Seite 1 / 8 Super-auflösende Fluoreszenzmikroskopie mit einzelnen

Fluoreszenzmikroskopie
Super-auflösende Fluoreszenzmikroskopie mit einzelnen Molekülen
20.09.2011 | Autor: Carsten Forthmann*, Jürgen Schmied* und Philip Tinnefeld *
Das Auflösungsvermögen der optischen Mikroskopie wird durch das so genannte Abbe’sche Beugungslimit
eingeschränkt. Die nacheinander erfolgende Detektion einzelner Moleküle mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie kann
diese Beschränkung umgehen und somit die Auflösung drastisch erhöhen.
Die Entdeckung biologischer Zellen und die Untersuchung ihres Aufbaus waren mit der Erfindung
des Mikroskops im 16. Jahrhundert und seiner stetigen Verbesserung verbunden. Bei den ersten
Mikroskopen der Renaissance handelte es sich um so genannte Lichtmikroskope. Diese können
so konstruiert werden, dass sie einen Gegenstand beliebig vergrößern. Jedoch kann kein
Lichtmikroskop Einzelheiten von weniger als einigen hundert Nanometern auflösen. Dies
entspricht ungefähr der Hälfte der Wellenlänge des sichtbaren Lichts. Die meisten Strukturen im
Inneren von Zellen sind daher zu klein, um mit dem Lichtmikroskop untersucht werden zu
können. Proteine haben z.B. eine Größe von wenigen Nanometern, Proteinkomplexe und kleine
Organellen sind 10 bis 100 nm groß.
Diese sichtbar zu machen war erst durch die Entwicklung der Elektronen-mikroskopie in den
Dreißigerjahren möglich. Bei dieser Technik wird statt Licht ein Elektronenstrahl genutzt. Da nun
Abb. 1:
die Wellenlänge eines solchen Elektronenstrahls deutlich kürzer ist als die des sichtbaren Lichtes,
Fluoreszenzmikroskopische
ist die Auflösung entsprechend höher. Sie liegt im Bereich von weniger als einem Nanometer. Ein
Aufnahme einer Zelle. (Bild:
großer Nachteil der Elektronenmikroskopie ist jedoch die komplizierte Probenpräparation und die
wikipedia.org)
hohe „Invasivität“. Die Anwendung auf lebende Strukturen ist daher nicht möglich. Die einzige
Möglichkeit, die Lebensvorgänge in einer Zelle in Detailschärfe mit verfolgen zu können, besteht
also darin, das seit dem 19. Jahrhundert als Dogma anerkannte Abbe’sche Beugungslimit auszutricksen. Das wird möglich,
wenn das Phänomen der Fluoreszenz zunutze gemacht wird.
Bildergalerie Klicken Sie auf ein Bild um die Bildergalerie zu öffnen (5 Bilder)
Fluoreszenzmikroskopie
Eine besondere Form der Lichtmikroskopie ist die so genannte Fluoreszenzmikroskopie. Als Fluoreszenz bezeichnet man die
Eigenschaft bestimmter Stoffe (den so genannten Fluoreszenzfarbstoffen), bei Bestrahlung mit Licht einer bestimmten
Wellenlänge, Fluoreszenzlicht auszusenden. Aufgrund des Farbunterschiedes zwischen dem Anregungslicht und dem
Fluoreszenzlicht, lässt sich das Anregungslicht ausblenden. Werden nun bestimmte Strukturen in einer Zelle chemisch mit
Fluoreszenzfarbstoffen markiert, lassen sich diese sehr kontrastreich abbilden (s. Abb. 1). Allerdings gilt natürlich auch für
diese Technik das Beugungslimit, sie ist also unscharf.
Seite 2 – Blinkmikroskopie
Blinkmikroskopie
Empfindliche Detektoren machen es mittlerweile möglich, einzelne Fluoreszenz-Farbstoffmoleküle zu beobachten, wodurch die
Veränderung der Helligkeit eines einzelnen Moleküls über die Zeit untersucht werden kann. Sendet ein Farbstoff gleichmäßig
helles Fluoreszenzlicht aus, so spricht man von einem Hell- bzw. Anzustand. Aus einem solchen Hellzustand kann das Molekül
in einen Dunkel- bzw. Auszustand übergehen. Erfolgt dieser Übergang irreversibel, spricht man von „bleichen“, andernfalls von
„blinken“. Durch die Möglichkeit, diese Übergänge an einzelnen Molekülen beobachten und studieren zu können, lassen sich
Seite 1 / 8
die dahinter stehenden photophysikalischen Prozesse nicht nur verstehen, sondern sogar nach Belieben beeinflussen. So
lassen sich z.B. Fluorophore bei maßgeschneiderten An- und Auszeiten gezielt zum Blinken bringen. Solche schaltbaren
Moleküle sind der Schlüssel zur Überwindung des Beugungslimits und damit auch zur superauflösenden Mikroskopie. Das
funktioniert wie folgt: Wird die farbstoffmarkierte Struktur (in Abb. 2 schwarz dargestellt) mit Licht der richtigen Wellenlänge
bestrahlt, so erzeugt jeder einzelne Farbstoff auf dem Bild einen verschwommenen Lichtfleck. In der Summe ergeben all diese
sich überlappenden Lichtflecke ein sehr unscharfes Bild der Gesamtstruktur (rot in Abb. 2). Anders sieht die Sache aus, wenn
die Fluorophore so blinken, dass sie immer nur kurz aufblitzen und ansonsten vollkommen dunkel sind. Das ist in Abbildung 2
dargestellt. Nimmt man unter diesen Bedingungen einen Film der Probe auf, so ist auf keinem Bild die gesamte Struktur zu
sehen, sondern immer nur einige wenige Farbstoffmoleküle. Die verschwommenen Lichtflecke der einzelnen Fluorophore
überlappen nun nicht mehr und so kann für jeden dieser Lichtflecke die Lage des Mittelpunkts mit sehr hoher Genauigkeit
ausgemessen werden. Der Mittelpunkt spiegelt genau die Position des markierten Moleküls wider. Wird diese Prozedur in
jedem Filmbild wiederholt, so erhält man am Ende eine Menge von Punkten, die zusammengesetzt ein sehr detailliertes Bild
der betrachteten Struktur ergeben (s. Abb. 3) [3, 4].
Quantitative Auflösung
Die Frage, die sich stellt, ist, welche Auflösung denn eigentlich erzielt werden kann. Um das zu vermessen, benötigt man ein
so genanntes Nanometerlineal, also eine Struktur, die in genau definierten Abständen Farbstoffe trägt. Der frei einstellbare
Farbstoffabstand wird dabei solange verkürzt, bis das verwendete superauflösende Mikroskop die einzelnen Farbstoffmoleküle
nicht mehr getrennt abbilden kann. Auf diese Weise lässt sich das Auflösungsvermögen des Mikroskops experimentell
bestimmen. Realisiert wurde ein solches Nanometerlineal kürzlich durch eine DNA-Nanostruktur, ein so genanntes DNAOrigami. Ein DNA-Origami besteht aus einem langen DNA-Strang, der durch zahlreiche kurze DNA-Stränge so zusammen
„getackert“ wird, dass da- raus eine ganz bestimmte Figur entsteht. Die Form dieser Figur hängt von der Wahl der „Tacker“Stränge ab und ist nahezu beliebig wählbar [3]. Im Fall des Nanometerlineals wird allerdings nur ein simples Rechteck
verwendet (s. Abb. 4) [4]. Da genau bekannt ist, an welcher Stelle des Rechteckes welcher Tacker-Strang sitzt und jeder
Tacker-Strang eine mögliche Anbindungsstelle für ein beliebiges Molekül ist, kann ein solches DNA-Origami als molekulare
Legoplatte genutzt werden, auf der Farbstoffe in beliebigem Muster angeordnet werden können. Auf diese Weise hergestellte
Nanometerlineale wurden schon an vielen Mikroskopen erfolgreich eingesetzt und sollen bald kommerziell erhältlich sein.
Auf den Punkt gebracht
Das Auflösungsvermögen eines Lichtmikroskops ist durch das Abbe’sche Beugungslimit auf ca. 200 nm begrenzt. Die weit
höhere Auflösung der Elektronenmikroskopie ist aber ungeeignet für lebende Proben. Mithilfe des Phänomens der Fluoreszenz
und einem einfachen Trick lässt sich das Beugungslimit allerdings „austricksen“ und das Auflösungsvermögen deutlich
verbessern. Durch Verwendung von künstlich erzeugten Nanostrukturen ist die gewonnene Auflösungsverbesserung auch
quantitativ bestimmbar. Die Anwendung dieser neu entwickelten Methode auf lebende Zellen ist Gegenstand hochaktueller
Forschung im Bereich der Biophysik und Zellbiologie.
Literatur
[1] C. Steinhauer, C. Forthmann, J. Vogelsang, P. Tinnefeld, Superresolution Microscopy on the Basis of Engineered Dark
States, J. Am. Chem. Soc. 2008
[2] J. Vogelsang, T. Cordes, C. Forthmann, C. Steinhauer, P. Tinnefeld, Exquisite Control of Fluorescence: Oxazines as
Single-Molecule Switches, Proc Natl Acad Sci U S A 2009
[3] P. Rothemund, Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns, Nature 2006
[4] C. Steinhauer, R. Jungmann, T. Sobey, F. Simmel, P. Tinnefeld, DNA-Origami als Nanometerlineal für die superauflösende
Mikroskopie, Angew Chem Int Ed 2009
* C. Forthmann, J. Schmied und P. Tinnefeld: Institut für theoretische und physikalische Chemie der TU Braunschweig, 38106
Braunschweig
Redakteur: Marc Platthaus
Dieser Beitrag ist urheberrechtlich geschützt.
Sie wollen ihn für Ihre Zwecke verwenden?
Infos finden Sie unter www.mycontentfactory.de.
Seite 2 / 8
Dieses PDF wurde Ihnen bereitgestellt von http://www.laborpraxis.vogel.de
Seite 3 / 8
Abb. 2: Schematische Darstellung des Prinzips der Blinkmikroskopie. (Bild: TU
Braunschweig)
Seite 4 / 8
Abb. 3a: Immobilisierte Aktinfilamente beugungsbegrenzter Auflösung. (Bild: TU
Braunschweig)
Seite 5 / 8
Abb. 3b: Immobilisierte Aktinfilamente und in Superauflösung. (Bild: TU
Braunschweig)
Seite 6 / 8
Abb. 3c: Immobilisierte Aktinfilamente: einige Frames mit blinkenden Molekülen. (Bild:
TU Braunschweig)
Seite 7 / 8
Abb. 4: Auf einem DNA-Origami realisiertes Nanometerlineal. Die beiden Farbstoffe
(F) weisen hier einen Abstand von 90 nm auf. (Bild: TU Braunschweig)
Seite 8 / 8