pasteurella multicida-i-1992

AVID III/1992
KLASSIFIZIERUNG:
PASTEURELLA MULTOCIDA
Familie :
Pasteurellaceae
Genus :
Pasteurella
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1. ALLGEMEINES
P.multocida ist ein primärer und auch sekundärer Erreger von Infektionskrankheiten bei
verschiedenen Tierarten. Die Infektionen sind weit verbreitet und können akut, subakut
oder chronisch verlaufen. Bedeutung besitzt P.multocida bei folgenden Erkrankungen:
Rind:
− Wild- und Rinderseuche (Hämorrhagische Septikämie)
− Pneumonie
− Atrophische Rhinitis
Schwein:
− akute Pasteurellose
− Atrophische Rhinitis
− Pneumonie
Schaf/Ziege:
− akute Pasteurellose
− Pneumonie
Kaninchen:
− akute Pasteurellose
− Pneumonie
− Atrophische Rhinitis
Geflügel:
− Geflügelcholera
− akute Pasteurellose (z. B. bei Cairina moschata)
Pferd:
− Lymphangitis
Hund/Katze:
− vorwiegend latente Träger; vereinzelt auch bei lokalen Infekten
im Maul-, Fang-, Rachenbereich
Pelztiere:
− akute septikämische Infektionen
Mensch:
− Pharyngitis
− Wundinfektionen nach Biß- und Kratzverletzungen, vor allem
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durch Hunde und Katzen
2. UNTERSUCHUNGSMATERIAL
− Zur Isolierung von Pasteurellen sind möglichst frische Organ- oder Tupferproben zu
verwenden.
− Die Tiere sollten nach Möglichkeit nicht unmittelbar vor der Probenentnahme oder
Tötung mit anschließender Sektion unter antibiotischer Therapie gestanden haben.
− Bei akuten Ausbrüchen ist es für eine schnelle Diagnose am zweckmäßigsten, schwer
erkrankte Tiere zur Tötung und sofortigen Sektion auszuwählen.
− Ist die unmittelbare Verarbeitung von Proben (Nasentupfer, Organmaterial) nicht
möglich, ist es vorteilhaft, die Proben eingefroren zu lagern (-20 o C bis zu 3 Mona ten)
und zu transportieren.
− Die Verwendung von Transportmedien ist ebenfalls möglich.
3. UNTERSUCHUNGSGANG
Mikroskopische Untersuchung
− Mikroskopische Untersuchungen sind bei akuten Infektionen für eine schnelle Dia gnose
des beteiligten Erregers von Bedeutung.
− Für subakute und chronische Infektionen hat der mikroskopische Nachweis nur wenig
Wert.
− In Objektträgerausstrichen pathologisch-anatomisch veränderter Organproben, gefärbt
mit Löfflers Methylenblau, werden Pasteurellen als feine, bipolar angefärbte, ovoide
Bakterien sichtbar (Sicherheitsnadelform).
Kulturelle Untersuchungen
− Organmaterial wird nach Abflammen der Proben und steriler Entnahme aus der Tiefe
des Probestückchens auf Blutagar mit und ohne Antibiotikazusatz (Anhang 1. und 2.)
ausgestrichen.
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− Die Bebrütung der Agarplatten erfolgt 18 - 22 Std. bei 37 o C.
− Pasteurellen entwickeln auf diesem Nährboden graublaue Kolonien mit 2 - 4 mm
Durchmesser und spermaähnlichem Ge ruch.
− Auf durchsichtigen Medien, z. B. Serum-Dextrose-Agar mit 3 - 5% Hefeextrakt
(Anhang 3.) oder PPLO-Agar (Anhang 4.), können verschiedene Wuchsformen unterschieden werden, besonders bei Anwendung der Henry'schen Beleuchtung.
M-Formen = sehr schleimig, rötliche Fluoreszenz
S-Formen = glatt, mit grünlicher Fluoreszenz
R-Formen = kleine rauhe Kolonien, keine Fluoreszenz)
Biochemische Differenzierung
− Zur biochemischen Charakterisierung sind die traditionellen Röhrchenverfahren und
Mikromethoden in vorgefertigten Platten möglich.
− Die Röhrchen oder Platten werden bei +37 o C bebrütet, die Ablesung des Reaktionsausfalls erfolgt nach 2, 5 und 10 Tagen.
− Für die Routine ist die Überprüfung einiger kultureller und biochemischer Reaktionen
ausreichend.
− Für P.multocida (BERGEY's Manual, 1984), P.multocida subsp. multocida (BISGAARD
et al., 1991) ergeben sich folgende typische Reaktionsausfälle, die ande ren PasteurellaArten gegenübergestellt sind:
Reaktion
Hämolyse
Wachstum auf
Mac Conkey Agar
Indol
Urease
Oxydase
Glukose
Laktose
Mannit
H 2 S-Bildung
P.multocida P.hämolytica
+
+
P.pneumotropica
+
P.ureae
P.aerogenes
-
+
P.gallinarum
-
+
(+)
+
+ x)
+
+
v
+
+
+
+
+
v
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
v
v
v
-
+
v
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x) = Stämme von Hunden und Katzen können negativ sein
v = variabel
Weitere taxonomische Zuordnungen auf Grund abweichender bio chemischer Merkmale können
nach den Angaben von BISGAARD et al. (1991) erfolgen.
1. WEITERE HINWEISE
Serologische Typisierung
− Voraussetzung sind Typenseren, die jedoch z. Z. kommerziell nicht angeboten werden.
− Die serologische Typisierung wichtiger Stämme ist im Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Bereich Jena, Naumburger Str.96a,
07722 Jena, möglich.
Vereinfachte Typisierung
Da die serologische Typisierung derzeit nicht routinemäßig ausgeführt wird, können als
Orientierungshilfen der Hyaluronidase- und Acriflavintest angesetzt werden.
Hyaluronidasetest:
− Vom Primärisolat werden mehrere Einzelkolonien auf Serum- Dextrose- oder PPLOAgar übertragen. Senkrecht zu dem Aus strich von Pasteurellen wird ein Staphylokokkenstamm (Stamm Nr. 7128, erhältlich im Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Bereich Jena) in einer geraden Linie ausgestrichen.
− P.-multocida-Stämme des Kapseltyps A nach CARTER bilden reichlich Hyaluronsäure,
welche durch die von den Staphylo kokken gebildete Hyaluronidase lysiert wird.
Entsprechende Pasteurellen wachsen in der Nähe des Staphylokokkenimpfstriches in
Kolonien mit kleinerer Größe.
− Unter schräg einfallendem Licht läßt sich eine deutliche Aufhellungszone von ca. 3 - 6
mm Breite erkennen.
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− Stämme der Kapseltypen B, D und E ergeben kein solches Phänomen (Hyaluronidasetest
negativ).
− Da E-Stämme in Europa bislang nicht isoliert wurden und B- Stämme nur bei akuten
septikämisch verlaufenden Pasteurello sen auftreten, gehören Stämme, die kein Aufhellungsphänomen ergeben, mit hoher Wahrscheinlichkeit dem Kapseltyp D an.
Acriflavintest:
− Die zu überprüfenden Isolate werden 18 - 24 Std. bei 37 o C in Brain-Heart-Bouillon
(abgefüllt zu je 3 ml in Röhrchen) bebrütet.
− Nach Zentrifugation (2500 U/Min. für 10 Min.) werden 2,5 ml des Überstandes verworfen.
− Die verbliebenen 0,5 ml Bakteriensuspension mit 0,5 ml einer frisch hergestellten
wäßrigen Acriflavinlösung (1 : 1000), gutdurchmischen und bei Raumtemperatur ste hen
lassen.
− Acriflavinlösungen sollten, in braunen Flaschen abgefüllt, nach der Herstellung nicht
länger als 1 Woche im Kühlschrank aufbewahrt werden.
− Nur Stämme vom Kapseltyp D führen innerhalb von 30 Min. (u.U. schon nach 5 Min.) zu
einem sich am Boden absetzenden flockigen Präzipitat mit klarem Überstand.
− Bei den Kapseltypen A, B und E fällt der Acriflavintest jeweils negativ aus.
Toxinnachweis bei P.-multocida-Isolaten
Wichtiger für die diagnostische Aussage ist im Vergleich zur Serotypisierung der Toxinnachweis. Dies gilt insbesondere für Isolate vom Schwein, weil toxinbildende P.-multocidaStämme als Ursache für Rhinitis atrophicans angesehen werden. Toxin bildende Stämme
können durchaus auch eine Bedeutung bei Kalb und Kaninchen haben. Aus die sem Grunde
ist eine entsprechende diagnostische Aussage auch bei D-Stämmen dieser Tierarten
wichtig. Zum Toxinnachweis stehen zur Zeit für die Routineanwendung Zellkultur- und
ELISA-Test zur Verfügung.
Zellkulturtest:
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− Die Toxinprüfung erfolgt mit permanenten EBL-Zellen (embryonic bovine lung) auf
Mikrotiterplatten.
− Die frisch trypsinierten Zellen werden in Zellkulturmedium (MEM mit 10% FKS) aufgenommen und die Zellzahl auf 2 x 10 5 Zellen/ml eingestellt.
− Zu 100 ul Zellsuspension/Vertiefung werden 50 ul Pasteurella-Kulturüberstand zur
Prüfung auf Toxin pipettiert.
− Die Zellkultur wird bei 37 o C und 5% CO 2 inkubiert und vom 4. - 6. Tag mit einem
Inversionsmikroskop beurteilt.
Bei Abwesenheit von Toxin bilden die EBL-Zellen einen dichten Zellrasen. Im positiven
Fall zeigen die Zellen nach anfänglichem Auswachsen gehemmtes Wachstum. Es bilden
sich Anhäufungen aus deformierten, abgekugelten Zellen mit mehreren länglichen Ausläufern, die zur nächstgelegenen Zellansammlung führen, so daß eine netzartige Struktur
entsteht.
ELISA-Test:
Ein entsprechender Test (DAKO-ELISA-PMT-Kit) ist im Handel erhältlich. Mit diesem
Test können sowohl in Primärkulturen (z. B. Mischkulturen von Nasentupfern) als auch in
Reinkulturen (Subkulturen) toxinbildende P.-multocida-Stämme ermittelt werden.
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LITERATUR
BISGAARD, M., S. B. HOUGHTON, R. MUTTERS, A. STENZEL (1991): classification of
German, British und Dutch isolates of so- called Pasteurella multocida obtained from
pneumonic calf lungs.
Vet. Microbiol. 26, 115 - 124.
CARTER, G. R., S. W. RUNDELL (1975): Identification of type A strains of P.multocida
using staphylococcal hyaluronidase.
Vet. Rec. 93, 343.
CARTER, G. R., P. SUBRONTO (1973): Identification of type D strains of Pasteurella
multocida with acriflavine.
Am. J. Vet., Res. 34, 293 - 294.
FRYMUS, T., W. BIELECKI, T. JAKUBOWSKI (1991): Toxigenic Pasteurella multocida in
rabbits with naturally occurring atrophic rhinitis.
Zbl. Vet. Med. B 38, 265 - 269.
JORDACHE, A., C. UNGUREANU, R. PUTSCHE, D. SCHIMMEL (1980): Empfehlungen
zur Isolierung und Differenzierung von Pasteuralla multocida.
Arch. exper. Vet. med. 34, 753 - 758.
MANNHEIM, W. (1984): Pasteurellaceae, in KRIEG, N. R., J. G. HOLT (ed.): BERGEY's
Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1, p. 550 - 575. Williams & Wilkins Company,
Baltimore-London.
MANNHEIM, W., K.-H. HINZ, R. HOLLÄNDER, R. MUTTERS, A. WEBER (1989): Isolierung und Identifizierung von Pasteurellaceae (Haemophilus, Pasteuralla, Actinobacillus
und verwandte Taxa).
Zbl. Bakt. 272, 87 - 109.
SACHBEARBEITER:
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Prof.Dr.habil. D. Schimmel, Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und
Veterinärmedizin, Bereich Jena, Naumburger Str. 96a,
07743 Jena
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ANHANG
1. Blutagar
1000,0 ml
10,0 g
Aqua dest.
Bacto-Pepton
3,0 g
NaCl
2,0 g
Na 2 HPO 4 . 12 H 2 O
6,0 g
Fleischextrakt
5 oder 10% defibriniertes Blut (Kalb, Rind oder Schaf)
2. Blutagar mit Antibiotikazusatz
Dem Blutagar (Anhang 1) wird zugesetzt pro ml:
2,0 µg
Neomycin-Sulfat
3,5 µg
Bacitracin
3. Serum-Dextrose-Agar
1000,0 ml
20,0 g
Pferdefleischwasser
Pepton
3,0 g
NaCl
2,0 g
sek. Natriumphosphat
10,0 g
Dextrose
50,0 ml
Serum
3 - 5%
Hefeextrakt (aus frischer Bäckerhefe)
20 - 25 g Agar
4. PPLO-Agar
500,0 ml
Aqua dest.
17,0 g
P P LO-Agar
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10%
Hefe (Bäckerhefeextrakt) oder 3 g Yeastextrakt
75,0 ml
Pferdeserum
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