docביולוגיה מולקולרית - שיעורים 7-11
download 
Report Transcription
ביולוגיה מולקולרית - שיעורים 7-11
שיעור :07שיטות מולקולריות לריקומבינצייתDNA 57 שיעור :07שיטות מולקולריות לריקומבינציית DNA המרצה :פרופ' דן כנעני ההיסטוריה של ביולוגיה מולקולרית • – 1956גילוי מבנה ה DNA-כדו-סליל על ידי ווטסון וקריק. • – 1962-1964במעבדה של אנפנסנד מתגלה הבסיס לקוד הגנטי המורכב משלשות נוקליאוטידים. הוא מתאים את הקודונים השונים לחומצות האמינו המתאימות להם .ב 1964-מגובשת הדוֹגמה המרכזית – כיוון זרימת הידע הוא מ DNA-דרך אמצעי הביניים mRNAהמיתרגם בסוף לחלבון. ידוע שיש וירוסים שנושאים RNAולהם יכולות נוספות של שיעתוק RNAעל בסיס .RNA • – 1964-1968קביעת עקרונות התרגום ,מקום הביצוע על גבי הריבוזומים והפוליזומים. • – 1969גנתר סטנט ,מדען בקטריופאג'ים ,מפרסם את ספרו "תור הזהב נגמר" – המעריך כי תור הזהב של התגליות הגדולות נגמר ונותר לגלות רק הפרטים הקטנים .האתגר הבא הוא חקר המוח והוא עוזב את הביולוגיה המולקולרית ועובר לחקר המוח .ההערכה הזו התנפצה במהירות. • – 1970שני חוקרים מגלים שבתוך הויריון של RNA-tumor virusesיש אנזים Reverse transcriptaseהפועל הפוך לדוֹגמה המרכזית .המהפכה שבגילוי מקבלת אישור בוועדת נובל כמה שנים אחר כך .לעובדה זו היה ערך לא רק בהבנת מנגנון השכפול של הויריונים אלא בשימוש באנזים הזה ליצירת DNAקומפלמנטרי של RNAעל מנת לשבט אותו לנשא .DNA זהו אנזים מפתח בשיבוטים רבים ).(cDNA • – 1970שיטה לחתוך DNAבצורה ספציפית לרצף מסויים על ידי אנזימי הגבלה מסוג .II • – 1972-3שני חוקרים מצליחים לחבר שני קטעי DNAממקורות שונים – הוירוס הסרטני SV40חובר לבקטריופאג' למבדא ) (λונוצר אלמנט כימרי .הניסוי פתחה חלון אתי מאוד פרוץ והתחום נכנס לתרדמת עד שפותח מדריך קווים מנחים בשם NIHעל מנת לוודא שלא ייעשה שימוש לרעה בניסויים בסוג זה. • – 1978שארפ ורוברטס מוצאים בניסוי שהגן אינו רציף; יש בו איזורים המיוצגים על ידי ה- mRNAשהם האקסונים והמקשרים ביניהם הם האינטרונים ,כאשר השיחבור מאפשר יצירת mRNAמאקסונים בלבד. • – 1978ריצוף גנטי • – 1985-1988יצירת שיטת ה PCR-על ידי מוליס לצורך הגברה של DNAו.RNA- • – 1991יצירה ראשונה של עכברי ,knock-outעכברים הפגועים בגן או גנים מסויימים. • – 1997איאן וולמוט יוצר כבשה כתוצאה מתהליך תיכנות מחדש ) (reprogrammingעל ידי הפריית ביצית מגרעין של תא סומטי לקבלת עובר כמעט תקין לחלוטין – דולי .הדבר נוגד את הטענה שהשינויים החלים בהתמיינות אינם הפיכים – שיש הבדלים משמעותיים בין DNAשל הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 58 עובר ל DNA-של תא סומטי ,ואין אפשרות להחזיר תא סומטי להיות תא עוברי .ניסוי זה הוכיח שהרעיון אינו נכון ושיש דבר מה בציטופלזמה של הביצית – פקטורים התפתחותיים – שמאפשרים את ההיפוך .יחד עם זאת ,התהליך אינו הפיך בצורה מושלמת.16 • – 2006-2008ימנאקה מנסה לבצע תיכנות מחדש עם מרכיבים מוגדרים על ידי בדיקת הגנים המבוטאים בעובר המוקדם ביותר ומבטא אותם בגן בוגר וממויין .הוא מגלה שתערובת של 27 גנים מחקים את המצב העוברי ומאפשרים לבצע רה-דיפרנציאציה .בהמשך מצמצמים זאת אף לארבעה גנים בלבד .הדבר מעלה תקוות רפואיות ליצירת רקמות ואיברים מתאימים לחולה מתאים סומטיים שמקורם באותו מטופל. הדוֹגמה המרכזית והתוספות עליה תודות לטכניקות הקיימות היום, המולקולריות התנועה לאורך הדוֹגמה המרכזית אינה בהכרח חד כיוונית. המחקר ההפוך מכונה reverse geneticsוהינו תולדה של הטכניקות שפותחו בעשורים האחרונים. שיבוט – cloning השיבוט מבקש לבודד גן בודד מאיזורים שאינם מקודדים – .spacer DNAלאחר השיבוט יש צורך לבצע הגברה .על מנת לשבט גן נדרשים מספר דברים: • חיתוך ה DNA-בצורה ספציפית על ידי אנזימי הגבלה. • נשא שלתוכו ניתן יהיה להכניס את חתיכת ה DNA-המבודדת .הנשא צריך להיות בעל יכולת רפליקציה – דוגמת פלסמיד שהינו בעל .OriRהפלסמידים המשובטים קטנים ,נושאים מעט פונקציות והינם פרזיטים – כמעט כל מערכת הרפליקציה של הפונדקאי נדרשת על מנת שיוכלו להשתכפל. • פונדקאי מתאים לנשא – חיידק ,שמר ,תאים הומנים. 16את דולי היה צריך להרוג כשנתיים וחצי לאחר לידתה ,כי הזדקנותה הייתה מואצת ככל הנראה כיוון שה DNA-שלה היה מבוגר והטלומרים שלה קצרים ,והיא אופיינה במחלות הזדקנות המאפיינות את התא ממנו היא יצאה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :07שיטות מולקולריות לריקומבינצייתDNA 59 אנזימי הגבלה האנזימים ביותר השימושיים לביולוגיה המולקולארית הם אנזימי הגבלה מסוג IIבהם, בניגוד לאנזימי הגבלה מסוג ,Iאתר ההכרה ואתר החיתוך של האנזימים זהים .האנזימים היוצרים קצוות דביקים מאופיינים ביצירת 5'-overhang )שקצה ' 5הוא זה עם הקצה הדביק( או 3'- .overhangתכונת הקצוות הדביקים יעילה ליצירת התאמה קומפלמנטרית בין המחדר לבין הפלסמיד החתוך. האנזימים המפורטים בטבלה )שקופיות ,5-6מצגת (7הם אנזימים מסוג .IIאנזימי הגבלה מסוג Iהתגלו ארבע שנים קודם לכן ,ובהם אתר החיתוך רחוק כ 300-זוגות בסיסים מאתר ההכרה .באופן מעשי משתמשים רק בסוג ,IIהמורכב מלמעלה מ 3,000-אנזימים שונים מפרוקריוטים שונים .עד כה נוקו בחברות מסחריות למעלה מ 600-אנזימים המעניקים יכולת מניפולציה רחבה. אתר ההכרה המינימלי של סוג IIמורכב מ 4-זוגות בסיסים ,כאשר יש גם שמכירים 6 ,5ומעטים המכירים 8זוגות בסיסים .מספר זוגות הבסיסים קובע את שכיחותו ההסתברותית של אתר החיתוך ועקב כך את גודל המקטעים המתקבלים – ככל שאתר החיתוך גדול יותר השכיחות קטנה יותר והמקטעים גדולים יותר. האנזימים יכולים לחתוך וליצור קצה דביק או קצה קטום ) ,bluntדוגמת (SmaIכאשר יש לזכור שהגדיל העליון הוא זה שהולך מ5'- ל .3'-שמות האנזימים ניתנים לפי החיידק ממנו בודדו את האנזים. המספור ניתן בהתאם למספר האנזים שהתגלה באותו חיידק )מבחינה היסטורית(. האיור מדגים חיתוך פרגמנט נתון בשני אנזימי הגבלה ,תחילה בנפרד ואז יחד. בצורה זו ניתן להבין את מבנה ורצף אתרי ההגבלה על גבי הפרגמנט. לאנזימי הגבלה מסוג Iורוב סוג IIיש פעילות ,נוסף על ביקוע ,של מתילאז )כחלק מהקומפלקס ,תת יחידה נפרדת(. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 60 אנזימי ההגבלה נתגלו כחלק ממנגנון ההגנה של חיידקים בפני פלישה של DNAזר )למשל של חיידק בקוניוגציה או התקפה של פאג' המזריק DNAומוביל למחזור ליטי או ליזוגני( DNA ,שאינו מהמין שלו .פעולת הגנה זו נעשית על ידי אנזימי הגבלה המרטשים את ה DNA-הזר .הזיהוי מבוסס על כך שה- DNAהעצמי ממותל באתרי ההכרה/חיתוך של האנזים )שאינו מסוגל לחתוך אתרי הכרה/חיתוך ממותלים( .מתילציה = הגנה מפני אנזימי הגבלה. מכאן שאותו קומפלקס מקיים תחרות אישית בין תת היחידה החותכת לתת היחידה הממתלת .האפיניות של תת היחידה הממתלת לרוב נמוכה מזו של תת היחידה החותכת ולכן היא זו שלרוב מנצחת בתחרות. תופעה זו נצפתה בניסוי של הרבר ,בו מיצו את ה DNA-הזר שהוכנס לחיידק מקבל בהצלחה והDNA- נבדק לאפיון מסויים; נמצא שה DNA-ממותל באתרים זהים לרצפים הממותלים ב DNA-של החיידק המארח .מכאן שהחיידק גם מגן על ה DNA-שלו עצמו מפני אנזימי ההגבלה על ידי המתילציה. בזמן השכפול של הגנום החיידקי ,סיב המקור כבר ממותל וזמן קצר לאחר בניית הסיב החדש מתילאז מזהה אתרים חצי-ממותלים )כי רק סיב אחד ממותל( ומחבר מתיל לסיב השני .באופן זה נשמרת המתילציה של הפונדקאי והוא מוגן בפני אנזימי ההגבלה שלו עצמו. הדבר השני שהרבר עשה היה לבודד את החיתוך של אנזים הגבלה .אולם הוא עבד עם אנזימי הגבלה מסוג Iולכן התקשה לאתר אתר חיתוך לעומת אתר הכרה .מדען אחר שעבד עם פאג' סלמונלה ראה שהפאג' מתקשה בהדבקה ,בודד את אנזים ההגבלה שפגע בגנום החיידקי והצליח לבודד את האנזים ולהגדיר את רצף הזיהוי. מדען נוסף שקיבל ממנו את האנזים המנוקה עשה מיפוי גנטי ראשון בעזרת אנזימי הגבלה של – SV-40 וירוס של קופים המתנהג גם כוירוס מתמיר של תאי עכבר ולכן שימש כמודל לוירוס סרטני .הדבר נעשה על ידי קביעת מקומות החיתוך של אנזימי ההגבלה ואז איתור המקטעים המכילים פונקציות שונות – הפוקנציות המוקדמות הנמצאות נגד כיוון השעון ל Ori-והפונקציות המאוחרות הנמצאות עם כיוון השעון ל.Ori- החוקר בודד DNAמתאים מודבקים המוזנים בנוקליאוטידים מסומנים ,העביר את התוצרים בג'ל ,העביר את זה לנייר וחשף לפילם .בזמנים קצרים התקבל סימון רק בפרגמנט שהכיל את ;Oriבזמנים ארוכים יותר התגבל סימון בפרגמנטים נוספים .כאשר בדק את ההיברידיזציה של ה DNA-למקטעים יכול היה להבין היכן נמצאים הגנים המוקדמים והגנים המאוחרים .זה היה המיפוי הראשון שנעשה בעזרת אנזימי הגבלה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :07שיטות מולקולריות לריקומבינצייתDNA 61 שיבוט DNAלתוך פלסמיד סטנלי כהן היה חוקר פלסמידים .פלסמידים הם וקטורים בעלי יכולת רפליקציה אינטרנית הקיימים באופן טבעי בפרוקריוטים. בוייר היה הראשון שבודד את .EcoRIבהינתן DNAגנומי הנחתך על ידי אנזימי הגבלה הזהים לאלו שחתכו את הפלסמיד )אנזימים שונים חותכים קצוות שונים( ,התוצר הלינארי הפתוח מושלם שוב למעגל על ידי כניסת המחדר בעזרת היברידיזציה לפלסמיד הנובעת מקומפלמנטציה של המחדר לקצוות הדביקים. הקצוות הפתוחים שנותרים בין המחדר לפלסמיד מחוברים על ידי פעולת אנזים הליגאז )המוכנס יחד עם אספקת .(ATPפעולה זו מבטיחה החדרה כיוונית של המחדר לתוך הפלסמיד ומונעת סגירת הפלסמיד על עצמו )כי הקצוות הדביקים שלו אינם בקומפלמנטציה(. הדרישות מוקטור פלסמיד • – Oriהרפליקון זקוק ל Origin of replication-שיקנה יכולת שיכפול פרזיטית בתאים הפונדקאים אליהם מוכנס הפלסמיד .בהתאם ל Ori-נקבע סוג התא שיוכל לאחסן את הפלסמיד. • מרקר סלקטיבי: • מרקר סלקטיבי דומיננטי – מאפשר בידוד חיידקים שקלטו פלסמיד תקין וסגור בעל יכולת רפליקציה .הדרישה הזו נובעת מכך שתהליך הטרנספורמציה ,החדרת הרפליקון לחיידק ,מאוד לא יעיל ולכן יש לבודד את המעטים שעברו טרנספורמציה .דוגמה :עמידות לאנטיביוטיקה. • מרקר סלקטיבי רצסיבי – החיידק המקבל יהיה חיידק מוטנט שאינו מסוגל לסנטז חומצה אמינית מסויימת .המרקר הסלקטיבי יהיה הגן החסר בחיידק ואז החיידקים שקלטו את הפלסמיד יבודדו על ידי זריעת התרבית במצע שאינו מכיל את חומצת האמינו שהחיידק הקומפטנטי פגוע במסלול הביוסינטטי שלה. ישנם שני אבטיפוסים של פלסמידים היוצרים מספר עותקים גבוה – – high copy numberבכל תא. בנסיונות הראשונים לשיבוט אנזימים של גנים חשובים רצו שהתא החיידקי ישמש בית חרושת להפקת החלבון ,ולכן נדרש מספר עותקים גבוה של הפלסמיד .החסרון של חיידקים אלו הוא שכאשר 50% מהמסה החלבונית של התא היא חלבון זר ,הדבר עשו להיות טוקסי לחיידק. לשם כך יש גם רשימת פלסמידים מסוג low copy numberבעלי עותקים בודדים בתא .מנגד אפשר להכניס את התוצר תחת פרומוטור חזק המופעל על ידי משרן; בצורה זו אין ביטוי גבוה קונסטיטוטיבית אלא רק בזמנים מבוקשים ונתונים. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 62 טרנספורמציות • – Transformationהעברת DNAנקי לתוך חיידקים. • – Transfectionהחדרת DNAנקי לתוך שמרים ותאים אנימליים. • – Infectionהחדרת DNAבעזרת וירוס או פאג'. וקטור הפלסמיד צריך Oriעל מנת שיוכל להשתכפל ואלמנט סלקטיבי; תהליך החדרת ה DNA-לחיידק אינו יעיל .טיפולים לחירור הממברנה עוזרים ליעילותו ,בין שעל ידי פולסים של חום או תוספת יוני סידן הנקשרים ל DNA-הטעון שלילית ומחוררים את הממברנה. הטרנספורמנטים נזרעים על צלחת המתאימה לגן הסלקטיבי שעל הוקטור בכדי לבודד את החיידקים המעטים שהכניסו את הפלסמיד .מהרגע שהוקטור נכנס לחיידק הוא יכול להתרבות .ההתרבות תלויה ב Ori-של הוקטור. קביעת מספר עותקי הוקטור רפליקון – Coli1הפריימר לרפליקציית DNAהוא RNAקצר; הוקטור מסונטז בפרה-פריימר, .RNA2יש אפיניות גדולה של RNAל DNA-ולכן ה RNA-יכול לסלק מקומית את הגדיל של ה- DNAותוך השיעתוק נוצר היבריד .RNA-DNA אנזים בשם RNase-Hרואה את הדופלקס היברידי ומשחרר את מה שיהיה בהמשך הפריימר ליצירת ה- DNAהחדש .לאחר פילמור ההיבריד הוא .DNA-DNAיחד עם זאת ,קיים תהליך מתחרה בו RNA רגולטורי שלילי RNA1 ,הנמצא בקומפלמנטציה ופולאריות הפוכה ל ,RNA2-המסוגל בתחילת תהליך השיעתוק של RNA primerלעבור היברידיזציה עם הפריימר .יצירת ההיבריד היציב מונעת יצירת דופלקס ה RNA2-ssDNA-ומקטינה את הסיכוי שלו להחתך על ידי .RNAse-H זהו אלמנט רגולטורי שלילי המוריד את מספר העותקים .התחרות הקיימת בין החיתוך על ידי RNase-H וההיברידיזציה על ידי RNA1וחלבון רגולטורי שלילי ROPהתורם להורדת מספר העותקים היא שתקבע את מספר העותקים הסופי. מספר העותקים יכול לנוע בין מספרים נמוכים מאוד ) (1-2ועד מספרים גדולים מאוד ) .(3000השימוש הוא בהתאם לצורך בכמויות החלבון – כאשר צריך כמויות חלבון גדולות משכפלים אותו במספר עותקים גבוה; אם החלבון עשוי להיות טוקסי ניתן להשתמש במספר עותקים נמוך או להפעיל אותו תחת פרומוטור מושרה כמו ,LacZאשר כל עוד לא הוסף המשרן ביטוי החלבון ידוכא. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :08שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג' 63 שיעור :08שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג' פאג' למבדא יכול להדביק את הפונדקאי ,E.coli ,בשני מהלכים: • תהליך ליטי – גורם לליזיס של הפונדקאי ולמוות. • תהליך ליזוגני – לאחר ההדבקה ,במקום רפליקציה מסיבית הגנום של הפאג' עובר אינקורפורציה למקום מוגדר בגנום החיידק המאחסן .במשך הזמן ,בהינתן סינגל מסויים ,הגנום הנגיפי יכול לעבור הוצאה מדוייקת – – excisionמתוך כרומוזום החיידק ,להכפיל את עצמו ולעבור למצב ליטי. אורך המולקולה של DNAהפאג' הוא כ49,000- בסיסים; נראה שיש בעיה בשימוש בו כאתר שיבוט – מכיל יותר אתרי רסטריקציה .מדוע אם כן הפך גנום הפאג' מועדף לשיבוט גנים? כ 20,000-הבסיסים הפנימיים אינם מקודדים לפונקציות הכרחיות למהלך הליטי; תוך עבודה עם הזרועות השמאלית והימנית בלבד ניתן לקבל מהלך ליטי מושלם ,ולכן גודל איזור השיבוט האפשרי הוא מעט יותר מ .20kb-זאת בניגוד לפלסמידים ,שאפילו כשמקטינים אותם ל ,3kb-טרנספורמציה של 10kb מעלה בעיית יציבות. הזרועות השמאלית והימנית מכילות את כל הדרוש למהלך ליטי של הפאג' .יחד עם העובדה שEcoRI- הוא אחד מאנזימי הרסטריקציה הראשונים שגילו ,מתברר שמשני צידי איזור ה"מיותר" של גנום הפאג' נמצאים אתרי EcoRIכך שניתן לחתוך את הגנום באנזים ,להפריד בין הזרועות הימנית לשמאלית, למצות אותן ואז לשבט לתוכן מקטעי DNAעם EcoRIבקצוות. היתרונות של פאג' למבדא לא מסתכמים בכך: • הזרוע השמאלית מקודדת לחלבוני הראש שעוברים הרכבה-מקדימה ספונטנית .כמו כן באותו צד נמצאים הגנים לזנב ,אשר עובר גם הוא הרכבה ספונטנית. • למבדא מוזרק לתא דרך הזנב ומתחיל ,בעזרת אנזימי התא, להכפיל עצמו במנגנון .rolling circleהוא מייצר 100 עותקים של הגנום .התהליך יוצר כפילויות גנום מחוברות, כאשר המפריד בין היחידות הוא אתר COSואנזים מיוחד היודע לבקע אותו. • אנזימים נוספים ממלאים את ראש הויריון בגנום ולאחר מכן מחובר הזנב .כ 10%-מהקופסיות אינן מכילות DNAועדיין הזנב מתחבר אליהן ,עובדה המורידה מעט מיעילות התהליך. תהליך הדבקה בפאג' יעיל פי 1000מתהליך הטרנספורמציה על ידי DNAנקי לחיידק .מכאן שיש עוד יתרון :נוסף על החדרת DNAגדול יותר ניתנת יעילות הדבקה גבוהה פי .1000 הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 64 ב 1975-נעשה ניסיון הכנסת ספריית הhuman - cDNAהראשונה לתוך פאג' על ידי תום מניאטיס )Maniatis ,(Tom שהיה מחלוצי שיטות ריקומבינציית .DNAרוב ה mRNA-היונקיים מכילים בקצותיהם זנב פוליאדנילין באורך ממוצע של 180נוקליאוטידים ,המוסף לאחר השיעתוק. ניתן לנצל עובדה זו על מנת לבודד את הmRNA- משאר ה RNA-שבתא ,כיוון שידוע שmRNA- מהווים רק 2-5%מכלל ה RNA-בתא )הרוב זה .(rRNA לשם כך מכילים קולונות קצרות המכילות חומר תווך דוגמת צלולוז ,אליו הודבקו .oligo-dT האוליגומר יוצר היבריד עם ,Poly-Aוכאשר מעבירים את כלל ה RNA-בקולונה בתנאי מלח גבוה ,חומצות הגרעין הנותרות בקולונה הן רק mRNAשניתן להסיר בהורדת ריכוז המלח. ) (1מניאטיס בודד את ה mRNA-והכניס אותם למבחנה עם oligo-dTקצרים ) 12בסיסים בערך(. האוליגומר יוצר היברידיזציה בנקודה כלשהי על זנב ה poly-A-וכך משמש פריימר לפעילות של RT ) ,(2אשר מסוגל לבנות DNAעל RNAוDNA- על DNAלאחר ש RNase-H-ביקע את הקשר של ההיבריד DNA-RNAוסילק את ה.RNA- בשלב הבא ) (3מוסיפים אלקלין ליצירת סביבה בסיסית שמפרקת DNA) RNAעמיד בפניו( .כמו כן מוסיפים poly-Gבקצה המנוגד ל Poly-T-על חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :08שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג' 65 ידי ,Terminal Transferaseהמופעל לזמן קצר בנוכחות dGכך שהוא מכניס הרבה פוליגואנין לגדיל. לאחר מכן ) (4עושים היברידיזציה עם oligo-dCכפריימר שעובר פולימריזציה ) (5ומקבלים סיב DNAמשלים .באופן הזה מתקבל DNAדו-גדילי מסוג – cDNAקומפלמנטרי ל.mRNA- בשלב הזה יש להכניס את הדו-גדיל בין שתי הזרועות של למבדא .לשם כך צריך אתרי חיתוך –EcoRI המתקבלים על ידי הכנסת אתרי החיתוך בצורה דו-גדילית שיחוברו לקצוות ה DNA-על ידי ליגאז ו- .ATPאולם ,כאן עולה בעיה :הגנום האנושי יכול להכיל אתרי חיתוך של ,EcoRIדבר שייפגע בגן עצמו .כדי להימנע מכך בודדו את ה ,EcoRI Methylase-שממתל ) (6את הדו-גדיל )לפני חיבור האתרים הייעודיים לחיתוך (7 ,ומקנה עמידות לאתרי הכרה/חיתוך אקראיים שעשויים להימצא בתוך גדילי ה .cDNA-עכשיו ניתן לחתוך בעזרת אנזימי ההגבלה המתאימים ).(8a היום חברות ביוטכנולוגיות מייצרות ) EcoRI adaptorאו לכל אנזים הגבלה אחר( שהוא כבר מייצג את הקצה החתוך על ידי האנזים ,עם הקצוות הדביקים .מבצעים ליגציה של האדפטור לקצוות ולא צריך לדאוג להגנה על האתרים בתוך הגן כי לא נעשה חיתוך באנזים ההגבלה בפועל. בשלב הבא מערבבים את שתי הזרועות המבודדות ) (8bשל למבדא ועושים ליגציה עם תערובת ה- .(9) cDNAתודות לקומפלמנטציה מתקבלות מולקולות שלמות שיכולות להיארז בקופסיות ויריון ריקות ) ,(10המעדיפות להתחבר לזנב רק לאחר הכנסת .DNA מדוע הזרועות הקומפלמנטריות לא חוברות אחת לשניה ישירות ללא cDNAביניהן? על בעיה זו מתגברים בעזרת שימוש בעודף מולארי של ה cDNA-על פני הזרועות .לפעולה יש חיסרון כי יכולה להיות ליגציה של ה cDNA-לעצמו .למניעת מצב זה ניתן לטפל בפוספאטאז ,המוריד את 5'-phosphateהמונע ליגציה של מולקולות cDNAאחת לשנייה .הקשרים הקוולנטים החסרים ייווצרו רק בתוך החיידק. דרך נוספת שנוצרה עם הזמן היא הקטנת הזרועות לגודל מינימלי של 78%מגודל הפאג'; מתחת ל,78%- האורך של הזרועות אינו מספיק כדי להיארז לתוך קופסית ולכן זרועות קצרות אלו המחוברות אחת לשנייה לא ייצרו פאג' תקין .הדבר מונע יצירת ויריונים עם זרועות בלבד. את הפאג'ים עם ה cDNA-זורעים על צלחת מלאה בחיידקים ) .(11מכל הדבקה של מולקולת פאג' אחת נוצרים 100תוצרים המפוצצים את מעטפת החיידק ותופסים את החיידקים השכנים; כל אחד מהם יוצר עוד ;100לאחר כמה הדבקות ניתן לראות פלאקים המכילים אלפי פאג'ים .זהו תהליך אמפליפיקציה מאוד גבוה של כל אחת מהמולקולות שמבקשים לפתח ולהרבות. על מנת לגלות האם באחת הפלאקים יש cDNAמעניין ,ניתן להשתמש בגלאי רדיואקטיבי קומפלמנטרי .אם ידועות 7חומצות אמינו מתוך החלבון ,ניתן לסנטז אוליגונוקליאוטידים של 21בסיסים היפותטיים של השילובים השונים של הקודונים היוצרים את רצף חומצות האמינו המוכר; מסמנים רדיואקטיבית את הנוקליאוטידים. על גבי פילטר צלולוז או ניילון ,גורמים לליזיס של הפאג'ים בטיפול באלקלין ופותחים את דו גדיל של ה- DNAבמקומו .בעזרת הגלאי המסומן ,הקומפלמנטרי לגן המבוקש ,ניתן לסמן רצפי DNAעם הגן .את עודפי האוליגומרים שוטפים ונותרים ה DNA-המקובעים והאוליגומרים הקומפלמנטרים הנשארים על גבי הפילטר. כעת חושפים את הפילטר לפילם ורואים היכן יש חשיפה .בתנאי המעבדה ,הדבר נעשה על ידי הנחת ניטרוצלולוז על הצלחת של הפלאקים למשך דקה; חלק מהפאג'ים נדבקים ואז מוציאים ומכינים דופליקט הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 66 באופן דומה .כך יש שני דופליקטים של ניטרוצלולוז ועדיין יש מספיק פאג'ים על גבי הצלחת .עושים ליזיס של הפאג'ים ,פיקסציה של ה DNA-על הניטרוצלולוז ,חשיפה לאוליגומרים ואז חשיפה לפילם ומוצאים שאחד הגלאים הגיב עם אחד הפלאקים .מכאן שהפלאק מכיל רצף קומפלמנטרי. ניתן לבודד את הפאג'ים ולבחון מקרוב האם זה ה- cDNAהקומפלמנטרי ל 6-7-חומצות האמינו .אם זהו רצף רפטיטיבי ,יש בעיה. היום לא משתמשים בשיטה זו ,כיוון שרוב הגנים ידועים ,ולכן נעשה שימוש ב.PCR- ידוע שישנם כ 25,000-גנים הומניים )למרות שבכל תא או רקמה יש גנים ייחודיים( .כמה פאג'ים יש לסרוק לגילוי הגן הייחודי מבין 5,000גנים שונים המבוטאים ברקמה כלשהי? לא כל הגנים מייצרים mRNAבמידה שווה; 10% מה mRNA-בכל תא מיוצרים בהרבה יותר עותקים מהאחרים .משום כך לא מספיק לקחת 5000פאג'ים וגם לא .10,000יש להתחשב גם בפרוססיביות הנמוכה של ה .RT-ב mRNA-מאוד ארוכים – 10- 12קילובסיסים – אין סיכוי ש RT-רגיל ייתן את כל הגן .אחד הפתרונות הוא לא להשתמש רק בפוליאדנילין בתור פריימר אלא גם באוליגונוקליאוטידים קצרים של 6בסיסים המוספים לפני ה .RT-הם נצמדים לרצפים קומפלמנטרים ומשמשים פריימרים לסינטזת .RTבאופן זה ניתן לייצג אזורים שונים של ,mRNAולא רק איזור ה- '.3 לגן יכולים להיות גם יותר מאתר Poly-Aאחד או שיהיה לו שיחבור חלופי המשנה את הרכב האקסונים; גורמים אלו מגדילים את מספר המושבות שיש לסרוק .בסך הכל יש לסרוק כמיליון פאג'ים. בצלחת גדולה ניתן להכניס עד 50,000פאג'ים )לשם השוואה ,ניתן להכיל 500-1000מושבות מבודדות בצלחת לכל היותר – יש הבדל של סדרי חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :08שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג' 67 גודל בין מספר המושבות שניתן להציג בצלחת( .לא כל ה 50,000-יוצרים פלאקים מבודדים – במצב זה כל המשטח עובר ליזיס והפאג'ים מתערבבים אלו באלו .דגימה מכילה 50פאג'ים במקום פאג' אחד; הדגימה נמהלת ,נזרעת מחדשוממנה מבודדים את הפאג'י הרלוונטי .מסיבה זו העובדה שיש צורך במיליון פאג'ים אינה מרתיעה ועדיין יעילה יותר משימוש בחיידקים. ניסוי ללנד הרטוול היה גנטיקאי שבחר לפצח את מחזור התא בשמרים .לשם כך הוא יצר כ 60-שמרים מוטנטים הפגועים במחזור התא ,שרובם רגישים לטמפרטורה גבוהה .העלאת הטמפרטורה עצרה את מחזור התא ובשמרים ניתן לראות מורפולוגית מהו שלב המחזור בו התא נמצא. התקדמות מחזור התא ,כך העלתה ההיפותזה, מבוססת על קינאזות, פוספורילציה ודה- פוספורילציה .הרטוול לקח פלסמיד המכונה – shuttle vectorהיכול להיות בשתי סביבות ולעבור שיכפול בחיידקים כמו גם בשמרים )בעזרת Ori חיידקי ו- [autonomousely ARS ] .(replicating sequenceכדי שהרטוול יכיר את הוקטור הוא מכיל גם גורם סלקציה – עמידות לאמפצילין )חיידקים( ו URA3-תקין ההכרחי לבניית נוקליאוטיד ) Uמוכנס לשמר פגוע .(ura3 הוקטור מכיל polylinkerהמסוגל להיחתך על ידי BamHIולקלוט גנום .cDNAהוא חתך את הגנים של השמר בחיתוך חלקי על ידי Sau3Aלקבלת פרגמנטים בגודל 2-3קילובסיסים .לאחר שמכניסים אותם לתוך הוקטור ,מכניסים את הפלסמיד לחיידקים ,אוספים את המושבות ,ומפיקים מהן .DNAבשלב הבא עושים טרנספקציה של ה DNA-המנוקה לתוך שמרים וזורעים אותם על מצע ללא אורציל. לאחר הזריעה של השמרים מעבירים אותם לנייר ניטרוצלולוז ,זורעים רפליקט בצלחת ומעבירים אותה לטמפרטורה גבוהה .במצב זה רוב המושבות מתות ,כי הם מוטנטים ,למעט כמה בודדות .הבודדות האלה יכולות להיות כאלה שיש להם את הגן החסר על cDNAאו רברטנטים. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 68 שיעור :09איפיון ושימוש במקטעי DNAמשובטים אלקטרופורזה יכולה להיעשות בתווך שונה ,כמו אקרילאמיד לעומת אגרוז סטנדרטי או אגרוז pulse ,fieldכאשר השוני בין התווכים הוא גודל הנקבוביות בין הגרגרים של התווך .ככל שהמקטעים גדולים יותר הם ייתקשו לחדור בין החלקיקים ,ולכן גודל המרווחים קובע את גודל ה DNA-שיוכל הג'ל להפריד .ככל שריכוז האגרוז נמוך יותר ,הוא יאפשר הפרדה של מולקולות יותר גדולות. • אקרילאמיד – 10-1000זוגות בסיסים • אגרוז סטנדרטי – 500-25,000זוגות בסיסים • אגרוז 10,000-2,000,000 - Pulse Fieldזוגות בסיסים אגרוז בריכוזים נמוכים מ 0.5%-לא יהיה קשיח מספיק כדי להוות ג'ל ולכן אינו פרקטי. ההפרדה משאירה את הפרגמנטים הכבדים למעלה ואת הקצרים למטה. כאשר מוסיפים את הג'ל לתמיסת אתידיום ברומיד ניתן לצבוע אותו ולראות היכן נמצאים הפרגמנטים. סאות'רן הציע גם להעביר את הג'ל לנייר ניטרוצלולוז או ממברנת ניילון כך שעל גבי הממברנה מתקבלת תמונת ראי של ה DNA-כפי שהוא מצוי בתוך הג'ל .הסיבים של ה- DNAהדו-גדילי ניתקים אחד מהשני בעזרת אלקלין ,כך שהם פנויים לעבור היברידיזציה עם גלאי DNA מסומן המוצא פרגמט DNAספציפי. שיטות הרצה – סאות'רן ,נורת'ן ,ווסטרן שיטת סאות'רן-בלוט השיטה פותחה על ידי אד סאות'רן וקרויה על שמו. לאחר הרצה של הג'ל ,מניחים את הג'ל על מגש זכוכית ושמים בקערה המכילה תמיסה אלקלית .על גבי הזכוכית מניחים נייר סופג שקצותיו מוספגים בתמיסה האלקלית .על גבי הנייר מונח הג'ל ומעליו נייר הניטרוצלולוז או הממברנה .על גבי הממברנה חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :09איפיון ושימוש במקטעי DNAמשובטים 69 מניחים עוד נייר ספוג .בכוח הנימיות התמיסה עוברת דרך הנייר הסופג הראשון ואל השני ,דרך הג'ל; במעבר בג'ל התמיסה קוטפת את הDNA- שעובר לנייר הניטרוצלולוז אך אינה יכולה להתקדם הלאה .באופן כזה ,בתוך כמה שעות ,כל תכולת הג'ל עוברת לנייר הניטרוצלולוז. הנוכחות של התמיסה האלקלית גרמה להיפרדות ה- in situ DNAלשני הגדילים שלו ,כך שהוא במצב חד גדילי על הנייר ומוכן לעבור היברידיזציה עם גלאי בעל רצף בסיסים מתאים .בשלב האחרון עורכים את ההיברידיזציה וחשיפה של הנייר לפילם וכך מגלים היכן נמצא הגן המבוקש. שיטת נורת'רן-בלוט מדען מסטנפורד ערך מודיפיקציות לשיטה כך שתתאים גם לשימוש עבור גדילי .RNAגדילי הRNA- עוברים הפרדה בעזרת פורמלדהיד .זוהי שיטה משלימה לסאות'רן אלא שהעבודה בה נעשית עם RNA והג'ל מורץ עם גדילים בתנאים דה-נטורטיבים. שיטת ווסטרן בלוט בשיטה זו נעשת הפרדה של חלבונים בג'ל ,SDS-PAGEכאשר החלבונים מאותרים על ידי נוגדנים ספציפיים כנגד אפיטופים של החלבון המבוקש .גם בשיטה זו יש העתקה של החלבונים שהורצו בג'ל לממברנה אשר כנגדה מופעל הנוגדן. שיטת ריצוף הDNA- ב 1978-התפרסמו שני מאמרים עם שתי שיטות שונות לחלוטין לקביעת רצף .DNAהשיטה המקובלת היא שיטתו של ,Fred Sangerכימאי אורגני אנגלי שפיתח שיטה לקביעת רצף מרכיבי חומצות האמינו בחלבון )וזכה בנובל( ואז הסב את עניינו לקביעת רצף ה.DNA- השיטה מכונה .dideoxy chain termination methodהיא משתמשת בנוקליאוטיד תלת-פוספט די-דיאוקסיריבוז ),(ddNTP כלומר עמדה ' 3של סוכר הריבוז בנוקליאוטיד אינה מכילה OH אלא .Hזאת לעומת הנוקליאוטיד הרגיל ,שהוא דיאוקסיריבוז, אשר חסר לו רק חמצן אחד בעמדה .'2 הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 70 כאשר מכניסים בסינטזת ה DNA-את ה ,ddNTP-הוא יוצר בקשר ' 5'-3דרך הפוספט אולם אינו מסוגל להמשיך את הארכת השרשר – אי אפשר לקשור עוד נוקליאוטידים כי אין OHבעמדה ' .3ברגע ש- ddNTPעובר אינקורפורציה לגדיל ,נפסקת ההתארכות של הגדיל. משום כך ,כאשר מניחים לפולימראז לסנטז DNA עם ריכוז מסויים של ddNTPספציפי ,ניתן יהיה לקבל גדילים קטועים בנקודות שונות כך שניתן יהיה לנתח אילו בסיסים מוספים באיזה סדר. הדבר נעשה בעזרת ארבע מבחנות שונות ,כאשר כל מבחנה מכילה ריכוז נתון של ארבעה dNTPוריכוז 1/100או 1/50של אחד מה .ddNTP-באופן רנדומלי ddNTPייכנס במקומות שונים ולכן ייווצרו חד-גדילי DNAהמופסקים בנקודות שונות של אותו .ddNTP כאשר יש ארבע מבחנות שבכל אחת ddNTPשונה, ניתן להריץ את התוצרים בג'ל )עם צביעה בברומיד( והג'לים )אקרילאמיד עם אוראה לצורך דה- נטורציה( ,שיכולים להפריד בין גדילים הנבדלים בבסיסים אחד בטווח שבין 10-1000בסיסים, מספקים תמונה של מגוון בנדים בכל אחת מהבאריות – בארית ,A C ,Tו .G-כאשר מתחילים מהגדיל הקצר ביותר )התחתון( ועולים כל פעם באחד ,ניתן לדעת מה היה רצף הנוקליאוטידים. לצורך שיפור השיטה ,התקינו לייזר בתחתית הג'ל שמעורר פלורופורים שונים שמחוברים ל ddNTP-ספציפיים )למשל אדום ל ,G-ירוק ל T-וכן הלאה( .בצורה כזו לפי קצב היציאה של ה- emissionמהג'ל ניתן לזהות את הנוקליאוטיד שבקצה השרשרת, וכך מתקבל גרף פיקים אשר בהפרדה אחת – בהרצת בארית אחת – מציג רצף של עד 700בסיסים. השיטה משתמשת בהרצה של דידיאוקסינוקליאוטידים עם פלואורפורים ייחודיים לכל נוקליאוטיד כך שבהרצה אחת ניתן יהיה להפריד את הגדילים ולזהות עד 700בסיסים. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :09איפיון ושימוש במקטעי DNAמשובטים 71 PCR – Polymerase Chain Reaction שיטה זו יצאה לראשונה ב 1985-וזכתה תחילה לזלזול בחשיבותה; המהפך חל ב 1988-עם שיפור השיטה .הממציא של השיטה הוא קארי מוליס ,אוסטרלי שעבד בחברת ביוטכנולוגיה ליד ברקלי ,ושיטתו ניסתה להפיק כמויות גדולות של DNAללא שיבוט – באמצעי טכני ,לא ביולוגי לכאורה. הטכנולוגיה הייתה להשתמש בדו-גדיל של .DNAבשלב הראשון נעשית דה-נאטורציה על ידי חימום ה- DNAל 92°C-למשך דקה .לאחר מכן מוסיפים עודף פריימרים )אוליגומרים קצרים ,עד 18בסיסים( הקומפלמנטרים לכל אחד משני הסיבים משני קצותיו של מקטע מבוקש .לאחר מכן ,כשמוסיפים פולימראז ונוקליאוטידים מתקבלת הארכה של השרשרת .בשלב הבא מתחיל מחזור נוסף. כל מחזור מורכב משלושה חלקים: • דה-נטורציה – פותחת את הגדילים על ידי חימום. • אנילינג – הפריימרים יעברו היברידיזציה עם המקטעים הקומפלמנטרים שלהם. • הארכה – הפולימראז משתמש בפריימרים כדי לסנטז את הגדילים. בתלות בהרכב הבסיסים של הפריימרים ,שלב האנילינג נעשה בטמפרטורה של .50-70°Cהשלב השלישי נעשה לאחר קירור ל37°C- על מנת שהפולימראז יעבוד. על מנת להתחיל במחזור חדש יש לחמם שוב לצורך דה-נטורציה .שלב זה ,של חימום גבוה מאוד ,פגע בפולימראז והרג אותו – ולכן היה צריך להוסיף פולימראז חדש בכל מחזור .בשל כך ב 1985-הריאקציה היתה לא יעילה והוכרזה כלא עובדת. ב 1987-קארל מוליס הצהיר שיש לחפש פולימראז עמיד לחום על מנת שניתן יהיה לעבוד עם השיטה; פולימראז כזה ניתן יהיה להפיק מאורגניזמים הרגילים לחום ,למשל יצורים שחיים בסביבת הגייזרים של ילוסטון .הפולימראז שמצאו שם הוא כזה שעמיד לחום ב 92°C-ועבד אופטימלית ב.72°C- מכאן ,שבזמן 0כשמתחילים את התגובה ניתן כבר להוסיף את הפולימראז ואפשר להריץ מחזורים רבים ללא הוספת אנזים .בצורה זו השיטה הפכה משיטה לא יעיה לשיטה אשר בתוך מחזורים ספורים בלבד ניתן לקבל את הפרגמנטים המוגדרים על ידי הפריימרים בכמויות עצומות .האנזים שעשה את ההבדל הוא .Taq polymerase ה PCR-דורש כתחל פרגמנט מאוד קצר – 18נוקליאוטידים .כיום מייצרים אנזים taqמאוד פרוססיבי, כך שניתן לקבל חתיכות של עד 20kbשל גנום – גנים שלמים במקרים של שמרים – בפעילות פשוטה. לפריימרים אפשר להוסיף בקצה ' 5אתרי רסטריקציה .על אף שאין הומולוגיה בין אתרי הרסטריקציה לתבנית ,מהר מאוד הרצף המקביל יפלמר את הרצף הזר .בצורה זו ניתן יהיה לחתוך את הגדיל הנוצר הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 72 בריאקציה ולשבט אותו לפלסמידים .מניפולציה קטנה זו גרמה לכך שניתן יהיה לשבט בקלות איזורים שהוגברו ב.PCR- קשה לתאר היום שטחים חשובים במדעי החיים והרפואה ללא :PCR • דיאגנוסטיקה רפואית – בעבר היו משתמשים בחתיכת נייר שהועברה על השיניים והונחה במצעי גידול שונים על מנת לזהות חיידקים מזהמים; PCRמאפשר לזהות את החיידקים לפי רצפי DNA ידועים של גורם פתוגני ,למשל. • שיטות השיבוט ,בימינו ,אינן מקובלות בתחום הרפואה כי הגנום היום ידוע; לכן ניתן להשתמש בערכה )קיט( להגברה או לשיבוט על מנת למצוא ולהגביר גן מסויים. • מעבדות מז"פ וחקר האבולוציה – יש מספיק DNAבשערה אחת על מנת לקבוע את הזהות והשייכות שלה לחשוד .גם מציאת DNAקדמוני על מנת לזהות את האבולוציה של מינים שונים, בכללם האדם ,נעזרת ב.PCR- ריצוף מסיבי מקביל in situאו Deep DNA Sequencing כאשר מבקשים לקבוע את רצף הגנום השלם – לא רק הקומפלמנטרי או הגנים אלא כלל הגנום – של אדם ,עומדים למעשה בפני משימה אדירה – שכן בבני אדם יש 3x109זוגות בסיסים .שיטה זו היא המסייעת בכך. העקרון הראשון הוא שלא משנה מהי החברה המשתמשת במיחשוב ,התוצר המתקבל הוא אוסף רב של מקטעי .DNAבמכשירי Solexaמתקבלים 35בסיסים ,ב Roche-מתקבלים מקטעים של 120בסיסים. אם רוצים לקבוע רצף של יצור לא מוכר ,השיטה אינה טובה – המקטעים קצרים מדי ומקשים על העימוד של הגדילים ללא אבטיפוס או תבנית של הגנום. לשם כך שוברים גנום מבוקש ,למשל של אדם ,לחתיכות קצרות; בעזרת ליגאז מוסיפים מולקולות adapterבקצה אחד ולאחר שהדבר מושלם מוסיפים adapterשונה לקצה השני .בצורה זו מתקבלות מולקולות שיש להן שני מתאמים שונים משני הקצוות. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :09איפיון ושימוש במקטעי DNAמשובטים 73 בשלב הבא יש לקבע את הרצפים במצב חד-גדילי לתמוכה ).(in situ לשם כך משתמשים בסיליקון מיוחד, עושים דה-נטורציה של הDNA- להפרדת הגדילים ומקבעים את ה- ssDNAדרך אחד מקצותיו לסיליקון. בנוסף מקבעים על הסיליקון באותו השלב פריימרים – גדילי הadapters- – בצפיפות גבוהה יותר מאשר הגדילים .כך מתקבל גדיל מקובע וסביבו פריימרים הזהים למתאמים. בשלב השלישי ,מבצעים Bridge – PCRה ssDNA-שבקצהו מתאם מסוגל להכיר ולעבור היברידיזציה עם הפריימר הקומפלמנטרי שמקובע לסיליקון לידו ,וכך הגדיל מתכופף על מנת לעבור היברידיזציה .בשלב הזה ניתן להוסיף polymerase taq לקבלת תוצרי PCRמקושתים על גבי הסיליקון. לאחר מכן נעשה עוד מחזור דה- נטורציה להפרדת הקשת; מכיוון שכל גדיל מקובע למשטח דרך אחד מהפריימרים מתקבלת הגברה של עמודי ה ssDNA-המקובעים .על המחזורים הנ"ל חוזרים שוב ושוב על מנת להגדיל את שכיחות החד- גדילים על המשטח. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 74 בסופו של תהליך מתקבלים צברים של ssDNAsשכולם התחילו מגדיל ssDNAיחיד .השאיפה היא שיהיו כ 1000-תוצרים בכל צבר .הללו דרושים על מנת להניב סיגנל מספיק חזק בשלב המתקבלים הריצוף. הצברים בטכנולוגיה התקבלו בהתחלה בשכיחות של 40מיליון. בהמשך הצליחו לדחוס אף למעלה מ- 100מיליון צברים על משטח. השלב הבא הוא הריצוף .כל צבר מחובר לנקודה מיקרוסקופית על המשטח .תחילה מוסיפים את אחד מהפריימרים המתאמים – למשל הסגול – אשר עובר היברידיזציה עם ה ssDNA-המכילים את הפריימר הקומפלמנטרי חופשי .לאחר מכן מוסיפים .ddNTPהפלמור נמשך לאורך נוקליאוטיד אחד בלבד .כעת מערכת לייזרים מקרינה מצד אחד ומערכת דימות מסתכלת על 100 מיליון נקודות הצברים וקובעת באיזו נקודה נכנסה איזה סוג פלורסנציה )דהיינו איזה .(ddNTP ה ddNTP-והפלורופור שנמצאים בשימוש כאן הם רברסיבילים – מורידים את הפלורופור שחוסם את ה ddNTP-כך שהוא הופך לנוקליאוטיד המשכי ,מוסיפים שוב ,ddNTPומקבלים את הנוקליאוטיד הבא שמתחבר בכל אחת מ 100-מיליון הנקודות. • • מערכת הדימות מחוברת למחשב הקובע מהו הרצף בכל נקודה והם מחפשים הומולוגיה של הרצף המתקבל לרצף ידוע. הכמויות המדוברות הן קטנות מאוד ,ולכן באופן יחסי הריאקציה זולה פי 100מאשר ריאקציות ישנות יותר. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :10שימוש במקטעי DNAמשובטים 75 שיעור :10שימוש במקטעי DNAמשובטים Deep DNA sequencingיכול להגיע לעלויות שבין $500-4000להרצה ,ומרצף בהיקף של 1010זוגות בסיסים ,פי 3מגודל הגנום האנושי ,באחה"צ אחד .במכון ברוד בוושינגטון יש 96מכונות כאלה – לשם השוואה למספר מכונים בודדים בארץ יש רק מכשיר אחד .המכון הוא שיתוף פעולה ייחודי בין MIT והרווארד עם מקדמה של 600מיליון דולר ,כך שיש להם האמצעים הכלכליים להפעיל כמות כזו של מכונות ריצוף. הפיתוח של ריצוף ה DNA-הוביל לכך שניתן לקחת את ה RNA-שבתא או ברקמה ,להפוך אותו לcDNA - counterpartולרצף אותם – כך שניתן לקבל את הריצוף של ה mRNA-המתורגמים באותה הרקמה. שיטה זו קיבלה את הכינוי .RNA-seqכיום ניתן לקבוע בהרצה אחת את כל ה RNA-הקצרים בתא ביום אחד ,עבודה מפרכת שהייתה בלתי אפשרית בעבר. כשפותחה היכולת לבודד cDNAהומני ,חברות מסחריות וחוקרים ייצרו כמויות גדולות של חיידקים המכילים את תוצרי הגנים החשובים – דוגמת ה- cDNAשל G-CSF – granulocyte colony .stimulating factorהם לקחו פלסמיד עם הפרומוטור של lacZוהכניסו במקום lacZאת הגן המבוקש .בעזרת המשרן IPTGניתן לקבל בתמיסה כמויות גדולות של החלבון – עד 50%מתכולת החלבון החיידקי תהיה החלבון המבוקש. יחד עם זאת ,התקוות להתעשרות מייצור מאסיבי של חלבונים אנושיים התבדו .הסיבה היא שהסתבר שלצורך פעילותם הנורמלית של החלבונים נדרשות מודיפיקציות המתחוללות באופן אופייני בתאי יונקים ואינן מצויות בחיידקים .החלבון המתקבל אינו זהה לחלבון ההומני ,למען זהות ברצף חומצות האמינו ,דבר המוריד מערך פעילותו .לכן החברות החלו לבטא חלבונים אלו במערכות יונקיות. טרנספקציות לתאים ממליים טרנספקציה זמנית וקטור הביטוי מורכב מפרומוטור ואחריו cDNAשל הגן המבוקש. ה cDNA-מכיל רצף של AAUAAAהמאותת לתא כי זהו סוף ה .mRNA-אנדונוקליאז מגיע לאתר, מזהה אותו ,מוריד 12-15נוקליאוטידים מהקצה של הmRNA- ומוסיף במקומם polyA בתהליך פוליאדנילציה. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 76 בפועל ,לעיתים קרובות התהליך אינו יעיל ולכן מרבית הוקטורים מכילים PolyA Addition Siteהמכניס באופן סינטטי את אתר ה AAUAAA-לתוך ה mRNA-המשועתק מגן העניין שהוכנס לוקטור בכדי לוודא התרחשותו של תהליך הפוליאדנילציה. בוקטור הביטוי אין אינטרון – הניסיון הראה שהכנסה של אינטרון אינה גוררת הבדל ,ולמרות שלכמה מהגנים זה עזר לאחרים זה אך הוריד את רמת הביטוי .משום כך מעדיפים לעבוד עם גנים ללא אפשרות השיחבור .שימו לב שהוספת אינטרון כוללת גם הוספת איזורי זיהוי של אקסון. הוקטורים מכילים לרוב כם .Viral origin of replicationמכיוון שהביטוי בתא היונקי הוא זמני, בוחנים אותו למשל 24-96שעות .לאחר יותר מ 72-שעות גורמות ל DNA-לעבור אינטגרציה לכרומוזומים בגרעין ,והביטוי שלו אבוד .הסיבה היא שמאות העותקים המצויים בגרעין עוברים אינטגרציה או דגרגדציה ,ולכן יורדת מידת הביטוי .על מנת להגביר את מספר הוקטורים בגרעין, הוסיפו OriRשל נגיף כלשהו ,דוגמת ה ,SV40-אשר בייצור חלבון ויראלי אחד – Large T Antigene – מאפשר למערכת התאית להכיר אותו כרפליקון ולספק הגברה של הביטוי .הגן הויראלי נמצא באיזור הקידוד המוקדם של הוירוס ,ולכן ניתן היה לקחת את הסגמנט OriR+earlyשל הוירוס. הכנסת ה DNA-העירום לתא נעשית על ידי חירור של הממברנה המאפשר למאקרומולקולות להיכנס לתא – בין אם על ידי פריקת קבל חשמלי )אלקטרופוראציה( או טיפול בתמיסה שמצפה את הDNA- ומעודדת את איחויו עם המעטפת הליפידית שבין התא והליפוזום שתופס את המאקרומולקולות. טרנספקציה יציבה גם כאן מתחילים בהחדרת ה DNA-העירום לתאים באותן שיטות; אולם כעת יש לבודד את פרקציית התאים הקטנה שלהן חדר ה DNA-הפלסמידי ובהן הוא מבוטא. הישארות ה DNA-כאפיזום או לאחר אינטגרציה אקראית לכרומוזום)ים( היונקיים הוא תהליך לא יעיל – 1מתוך 10,000תאים מבטא גנים מהפלסמיד .משום כך יש להשתמש בגורם סלקטיבי שייפטר מהתאים האחרים .בחיידקים אלמנט זה כונה .dominant selective marker באיור ניתן לראות עמידות לאנטיביוטיקה ניאומיצין- סולפאט ) ,(neorהמעכבת את שלב ההארכה ) (elongationבתרגום .האנטיביוטיקה מאבדת פעילות אם היא מזורחנת ,והגן לעמידות עושה בדיוק זאת .התאים הבודדים שהכניסו את הפלסמיד ,חתכו אותו סביב הגן לעמידות לניאומיצין והכניסו אותה באינטגרציה לגנום התא יוכלו לנטרל את האנטיביוטיקה ולשרוד. זה היה הסמן הסלקטיבי הדומינננטי הראשון .אחריו הופיעו אחרים לאנטיביוטיקות אחרות. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :10שימוש במקטעי DNAמשובטים 77 העובדה שיש עמידות לניאומיצין אינה ערובה לביטוי לגן העניין – האינטגרציה של עמידות לניאומיצין נעשית באופן בלתי תלוי לאינטגרציה של גן העניין ואינה מבטיחה אותה .להגדלת הסיכוי לתאחיזה בין שתי היחידות מבצעים חיתוך מוקדם של הפלסמיד באיזור הימני לגן הניאומיצין; חיתוך זה יוצר DNAלינארי .ה DNA-הלינארי מעדיף לעבור אינטגרציה דרך הקצוות שנוצרו – וכך ניתן לכוון את הקצוות החופשיים שיעברו אינטגרציה לגנום )גם אם לא ניתן לכוון את מקום האינטגרציה( .כתוצאה עולה פי 10ההסתברות לאינטגרציה של שני הגנים בגנום. ניתן להשתמש בשיטות אחרות על מנת לקשר בין שני הגנים .הוקטור הבא הוא וקטור מאוחר יחסית, כאשר הגן לעמידות נמצא אחרי הפרומוטור הויראלי החזק ואתר הוספת .PolyAהוקטור מיועד לחקר של פרומוטורים – המוכנסים ל ,MCS-ואז מביאים לשיעתוק וביטוי ה GFP-הסמוך GFP .ניחן ביכולת לאחות אותו לחלבון בקצה הקרבוקסילי ,באותה מסגרת קריאה ,מבלי לאבד מהפעילות של אף אחד מהחלבונים המאוחים .בצורה זו ניתן לראות בעיניים – אפילו לפני בדיקת תפקוד החלבון – האם הוא נכנס לפי בדיקת הזוהר של ה.GFP- דרך אחת לקבל תאים פעילים היא להצמיד את ה GFP-כגן מדווח לגן/פרומוטור העניין .זהו אינו גן סלקטיבי ,אלא אם משתמשים בו לצורך מיון בעזרת .FACSלעומת זאת ,ה neo-הוא הסלקטור הדומיננטי אך אינו יכול להבטיח שמי שמכיל את העמידות מכיל את גן העניין. על מנת ליצור תאחיזה בין הסמן הסלקטיבי וגן העניין קיים האלמנט התרגומי IRES (internal .(ribosome entry siteביונקים קיימים – mRNA monocystronגן אחד בכל .mRNAלרוב ,ה- AUGהראשון מה 5'-הוא ה AUG-בו מתחיל התרגום .בנגיפים מסוג הפוליו יש אפשרות ל– IRES- הריבוזום לאו דווקא יכיר את ה AUG-הראשון מ 5'-אל ' ,3אלא יהיו לו 3מסגרות קריאה בהן הוא יכול להיכנס סימולטנית באופן בלתי תלוי .על ידי משחק בקונפורמציה של ה mRNA-ניתן להכווין את הריבוזום לאתרים ספציפיים .אלמנט ה IRES-מאפשר לריבוזום לראות את מסגרת הקריאה המתאימה. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 78 היישום המחקרי יצר יחידת תרגום דו-ציסטרונית הכוללת את החלבון לעמידות ואת הגן המעניין .ביניהם יש יחידת .IRESבצורה זו אותו הפרומוטור מאפשר הפעלה של שני הגנים .המצב היחיד שבו תהיה הפרדה בין הגנים יהיה אם תהיה שבירה ביניהם ואינטגרציה של הגן לעמידות לצד פרומוטור חזק בגנום. ה IRES-הוא מנגנון יעיל ליצירת mRNAפוליציסטרוני .התופעה של אופרונים פוליציסטרונים מוכרת בפרוקריוטים ,אך באאוקריוטים זה לכאורה לא קיים; ה IRES-יוצר פוליציסטרוניות מלאכותית .עם זאת, ניתן ליצור mRNAעם מסגרת קריאה פתוחה בצמידות לגן אחד ,להכניס AUGהחופף חלקית את הטרמינטור והנמצא במרחקים הולכים וגדלים ממנו .במצבים כאלה רואים שכנראה הריבוזום שנופל לאחר קודון העצירה מסוגל לזחול מעט קדימה ל AUG-קרוב שהינו חופף או סמוך לנקודת הטרמינציה. שיעור :10אנליזה בהיקף-גנום של ביטוי גנים בסביבות שנת 2000החלו להתפרסם הרצפים השלמים של אורגניזמים ראשונים; הטיוטה של הגנום האנושי התפרסם רק ב 2002-ולכן בתחילה חשבו שיש בו יותר גנים ממה שידוע שיש כיום .אורגניזמים פשוטים יותר – דרוזופילה ,תולעים ,ארבידופסיס – אינם נופלים משמעותית מכמות הגנים בגנום האנושי .עובדה זו מראה שאין קשר בין מורכבות האורגניזם לכמות הגנים המוכלים בגנום שלו. כמו כן הדבר העלה את השאלה בנוגע לכמות הגנים שתפקידם ידוע ושהינם פעילים במנגנונים שונים לעומת גנים שאיננו יודעים את תפקידם; לפחות במחצית מהגנים ההומנים התפקוד הוא תעלומה .לאחר כ- 30שנות עבודה ,אלפי מעבדות שעבדו בהגדרת הגנים האנושיים ידעו יחד את תפקידם של כרבע מהגנים האנושיים .הן הגיעו למסקנה שלא ניתן להמשיך באותה שיטת אנליזה שהייתה מבוססת על one gene at ,a timeשאחרת יידרשו שני דורות עד גילוי כל הגנים ההומנים .לשם כך חובה לפתח שיטות גנומיות. פיתוח המיקרואראי )(Microarray פטריק בראון מאוניברסיטת סטנפורד ,וירולוג במקורו ,העסיק את עצמו בטכניקות מולקולריות ומחקרים ניסויים בעלי סיכויים נמוכים .הוא ביקש להסתכל על ספקטרום הגנים המתבטאים בשמרים בשני מצבי גידול – על גלוקוז ועל אתנול .היה ברור שחייבים להיות סטים של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי .לשם כך פיתח את המערכת שבאיור. הוא גידל את השמרים בארלנמיירים עם מצע גידול רלוונטי ואז הפיק את הגנום מכל תרבית .הוא יצר cDNA מה ,RNA-ותוך כדי הכניס NTP מסומן )ירוק בגלוקוז ואדום באתנול(. כעת ה cDNA-מעורבב ביחס 1:1 בין שני תנאי הגידול. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :10אנליזה בהיקף-גנום של ביטוי גנים 79 רפי שלון ,סטודנט שלו ,לקח סלייד מיקרוסקופי – בעזרת מכשיר המניח טיפה מזערית על צלחת בעלת הרבה באריות הוא מכניס דוגמאות מכל ה DNA-השמריים )בתקופה שכבר כל 6000הגנים השמריים היו מבודדים וניתן היה לזהות אותם ,ובכל בארית היה DNAאחר(. דה-נטורציה של הגנים מפרידה את הגדילים .לאחר מכן הם מקובעים לזכוכית ואז עוברים היברידיזציה. לאחר השטיפה בוחנים את הבאריות עם דטקטור של הפלורופור .בכל בארית יש תחרות בין תערובת ה- DNAעל גן מסויים :אם כמות ה RNA-של הגן בתנאי גלוקוז גדולה מאשר באתנול ,תהיה פלורוסנציה ירוקה; במצב ההפוך תהיה פלורסנציה אדומה; אם הכמות דומה תתקבל פלורסנציה צהובה. הנסיונות הראשונים היו פשוטים מאוד – בעיקר כי לא ניתן היה להכניס 6400אתרים בזכוכית נושאת אחת – אבל ניסוי זה הדגים את עקרון ההסתכלות על RNAמכמות גדולה של גנים במקביל .מאוחר יותר הוכחה גדולת הטכניקה ,ששופרה על מנת ליצור את שיטת ה microarray-על ידי חבר סגל בסטנפורד. נסיון אחר שהתפרסם על ידי קבוצתו של בראון השתמש בתאים הומנים. כאשר מגדלים פיברובלסטים במצע עני והרעבה לפקטורי גידול, הם נכנסים לעצירה ופעילות מטאבולית נמוכה; זאת לעומת פיברובלאסטים שכאשר יש להם נסיוב נכנסים לפעילות מטאבולית גבוהה וגידול. בראון רצה לבדוק את נוכחות הגנים המתבטאים בשני התנאים ,ולשם כך השתמש בשיטה דומה: סימן דיפרנציאלית את ה cDNA-שהופק מכל אוכלוסיה ואז לקח cDNAהומני מבודד )בתקופה זו היו כמה אלפי cDNAמבודדים( והעביר אותו בעזרת הרובוט של שלון לזכוכית .בצורה כזו התקבלה התמונה הבאה: האיור מציג ציר זמן בן 24שעות ) (Yשמראה את ההיברידיזציה של 8600גנים ) (Xלאורך הזמן .ירוק מסמן ירידה בביטוי ואדום עלייה בביטוי לעומת הרפרנס ,שהוא התאים המורעבים .ניתן לאפין דמיון הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 80 התנהגותי של קבוצות גנים מסויימות – גם מבלי לדעת מה זהותם .כאשר בחנו לעומק את הגנים בכל קבוצה נמצאה חוקיות ברורה בין הגנים בקבוצות :גנים Dהם גנים הקשורים לריפוי פציעה של תרבית )המתבטאים כאשר חותכים תרבית ,פעולה הפוגעת בצמידות בין התאים(; Bהם גנים של מחזור התא. זהו אחד הנסיונות הראשונים לאנליזה של ה RNA Transcriptom-על גבי מיקרואראי .האנליזה מתבססת על ההיברידיזציה .לשיטה זו קמו הרבה וריאציות – ניתן לבדוק פולימורפיזם על סמך מידת ההיברידיזציה ,למשל; השדרוג המרכזי לשיטה היה על ידי חברת אפימטריקס ,אשר הציעה לשים את הדגימות לא על זכוכית אלא על סיליקון בשיטות המתפתחות של מוליכים למחצה ,כמו בDeep DNA - .Sequencingכיום כל הגנום האנושי ממופה על גבי ארבעה משטחי סיליקון כאלו. המיקרואראי אינם cDNAשעובר היברידיזציה אלא אוליגונוקליאוטידים המסונטזים עם רצף קבוע במקום ,כאשר בכל נקודה מסונטז אוליגונוקליאוטיד מסויים .אפימטריקס ודומותיה התמחו בתחום זה ויצרו את שיטת המיקרואראי שהפכה לשיטה דיאגנוסטית נפוצה ביותר. האיור הבא )שקופית ,14מצגת (10הוצג במאמר מפתח במחקר סרטן השד ,המאופיין בהיותו קל או קשה יותר במופעים מסויימים .שיתוף פעולה בין חברת רוזטה ואחד מבתי החולים המרכזיים באמסטרדם השווה בין RNAשהופק מגידול ראשוני של חולות שאובחנו .הם עשו היברידיזציה לאלפי גנים ומצאו את הגנים בעלי הסבירות הטובה ביותר לשמש לפרוגנוזה של החולות. כל שורה במיקרואראי היא חולה וכך קו אנכי הוא גן ) 70גנים סה"כ( .הטענה הייתה שניתן להשתמש בדוגמת ה RNA-מהגידול ולהשוות אותה לייצוג ה RNA-של כל 250החולות האחרות; אם הכלל היה הומוגני בתחום ,לא נראים הבדלים .אם הכלל היה הטרוגני רואים הבדלים .סימן אדום מציין ייצור גבוה מהכלל ,סימן ירוק אומר ייצור נמוך מהכלל .החוקרים טוענים שניתן לחלק על סמך תבנית ההיברידיזציה את החולות לשתי קבוצות :העליונה והתחתונה .העליונה בעלת פרוגנוזה טובה יותר מהתחתונה .הטענה מבוססת על כך שאחרי החלוקה במיקרואראי נבדקו התוצאות העובדתיות בנוגע לחולות היום .זמן המעקב הוא עד 12שנים אחורה. החולות המסומנות באדום פיתחו מטסטאזות רחוקות – שהרחיקו ליותר מאשר בלוטות לימפה הסמוכות לשד .הנקודה הכחולה היא סוף זמן המעקב והקווים השחורים מראים את חלוקת המטאסטאזות הקרובות. נראה שאין הבדל בחלוקה של היווצרות גרורות קרובות ,אבל בקבוצה החמורה יש יותר גרורות רחוקות ויותר מוות .בצורה זו הם טענו שההיברידיזציה ב 70-הגנים מספקת ערך פרדקטיבי שנלקח מתוך ה- RNAהראשוני – לא מתוך הגרורות ,ונראה גם שהעובדה שיש או אין גרורות קרובות אינה מהווה אינדיקציה לחומרת המחלה או לסיכוי לגרורות רחוקות. חתימת 70הגנים אינה יחידה ממינה; יש חתימות נוספות של קבוצות גנים אחרות .ה FDA-לא אישר את המבחן הזה לחברות הביטוח בארה"ב משום שיש 30%סיכוי לתוצאה .false-positive חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :10ביטול התפקוד של גנים ספציפיים ביונקים 81 שיעור :10ביטול התפקוד של גנים ספציפיים ביונקים יצירת תאי ESהנושאים מוטציית knockoutמוכרת השיטה מדגימה מוטגנזה בעזרת ריקומבינציה הומולוגית .המחקר מחבר בין שני דברים לכאורה ברורים: • המרקר לעמידות לניאומיצין );(neor • מרקר דומיננטי שלילי ).(tkHSV כל אורגניזם שמקבל את tkיכול לעבור סלקציה שתמית אותו; זהו הגן לטימידין-קינאז של וירוס ההרפס .בהוספת אנלוג לטימידין רק ההרפס יודע לזרחן את האנאלוג ולהשתמש בו כמו בטימידין – עובר אינקורפורציה – אל בעצם כך עוצר את סינטזת ה .DNA-האנלוג הוא Ganciclovir שבנוכחותו נעצר השיכפול. הגן לניאומיצין צריך להכיל פרומוטור וגם רצף לפוליאדנילציה ,שכן הגן הוא חיידקי במקורו וללא הפוליאדנילציה לא ייצא ה mRNA-מהגרעין. הגן של הסלקציה החיובית הוכנס בתוך גן עניין והפך אותו למוטנט .באינקורפורציה של המחדר לגנום, האירועים השכיחים הם כניסה לא ספציפית- הומולוגית לגנום; רק במקרים נדירים של הכרה וריקומבינציה הומולוגית ייכנס הגן שבין שני המרקרים לתוך הגנום ויחליף לחלוטין את הגן המקורי ,התקין. התאים שהכניסו את הגדיל ללא הומולוגיה הכניסו גם את שני המרקרים ולכן ניתן להרוג אותם בעזרת ;Ganciclovirאלו שביצעו ריקומבינציה הומולוגית מכילים רק עמידות לניאומיצין ולכן עמידים לאנלוג. האירוע הזה כה נדיר עד כי רק 1-10%מהמושבות המבודדות יהיו בעלות הגן המוטנטי. יכולה להיות גם כניסה לא ספציפית ששברה את מחדר לפני הגן השלילי ,ולכן זה עדיין לא יהיה ספציפי. אם התהליך נעשה בתאי גזע של עכבר ,ניתן להזריק את התאים המוצלחים לבלסטוציט של עכבר ,ליצור עכברים כימרים ולקבל עכברים בעלי גן פגום ,להפריד הומוזיגוטים ולהמשיך במחקר הגן על מודל העכבר. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 82 שיעור :11שימוש במקטעי DNAמשובטים – המשך הבהרהpIRES-Era-hyg3 : ניתן ליצור mRNAפוליציסטרוני ביונקים בעזרת וקטור המכיל את אלמנט ה .IRES-תחת פרומוטור חזק הוכנסה ,Open Reading Frameאחריה אינטרון IRES ,ומסגרת קריאה פתוחה של גן בקטריאלי לעמידות לסם ) hygomicineיחד עם .(PolyA sequenceבצורה זו נוצר טרנסקריפט אחד שהולך דרך כל מסגרות הקריאה הפתוחות ומסתיים בפוליאדנילציה. האפשרות של מסגרת הקריאה השנייה ניתנת על ידי ה .IRES-סלקציה להיגרומיצין גורמת לתאחיזה עם מסגרת הקריאה שמעל ההיגרומיצין ,המבטיחה שרוב המושבות העמידות לאנטיביוטיקה יבטאו את הגן המבוקש כי הפרומוטור מצוי מעליו. הדבר עשוי להידפק אם תהיה אינטגרציה ללא הגן השלם והחתיכה תנחת ליד פרומוטור שיניע ביטוי של הגן לעמידות .הסיכוי לכך קטן ,ולכן עושים אנליזה של המושבות שהתקבלו כדי לוודא שזה לא קרה. יצירת עכברי Knockout ניתן לקחת את ה ORF-בלבד והאינטרון של הגן שמצומד לניאומיצין כבר יעבור שיחבור ויוסר מהגדיל. עדיין צריך להוסיף סיגנל לפוליאדנילציה .על משקל זה נוצר וקטור בו כיוונו נחיתה של האלמנט ליד פרומוטור ,ואז הוא חיפש מצבים שבהם הסרה של האקסון של הגן הביאה עדיין לביטוי הניאומיצין. כאשר קפקי ,שפיתח את השיטה ,שלח גראנט של הטכניקה לפני התוצאות ,הוא בנה אותו כך שהוא הכיל רצפים בני 1000נוקליאוטידים שיהיו אקסונים; הוועדה דחתה אותו מתוך טענה שאין זה סביר שתהליך ההומולוגיה יעבוד ברצף כל כך קטן – כי הוא מקופל בכרומוזום בצורה מאוד קומפקטית בכרומטין .קפקי השיג מימון ממקומות אחרים ועדיין הצליח להראות שהתהליך עובד. יחד עם זאת היו דברים בגו – התא מתקשה לבצע ריקומבינציה הומולוגית לכל גן ברצפים כל כך קצרים, ויש גנים רבים החבויים בהטרוכרומטין ובכרומטין .החשיפה של הגנים אינה גדולה ולכן ראו שאם הגן מתבטא בתא הסיכוי לעבור ריקומבינציה גדול יותר – כי הכרומטין באיזור יותר פתוח. השיטה הזו מורכבת לשיבוט גנים – אקסונים המכילים פחותמ 500-נוקליאוטידים היא לא עובדת .לרוב משתמשים באיזורים גדולים כגבולות עליונים ,שוברים את הוקטור בעזרת אנזימים לפני שמחדירים אותם בפריקת קבל .בין 1-10%מהמושבות עוברות אירוע של ריקומבינציה הומולוגית ,ו90-99%- המקרים האחרים הם ריקומבינציה אקראית )המסולקים על ידי הסלקציה השלילית(. קפקי לא נתן לתלמידיו לעשות את התהליך ,אלא רק לשלוש טכנאיות מנוסות מאוד ,כי התאים הושתלו בהמשך בבלסטולה של עכבר לקבלת עכבר טרנסגני בו אחד מהאללים )בהנחה שזה לא בכרומוזום המין( יהיה מבוטל; צריך לעשות הכלאה הטרוזיגוטית כדי לקבל צאצאים של .double knock-out זו הייתה המעבדה הראשונה שיצרה עכברי נוק-אאוט בגן ספציפי לפי בקשה. כיצד ניתן לבדוק האם הייתה הכנסה? ניתן לעשות PCRבגבולות של הגן התקין ,אם הגן עבר החלפה ייתקבל רק את הגן עם הניאומיצין ואם לא עבר החלפה ייתקבלו שני תוצרים .הפריימרים חייבים להיות מחוץ לגן של הניאומיצין ,כדי להראות האם הוא בפנים או לא. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :11שימוש במקטעי DNAמשובטים – המשך 83 מהפכת הmiRNA- האפשלרות לבצע ביטול מכוון של גן – בתרביות או בעכברים – חוללה מהפכה בביולוגיה המולקולרית, כי נוצרו מודלים למחלות אנושיות גם בעכברים .בתוך תקופה קצרה חוקרים וחברות יצרו עכברי נוק- אאוט ומכרו אותם .אולם יש לזכור שלא כל אתר נגיש לריקומבינציה הומולוגית ולכן לא לכל אתר אפשר ליצור עכבר טרנסגני. הפרוצדורה אינה פשוטה ואינה בטוחה; היא דורשת אינפורמציה רבה על הגן .היום יש יותר מידע וניתן לתכנן וקטורי החלפה ,אולם זו עדיין נותרת עבודה מורכבת .מסיבה זו נובעת חשיבות הגילוי ב 1998-של אנדרו פייר וקרייג מלו – אשר הבחינו בתולעים העגולות C.elegamceבתופעה הבאה:17 ב 1975-בדקו האם כשמכניסים לתאים הומנים או עכבריים ) anti-sense RNA (asRNAלאיזשהו ,mRNAהוא יכול לעבור היברידיזציה בציטופלזמה .ה asRNA-יהיה באיזור ה AUG-וכך הריבוזום לא יוכל להתקשר לגדיל והתרגום של החלבון ייעצר .המאמר פורסם ב Cell-והראה תוצאות שנראו מתאימות להיפותזה – asRNAמונע תרגום ומאפשר חקירת הגן. על הניסיון ניסו לחזור אלפי מדענים ,כל אחד מגן המעניין אותו .לא היה ספק שבגן של החוקר וכמה גנים נוספים האפקט התקבל והתוצאות היו נכונות; אך מדענים אחרים ראו שזה לא עבד .היאוש החל לחלחל, והמחשבה הייתה שזה עבד לחוקר הראשון מתוקף מזל בלבד. בתולעים העגולות ,פייר בודד גן מסויים והחליט לנסות ללמוד על הגן בעזרת .asRNAהוא הזריק אותו לגונדות של העובר והסתכל באמצעות נוגדנים או RNAמסומן שעובר היברידיזציה לmRNA- כדי לראות האם יש ביטוי של החלבון. השיטה היא הכנסת גדיל Senseשל גן העניין על גבי וקטור חיידקי המכיל גם RNA polymerase מתאים .לאחר מכן הופכים את ה cDNA-ובאוריינטציה הפוכה של הגן ניתן לקבל תחת אותו פרומוטור את ה .asRNA-הוא הכניס את שני הוקטורים – הראשון כביקורת והשני כניסוי – לתולעים וראה שיש ירידה קלה בביטוי שהתקבלה על ידי שני הוקטורים יחד .לפיכך החליט לעשות ביקורת נוספת על ידי :double strand RNAהוא לקח את שני הוקטורים ,עשה להם אנילינג ,והזריק את ה- .dsRNAהתוצאה הייתה ירידה דרסטית בביטוי החלבון. פייר היה זהיר מספיק ואמר שייתכן שהתופעה נובעת מאינטרפרונים .ידוע היה ש dsRNA-מעודד ביטוי אינטרפרונים ולכן יכול להיות שהתופעה טריוויאלית ,והאינטרפרונים הם שמעכבים את הסינטזה של החלבונים .יחד עם זאת ,ידוע גם שאם מקצרים את ה dsRNA-ל 30-זוגות בסיסים התופעה נעלמת; ואילו גם כאשר הקטין את גודל המחדר התופעה נמשכה .לפיכך ,הוא ביקש לראות כמה mRNAיש לאחר ההזרקה .הוא סימן אותו וראה כי אין כלל mRNAבתא. 17אנדרו פייר ערך נסיון בסיסי וקיבל תוצאות בלתי צפויות .הגדולה של פייר הייתה במחשבה על הפתרון לבעיה. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב 84 ביוכימיה ב' -שיעור1 ההנחה הייתה שה dsRNA-גורם לדגרדציה של ה .mRNA-התופעה הזו הופיעה גם בגנים אחרים וזכתה לכינוי ) .RNA interference (RNAiהממצא הזה פורסם ב 1998-ומייד תפס – חוקרים משטחים שונים שראו תופעות של RNAשלא יכלו לפענח ,קיבלו את התשובה לשאלותיהם דרך ההסבר הזה. תופעת ה RNAi-הגורם לדגרדציה יכלה לשמש כאלמנט סופרסורי .באותו זמן כבר לא השתמשו בפלסמידים פשוטים ,אלא היה אתר קשירה של RNAפולימראז מנוקה שאוחה מצידו השני של הפלסמיד .בצורה זו לא צריך להפוך את המחדר – במבחנה אחד עובד פולימראז מנוקה מסוג אחד שנקשר לאתר הקישור ב Sense-ובמבחנה שנייה פולימראז אחר שנקשר לאתר שיוצר .Antisense מדוע הרמות היו דומות עם כל אחד מהוקטורים? מסתבר שפעילות הפולימראז לא ספציפית ,ולכן כאשר מכניסים פולימראז אחד הוא נקשר גם לאתר הקישור של הפולימראז השני ,כך שנוצר קצת antisense שנתן תוצאה דומה גם בוקטור ה sense-וההיפך. לאחר פרסום המאמר נפתרו תעלומות רבות; אחת מהן הייתה שבטבע נפוצות יחסית מולקולות בעלות תפקיד זהה ל .RNAi-מולקולות אלו מכונות ) .miRNA (micro-RNAבמהלך שיעתוק של גדיל אחד מאיזור של ,miRNAמשועתק רצף שחוזר על עצמו באוריינטציה הפוכה )(Inverted Repeat, IR היוצר התקפלות עוד בגרעין .ה 5’-עובר ,cappingובין שני ה IR -יש לולאה במבנה .stem & loop אנשי ה C.elegance-הבחינו שה miRNA-עובר שני חיתוכים :חיתוך ראשון בגרעין שיוצר את האיזורים ;Drosha & DGCR58הקומפלקס החלבוני חותך ב 5'-של ה .IR-הוא עובר בחורי הגרעין ,שם החלבון Exportin5מעביר אותה החוצה .בציטופלזמה מתלבש עליו קומפלקס Dicer שחותך אותו ליד הלולאה ,דבר שגורם לשחרור ה- .dsRNAהאורך שלו הוא 23נוקליאוטידים ובקצה ה '3-יש שני נוקליאוטידים בולטים מכל צד .הוא נלקח על ידי קומפלקס שמסלק את ה Sense-ושומר רק את ה.Antisense- זהו תוצר טבעי בתאים של עכבר ,אדם ,תולעת; הוא אינו קיים בשמרים .כאשר ביואינפורמטיקאים הסתכלו על הגנום האנושי לחיפוש אפשרויות ל ,IR-נמצאו לפחות 5000אתרים שמסוגלים ליצור תוצר כזה .היום ידוע שיש לפחות ,miRNA 1000וכנראה יותר .ל miRNA-אין הומולוגיה מלאה ל- mRNAאו ל .RNA-מכיוון שכך ,לכל miRNAיש יותר מאשר סובסטרט אחד – וחלק גדול מהמחקר מאתר אילו גנים הם סובסטורטים של miRNAנתון .מניחים כיום שכשליש מהגנים ההומנים נתונים תחת בקרת ,miRNAעובדה המסבכת מאוד את כל מה שהובן עד כה לגבי בסיס של מחלות – נכנס אלמנט רגולציה לא צפוי ומאוד משפיע. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :11שימוש במקטעי DNAמשובטים – המשך 85 וגם siRNA ה IR-עובר חיתוך ראשון בגרעין וחיתוך שני בציטופלזמה )(Dicer ויוצר dsRNAעם קצוות '3בולטים. המקטע קיבל את השם – siRNA .short interfereingבציטופלזמה נוצר קומפלקס RISC = RNA- .induced silencing Complex הוא נקשר לקומפלקס חלבוני המחפש גדיל mRNAקומפלמנטרי מלא או חלקי .כאשר הוא מוצא אותו ,הוא מסוגל לעשות אחד משני דברים: • אם יש קומפלמנטציה מלאה בין siRNA+mRNAהקומפלקס יוכר על ידי האנזים ,Slicerהמכיר רצף בין הנוקליאוטידים 2-7וחותך בקצה ' 3של הרצף בגדיל אחד – דבר שחושף אותו לאנדונוקליאזות ולפירוק. • אם יש קומפלמנטציה חלקית ,הרצפים הקומפלמנטרים יהיו ב .‘3-UTR-הנוכחות שלו ,למרות שהיא בקצה ' 3ולא ' ,5תעכב את התרגום של ה.mRNA- הידע הזה היווה מכשיר ללימוד תפקידי גנים מכיוון שכל מה שצריך הוא אחד משניים :לקנות dsRNA מוכן כנגד ה mRNA-המעניין ,שעובר היברידיזציה; או לחילופין ליצור פריקורסור RNAשיעבור את החיתוך באופן מלא או חלקי כך שייצור siRNAבתוך התא. לשם כך ,מכניסים את ה IR-המתוכנן תחת פרומוטור של RNAפולימראז חזק בתאים הומנים ,כדי לייצר כמויות גדולות של ה .siRNA-התוצר יסנטז את ה ,IR-יעבור חיתוך ראשון בגרעין וייתקבל siRNAבכמויות גדולות .היתרון שלו לעומת dsRNAהסינטטי הוא שבסינטטי צריך להוסיף את חומצת הגרעין למדיום ואז בתנאי טרנספקציה לחורר את הממברנה ולהכניס את מולקולות המדיום; שיפור קל של תהליך הטרנספקציה הלא-יעיל מתקבל אם כולאים את ה RNAבתוך ליפוזומים שיאוחו עם התאים. החסרון הוא שה siRNA-יכול לפעול לאורך זמן רק אם כל שלושה ימים יוצרים הדבקה מחדש עם – siRNAכלומר בניסוי של 10ימים יש להחליף אותו 3פעמים .הדבר הופך את הניסויים לזמניים ויקרים מאוד. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 86 קבוצות מסויימות עדיין עושות זאת ותיכננו siRNAלכל הגנים ההומנים. הגישה המשלימה היא לייצר עצמאית את ה siRNA-בתא ,בצורה יציבה .בעזרת הפלסמיד ווירוס ניתן להכניס אותו לגנום – אלמנטים של Long Terminal Repeatsשנמצאיםן בשני צידי הגן מבטיחים שהמחדר יישאר שלם – ולקבל גנים כרומוזומלים שבעזרת פרומוטור אינדוסיבילי )בנוכחות משרן בלבד( יתבטא ה siRNA-ויאפשר לבדוק מה קורה לפנוטיפ של התאים. ה RNA-הוכח ככלי הזול והטוב ביותר בהפרעה של גנים ולימוד שלהם ,in vitro & in vivoעל ידי הדבקת חיות בעזרת הוירוסים. • • • תופעת ה RNAi-תורמת לדגרדציה של RNAועיכוב בתרגום. בדיעבד מתברר שיש להם עוד פעילויות :דגרדציה של DNAבגרעין ,תגלית שעוררה מהפכה במחקר ,וכן שיעתוק והטרוכרומטין. dsRNAקושר את הכרומטין ומעכב את השיעתוק. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 /שיעור :11פיענוח מחזור התא 87 שיעור :11פיענוח מחזור התא בבחינת מחזור התא בצורה סכמטית ,בהנחה שהוא אורך 24שעות ,יש בו ארבע פאזות ושני אירועים מרכזיים :הכפלת ה (S-Phase) DNA-האורכת כ- 10שעות וחלוקת התא עצמה – – M-Phaseחלוקת האינפורמציה הגנטית ,הציטופלזמה והאברונים לשני תאי הבת .החלוקה מכונה מיטוזה ואורכת 30דקות בלבד. בין שני האירועים ישנן שתי פאזות של מרווחים או אתנחתות – .Gaps, G-Phaseהתא מנצל אותם להכנות לשלב הבא – כמו יצירת פריקורסורים של DNAו RNA-בשלב .G1 פקטורים להכתבת מצב מחזור התא בשלב המיטוזה ומעט לפניו יש דחיסה ) (condensationשל הכרומוזומים .לעומת זאת במצב G1לא ניתן לראות את הדחיסה הזו .בשנות ה ,60-מדען בשם האריס מאוקספורד פיתח שיטה לאיחוי של תאים ויצירה של .HeteroCaryones שני חוקרים מקיימברידג' השתמשו בשיטה שלו כדי לאחות בעזרת מעטפת וירוס שני תאים שונים. החוקרים תהו מה יקרה אם יקחו תאים מפאזות שונות ממחזור התא ויאחו ביניהן – לאן התאים ילכו? להפתעתם גילו שאם לוקחים תא במיטוזה ומאחים עם תא במצב ,G1הכרומוזומים בגרעין G1 יעברו דחיסה .מכאן הם הניחו שיש פקטור)ים( חלבוניים דיפוזיים בציטופלזמה או בגרעין התא המיטוטי )מכיוון שהממברנה של הגרעין מפורקת בתא המיטוטי אין הבדל( ,אשר גורמים לתא שב- G1להתנהג כאילו היה במיטוזה. הם המשיכו לשלב צירופים שונים ,המסוכמים באיור: יש לציין את האינטרפאזה – המורכבת משלושת הפאזות שאינן מיטוזה ,ושלא ניתן להבחין בהם מיקרוסקופית ולהבדיל ביניהם. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 88 • בהכלאה של תאים מיטוטיים עם תאים בשלבי האינטרפאזה השונים ,התא הראשוני מתחלק; כל אחד משלושת התאים האחרים מתחלק גם כן – או עושה הכנות לחלוקה ,כמו דחיסת הכרומוזומים .מכאן שהפקטורים למיטוזה דומיננטים על כל אחת מהפאזות האחרות. • הכלאה של תא בשלב Sמעוררת חלוקה על שלב G1אך לא על – G2הפקטורים הרפליקטיבים אינם מתגברים על הפקטורים או מנגנוני הדגרדציה הקיימים עבורם בשלב שאחריהם ,G2 ,אך פעילים בשלב G1בו כנראה אין להם עדיין מעכבים. • בתא כזה שמצוי ב ,G1-האם הפקטורים עברו אליו לאחר סיום החלוקה? כאשר מכליאים תא כזה לתא במצב ,G2האם יידחוף אותו לחלוקה? התשובה היא לא – התא ההיברידי מחכה .מכאן שהפקטורים של המיטוזה הדומיננטים עוברים דגרדציה או אינאקטיבציה ואינם נשארים בשלב .G1הפקטורים האלה זכו לכינוי .M-Phase Prooting Factors כיצד ניתן לזהות תאים בשלבים שונים של מחזור התא? בשנות ה 60-פותחו שיטות ראשונות לסינכרוניזציה של מחזור התא .אחת הדרכים הפשוטות היא להרעיב תאים בתרבית על ידי הוצאת הסרום מהמדיום .התאים אינם מסוגלים להכין פריקורסורים לסינטזת DNAולכן אלו הנמצאים בשלבים שונים של מחזור התא ייעצרו בשלב 24 .G0שעות לאחר ההרעבה ניתן להוסיף את הסרום ולגרום להם להתחיל במסלול בצורה מסונכרנת .בעזרת הדבקה בוירוס ה Sendai-שעבר אינאקטיבציה גרמו לאיחוי ,שכן ממברנות הוירוס עוררו איחוי של הממברנות התאיות. מחקרים ביוכימיים באאוציטים ,ביציות ועוברים ניסויים אלו נעשו על תאים סומטיים ולא על תאי המין .ניסויים בתחום הזה התחילו על ידי .Masui בהמשך התקדמו לעבוד עם תאי ביצה של צפרדע ,שהן תאים בודדים ענקיים שניתן לעבוד איתם גם ללא תנאי הסתכלות מחמירים. מסוי מצא את פקטור קידום ההבשלה ) (MPFשאחד מהם הציקלין ) .(Cdkבחלוקה מיוטית ,לפני החלוקה המיוטית הראשונה מתבצעת הכפלת ה ;DNA-כל תא מכיל בשלב זה 4nכרומוזומים .החלוקה הראשונה מניבה שני תאים עם 2nכרומוזומים ובחלוקה השנייה – שנעשית ללא שיכפול נוסף של הגנום – מניבה ארבעה תאים שבכל אחד 1nכרומוזומים. האאוציט ,ביצית הצפרדע ,עצור בשלב .G2התאים המקיפים את האאוציט משחררים פרוגסטרון ,הורמון המעודד את שתי החלוקות המיוטיות .התאים עוצרים בסוף החלוקה המיוטית השנייה .החלוקה אינה מושלמת ,והביצית ממתינה לזרע – שלב ההפריה .כניסת הזרע לביצית גורמת להשלמת תהליך המיוזה ולאחר מכן מתחילות 13חלוקות סינכרוניות מהירות של העובר. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 /שיעור :11פיענוח מחזור התא 89 אחד התאים שנוצרים בחלוקה המיוטית הראשונה ממתנוון .גם לאחר החלוקה השנייה אחד התאים מתנוון .שני התאים המנוונים יוצרים שני ) Polar bodiesראשון ושני( .תהליך ההכפלה של תא שעצור בשלב G2מכונה – Maturationהבשלה. מסוי שאל את עצמו האם משהו בשתי חלוקות ההפחתה של הביצית ולפני האיחוי עם הזרע הגורם לשינוי קבוע לעומת התא שהתחיל עם 4nכרומוזומים? האם ניתן לקחת ציטופלזמה של ביצית גדולה ,להזריק אותה לתא העצור ב G2-וללא פרוגסטרון לעורר אותו לעבור חלוקות מיוטיות? מסואי חיפש פקטורים בציטופלזמה שחיקו את פעולת הפרוגסטרון. כשעשה את ההזרקה הזו ,הבחין בנדידה של הגרעין והכרומוזומים למקום קרוב לדופן ,המאפיין את תהליך החלוקה ,וניתן להבחנה כיוון שהתנועה גורמת לבהרה בתאים. הפקטור שמסוי מצא כגורם לתהליך ההבשלה זכה לכינוי ) .Maturation Promoting Factor (MPFההשראה של החלוקה המיוטית הייתה תהליך חדשני שתפס חוקרים רבים .הנסיון לאתר את הפקטור הכשיל תלמידים רבים ,עד שב 1988-הוא הצליח תודות לכך שהתגלה ,בין היתר ,שזהו אינו חלבון בודד כי אם קומפלקס. מציאת קומפלקס ההבשלה ג'ון גרהארט ) (1983-4ניסה לבדוק מהי הפעילות במערכת ביצי הצפרדע לאורך זמן מבחינת רמת ה- .MPFעל מנת לבדוק את רמת ה ,MPF-בהיעדר הידע מהו בדיוק ,היה צריך להזריק בנקודות זמן שונות ציטופלזמה ולוודא האם היא עדיין גורמת למיוזה. ניתן לראות שבחלוקה המיוטית הראשונה ה MPF-עולה ואז יורד; גם לפני החלוקה השנייה יש עלייה הנותרת יציבה עד ההפרייה .עם ההפריה יש ירידה דראסטית בפעילות .גם בחלוקות הראשונות של העובר יש עליה תלולה וירידה לקראת כל מיטוזה של תאי העובר. מכאן רואים של MPF-יש פעילות מחזורית הקשורה בחלוקה המיוטית כמו גם בחלוקה המיטוטית. סטודנט מהרווארד מקבוצתה של ג'ואן רודרמן שעובדת בקפודי ים ורכיכות דיווח באותה תקופה על פעילות קבוצתו .לאחר הפרייה ,בדומה לצפרדע, הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב 90 ביוכימיה ב' -שיעור1 מסמנים את העובר על ידי הזרקת חומצת אמינו רדיואקטיבית .כמו כן מפיקים חלבונים בזמנים שונים מהתא ומסתכלים בכל נקודת זמן על תבנית החלבונים המסתמנים בתא .ניתן לראות בג'ל שקיימים כמה חלבונים המסונטזים קונסטיטוטיבית ושני חלבונים בעלי התנהגות מחזורית :מופיעים ונעלמים. בקהל בהרצאתו של הסטודנט מהרווארד יושב סטודנט של טים האנט ,העובד במערכת דומה. הסטודנט חוזר ללונדון ומספר על נסיון זה להאנט. הם מעמידים את המערכת ומוצאים את החלבון בעל ההתנהגות הציקלית – לו הוא קורא ציקלין .אם מסמנים את ההתנהגות של סינטזת הציקלין )אדום( כפונקציה של מה שניתן לראות כחלוקה של התא, העלייה בציקלין תמיד קודמת לחלוקה. השיא של ציקלין מגיע לפני החלוקה של התא. ב 1984-יש את הרצף ו mRNA-של הציקלין; ב- 1988מתפרסם גם רצף של חלבון מוטנט בשמרים המעודד חלוקה ,וזוכה לכינוי .CDC28 במקביל ,סטודנט של מסוי מבודד ב 1988-קומפלקס בעל פעילות של MPFהעשוי משני חלבונים .הוא קובע את הרכב חומצות האמינו של כל חלבון ורואה ששני המרכיבים האלו כבר ידועים – החלבון האחד אנלוגי ל CDC28-השמרי ,שמבנהו התפרסם באותה שנה; השני זהה לציקלין של טים האנט .מכאן שסרין טריאונין-קינאז יחד עם הציקלין מניע את מחזור התא על ידי פעילות של .MPF היחידה הקטליטית שמורה בצורה מופלאה בין היצורים הנחותים ועד לאדם .אותו הדבר גם לגבי הציקלין – אחד ממשפחה שלמה של ציקלינים הדומים ברצפי חומצות האמינו ושמורים דיים שניתן אפילו לבצע החלפות בין חלבון הומני שיעבוד בשמר ולהיפך. קומפלקס הציקלין ו Cdk-הוא אחד הקומפלקסים השמורים ביותר באבולוציה. הגרפים הבאים מציגים נסיון של קירשנר ) ,(1989אשר עבד במערכות הביצים של הצפרדע והקים מערכת מדהימה לאותן שנים :הוא לקח גרעינים מהזרע והכין תמצית ביציות .הוא הוסיף את הגרעין עם התמצית של הביצית והראה שניתן לגרום למספר חלוקות במבחנה – 3-4הכפלות וחלוקות. קירשנר יכול היה לעקוב אחר המדדים של ,MPFשכבר היה ידוע שנה קודם ,הוא הראה שהיסטון H1 הוא סובסטרט של קומפלקס Cdkולכן בציר Yהוא מודד כפונקציה של הזמן את פעילות MPFעל ידי זירחון של .H1 חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 /שיעור :11פיענוח מחזור התא 91 כמו כן הוא יכול לראות מיקרוסקופית את הגרעין של הזרע ,הנותר בשלמותו בתהליך – הוא אינו מתפורר ,למרות שיש שלבים בהם הממברנה מתחררת והוא יכול לעקוב במשך 3-4מחזורי השלבים המוקדמים והשלבים המאוחרים של המיטוזה. הוא מדד גם את ריכוז הציקלין B-באותו האופן שבו נמדד לראשונה בג'לים כשמצאו נוכחות של החלבון. ביצית הקסילופוס מכילה 2או 3ציקלינים והוא בחן את ביטוי הציקלין Bכפונקציה של זמן .הקו האדום מתאר זירחון H1והכחול את כמות הציקלין .B-ניתן לראות עלייה וכמו שגרהארט הראה לפניו העלייה נעצרת ומתחוללת ירידה ב MPF-ודגרדציה של ציקלין .Bהתנועה של שני הקווים מסונכרנת .הכניסה למיטוזה מתרחשת בתחילת המיטוזה והיציאה ממיטוזה מתרחשת עם סיום הדגרדציה. כאשר מטפלים בתמצית בעזרת RNaseמתבטלת התנועה של ציקלין ,Bולכן הוא הסיק שהחלבון ציקלין Bאינו יציב ועל מנת לספק אותו התא צריך להכיל את mRNAשל החלבון .מכיוון שבודדו כבר את ה- mRNAשל ציקלין ,Bניתן היה לטפל במערכת ב RNAse-ולהוסיף רק את ה .mRNA-בתנאים אלו המערכת עבדה ,מכאן שה RNase-לא פוגע באלמנטים חיוניים אחרים. הטיפול ב RNAae-עדין ,אחרת היה פוגע גם באלמנטים אחרים של מערכת סינטזת החלבונים – tRNA, .rRNAכמו כן הריבוזום מגן על רוב ה rRNA-וה tRNA-בעל מבנה קומפקטי המגן עליו מפני .RNAse בריצוף חלבון הציקלין B-נמצא איזור של 8חומצות אמינו החוזרות על עצמן בקצה Cשל חלבונים לא יציבים .מכיוון שידוע שהציקלין מתפרק ,הניחו שזהו סיגנל לדגרדציה של הציקלין .האלמנט זכה לכינוי ) .D-Box (destructionקירשנר ייצר mRNAשאינו מסנטז את שמונה חומצות האמינו של סיגנל ההרס ,וכך ערך את ניסוי – Dהכנסה של ציקלין Bשחסר את תיבת ההרס ,כלומר הוא אינו ניתן לדגרדציה .בתהליך זה יש ביטוי ועלייה בציקלין ,יש כניסה למיטוזה אך התהליך נתקע בשלבים המוקדמים ואינו מסוגל לצאת מהמיטוזה .הפעילות של mMPFהמוטנטי יציבה .מכאן הגיעו למסקנה שהדגרדציה של הציקלין Bהיא הכרח על מנת שתא מיטוטי יסיים את המיטוזה. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 92 מכאן שיש כוח מניע המורכב מציקלינים ו Cdk-המופיעים בשלבים שונים של מחזור התא – כאלה המכינים את התא לשלב .M ,S ,G1מרכיב אחד של מחזור התא הוא סדרה של זירחונים על ידי .Cdk’s ידוע שבתאים הומנים קיימים מאות סובסטרטים שעוברים זירחון בתהליכי מחזור התא וכי הזירחון הזה מהווה מנגנון לקידום מחזור התא. מערכת הדגרדציה במחזור התא ישנם כמה חלבונים שחייבים לעבור דגרדציה ספציפית במחזור התא .המערכת קשורה במערכת היוביקוויטין שהתגלתה על ידי הרשקו וקבוצתו במכון וויצמן .הציקלין B-עובר דגרדציה במערכת זו. בעוד שהדגרדציה מתבצעת במעין שק ציטופלזמטי המכיל אנזימים לדגרדציה של חלבונים ,הקומפלקס המיועד לדגרדציה צריך להיות מסומן ספציפית ולהגיע למתחם הדגרדציה .במקרה של ציקלין B-מדובר בקומפלקס בשם APC – Anaphase Promoting Complexופקטור של ספציפיות המזהה את ציקלין .B-הפקטור הוא תוצר של .Cdh1 במהלך האנאפאזה הציקלין עובר פולי-יוביקוויטינציה ואז הפרוטאוזום לוקח את המולקולה המסומנת ביוביקוויטין ועורך דגרדציה לאוליגופפטידים קצרים .הפעילות הקונסטיטוטיבית של הקומפלקס המפרק מופסקת על ידי קומפלקס של Cdk+G1-Cyclinהרואים את מולקולת Cdh1ומזרחנים אותה .הזירחון מנתק אותו מהקומפלקס של APC ומנטרל אותו מפעילות עד לשלב המיטוזה המוקדם בו פוספאטאז )תוצר של (Cdc14מוריד את הזרחן ומאפשר שוב בנייה של קומפלקס APCהמשופעל. הסימון של Cyclin-Cdk G1 והפעלת הדגרדציה ועצירה היא מחזוריות שעוקבת אחר מחזור התא – מכאן שמחזו רהתא אינו רק מחזוריות של קינאזות אלא גם של פוספאטאזות ושל דגרדציות. באיור הבא ניתן לראות שלמעט בקרה בדגרדציה ,גם תת היחידה הקטליטית – – Cdkיכולה להיות נתונה לבקרה .הבקרה נעשית על ידי סדרת קינאז ופוספואטאזות .באיור מצויין ,CDC28הדומה לCdk- ההומני. בשלב הראשון נעשה זירחון של טירוזין בעמדה 15המעכבת את המבנה .לאחר מכן קינאז אחר – Cdk- activating Kinazeמזרחן את טריאונין ,161שהיא פעולה מאקטבת .אחריו Cdc25 ,מוריד את הזרחן מהעמדה המעכבת וכך נוצר ה Cdk-האקטיבי .בתוך הכיס שנוצר בין שני החלבונים ניתן לקלוט את הסובסטרטים. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 /שיעור :11פיענוח מחזור התא 93 גם היחידה הקטליטית של ה MPF-נתונה לרגולציה על ידי קינאזות ופוספאטאזות. נקודות בקרה – Checkpoints במחזור התא קיימות נקודות בקרה הבודקות האם התא מוכן לעבור לשלב הבא .אחת מהנקודות החשובות – אם לא החשובה ביותר – היא נקודת ה Restriction point-ביונקים או ) Start (S pointבשמרים )ידועה גם כנקודת ה commitement-בה התא מתחייב לחלוקה(. כאשר מוסיפים פקטורים לתאיםן מורעבים ,התאים יוצאים ממצב G0אליו נכנסו בהרעבה וחוזרים ל- .G1אם ירעיבו שוב את התאים ,הם ייעצרו בנקודת ה chceckpoint-ולא ימשיכו הלאה; אם עברו את הנקודה הם ימשיכו בתהליך בכל מקרה. המאפיין של תאים סרטניים לעומת תאים סומטיים ורגילים הוא שיש בהם התגברות ) (overridingעל נקודת הביקורת הזו. שנים רבות ביקשו לבדוק מה קורה בנקודת ההגבלה הזו; התשובה נמצאת באיור הבא :חלבון הגן .Rb החלבון יוצר קומפלקס לא פעיל של ,E2Fפקטור שיעתוק הכרחי מסוג Master TFהאחראי על סוללות של גנים הומנים .משפחת Rbמורכבת משלושה חלבונים ו E2F-הוא חלבון שפעולתו מועצמת על ידי היותו קומפלקס של 5חלבונים. קומפלקס E2Fהכרחי למעבר שלב G1עקב הפעלה של כל מיני חלבונים .הקומפלקס עם Rbמעכב את E2Fואת ביטוי ה early genes-שהוא מפעיל )דוגמת צקליןE-ו.(Cdk2- העיכוב מבוטל על ידי קומפלקס Cyclin D+ lieהמזרחן את Rbומביא לשינוי קונפורמציה המשחרר את E2Fלשיעתוק .החלבונים המופעלים על ידי E2Fמוסיפים להגברת המעבר מ Mid G1-לLate - .G1 סוג נוסף של פעילות tumor-suporessor geneמוצג באיור הבא .חלבון ) p16בעל מסה של (16Sהינו בעל תאום .p15דיוויד ביץ' החליט לחקור מלנומות דרך איזורי אינאקטיבציה ספציפית במחלה .הוא הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב ביוכימיה ב' -שיעור1 94 בודד איזור מסויים שלעיתים קרובות היה מחוק במלנומה וראה שתי מסגרות קריאה פתוחות ,המקדדות לשני חלבונים 15S :ו .16S-אולם הרצף לא נתן רמז לפעילות של החלבונים. זאת עד שבודדו קומפלקס בו נמצא .Cdk4, CycD & p16ששני הציקלין והקינאז הם קומפלקסים של השלב המיטוטי המוקדם .החלבון p16הוא אינהיביטור שמונע את פעילות הקומפלקס .אם p15+p16 מסולקים ,מתאפשרת פוספורילציה של Rbולכן העובדה שהחלבונים עוברים מחיקה בסרטן עוזרת לתא הסרטני לעבור את נקודת ההגבלה כך שייקל עליו לזרחן את .Rb זהו מנגנון של מדכאי גידול היוצרים קומפלקס לעיכוב .Cdk צ'יפים החלבונים p15ו p16-נמצאו כמעכבים של Cdkהמכונים ;INK4בקבוצה זו יש יותר משני סוגים אלו בלבד .יש קבוצת מעכבי Cdkנוספת המכונים .CIP – Cdk Inhibition Proteinשם החלבון ניתן לפי משקלו המולקולרי .החלבון p21נחשב כמעכב אוניברסלי כי הוא נקשר לכל קומפלקס כמעט. האיור מראה את נקודות העצירה )ורוד( .החלבון P21נקשר לקומפלקס ומונע התקדמות; בשלבים שונים יש אקטיבציות או עיכובים של Cdkבתור רגולציה על ידי נקודת הבידוק. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011
