doc1 - Weizmann Institute of Science
download 
Report Transcription
1 - Weizmann Institute of Science
דד
זיהוי ואפיון אנזימים בקרום ה ת א ש 7
ACHOLEPLASMA — 1 MYCOPLASMA
)6
y
^
o
c
חיבור ל ש ם ק ב ל ת ה ת ו א ר
לפילוסופיה
דוקטור
H
מאת
-s־״/
I
מ ר י ת פכט )7נדאו(
הוגש ל מ ו ע צ ה ה מ ד ע י ת ש ל מ כ ו ן ויצמן ל מ ד ע
רחובות
אלול תשל״ז
םפטמבר
!977
יהוי ואפיון אנזימים בקרו• ה ת א ש ל
ACHOLEPLASMA — 1 MYCOPLASMA
חיבור ל ש ם ק ב ל ת ה ת ו א ר
דוקטור
לפילוסופיה
מאת
מרית פכס
)לנדאו(
הוגש ל מ ו ע צ ה ה מ ד ע י ת ש ל מכון ויצמן ל מ ד ע
רחובות
אלול
תשל״ז
ס פ ט מ ב ר 1977
עבודה
ז ו ב ו צ ע ה ב ה ד ר כ ת ו של
פרופ'
אפרים קציר,
במחלקה
מכון
לביופיםיקה,
ויצמן למדע,
רחובות
לזכרו
טל א ח י דן
לנדאו
אשר נ פ ל כ ע ת מ י ל ו י ת פ ק י ד ו
בכ״א א ל ו ל תטכ״ז
להורי
ו ה ו א בן . 2 0
היקרים יבדל״א .
תודתי
העמוקה נ ת ו נ ה ל מ ד ר י כ י
פרופ'
אפרים קציר,
אשר ה א י ר את ד ר כ י ב נ ב כ י המדע
במשך כ ל ש נ ו ת ע ב ו ד ת י ע מ ו ו א ף ה ת פ נ ה
מתפקידו
הרם ל ס י י ע ל י
בעריכת
עבודה ז ו .
תודותי
נ ת ו נ ו ת גם לעמיתי
דייר י ו ס ף י ר י ב ודייר א ל ד ד ג י ב ר ת ן
על ש י ת ו ף ה פ ע ו ל ה ה נ א מ ן ,
ולפרופי
שמואל ר ז י ו על ק ר י א ת
כתב היד וההערות ה מ ו ע י ל ו ת .
ל מ ר ישראל י ע ק ו ב ם ו ו א ו ד ה על
העזרה המסורה ב ם י נ ת י ז ו ת ה פ פ ט י ד י ם ,
לגבי
י ו ל י א נ ה ק ו ב ו על ב י צ ו ע
אנליזות
החומצות האמיניות.
תודה לנעמי עותמי
ו צ י פ ו ר ה שיר
על מ ה י ר ו ת ו ב ה ד פ ס ה ה נ א ה של ע ב ו ד ה ז ו .
תוכן
עמוד
הענינים
ת מ צ י ת
.1
1
מבוא
6
1.1ת כ ו נ ו ת של אנזימים הקשורים בממברנות ב י ו ל ו ג י ו ת
6
1.2מיקופלםמה -ת כ ו נ ו ת ה מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז ם השלם וקרום התא שלו
10
1.2.1
קרום התא של מיקופלסמה
12
א .ב י ד ו ד הממברנה הפלסמטית והרכבה
12
ב .פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת הקשורות בממברנה
13
ג .המסה ו ב י ד ו ד של ח ל ב ו נ י הממברנה
14
ד .שומני הממברנה
15
ה .א ר ג ו ן החלבונים והשומנים בממברנה
17
ו .מ נ ג נ ו נ י טרנספורט
18
ז .דרישות ת ז ו נ ת י ו ת ו י כ ו ל ת ביוםינתטית
18
ח .מ נ ג נ ו ן מעבר האלקטרונים
19
.2מטרת העבודה
21
r^ .3ל pנ ם י ו נ י
22
3.1מיקופלםמה -תנאי ג י ד ו ל והכנת התאים ל נ י ס ו י
3.2קביעת הפעילות האמידטית של מיקופלסמה
22
)
2
2
3.3םינתיזה של םובסטרטים פפטידיים
23
3.4קביעת פעילות מיקופלסמה ב ה י ד ר ו ל י ז ה של פפטידים
25
26
)Amidase
)
4
Peptidase) 2
L-Alanine
Acholeplasma laidlawii
3.7הכנת תכשיר קרומי של מיקופלסמה
28
3.8קביעת פוספט א י א ו ר ג נ י ו א ו ר ג נ י
29
3.9קביעת פעילות NADH Oxidaseהקשורה לממברנה של
29
Acholeplasma
laidlawii
3.10ז י ה ו י ח ל ב ו נ י ם בתכשיר קרומי של Acholeplasma laidlawiiע ל -י ד י
30
gel electrophoresis
SDS-Polyacrylamide
תוכן העני נים -המשך
עמוד
תוצאות ו ד י ו ן
פעילות
31
4.
אמידטית של מיקופלסמה
מידטית של
4.1.1
מידטית של
4.1.2
3
31
Mycoplasma fermentans
31
Acholeplasma laidlawii
1
.
.
pH -
4
של
רות
4.2.2
M. fermentans
פטידטית של
4.3.2
אקטיבציה
שינויים בריכוז
41
פפטידטית של מיקופלםמה
פטידטית של
45
Mycoplasma fermentans
של הפעילות האמידטית על ידי קטיונים חד ערכיים
NaClבמדיום
אנזימים על הפעילות האמידטית של
ריפםין
ליפז
4.5.2
פעילות אמידטית של
בחומצה מתאי
4.4
4.4.2
4.5
65
65
C
4.5.2.1
66
A. laidlawii
66
A. laidlawii
4.5.2.2
עקב טיפול בפוםפוליפז C
פעילות
59
62
Acholeplasma laidlawii
4.5.1
48
59
ש י נ ו י י ס ו ג הקטיון החד ערכי במדיום
השפעת
4.3
45
Acholeplasma laidlawii
4.4.1
השפעת
38
38
להיסטידין
4.3.1
4.2
Mycoplasma fermentans
על ידי ריאגנטי אלקילציה
פעילות
32
34
ריאגנטים מעכבים על הפעילות האמידטית של
השפעת
Mycoplasma fermentansכלפי L-Histidyl-3-naphthylamide
ועל כושר קליטת היםטידין
4.2.1
4.1
ויציבות הפפטידז )אמידז( בתכשיר קרומי
67
70
4.6
תוכן הענינים -המטר
חדירות תאי 4.7
עמוד
Acholeplasma laidlawii
נפח האינולין
4.8
בממברנה
NADH Oxidase
לאלנין וקביעת
72
טל
Acholeplasma laidlawii
Aו C -על ממברנה
4.8.1
השפעת
77 A. laidlawii
המסה סלקטיבית של תממברנה באמצעות הדטרגנט
Tween 20על פעילות NADH Oxidase
מיצוי
רופוריזה
קטיבציה של פעילות
4.8.2.3
טרגנט על פעילות
4.8.2.4
SDS-PAGEשל ממברנה
4.8.2.1
81
לאחר
מיצוי עם Tween 20
83
NADH Oxidase
בממברנה שטופלה בדטרגנט ,בהשוואה לממברנה
רגילה
85
NADH Oxidase
בתנאי pHשונים
4.8.3
88
NADHבממברנת
laidlawii
טידים מחומצנים
4.8.2
80
סלקטיבי של חלבונים ופוםפוליפידים
באמצעות Tween 20
4.8.2.2
מצון
75
Acholeplasma
4.8.3.1
הטפעת
91
92
פירידין נוקליאוטידים מחןמצנים על
פעילןת
NADH Oxidase
^ ^ - N A D Hלתכשיר קרומי
אינטראקציה בין 4.8.3.3
מAcholeplasma laidlawii -
4.8.3.2
92
92
דיון מםבם
98
רשימת ספרות
110
תמצית באנגלית
I
1
ת מ צ י ת
נחקרו פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת הקשורות לקרום התא של
ו־
Mycoplasma
Acholeplasmaבמטרה להבהיר את ה ת כ ו נ ו ת ה מ י ו ח ד ו ת של ח ל ב ו נ י ם בעלי
פ ע י ל ו ת ס פ צ י פ י ת המשולבים במבנה ק ר ו ם התא .המיקופלםמה ואכולפלםמה משפחת
Mycoplasmataceaeלמחלקת ה -
, Mollicutesנבחרו כמערכת מתאימה ב י ו ת ר
ה י ו ת והתא חסר ד ו פ ן פ פ ט י ד ו ג ל י ק ן צפיד והמעטפת ה ח י צ ו נ י ת היא הקרום ה י ח י ד
בתא.
ה פ ע י ל ו י ו ת ה א נ ז י מ ט י ו ת שנבדקו ו א ו פ י י נ ו ת כ ו נ ו ת י ה ן :
אמידז ו פ פ ט י ד ז ב Mycoplasma fermentans -ו ב -
א.
Acholeplasma
» laidlawii
ב.
NADHא ו ק ם י ד ז ב -
אמידז
ופפטידז ב-
Acholeplasma laidlawii
Acholeplasma l a i d l a w i i ^ Mycoplasma fermentans
פ ע י ל ו ת א מ י ד ז ,המתבטאת ב פ י ר ו ק - 3נ פ ת י ל א מ י ן מ - 3 -נ פ ת י ל א מ י ד י ם של
. M. fermentansה א נ ז י ם
חומצות א מ י נ י ו ת ,נמצאה לראשונה על י ד י נ ו ב -
הקשור לקרום התא מגלה ס פ צ י פ י ו ת ב ב י ק ו ע נ פ ת י ל א מ י ד י ם של החומצות ה א מ י נ י ו ת
הבסיסיות:
נפתילאמיד
ריםטידין ,ארגינין
) - 2 5 . K m = l
ו ל י ז י ן .הזיקה החזקה ב י ו ת ר של ה א נ ז י ם הזה
״ה(0M
ה נ פ ת י ל א מ י ד י ם נמצא בתחום
9.5-10
1
x
H
pהאופטימלי ל פ י ר ו ק
ו פ ר ו פ י ל ה pH -של פ ע י ל ו ת הקרום המבןדד
דומה ב י ו ת ר ל ז ה של פ ע י ל ו ת תאים שלמים ,ממצא המרמז על כך שהאנזים בתא
השלם ו ב ק ר ו ם חשופים ל א ו ת ו pH״ ה פ ע י ל ו ת האמידטית דורשת קבוצה ג>-אמינית
חופשית של החומצה ה א מ י נ י ת ,כך שניתן להגדירה כ א מ י נ ו פ פ ט י ד ז .פ ע י ל ו ת דומה
של א מ י ד ז ,אך בעלת תחום ס פ צ י פ י ו ת שונה ,נמצאה ב .A. laidlawii -האמידז
של A. laidlawiiהקשןר גם כן בקרום ג י ל ה ס פ צ י פ י ו ת ב פ י ר ו ק א ל נ י ל נ פ ת י ל
4
אמיד ,Km=6xlO~ M ,בעןד שההידרןליזה של שאר ה נ פ ת י ל א מ י ד י ם שנבדקו היתה
מועטת .ה pH -האופטימלי ל פ ע י ל ו ת האמידז של A. laidlawiiנמצא בתחום
2
8-9pHוגם פעילות זו היא מסוג אמינופפטידזהנפתיל אמידז שזוהה ואופיין.
במיקופלסמה דומה בתכונותיו לארילאמידזות שנמצאו בחיידקים אך שונה במיקומו
הבלעדי בקרום התא.
הפעילות האמידטית של
M. fermentans
עוכבה כאשר התאים טופלו
ביודואצטט ב ;7>,pH5 -ניתן להגן על האמידז מפני עיכוב זה באמצעות היםטידין.
עיכוב האמידז שהינו כנראה תוצאה של התמרת ציםטאינים
המתרחשת על שטח פני
התא ,מתרחש בשני שלבים -שלב מהיר בו מושג עיכוב של 50%מהפעילות ההתחלתית
ושלב איטי שאינו מביא לעיכוב מלא ,מה שמעיד על שינויים אפשריים במזומנות
של קבוצות SHהחיוניים לפעילות(TLCK) .
,Tosyl lysine chloromethylketone
בהיותו ריאגנט התמרה דמוי םובסטרט ,לא פעל כמעכב בעל זיקה חזקה יותר
מיודואצטט בתחום הריכוזים הנבדק .נמצא כי גם כושר ההחדרה של
M. fermentans
להיסטידין ניפגם עד כדי 90%לאחר שהתאים טופלו ביודואצטט.
הממצא של עיכוב דומה של פעילויות קטליטיות שונות ,בעלות ספציפיות לאותו
סובםטרט ,הקשורות לקרום מהווה תמיכה בהשערה של Craneבדבר קיום קשר
תיפקודי בין האנזים למערכת טרנספורט של םובסטרט מסויים.
פעילות פפטידטית של
M. fermentansנמצאה לגבי די וטרי פפטידים
סינטטיים המכילים ) (Lחומצות אמיניות הבסיסיות היסטידין וליזין ,א ר לא
אורניטין .תוצרי פעילות הפפטידז אשר זוהו בכרומטוגרפיה הראו כי הביקוע
מתרחש מהקצה האמיני של הפפטיד ודורש קבוצה -0אמינית טרמינלית חופשית.
הספציפיות של ההידרוליזה והן ה pH -האופטימלי דומים בשתי הפעילויות -
פפטידז ואמידז .הפפטידז של , A. laidlawiiבדומה לאמידז ,מפרק בעיקר
_-1אלנין
מהקצה ה-^ -טרמינלי של פפטידים המכילים מ 2 -ועד 9שיירים.
הסטראוםפציפיות טל האנזים ,במקרה והפפטיד מכיל ם־חומצה אמינית ,דורשת
•4
רצף מוגדר , LLDכאשר שייר D
במרחק שני שיירים מהקשר הנבקע .מהכנת סדרת
אלנין אוליגופפטידים מוגדרת H L(LD) OHלמדנו כי הפפטידז הינו אמינופפטידז
3
כמו כ ן ,מהירות ה פ י ר ו ק י ו ר ד ת עם עלית אורך ׳הפפטיד ,מה שמצביע על אתר
קישור מ ו ג ב ל בגדלו או על התלות של מהירות ה פ י ר ו ק ב ד י פ ו ז י ה של הםובסטרס
באם האתר מצוי בעומק מ ם ו י י ם בממברנה .פ ע י ל ו ת ה פ פ ט י ד ז ,כמו האמידז קשורה
גם כן ל ק ר ו ם התא ו ה י ת ר ו ן ב מ י ק ו ם זה הוא באפשרות של המיקופלסמה והאכולפלסמה
שהם פ ר ז י ט י ם ובעלי כושר ב י ו ם י נ ט ט י מ ו ג ב ל ,לקלוט חומצות א מ י נ י ו ת מן המוכן
כאשר קצב הקליטה מבוקר על י ד י ה פ ע י ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ט י ת .
ל א ל נ י ן מצאתי כ י כאשר התאים מורחפים
בבדיקת חדירות A. laidalwii
בתמיסת בופר א י ז ו ט ו נ י ת ,ד ה י י נ ו בתנאים בהם נבדקו פ ע י ל ו ת הפפטידז ו ה א מ י ד ז ,
הם א י נ ם ח ד י ר י ם ל א ל נ י ן ,אשר ממלא את נפח ה א י נ ן ל י ן )הנפח ה ב י ן -ת א י ( .חדירה
של א ל נ י ן לתוך התא מתרחשת כאשר התאים ב מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל שלהם .תוצאה ז ו
מצביעה על מ י ק ו ם הפפטידז בעברה ה ח י צ ו נ י של הממברנה ,הבא במגע עם המדיום.
למלחים של ק ט י ו נ י ם חד ע ר כ י י ם יש השפעה בהגברת ה פ ע י ל ו ת האמידטית של
. A. laidlawiiמחסום החדירות טל התאים החשופים זמן קצר ל ר י כ ו ז ג ב ו ה של
מלח א י נ ו נ פ ג ע ואף ה פ ע י ל ו ת האמידטית א י נ ה י ו ר ד ת לתמיסה .הן ל ר י כ ו ז עולה
של המלח והן ל ס ו ג הקטיון יש השפעה מגבירת פ ע י ל ו ת שהינה מ י ר ב י ת ב נ ו כ ח ו ת
נ י אשלגן ) 1 . 6 7
M
( .ידועה השפעת המסוך של מטענים ש ל י ל י י ם על פ נ י
הממברנה ב נ ו כ ח ו ת ק ט י ו נ י ם ח ד -ע ר כ י י ם ,ו כ ן השפעתם על י י צ ו ב המצב ה ״ נ ו ז ל י "
של הממברנה .יתכן ו פ ע י ל ו ת ה י ד ר ו ל י ט י ת מהירה י ו ת ר מושגת כאשר ממברנת
המיקופלםמה במצב " נ ו ז ל י " .
ה פ ע י ל ו ת האמידטית של A. laidlawii
א י נ ה מושפעת in situמחשיפת התאים
לפעולת טריפםין או פ ו ס פ ו ל י פ ז .C
הפפטידז
והאמידז המגלים י צ י ב ו ת בתא השלם ,מאבדים פ ע י ל ו ת ם במעבר מהרמה
התאית לתכשיר ק ר ו מ י .תכשירים ק ר ו מ י י ם שהוכנו מ-
.
A
,
M. fermentans
בשיטות ש ו נ ו ת ב ק ר ו ר ל C0° -ו ב נ ו כ ח ו ת מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל ,א י ב ד ו
במהירות את פ ע י ל ו ת ם .רגישות מ י ו ח ד ת הראה התכשיר הקרומי מA. laidlawii -
/
4
אשר איבד כמעט את כל פעילותו תוך זמן קצר .אי-לכך ,לא היה באפשרותי
לבדוק את התכונות של האמידז והפפטידז בתכשיר הקרומי.
NADHאוקםידז בA. laidlawii -
NADHאוקםידז ב A. laidlawii -הינו חלבון קרומי המהווה חלק משרשרת
הנשימה המסתיימת בפלבין.אפיינתי מספר תכונות של אנזים זה הקשורות במיקומו
בקרום התא.
הראיתי כי ניתן להןציא את פעילןת האןקםידז לתסנין על ידי עיכול
הקרום עם פוםפוליפזות A
ו , C -החופשיות מפעילות פרוטאןליטית .התכשיר
המסים יכול לשמש כמוצא ל נ י ק ו י נוסף של האנזים בעל הפעילות בהעברת
אלקטרןנים אל חמצן כאקספטור .עיכול הפוםפוליפידים בד בבד עם שמירת
פעילות האוקםידז מאשר
ממצאים קודמים כי ליפידים אינם ח י ו נ י י ם לפעילות
אנזים זה.
מאידך ,האוקסידז הנשאר קשור בקרום שהושרו בו ש י נ ו י י ארגון מגלה מספר
תכונות המשקפות שינויים אלה בסביבתו הקרובה .למשל ,הדטרגנט הלא י ו נ י
Tween 20ממיס באןפן מבוקר את מרכיבי הקרןם כך שמשתנה יחס החלבןן לליפיד
מ2:1 -
ל , 4.5:1 -כלומר העשרה ניכרת בחלבון .תוצאת השינןי הזה התבטאה
בשינוי בנדידת החלבונים בSDS -
גל אלקטרופוריזה NADH .אוקסידז שנשאר
קשור בקרום המטופל גילה פעילות גבוהה יותר ,אף בהעדר מרקפטואתנול .זאת
ב נ י ג ו ד לתכשיר הקרומי המקורי אשר א י נ ו
מגלה את מלוא פעילותו בהעדר
מרקפטואתנול .השינוי בסביבה המקומית של האנזים התבטא גם בתזוזה של
פרופיל ה־ pH
לערכי pHגבוהים יותר.
ניסיתי לבודד את האוקםידז מהקדום על ידי סימונו בשלב ראשון עם מעכב
זיקה ובשלב שני המסת הקרום בדטרגנט י ו נ י והפרדת הקומפלכס האנזימטי .אכן,
מצאתי כי NADHדי-אלדהיד אשר הוכן על ידי חימצון במטפריודט ,מתאים לשמש
כמעכב זיקה של האנזים בהיותו מעכב את רוב הפעילות בריכוז נמוך .נראה כי
5
ר-זרחש אמנם קישור NADHדי-אלדהיד ,כנראה תוך יצירת בסיס שיף עם קבוצות
א מ י נ י ו ת בקרום שאינן ה י ו נ י ו ת לפעילות האוקםידז .אך השינוי הכימי גרם
ליצירת אגרגטים גבה מ ו ל ק ו ל ר י י ם של ח ל ב ו נ י ם ממברנליים כפי שנראה בSDS -
גל
אלקטרופוריזה ובתופעת החלבון המסומן בנפח ה פ נ ו י של עמודת ספרוז 4B
ב נ ו כ ח ו ת דטרגנטים.
6
מ ב ו א
.1
בעבודה ז ו א נ י מתארת ת כ ו נ ו ת מספר א נ ז י מ י ם הקשורים בממברנר• של שני
ס ו ג י מיקופלםמה:
Acholeplasma laidawiiו ־ . Mycoplasma fermentans
בחרתי במיקופלסמה משום ש ב מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז ם זה י כ ו ל ת ה ב י ו ם י נ ת י ז ה מ ו ג ב ל ת ,
התא חסר ד ו פ ו צפיד ,והממברנה ה ח י צ ו נ י ת שהיא היחידה בתא נ י ת נ ת להפקה
ה א נ ז י מ י ם שבחנתי ה י ו :האמידזות ה פ פ ט י ד ז ו ת ו ה -
בקלות.
באיפיוו
. NADH oxidase
ה ת כ ו נ ו ת של א נ ז י מ י ם ממברנלים אלה ה ת כ ו ו נ ת י להכיר את השפעת
הממברנה על ת כ ו נ ו ת ה א נ ז י ם .כדי להרחיב י ד י ע ו ת י על ממברנת המיקופלסמה
חקרתי גם ח ד י ר ו ת ה מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז ם לחומצות א מ י נ י ו ת והשפעתם של חמרים מעכבי
ח ד י ר ו ת על החדירות ועל ה א נ ז י מ י ם הקשורים בממברנה.
להלו אסקור את ה ת כ ו נ ו ת ה מ א פ י י נ ו ת א נ ז י מ י ם הקשורים לממברנות
ב י ו ל ו ג י ו ת ו כ ו מערכות טרנספורט הקשורות ב פ ע י ל ו ת א נ ז י מ ט י ת .כן אסקור את
המבנה
ו ה פ י ס י ו ל ו ג י ה של מיקופלסמה ואפרט את ה י ד ו ע על ההרכב ו ה ת כ ו נ ו ת של
הממברנה של מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז ם זה.
הבנה מעמיקה של התהליכים ה ס פ צ י פ י י ם ה י ו צ א י ם לפועל בממברנות ב י ו ל ו ג י ו ת
תתכו אך ורק ת ו ך הכרת ה ק ו נ פ ו ר מ צ י ה של ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם המרכיבים את
הממברנה,
ידיעה של ס ו ג י הקשרים האחראים לאינטראקציה שביו מ ר כ י ב י הממברנה
ו מ ו ל י כ י ם למבנה המרחבי המיוחד שלה .אולם מו הראוי ל צ י י ו שעל אף המחקר
המקיף ת ו ך שימוש בשיטות פ י ס י ק ל י ו ת ו כ י מ י ו ת טרם הוברר הארגוו של מ ר כ י ב י
הממברנה ברמה ה מ ו ל ק ו ל ר י ת .
1.1
ה ת כ ו נ ו ת של א נ ז י מ י ם הקשורים לממברנות ב י ו ל ו ג י ו ת
א נ ז י ם הקשור לממברנה נמצא בסביבה מיוחדת
Microenvironment
ה מ א ו פ י י נ ת על י ד י מבנה הממברנה ו א ו פ י מ ר כ י ב י ה .פ ע י ל ו ת ו של א נ ז י ם
הקשור לממברנה י כ ו ל ה לשמש כמדד רגיש ל ש י נ ו י י ם במרכיבי הממברנה או
באירגונם.
ש י נ ו י מזערי במולקולה חלבוו או ל י פ י ד ממברנלי שקשה ל ג ל ו ת ו
7
בשיטות פיסיקליות עלול להשתקף בשינוי מתאים בפעילות האנזים
הניתנת למדידה .ההשפעה המיוחדת של הסביבה המקומית על תכונות אנזים
נבדקה במערכות מודל של אנזימים הקשורים לממברנה סינטתית ).(1נמצא
שהמטען החשמלי של הממברנה וגם הרכבה וכן עובי שכבת הדיפו ז יה
המפרידה בין האנזים הממןקם בממברנה לבין הסובסטרט במדיום קובעים
את הפרמטרים הקינטיים כמו תלות הפעילות בריכוז הסובסטרט וב pH -״
השוואת פעילות אנזים ממברנלי לפעילותו בתמיסה מצביעה על רגישות שונה
בשני המצבים למעכבים ולטמפרטורה .תופעה זו אשר נבדקה לגבי )(Fj
ATPaseהמיטוכונדריאלי הוגדרה על ידי ( R a c k e r(2כאלוטופיה .תופעה
דומה נמצאה גם ב ATPase -בקטריאלי ) . ( 3אנזים חלקיקי מגלה שוני,
בהשוואה לאנזים המסים ,בתכונות כמו pHאופטימלי ,Km ,ספציפיות
לםובםטרט ,יציבות לטמפרטורה ,פוטנציאל חיזור וכדי .
התכונות המיוחדות שהממברנה מקנה לאנזים קשור הן:
א(
- Compartmentationהמיקום המרחבי של האנזים בא לידי ביטוי
באפשרות טל היווצרות ריכוז מקומי גבוה של סובסטרט ,בהפרדה
מרחבית של תהליכים מתחרים או ביצירת שרשרת תהליכים רציפים.
ב( פזה ליפידית -פאזה זו מאפשרת קיום למוצרי ביניים הנהרסים
על נקלה״בפאזה מימית.
הדבר נכון למשל לגבי אנזימים ממברנליים הקשורים במטבוליזם
של שומנים או בהעברת אלקטרונים.
חשיבות מבנה הממברנה לפעילויות אנזימטיות ולגבי מערכות טרנספורט
מוכחת מכך שפעילויות אלה נעלמות תוך כדי הרחקת הליפידים הממברנליים.
איבוד הפעילות הקטליטית עקב הפעלת דטרגנטים ,ממסים אורגנים או
פוספוליפזות על הממברנות ,אינה הוכחה בלעדית לתלות האנזים בליפיד.
8
אינאקטיבציה יכולה להיות תוצאה של:
בליפידים;
א( דנטורציה שאינה קשורה
ב( פעולה מעכבת של תוצרי המודיפיקציה;
ג( פעולה מעכבת
ישירה של הריאגנט או חמרי לוואי כמו אנזימים פרוטאוליטים .תאום בין
ריאקטיבציה של הפעילות וקישור עם ליפידים מהווה מבחן עיקרי לתלות
אנזים בליפידים לצורך פעילות תקינה .נמצא כי רב האנזימים הממברנלים
הדורשים ליפידים לפעילותם ,דהיינו תלויים בקיום המבנה הספציפי של
הממברנה ,הינם אנזימים הפעילים בהעברת אלקטרונים ,במטבוליזם של שומנים
וכו חלבונים הקשורים בטרנספורט ובהעברת אינפורמציה.
רוב האנזימים הממברנליים שהומסו באמצעים שאינם גורמים לדנטורציה
כמו 90%אצטוו בטמפרטורה נמוכה או על ידי הפעלת פוספוליפזות ,יכולים
לעבור ריאקטיבציה בנוכחות תערובת של פוספוליפידים ממברנליים ,או
אפילו עם דטרגנטים לא-יאונים ,גליצרידים וחומצות שומניות ) .(4לגבי
אנזימים כאלה מהוים הליפידים מדיום להמסת םובםטרט ליפידי כמו למשל
במערכת ,(UDP-hexosyltransferase (5או לאינטראקציה עם אלקטרוו
אקםפטור המסיס בשומן .(NADH-Cytochrome C reductase(6מאידך ,ישנם
אנזימים ממברנלים המגלים תלות מוחלטת בפוספוליפיד מםויים ) ,(7כמו
למשל פוםפטידיל כולין באנזימים ממקור אנימלי
g-hydroxybutyrate
dehydrogenaseו,GTP-dependent acyl-CoA synthetase -פוםפטידיל
גליצרול באנזים הבקטריאלי
Phospho-enolpyruvate phosphotransferase
וקרדיוליפיו באנזים בקטריאלי dehydrogenase.
אנזימים המוגדרים כקשורים ברפיון
•FAD-dependent malate
) ,(loosely boundהניתנים לניתוק
מהממברנה על ידי םוניקציה קצרה או חשיפה לתמיסת מלח מרוכזת בנוכחות
, EDTAמראים ספציפיות בקיטורם החוזר לממברנה .למשל קישורם של
Monoamine Oxidaseלממברנה החיצונית של מיטוכונדריה ו ATPase -לממברנה
הפנימית מראה קינטיקת רוויוו המעידה על קיום אתרי קישור ספציפיים
לחלבונים אלה על הממברנה ). (8
9
כ י ש י נ ו י י ק ו נ פ ו ר מ צ י ה א ו א פ ש ר ו ת תנוער .של ח ל ב ו נ י ם ב מ ד י ו ם
צפוי
ה ה י ד ר ו פ ו ב י של ה -
bilayer
י ת ר ח ש ו עם א נ ר ג י ת א ק ט י ב צ י ה נ מ ו כ ה י ו ת ר
כאשר ה ל י פ י ד י ם במצב נ ו ז ל י ל ע ו מ ת מצב ג ב י ש י ,מאחר ו א י נ ט ר א ק צ י ו ת
ליפיד-חלבון
)(9
חלשות י ו ת ר ב ס ב י ב ה נ ו ז ל י ת .א כ ן נמצא על י ד י ר ו ת ם ו ח ב ר י ו
כ י המעבר של ה מ מ ב ר נ ה של ז ן
גבישי
M. mycoidesה ע נ י ב כ ו ל ס ט ר ו ל ,ל מ צ ב
מ ל ו ו ה ב ע ל י ה ב א נ ר ג י ת ה א ק ט י ב צ י ה של ת ה ל י ך ה ט ר נ ס פ ו ר ט של
מ-מתילגלוקוזיד.
התבטאו
במקרה ז ה ,
שינויים בארגון
ה א י ז ו ר ה ל י פ י ד י של ה מ מ ב ר נ ה
ב ק י נ ט י ק ה של ת ה ל י ך ה ה ח ד ר ה .
כי ה ל י פ י ד י ם הממברנלים חשובים ל פ ע י ל ו י ו ת קטליטיות הממוקמות
ראינו
ב מ מ ב ר נ ה מעצם ה י ו ת ם מ ד י ו ם ה י ד ר ו פ ו ב י ל ר י א ק צ י ה ה ק ט ל י ט י ת ,
מתאימה,
החלבון
ג(
בצמיגות
א ו ד ר ו ש י ם ב א ו פ ן ס פ צ י פ י כ נ ר א ה ל י י צ ו ב ק ו נ פ ו ר מ צ י ה מ ס ו י י מ ת טל
הפעיל ה ח י ו נ י ת ל פ ע י ל ו ת ו הקטליטית.
מ י ק ו ם ח ו ץ א ו פ נ י ם -אתר פ ע י ל ב מ מ ב ר נ ה ה פ ל ם מ ט י ת מ ע ו ר ר את השאלה
לגבי
מ י ק ו מ ו ב י ח ס ל ח ו ץ א ו פ נ י ם התא .ב ע י ה ז ו קשורה ג ם ב ד ר י ש ו ת
ה ת ז ו נ ת י ו ת של התא ו ב א פ ש ר ו ת טל ק י ו ם קטר פ ו נ ק צ י ו נ ל י ביו ת ה ל י כ י ם
אנזימטיים
כי
ו ת ה ל י כ י החדרה ד ר ך ה מ מ ב ר נ ה .א פ ש ר ו ת אחת שהועלתה למשל ה י א
ה א נ ז י ם עצמו מ ס ו ג ל ל ק ש ו ר ו ל ה ע ב י ר ם ו ב ס ט ר ט י ם ב י ן ת ו ץ ל פ נ י ם ה ו ד ו ת
לשינויי
עברי
ק ו נ פ ו ר מ צ י ר .ב מ ו ל ק ו ל ה ה מ ת ב ט א י ם ב ז י ק ה ש ו נ ה של אתר ה ק י ש ו ר מ ש נ י
הממברנה
) .(10ת ו פ ע ה אחרת ה י א א י נ ט ר א ק צ י ה של ה ו ר מ ו ו עם אתר
ספציפי
ב ע ב ר ה ח י צ ו נ י של ה מ מ ב ר נ ה ה ג ו ר מ ת לשרשרת ת ה ל י כ י ם ש ס ו פ ם ה פ ע ל ת
האנזים
א ד נ י ל צ י ק ל ז בתא.
קיימת
הבחנה א ו פ ר ט י ב י ת ב י ו
חלבונים פריפרליים ואינטריםיים
ז א ת על פ י מ ה ו ת ו ח ו ז ק ה ק ש ר י ם של ח ל ב ו נ י ם אלה ל מ מ ב ר נ ה .
טכניים,
שינויי
),(11
ה ק ר י ט ר י ו נ י ם הם
כ ל ו מ ר שימוש ב ש י ט ו ת ש ו נ ו ת ל ה פ ר ד ה .א מ צ ע י ם ה נ ח ש ב י ם ע ד י נ י ם כ מ ו
העצמה ה י ו נ י ת ) ב ת ו ס פ ת (EDTAמ ש פ י ע י ם ב ע י ק ר על ק ש ר י ם א ל ק ט ר ו ם ט ט י ם .
10
אמצעים דרםטים כמו דטרגנטים או חמרים כאוטרופיים מוציאים את החלבון
בדרך כלל ,בצורה דנטורטיבית ,בצורת קומפלכס עם הדטרגנט או עם ליפידים.
בבדיקת פעילות אנזימים הקשורים לממברנה מתעוררים קשיים
אנליטיים מהיותם חלקיקיים .בקטליזה הטרוגנית תלויה מהירות הריאקציה
בדיפוזיה של הםובסטרט אל האתר הפעיל והיא מושפעת גם משינויים מקומיים
ב pH -או בקבוע הדיאלקטרי .גם השיטות השונות של הכנת פרפרטים ממברנלים
אינן אמינות ותלויות בתנאי ההכנה ובסוג הממברנה .לעיתים קרובות מוצאים
היפוך חוץ-פנים או אגרגציות של חלקיקים קטנים וכתוצאה מכך אובדות
לעיתים פעילויות קיימות או נחשפים אתרים אשר באופן טבעי אינם באים
לידי ביטוי כנראה עקב מחסום החדירות.
1.2
מיקופלסמה -תכונות המיקרואןרגניזם השלם ןקרום התא שלו
המיקרואורגניזמים הנמנים על קבוצת המיקופלסמה הם האורגניזמים
הקטנים ביותר המסוגלים לגדול אוטונומית .מבחינה מורפולוגית תא
המיקופלסמה תינו שק מוקף קרום פלסמטי ,המכיל ריבוזומים וחומר גרעיני
המאורגן בדומה לתאים פרוקריוטים דהיינו ללא קרום גרעין .מיון
המיקופלסמה למשפחות ה-
MycoplasmataceaeוAcholeplasmataceae -
מושתת על הדרישה או העדר הדרישה לכולסטרול וסטרולים אחרים כפקטורים
לגידול .המיקופלםמטצה נזקקים לםטרולים ,בעוד שהאכולפלסמטצה אינם
זקוקים לסטרולים ) . ( 1 2אכולפלסמה נחשבו תחילה כםפרופיטים היות ובודדו
לראשונה מאדמה ומביוב .אך הדרישות התזונתיות ורגישותם האוםמוטית
מעמידים בספק היותם םפרופיטים אמיתיים בתנאים אקולוגים משתנים .
המיקןפלסמה חסרים את דופן הפפטידוגליקן הצפיד המאפייו חיידקים .עובדה
זו מתבטאת בפלסטיות של התא ,המסוגל בהשפעת לחץ לחדור מבעד לנקבים
טרו
)
(
) .(pm0.2-0.313תכונות נוספות הנובעות מהעדר הדופן
הן עיכוב הגידול על ידי נוגדנים ספציפיים לקרום התא וכן יציבות מוחלטת
11
הצורה ה מ ו ר פ ו ל ו ג י ת ה ב ס י ס י ת ה י א הצורה ה כ ד ו ר י ת ,ה ק ו ק י ת ,
לפניצילין.
אולם ק י י מ י ם תנאי
ג י ד ו ל ב ה ם מ ו צ א י ם ג י ד ו ל י ם פ י ל מ נ ט י י ם ) .(14ק ר ו ם התא
נ ר א ה בחתך כ "unit membrane"-א ו פ י י נ י ב ע ו ב י של . ( O n m . 8 . 0 - 1 1(15א י ן
ע ד ו ת ל ק י ו מ ו של מ מ ב ר נ ו ת ת ו ך -ת א י ו ת .ה ת ר ב ו ת ה מ י ק ו פ ל ס מ ה נ ע ש י ת ב ד ו מ ה
לאורגניזמים
בהתפצלות
פ ר ו ק ר י ו ט י י ם אחרים,
ב י נ ר י ת ).(16
ב מ י ק ו פ ל ס מ ה שלא כאשר ב ח י ד ק י ם ב ע ל י ד ו פ ו ,א י ו
למצוא תמיד ס י נ כ ו ר ו נ י ז צ י ה
הציטופלסמה.
יותר.
מלאה ביו
רפליקצית הגנום
לביו
חלוקת
ל ע ת י ם נ ו צ ר י ם פ י ל מ נ ט י ם ר ב -ג ר ע י נ י י ם ה מ ת פ ר ק י ם בשלב מ א ו ח ר
ה נ צ ה ה נ ר א י ת ל ע י ת י ם ק ר ו ב ו ת ב ת ר ב י ו ת מ י ק ו פ ל ס מ ה ה י נ ה למעשה ג ם כו
התפצלות
ב י נ ר י ת בה ח ל ו ק ת ה צ י ט ו פ ל ס מ ה א י נ ה ש ו ו ה .ה ח ו מ ר ה ג נ ט י של
מיקרפלסמה
המוכפל
ד ה י י נ ו ר פ ל י ק צ י ה של ה ג נ ו ם ה מ ל ו ו ה
ב ד ו מ ה ל ח י י ד ק י ם ה ו א כ ר ו מ ו ז ו ם מ ע ג ל י מ ר כ ב מ DNA -ד ו -ג ד י ל י
ב צ ו ר ה ס מ י ק ו נ ס ר ב ט י ב י ת ח ד -כ ו ו נ י ת מאתר ג ד י ל ה י ח י ד ).(17
סווג
ה א כ ו ל פ ל ס מ ה כמשפחה נ פ ר ד ת מ ב ו ס ס ב מ י ד ה ר ב ה על ג ו ד ל ה ג נ ו ם -
Q
ו ג ד ו ל פ י שנייםE. coliהמתקרב ב ג ו ד ל ו ל ג נ ו ם של
ל ע ר ך מ ג נ ו ם של מ י ק ו פ ל ס מ ה .
ציסטרונים.
ה מ י י ח ד את ג נ ו ם ה מ י ק ו פ ל ס מ ה מ ח י י ד ק י ם ה ו א ה ת כ ו ל ה ה נ מ ו כ ה
של , GCכ .23-35% -
אינפורמציה
ג נ ו ם ב ג ו ד ל זר .מ כ י ל א י נ פ ו ר מ צ י ה ל 1200-1300 -
עובדה ז ו
י כ ו ל ה ל ה ס ב י ר את ה כ מ ו ת המצומצמת של
ל ת ר ג ו ם ה י ו ת ו א י ו א פ ש ר ו ת ל ד ג נ ר צ י ה של ה צ ו פ ו .ל מ ר ו ת ג ו ד ל ו
ה מ צ ו מ צ ם של ה ג נ ו ם ו ל כ א ו ר ה פשטות ה מ ב נ ה ,ל א ב ו צ ע מ י פ ו י ו עד כ ה .אחת
הסיבות
ה ע ק ר י ו ת ל כ ך ט מ ו נ ה בקושי הרב לקבל מ ו ט נ ט י ם החסרים ת כ ו נ ו ת
ביוכימיות
מסויימות,
ו ז א ת ע ק ב ה מ ד י ו ם העשיר ו ה ב ל ת י מ ו ג ד ר הדרוש ל ג י ד ו ל
ר ו ב מ י נ י ה מ י ק ו פ ל ם מ ה .עד עתה נ כ ש ל ו כ ל ה נ ס י ו נ ו ת ל מ י ק ו ם ס מ נ י ם ג נ ט י י ם
על ה כ ר ו מ ו ז ו מ י ם של מ ו ט נ ט י ם ה ר ג י ש י ם ל ט מ פ ר ט ו ר ה .
ב-
A. laidlawii
לביטוי
יצירת
a-glucosidase
בהשראת מ ל ט ו ז מ ה ו ו ה ה ו כ ח ה ר א ש ו נ ה ל ק י ו ם מ נ ג נ ו ו בקרה
ה ג נ ט י ב מ י ק ו פ ל ם מ ה ).(18
12
ם י נ ת י ז ת ה ח ל ב ו נ י ם במיקופלםמה נעשית כנראה על פ י המתכונת שנמצאה
ב א ו ר ג נ י ז מ י ם ה פ ר ו ק ר י ו ט י ם ,והיא מעוכבת על י ד י כ ל ו ר א מ פ נ י ק ו ל ,מעכב
ספציפי טל ם י נ ת י ז ת ח ל ב ו נ י ם על ר י ב ו ז ו מ י ם
70
S
בקטריאליים .ה ר י ב ו ז ו מ י ם
של מיקופלסמה ד ו מ י ם י ו ת ר ל ר י ב ו ז ו מ י ם בקטריאלים מאשר ל א נ י מ ל י ם הן במבנה
והן ב פ ו נ ק צ י ה .הם מ כ י ל י ם יחס RNAלחלבון 60:40בהשוואה ליחס של 40:60
ב ר י ב ו ז ו מ י ם ה א א ו ק ר י ו ט י ם .ה מ י ג ו ו ן של tRNAמצומצם ,ונמצאה כמות העתקים
מ י ז ע ר י ת המתאימה ב ד י ו ק למערכת החומצות ה א מ י נ י ו ת .מציאות
et
™tRNA
מראה ש פ ו ר מ י ל מ ת י ו נ י ן מעורב ב א י נ י א צ י ה של ס י נ ת י ז ת השרשרת ה פ ו ל י פ פ ט י ד י ת .
הידע על ו ו י ס ו ת ובקרה של ם י נ ת י ז ת מ א ק ר ו מ ו ל ק ו ל ו ת במיקופלסמה מ ו ג ב ל .
ל ג ב י מיקופלםמה בעלי ג נ ו ם קטן )
3-4
ד ל ט ו ן ( x 1 0נמצא חוסר ק ו א ו ר ד י נ צ י ה
ב י ן ס י נ ת י ז ת ח ל ב ו ן ו ־ RNAלקצב ם י נ ת י ז ת ,DNAו מ ב ח י נ ה א ב ו ל ו צ י ו נ י ת נ י ת ן
לכך הסבר ב א ו פ י ה פ ר ז י ט י של אותם מיקופלםמה ה ג ד ל י ם בסביבה מבוקרת של
הפונדקאי.
לעומת זאת ,באכולפלםמה נמצאה התאמה מ ם ו י י מ ת ב י ן קצב ם י נ ת י ז ת
DNAו ח ל ב ו ן
) .(19יש לצפות אמנם כי ב ג נ ו ם ה ג ד ו ל י ו ת ר של אכולפלםמה
תהיה א י נ פ ו ר מ צ י ה גם ל מ נ ג נ ו נ י ו ו י ס ו ת ובקרה של ס י נ ת י ז ה .
1.2.1
ק ר ו ם התא של מיקופלסמה
א.
ב י ד ו ד הממברנה הפלםמטית והרכבה
העדר ד ו פ ן פ פ ט י ד ו ג ל י ק ן ,ו כ ן ההעדר של ממברנות
צ י ט ו פ ל ס מ ט י ו ת ת ו ך -ת א י ו ת ,גרמו לכך שחוקרים רבים ר ו א י ם
במיקופלםמה מערכת נאותה לחקר ההיבטים השונים של מבנה
ו ת י פ ק ו ד הממברנה הפלסמטית של התא .ל י ז י ס א ו ם מ ו ט י ,השיטה
העדינה ב י ו ת ר ל ב י ד ו ד מ מ ב ר נ ו ת ,מתאימה להפרדת ממברנות של
אכולפלםמה הרגישים ב מ י ו ח ד לשוק אוםמוטי ) .(20שיטות
אחרות כמו ם ו נ י ק צ י ה ,הפשרה והקפאה ל ס י ר ו ג י ן ,דרושות
ל ב י ד ו ד ממברנות ממיקופלםמה ,דורשי הםטרול ,העמידים בתחום
רחב למדי של עצמה י ו נ י ת .המגרעת של השיטות האלו בכך שהן
13
ג ו ר מ ו ת לשבירת הממברנות ל ח ל ק י ק י ם ק ט נ י ם שאינם נ י ת נ י ם להשקעה
ב xg-C21)4 0 , 0 0 0
).(22
ואף א י נ ן ג ו ר מ ו ת לשבירה מלאה של כל התאים
ה י צ י ב ו ת האוסמוטית הרבה של מיקופלסמה במשך ר ו ב שלבי
התרבותם א י נ ה ברורה .הסבר אפשרי מתבסס על היחס הגבוה של שטח
פ נ י ם לנפח המאפשר שיחדור מהיר של מומסים ת ו ך -ת א י י ם בזמן
העברה ל מ ד י ו ם ה י פ ו ט ו נ י ,והקטנה מהירה של הלחץ האוסמוטי ה פ נ י מ י .
בהקשר ז ה ,ידועה העובדה שמיקופלסמה ה י נ ם leakyבתמיסות שאינן
תזונתיות.
מ ע נ י ן ל צ י י ן שממברנת מיקופלםמה יציבה בהרבה
ל ם ו נ י ק צ י ה מהממברנה של פ ר ו ט ו פ ל ם ט י ם בקטריאלים.האם יש קשר
ל י צ י ב ו ת ז ו עם התכולה הגבוהה של כ ו ל ס ט ר ו ל בממברנה ) (23לא
הובהר ע ד י י ן .היחס של חלבון ל ל י פ י ד בממברנה הוא 60:40
באכולפלםמה ובמיקופלםמה ) .(23יחם זה ע ל ו ל להשתנות בממברנות
מ ב ו ד ד ו ת עקב נ ו כ ח ו ת פ פ ט י ד ז ו ת ו פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת ,ויש על כן לשמור
את הפרפרטים הממברנליים בטמפרטורה נ מ ו כ ה .הכמות הקטנה של
פחמימות בממברנה זוהתה כ ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם .א י ן עדות ל נ ו כ ח ו ת
ג ל י ק ו פ ר ו ט א י נ י ם שהם מ ר כ י ב י ם ע י ק ר י י ם בממברנה הפלסמטית של
A. laidlawiiמ כ י ל ו ת ג ל ו ק ו ז א מ י ן
אאוקריוטים.
ממברנות של
וקלקטוזאמין
ה נ י ת נ י ם ל מ י צ ו י באצטון מימי ו א י נ ם קשורים
ל ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם כמוכח מהנדידה השונה ב א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה .כנראה
שחומרים אלה מ ו פ י ע י ם בצורה טבעית כ פ ו ל י מ ר הקשור או םפוח בצורה
רופפת ל ק ר ו ם התא ).(24
ב.
פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת הקשורות בממברנה
ז ו ה ו כתריסר פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת הקשורות בממברנר ,של
מיקופלםמה ) ,(25אך הידע על מ י ק ו ם פ ע י ל ו י ו ת אלה מצומצם ב י ו ת ר .
נמצא כ י ATPaseקשור בממברנה ,כנראה בצידה ה פ נ י ם -ת א י .פ ע י ל ו ת
NADH Oxidaseקשורה בממברנה נמצאה ב -
,A. laidlawiiמאידך
14
הפעילות
מםיסה
ג.
ה א נ ז י מ ט י ת ט ל א ו ק ם י ד ז ה ז ו ב מ י ק ו פ ל ם מ ה נמצאה ב צ ו ר ה
בציטופלסמה
המסה
).(26
ו ב י ד ו ד טל ח ל ב ו נ י ה מ מ ב ר נ ה
ר ו ב השיטות ה ק י י מ ו ת להפרדה
מותאמות
ו ל פ ר ק צ י ו נ צ י ה של ח ל ב ו נ י ם
ל ח ל ב ו נ י ם ה י ד ר ו פ י ל י י ם ב ת מ י ס ה וקשה ב י ו ת ר ל ר ת א י מ ן
לחלבונים
ממברנלי
חלקיקיים הידרופוביים.
ה נ ס י ו נ ו ת ל פ ר ק צ י ו נ צ י ה של ח ו מ ר
מ מ י ק ו פ ל ס מ ה ,שהומס על י ד י ד ט ר ג נ ט י ם ,על ע מ ו ד ו ת ס פ ד ק ם
או ס פ ר ו ז בהעדר ד ט ר ג נ ט י ם נכשלו ה י ו ת
בעת האלוציר.
להפריד
).(27
ב נ ו כ ח ו ת ד ט ר ג נ ט ב ב ו פ ר ההפרדה נ י ת ו ה י ה
ח ל ב ו נ י ם מ ל י פ י ד י ם ו א ף ל ק ב ל מ י ד ה מ ם ו י י מ ת של פ ע י ל ו ת
NADH Oxidaseאשר ה ו פ י ע ה ב -
כלומר
ו ה ח ל ב ו נ י ם עברו אגרגציה
void volumeשל ,Sephadex G-200
ב צ ו ר ת ח ל ב ו ו ג ב ה מ ו ל ק ו ל ר י כ נ ר א ה במצב א ג ר ג ט י ב י .
הואיל
ואיבוד
ו ה פ ר ד ת ם של א נ ז י מ י ם מ מ ב ר נ ל י י ם מ מ י ק ו פ ל ס מ ה ,ל ל א ד נ ט ו ר צ י ה
פ ע י ל ו ת ,כה קשה ,ל א א ו פ י י נ ו ה פ ע י ל ו י ו ת ה ש ו נ ו ת .ה ־ ATPaseטל
laidlawii״ Aר ג י ש ב י ו ת ר ל ד ט ר ג נ ט י ם ,
ואיו הוא נ י ת ו
על י ד י ה ק ט נ ת ה ע ו צ מ ה ה י ו נ י ת ב נ ו כ ח ו ת EDTA
לבידוד
או ם ו נ י ק צ י ה קצרה,
ת נ א י ם אשר ה ו פ ע ל ו בהצלחה ב ש ח ר ו ר א נ ז י מ י ם ד ו מ י ם מ ח י י ד ק י ם .ל מ ר ו ת
היותו
כנראה א נ ז י ם א י נ ט ג ר ל י במבנה הממברנה ה ו א דומה ל א נ ז י מ י ם
ה ב ק ט ר י א ל י ם ב ז ה ש א י נ ו דורש ל פ ע י ל ו ת ו
יוני
בתרו
ואשלגו
ואינו
מ ע ו כ ב על י ד י . ( O u a b a i n(28ל א ב ר ו ר האם ה ־ ATPase
ו phosphatase -
nitrophenyl־ pמ ב ט א י ם פ ע י ל ו ת של ח ל ב ו ו א ח ד א ו
ה י נ ם שני א נ ז י מ י ם ש ו נ י ם .
אורגניים
ו ל פ ר ו נ ז מ ע י ד ה שכנראה א י ו ז ה א נ ז י ם א ח ד .
NADH Oxidaseע מ י ד ה ל מ ד י
משוחזרות
בנוכחות
הרגישות השונה ל ד ט ר ג נ ט י ם ,לממיםים
פעילות
ב נ ו כ ח ו ת דטרגנטים וזוהתה גם בממברנות
) .(29כ פ י ש צ ו י י ו
לעיל,
ניתו
להפריד את ה א ו ק ם י ד ז
ד ט ר ג נ ט מ ל י פ י ד י ם מ מ ב ר נ ל י ם שכנראה א י נ ם ד ר ו ש י ם ל ב י ט ו י
15
תקין טל ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת נ.(30
א נ ל י ז ת החומצות ה א מ י נ י ו ת טל ממברנות
A. laidlawii
אינה
מראה תכולה גבוהה ב מ י ו ח ד טל חומצות א מ י נ ו ה י ד ר ו פ ו ב י ו ת ).(24
ממצא זה נ ו ג ד את הדיעה ש ה ה י ד ר ו פ ו ב י ו ת טל ח ל ב ו נ י הממברנה ת ל ו י ה
בהעטרתם בחומצות א מ י נ י ו ת ה י ד ר ו פ ו ב י ו ת .בדומה לממברנות ב י ו ל ו ג י ו ת
אחרות ,תכולת הציסטאין והציםטין בממברנת
A. laidlawiiנמוכה
ב י ו ת ר ) .(31 ,32העדר קשרים ד י -ם ו ל פ י ד י י ם א ו פ י י נ י ל ח ל ב ו נ י ם
הקטורים עם ל י פ י ד י ם בממברנות ו ג ם בקומפלכםים ל י פ ו פ ר ו ט א י נ י ם
בתמיסה .הטרשרות ה פ ו ל י פ פ ט י ד י ו ת טאין בהן גשרי ב י נ י י ם ח ו פ ט י ו ת
לתנועה,
ומשום כך מ ס ו ג ל ו ת השרשרות הפחמתיות של ט ו מ נ י הממברנה
להשתלב ב א ז ו ר י ם ה ה י ד ר ו פ ו ב י י ם של החלבון ) .(33ק ב ו צ ו ת ה SH -
מ צ ו י ו ת כנראה באתרים החשובים ל פ ע י ל ו ת ה ב י ו ל ו ג י ת של הממברנה ואכן
נמצאה רגישות גבוהה של ( A T P a s e(28ושל מערכות טרנספורט )(34
ל ר י א ג נ ט י SH״
מיגוון
ה ח ל ב ו נ י ם הממברנלים הנראה ב א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה ב ג ל של
פוליאקרילאמיד,
המכיל דטרגנט ,SDSמ ג י ע ל 15-30 -פסים הנצבעים
בצביעה ספציפית )מספר הפסים ת ל ו י בשיטת ה א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה ( .משקלם
ה מ ו ל ק ו ל ר י של ה ח ל ב ו נ י ם הוא בתחום . 9,000-70,000ת מ ו נ ת
ה א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה בתנאים מ ו ג ד ר י ם ספציפית למין של המיקופלסמה,
יתכן א י פ ו א להשתמש בה ב ז י ה ו י ו מ י ו ן מיקופלסמה ).(35
ד.
שומני הממברנה
בסקירה ז ו נעמוד אך בקצרה על הרכב השומנים ותפקידם במבנה
ממברנת המיקופלםמה .י ד ו ע כ י כל השומנים של מיקופלםמה ממוקמים
בממברנה והרכבם ב ר ו ב ו שומנים פ ו ל ר י י ם
)פוםפו-וגליקוליפידים(,
ו מ י ע ו ט ו כ ו ל ס ט ר ו ל ו ק ר ו ט נ ו א י ד י ם ) .(25כל המיקופלסמה שנבדקו
16
דורשים חומצות ש ו מ נ י ו ת א ר ו כ ו ת שרשרת ל ג י ד ו ל ם ,וחלקם אף דורש
גליצרול.
תלות ז ו של ה ג י ד ו ל ב פ ר ק ו ר ס ו ר י ם של שומנים מאפשרת,
ב ג ב ו ל ו ת מ ס ו י י מ י ם ,ל ו ו ס ת באופן מלאכותי כמות של מרכיב מ ם ו י י ם
ו ל ב ד ו ק השפעת ה ש י נ ו י שנגרם על ת כ ו נ ו ת הממברנה .כך למשל הראו
) (36כ י עליה בתכולת חומצה א ו ל א י ת מ ל ו ו ה בעליה נ י כ ר ת במספר
התאים ו י צ י ב ו ת ם האוסמוטית ו כ ן בנטיתם לצמוח בצורת פ י ל מ נ ט י ם .
לעומת זאת ,מתן חומצה סטארית עיכב את ה ג י ד ו ל ,התאים ה י ו נ פ ו ח י ם
ורגישים לשבירה .השפעות אלו מ י ו ח ס ו ת ל ש י נ ו י י ם בארגון הממברנה,
דהיינו
ס י ד ו ר ט ו נ ה טל השרשרות הפחמתיות ב -
המתבטאים ב ט י נ ו י י ם ב ח ד י ר ו ת ו ב פ ל ם ט י ו ת .ל -
bilayerה ל י פ י ד י ,
A. laidlawiiיש
כנראה מ נ ג נ ו ן ל ו ו י ס ו ת ה נ ו ז ל י ו ת טל ה א ז ו ר י ם ה ל י פ י ד י י ם בממברנה
בתנאים פ י ס י ו ל ו ג י י ם משתנים .הורדה נ י כ ר ת טל טמפרטורת ה ג י ד ו ל
התבטאה בעליה נ י כ ר ת של א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ת חומצה א ו ל א י ת והקטנה של
ה א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה של כ ו ל ס ט ר ו ל .ה ש י נ ו י י ם ב נ ו ז ל י ו ת א ו ב ח נ ו בעזרת
חומצות ש ו מ נ י ו ת
, spin-labeledונראה כי בטמפרטורה נמוכה חופש
התנועה של החומצה השומנית המסומנת ג ב ו ה י ו ת ר מאשר בטמפרטורת
ה ג י ד ו ל האופטימלית
)
(
) . ( C 3 7 ° 3 7הדרישה ל כ ו ל ס ט ר ו ל היתה אחד
ה ק ר י ט ר י ו נ י ם המובהקים ל ס י ו ו ג המיקופלסמה בנפרד מ ה ח י י ד ק י ם
).(38
תאי המיקופלסמה מ פ י ק י ם כ ו ל ס ט ר ו ל מהמדיום בצורתו החופשית )(39
בדומה לתאים א נ י מ ל י ם בתרבית .תפקיד הכולסטרול בממברנה נחקר רבות
אך לא י ד ו ע ב ב י ר ו ר .יש ה ס ב ו ר י ם שתפקידו ם ט ר ו ק ט ו ר ל י ,ד ה י י נ ו
בארגון של ה פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם במבנה הדו-טכבתי כך שציר האורך של
השרשרות הפחמתיות נ י צ ב למישור הלמלרי .יתכן ו כ ו ל ס ט ר ו ל דרוש
ל ג י ד ו ל המיקופלםמה משום תלותם המוחלטת באספקת חומצות ש ו מ נ י ו ת
וה-
turn-overה נ מ ו ך של ל י פ י ד י ם פ ו ל ר י י ם שאינו מאפשר ר ג ו ל צ י ה
של נ ו ז ל י ו ת ה א ז ו ר י ם ה ל י פ י ד י ם .א י נ ק ו ר פ ו ר צ י ה בממברנה של כ ו ל ס ט ר ו ל
17
שהופק מהמדיום מאפשרת ק י ו ם ר ג ו ל צ י ה כזאת .תאי ה-
A. laidlawii
ה מ ס ו ג ל י ם לסנתז חומצות ש ו מ נ י ו ת ר ו ו י ו ת א ר ו כ ו ת שרשרת א י נ ם דורשים
כ ו ל ס ט ר ו ל ל ג י ד ו ל ם .יתר על כ ן ,הם מ ס נ ת ז י ם ק ר ו ט נ ו א י ד י ם שבהיותם
מ ו ל ק ו ל ו ת פחמתיות פ ל נ ר י ו ת י כ ו ל י ם להחליף כ ו ל ס ט ר ו ל בתפקיד של
י י צ ו ב מבנה ה.bilayer -
ה.
א ר ג ו ן ה ח ל ב ו נ י ם והשומנים בממברנה
שומני מהווה את המבנה ה י ס ו ד י של ממברנת מיקופלםמה.
bilayer
מסקנה ז ו נ ג ז ר ת מ ה נ ת ו נ י ם ה כ ר ו כ י ם במדידות
x-ray diffraction,
Differential scanning calorimetry, capacitanceו ESR -
של
חומצות ש ו מ נ י ו ת מ ס ו מ נ ו ת .בשיטות ה פ י ם י ק ל י ו ת הראו כי ה ל י פ י ד י ם
בממברנה מתנהגים בדיעבד כמו ל י פ י ד י ם במים ,כלומר מ א ו ר ג נ י ם בצורת
דו-שכבה בה השרשרות הפחמתיות משולבות ז ו ב ז ו ולא ב ח ל ב ו נ י ם .י ח ד
עם זאת יש ל צ י י ן שהמדידות ה פ י ם י ק ל י ו ת דלעיל א י נ ן מ ו צ י א ו ת מכלל
אפשרות נ ו כ ח ו ת א ז ו ר י ם בהם ק י י מ ת אינטראקציה ספציפית ב י ן ל י פ י ד י ם
ל ח ל ב ו נ י ם .אי לכך לא נ י ת ן מהשיטות ה פ י ס י ק ל י ו ת בלבד ל ק ב ו ע בברור
א י ז ה חלק מ ה ל י פ י ד י ם מאורגן בצורת מבנה דו-שכבתי ומה מידת
האינטראקציה של ל י פ י ד י הממברנה עם ה ח ל ב ו נ י ם .
הידע על א ר ג ו ן ה ח ל ב ו נ י ם בממברנה מצומצם .ט י פ ו ל בממברנת
laidlawii־A
המבנה ה-
באצטון מימי המאפשר מ י צ ו י 95%מ ה ל י פ י ד י ם ,שומר על
trilaminar
ה א ו פ י י נ י הנראה ב מ י ק ר ו ס ק ו פ ה א ל ק ט ר ו נ י .
לעומת זאת ,על י ד י הפעלת
פ ר ו נ ז ו ע י כ ו ל כ 80% -מ ה ח ל ב ו נ י ם
הממברנליים י ו ר ד במידה נ י כ ר ת ע ו ב י הממברנה ונעלם המבנה
ה . ( t r i l a m i n a r(24-ה ח ל ב ו נ י ם שאינם מ ע ו כ ל י ם על י ד י פ ר ו נ ז
משולבים לפי הנראה בתוך מבנה ה bilayer -בצורה המונעת חשיפתם גם
125
ל ס י מ ו ן עם I (40
(
,אך הרכבם מבחינת החומצות ה א מ י נ י ו ת א י נ ו
שונה משל שאר ח ל ב ו נ י הממברנה .חלק נ י כ ר מ ה ח ל ב ו נ י ם מ א ו ר ג נ י ם
18
כנראה
על שטח
לאינטראקציה
ו.
מ י ק ו פ ל ס מ ה נמצאה מערכת ט ר נ ס פ ו ר ט ל ס ו ב ר י ם מ ס ו ג
phosphotransferase
p h o s p h o - e n o l p y r u v a t eבדומה
למרות היותם פרמנטטיביים
חסרים מערכת ט ר נ ס פ ו ר ט י ע י ל ה
של
במנגנון
חומצות
הראו
על
ידי
ריאגנטי
תכונות
צבירת
SH
האשלגן
לאורגניזמים
ז.
M. f e r m e n t a n s
התהליך
בפעילות
ומעוכב
דורט אנרגיה
י ו נ י אשלגן
laidlawii
A.
ATPaseבדומה
שלהם.
ויכולת
ביוסינתטית
לליפידים
ח ו מ צ ו ת ש ו מ נ י ו ת א ר ו כ ו ת שרשרת,
ב מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל בהרכב מ א ו ז ן ,
את ר ו ב ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ,
האנזים
בחיידקים.
החומצות
פרוקריוטים.
מוגבלת.
ב-
laidlawii
בצורתן
מ י ק ופלסמה
ע ו ב ד ה ה מ צ ב י ע ה על
A.
נמצאה
גלוטמט-דהידרוגנז
שהינו
החופשית,
ובלווית
דורשים עבור
יכולת
).(44
א נ ז י ם מפתח ב י ן
ו מ ט ב ו ל י ז ם של פ ח מ י מ ו ת מ ע י ד ה ש י ש כ נ ר א ה
מוצא
י כ ו ל ת ל ם י נ ת י ז ה של
ה א ר ו מ ט י ו ת באמצעות מעבר החומצה ה ש י ק י מ י ת
)(45
וחומרי
י ח ד עם כ ו ל ס ט ר ו ל
מ נ ט ר ל על מ נ ת ל מ נ ו ע ל י ז י ם של ה ת א י ם .
החומצות
ו-
,
הדרישה
ביוםינתטית
M. h o m i n i s
ו ב ק ב ו צ ו ת SHח ו פ ש י ו ת נ מ צ א ה ב -
ה ע י ק ר י ת של מ י ק ו פ ל ס מ ה ה י נ ה
גידולם
לגידולם
),(43
ח ו ד ר י ם כ נ ר א ה לתא
) aמ ע ר כ ת פ ע י ל ה בהחדרת
אינה תלויה
לחיידקים
).(42
מ ע ר כ ו ת ה ט ר נ ס פ ו ר ט ה פ ע י ל ו ת בהחדרת
דרישות
יש לספק
חנקן
ואלה
תזונתיות
לסינתיזה
חומר
לסוברים,
מצטברות במאגר התוך ת א י ,
באנרגיה
יוני
ב-
ודורשים סוכר
א ו פ י י נ י ו ת למערכות טרנספורט דומות
.(34
התלויה
).(b34
ד י פ ו ז י ה מוחשת.
א מ י נ י ו ת שנמצאו
האמיניות
).(41
טרנספורט
מיני
אכולפלםמה,
ב צ ו ר ה המאפשרת ג ם ח ט י פ ת
עם א נ ט י ם ר ו ם ס פ צ י פ י
מנגנוני
בכמה
פני
הממברנה,
הגליקוליפידים
מציאת
מ ט ב ו ל י ז ם של
ביכולת האורגניזם
19
דרישת A. laidlawii
לםנתז חומצות א מ י נ י ו ת נ ו ס פ ו ת מחומצות ק ט ו .
ל פ ר ק ו ר ס ו ר י ם של חומצות נ ו ק ל י א י ו ת ) (46מראה על העדר המעבר שביו
החומצה ה א ו ר ו ט י ת ל פ י ר י מ י ד י ן ,ו כ ן על העדר ה א נ ז י ם ת י מ י ד י ל ט ם י נ ת ט ז .
לעומת זאת י כ ו ל י ם התאים לנצל א ו ר י ד י ן ולהפכו ל נ ג ז ר ת ה מ ו נ ו פ ו ם פ ט .
ה ו ד ו ת ל פ ע י ל ו ת ה נ ו ק ל י א ו ל י ט י ת הקשורה לממברנר (47) .י כ ו ל י ם
ו DNA -כמקור ל פ ר ק ו ר ם ו ר י ם
המיקופלסמה לנצל באופן ישיר RNA
ל ם י נ ת י ז ה של חומצות ג ר ע י ן .
ח.
מ נ ג נ ו ן מעבר ה א ל ק ט ר ו נ י ם
ב ר ו ב מ י נ י המיקופלםמה מסתיימת מערכת מעבר האלקטרונים ב פ ל ב י ן ,
לא נמצאו צ י ט ו כ ר ו מ י ם וקטלז
) .(25הצטברות
^ H^Qנמצאה כמעט בכל
התרביות של מיקופלסמה .נ ו כ ח ו ת פ ל ב י ן בממברנות
הוכחה באןפן ספקטרוסקןפי
האלקטרונים ב -
) .(24נ י ת ן לתאר באופן סכימטי את מעבר
:A. laidlawii
•<
^0
A. laidlawii
y Flavoprotein
פ ע י ל ו ת NADH Oxidase
NAD־<
AH
2
נמצאה קשורה לפרקציה הממברנלית של
laidlawii״ , Aאך לעומת זאת פ ע י ל ו ת דומה נמצאה בציטופלסמה של
מיקופלסמה אחרים ) .(26עובדה ז ו מראה שתהליכי מעבר האלקטרונים
א י נ ם בהכרח קשורים למבנה הממברנה .פ ר י צ י א נ י ד ,ד י כ ל ו ר ו פ נ ו ל -
אינדופנול
ו מ נ ד י א ו ן י כ ו ל י ם להחליף חמצן כאקםפטורים ל א ל ק ט ר ו נ י ם .
פ ע י ל ו ת א נ ז י ם זה י ו ר ד ת עם הריסת התא עקב חשיפת ק ב ו צ ו ת SHל ח י מ צ ו ן ,
ו נ י ת ן להשיבה במידה מ ם ו י י מ ת על י ד י ח י ז ו ר עם מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל .מ י צ ו י
ממברנת
A. laidlawii
א ו ק ס י ד ז שעובר
הראו Jinks
עם SDS
ו-
exclusionבG(200-27-
Sodium deoxycholateמשחרר
. ( S e p h a d e xלאחרונה
ו ( M a t z(48-כי על י ד י מ י צ ו י א ת נ ו ל י ) (9%נ י ת ן
להפריד מהממברנה
, NADH dehydrogenaseבעל פ ע י ל ו ת ספציפית גבוהה
20
פי 3-5מ ז ו של ה א נ ז י ם הממברנלי .א נ ז י ם ז ה א י ג ד את הכושר להשתמש
בחמצן כבאקםפטור ולכן ה ו ג ד ר כ ד ה י ד ר ו ג נ ז .ה מ י צ ו י הכיל פ ל ב י נ י ם
מםוג FAD
ו FMN -ו כ ן 30-40%ל י פ י ד י ם .התכולה הגבוהה של ל י פ י ד י ם
גרמה לאי שקיעת ה א נ ז י ם החלקיקי ב -
100,000
g
x
.מהתכונות הקיגטיות
נראה כ א י ל ו יש שני אתרים לפחות ל ח י ז ו ר פ ר י צ י א נ י ד וחמצן ,בעלי
רגישות שונה ל . NADH -ה י ו ת ו A. laidlawii -הם אנאארובים
פ ק ו ל ט ט י ב י י ם ,יש י ת ר ו ן ל מ נ ג נ ו ן נשימה מ ס ו ג זה המאפשר ,בהתאם
לתנאים,
נ י צ ו ל נ מ ו ך י ו ת ר של חמצן ומאידך ח י ז ו ר י ע י ל על רמה
םובסטרט .חוסר הרגישות ל א ו ל י ג ו מ י צ י ן מצביע על כך שמערכת הנשימה
א י נ ה צמודה ,או צמודה באופן ר ו פ ף ,למערכת יצירת ה א נ ר ג י ה .
21
.2
מטרות העבודה
ה מ ט ר ו ת ש ה צ ב נ ו ל ע צ מ נ ו ב ע ב ו ד ה ז ו ,מ ת ו ך מחשבה ל ה ב ה י ר א ת ה ת כ ו נ ו ת
ה מ י ו ח ד ו ת של ח ל ב ו נ י ם ב ע ל י פ ע י ל ו ת ב י ו ל ו ג י ת ס פ צ י פ י ת ה מ ה ו ו י ם חלק
א י נ ט ג ר ט י ב י של מ ב נ ה ק ר ו ם התא ,ה ו :
א.
איפיוו
מיקופלסמה
כיצד
פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת ה ק ש ו ר ו ת ל מ מ ב ר נ ה ה פ ל ס מ ט י ת של
ו ב ד י ק ת השפעת ה ס ב י ב ה ה מ ק ו מ י ת על ה פ ע י ל ו ת ה ק ט ל י ט י ת .
ש י נ ו י י ם ב מ ב נ ה ה מ מ ב ר נ ה כ מ ו חשיפה ל ס ב י ב ה
יונית
דהיינו,
ש ו נ ה ,הוצאה
ס ל ק ט י ב י ת של ח ל ב ו נ י ם א ו ל י פ י ד י ם ,מ ת ב ט א י ם ב פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת .
ב.
ק ב י ע ת מ י ק ו ם ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת ב י ח ס לשטח פ נ י ה מ מ ב ר נ ה על י ד י
ב ד י ק ה של ה פ ע י ל ו ת ל ג ב י ם ו ב ם ט ר ט י ם ש א י נ ם ח ו ד ר י ם לתא ו ע ל י ד י ר י א ג נ ט י ם
ספציפיים.
22
חלק
נםיוני
3.1
מיקופלסמה -תנאי ג י ד ו ל ו ה כ נ ת התאים ל נ י ס ו י
Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma fermentansנתקבלו ממעבדת
פ ר ו פ ׳ שמואל ר ז י ו ,המח׳
ירושלים.
ל מ י ק ר ו ב י ו ל ו ג י ה ק ל י נ י ת ,ה א ו נ י ב ר ס י ט ה העברית,
ה מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז מ י ם ג ו ד ל ו במצע ( E d w a r d(49שהכיל )(v/v
םרום
( ו כ ו פ נ י צ י ל י וG(300
0
.
י ח י ד ו ת ל מ י י ל ( pH,ב־8
9
התאים נאספו לקראת ס ו ף הפאזה ה ל ו ג ר י ת מ י ת ,כ ש ר י כ ו ז ם ה ג י ע ל 2x10 -במייל,
אחר א י נ ק ו ב צ י ה של כ -
6
-
1
בC37°
שעות
ללא ט י ל ט ו ל .א י ס ו ף התאים בוצע
משך 15דקות ב . C4° -התאים
על י ד י ס י ר כ ו ז ב xg ,Sorvall14,000-
נשטפו ו ה ו ר ח פ ו בתמיסת מלח א י ז ו ט ו נ י ת )25 M NaCl־MMgCl0 01;0
בתמיסת ם ו כ ר ו ז
) ם ו כ ר ו ז ־MMgCl01;04M
2
ב 1 -מייל .ספירת התאים נעשתה ב -
(
2
( או
10
0־ ל ר י כ ו ז של כ x10 2 -ת א י ם
, Cameraת ו ך שימוש ב מ י ק ר ו ס ק ו פ
נ י ג ו ד ה פ א ז ו ת .ח ל ב ו ן בתרחיף התאים נקבע בשיטת. ( L o w r y(50
3.2
קביעת ה פ ע י ל ו ת האמידטית של מיקופלסמה
פ ע י ל ו ת תאים שלמים בפרוק של 8־ נ פ ת י ל א מ י ד י ם ) (gNAשל ח ו מ צ ו ת
אמיניות שונות
6־נפתילאמין
) (Mann Research lab. N.Y.נקבעה בשיטה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת .
המעוררבnm-335
מגלה פליטה חזקה ב . ( n m(41051-ל ע ו מ ת
זאת - 6 ,נ פ ת י ל א מ י ד של חומצה א מ י נ י ת ,הםובםטרט במקרה ד נ ן ,ה מ ע ו ר ר
באורך
גל זה מגלה פליטה נמוכה ב י ו ת ר .ערכי הפליטה של ש ־ נ פ ת י ל א מ י ן מ ר א י ם ת ל ו ת
-7
5-
ל י נ א ר י ת ב ר י כ ו ז ו בתחום של M
בםפקטרופלואורימטר
,Amino-Keissתוצרת
ב מ נ ו ר ת ק ם נ ו ן (w)150
,Paris) Graphispot
5x10עד M
ו־
5x10״ המדידות בוצעו
American Instrumentsמ צ ו י י ר
phototube21RCA IPהמחובר לרשם זמן
«(Sephramתערובת הריאקציה הסטנדרטית ) נ פ ח ס ו פ י
1מייל( הכילה 2.8 -מ י ק ר ו מ ו ל י ם - 6נ פ ת י ל א מ י ד של חומצה א מ י נ י ת מ ם ו י י מ ת ,
50מ י ק ר ו מ ו ל י ם ב ו פ ר ו ר ו נ ל ב ,8.pH,5 -ו 0.5-מייל תרחיף מיקופלסמה בתמיסת
לכ-
10
0.5x10 -
מ״ג ח ל ב ו ן או
10
10 lx0.3-0.6
תאים(.
23
תערובת הריאקציה הושמה בתא שהטמפרטורה בו מווסתת ל -
25
C
על י ד י זרם
מ י ם מטרמוסטט ח י צ ו נ י .תאי ה ק ו ו ר ץ ה י ו מ ס ו ג (Hellma, W. Germany) PS
עם דרך א ו ר של 10.20mm״
ה פ ע י ל ו ת האמידטית הספציפית מבוטאת ככמות ) (n molesטל - 3נ פ ת י ל א מ י ן
המשתחררת בדקה למ״ג אחד של ח ל ב ו ן התא .קצב ה ה י ד ר ו ל י ז ה חושב מן המהירות
ההתחלתית.
3.3ם י נ ת י ז ה של םובסטרטים פ פ ט י ד י י ם
הפפטידים
2
L-Ala־L-Lys; L-Ala-L-Lys; L-Lys-L-Ala; L-His־;L-lys
)L-Phe-L-Ala; AcGly-L-Phe-L-Ala; L-Ala-(Gly־; Gly
L-Phe-L-Ala־ )L-(Ala
2
לביופיםיקה.
ה ו כ נ ו .על י ד י מר ישראל י ע ק ו ב ס ו ן ,המחלקה
הפפטידים של א ו ר נ י ט י ן
ן ל י ז י ן נתקבלו מדייר יהודה ל ו י ן ,
המחלקה ל ב י ו פ י ם י ק ה .כל ה פ פ ט י ד י ם ה י ו נ ק י י ם ל פ י בדיקה כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ת ).(52
א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם של א ל נ י ן ה ו כ נ ו בשתי שיטות כדלקמן:
א.
א ו ל י ג ן פ פ ט י ד י ם של א ל נ י ן ב ק ו נ פ י ג ו ר צ י ה ) (Lה מ צ ו י י נ י ם ^ ) ( A l a
n
כאשר , n = 2;3;5;6ה ו כ נ ו על י ד י ק ו נ ד נ ם צ י ה של ב נ ז י ל א ו ק ם י ק ר ב ו נ י ל
- ! .א ל נ י ן עם ק ־ נ י ט ר ו ב נ ז י ל א ס ט ר של החומצה ה א מ י נ י ת או הפפטיד המתאים,
ל פ י שכטר ו ב ר ג ר ) .(53א נ ה י ד ר י ד מעורב ה ו כ ן על י ד י הוספת א ק ו י ו ל נ ט
אחד של טריאתילאמין לתמיסת 10%של ב נ ז י ל א ו ק ס י ק ר ב ו נ י ל )-(1.אלנין
ב D M F -ק ר ו ר ל
,
,-C8° -הוספת א ק ו י ו ל נ ט אחד של א י ז ו ב ו ט י ל כ ל ו ר ו פ ו ר מ ט
ו ק ר ו ר נ ו ס ף משך 20ד ק ו ת .תמיסת האסטר ה ו כ נ ה על י ד י נ י ט ר ו ל תמיסת
) 10%ב (DMF -טל ה -ק -נ י ט ר ו ב נ ז י ל אסטר ה י ד ר ו ב ר ו מ י ד עם א ק ו י ו ל נ ט
אחד של ט ר י א ת י ל א מ י ן .כ מ ו י ו ת א ק ו י מ ו ל ר י ו ת של שתי התמיסות ע ו ר ב ב ו
והושארו משך ל י ל ה בטמפרטורת החדר .ה ב נ ז י ל א ו ק ס י ק ר ב ו נ י ל פפטיד אסטר
המתקבל הושקע מתערובת הריאקציה על י ד י הוספת
נ פ ח י ם של
M0.0510
. .1HCהמטקע נשטף במים עד נ י ט ר ל י ו ת ויובש ב ו א ק ו ם על חומצה ג פ ר י ת נ י ת
24
הפפטיד אסטר החפשי התקבל על ידי הורדת קבוצת הבנזילאוקסיקרבוניל
עם חומצה הידרוברומית בחומצת חומץ .הפפטיד התופשי התקבל על ידי
חיזור של תמיסת פפטיד אםטר הידרוברומיד בחומצת חומץ עם פלדיום על
פוום .הפפטיד החופשי השקע מהתמיסה המימית )אחרי ניטרול( עם אתנול
ואצטוו .הפפטידים שהתקבלו היו מסיסים במים ונקיים לפי קריטריונים
של אלקטרופוריזה במתח גבוה ב4 -״ pHlאו כרומטוגרפיה בשכבה דקה על
פלטות צלולוז ) (Riedel-DeHaen , AG.עם מערכת הממיטים ח-בוטנול
) :(4חומצת חומץ ) :(1מים ) . v/v/v :(1אורך הפפטיד חושב מהיחס
שביו חנקו קבוצות האמינו שנקבע לפי , ( V a n Slyke(54לחנקן כללי
שנקבע בשיטת מיקרו . ( K j e l d a h l(55היחס שהתקבל באנליזות היה שווה
ליחס המצופה באופו תיאורטי.
ב .אלניל אוליגופפטידים מורכבים משיירים בעלי קונפיגורציה )(L
ו (D) -ברצף מסודר ) L(LDכאשר = 2;4;8ח ,הוכנו על ידי צימוד
n
^הידרוקסיסוקצינאימיד אםטר של בנזילאוקסיקרבוניל .ו־אלניו עם
ם־אלניו או עם פפטידים מסוג
a(D)] 1A־a(L)A1
n
[)56.ריאקציתהצימוד
(
נעשתה על ידי הוספת שני אקויולנטים של א-הידרוקסיםוקצינאימיד אסטר
של בנזילאוקםיקרבוניל -!.אלניו בדיאוקםו ,לתמיסה מימית שהכילה
אקויולנט אחד של הפפטיד ואקויולנט אחד של ביקרבונט .הריאקציה נמשכה
כשעתיים בטמפרטורת החדר הפפטיד הושקע על ידי הוספת מים ,החמצה
ו
ק
ר
ו
ר
2
.הפפטידים גובשו
מ ח ד ש
חם .אורך הפפטידים חושב באותה דרך כמצוייו בסעיף הקודם.
מאזילאצטט
ה פ פ ט י ד ל ם
עד לאורך של תשעה שיירי אלניו היו מסיסים במים בריכוז של . 5CmM
3.4קביעת פעילות מיקופלסמה בהידרוליזה של פפטידים )(peptidase
הידרוליזה של די-ואוליגופפטידים אשר הוכנו כמתואר בפרק ,3.3בוצעה
בתמיסת מלחים איזוטונית שהרכבה כדלקמו :בופר ורונל ;10mM MgClp ;50mM
25
, m M NaCl250
בכמות מתאימה ל כ -
א י נ ק ו ב צ י ה מעיר
2
0
.
דקות
בpH3 -״ , 8נפח ם ו פ י 0.5מ י י ל ת ע ר ו ב ת הריאקציה הכילה.
0
ב
מ״ג חלבון
3
פ פ ט י ד .לאחר
וmM50
C37° -ה ו פ ר ד ו התאים על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה
ו ת כ ו ל ת התסנין נבדקה בשתי שיטות:
א( ז י ה ו י א י כ ו ת י -כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה על משטח דק של ס י ל י ק ו ן
)W. Germany
טים:
ח -ב ו ט נ ו ל :ח ו מ צ ת חומץ:מים
אמיניות
»(Riedel-DeHaen,ההפרדה נעשתה על י ד י מערכת
. ( v / v / v ,חומצות
) 4 : 1 : 1
ו פ פ ט י ד י ם ח ו פ ש י י ם בקצה ה־ א -ט ר מ י נ ל י ז ו ה ו על י ד י ר י א ג נ ט
נינהידרין
) , w/v ,0.5%ב 95% -אצטון המכיל 0.3%פ י ר י ד י ן .(v/v
ב( קביעה כ מ ו ת י ת -הפרדת א ל נ י ן מ א ו ל י ג ו א ל נ י ן פ פ ט י ד י ם נעשתה
באמצעות . ( A m i n o Acid Analyser(57השתמשנו בעמודה הסטנדרטית
ה
דה
י
ו
ם ציטרט ב ס ו ד י ו ם כ ל ו ר י ד
x
w
e
o
:ם ו ד י ו ם ציטרט M2־0
D
,
״
ל) 5 , 2 5 p H -
M102
יוליאנה ק ו נ ו ( .
א נ ל י ז ו ת א ל ו נעשו ב ס י ו ע ה האדיב של ה ג ב '
3.5מדידת ח ד י ר ו ת מיקופלםמה ל L-Alanine -
10
10
תרחיף מיקופלסמה)2x10 -31,מייל
M
ב(Veronal
ל תמיסת חומר
3
M
m
ר
( ,אינולין
)
3
0 xl
0
ד
M־ ( 3 . 8
י
תאים( בתמיסת מלחים
5
ו
א
ק
א
ט
י
ו במצע ג י ד ו ל
ב
י
x l 0א ו דקסטרן
1
0
:אלנין
3
) M־-37°CxlO1.7ב(,
ד ו ג מ א ו ת של 0.2מייל נלקחו מתערובת הריאקציה ב ז מ נ י ם מ ם ו י י מ י ם לבדיקת
הרדיואקטיביות.
התאים ה ו פ ר ד ו מן התערובת בשיטת ההרחפה ה ד י פ ר נ צ י א ל י ת
) (58כדלקמן :הדוגמא שנפחה 0.2מייל הושמה במבנת פ ו ל י א ת י ל ן
מייל( שהכילה
5
0
.
0
)
מייל שמן
xg , Eppendorf microfuge 10,000
)תכולה
צ פ י פ ו ת >,(l g/ml066צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה נעשתה
־
משך 2.5-3ד ק ו ת .ב ת נ א י ם אלה
עברו 80%מהתאים את שכבת השמן .ח י ת ו ר המבחנה ק ר ו ב ככל האפשר למשקע
.
26
התאים ,איפשר את הפרדתו מבלי לבוא במגע עם ה ת ם נ י ן .המשקע הורחף
ב י ס ו ד י ו ת ב 0.1 -מייל מ י ם .לדוגמא של 50מ י ק ר ו ל י ט ר מתרחיף זה ה ו ס פ ו
Bray
10
) ו ה ד ד י ו א ק ט י ב י ו ת נקבעה במכשיר
)59
.Packard Tri-Carb Liquid Scintillation Spectrometerחדירת א ל נ י ך
לתאים באופן יחסי ל א י נ ו ל י ן או לדקםטרן נקבעה בתרחיף המכיל את שני
החומרים י ח ד ,אך מ ס ו מ נ י ם באופן שונה -האחד ב ( : -
14
3
והשני ב . H -
ח ד י ר ו ת החומר הגבה מ ו ל ק ו ל ר י ל pellet -התאים משמשת למדידת נפח המים
הקביעה היחסית מאפשרת להבדיל ב י ן ח ד י ר ו ת חומר נמוך מ ו ל ק ו ל ר י
הבין-תאי.
לתוך התא לעומת המצאותו בנפח ה ב י ן -ת א י שב .pellet -בתוצאות הספירות
של נ ם י ו נ ו ת הסימון הכפול נעשו ת י ק ו נ י ם עבור מעבר הקרינה מערוץ C
ל-
3
Hולהיפך
1 4
.
חומרים ר ד י ו א ק ט י ב י י ם :
14
( C ) Dextran; (Spec. Act. 0.46 yCi/mg),
14
משקל מ ו ל ק ו ל ר י L - ( C ) Alanine; (Spec. Act. 14.2 mCi/mmole) ,28,700
3
), L-( H) Alanine ; (Spec. Act. 167 mCi/mmole
נרכשו
מInulin; . Radiochemical Center, Amersham, England -
3
)(^C
3
)(Spec. Act. 6.6 Ci/mole) ,( H)Inulin (Spec. Act. 250yCi/ml,1.15xl0" M
.נרכשו מ New England Nuclear , U.S.A -־
השמנים מהם ה ו כ נ ו התערובות בעלות צ פ י פ ו י ו ת ש ו נ ו ת :
Octoil-S (Rochester Div. Consolitated Electridynamics Corp.
Rochester, N.Y.) , di-N-Butyl Phthalate (Eastman Kodak Co.
Rochester N.Y.) .
A. laidlawii
3.6
משקע ) (pelletתאים שהתקבל על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה של תרחיף תאים
0
3.1
0
0
,
7
Sorvall -
) Cה ו ר ח ף ב מ ד י ו ם ג י ד ו ל טרי 4°),
27
1
ב
18
C
,2H)1mMK
R
MNaCl135,mM
(-0.ב94°מועשרת־
m
ה פ ר ד ת ה ת א י ם מ ת ע ר ו ב ת ז ו נעשתה בשיטת ההרחפה ה ד י פ ר נ צ י א ל י ת
י
צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה משך 2 . 5ד ק ו ת ב -
בת השמן
ו
xg
10,000
)סעיף , ( 3 . 5
״ ח ת ו ך ה מ ב ח נ ו ת נעשה
( g / c cה מ פ ר י ד ה ב י ן המשקע ל נ ו ז ל ה ע ל י ו ן .משקע
) 1 . 0 6 6
ה ת א י ם ה ו ר ח ף ב 0 . 1 0 -מייל .H 0ד ו ג מ א של 40מ י ק ר ו ל י ט ר מ ת ר ח י ף ז ה נ ל ק ח ה
2
Q
' I1 f f..
לקביעת היחס ה א י ז ו ט ו פ י 0 / 0
לקביעת היחס ה א י ז ו ט ו פ י 0
ל א י ז ו ט ו פ י ם של מ כ ו ן
0/
ויצמן
נ פ ח ה מ י ם של ה -
ן
ב מ כ ש י ר Mass Spectrometer
למדע.
,Pellet
)מייל( ,v
בעזרת
חושב מ ה ע ר ך ה נ מ ד ד 0 / 0
0
של ה ת ע ר ו ב ת ה מ ק ו ר י ת
המשוואה
) ב י ח י ד ה )60
8
(
1
/
R
של
(
RV
׳R
RV + 0.1
כאשר 0 . 1מייל ה ו א נ פ ח ה מ י ם ה מ ו ס ף ל -
,,Pellet
מ ס פ ר ה ת א י ם ב ת ע ר ו ב ת ה א י נ ק ו ב צ י ה נ ק ב ע :א ( בתא ס פ י ר ה
ניגוד-הפאזות ;
מתמדת משך ש ב ו ע .
ב(
במיקרוסקופ
בלחות
ס פ י ר ת מ ו ש ב ו ת ש ג ו ד ל ו ע ל פ ל ט ו ת א ג רבC-37°
ע ר כ י ם ד ו מ י ם ה ת ק ב ל ו בשתי ה ש י ט ו ת .
נ פ ח המים הקשור בתא א ח ד ב -
Pelletחושב מ ה ע ר כ י ם ש נ ק ב ע ו
ונמצא
3
וח^ . 0.24±0.02ת ו צ א ה ז ו ה י א מ מ ו צ ע של א ר ב ע ה
העיקרית
נ ו ב ע ת משיטות ספירת התאים.
נ פ ח ה א י נ ו ל י ן של ה -
כדלהלן:
והמכיל
תמיסה
5
נסיונות שונים.
השגיאה
, Pellet
ה מ ו ד ד את ה מ י ם ה ח ו ץ -ת א י י ם ,
לתרחיף תאים ב מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל המהול ביחס
x
מ י מ י ת של
inulin
10
ת א י םב 15110הוספו,
14
) ,pH7.6) ( c
ד ו ג מ א של 0.2מייל נ ל ק ח ה מ ת ע ר ו ב ת ז ו
)
1
:
נקבע
v/v)1עם
מייל
מיקרוליטר
.(174mg/ml,Spec. Act. 180yCi/ml
והתאים הושקעו על י ד י
צנטריפוגציה
28
בשיטת ההרחפה ה ד י פ ר נ צ י א ל י ת כמתואר ל ע י ל .ה-
Pelletוזורווף ב 0.1 -מייל
^ 0והדדי ו א ק ט י ב י ו ת נקבעה בדוגמא של 20מ י ק ר ו ל י ט ר עם תמיסת Bray
) 10מייל( .נקבעה גם ה ר ד י ו א ק ט י ב י ו ת בדוגמא של 10מ י ק ר ו ל י ט ר מתרחיף
התאים ה מ ק ו ר י .נפח ה א י נ ו ל י ן חושב מערכי הספירה ,בהנחה שריכוז ה א י נ ו ל י ן
Pellet
במים החוץ-תאיים שב-
זהה ל ר י כ ו ז ו בתערובת ה א י נ ק ו ב צ י ה .נפח
3
ה א י נ ו ל י ן לתא ב -
Pelletנמצא
לתקן את נפח המים לתא
3.7
.0 14pmקביעה ז ו נתנה את האפשרות
־
3
A. laidlawiiשהינו ל פ י כ ך
10±0ym02־״» 0
הכנת תכשיר ק ר ו מ י של מיקופלסמה
בהכנת
תכשיר קרומי
יש לבחור בשיטות ע ד י נ ו ת אשר במידה פחותה
כ כ ל האפשר תפגענה ב א ר ג ו ן הספציפי של ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם .דטרגנטים
או ממיסים משנים את מבנה הממברנה על י ד י מ י צ ו י סלקטיבי של מ ר כ י ב י ה .
ג ל י ם א ו ל ט ר ה -ם ו נ י י ם שוברים את הממברנה ל פ ר ג מ נ ט י ם ק ט נ י ם ה נ ו ט י ם לעבור
ר י א ג ר ג צ י ה בלתי ס פ צ י פ י ת .השיטה העדינה ב י ו ת ר היא ל י ז י ם א ו ם מ ו ט י ;
על י ד י חשיפת התאים לתנאים ה י פ ו ט ו נ י י ם משתחרר ת ו כ נ ם והממברנה מתקבלת
בצורת ghostהנראה ב א ל ק ט ר ו ן -מ י ק ר ו ס ק ו פ ו כ ן ב ־ Freeze -Etchingכמבנ
הדומה לממברנת התא השלם.
M. Fermentans
עמיד י ח ס י ת ב פ נ י שוק א ו ס מ ו ט י ) ,(20לכן ה י ה
צורך להשתמש בשיטה דרסטית על מ נ ת לקבל פרפרט מ מ ב ר נ ל י .ם ו נ י ק צ י ה של
ה במכשיר
3 B r a n s o nדקות ,ל ס י ר ו ג י ן תוך קרור ל -
משך
הפרקציה הבלתי מסיטה נעשתה על י ד י צ ב ט ר י פ ו ג צ י ה ) 4 0 , 0 0 0
C0°״
xg
Sorvall,30ד ק ו ת ( ־ פ ע י ל ו ת ה י ד ר ו ל י ט י ת נבדקה ב ת ס נ י ן הראשון ו כ ן במשקע
2
:
M e r c a p t o e t h a n o l־ 5 0
mM NaCl150
MB10;mMTris
מובא ל -4״ 7pHעם
A. laidlawii
m
;
־HCl
לעומת זאת ,רגיש ל ת נ א י ם ה י פ ו ט ו נ י י ם .הרחפת התאים
בבופר & מהול 1:20עם מ י ם מ ז ו ק ק י ם ו א י נ ק ו ב צ י הבC-37°
משך 30דקות
29
תוצאתה
נ י ת ן לעקוב אחר הירידה ב צ פ י פ ו ת האופטית
ל י ז י ם טל ר ו ב התאים.
של ה ת ר ח י ף ב -ת1וו 500ו ב מ ק ב י ל א ח ר העל י ה ב ב ל י ע ה טל ה ת ם נ י ן ב -וזזוו260
.ת א י ם שלא נ ש ב ר ו ה ו פ ר ד ו ע ל י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ב ־
9,000
xg
40,000
התםניו עבר צנטריפוגציה ב -
xg
משך
משך 30ד ק ו ת ל א י ס ו ף
פ ר פ ר ט ה מ מ ב ר נ ו ת נשטף 4-5פ ע מ י ם ) ע ד ש ת ם נ י ו השטיפה חסר
הממברנות.
ב ל י ע ה ב nm260-א ו (280nm
8והורחף
.פ ר פ ר ט ה מ מ ב ר נ ו ת נשמר
בבופר
ב -20°C -־
3 . 8קביעת פוספט א י א ו ר ג נ י
בשיטה של( E i b l(61
ואורגני
ל ק ב ו ע א ת ה ק ו מ פ ל ק ס פ ו ם פ ו מ ו ל י ב ד ט עם
ניתו
Triton x-100ב מ ק ו ם ח מ ר י ם מ ח ז ר י ם .
30-90
פ ט ב ת ח ו ם של
ה ע כ י ר ו ת המתקבלת פ ר ו פ ו ר צ י ו נ י ת
. n m o l eב ה ק ט נ ת ה נ פ ח ה ס ו פ י של ת ע ר ו ב ת
1
י א ק צ י ה אפשר ל ה ג ד י ל את ה ר ג י ש ו ת עד ל ק ב י ע ה של
פ ו ס פ ט .שחרור
nmole
ה פ ו ם פ ט מ ח ו מ ר א ו ר ג נ י נעשה ע ל י ד י ש ר י פ ה ב נ ו כ ח ו ת ח ו מ צ ה ג פ ר י ת נ י ת
) 3 0 %
,
H
2
0
2
ו ח מ ו ם נ ו ס ף משך 15ד ק ׳
(
ב ) 300°C -ע ו ד ף ה פ ר ה י ד ר ו ל נ ה ר ס ( .לאחר ק ר ו ר מ ו ה ל י ם א ת ה ד ג י מ ה ב מ י ם
ו ק ו ב ע י ם א ת ה פ ו ס פ ט שהשתחרר,
3.9
ק ב י ע ת פ ע י ל ו ת NADHא ו ק ס י ד ז
הפעילות
ירידה
כ נ ג ד עקומת כ י ו ל עם נתרו פ ו ס פ ט .
בבליעה ב -
הקשור ל מ מ ב ר נ ה של
נ ב ד ק ה בשיטה ם פ ק ט ר ו ם ק ו פ י ת )(26
nm
340
A. laidlawii
ו ה י א מעקב א ח ר מ ה ל ך
עם ה ו ס פ ת NADHל ת כ ש י ר ה נ ב ד ק .ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה
) מ י י ל ( 3ה כ י ל ה 0.05 :עד 1מ ״ ג ח ל ב ו ו של התכשיר ה ק ר ו מ י ;;mMNaCl25
0.5
- 2 m Mהתחלת; pH
mercaptoethanol
NADH
i
־
-4
ז
ס ו פ י של
הפעילות
(
)
r
e
g
n
r
h
e
o
B
M10x־
ה א נ ז י מ ט י ת מ ב ו ט א ת כ י ר י ד ה ב ב ל י ע ה ) (AODבדקה ל מ ״ ג ח ל ב ו ו ק ר ו מ י .
30
זיהוי
3.10
חלבונים
ב ת כ ש י ר ק ר ו מ י של
על-ידי
A. laidlawii
(SDS-PAGE) SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
אלקטרופוריזה
בוצעה ב ג י ל י ם טל
Acrylamide
N,N-Methylenebisacrylamideב י ח ס )37:1 (62
טל
)
w
/
w
( ) ל פ י ההגדרה
Hjerten)63( )02.6%; T=22.8%ה ר י כ ו ז של א ק ר י ל א מ י ד ב ת ע ר ו ב ת
0
ה פ ו ל י מ ר י ז צ י ה ה י ה . 7.5%
ה פ ו ל י מ ר י ז צ י ה נעשתה ע ם א מ ו נ י ו ם פ ר ם ו ל פ ט
) w/v)0 . 0 7 5 %מ י מ י .ת ע ר ו ב ת ה א ק ל י ל א מ י ד ו ב ו פ ר ההרצה ה כ י ל ו נ ת ר ן
ב 2 -־pH 7
M
1%
ו-
M 2-Mercaptoethanol
יות
, x 0 . 5
פרספקס ב ג ו ד ל
S D S־ 0־ ב ו פ ר ההרצה ה כ י ל ג ם
.ההרצה ב ו צ ע ה ב מ כ ש י ר ת ו צ ר ת " י ד ע " .
ם ״ מ 6ה ה ר צ ה בכוון
ה י ה בדרך כ ל ל כ 3 -טעות ,בזרם טל
פוספט
6-8
mA
הגלים
ה א נ ו ד ה .מ ט ך ההרצה
ל ג ל ,ב ט מ פ ר ט ו ר ת ה ח ד ר .כל
ה ר י א ג נ ט י ם ה י ו מ ת ו צ ר ת ,BDHכ ד ר ג ת ה נ ק י ו ו ה ג ב ו ה ה ב י ו ת ר .
דוגמאות תכטיר קרומי עברו דנטורציה ל פ נ י
ט ה כ י ל ) נ פ ח ס ו פ י 33מייל(1 :נתרן פ ו ס פ ט ח ד ב ס י ס י
האלקטרופוריזה בבופר
(M1מייל(; נ ת ר ן
פ ו ס פ ט ד ו ב ס י ס י M5»0 (10מייל(; SDS10% (0.33מ י י ל ( ;
ג ל י צ ר ו ל ) 3.3מייל(;
5%
מ י ם מ ז ו ק ק י ם להטלמת ה נ פ ח .
צביעה
ט ל 0.25%
ם ,משך
ב-
2
1שעות ב ת מ י ס ת
ה ד נ ט ו ר צ י ה נעטתה ב -
לזיהוי
) 5 : 1 : 5
-
Blue
B r o m o p h e n o l״ 1.3) 0מייל(;
3 C 1 0 0 °
ח ל ב ו נ י ם נעטתה עם )(R 250
,
Mercaptoethanol
( v / v / v
משך
דקות.
Ccomassie B r i l l i a n t
מ ת נ ו ל :ח ו מ צ ת חומץ:
שעות ב . C 4 5 °מ י צ ו י ע ו ד ף הצבע נעשה ע ל י ד י ה ש ר י י ת ה ג ל י ם
) 5 : 1 : 5
( v / v / v ,מ ת נ ו ל :ח ו מ צ ת חומץ:מים ולאחר
5מתנול .
מ כ ן ה ו ע ב ר ו ל ת מ י ס ה מ י מ י ת ה מ כ י ל ה 7.5%ח ו מ צ ת ח ו מ ץ ו % -
31
תוצאות
4.1
ודיון
פעילות אמידטית של מיקופלםמה
ההידרוליזה של -3נפתילאמידים של חומצות אמיניות שונות על ידי
תאים שלמים נקבעה בשיטה הפלואורימטרית המתוארת בפרק . 3.2מהירות
ההידרוליזה חושבה מו הדקות הראשונות של הריאקציה כאשר הםובםטרט מצוי
בעודף ניכר וקצב ההידרוליזה מראה תלות לינארית בזמו .הפעילות
ההידרוליטית נבדקה בריכוזי םובסטרט שונים ותלות הקצב ההתחלתי של
הריאקציה v/1ב s/1 -הוצגה לפי
ה-
)(apparent
. Lineweaver-Burkמתלות זו חושב
.הפעילות הספציפית מבוטאת על ידי כמות התוצר
-nmolesנפתילאמין( המשתחררת לדקה על ידי כמות תאים האקויולנטית
6
למ״ג חלבון .כיול הפליטה של תוצר ההידרוליזה נעשה עם ש־נפתילאמין
מסחרי ) , F l u k a
(
M־- 5xlO
M־
שגובש מאתנול .מידת הפליטה בnm410-של ש-נפתילאמין
ה
5
4.1.1
ח
ו
ר
מ
m
n
,בתחום של
6
־lxlO
הפעילות האמידטית של
Mycoplasma fermentans
תוצאות בדיקת הפעילות האמידטית של
M.fermentansלגבי
^-נפתילאמידים של חומצות אמיניות שונות מוצגות בטבלה . 1
נמצא כי תאי
M. fermentansמסוגלים לפרק את הקשר האמידי שליד
השייר הנפתילאמיני
ב
-וNA6-L-Arg-L-His-eNAגם כאשר הקבוצה
ה־ a - ₪ 2בתרכובות אלו מותמרת בשייר אצטיל או בנזואיל ,אלא
שהפרוק במקרים אלו איטי בכ 50% -בהשוואה לםובסטרט בעל הקבוצה
ה a -אמינית החופשית.
32
טבלה
: 1
M-fermentans
ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של
specific activity
apparent
nmoles/min/mg
M
cell protein
4
4
4
0־1.25xl
5
L-His-BNA
9
4.8
L-Arg-BNA
0־ 8.5 x l
4.6
L-Lys-gNA
"xlO
-
0
L-a-Glu-3NA
-
1
Ala-3NA־L
-
0
L L-Phe-BNA
הרכב תערובת הריאקציה ה י ה כדלקמן
o
m
0
y
substrate
.
s:L-His-gNA2.14
5
e
;L-Lys
של שאר ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ;
l
m
o
y
;
3-ymolesנפתילאמידיםNA-
50כ ו פ ר ו ר ו נ ל8.6pHymolesו 0 . 2 -מייל
ת ר ח י ף ת א י ם ה מ ת א י ם ל כ 0.6 -מ ״ ג ח ל ב ו ן .ה נ פ ח ה ס ו פ י של ת ע ר ו ב ת
ה ר י א ק צ י ה ה י ה 1מ ״ ל ,ה ט מ פ ר ט ו ר ה .l°C+25°
4.1.2
ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של
Acholeplasma laidlawii
ב ד י ק ה מ ו ק ד מ ת הראתה ש ה ת ר כ ו ב ו ת ;L-Arg-3NA ;L-His-3NA
NA
ידי
ב ת נ א י נ ס י ו ו ה ד ו מ י ם לאלה ב ה ם נ ב ח ן פ ר ו ק ם ע ל י ד י
) ס ע י ף-L-Ala4.1.1מ א י ד ך נמצא
ל י ד י תרחיף תאי
ש(.
A
M. fermentans
NA3-
מתפרק על י ד י
3
a
N
נ ק ב ע בשיטה ה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת ) פ ר ק (3.2
-
i
i
w
. A. laidlawii
l
d
i
a
A. l
ו ה מ ה ל ך ה א ו פ י י נ י של ה ר י א ק צ י ה
מ ת ו א ר ב צ י ו ר .1
ר ו ל י ז ה ה ה ת ח ל ת י ב ת נ א י ם א ל ו נמצא
נפתילאמיו
בריכוזי
והטמפ.
0.9±0.1
המשתחרר בדקה ל מ ״ ג ח ל ב ו ו .
nmoles
ה פ ע י ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ט י ת נקבעה
ס ו ב ם ט ר ט ש ו נ י ם ו ה 6xlO~^(apparent)-נמצא!
המצוי י נ י ם .
4
M
,
ב ת נ א י ה pH -
33
את ה ה י ד ר ו ל י ז ה של
A1a-3NA־L
4
על י ד י תאי A. laidlawiiבתנאי ה נ ם י ו ן המפורטים ל ע י ל .לעומת זאת
ה ד י -פ פ ט י ד L-A1a-D-A1aנמצא מעכב את ה פ ע י ל ו ת האמידטית של התאים -
כאשר 50%ע י כ ו ב הושג ב ר י כ ו ז ד י פ פ ט י ד של M
_9
5xl0״. 2
צ י ו ר מ ם .1:ה ק י נ ט י ק ה של ה י ד ר ו ל י ז ת eNA־ a1L-Aעל י ד י תאי
A. laidlawii
תערובת הריאקציה ,בתא ב ו הטמפרטורה מ ו ו ס ת ת ל ,25°C -הכילה בנפח
:50ymoles; L-Alaמ״לNA3-1
8.6pHו
ymoles2.8
מייל תרחיף תאים המכיל10x5-0.5תאים
ל כ 0 . 3 -מ״ג ח ל ב ו ן ( .
בופר ו ר ו נ ל
כמות
המתאימה)
34
4.1.3
תלות הפעילות האמידטית בpH -
התלות ב pH -של פעילות
L-His-BNA
M. fermentansבהידרוליזה של
נבדקה עם תאים שלמים ועם פרפרט ממברנלי .התאים השלמים
הוכנו בתמיסת ם ו כ ר ו ז -מ ג נ ז י ו ם א י ז ו ט ו נ י ת )פרק .(3.1פרפרט ממברנלי הוכ
על ידי סוניקציה של תרחיף תאים במכשיר
,Bransonשלש פעמים משך דקה,
בעצמה של amp3.5תוך קרור ל . C0° -כתוצאה מטיפול זה קטנה העכירות
של התרחיף בכ .40% -הממברנות הורחפו על ידי צנטריפוגציה ב,Sorvall -
g
משך
x
0
3דקות ב . C4° -תרחיף הממברנות נשטף פעמים מספר
בבופר & מהול 1 : 2 0פ ר ק
) ( 3 . 7ונשמר בC20° -־ .
תמיסות בופר לבדיקת פעילות תאים שלמים הוכנו בריכוז של 0.1M
בתמיסת ס ו כ ר ו ז ־ מ ג נ ז י ו ם .פעילות אנזימטית של ממברנות נבדקה בכופר
ללא םוכרוז.
תוצאות של בדיקת הפעילות האמידטית של תאי
תאים אלה ,לגבי
N A 3 - H i s־ , LשוניםpHבתנאי
M. fermentans
מובאות
בציור . 2
כדי לודא שהשינוי במהירות ההידרוליזה בערכי ה pH -השונים אכן
מבטא תכונה אינטרינםית של הפעילות הקטליטית של האנזים ,בדקנו באם
הפליטה הפלואורסצנטית של נפתילאמין תלויה ב . pH -מצאנו כי בתחום
ה pH -הנבדק ד ה י י נ ו , 6-9.6לא היה שינוי בפליטה של -3נפתילאמין
ב־ .420nm
תלות הפעילות האמידטית של תאי A. laidlawiiב pH -נבדקה עם
תאים מורחפים בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת )פרק (3.1והתוצאות מתוארות
בציור . 3
55
T
8
7
10
9
pH
צ י ו ר מ ס :2 .
(0
ת ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ז ר ,של ,L-His-gNAעל י ד י תאי
( M . fermentans
)<( ב pH -
ופרפרט ממברנלי
הרכב תערובת הריאקציה ל צ ו ר ך הבדיקה ה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת )פרק (3.2
ס ו פ י של 1מייל ה י ה כ ד ל ק מ ן
ymoles
50
y m o l e s:gNA2.14־ ; L - H i s
ב ו פ ר ב pH -ה מ ת א י ם ; ת ר ח י ף ת א י ם ב ת מ י ס ת ם ו כ ר ו ז
מ ג נ ז י ו ם ) 0 . 2מייל ,כ מ ו ת המתאימה ל כ 0 . 6 -מ ״ ג ח ל ב ו ן ( א ו ת ר ח י ף
מ מ ב ר נ ו ת )0.2מייל 0 . 2 ,מ ״ ג ח ל ב ו ן (
בבופר
1:20
g
ט מ פ ר ט ו ר ה C25°
ה כ ו פ ר י ם ה י ן כ ד ל ק מ ן :ט ר י ם -מ ל א ט ל 8.0pH -ו 74 -״;
-
קרבונט-ביקרבונט
ל9.6pH
ו-9,15
ה א נ ז י מ ט י ת מבוטאת כאחוז מהפעילות המירבית.
ורונל
.הפעילות
־
36
צ י ו ר מ ס :3 .ת ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ז ה עול L-Ala-BNA
A, laidlawii
ב pH -
ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ל ב ד י ק ה ה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת ,בטמפ׳
י
י
ל
1
5
0
על י ד י תאי
, 25°
Cה כ י ל ה
ymoles2.8ymoles; L-Ala-eNAבול׳
Q
ים
)
(
) .
מ״ג
ח ל ב ו ן 0 . 3ם (
( M ; 0 . 0 5 (0ב ו פ ר פ ו ס פ ט ; ב ו פ ר ו ר ו נ ל ;
הידרוקםידM ,0.05
־
ב ו פ ר חומצה ב ו ד י ת -ב י ד
ביקרבונט-םודיום
37
דיון
ב פ ר ק 4.1
פ ע י ל ו ת א מ י ד ט י ת ו פ פ ט ל ד ט י ת של
ע ל י ד י נ ו ) .(64לאחר מ כ ן
ש ו נ ה ,ג ם ב laidlawii(65-
שבדקנו
Mycoplasma fermentansד ו ו ח ה
א י פ י י נ ו פ ע י ל ו ת ד ו מ ה ,ב ע ל ת תיזום ס פ צ י פ י ו ת
.(Acholeplasmaשני מ י נ י המיקופלםמה
מ ג ל י ם פ ע י ל ו ת ב ה י ד ר ו ל י ז ה של הקשר ה א מ י ד י ב נ פ ת י ל א מ י ד י ם של
אמיניות שונות.
חומצות
M. fermentans
הראה ס פ צ י פ י ו ת ב ב י ק ו ע הקשר
ה א מ י ד י ל י ד ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ה ב ס י ס י ו ת ו ל א ה ת ק י ף כ ל ל את ה נ פ ת י ל א מ י ד י ם
ו פ נ י ל א ל נ י ן ,א ל נ י ל נ פ ת י ל א מ י ד התפרק א ך במעט.
של ח ו מ צ ה ג ל ו ט מ י ת ,
A. laidlawiiהראה ל ע ו מ ת ז א ת ס פ צ י פ י ו ת ב ה י ד ר ו ל י ז ה של א ל נ י ל נ פ ת י ל א מ י ד
בעוד
ש ה י ד ר ו ל י ז ה של שאר ה נ פ ת י ל א מ י ד י ם ש נ ב ד ק ו ה י ת ה מ ו ע ט ת .
האמידז
בשני מ י נ י ה מ י ק ו פ ל ס מ ה ל נ פ ת י ל א מ י ד י ם ה ש ו נ י ם ,המבוטאת על י ד י
4
ה-
ה א פ י נ י ו ת טל
נמצאה ד ו מ ה ,
-
ד ה י י נ ו ב ת ח ו ם של M
4
- 8.5x10
.1.25x10
ב ד י ק ת ת ל ו ת ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ב pH -הראתה ה ב ד ל נ י כ ר ב י ן ש נ י מ י נ י
המיקופלםמה.
ב ע ו ד ט ה ה י ד ר ו ל י ז ה ה מ י ר ב י ת של ה י ם ט י ד י ל נ פ ת י ל א מ י ד ע ל י ד י
M. fermentansה י ת ר ב ת ח ו ם
אופטימום
י ד י laidlawii
.
9.5-10pH
.
)למעשה ל א נ י ת ן ה י ה ל ק ב ל ע ק ו מ ת
ב ג ל ל ה pH -ה ג ב ו ה ( ,ה ר י ה פ ר ו ק ה מ י ר ב י ט ל א ל נ י ל נ פ ת י ל א מ י ד
A
התרחש ב p Hנ מ ו ך י ו ת ר . 8-9pH ,
-
M. fermentansש ל מ י ם ,
תאי
ו פ ר פ ר ט מ מ ב ר נ ל י שהוכן מ ת א י ם א ל ו מ ר א י ם ת ל ו ת
ד ו מ ה של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ב .pH -ממצא ז ה מרמז ע ל החשיפה האפשרית של
האמידז
ב מ מ ב ר נ ה ל pH -ב מ ד י ו ם .ל א נ י ת ן ה י ה ל ע ר ו ך ה ש ו ו א ה ד ו מ ה
ב A. laidlawii -
מאחר ו ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ב פ ר פ ר ט ה מ מ ב ר נ ל י אבדה מ ה י ר ו ת ,
כפי שידווח להלן.
פעילות
החומצה
קרבוניל.
האמידז
י ו ר ד ת ב מ י ד ה נ י כ ר ת כאשר ה ק ב ו צ ה ה - 0 -א מ י נ י ת של
ה א מ י נ י ת -נ פ ת י ל א מ י ד מותמרת על י ד י ש י י ר אצטיל א ו
בנזילאוקסי-
ממצא ז ה תמך ב ה נ ח ת נ ו ש ה פ ע י ל ו ת ה ז ו ה י א מ ס ו ג א ק ס ו פ פ ט י ד ז .
38
א נ ז י ם ב ע ל פ ע י ל ו ת א ר י ל א מ י ד ז ,המפרק את הקטר ה א מ י ד י ב ת ר כ ב ו ת
Pspudomonas aeruginosa
- 6נ פ ת י ל א מ י ד י ם של ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת ב ו ד ד מ -
באנזים תוך-תאי
ואופיין
וקונסטיטוטיבי ).(66
ה י א ב ב י ק ו ע הקטר ה א מ י ד י טל
6־ נ פ ת י ל א מ י ד י ם טל )(L
האנזים ד י -ו
ו א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם של ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת א ל ה ,
ה -ג>-אמיני.
פעילות הפפטידז
א מ י ד י ם ,ז א ת הראו
החופשיים בקצה
א י נ ה ת ל ו י ה ב מ ע ר כ ת ההחדרה של ה נ פ ת י ל -
ב ח י י ד ק י ם אשר ג ד ל ו במצע מ י ז ע ר י
א ך ח ס ר ו את ה י כ ו ל ת ל ה ח ד י ר את ה ם ו ב ם ט ר ט .
שהראנו
חומצות אמיניות
ו נ י ט ר ל י ו ת ,אשר הקצה ה - 0 -א מ י נ י שלהם ח ן פ ט י .כ מ ן כ ן מ פ ר ק
בסיסיות
פעילות
ה ס פ צ י פ י ו ת של א נ ז י ם ז ה
האמידז
ו ה כ י ל ו את ה פ פ ט י ד ז
של מ י ק ו פ ל ם מ ה ,ב ע ל
א נ ל ו ג י ת ל ז ו שנמצאה ב ח י י ד ק י ם ,מ מ ו ק ם ל ע ו מ ת ז א ת ב מ מ ב ר נ ה כ פ י
ב פ ר ק . 4 . 6אפשר ש מ י ק ו ם ה א נ ז י ם ב מ מ ב ר נ ה ה פ ל ם מ ט י ת ,
באורגניזם
ח ס ר ד ו פ ן ,בצורר .המאפשרת ל ו מ ג ע ע ם ם ו ב ם ט ר ט י ם ב מ ד י ו ם ,יש ב ו משום
ל מ י ק ו פ ל ס מ ה ה ד ו ר ש י ם א ת ר ו ב ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת במצע ה ג י ד ו ל
תועלת
ומקבלים אותן
שה-pH
ב צ ו ר ת ה י ד ר ו ל י ז ט ח ל ק י של ח ל ב ו נ י ם .יש ל צ י י ן בהקשר זר.
האופטימלי
ל פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ז של A. laidlawii
ו כ ן ג ם ה -pHה א ו פ ט י מ ל י
4.2
נמצא ב ת ח ו ם 8-9H׳
ל ג י ד ו ל ה ת א י ם ה ו א ב ת ח ו ם. ( 8 - 8 . 5 p H(67
השפעת ר י א ג נ ט י ם מ ע כ ב י ם על ה פ ע י ל ן ת ה א מ י ד ט י ת של
בלפי
••]. fermentans
His-BNA־ Lו ע ל כ ו ש ר ק ל י ט ת ה י ס ט י ד י ן
ע י כ ו ב ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של
4.2.1
ריאגנטי
יודואצטט,
כריאגנטים
אלקילציה
יודואצטאמיד ו -
המתמידים שיירי ציסטאין,
ת ל ו י ה ב pH -
חומצות
N-ethylmaleimide
מתיונין
ידועים
והיסטידין
בחלבוני,
,mM5-10עם ח ל ב ו נ י ם
(.
האמינית.
M. fermentans
על י ד י
ה י ו ת ו ה ם מ ג י ב י ם ע ם ה צ ו ר ה ה מ י ו נ נ ת של ש י י ר החומ^-
י ו ד ו א צ ט ט )12־ (pK=3מ ת א י ם לשמש כ ר י א ג נ ט ל ה ת מ ד ת ש י י ר י
א מ י נ י ו ת ב ק ר ו ם התא,
החשופות למדיום ה ח י צ ו נ י ,
ה י ו ת והתאי
39
מצויירים במחסום חדירות ל א נ י ו נ י ם .כמו כ ן ,יודואצטט נוטה להתרכז
בפאזה שומנית )קבוע התחלקות . (2.9
השפעת הריאגנטים הללו על הפעילות האמידטית של M. fermentans
נבדקה על ידי הדגרה של התאים עם הריאגנט ולאחר מכן בדיקת הפעילות
האמידטית של התאים המטופלים בהשוואה לבקורת טל תאים שהודגרו
באותם תנאים אך בהעדר הריאגנט .זאת נעשה באופן הבא :לתרחיף תאים
) 2.5-3מ״ג חלבון ב 1 -מייל תמיסת ם ו כ ר ו ז -מ ג נ ז י ו ם א י ז ו ט ו נ י ת ,
ב 7 . 5 p H -ה ו ס פ ו
0.5מייל מתמיםות המוצא של חומצה יודואצטית או
(
יודואצטאמיד ) (uka,purumF1בבופר טרים-מלאט 1M״, ,pH7.50שריכוזן
2
10M ~xlO4״ ההדגרה עם הריאגנט ,בריכוז סופי של(30°mMבוצעהב־נ,
תוך טלטול קל .בזמנים שונים נלקחה דגימה של תאים ,פעילות הריאגנט
ה הופסקה על ידי הוספת
מייל של
0
1
^
2
,
0בMKNaHPO
-
8.5pH
) (69והתאים הורחקו על ידי צנטריפוגציה .התאים נשטפו פעמים מספר
בתמיסת ם ו כ ר ו ז -מ ג נ ז י ו ם א י ז ו ט ו נ י ת והובאו לנפח ההתחלתי של הדגימה.
הפעילות האמידטית נבדקה בשיטה הפלואורימטרית )פרק (3.2עם
L-His-BNAכסובםטרט.
תוצאות נםיןן כמתואר לעיל מובאות בציור . 4
הנתונים טבטבלה 1מראים של-
M. fermentansפעילות אמידטית
ספציפית לגבי החומצות האמיניות הבסיסיות .הואיל וטריפםין פועל
אף הוא כהידרולז של אסטרים ואמידים של חומצות אמיניות הבסיסיות
ליזין
ו א ר ג י נ י ן ,והוא נעכב ספציפית על ידי
Tosyl-L-Lys-
. ( T L C K )chloromethylketone)(70בחנו את השפעתו של מעכב זה על
הפעילות האמידטית של
. M. fermentans
תרחיף תאים ) 3מ״ג חלבון( הודגר עם ר י כ ו ז י ם שונים של , TLCK
7 . 4 pה מ כ י ל סוכרוז לריכוז א י ז ו ט ו נ י
,
.
40
40
3
60
50
min
צ י ו ר מ ם :4 .
הפעילות
על י ד י ח ו מ צ ה י ו ד ו א צ ט י ת ) ( 0
ו י ו ד ו א צ ט א מ י ד נ(8
ה א מ י ד ט י ת של ת א י ם ש ט ו פ ל ו ב ח ו מ צ ה י ו ד ו א צ ט י ת ) ! : ( 0ו
יודואצטאמיד
כדלקמן:
ע י כ ו ב ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של
M. fremantans
)•(
נ ב ד ק ה בשיטה ה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת ) פ ר ק (3.2
ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ,בטמפ' C 2 5 °נ פ ח ס ו פ י
s
e
l
o
m
y
1מייל ה כ י ל ה
,
6
.
8
ודגימת
ת א י ם ) 0.2מייל( .כ ד י ל ב ד ו ק ה ג נ ה על ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת מ פ נ י
ה ר י א ג נ ט המעכב ,באמצעות ה י ם ט י ד י ן ,
l-His
עם
)ריכוז
30°C
צנטריפוגציה
יודואצטית
מהירה
ה ו ד ג ר ו ת א י ם כמשך isר ק
ס ו פ י. ( 2 5 m M )(A
ו ה ו ר ח פ ו ל ר י כ ו ז ם ההתחלתי
ה ת א י ם ה ו ר ח ק ו על
ו ט ו פ ל ו עם ח ו מ צ ה
כמתואר ל ע י ל .
ה פ ע י ל ו ת ב כ ל ד ג י מ ה מ ב ו ט א ת כ א ח ו ז מ ה פ ע י ל ו ת של ה ת א י ם ב ב ק ו ר ת
ששהתה ב ה ד ג ר ה ב א ו ת ו פ ר ק ז מ ן .
41
ה נ פ ח ה ס ו פ י של ת ע ר ו ב ת ה ת א י ם עט ה ר י א ג נ ט ה י ה
מייל ה ט מ פ ר ט ו ר ה C30°2
ו ה ז מ ן מ 45 -ד ק ו ת ע ד 75ד ק ו ת .ת א י ם אשר ה ו ד ג ר ו ב ב ו פ ר ם ו כ ר ו ז
ב א ו ת ם ת נ א י ם א ך בהעדר ה ר י א ג נ ט שימשו כ ב ק ו ר ת .עם ת ו ם
איזוטוני
ה ה ד ג ר ה ה ו ר ח ק ו ה ת א י ם על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ,נשטפו מ ס פ ר פ ע מ י ם
בבופר
לבדיקה
והרחפו ל נ פ ח התחלתי בתמיסה ה א י ז ו ט ו נ י ת .
כסובסטרט.
פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת עם L-His-eNA
דגימות נלקחו
תוצאות נ ס י ו ו זה
מ ת ו א ר ו ת בטבלה . 2
טבלה
:2
השפעת TLCKע ל ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ת א י
M. fermentans
activity
%
incubation period
min.
TLCK
M
63
75
3
0־6xl
20
60
2
־3xlO
20
45
2
־2xlO
ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת אשר נ ק ב ע ה בשיטה ה פ ל ו א ו ר י מ ט ר י ת
) פ ר ק (3.2מ ב ו ט א ת כ א ח ו ז מ ה פ ע י ל ו ת של ה ת א י ם ב ב ק ו ר ת המתאימה״
ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ,ט מ פ ' 1 ,C25°הכילה ב נ פ ח ס ו פ י של
14״2ymoles
NA350ymoles ; L-His-ב ו פ ר ו ר ו נ ל ,
מ״ל:
pHודגימת8.6
ת א י ם ) 0.2מ י י ל ( .
ר י א ג נ ט א ח ר ,ה (NEM) -
N-ethylmaleimideנ ב ד ק ג ם כ ו כ מ ע כ ב
אפשרי של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של
,M. fermentansב ת נ א י ם ד ו מ י ם
_3
1
M10xמ ע כ ב כ 60% -
ב ר י כ ו ז שלNEMנמצאכ י
מ ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ל א ח ר ט י פ ו ל של 60ד ק ו ת ב ת א י ם .
4.2.2
השפעה של ח ו מ צ ה י ו ד ו א צ ט י ת על ח ד י ר ו ת
M. fermentans
להיסטידיו
fermentans״ Mק ו ל ט ה י ס ט י ד י ו
ב מ נ ג נ ו ן המראה ק י נ ט י ק ת ר ו ו י ה ,
42
התלויה
חומצה
ב ט מ פ ר ט ו ר ה ו ב .(34a) pH -מ ע נ י ן ה י ה א י פ ו א ל ב ח ו ן השפעת
יודואצטית,
ר י א ג נ ט המעכב א ת ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ה א ו ר ג נ י ז מ .
על ק ל י ט ת ה ה י ם ט י ד י ן .לשם כ ך ה ו ם פ ו ל ת ר ח י ף ת א י
M. fermentans
) 1מייל 0.2 ,מ ״ ג ח ל ב ו ן ; ב ת מ י ס ת ם ו כ ר ו ז -מ ג נ ז י ו ם ה מ כ י ל ה ב ו פ ר
ט ר י ם -מ ל א ט ב MpH05-
5
s
יודואצטט
) 1
M
(
ב ב ו פ ר ט ר י ם -מ ל א ט ( .ה ת א י ם ה ו ד ג ר ו עם ה ר י א ג נ ט ,
2
שריכוזו
הודגרה
.
7
0״ 1 0מ י ק ר ו ל י ט ר מ ת מ י ס ת מ ו צ א של אשלגן
ב
~ ,M lxlOמשך-30°C20ד ק ו ת
״ כ מ ו ת א ק ו י ו ל נ ט י ת טל תאים
בתמיטת ה ב ו פ ר ה א י ז ו ט ו נ י ת ,ללא ה ר י א ג נ ט .התאים הורחקו
ע ל י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ו נ ש ט פ ו מ ס פ ר פ ע מ י ם עם ת מ י ס ת ם ו כ ר ו ז -מ ג נ ז י ו ט
מקוררת.
ל צ ו ר ך ב ד י ק ת ה ק ל י ט ה של ה י ם ט י ד י ן
שהודגרה
.(34
בנוכחות הריאגנט וכן
pH5.6
ל י ד י ם נ ו נ ם על מ י ל י פ ו ר פ י ל ט ר
נקבעה בתאים שהודגרו פרק ז מ ן קבוע
0
14
עם ה י ס ט י ד י ן ]C
ד ו ג מ ת ה ב י ק ו ר ת ,בתמיסה מתאימה
) aק ל י ט ת היםטידין
[ ב-
הורחפו התאים ,הדוגמה
37
.עודף החומצה ה א מ י נ י ת הורחק מן התאים
C
ה נ ק ב ו ב י ו ת . ( y
) 0.45גודל
נשטפו מספר פעמים בתמיסת ם ו כ ר ו ז :מ ג נ ז י ו ם מ ק ו ר ר ת ,
והועברו
יובשו באויר
השפעת י ו ד ו א צ ט ט על ח ד י ר ו ת
:3
cpm/0.2mg iodoacetate
protein pretreatment
+
M. fermentansל ה י ס ט י ר י ן
activity
%
2985
10
30850
100
ה ת ו צ א ו ת ה מ ו ב א ו ת ב ט ב ל ה ה י נ ן מ מ ו צ ע של שלוטה
קליטת
ההיסטידין
נ ם י ו נ ו ת נפרדים.
נ ב ד ק ה ב ת ע ר ו ב ת ש ה כ י ל ה ב נ פ ח ס ו פ י ט ל 1מייל:
ת א י ם ב כ מ ו ת א ק ו י ו ל נ ט י ם ל 0.2 -מ ״ ג חלבוןmM ;50
28בריכוז
).(59
ל ב ק ב ו ק י ם ה מ כ י ל י ם 10מייל נ ו ז ל ם י נ ט י ל צ י ה ב ד י א ו ק ס ן
טבלה
mM ;pH5.6280
ס ו כ ר ו ז ; 7mMמ ג נ ז י ו ם כ ל ו ר י ד ;
(
C
ס ו פ י טל
הפילטרים
e
משך ה ה ד ג ר ה ה י ה 15ד ק ו ת .
l
o
m
p
/
i
בופר טרים-מלאט,
14
[CJL-His
y
~
6
״
M
ד ג י מ ו ת של 0.5מייל נ ל ק ח ו ל ב ד י ק ת
2
43
הרדיואקטיביות .הפילטרים הושרו קודם בתמיסת היםטידין בלתי
מ ס ו מ ן על מ נ ת ל מ נ ו ע ס פ י ח ה ב ל ת י ס פ צ י פ י ת .
ד י ן ן ב פ ר ק 4.2
י ו ד ו א צ ט ט ו י ו ד ו א צ ט א מ י ד מ ג י ב י ם ע ם ש י י ר י ם נ ו ק ל א ו פ י ל י י ם ). (69
ב , pH7.5-8 -ב ר י כ ו ז י ם של ,5-10mMה ת ג ו ב ה ה מ ת ר ח ש ת ה י נ ד ,ב ע י ק ר
ק ר ב ו ק ם י מ ת י ל צ י ה של צ י ם ט א י ן .ב ר י כ ו ז י ם י ו ת ר ג ב ו ה י ם י כ ו ל ה ל ה ת ר ח ש ג ם
ת ג ו ב ה ע ם מ ת י ו נ י ן )~) ,(pH3אמידזול (5.5-6PHן ל י ז י ן ) (8.5pHכ פ י ש נ מ צ א
ב ה ת מ ד ה של ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ).(71
ת ו צ א ו ת נ ס י ו נ ו ת י נ ו מ ר א י ם ש פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ,M. fermentansכ ל פ י
- $נ פ ת י ל א מ י ד של ה י ס ט י ד י ן ,מ ע ו כ ב ת על י ד י י ו ד ו א צ ט ט ו י ו ד ו א צ ט א מ י ד .ע י כ ו ב
ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת מ ה י ר י ו ת ר ו ח ז ק י ו ת ר עם י ו ד ו א צ ט ט .ה ז מ ן שנדרש ל ע י כ ו ב
של 50%ע ל י ד י י ו ד ו א צ ט ט ה י ה 5ד ק ו ת ,ל ע ו מ ת 50%ע י כ ו ב ע ל י ד י י ו ד ו א צ ט א מ י ד
ת ו ך 30ד ק ו ת .א פ ש ר ל ה ב ח י ן ב מ ה ל ך ה ע י כ ו ב ע ם י ו ד ו א צ ט ט ש נ י ש ל ב י ם ,שלב מ ה י ר
ה מ ב י א ל 50% -ע י כ ו ב ת ו ך 5ד ק ו ת ו ש ל ב א י ט י ה מ ב י א ל ע י כ ו ב נ ו ס ף ע ד 80%ב מ ש ך
60ד ק ו ת .ה ד ג ר ה מ ו ק ד מ ת של ה ת א י ם ע ם ה י ס ט י ד י ן ,אשר ה נ פ ת י ל א מ י ד ש ל ו משמש
םובםטרט ל א מ י ד ז ,בטרם הוספה ה י ו ד ו א צ ט ט נתנה ה ג נ ה מלאה לאותן ק ב ו צ ו ת
ר ג י ש ו ת אשר מ ו ת ק פ ו ת ע ל י ד י ה ר י א ג נ ט .ה ן ע ם י ו ד ו א צ ט ט ו ה ן עם י ו ד ו א צ ט א מ י ד
ע י כ ו ב ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת א י נ ו מ ל א ו מ ג י ע ל מ י ר ב של 80%ת ו ך פ ר ק ז מ ן של
60ד ק ו ת .ג ם , TLCKאשר ה י ה צ פ ו י ל ה י ו ת ר י א ג נ ט ס פ צ י פ י ,ו כ ן NEMל א
ע י כ ב ו י ו ת ר מ 60% -של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ,ב ת ח ו ם ר י כ ו ז י ם ד ו מ ה משך א ו ת ו
פ ר ק ז מ ן .כ נ ר א ה שיש ל M. fermentans -ל פ ח ו ת ש נ י ס ו ג י ם של ש י י ר י ח ל ב ו נ י ם
ה ר ג י ש י ם ל י ו ד ו א צ ט ט ,אשר מ י ד ת ח ש י פ ת ם ע ל שטח פ נ י ה ת א א ו ה ר י א ק ט י ב י ו ת
ש ל ה ם בשל מ י ק ו ם ב א י ז ו ר ס פ צ י פ י ש ו נ ה ו ל כ ן הם מ ג י ב י ם ע ם ה ר י א ג נ ט ב מ ה י ר ו ת
שונה.
ה ע ו ב ד ה ש TLCK -ל א ש י מ ש כ מ ע כ ב ט ו ב י ו ת ר ב ה ש ו ו א ה ל י ו ד ו א צ ט ט ,ע ל א ף
ה י ו ת ו ת ר כ ו ב ת של ל י ז י ן אשר ה נ פ ת י ל א מ י ד ש ל ו משמש כ ס ו ב ס ט ר ט ל א מ י ד ז
44
מ ק ו ם לחשוב ט ה ק ב ו צ ו ת ה ר ג י ט ו ת ל ע י כ ו ב א י נ ן מ ע ו ר ב ו ת ב א ו פ ן ישיר ב ק י ט ו ר
ה ם ו ב ס ט ר ט א ו ב ת ה ל י ך ה ק ט ל י ט י .התמרת ק ב ו צ ו ת פ ו נ ק צ י ו נ ל י ו ת של ח ל ב ו נ י ם
י כ ו ל ה ג ם ל ג ר ו ם ל ש י נ ו י י ם ב מ ב נ ה ו ע ל י ד י כ ך ל ה ש פ י ע ב א ו פ ן ע ק י ף על פ ע י ל ו ת
מ צ א נ ו כ י ג ם כ ן ש ר ההחדרה של
האמידז .
ע ד כ ד י ,90%ל א ח ר שהתאים ט ו פ ל ו
כלפי
M. fermentans
ב י ו ד ו א צ ט ט .הממצא של שתי
חומצה א מ י נ י ת מ ס ו י י מ ת ,הקשורות ב ק ר ו ם התא,
פעילויות שונות
ו ה מ ע ו כ ב ו ת במידה דומה
על י ד י א ו ת ו מ ע כ ב ת ו מ כ ת במחשבה על קשר פ ו נ ק צ י ו נ ל י ב י ן
הטרנספורט.
להיסטידין
נפגם
ה א נ ז י ם למערכת
ר ע י ו ן ד ו מ ה העלה על י ד י ( C r a n e(72ל ג ב י קשר פ ו נ ק צ י ו נ ל י ב י ן
א נ ז י מ י ם מ פ ר ק י ס ו כ ר י ם ו מ ע ר כ ו ת ט ר נ ס פ ו ר ט ל ס ו כ ר י ם א ל ה בתאי א פ י ט ל ה מ ע י .
ההבדל
בריאקטיביות בין
יודואצטט ליודואצטאמיד ידוע בספרות.
למשל פ ע י ל י ו ת ר ב א ל ק י ל צ י ה של צ י ס ט א י ן
יודואצטט
ו י ו ד ו א צ ט א מ י ד לעומת זאת מתמיר
ב מ ה י ר ו ת ר ב ה י ו ת ר ת י ו ג ל י ק ו ל ט ) .(73ה ר ג י ש ו ת ה ש ו נ ה של ק ב ו צ ו ת SHב מ ו ל ק ו ל ה
חלבון
ל ר י א ג נ ט י ה א ל ק י ל צ י ה נמצאה ב מ ע ר כ ו ת כ מ ו
( K i n a s e (74
Bovine Brane Kreatine
ו . ( R a b b i t Muscle Aldolase(75-
SHב א נ ז י ם ק י נ ז ,
ב א ל ק י ל צ י ה טל ש נ י ש י י ר י
ה ח י ו נ י י ם ל פ ע י ל ו ת ו ,נמצא כ י ה ע י כ ו ב א י נ ו מ ו ח ל ט ו מ ג י ע
ל 75% -ג ם כאשר ה ר י א ג נ ט מ צ ו י ב י ח ס .100:1כ מ ו כ ן מצאו כ י ADPו מ ג נ ז י ו ם
מ ג י נ י ם על ה א נ ז י ם ב פ נ י ה ע י כ ו ב ע ל י ד י
י ו ד ו א צ ט א מ י ד .א ל ק י ל צ י ה ט ל ט י י ר SH
א ח ד מ ג י נ ה על ה ש י י ר ה ח י ו נ י השני מ פ נ י ח י מ צ ו ן
פעילותו
מולקולת
ו ה א נ ז י ם ט ה י נ ו 50%מ ע ו כ ב
י צ י ב ה י ו ת ר .מ נ י ח י ם כ י התמרת SHח י ו נ י ג ו ר מ ת ל ש י נ ו י ב מ ב נ ה של
החלבון,
ו כ ת ו צ א ה מ כ ך ש י י ר י ם מ ם ו י י מ י ם ח ש ו פ י ם פ ח ו ת להתמדה נ ו ם פ ת .
ג ם ב א נ ז י ם א ל ד ו ל ז נמצא כ י ה ם ו ב ס ט ר ט פ ר ו ק ט ו ז - 6 - 1 -ד י פ ו ס פ ט מ ג ן על ש י י ר י SH
החיוניים
מ פ נ י התמרה .מ ת ו ך שלושת ש י י ר י ה SH -ה ח ש ו ב י ם ל פ ע י ל ו ת ו ה ק ט ל י ט י ת
ש נ י י ם מ ג י ב י ם ב מ ה י ר ו ת עם י ו ד ו א צ ט א מ י ד ו א י ל ו השלישי מ ג י ב בקצב הרבה י ו ת ר
איטי.
45
פ ע י ל ו ת פפטידטית של מיקופלסמוז
4.3
לאחר שאפיינתי את ה ס פ צ י פ י ו ת של האמידז
של
M. fermentans
ו A. laidlawii -לנפתילאמידינו של החומצות ה א מ י נ י ו ת ה ש ו נ ו ת ,בדקתי
פ ע י ל ו ת ה מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז מ י ם ב ה י ד ר ו ל י ז ה של ד י -ו א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם .פ ע י ל ו ת
פפטידטית של
M.fermentansנבדקה ל ג ב י די ו ט ר י פ פ ט י ד י ם של החומצות
ה א מ י נ י ו ת ה ב ס י ס י ו ת ,כ מ צ ו י י ו בפרק . 3 . 3פ ע י ל ו ת פפטידטית של A.laidlawii
נבדקה כלפי א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם של ) (Lא ל נ י ן וכן א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם של )(L
ו (D) -א ל נ י ן המסודרים ברצף מ ס ו י י ם
4.3.1
פ ע י ל ו ת פפטידטית של
Mycoplasma fermentans
פ ע י ל ו ת ם הפפטידטית של תאי
של ()L
חומצות
:
, Lys-Ala; His-Ala
)־Lys-(Orn
2
M. fermentansנבדקה עם ה ד י -
;Lys-Lys
אמינו;Ala-Lys0
;rn־rn0
ו ה ט ר י -פ פ ט י ד י ם 0 :־( ( r n 0 ; )rn; )Ala־ A l a
;(rn0) Lys״
2
n
) fL(LDשהוכנו כמתואר בפרק . 3.3
2
2
תוצרי ה פ י ר ו ק ז ו ה ו באופן א י כ ו ת י על
י ד י השוואת נ ד י ד ת ם ב כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה ל נ ד י ד ה של ס מ נ י ם י ד ו ע י ם .
בדיקת ה פ ע י ל ו ת נעשתה על י ד י הדגרת תאים בתמיסת מלחים
א י ז ו ט ו נ י ת עם הפפטיד המומס בבופר ו ר ו נ ל ,ב . pH8.3 -כמות דומה
של תאים הודגרה ב מ ק ב י ל ,אך בהעדר סובסטרט ,כ ב י ק ו ר ת לאפשרות של
שיחדור חומצות א מ י נ י ו ת ל מ ד י ו ם .כעבור שעתיים של הדגרה ,תוך
ט י ל ט ו ל קל ב ,37°C -ה ו פ ר ד ו התאים על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה
ב ,(-Beckman)M i c r o f u g eעל טיפת שמן בעלת צ פ י פ ו ת של .g/cc1.024
תוצרי ה פ י ר ו ק ב ת ס נ י ו ז ו ה ו על י ד י כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה על נ י י ר ווטמו
מם׳
1 ,ב מ ע ר כ ת הממיטים :ב ו ט נ ו ל ) :(30חומצת חומץ ) :(6מ י ם :(j24
פירידיו
) , v/v (20משך 40שעות ל פ י. ( W a l e y and Watson(52
פתוח הכרומטוגרם נעשה עם ר י א ג נ ט נ י נ ה י ד ר י ו ,כמתואר בפרק . 3.4
תוצאות בדיקת ה פ ע י ל ו ת הפפטידטית של
ב צ י ו ר 5ובטבלה . 4
M. fermentansמ ו ב א ו ת
46
47
ז י ה ו י כרומטוגרפי של תוצרי הפעילות הפפטידטית
ציור מס:5 .
M. fermentans
טל
תערובת הריאקציה הכילה בנפח סופי טל 0.5מייל 0.2 :מייל תרחיף
פפטיד;mM50בופר ורונל
תאים )כ -0.2מ״גחלבון(mM;50
,בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת .הדגרה 120דקותב> , C-37°
ב8.3 -pH
- Aמיקופלסמה אטד הודגרו עם הפפטידיםLys -1 :־ );(Orn
ס מ נ י ם ;Lys - 5
:
(rn0) -2־Lys־> , A l a - 4 ;Lys-Lys -3;Lys
2
2
-
2
Ala־;Orn-6
;Lys־
) ( 0 r n־ 2
L y s־
2
-7
; ) 0 r n־ );rn0-(Ala
) 3
2
4-Ala־ )״(Orn
);rn0-(Ala r n ) -4־ סמנים-Ala;5 :
2
פטידים
-
2
2-Ala־ );(0rn) -3 ;(Orn(0
«(0rn) -7 ;Orn -6
)כוןן הנדידה מימין לשמאל בתמונה ,ד ה י י נ ו מלמעלה למטה
בכרומטוגרם(.
2
4
2
2
תוצאות הכרומטוגרם שהובא בציור 5סוכמו בטבלה .4
טבלה :4
הידרוליזה של ד י -וטריפפטידים על ירי M, fermentans
hydrolysis
+
+
+
+
+
-
תנאי
products
)His; Ala; (His-Ala
Lys; Ala
Ala; Lys
Lys
)Ala;(Orn
2
substrate
His-Ala
Lys-Ala
Ala-Lys
Lys-Lys
)rn־)Ala0
Ala־)(0rn
)(Orn
2
-
+
)Lys; (Orn
-
-
2
2
2
2
)(Orn־Lys
(0rn) -Lys
ה נ ם י ו ן ז ה י ם ל ת נ א י ם שפורטו בהסבר ל צ י ו ר . 5
2
48
טבלה 4מראה שתאי
M. fermentans
מפרקים שיירי ל י ז י ן
ואלניו מן הקצה האמיני טל הפפטידים שנבדקו .מאידך ,פפטידים
שהכילו אורניטיו בקצה האמיני לא התפרקו .הידרוליזה ליד שייר
טל ל י ז י ן או אלניו אינה יוצאת לפועל כאשר הקבוצה ה -מ-אמינית
מותמרת ,למשל על ידי טייר אצטיל .דיפפטידים המכילים ל י ז י ן ,
היםטידיו או אלנין מתפרקים בדרך כלל בשלמות .בדיקת פעילות
fermentans
)Pלגבי
כרומטוגרפית
.
M
(
0
3
6
m
,
,
4.3.2
.
פעילות פפטידטית של
Acholeplasma laidlawii
פעילותם של תאי A. laidlawiiבפירוק פפטידים של אלניו נבדקה
עם שתי סדרות של פפטידים ,אשר הוכנו כמתואר בפרק . 3.3
א.
ב.
אוליגופפטידים של -1.אלנין המכילים עד ששה שיירים.
אוליגופפטידים של -L
ו -ס ־ א ל נ י ן ,המכילים עד תשעה
שיירים ,ומסודרים ברצף מסויים לפי הנוסחה H L(LD) 0H״
n
תוצרי הפירוק זוהו באופן איכותי על ידי כרומטוגרפיה במשטח
דק ) (TLCונקבעו באופן כמותי על ידי הפרדה על עמודת
ה-
Amino Acid Analyzerכפי שפורט בפרק . 3.4
בדיקת הפעילות הפפטידטית של A. laidlawiiנעשתה על ידי
הדגרת התאים עם הפפטיד בבופר ורונל ב , pH8.3 -בתמיסת מלחים
י ת .ההדגרה ,ב ,C37° -נמשכה מ-
1 5 0 3 0
דקות עד
דקות.
התאים הורחקו מתערובת הריאקציה על ידי צנטריפוגציה .כביקורת
שימשה דוגמה של תאים ששהתה באותם תנאי הדגרה ,אך בהעדר סובסטרט.
תוצרי הפירוק נבדקו בתםנין על ידי הפרדה בכרומטוגרפיה בשכבה
דקה על פלטות צ ל ו ל ו ז ,עם ה נ ו ז ל המפתח :בוטנול ) :(4חומצת חומץ
): (1
מים נ ! ( v/v ,״
התוצאות מובאות בציורים 6ו . 7 -
49
L-ala
2
)(a1a־L
3
)(a1a־L
6
)L-(ala
(ala) +M
2
(ala) +M
3
(ala) +M
5
(ala) +M
g
ציור מם:6 .
זיהוי כרומטוגרפי טל תוצרי הפעילות הפפטידטית
של
A. laidlawiiלגבי L-Alaאוליגופפטידים
תערובת הריאקציה הכילה בנפח םופי של 0.5מ״ל :תאי מיקופלםמה
בכמות המתאימה לכ -0.2מ״ג חלבון; 50mMפפטיד;mM50בופר ורונל
ב , 8 . 3 -PHבתמיסת מלחים איזוטונית .הדגרה 30דקותב C-37°״
דוגמה של 10מיקרוליטר מהתסנין ,לאחר הרחקת התאים ,הושמה על
פלטת ה TLC -״ ההרצה מלמטה למעלה בוצעה במיכל סגור ,רווי באידי
הנוזל המפתח ,עד שהנוזל הגיע לקצה המשטח )כ 90-דקות(.
- M
מסמל מיקולפסמה.
מציור 6ניתן לראות שתאי A. laidlawiiמפרקים אוליגופפטידים
טל -1.אלנין לאלנין ,באופן כמעט מלא ,בתנאי הנסיןן.
פעילות תאי A. laidlawiiנבדקה גם לגבי פפטידים של אלנין
המכילים עד תטעה שיירים והמסודרים לפי הרצף ) ,L(LDוכן כלפי
אלנין פפטיד המכיל את הרצף LLבקצה הקרבוקםילי .התוצאות מובאות
בציור . 7
50
B
r
־
LL
LL+M ;
LLD
f
LLD+M
LLDLD
ZLLD
LLDLD+M
- ZLLD+M
־M
M
L-ala
LLD
t
- LLD+M
DLL
i
j; DLL+M
•i
}' AcDLL
j:
1 AcDLL+M
51
ציור מס:7 .
ז י ה ו י כרומטוגרפי של תוצרי הפעילות הפפטידטית
של A. laidlawiiלגבי אלנין אוליגופפטידיס
המכילים שיירי L
וD -
תערובת הריאקציה הכילה בנפח סופי של 0.5מייל :ו;0י מיקופלםמה
בכמות המתאימה
לכ-0.2
מייג חלבון; mMפפטיד; mM50בופר ו ר ו נ ל
ב ,8.3pH -בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת .הדגרה נמשכה
0
3
-
דקות ב 3 7 ° 0״
דוגמה של 10מיקרוליטר מהתםנין ,לאחר הרחקת התאים ,הושמה על
פלטת ה TLC -״
- M
מסמל תאי מיקופלסמה.
נראה כי תאי המיקופלםמה מפרקים a17מהקצה האמינו
L-A
טרמינלי של אלניל אוליגופפטידים ברצף )) L(LDחלק א( .הפפטידז
אינו
מפרק דיפפטיד של אלנין ) ,(LDב נ י ג ו ד לפירוק מלא של )) (LLחלק ב(.
כמו כן אין האנזים מסוגל לפרק את האלנין הטרמינלי כאשר הקבוצה
ה-(* -אמינית חסומה .הפפטידז
א י נ ו מפרק את הרצף ) (LLכאשר נמצא בקצה
הקרבוקםילי כמו בפפטיד ,DLLלעומת פירוק אלניו כאשר רצף זה מצוי
בקצה האמיני בפפטיד ) ,LLDחלק ג ( .דוגמה של תאים בכופר ,ללא פפטיד,
משחררת בפרק זמן ההדגרה כמות כה זעירה של חומצות אמיניות שאינה
מפריעה ל ז י ה ו י אלנין חופשי בהשוואה לנדידתו של הסמן )חלק א(.
בדקנו גם את הפעילות הפפטידטית של A. laidlawiiלגבי פפטידים
המכילים חומצות אמיניות אחרות ו (L) -אלנין בקצה האמיני או
הקרבוקסילי.
תוצאות נםיון כזה מובאות בציור . 8
תוצאות הבדיקה הכרומטוגרפית מראות כי הפפטידז של A. laidlawii
בעל פעילות אמינופפטידז אך במידת מה גם קרבוקםיפפטידז .הפפטיד
Ala-Gly-Glyהתפרק לחלוטין לאלנין ו ג ל י צ י ן .הפפטיד Gly-Phe-Alaהתפרק
לאלנין
ן ג ל י צ י ן ,אך הפירוק לא היה מלא והופיעו גם הדיפפטיד Phe-Ala
וכן הםובסטרט .כאשר הקבוצה ה־ -0אמינית של טריפפטיד זה היתה חסומה
על ידי שייר אצטיל הופיע אלנין בלבד כתוצר הפירוק האנזימטי.
-Phe-Ala, P h e - Aהתפרק לאלנין
ו(
תוצאה המראה כי
52
Phe-Ala־(Ala),
AcGly-Phe-Ala
Gly-Phe-Ala
Phe-Ala
Gly-Phe
Ala+Gly+Phe
G
5
4
3
Z
1
צ י ו ר מם:8 .
פ ע י ל ו ת פ פ ט י ד י ת של A. laidlawiiכלפי פ פ ט י ד י ם
המכילים ) (Lא ל נ י ן בקצר• ה א מ י נ י או ת ק ר כ ו ק ס י ל י
תערובת הריאקציה הכילה בנפח ס ו פ י של 0.5מ״ל :תאי מיקופלםמה
בכמות המתאימה
לכ-0.2
מ״ג ח ל ב ו ן ; 50mMפפטיד; mM50ב ו פ ר ו ר ו נ ל
ב , 8 . 3 -pHבתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת .משך ההדגרה 30דקות ב C -37°״
דוגמה של 10מ י ק ר ו ל י ט ר מ ה ת ס נ י ן ,לאחר הפרדת התאים ,נלקחה להפרדה
על פלטת ה TLC -״
:1-5
תערובת של A. laidlawiiעם הפפטידים הבאים;Ala-Lys :
Ala ;Gly-Phe-Ala ;Ac-Gly-Phe-Ala ;Ala-Gly-Gly־ (Ala) -Phe־
2
6
-
תאי A. laidlawii
בבופר א י ז ו ט ו נ י .
53
פעילות האמינופפטידז
הינה הפעילות העיקרית.
מהבדיקה הכרומטוגרפית קבלנו מושג על הספציפיות טל הפפטידז
של
המיקופלםמה לחומצות האמיניות השונות ולמיקומן בקצה האמיני או
הקרבוקסילי של האוליגופפטיד .כדי לקבוע את מידת הפירוק של פפטידים
מאורך שונה בחרנו בשיטה המאפשרת קביעה כמותית של תוצרי הפירוק
האנזימטי עם ריאגנט נינהידרין ,לאחר הפרדתם על עמודת מחליף יונים
של ה-
Amino Acid Analyzer
הפרדת תערובת של אלנין ואלנין
בבדיקה מוקדמת כיילנו את המערכת על ידי
אוליגופפטידים מהסדרה )L(LD
N
בריכוז
ידוע.
תוצאות ההפרדה הכרומטוגרפית של אלנין אוליגופפטידים
בAmino Acid Analyzer -
מובאות בציור . 9
קבוע האינטגרציה) ( c )(76לשטח מתחת לשיאים נקבע עבור אלנין
וכל אחד מן האוליגופפטידים .בערכי cאלה השתמשנו על מנת לקבוע את
כמות האלנין או האוליגופפטידים בתסנין טל תערובת הריאקציה האנזימטית.
לאחר שהיתה בידינו טיטה לקביעה כמותית טל תוצרי ההידרוליזה
בדקנו את תוצרי הפעילות הפפטידטית של A. laidlawiiלגבי אלנין
אוליגופפטידים המכילים מטלוטה עד תטעה
שיירים של אלניו,
היחידי טל אלנין המתפרק הינו האלנין ה^ -טרמינלי.
תוצאות נםיון כזה מתוארות בטבלה .5
כאשר השייר
54
o
6
)Ime(min
צ י ו ר מ ם :9 .
0
T
הפרדת א ל נ י ן
ו א ל נ י ן -א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם על ע מ ו ד ת
Dowex-50של
Amino Acid Analyzer
ת ע ר ו ב ת של א ל נ י ן
ו א ל נ י ן -א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם ה ו כ נ ה ב ר י כ ו ז של
0 ymoles05ב נ פ ח של 1מייל מ י ם .מ ת מ י ס ת ז א ת נ ל ק ח ו
־
מייל0.5
ל ע מ ו ד ת 5 0־ Dowexמ ם 1 .ה ס ט נ ד ר ט י ת של מ כ ש י ר
ה כ ו פ ר י ם כדלקמן
.
0
-
.
ס ו ד י ו ם ציטרט
םודיום
ל3.25pHM
כ ל ו ר י ד ל« 5pH« -25
B
ו -״M ;pH1.225
םודיום
ציטרט־4
55
ש
( ילOI M
CI <t י ז
•)ז
fl•
o
ש
ש
r־
j —
o
n
ש
<c o
E
3-
וin
O •׳-
י3-
o
00
cr>
•־3
CM
vo י-ו
o״v 1
—
1
O
o
י—י
o
O
o
n
ש
r/י־
X
n.
S_ w
>> כדs«
י
<S־
«d־
«3־
«c
O
o
o
o
1 m
o •׳s- w
י
O
o
o
>7ו0
O
o
rz
••
o
*־3
u>־
O
vo
CO
vo
LO
vo
a
מ
o
ש
in
ro Q)
o
p.
VO
ro
O
in
O
CO
10
o o o o
co
o
CM
Q
oo
v '
•
c
CM
I
9
o
o
ש
o
'5
CO
o
o
O
CM
oo
נח
כד
1
•—
•
O •r-
s- in
«&י< נ ד
<<׳3:
o
n
r—ם
VO
ש
m
n
n
/ד
c
ש
CO
o
3.
1 in
O •׳s- in
די
in
o•
o
oo
•
00
zc
a.
rz
rr•
3
to
סso ( עE ro
s_ -t->
a. o 1- J3
כי+-> 3
O
C
o
o
י0
o
LO
G
r»
a
*י
n
n
<—
•ת
n
o
ת
1
r•
n
VO
c!
o
r~
r•
r-
a
rz
5>
.Tv
rz
ci
פ
/י־
CO
a
n
o
ci
׳—י
1
o
n
C
E:
IT)
o
o9
o
•
a
-
c
/י
li.
r
r—
S\
/י
o
li.
r־
rz
Cl
o
n
rr-י
ד׳
ri.
c
/—
ri —
c
ג:
c
3
in
a
3
a
Pv
-Tv
V—
r:
Cl
c
C
r
n
ג:
o
LO
1
מ
/י
a
פ
aj
M
>>
X
r• =
ש
r־
r*
O
*
f
די
r
j \
c
rz
n
1—
£3
?1
r•
<—
סי
ש
־s:
n
n
•r—
<J
o
cz
• r—
E
•
X
r\
Jr*\
J—
o
rz
T—1
rz
r
CM
O
l_>
a
CL
,—
c
n
a
n
n:
^
Pv
a!
CO
a
O
/י
-Tv
Cl
י־׳
JN
?1
מ
״
r:
c
o
ro
E
*ר
ן/•י
t—
s_
D
rz
די
X
<u
s
o
j —
ג:
Pv
מ
,—
Cl
1—
>ה
ro
,—
n
y\
n
O
rr-
c
פ
a)
ש
n.
>\
rz
פS3
1ד
a ro
c
Pv <c
rz
r
r—
a
—ו
r~
n
a
rz
r־
c
rz
Q
ו
r־
a!
1—
S>
s\
rz
c\
v '
-Tv
/י
>1
r
n
a
4N
1
r־
r—
>—
1
—
c
—
o
r
ci
r
ar• .
ג:
c
ro
n
,—•
2:
f ־
בד
ai 4 - ש
<-> c
u •׳3
E o o
ת
j—•
o
—׳o
•a: E
r—
*—
n
•
in
>ע
ro 1
—
ci
r־
r־
• r—
r־-
r־
ש
o
LO co
>-1
•*
o
r־
ש
o
O
פ
1
—
1
o
O
in
CO
ש
1—
—׳
וin
o •׳S- in
>> פדj
o
a
r—
»
X
כ
Q
<
r־
tLO
^-
c
1
/י
o
/- ^
ג:
r~
•
a
a
n1
1
ש
n
r~
JS
n
r~
>X
Pv
n
ft.
r1
ש
/
o
<<־־׳
<
a
r
o
rz
rz
CTv
CM
r-l
o
ש
f—V
LO
*ד־
*\
/י
an
<<53
o
v—
E
^׳
n
n
00
r
ש
ac
S- m
ס־
rz
rz
r
^
r
rz
c
יד
1 in
O •r-
ft.
i —
56
מכמות ה א ל נ י ו שנקבעה ב ת ס נ י ן של תערובת הריאקציה עם תאי
המיקופלסמה,
ה ו ר ד נ ו את כמות ה א ל נ י ן שנמדדה ב ב י ק ו ר ת של תרחיף תאים
שעברו הדגרה באותם תנאים אך בהעדר הםובםטרט .למשלymoles006,< ,0
א ל נ י ו שוחרר ל מ ד י ו ם כעבור 60דקות ו 0ymoles01 -״ כ ע ב ו ר 150דקות.
ב ד ק נ ו האם הפרדת הפפטידים מתאי המיקופלסמה בתערובת ההדגרה ,בשיטת
ההרחפה ההפרדתית על טיפת שמו ,אכו כמותית ו א י ו טפיחה של הפפטיד
ל ,,pellet -זאת נעשה על י ד י הדגרת התאים עם א ו ל י ג ו פ פ ט י ד של
אלניו
שאינו משמש סובסטרט כמו
4
) ,(LDבתנאים הדומים לאלה בהם
בוצע ה נ י ס ו י ל ע י ל .ה ת ס נ י ו של תערובת הריאקציה ,טחופרד על י ד י
צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה על טימו שמו ,נבדק ב -
Amino Acid Analyzerונמצאה
ב ו כמות הפפטיד שהוכנסה באופן מ ק ו ר י לתערובת ב ג ב ו ל ו ת ד י ו ק של
כ . ±10% -
ד י וו בפרק 4.5
על פ ע י ל ו י ו ת פפטידז ו א ר י ל א מ י ד ז הקשורות בקרום התא של
fermentans
ד ו ו ח על י ד י נ ו נ .(64ה פ ע י ל ו ת הפפטידטית של
Mycoplasma
M. fermentans
ה י נ ה כלפי די וטרי פ פ ט י ד י ם ה מ כ י ל י ם ה י ס ט י ד י ן ,ל י ז י ן ובמידה פחותה א ל נ י ו .
הפרוק מתבצע מהקצה האמיני ו מ ו ת נ ה בכך שהקבוצה ה-(* -אמינית הופשלה.
הפפטידז א י נ ו פעיל בפרוק פ ו ל י _ - 1ל י ז י ן .ה ס פ צ י פ י ו ת של הפפטידז טל
M. fermentansחופפת את ה ס פ צ י פ י ו ת של האמידז כלפי - 3נ פ ת י ל א מ י ר י ם של
החומצות ה א מ י נ י ו ת ה ב ס י ס י ו ת ה י ס ט י ד י ן ל י ז י ו
ו א ר ג י נ י ו .גם ת ח ו ם ה pH -של
שתי ה פ ע י ל ו י ו ת ,הפפטיד ו ה א מ י ד ז ,דומה8.3-8.6-pH
״ י ת כ ן ושתי ה פ ע י ל ו י ו ת
קשורות באותה מ ו ל ק ו ל ה או קומפלכס .
פ ע י ל ו ת פפטידטית דומה,אך בעלת ס פ צ י פ י ו ת שונה ,מצאנו גם בהאי
Acholeplasma laidlawii
ו ב ק ר ו ם המבודד מתאים א ל ו ) .(65הפפטידז של
laidlawiiמגלה ס פ צ י פ י ו ת בפרוק פ פ ט י ד י ם באורך שונה ,מ -ד י ועד נ ו נ פ פ ט י ד ,
כאשר ה ב י ק ו ע מתרחש ל י ד ה ק ר ב ו ק ם י ל של - 1 .א ל נ י ו
הפפטידז
וגליצין.
ה ס פ צ י פ י ו ת של
ד ו מ ה ל ז ו של ה א מ י ד ז ה פ ע י ל ב פ י ר ו ק 6־ נ פ ת י ל א מ י ד של א ל נ י ן .מ צ א נ ו
כי ם־אלנין
ה נ ו ט ל ה ל ק בקשר ה פ פ ט י ד י ) כ מ ו (LD
מ ו נ ע את ה ה י ד ר ו ל י ז ה ו ד ר ו ש
ר צ ף של ש י י ר י א ל נ י ן מ ה ס ו ג ,LLDכאשר ם ־ א ל נ י ן במרחק של ל פ ח ו ת ש נ י ש י י ר י ם
מהקשר המתבקע ).(LLD
ה פ ע י ל ו ת ה ע י ק ר י ת של ה א ק ס ו פ פ ט י ד ז ה י א א מ י נ ו פ פ ט י ד ט י ת .
ר א י נ ו כ י א ל נ י ן ט ר י פ פ ט י ד מ ה ס ו ג DLLא י נ ו מתפרק ו כ ן ה ט ט ר פ פ ט י ד
Phe-Ala־ ) (Alaמתפרק ל Ala -ו ,Phe-Ala -מ א י ד ך ,מ צ א נ ו פ ע י ל ו ת נ מ ו כ ה של
2
קרבוקםיפפטידז
כרומטוגרפית(.
שהטריפפטידים
כ ל פ י ה פ פ ט י ד Gly-Phe-Ala
מעניו
) ה פ פ ט י ד עצמו ה י ה נ ק י ל פ י ב ד י ק ה
ל צ י י ן כ י ה פ י ר ו ק של ה ד י פ פ ט י ד י ם ה י ה מ ל א ב ע ו ד
התפרקו ב א ו פ ו
ח ל ק י ,ב פ ר ק ז מ ו של 30ד ק ו ת .האם ע ו ב ד ה ז ו
מבטאת את ה ד י פ ו ז י ה של ה ס ו ב ם ט ר ט אל ה א נ ז י ם ה מ מ ב ר נ ל י ,
התלויה כמובו
בגדלו,
א ו את האפשרות ש ה ד י פ פ ט י ד י ם ח ו ד ר י ם ל ת ו ך התא ו מ ת פ ר ק י ם ע ל י ד י פ פ ט י ד ז ו ת
ציטופלסמטיות
ב ע ו ד ש ה ט ר י פ פ ט י ד י ם א י נ ם ע ו ב ר י ם את מ ח ס ו ם ה ח ד י ר ו ת .
נראה ל פ י
ת ו צ א ו ת שהתקבלו בהמשך ב ב ד י ק ת ה ח ד י ר ו ת ל א ל נ י ו כ י האפשרות ה ר א ש ו נ ה ס ב י ר ה
יותר
במערכת ז ו .השימוש ב פ פ ט י ד י ם של א ל נ י ן
כםובסטרטים
האלניו
ל פ פ ט י ד ז של A. laidlawii
ה-[^-טרמינלי,
ה מ ס ו ד ר י ם ל פ י הרצף
n
)L(LD
א י פ ש ר ל ק ב ו ע את מ י ד ת ה פ י ר ו ק של
ב ת ל ו ת ב ג ו ד ל ה פ פ ט י ד .מ צ א נ ו כ י עם ע ל י ת א ו ר ך ה פ פ ט י ד
ק ט נ ה מ י ד ת ה פ י ר ו ק ,מ 60% -פ י ר ו ק של ה ט ר י פ פ ט י ד LLDל 40% -פ י ר ו ק של
ה נ ו נ פ פ ט י ד ^)L(LD״ ל ע ו מ ת ז א ת ,
פ י ר ו ק ה ד י פ פ ט י ד LLה י נ ו מ ל א .הארכת
משך
ה א י נ ק ו ב צ י ה מ 30 -ד ק ו ת ל 150 -ד ק ו ת איפשרה פ י ר ו ק של ע ו ד כ 5-10% -
מהסובםטרט ,אך ה ת ו צ א ו ת בפרקי ה ז מ ו
ה א ר ו כ י ם פ ח ו ת מ ה י מ נ ו ת ע ק ב leakiness
של ה ת א י ם ב ת מ י ס ה ה ש ו נ ה מ מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל שלהם.
ת ו צ א ו ת אלה
א ת ר ה ק י ש ו ר של ה פ פ ט י ד ז מ ס ו ג ל ל ק ש ו ר ב א ו פ ו א ו פ ט י מ ל י
ארוכים
יותר יתפרקו
נ י ת נ ו ת ל ה ס ב ר אם
די-פפטיד.
פפטידים
ב י ע י ל ו ת ה ו ל כ ת וקטנה עקב ע י כ ו ב י ם סטארים ה נ ו ב ע י ם
מהפרעה של ה ק י ש ו ר א ו של ה ת ה ל י ך ה ק ט ל י ט י .
58
Choules
ו ( G r a y(77-נתקלו גם הם ב פ ע י ל ו ת פפטידז הקשורה לממברנר.
של A. laidlawiiבעת שהכינו פרפרטים מ מ ב ר נ ל י י ם לצורר מ י פ ו י פ פ ס י ד י של
ה ח ל ב ו נ י ם .כאשר השתמשו בממברנות לא ד נ ט ו ר ט י ב י ו ת )בהעדר (SDSמצאו כי
חלק נ י כ ר מהחלכון הממברנלי עבר פ י ר ו ק .הם בדקו את ה פ ע י ל ו ת של הפרפרט
הממברנלי כלפי ד י פ פ ט י ד י ם ו ד י פ פ ט י ד -א מ י ד י ם ם י נ ט ט י י ם
כ
מ
ו
;NH׳ Leu
2
.
A r g - A׳ S e r - T y rומצאו פ י ר ו ק שלAc-Phe-Trp80-90%בבדיקהשל
מצאו פ ע י ל ו ת נמוכה של ק ר ב ו ק ס י פ פ ט י ד ז ) . ( > 1 0 %מסקנתם היתה כ י ה פ ע י ל ו ת
העיקרית ה י נ ה א מ י נ ו פ פ ט י ד ז ו ד י פ פ ט י ד ז ,אר הם לא בדקו את ה פ ע י ל ו ת כלפי
פ פ ט י ד י ם א ר ו כ י ם י ו ת ר ו כ ן לא א פ י י נ ו ת כ ו נ ו ת ק י נ ט י ו ת או ת ל ו ת ב pH -ו י צ י ב ו ת .
פ ע י ל ו ת של א ק ס ו פ פ ט י ד ז הקשורה לממברנות של כ ד ו ר י ו ת דם אדומות ידועה
מכבר ) . ( 7 8ב ח י ד ק י ם יש רק ד ו ג מ א ו ת ס פ ו ר ו ת ל פ ע י ל ו ת מ ס ו ג ז ה ,למשל
D-Alanine Carboxypeptidaseשנמצא ב -
subtil is״ Bוקשור כנראה
ב ב י ו ס י נ ת י ז ה של ד ו פ ן התא ) . ( 7 9פ פ ט י ד ז ו ת של ח י י ד ק י ם א ו פ י י נ ו בדרר כלל
ב א נ ז י מ י ם ק ו נ ם ט י ט ו ט י ב י י ם ,ת ו ר ת א י י ם ,ה מ צ ו י י ם בפרקציה הציטופלםמטית.
א ו פ י י נ ו למשל פ פ ט י ד ז ו ת בעלות פ ע י ל ו ת ב פ י ר ו ק די וטרי
פנילאלנין
האמיני
פ פ ט י ד י ם של
ו מ ת י ו נ י ן מהקצה האמיני ) , ( 8 0א נ ז י ם המבקע שיירי
)(81
ו א נ ז י ם ס פ צ י פ י ל -6 -אםפרטיל פ פ ט י ד י ם
),(82
לויצין,
פרולין
מהק״ה
ו ל פ ח ו ת ארבע
פ פ ט י ד ז ו ת ט ו נ ו ת המבקעות קשרי ל י ז י ל -ל י ז י ן בדי טרי וטטרפפטידים
ליזין
על
) . ( 8 3פפטידז הקשור לפרקציה ה ר י ב ו ז ו מ ל י ת א ו פ י י ן על י ד י( M a t h e s o n(84
בחלבון גבה מ ו ל ק ו ל ר י ) 3 - 4 1 0ד ל ט ו ן ( הדורש ק ב ו צ ו ת SH
5
שלפפטידזות ת פ ק י ד י ם ,בצד ב י ק ו ע של פ פ ט י ד י ם ה מ נ ו צ ל י ם
לפעילותו.
מחמדיום,
כנראה
בתהליכים
תיר ת א י י ם הקשורים ב ם י נ ת י ז ה ו פ י ר ו ק של פ ו ל י פ פ ט י ד י ם .תפקיד נ ו ס ף של
ה פ פ ט י ד ז ו ת י כ ו ל ל ה י ו ת בטמטם כמנטרלים טל פ פ ט י ד י ם מעכבים כמו פ פ ט י ד י ם טל
לויצין,
א ו ר נ י ט י ן או ל י ז י ן
).(85
א נ ז י ם שהוגדר כ "Peptidase like" -
ו-
,Arylamidaseהמשחרר
59
- £נ פ ת י ל א מ י ן מ £ -־ נ פ ת י ל א מ י ד י ם של ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת נמצא ב ח י י ד ק י ם ג ר ם -
ש ל י ל י י ם )(86
ואופיין
ו ג ר ם ח י ו ב י י ם ).(87,88
באנזים תוךתאי,
נמצאה כ ל פ י
לטרמינל
ואוליגופפטידים.
ה א נ ז י ם ב ו ד ד מ aeruginosa(66-
קונסטיטוטיבי.
( P .
ה ס פ צ י פ י ו ת של ה א נ ז י ם ה מ נ ו ק ה
- [ .ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת ב ס י ס י ו ת ו נ י ט ר ל י ו ת של ד י
כאשר ה ש י י ר ה ס מ ו ך ל ח ו מ צ ה ה א מ י נ י ת ה ^ -ט ר מ י נ ל י ת ה י נ ו
'n-Dא מ י נ י ת ,ל א מתרחשת ה י ד ר ו ל י ז ה .
אם בעבר ה י ת ה ק י י מ ת השקפה ב ד ב ר ה ת כ ו נ ו ת ה מ י ו ח ד ו ת של פ פ ט י ד י ם
ספציפיים
כמעוררי
ג י ד ו ל ) ,(growth promotersה ר י המחשבה ה מ ק ו ב ל ת כ י ו ם
ה י א שערכם ה ה ז נ ת י של פ פ ט י ד י ם ה ו א ב ה י ו ת ם מ ס פ ק י ם ב ב ת אחת כמה ח ו מ צ ו ת
אמיניות,
ב ת נ א י של נ ו כ ח ו ת ה פ פ ט י ד ז ה מ ת א י ם .למשל,
החסר פ ע י ל ו ת של ד י ג ל י צ י ן פ פ ט י ד ז א י נ ו
ש ד י פ פ ט י ד ז ה ח ו ד ר ל ת ו ך התא ).(89
המיקופלםמה
גליצין אוקםוטרופ
יכול לנצל ד י ג ל י צ י ן
ה מ י ק ו ם של ה פ פ ט י ד ז
ל ג י ד ו ל ,למרות
) א מ י ד ז ( של
ב ק ר ו ם התא ,ה ש ו נ ה ב ה ש ו ו א ה ל ח י י ד ק י ם ו ד ו מ ה י ו ת ר ל ת א י ם
אאוקריוטים ,וכן
י כ ו ל ת ה א נ ז י מ י ם האלה ל פ ר ק א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם -ק ש ו ר י ם א ו ל י
באופי
ה פ ר ז י ט י של מ י ק ר ו א ו ר ג נ י ז ם ז ה ה מ ת ק י י ם ב ס ב י ב ה עשירה ב ח ו מ ר י מ ז ו ן
וצריך
ל ק ל ו ט את ר ו ב ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת מן ה מ ו כ ן .
4.4
א ק ט י ב צ י ה של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת על י ד י ק ט י ו נ י ם חד ע ר כ י י ם
הואיל
ו מ י נ י מיקופלסמה שונים,
ב מ י ו ח ד אלה ה מ כ י ל י ם ס ט ר ו ל י ם
ב מ מ ב ר נ ה שלהם ,מ צ ט י י נ י ם י ח ס י ת ב י צ י ב ו ת א ו ס מ ו ט י ת ),(67
נ י ת נ ה האפשרות
ל ב ח ו ן את ההשפעה של מ ל ח י ם ב ע ל י ק ט י ו נ י ם ש ו נ י ם על ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת
שלהם.
4.4.1
השפעת ש י נ ו י י ם ב ר י כ ו ז NaClב מ ד י ו ם
ת ר ב י ת A. laidlawii
לכ־
1 0
מ ג י ד ו ל ל ו ג ר י ת מ י נשטפה ו ר ו כ ז ה
5 x l 0ת א י ם ב 1 -מייל ת מ י ס ת מ ל ח י ם
M NaCl25״ ( 0״ כ מ ו ת של
;
2
(0.01M MgCl
מייל מ ת ר ח י ף ז ה נ ל ק ח ה ל ב ד י ק ת פעילות0.1
60
א מ י ד ט י ת עם
כ ם ו ב ס ט ר ט ב ש י ט ה הפלואורומטרית
N A 6־ , L - A l a
) פ ר ק ( , 3 . 2ב 8.5PH -ב נ ו כ ח ו ת ר י כ ו ז י ם ש ו נ י ם של NaClב ת ע ר ו ב ת
הריאקציה.
-
ה ת ו צ א ו ת מ ס ו כ מ ו ת בטבלה 6
A
Lעל י ד י
בנוכחות
N
6
-
ו צ י ו ר .10
1
a
laidlawii A
0
ר י כ ו ז י ם ש ו נ י ם של NaCl
Rate of
Hydrolysis
)(U/min
NaCl in
reaction
)mixture (M
1.36
0.175
2
0.425
2.36
0.55
2.7
0.675
3.34
0.925
6.2
1.675
7.6
2.175
ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ב ק י ו ו ט ה ה כ י ל ה ב נ פ ח ס ו פ י של 1
9
0.1מייל ת ר ח י ף ת א י
ר ורונל
M
ב
כמצויין
m
-A.laidlawii
-
כ ) 10x5ת א י ם ( ;
NaCl ;pHלהשלמת ה ר י כ ו ז
המולרי8.5
ב ט ב ל ה 2.8 :מ י ק ר ו מ ו ל י ם של - U .L-Ala-BNAי ח י ד ו ת
א ר ב י ט ר ר י ו ת של פ ל י ט ה פ ל ו א ו ר ם צ נ ט י תבNM-410
״
כ ד י ל ו ו ד א שהעליה ב מ ה י ר ו ת ה פ י ר ו ק של ה ס נ ב ס ט ר ט L-Ala-gNAא י נ ת
ת ו צ א ה של ת ל ו ת ה פ ל י ט ה של ה ת ו צ ר - $נ פ ת י ל א מ י ן
את ה פ ל י ט ה ה פ ל ו א ו ר ס צ נ ט י ת של ת מ י ס ת
ב nm335 -בטני
ריכוזי (
ב ר י כ ו ז המלח,
בדקנו
נ פ ת י ל א מ י ן ב ) 410NM -ע ר ו ר
NaClקיצונייםM :2
ו , 0M2 -
־
וערכי
הפליטה טהתקבלו ה י ו ש ו ו י ם .
התוצאות
ה מ ו ב א ו ת ב ט ב ל ה ע ו ב ד ו ע ל מ נ ת ל ה צ י ג את מ י ד ת
ה א ק ט י ב צ י ה ט ל ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת עם ע ל י ת ר י כ ו ז המלח ב ת ע ר ו ב ת
הריאקציה,
כאשר כ 100%-פ ע י ל ו ת נ ל ק ח הערך שהתקבל ב נ ו כ ח ו ת
61
ציור
.
0.175
צ י ו ר מם:10 .
.10
אקטיבציה של ה פ ע י ל ו ת האמידטית של A. laidlawii
בהשפעת ר י כ ו ז י ם ע ו ל י ם של NaClבתערובת הריאקציה
מידת האקטיבציה חושבה מ ה נ ת ו נ י ם המובאים בטבלה .6קצב ה פ ע י ל ו ת
ב נ ו כ ח ו תMNaCl0.175
האקטיבציה.
נלקח
כ-1
ו ב א ו פ ו יחסי חוטבה מידת
62
ה ת ו צ א ו ת ה מ ו ב א ו ת ב ט ב ל ה 6ו צ י ו ר 10מ ר א ו ת על א ק ט י ב צ י ה של
הפעילות
ה א מ י ד ט י ת פ י ,5עם ע ל י ת ר י כ ו ז המלח ב ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה
ה
וסקופ נ י ג ו ד
פ
ששהו ב מ ד י ו ם ה ה י פ ר ט ו נ י ב ת נ א י ב ד י ק ת ה פ ע י ל ו ת כ ־
ו
ז
ת
דקות
ב
2
0
,בתאים
1
,C25° -
נ י ת ן ה י ה ל ר א ו ת שהתאים ה ת כ ו ו צ ו ב מ י ד ה נ י כ ר ת א ך ע ד י י ן ה י ו ב ל ת י
חדירים ל -
ששהו ב מ ד י ו ם ה ה י פ ר ט ו נ י
. Trypan blueב ד י ק ת פ ע י ל ו ת א מ י ד ט י ת ב ת ה נ י ן טל ה ת א י ם
) צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה משך 30ד ק ו ת ב -
100,000
x
g
(
היתר .ש ל י ל י ת .ה מ ס ק נ ה ה י א שתאי A. laidlawiiב מ ד י ו ם ה י פ ר ט ו נ י
מגלים
פ ע י ל ו ת אמידטית גבוהה י ו ת ר בהשוואה ל מ ד י ו ם א י ז ו ט ו נ י
ו פ ע י ל ו ת ז ו א י נ ה הופכת למסיםה עקב ה ט י פ ו ל הזה.
4.4.2
השפעת ס ו ג ה ק ט י ו ן ה ח ד ע ר כ י ב מ ד י ו ם
בדקנו
השפעתם של ק ט י ו נ י ם חד ע ר כ י י ם ש ו נ י ם על ה פ ע י ל ו ת
ה א מ י ד ט י ת של A. laidlawii
ו בהרכב התמיסה
מ ג י ד ו ל ל ו ג ר י ת מ י ,כמתואר בסעיף הקודם.
״
ה י ו 1:CsCl;L i C l ; NaCl; K C
כאשר ר י כ ו ז ם ה ס ו פ י ב ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ה י ה 1.675M״ מ י ד ת ה א ק ט י ב צ י ה
אשר חושבה ב י ח ס ל מ ה י ר ו ת ה ה י ד ר ו ל י ז ה של L-Ala-eNAב מ ד י ו ם של
M25־ ,NaCl 0מ ו ב א ת ב ט ב ל ה
7.
63
טבלה
:7
השפעת ק ט י ו נ י ם ש ו נ י ם על ה פ ע י ל ו ת האמידטית של
A. laidlawii
Activation
Monovalent
cation
x 6
+
K
x 4.5
+
x 1.5
+
Li
x 1
+
Cs
Na
תערובת הריאקציה ב ק י ו ו ט ה הכילה בנפה ס ו פ י של 1מ״ל:
מייל תרהיף תאי
כי)A.laidlawii
ו ר ו נ ל ב8.5 -pH
.
של
9
בופר
;(0 xl5
; מ ל ה ב ר י כ ו ז של M; 1.6758«2מ י ק ר ו מ ו ל י ם
L - A l a - g N Aה ר י א ק צ י ה ב־ . C25°
די וו בפרק 4.4
התוצאות המובאות בפרק זה מראות כי למלחים יש השפעה בהגברת הפעילות
האמידטית של תאי A. laidlawiiכלפי .L-Ala-gNAהתאים החשופים זמו קצר
ל מ ד י ו ם ה ה י פ ר ט ו נ י משנים אמנם את צורתם אך א י נ ם נצבעים ב -
,Trypan blue
כלומר מחסום החדירות שלהם לא נ פ ג ע .פ ע י ל ו ת האמידז ,כתוצאה מהטיפול במלח,
א י נ ה י ו ר ד ת לתמיסה -עובדה המצביעה על מידת האינטגרציה של החלבוו הפעיל
במבנה הממברנה .לעומת זאת ,ר י כ ו ז מלח גבוה ) (2M Na Iנמצא י ע י ל בהוצאת
) ATPaseשאינו רגיש ל (Oabain -ממברנת א ר י ת ר ו צ י ט י ם ומפרקציות מ י ק ר ו ם ו מ ל י ו ת
של רקמות ש ו נ ו ת ) .(90הו ל ר י כ ו ז עולה של המלח והו ל ס ו ג ה ק ט י ו ו החד ערכי
יש השפעה באקטיבציה של הפעילות האמידטית של .A. laidlawiiהאקטיבציה
מירבית )
(
x 6ה ו ש ג ה עםMKC11.675
.למלחים ב מ ד י ו ם יתכו אפקט כ פ ו ל על
התאים:
א(
השפעה אוםמוטית המתבטאת ב א י ב ו ד או קליטת מים על י ד י התא.
נמצאו י צ י ב י ם בלחץ אוסמוטי המשתנה בתחום של
«atm7-27
,
64
ו ה tonicity -ה א ו פ ט י מ ל י טל ה מ ד י ו ם ה י נ ו כ . ( l O a t m(134-
נמצאו
מ פ ס י ד י ם ח ו מ ר ת ו ך תאי ב ת נ א י ם ה י פ ר ט ו נ י י ם ו נ י ת ן
++
ז ה על י ד י ת ו ס פ ת
ב(
א ו (135
Ca
++
מיקופלסמה
ל מ נ ו ע leakage
. ( M g
הטפעה ע ל מ ב נ ה ה מ מ ב ר נ ה .
י ד ו ע כ י ה ק ב ו צ ו ת ה פ ו ל ר י ו ת טל ה פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם ב ל י פ י ד -ח ל ב ו ן
Micellar Interface
חלבונים,
מ ט פ י ע ו ת ע ל ה י א ו נ י ז צ י ה ט ל ק ב ו צ ו ת פ ו נ ק צ י ו נ ל י ו ת טל
הטפעה ט י ט לה ה ט ל כ ו ת ע ל ה ת ה ל י ך ה ק ט ל י ט י
Clustering
ה ט ל י ל י י ם על פ נ י הממברנה י כ ו ל ל ג ר ו ם ל -
של ה פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם מצד א ח ד ו ל מ נ י ע ת
מ מ ב ר נ ל י י ם ב א מ צ ע ו ת ion-pairs
) .(136מ י ס ו ך המטענים
טל ה ק ב ו צ ו ת ה פ ו ל ר י ו ת
א י נ ט ר א ק צ י ה טל ח ל ב ו נ י ם ו ל י פ י ד י ם
מאידך.
השפעת ק ט י ו נ י ם ח ד ע ר כ י י ם א י נ ה רק ת ו פ ע ה של מ י ס ו ך על פ נ י השטח ,אלא
כ פ י שהראו Trauble
,K
צב
בניגוד
+
,Na
ו ( E i b l(94-
+
"
ג ם ע ל ה נ ו ז ל י ו ת של ה מ מ ב ר נ ה .
ה
ו
נ
ז
ל
י
חוקרים
" של ה מ מ ב ר נ ה
ל י א ו נ י ם ד ו ע ר כ י י ם ה מ ש פ י ע י ם על י י צ ו ב המצב " ה מ ע ו ב ה ״ .
ה ר י כ ו ז הגבוה
טל ה מ ל ח י ם ה ד ר ו ש ל ק ב ל ת א פ ק ט מ י ר ב י ) ע ד ( ,M2מ ר א ה כ י א י ן ז ו א י ט נ ר א ק צ י ה
ס פ צ י פ י ת א ל א אפקט של ח ו ז ק י ו נ י .ל א ר ג ו ן
או חצי גבישי
ה ל י פ י ד י ם ב מ מ ב ר נ ה במצב נ ו ז ל י
) מ ע ו ב ה ( יש השפעה ע ל פ ע י ל ו י ו ת ב י ו ל ו ג י ו ת ה ק ש ו ר ו ת ב מ מ ב ר נ ה
כ מ ו ט ר נ ס פ ו ר ט ו א נ ז י מ י ם ) . ( 9 2 , 9 3השפעה ז ו מתבטאת ב א ו פ ן
ב נ ק ו ד ו ת שבירה ש ו נ ו ת ב ע ק ו מ ת א ר נ י ו ם ,
הפחמתיות.
נ ס י ו נ י למטל
ב ת ל ו ת ב מ צ ב י א ר ג ו ן ש ו נ י ם של ה ש ר ש ר ו ת
נמצא כ י פ ע י ל ו ת א ו פ ט י מ ל י ת ד ו ר ש ת שהשרשרות ה פ ח מ ת י ו ת טל ה ל י פ י ד י ם
ת ה י י נ ה במצב מ ו ב י ל י .
ת ו פ ע ה של י י צ ו ב ה מ מ ב ר נ ה של laidlawii
במיקופלסמה ) (94במדידת ה ש נ ו י י ם ב -
1-N
.
A.
turbidity
על י ד י
ק ט י ו נ י י ם נמצאה
ב נ ו כ ח ו ת מלחים
65
4.5
השפעת א נ ז י מ י ם על ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של A. laidlawii
טריפםין
4.5.1
פ ר ו ט א ו ל י ט י ם משמשים כ מ כ ש י ר ל ח ק ר שטח ה פ נ י ם ה ח י צ ו נ י
אנזימים
של ק ר ו מ י ם על י ד י הפעלתם על ת א י ם שלמים א ו על ת כ ש י ר י ם ק ר ו מ י י ם .
חלבוני
יציבים
ה מ מ ב ר נ ה ב ת א י ם שלמים הם ב ד ר ך כ ל ל פ ח ו ת ח ש ו פ י ם ו ל כ ן
ל פ ר ו ט א ז ו ת ל ע ו מ ת ה מ מ ב ר נ ו ת ה מ ב ו ד ד ו ת ).(95
יותר
ב ד ק נ ו השפעת
ט ר י פ ם י ן על ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ת א י ם שלמים של A. laidlawii״
לשם כ ך השתמשנו בתאי A. laidlawii
תמיסת מלח א י ז ו ט ו נ י ת
מ ג י ד ו ל ל ו ג ר י ת מ י אשר נשטפו
; MTris-HCl0.05);0.01MMgCl
2
־
M NaCl25
-
ב . ( 7 . 5 p H 0תרחיף תאים
OJ
(
עם ר י כ ו ז י ם ש ו נ י ם של ט ר י פ ס י וsaltfree)Worthington,2
מ lmg/mlO -ע ד , mg/ml0.5
0
טריפסין
10
) , 1מ״ל10 x2תאיםהודגר(
15משך
דקות
cryst
ב-37°C
x
ת ו ך טיטול קל.
ב ת נ א י ם ד ו מ י ם פ ע ל על תכשיר ק ר ו מ י ש ה ו כ ן מתאי
laidlawii״ Aו ג ר ם ל פ ר ו ק של כ 20-30% -מ ה ח ל ב ו ן ,אשר נ ק ב ע בשיטת
. Lowryכ ד י ל ע כ ב את ה פ ע י ל ו ת ה פ ר ו ט א ו ל י ט י ת ה ו ס פ ת י 50מ י ק ר ו ל י ט ר
ת מ י ס ת מ ע כ ב ט ר י פ ס י ן מ פ ו ל י ס ו י ה ) .(15mg/mlה ת א י ם ה ו פ ר ד ו מ ת ע ר ו ב ת
ה ה ד ג ר ה על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ו פ ע י ל ו ת ם כ ל פ י L-Ala-eNAנ ב ד ק ה בשיטה
ה פ ל ו א ו ר ו מ ט ר י ת ) פ ר ק .(3.2
ת ו צ א ו ת הבדיקה הראו כ י ה ט י פ ו ל ב ט ר י פ ס י ן
ל א ע י כ ב את ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ה ת א י ם .מ צ א נ ו כ י כ 80%-מ ה פ ע י ל ו ת
ה ה ת ח ל ת י ת נשארה קשורה ל ת א י ם ,ל ע ו מ ת כ 10% -פ ע י ל ו ת מ ם י ס ה ש י כ ו ל ה
ל ה י ו ת ג ם ת ו צ א ה של פ ר ג מ נ ט צ י ה של ה ת א י ם .
תנאי
ב ב י ק ו ר ת של ת א י ם ב א ו ת ם
ה ד ג ר ה ,בהעדר ט ר י פ ס י ן ,ל א ה י ה כ ל א י ב ו ד של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת
של ה ת א י ם ו כ ן לא ה י ה הפסד של פ ע י ל ו ת ל ת מ י ס ה .
נ ם י ו ן ז ה מראה כ י
ה ח ל ב ו ן ) א ו ה ק ו מ פ ל כ ם ( ב ע ל ה פ ע י ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ט י ת כ ל פ י L-Ala-BNA
אינו
ע ו ב ר א י נ א ק ט י ב צ י ה על י ד י פ ע ו ל ת ט ר י פ ם י ן ,אם מ ה י ו ת ו חשוף
ב מ י ד ה מ ו ע ט ת לשטח ה ח י צ ו נ י של התא א ו ש ה י נ ו מ מ ו ס ך על י ד י מ ו ל ק ו ל ו ת
66
של פ ו ל י ה ק ם ו ז א מ י ן שנמצאו ק ש ו ר ו ת ל ת א יl a i d l a w i i(96
4.5.2
. ( A .
פוספוליפז c
A. l a i d l a w i i
כמרכיבים
מכיל פוםפטידיל-גליצרול
ע י ק ר י י ם של ה ל י פ י ד י ם ב ק ר ו ם התא
של פ ע ו ל ת פ ו ם פ ו ל י פ ז cמ -
מהבחינות
ודיפוםפטידיל-גליצרול
).(97
B. cereusע ל ת א י
ב ד ק נ ו את ההשפעה
A. l a i d l a w i i
הבאות:
A. l a i d l a w i iש ל מ י ם .
א.
ה ת ב ט א ו ת של ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ת א י
ב.
שחרור פ ו ס פ ט מסים בחומצה ,בעקבות הפעלת ה א נ ז י ם על התאים.
פ ו ם פ ו ל י פ ז cפ ו ע ל ע ל פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם ב ר י א ק צ י ה הבאה:
- Diglyceride+Phosphoryl -Rי
Phosphatide
ש י י ר Rה י נ ו ב ד ר ך כ ל ל כ ו ל י ו ,א ך ה א נ ז י ם מ B. cereus -ב ע ל
ספציפיות
גליצרול
יוני
רחבה ו ת ו ק ף ג ם פ ו ם פ ו ג ל י צ ר י ד י ם א נ י ו נ י י ם כ מ ו
).(98
סידן
מקור״
האנזים מ-
לפעילותו
א י נ ו המוליטי
B. cereus
פוספטידיל
ו א י נ ו דורש
) .(99ה פ ר פ ר ט של ה פ ו ס פ ו ל י פ ז שהתקבל מ ח ב ר ת
) י ר ו ש ל י ם ( ע ב ר ט י פ ו ל מ ו ק ד ם של א י נ ק ו ב צ י ה
בC60°
משך
10ד ק ו ת ,ל ה ר י ס ת פ ע י ל ו ת פ ר ו ט י א ו ל י ט י ת נ י ל ו ו י ת .
פ ע י ל ו ת א מ י ד ט י ת של A. l a i d l a w i i
4.5.2.1
תרחיף
איזוטונית
A. l a i d l a w i i
)ריכוז
++
Mg
מ ג י ד ו ל ל ו ג ר י ת מ י הוכן בתמיסת מלחים
רק ImM
ו ר י כ ו ז ה ב ו פ ר ט ר י ס -מ ל א ט ,mM5
כ ד י שלא ל ע כ ב פ ע י ל ו ת ה פ ו ם פ ו ל י פ ז ( .
ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של ה ת א י ם
נ ב ד ק ה עם L-Ala-eNAבשיטה ה פ ל ו א ו ר ו מ ט ר י ת ) פ ר ק .(3.2ת מ י ס ת
פוספוליפז
השימוש.
mg/ml04־
״ ה ה ד ג ר ה נעשתה
נבדקה
במים,c
ב ר י כ ו ז טל mg/ml2ה ו כ נ ה ז מ ן ק צ ר ל פ נ י
פ ו ם פ ו ל י פ ז cהוסף לתרחיף התאים כך ש ר י כ ו ז ו ה ס ו פ י
ב
0
C37° -משך ד ק ו ת . 6 0
ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת ט ל ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ו כ ן של ה ת א י ם
67
והתםנין־
ל א ח ר ה פ ר ד ת ם .לא נמצאה י ר י ד ה מ ש מ ע ו ת י ת ב פ ע י ל ו ת
ה א מ י ד ט י ת של ה ת א י ם ,ל א ח ר חשיפתם ל פ ו ס פ ו ל י פ ז ,ו כ ך ל א עברה
מ ש מ ע ו ת י ת מן ה ת א י ם ל ת ם נ י ן .
פעילות
4.5.2.2
ש ח ר ו ר פ ו ס פ ט מ ס י ם ב ח ו מ צ ה מתאי
עקב ט י פ ו ל
A. l a i d l a w i i
בפוספוליפז c
אחת ה ש י ט ו ת ל ב ד י ק ת פ ע י ל ו ת ל י ט י ת של פ ו ם פ ו ל י פ ז cה י א
ב ד י ק ת שחרור פ ו ס פ ט ל מ ד י ו ם ,אחרי ה פ י כ ת ו מפוספט א ו ר ג נ י
לאיאורגני.
ו-
ב מ ו ד י פ י ק צ י ה של השיטה של
ClOO) Macfarlane
. ( E i b l (61
c
רה
השתמשנו
תרחיף
Knight
ו ק ב ע נ ו את ה פ ו ס פ ט ה א ו ר ג נ י בשיטה של
A. l a i d l a w i i
2
ב ב ו פ ר א י ז ו ט ו נ י ה ו ד ג ר עם
מ ת מ י ס ת ה מ ו צ א של mg/ml
נעשתה ב C37° -משך
ט י ל ט ו ל . 6 0
דקות תוך
במים.
במקביל הועמדו
שתי ב י ק ו ר ו ת ,ת א י ם ב ב ו פ ר א י ז ו ט ו נ י א ך ב ה ע ד ר פ ו ס פ ו ל י פ ז
M
במקום
נלקחו 4
0
m
לתםניו
טריכלורואצטית,
א ו ר ג נ י על שתי
ה ו ס פ ו 20מ י ק ר ו ל י ט ר של ח ו מ צ ה
ס ו פ י של %ר .ל א ח ר הרחקת המשקע,
נקבע
ד ג י מ ו ת של 100מ י ק ר ו ל י ט ר ו פ ו ס פ ט
ד ג י מ ו ת א ח ר ו ת ,ל א ח ר שריפה ) פ ר ק . ( 3 . 8
התוצאות
ב ט ב ל ה .8
הנסי וו
פוספט
לריכוז
א י א ו ר ג נ י על שתי
מסוכמות
.
מ
ל
נסיון
ד ג י מ ו ת של 0 . 2מייל ו ה ת א י ם ה ו ר ח ק ו ע ל י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה
ב .Microfuge -
פוספט
5
2
M
m
כ
וביקורת
ה מ ס ו כ ם ב ט ב ל ה 8מראה כ י א י ו ש ח ר ו ר משמעותי של
א ו ר ג נ י או
הפוספוליפז.
א י א ו ר ג נ י מתאי
A. l a i d l a w i iכ ת ו צ א ה מ פ ע ו ל ת
י ר י ד ה ב ר י כ ו ז המלח ב מ ד י ו ם
מ ו ע ט של פ ו ס פ ט א ו ר ג נ י
כ ת ו צ א ה של י צ י א ת
)כ10%-
) ב ק ו ר ת (B
י ו ת ר בהשוואה ל ב ק ו ר ת ,(Aכנראה
נ ו ק ל י א ו ט י ד -פ ו ס פ ט י ם ,מהתאים.
של ח ו מ ר ג ב ה מ ו ל ק ו ל ר י מתאי
גורמת לשחרור
A. l a i d l a w i i
א י ב ו ד משמעותי
בתנאים ה י פ ו ט ו נ י י ם
68
יש רק ב ר י כ ו ז י ם נ מ ו כ י ם מ NaCl 150mM -
טבלה
:8
קביעת פוספט א ו ר ג נ י
).(20
ו א י א ו ר ג נ י ב ת ם נ י ן של
A. l a i d l a w i iל א ח ר ט י פ ו ל ב פ ו ס פ ו ל י פ ז c
nmole Po/ml
203
61.5
0.02
282
70.5
0.04
220
70.5
0.1
207
75
0.2
253
59
־ )A
290
70.5
־ )B
A. l a i d l a w i i x 2
הריאקציה הכילה
ופוםפוליפז
)1נפח ס ו פ י
nmole Pi/ml
PLC
mg/ml
תאי
,
10
cב ר י כ ו ז י ם המצויינים ,בבופר א י ז ו ט ו נ י
מ ״ ל ( .ה ד ג ר ה מטך 60ד ק ו ת ב C 3 7 ° -
־
פוספט
מ ס י ם ב ח ו מ צ ה נ ק ב ע ב ד ג י מ ו ת של 0.1מייל .
- (A
ב ק ו ר ת של ת א י ם ב ב ו פ ר א י ז ו ט ו נ י
);5mM Tris-maleate ;250mM NaCl
-( B
2
(pH7.2 ;lmM MgCl
ב ק ו ר ת של ת א י ם ב ב ו פ ר ש ה כ י ל m M NaCl225״
ק י צ ו ר י ם PLC :
)
(
Po,פוםפוליפזc
)פוספט א ו ר ג נ י ( ,
) Piפ ו ס פ ט א י א ו ר ג נ י ( .
ה ק ב י ע ו ת הן מ מ ו צ ע של ד ו פ ל י ק ט י ם שההבדל ב י נ י ה ם לא עלה
על
דיון
4%
.
בפרק 4 . 5
תוצאות
ה נ ס י ו נ ו ת ש פ ו ר ט ו ב פ ר ק ז ה ה ר א ו כ י ה פ ע י ל ו ת ה א מ י ד ט י ת של האי
A. l a i d l a w i iא י נ ה מ ו ש פ ע ת
in s i t uמחשיפת ה ת א י ם ל פ ע ו ל ת טריפםין או
פ ו ם פ ו ל י פ ז cו כ מ ו כ ן א י ן מעבר של פ ע י ל ו ת ל ת מ י ס ה .
ב מ י ד ה ש ו נ ה ל ט ר י פ ם י נ י ז צ י ה .למשל,
ק ט נ ה של
ס ו ג י תאים ש ו נ י ם רגישים
כ ד ו ר י ו ת דם א ד ו מ ו ת מ ש ח ר ר ו ת רק כ מ ו ת
ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם ו א י נ ן ע ו ב ר ו ת ל י ז י ס ,ב ע ו ד שתאי
Ehrlich ascites
69
lymphoidנ ה ר ס י ם ע ק ב ט י פ ו ל ק צ ר ב ט ר י פ ם י ן .ההטפעה ט ל א נ ז י מ י ם
או תאי
פ ר ו ט א ו ל י ט י ם על פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת ט ל ה מ מ ב ר נ ה ת ל ו י ה ב מ י ק ו מ ו טל
פ ע י ל ו י ו ת א ל ה ב ק ר ו ם ו ב מ י ד ת ח ט י פ ת ם ט ל ה ח ל ב ו נ י ם ל א י נ ט ר א ק צ י ה עם
מקרומולקולה
אדומות
ב א נ ז י ם .ה פ ע ל ת פ ר ו נ ז ,ט ר י פ ם י ו א ו כ י מ ו ט ר י פ ס י ו על כ ד ו ר י ו ת
ה ו ר ס ת א ת ר ו ב פ ע י ל ו ת ה כ ו ל י ו א ם ט ר ז א ך ל א מ ט פ י ע ה כמעט על פ ע י ל ו ת
ה ט ר נ ס פ ו ר ט טל כ ו ל י ו ו ט ל
נ ת ר ו ).(101
יוני
מ כ ד ו ר י ו ת ה ד ם פ ע י ל ו ת ה ־ ATPase
לטריפםיו
קרומי
ואובדת במהירות.
),(102
בתכטיר
נתרו
התלויה ב י ו נ י
ב ה פ ע ל ת פ ר ו נ ז על ת א י
נמצא כ י ATPase
הקרומי,
לעומת זאת,
בממברנות המבודדות
ואטלגו ,רגיטה ביותר
A. l a i d l a w i i
ועל תכטיר
ו NADH oxidase -ט ה י נ ם ר ג י ט י ם ל א י נ א ק ט י ב צ י ה
י צ י ב י ם ב י ו ת ר בתאים הטלמים.
ה פ ע ל ת א נ ז י מ י ם ל י פ ו ל י ט י י ם ב ע ל י ס פ צ י פ י ו ת ט ו נ ה ע ל התא השלם י כ ו ל ה
ל ת ת מ ו ט ג על מ י ד ת ה ח ט י פ ה ט ל ה פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם ה ט ו נ י ם ו ע ל ת ר ו מ ת ם ל י צ י ב ו ת
או ל פ ע י ל ו ת טל א נ ז י מ י ם הממוקמים ב ק ר ו ם .למטל,
ט י נ ו י י ם בליפידים ממברנליים
ה נ ג ר מ י ם ע ק ב פ ע ו ל ת פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת ת ו צ א ת ם ט ח ר ו ר ט ל א נ ז י מ י ם מ ם ו י י מ י ם מו
ה מ מ ב ר נ ה כ מ ו ( H y d r o x y b u t y r a t edehydrogenase-3(103ו NADH -
dehydrogenaseמ י ט ו כ ו נ ד ר י א ל י ).(104
היות
ב נ ס י וו ז ה ל א ה ט ת מ ט נ ו
ו א נ ז י ם ז ה מטחרר ח ו מ צ ו ת ט ו מ נ י ו ת ח פ ט י ו ת
מולקולות
לפירוק
בפוםפוליפז A
ו ל י ז ו פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם טבהיותו
ד מ ו י ו ת ד ט ר ג נ ט ג ו ר מ ו ת ל ה ר ס התא ה ט ל ם .
פוםפוליפז cאינו
גורם
מ ט מ ע ו ת י טל פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם ב כ ד ו ר י ו ת א ד ו מ ו ת ט ל מ ו ת ב ת נ א י ם
איזוטוניים
).(105
ה א נ ז י ם י כ ו ל לפרק
לציטיו
ו ל ג ר ו ם ל ל י ז י ם טל ה כ ד ו ר י ת
ר ק א ח ר י ט י פ ו ל מ ו ק ד ם ב ס פ י נ ג ו מ י י ל י נ ז המבקע ע ד 80-85%מ ה ס פ י נ ג ו מ י י ל י ו
הממברנלי,
בעלי
ט כ נ ר א ה ממסך את ה ל צ י ט י ו
תכולה גבוהה טל ל צ י ט י ו
זאת לפעולת פ ו ס פ ו ל י פ ז c
ב כ ד ו ר י ת טלמה.
ו כ מ ו ת ק ט נ ה טל
מ B. cereus -
כ ד ו ר י ו ת דם מ ח ז י ר י -י ם
םפינגומייליו,
ועוברות ליזיס
ודיפוםפטידיל גליצרול וכו
רגיטות לעומת
) .(106פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם
ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם הם
חומציים,
פוםפטידיל גליצרול
המרכיבים
ה ע י ק ר י י ם ט ל ה ל י פ י ד י ם ה מ מ ב ר נ ל י י ם ב מ י ק ו פ ל ס מ ה ).(97
כולסטרול
70
מ צ ו י ג ם ה ו א ב כ מ ו ת נ י כ ר ת ב מ מ ב ר נ ת , A. laidlawiiעד כ 10-12%-מ כ ל ל
ה מ מ ב ר נ ל י י ם ) .(107מ ד י ד ו ת ב ש י ט ו ת פ י ס י ק ל י ו ת ה ר א ו כ י כ90%-
הליפידים
מהליפידים
).(108
ע ר ו כ י ם במבנה ה -
bilayerכ פ י שהוצע ב מ ו ד ל של ד נ י א ל י
ודווסוו
י ד ו ע ר ק מ ע ט ע ל ה א ר ג ו ן של ה ל י פ י ד י ם מ ש נ י ע ב ר י ק ר ו ם התא טל
, A. laidlawiiלמשל ב ד י ק ו ת א י מ ו נ ו ל ו ג י ו ת ה ר א ו כ י ה ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם ח ש ו פ י ם
ע ל שטח פ נ י התא ) .(41כ ו ל ס ט ר ו ל מ צ ו י כ נ ר א ה ג ם כ ן על שטח פ נ י התא
פוספוליפז cאינו
).(109 ,110
י כ ו ל ל פ ע ו ל על ת א י ם שלמים של A. laidlawii
מהסיבות הבאות:
א( מ ס ו ך ה פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם ה ח ו מ צ י י ם ע ל י ד י
גליקוליפידים וכולסטרול.
ב( צ פ י פ ו ת י ת ר של ה מ ו ל ק ו ל ו ת ה נ ו ב ע ת מ א ר ג ו ן ה . ( b i l a y e r(105-
פ ע י ל ו ת ו י צ י ב ו ת ה פ פ ט י ד ז -א מ י ד ז בתכשיר ק ר ו מ י
4.6
ידינו באנזים
ה פ פ ט י ד ז ) - 6נ פ ת י ל א מ י ד ז ( של מ י ק ו פ ל ם מ ה ה ו ג ד ר על
מ מ ב ר נ ל י מאחר ו ה פ ע י ל ו ת נמצאה ק ש ו ר ה ב א ו פ ן ב ל ע ד י עם ה פ ר ק צ י ה ה מ מ ב ר נ ל י ת .
במטרה ל ח ק ו ר א ת ה ת כ ו נ ו ת של ה א נ ז י ם ,ש א ן פ י י ן עד עתה ע ל י ד י ב ד י ק ת
פ ע י ל ו ת התא השלם ,ב -
קרומי
Mioroenvironment
הממברנלי
נ י ס י נ ו ה כ נ ת תכשיר
בשיטות שונות:
שבירת תאי
א(
M. Fermentans
העמידים יותר בשנויים אוסמוטיים
) - (20ה פ ע ל ת ל ח ץ ) 750א ו 1250א ט מ ו ס פ י ר ו ת ( ב מ כ ש י ר
א ו ם ו נ י ק צ י ה במכשיר
לC -0°
ב(
ו
.
0.05
ק
ק
י
Bransonמ ט ך 3ד ק ו ת ל ס י ר ו ג י ן ת ו ך ק י ר ו ר
ל י ז י ם א ו ם מ ו ט י של A. laidlawii
הרכבו
ם
Yeda Press
M
;NaCl
,מובא ל -
ב כ ו פ ר 6מ ה ו ל ,1:20משך
M
H C p H
6
עם
5
1
.
0
M
;
. 1 7 . 4
ש ב י ר ת ה ת א י ם נ ב ד ק ה על י ד י מעקב ם פ ק ט ר ו פ ו ט ו מ ט ר י א ח ר ה י ר י ד ה
(500
n mו ב מ ק ב י ל עליה בחומצות נ ו ק ל י א י ו ת
)(260
n mב ת ס נ י ו .
71
א י ם שלא נ ש ב ר ו ה ו ר ח ק ו על י ד י
מברנות הושקעו ב -
צנטריפוגציה ב-
xg
40,000
ב ב ו פ ר Bמ ה ו ל . 1:20
הFlotation
בצפיפות
9,000
ה מ מ ב ר נ ו ת נ י ת נ ו ת להשקעה ג ם בשיטת ה
ד ר ך שמן ב ע ל צ פ י פ ו ת ,g/cc1.011-1.012
ג ב ו ה ה מ 1.014 -ה מ מ ב ר נ ו ת א י נ ן
במשקע ה מ מ ב ר נ ו ת של
האנזימטית
xg
משך 30ד ק ו ת ו נ ש ט פ ו פ ע מ י ם א ח ד ו ת
Differential
ההתחלתית,
ואילו
M. Fermentans
ע ו ב ר ו ת את שכבת השמן.
מ צ א נ ו 60-70%מ ן
הפעילות
ב ה ש ו ו א ה ל ת א י ם ש ל מ י ם ,אשר נ ק ב ע ה עם ה ס ט י ד י ל
- 3נ פ ת י ל א מ י ד כםובםטרט.
ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת של המשקע ה מ מ ב ר נ ל י א י נ ה
י צ י ב ה א ף ב , 0 ° 0 -כ 50% -מ ה פ ע י ל ו ת ה ו ל כ ת ל א י ב ו ד א ח ר י ש ע ת י י ם
ומחצה מ ע ת הפקת ה מ מ ב ר נ ו ת .
פעילותם
ת א י ם שלמים ל ע ו מ ת ז א ת ,ש ו מ ר י ם על
ה א נ ז י מ ט י ת ל פ ח ו ת 12שעות מעת ק צ י ר ת ם ,כאשר נ ש מ ר י ם ב . 0 ° 0 -
במשקע מ מ ב ר נ ו ת מ ו פ ק מ A. l a i d l a w i i -
מהפעילות
ההתחלתית.
מ צ א נ ו ע ד 10%ב ל ב ד
ב ש נ י ה מ ק ר י ם ,ל א ח ר נ י ס ו י ש י ט ו ת שבירה ש ו נ ו ת ,
ל א נמצאה פ ע י ל ו ת ה י ד ר ו ל י ט י ת כ ל פ י א ל נ י ל & -נ פ ת י ל א מ י ד ב ת ס נ י ן ה ת א י ם
השבורים.
,1
ח ו ס ר ה י צ י ב ו ת של ה פ פ ט י ד ז -א מ י ד ז בתכשיר ק ר ו מ י ,אף
2-Mercaptoethanol
m Mמ ע י ד על ח י ו נ י ו ת ה א ר ג ו ן השלם
של התא ל ה ת ב ט א ו ת ת ק י נ ה של ה פ ע י ל ו ת ה ה י ד ר ו ל י ט י ת ה מ מ ב ר נ ל י ת .ל פ י
ה ק ר י ט ר י ו נ י ם של ב י ד ו ד א נ ז י מ י ם מ מ ב ר נ ל י י ם ) (111אפשר לתאר ס ו ג
א נ ז י מ י ם זה ב ח ל ב ו נ י ם א י נ ט ג ר ל י י ם
הפעילות
מהסיבות
בלתי
)אינטרינםיים(.
א י ב ו ד נ י כ ר של
ה ה י ד ר ו ל י ט י ת במעבר מהרמה ה ת א י ת לרמה מ מ ב ר נ ל י ת י כ ו ל ל ה י ו ת
הבאות:
עיכול פרוטאוליטי א נ ד ו ג נ י בקרום המבודד,
ה פ י כ י ם ה נ ו צ ר י ם בקרום כתוצאה מ ה ל י ז י ם ה ה י פ ו ט ו נ י
לשוני
באינטראקציה ב י ן
פקטורים
שינויים
הגורמים
ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם ) ,(112,113א ו א י ב ו ד
הדרושים ל פ ע י ל ו ת או
ליציבות האנזים.
אי ל כ ך לא ה י ה באפשרותי ל ב ד ו ק
ו ל ה ש ו ו ת את ה ת כ ו נ ו ת של ה א מ י ד ז
72
והפפטידז בתכשיר הקרומי לתכונות האנזים )אנזימים( שאופיינו
בהאים
שלמים.
4.7
חדירות A. laidlawiiלאלנין וקביעת נפה האינולין
התחלקות -!.אלניו וחומרים גבה מולקולריים ביו נפח המים התוך-תאי
והחוץ-תאי של תאי A. laidlawiiנמדדה עם תאים מורחפים בתמיסת מלחים
איזוטונית ,כמתואר בחלק הנסיוני )פרק . ( 3 . 4היות וחדירת האלניו לתאים
נקבעת על ידי מנית הרדיואקטיביות בדוגמא של ה ,Pellet -יש לקחת
בחטבוו
את הנפח הביו-תאי הנקבע באמצעות חומרים גבה מולקולריים כאינוליו
ודקםטרו שאינם חודרים לתאים.
התוצאות המסוכמות בטבלה 9מראות בבירור שבתנאי הנסי וו התאים
אינם חדירים ל א ל נ י ו ,היות ואלניו נמצא מוגבל לנפח האינוליו
) (Trapped Volumeהמהווה כ 60% -מנפח ה.Pellet -
טבלה :9
התחלקות
,L-Alanineדקסטרן ואינולין בPellet -
של A. laidlawii
Relative
** solute
Concentration
4
Concentration x 10 M
*in supernatant in pellet
solute
0.60
0.10
0.17
Dextran
0.58
8.60
14.60
Inulin
0.63
0.22
0.35
L-Alanine
* הריכוז מחושב לגבי תכולת המים של הPellet -
שנקבעה
בנפרד
כמתואר בחלק הנםיוני )פרק . ( 3 . 6
** ריכוז המומס ב Pellet -הושווה לריכוזו
האחרוו נלקח כ. 1 . 0 0 0 -
בתסנין,
כאער הערך
73
(L-
ב נ ס י ו נ ו ת המסוכמים בטבלה 10ה ו ד ג ר ו התאים עם C) Alanine
ו ( H) Inulin -בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת או במדיום ג י ד ו ל ט ר י .יחם
3
האלנין
ל א י נ ו ל י ן )C/ H
14
ב Pellet -
(
הושווה ליחס חומרים אלה
בתערובת ה א י נ ק ו ב צ י ה ,כ ע ב ו ר 20דקות .ר י כ ו ז י א ל נ י ו
ו א י נ ו ל י ו ב Pellet -
התאים חושבו ל ג ב י נ פ ח המים הכללי של Pellet״
ל L-Alanine -
טבלה :10ח ד י ר ו ת A. laidlawii
Ratio
L-alanine/
inulin
)(normalized
Inulin
)(nmole/yl
1.0
L-alanine
)(nmole/pl
0.236
1.7
Fraction
analyzed
Suspension 0.071
0.142+0.011 0.267±0.003
0.233
1.0
Suspension 0.074
Salt solution
Pellet
תרחיף ה א י נ ק ו ב צ י ה הכיל תאי laidlawii
1 { A .מייל,
מ ל ח י ם 9,250mMNaCl ;10mM MgCl ) , p H
.
2
Potassium Phosphate50
Growth medium
Pellet
0.083±0.004 0.256±0.008
1.0
Incubation
mixture
10x6
;
7
( m Mא ו ב מ ד י ו ם ג י ד ו ל טרי גם כן,
מ י ק ר ו ל י ט ר מתמיסת מוצא של החומרים ה ר ד י ו
ב ,7.9pH -
ו-40
אקטיביים.
תמיסת המוצא ה ו כ נ ה כתערובת של:
3
M - ( H-Methoxy)Inulinx101
14
- ( C-U)L-Alanine
3
25CCi/mole,פעילותספציפית
M
e
l
o
m
/
i
C
ביחס של v / v ( ) 1:1־ א י נ ק ו ב צ י ה נעשתה ב C37° -ללא טלטול .ד ג י מ ו ת
של 200מ י ק ר ו ל י ט ר נלקחו אחרי 20דקות ו Pellets -ה ו כ נ ו לספירה
כמתואר בפרק ה נ ס י ו נ י )פרק .(3.5בכל נסי ו ו ,היחס של א ל נ י ן
לאינוליו
שנקבע בתרחיף ה א י נ ק ו ב צ י ה נלקח כ . 1.0 -
בתמיסת מלחים א י ז ו ט ו נ י ת ,יחס ר י כ ו ז י א ל נ י ו ל א י נ ו ל י ו ב Pellet -
נמצא שווה ליחס זה בתרחיף ה א י נ ק ו ב צ י ה ,בתקופת זמו מ 2 -דקות עד
70דקות )בטבלה מובא ל ד ו ג מ א הערך שנקבע כעבור 20ד ק ו ת ( .אי ל כ ך ,נמצא
כי א ל נ י ו תופס את א ו ת ו חלק של נ פ ח ה Pellet -כמו ה א י נ ו ל י ו המשמש כםמו
,
74
של הנפח ה ב י ו -ת א י .לעומת זאת ,תאים המורחבים ב מ ד י ו ם ג י ד ו ל טרי
באותו ,pHנמצאו ח ד י ר י ם ל א ל נ י ן -היחס א ל נ י ן ל א י נ ו ל י ן גבוה
ב Pellet -בהשוואה לתרחיף .יחס זה עלה מ 1.2 -כעבור 2דקות ל 2.5 -
כעבור 70דקות.
ד י ו ן בפרק 4.7
ה נ ם י ו נ ו ת לקביעת ח ד י ר ו ת תאי laidlawii״ Aל א ל נ י ן ,בתנאים של ב ו פ ר
איזוטוני
בהשוואה ל מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל ,נעשו כ ד י לברר את מידת החדירות של
התאים בתנאים בהם ב ד ק נ ו את פ ע י ל ו ת ם כלפי א ל נ י ל נפתילאמיד ו כ ל פ י
אוליגופפטידים.
מצאנו כי בתנאים בהם נבדקו פ ע י ל ו י ו ת הפפטידז ו ה א מ י ד ז ,
ד ה י י נ ו תמיסת ב ו פ ר א י ז ו ט ו נ י ת ,התאים א י נ ם ח ד י ר י ם ל א ל נ י ן ,הממלא את הנפח
הביו ת א י .מתוצאה ז ו הסקנו כ י פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת אלו הקשורות לממברנה
ממוקמות בעברה ה פ ו נ ה ל מ ד י ו ם ה ח י צ ו נ י .
על טרנספורט של פ פ ט י ד י ם ב ח י י ד ק י ם י ד ו ע כ י ק י י מ ו ת מערכות להחדרת
דיפפטידים
ו א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם ) .(83המסקנות בדבר חדירתם טל פ פ ט י ד י ם מ ב ו ס ס ו ת
על נ י צ ו ל ם לצורך ג י ד ו ל ,במצע מ ו ג ד ר .במספר מקרים הראו כ י מ ע ר כ ו ת
הטרנספורט טל פ פ ט י ד י ם נ פ ר ד ו ת מ ה פ פ ט י ד ז ו ת ,זאת על י ד י ט י מ ו ט ב מ ו ט נ ט י ם
שאיבדו את פ ע י ל ו ת הפפטידז אך מ ס ו ג ל י ם להחדיר את הפפטיד או ל ה י פ ך ,א י ב ד ו
את כושר ההחדרה בעוד שפעילות הפפטידז לא הופרעה ) .(89טרנספורט של
פ פ ט י ד י ם במיקופלסמה לא נבדק עקב הקושי בהרכבת מ ד י ו ם מ ו ג ד ר .דרישת
מיקופלסמה לחומצות א מ י נ י ו ת הוגדרה עבור מספר מצומצם של מ י נ י ם .
A. laidlawii
דורש 17חומצות א מ י נ י ו ת במצע ה ג י ד ו ל ,אך א ל נ י ו א י נ ה חומצה
הכרחית -פ נ י ל א ל נ י ו
ו ט י ר ו ז י ו מספקים גם את הדרישה ל א ל נ י ן ) .(114ב ס ו ג אחר
Mycoplsma strain Yהראו כי א ל נ י ו א י נ ו דרוש בחומצה החופשית ב מ ד י ו ם
ומסופק בצורת הטריפפטיד של _-1אלניו ) .(115ה י ו ת ולא נמצא קשר ישיר ב י ו
הדרישה ל פ פ ט י ד י ם של מ י נ י מיקופלסמה מ ס ו י י מ י ם ל ב י ו תכולת החומצות ה א מ י נ י ו ת
75
והרצף שלהן בפפטידים ,הועלתה הסברה כ י תפקידם של הפפטידים במצע ה ג י ד ו ל
לשמש כמנטרלים של חומצות ש ו מ נ י ו ת הדרושות ל ג י ד ו ל ) .(116תפקיד הפפטידים
ב ת ז ו נ ה של מיקופלסמה כ -
Growth Promoting Factorsלא הוכה עד עתה באופך
ישיר.
פיוו
NADH oxidaseבממברנה של A. laidlawii
ו ס י מ ו ו 4.8
laidlawii״ Aנמנה עם המיקופלסמה הפרמנטטיביים המקבלים את הפחמו
14
ו ה א נ ר ג י ה מ פ י ר ו ק של ס ו כ ר י ם שש פ ח מ נ י י ם .מתו ג ל ו ק ו ז c -
של ה ס י מ ו ו ב -
2
, coאצטט ,פ י ר ו ב ט ולקטט .ה מ י נ י ם ה פ ר מ נ ט ט י ב י י ם ה י נ ם
בעלי שרשרת הימצוו המסתיימת ב פ ל ב י ו ) ,(117בדומה ל -
מנדיוו,
מראה פ י ז ו ר
Lactobacilli״
ד י כ ל ו ר ו פ נ ו ל א י נ ד ו פ נ ו ל ו פ ר י צ י א נ י ד י כ ו ל י ם להחליף החמצו
כאקספטורים לחימצוו ה-
Cyt C . NADHלעומת זאת ,א י נ ו י כ ו ל לשמש
כאקספטור .מערכת מעבר ה א ל ק ט ר ו נ י ם ב A. laidlawii -מכילה פ ל ב ו פ ר ו ט א י ו
אחד או ש נ י י ם ) ;(48ה פ ע י ל ו ת א י נ ה ת ל ו י ה ב ל י פ י ד י ם הממברנליים )(27
ו א י נ ה מושפעת ממצבם ה פ י ס י ק ל י ) .(118ממצאים אלה מצביעים על כך שמערכת
מעבר האלקטרונים ב A. laidlawii -
כנראה א י נ ה משולבת באופו הדוק
ב י ו ת ר במבנה הממברנה ,ב נ י ג ו ד ל NADH oxidase -
lysodeikticusהדורש ל י פ י ד י ם ל פ ע י ל ו ת ו ).(119
ב-
Micrococcus
מעבר האלקטרונים ב מ י נ י ם פ ר מ נ ט ט י ב י י ם של מיקופלסמה ל פ י (67) Smith
מתואר ב צ י ו ר הםכימתי:
MENADIONE
\
I
/
NADP
76
ע ב ו ד ת ו של
בפרקציות
Pollack
ע ל מ י ק ו ם פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת של מ י ק ו פ ל ס מ ה
ה ש ו נ ו ת של התא הראתה כ ל ה פ ע י ל ו ת של
ב ־ A. laidlawii
קשורה ל מ מ ב ר נ ה ).(26
NADH oxidase
לעומת ז א ת ,
פעילות
NADPH oxidaseמ צ ו י י ר .ב א ו פ ו ב ל ע ד י ב פ ר ק צ י ה ה מ ס י ס ה של ה ת א .
NADH oxidase
ה מ י ק ו ם של
שונה במיקופלסמה הדורשים םטרול לעומת האכולפלםמה שאינם
דורשים םטרול -ב ר א ש ו נ י ם ה פ ע י ל ו ת ה י א מםיסה ב ע ו ד ש ב א ח ר ו נ י ם ה פ ע י ל ו ת
קשורה ל ק ר ו ם התא ).(120
ה א נ ז י ם המחמצו NADHא י נ ו ב ה כ ר ח ק ש ו ר ל מ מ ב ר נ ה
של מ י ק ו פ ל ם מ ה ,כ פ י ש נ כ ו ו ב ד ר ך כ ל ל ב ח י י ד ק י ם ).(121
ה-
NADH oxidaseשל A. laidlawii
מ ב ו ק ר ת ע ל י ד י רמת ה ADP -״ בקרה
ז ו א פ י י נ י ת ר ק ל א נ ז י ם הקשור ל מ מ ב ר נ ה ,
ר ג י ש כ ל ל ל . ( A D P(122-
המסיס
בעוד שהאנזים הציטופלםמטי א י נ ו
הבדלים נוספים ב י ו
נמצאו ביחס פ ע י ל ו י ו ת ה א ו ק ם י ד ז
ל א י נ א ק ט י ב צ י ה ע ל י ד י ח ו ם ).(123
פעילות
ה א נ ז י ם הממברנלי
לאוקםידורדוקטז וכו
פעילות ה-
לאנזים
הרגישות
NADH oxidase
ב A. laidlawii -נמצאה י צ י ב ה ב ת נ א י ם ד ר ס ט י י ם של ט י פ ו ל ב מ מ ב ר נ ה כ מ ו
אצטוו
מכילה
מ י מ י ,אבקת ה א צ ט ו ו המתקבלת ב ע ק ב ו ת מ י צ ו י ר ו ב ה ש ו מ נ י ם ע ד י י ו
פ ע י ל ו ת א ו ק ם י ד ז ).(124
דיאליזה
כ נ ג ד בופר המכיל
יוני
מ מ ב ר נ ו ת שהומסו
ב ד ט ר ג נ ט ו ע ב ר ו לאחר מכו
מ ג נ ז י ו ם ,מראות פ ע י ל ו ת
NADH oxidase
ה ע ו ל ה ע ם מ י ד ת ה א ג ר ג צ י ה ) .(125ה ס ת ב ר כ י ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת ח ו ז ר ת ג ם
כשהריאגרגציה
א י נ ה ס פ צ י פ י ת ) ,(126כ ך כאשר משתמשים ב ד ט ר ג נ ט י ו נ י
כמו
SDSה ג ו ר ם ל ש י נ ו י י ם ד נ ט ו ר ט י ב י י ם ב ל ת י ה פ י כ י ם ב מ ב נ ה ח ל ב ו נ י ם מ מ ב ר נ ל י י ם
),(127
ולאחר מ כ ו מ ר ח י ק י ם את הדטרגנט יוצאת ל פ ו ע ל א ג ר ג צ י ה ה מ ל ו ו ה
פעילות
ב A. laidlawii -ק ש ו ר
באופו
א נ ז י מ ט י ת .ה ע ו ב ד ה ש-
א י נ ט ג ר ל י בממברנה
NADH oxidase
ו י צ י ב ב מ י ד ה ר ב ה ל ט י פ ו ל י ם ש ו נ י ם ) ,(27מאפשרת
ב ד י ק ת ההשפעות של מ ו ד י פ י ק צ י ו ת כ י מ י ו ת א ו א נ ז י מ ט י ו ת ע ל פ ע י ל ו ת ה א נ ז י ם .
המסה מ ב ו ק ר ת של ה מ מ ב ר נ ה ע ל י ד י ד ט ר ג נ ט לא י ו נ י
נ ו ת נ ת אפשרות ל ב ד ו ק
77
את ה מ ז ו מ נ ו ת של ה ח ל ב ו נ י ם ה מ מ ב ר נ ל י י ם ל מ ע כ ב י ם ב מ מ ב ר נ ה שעברה ש י נ ו י ,
ב ה ש ו ו א ה למצב ה מ ק ו ר י .
במטרה ל ק ב ל מ י ד ע על הקשר ב י ו
בממברנה
ושלמות המבנה,
NADH oxidaseל ב י ן מ ר כ י ב י ם א ח ר י ם
נ י ס י נ ו ל ב ח ו ו את השפעת הרחקתם ה ס ל ק ט י ב י ת של
ל י פ י ד י ם א ו ח ל ב ו נ י ם מ ו ה מ מ ב ר נ ה על ה פ ע י ל ו ת ה נ מ ד ד ת .
פעולת פ ו ס פ ו ל י פ ז ו ת A
4.8.1
ו־ C
תכשיר ק ר ו מ י של A. laidlawii
על מ מ ב ר נ ת
ה ו כ ו על י ד י ל י ז י ס א ו ם מ ו ט י של
ה ת א י ם ,אשר נ ק צ ר ו ב פ ז ה ה ל ו ג ר י ת מ י ת ) 18ש ע י ( ,
משך 30ד ק ו ת ב -
37°
ונשמרו
8
בבופר
ב ב ו פ ר 8מ ה ו ל ,1:20
) Cפ ר ק .(3.7ה מ מ ב ר נ ו ת ר ו כ ז ו ,לאחר הרחקת ת א י ם
שלא ע ב ר ו ל י ז י ם ,על י ד י צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ב -
-
A.laidlawii
40,000
,משך 40ד ק ו ת ,
xg
המהול ב - C 2 0 °־
תכשיר של פ ו ם פ ו ל י פ ז Cמ -
(Sigma) C l . welchiiא ו מ -
(Makor) B» cereusב ר י כ ו ז של 2מ ״ ג /מ ״ ל ע ב ר ט י פ ו ל מ ו ק ד ם של ח י מ ו ם
ת
נ
Aמ-
ל
ו
ו
י
ת
(Worthington) Crotalus adamenteus
0
1
ב ר י כ ו ז של 1מ ״ ג /מ ״ ל
לא ע ב ר ט י פ ו ל מ י ו ח ד .התכשיר ה ק ר ו מ י מ A. laidlawii -
פ ו ס פ ו ל י פ זC(200
ב C37° -למשך 15
מ י ק ר ו ג ר ם ( א ו עם פ ו ם פ ו ל י פ זA(100
דקותפעילות
)
הפרדתם ב צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה
פעילות
0
.
3
.
פוםפוליפז
ה ו ד ג ר עם
מיקרוגרם(,
NADHא ו ק ם י ד ז נ ב ד ק ה ב ת ע ר ו ב ת ה ה ד ג ר ה
,
xg
40,000
דקות(
ה א ו ק ם י ד ז נ ב ד ק ה כ מ ת ו א ר ב פ ר ק ,3.9ע ל י ד י מעקב א ח ר ה י ר י ד ה
-4
ב-
340
n mע ם הוספת
תוצאות
NADH
ב ר י כ ו ז של M
2xl0־ l־
ב ד י ק ת ה פ ע י ל ו ת של תכשיר ק ר ו מ י מ A. laidlawii -ב ח י מ צ ו ו
NADHלאחר ט י פ ו ל ב פ ו ס פ ו ל י פ ז ו ת מ ת ו א ר ב צ י ו ר . 11
78
ן
1
ה
1
1
1
1
1
1
1
1
o Membranes
° Phospholipase A treated membranes
• Phospholipase C treated membranes
& Soluble fraction
A Soluble fraction
A Insoluble fraction
»Insoluble traction
l
l
1
l
2
l
3
י ד י- ע לNADH
בפוספוליפזות
I
I
I
I
I
1
4 5
time (min)
2
מעקב ט פ ק ט ר ו פ ו ט ו מ ט ר י אחר ח י מ צ ו ן
אשר ט ו פ ל ו
:11
ציור
A. l a i d l a w i i - מ מ ב ר נ ו ת מ
: מייל( ה כ י ל ה3) ה ר י א ק צ י ה ל ב ד י ק ה ה ס פ ק ט ר ו פ ו ט ו מ ט ר י ת
מ ת מ י ס ת מ ו צ אNADH מ י ק ר ו ל י ט ר10 ; ( מ ״ ג ח ל ב ו ו0.4)
;pH7.4 ־
I
תערובת
תכשיר ק ר ו מ י
2
10mM T r i s - H C l ; 25mM NaCl ; 3 6 x l 0 ־M של
ב ת ע ר ו ב תNADH ה ר י כ ו ז ה ס ו פ י של
I
3 4 5
time (min)
o
״m M Mercaptoethanol
-4
o l x l 0 M־2 ה ר י א ק צ י ה ה י ה
79
ה פ ע י ל ו ת ה ס פ צ י פ י ת של ה ת כ ש י ר ה ק ר ו מ י ב ת נ א י ם אלה נ מ צ א ה
0.42מ י ק ר ו מ ו ל י מ /ד ק ה /מ ״ ג ח ל ב ו ן .ה פ ע י ל ו ת ה ס פ צ י פ י ת של ה ת כ ש י ר ה ק ר ו מ י
שעבר ט י פ ו ל על י ד י פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת ושל ה ת ס נ י ן של התכשיו
המטופל
מ ו צ ג ו ת ב ט ב ל ה .11
טבלה :11
המסת
NADH oxidase
על י ד י הפעלת פ ו ס פ ו ל י פ ז Aו(:-
על ממברנת A. laidlawii
Phospholipase C
Phpspholipase A
ymole NADH/
% of ymole NADH/
% of
min/mg
initial
min/mg
initial
protein
activi ty
protein
activity
84
0.354
78.5
0.33
78
0.33
74
0.31
Enzyme
treated
membrane
preparation
Supernatant
התנאים לבדיקת ה פ ע י ל ו ת של NADHא ו ק ם י ד ז ה י ו כמפורט בהסבר
ל צ י ו ר .11ה פ ע י ל ו ת חושבה מן החלק ה ל י נ א ר י של ה ר י א ק צ י ה ,ד ה י י נ ו
בדקה הראשונה אחרי הוספת .NADHה פ ע י ל ו ת הספציפית מבוטאת
כ ymole NADH -אשר התחמצנו בדקה על י ד י 1מ״ג של ח ל ב ו ן .
של התכשיר הקרומי היתר.
חלבון
0.42
.ymole/min/mg
ב ת ס נ י ן היה 0.36-0.37מ״ג .
תוצאות ה נ ס י ו ן של ש י נ ו י מבוקר בתכשיר הקרומי על י ד י הפעלת
פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת מצביעות על מ ס ק נ ו ת הבאות:
א(
כתוצאה מ ש נ ו י י ם ב פ ו ם פ ו ל י פ י ד י ם של הקרום נגרמה א י נ א ק ט י ב צ י ה
מועטת של פ ע י ל ו ת ה א ו ק ס י ד ז ,בשיעור של .15-20%ר ז י ו ו ק ב ו צ ת ו
מצאו גם כן כ י אפשר להרחיק את ר ו ב ה ל י פ י ד י ם הממברנלים
מהפרקציה המכילה NADHא ו ק ס י ד ז על עמודת G-200
ב נ ו כ ח ו ת דטרגנט ולקבל ע ד י י ו פ ע י ל ו ת נ י כ ר ת ). (27
Sephadex
80
ב(
ה ש י נ ו י י ם ב ל י פ י ד י ם של הקרום גרמו להופעת הפעילות
40,000
האוקםידטיבית ב ח ל ק י ק י ם שאינם שוקעים ב -
g
x
.במשקע
נמצאו רק עקבות פ ע י ל ו ת . > 5% ,ב ב י ק ו ר ת של תכשיר קרומי שהודגר
במקביל בתנאים ז ה י ם ,בהעדר פ ו ם פ ו ל י פ ז ,לא אבדה פ ע י ל ו ת ו כ ן לא
היה שחרור של פ ע י ל ו ת א ו ק ס י ד ז ל ת ס נ י ן .אי ל כ ך א י ן ל ה נ י ח שהמםת
ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת היא תוצאה של פרגמנטציה של הממברנה בתנאי
ההדגרה.
( J i n k s (48אשר ק י ב ל NADH
ד ה י ד ר ו ג נ ז "מסים" ב מ י צ ו י א ת נ ו ל י
של ממברנת A. laidlawiiהראה כ י פ ע י ל ו ת ז ו עשירה ב ג ל י ק ו ל י פ י ד י ם
) (30-40%ולכן קשה לקבלה בצורה מםיסה .מ י צ ו י ה ל י פ י ד י ם בדרך ז ו
גרם להריסת פ ע י ל ו ת האוקםידז עם חמצן מ ו ל ק ו ל ר י כאקםפטור ,ומאידך
ל נ י ק ו י של ה ד ה י ד ר ו ג נ ז שהוא כנראה חלק מקומפלכם ה NADH -א ו ק ס י ד ז .
NADHא ו ק ס י ד ז "מסים" מ ו פ י ע בנפה ה פ נ ו י של עמודת ,Sephadex G-200
ממצא המעיד על האופי האגרגטיבי של א נ ז י ם זה ).(27
ה פ ע י ל ו ת הספציפית של התכשיר הקרומי הבלתי מטופל שמצאתי דומה
ל פ ע י ל ו ת שמצא ( L a r r a g a(123בתכשיר שהוכן מתרבית בת 18שעות.
מ ע נ י ן כ י ה פ ע י ל ו ת עולה פ י 10עם עלית ג י ל התאים ,ממצא שלא הוסבר
על ידם.
4.8.2
השפעת המסה סלקטיבית של הממברנה
על פ ע י ל ו ת
באמצעות דטרגנט
לא י ו ג י
NADH oxidase
הדטרגנטים הלא י ו נ י ם
שפעילותם בהמסת הממברנה חלשה י ו ת ר מאשר
הדטרגנטים ה י ו נ י י ם ,נמצאו מתאימים י ו ת ר להמסה מבוקרת ובלתי
ד נ ט ו ר ט י ב י ת של הממברנה .במקרים אחדים קבלו בדרך ז ו קומפלכםים
ל י פ ו פ ר ו ט א י נ י ם אשר שמרו על פ ע י ל ו ת א נ ז י מ ט י ת ) .(128בחנתי את
י ע י ל ו ת הדטרגנט Tween 20בהמסת תכשיר ממברנלי שהוכן ^ , A . l a i d l a w i i
81
על ידי בדיקה של חלבונים ופוםפוליפידים אשר שוחררו לתמיסה לעומת
אלה שנשארו קשורים לממברנה אחרי הטיפול בדטרגנט .בדקתי את מיקום
ה NADH oxidase -אם בפרקציה המסיסה או הבלתי מםיסה לאחר הטיפול,
והשוויתי את הפעילות האנזימטית של הממברנה שטופלה בדטרגנט
לפעילות הממברנה המקורית בתנאי pHשונים וכן תגובה למעכבים.
4.8.2.1
מיצוי של חלבונים ופוספוליפידים מממברנת
A, laidlawiiעל ידי Tween 20
המסת הממברנה נעשתה על ידי הוספת נפח אחד של בופר 3
Atlas chemie GMBH, E s s e n
)
Tween5%
(Germanyלנפח אחד של תכשיר ממברנלי ) 7.5מ״ג חלבון ב 1 -מייל(.
אחרי 60דקות בטמפרטורת החדר םורכזה התערובת משך 30דקות
ב-
40,000
xg
״ פעילות
NADH oxidaseנבדקה בתערובת
האינקובציה ,במשקע אשר הורחף בבופר 8לנפח ההתחלתי ןבתםנין,
כמתואר בפרק . 3 . 9חלבון נקבע בשיטת Lowry־ פוספט אורגני
נקבע כמתואר בפרק , 3 . 8עם -6גליצרופוםפט כסטנדרט .פיזור
הפעילות האנזימטית ,חלבון ופוםפט בתערובת ההדגרה ,משקע ותסנין
מתוארים בטבלה . 1 2יש לציין כי הממברנות איבדו כתוצאה מהטיפול
בדטרגנט את הצבע הצהוב של הקרוטנואידים ופלבין ,אשר הופיע
בתסנין.
82
טבלה
המסה של מ מ ב ר נ ת A. laidlawiiב Tween 20 -
:12
וההשפעה ע ל פ ע י ל ו ת
NADH oxidase
specific
total
activity protein activity phosphate
ymole/mg ymole
AOD/min
mg
protein
3.6
0.288
7.5
2.4
membrane
preparation
1.2
0.518
5.4
2.8
Tween
treated
membrane
insoluble
fraction
-
-
-
0.06
solubilized
material
ספקטרופוטומטרי
פ ע י ל ו ת NADHא ו ק ס י ד ז נ ב ד ק ה ב א ו פ ו
ב ת ע ר ו ב ת ר י א ק צ י ה אשר ה כ י ל ה א ת ה מ ר כ י ב י ם ה ב א י ם נ ב 3 -מייל(:
ת כ ש י ר ק ר ו מ י ) 0.75מ ״ ג ח ל ב ו ו ( א ו ת כ ש י ר ל א ח ר ה ט י פ ו ל
ב ד ט ר ג נ ט } 0.27מ ״ ג ח ל ב ו ו ( ; 10מ י ק ר ו ל י ט ר NADHמ ת מ י ס ת
2
xlO«63
10m־ Mמוצאש ר י כ ו ז ה
ב 0.5 -״ . 7mM Mercaptoethanol ;pH4ה ר י כ ו ז ה ס ו פ י טל
-4
NADHב ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ה י ה M
.1,2x10
חושבה מ ו החלק ה ל י נ א ר י של ה ר י א ק צ י ה .
מבןטאת
חלבוו
המהירות ההתחלתית
הפעילות הספציפית
כ מ י ק ר ו מ ו ל י ם NADHאשר ה ת ח מ צ נ ו בדקה ע ל י ד י 1מ ״ ג
קרומי.
ה ת ו צ א ו ת ה מ ס ו כ מ ו ת בטבלה 12מ צ ב י ע ו ת ע ל ה מ ס ק נ ו ת ה ב א ו ת :
א.
כ ת ו צ א ה מ ו ה א י נ ט ר א ק צ י ה ב י ו ה ד ט ר ג נ ט Tween 20ל ת כ ש י ר
ה ק ר ו מ י ל א התרחשה א י נ א ק ט י ב צ י ה של ה פ ע י ל ו ת ה א ו ק ם י ד ט י ב י ת .
ה י ת ה ע ל י ת מה ב כ ל ל פ ע י ל ו ת ה ת כ ש י ר .
ב.
ה ט י פ ו ל ב ד ט ר ג נ ט ג ר ם ל מ י צ ו י ס ל ק ט י ב י של ח ל ב ו נ י ם
׳ופוספוליפידים.
ב ת כ ש י ר ה ק ר ו מ י לאחר ה מ י צ ו י נ מ צ א ו 73%מ ה ח ל ב ו ו
ו ־ 33%מ ה פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם ,ב ה ש ו ו א ה ל ת כ ש י ר ה מ ק ו ר י .ה י ח ס ח ל ב ו ו :
83
ל י פ י ד השתנה
ג.
מ 2:1 -ל ,4.5:1 -כלומר העשרה נ י כ ר ת ב ח ל ב ו ן .
עקב ה מ י צ ו י הסלקטיבי עלתה הפעילות ה א ו ק ס י ד ט י ב י ת הספציפית
של התכשיר הקרומי פ י . 1.8
ד.
פ ע י ל ו ת ה NADH -א ו ק ס י ד ז נמצאה ממוקמת באופן בלעדי בפרקציה
של הממברנה המטופלת בדטרגנט אשר הושקעה ב-
4.8.2.2
אלקטרופוריזה ב-
40,000
.
xg
SDS-Polyacrylamide gelשל תכשיר
ק ר ו מ י לאחר מ י צ ו י ב -
Tween 20
האם ההרחקה הסלקטיבית של ל י פ י ד י ם לעומת ח ל ב ו נ י ם ו ש י נ ו י
היחס ח ל ב ו ן :ל י פ י ד ,כ פ י שהראינו בפרק הקודם ,השפיעה על א ר ג ו ן
ה ח ל ב ו נ י ם בממברנה? על שאלה ז ו נ י ס י נ ו ל ע נ ו ת על י ד י בדיקה
א ל ק ט ר ו פ ו ר י ט י ת של ח ל ב ו נ י הממברנה לאחר מ י צ ו י ב -
Tween 20
בהשוואה לממברנה המקורית .ה א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה נעשתה כמתואר בפרק ,3.10
ב ג ל י ם של 7.5%אקרילאמיד ה מ כ י ל י ם
7,2pHהמכיל
ב-
1%
0,1%
. S D Sההרצה היתה בבופר פוספט
S D Sד ג י מ ו ת מתכשיר ק ר ו מ י ,תכשיר ק ר ו מ י שטופל.
Tween 20ו ת ס נ י ן של תכשיר זה -נמהלו 1:10בבופר פוספט
,7pH M0.075,המכיל 2 S D S 1 0 %
־
ו ־ -מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל .ד נ ט ו ר צ י ה של
ת נעשתה ב־ C100°־ 90משך 3ד ק ו ת ד ו ג מ א ו ת המכילות
.
50
מ י ק ר ו ג ר ם חלבון הושמו על הגל אשר ב צ י נ ו ר י ת .א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה בוצעה
בטמפרטורת החדר משך כ 3 -שעות ,עד אשר הצבע ב ר ו מ ו פ נ ו ל -כ ח ו ל המסמן
את ח ז י ת ה נ ד י ד ה ה ג י ע למרחק של כ 2 -מ״מ מקצה ה צ י נ ו ר י ת ,בתנאים
שלmA8ל ג ל )30זאת לאחר פ ר א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה של
פרםולפט(.
עם
דקות ל ס י ל ו ק א מ ו נ י ו ם
צביעת ה ג ל י ם ,לאחר פיקסציה במתנול-חומצת חומץ ,נעשתה
,Coomassie blue
84
ג
ציור :12
א
ב
אלקטרופוריזר .של ח ל ב ו נ י ממברנת A. laidlawii
לפני
ואחרי ט י פ ו ל ב -
Tween 20
)א(
תכשיר ק ר ו מ י ; )ב( תכשיר קרומי לאחר ט י פ ו ל בדטרגנט;
)ג(
ת ס נ י ן של התכשיר הקרומי המטופל.
תמונת האלקטרופוריזה של ח ל ב ו נ י הקרום לאחר מ י צ ו י בדטרגנט
)ב( מראה הבדלים בהשוואה לתכשיר הקרומי המקורי )א( -פסים מס2 .
) נ מ ו ך מ ו ל ק ו ל ר י ( ומם) 9 .גבה מ ו ל ק ו ל ר י ( חסרים; במקום פסים מם3 .
ו 4 -מ ו פ י ע פס אחד שמרחק נ ד י ד ת ו הוא ב י ו שני פסים אלה .ב ת ס נ י ן
)40,000
g
( של התכשיר המטופל בדטרגנט ה ו פ י ע ו שני פסים גבה
x
מולקולרים.
שקיבלו
תמונת ה א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה של התכשיר הקרומי דומה לתמונה
Hjerten
ו ( J o h a n s s o n(129-המסקנה היא שנוסף על מ י צ ו י
חלק מהחלבוו הממברנלי .ל ת ס נ י ו ,גרם הדטרגנט ל ש י נ ו י מהותי במבנה
הקרום אשר התבטא ב נ ד י ד ה שונה של חלק מ ה פ ו ל י פ פ ט י ד י ם .
85
ע י כ ו ב ו ר י א ק ט י ב צ י ה טל פ ע י ל ו ת
4.8.2.3
שטופלה ב -
המיצוי
לשינוי
ב א ר ג ו ן שארית מ ר כ י ב י ה מ מ ב ר נ ה ,
ב י ט ו י לכך גם בשוני
הבדלים
בהשוואה לממברנה ר ג י ל ה
ה ס ל ק ט י ב י של ה ק ר ו ם ו ש י נ ו י י ח ם ה ח ל ב ו ן :ל י פ י ד ג ו ר מ י ם
מהותי
האוקסידז
,Tween 20
NADH oxidaseב מ מ ב ר נ ה
י ת כ ן א י פ ו א שימצא
ב ת כ ו נ ו ת של ה א נ ז י ם ה ק ש ו ר .
ב ח נ ת י על כ ן האם
ה ק ש ו ר ל מ מ ב ר נ ה ,שמוצו מ מ נ ה ח ל ב ו נ י ם ו ל י פ י ד י ם ,מראה
ב ר ג י ש ו ת ל מ ע כ ב י ם ב ה ש ו ו א ה ל מ מ ב ר נ ה ה מ ק ו ר י ת .למטרה ז ו
בריאגנט המגיב באופן
השתמשתי
ו ר ב ר ס י ב ל י עם ק ב ו צ ו ת -SH
ספציפי
ב ח ל ב ו נ י ם .p-Chloromercuriphenyl sulfonate (PCMBS) (Sigma) -
פעילות
מהלך
NADH oxidaseב נ ו כ ח ו ת
PCMBSנ ב ד ק ה כ מ ת ו א ר ב פ ר ק .3.9
ה ע י כ ו ב עם PCMBSשל מ מ ב ר נ ה שמוצתה ב ד ט ר ג נ ט ל ע ו מ ת תכשיר
ממברנת
ר ג י ל מתואר ב צ י ו ר . 1 3
התוצאות
המובאות ב צ י ו ר זה מראות כ י
ב נ ו כ ח ו ת PCMBSב ר י כ ו ז
-4
שלM0xl3״-95%מ ו ש ג ע י כ ו ב מ י י ד י טל למעלה
האוקםידז.
הפעילות
ב ר י כ ו ז ה נ מ ו ך י ו ת ר טל
4
l־66xlC. M
מ8
של פ ע י ל ו ת
אין
ע י כ ו ב של
ה א ו ק ס י ד ט י ב י ת . .מ י ד ת ה ע י כ ו ב של ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת
ד ו מ ה הן ב ת כ ש י ר מ מ ב ר נ ל י ר ג י ל ו ה ן ל א ח ר מ י צ ו י ו ב ד ט ר ג נ ט
,Tween 20מה שמראה על ר ג י ש ו ת ד ו מ ה של ה א נ ז י ם ב ש נ י ה ת כ ש י ר י ם
למעכב.
ר י א ק ט י ב צ י ה של ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת ,ה מ ע ו כ ב ת על י ד י ,PCMBS
נ ב ד ק ה בשתי ד ר כ י ם :
א( על י ד י ה ד ג ר ה מ ו ק ד מ ת של ת כ ש י ר מ מ ב ר נ ל י ר ג י ל א ו תכשיר
שטופל
ב ד ט ר ג נ ט ,במשך 1 0ד ק ו ת ב ט מ פ ר ט ו ר ת ה ח ד ר ,עם
B-Mercaptoethanolב ר י כ ו ז ס ו פ י של .5mMלאחר מ כ ן
פעילות
ה א ו ק ם י ד ז טל ש נ י התכשירים.
נבדקה
86
ב( על ידי הוספת מרקפטואתנול לתערוכת ריאקציה המכילה
NADHותכשיר ממברנלי המעוכב על ידי .PCMBS
1
1
1
1
1
ן
ן
ו
1
ו
Membranes
-3
^1.66x10
membranes
M
8.3x10
T w e e n 20 treated
•
Tween
x
mernb.+PCMB
M
-4
1.66x10 M
8.3»I0
0
x Membranes • P C M B
Membrones-fPCMB
•
;*Membranes• P C M B
1.0,
K
-n
1
1
*
M
o
וד־י־**ץ
\
\
\
•
o
גיro
V
°
Q
O
\
0 5
1
1
1
1
1
1
1
1
)time (min
ציור :13
פעילות NADHאוקסידז הקשור לממברנת
,A. laidlawiiבנוכחות PCMBS
תערובת הריאקציה בקיווטה הכילה :בופר Tris-HCl 50mM
ב ;pH7 6 -כמות אקויולנטית של תכשיר ממברנלי שטופל
0
ב Tween 20 -או של תכשיר ממברנלי רגיל; PCMBSבריכוזים
שונים .התחלת הריאקציה על ידי הוספת NADHלריכוז סופי
של M־3xlO־
4
87
תוצאות נםיונות הריאקטיבציה מסוכמים בציור .14
1
ו1
r
T
1
o - Tween 20 treated membranes
• - Tween 20 treated membranes• ME
T
o - Membranes
)Membrane$«PCMB(3.3xl0' M
4
a-
• - Membranes• ME
0.6
(•ME
I
\
0.4
o
6
•
•
\
J
L
5
4
ציור
:14
\
I
2
3
0.2
\
I
I
1
I
5
I
4
2
3
1
)time (min
ריאקטיבציה של NADHאוקסידז ממברנלי עם
Mercaptoethanol
בדיקת פעילות האוקסידז נעשתה כמתואר בהסבר לציור ,13
4־
ריכוז NADHבתערובת הריאקציה היה o l 8xl0 M
־
הנסיונות מראים כי תכשיר ממברנות רגיל ,בהעדר מרקפטואתנול,
אינו מראה את מלוא פעילותו בהימצוו .NADHאם פעילות התכשיר היתה
, D0min 0A / 1 2הרי בנוכחות מרקפטואתנול הגיעה הפעילות
־
,
Q34
0 42/min
o
q
5
תוספת מרקפטואתנול לתכשיר לפני הריאקציה עם
.
. 3
NADHאו במהלכה,
כאשר הפעילות מעוכבת על ידי , PCMBSתוצאתה שווה דהיינו
אקטיבציה של הפעילות האוקםידטיבית לערך מירבי דומה.
לעומת זאת ,תכשיר ממברנלי לאחר מיצוי חלק מהחלבונים והליפידים
מראה פעילות אוקסידטיבית מירבית גם בהעדר מרקפטואתנול ,פעילות
88
ה ג ב ו ה ה פ י 1.3ב ה ש ו ו א ה ל ת כ ש י ר ה מ מ ב ר נ ו ת ה מ ק ו ר י .
מ ס ק נ ו ת ה נ ם י ו נ ו ת ה מ ו ב א י ם ל ע י ל מ צ ב י ע י ם על מ ע ו ר ב ו ת ש ו נ ה
של ק ב ו צ ו ת SHב ה ת ב ט א ו ת ה מ י ר ב י ת של ה א ו ק ס י ד ז ה מ מ ב ר נ ל י .ח ל ק
מ ק ב ו צ ו ת ה SH -ה מ ע ו ר ב ו ת ב כ 70% -מ ה פ ע י ל ו ת של ה א ו ק ס י ד ז ,ר ג י ש
ל ח מ צ ן ה א ו י ר ו ל כ ן פ ע י ל ו ת ז ו ב א ה ל י ד י ב י ט ו י מ ל א רק ב נ ו כ ח ו ת
מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל .שאר ק ב ו צ ו ת ה SH -אשר א י נ ן ר ג י ש ו ת ל ח מ צ ן ה א ו י ר
נ ת נ ו ת ל ע י כ ו ב ע ל י ד י .PCMBSה ר ג י ש ו ת ה ש ו נ ה של ה א ו ק ס י ד ז ל ח מ צ ן
ו ל PCMBS -מ ר מ ז ת ע ל מ י ק ו ם א ו מ י ד ת ח ט י פ ה ט ו נ י ם של ק ב ו צ ו ת SH
בתכטיר הקרומי.
א י ב ו ד ה ר ג י ש ו ת טל ה א ו ק ס י ד ז ל מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל ב ת כ ט י ר ט מ ו צ ו
מ מ נ ו ח ל ב ו נ י ם ו ל י פ י ד י ם מראה על התרחשות ש י נ ו י י ם בלתי ה פ י כ י ם
ב מ ב נ ה ה ק ר ו ם .נ י ת ן לשער כ י ע ק ב ה ו צ א ת ח ל ב ו נ י ם ו ל י פ י ד י ם
מהממברנה חל ש י נ ו י ב א ר ג ו ן שארית ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם ה פ ר ק צ י ה
ה ב ל ת י מ ס י ט ה ,ה מ ש פ י ע על י י צ ו ב ק ב ו צ ו ת ה SH -ה ח י ו נ י ו ת ל פ ע י ל ו ת
ה א נ ז י מ ט י ת .נ ם י ו נ ו ת אלה א י נ ם מ ו כ י ח י ם אם מ ע ו ר ב ו ת ק ב ו צ ו ת
ה SH -ה י נ ה מ י ב נ י ת ,ד ה י י נ ו ק ב ו צ ו ת ה SH -ב מ צ ב ה מ ח ו ז ר ד ר ו ש ו ת
ל י י צ ו ב מ ב נ ה ה ק ר ו ם ה מ ב ו ד ד .י ת כ ן ג ם כ י ק ב ו צ ו ת SHדרושות באופן
יטיר לתהליך הקטליטי בקיטור הםובםטרט או ב מ נ ג נ ו ן החימצון.
4.8.2.4ה ט פ ע ת ט י פ ו ל ב ד ט ר ג נ ט
א ו ק ס י ד ז ה מ מ נ ר נ ל י ב ת נ א י pHט ו נ י ם
ה ר א י נ ו כ י מ י צ ו י ס ל ק ט י ב י של ח ל ב ו נ י ם ו ל י פ י ד י ם מהקרום
מ ש פ י ע ע ל פ ע י ל ו ת NADHא ו ק ם י ד ז ,ב כ ך ש מ ש ת נ ה ה ס ב י ב ה הקרובה טל
ק ב ו צ ו ת ה SH -ה ח י ו נ י ו ת ל פ ע י ל ו ת ו ה ר ג י ש ו ת ל ע י כ ו ב על י ד י PCMBS״
ב ד ק ת י ב א ם ה ש י נ ו י בcroenvironment-יווה ,ע ק ב א ר ג ו ן מ ח ד ש של
ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם בקרום לאחר ה מ י צ ו י ,בא ל י ד י ב י ט ו י גם
Tween -20על פ ע י ל ו ת NADH
89
בתכונה אחרת של ה א נ ז י ם -פ ע י ל ו ת בתנאי pHט ו נ י ם .לשם כך בחנתי
פ ע י ל ו ת של תכשיר ק ר ו מ י ,ל פ נ י ואחרי מ י צ ו י עם ,Tween -20
בחימצון NADHבשיטה המתוארת בפרק .3.9תוצאות הבדיקות מסוכמות
ב צ י ו ר 15ובטבלה . 13
ו
ו
ו
ו
1
Tween treated membranes pH 76ם
l
l l l
3
4
5
)time (min
צ י ו ר :15
J
1 2
מעקב ספקטרופוטומטרי אחר פ ע י ל ו ת NADHא ו ק ם י ד ז של תכשיר
קרומי לאחר מ י צ ו י ב Tween -ושל תכשיר ק ר ו מ י ר ג י ל ,בתנאי
pHט ו נ י ם
תערובת הריאקציה ב ק י ו ו ט ה )נפח ס ו פ י 3מייל( הכילה 0.05 :מייל תכשיר
קרומי ) 370מ י ק ר ו ג ר ם ח ל ב ו ן ( או 0.1מייל תכשיר קרומי לאחר מ י צ ו י כמתואר
-4
חלבון N A D H ; ( 4 . 8 . 2 . 1 )270ל ר י כ ו ז ס ו פ י של; M 1 0x3
5״-6ל p H M mTris-HClאו בופר ו ר ו נ ל. 5 0 ^806pH7
5הכופרים ה כ י ל ו מרקפטואתנול ב ר י כ ו ז ס ו פ י mM
a
M
m
ש
נ
י
90
ה כ ל ל י ת ו ה פ ע י ל ו ת ה ס פ צ י פ י ת אשר ח ו ש ב ו מ צ י ו ר ,15
הפעילות
בטבלה .13
נתונים
:13
טבלה
ה ש ו ו א ת ה פ ע י ל ו ת ה א ו ק ם י ד ט י ב י ת של ת כ ש י ר ק ר ו מ י
ל א ח ר מ י צ ו י ו ת כ ש י ר ק ר ו מ י ר ג י ל ,ב ת נ א י pHט ו נ י ם
pH 7.6
pH 8.6
specific
specific
total
total
activity
activity
activity
activity
ymole/min/mg
ymole/min/mg
pmole/min
ymole/min
protein
protein
0.24
0.09
0.81
0.30
Membrane
preparation
2.04
0.55
1.63
0.44
Tween
treated
membrane
preparation
ה מ ס ו כ מ ו ת ב ט ב ל ה ז ו מ ר א ו ת על א ק ט י ב צ י ה של ה פ ע י ל ו ת
התוצאות
האוקםידטיבית
בממברנה שמוצו ממנה חלק מ ה ח ל ב ו נ י ם ו ה ל י פ י ד י ם
על י ד י ה ד ט ר ג נ ט
ה כ ל ל י ת א ל א ג ם ב ת ז ו ז ה טל מ י ר ב ה פ ע י ל ו ת ל ע ר כ י pH
בפעילות
גבוהים
pH
.Tween
ה ש י נ ו י ב ק ר ו ם מתבטא לא רק ב ע ל י ה
יותר.
ה פ ע י ל ו ת ה מ י ר ב י ת של התכשיר ה ק ר ו מ י ה מ ק ו ר י ה י א
כ
ו ב 6 - 7־ p Hנ מ צ א ו רק
לעומת זאת,
8
30% -מ ה פ ע י ל ו ת ה מ י ר ב י ת .
ה פ ע י ל ו ת ה א ו ק ם י ד ט י ב י ת של התכשיר ה ק ר ו מ י הממוצה
ה י א מ י ר ב י ת ב pH6 -״ 8ו א י ל ו ב 7,,pH6 -נ מ צ א ו 75%מ ה פ ע י ל ו ת
המירבית.
האנזים,
ת ו פ ע ה ז ו מ ר מ ז ת על ש י נ ו י י ם ב ס ב י ב ה ה מ ק ו מ י ת טל
ה י כ ו ל י ם להתבטא ב ר י כ ו ז מ ק ו מ י ט ו נ ה של פ ר ו ט ו נ י ם א ו
סובסטרט,
ואשר כ נ ר א ה נ ג ר מ ו כ ת ו צ א ה מ ה א ר ג ו ו מחדש טל ט א ר י ת
החלבונים
בפרקציה הבלתי מםיסה לאחר מ י צ ו י חלק מ ה ח ל ב ו נ י ם
והליפידים
מהקדום.
91
4.8.3
ס י מ ו ן ז י ק ה של החלבון הפעיל בחימצון NADHבממברנת
A. laidlawii
לסימון זיקה
נםיון
) (Affinity labelingטל מול!.ולת)ות(
החלבון בעלת ה פ ע י ל ו ת בחימצון NADHהממוקמת בקרום טל A. laidlawii
נעטר• על סמך נ ס י ו נ ו ת מוקדמים טל בדיקת הטפעת NAD
ו ,NADH -
המחומצנים בקבוצות H0 '3ו '2 -טל ט י י ר ה ר י ב ו ז ,על פ ע י ל ו ת הקרום
בחימצון .NADHב ד ק נ ו גם את ח י ו נ י ו ת ן טל ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת חפטיות
ל פ ע י ל ו ת NADHא ו ק ם י ד ז על י ד י מ ו ד י פ י ק צ י ה טל תכטיר קרומי עם
ר י א ג נ ט י ם הפועלים על ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת ,כמו
Dansyl chloride,
.Succinic anhydrideמצאנו כ י ט נ י ה ר י א ג נ ט י ם ה ל ל ו ,ב ר י כ ו ז טל
mM5ו ב -
, 9 . 5 p H 7 . 6א י נ ם מטפיעים כלל על פ ע י ל ו ת
או
הקרומי.
אוקסידזNADH
נראה כי ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת ב ח ל ב ו נ י הקרום ז מ י נ ו ת להתמדה מבלי
ל פ ג ו ע ב פ ע י ל ו ת ה א ו ק ס י ד ט י ב י ת ,בתנאי ט ה ט י נ ו י א י נ ו באתר הפעיל.
חימצון
ה פ י ר י ד י ן נ ו ק ל י א ו ט י ד י ם נעשה ל פ י { G i l h a m(130אשר תאר
ק י ט ו ר של נ ו ק ל י א ו ז י ד י ם ,נ ו ק ל י א ו ט י ד י ם ו ח ו מ צ ו ת נ ו ק ל י א י ו ת
ל-
.Aminoethyl celluloseהצימוד נעשה על י ד ו בשלושה שלבים -
חימצון ק ב ו צ ו ת ה ה י ד ר ו ק ס י ל ׳ - 3׳ 2של שייר ה ר י ב ו ז על י ד י פ ר י ו ד ט ,
יצירת בסים שיף ) (Schiff baseעם א מ י נ ו א ת י ל צ ל ו ל ו ז ו ל ב ס ו ף ח י ז ו ר
בסיס שיף עם נתרן ב ו ר ו ה י ד ר י ד .ב ע י ק ר ו ן של שיטה ז ו השתמשנו ל ס י מ ו ן
הזיקה של ה NADH -א ו ק ס י ד ז עם הםובסטרט המותמר ל ד י -א ל ד ה י ד Lamed .
ו ח ב ר י ו ) (131הטתמטו כ נ ג ז ר ו ת א ל ד ה י ד י ו ת טל נ ו ק ל י א ו ט י ד די ו ט ר י -
פ ו ס פ ט י ם ל ק י ט ו ר ם לעמודת
Agarose hydrazideלצורך הכנת עמודות
ז י ק ה להפרדת ד ה י ד ר ו ג נ ז ו ת המטתמטות ב פ י ר י ד י ן נ ו ק ל י א ו ט י ד י ם
כקופקטורים.
92
4.8.3.1
NADHלתמיסת
או
הכנת פ י ר י ד י ן
NAD
(10
נוקליאוטידים מחומצנים
) m Mב כ ו פ רMTris-HCl0005
ב ,pH7«6 -ה ו ס ף ס ו ד י ו ם מ ט ה פ ר י ו ד ט ל ר י כ ו ז ס ו פ י של .lOmM
תערובת הריאקציה הודגרה ב -
0 °משך שעה
-340nmב
א
0
ח
ת
7
.ה ב ל י ע ה של
C
2
ת ו פ ש י אפשר ל ז ה ו ת על י ד י ב ל י ע הבnm-232
»0 I
*= 6
4
"(E
ו ל ס ל ק ו על י ד י ה ע ב ר ת
ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה על ע מ ו ד ת . ( D o w e x(132-50ל פ י י ח ס י ה ב ל י ע ה
לתמיםות,
שעה ,ב ה ש ו ו א ה
הריאקציה232nm
של ת ע ר ו ב ת
של ר י א ג נ ט י ה מ ו צ א ,ל א נשאר "^ 10ח ו פ ש י .
המחומצנים
4.8.3.2
הפירידין
נוקלאוטידים
נשמרו ב -20°C -״
השפעת פ י ר י ד י ן
נ ו ק ל י א ו ט י ד י ס מ ח ו מ צ נ י ם על פ ע י ל ו ת
NADHא ו ק ס י ד ז
NAD
נבדקו
קרומי
ו NADH -ד י -א ל ד ה י ד ,אשר ה ו כ נ ו כ מ ת ו א ר ב ס ע י ף ה ק ו ר ם ,
כ מ ע כ ב י ם של פ ע י ל ו ת NADHא ו ק ס י ד ז על י ד י ה ו ס פ ת ם ל ת כ ש י ר
ב ב ו פ ר 0.05M Tris-HCl
מרקפטואתנול(
ב pH7.6 -
ל ר י כ ו ז ס ו פ י של mM4״-2
.
) ה מ כ י ל 10mM
lה פ ע י ל ו ת האוקםידטיבית
של התכשיר ה ק ר ו מ י נ ב ד ק ה כ ל פ י m M )NADH13״ ( 0
בפרק
ב -שוו340,כמתואר
. 3.9ב מ ה ל ך ה ר י א ק צ י ה שנמשכה כ ־ 5ד ק ו ת נמצא כ י NAD
ד י -א ל ד ה י ד מ ע כ ב את ה פ ע י ל ו ת ב כ ,20-30% -ב ע ו ד שNADH -
די-אלדהיד
4.8.3.3
ג ו ר ם ל ע י כ ו ב מלא של פ ע י ל ו ת NADHא ו ק ם י ד ז .
א י נ ט ר א ק צ י ה ב י ן NADH
ריאקצית
קרומי
)
מ״ג
ה צ י מ ו ד ב י ו NADH
א ל ד ה י ד לתכשיר ק ר ו מ י
א ל ד ה י ד ) 2 y m o l e־ ( 7ל ב י ן תכשיר
ח ל ב ו ן ( 0 . 7נעשתה ב 0 -״ ) 9pHנ ת ר ן
(M0.1
ביקרבונט
ת ו ך א י נ ק ו ב צ י ה ב ט מ פ ר ט ו ר ת החדר משך 90דקותכבקורת.
שמש פ ר פ ר ט מ מ ב ר נ ו ת ש ה ו ד ג ר ב ב י ק ר ב ו נ ט ב א ו ת ם ת נ א י ם .עם ת ו ם
93
נ ל ק ח ו ד ו ג מ א ו ת מכל פרפרט לבדיקת פ ע י ל ו ת
הריאקציה
NADH oxidaseב -5״ 7«1M) pH0ב ו פ ר פ ו ס פ ט mM10,מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל ( .
פ ר פ ר ט ה מ מ ב ר נ ו ת ש ה ו ד ג ר ב נ ו כ ח ו ת ב י ק ר ב ו נ ט ב ל ב ד הראה פ ע י ל ו ת
אלדהיד
/min
min/0.015AOD
מ ה פ ע י ל ו תהמקורית6%כלומררק
בנםיון
.
,
ל י י צ ב את בסים ש י ף ,ש נ ו צ ר כ נ ר א ה ב א י נ ט ר א ק צ י ה ב י ן
ק ב ו צ ת ה א ל ד ה י ד של ה ר י א ג נ ט ו ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת ב מ מ ב ר נ ה ,ע ם נ ת ר ן
ב ו ר ו ה י ד ר י ד -הסתבר כ י נ ת ר ן
גדולים
ב ו ר ו ה י ד ר י ד עצמו ג ו ר ם ל ש י נ ו י י ם
ב מ מ ב ר נ ה -נ ו ס ף ל א י נ א ק ט י ב צ י ה של פ ע י ל ו ת הNADH -
oxidaseנ ג ר ם כ נ ר א ה ג ם נ ז ק ל ק ר ו ט נ ו א י ד י ם ו ה פ ל ב י נ י ם שכן
הממברנה מאבדת את צ ב ע ה ה צ ה ו ב ה ט י פ ו ס י .
ע ל מ נ ת ל ב ו ד ד ו ל א פ י י ן את ה ח ל ב ו ן א ו ה ח ל ב ו נ י ם ש ״ ס ו מ נ ו "
ב NADH -א ל ד ה י ד נ י ס י נ ו ש י ט ו ת ש ו נ ו ת :
גל
א( א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה ב SDS -פ ו ל י א ק ר י ל א מ י ד
מ מ ב ר נ ו ת ש ט ו פ ל ו ב NADH -א ל ד ה י ד נ ש ט פ ו ,ת ו ך שמירה ע ל
9~pHו ט ו פ ל ו ב ב ו פ ר המסה המתאים ל א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה )(3.10.פרק
טרופוריזה
נעשתה ב ג ל י ם של
אקרילאמיד
ב נ ו כ ח ו תSDS1%.'0
ב
״הפרדת ה ח ל ב ו נ י ם ה מ מ ב ר נ ל י י ם ל א הראתה
ת מ ו נ ה ב ר ו ר ה אך ה ב ח נ ו
הארת ה ג ל
הראתה
%
5
.
7
-
2־7pH
ב ב ר ו ר בפס פ ל ו א ו ר ם צ נ ט י י ר ק ר ק אחר
ב מ נ ו ר ת UV״ צ ב י ע ת ג ל מ ק ב י ל עם
Coomassie blue
נ ו כ ח ו ת ח ל ב ו ן ג ב ה מ ו ל ק ו ל ר י )מעל 1 4 0 , 0 0 0ל פ י
נדידת
סמן 3ג ל ק ט ו ז י ד ז ( ,בראשית ה ג ל ב א ז ו ר ה מ ק ב י ל ל ה ו פ ע ת הפס
הפלואורםצנטי.
נוצרו
כ נ ר א ה שכתוצאה מ ה ט י פ ו ל עם NADHא ל ד ה י ד
א ג ר ג ט י ם של ק ו מ פ ו נ נ ט ו ת מ מ ב ר נ ל י ו ת שלא נ פ ר ד ו ב ,,SDS -
94
ב.
ה פ ר ד ה של ת כ ש י ר ק ר ו מ י מ ס ו מ ן ב NADH -ר י -א ל ד ה י ר על
B4Sepharose
עמודת
תכשיר ק ר ן מ י
(Triton x
בנוכחות
) 0.5מ ״ ג ח ל ב ו ן (
( 1 0 0 - 3 %
3מייל . ( V o i d volume
100-Tritonx״
ה מ כ י ל NADHק ש ו ר ,ה ו מ ם
ו ה ו ש ם על ע מ ו ד ת 4Bם פ ר ו ז ) 15x0.9ם״מ;
ה א ל ו צ י ה היתר ,עם ב ו פ ר 3מ ה ו ל 1:20ה מ כ י ל
Triton x-100ב ר י כ ו ז ס ו פ י של .0.16%
באוסף
פ ר ק צ י ו ת ()LKB
ממברנות
ציור
ב-
ה ב ל י ע ה ב mM260 -ו כ ן
חלבון לפי
ת ו צ א ו ת ה ה פ ר ד ה ה מ ו ב א ו ת ב צ י ו ר 16מ ר א ו ת ח פ י פ ה ר ב ה על
Lowry״
עצמו.
ונקבעה בהן
פ ר ק צ י ו ת של 0.6מייל נ א ס פ ו
הביקורת,
מ מ ב ר נ ו ת מ ט ו פ ל ו ת ב NADH -א ל ד ה י ד ו ה ר י א ג נ ט
שיטה ז ו ל א נמצאה מ ת א י מ ה ל ה פ ר ד ה ה מ ב ו ק ש ת .
:16
ה פ ר ד ה של ת כ ש י ר ק ר ו מ י מ ס ו מ ן ב NADH -א ל ד ה י ד ו מ ו מ ם
100-Tritonxע ל ע מ ו ד ת ,B4Sephorose
ב נ ו כ ח ו ת הדטרגנט
95
ג.
הפרדה של תכשיר קרומי מסומן ב NADH -אלדהיד על עמודת
B4Sepharoseב נ ו כ ח ו ת
58
BRIJ
58BRIJכמו Triton x-100ה י נ ם ד ט ר ג נ ט י ם לא יוניםנגזרות,
של Glycol
,Polyoxyethyleneכאשר BRIJ 58ה י נ ו Cetyl Alcohol
ו א י ל ו Triton x-100ה י נ ו
ב-
.Octylphenolיש ב י נ י ה ם הבדל
,Critical micelle concentrationו כ ן נמצאו בעלי י ע י ל ו ת
שונה בהמסת ממברנות ובעלי השפעה שונה על פ ע י ל ו י ו ת א נ ז י מ ט י ו ת .
תכשיר
2% BRIJ
קרומי מסומן ב NADH -
5 8ה ה פ ר ד ה נעשתה על עמודת ס פ ר ו ז B4} 26x1.3ס״מ,
23םמ״ק
0.16%
אלדהיד } 0.5מיע ח ל ב י ו ( הומס
BRIJ
,(void volumeא ל ו צ י ה עם בופר 6מהול 1:20המכיל
.נאספו פ ר ק צ י ו ת של 1.1מייל ונקבעה בהן הבליעה
ב - n m 2 6 0 -ו 2 8 0־ לדטרגנט עצמו א י ן בליעה בתחום זה ) ב נ י ג ו ד
ל x100- -
Tritonשיש ל ו בליעה נ י כ ר ת ב (nm280 -״ יחסי הבליעה
280/260ל ג ב י חמרי המוצא נקבעו בנפרד ונמצאו
על העמודה(NADH :
אלדהיד
) ב ר י כ ו ז י ם שהושמו
אלדהיד ;0.28ממברנות מותמרות ב NADH -
;0.5ממברנות לא מ ט ו פ ל ו ת .1.14תוצאות ההפרדה של פרפרט
הממברנות המותמר עם NADHאלדהיד מ ו ב א ו ת ב צ י ו ר .17
התמונה מראה הפרדה ב י ן הממברנות שעברו מ ו ד י פ י ק צ י ה ל ב י ו עודף
ה ר י א ג נ ט שלא נקשר ,ה מ ו פ י ע ב -
.Void volumeב נ ס י ו נ ו ת לקבל
את החלבון הממברנלי המסומן ב NADH -חופשי מדטרגנט על י ד י
ד י א ל י ז ה של הפרקציות המתאימות שעברו א ל ו צ י ה מהעמודה כ נ ג ד ב ו פ ר
התקבלו א ג ר ג ט י ם בלתי מ ס י ס י ם ששקעו בשקית ה ד י א ל י ז ה .
96
ז
104
)
)
OX - NADH treated membranes
!reeled membranes
־
OX - NADH
ציור :17
ב-
-
m
m
NADH
n
n
0
0
oxidized
6
8
2
2
הפרדה של תכשיר קרומי מסומן כ-
Brij
58
(
(
NADH
•
»
אלדהיד ומומם
על עמודת ,B4Sepharoseכנוכחות הדטרגנט
תוצאות נםיוו םימוו תזיקר .של NADH
די-אלדהיד מצביעות על
-ם
אוקסידז הקרומי באמצעות NADH
המסקנות הבאותNADH :
די-אלדחיד בניגוד ל!AD! -
1
די-אלדהיד מעכב את הפעילות האוקםידטיבית באופו מוחלט ומתאים לשמש כמעכב
זיקה .קישור הנוקליאוטיד המותמר לקרום ,כפי שנראה בנםיוו האלקטרופוריזה
בנוכחות ,SDSגרם לשינוי במצב החלבונים בקרום ולהופעת אגרגטים גבה
מולקולרים .הריאגנט בהיותו בי-פונקציונלי יתכו וגרם לצילוב של שרשרות
פוליפפטידיות שמבחינה מבנית מצויות בקרבה רבה אך אינו שייכות לאותה
מולקולת חלבוו .התכשיר הקרומי המותמר ב NADH -די-אלדהיד נתו להמסה
על ידי הדטרגנטים Triton x-100
ו Brij 58 -״ העובדה שהפרקציה המכילה
97
את ה NADH -הקשור היא גבה מ ו ל ק ו ל ר י ת באה ל י ד י ב י ט ו י בהופעתה
volume
-void
B4
ב נ ו כ ח ו תTritonx.58100-Brij
נמצא מתאים י ו ת ר להפרדת הפרקציה ה ח ל ב ו נ י ת המסומנת ,אך כל ה נ ם י ו נ ו ת ל נ ק ו ת
את החלבון המסומן שיצא מהעמודה ב נ ו כ ח ו ת הדטרגנט על י ד י ד י א ל י ז ה -לא ע ל ו .
אי לכך נ מ נ ע המשך ה א י פ י ו ן של הקרום המותמר על י ד י מעכב ה ז י ק ה .
98
.5
די ן ן
מסכם
בחלקה הראשון של עבודה זו זיהיתי ואיפיינתי פעילות ארילאמידז ופפטידז
•Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma fermentans
בשני מיני מיקופלסמה,
הארילאמידז הוא אנזים המפרק -5נפתילאמידים של _-1חומצות אמיניות לחומצה
האמינית ו-6 -נפתילאמין ,והינו מוכר בחיידקים באנזים תוך-תאי ). (137
תפקידו הפיסיולוגי העיקרי כנראה בםינתיזה ודגרדציה של פוליפפטידים ,אם כי
לא ברור מהו הםובסטרט הטבעי של אנזים זה .ב Pseudomonas -מצאו כי הפעילות
היא מירבית כאשר התאים בפזה הלוגריתמית ויורדת בפזה הקבועה.
המאפיין את הארילאמידז של שני מיני המיקופלםמה ,כפי שהראיתי ,היותו
אנזים קשור לקרום התא .תאים שלמים ,מורחפים בבופר איזוטוני ,מפרקים את
הסובסטרט הנפתילאמידי .עם שבירת התא התקבלה הפעילות האמידטית באופן בלעדי
יה השוקעת ב-
g
40,000
x
,מהירות בה ניתן להשקיע את הממברנה של
מיקופלםמה .הפעילות האמידטית של התכשיר הקרומי לא היתר ,יציבה ודעכה
במהירות ,גם ב , C0° -עם זמן מחצית חיים של כ -שעות .2.5הניצולת הנמוכה
ואי היציבות של האמידז בתכשיר הקרומי ,גם בנוכחות מרקפטואתנול ,מעידים
על המעורבות של האנזים במבנה הממברנה ואולי אף על אפשרות של קשר
פונקציונלי עם מרכיבים אחרים בקרום.
שני מיני המיקופלםמה השונים נבדלו גם בספציפיות לגבי פרוק
הנפתילאמידים של חומצות אמיניות שונות.
M. fermentansהראה אפיניות
גבוהה ביותר בביקוע היסטידיל נפתילאמיד בעוד ש A. laidlawii -היה פעיל
ביותר כלפי אלניל נפתילאמיד .הוצע להשתמש בספציפיות של הארילאמידז כאמצעי
למיון של חיידקים
).(138
נמצא למשל כי ניתן להבדיל בין
Leptospirae
פתוגניים לבלתי פתוגניים על סמך נוכחות הארילאמידז בזנים הפתוגניים בלבד
).(139
וחבריו
מיון מיקופלסמה על פי פעילות אנזימטית הוצעה כבר על ידי בירגר
).(140
חוקרים אלה הראו גם כן פעילות נפתילאמידז של תאי מיקופלםמה
99
ממינים שונים ,מורחפים בתמיסת מלח ,אך ה 0השתמשו בשיטה קולורימטרית
שהרגישות שלה נמוכה וכן לא הגדירו את הספציפיות של המינים השונים לחומצות
האמיניות השונות .השיטה הפלואורימטרית בה השתמשתי לבדיקת פעילות
דז הינה פי 1000
יותר רגישה וניתן לזהות באמצעותה
005
nmole
של
נפתילאמין.
הארילאמידז של מיקופלםמה ,בדומה לארילאמידז הבקטריאלי ,הינו
אמינופפטידז כלומר דורש לפעילותו קבוצה גו-אמינית חופשית .בניגוד
לארילאמידזות טל בעלי חיים ) (141,142הדורשים יוני
מתכת דו-ערכית
לפעילותם ,הארילאמידזות בחיידקים אינם תלויים במתכות .גם הארילאמידז של
מיקופלםמה אינו דורש יוני
ומאידך תוספת או העדר יוני
מתכת; טיפול ב EDTA -אינו גורם לאינאקטיבציה
מגנזיום או סידן בבופר הריאקציה אינה משפיעה
על מהירות ההידרוליזה .לקבוצת ה-6 -נפתילאמין יש כנראה חשיבות ביצירת
הקומפלכס אנזים-סובסטרט היות ומצאתי כי פירוק תרכובת ק-ניטרואניליד של
אלנין הרבה יותר איטי בהשוואה לנפתילאמיד.
כמו בחיידקים ,לא ברור מהו הםובסטרט הטבעי עליו פועל הארילאמידז של
המיקופלסמה אך מיקומו בקרום התא יכול להעיד על תפקידים נוספים מלבד
ביוסינתיזה ודגרדציה של חלבונים ,למשל בניצול חומצות אמיגיות מפפטידים
במדיום .הממצא שפעילות היסטידיל נפתילאמידז וכן כושר ההחדרה של היםטידין
ב M. fermentans -מעוכבים במידה דומה על ידי טיפול בתאים ביודואצטט,
יכול לתמוך בכוון מחשבה על קשר פונקציונלי בין הארילאמידז למערכת ההחדרה
טל החומצה האמינית הספציפית .כמו כן יש מקום לבדוק את הספציפיות של
הארילאמידז טל מיני מיקופלסמה נוספים בטיטה הפלואורימטרית הרגיטה ,כדי
להפוך טיטה זו לעזר במיון הטקס ו נ ומי .טל מיקופלםמה.
על קשר הדוק בין מבנה הממברנה ופעילות הארילאמידז הקשור בה ,מראה
הממצא טל אקטיבצית הפעילות האמידטית על ידי ריכוזים עולים של מלח ובעיקר
100
עם K״ האקטיבציה המשמעותית המושגת בריכוז גבוה למדי של מלח ,כאשר
+
התאים עדיין יציבים מבחינה אוסמוטית ,ניתן להסבירה כתוצאה של מיסוך
מטענים שליליים על פני הממברנה ,בעיקר של הקבוצות הפולריות של
פוספוליפידים .מיסוך זה יגרום לארגון הדוק יותר ,דהיינו לעיבוי של
ה bilayer -הליפידי .שינוי בארגון השכבה הליפידית ישפיע מאידך על ארגןן
החלבונים הבאים במגע עם הליפידים ויכול להתבטא בשינויים בפעילויות של
חלבונים אלה ,למשל בפעילות הקטליטית.
מאידך ,טיפול בתאים באנזימים כמו טריפםין ופוספוליפז Cלא גרם
לאינאקטיבציה משמעותית של פעילות הארילאמידז .עובדה זו ניתנת להסבר אם
האנזים טמון במידה מסויימת בשכבת הממברנה ,או אם שטח פני הממברנה ממוסך
על ידי מולקולות שאינן חלבונים או פוספוליפידים ,כמו הפולימר המורכב
מיחידות הקםוזאמין שנמצא קשור באופן רופף לתאי . A. laidlawii
בדקתי את פעילות התאים השלמים בפירוק קשרים אמידיים בפפטידים .אכן
נמצא כי שני מיני המיקופלםמה שנבדקו מגלים פעילות של אמינופפטידז,
המתבטאת בביקוע הדרגתי מן השייר ה^ -טרמינלי .פעילות הפפטידז ,בדומה
לאמידז ,דורשת כי הקבוצה ה-0 -אמינית של השייר ה^ -טרמינלי תהיה חופשית.
תאים שלמים פרקו פפטידים המכילים מ 2-ועד 9חומצות אמיניות .ספציפיות
הפפטידז נמצאה דומה לזו של הארילאמידז .דהיינו,
M. fermentans
מבקע פפטידים של היסטידין והחומצות האמיניות הבסיסיות ,ואילו
נמצא
A.laidlawii
פעיל בעיקר בביקוע פפטידים המכילים אלנין כשייר הN -־טרמינלי.הפפטידז של
laidlawii״ Aהראה סטראוספציפיות מוגדרת ועל מנת לבקע את הקשר האמידי
ה^! -טרמינלי דרוש רצף של שיירי אלנין מהסוג LLD״ שייר ם־אלנין בסמוך
לקשר הפפטידי ה -N -טרמינלי מונע פעילות הפפטידז .מהדמיון בספציפיות
לחומצות אמיניות ותחום ה pH -האופטימלי ,וכן אי היציבות עם שבירת התא,
יש להניח כי שתי הפעילויות -הארילאמידז והפפטידז קשורות באותו חלבון או
101
ממברנלי.
קומפלכס
ה מ י י ח ד את ה פ פ ט י ד ז ט ל מ י ק ו פ ל ס מ ה ,כ פ י ש ה ר א נ ו ה ו א ה מ י ק ו ם ב ק ר ו ם התא.
ממברנלי
אנזים
י כ ו ל ל ה י ו ת מ מ ו ק ם ב ע ב ר ה צ י ט ו פ ל ם מ ט י של ה ק ר ו ם א ו ב ע ב ר
ה ח י צ ו נ י הבא ב מ ג ע עם ה מ ד י ו ם .
על פ ע י ל ו ת ו
ת ח ד י ר ו ת תאי
מ י ק ו ם ז ה ט ל ה א נ ז י ם ב ק ר ו ם יש ל ו ה ש ל כ ו ת
ה פ י ס י ו ל ו ג י ת .כ ד י ל ע נ ו ת על טאלה ז ו ל ג ב י מ י ק ו ם ה פ פ ט י ד ז ב ד ק נ ו
.
laidlawii
A
.
14
ל א ל נ י ן ק ב י ע ת התחלקות א ל נ י ו מםומו ב ,(C ) -
לעומת חומר גבה מ ו ל ק ו ל ר י ט א י נ ו חודר לתא כ א י נ ו ל י ו המםומו ב ,(H) -
הנפח
בין
ה ת ו ך ת א י ל נ פ ח ה ב י ו ת א י הראתה כ י ת א י ם ה מ ו ר ח פ י ם ב ת מ י ס ת מלח
איזוטונית
ריכזו
א י נ ם מחדירים א ל נ י ו .לעומת ז א ת ,תאים המורחפים במדיום ה ג י ד ו ל
אלניו
ב ת ו ך ה ת א ,א ם כ י ב מ י ד ה מ ו ע ט ת .ה ע ו ב ד ה טתאי
A. laidlawii
טלמים מפרקים פ פ ט י ד י ם ה מ כ י ל י ם עד 9ט י י ר י א ל נ י ו באותם ת נ א י ם בהם א ל נ י ו
חודר לתא ,מעידה כ י מ י ק ו מ ו טל ה א נ ז י ם ה ו א בעברו
אינו
תמיכה
ה ח י צ ו נ י טל ה ק ר ו ם .
נ ו ס פ ת ל מ י ק ו ם ה ח י צ ו נ י ט ל ה א נ ז י ם ה מ מ ב ר נ ל י ה ז ה באה מהממצא טהתקבל
בהשוואת
שלמים.
פ ר ו פ י ל ה pH -ט ל ה א ר י ל א מ י ד ז ב ת כ ט י ר ק ר ו מ י
ה א נ ז י ם בשני המצבים ה ג י ב ב א ו ת ו א ו פ ו
ובתאי
M. fermentans
ל ש י נ ו י ה pH -ב מ ד י ו ם ,
דהיינו,
ה א נ ז י ם בתא השלם ו ה א נ ז י ם ב ק ר ו ם ה מ ב ו ד ד מ צ ו י י ם ב ס ב י ב ה א ל ק ט ר ו ס ט ט י ת ד ו מ ה
ל א ו ת ו pH״
וחשופים
אם כ י ה פ פ ט י ד ז ב ר גישה ל מ ד י ו ם ה ח י צ ו נ י ,ה ו א א י נ ו חשוף ל ג מ ר י ע ל שטח
פ נ י ה ק ר ו ם .ז א ת ל מ ד נ ו מ מ ה י ר ו ת ה ת ג ו ב ה ט ל ה פ פ ט י ד ז עם א ל נ י ו
אורך
פפטידים בעלי
ע ו ל ה מ ד י -פ פ ט י ד ו ע ד פ פ ט י ד ט ל תשעה ש י י ר י ם .מצאתי כ י ב פ ר ק ז מ ו של
30ד ק ו ת ,
ד י -פ פ ט י ד התפרק ל ג מ ר י ב ע ו ד ט מ ט ר י -פ פ ט י ד התפרק ר ק 60%טל ה א ל נ י ו
ה-^ -טרמינלי
ו מ ה נ ו נ -פ פ ט י ד התפרק 40%א ל נ י ו .ת ל ו ת מ י ד ת ה ה י ד ר ו ל י ז ה ב א ו ר ך
הפפטיד
י כ ו ל ה ל ה י ו ת ה ת ב ט א ו ת טל ה ד י פ ו ז י ה ט ל ה פ פ ט י ד אל ה א נ ז י ם ה מ צ ו י ב ע ו מ ק
מםויים
ב מ מ ב ר נ ה .מ א י ד ך י י ת כ ו כ י אתר ה ק י ט ו ר טל ה א נ ז י ם מ ת א י ם ב א ו פ ו
אופטימלי
ל ד י -פ פ ט י ד ו ה ק י ט ו ר טל פ פ ט י ד י ם א ר ו כ י ם י ו ת ר פ ח ו ת י ע י ל .
102
ה פ ע י ל ו ת של ב י ק ו ע ק ש ר י ם פ פ ט י ד י י ם מ ו ג ב ל ת ל א ו ל י ג ו פ פ ט י ד י ם ב ל ב ד ,שכן
M. fermentans
תאי
כםובםטרטים
ו A. laidlawii -ל א ג י ל ו פ ע י ל ו ת פ ר ו ט א ו ל י ט י ת .
ל ב ד י ק ת פ ע י ל ו ת פ ר ו ט א ו ל י ט י ת ) (143השתמשתי ב ק ז א י ן
של א י נ ס ו ל י ן ו כ ן
.
לא ה ת ג ל ה פ י ר ו ק ל ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת הן
בפולי
והמוגלובין
- 1ל י ז י ן )(m360״
בתגובה קולורימטרית והן
בבדיקה
כרומטוגרפית.
מיקום
)(144
ה פ פ ט י ד ז של מ י ק ו ל פ ם מ ה ב ק ר ו ם ה ת א ,ב ד ו מ ה ל ת א י ם א א ו ק ר י ו ט י ם
שונה מ פ ר ו ק ר י ו ט י ם .
ב ח י י ד ק י ם נמצאו
) (80,83א ו ק ש ו ר י ם ל ר י ב ו ז ו מ י ם ).(145
הבקטריאליות,
פפטידים
בתהליכי
פפטידזות בעיקר בציטופלסמה
ה מ י ק ו ם ה ת ו ך ת א י של ה פ פ ט י ד ז ו ת
ו ה י ו ת ם א נ ז י מ י ם ק ו נ ס ט י ט ו ב י י ם אשר רמתם א י נ ה מ ו ש פ ע ת מ ת ו ס פ ת
ל מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל -ת כ ו נ ו ת אלה מ ע י ד ו ת על תפקיד א נ ז י מ י ם אלה ב ע י ק ר
פירוק
מיקופלםמה
ו ב נ י ה של פ ו ל י פ פ ט י ד י ם ב ת ו ך ה ת א .
לעומת זאת,
ה פ פ ט י ד ז של
הממוקם ב ק ר ו ם י כ ו ל לתפקד ב נ י צ ו ל פ פ ט י ד י ם מ ה מ ר י ו ם לאספקת ח ו מ צ ו ת
והתחלקות התאים.
אמיניות
הדרושות ל ג י ד ו ל
מוגבלת.
A. laidlawiiלמשל,
ה י כ ו ל ת ה ב י ו ס י נ ט ט י ת של מ י ק ו פ ל ס מ ה
ת ל ו י באספקת ר ו ב ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ,מלבד
חומצה
א ס פ ר ט י ת ו ג ל ו ט מ י ת ה נ ט מ ע ו ת ר ק ב צ ו ר ת ה א מ י ד י ם ).(146
הורכב
ע ב ו ר מ ס פ ר מ י נ י מ ק ו פ ל ס מ ה ו א כ ו ל פ ל ס מ ה ו נ ר א ה כ י הדרישה ה י א ל כ 13-17 -
חומצות
אמיניות.
מדיום מוגדר
ה י ד ר ן ל י ז ט ח ל ב ן ן ,ל א ח ר ד י א ל י ז ה י כ ו ל ל ס פ ק ל פ ח ו ת חלק
מ ה ח ו מ צ ו ת י ־ ׳ א מ י נ י ו ת ) ( R o d w e l l(147.(67הראה צ ו ר ך ב פ פ ט י ד ס פ צ י פ י
ה ג י ד ו ל של . Mycoplasma strain Y
במדיום
ג י ד ו ל תאים אלה ה י ה מהיר ב נ ו כ ח ו ת
ה ט ר י -פ פ ט י ד ^) ,(L-Alaפ ח ו ת מ ה י ר ב נ ו כ ח ו ת ה ח ו מ צ ה ה א מ י נ י ת ה ח ו פ ש י ת ו א י ט י
בהעדר החומצה ה א מ י נ י ת א ו ה פ פ ט י ד .
ב-
פחות
הצורך בפפטידים ל ג י ד ו ל מוכר גם בחידקים.
Lactobacillus delbrueckiiנמצא כ י
נ י צ ו ל חומצות א מ י נ י ו ת מסויימות
י ע י ל כאשר הן ב צ ו ר ה ח ו פ ש י ת ל ע ו מ ת ה פ פ ט י ד י ם ) .(148ל א ב ר ו ר באם
הדרישה של מ י ק ו פ ל ס מ ה ל פ פ ט י ד י ם ב מ ד י ו ם ה ג י ד ו ל ה י נ ה ס פ צ י פ י ת ,ל א נמצא קשר
ב י ן ה ה ר כ ב ו ה ר צ ף של ה פ פ ט י ד י ם אשר נ ב ד ק ו
)(147,149
לבין
יכולתם בזירוז
103
ה ג י ד ו ל .ב A. laidlawii -
אספקת
ג ל ו ט מ י ן ו Tween -80 -כ מ ק ו ר ל ח ו מ צ ה א ו ל א י ת ).(150
ניצול
מספקים
ביותר
ולכן
מ צ א ו כ י הדרישה ה ז ו
נ י ת נ ת להתמדה על י ד י
פפטידים מהמדיום והיותם מזרזי
גידול,
נ ו ב ע כנראה בהיותם
ב ב ת אחת כמה ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת .ה מ י ק ו פ ל ם מ ה ב א ו ר ג נ י ז מ י ם ה ק ט נ י ם
המסוגלים להתרבות באופן
א ו ט ו נ ו מ י ,ב ע ל י ג נ ו ם ק ט ן בהרבה מ E. coli -
ח ס ר י ם הרבה מ ה מ נ ג נ ו נ י ם ה ב י ו ס י נ ט ט י י ם ה מ ו כ ר י ם ב ח י י ד ק י ם ,
ב א מ צ ע ו ת ה פ פ ט י ד ז ב ק ר ו ם התא ל נ צ ל ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת ב א ו פ ן
יכולים
י ע י ל מהמדיום ללא
צ ו ר ך ל ה ח ד י ר את ה פ פ ט י ד י ם ל ת ו ך התא ד ר ך מ ע ר כ ו ת ט ר נ ס פ ו ר ט נ פ ר ד ו ת ) ה ק י י מ ו ת
)((85
בחיידקים
.
חלקה ה ט נ י ט ל ה ע ב ו ד ה ה ת ר כ ז ב א י פ י ן ן NADHא ו ק ס י ד ז ה פ ע י ל ב ה ע ב ר ת
א ל ק ט ר ו נ י ם מ NADH -
ב מ י ק ו פ ל ם מ ה NADH .
חלבון
לחמצן
ו ה י נ ו ה מ ר כ י ב ה ע י ק ר י טל טרטרת ה ח י מ צ ן ן
א ו ק ם י ד ז ה ק ט ו ר ל ק ר ו ם התא טלlaidlawii(151
.
A
( הוא
א י נ ט ר י נ ם י אטר נ י ת ן ל ה ר ח ק ה מ ה ק ד ו ם ר ק על י ד י ד ט ר ג נ ט י ם א ו מ מ י ס י ם
) ,(27,48א ך ל א על י ד י EDTAו ת מ י ס ה ה י פ ו ט ו נ י ת ).(152
אורגניים
הראיתי
כי ניתן
ב פ ר ק 4.8.1
ל ה ו צ י א את ה NADH -א ו ק ס י ד ז מ ה ק ד ו ם ל ת מ י ס ה
על י ד י ב ק י ע ה ס פ צ י פ י ת ט ל ט ו מ נ י ה ק ר ו ם ב א מ צ ע ו ת פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת .ל צ ו ר ך ז ה
השתמטתי
ב נ ו ס ף ל פ ו ם פ ו ל י פ ז ,Aט א י נ ו ת כ ט י ר מ נ ו ק ה ו מ כ י ל ב ד ר ך כ ל ל פ ע י ל ו ת
פ ר ו ט א ו ל י ט י ת ,ג ם ב פ ו ס פ ו ל י פ ז Cמ נ ו ק ה ו ח ו פ ט י מ פ ע י ל ו ת פ ר ו ט א ו ל י ט י ת .הפעלת
ט נ י ה א נ ז י מ י ם ,ב ע ל י ה ס פ צ י פ י ו ת ה ט ו נ ה ,על ת כ ט י ר ק ר ו מ י ט ה ו כ ן
מ ־ A. laidlawiiגרמה ל ת ו צ א ה ד ו מ ה -ט ח ר ו ר ר ו ב פ ע י ל ו ת NADHא ו ק ס י ד ז
דהיינו לתסנין
ע ל י ו ן טל
40,000
xg
,מבלי ל ג ר ו ם לאינאקטיבציה
מ ט מ ע ו ת י ת ט ל ה פ ע י ל ו ת NADH .ד ה י ד ר ו ג נ ז התקבל )(48
ב מ י צ ו י א ת נ ו ל י )(9%
ב ,C43° -מ ת כ ט י ר ק ר ו מ י טל . A. laidlawiiא י ט ק י ע ת ה א נ ז י ם ב -
xg100,000
נ ב ע מ ת כ ו ל ת ה ל י פ י ד ט ב ו ,טנמצאה כמחצית מכמות ה ח ל ב ו ן ,כ ל ו מ ר ב א ו ת ו יחם
כמו בממברנה המקורית.
ה א נ ז י ם א ט ר ה ו פ ק ב נ י צ ו ל ת ב י נ ו נ י ת ) ,(40%א י ב ד את
104
ה כ ו ש ר ל ה ג י ב עם ח מ צ ן .נ ר א ה כ י ה ת ס נ י ן ש ק י ב ל ת י ב ע ק ב ו ת הפעלת ה פ ו ס פ ו ל י פ ז ו ת
ואשר מ כ י ל את ה פ ע י ל ו ת ה א ו ק ס י ד ט י ב י ת עם חמצן כ א ק ם פ ט ו ר י כ ו ל לשמש כ ת כ ש י ר
מוצא מתאים ל נ י ק ו י
נ ו ס ף של ה א נ ז י ם ה מ כ י ל את ש נ י א ת ר י ה ת ג ו ב ה -הן עם
חמצן ו ה ן עם א ק ס פ ט ו ר י ם ם י נ ט ט י י ם כ פ ר י צ י א נ י ד .
השימוש ב ע י כ ו ל על י ד י
במספר מקרים כ מ ו ל ג ב י
דהידרוגנז
פ ו ם פ ו ל י פ ז ו ת ל ה ו צ א ת א נ ז י מ י ם מ ה ק ד ו ם נמצא מ ו ע י ל
- 6ה י ד ר ו ק ם י ב ו ט י ר ט ד ה י ד ר ו ג נ ז ) (103ו NADH -
ה א נ ז י ם ששימש למטרה ז ו ה י ה פ ו ם פ ו ל י פ ז A
מ י ט ו כ ו נ ד ר י א ל י ).(104
ה ל י פ ו ל י ט י ת ה י ש י ר ה משחרר ל י ז ו פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם
מארם נ ח ש י ם ,אשר ב נ ו ס ף ל פ ע י ל ו ת ו
ו ח ו מ צ ו ת ש ו מ נ י ו ת אשר ע ל ו ל י ם ל ה פ ר י ע את מ ב נ ה ה מ מ ב ר נ ה ב ה י ו ת ם ד מ ו י י
).(153
דטרגנטים
הנסיונות
א(
ה מ ס ו כ מ י ם ב פ ר ק 4.8.1מ צ ב י ע י ם ע ל שתי מ ס ק נ ו ת ע י ק ר י ו ת :
המצב ב ו ה א נ ז י ם NADH
א ו ק ם י ד ז קשור למבנה מ מ ב ר נ ל י מ א ו ר ג ן ,
אינו
ב ה כ ר ח ד ר ו ש ל ב י ט ו י פ ע י ל ו ת ו ה מ ח מ צ נ ת ,אשר נ ב ד ק ה עם חמצן כ א ק ם פ ט ו ר .
ו ה מ ע ב ר ל ת מ י ס ה פ ו ג ע ב פ ע י ל ו ת עם א ק ם פ ט ו ר י ם א ח ר י ם ,פ ע י ל ו ת
יתכן
א ו ק ם י ד ו -ר ד ו ק ט ז ,אשר מתרחשת כ נ ר א ה באתר נ פ ר ד ) .(154ג ם Larraga
ו ( R a z i n(123-ה ר א ו כ י NADH
בלעדי
הוכח
א ו ק ס י ד ז במיקופלםמה א י נ ו קשור באופן
ל מ ב נ ה ה ק ר ו מ י ו מ צ ו י ב צ י ט ו פ ל ס מ ה של
הדמיון
המולקולרי בין
, M. mycoidesאם כ י לא
ה א נ ז י מ י ם בשני ה מ י נ י ם ה ש ו נ י ם
). (M. mycoides, A.laidlawii
ב(
פ ג י ע ה ב פ ו ס פ ו ל י פ י ד י ם ה מ מ ב ר נ ל י י ם א י נ ה משפיעה על פ ע י ל ו ת ה NADH -
אוקסידז.
נאמן
ו ר ז י ו מצאו ג ם כ ן ) (102כ י
ליפידים אינם חיוניים
ל פ ע י ל ו ת ה NADH -א ו ק ס י ד ז של A. laidlawiiאשר ה ו פ ר ד מ ן ה ק ר ו ם ב נ ו כ ח ו ת
דטרגנט.
105
מצאתי ע נ י ו מיוחד ב א י פ י ו ן פ ע י ל ו ת האוקםידז situחיו בקרום ,ובבדיקת
השפעתם של ש י נ ו י י ם במבנה הקרום על התכונות של הפעילות האוקםידטיבית.
האנזים הקשור לקרום שנעשו ב ו ש י נ ו י י ם ב ר ר נ י י ם ,תוך הרחקת מרכיבים ש ו נ י ם ,
י כ ו ל לשמש מעין אלקטרודה טבעית רגישה ב י ו ת ר המדווחת על השפעת ה ש י נ ו י י ם
במבנה על פ ע י ל ו ת ו של האנזים .המסה מבוקרת של ממברנת ב י ו ל ו ג י ת אפשר להשיג
על י ד י שימוש בדטרגנטים לא י ו נ י י ם אשר בהיותם אמפיפיליים הם מתקשרים
ל ח ל ב ו נ י ם האינטירינםיים בממברנה שגם הם בעלי אופי אמפיפילי ) .(128ב ר ו ב
המקרים נשמרת הפעילות האנזימטית הקשורה לממברנה מאחר והדטרגבט הלא י ו נ י
א י נ ו גורם ל ש י נ ו י י קונפורמציה בלתי הפיכים או להפרדה של תת-יתידות ח ל ב ו ן .
דטרגנטים חלשים כמו Tween -20חינם סלקטיביים בפעולת ההמםה ה י ו ת וכמעט
אינם פועלים על א ז ו ר י ממברנה בהם יש אינטראקציות ח ל ב ו ו ־ ח ל ב ו ן Hierten .
ו ( J o h a n s s o n(129-השתמשו בדטרגנט זה להמסה מבוקרת של תכשיר קרומי
מA. laidlawii -
והראו באלקטרופוריזה כ י הרחקת החלבון הקרומי היתה
סלקטיבית .נאמו ) (102הראה שאפשר לתמים את הקרום של A. laidlawiiעל ידי
הדטרגנטים הלא י ו נ י י ם
Triton x -100ו Brij 58 -ולקבל את מלוא פעילות
NADHאוקסידז .ב נ ם י ו נ ו ת בהם השתמשתי ב 2 0 -־ Tweenלהמסה של הממברנה
)פרק (4.8.2הסתבר כי אכו נ י ת ן היה לקבל ש י נ ו י מבוקר של הקרום באופן שיחס
החלבון ל ל י פ י ד השתנה באופן משמעותי ל כ י ו ו ן של העשרה ב ח ל ב ו ו .ל ש י נ ו י זה
היתה השפעה על רגישות של ק ב ו צ ו ת SHה ח י ו נ י ו ת לפעילות של האנזים ו כ ן על
תלות הפעילות ב ־ .pHהחלבונים אשר נשארו בקרום המטופל נ ד ד ו בחלקם באופן
טונה באלקטרופוריזה ,בהשוואה ל ח ל ב ו נ י הקרום המקורי .ממצא זה מעיד על
התארגנות שונה בקרום -על אינטראקציות חדשות שלא ה י ו קיימות כאשר הקרום
היה עשיר בליפידים .תכשיר קרומי של A. laidlawii
מגלה מירב הפעילות
האוקסידטיבית ל ג ב י NADHרק ב נ ו כ ח ו ת ש־מרקפטואתנול בתערובת הריאקציה.
י ד ו ע כי א נ ז י מ י ם ממברנליים הדורשים קבוצות SHחופשיות לפעילותם רגישים
מאד לאינאקטיבציר .בעת ב י ד ו ד הקרום ,עקב חימצון על י ד י חמצו מ ו ל ק ו ל ר י .
106
מסתבר כי NADHאוקסידז שאכן מגלה רגישות כ ז ו בתכשיר קרומי מאבדה בקרום
אשר טופל ב Tween -״ יתכן ,כי הארגון מחדש של החלבונים אשר נשארו בקרום
שעבר מיצוי חלקי ,יוצר אפשרות לאינטראקציות אשר גורמים לייצוב קבוצות
הSH -
שנחשפו .הראינו גם רגישות שונה של NADHאוקםידז בקרום של
laidlawii״ Aלחמצן ו ל PCMBS -הניתנת להסבר במיקום או מידת חשיפה שונים
של קבוצות ה SH -בתכשיר הקרומי.
השפעות של ריאגנטי SHברמה התאית מתבטאות בתהליכים הקשורים בממברנה-
פעילות אנזימים ותהליכי טרנספורט .רוב הפעילויות הממוקמות בממברנה
והקשורות בחדירות הסלקטיבית ל י ו נ י ם
ולמטבוליטים ,אנזימי חימצון-חיזור
ואנזימים הקשורים במטבוליזם של שומנים וחלבונים ממברנלים -רובם מעוכבים
על ידי ריאגנטיSH(73
( .במערכת מורכבת כממברנה ב י ו ל ו ג י ת תלויה
הריאקטיביות של קבוצות ה SH -ב־
;microenvironmentבתרומה של קבוצות
מ י ו נ נ ו ת המצויות בסמיכות ובמידת החשיפה של החלבון לסביבה הידרופילית.
לא כל קבוצות ה SH -קשורות באופן ישיר לפעילותם הביולוגית של החלבונים
הממברנלים ,לחלקן יש גם תפקיד בייצוב המבנה של הממברנה .קבוצות SH
בממברנה יכולות להיות מעורבות בקשרי מימן ,קשרי ונדרוולם או אינטראקציות
הידרופוביות .נמצאה למשל עדות לאינטראקציה בין קבוצות SHשל חלבונים
לבין קשרים כפולים טל ליפידים בממברנות מיקרוםומליות
סלקטיבית של קבוצות SHעם המעכב PCMBנמצאה באלדולז
).(155
).(156
תגובה
חלק מהקבוצות
נמצא מגיב במהירות עם הריאגנט ,מעט מגיבים בצורה איטית ושאר הקבוצות
אינן מגיבות כלל אלא אם כן גורמים לדנטורציה של החלבון .דווקא הקבוצות
החשופות לתגובה מהירה עם המעכב אינן ח י ו נ י ו ת לפעילות האנזימטית ,אלא
הקבוצות המגיבות באיטיות .מצב דומה נמצא במערכת NADHדהידרוגנז;
NADH;Cyt Cרדוקטז ו NADH -אוקםידז
).(157
בעוד שפעילות האוקסידז
והרדוקטז רגישות ביותר ל־ PCMBהרי פעילות הדהידרוגנז בחיזור פריציאניד
אינה מושפעת .הוצע ששני סוגי קבוצות SH
משתתפות בחימצון - NADHס ו ג אחד
107
רגיש לריאגנט PCMBומצוי בין האתר הפעיל של הדהידרוגנז וקצה שרשרת
החימצון ,וסוג שני החבוי בקומפלכס הדהידרוגנז ונחשף רק בהתפרקו ל־ Cyt C
רדוקטז .נחיצות קבוצות SHלפעילות NADHאוקסידז ו NADH-DCPIP -אוקםידו-
סמה ,הראו גם
ורזיו
•123C)Larraga
השינוייח אשר התרחשו בקרום של A. laidlawiiבעקבות הטיפול בדטרגנט
,Tween -20באו לידי ביטוי גם בתזוזה של מירב הפעילות של NADHאוקסידז
לערכי pHגבוהים יותר בהשוואה לתכשיר הקרומי המקורי )פרק
.(4.8.2.4
ממצא זה מראה על הרגישות הרבה של אנזים ממברנלי לסביבתו הקרובה ,במקרה
זה השינוי בסביבה האלקטרוסטטית המקומית ,דהיינו שינוי בריכוז המקומי של
פרוטונים או םובםטרט מתבטא בתזוזה של מהירות התגובה האנזימטית המירבית
מ -״ 7pH5ל .8pH6» -תופעה דומה נחקרה ביסודיות לגבי אנזימים הקשורים
לפולימרים סינטטים ,אניוניים או קטיוניים ,ואכו נמצאה השפעה גדולה של
הסביבה האלקטרוםטטית בקרבת האתר הפעיל טל האנזים ,התלויה בסוג המטען
ובצפיפותו ).(158
הראיתי כי NADHאוקםידז הממברנלי טל A. laidlawiiאינו דורט ליפידים
לפעילותו וניתו להוצאה מו הקרום בעקבות פעולת פוםפוליפזות ,או מאידך
יכול לשמש כמרווח רגיש לטינויים מבניים בקרום אם הקרום ממוצה באופו
בררני והאנזים נשאר קשור .בשלב האחרוו של איפיוו ה־ NADHאוקםידז,
ניסיתי לאפיינו על ידי םימוו זיקה כאשר האנזים ,עדייו מהווה חלק מהקדום
ועל ידי כך לקבלו בצורה טבעית ושלמה ככל האפשר אחרי המסת הממברנה
בדטרגנט .פירידיו נוקליאוטידים מחומצנים קשורים לםפדקם או ספרוז שימשו
להפרדת זיקה של דהידרוגנזות
).(131
לאחר שמצאתי כי NADHמחומצו בקבוצות
הידרוקסי ' 2 ' - 3של שייר הריכוז ,משמש מעכב של האנזים בריכוז נמוך,
הוחלט להטתמש ב NADH -די-אלדהיד כמעכב זיקה אשר יתקשר לאתר הפעיל של
האוקסידז בקרום של . A. laidlawiiהתברר כי אכו התרחש קישור של
108
די-אלדהיד
ל ת כ ט י ר ק ר ו מ י טל , A. laidlawiiת ו ך ע י כ ו ב פ ע ו ל ת ה א ו ק ם י ד ז .
ה ס פ צ י פ י ו ת ט ל ה ק י ט ו ר נתמכה ב ע ו ב ד ה ט א נ ה י ד ר י ד ט ל ח ו מ צ ה ס ו ק צ י נ י ת ל א ע י כ ב
ק י ט ו ר ה ד י -א ל ד ה י ד התבטא ב ה ו פ ע ת פ ל ו א ו ר ם צ נ צ י ה
א ת פ ע י ל ו ת ה NADH -א ו ק ס י ד ז .
י ר ק ר ק ה ב SDS -ג ל א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה ,הקשורה ל ח ל ב ו ן ג ב ה מ ו ל ק ו ל ר י .
הדי-אלדהיד גרם לצילןב בין
היה
הספציפי
גם
חלבונים שונים ,וכן
קישור בלתי ס פ צ י פ י .
נראה כ י
נראה כ י בצד ק י ש ו ר ו
י ד ו ע מהספרות כ י אלקילציה מחזרת
של ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת ב ח ל ב ו נ י ם ,ה נ ע ש י ת על י ד י ר י א ק צ י ה עם א ל ד ה י ד י ם א ו
ב נ ו כ ח ו ת נתרן
קטיונים
החלבונים
ב ו ר ו ה י ד ר י ד ,א י נ ה גורמת ל ש י נ ו י מהותי במבנה
ה מ ו ת מ ר י ם ).(159
נ ס י ו ן ל ה פ ר י ד את ה ח ל ב ו ן ה ג ב ה מ ו ל ק ו ל ר י ה מ ס ו מ ן ,
ל א ח ר המסת ה מ מ ב ר נ ה ב ד ט ר ג נ ט ,על ע מ ו ד ת ס פ ר ו ז ב נ ו כ ח ו ת ד ט ר ג נ ט לא עלה י פ ה .
ז א ת ב ג ל ל ה א ו פ י ה א ג ר ג ט י ב י של ה ח ל ב ו ן א פ י ל ו
השימוש ב ש י ט ו ת ז י ק ה ל ז י ה ו י
אנלוגי
בנוכחות הדטרגנט.
ח ל ב ו נ י ם מ מ ב ר נ ל י י ם בעלי פ ע י ל ו ת ב י ו ל ו ג י ת
) (160עם כ ר ו מ ו פ ו ר ,
ל ס י מ ו ן אתר פ ע י ל של א נ ז י ם ב ת מ י ס ה ,
,spin-label
א ו ח ו מ ר ר ד י ו א ק ט י ב י ב ע ל א פ י נ י ו ת לאתר ה פ ע י ל .
נעשו
נ ס י ו נ ו ת לסמן את ה א ת ר י ם ה פ ע י ל י ם של ) ATPaseנ ת ר ן ,א ש ל ג ן (
3
ה מ מ ב ר נ ל י על י ד י ק י ש ו ר
כמעכבים
cardiac glycosidesמ ס ו מ נ י ם ב ,( H) -
ס פ צ י פ י י ם טל ה פ ע י ל ו ת ה א נ ז י מ ט י ת ושל ט ר נ ס פ ו ר ט האשלגן
ז ו ל א הצליהר .מאחר ו ה ת ק ב ל ס י מ ו ן על ר ק ע ב ל ת י ס פ צ י פ י
הבלתי
)(162
ספציפי התגברו בסימון
ובסימון
הידועים
).(161
גישה
ג ב ו ה .על ב ע י ת ה ס י מ ו ן
ז י ק ה טל אצטיל כ ו ל י ן אסטרז מ א ר י ת ר ו צ י ט י ם
ה ח ל ב ו ן ה מ ע ו ר ב ב ט ר נ ס פ ו ר ט ט ל - 5ג ל ק ט ו ז י ד י ם ב Eo coli -
ר י ו ו י הממברנה בחומר המסומן
) , (163על י ד י
ב נ ו כ ח ו ת מעכב ס פ צ י פ י
ובטלב
ש נ י ל א ח ר ס י ל ו ק המעכב התרחטה ת ג ו ב ה ס פ צ י פ י ת ב י ן המעכב ל א ת ר ה פ ע י ל .
יודואצטט
אדנילט
סימון
שהינו
ציקלז
ר י א ג נ ט ב ע ל ס פ צ י פ י ו ת ר ח ב ה ,שימש ל ס י מ ו ן
ס פ צ י פ י של
) ,(164בשיטה ד ו מ ה ת ו ך ה ג נ ה על האתר ה פ ע י ל ע ל י ד י
14
כ פ ו ל עם ) ( C
3
ו ( H) -
יודואצטט,
ב נ ו כ ח ו ת ובהעדר
גלוקגון.
ג ל ו ק ג ו ן ,איפשר
109
זיהוי
מ ר כ י ב של א ד נ י ל ט צ י ק ל ז ב SDS -ג ל א ל ק ט ר ו פ ו ר י ז ה כ פ ו ל י פ פ ט י ד בעל
משקל מ ו ל ק ו ל ר י . 240,000
ההסתייגות
ב ס י מ ו ן מ ר כ י ב י ם מ מ ב ר נ ל י י ם על י ד י
י צ י ר ת קשרים ק ו ו ל נ ט י ם
ה י א כ י ה ש י נ ו י ה כ י מ י של מ ו ל ק ו ל ה ס פ צ י פ י ת י כ ו ל ל ה ש פ י ע על מ ב נ ה המערכת
ה מ מ ב ר נ ל י ת המורכבת ולהתבטא ב א ו פ ן בלתי ס פ צ י פ י ב מ ר כ י ב י ם א ח ר י ם .
כדי
ל ו ו ד א שהחומר המסמן אכן ק ש ו ר ל ח ל ב ו ן ה ס פ צ י פ י ב ק ר ו ם יש צ ו ר ך
ל ה פ ר י ד את ה ח ל ב ו ן ה מ ס ו מ ן
ו ל א פ י י נ ו בצורה מסיםה.
מ ה מ מ ב ר נ ה שהומסה ב ד ט ר ג נ ט הם ב צ ו ר ה
של ק ו מ פ ל כ ס
ה ח ל ב ו נ י ם המשתחררים
חלבון-דטרגנט-ליפיד.
את מ י צ ל ו ת ה ל י פ י ד י ם אפשר ל ה פ ר י ד ב ש י ט ו ת פ י ל ט ר צ י ה על ע מ ו ד ו ת .מ א י ד ך ,
סילוק
הדטרגנט מהקומפלכס ח ל ב ו ן -ד ט ר ג נ ט ג ו ר ם בדרך כ ל ל ל א ג ר ג צ י ה ו ל ה ו ו צ ר ו ת
משקעים א מ ו ר פ י י ם נ .(160ת ו פ ע ת ה א ג ר ג צ י ה ה י א כ נ ר א ה ת ו צ א ה של ח ט י פ ת א ז ו ר י ם
ה י ד ר ו פ ו ב י י ם על ה ח ל ב ו ן ה א מ פ י פ י ל י .ל א ח ר ו נ ה ה צ ל י ח ו ל ק ב ל ג ל י ק ו פ ר ו ט א י ן
נגיפי
ח ו פ ש י מ ל י פ י ד ו ד ט ר ג נ ט על י ד י הפרדה ה ד ר ג ת י ת ב מ פ ל י ם ו כ ר ו ז .אך גם
ה ח ל ק י ק י ם שהתקבלו לא ה י ו מ ו נ ו מ ר י ם אלא א ו ק ט מ ר י ם ב ע ל י משקל מ ו ל ק ו ל ר י
של 900,000
). (128
110
REFERENCES
1.
K a t c h a l s k i , E . , Silman, I . and Goldman, R . , Adv. i n Enzymol. 3U,
kh$
(1971).
2.
Bulos, B. and Racker, E . , J . B i o l . Chem. 2h3, 3891 (1968).
3.
Baron, C. and Abrams, A . , J . B i o l . Chem. 2h6, 15h2 (1971).
h.
Fleischer,
S. , B r i e r l y , G. , Klouwer, H. and Slauterbach, D.B. ,
J . B i o l . Chem. 237,
326U (1962).
5.
R o t h f i e l d , L . and Pearlman, H . , J . B i o l . Chem. 2kl, 1386 (1966).
6.
Jones, P.D. and V a k i l , S . , J . B i o l . Chem. 2^2, 5267 (1967).
7•
Coleman, R . , Biochim. Biophys. Acta 300, 1 (1973).
8.
Racker, E . and Proctor, H . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 39,
1120 (1970).
9•
Rottem, S . , C i r i l l o , V . P . , de Kruyff, B . , Shinitzky, M. and
Razin, S . , Biochim. Biophys. Acta
10.
11.
Kaback, H . R . , Ann. Rev. Biochem.
323, 509 (1973).
39,
561 (1970).
1
Singer, S . J . , i n "Structure and ! unction of B i o l o g i c a l Membranes"
(Rothfield,
L . I . , e d . ) , pp. 1U6-190, Academic Press, N.Y. (1971).
Singer, S . J . , i n Ann. Rev. Biochem., V o l . U3, p. 805 (197*0•
12.
Edward, D.G. f . f . and Freundt, E . A . , J . Gen. M i c r o b i o l . 62, 1
(1970).
13.
Edward, D.G. f . f . et a l . , Intern. J . Sys. B a c t e r i o l . 22, 18U
(1972).
1U.
Razin, S . , Cosenza, B . J . and T o u r t e l l o t t e ,
M . E . , Ann. N.Y. Acad.
S c i . 1U3, 66 (1967).
15.
Carstensen,
11,
16.
E . L . , Maniloff, J . and E i n l o f , C.W. J r . , Biophys. J .
572 (1971).
Morowitz, H . J . , i n "The Ifycoplasmatales and the L-phase of
Bacteria"
(L. Hayflick, ed.) pp. U05-^12, Appleton Century
Crofts, N.Y. (1969).
1
17•
Smith, D.W., Biochim. Biophys. Acta
179, +08 (1969)•
18.
S l a t e r , M.L. and Falsome, C . E , , Nature 229, 117 (1971).
19.
Smith, D.W. and Hanawalt, P . C . , J . B a c t e r i o l .
96, 2066 (1968).
1
20.
Razin, S. , J . Gen.. M i c r o b i o l . 33, *71 (1963).
21.
Kahane, I . and Razin, S . , J . B a c t e r i o l . 100, 187 (1969)•
Ill
22.
23.
6 7 , 585 ( 1 9 6 9 ) .
1U3_, 115 ( 1 9 6 7 ) .
Razin, S. , Ann. N.Y. Acad. S c i .
2U.
Morowitz, H . J . and T e r r y , T . M . , Biochim. Biophys. Acta 1 8 3 , 2 7 6
Hollingdale, M.R. and Lemcke, R.M.
, J . Hyg.
(1969).
25•
Razin, S. , Adv. Microb. Physiol.
10,
26.
P o l l a c k , J . D . , Razin, S. and Cleverdon, R . C . , J . B a c t e r i o l . 9 0 ,
pp. 31-32
(1973).
617 ( 1 9 6 5 ) .
27.
Neeman, Z. , Kahane, I . , Kovartovsky, Y. and Razin, S . , Biochim.
Biophys. Acta
2 6 6 , 255 ( 1 9 7 2 ) .
28.
Rottem, S. and Razin, S . , J . B a c t e r i o l .
29•
Razin, S. , Morowitz, H . J . and Terry, T . M . , Proc. N a t l . Acad. S c i .
U.S.
9 2 , 71U ( 1 9 6 6 ) .
5 ^ , 219 ( 1 9 6 5 ) .
32.
(1972).
Choules, G . L . and Bjorklund, R . F . , Biochemistry 9., U759 ( 1 9 7 0 ) .
Kahane, I.
Ph. D. Thesis, The Hebrew University Jerusalem ( 1 9 7 1 ) .
33•
Camejo, G. , Colacicco, G. and Rapport, M.M.
30.
31.
Razin, S. Biochim. Biophys. Acta
265,
2 k l
, J . L i p i d Res. 9., 5 6 2
(1968).
3Ua.
Razin, S. , G o t t f r i e d , L . and Rottem, S. , J . B a c t e r i o l .
95., 1 6 8 5
(1968) .
b. Cho, H.W. and Morowitz, H . J . , Biochim. Biophys. Acta
1 8 3 , 295
(1969) .
35•
Rottem, S. and Razin, S. , J . B a c t e r i o l .
36.
Razin, S . , Cosenza, B . J . and T o u r t e l l o t t e ,
biol.
37•
38.
U2,
139
9h_,
359 ( 1 9 6 7 ) .
M . E . , J . Gen. Micro-
(1966).
9., 57 ( 1 9 7 0 ) .
Edward, D.G. f . f . and Freundt, E . A . , i n "The M y c o p l a s m a t a l e s
and the L-phase of Bacteria"
(L. H a y f l i c k , ed.)
pp. 1 U 7 - 2 0 0 ,
Appleton Century Crofts, N.Y. ( 1 9 6 9 ) .
39• Argaman, M. and Razin, S . , J . Gen. M i c r o b i o l . 3 8 , 153 ( 1 9 6 5 ) .
h0.
Rottem, S. and Razin, S . , Med. M i c r o b i o l . Immunol. 1 5 7 , 171 ( 1 9 7 2 ) .
Rottem, S. and Panos, C. , Biochemistry
*
Ul.
Razin, S . , Prescott, B. and Chanock, R . M . , Proc. N a t l . Acad. S c i .
U.S.
U2.
6 7 , 590 ( 1 9 7 0 ) .
Van Demark, P . J . and Plackett,
P . , J . Bacteriol. I l l ,
1
1+5* ( 1 9 7 2 ) .
112
1+3.
Razin, S. and Cohen, A . , J . Gen. M i c r o b i o l . 30,
hh.
Tourtellotte,
Bacteria"
1U1 ( 1 9 6 3 ) .
M . E . , i n "The Mycoplasmatales and the L-phase of
(L. Hayflick, ed.)
Appleton Century C r o f t s , N.Y.
(1969)•
1+5•
Y a r r i s o n , G. , Young, D.W. and Choules, G . L . , J . B a c t e r i o l . 1 1 0 ,
k9h
(1972).
28,
(1962).
1+6.
Razin, S . , J . Gen. M i c r o b i o l .
1+7•
Razin, S . , Knyszynski, A. and L i f s h i t z , Y . , J . Gen. M i c r o b i o l .
36,323
1+8.
2h3
(196U).
J i n k s , D.C. and Matz, L . L . , Biochim. Biophys. Acta
1+30, 7 1
(1976).
238 (19I+7).
1+9.
Edward, D.G. f . f . ,
50.
Lowry, O . H . , Rosebrough, N . J . , F a r r , A . L . and Randall, R . J .
J.
B i o l . Chem.
J . Gen. M i c r o b i o l . 1 ,
1 9 3 , 265 ( 1 9 5 1 ) .
51.
52.
53.
5U.
55•
9., 1+30 ( 1 9 6 2 ) .
Waley, S.G. , and Watson, J . , Biochem. J . 55., 328 ( 1 9 5 3 ) .
Schechter, I. and Berger, A . , Biochemistry 5., 3362 ( 1 9 6 6 ) .
Van Slyke, D.D. , J . B i o l . Chem. 8 3 , 1+25 (1929)•
McKenzie, H.R. and Wallace, H . S . , Aust. J . Chem. 7 , 55 (195*0.
56.
Anderson, G.W., Zimmerman, J . B . and Callahan, F . N . , J.Am. Chem.
Greenberg, L . J . , Biochem. Biophys. Res. Comm.
Soc. 8 6 , 1839 (1961+).
57•
58.
59.
60.
61.
Bray, G . A . , Anal. Biochem.
62.
Shapiro, A . L . , Vinuela, E . and M a i z e l , J . V . , Biochem.
Spackman, D . H . , Fed. Proc.
22,
2kh
(1963).
Giberman, E . and Rosenberg, E . , J . B a c t e r i o l .
Dostrovsky,
1 , 279 ( i 9 6 0 ) .
2H,
I. and K l e i n , F . S . , Anal. Chem.
E i b l . H . J . and Lands, W.E.M., Anal. Biochem.
Res.
Comm.
1 0 U , 87 ( 1 9 7 0 ) .
30,
(1952).
51 ( 1 9 6 9 ) .
k l k
Biophys.
2 8 , 815 ( 1 9 6 7 ) .
63.
Hjerten, S . , Arch. Biochem. Biophys.
6k.
Pecht, M. , I s r a e l J . Chem.
65•
Pecht, M. , Giberman, E . , Keysary, A . , Y a r i v , J . and K a t c h a l s k i , E . ,
Biochim. Biophys. Acta
66.
Suppl.
1 , 11+7 ( 1 9 6 2 ) .
8 , 187p ( 1 9 7 0 ) .
2 9 0 , 267 ( 1 9 7 2 ) .
R i l e y , P . S . and Behal, F . J . , J . B a c t e r i o l .
1 0 8 , 809 ( 1 9 7 1 ) .
113
67•
Smith, P . F .
"The Biology of Mycoplasmas"
Academic P r e s s ,
N.Y.
(1971).
68.
Cohen, L . A . ,
69.
Crestfield,
i n Ann. Rev. Biochem., V o l .
37,
P-
695 ( 1 9 6 8 ) .
A . M . , S t e i n , W.H. and Moore, S . , J . B i o l .
Chem. 2 3 8 ,
2U13 ( 1 9 6 3 ) .
70.
Shaw, E. and Springhorn, S . , Biochem. Biophys. Res. Comm. 2 7 ,
391 ( 1 9 6 7 ) .
71.
Gundlach, H . G . , S t e i n , W.H. and Moore, S.
J . Biol.
Chem. 2 3 U ,
175U ( 1 9 5 9 ) .
72.
Crane, R.K.
Cell.
Biol.
i n " I n t r a c e l l u l a r Transport"
(K.B. Warren, e d . ) ,
Vol.
Symp. Intern. Soc.
5 , p.
Academic P r e s s ,
71,
N.Y. ( 1 9 6 6 ) .
73•
Webb, J . L .
"Enzyme and Metabolic
Press, N.Y.
7*+.
Atherton,
Inhibitors", Vol.
3 , Academic
(1966).
R . S . , Laws, J . F . and Thomson, A . R . , Biochem. J . 1 1 8 ,
903 ( 1 9 7 0 ) .
1
75•
Anderson, P . J . and Perham, R . N . , Biochem. J .
76.
Moore,
S. and S t e i n , W.H. i n "Methods
Colowick and N.O.
Kaplan, e d . ) ,
1 1 7 , +90 ( 1 9 7 0 ) .
i n Enzymology"
Vol. VI,
p.
(S.P.
8 1 9 , Academic P r e s s ,
N.Y. ( 1 9 6 3 ) .
77•
Choules, G.L. and Gray, W.R.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 1+5,
8U9 ( 1 9 7 1 ) .
78.
Bishop, C. and Surgmor, D.M.
Academic P r e s s , N.Y.
79•
"The Red Blood C e l l " p. 11+8,
(1961+).
Lawrence, P . J . and Strominger,
J . L . , J . Biol.
Chem. 21+5, 3660
(1970) .
80.
Simmonds, S . , Biochemistry
81.
S a r i d , S . , Berger, A. and K a t c h a l s k i ,
£,
1 (1970).
E., J . Biol.
Chem.
237,
2207 ( 1 9 6 2 ) .
82.
Haley, E . E . , J . B i o l .
83•
Sussman, A . J .
Chem.,
and G i l v a r g ,
21+3, 571+8 ( 1 9 6 8 ) .
C . , Ann. Rev. Biochem. U0, 3 9 7
(1971) .
81+.
Dick, A . J . , Matheson,
U8, 1181 ( 1 9 7 0 ) .
A.T.
and Wang, J . H . , Canad. J . Biochem.
ו*״
85.
86.
Payne, J.W. and G i l v a r g , C . ,
87.
Behal, F . J . and Folds, J . D .
3 5 , 187 ( 1 9 7 1 ) .
9 6 , 12U0 ( 1 9 6 8 ) .
Adv. i n Enzymol.
Behal, F . J . and Cox, S.T. , J . B a c t e r i o l .
Biochem. Biophys. Res. Comm. 27,
3kk ( 1 9 6 7 ) .
88.
89.
Muftic, M . , F o l i a M i c r o b i o l .
90.
Nakao, T . , Nakao, M . , Mizuno, N . , Komatsu, Y. and F u j i t a , M . ,
(1967).
500
Kessel, D. and Lubin, M. , Biochim. Biophys. Acta
J.
91.
12,
Biochem. 73,
7 1 , 656 ( 1 9 6 3 ) .
609 ( 1 9 7 3 ) .
Trauble, H. and E i b l , H . J . , Proc. N a t l . Acad. S c i . U.S. 7 1 , 2 1 U
(197*0•
92.
Overath, P . , Schairer, H.U. and S t o f f e l ,
Sci. U.S.
93.
6 7 , 606 ( 1 9 7 0 ) .
Esfahani, M . , Limbrick, A . R . , Knutton, S . , Oka, T. and W a c k i l , S . J .
Proc. N a t l . Acad. S c i . U.S.
9k.
W., Proc. N a t l . Acad.
6 8 , 3180 ( 1 9 7 1 ) .
Spears, D.M. and Provost, P . J .
Canad. J . M i c r o b i o l . 13,
213
(1967).
95•
Rosenberg, S.A. and G u i d o t t i , G . , i n "Red C e l l Membranes Structure and Function"
p.
96.
172,
(G.A. Jamieson and T . J . Greenwalt,
ed.)
(1969)•
J . B . L i p p i n c o t , Philadelphia
Terry, T.M. and Zupnik, J . S . , Biochim. Biophys. Acta
291, i k k
(1973).
97•
Razin, S . ,
i n "The Mycoplasma Membrane" (series Progress i n
Surface and Membrane Science) (D.A. Cadenhead, J . F . D a n i e l l i
and M.D. Rosenberg,
ed.)
V o l . 9 , p• 2 5 7 , Academic Press, N.Y.
(1975).
98.
van Deenen, L . L . M . and de Haas, G.H.
,
Ann. Rev. Biochem.
35.,
178 ( 1 9 6 6 ) .
99•
Ottolenghi, A . C . , i n "Methods i n Enzymology" ( J . H . Lowenstein,
ed.), Vol. I k ,
p. 188, Academic Press, N.Y.
(1969).
100.
Ottolenghi, A . C . , i b i d , p. 1 9 3 •
101.
Martin, K . C . ,
102.
Ne'eman, Z. and Razin, S . , Biochim.
103.
F l e i s c h e r , B . , Casu, A. and F l e i s c h e r , S . , Biochem. Biophys.
Biochim. Biophys. Acta
Res. Comm. 2U,
189 ( 1 9 6 6 ) .
182 ( 1 9 7 0 ) .
Biophys. Acta 3 7 5 , 5*+ ( 1 9 7 5 ) .
203,
115
10k.
Aswathi, Y . C . , Ruzicka, F . J . and Crane, F . L . , Biochim. Biophys.
Acta
105•
203, 233 (1970).
Zwaal, R . F . A . , Roelofsen, B. and C o l l e y , C M . , Biochim. Biophys
Acta
300,
11973)
צ
9
)
.
106.
Zwaal, R . F . A . et a l . , i b i d , p. 1 6 8 .
107.
de K r u i j f f , B . , Demel, R.A. and van Deenen, L . L . M . , Biochim.
Biochim. Biophys. Acta
108.
255,
331
(1972).
D a n i e l l i , J . F . and Davson, H . , J . C e l l .
Comp. Physiol.
5., U 9 5
(1935).
109.
Caspar, D . L . D . and Kirschner, D . A . , Nature new B i o l . 231, k6
(1971).
110.
V e r k l e i j , A . J . , de K r u i j f f , B . , Gerritsen, W.F. , Demel, R.A.
2 9 1 , 577 (1973)
25., 205 ( 1 9 7 2 ) .
and van Deenen, L . L . M . , Biochim. Biophys. Acta
111.
Capaldi, R.A. and Green, D . E . , FEBS L e t t .
112.
Woodward, C.B. and Zwaal, R . F . A . , Biochim. Biophys. Acta
2!k,
272 ( 1 9 7 2 ) .
113.
Carr away, K . L . , Kobylka, D. , Summer z , J . and Carraway, C A . ,
Chem. Phys. Lipids
Ilk.
Tourtellotte,
8_, 6 5 ( 1 9 7 2 ) .
M . E . , i n "The *fycoplasmatales and L-Phase of
Bacteria" (L. H a y f l i c k , e d . ) ,
Crofts, N.Y.
pp.
U51-U68,
Appleton Century
(1969).
115•
Rodwell, A . W . , J . Gen. M i c r o b i o l .
116.
Smith, P . F . , i n "The Biology of Mycoplasma", p. 12k, Academic
Press, N.Y.
117•
58, 39 (1969).
(1971).
van Demark, P . J . , i n "The Itycoplasmatales and L-Phase of
Bacteria" (L. H a y f l i c k , e d . ) ,
p. U 9 1 , Appleton Century Crofts,
N.Y. ( 1 9 6 9 ) .
118.
de K r u i j f f , B . , van D i j c k , P.W.M., Goldbach, R.W., Demel, R.A.
and van Deenen, L . L . M . , Biochim. Biophys. Acta
119.
330,
269 (1973)
Nachbar, M.S. and Salton, M . R . J . , Biochim. Biophys. Acta
223,
309 ( 1 9 7 0 ) .
120.
121.
P o l l a c k , J . D . , Int.
2 5 , 108 ( 1 9 7 5 ) .
M i c r o b i o l . 1 , 161 ( 1 9 7 1 ) .
J . Syst. B a c t e r i o l .
Salton, M . R . J . , CRC C r i t i c a l Rev.
116
122.
Stopkie, R . J . and Weber, M.M.,
Biochem. Biophys. Res. Comm.
2 8 , 103k ( 1 9 6 7 ) .
1 2 8 , 827 ( 1 9 7 6 ) .
123.
Larraga, V. and Razin, S . , J . B a c t e r i o l .
12U.
Rodwell, A . W . , Razin, S . , Rottem, S. and Argaman, M . , Biochim.
Biophys. Acta
125.
1 2 2 , 621 ( 1 9 6 7 ) .
Rottem, S . , S t e i n , 0 . and Razin, S . , Arch. Biochem. Biophys.
1 2 5 , U6 ( 1 9 6 8 ) .
126.
Kahane, I . and Razin, S . , Biochim. Biophys. Acta
21+9, 159 ( 1 9 7 1 ) .
127.
Reynolds, J . A . , and Tanford, C. Proc. N a t l . Acad. S c i . U.S.
6 6 , 1002 ( 1 9 7 0 ) .
128.
Helenius,-A. and Simons, K . , Biochim. Biophys. Acta U 1 5 ,
29
(1975).
129.
Hjerten, S. and Johansson, K . E . ,
Biochim. Biophys. Acta 2 8 8 ,
312 ( 1 9 7 2 ) .
130.
Gilham, P . T . , Methods Enzymol.
131.
Lamed, R . , L e v i n , Y. and Wilchek, M . , Biochim. Biophys. Acta
30k,
132.
133.
13U.
2 1 , 191 ( 1 9 7 1 ) .
231 ( 1 9 7 3 ) .
135•
82_, 6380 ( i 9 6 0 ) .
Shelton, K . R . , Biochem. Biophys. Res. Comm. k 3 , 367 ( 1 9 7 1 ) .
Leach, R . H . , J . Gen. M i c r o b i o l . 2 7 , 3U5 ( 1 9 6 2 ) .
Rodwell, A . W . , J . Gen. M i c r o b i o l . U0, 227 ( 1 9 6 5 ) .
136.
T r i g g l e , D . J . , i n "Recent Progress i n Surface Science"
Khym, J . X . and Cohn, W . E . , J . Am. Chem. Soc.
(J.F.
137•
273-290
(1970).
Westley, J . W . , Anderson, P . J . , Close, V . A . , Halpern, B. and
Appl. M i c r o b i o l .
1 5 , 822 ( 1 9 6 7 ) .
Burton, G . , Blenden, D.C. and Goldberg, H.S. Appl. M i c r o b i o l . 19
586
1U0.
pp.
(1967).
Lederberg, E.M.,
139•
3,
Behal, F . J . and Folds, J . D . , Biochem. Biophys. REs. Comm. 2 7 ,
3kk
138.
D a n i e l l i et a l . , e d . ) , V o l .
(1970).
Burger, H . , Doss, M . , Mannheim, W. and Schuler, A . , Z . Med.
Mikrobiol. Immun.
1 5 3 , 138 ( 1 9 6 7 ) .
11+1.
Brecher, A . S . and Suszkiw, J . B . , Biochem. J .
11+2.
Behal, F . J . , L i t t l e , G.H. and K l e i n , R.A,., Biochim. Biophys.
Acta
1 7 8 , 118 ( 1 9 6 9 ) .
1 1 2 , 335 ( 1 9 6 9 ) .
117
11*3.
Northrop, J . H . , Kunitz, M. and H e r r i o t , R.M.
Enzymes"
11*1*.
2 n d ed.,
Columbia Press, N.Y.
"Crystalline
(19U8).
L i t t l e , G . H . , Starnes, W.L. and Behal, F . J . , Methods Enzymol.
XLV, U95 ( 1 9 7 6 ) .
1U5.
Matheson, A . T . and Murayama, T . , Canad. J . Biochem. M*_, 11*07
(1966).
1U6.
11*7•
11*8.
Razin, S . , Adv. M i c r o b i a l . Physiol.
1 0 , 1 (1973).
Rodwell, A.W. , Ann. N.Y. Acad. S c i . 11*3, 88 ( 1 9 6 7 ) .
Leech, F.R. and S n e l l , E . E . , J . B i o l . Chem. 235, 3523 ( i 9 6 0 ) .
11*9•
Tourtellotte,
M . E . , Morowitz, H . J . and Kasimer, P . ,
J.Bacteriol.
8 8 , 1 1 (1961*).
150.
Tourtellotte,
M . E . , i n "The Mycoplasmatales and L-Phase of
Bacteria" (L. H a y f l i c k , e d . ) ,
C r o f t s , N.Y.
p.
1*51-1*68,
Appleton Century
(1969).
151.
Razin, S . , Progr. Surface Membrane S c i . £ ,
293 ( 1 9 7 5 ) .
152.
Ne'eman, Z. , Kahane, I . and Razin, S . , Biochim. Biophys. Acta
21*9, 169 ( 1 9 7 1 ) .
153.
151*.
155•
156.
157•
Minakami, S. et a l .
158.
L e v i n , Y . , Pecht, M . , Goldstein, L . and K a t c h a l s k i , E .
Coleman, R . , Biochim. Biophys. Acta
300,
1 (1973).
J i n k s , D.C. andMatz, L . L . , Biochim. Biophys. Acta
Robinson, J . O .
Nature
1*52,
(1976).
30
2 1 2 , 199 ( 1 9 6 6 ) .
7 9 , 2171* ( 1 9 5 7 ) .
2 3 8 , 1529 (1963).
Swenson, A.D. and Boyer, P.D. , J . Am. Chem. Soc.
Biochemistry
J . B i o l . Chem.
3 , 1 9 0 5 (1961*).
159•
160.
161.
Means, G.E. and Feeney, K . E . ,
162.
Bellhorn, M . B . , Blumenfeld, 0 . 0 . and Gallop, P . M . , Biochem.
Carraway, K . L .
Hokin, L . E . ,
Biophys.
163.
7., 2 1 9 2 ( 1 9 6 8 ) .
, Biochim. Biophys. Acta 1*15., 379 ( 1 9 7 5 ) .
J . Gen. Physiol.
5**., 3275 ( 1 9 6 9 ) .
Res. Comm.
Biochemistry
3 9 , 267 ( 1 9 7 0 ) .
Fox, C . F . and Kennedy, E . P . , Proc. N a t l . Acad. S c i . U.S.
5U,
891 ( 1 9 6 5 ) .
161*.
Storm, D.R. and Dolginow, Y . D . , J . B i o l . Chem.
21*8, 5208 ( 1 9 7 3 ) .
STUDY
OF ENZYMES
MEMBRANE
LOCATED
OF MYCOPLASMA
Thesis for
IN THE C E L L
AND
ACHOLEPLASMA
the [Degree of
DOCTOR OF PHILOSOPHY
by
MARIT
PECHT
(LANDAU)
Submitted to the Scientific Council of the Weizmann Institute of Science
Rehovot
September 1977
STUDY
OF ENZYMES
MEMBRANE
OF
LOCATED
MYCOPLASMA
Thesis for
the
AND
IN
THE
CELL
ACHOLEPLASMA
Degree of
DOCTOR OF PHILOSOPHY
by
MARIT
PECHT
(LANDAU)
Submitted to the Scientific Council of the Weizmann Institute of Science
Rehovot
September
1977
SUMMARY
Enzymes located i n the c e l l membrane of Mycoplasma and Acholeplasma have been studied as a model for the r e l a t i o n between the
membrane
and the properties of enzymes bound to i t .
Mycoplasma and
Acholeplasma, belonging to the family I^ycoplasmataceae
of the
Mollicutes c l a s s , were chosen as the most suitable system since these
procaryotes lack a r i g i d peptidoglycan c e l l wall and the plasma
membrane i s t h e i r only c e l l u l a r membrane.
The enzymes that have been studied and characterized are:
(a)
Amidase and peptidase of Mycoplasma fermentans
laidlawii.
(b)
and Acholeplasma
NADH oxidase i n Acholeplasma l a i d l a w i i .
An amidase capable of hydrolyzing amino acid-B-naphthylamides
has been shown to be
inuiuDrciic
bound i n M. fermentans.
This enzyme
exhibits s p e c i f i c i t y towards the basic amino acids h i s t i d i n e , arginine
and l y s i n e , having the highest a f f i n i t y towards h i s t i d y l - B - n a p h t h y l amide
(K = 1 . 2 5 X 1 0 ~
m
k
M).
The optimal pH for the hydrolysis of the
naphthylamide substrates was found to be i n the range of pH
9•5-10.
The pH p r o f i l e s of the amidase a c t i v i t y of the intact c e l l and of the
i s o l a t e d membrane were found to be very s i m i l a r , suggesting that the
enzyme i s exposed to the same environment i n both states.
To exhibit
maximal a c t i v i t y of the amidase, a free a-amino group on the
substrate
i s required.
A membrane bound amidase has been found also i n A. l a i d l a w i i ,
however i t was shown to have a different s p e c i f i c i t y .
The l a t t e r
amidase was most active towards alanyl-3-naphthylamide (K
1
= 6 x 1 0 *M
whereas hydrolysis of other amino acid-naphthylamides was n e g l i g i b l e .
The pH optimum for the hydrolysis of alanyl-S-naphthylamide was pH 8 - 9
The hydrolytic a c t i v i t y observed with A. l a i d l a w i i could also be
defined as that of an aminopeptidase, acting only on substrates
containing free a-amino group.
The naphthylamidases that we have
characterized i n M. fermentans
and A. l a i d l a w i i
are reminiscent of
- ii -
arylamidases found in the cytoplasm of some b a c t e r i a , but d i f f e r i n
t h e i r r e s t r i c t e d l o c a l i z a t i o n to the c e l l membrane.
a c t i v i t y of M. fermentans
The amidase
could be i n h i b i t e d with iodoacetate and
protected from modification by preincubation with h i s t i d i n e .
The
i n h i b i t i o n was a two stage process - a rapid i n h i b i t i o n of 50%
followed by a much slower r a t e , which d i d not reach complete
inhibition.
essential
This might suggest that not a l l the sulfhydryl groups,
for the enzymic a c t i v i t y , are available or sensitive to the
same extent.
A l t e r n a t i v e l y i t i s conceivable that modification of
part of the SH groups leads to s t r u c t u r a l rearrangements that
the protection of the r e s t .
by M. fermentans
induces
We have found that the uptake of h i s t i d i n e
i s also i n h i b i t e d by iodoacetate.
The above data
lend further support to the idea that a functional r e l a t i o n s h i p may
exist between a transport system and a membrane enzyme acting on the
same substrate, which has been put forward by Crane (72 ).
In further work a peptidase that hydrolyses synthetic d i - and
tripeptides containing ^ - h i s t i d i n e and L - l y s i n e , but not o r n i t h i n e ,
was found i n M. fermentans membrane.
The hydrolysis products iden-
t i f i e d by chromatography have proven that t h i s was an aminopeptidase,
cleaving the amino terminal residue possessing a free a-NH2 group.
The substrate s p e c i f i c i t y and pH optimum of the amidase and the p e p t i dase i n M. fermentans
overlapped, suggesting that both
activities
originate in the same membrane protein or protein complex.
membrane of A. l a i d l a w i i
L - a l a oligopeptides
In the
a peptidase was found capable of hydrolyzing
of 2 to 6 residues length.
This enzyme also
cleaved the N-terminal L - a l a from oligoalanine peptides of the
designed sequence L ( L D )
n
strict stereospecificity,
D
(n = 1 ; 2; U ) . The peptidase showed a
cleaving the N-terminal L - a l a only when the
residue was at a distance of two peptide bonds.
cleavage of L - a l a of the
specially
The efficiency
digopeptide decreased with the increase
of
in •
peptide length, suggesting a l i m i t e d binding capacity of the enzyme
יite or slower d i f f u s i o n of the peptide to the enzyme embedded i n the
membrane .
- iii -
A. l a i d l a w i i
c e l l s kept i n isotonic
be impermeable to L-alanine.
growth medium at
s a l t solution were found to
Even when the c e l l s were suspended i n
3 T ° C , the i n t e r n a l concentration of alanine was
found to be rather low. The external l o c a t i o n of the peptidase was
deduced from the observation that the nonapeptide Ala(L)-{ Ala(L)-Ala(D)],
was cleaved by intact c e l l s under conditions at which the c e l l s were
nonpermeable to alanine.
Monovalent cations, known to s t a b i l i z e the f l u i d state of the
membrane, have an a c t i v a t i n g influence on A. l a i d l a w i i amidase.
Though being exposed to quite high s a l t concentration, the amidase
not detached o f f the membrane.
is
A l s o , i t was not inactivated by
t r e a t i n g A. l a i d l a w i i c e l l s with t r y p s i n or phospholipase C.
The
i n t e g r i t y of the membrane structure seems to be e s s e n t i a l for the
a c t i v i t y of the amidase and peptidase,
since both a c t i v i t i e s were
r a p i d l y l o s t i n membrane preparations.
This l i m i t e d the efforts
to
characterize further the enzyme properties i n the i s o l a t e d membrane
compared to the intact
cells.
NADH oxidase i s an i n t r i n s i c membrane protein that is part of the
f l a v i n terminated respiratory chain i n A. l a i d l a w i i
study I have investigated
( 67).
In t h i s
some properties of t h i s enzyme that might be
dominated by the membranal environment.
The NADH
oxidase could be
s o l u b i l i z e d by t r e a t i n g the membrane preparation with
phospholipases.
The p a r t i a l l y s o l u b i l i z e d a c t i v i t y can be further used for p u r i f i c a t i o n
of the enzyme capable of electron transfer to oxygen. This also
corroborates previous findings that l i p i d s are not e s s e n t i a l for the
oxidase a c t i v i t y .
detergent
Tween-20'
Treatment of the membrane with the non-ionic
caused a selective s o l u b i l i z a t i o n of the membrane
and to a •enrichment of protein r e l a t i v e to l i p i d .
The s t r u c t u r a l
rearrangement of the membrane constituents was manifested by a
different mobility pattern i n SDS-acrylamide gel
electrophoresis.
A l s o , the oxidase of the modified membrane i n contrast to the enzyme
in the native membrane, did not require mercaptoethanol i n order to
- iv -
exhibit maximal a c t i v i t y . The change i n the oxidase microenvironment
was also manifested by a s h i f t i n the pH optimum.
The technique of a f f i n i t y l a b e l i n g was employed to l a b e l the
NADH oxidase i n the membrane.
NADH aldehyde, prepared by periodate
oxidation, did apparently react with amino groups at the
by Schiff-base
formation.
surface,
The chemical modification d i d , however,
cause drastic changes i n the membrane, r e s u l t i n g in protein
aggregations that could not be s o l u b i l i z e d even i n SDS.
This
labeled protein complex appeared i n the void volume of Sepharose
UB
columns, also i n the presence of detergents.
Further
characterization of the labeled protein aggregate was thus not
feasible.
