Användarinstruktion och tips

Anrikning av Cryptosporidium oocystor
från kliniska material med IMS
Dr Romanico Arrighi – Utredare
Enheten för parasitologi, livsmedels- och vattenburen smitta (MI-PL)
Sid
.
Krisberedskap projekt (2013-2015)
Förbättrad förmåga för upptäckt, tidig varning, och analys av naturlig
och avsiktlig spridning av Cryptosporidium spp.
Skapa genomiska referensdata för Cryptosporidium spp.
Baserad på framtagen genomisk information, identifiera genetiska
markörer som möjliggör högupplösande typning av Cryptosporidium
spp.
Utveckling, test, och utvärdering av högupplösande typning för
smittspårning baserad på NGS
Sid 2. 2015-10-27
Bakgrund info - Cryptosporidium
Foto: Marianne Lebbad
• Encellig parasit (protozo), 4-6µm diameter
• en oocysta som utsöndras i mycket höga halter via
avföringen – infektiösa fas
• Genom 9.1 Mb
• Ungefär 25 olika arter
• Vanligaste är C. hominis (bara infektera människor)
och C. parvum (zoonotisk, boskap)
• Fekal-oral spridning
Sid 3. 2015-10-27
I got 99 problems…………………………..
Order from chaos
Purification/Isolation
Sid 4. 2015-10-27
DNA extraction
Amplification and sequencing
What do we need?
1
Isolation
2
3
DNA extraction
Amplification and sequencing
1) Immunomagnetic Separation (IMS)
• Dynabeads “trap” the parasites
• Direct from feces
A
B
(A) pre-IMS
(B) post-IMS
Andersson et al: J Microbiol Methods. 2015 Mar 21;113:10-12
Sid 5. 2015-10-27
1
Isolation
2
DNA extraction
3
Amplification and sequencing
2) Bullet Blender and QIAamp DNA mini kit
• Effective extraction of Cryptosporidium DNA
3) Ion Torrent platform
• Library prep – enzymatic shearing of DNA and adaptor ligation
• PCR max 25 cycles
• Size Selection; 200-400bp (Pippin prep)
• Emulsions PCR (Ion Chef/OT2 depending on DNA concentration and whether de
novo assembly is required) and Ion Torrent PGM sequencing
Sid 6. 2015-10-27
Proof of priniciple*
#
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Species
C. parvum
Subtype
IIdA24G1
IIbA14G1R1
IIaA15G2R1
IIaA16G1R1
IInA10
IIa A15G1R1
IIdA23G1
IIaA17G1R1
IIaA18G1R1
IIdA19G1
IIdA22G1
IIeA13G1
Total oocysts
after IMS
2x10⁴
6x10⁵
2x10⁴
8x10⁵
2x10⁴
6x10⁵
6x10⁵
7x10⁵
7x10⁵
1x10⁶
1x10⁶
1X10⁵
SNPs
1634
4497
940
4306
13726
4563
3947
2682
4765
4265
4910
11804
Unique
337
366
194
383
8557
485
365
216
536
921
445
7064
% Crypto DNA
73%
90%
16%
64%
55%
91%
73%
72%
92%
98%
84%
69%
Frac Cov x Avg Cov
0,97
26
0,99
45
0,99
23
0,99
35
0,98
26
0,99
43
0,99
28
0,99
24
0,99
44
0,99
32
0,99
43
0,99
24
* Sample list until April 2015
Sid 7. 2015-10-27
More data please*
# Species
1
2
3
4
C. hominis
5
6
7
8
Total oocysts after
Subtype
IMS
IbA9G3
1x10⁶
IdA14
1x10⁵
IaA20R3
7x10⁵
IbA13G3
4x10⁵
IfA12G1
1x10⁵
IaA23R3
2x10⁵
IeA11G3T3
1x10⁵
IbA10G2
3x10⁵
SNPs
Unique
3858
4138
381
4282
2969
4637
2183
2294
288
2551
1103
4055
% Crypto
DNA
91%
86%
94%
74%
83%
94%
44%
96%
Frac Cov x Avg Cov
400
0,99
35
0,99
51
0,92
35
0,99
42
0,99
43
0,77
24
0,99
34
and…………………………………………..
#
Species
1
C. viatorum
2 C. spp horse genotype
3
C. meleagridis
4
C. ubiquitum
5
C. cuniculus
6
C. erinacei
Subtype
n/a
n/a
IIIeA19G2R1
genA
VcA18G1
XIIIaA23R12
Total oocysts after
IMS
% Crypto DNA x Avg Cov
6x10⁴
65%
400
>>1x10⁶
51%
166
6x10⁴
72%
159
1x10⁶
72%
239
7x10⁴
84%
99
2x10⁴
65%
102
* Sample list until April 2015
Sid 8. 2015-10-27
Summary
• Method applied to clinical material, providing high quality genome sequencing data
(>30 samples sequenced)
• IMS can isolate and purify at least 12 different species from clinical specimens
• Current method input threshold: approx. 1x104 oocysts (~400pg DNA)
Project progress
• Currently designing and testing markers for higher resolution genotyping
Sid 9. 2015-10-27
Acknowledgements
Jessica Beser
Sara Byfors
Benjamin Edvinsson
Sofia Andersson
Jadwiga Winiecka Krusnell
Emma Bränn
Per Sikora
Erik Alm
Maria Lind Karlberg
Gabriel Östlund
Björn Hallström
Steve Glavas
Reza Advani
Sid 10. 2015-10-27
Karin Troell
Cecilia Alsmark
Parasitology
Laboratory
Development and
Technology Transfer
Swedish Defence Research Agency
Anders Allgardsson
Pär Larsson
Per Stenberg
Adrian Läkeryd