docFluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) - lokalizacija
download 
Report Transcription
Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) - lokalizacija
Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) lokalizacija molekularnih spektroskopskih informacij s fluorescenčnim mikroskopom Janez Štrancar Laboratorij za biofiziko, IJS / CO NAMASTE Zakaj je ta slika netipčna za navadno mikroskopijo, zakaj za fluorescenčno mikroskopijo? Od mikroskopije do fluorescenčne mikroskopije • Kontrast! microscopy fluorescence microscopy Pojav fluorescence Absorbcijski in emisijski spekter Eksitacija in relaksacija elektronskih stanj 3 Konfokalna fluorescenčna mikroskopija • Optično rezinjenje! fluorescence microscopy – Eksitiramo eno optično ravnino in – Zajemamo svetlobe iz ene optične ravnine! fluorescent confocal microscopy Fluorescenčna mikrospektroskopija lokalizacija pri fiziol. pogojih 3D microscopy confocal microscopy fluorescence microscopy microspectroscopy kontrolirano ozadje spektralno občutljiva detekcija Fluorescence microspectroscopy (FMS) Shema FMS konfokalna mikroskopija fluorescenca spektroskopija Liquid crystal tunable filter EM Iztok Urbančič FMS 7 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E • primeren za opazovanje bioloških vzorcev v tekočini • objektivi 10x, 40x, 100x (oljni in vodni imerzijski) • motorizirana mizica (ravnina XY) • motoriziran revolver objektivov (Z) Iztok Urbančič FMS 8 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS • nazivna moč 300 W • 4,5 W izsevane svetlobe, 500 mW v vidnem delu • zvezen spekter od UV do NIR • nadomešča nabor več laserjev Iztok Urbančič FMS 9 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS Fluorescenčna enota BD Carv II nabor • širokoprepustnih vzbujevalnih in izsevnih filtrov • in dvobarvnih zrcal Iztok Urbančič FMS 10 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS Fluorescenčna enota BD Carv II Konfokalna enota BD Carv II V primerjavi z laserskim skeniranjem: • manj „bledenja fluorescence“ • neodvisnost pri izbiri fluorescenčnih barvil Iztok Urbančič FMS 11 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS Fluorescenčna enota BD Carv II Konfokalna enota BD Carv II TK nastavljivi filter VariSpec • spektralno območje 400–720 nm • spektralna širina prepustnosti 10 nm • korak 1 nm • odzivni čas 50 ms Iztok Urbančič FMS 12 Elementi FMS Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS Fluorescenčna enota BD Carv II Konfokalna enota BD Carv II TK nastavljivi filter VariSpec EMCCD kamera QImaging Rolera Mgi+ • ločljivost 512x512, velikost elementov 16 µm • kvantni izkoristek > 90% • hitrost snemanja 30 s–1 • temni tok < 0.2 e– (pix s)–1 @–25°C • elektronsko pomnoževanje signala (do 1000x) Iztok Urbančič FMS 13 Elementi FMS fluorescenčne nanokroglice (50 nm) Obrnjeni mikroskop Nikon TE2000-E Obločna svetilka (Xe) Lambda LS Fluorescenčna enota BD Carv II Konfokalna enota BD Carv II 10 µm TK nastavljivi filter VariSpec EMCCD kamera QImaging Rolera Mgi+ • IR vlakenski laser 1064 nm • izhodna moč 5 W • več kot 1000 sočasnih pasti • preklapljanje med pastmi 100 kHz Optična pinceta Aresis Tweez 200si Iztok Urbančič • natančnost lege pasti < 1 nm FMS 14 Zajem in kodiranje krajevno lociranih spektralnih lastnosti Kam so šli vsi fotoni? element prepustnost [1] 300 W Xe obločnica jakost [W] fotonski tok [s–1] 4,5 10+0 1,5 1019 svetlobni vodnik 0,1 4,5 10–1 1,5 1018 vzbujevalni filtri 0,2 9,0 10–2 3,0 1017 konfokalni disk 0,08 7,2 10–3 2,4 1016 objektiv (vstopna odprtina) 0,08 5,7 10–4 1,9 1015 fluorofori (absorpcija, emisija) (5 10–4) 2,9 10–7 9,7 1011 / 3D slikovni element („voxel“) 6 10–7 1,7 10–14 5,7 104 objektiv (NA, n) 0,3 5,2 10–15 1,7 104 izsevni filtri 0,7 3,6 10–15 1,2 104 TK filter 0,02 8,0 10–17 2,4 102 kamera (γ ⇒ ADCe) (0,02) 4,8 101 Iztok Urbančič FMS [(pix s)–1] : : [ADCe (pix s)–1] Ciljano porazdeljevanje označevalcev • Od lastnosti označevalcev je odvisno, kje se le ti porazdeljujejo! A 10 µm B C D E F Preverjamo stabilnost vezave označevalcev • • Akumulirane titan oksidne nanocevke v MCF7 celicah (rak dojke) po 1 dnevu, sprane s PBS Vezan in prost Alexa označevalec imata vrha emisijskega spektra razmaknjena za 8 nm emmision-maximum-coding FMS image emmision spectra of the two states of the same probe Identificiramo delce manjše od resolucije mikroskopije Akumulirani polistirenski nanodelci v MCF7 celicah (rak dojke) po 1 dnevu Kolokalizacija z doma-sintetiziranim membranskim označevalcem , ki ima vrh emisijskega spektra zamaknjen za 40 nm glede na vrh spektra označevalca na nanodelcih Intenziteta fluorescence (a.u.) • • Nanodelci Membranska proba 500 slika, ki kodira intenziteto slika, ki kodira vrh emisijskega spektra 550 Valovna dolžina (nm) 600 Emisijski spekter obeh označevalcev membranski označevalec Opazujemo časovno odvisne pojave, kot je zlivanje membran • Zaradi zlivanja membrane liposomov s plazemsko membrano, s okoli fluorescenčnih označevalcev spreminja koncentracija holesterola, ki vpliva na strukturiranost membrane, ta pa se odraža na vrhu emisijskega spektra 5 µm 5 min 10 min 15 min Razglednica za spomin Koncept FMS Barvno kodiranje spektralnih lastnosti Detekcija nanodelcev preko spektralnega kontrasta Detekcija lokalnega molekularnega okolja Projektna skupina Laboratorij za biofiziko @ F5.IJS, FFA.UNI-LJ, CO NAMASTE Darija Jurašin Ivan Kvasić Stane Pajk Janez Mravljak Alma Mehle Ajasja Ljubetič Iztok Urbančič Maja Garvas Daniele Biglino Zoran Arsov Marjeta Šentjurc Jana Mlakar Jure Zdovc Slavko Pečar Tilen Koklič http://lbf.ijs.si http://www.conamaste.si Janez Štrancar
