die Standard-DNA an
zentraler Stelle hergestellt und zusammen mit den Ringversuchsproben versendet werden.
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Die Durchführung eines einfachen Inhibitionstests im Rahmen des Ringversuches ist zu
empfehlen, besonders wenn sich im Rahmen der Einzellaborvalidierung Anhaltspunkte dafür
ergeben, dass bei bestimmten Untersuchungsproben einer Lebensmittelmatrix Inhibitionen
auftreten können. Beispielsweise wird jede DNA zusätzlich in einer 1:4-Verdünnung untersucht.
Beispiel 1: Lebensmittel, einzelne Matrices
Aus mindestens drei verschiedenen Untersuchungsmaterialien der Lebensmittelmatrix (z. B.
Stärke, Honig [12, 13]) wird von jedem Labor DNA extrahiert. Jedes Labor extrahiert DNA
aus jeweils drei Untersuchungsproben eines Untersuchungsmaterials, sodass insgesamt
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neun Proben (drei Untersuchungsmaterialien, je drei Untersuchungsproben) pro Labor bearbeitet werden. Aus jeder Probe wird im Einfachansatz DNA extrahiert. Es werden Negativ-,
ggf. auch Positivextraktionskontrollen mitgeführt. Jeder DNA-Extrakt wird im Doppelansatz
mittels real-time PCR untersucht, ebenso jede Verdünnungsstufe der DNA-Standardreihe.
Falls Anhaltspunkte vorliegen, dass PCR-Inhibitionen bei einzelnen Proben möglich sind,
wird jede DNA zusätzlich in Duplika in einer 1:4-Verdünnung untersucht.
Beispiel 2: Universalextraktionsmethoden
Bei Universalextraktionsmethoden wird jeweils ein Untersuchungsmaterial aus fünf verschiedenen, repräsentativen Matrices untersucht. Jedes Labor extrahiert DNA aus jeweils drei Untersuchungsproben eines Untersuchungsmaterials, sodass insgesamt (5 x 1 x 3) = 15 Proben pro Labor bearbeitet werden. Aus jeder Probe wird im Einfachansatz DNA extrahiert. Es
werden Negativ-, ggf. auch Positivextraktionskontrollen mitgeführt. Jeder DNA-Extrakt wird
im Doppelansatz mittels real-time PCR untersucht, ebenso jede Verdünnungsstufe der DNAStandardreihe. Falls Anhaltspunkte vorliegen, dass PCR-Inhibitionen bei einzelnen Proben
möglich sind, wird jede DNA zusätzlich in Duplika in einer 1:4-Verdünnung untersucht.
5.2.1
Auswertung
Es werden folgende Daten und Ergebnisse protokolliert:
•
Einwaage und DNA-Extraktion (eventuelle Abweichungen von dem Ringversuchsprotokoll)
•
Zahl der Extraktionen pro codierter Probe (DNA-Extraktionsreplikate; Standard = 1)
•
ermittelte DNA-Konzentration
•
verwendetes real-time PCR Gerät und Mastermix (sofern nicht vorgegeben)
•
Zahl der PCR-Replikate (Standard = 2)
•
eingesetzte DNA-Menge
•
eventuelle Abweichungen von der Ringversuchsvorschrift
•
Ct-Werte der DNA-Standardreihe und der DNA-Extrakte aus den codierten Proben
(Baseline- und Threshold-Einstellungen notieren), ggf. zusätzlich der verdünnten
DNA-Extrakte (Inhibitionstest)
•
Ergebnisse für die negative Extraktionskontrolle sowie die PCR-Reagenzienkontrolle
•
die NGprakt jedes DNA-Extraktionsreplikates
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Die im jeweiligen Labor erhaltenen Daten zur linearen Regression der Standardreihe (CtWerte für die jeweiligen Verdünnungsstufen gegen die logarithmierten Konzentrationen als
Kopienzahl pro Ansatz) werden berechnet. Für jedes mit DNA-Extrakten der codierten Proben durchgeführtes PCR-Replikat wird außerdem der gemessene Ct-Wert zur Berechnung
der mittleren Kopienzahl über die Standardreihe herangezogen.
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Die Daten aller Labors werden ausgewertet. Für jedes Labor werden die Resultate nach Decodierung den einzelnen Ringversuchsmaterialien zugeordnet und für jedes Material separat
ausgewertet.
Berechnet werden folgende Daten:
•
•
5.2.2
Pro Labor:
o
Anzahl der positiven Reaktionen
o
Anteil der positiven Reaktionen
o
Mittelwerte (Ct-Wert, Kopienzahl) pro Präparation
o
Mittelwert aller Präparationen
o
im Falle von Inhibitionstests: z. B. Differenz der Ct-Werte pro Präparation
Zusammenfassung für alle Labors:
o
Anteil der positiven Reaktionen
o
Mittelwert und Median-Kopienzahl
o
Standardabweichung absolut und relativ
o
im Falle von Inhibitionstests: Zahl der Labore sowie Zahl der Extraktionen insgesamt, bei denen keine Inhibitionen festgestellt wurden (z. B. ∆Ct>1,5 bei
Verwendung von Vierfach-Verdünnungen)
o
mittlere praktische Nachweisgrenze (Berechnung durch Division der absoluten
Nachweisgrenze (NGabs) der Nachweismethode für die gentechnisch veränderte Zielsequenz durch die gemittelten Kopienzahlen der Referenz-DNASequenz aller Labore (vgl. 4.5))
Bewertung
Im Ringversuch soll das Verfahren die folgenden Leistungskriterien erfüllen:
•
alle untersuchten DNA-Extraktionsreplikate sollten amplifizierbar sein. Für eine positive Bewertung eines DNA-Extraktionsreplikates müssen alle PCR-Replikate eine
Amplifikation aufweisen.
•
alle untersuchten DNA-Extraktionsreplikate müssen frei von Inhibition sein.
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Bei Abweichungen in einzelnen Laboren ist zu prüfen, ob systematische Fehler vorliegen
oder diese zufällig in einzelnen Laboren aufgetreten sind.
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Bei einzelnen Matrices, aus denen erfahrungsgemäß nur wenig DNA extrahiert werden kann
oder bei Verwendung der DNA-Extrakte PCR-Inhibitionen möglich sind, können aufgrund der
bisherigen Ergebnisse aus Ringversuchen [12, 13] folgende Kriterien als Anhaltspunkte für
die Bewertung der Ringversuchsergebnisse verwendet werden:
6
•
mindestens 90 % aller untersuchten DNA-Extraktionsreplikate sollten amplifizierbar
sein. Für eine positive Bewertung eines DNA-Extraktionsreplikates müssen alle PCRReplikate eine Amplifikation aufweisen.
•
mindestens 80 % aller untersuchten DNA-Extraktionsreplikate müssen frei von Inhibition sein. Sofern bei einzelnen Materialien einer Lebensmittelmatrix dieser Wert nicht
erreichbar ist, ist in der Methodenbeschreibung ein routinemäßiger Inhibitionstest
vorzusehen.
•
für mindestens 90 % aller untersuchten DNA-Extraktionsreplikate muss eine Kopienzahl von mindestens 1 000 Kopien der Referenz-DNA-Sequenz gemessen werden.
Sollten im Ringversuch auch Materialien untersucht werden, die nur geringe DNAAusbeuten erwarten lassen, ist dies bei mindestens einem Untersuchungsmaterial zu
zeigen.
Überprüfung von DNA-Extrakten zur Proben-bezogenen Qualitätskontrolle
Für die Überprüfung eines DNA-Extrakts aus einer Untersuchungsprobe insbesondere in der
Routineanalytik ist die Untersuchung von beispielsweise zwei Konzentrationsstufen (z. B.
"unverdünnt" und 1:4 verdünnt) mittels real-time PCR im Doppelansatz ausreichend. Für Inhibitionstests können auch andere Verfahren eingesetzt werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen.
6.1
Auswertung
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Für jede Verdünnungsstufe ist der Ct-Mittelwert zu bestimmen und anschließend die Differenz zwischen den beiden Ct-Mittelwerten zu bilden. Bei einer vierfach verdünnten DNA sollte die theoretische Differenz der Ct-Werte 2,0 betragen. Die Differenz zwischen dem erwarteten und dem gemessenen Ct-Wert soll generell < 0,5 sein.
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7
Literatur
[1] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB, Band I (L) L 00.00119, Untersuchung von Lebensmitteln – Verfahren zum Nachweis von gentechnisch
modifizierten Organismen und ihren Produkten in Lebensmitteln – Nukleinsäureextraktion (Übernahme der gleichnamigen Norm DIN EN ISO 21571, Ausgabe Mai 2005)
[2] Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing – European Network of GMO Laboratories (ENGL) 13. October 2008 http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/doc/Min_Perf_Requirements_Analytical_methods.pdf
[3] Waiblinger HU, Grohmann L, Guidelines for validation of DNA extraction methods applied in subsequent PCR analysis of food and feed products for the presence of genetically modified material. J Verbrauch Lebensm (2014) 9:2; DOI 10.1007/s00003-0140862-3
[4] DIN EN ISO 24276 Lebensmittel – Verfahren zum Nachweis von gentechnisch modifizierten Organismen und ihren Produkten – Allgemeine Anforderungen und Definitionen
[5] Ahn SJ, Emanuel JR (1996) PicoGreen quantitation of DNA: Effective evaluation of
samples pre- or post-PCR. Nucleic Acids Res. 13: 2623-2625.
[6] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB Band I (L) L 00.00105, Untersuchung von Lebensmitteln – Verfahren zum Nachweis von gentechnisch
modifizierten Organismen und ihren Produkten – Quantitative auf Nukleinsäuren basierende Verfahren (Übernahme der gleichnamigen Norm DIN EN ISO 21570, Ausgabe
November 2005).
[7] Anderson A, Pietsch K, Zucker R, Mayr A, Müller-Hohe E, Messelhäusser U, Sing A,
Busch U, Huber I (2011) Validation of a Duplex Real-Time PCR for the detection of Salmonella spp. in different food products. Food Anal. Methods 4:259–267.
[8] Morisset D, Štebih D, Milavec M, Gruden K, Žel J (2013) Quantitative Analysis of Food
and Feed Samples with Droplet Digital PCR. PLoS ONE 8(5): e62583.
doi:10.1371/journal.pone.0062583
[9] Arumuganathan K, Earle ED (1991) Plant Mol. Biol Rep 9: 208-218
[10] Kew Gardens Cvalue database: http://data.kew.org/cvalues
[11] Hardie DC and Hebert PDN (2003) The nucleotypic effects of cellular DNA content in
cartilaginous and ray-finned fishes. Genome 46: 683-706
[12] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB Band I (L)
L 16.04.03-1 Untersuchung von Lebensmitteln – Präparation von DNA aus nativer Maisstärke. (Ausgabe Juli 2012).
BVL_FO_04_0022_000_V1.1
[13] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB Band I (L) L 40.0014 Untersuchung von Lebensmitteln – Präparation von DNA aus Honig. (Ausgabe Juli
2012).