Lab - Protein syntes - Cambro

UMEÅ UNIVERSITET
Biokemi
Lars Backman
LABORATIONSHANDLEDNING
Farmaceutisk kemi 1
2011-09-09
BIOLOGISK SYNTES AV PROTEIN
Utblick
Våra gener innehåller all information som behövs för att ”tillverka” en ny kopia av oss själva.
Genom att generna blandas från båda föräldrarna blir våra avkommor exakt kopior av oss.
Genom den mycket snabba utvecklingen inom det som allmänt kallas bioteknik kan man med
mycket enkla medel göra nästan vad som helst med en uppsättning gener hos en levande
varelse.
Många av dessa möjligheter som i grunden är postiva för oss, som t ex sjukdomsdiagnostik,
kan samtidigt användas för helt andra ändamål. Hur mycket vill vi veta om de sjukdomsanlag
som vi kanske bär på? Ökad kunskap inom det här området, tillsammans med den information
om det mänskliga genomets bassekvens som följer av HUGO-projektet, leder till svåra etiska
frågor som vi måste ta ställning till.
Målsättning
Efter laborationen skall du:
•
Förstå hur information förs från DNA till RNA till protein
•
Veta var och hur proteiner tillverkas i en levande cell
•
Ha viss kunskap om proteiners struktur
•
Känna till hur man klonar en gen
Lab - Protein syntes.docx
2011-0+9-09
Proteinsyntes
TEORI
Introduktion
Sedan början av 1970-talet har en fullkomlig revolution
ägt rum inom modern biologi och biokemi. En helt ny
metodik har utvecklats. Metoderna kallas för
rekombinant-DNA-teknik eller genetisk ingenjörskonst
och grundas på möjligheten till genkloning. Genkloning
är en teknik där man preparerar fram en specifik gen från
större DNA-molekyler och mångfaldigar den. Tekniken
spelar en viktig roll i dagens forskning; den används för
att studera geners sekvens och struktur liksom kontroll av
genuttryck men även proteiners och peptiders
primärstruktur. Specifika genmodifieringar som riktad
mutagenes eller deletioner har också blivit möjliga att
göra. Rekombinant-DNA-tekniken är även viktig inom
industrin, t ex för produktion av antibiotika, vacciner,
hormoner, enzymer som bryter ned miljöfarligt avfall etc.
Genkloning
Vid genkloning måste rent DNA med de specifika
generna prepareras fram. Arbetar man med högre
eukaryota organismer så måste man ta hänsyn till att
generna består av både exoner och introner. Exonerna är
de delar av DNA som innhåller den information som
translateras, dvs översätts till protein, och mellan dessa
finns introner. Introner är DNA som inte översätts utan
transkriberas och klipps bort via splicing när exonerna
sätts ihop. Eftersom splicing inte sker hos bakterier
kommer det inte att ske syntes av något funktionellt
protein vid uttryck av eukaryota gener. För att undvika
detta problem går man “bakvägen” istället. Först isoleras
moget mRNA vilka innehåller RNA med bortklippta
introner sedan låter man enzymet omvänt transkriptas
(“reverse transcriptase”) använda detta mRNA som mall
för syntesen av komplementärt DNA (cDNA). Därigenom
får man ett DNA-fragment som bara innehåller den
kodande delen av genen.
Vektorer
Vektorer eller plasmider används som redskap för uttryck
av gener till proteiner. Dessa vektorer har viktiga
egenskaper: i) de kan överföras till bakterier; ii) de hålls
stabila i värdcellen; och iii) de innehåller information för
uttryck av proteiner. Vektorer finns naturligt i en mängd
olika organismer, både prokaryota och eukaryota, och
man brukar prata om två huvudgrupper, plasmider och
bakteriofager.
• Plasmider kan replikera sig oberoende av värdcellens
kromosom och finns naturligt hos en del bakterier
liksom hos jäst.
2(5)
• Bakteriofager är virus som infekterar bakterier. Virus
injicerar sin kromosom in i värdcellen och replikeras
där, antingen som egen DNA-molekyl eller
inkorporerat i värdcellens kromosomala DNA.
Det finns en mängd olika vektorer tillgängliga. Alla
kommer ursprungligen från naturligt förekommande
plasmider eller virus och har modifierats på olika sätt för
att passa genkloningstekniken.
Inkorporering av DNA i en vektor
För att praktiskt inkorporera ett DNA-fragment i en
vektor så klipper man upp den med ett eller två
restriktionsenzymer. Restriktionsenzymer är enzymer som
hydrolyserar fosfodiesterbindningen vid vissa speciella
DNA-bassekvenser och de benämns utifrån vilken
bakterie de härstammar från. EcoR I (från Escherichia
coli) klyver vid sekvensen GAATTC och BamH I (från
Bacillus amyloliquefaciens) klyver vid GGATCC. Det
finns olika typer av restriktionsenzymer: enzymer som
klyver dubbelsträngat DNA så att det sticker ut en bit
enkelsträngad DNA, vilket ger “sticky ends”, och
enzymer som klyver DNAs båda strängar på samma ställe
så att ändarna är trubbiga, “blunt ends”.
STICKY ENDS
-N-G-A-A-T-T-C-N-N-C-T-T-A-A-G-N-
EcoRI

-N-G
A-A-T-T-C-N-
-N-C-T-T-A-A
BLUNT ENDS
-N-A-G-C-T-N-N-T-C-G-A-N-
AluI

-N-A-G
C-T-N-
-N-T-C
G-A-N-
Det här kan man utnyttja när man vill sätta (“klistra”)
ihop två fragment som tidigare inte har suttit ihop. Man
klyver vektorn och DNA med enzymer som ger samma
sorts ändar. Även om man kan få “sticky ends” att sitta
ihop genom basparning så krävs det att man fyller igen
hålen (“nicks”) i DNAet genom att återskapar
fosfodiesterbindningarna. Dessa “nicks” repareras av
enzymet DNA-ligas. Den konstruktion som nu skapats av
plasmiden och det nya DNA-fragmentet kallas för en
rekombinant DNA-molekyl.
Ofta innehåller vektorerna en gen som kodar för resistens
mot en viss antibiotika. Bakterierna kan då överleva i ett
medium som innehåller just den antibiotikan.
Antibiotikan ampicillin (och andra penicillinderivat)
binder till och inhiberar enzymer som deltar i syntesen av
bakteriens cellvägg och hindrar därigenom bakterierna att
växa. Genen för resistens mot ampicillin kodar för ett
enzym, β-lactamas, som utsöndras i periplasman hos
bakterien och katalyserar hydrolys av β-lactamringen på
G-N-
Proteinsyntes
3(5)
ampicillin vilket medför att ampicillinet förlorar sin
funktion.
Eukaryot cell
Prokaryot cell
DNA prepareras
Klyva med
restriktionsenzymer
m-RNA
Reverse Transkript as
Separera fragment
genom gelelektrof ores
c-DNA
Preparera f ragment
av en viss storlek
(ev. konstruera linkers)
lacZ
――――►
ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG
Hind III
TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTA GAA
DNA-Ligas
Självlig era d
vekto r
"Fel" rekombinerad
DNA- mo lekyl
GFPuv
――――►
Oligerad vekt or
"Rätt" reko mbinera d
DNA- mo lekyl
Normal cell
RbCl, 0°C
Kompe tent cell
cell utan
vektor
överlever inte
Agar med antibiotika
Klon med "rä tt" v ekt or
Figur 2. Restriktionskarta över pGFPuv
Ampr- genen för ampicillinresisten; Plac - lac-operonets
promotor; pUC ori - start för replikation av plasmiden.
Transformering
42°C
Klon med "f el" vektor
ATG ATG ... ... ... ... TAA TGA ATT CCA ACT GAG
stopp
EcoR I
Klon med
självligera d vekto r
Figur 1. Grundläggande steg inom genkloning
Plasmiden pGFPuv
Plasmiden (pGFPuv) innehåller flera viktiga
gensekvenser. Bl a finns genen för ampicillinresistens
(ampr), origin för replikationen (pUC ori) och en
inducerbar promotor för lac operonet (Plac). Efter
promotorn finns den kodande DNA-sekvensen för “Green
fluorescent protein” (GFP).
DNA-sekvensen som vi ska undersöka innehåller
informationen för GFP, ett protein som normalt finns i
manter av familjen Aequorea victoria. Om man belyser
GFP med UV-ljus så börjar proteinet fluoresera, vilket
kan utnyttjas för att t ex följa reningen av GFP.
Den rekombinanta plasmiden överförs till en värdcell via
transformering. Man använder ofta bakterier som
värdceller för främmande DNA eftersom bakterier är lätta
att odla och manipulera. Först måste man behandla
bakterien så att den kan släppa in plasmiden, dvs göra
cellerna kompetenta. Kompetenta celler utsätts sedan för
en iskall saltlösning (ofta RbCl) varefter man utsätter
cellerna för en värmechock (42° C). Detta gör små “hål” i
cellhöljet och plasmiden kan tas upp. Celler kan även
transformeras med elektroporering, vilket innebär att
cellerna får en elektrisk chock istället för värmechock.
Elektropoering är ofta både enklare och effektivare än
värmechock. När en cell tagit upp en plasmid kallar man
den för en transformerad cell.
Varje cell som överlever odling i medium med ampicillin
(eller annan lämplig antibiotika) kommer att innehålla en
plasmid och ger upphov till identiska kopior när den delar
på sig. På en agarplatta kan detta ses som kolonier av
celler där varje koloni är en klon.
Uttryck av proteinet
Efter att ha isolerat en klon med den rekombinanta genen
kan man börja studera genen eller proteinet. För studier av
proteinet odlas cellerna så att proteinet produceras.
Uttryck av främmande proteiner är ofta toxiskt för
bakterierna. För att undvika detta brukar man låta
bakteriekulturen växa till en viss densitet (ca 1x107
celler/ml) och först därefter inducerar man produktionen
av proteinet. Har man använt en plasmid med lac-
Proteinsyntes
operonets promotor framför genen sätter inducerar man
syntes av proteinet genom att tillsätt IPTG (isopropylthiogalactopyranos) till bakteriekulturen. IPTG binder till lacrepressorn och förhindrar repressorn att inhibera
proteinsysntes. Efter induktion låter man bakterierna
producerar proteinet under en viss tid och skördar
(centrifugera ner cellerna) därefter.
4(5)
Proteinsyntes
5(5)
EXPERIMENTELL DEL: BIOLOGISK SYNTES AV PROTEIN
Lösningar och kemikalier
Sterila lösningar
DNA (plasmid pGFPuv) 1 ng/µl (i TE)
LA 100/Amp och LA 100/Amp/IPTG plattor (100 µg amp/ml och 0.5 mΜ IPTG)
kompetenta celler (E. coli/JM109)
plastinöser
SOB-medium (komplementerat med Mg2+)
Sterila glasvaror mm
Pipettspetsar (200 µl)
Eppendorfrör
rackla (plast, glas)
Övrigt
Kylblock (kylt -20° C) eller isbad
Värmeblock eller vattenbad (42° C)
UV-lampa
Automatpipetter (20 µl och 200 µl)
"rackelsnurra"
Transformering och odling
Tina 200 µl JM109 kompetenta celler på is. Torka under tiden 1 LA 100/Amp-platta och 1 LA 100/Amp/IPTG-platta i
37° C. Blanda 10 µl pGFPuv med 100 µl tinade kompetenta celler i två sterila Eppendorfrör. Inkubera båda proven på is
i 30 - 45 minuter.
”Heat-shock”
Värm cellerna (“heat-shock”) vid 42 °C i 90 sec i ett värmeblock eller vattenbad. Kyl på is i 5 min. Tillsätt 0.2 ml SOB
och blanda om. Inkubera rören i 30 - 45 minuter på skak vid 37° C.
Rackla ut lösningarna på LA-plattorna med och utan IPTG.
Skriv upp namn, datum och typ av kultur på plattans undersida. Inkubera plattorna upp- och nervända i 37° C över natt.
Analys av syntetiserat protein
För att analysera om bakterierna har tillverkat GFP utnyttjas GFP fluorescerande egenskap.
Beräkna hur många kolonier som har växt på de båda agar-plattorna. Belys sedan plattorna med UV-ljus och beräkna
hur många kolonier som fluorescerar.
Laborationsredogörelsen ska innehålla
Teori:
Beskriv teori och syftet med laborationen.
Resultat:
Beskriv resultaten och jämför speciellt tillväxten på de båda plattorna.
Diskussion:
Diskutera resultaten med utgångspunkt från teorin.
Besvara även följande:
Varför ger man bakteriecellerna en chock i samband med transformeringen?
Vilken funktion har IPTG? Vad skulle hända om IPTG utelämnades?
Varför tillverkas inte GFP på båda agar-plattorna?
Referenser
Brown, T.A. Gene Cloning and DNA analysis. An Introduction. 4th ed. (2001) Blackwell Science.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. (2001) Cold Spring
Harbor Laboratory Press (USA)
http://www.bio.cmu.edu/Courses/BiochemMols/ribosome/70S.htm