ביולוגיה מולקולרית - שיעורים 7-11

Transcription

ביולוגיה מולקולרית - שיעורים 7-11
‫שיעור ‪ :07‬שיטות מולקולריות לריקומבינציית‪DNA‬‬
‫‪57‬‬
‫שיעור ‪ :07‬שיטות מולקולריות לריקומבינציית ‪DNA‬‬
‫המרצה‪ :‬פרופ' דן כנעני‬
‫ההיסטוריה של ביולוגיה מולקולרית‬
‫•‬
‫‪ – 1956‬גילוי מבנה ה‪ DNA-‬כדו‪-‬סליל על ידי ווטסון וקריק‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – 1962-1964‬במעבדה של אנפנסנד מתגלה הבסיס לקוד הגנטי המורכב משלשות נוקליאוטידים‪.‬‬
‫הוא מתאים את הקודונים השונים לחומצות האמינו המתאימות להם‪ .‬ב‪ 1964-‬מגובשת הדוֹגמה‬
‫המרכזית – כיוון זרימת הידע הוא מ‪ DNA-‬דרך אמצעי הביניים ‪ mRNA‬המיתרגם בסוף לחלבון‪.‬‬
‫ידוע שיש וירוסים שנושאים ‪ RNA‬ולהם יכולות נוספות של שיעתוק ‪ RNA‬על בסיס ‪.RNA‬‬
‫•‬
‫‪ – 1964-1968‬קביעת עקרונות התרגום‪ ,‬מקום הביצוע על גבי הריבוזומים והפוליזומים‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – 1969‬גנתר סטנט‪ ,‬מדען בקטריופאג'ים‪ ,‬מפרסם את ספרו "תור הזהב נגמר" – המעריך כי תור‬
‫הזהב של התגליות הגדולות נגמר ונותר לגלות רק הפרטים הקטנים‪ .‬האתגר הבא הוא חקר המוח‬
‫והוא עוזב את הביולוגיה המולקולרית ועובר לחקר המוח‪ .‬ההערכה הזו התנפצה במהירות‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – 1970‬שני חוקרים מגלים שבתוך הויריון של ‪ RNA-tumor viruses‬יש אנזים ‪Reverse‬‬
‫‪ transcriptase‬הפועל הפוך לדוֹגמה המרכזית‪ .‬המהפכה שבגילוי מקבלת אישור בוועדת נובל‬
‫כמה שנים אחר כך‪ .‬לעובדה זו היה ערך לא רק בהבנת מנגנון השכפול של הויריונים אלא‬
‫בשימוש באנזים הזה ליצירת ‪ DNA‬קומפלמנטרי של ‪ RNA‬על מנת לשבט אותו לנשא ‪.DNA‬‬
‫זהו אנזים מפתח בשיבוטים רבים )‪.(cDNA‬‬
‫•‬
‫‪ – 1970‬שיטה לחתוך ‪ DNA‬בצורה ספציפית לרצף מסויים על ידי אנזימי הגבלה מסוג ‪.II‬‬
‫•‬
‫‪ – 1972-3‬שני חוקרים מצליחים לחבר שני קטעי ‪ DNA‬ממקורות שונים – הוירוס הסרטני‬
‫‪ SV40‬חובר לבקטריופאג' למבדא )‪ (λ‬ונוצר אלמנט כימרי‪ .‬הניסוי פתחה חלון אתי מאוד פרוץ‬
‫והתחום נכנס לתרדמת עד שפותח מדריך קווים מנחים בשם ‪ NIH‬על מנת לוודא שלא ייעשה‬
‫שימוש לרעה בניסויים בסוג זה‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – 1978‬שארפ ורוברטס מוצאים בניסוי שהגן אינו רציף; יש בו איזורים המיוצגים על ידי ה‪-‬‬
‫‪ mRNA‬שהם האקסונים והמקשרים ביניהם הם האינטרונים‪ ,‬כאשר השיחבור מאפשר יצירת‬
‫‪ mRNA‬מאקסונים בלבד‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – 1978‬ריצוף גנטי‬
‫•‬
‫‪ – 1985-1988‬יצירת שיטת ה‪ PCR-‬על ידי מוליס לצורך הגברה של ‪ DNA‬ו‪.RNA-‬‬
‫•‬
‫‪ – 1991‬יצירה ראשונה של עכברי ‪ ,knock-out‬עכברים הפגועים בגן או גנים מסויימים‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – 1997‬איאן וולמוט יוצר כבשה כתוצאה מתהליך תיכנות מחדש )‪ (reprogramming‬על ידי‬
‫הפריית ביצית מגרעין של תא סומטי לקבלת עובר כמעט תקין לחלוטין – דולי‪ .‬הדבר נוגד את‬
‫הטענה שהשינויים החלים בהתמיינות אינם הפיכים – שיש הבדלים משמעותיים בין ‪ DNA‬של‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪58‬‬
‫עובר ל‪ DNA-‬של תא סומטי‪ ,‬ואין אפשרות להחזיר תא סומטי להיות תא עוברי‪ .‬ניסוי זה הוכיח‬
‫שהרעיון אינו נכון ושיש דבר מה בציטופלזמה של הביצית – פקטורים התפתחותיים –‬
‫שמאפשרים את ההיפוך‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬התהליך אינו הפיך בצורה מושלמת‪.16‬‬
‫•‬
‫‪ – 2006-2008‬ימנאקה מנסה לבצע תיכנות מחדש עם מרכיבים מוגדרים על ידי בדיקת הגנים‬
‫המבוטאים בעובר המוקדם ביותר ומבטא אותם בגן בוגר וממויין‪ .‬הוא מגלה שתערובת של ‪27‬‬
‫גנים מחקים את המצב העוברי ומאפשרים לבצע רה‪-‬דיפרנציאציה‪ .‬בהמשך מצמצמים זאת אף‬
‫לארבעה גנים בלבד‪ .‬הדבר מעלה תקוות רפואיות ליצירת רקמות ואיברים מתאימים לחולה‬
‫מתאים סומטיים שמקורם באותו מטופל‪.‬‬
‫הדוֹגמה המרכזית והתוספות עליה‬
‫תודות‬
‫לטכניקות‬
‫הקיימות‬
‫היום‪,‬‬
‫המולקולריות‬
‫התנועה‬
‫לאורך‬
‫הדוֹגמה המרכזית אינה בהכרח חד‬
‫כיוונית‪.‬‬
‫המחקר‬
‫ההפוך‬
‫מכונה‬
‫‪ reverse genetics‬והינו תולדה של‬
‫הטכניקות‬
‫שפותחו‬
‫בעשורים‬
‫האחרונים‪.‬‬
‫שיבוט – ‪cloning‬‬
‫השיבוט מבקש לבודד גן בודד מאיזורים שאינם מקודדים – ‪ .spacer DNA‬לאחר השיבוט יש צורך‬
‫לבצע הגברה‪ .‬על מנת לשבט גן נדרשים מספר דברים‪:‬‬
‫•‬
‫חיתוך ה‪ DNA-‬בצורה ספציפית על ידי אנזימי הגבלה‪.‬‬
‫•‬
‫נשא שלתוכו ניתן יהיה להכניס את חתיכת ה‪ DNA-‬המבודדת‪ .‬הנשא צריך להיות בעל יכולת‬
‫רפליקציה – דוגמת פלסמיד שהינו בעל ‪ .OriR‬הפלסמידים המשובטים קטנים‪ ,‬נושאים מעט‬
‫פונקציות והינם פרזיטים – כמעט כל מערכת הרפליקציה של הפונדקאי נדרשת על מנת שיוכלו‬
‫להשתכפל‪.‬‬
‫•‬
‫פונדקאי מתאים לנשא – חיידק‪ ,‬שמר‪ ,‬תאים הומנים‪.‬‬
‫‪ 16‬את דולי היה צריך להרוג כשנתיים וחצי לאחר לידתה‪ ,‬כי הזדקנותה הייתה מואצת ככל הנראה כיוון שה‪ DNA-‬שלה היה‬
‫מבוגר והטלומרים שלה קצרים‪ ,‬והיא אופיינה במחלות הזדקנות המאפיינות את התא ממנו היא יצאה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :07‬שיטות מולקולריות לריקומבינציית‪DNA‬‬
‫‪59‬‬
‫אנזימי הגבלה‬
‫האנזימים‬
‫ביותר‬
‫השימושיים‬
‫לביולוגיה‬
‫המולקולארית הם אנזימי הגבלה מסוג ‪ II‬בהם‪,‬‬
‫בניגוד לאנזימי הגבלה מסוג ‪ ,I‬אתר ההכרה ואתר‬
‫החיתוך של האנזימים זהים‪ .‬האנזימים היוצרים‬
‫קצוות דביקים מאופיינים ביצירת ‪5'-overhang‬‬
‫)שקצה '‪ 5‬הוא זה עם הקצה הדביק( או ‪3'-‬‬
‫‪ .overhang‬תכונת הקצוות הדביקים יעילה ליצירת‬
‫התאמה קומפלמנטרית בין המחדר לבין הפלסמיד‬
‫החתוך‪.‬‬
‫האנזימים המפורטים בטבלה )שקופיות ‪ ,5-6‬מצגת ‪ (7‬הם אנזימים מסוג ‪ .II‬אנזימי הגבלה מסוג ‪ I‬התגלו‬
‫ארבע שנים קודם לכן‪ ,‬ובהם אתר החיתוך רחוק כ‪ 300-‬זוגות בסיסים מאתר ההכרה‪ .‬באופן מעשי‬
‫משתמשים רק בסוג ‪ ,II‬המורכב מלמעלה מ‪ 3,000-‬אנזימים שונים מפרוקריוטים שונים‪ .‬עד כה נוקו‬
‫בחברות מסחריות למעלה מ‪ 600-‬אנזימים המעניקים יכולת מניפולציה רחבה‪.‬‬
‫אתר ההכרה המינימלי של סוג ‪ II‬מורכב מ‪ 4-‬זוגות בסיסים‪ ,‬כאשר יש גם שמכירים ‪ 6 ,5‬ומעטים‬
‫המכירים ‪ 8‬זוגות בסיסים‪ .‬מספר זוגות הבסיסים קובע את שכיחותו ההסתברותית של אתר החיתוך‬
‫ועקב כך את גודל המקטעים המתקבלים – ככל שאתר החיתוך גדול יותר השכיחות קטנה יותר והמקטעים‬
‫גדולים יותר‪.‬‬
‫האנזימים יכולים לחתוך וליצור קצה דביק או קצה קטום )‪ ,blunt‬דוגמת ‪ (SmaI‬כאשר יש לזכור‬
‫שהגדיל העליון הוא זה שהולך מ‪5'-‬‬
‫ל‪ .3'-‬שמות האנזימים ניתנים לפי‬
‫החיידק ממנו בודדו את האנזים‪.‬‬
‫המספור ניתן בהתאם למספר האנזים‬
‫שהתגלה‬
‫באותו‬
‫חיידק‬
‫)מבחינה‬
‫היסטורית(‪.‬‬
‫האיור מדגים חיתוך פרגמנט נתון בשני‬
‫אנזימי הגבלה‪ ,‬תחילה בנפרד ואז יחד‪.‬‬
‫בצורה זו ניתן להבין את מבנה ורצף‬
‫אתרי ההגבלה על גבי הפרגמנט‪.‬‬
‫לאנזימי הגבלה מסוג ‪ I‬ורוב סוג ‪ II‬יש‬
‫פעילות‪ ,‬נוסף על ביקוע‪ ,‬של מתילאז‬
‫)כחלק מהקומפלקס‪ ,‬תת יחידה נפרדת(‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪60‬‬
‫אנזימי ההגבלה נתגלו כחלק ממנגנון ההגנה של חיידקים בפני פלישה של ‪ DNA‬זר )למשל של חיידק‬
‫בקוניוגציה או התקפה של פאג' המזריק ‪ DNA‬ומוביל למחזור ליטי או ליזוגני(‪ DNA ,‬שאינו מהמין‬
‫שלו‪ .‬פעולת הגנה זו נעשית על ידי אנזימי הגבלה המרטשים את ה‪ DNA-‬הזר‪ .‬הזיהוי מבוסס על כך שה‪-‬‬
‫‪ DNA‬העצמי ממותל באתרי ההכרה‪/‬חיתוך של האנזים )שאינו מסוגל לחתוך אתרי הכרה‪/‬חיתוך‬
‫ממותלים(‪ .‬מתילציה = הגנה מפני אנזימי הגבלה‪.‬‬
‫מכאן שאותו קומפלקס מקיים תחרות אישית בין תת היחידה החותכת לתת היחידה הממתלת‪ .‬האפיניות‬
‫של תת היחידה הממתלת לרוב נמוכה מזו של תת היחידה החותכת ולכן היא זו שלרוב מנצחת בתחרות‪.‬‬
‫תופעה זו נצפתה בניסוי של הרבר‪ ,‬בו מיצו את ה‪ DNA-‬הזר שהוכנס לחיידק מקבל בהצלחה וה‪DNA-‬‬
‫נבדק לאפיון מסויים; נמצא שה‪ DNA-‬ממותל באתרים זהים לרצפים הממותלים ב‪ DNA-‬של החיידק‬
‫המארח‪ .‬מכאן שהחיידק גם מגן על ה‪ DNA-‬שלו עצמו מפני אנזימי ההגבלה על ידי המתילציה‪.‬‬
‫בזמן השכפול של הגנום החיידקי‪ ,‬סיב המקור כבר ממותל וזמן קצר לאחר בניית הסיב החדש מתילאז‬
‫מזהה אתרים חצי‪-‬ממותלים )כי רק סיב אחד ממותל( ומחבר מתיל לסיב השני‪ .‬באופן זה נשמרת‬
‫המתילציה של הפונדקאי והוא מוגן בפני אנזימי ההגבלה שלו עצמו‪.‬‬
‫הדבר השני שהרבר עשה היה לבודד את החיתוך של אנזים הגבלה‪ .‬אולם הוא עבד עם אנזימי הגבלה‬
‫מסוג ‪ I‬ולכן התקשה לאתר אתר חיתוך לעומת אתר הכרה‪ .‬מדען אחר שעבד עם פאג' סלמונלה ראה‬
‫שהפאג' מתקשה בהדבקה‪ ,‬בודד את אנזים ההגבלה שפגע בגנום החיידקי והצליח לבודד את האנזים‬
‫ולהגדיר את רצף הזיהוי‪.‬‬
‫מדען נוסף שקיבל ממנו את האנזים המנוקה עשה מיפוי גנטי ראשון בעזרת אנזימי הגבלה של ‪– SV-40‬‬
‫וירוס של קופים המתנהג גם כוירוס מתמיר של תאי עכבר ולכן שימש כמודל לוירוס סרטני‪ .‬הדבר נעשה‬
‫על ידי קביעת מקומות החיתוך של אנזימי ההגבלה ואז איתור המקטעים המכילים פונקציות שונות –‬
‫הפוקנציות המוקדמות הנמצאות נגד כיוון השעון ל‪ Ori-‬והפונקציות המאוחרות הנמצאות עם כיוון השעון‬
‫ל‪.Ori-‬‬
‫החוקר בודד ‪ DNA‬מתאים מודבקים המוזנים בנוקליאוטידים מסומנים‪ ,‬העביר את התוצרים בג'ל‪ ,‬העביר‬
‫את זה לנייר וחשף לפילם‪ .‬בזמנים קצרים התקבל סימון רק בפרגמנט שהכיל את ‪ ;Ori‬בזמנים ארוכים‬
‫יותר התגבל סימון בפרגמנטים נוספים‪ .‬כאשר בדק את ההיברידיזציה של ה‪ DNA-‬למקטעים יכול היה‬
‫להבין היכן נמצאים הגנים המוקדמים והגנים המאוחרים‪ .‬זה היה המיפוי הראשון שנעשה בעזרת‬
‫אנזימי הגבלה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :07‬שיטות מולקולריות לריקומבינציית‪DNA‬‬
‫‪61‬‬
‫שיבוט ‪ DNA‬לתוך פלסמיד‬
‫סטנלי כהן היה חוקר פלסמידים‪ .‬פלסמידים הם וקטורים בעלי יכולת רפליקציה אינטרנית הקיימים באופן‬
‫טבעי בפרוקריוטים‪.‬‬
‫בוייר היה הראשון שבודד את ‪ .EcoRI‬בהינתן ‪ DNA‬גנומי הנחתך על ידי אנזימי הגבלה הזהים לאלו‬
‫שחתכו את הפלסמיד )אנזימים שונים חותכים קצוות שונים(‪ ,‬התוצר הלינארי הפתוח מושלם שוב למעגל‬
‫על ידי כניסת המחדר בעזרת היברידיזציה לפלסמיד הנובעת מקומפלמנטציה של המחדר לקצוות‬
‫הדביקים‪.‬‬
‫הקצוות הפתוחים שנותרים בין המחדר לפלסמיד מחוברים על ידי פעולת אנזים הליגאז )המוכנס יחד עם‬
‫אספקת ‪ .(ATP‬פעולה זו מבטיחה החדרה כיוונית של המחדר לתוך הפלסמיד ומונעת סגירת הפלסמיד על‬
‫עצמו )כי הקצוות הדביקים שלו אינם בקומפלמנטציה(‪.‬‬
‫הדרישות מוקטור פלסמיד‬
‫•‬
‫‪ – Ori‬הרפליקון זקוק ל‪ Origin of replication-‬שיקנה‬
‫יכולת שיכפול פרזיטית בתאים הפונדקאים אליהם מוכנס‬
‫הפלסמיד‪ .‬בהתאם ל‪ Ori-‬נקבע סוג התא שיוכל לאחסן את‬
‫הפלסמיד‪.‬‬
‫•‬
‫מרקר סלקטיבי‪:‬‬
‫•‬
‫מרקר סלקטיבי דומיננטי – מאפשר בידוד חיידקים שקלטו פלסמיד תקין וסגור בעל יכולת‬
‫רפליקציה‪ .‬הדרישה הזו נובעת מכך שתהליך הטרנספורמציה‪ ,‬החדרת הרפליקון לחיידק‪ ,‬מאוד‬
‫לא יעיל ולכן יש לבודד את המעטים שעברו טרנספורמציה‪ .‬דוגמה‪ :‬עמידות לאנטיביוטיקה‪.‬‬
‫•‬
‫מרקר סלקטיבי רצסיבי – החיידק המקבל יהיה חיידק מוטנט שאינו מסוגל לסנטז חומצה‬
‫אמינית מסויימת‪ .‬המרקר הסלקטיבי יהיה הגן החסר בחיידק ואז החיידקים שקלטו את הפלסמיד‬
‫יבודדו על ידי זריעת התרבית במצע שאינו מכיל את חומצת האמינו שהחיידק הקומפטנטי פגוע‬
‫במסלול הביוסינטטי שלה‪.‬‬
‫ישנם שני אבטיפוסים של פלסמידים היוצרים מספר עותקים גבוה – ‪ – high copy number‬בכל תא‪.‬‬
‫בנסיונות הראשונים לשיבוט אנזימים של גנים חשובים רצו שהתא החיידקי ישמש בית חרושת להפקת‬
‫החלבון‪ ,‬ולכן נדרש מספר עותקים גבוה של הפלסמיד‪ .‬החסרון של חיידקים אלו הוא שכאשר ‪50%‬‬
‫מהמסה החלבונית של התא היא חלבון זר‪ ,‬הדבר עשו להיות טוקסי לחיידק‪.‬‬
‫לשם כך יש גם רשימת פלסמידים מסוג ‪ low copy number‬בעלי עותקים בודדים בתא‪ .‬מנגד אפשר‬
‫להכניס את התוצר תחת פרומוטור חזק המופעל על ידי משרן; בצורה זו אין ביטוי גבוה קונסטיטוטיבית‬
‫אלא רק בזמנים מבוקשים ונתונים‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪62‬‬
‫טרנספורמציות‬
‫•‬
‫‪ – Transformation‬העברת ‪ DNA‬נקי לתוך חיידקים‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – Transfection‬החדרת ‪ DNA‬נקי לתוך שמרים ותאים אנימליים‪.‬‬
‫•‬
‫‪ – Infection‬החדרת ‪ DNA‬בעזרת וירוס או פאג'‪.‬‬
‫וקטור הפלסמיד צריך ‪ Ori‬על מנת שיוכל להשתכפל ואלמנט סלקטיבי; תהליך החדרת ה‪ DNA-‬לחיידק‬
‫אינו יעיל‪ .‬טיפולים לחירור הממברנה עוזרים ליעילותו‪ ,‬בין שעל ידי פולסים של חום או תוספת יוני סידן‬
‫הנקשרים ל‪ DNA-‬הטעון שלילית ומחוררים את הממברנה‪.‬‬
‫הטרנספורמנטים נזרעים על צלחת המתאימה לגן הסלקטיבי שעל הוקטור בכדי לבודד את החיידקים‬
‫המעטים שהכניסו את הפלסמיד‪ .‬מהרגע שהוקטור נכנס לחיידק הוא יכול להתרבות‪ .‬ההתרבות תלויה‬
‫ב‪ Ori-‬של הוקטור‪.‬‬
‫קביעת מספר עותקי הוקטור‬
‫רפליקון ‪ – Coli1‬הפריימר לרפליקציית ‪ DNA‬הוא ‪ RNA‬קצר; הוקטור מסונטז בפרה‪-‬פריימר‪,‬‬
‫‪ .RNA2‬יש אפיניות גדולה של ‪ RNA‬ל‪ DNA-‬ולכן ה‪ RNA-‬יכול לסלק מקומית את הגדיל של ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬ותוך השיעתוק נוצר היבריד ‪.RNA-DNA‬‬
‫אנזים בשם ‪ RNase-H‬רואה את הדופלקס היברידי ומשחרר את מה שיהיה בהמשך הפריימר ליצירת ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬החדש‪ .‬לאחר פילמור ההיבריד הוא ‪ .DNA-DNA‬יחד עם זאת‪ ,‬קיים תהליך מתחרה בו ‪RNA‬‬
‫רגולטורי שלילי‪ RNA1 ,‬הנמצא בקומפלמנטציה ופולאריות הפוכה ל‪ ,RNA2-‬המסוגל בתחילת תהליך‬
‫השיעתוק של ‪ RNA primer‬לעבור היברידיזציה עם הפריימר‪ .‬יצירת ההיבריד היציב מונעת יצירת‬
‫דופלקס ה‪ RNA2-ssDNA-‬ומקטינה את הסיכוי שלו להחתך על ידי ‪.RNAse-H‬‬
‫זהו אלמנט רגולטורי שלילי המוריד את מספר העותקים‪ .‬התחרות הקיימת בין החיתוך על ידי ‪RNase-H‬‬
‫וההיברידיזציה על ידי ‪ RNA1‬וחלבון רגולטורי שלילי ‪ ROP‬התורם להורדת מספר העותקים היא‬
‫שתקבע את מספר העותקים הסופי‪.‬‬
‫מספר העותקים יכול לנוע בין מספרים נמוכים מאוד )‪ (1-2‬ועד מספרים גדולים מאוד )‪ .(3000‬השימוש‬
‫הוא בהתאם לצורך בכמויות החלבון – כאשר צריך כמויות חלבון גדולות משכפלים אותו במספר עותקים‬
‫גבוה; אם החלבון עשוי להיות טוקסי ניתן להשתמש במספר עותקים נמוך או להפעיל אותו תחת‬
‫פרומוטור מושרה כמו ‪ ,LacZ‬אשר כל עוד לא הוסף המשרן ביטוי החלבון ידוכא‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :08‬שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג'‬
‫‪63‬‬
‫שיעור ‪ :08‬שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג'‬
‫פאג' למבדא יכול להדביק את הפונדקאי‪ ,E.coli ,‬בשני מהלכים‪:‬‬
‫•‬
‫תהליך ליטי – גורם לליזיס של הפונדקאי ולמוות‪.‬‬
‫•‬
‫תהליך ליזוגני – לאחר ההדבקה‪ ,‬במקום רפליקציה מסיבית הגנום של הפאג' עובר אינקורפורציה‬
‫למקום מוגדר בגנום החיידק המאחסן‪ .‬במשך הזמן‪ ,‬בהינתן סינגל מסויים‪ ,‬הגנום הנגיפי יכול לעבור‬
‫הוצאה מדוייקת – ‪ – excision‬מתוך כרומוזום החיידק‪ ,‬להכפיל את עצמו ולעבור למצב ליטי‪.‬‬
‫אורך המולקולה של ‪ DNA‬הפאג' הוא כ‪49,000-‬‬
‫בסיסים; נראה שיש בעיה בשימוש בו כאתר שיבוט‬
‫– מכיל יותר אתרי רסטריקציה‪ .‬מדוע אם כן הפך‬
‫גנום הפאג' מועדף לשיבוט גנים?‬
‫כ‪ 20,000-‬הבסיסים הפנימיים אינם מקודדים לפונקציות הכרחיות למהלך הליטי; תוך עבודה עם‬
‫הזרועות השמאלית והימנית בלבד ניתן לקבל מהלך ליטי מושלם‪ ,‬ולכן גודל איזור השיבוט האפשרי הוא‬
‫מעט יותר מ‪ .20kb-‬זאת בניגוד לפלסמידים‪ ,‬שאפילו כשמקטינים אותם ל‪ ,3kb-‬טרנספורמציה של ‪10kb‬‬
‫מעלה בעיית יציבות‪.‬‬
‫הזרועות השמאלית והימנית מכילות את כל הדרוש למהלך ליטי של הפאג'‪ .‬יחד עם העובדה ש‪EcoRI-‬‬
‫הוא אחד מאנזימי הרסטריקציה הראשונים שגילו‪ ,‬מתברר שמשני צידי איזור ה"מיותר" של גנום הפאג'‬
‫נמצאים אתרי ‪ EcoRI‬כך שניתן לחתוך את הגנום באנזים‪ ,‬להפריד בין הזרועות הימנית לשמאלית‪,‬‬
‫למצות אותן ואז לשבט לתוכן מקטעי ‪ DNA‬עם ‪ EcoRI‬בקצוות‪.‬‬
‫היתרונות של פאג' למבדא לא מסתכמים בכך‪:‬‬
‫•‬
‫הזרוע השמאלית מקודדת לחלבוני הראש שעוברים הרכבה‪-‬מקדימה ספונטנית‪ .‬כמו כן באותו צד‬
‫נמצאים הגנים לזנב‪ ,‬אשר עובר גם הוא הרכבה ספונטנית‪.‬‬
‫•‬
‫למבדא מוזרק לתא דרך הזנב ומתחיל‪ ,‬בעזרת אנזימי התא‪,‬‬
‫להכפיל עצמו במנגנון ‪ .rolling circle‬הוא מייצר ‪100‬‬
‫עותקים של הגנום‪ .‬התהליך יוצר כפילויות גנום מחוברות‪,‬‬
‫כאשר המפריד בין היחידות הוא אתר ‪ COS‬ואנזים מיוחד‬
‫היודע לבקע אותו‪.‬‬
‫•‬
‫אנזימים נוספים ממלאים את ראש הויריון בגנום ולאחר מכן‬
‫מחובר הזנב‪ .‬כ‪ 10%-‬מהקופסיות אינן מכילות ‪ DNA‬ועדיין‬
‫הזנב מתחבר אליהן‪ ,‬עובדה המורידה מעט מיעילות‬
‫התהליך‪.‬‬
‫תהליך הדבקה בפאג' יעיל פי ‪ 1000‬מתהליך הטרנספורמציה על ידי ‪ DNA‬נקי לחיידק‪ .‬מכאן שיש עוד‬
‫יתרון‪ :‬נוסף על החדרת ‪ DNA‬גדול יותר ניתנת יעילות הדבקה גבוהה פי ‪.1000‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪64‬‬
‫ב‪ 1975-‬נעשה ניסיון הכנסת ספריית ה‪human -‬‬
‫‪ cDNA‬הראשונה לתוך פאג' על ידי תום מניאטיס‬
‫)‪Maniatis‬‬
‫‪,(Tom‬‬
‫שהיה‬
‫מחלוצי‬
‫שיטות‬
‫ריקומבינציית ‪ .DNA‬רוב ה‪ mRNA-‬היונקיים‬
‫מכילים בקצותיהם זנב פוליאדנילין באורך ממוצע‬
‫של ‪ 180‬נוקליאוטידים‪ ,‬המוסף לאחר השיעתוק‪.‬‬
‫ניתן לנצל עובדה זו על מנת לבודד את ה‪mRNA-‬‬
‫משאר ה‪ RNA-‬שבתא‪ ,‬כיוון שידוע ש‪mRNA-‬‬
‫מהווים רק ‪ 2-5%‬מכלל ה‪ RNA-‬בתא )הרוב זה‬
‫‪.(rRNA‬‬
‫לשם כך מכילים קולונות קצרות המכילות חומר‬
‫תווך דוגמת צלולוז‪ ,‬אליו הודבקו ‪.oligo-dT‬‬
‫האוליגומר יוצר היבריד עם ‪ ,Poly-A‬וכאשר‬
‫מעבירים את כלל ה‪ RNA-‬בקולונה בתנאי מלח‬
‫גבוה‪ ,‬חומצות הגרעין הנותרות בקולונה הן רק‬
‫‪ mRNA‬שניתן להסיר בהורדת ריכוז המלח‪.‬‬
‫)‪ (1‬מניאטיס בודד את ה‪ mRNA-‬והכניס אותם‬
‫למבחנה עם ‪ oligo-dT‬קצרים )‪ 12‬בסיסים בערך(‪.‬‬
‫האוליגומר יוצר היברידיזציה בנקודה כלשהי על זנב‬
‫ה‪ poly-A-‬וכך משמש פריימר לפעילות של ‪RT‬‬
‫)‪ ,(2‬אשר מסוגל לבנות ‪ DNA‬על ‪ RNA‬ו‪DNA-‬‬
‫על ‪ DNA‬לאחר ש‪ RNase-H-‬ביקע את הקשר של‬
‫ההיבריד ‪ DNA-RNA‬וסילק את ה‪.RNA-‬‬
‫בשלב הבא )‪ (3‬מוסיפים אלקלין ליצירת סביבה‬
‫בסיסית שמפרקת ‪ DNA) RNA‬עמיד בפניו(‪ .‬כמו‬
‫כן מוסיפים ‪ poly-G‬בקצה המנוגד ל‪ Poly-T-‬על‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :08‬שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג'‬
‫‪65‬‬
‫ידי ‪ ,Terminal Transferase‬המופעל לזמן קצר בנוכחות ‪ dG‬כך שהוא מכניס הרבה פוליגואנין לגדיל‪.‬‬
‫לאחר מכן )‪ (4‬עושים היברידיזציה עם ‪ oligo-dC‬כפריימר שעובר פולימריזציה )‪ (5‬ומקבלים סיב‬
‫‪ DNA‬משלים‪ .‬באופן הזה מתקבל ‪ DNA‬דו‪-‬גדילי מסוג ‪ – cDNA‬קומפלמנטרי ל‪.mRNA-‬‬
‫בשלב הזה יש להכניס את הדו‪-‬גדיל בין שתי הזרועות של למבדא‪ .‬לשם כך צריך אתרי חיתוך –‪EcoRI‬‬
‫המתקבלים על ידי הכנסת אתרי החיתוך בצורה דו‪-‬גדילית שיחוברו לקצוות ה‪ DNA-‬על ידי ליגאז ו‪-‬‬
‫‪ .ATP‬אולם‪ ,‬כאן עולה בעיה‪ :‬הגנום האנושי יכול להכיל אתרי חיתוך של ‪ ,EcoRI‬דבר שייפגע בגן‬
‫עצמו‪ .‬כדי להימנע מכך בודדו את ה‪ ,EcoRI Methylase-‬שממתל )‪ (6‬את הדו‪-‬גדיל )לפני חיבור‬
‫האתרים הייעודיים לחיתוך‪ (7 ,‬ומקנה עמידות לאתרי הכרה‪/‬חיתוך אקראיים שעשויים להימצא בתוך‬
‫גדילי ה‪ .cDNA-‬עכשיו ניתן לחתוך בעזרת אנזימי ההגבלה המתאימים )‪.(8a‬‬
‫היום חברות ביוטכנולוגיות מייצרות ‪) EcoRI adaptor‬או לכל אנזים הגבלה אחר( שהוא כבר מייצג את‬
‫הקצה החתוך על ידי האנזים‪ ,‬עם הקצוות הדביקים‪ .‬מבצעים ליגציה של האדפטור לקצוות ולא צריך לדאוג‬
‫להגנה על האתרים בתוך הגן כי לא נעשה חיתוך באנזים ההגבלה בפועל‪.‬‬
‫בשלב הבא מערבבים את שתי הזרועות המבודדות )‪ (8b‬של למבדא ועושים ליגציה עם תערובת ה‪-‬‬
‫‪ .(9) cDNA‬תודות לקומפלמנטציה מתקבלות מולקולות שלמות שיכולות להיארז בקופסיות ויריון ריקות‬
‫)‪ ,(10‬המעדיפות להתחבר לזנב רק לאחר הכנסת ‪.DNA‬‬
‫מדוע הזרועות הקומפלמנטריות לא חוברות אחת לשניה ישירות ללא ‪ cDNA‬ביניהן? על בעיה זו מתגברים‬
‫בעזרת שימוש בעודף מולארי של ה‪ cDNA-‬על פני הזרועות‪ .‬לפעולה יש חיסרון כי יכולה להיות‬
‫ליגציה של ה‪ cDNA-‬לעצמו‪ .‬למניעת מצב זה ניתן לטפל בפוספאטאז‪ ,‬המוריד את ‪ 5'-phosphate‬המונע‬
‫ליגציה של מולקולות ‪ cDNA‬אחת לשנייה‪ .‬הקשרים הקוולנטים החסרים ייווצרו רק בתוך החיידק‪.‬‬
‫דרך נוספת שנוצרה עם הזמן היא הקטנת הזרועות לגודל מינימלי של ‪ 78%‬מגודל הפאג'; מתחת ל‪,78%-‬‬
‫האורך של הזרועות אינו מספיק כדי להיארז לתוך קופסית ולכן זרועות קצרות אלו המחוברות אחת לשנייה‬
‫לא ייצרו פאג' תקין‪ .‬הדבר מונע יצירת ויריונים עם זרועות בלבד‪.‬‬
‫את הפאג'ים עם ה‪ cDNA-‬זורעים על צלחת מלאה בחיידקים )‪ .(11‬מכל הדבקה של מולקולת פאג' אחת‬
‫נוצרים ‪ 100‬תוצרים המפוצצים את מעטפת החיידק ותופסים את החיידקים השכנים; כל אחד מהם יוצר‬
‫עוד ‪ ;100‬לאחר כמה הדבקות ניתן לראות פלאקים המכילים אלפי פאג'ים‪ .‬זהו תהליך אמפליפיקציה‬
‫מאוד גבוה של כל אחת מהמולקולות שמבקשים לפתח ולהרבות‪.‬‬
‫על מנת לגלות האם באחת הפלאקים יש ‪ cDNA‬מעניין‪ ,‬ניתן להשתמש בגלאי רדיואקטיבי‬
‫קומפלמנטרי‪ .‬אם ידועות ‪ 7‬חומצות אמינו מתוך החלבון‪ ,‬ניתן לסנטז אוליגונוקליאוטידים של ‪ 21‬בסיסים‬
‫היפותטיים של השילובים השונים של הקודונים היוצרים את רצף חומצות האמינו המוכר; מסמנים‬
‫רדיואקטיבית את הנוקליאוטידים‪.‬‬
‫על גבי פילטר צלולוז או ניילון‪ ,‬גורמים לליזיס של הפאג'ים בטיפול באלקלין ופותחים את דו גדיל של ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬במקומו‪ .‬בעזרת הגלאי המסומן‪ ,‬הקומפלמנטרי לגן המבוקש‪ ,‬ניתן לסמן רצפי ‪ DNA‬עם הגן‪ .‬את‬
‫עודפי האוליגומרים שוטפים ונותרים ה‪ DNA-‬המקובעים והאוליגומרים הקומפלמנטרים הנשארים על‬
‫גבי הפילטר‪.‬‬
‫כעת חושפים את הפילטר לפילם ורואים היכן יש חשיפה‪ .‬בתנאי המעבדה‪ ,‬הדבר נעשה על ידי הנחת‬
‫ניטרוצלולוז על הצלחת של הפלאקים למשך דקה; חלק מהפאג'ים נדבקים ואז מוציאים ומכינים דופליקט‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪66‬‬
‫באופן דומה‪ .‬כך יש שני דופליקטים של ניטרוצלולוז ועדיין יש מספיק פאג'ים על גבי הצלחת‪ .‬עושים‬
‫ליזיס של הפאג'ים‪ ,‬פיקסציה של ה‪ DNA-‬על‬
‫הניטרוצלולוז‪ ,‬חשיפה לאוליגומרים ואז חשיפה‬
‫לפילם ומוצאים שאחד הגלאים הגיב עם אחד‬
‫הפלאקים‪ .‬מכאן שהפלאק מכיל רצף קומפלמנטרי‪.‬‬
‫ניתן לבודד את הפאג'ים ולבחון מקרוב האם זה ה‪-‬‬
‫‪ cDNA‬הקומפלמנטרי ל‪ 6-7-‬חומצות האמינו‪ .‬אם‬
‫זהו רצף רפטיטיבי‪ ,‬יש בעיה‪.‬‬
‫היום לא משתמשים בשיטה זו‪ ,‬כיוון שרוב הגנים‬
‫ידועים‪ ,‬ולכן נעשה שימוש ב‪.PCR-‬‬
‫ידוע שישנם כ‪ 25,000-‬גנים הומניים )למרות שבכל‬
‫תא או רקמה יש גנים ייחודיים(‪ .‬כמה פאג'ים יש‬
‫לסרוק לגילוי הגן הייחודי מבין ‪ 5,000‬גנים שונים‬
‫המבוטאים ברקמה כלשהי?‬
‫לא כל הגנים מייצרים ‪ mRNA‬במידה שווה; ‪10%‬‬
‫מה‪ mRNA-‬בכל תא מיוצרים בהרבה יותר עותקים‬
‫מהאחרים‪ .‬משום כך לא מספיק לקחת ‪ 5000‬פאג'ים‬
‫וגם לא ‪ .10,000‬יש להתחשב גם בפרוססיביות‬
‫הנמוכה של ה‪ .RT-‬ב‪ mRNA-‬מאוד ארוכים – ‪10-‬‬
‫‪ 12‬קילובסיסים – אין סיכוי ש‪ RT-‬רגיל ייתן את כל‬
‫הגן‪ .‬אחד הפתרונות הוא לא להשתמש רק‬
‫בפוליאדנילין‬
‫בתור‬
‫פריימר‬
‫אלא‬
‫גם‬
‫באוליגונוקליאוטידים קצרים של ‪ 6‬בסיסים המוספים‬
‫לפני ה‪ .RT-‬הם נצמדים לרצפים קומפלמנטרים‬
‫ומשמשים פריימרים לסינטזת ‪ .RT‬באופן זה ניתן‬
‫לייצג אזורים שונים של ‪ ,mRNA‬ולא רק איזור ה‪-‬‬
‫'‪.3‬‬
‫לגן יכולים להיות גם יותר מאתר ‪ Poly-A‬אחד או‬
‫שיהיה לו שיחבור חלופי המשנה את הרכב‬
‫האקסונים; גורמים אלו מגדילים את מספר המושבות‬
‫שיש לסרוק‪ .‬בסך הכל יש לסרוק כמיליון פאג'ים‪.‬‬
‫בצלחת גדולה ניתן להכניס עד ‪ 50,000‬פאג'ים‬
‫)לשם השוואה‪ ,‬ניתן להכיל ‪ 500-1000‬מושבות‬
‫מבודדות בצלחת לכל היותר – יש הבדל של סדרי‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :08‬שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג'‬
‫‪67‬‬
‫גודל בין מספר המושבות שניתן להציג בצלחת(‪ .‬לא כל ה‪ 50,000-‬יוצרים פלאקים מבודדים – במצב זה‬
‫כל המשטח עובר ליזיס והפאג'ים מתערבבים אלו באלו‪ .‬דגימה מכילה ‪ 50‬פאג'ים במקום פאג' אחד;‬
‫הדגימה נמהלת‪ ,‬נזרעת מחדשוממנה מבודדים את הפאג'י הרלוונטי‪ .‬מסיבה זו העובדה שיש צורך במיליון‬
‫פאג'ים אינה מרתיעה ועדיין יעילה יותר משימוש בחיידקים‪.‬‬
‫ניסוי‬
‫ללנד הרטוול היה גנטיקאי שבחר לפצח את מחזור‬
‫התא בשמרים‪ .‬לשם כך הוא יצר כ‪ 60-‬שמרים‬
‫מוטנטים הפגועים במחזור התא‪ ,‬שרובם רגישים‬
‫לטמפרטורה גבוהה‪ .‬העלאת הטמפרטורה עצרה‬
‫את מחזור התא ובשמרים ניתן לראות מורפולוגית‬
‫מהו שלב המחזור בו התא נמצא‪.‬‬
‫התקדמות מחזור התא‪ ,‬כך העלתה ההיפותזה‪,‬‬
‫מבוססת‬
‫על‬
‫קינאזות‪,‬‬
‫פוספורילציה‬
‫ודה‪-‬‬
‫פוספורילציה‪ .‬הרטוול לקח פלסמיד המכונה‬
‫‪ – shuttle vector‬היכול להיות בשתי סביבות‬
‫ולעבור שיכפול בחיידקים כמו גם בשמרים )בעזרת‬
‫‪Ori‬‬
‫חיידקי‬
‫ו‪-‬‬
‫‪[autonomousely‬‬
‫‪ARS‬‬
‫]‪ .(replicating sequence‬כדי שהרטוול יכיר את‬
‫הוקטור הוא מכיל גם גורם סלקציה – עמידות לאמפצילין )חיידקים( ו‪ URA3-‬תקין ההכרחי לבניית‬
‫נוקליאוטיד ‪) U‬מוכנס לשמר פגוע ‪.(ura3‬‬
‫הוקטור מכיל ‪ polylinker‬המסוגל להיחתך על ידי ‪ BamHI‬ולקלוט גנום ‪ .cDNA‬הוא חתך את הגנים‬
‫של השמר בחיתוך חלקי על ידי ‪ Sau3A‬לקבלת פרגמנטים בגודל ‪ 2-3‬קילובסיסים‪ .‬לאחר שמכניסים‬
‫אותם לתוך הוקטור‪ ,‬מכניסים את הפלסמיד לחיידקים‪ ,‬אוספים את המושבות‪ ,‬ומפיקים מהן ‪ .DNA‬בשלב‬
‫הבא עושים טרנספקציה של ה‪ DNA-‬המנוקה לתוך שמרים וזורעים אותם על מצע ללא אורציל‪.‬‬
‫לאחר הזריעה של השמרים מעבירים אותם לנייר ניטרוצלולוז‪ ,‬זורעים רפליקט בצלחת ומעבירים אותה‬
‫לטמפרטורה גבוהה‪ .‬במצב זה רוב המושבות מתות‪ ,‬כי הם מוטנטים‪ ,‬למעט כמה בודדות‪ .‬הבודדות האלה‬
‫יכולות להיות כאלה שיש להם את הגן החסר על ‪ cDNA‬או רברטנטים‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪68‬‬
‫שיעור ‪ :09‬איפיון ושימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬
‫אלקטרופורזה יכולה להיעשות בתווך שונה‪ ,‬כמו אקרילאמיד לעומת אגרוז סטנדרטי או אגרוז ‪pulse‬‬
‫‪ ,field‬כאשר השוני בין התווכים הוא גודל הנקבוביות בין הגרגרים של התווך‪ .‬ככל שהמקטעים גדולים‬
‫יותר הם ייתקשו לחדור בין החלקיקים‪ ,‬ולכן גודל המרווחים קובע את גודל ה‪ DNA-‬שיוכל הג'ל‬
‫להפריד‪ .‬ככל שריכוז האגרוז נמוך יותר‪ ,‬הוא יאפשר הפרדה של מולקולות יותר גדולות‪.‬‬
‫•‬
‫אקרילאמיד – ‪ 10-1000‬זוגות בסיסים‬
‫•‬
‫אגרוז סטנדרטי – ‪ 500-25,000‬זוגות בסיסים‬
‫•‬
‫אגרוז ‪ 10,000-2,000,000 - Pulse Field‬זוגות בסיסים‬
‫אגרוז בריכוזים נמוכים מ‪ 0.5%-‬לא יהיה קשיח מספיק כדי להוות ג'ל ולכן אינו פרקטי‪.‬‬
‫ההפרדה משאירה את הפרגמנטים‬
‫הכבדים למעלה ואת הקצרים למטה‪.‬‬
‫כאשר מוסיפים את הג'ל לתמיסת‬
‫אתידיום ברומיד ניתן לצבוע אותו‬
‫ולראות היכן נמצאים הפרגמנטים‪.‬‬
‫סאות'רן הציע גם להעביר את הג'ל‬
‫לנייר ניטרוצלולוז או ממברנת ניילון‬
‫כך שעל גבי הממברנה מתקבלת‬
‫תמונת ראי של ה‪ DNA-‬כפי שהוא‬
‫מצוי בתוך הג'ל‪ .‬הסיבים של ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬הדו‪-‬גדילי ניתקים אחד מהשני‬
‫בעזרת אלקלין‪ ,‬כך שהם פנויים‬
‫לעבור היברידיזציה עם גלאי ‪DNA‬‬
‫מסומן המוצא פרגמט ‪ DNA‬ספציפי‪.‬‬
‫שיטות הרצה – סאות'רן‪ ,‬נורת'ן‪ ,‬ווסטרן‬
‫שיטת סאות'רן‪-‬בלוט‬
‫השיטה פותחה על ידי אד סאות'רן וקרויה על שמו‪.‬‬
‫לאחר הרצה של הג'ל‪ ,‬מניחים את הג'ל על מגש‬
‫זכוכית ושמים בקערה המכילה תמיסה אלקלית‪ .‬על‬
‫גבי הזכוכית מניחים נייר סופג שקצותיו מוספגים‬
‫בתמיסה האלקלית‪ .‬על גבי הנייר מונח הג'ל ומעליו‬
‫נייר הניטרוצלולוז או הממברנה‪ .‬על גבי הממברנה‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :09‬איפיון ושימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬
‫‪69‬‬
‫מניחים עוד נייר ספוג‪ .‬בכוח הנימיות התמיסה‬
‫עוברת דרך הנייר הסופג הראשון ואל השני‪ ,‬דרך‬
‫הג'ל; במעבר בג'ל התמיסה קוטפת את ה‪DNA-‬‬
‫שעובר לנייר הניטרוצלולוז אך אינה יכולה להתקדם‬
‫הלאה‪ .‬באופן כזה‪ ,‬בתוך כמה שעות‪ ,‬כל תכולת הג'ל‬
‫עוברת לנייר הניטרוצלולוז‪.‬‬
‫הנוכחות של התמיסה האלקלית גרמה להיפרדות ה‪-‬‬
‫‪ in situ DNA‬לשני הגדילים שלו‪ ,‬כך שהוא במצב‬
‫חד גדילי על הנייר ומוכן לעבור היברידיזציה עם‬
‫גלאי בעל רצף בסיסים מתאים‪ .‬בשלב האחרון‬
‫עורכים את ההיברידיזציה וחשיפה של הנייר לפילם‬
‫וכך מגלים היכן נמצא הגן המבוקש‪.‬‬
‫שיטת נורת'רן‪-‬בלוט‬
‫מדען מסטנפורד ערך מודיפיקציות לשיטה כך שתתאים גם לשימוש עבור גדילי ‪ .RNA‬גדילי ה‪RNA-‬‬
‫עוברים הפרדה בעזרת פורמלדהיד‪ .‬זוהי שיטה משלימה לסאות'רן אלא שהעבודה בה נעשית עם ‪RNA‬‬
‫והג'ל מורץ עם גדילים בתנאים דה‪-‬נטורטיבים‪.‬‬
‫שיטת ווסטרן בלוט‬
‫בשיטה זו נעשת הפרדה של חלבונים בג'ל ‪ ,SDS-PAGE‬כאשר החלבונים מאותרים על ידי נוגדנים‬
‫ספציפיים כנגד אפיטופים של החלבון המבוקש‪ .‬גם בשיטה זו יש העתקה של החלבונים שהורצו בג'ל‬
‫לממברנה אשר כנגדה מופעל הנוגדן‪.‬‬
‫שיטת ריצוף ה‪DNA-‬‬
‫ב‪ 1978-‬התפרסמו שני מאמרים עם שתי שיטות שונות לחלוטין לקביעת רצף ‪ .DNA‬השיטה המקובלת‬
‫היא שיטתו של ‪ ,Fred Sanger‬כימאי אורגני אנגלי שפיתח‬
‫שיטה לקביעת רצף מרכיבי חומצות האמינו בחלבון )וזכה בנובל(‬
‫ואז הסב את עניינו לקביעת רצף ה‪.DNA-‬‬
‫השיטה מכונה ‪ .dideoxy chain termination method‬היא‬
‫משתמשת בנוקליאוטיד תלת‪-‬פוספט די‪-‬דיאוקסיריבוז )‪,(ddNTP‬‬
‫כלומר עמדה '‪ 3‬של סוכר הריבוז בנוקליאוטיד אינה מכילה ‪OH‬‬
‫אלא ‪ .H‬זאת לעומת הנוקליאוטיד הרגיל‪ ,‬שהוא דיאוקסיריבוז‪,‬‬
‫אשר חסר לו רק חמצן אחד בעמדה ‪.'2‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪70‬‬
‫כאשר מכניסים בסינטזת ה‪ DNA-‬את ה‪ ,ddNTP-‬הוא יוצר בקשר '‪ 5'-3‬דרך הפוספט אולם אינו מסוגל‬
‫להמשיך את הארכת השרשר – אי אפשר לקשור עוד נוקליאוטידים כי אין ‪ OH‬בעמדה '‪ .3‬ברגע ש‪-‬‬
‫‪ ddNTP‬עובר אינקורפורציה לגדיל‪ ,‬נפסקת ההתארכות של הגדיל‪.‬‬
‫משום כך‪ ,‬כאשר מניחים לפולימראז לסנטז ‪DNA‬‬
‫עם ריכוז מסויים של ‪ ddNTP‬ספציפי‪ ,‬ניתן יהיה‬
‫לקבל גדילים קטועים בנקודות שונות כך שניתן יהיה‬
‫לנתח אילו בסיסים מוספים באיזה סדר‪.‬‬
‫הדבר נעשה בעזרת ארבע מבחנות שונות‪ ,‬כאשר כל‬
‫מבחנה מכילה ריכוז נתון של ארבעה ‪ dNTP‬וריכוז‬
‫‪ 1/100‬או ‪ 1/50‬של אחד מה‪ .ddNTP-‬באופן‬
‫רנדומלי ‪ ddNTP‬ייכנס במקומות שונים ולכן‬
‫ייווצרו חד‪-‬גדילי ‪ DNA‬המופסקים בנקודות שונות‬
‫של אותו ‪.ddNTP‬‬
‫כאשר יש ארבע מבחנות שבכל אחת ‪ ddNTP‬שונה‪,‬‬
‫ניתן להריץ את התוצרים בג'ל )עם צביעה בברומיד(‬
‫והג'לים )אקרילאמיד עם אוראה לצורך דה‪-‬‬
‫נטורציה(‪ ,‬שיכולים להפריד בין גדילים הנבדלים‬
‫בבסיסים אחד בטווח שבין ‪ 10-1000‬בסיסים‪,‬‬
‫מספקים תמונה של מגוון בנדים בכל אחת מהבאריות – בארית ‪,A‬‬
‫‪ C ,T‬ו‪ .G-‬כאשר מתחילים מהגדיל הקצר ביותר )התחתון( ועולים‬
‫כל פעם באחד‪ ,‬ניתן לדעת מה היה רצף הנוקליאוטידים‪.‬‬
‫לצורך שיפור השיטה‪ ,‬התקינו לייזר בתחתית הג'ל שמעורר‬
‫פלורופורים שונים שמחוברים ל‪ ddNTP-‬ספציפיים )למשל אדום‬
‫ל‪ ,G-‬ירוק ל‪ T-‬וכן הלאה(‪ .‬בצורה כזו לפי קצב היציאה של ה‪-‬‬
‫‪ emission‬מהג'ל ניתן לזהות את הנוקליאוטיד שבקצה השרשרת‪,‬‬
‫וכך מתקבל גרף פיקים אשר בהפרדה אחת – בהרצת בארית אחת‬
‫– מציג רצף של עד ‪ 700‬בסיסים‪.‬‬
‫השיטה משתמשת בהרצה של דידיאוקסינוקליאוטידים עם‬
‫פלואורפורים ייחודיים לכל נוקליאוטיד כך שבהרצה אחת ניתן‬
‫יהיה להפריד את הגדילים ולזהות עד ‪ 700‬בסיסים‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :09‬איפיון ושימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬
‫‪71‬‬
‫‪PCR – Polymerase Chain Reaction‬‬
‫שיטה זו יצאה לראשונה ב‪ 1985-‬וזכתה תחילה לזלזול בחשיבותה; המהפך חל ב‪ 1988-‬עם שיפור‬
‫השיטה‪ .‬הממציא של השיטה הוא קארי מוליס‪ ,‬אוסטרלי שעבד בחברת ביוטכנולוגיה ליד ברקלי‪ ,‬ושיטתו‬
‫ניסתה להפיק כמויות גדולות של ‪ DNA‬ללא שיבוט – באמצעי טכני‪ ,‬לא ביולוגי לכאורה‪.‬‬
‫הטכנולוגיה הייתה להשתמש בדו‪-‬גדיל של ‪ .DNA‬בשלב הראשון נעשית דה‪-‬נאטורציה על ידי חימום ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬ל‪ 92°C-‬למשך דקה‪ .‬לאחר מכן מוסיפים עודף פריימרים )אוליגומרים קצרים‪ ,‬עד ‪ 18‬בסיסים(‬
‫הקומפלמנטרים לכל אחד משני הסיבים משני קצותיו של מקטע מבוקש‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬כשמוסיפים‬
‫פולימראז ונוקליאוטידים מתקבלת הארכה של השרשרת‪ .‬בשלב הבא מתחיל מחזור נוסף‪.‬‬
‫כל מחזור מורכב משלושה חלקים‪:‬‬
‫• דה‪-‬נטורציה – פותחת את הגדילים על ידי חימום‪.‬‬
‫• אנילינג – הפריימרים יעברו היברידיזציה עם המקטעים הקומפלמנטרים שלהם‪.‬‬
‫• הארכה – הפולימראז משתמש בפריימרים כדי לסנטז את הגדילים‪.‬‬
‫בתלות בהרכב הבסיסים של‬
‫הפריימרים‪ ,‬שלב האנילינג נעשה‬
‫בטמפרטורה של ‪ .50-70°C‬השלב‬
‫השלישי נעשה לאחר קירור ל‪37°C-‬‬
‫על מנת שהפולימראז יעבוד‪.‬‬
‫על מנת להתחיל במחזור חדש יש‬
‫לחמם שוב לצורך דה‪-‬נטורציה‪ .‬שלב‬
‫זה‪ ,‬של חימום גבוה מאוד‪ ,‬פגע‬
‫בפולימראז והרג אותו – ולכן היה‬
‫צריך להוסיף פולימראז חדש בכל‬
‫מחזור‪ .‬בשל כך ב‪ 1985-‬הריאקציה היתה לא יעילה והוכרזה כלא עובדת‪.‬‬
‫ב‪ 1987-‬קארל מוליס הצהיר שיש לחפש פולימראז עמיד לחום על מנת שניתן יהיה לעבוד עם השיטה;‬
‫פולימראז כזה ניתן יהיה להפיק מאורגניזמים הרגילים לחום‪ ,‬למשל יצורים שחיים בסביבת הגייזרים של‬
‫ילוסטון‪ .‬הפולימראז שמצאו שם הוא כזה שעמיד לחום ב‪ 92°C-‬ועבד אופטימלית ב‪.72°C-‬‬
‫מכאן‪ ,‬שבזמן ‪ 0‬כשמתחילים את התגובה ניתן כבר להוסיף את הפולימראז ואפשר להריץ מחזורים רבים‬
‫ללא הוספת אנזים‪ .‬בצורה זו השיטה הפכה משיטה לא יעיה לשיטה אשר בתוך מחזורים ספורים בלבד‬
‫ניתן לקבל את הפרגמנטים המוגדרים על ידי הפריימרים בכמויות עצומות‪ .‬האנזים שעשה את ההבדל הוא‬
‫‪.Taq polymerase‬‬
‫ה‪ PCR-‬דורש כתחל פרגמנט מאוד קצר – ‪ 18‬נוקליאוטידים‪ .‬כיום מייצרים אנזים ‪ taq‬מאוד פרוססיבי‪,‬‬
‫כך שניתן לקבל חתיכות של עד ‪ 20kb‬של גנום – גנים שלמים במקרים של שמרים – בפעילות פשוטה‪.‬‬
‫לפריימרים אפשר להוסיף בקצה '‪ 5‬אתרי רסטריקציה‪ .‬על אף שאין הומולוגיה בין אתרי הרסטריקציה‬
‫לתבנית‪ ,‬מהר מאוד הרצף המקביל יפלמר את הרצף הזר‪ .‬בצורה זו ניתן יהיה לחתוך את הגדיל הנוצר‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪72‬‬
‫בריאקציה ולשבט אותו לפלסמידים‪ .‬מניפולציה קטנה זו גרמה לכך שניתן יהיה לשבט בקלות איזורים‬
‫שהוגברו ב‪.PCR-‬‬
‫קשה לתאר היום שטחים חשובים במדעי החיים והרפואה ללא ‪:PCR‬‬
‫•‬
‫דיאגנוסטיקה רפואית – בעבר היו משתמשים בחתיכת נייר שהועברה על השיניים והונחה במצעי‬
‫גידול שונים על מנת לזהות חיידקים מזהמים; ‪ PCR‬מאפשר לזהות את החיידקים לפי רצפי ‪DNA‬‬
‫ידועים של גורם פתוגני‪ ,‬למשל‪.‬‬
‫•‬
‫שיטות השיבוט‪ ,‬בימינו‪ ,‬אינן מקובלות בתחום הרפואה כי הגנום היום ידוע; לכן ניתן להשתמש‬
‫בערכה )קיט( להגברה או לשיבוט על מנת למצוא ולהגביר גן מסויים‪.‬‬
‫•‬
‫מעבדות מז"פ וחקר האבולוציה – יש מספיק ‪ DNA‬בשערה אחת על מנת לקבוע את הזהות‬
‫והשייכות שלה לחשוד‪ .‬גם מציאת ‪ DNA‬קדמוני על מנת לזהות את האבולוציה של מינים שונים‪,‬‬
‫בכללם האדם‪ ,‬נעזרת ב‪.PCR-‬‬
‫ריצוף מסיבי מקביל ‪ in situ‬או ‪Deep DNA Sequencing‬‬
‫כאשר מבקשים לקבוע את רצף הגנום השלם – לא רק הקומפלמנטרי או הגנים אלא כלל הגנום – של‬
‫אדם‪ ,‬עומדים למעשה בפני משימה אדירה – שכן בבני אדם יש ‪ 3x109‬זוגות בסיסים‪ .‬שיטה זו היא‬
‫המסייעת בכך‪.‬‬
‫העקרון הראשון הוא שלא משנה מהי החברה המשתמשת במיחשוב‪ ,‬התוצר המתקבל הוא אוסף רב של‬
‫מקטעי ‪ .DNA‬במכשירי ‪ Solexa‬מתקבלים ‪ 35‬בסיסים‪ ,‬ב‪ Roche-‬מתקבלים מקטעים של ‪ 120‬בסיסים‪.‬‬
‫אם רוצים לקבוע רצף של יצור לא מוכר‪ ,‬השיטה אינה טובה – המקטעים קצרים מדי ומקשים על העימוד‬
‫של הגדילים ללא אבטיפוס או תבנית של הגנום‪.‬‬
‫לשם כך שוברים גנום מבוקש‪ ,‬למשל של אדם‪ ,‬לחתיכות קצרות; בעזרת ליגאז מוסיפים מולקולות‬
‫‪ adapter‬בקצה אחד ולאחר שהדבר מושלם מוסיפים ‪ adapter‬שונה לקצה השני‪ .‬בצורה זו מתקבלות‬
‫מולקולות שיש להן שני מתאמים שונים משני הקצוות‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :09‬איפיון ושימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬
‫‪73‬‬
‫בשלב הבא יש לקבע את הרצפים‬
‫במצב חד‪-‬גדילי לתמוכה )‪.(in situ‬‬
‫לשם כך משתמשים בסיליקון מיוחד‪,‬‬
‫עושים דה‪-‬נטורציה של ה‪DNA-‬‬
‫להפרדת הגדילים ומקבעים את ה‪-‬‬
‫‪ ssDNA‬דרך אחד מקצותיו לסיליקון‪.‬‬
‫בנוסף מקבעים על הסיליקון באותו‬
‫השלב פריימרים – גדילי ה‪adapters-‬‬
‫– בצפיפות גבוהה יותר מאשר‬
‫הגדילים‪ .‬כך מתקבל גדיל מקובע‬
‫וסביבו פריימרים הזהים למתאמים‪.‬‬
‫בשלב השלישי‪ ,‬מבצעים‬
‫‪Bridge‬‬
‫‪ – PCR‬ה‪ ssDNA-‬שבקצהו מתאם‬
‫מסוגל להכיר ולעבור היברידיזציה עם‬
‫הפריימר‬
‫הקומפלמנטרי‬
‫שמקובע‬
‫לסיליקון לידו‪ ,‬וכך הגדיל מתכופף על‬
‫מנת לעבור היברידיזציה‪ .‬בשלב הזה‬
‫ניתן‬
‫להוסיף‬
‫‪polymerase‬‬
‫‪taq‬‬
‫לקבלת תוצרי ‪ PCR‬מקושתים על גבי‬
‫הסיליקון‪.‬‬
‫לאחר מכן נעשה עוד מחזור דה‪-‬‬
‫נטורציה להפרדת הקשת; מכיוון שכל גדיל מקובע‬
‫למשטח דרך אחד מהפריימרים מתקבלת הגברה של‬
‫עמודי ה‪ ssDNA-‬המקובעים‪ .‬על המחזורים הנ"ל‬
‫חוזרים שוב ושוב על מנת להגדיל את שכיחות החד‪-‬‬
‫גדילים על המשטח‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪74‬‬
‫בסופו של תהליך מתקבלים צברים‬
‫של ‪ ssDNAs‬שכולם התחילו מגדיל‬
‫‪ ssDNA‬יחיד‪ .‬השאיפה היא שיהיו‬
‫כ‪ 1000-‬תוצרים בכל צבר‪ .‬הללו‬
‫דרושים על מנת להניב סיגנל מספיק‬
‫חזק‬
‫בשלב‬
‫המתקבלים‬
‫הריצוף‪.‬‬
‫הצברים‬
‫בטכנולוגיה‬
‫התקבלו‬
‫בהתחלה בשכיחות של ‪ 40‬מיליון‪.‬‬
‫בהמשך הצליחו לדחוס אף למעלה מ‪-‬‬
‫‪ 100‬מיליון צברים על משטח‪.‬‬
‫השלב הבא הוא הריצוף‪ .‬כל צבר‬
‫מחובר לנקודה מיקרוסקופית על‬
‫המשטח‪ .‬תחילה מוסיפים את אחד‬
‫מהפריימרים המתאמים – למשל‬
‫הסגול – אשר עובר היברידיזציה עם‬
‫ה‪ ssDNA-‬המכילים את הפריימר‬
‫הקומפלמנטרי חופשי‪ .‬לאחר מכן‬
‫מוסיפים ‪ .ddNTP‬הפלמור נמשך‬
‫לאורך נוקליאוטיד אחד בלבד‪ .‬כעת‬
‫מערכת לייזרים מקרינה מצד אחד‬
‫ומערכת דימות מסתכלת על ‪100‬‬
‫מיליון נקודות הצברים וקובעת באיזו‬
‫נקודה נכנסה איזה סוג פלורסנציה‬
‫)דהיינו איזה ‪.(ddNTP‬‬
‫ה‪ ddNTP-‬והפלורופור שנמצאים בשימוש כאן הם רברסיבילים – מורידים את הפלורופור שחוסם את‬
‫ה‪ ddNTP-‬כך שהוא הופך לנוקליאוטיד המשכי‪ ,‬מוסיפים שוב ‪ ,ddNTP‬ומקבלים את הנוקליאוטיד הבא‬
‫שמתחבר בכל אחת מ‪ 100-‬מיליון הנקודות‪.‬‬
‫•‬
‫•‬
‫מערכת הדימות מחוברת למחשב הקובע מהו הרצף בכל נקודה והם מחפשים הומולוגיה של‬
‫הרצף המתקבל לרצף ידוע‪.‬‬
‫הכמויות המדוברות הן קטנות מאוד‪ ,‬ולכן באופן יחסי הריאקציה זולה פי ‪ 100‬מאשר ריאקציות‬
‫ישנות יותר‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :10‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬
‫‪75‬‬
‫שיעור ‪ :10‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬
‫‪ Deep DNA sequencing‬יכול להגיע לעלויות שבין ‪ $500-4000‬להרצה‪ ,‬ומרצף בהיקף של ‪ 1010‬זוגות‬
‫בסיסים‪ ,‬פי ‪ 3‬מגודל הגנום האנושי‪ ,‬באחה"צ אחד‪ .‬במכון ברוד בוושינגטון יש ‪ 96‬מכונות כאלה – לשם‬
‫השוואה למספר מכונים בודדים בארץ יש רק מכשיר אחד‪ .‬המכון הוא שיתוף פעולה ייחודי בין ‪MIT‬‬
‫והרווארד עם מקדמה של ‪ 600‬מיליון דולר‪ ,‬כך שיש להם האמצעים הכלכליים להפעיל כמות כזו של מכונות‬
‫ריצוף‪.‬‬
‫הפיתוח של ריצוף ה‪ DNA-‬הוביל לכך שניתן לקחת את ה‪ RNA-‬שבתא או ברקמה‪ ,‬להפוך אותו ל‪cDNA -‬‬
‫‪ counterpart‬ולרצף אותם – כך שניתן לקבל את הריצוף של ה‪ mRNA-‬המתורגמים באותה הרקמה‪.‬‬
‫שיטה זו קיבלה את הכינוי ‪ .RNA-seq‬כיום ניתן לקבוע בהרצה אחת את כל ה‪ RNA-‬הקצרים בתא ביום‬
‫אחד‪ ,‬עבודה מפרכת שהייתה בלתי אפשרית בעבר‪.‬‬
‫כשפותחה היכולת לבודד ‪ cDNA‬הומני‪ ,‬חברות‬
‫מסחריות וחוקרים ייצרו כמויות גדולות של חיידקים‬
‫המכילים את תוצרי הגנים החשובים – דוגמת ה‪-‬‬
‫‪ cDNA‬של ‪G-CSF – granulocyte colony‬‬
‫‪ .stimulating factor‬הם לקחו פלסמיד עם‬
‫הפרומוטור של ‪ lacZ‬והכניסו במקום ‪ lacZ‬את הגן‬
‫המבוקש‪ .‬בעזרת המשרן ‪ IPTG‬ניתן לקבל בתמיסה‬
‫כמויות גדולות של החלבון – עד ‪ 50%‬מתכולת‬
‫החלבון החיידקי תהיה החלבון המבוקש‪.‬‬
‫יחד עם זאת‪ ,‬התקוות להתעשרות מייצור מאסיבי‬
‫של חלבונים אנושיים התבדו‪ .‬הסיבה היא שהסתבר‬
‫שלצורך פעילותם הנורמלית של החלבונים נדרשות‬
‫מודיפיקציות המתחוללות באופן אופייני בתאי יונקים ואינן מצויות בחיידקים‪ .‬החלבון המתקבל אינו זהה‬
‫לחלבון ההומני‪ ,‬למען זהות ברצף חומצות האמינו‪ ,‬דבר המוריד מערך פעילותו‪ .‬לכן החברות החלו‬
‫לבטא חלבונים אלו במערכות יונקיות‪.‬‬
‫טרנספקציות לתאים ממליים‬
‫טרנספקציה זמנית‬
‫וקטור הביטוי מורכב מפרומוטור ואחריו ‪ cDNA‬של‬
‫הגן המבוקש‪.‬‬
‫ה‪ cDNA-‬מכיל רצף של ‪ AAUAAA‬המאותת לתא‬
‫כי זהו סוף ה‪ .mRNA-‬אנדונוקליאז מגיע לאתר‪,‬‬
‫מזהה אותו‪ ,‬מוריד ‪ 12-15‬נוקליאוטידים מהקצה של‬
‫ה‪mRNA-‬‬
‫ומוסיף‬
‫במקומם‬
‫‪polyA‬‬
‫בתהליך‬
‫פוליאדנילציה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪76‬‬
‫בפועל‪ ,‬לעיתים קרובות התהליך אינו יעיל ולכן מרבית הוקטורים מכילים ‪ PolyA Addition Site‬המכניס‬
‫באופן סינטטי את אתר ה‪ AAUAAA-‬לתוך ה‪ mRNA-‬המשועתק מגן העניין שהוכנס לוקטור בכדי לוודא‬
‫התרחשותו של תהליך הפוליאדנילציה‪.‬‬
‫בוקטור הביטוי אין אינטרון – הניסיון הראה שהכנסה של אינטרון אינה גוררת הבדל‪ ,‬ולמרות שלכמה‬
‫מהגנים זה עזר לאחרים זה אך הוריד את רמת הביטוי‪ .‬משום כך מעדיפים לעבוד עם גנים ללא אפשרות‬
‫השיחבור‪ .‬שימו לב שהוספת אינטרון כוללת גם הוספת איזורי זיהוי של אקסון‪.‬‬
‫הוקטורים מכילים לרוב כם ‪ .Viral origin of replication‬מכיוון שהביטוי בתא היונקי הוא זמני‪,‬‬
‫בוחנים אותו למשל ‪ 24-96‬שעות‪ .‬לאחר יותר מ‪ 72-‬שעות גורמות ל‪ DNA-‬לעבור אינטגרציה‬
‫לכרומוזומים בגרעין‪ ,‬והביטוי שלו אבוד‪ .‬הסיבה היא שמאות העותקים המצויים בגרעין עוברים‬
‫אינטגרציה או דגרגדציה‪ ,‬ולכן יורדת מידת הביטוי‪ .‬על מנת להגביר את מספר הוקטורים בגרעין‪,‬‬
‫הוסיפו ‪ OriR‬של נגיף כלשהו‪ ,‬דוגמת ה‪ ,SV40-‬אשר בייצור חלבון ויראלי אחד – ‪Large T Antigene‬‬
‫– מאפשר למערכת התאית להכיר אותו כרפליקון ולספק הגברה של הביטוי‪ .‬הגן הויראלי נמצא באיזור‬
‫הקידוד המוקדם של הוירוס‪ ,‬ולכן ניתן היה לקחת את הסגמנט ‪ OriR+early‬של הוירוס‪.‬‬
‫הכנסת ה‪ DNA-‬העירום לתא נעשית על ידי חירור של הממברנה המאפשר למאקרומולקולות להיכנס‬
‫לתא – בין אם על ידי פריקת קבל חשמלי )אלקטרופוראציה( או טיפול בתמיסה שמצפה את ה‪DNA-‬‬
‫ומעודדת את איחויו עם המעטפת הליפידית שבין התא והליפוזום שתופס את המאקרומולקולות‪.‬‬
‫טרנספקציה יציבה‬
‫גם כאן מתחילים בהחדרת ה‪ DNA-‬העירום לתאים‬
‫באותן שיטות; אולם כעת יש לבודד את פרקציית‬
‫התאים הקטנה שלהן חדר ה‪ DNA-‬הפלסמידי ובהן‬
‫הוא מבוטא‪.‬‬
‫הישארות ה‪ DNA-‬כאפיזום או לאחר אינטגרציה‬
‫אקראית לכרומוזום)ים( היונקיים הוא תהליך לא‬
‫יעיל – ‪ 1‬מתוך ‪ 10,000‬תאים מבטא גנים‬
‫מהפלסמיד‪ .‬משום כך יש להשתמש בגורם סלקטיבי‬
‫שייפטר מהתאים האחרים‪ .‬בחיידקים אלמנט זה כונה‬
‫‪.dominant selective marker‬‬
‫באיור ניתן לראות עמידות לאנטיביוטיקה ניאומיצין‪-‬‬
‫סולפאט )‪ ,(neor‬המעכבת את שלב ההארכה )‪ (elongation‬בתרגום‪ .‬האנטיביוטיקה מאבדת פעילות אם‬
‫היא מזורחנת‪ ,‬והגן לעמידות עושה בדיוק זאת‪ .‬התאים הבודדים שהכניסו את הפלסמיד‪ ,‬חתכו אותו‬
‫סביב הגן לעמידות לניאומיצין והכניסו אותה באינטגרציה לגנום התא יוכלו לנטרל את‬
‫האנטיביוטיקה ולשרוד‪.‬‬
‫זה היה הסמן הסלקטיבי הדומינננטי הראשון‪ .‬אחריו הופיעו אחרים לאנטיביוטיקות אחרות‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :10‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬
‫‪77‬‬
‫העובדה שיש עמידות לניאומיצין אינה ערובה לביטוי לגן העניין – האינטגרציה של עמידות‬
‫לניאומיצין נעשית באופן בלתי תלוי לאינטגרציה של גן העניין ואינה מבטיחה אותה‪ .‬להגדלת‬
‫הסיכוי לתאחיזה בין שתי היחידות מבצעים חיתוך מוקדם של הפלסמיד באיזור הימני לגן הניאומיצין;‬
‫חיתוך זה יוצר ‪ DNA‬לינארי‪ .‬ה‪ DNA-‬הלינארי מעדיף לעבור אינטגרציה‬
‫דרך הקצוות שנוצרו – וכך ניתן לכוון את הקצוות החופשיים שיעברו‬
‫אינטגרציה לגנום )גם אם לא ניתן לכוון את מקום האינטגרציה(‪ .‬כתוצאה‬
‫עולה פי ‪ 10‬ההסתברות לאינטגרציה של שני הגנים בגנום‪.‬‬
‫ניתן להשתמש בשיטות אחרות על מנת לקשר בין שני הגנים‪ .‬הוקטור הבא הוא וקטור מאוחר יחסית‪,‬‬
‫כאשר הגן לעמידות נמצא אחרי הפרומוטור הויראלי החזק ואתר הוספת ‪ .PolyA‬הוקטור מיועד לחקר‬
‫של פרומוטורים – המוכנסים ל‪ ,MCS-‬ואז מביאים לשיעתוק וביטוי ה‪ GFP-‬הסמוך‪ GFP .‬ניחן ביכולת‬
‫לאחות אותו לחלבון בקצה הקרבוקסילי‪ ,‬באותה מסגרת קריאה‪ ,‬מבלי לאבד מהפעילות של אף אחד‬
‫מהחלבונים המאוחים‪ .‬בצורה זו ניתן לראות בעיניים – אפילו לפני בדיקת תפקוד החלבון – האם הוא‬
‫נכנס לפי בדיקת הזוהר של ה‪.GFP-‬‬
‫דרך אחת לקבל תאים פעילים היא להצמיד את ה‪ GFP-‬כגן מדווח לגן‪/‬פרומוטור העניין‪ .‬זהו אינו גן‬
‫סלקטיבי‪ ,‬אלא אם משתמשים בו לצורך מיון בעזרת ‪ .FACS‬לעומת זאת‪ ,‬ה‪ neo-‬הוא הסלקטור‬
‫הדומיננטי אך אינו יכול להבטיח שמי שמכיל את העמידות מכיל את גן העניין‪.‬‬
‫על מנת ליצור תאחיזה בין הסמן הסלקטיבי וגן העניין קיים האלמנט התרגומי ‪IRES (internal‬‬
‫‪ .(ribosome entry site‬ביונקים קיימים ‪ – mRNA monocystron‬גן אחד בכל ‪ .mRNA‬לרוב‪ ,‬ה‪-‬‬
‫‪ AUG‬הראשון מה‪ 5'-‬הוא ה‪ AUG-‬בו מתחיל התרגום‪ .‬בנגיפים מסוג הפוליו יש אפשרות ל‪– IRES-‬‬
‫הריבוזום לאו דווקא יכיר את ה‪ AUG-‬הראשון מ‪ 5'-‬אל '‪ ,3‬אלא יהיו לו ‪ 3‬מסגרות קריאה בהן הוא יכול‬
‫להיכנס סימולטנית באופן בלתי תלוי‪ .‬על ידי משחק בקונפורמציה של ה‪ mRNA-‬ניתן להכווין את‬
‫הריבוזום לאתרים ספציפיים‪ .‬אלמנט ה‪ IRES-‬מאפשר לריבוזום לראות את מסגרת הקריאה המתאימה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪78‬‬
‫היישום המחקרי יצר יחידת תרגום דו‪-‬ציסטרונית הכוללת את החלבון לעמידות ואת הגן המעניין‪ .‬ביניהם‬
‫יש יחידת ‪ .IRES‬בצורה זו אותו הפרומוטור מאפשר הפעלה של שני הגנים‪ .‬המצב היחיד שבו תהיה‬
‫הפרדה בין הגנים יהיה אם תהיה שבירה ביניהם ואינטגרציה של הגן לעמידות לצד פרומוטור חזק בגנום‪.‬‬
‫ה‪ IRES-‬הוא מנגנון יעיל ליצירת ‪ mRNA‬פוליציסטרוני‪ .‬התופעה של אופרונים פוליציסטרונים מוכרת‬
‫בפרוקריוטים‪ ,‬אך באאוקריוטים זה לכאורה לא קיים; ה‪ IRES-‬יוצר פוליציסטרוניות מלאכותית‪ .‬עם זאת‪,‬‬
‫ניתן ליצור ‪ mRNA‬עם מסגרת קריאה פתוחה בצמידות לגן אחד‪ ,‬להכניס ‪ AUG‬החופף חלקית את‬
‫הטרמינטור והנמצא במרחקים הולכים וגדלים ממנו‪ .‬במצבים כאלה רואים שכנראה הריבוזום שנופל לאחר‬
‫קודון העצירה מסוגל לזחול מעט קדימה ל‪ AUG-‬קרוב שהינו חופף או סמוך לנקודת הטרמינציה‪.‬‬
‫שיעור ‪ :10‬אנליזה בהיקף‪-‬גנום של ביטוי גנים‬
‫בסביבות שנת ‪ 2000‬החלו להתפרסם הרצפים השלמים של אורגניזמים ראשונים; הטיוטה של הגנום‬
‫האנושי התפרסם רק ב‪ 2002-‬ולכן בתחילה חשבו שיש בו יותר גנים ממה שידוע שיש כיום‪ .‬אורגניזמים‬
‫פשוטים יותר – דרוזופילה‪ ,‬תולעים‪ ,‬ארבידופסיס – אינם נופלים משמעותית מכמות הגנים בגנום‬
‫האנושי‪ .‬עובדה זו מראה שאין קשר בין מורכבות האורגניזם לכמות הגנים המוכלים בגנום שלו‪.‬‬
‫כמו כן הדבר העלה את השאלה בנוגע לכמות הגנים שתפקידם ידוע ושהינם פעילים במנגנונים שונים‬
‫לעומת גנים שאיננו יודעים את תפקידם; לפחות במחצית מהגנים ההומנים התפקוד הוא תעלומה‪ .‬לאחר כ‪-‬‬
‫‪ 30‬שנות עבודה‪ ,‬אלפי מעבדות שעבדו בהגדרת הגנים האנושיים ידעו יחד את תפקידם של כרבע מהגנים‬
‫האנושיים‪ .‬הן הגיעו למסקנה שלא ניתן להמשיך באותה שיטת אנליזה שהייתה מבוססת על ‪one gene at‬‬
‫‪ ,a time‬שאחרת יידרשו שני דורות עד גילוי כל הגנים ההומנים‪ .‬לשם כך חובה לפתח שיטות גנומיות‪.‬‬
‫פיתוח המיקרואראי )‪(Microarray‬‬
‫פטריק בראון מאוניברסיטת סטנפורד‪ ,‬וירולוג במקורו‪ ,‬העסיק את עצמו בטכניקות מולקולריות ומחקרים‬
‫ניסויים בעלי סיכויים נמוכים‪ .‬הוא ביקש להסתכל על ספקטרום הגנים המתבטאים בשמרים בשני מצבי‬
‫גידול – על גלוקוז ועל אתנול‪ .‬היה‬
‫ברור שחייבים להיות סטים של גנים‬
‫המתבטאים באופן דיפרנציאלי‪ .‬לשם‬
‫כך פיתח את המערכת שבאיור‪.‬‬
‫הוא גידל את השמרים בארלנמיירים‬
‫עם מצע גידול רלוונטי ואז הפיק את‬
‫הגנום מכל תרבית‪ .‬הוא יצר ‪cDNA‬‬
‫מה‪ ,RNA-‬ותוך כדי הכניס ‪NTP‬‬
‫מסומן )ירוק בגלוקוז ואדום באתנול(‪.‬‬
‫כעת ה‪ cDNA-‬מעורבב ביחס ‪1:1‬‬
‫בין שני תנאי הגידול‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :10‬אנליזה בהיקף‪-‬גנום של ביטוי גנים‬
‫‪79‬‬
‫רפי שלון‪ ,‬סטודנט שלו‪ ,‬לקח סלייד מיקרוסקופי – בעזרת מכשיר המניח טיפה מזערית על צלחת בעלת‬
‫הרבה באריות הוא מכניס דוגמאות מכל ה‪ DNA-‬השמריים )בתקופה שכבר כל ‪ 6000‬הגנים השמריים‬
‫היו מבודדים וניתן היה לזהות אותם‪ ,‬ובכל בארית היה ‪ DNA‬אחר(‪.‬‬
‫דה‪-‬נטורציה של הגנים מפרידה את הגדילים‪ .‬לאחר מכן הם מקובעים לזכוכית ואז עוברים היברידיזציה‪.‬‬
‫לאחר השטיפה בוחנים את הבאריות עם דטקטור של הפלורופור‪ .‬בכל בארית יש תחרות בין תערובת ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬על גן מסויים‪ :‬אם כמות ה‪ RNA-‬של הגן בתנאי גלוקוז גדולה מאשר באתנול‪ ,‬תהיה פלורוסנציה‬
‫ירוקה; במצב ההפוך תהיה פלורסנציה אדומה; אם הכמות דומה תתקבל פלורסנציה צהובה‪.‬‬
‫הנסיונות הראשונים היו פשוטים מאוד – בעיקר כי לא ניתן היה להכניס ‪ 6400‬אתרים בזכוכית נושאת‬
‫אחת – אבל ניסוי זה הדגים את עקרון ההסתכלות על ‪ RNA‬מכמות גדולה של גנים במקביל‪ .‬מאוחר יותר‬
‫הוכחה גדולת הטכניקה‪ ,‬ששופרה על מנת ליצור את‬
‫שיטת ה‪ microarray-‬על ידי חבר סגל בסטנפורד‪.‬‬
‫נסיון אחר שהתפרסם על ידי קבוצתו של בראון‬
‫השתמש‬
‫בתאים‬
‫הומנים‪.‬‬
‫כאשר‬
‫מגדלים‬
‫פיברובלסטים במצע עני והרעבה לפקטורי גידול‪,‬‬
‫הם נכנסים לעצירה ופעילות מטאבולית נמוכה; זאת‬
‫לעומת פיברובלאסטים שכאשר יש להם נסיוב‬
‫נכנסים לפעילות מטאבולית גבוהה וגידול‪.‬‬
‫בראון רצה לבדוק את נוכחות הגנים המתבטאים‬
‫בשני התנאים‪ ,‬ולשם כך השתמש בשיטה דומה‪:‬‬
‫סימן דיפרנציאלית את ה‪ cDNA-‬שהופק מכל‬
‫אוכלוסיה ואז לקח ‪ cDNA‬הומני מבודד )בתקופה‬
‫זו היו כמה אלפי ‪ cDNA‬מבודדים( והעביר אותו‬
‫בעזרת הרובוט של שלון לזכוכית‪ .‬בצורה כזו‬
‫התקבלה התמונה הבאה‪:‬‬
‫האיור מציג ציר זמן בן ‪ 24‬שעות )‪ (Y‬שמראה את ההיברידיזציה של ‪ 8600‬גנים )‪ (X‬לאורך הזמן‪ .‬ירוק‬
‫מסמן ירידה בביטוי ואדום עלייה בביטוי לעומת הרפרנס‪ ,‬שהוא התאים המורעבים‪ .‬ניתן לאפין דמיון‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪80‬‬
‫התנהגותי של קבוצות גנים מסויימות – גם מבלי לדעת מה זהותם‪ .‬כאשר בחנו לעומק את הגנים בכל‬
‫קבוצה נמצאה חוקיות ברורה בין הגנים בקבוצות‪ :‬גנים ‪ D‬הם גנים הקשורים לריפוי פציעה של תרבית‬
‫)המתבטאים כאשר חותכים תרבית‪ ,‬פעולה הפוגעת בצמידות בין התאים(; ‪ B‬הם גנים של מחזור התא‪.‬‬
‫זהו אחד הנסיונות הראשונים לאנליזה של ה‪ RNA Transcriptom-‬על גבי מיקרואראי‪ .‬האנליזה‬
‫מתבססת על ההיברידיזציה‪ .‬לשיטה זו קמו הרבה וריאציות – ניתן לבדוק פולימורפיזם על סמך מידת‬
‫ההיברידיזציה‪ ,‬למשל; השדרוג המרכזי לשיטה היה על ידי חברת אפימטריקס‪ ,‬אשר הציעה לשים את‬
‫הדגימות לא על זכוכית אלא על סיליקון בשיטות המתפתחות של מוליכים למחצה‪ ,‬כמו ב‪Deep DNA -‬‬
‫‪ .Sequencing‬כיום כל הגנום האנושי ממופה על גבי ארבעה משטחי סיליקון כאלו‪.‬‬
‫המיקרואראי אינם ‪ cDNA‬שעובר היברידיזציה אלא אוליגונוקליאוטידים המסונטזים עם רצף קבוע‬
‫במקום‪ ,‬כאשר בכל נקודה מסונטז אוליגונוקליאוטיד מסויים‪ .‬אפימטריקס ודומותיה התמחו בתחום זה‬
‫ויצרו את שיטת המיקרואראי שהפכה לשיטה דיאגנוסטית נפוצה ביותר‪.‬‬
‫האיור הבא )שקופית ‪ ,14‬מצגת ‪ (10‬הוצג במאמר מפתח במחקר סרטן השד‪ ,‬המאופיין בהיותו קל או קשה‬
‫יותר במופעים מסויימים‪ .‬שיתוף פעולה בין חברת רוזטה ואחד מבתי החולים המרכזיים באמסטרדם‬
‫השווה בין ‪ RNA‬שהופק מגידול ראשוני של חולות שאובחנו‪ .‬הם עשו היברידיזציה לאלפי גנים ומצאו‬
‫את הגנים בעלי הסבירות הטובה ביותר לשמש לפרוגנוזה של החולות‪.‬‬
‫כל שורה במיקרואראי היא חולה וכך קו אנכי הוא גן )‪ 70‬גנים סה"כ(‪ .‬הטענה הייתה שניתן להשתמש‬
‫בדוגמת ה‪ RNA-‬מהגידול ולהשוות אותה לייצוג ה‪ RNA-‬של כל ‪ 250‬החולות האחרות; אם הכלל היה‬
‫הומוגני בתחום‪ ,‬לא נראים הבדלים‪ .‬אם הכלל היה הטרוגני רואים הבדלים‪ .‬סימן אדום מציין ייצור גבוה‬
‫מהכלל‪ ,‬סימן ירוק אומר ייצור נמוך מהכלל‪ .‬החוקרים טוענים שניתן לחלק על סמך תבנית‬
‫ההיברידיזציה את החולות לשתי קבוצות‪ :‬העליונה והתחתונה‪ .‬העליונה בעלת פרוגנוזה טובה יותר‬
‫מהתחתונה‪ .‬הטענה מבוססת על כך שאחרי החלוקה במיקרואראי נבדקו התוצאות העובדתיות בנוגע‬
‫לחולות היום‪ .‬זמן המעקב הוא עד ‪ 12‬שנים אחורה‪.‬‬
‫החולות המסומנות באדום פיתחו מטסטאזות רחוקות – שהרחיקו ליותר מאשר בלוטות לימפה הסמוכות‬
‫לשד‪ .‬הנקודה הכחולה היא סוף זמן המעקב והקווים השחורים מראים את חלוקת המטאסטאזות הקרובות‪.‬‬
‫נראה שאין הבדל בחלוקה של היווצרות גרורות קרובות‪ ,‬אבל בקבוצה החמורה יש יותר גרורות רחוקות‬
‫ויותר מוות‪ .‬בצורה זו הם טענו שההיברידיזציה ב‪ 70-‬הגנים מספקת ערך פרדקטיבי שנלקח מתוך ה‪-‬‬
‫‪ RNA‬הראשוני – לא מתוך הגרורות‪ ,‬ונראה גם שהעובדה שיש או אין גרורות קרובות אינה מהווה‬
‫אינדיקציה לחומרת המחלה או לסיכוי לגרורות רחוקות‪.‬‬
‫חתימת ‪ 70‬הגנים אינה יחידה ממינה; יש חתימות נוספות של קבוצות גנים אחרות‪ .‬ה‪ FDA-‬לא אישר את‬
‫המבחן הזה לחברות הביטוח בארה"ב משום שיש ‪ 30%‬סיכוי לתוצאה ‪.false-positive‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :10‬ביטול התפקוד של גנים ספציפיים ביונקים‬
‫‪81‬‬
‫שיעור ‪ :10‬ביטול התפקוד של גנים ספציפיים ביונקים‬
‫יצירת תאי ‪ ES‬הנושאים מוטציית ‪ knockout‬מוכרת‬
‫השיטה מדגימה מוטגנזה בעזרת ריקומבינציה הומולוגית‪ .‬המחקר מחבר בין שני דברים לכאורה ברורים‪:‬‬
‫•‬
‫המרקר לעמידות לניאומיצין )‪;(neor‬‬
‫•‬
‫מרקר דומיננטי שלילי )‪.(tkHSV‬‬
‫כל אורגניזם שמקבל את ‪ tk‬יכול לעבור סלקציה‬
‫שתמית אותו; זהו הגן לטימידין‪-‬קינאז של וירוס‬
‫ההרפס‪ .‬בהוספת אנלוג לטימידין רק ההרפס יודע‬
‫לזרחן את האנאלוג ולהשתמש בו כמו בטימידין –‬
‫עובר אינקורפורציה – אל בעצם כך עוצר את‬
‫סינטזת ה‪ .DNA-‬האנלוג הוא ‪Ganciclovir‬‬
‫שבנוכחותו נעצר השיכפול‪.‬‬
‫הגן לניאומיצין צריך להכיל פרומוטור וגם רצף לפוליאדנילציה‪ ,‬שכן הגן הוא חיידקי במקורו וללא‬
‫הפוליאדנילציה לא ייצא ה‪ mRNA-‬מהגרעין‪.‬‬
‫הגן של הסלקציה החיובית הוכנס בתוך גן עניין והפך‬
‫אותו למוטנט‪ .‬באינקורפורציה של המחדר לגנום‪,‬‬
‫האירועים השכיחים הם כניסה לא ספציפית‪-‬‬
‫הומולוגית לגנום; רק במקרים נדירים של הכרה‬
‫וריקומבינציה הומולוגית ייכנס הגן שבין שני‬
‫המרקרים לתוך הגנום ויחליף לחלוטין את הגן‬
‫המקורי‪ ,‬התקין‪.‬‬
‫התאים שהכניסו את הגדיל ללא הומולוגיה הכניסו‬
‫גם את שני המרקרים ולכן ניתן להרוג אותם בעזרת‬
‫‪ ;Ganciclovir‬אלו שביצעו ריקומבינציה הומולוגית מכילים רק עמידות לניאומיצין ולכן עמידים לאנלוג‪.‬‬
‫האירוע הזה כה נדיר עד כי רק ‪ 1-10%‬מהמושבות המבודדות יהיו בעלות הגן המוטנטי‪.‬‬
‫יכולה להיות גם כניסה לא ספציפית ששברה את מחדר לפני הגן השלילי‪ ,‬ולכן זה עדיין לא יהיה ספציפי‪.‬‬
‫אם התהליך נעשה בתאי גזע של עכבר‪ ,‬ניתן להזריק את התאים המוצלחים לבלסטוציט של עכבר‪ ,‬ליצור‬
‫עכברים כימרים ולקבל עכברים בעלי גן פגום‪ ,‬להפריד הומוזיגוטים ולהמשיך במחקר הגן על מודל‬
‫העכבר‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪82‬‬
‫שיעור ‪ :11‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים – המשך‬
‫הבהרה‪pIRES-Era-hyg3 :‬‬
‫ניתן ליצור ‪ mRNA‬פוליציסטרוני ביונקים בעזרת וקטור המכיל את אלמנט ה‪ .IRES-‬תחת‬
‫פרומוטור חזק הוכנסה ‪ ,Open Reading Frame‬אחריה אינטרון‪ IRES ,‬ומסגרת קריאה פתוחה של‬
‫גן בקטריאלי לעמידות לסם ‪) hygomicine‬יחד עם ‪ .(PolyA sequence‬בצורה זו נוצר טרנסקריפט‬
‫אחד שהולך דרך כל מסגרות הקריאה הפתוחות ומסתיים בפוליאדנילציה‪.‬‬
‫האפשרות של מסגרת הקריאה השנייה ניתנת על ידי ה‪ .IRES-‬סלקציה להיגרומיצין גורמת‬
‫לתאחיזה עם מסגרת הקריאה שמעל ההיגרומיצין‪ ,‬המבטיחה שרוב המושבות העמידות‬
‫לאנטיביוטיקה יבטאו את הגן המבוקש כי הפרומוטור מצוי מעליו‪.‬‬
‫הדבר עשוי להידפק אם תהיה אינטגרציה ללא הגן השלם והחתיכה תנחת ליד פרומוטור שיניע‬
‫ביטוי של הגן לעמידות‪ .‬הסיכוי לכך קטן‪ ,‬ולכן עושים אנליזה של המושבות שהתקבלו כדי לוודא‬
‫שזה לא קרה‪.‬‬
‫יצירת עכברי ‪Knockout‬‬
‫ניתן לקחת את ה‪ ORF-‬בלבד והאינטרון של הגן שמצומד לניאומיצין כבר יעבור שיחבור ויוסר מהגדיל‪.‬‬
‫עדיין צריך להוסיף סיגנל לפוליאדנילציה‪ .‬על משקל זה נוצר וקטור בו כיוונו נחיתה של האלמנט ליד‬
‫פרומוטור‪ ,‬ואז הוא חיפש מצבים שבהם הסרה של האקסון של הגן הביאה עדיין לביטוי הניאומיצין‪.‬‬
‫כאשר קפקי‪ ,‬שפיתח את השיטה‪ ,‬שלח גראנט של הטכניקה לפני התוצאות‪ ,‬הוא בנה אותו כך שהוא הכיל‬
‫רצפים בני ‪ 1000‬נוקליאוטידים שיהיו אקסונים; הוועדה דחתה אותו מתוך טענה שאין זה סביר שתהליך‬
‫ההומולוגיה יעבוד ברצף כל כך קטן – כי הוא מקופל בכרומוזום בצורה מאוד קומפקטית בכרומטין‪ .‬קפקי‬
‫השיג מימון ממקומות אחרים ועדיין הצליח להראות שהתהליך עובד‪.‬‬
‫יחד עם זאת היו דברים בגו – התא מתקשה לבצע ריקומבינציה הומולוגית לכל גן ברצפים כל כך קצרים‪,‬‬
‫ויש גנים רבים החבויים בהטרוכרומטין ובכרומטין‪ .‬החשיפה של הגנים אינה גדולה ולכן ראו שאם הגן‬
‫מתבטא בתא הסיכוי לעבור ריקומבינציה גדול יותר – כי הכרומטין באיזור יותר פתוח‪.‬‬
‫השיטה הזו מורכבת לשיבוט גנים – אקסונים המכילים פחותמ‪ 500-‬נוקליאוטידים היא לא עובדת‪ .‬לרוב‬
‫משתמשים באיזורים גדולים כגבולות עליונים‪ ,‬שוברים את הוקטור בעזרת אנזימים לפני שמחדירים‬
‫אותם בפריקת קבל‪ .‬בין ‪ 1-10%‬מהמושבות עוברות אירוע של ריקומבינציה הומולוגית‪ ,‬ו‪90-99%-‬‬
‫המקרים האחרים הם ריקומבינציה אקראית )המסולקים על ידי הסלקציה השלילית(‪.‬‬
‫קפקי לא נתן לתלמידיו לעשות את התהליך‪ ,‬אלא רק לשלוש טכנאיות מנוסות מאוד‪ ,‬כי התאים הושתלו‬
‫בהמשך בבלסטולה של עכבר לקבלת עכבר טרנסגני בו אחד מהאללים )בהנחה שזה לא בכרומוזום המין(‬
‫יהיה מבוטל; צריך לעשות הכלאה הטרוזיגוטית כדי לקבל צאצאים של ‪.double knock-out‬‬
‫זו הייתה המעבדה הראשונה שיצרה עכברי נוק‪-‬אאוט בגן ספציפי לפי בקשה‪.‬‬
‫כיצד ניתן לבדוק האם הייתה הכנסה? ניתן לעשות ‪ PCR‬בגבולות של הגן התקין‪ ,‬אם הגן עבר החלפה‬
‫ייתקבל רק את הגן עם הניאומיצין ואם לא עבר החלפה ייתקבלו שני תוצרים‪ .‬הפריימרים חייבים להיות מחוץ‬
‫לגן של הניאומיצין‪ ,‬כדי להראות האם הוא בפנים או לא‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :11‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים – המשך‬
‫‪83‬‬
‫מהפכת ה‪miRNA-‬‬
‫האפשלרות לבצע ביטול מכוון של גן – בתרביות או בעכברים – חוללה מהפכה בביולוגיה המולקולרית‪,‬‬
‫כי נוצרו מודלים למחלות אנושיות גם בעכברים‪ .‬בתוך תקופה קצרה חוקרים וחברות יצרו עכברי נוק‪-‬‬
‫אאוט ומכרו אותם‪ .‬אולם יש לזכור שלא כל אתר נגיש לריקומבינציה הומולוגית ולכן לא לכל אתר‬
‫אפשר ליצור עכבר טרנסגני‪.‬‬
‫הפרוצדורה אינה פשוטה ואינה בטוחה; היא דורשת אינפורמציה רבה על הגן‪ .‬היום יש יותר מידע וניתן‬
‫לתכנן וקטורי החלפה‪ ,‬אולם זו עדיין נותרת עבודה מורכבת‪ .‬מסיבה זו נובעת חשיבות הגילוי ב‪ 1998-‬של‬
‫אנדרו פייר וקרייג מלו – אשר הבחינו בתולעים העגולות ‪ C.elegamce‬בתופעה הבאה‪:17‬‬
‫ב‪ 1975-‬בדקו האם כשמכניסים לתאים הומנים או עכבריים )‪ anti-sense RNA (asRNA‬לאיזשהו‬
‫‪ ,mRNA‬הוא יכול לעבור היברידיזציה בציטופלזמה‪ .‬ה‪ asRNA-‬יהיה באיזור ה‪ AUG-‬וכך הריבוזום לא‬
‫יוכל להתקשר לגדיל והתרגום של החלבון ייעצר‪ .‬המאמר פורסם ב‪ Cell-‬והראה תוצאות שנראו מתאימות‬
‫להיפותזה – ‪ asRNA‬מונע תרגום ומאפשר חקירת הגן‪.‬‬
‫על הניסיון ניסו לחזור אלפי מדענים‪ ,‬כל אחד מגן המעניין אותו‪ .‬לא היה ספק שבגן של החוקר וכמה גנים‬
‫נוספים האפקט התקבל והתוצאות היו נכונות; אך מדענים אחרים ראו שזה לא עבד‪ .‬היאוש החל לחלחל‪,‬‬
‫והמחשבה הייתה שזה עבד לחוקר הראשון מתוקף מזל בלבד‪.‬‬
‫בתולעים העגולות‪ ,‬פייר בודד גן מסויים והחליט‬
‫לנסות ללמוד על הגן בעזרת ‪ .asRNA‬הוא הזריק‬
‫אותו לגונדות של העובר והסתכל באמצעות נוגדנים‬
‫או ‪ RNA‬מסומן שעובר היברידיזציה ל‪mRNA-‬‬
‫כדי לראות האם יש ביטוי של החלבון‪.‬‬
‫השיטה היא הכנסת גדיל ‪ Sense‬של גן העניין על גבי וקטור חיידקי המכיל גם ‪RNA polymerase‬‬
‫מתאים‪ .‬לאחר מכן הופכים את ה‪ cDNA-‬ובאוריינטציה הפוכה של הגן ניתן לקבל תחת אותו‬
‫פרומוטור את ה‪ .asRNA-‬הוא הכניס את שני הוקטורים – הראשון כביקורת והשני כניסוי – לתולעים‬
‫וראה שיש ירידה קלה בביטוי שהתקבלה על ידי שני הוקטורים יחד‪ .‬לפיכך החליט לעשות ביקורת‬
‫נוספת על ידי ‪ :double strand RNA‬הוא לקח את שני הוקטורים‪ ,‬עשה להם אנילינג‪ ,‬והזריק את ה‪-‬‬
‫‪ .dsRNA‬התוצאה הייתה ירידה דרסטית בביטוי החלבון‪.‬‬
‫פייר היה זהיר מספיק ואמר שייתכן שהתופעה נובעת מאינטרפרונים‪ .‬ידוע היה ש‪ dsRNA-‬מעודד ביטוי‬
‫אינטרפרונים ולכן יכול להיות שהתופעה טריוויאלית‪ ,‬והאינטרפרונים הם שמעכבים את הסינטזה של‬
‫החלבונים‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬ידוע גם שאם מקצרים את ה‪ dsRNA-‬ל‪ 30-‬זוגות בסיסים התופעה נעלמת;‬
‫ואילו גם כאשר הקטין את גודל המחדר התופעה‬
‫נמשכה‪ .‬לפיכך‪ ,‬הוא ביקש לראות כמה ‪ mRNA‬יש‬
‫לאחר ההזרקה‪ .‬הוא סימן אותו וראה כי אין כלל‬
‫‪ mRNA‬בתא‪.‬‬
‫‪ 17‬אנדרו פייר ערך נסיון בסיסי וקיבל תוצאות בלתי צפויות‪ .‬הגדולה של פייר הייתה במחשבה על הפתרון לבעיה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫‪84‬‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫ההנחה הייתה שה‪ dsRNA-‬גורם לדגרדציה של ה‪ .mRNA-‬התופעה הזו הופיעה גם בגנים אחרים וזכתה‬
‫לכינוי )‪ .RNA interference (RNAi‬הממצא הזה פורסם ב‪ 1998-‬ומייד תפס – חוקרים משטחים‬
‫שונים שראו תופעות של ‪ RNA‬שלא יכלו לפענח‪ ,‬קיבלו את התשובה לשאלותיהם דרך ההסבר הזה‪.‬‬
‫תופעת ה‪ RNAi-‬הגורם לדגרדציה יכלה לשמש כאלמנט סופרסורי‪ .‬באותו זמן כבר לא השתמשו‬
‫בפלסמידים פשוטים‪ ,‬אלא היה אתר קשירה של ‪ RNA‬פולימראז מנוקה שאוחה מצידו השני של‬
‫הפלסמיד‪ .‬בצורה זו לא צריך להפוך את המחדר – במבחנה אחד עובד פולימראז מנוקה מסוג אחד שנקשר‬
‫לאתר הקישור ב‪ Sense-‬ובמבחנה שנייה פולימראז אחר שנקשר לאתר שיוצר ‪.Antisense‬‬
‫מדוע הרמות היו דומות עם כל אחד מהוקטורים? מסתבר שפעילות הפולימראז לא ספציפית‪ ,‬ולכן כאשר‬
‫מכניסים פולימראז אחד הוא נקשר גם לאתר הקישור של הפולימראז השני‪ ,‬כך שנוצר קצת ‪antisense‬‬
‫שנתן תוצאה דומה גם בוקטור ה‪ sense-‬וההיפך‪.‬‬
‫לאחר פרסום המאמר נפתרו תעלומות רבות; אחת מהן הייתה שבטבע נפוצות יחסית מולקולות בעלות‬
‫תפקיד זהה ל‪ .RNAi-‬מולקולות אלו מכונות )‪ .miRNA (micro-RNA‬במהלך שיעתוק של גדיל אחד‬
‫מאיזור של ‪ ,miRNA‬משועתק רצף שחוזר על עצמו באוריינטציה הפוכה )‪(Inverted Repeat, IR‬‬
‫היוצר התקפלות עוד בגרעין‪ .‬ה‪ 5’-‬עובר ‪ ,capping‬ובין שני ה‪ IR -‬יש לולאה במבנה ‪.stem & loop‬‬
‫אנשי ה‪ C.elegance-‬הבחינו שה‪ miRNA-‬עובר‬
‫שני חיתוכים‪ :‬חיתוך ראשון בגרעין שיוצר את‬
‫האיזורים ‪ ;Drosha & DGCR58‬הקומפלקס‬
‫החלבוני חותך ב‪ 5'-‬של ה‪ .IR-‬הוא עובר בחורי‬
‫הגרעין‪ ,‬שם החלבון ‪ Exportin5‬מעביר אותה‬
‫החוצה‪ .‬בציטופלזמה מתלבש עליו קומפלקס ‪Dicer‬‬
‫שחותך אותו ליד הלולאה‪ ,‬דבר שגורם לשחרור ה‪-‬‬
‫‪ .dsRNA‬האורך שלו הוא ‪ 23‬נוקליאוטידים ובקצה‬
‫ה‪ '3-‬יש שני נוקליאוטידים בולטים מכל צד‪ .‬הוא‬
‫נלקח על ידי קומפלקס שמסלק את ה‪ Sense-‬ושומר‬
‫רק את ה‪.Antisense-‬‬
‫זהו תוצר טבעי בתאים של עכבר‪ ,‬אדם‪ ,‬תולעת; הוא אינו קיים בשמרים‪ .‬כאשר ביואינפורמטיקאים‬
‫הסתכלו על הגנום האנושי לחיפוש אפשרויות ל‪ ,IR-‬נמצאו לפחות ‪ 5000‬אתרים שמסוגלים ליצור תוצר‬
‫כזה‪ .‬היום ידוע שיש לפחות ‪ ,miRNA 1000‬וכנראה יותר‪ .‬ל‪ miRNA-‬אין הומולוגיה מלאה ל‪-‬‬
‫‪ mRNA‬או ל‪ .RNA-‬מכיוון שכך‪ ,‬לכל ‪ miRNA‬יש יותר מאשר סובסטרט אחד – וחלק גדול מהמחקר‬
‫מאתר אילו גנים הם סובסטורטים של ‪ miRNA‬נתון‪ .‬מניחים כיום שכשליש מהגנים ההומנים נתונים‬
‫תחת בקרת ‪ ,miRNA‬עובדה המסבכת מאוד את כל מה שהובן עד כה לגבי בסיס של מחלות – נכנס‬
‫אלמנט רגולציה לא צפוי ומאוד משפיע‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :11‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים – המשך‬
‫‪85‬‬
‫וגם ‪siRNA‬‬
‫ה‪ IR-‬עובר חיתוך ראשון בגרעין‬
‫וחיתוך שני בציטופלזמה )‪(Dicer‬‬
‫ויוצר ‪ dsRNA‬עם קצוות ‪ '3‬בולטים‪.‬‬
‫המקטע קיבל את השם – ‪siRNA‬‬
‫‪ .short interfereing‬בציטופלזמה‬
‫נוצר קומפלקס ‪RISC = RNA-‬‬
‫‪.induced silencing Complex‬‬
‫הוא נקשר לקומפלקס חלבוני המחפש‬
‫גדיל ‪ mRNA‬קומפלמנטרי מלא או‬
‫חלקי‪ .‬כאשר הוא מוצא אותו‪ ,‬הוא‬
‫מסוגל לעשות אחד משני דברים‪:‬‬
‫•‬
‫אם‬
‫יש‬
‫קומפלמנטציה‬
‫מלאה‬
‫בין‬
‫‪ siRNA+mRNA‬הקומפלקס יוכר על ידי‬
‫האנזים ‪ ,Slicer‬המכיר רצף בין הנוקליאוטידים‬
‫‪ 2-7‬וחותך בקצה '‪ 3‬של הרצף בגדיל אחד –‬
‫דבר שחושף אותו לאנדונוקליאזות ולפירוק‪.‬‬
‫•‬
‫אם יש קומפלמנטציה חלקית‪ ,‬הרצפים‬
‫הקומפלמנטרים יהיו ב‪ .‘3-UTR-‬הנוכחות‬
‫שלו‪ ,‬למרות שהיא בקצה '‪ 3‬ולא '‪ ,5‬תעכב את‬
‫התרגום של ה‪.mRNA-‬‬
‫הידע הזה היווה מכשיר ללימוד תפקידי גנים מכיוון‬
‫שכל מה שצריך הוא אחד משניים‪ :‬לקנות ‪dsRNA‬‬
‫מוכן כנגד ה‪ mRNA-‬המעניין‪ ,‬שעובר היברידיזציה; או לחילופין ליצור פריקורסור ‪ RNA‬שיעבור את‬
‫החיתוך באופן מלא או חלקי כך שייצור ‪ siRNA‬בתוך התא‪.‬‬
‫לשם כך‪ ,‬מכניסים את ה‪ IR-‬המתוכנן תחת פרומוטור של ‪ RNA‬פולימראז חזק בתאים הומנים‪ ,‬כדי‬
‫לייצר כמויות גדולות של ה‪ .siRNA-‬התוצר יסנטז את ה‪ ,IR-‬יעבור חיתוך ראשון בגרעין וייתקבל‬
‫‪ siRNA‬בכמויות גדולות‪ .‬היתרון שלו לעומת ‪ dsRNA‬הסינטטי הוא שבסינטטי צריך להוסיף את חומצת‬
‫הגרעין למדיום ואז בתנאי טרנספקציה לחורר את הממברנה ולהכניס את מולקולות המדיום; שיפור קל‬
‫של תהליך הטרנספקציה הלא‪-‬יעיל מתקבל אם כולאים את ה‪ RNA‬בתוך ליפוזומים שיאוחו עם התאים‪.‬‬
‫החסרון הוא שה‪ siRNA-‬יכול לפעול לאורך זמן רק אם כל שלושה ימים יוצרים הדבקה מחדש עם‬
‫‪ – siRNA‬כלומר בניסוי של ‪ 10‬ימים יש להחליף אותו ‪ 3‬פעמים‪ .‬הדבר הופך את הניסויים לזמניים‬
‫ויקרים מאוד‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪86‬‬
‫קבוצות מסויימות עדיין עושות זאת ותיכננו ‪ siRNA‬לכל הגנים ההומנים‪.‬‬
‫הגישה המשלימה היא לייצר עצמאית את ה‪ siRNA-‬בתא‪ ,‬בצורה יציבה‪ .‬בעזרת הפלסמיד ווירוס ניתן‬
‫להכניס אותו לגנום – אלמנטים של ‪ Long Terminal Repeats‬שנמצאיםן בשני צידי הגן מבטיחים‬
‫שהמחדר יישאר שלם – ולקבל גנים כרומוזומלים שבעזרת פרומוטור אינדוסיבילי )בנוכחות משרן‬
‫בלבד( יתבטא ה‪ siRNA-‬ויאפשר לבדוק מה קורה לפנוטיפ של התאים‪.‬‬
‫ה‪ RNA-‬הוכח ככלי הזול והטוב ביותר בהפרעה של גנים ולימוד שלהם ‪ ,in vitro & in vivo‬על ידי‬
‫הדבקת חיות בעזרת הוירוסים‪.‬‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫תופעת ה‪ RNAi-‬תורמת לדגרדציה של ‪ RNA‬ועיכוב בתרגום‪.‬‬
‫בדיעבד מתברר שיש להם עוד פעילויות‪ :‬דגרדציה של ‪ DNA‬בגרעין‪ ,‬תגלית שעוררה מהפכה‬
‫במחקר‪ ,‬וכן שיעתוק והטרוכרומטין‪.‬‬
‫‪ dsRNA‬קושר את הכרומטין ומעכב את השיעתוק‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫‪/‬שיעור ‪ :11‬פיענוח מחזור התא‬
‫‪87‬‬
‫שיעור ‪ :11‬פיענוח מחזור התא‬
‫בבחינת מחזור התא בצורה סכמטית‪ ,‬בהנחה שהוא‬
‫אורך ‪ 24‬שעות‪ ,‬יש בו ארבע פאזות ושני אירועים‬
‫מרכזיים‪ :‬הכפלת ה‪ (S-Phase) DNA-‬האורכת כ‪-‬‬
‫‪ 10‬שעות וחלוקת התא עצמה – ‪ – M-Phase‬חלוקת‬
‫האינפורמציה הגנטית‪ ,‬הציטופלזמה והאברונים לשני‬
‫תאי הבת‪ .‬החלוקה מכונה מיטוזה ואורכת ‪ 30‬דקות‬
‫בלבד‪.‬‬
‫בין שני האירועים ישנן שתי פאזות של מרווחים או‬
‫אתנחתות – ‪ .Gaps, G-Phase‬התא מנצל אותם‬
‫להכנות לשלב הבא – כמו יצירת פריקורסורים של‬
‫‪ DNA‬ו‪ RNA-‬בשלב ‪.G1‬‬
‫פקטורים להכתבת מצב מחזור התא‬
‫בשלב‬
‫המיטוזה‬
‫ומעט‬
‫לפניו‬
‫יש‬
‫דחיסה‬
‫)‪ (condensation‬של הכרומוזומים‪ .‬לעומת זאת‬
‫במצב ‪ G1‬לא ניתן לראות את הדחיסה הזו‪ .‬בשנות‬
‫ה‪ ,60-‬מדען בשם האריס מאוקספורד פיתח שיטה‬
‫לאיחוי של תאים ויצירה של ‪.HeteroCaryones‬‬
‫שני חוקרים מקיימברידג' השתמשו בשיטה שלו כדי‬
‫לאחות בעזרת מעטפת וירוס שני תאים שונים‪.‬‬
‫החוקרים תהו מה יקרה אם יקחו תאים מפאזות‬
‫שונות ממחזור התא ויאחו ביניהן – לאן התאים‬
‫ילכו? להפתעתם גילו שאם לוקחים תא במיטוזה‬
‫ומאחים עם תא במצב ‪ ,G1‬הכרומוזומים בגרעין ‪G1‬‬
‫יעברו דחיסה‪ .‬מכאן הם הניחו שיש פקטור)ים(‬
‫חלבוניים דיפוזיים בציטופלזמה או בגרעין התא‬
‫המיטוטי )מכיוון שהממברנה של הגרעין מפורקת‬
‫בתא המיטוטי אין הבדל(‪ ,‬אשר גורמים לתא שב‪-‬‬
‫‪ G1‬להתנהג כאילו היה במיטוזה‪.‬‬
‫הם המשיכו לשלב צירופים שונים‪ ,‬המסוכמים באיור‪:‬‬
‫יש לציין את האינטרפאזה – המורכבת משלושת הפאזות שאינן מיטוזה‪ ,‬ושלא ניתן להבחין בהם‬
‫מיקרוסקופית ולהבדיל ביניהם‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪88‬‬
‫•‬
‫בהכלאה של תאים מיטוטיים עם תאים בשלבי האינטרפאזה השונים‪ ,‬התא הראשוני מתחלק; כל אחד‬
‫משלושת התאים האחרים מתחלק גם כן – או עושה הכנות לחלוקה‪ ,‬כמו דחיסת הכרומוזומים‪ .‬מכאן‬
‫שהפקטורים למיטוזה דומיננטים על כל אחת מהפאזות האחרות‪.‬‬
‫•‬
‫הכלאה של תא בשלב ‪ S‬מעוררת חלוקה על שלב ‪ G1‬אך לא על ‪ – G2‬הפקטורים הרפליקטיבים‬
‫אינם מתגברים על הפקטורים או מנגנוני הדגרדציה הקיימים עבורם בשלב שאחריהם‪ ,G2 ,‬אך‬
‫פעילים בשלב ‪ G1‬בו כנראה אין להם עדיין מעכבים‪.‬‬
‫•‬
‫בתא כזה שמצוי ב‪ ,G1-‬האם הפקטורים עברו אליו לאחר סיום החלוקה? כאשר מכליאים תא כזה‬
‫לתא במצב ‪ ,G2‬האם יידחוף אותו לחלוקה? התשובה היא לא – התא ההיברידי מחכה‪ .‬מכאן‬
‫שהפקטורים של המיטוזה הדומיננטים עוברים דגרדציה או אינאקטיבציה ואינם נשארים בשלב‬
‫‪ .G1‬הפקטורים האלה זכו לכינוי ‪.M-Phase Prooting Factors‬‬
‫כיצד ניתן לזהות תאים בשלבים שונים של מחזור התא? בשנות ה‪ 60-‬פותחו שיטות ראשונות לסינכרוניזציה‬
‫של מחזור התא‪ .‬אחת הדרכים הפשוטות היא להרעיב תאים בתרבית על ידי הוצאת הסרום מהמדיום‪ .‬התאים‬
‫אינם מסוגלים להכין פריקורסורים לסינטזת ‪ DNA‬ולכן אלו הנמצאים בשלבים שונים של מחזור התא ייעצרו‬
‫בשלב ‪ 24 .G0‬שעות לאחר ההרעבה ניתן להוסיף את הסרום ולגרום להם להתחיל במסלול בצורה‬
‫מסונכרנת‪ .‬בעזרת הדבקה בוירוס ה‪ Sendai-‬שעבר אינאקטיבציה גרמו לאיחוי‪ ,‬שכן ממברנות הוירוס עוררו‬
‫איחוי של הממברנות התאיות‪.‬‬
‫מחקרים ביוכימיים באאוציטים‪ ,‬ביציות ועוברים‬
‫ניסויים אלו נעשו על תאים סומטיים ולא על תאי המין‪ .‬ניסויים בתחום הזה התחילו על ידי ‪.Masui‬‬
‫בהמשך התקדמו לעבוד עם תאי ביצה של צפרדע‪ ,‬שהן תאים בודדים ענקיים שניתן לעבוד איתם גם ללא‬
‫תנאי הסתכלות מחמירים‪.‬‬
‫מסוי מצא את פקטור קידום ההבשלה )‪ (MPF‬שאחד מהם הציקלין )‪ .(Cdk‬בחלוקה מיוטית‪ ,‬לפני‬
‫החלוקה המיוטית הראשונה מתבצעת הכפלת ה‪ ;DNA-‬כל תא מכיל בשלב זה ‪ 4n‬כרומוזומים‪ .‬החלוקה‬
‫הראשונה מניבה שני תאים עם ‪ 2n‬כרומוזומים ובחלוקה השנייה – שנעשית ללא שיכפול נוסף של הגנום‬
‫– מניבה ארבעה תאים שבכל אחד ‪ 1n‬כרומוזומים‪.‬‬
‫האאוציט‪ ,‬ביצית הצפרדע‪ ,‬עצור בשלב ‪ .G2‬התאים המקיפים את האאוציט משחררים פרוגסטרון‪ ,‬הורמון‬
‫המעודד את שתי החלוקות המיוטיות‪ .‬התאים עוצרים בסוף החלוקה המיוטית השנייה‪ .‬החלוקה אינה‬
‫מושלמת‪ ,‬והביצית ממתינה לזרע – שלב ההפריה‪ .‬כניסת הזרע לביצית גורמת להשלמת תהליך המיוזה‬
‫ולאחר מכן מתחילות ‪ 13‬חלוקות סינכרוניות מהירות של העובר‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫‪/‬שיעור ‪ :11‬פיענוח מחזור התא‬
‫‪89‬‬
‫אחד התאים שנוצרים בחלוקה המיוטית הראשונה ממתנוון‪ .‬גם לאחר החלוקה השנייה אחד התאים‬
‫מתנוון‪ .‬שני התאים המנוונים יוצרים שני ‪) Polar bodies‬ראשון ושני(‪ .‬תהליך ההכפלה של תא שעצור‬
‫בשלב ‪ G2‬מכונה ‪ – Maturation‬הבשלה‪.‬‬
‫מסוי שאל את עצמו האם משהו בשתי חלוקות ההפחתה של הביצית ולפני האיחוי עם הזרע הגורם לשינוי‬
‫קבוע לעומת התא שהתחיל עם ‪ 4n‬כרומוזומים? האם ניתן לקחת ציטופלזמה של ביצית גדולה‪ ,‬להזריק‬
‫אותה לתא העצור ב‪ G2-‬וללא פרוגסטרון לעורר אותו לעבור חלוקות מיוטיות? מסואי חיפש פקטורים‬
‫בציטופלזמה שחיקו את פעולת הפרוגסטרון‪.‬‬
‫כשעשה את ההזרקה הזו‪ ,‬הבחין בנדידה של הגרעין והכרומוזומים‬
‫למקום קרוב לדופן‪ ,‬המאפיין את תהליך החלוקה‪ ,‬וניתן להבחנה‬
‫כיוון שהתנועה גורמת לבהרה בתאים‪.‬‬
‫הפקטור שמסוי מצא כגורם לתהליך ההבשלה זכה לכינוי‬
‫)‪ .Maturation Promoting Factor (MPF‬ההשראה של‬
‫החלוקה המיוטית הייתה תהליך חדשני שתפס חוקרים רבים‪ .‬הנסיון לאתר את הפקטור הכשיל תלמידים‬
‫רבים‪ ,‬עד שב‪ 1988-‬הוא הצליח תודות לכך שהתגלה‪ ,‬בין היתר‪ ,‬שזהו אינו חלבון בודד כי אם קומפלקס‪.‬‬
‫מציאת קומפלקס ההבשלה‬
‫ג'ון גרהארט )‪ (1983-4‬ניסה לבדוק מהי הפעילות במערכת ביצי הצפרדע לאורך זמן מבחינת רמת ה‪-‬‬
‫‪ .MPF‬על מנת לבדוק את רמת ה‪ ,MPF-‬בהיעדר הידע מהו בדיוק‪ ,‬היה צריך להזריק בנקודות זמן שונות‬
‫ציטופלזמה ולוודא האם היא עדיין גורמת למיוזה‪.‬‬
‫ניתן לראות שבחלוקה המיוטית הראשונה ה‪ MPF-‬עולה ואז יורד; גם לפני החלוקה השנייה יש עלייה‬
‫הנותרת יציבה עד ההפרייה‪ .‬עם ההפריה יש ירידה דראסטית בפעילות‪ .‬גם בחלוקות הראשונות של‬
‫העובר יש עליה תלולה וירידה לקראת כל מיטוזה של תאי העובר‪.‬‬
‫מכאן רואים של‪ MPF-‬יש פעילות מחזורית‬
‫הקשורה בחלוקה המיוטית כמו גם בחלוקה‬
‫המיטוטית‪.‬‬
‫סטודנט מהרווארד מקבוצתה של ג'ואן רודרמן‬
‫שעובדת בקפודי ים ורכיכות דיווח באותה תקופה על‬
‫פעילות קבוצתו‪ .‬לאחר הפרייה‪ ,‬בדומה לצפרדע‪,‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫‪90‬‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫מסמנים את העובר על ידי הזרקת חומצת אמינו‬
‫רדיואקטיבית‪ .‬כמו כן מפיקים חלבונים בזמנים‬
‫שונים מהתא ומסתכלים בכל נקודת זמן על תבנית‬
‫החלבונים המסתמנים בתא‪ .‬ניתן לראות בג'ל‬
‫שקיימים כמה חלבונים המסונטזים קונסטיטוטיבית‬
‫ושני חלבונים בעלי התנהגות מחזורית‪ :‬מופיעים‬
‫ונעלמים‪.‬‬
‫בקהל בהרצאתו של הסטודנט מהרווארד יושב‬
‫סטודנט של טים האנט‪ ,‬העובד במערכת דומה‪.‬‬
‫הסטודנט חוזר ללונדון ומספר על נסיון זה להאנט‪.‬‬
‫הם מעמידים את המערכת ומוצאים את החלבון בעל‬
‫ההתנהגות הציקלית – לו הוא קורא ציקלין‪ .‬אם‬
‫מסמנים את ההתנהגות של סינטזת הציקלין )אדום(‬
‫כפונקציה של מה שניתן לראות כחלוקה של התא‪,‬‬
‫העלייה בציקלין תמיד קודמת לחלוקה‪.‬‬
‫השיא של ציקלין מגיע לפני החלוקה של התא‪.‬‬
‫ב‪ 1984-‬יש את הרצף ו‪ mRNA-‬של הציקלין; ב‪-‬‬
‫‪ 1988‬מתפרסם גם רצף של חלבון מוטנט בשמרים‬
‫המעודד חלוקה‪ ,‬וזוכה לכינוי ‪.CDC28‬‬
‫במקביל‪ ,‬סטודנט של מסוי מבודד ב‪ 1988-‬קומפלקס בעל פעילות של ‪ MPF‬העשוי משני חלבונים‪ .‬הוא‬
‫קובע את הרכב חומצות האמינו של כל חלבון ורואה ששני המרכיבים האלו כבר ידועים – החלבון האחד‬
‫אנלוגי ל‪ CDC28-‬השמרי‪ ,‬שמבנהו התפרסם באותה שנה; השני זהה לציקלין של טים האנט‪ .‬מכאן‬
‫שסרין טריאונין‪-‬קינאז יחד עם הציקלין מניע את מחזור התא על ידי פעילות של ‪.MPF‬‬
‫היחידה הקטליטית שמורה בצורה מופלאה בין היצורים הנחותים ועד לאדם‪ .‬אותו הדבר גם לגבי הציקלין‬
‫– אחד ממשפחה שלמה של ציקלינים הדומים ברצפי חומצות האמינו ושמורים דיים שניתן אפילו לבצע‬
‫החלפות בין חלבון הומני שיעבוד בשמר ולהיפך‪.‬‬
‫קומפלקס הציקלין ו‪ Cdk-‬הוא אחד הקומפלקסים השמורים ביותר באבולוציה‪.‬‬
‫הגרפים הבאים מציגים נסיון של קירשנר )‪ ,(1989‬אשר עבד במערכות הביצים של הצפרדע והקים‬
‫מערכת מדהימה לאותן שנים‪ :‬הוא לקח גרעינים מהזרע והכין תמצית ביציות‪ .‬הוא הוסיף את הגרעין עם‬
‫התמצית של הביצית והראה שניתן לגרום למספר חלוקות במבחנה – ‪ 3-4‬הכפלות וחלוקות‪.‬‬
‫קירשנר יכול היה לעקוב אחר המדדים של ‪ ,MPF‬שכבר היה ידוע שנה קודם‪ ,‬הוא הראה שהיסטון ‪H1‬‬
‫הוא סובסטרט של קומפלקס ‪ Cdk‬ולכן בציר ‪ Y‬הוא מודד כפונקציה של הזמן את פעילות ‪ MPF‬על ידי‬
‫זירחון של ‪.H1‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫‪/‬שיעור ‪ :11‬פיענוח מחזור התא‬
‫‪91‬‬
‫כמו כן הוא יכול לראות מיקרוסקופית את הגרעין של הזרע‪ ,‬הנותר בשלמותו בתהליך – הוא אינו‬
‫מתפורר‪ ,‬למרות שיש שלבים בהם הממברנה מתחררת והוא יכול לעקוב במשך ‪ 3-4‬מחזורי השלבים‬
‫המוקדמים והשלבים המאוחרים של המיטוזה‪.‬‬
‫הוא מדד גם את ריכוז הציקלין‪ B-‬באותו האופן שבו נמדד לראשונה בג'לים כשמצאו נוכחות של החלבון‪.‬‬
‫ביצית הקסילופוס מכילה ‪ 2‬או ‪ 3‬ציקלינים והוא בחן את ביטוי הציקלין ‪ B‬כפונקציה של זמן‪ .‬הקו האדום‬
‫מתאר זירחון ‪ H1‬והכחול את כמות הציקלין‪ .B-‬ניתן לראות עלייה וכמו שגרהארט הראה לפניו העלייה‬
‫נעצרת ומתחוללת ירידה ב‪ MPF-‬ודגרדציה של ציקלין ‪ .B‬התנועה של שני הקווים מסונכרנת‪ .‬הכניסה‬
‫למיטוזה מתרחשת בתחילת המיטוזה והיציאה ממיטוזה מתרחשת עם סיום הדגרדציה‪.‬‬
‫כאשר מטפלים בתמצית בעזרת ‪ RNase‬מתבטלת התנועה של ציקלין ‪ ,B‬ולכן הוא הסיק שהחלבון ציקלין‬
‫‪ B‬אינו יציב ועל מנת לספק אותו התא צריך להכיל את ‪ mRNA‬של החלבון‪ .‬מכיוון שבודדו כבר את ה‪-‬‬
‫‪ mRNA‬של ציקלין ‪ ,B‬ניתן היה לטפל במערכת ב‪ RNAse-‬ולהוסיף רק את ה‪ .mRNA-‬בתנאים אלו‬
‫המערכת עבדה‪ ,‬מכאן שה‪ RNase-‬לא פוגע באלמנטים חיוניים אחרים‪.‬‬
‫הטיפול ב‪ RNAae-‬עדין‪ ,‬אחרת היה פוגע גם באלמנטים אחרים של מערכת סינטזת החלבונים – ‪tRNA,‬‬
‫‪ .rRNA‬כמו כן הריבוזום מגן על רוב ה‪ rRNA-‬וה‪ tRNA-‬בעל מבנה קומפקטי המגן עליו מפני ‪.RNAse‬‬
‫בריצוף חלבון הציקלין‪ B-‬נמצא איזור של ‪ 8‬חומצות אמינו החוזרות על עצמן בקצה ‪ C‬של חלבונים לא‬
‫יציבים‪ .‬מכיוון שידוע שהציקלין מתפרק‪ ,‬הניחו שזהו סיגנל לדגרדציה של הציקלין‪ .‬האלמנט זכה לכינוי‬
‫)‪ .D-Box (destruction‬קירשנר ייצר ‪ mRNA‬שאינו מסנטז את שמונה חומצות האמינו של סיגנל‬
‫ההרס‪ ,‬וכך ערך את ניסוי ‪ – D‬הכנסה של ציקלין ‪ B‬שחסר את תיבת ההרס‪ ,‬כלומר הוא אינו ניתן‬
‫לדגרדציה‪ .‬בתהליך זה יש ביטוי ועלייה בציקלין‪ ,‬יש כניסה למיטוזה אך התהליך נתקע בשלבים‬
‫המוקדמים ואינו מסוגל לצאת מהמיטוזה‪ .‬הפעילות של ‪ mMPF‬המוטנטי יציבה‪ .‬מכאן הגיעו למסקנה‬
‫שהדגרדציה של הציקלין ‪ B‬היא הכרח על מנת שתא מיטוטי יסיים את המיטוזה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪92‬‬
‫מכאן שיש כוח מניע המורכב מציקלינים ו‪ Cdk-‬המופיעים בשלבים שונים של מחזור התא – כאלה‬
‫המכינים את התא לשלב ‪ .M ,S ,G1‬מרכיב אחד של מחזור התא הוא סדרה של זירחונים על ידי ‪.Cdk’s‬‬
‫ידוע שבתאים הומנים קיימים מאות סובסטרטים שעוברים זירחון בתהליכי מחזור התא וכי הזירחון הזה‬
‫מהווה מנגנון לקידום מחזור התא‪.‬‬
‫מערכת הדגרדציה במחזור התא‬
‫ישנם כמה חלבונים שחייבים לעבור דגרדציה ספציפית במחזור התא‪ .‬המערכת קשורה במערכת‬
‫היוביקוויטין שהתגלתה על ידי הרשקו וקבוצתו במכון וויצמן‪ .‬הציקלין‪ B-‬עובר דגרדציה במערכת זו‪.‬‬
‫בעוד שהדגרדציה מתבצעת במעין שק ציטופלזמטי המכיל אנזימים לדגרדציה של חלבונים‪ ,‬הקומפלקס‬
‫המיועד לדגרדציה צריך להיות מסומן ספציפית ולהגיע למתחם הדגרדציה‪ .‬במקרה של ציקלין‪ B-‬מדובר‬
‫בקומפלקס בשם ‪ APC – Anaphase Promoting Complex‬ופקטור של ספציפיות המזהה את‬
‫ציקלין‪ .B-‬הפקטור הוא תוצר של ‪.Cdh1‬‬
‫במהלך האנאפאזה הציקלין עובר פולי‪-‬יוביקוויטינציה ואז הפרוטאוזום לוקח את המולקולה המסומנת‬
‫ביוביקוויטין ועורך דגרדציה לאוליגופפטידים קצרים‪ .‬הפעילות הקונסטיטוטיבית של הקומפלקס המפרק‬
‫מופסקת על ידי קומפלקס של ‪ Cdk+G1-Cyclin‬הרואים את מולקולת ‪ Cdh1‬ומזרחנים אותה‪ .‬הזירחון‬
‫מנתק אותו מהקומפלקס של ‪APC‬‬
‫ומנטרל אותו מפעילות עד לשלב‬
‫המיטוזה המוקדם בו פוספאטאז‬
‫)תוצר של ‪ (Cdc14‬מוריד את הזרחן‬
‫ומאפשר שוב בנייה של קומפלקס‬
‫‪ APC‬המשופעל‪.‬‬
‫הסימון‬
‫של‬
‫‪Cyclin-Cdk‬‬
‫‪G1‬‬
‫והפעלת הדגרדציה ועצירה היא‬
‫מחזוריות שעוקבת אחר מחזור התא –‬
‫מכאן שמחזו רהתא אינו רק מחזוריות‬
‫של קינאזות אלא גם של פוספאטאזות‬
‫ושל דגרדציות‪.‬‬
‫באיור הבא ניתן לראות שלמעט בקרה בדגרדציה‪ ,‬גם תת היחידה הקטליטית – ‪ – Cdk‬יכולה להיות‬
‫נתונה לבקרה‪ .‬הבקרה נעשית על ידי סדרת קינאז ופוספואטאזות‪ .‬באיור מצויין ‪ ,CDC28‬הדומה ל‪Cdk-‬‬
‫ההומני‪.‬‬
‫בשלב הראשון נעשה זירחון של טירוזין בעמדה ‪ 15‬המעכבת את המבנה‪ .‬לאחר מכן קינאז אחר – ‪Cdk-‬‬
‫‪ activating Kinaze‬מזרחן את טריאונין ‪ ,161‬שהיא פעולה מאקטבת‪ .‬אחריו‪ Cdc25 ,‬מוריד את הזרחן‬
‫מהעמדה המעכבת וכך נוצר ה‪ Cdk-‬האקטיבי‪ .‬בתוך הכיס שנוצר בין שני החלבונים ניתן לקלוט את‬
‫הסובסטרטים‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫‪/‬שיעור ‪ :11‬פיענוח מחזור התא‬
‫‪93‬‬
‫גם היחידה הקטליטית של ה‪ MPF-‬נתונה לרגולציה על ידי קינאזות ופוספאטאזות‪.‬‬
‫נקודות בקרה – ‪Checkpoints‬‬
‫במחזור התא קיימות נקודות בקרה הבודקות האם התא מוכן לעבור לשלב הבא‪ .‬אחת מהנקודות החשובות‬
‫– אם לא החשובה ביותר – היא נקודת ה‪ Restriction point-‬ביונקים או )‪ Start (S point‬בשמרים‬
‫)ידועה גם כנקודת ה‪ commitement-‬בה התא מתחייב לחלוקה(‪.‬‬
‫כאשר מוסיפים פקטורים לתאיםן מורעבים‪ ,‬התאים יוצאים ממצב ‪ G0‬אליו נכנסו בהרעבה וחוזרים ל‪-‬‬
‫‪ .G1‬אם ירעיבו שוב את התאים‪ ,‬הם ייעצרו בנקודת ה‪ chceckpoint-‬ולא ימשיכו הלאה; אם עברו את‬
‫הנקודה הם ימשיכו בתהליך בכל מקרה‪.‬‬
‫המאפיין של תאים סרטניים לעומת תאים סומטיים ורגילים הוא שיש בהם התגברות )‪ (overriding‬על‬
‫נקודת הביקורת הזו‪.‬‬
‫שנים רבות ביקשו לבדוק מה קורה בנקודת ההגבלה‬
‫הזו; התשובה נמצאת באיור הבא‪ :‬חלבון הגן ‪.Rb‬‬
‫החלבון יוצר קומפלקס לא פעיל של ‪ ,E2F‬פקטור‬
‫שיעתוק הכרחי מסוג ‪ Master TF‬האחראי על‬
‫סוללות של גנים הומנים‪ .‬משפחת ‪ Rb‬מורכבת‬
‫משלושה חלבונים ו‪ E2F-‬הוא חלבון שפעולתו‬
‫מועצמת על ידי היותו קומפלקס של ‪ 5‬חלבונים‪.‬‬
‫קומפלקס ‪ E2F‬הכרחי למעבר שלב ‪ G1‬עקב הפעלה‬
‫של כל מיני חלבונים‪ .‬הקומפלקס עם ‪ Rb‬מעכב את‬
‫‪ E2F‬ואת ביטוי ה‪ early genes-‬שהוא מפעיל‬
‫)דוגמת צקלין‪E-‬ו‪.(Cdk2-‬‬
‫העיכוב מבוטל על ידי קומפלקס ‪ Cyclin D+ lie‬המזרחן את ‪ Rb‬ומביא לשינוי קונפורמציה המשחרר‬
‫את ‪E2F‬לשיעתוק‪ .‬החלבונים המופעלים על ידי ‪ E2F‬מוסיפים להגברת המעבר מ‪ Mid G1-‬ל‪Late -‬‬
‫‪.G1‬‬
‫סוג נוסף של פעילות ‪ tumor-suporessor gene‬מוצג באיור הבא‪ .‬חלבון ‪) p16‬בעל מסה של ‪ (16S‬הינו‬
‫בעל תאום ‪ .p15‬דיוויד ביץ' החליט לחקור מלנומות דרך איזורי אינאקטיבציה ספציפית במחלה‪ .‬הוא‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪94‬‬
‫בודד איזור מסויים שלעיתים קרובות היה מחוק במלנומה וראה שתי מסגרות קריאה פתוחות‪ ,‬המקדדות‬
‫לשני חלבונים‪ 15S :‬ו‪ .16S-‬אולם הרצף לא נתן רמז לפעילות של החלבונים‪.‬‬
‫זאת עד שבודדו קומפלקס בו נמצא ‪ .Cdk4, CycD & p16‬ששני הציקלין והקינאז הם קומפלקסים של‬
‫השלב המיטוטי המוקדם‪ .‬החלבון ‪ p16‬הוא אינהיביטור שמונע את פעילות הקומפלקס‪ .‬אם ‪p15+p16‬‬
‫מסולקים‪ ,‬מתאפשרת פוספורילציה של ‪ Rb‬ולכן העובדה שהחלבונים עוברים מחיקה בסרטן עוזרת‬
‫לתא הסרטני לעבור את נקודת ההגבלה כך שייקל עליו לזרחן את ‪.Rb‬‬
‫זהו מנגנון של מדכאי גידול היוצרים קומפלקס לעיכוב ‪.Cdk‬‬
‫צ'יפים‬
‫החלבונים ‪ p15‬ו‪ p16-‬נמצאו כמעכבים של ‪ Cdk‬המכונים ‪ ;INK4‬בקבוצה זו יש יותר משני סוגים אלו‬
‫בלבד‪ .‬יש קבוצת מעכבי ‪ Cdk‬נוספת המכונים ‪ .CIP – Cdk Inhibition Protein‬שם החלבון ניתן לפי‬
‫משקלו המולקולרי‪ .‬החלבון ‪ p21‬נחשב כמעכב אוניברסלי כי הוא נקשר לכל קומפלקס כמעט‪.‬‬
‫האיור מראה את נקודות העצירה )ורוד(‪ .‬החלבון ‪ P21‬נקשר לקומפלקס ומונע התקדמות; בשלבים שונים‬
‫יש אקטיבציות או עיכובים של ‪ Cdk‬בתור רגולציה על ידי נקודת הבידוק‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬