docAssistert befruktning i laboratoriet
download 
Report Transcription
Assistert befruktning i laboratoriet
Assistert befruktning i laboratoriet Assistert befruktning i Norge Mette Haug Stensen Senior klinisk embryolog Laboratoriesjef @ Medisinsk fødselsregister (MFR) 2010: > 23 000 ART barn født 1994: 1/100 barn 2009: 2.9/100 barn Oslo Assistert befruktning i Norge Medisinsk fødselsregister (MFR) Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Assistert befruktning i Norge Medisinsk fødselsregister (MFR) Flerlingeraten er redusert fra ca 42% (2002) til ca 20% (2008) pga single embryo transfer (SET) 50% IVF 40% ICSI 10% andre (PESA/TESA, sæddonasjon,TIN, IUI) Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Historien om ART 1959: kaniner født etter IVF 1965: humane oocytter fertilisert in vitro 1978: første fødsel etter naturlig syklus IVF (Louise Brown) 1983: første fødsel med donerte oocytter 1983: første fødsel etter frys/tin ART metoder i Norge 1983: modning og fertilisering av umodne oocytter dyrket frem in vitro (IVM) 1986: første fødsel etter PESA 1989: PGD for kjønnsbundet sykdom 1990: første fødsel etter vitrifisering av embryo 1992: første fødsel etter ICSI 1993: første fødsel etter TESA 2005: første fødsel etter ovarialvev transplantasjon 2014: første fødsel etter livmor transplantasjon • Intrauterin inseminering (IUI) • In vitro fertilisering (IVF) • Intracytoplasmisk spermie injeksjon (ICSI) • Kryopreservering (frys): oocytter, sæd og embryo • Uthenting av sædceller fra testiklene (PESA/TESA/TESE) • Sæddonasjon (mannlig faktor og lesbiske par) • Kryopreservering av ovarialvev • In vitro modning (IVM) • Preimplantasjons genetisk screening (PGD) i utlandet Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Lovverket § Lov om humanmedisinsk bruk av bioteknologi m.m. (Bioteknologiloven) • Godkjent virksomhet – rapporteres årlig til Helsedirektoratet • Ufrivillig barnløse som lever i et langvarig parforhold (2 år eller mer) • ICSI: tillatt i en prøveperiode fra høsten 1995 • PESA/TESA/TESE: prøveordning fra 2004 • Sæddonasjon tillatt (men ikke lenger anonym sæddonor – siden 2005) • Lesbiske par kan behandles (siden 2009) • Oppbevaring av frosne embryo i opptil 5 år (tidligere 3 år) • PGD nemd • Eggdonasjon, surrogati, behandling av enslige og preimplanatasjons genetisk screening (PGS) forbudt Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Assistert befruktning + Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret MEIOSEN • Bare i eggstokken (oocyttene) og i testikkelen (spermiene) • Fullføring av meiosen kan ta mange år (opptil 50 år) • En runde med DNA replikasjon og to celledelinger • Fire haploide datterceller som er genetisk forskjellig fra morcellen OOGENESEN Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret SPERMATOGENESEN • 1. Spermatocytogenesen: spermatogonia til spermatocytt • 2. Meiose: spermatocytt til spermatid • 3. Spermiogenese: spermatid til spermatozoa: -Spermatozoa frigis inn i tubuli lumen - Spermiemodningen fortsetter i epididymis i 2 uker • Mitose i tidlig fosterstadiet • Meiose I: begynner i fjerde mnd i fosterstadiet, stanser i Profase I ved 20 uker • Pause i opptil 50 år • Etter puberteten: LH↑, fullføring av meiose I, 1. pollegme (oocytt modning) • Meiose II: fullføring av meiose II etter (og bare etter) fertilisering av en spermie (oocytt aktivering), 2.pollegeme Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret SPERMIOGENESE Spermatocytogenese + spermiogenese = spermatogenese (≈74 days) Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret DAG 0: SÆDANALYSE SÆDPREPARERING – Swim up Behandlingsforsøk IVF/ICSI • Dag 0: sædanalyse, sædpreparering, egguttak (ovum pick up = OPU), inseminering (IVF/ICSI) • Dag 1: bedømmelse av befruktning • Dag 2 – 5: vurdering av embryokvalitet og utvelgelse av embryo til tilbakesetting av livmor (ET) • Dag 2 – 5: ET • Dag 0 – 5: Kryopreservering (frys) av egg (oocytter), befruktede egg (zygoter), embryo, blastocyster • Analyserer konsentrasjon og motilitet • Preparerer sædprøver med bevegelige spermier • Swim up: sæd på bunnen av reagensglass med medium over i varmeskap (37 °C) – ca 45min - 1 time • Beste svømmerne øverst, de døde på bunnen • Naturlig • Fjerne sædplasma - hindrer kapasitering samt fjerning av prostaglandiner som kan forårsake kontraksjoner i livmor Bioteknologirådet Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret DAG 0: SÆDPREPARERING – gradient sentrifugering • Sæd på toppen • Sentrifugeres gjennom flere lag medium med ulik tetthet • Beste sædcellene på bunnen • Grums og andre celler over • Sædprøver med få sædceller • Kapasitering Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Kapasitering • • • • • Kapasitet til å bindes til og penitrere oocytten Økning i membranens fluiditet Hyperaktiv bevegelse Ca 6 timer, 37 - 39 °C Fjerner epididymale og seminal plasma proteiner rundt spermiene • Follikkelvæsken kan forårsake kapasitering • Akrosomreaksjon: 1) ytre akrosomale membraner smelter sammen med plasmamembranen på hodet til spermien 2) Akrosomale granuler brytes ned; frigir lysiner 3) Plasmamembranen på spermiehodet og oocyttens plasmamembran fusjonerer Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Preparert sæd kan benyttes til…. IVF/ICSI: DAG 0: egguthenting (OPU = ovum pick up) • Intrauterin inseminering (IUI): Indikasjon: mild mannlig faktor, ukjent årsak til fertilitet • In vitro fertilisering (IVF): kvinnelig/ukjent årsak, mild mannlig faktor • Intracytoplasmisk spermieinjeksjon (ICSI): mannlig faktor, tidligere forsøk med lav/ingen befruktning IVF • Forbereder skåler med medium dagen før • Follikkelvæske med egg (oocytt) • Observeres i et mikroskop av embryolog ca 100 μm i diameter • Antall egg (gjennomsnittlig 8 stk) • Skylling • NB: temperatur! Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret ICSI: Modenhet oocytter DAG 0: Kvalitet/modenhet oocytter • Modne oocytter for å fertiliseres • IVF: kompaktheten av cumulus celler rundt egget (cumulus oophorus) • ICSI – eggene må vurderes om modne (MII) Oocytt • Fjerne cumuluscellene rundt egget- denudering • Legges i HYASE • Pipeteres inn og ut av denuderings pipette PV 1.PB ZP GV CYTOPLASMA MII OOLEMMA Cumulusceller GV = germinal vesikkel MI MI = metafase I Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret MII = metafase II ZP = Zona Pellucida ICSI: OOCYTTKVALITET • Cytoplasma (vakuoler, mørkt, lyse flekker) • Unormal størrelse • Zona pellucida • Perivitillin-rommet (PV) • 1.pollegeme • Modenhet Dag 0: ICSI = intracytoplasmatisk spermieinjeksjon Normal Unormal vakuole Stort PV-rom Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Dag 0: IVF • Modne egg (MII) • Immobiliserer en spermie – morfologisk normal, svømmer godt • Inn i egget, suger ut litt cytoplasma, oolemma breakage • Avleverer spermie ved oolemma på motsatt side • Unngå å stikke rett under pollegemet • Bedømmes dag 1 for befruktning 1.pollegemet = PB spindel Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Sperm – oocytt sammensmelting • Setter til 50 000 – 100 000 preparerte spermier til hvert egg i fertiliseringsmedium • Flere proteiner i zona pellucida involvert • Avhengig av temperatur, pH og [Ca2+] • Endringer i intracellulært Ca2+ i oocytten – fullfører meiose II • Befrukter egget selv, gjerne i løpet av 1-2 t • Må ha cumulusceller • Denuderes på dag 1 for å se befruktning Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret DAG 1: FERTILISERING - ZYGOTE Kortikal reaksjon Sjekker fertilisering 16 – 19 timer etter inseminering/mikroinjeksjon Gjennomsnittlig 60 -70% av oocyttene • Frigjøring av kortikale granuler rett under zona pellucida • Indusert av Ca 2+ • Hindrer polyspermi ved endringer i zona pellucida (blir hard) • Spermiekjernen går inn i oocytten og utvikles til mannlig pronucleus (forkjerne) 1PB 2PB 1PN 2PN ZP Ikke fertilisert 0 pronuclei = PN, 1PB Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret 2PB ZP Fertilisert = zygote 2PN, 2PB Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Dag 1/Dag 2: EMBRYOUTVIKLING DAG 1: FERTILISERING • Early cleavage 25 -27 timer etter inseminering/mikroinjeksjon: 2 celler – økt graviditets – og implantasjonsrate (Lundin et al., 2001) • Dag 2: 44 – 48 timer etter inseminering: 2 – 6 celler; 4 celler foretrekkes (Ziebe et al., 1997) ZP ZP Nucleolar precursor bodies 2PB 1PN 3PN 2PB ZP 1 ZP 2 4 1 1PN, 2PB 3 PN, 2PB Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret 3 2 Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Dag 5: EMBRYOUTVIKLINGBLASTOCYST Dag 3/dag 4: EMBRYOUTVIKLING • Dag 3: 64 – 72 timer etter inseminering: 4 – 10 celler; 8 celler foretrekkes, morula • Dag 5: blastocyst; ca 100 celler, inner cell mass (foster), trophectoderm (placenta) og blastocoel (væskefylt rom). Tynn zona pellucida. • Hatching: Trophectoderm cellene kommer ut av zona pellucida. • Dag 4: morula: ≈ 16 celler. Kompaksjon: tight junctions og desmosomer holder cellene tett sammen 2 ZP 6 7 12 3 ICM ZP BL BL 13 8 8 4 11 10 2 5 4 1 1 TE 3 5 7 9 6 TE ICM ZP ZP Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret EMBRYOMORFOLOGI – delingshastighet Antall blastomerer: «Ikke for sent, ikke for raskt» • Dag 1: early cleavage • Dag 2: 4 celler • Dag 3: 8 celler • Synkronisert deling – (2,4,8,16….) • Dag 4: morula • Dag 5: blastocyst/ekspandert blastocyst Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Hatching ICM = inner cell mass TE = trophectoderm BL = blastocoel Morula Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Antall blastomerer dag 2 og dag 3 25 % 20 % 15 % 10 % Implantasjonsrate 5% 0% 2 celler 3 celler 4 celler >4 celler Ziebe et al, Human Reprod., 1997 Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret EMBRYOMORFOLOGI - fragmentering • Økende grad av fragmentering korrelerer med aneuplodi (Hnida et al., 2004) • Økende grad av fragmentering korrelerer negativt med graviditets- og implantasjonsrater (Ziebe et al., 1997) • Kan inneholde kromosomer (Chavez, et al., 2012) • Svært ofte sett i humane embryo (75 %) EMBRYOMORFOLOGI – blastomerstørrelse • Ujevne blastomerer korrelerer med sannsynlighet for aneuploidi (Hardarson et al, 2001) • Ujevne blastomerer har økende grad av multinukleære blastomerer og lavere implantasjonsrate (Hardarson et al., 2001) •Kan endres gjennom celleutviklingen Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret EMBRYOMORFOLOGI – antall kjerner • Èn synlig kjerne i hver blastomer • Multinukleære blastomerer: binukleære, multinukleære, mikronukleære Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Blastomerer med èn kjerne og multinukleære blastomerer • Dess flere blastomerer med èn synlig kjerne, jo høyere graviditetsrate (Palmstierna et al., 1998) • Multinuklære blastomerer korrelerer med kromosomale avvik (Hardarson et al., 2001) • Embryo med multinukleære blastomerer er assosiert med lavere implantasjons-, graviditets- og fødselsrate (Van Royen et al., 2003) nuclei nuclei nuclei Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret BLASTOCYSTMORFOLOGI • Størrelse (ekspandert) • Inner cell mass (ICM): antall celler og kompaksjon • Trophectoderm (TE): struktur og antall celler • ZP: tynn TE MORFOLOGI- system ICM TE BLASTOCOEL ICM ZP Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Morfokinetikk • Time-lapse + morfologi • Innebygd mikroskop i en inkubator (stabil temperatur og pH) • Bilde hvert 5 - 20 min, 6 ulike plan • Hele embryoutviklingen fra inseminering til transfer • Oppdager dynamiske prosesser (fragmentering, antall kjerner) • Oppdager unormale celledelinger (direkte eller reverserte delinger) Ziebe et al., 2003 Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Time lapse Dag 2, 3 eller 5: TRANSFER • Embryoet/blastocysten legges i transfer – skål med medium • Suges opp i et kateter vha sprøyte • Sprøytes inn i livmoren • Kateteret sjekkes etterpå! Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Dag 0, 1, 2, 3 eller 5, 6: FRYS • • • • Oocytter: MII (medisinsk grunnlag) Zygoter: 2 PN Embryo: dag 2 eller dag 3 Blastocyster: dag 5 eller dag 6 • Sæd – kreftbehandling/lagring • Ovarialvev – kreftbehandling (Nasjonalt senter OUS) – transplanteres tilbake • Slow freeze eller vitrifisering Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret FRYS • Fryseprosessen: vann i cellene, øker i størrelse ved isdannelse, cellene sprekker, vann i cellene ut, frysemedium inn som hindrer isdannelse, lagres i strå/ampuller i flytende nitrogen (- 196°C) eller nitrogendamp • Slow freeze: sakte nedfrysning, lav konsentrasjon frysemedium, sakte økning i konsentrasjon, toksisk, maskin • Vitrifisering: høy konsentrasjon av frysemedium, rask nedfrysning, rett i flytende nitrogen glass-struktur, toksisk, manuelt • Embryo/blastocyster kan lagres i opptil 5 år Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret TIN Dag -1 evt Dag 0 : TESA/PESA • Tineprosessen: frysemedium ut, væske fra mediumet inn i cellene igjen til normal størrelse • Minst 50% av et embryos blastomerer (celler) må overleve • Oppbygging av livmorslimhinnen • Naturlig eller substituert syklus • Ingen spermier i ejakulatet • TESA = testikulær sperm aspirasjon • PESA = percutanøs epidymal sperm aspirasjon • Moser/kutter opp tråder av vev med spermier • Bevegelige eller ikke-bevegelige spermier • ICSI Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret IVM = in vitro modning • Umodne egg (GV) • Follikler: 2 – 10 mm, ledende follikkel 10 mm • Dyrkningsmedier til MII – befruktning • Polycystisk ovarie syndrom (PCOS) • Østrogen og progesteron • Ikke helt utviklet metode Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret PGD = Preimplantasjons genetisk diagnostikk • Alvorlig genetiske sykdommer med stor fare for overføring til eventuelle barn • Maternelle og paternelle sykdommer • Vevstype – stamcelle donor for søsken med alvorlig, arvelig sykdom • Blastomerer eller trofektoderm-celler • Mosaikker • Biopsi – genetisk analyse – seleksjon og transfer uaffektert embryo/blastocyst • PGD-nemd • Preimplantasjons genetisk screening (PGS) er forbudt i Norge Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret Framtidsutsikter i laboratoriet Kom gjerne på besøk - • Nye ikke-invasive metoder til å bedømme embryokvalitet (time-lapse, metabolomics, granulosaceller…) • PGS versjon II • Fryse alle embryo – ET i tin syklus • Oocyttfrys på sosialt grunnlag Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
