Fungos no trato respiratório de equinos

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
PAULA BITTENCOURT VAGO
FUNGOS DO TRATO RESPIRATÓRIO DE EQUINOS:
DESTAQUE PARA O ISOLAMENTO DE ESPÉCIES DE CANDIDA
NÃO-ALBICANS
FORTALEZA
2012
1
FUNGOS DO TRATO RESPIRATÓRIO DE EQUINOS: UM
NÃO-ALBICANS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para a obtenção do grau de mestre em Ciências
Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros,
herbívoros, onívoros e aves.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Co-Orientadora: Profa. Dra. Rossana de Aguiar Cordeiro
FORTALEZA
2012
2
FUNGOS DO TRATO RESPIRATÓRIO DE EQUINOS: UM
NÃO-ALBICANS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para a obtenção do grau de mestre em Ciências
Veterinárias.
Aprovada em: 03/07/2012.
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________________
Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Universidade Estadual do Ceará
Orientador
__________________________________________________
Profa. Dra. Rossana de Aguiar Cordeiro
Universidade Federal do Ceará
Examinadora
__________________________________________________
Prof. Dr. José Mário Girão Abreu
Universidade Estadual do Ceará
Examinador
__________________________________________________
Dra. Débora Castelo Branco de Souza Collares Maia
Universidade Federal do Ceará
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES/PNPD
Examinadora
3
À minha mãe, Ruth, por sempre ter sido a minha melhor amiga,
maior companheira e incentivadora, e por estar presente
em todos os momentos da minha vida.
4
“Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,
qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim.”
(Chico Xavier)
5
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Faculdade de Veterinária, da
Universidade Estadual do Ceará.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio
financeiro.
Ao Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM), da Universidade Federal do Ceará.
Ao professor Marcos Fábio Gadelha Rocha pela orientação, dedicação, ensinamentos, apoio e
cobranças, visando sempre o aprimoramento dos seus orientados.
À professora Rossana de Aguiar Cordeiro, pela orientação, ensinamentos, paciência,
disponibilidade, pelas palavras de incentivo e confiança.
À Professora Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante, pelos ensinamentos.
Ao Professor José Júlio Costa Sidrim, pelos alicerces do Centro Especializado em Micologia
Médica.
Ao Professor André Jalles Monteiro, pela sua capacidade estatística.
A todos os colegas do CEMM que dividiram comigo as alegrias, sofrimentos e a busca pelo
conhecimento nessa incrível jornada da pós-graduação. Um agradecimento especial a Kylvia
Rocha de Castro e Silva, Lucas Pereira de Alencar, Francisca Jakelyne de Farias Marques e
Débora Castelo Branco de Souza Collares Maia.
À Sabrina Tainah da Cruz Silva e ao Carlos Eduardo Cordeiro Teixeira pelo apoio
incondicional tanto no desenvolvimento do projeto como nas viagens de coleta e, além de
tudo, pela amizade sincera.
À Terezinha de Jesus Santos Rodrigues, ao Daniel Teixeira Lima e à Monalisa Cunha, por
todo o suporte proporcionado para a realização de nossas pesquisas.
À Adriana Sales Albuquerque, secretária do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias, da Universidade Estadual do Ceará, pela atenção e disponibilidade.
À minha mãe, Ruth Ribeiro Bittencourt, pelo amor incondicional, companheirismo, paciência
e por ser o meu exemplo de vida!
Ao Artur Fonseca, pelo amor, pela cumplicidade, paciência e por estar ao meu lado em todos
os momentos.
Aos meus tios, Ester Bittencourt e Marcos Licurgo, meus segundos pais, e Janaína
Bittencourt, minha prima-irmã, por estarem, mesmo a distância, compartilhando seu amor,
carinho e apoio.
6
Aos meus queridos amigos Goethe Carvalho, Lúcia Fernandes, Alaíde Poti, Ana Carolina
Soares pelo apoio emocional.
Aos meus amigos de quatro patas: meu gato Saddan (in memorian), minha gata Jujuba, meus
cavalos Prinz Royal e Mahamed, por me mostrarem sentimento puro e leal, e por sempre me
lembrar da escolha da minha profissão.
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RESUMO
Há muitos trabalhos abordando sobre patógenos bacterianos e virais que acometem o trato
respiratório de equinos. No tocante aos fungos, entretanto, os estudos são limitados. Dessa
forma, o objetivo inicial desta pesquisa foi identificar Candida spp. isoladas da cavidade nasal
de equinos e determinar a sensibilidade in vitro destas leveduras ante a anfotericina B,
fluconazol e itraconazol. Ademais, foi realizada uma investigação sorológica para
histoplasmose e coccidioidomicose. Para a obtenção de Candida spp. foram coletadas
amostras da cavidade nasal rostral e caudal de 97 equinos, escolhidos aleatoriamente, no
Estado do Ceará, Nordeste do Brasil, por meio do uso de swabs de algodão, os quais eram
acondicionados em solução salina acrescida de cloranfenicol. As leveduras obtidas foram
identificadas por métodos manuais, como características macro e micromorfológicas, cultura
em meio cromogênico CHROMagar-Candida e perfil bioquímico, e, excepcionalmente, pelo
método automatizado VITEK 2. Dessa forma, foram recuperados 56 isolados de Candida
spp., provenientes de 35 equinos (36,08%), sendo 18 (32,14%) C. famata, 14 (25%) C.
parapsilosis, 12 (21,42%) C. guilliermondii, 11 (19,64%) C. tropicalis e 1 (1,78%) C.
pelliculosa. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) foram determinadas de acordo com
o documento M27-A3, como descrito pelo CLSI. As CIMs variaram de 0,03125 a 1 µg/mL
para anfotericina B; de 0,03125 a >16 µg/mL e 0,125 a >64 µg/mL para itraconazol e
fluconazol, respectivamente, sendo observadas resistências para fluconazol e itraconazol em
isolados de C. tropicalis (n=3) e C. guilliermondii (n=1). Por fim, o teste sorológico foi
realizado em 177 cavalos saudáveis dos municípios de Fortaleza, Eusébio, Caucaia,
Jaguaribe, Sobral e Santa Quitéria, no Estado Estado do Ceará, mediante a técnica de
imunodifusão dupla com kit comercial para Coccidioides spp. e Histoplasma capsulatum.
Todas as amostras apresentaram, no entanto, resultado negativo para histoplasmose e
coccidioidomicose. Em suma, os dados demonstram um predomínio de Candida não-albicans
na microbiota da cavidade nasal de equinos, inclusive com isolados resistentes a antifúngicos
e que os equinos, investigados mediante a técnica de imunodifusão dupla, não são bons
animais sentinela para histoplasmose e coccidioidomicose nesta região geográfica.
Palavras-chave: Equinos, Candida spp., antifúngicos, imunodifusão, histoplasmose,
coccidioidomicose.
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ABSTRACT
There are several studies focusing on bacterial and viral pathogens which attack the
respiratory tract of horses. However, regarding fungi, the studies are limited. Thus, the initial
goal of this research was to identify Candida spp. isolated from the nasal cavity of equines
and to determine the in vitro susceptibility of these yeasts against amphotericin B, fluconazole
and itraconazole. In addition, a serological investigation for histoplasmosis and
coccidioidomycosis was held. In order to obtain Candida spp., samples from the caudal and
rostral nasal cavity of 97 equines were collected through use of cotton swabs, which were put
up in saline solution plus chloramphenicol. These animals were randomly chosen, in the State
of Ceará, Northeastern Brazil, Yeast obtained was identified by manual methods (such as
macro and micro morphological features, chromogenic culture media CHROMagar Candida,
biochemical profile) and exceptionally through VITEK 2 automated system. Hence, 56
Candida spp. isolates from 35 horses (36.08%), of which 18 (32.14%) C. famata, 14 (25%) C.
parapsilosis, 12 (21.42%) C. guilliermondii, 11 (19.64%) C. tropicalis and 1 (1.78%) C.
pelliculosa. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) values were determined according to
the document M27-A3, as described by CLSI. The MICs ranged from 0.03125 to 1 µg/mL for
amphotericin B; from 0.03125 > 16 µg/mL and from 0.125 to >64 µg/mL for itraconazole and
fluconazole, respectively, and resistance to fluconazole and itraconazole was observed in
isolates of C. tropicalis (n = 3) and C. guilliermondii (n = 1). Finally, the serological test was
held in 177 healthy horses in the cities of Fortaleza, Eusébio, Caucaia, Jaguaribe, Sobral and
Santa Quitéria, in the State of Ceará, through immunodiffusion with commercial kit for
Coccidioides spp. and Histoplasma capsulatum. However, all samples showed negative
results on the double immunodiffusion test for histoplasmosis and coccidioidomycosis. In
short, the data show the predominance of non-albicans Candida in the microbiota of the nasal
cavity of equines, including some cases of in vitro resistance to azole derivatives, and that
horses, investigated through double immunodiffusion, are not good sentinels for
histoplasmosis and coccidioidomycosis in this geographical region.
Keywords:
Horses,
Candida
spp.,
antifungal,
imunodiffusion,
histoplasmosis,
coccidioidomycosis.
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LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA:
Figura 1: a) Placa contendo ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol,
demonstrando o crescimento de colônias de Candida spp....................................... 22
Figura 1: b) Tubo contendo ágar batata, apresentando crescimento de colônias de
Candida spp.
22
Figura 1: c) Microcultivo de C. albicans em ágar fubá acrescido de Tween 80.
Observa-se a presença de clamidoconídio (seta)...................................................... 22
Figura 1: d) Placa contendo ágar cromogênico, permitindo a identificação
presuntiva de Candida albicans (seta verde), C. krusei (seta preta) C.
parapsilosis (seta rosa) e C. tropicalis (seta azul).................................................... 22
Figura 2: Microdiluição em placas de 96 poços em formato de U .......................... 24
Figura 3: Distribuição geográfica do Histoplasma capsulatum no Brasil. Estados
marcados em vermelho demonstraram isolamento do fungo em animais................ 27
Figura 4: a) Macromorfologia de Histoplasma capsulatum em sua forma micelial
– Cultivo em ágar batata dextrose à 28ºC (20 dias), apresentando colônias
brancas e algodonosas. b) Micromorfologia de H. capsulatum em sua forma
micelial à temperatura de 28ºC, apresentando hifas hialinas, finas e septadas com
macroconídios tuberculados, característicos do fungo (seta). Exame direto da
colônia com lactofenol azul algodão..................................
29
Figura 5: a) Biópsia de tecido pulmonar corado com prata metenamina Grocott
demonstrando leveduras ovais típicas do Histoplasma capsulatum. b) Aspecto
microscópico de H. capsulatum corado pelo Giemsa a partir de creme
leucocitário: visualização de células leveduriformes intracelulares (seta)............... 32
Figura 6: Distribuição geográfica do Coccidioides posadasii. Estados marcados
em vermelho são endêmicos para coccidioidomicose. Áreas coloridas
correspondem a municípios do Estado do Ceará com casos confirmados da
doença ...................................................................................................................... 36
Figura 7: a) Macromorfologia de Coccidioides spp. em agar batata dextrose,
mostrando colônias brancas com textura algodonosa. b) Micromorfologia de
Coccidioides spp. revelando hifas maduras contendo artroconídios (seta)
espaçados por células disjuntoras. Montagens tipo lâmina-lamínula com
lactofenol azul algodão............................................................................................. 38
Figura 8: Vegetação característica de caatinga, em Jaguaribe, cidade com casos
humanos confirmados............................................................................................... 39
Figura 9: a) Aspecto micromorfológico da forma parasitária de Coccidioides spp.
em tecido pulmonar de camundongos, visualizado em exame direto com KOH
10%. Histopatológico corado por PAS (b) e Grocott prata metenamina (c), com
observação de endosporos liberados de esférula rompida................................
42
10
Figura 10: Padrão da reação positiva no teste de Imunodifusão em gel de
agarose. Poço 1 – Antígeno; 2 e 5 – Soros controles positivos; 3,4,6 e 7 – Soros
para teste .................................................................................................................. 43
Figura 11: Reação de imunodifusão para detecção de anticorpos contra
Histoplasma capsulatum. Poço central – Antígeno; Nos poços 1 e 4 – Soros
controle positivos: onde são visualizadas linhas de precipitação M e H.................. 44
11
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1:
Tabela 1 - The numbers of various yeast species isolated from anatomical
locations from upper respiratory tract of in 97 clinically normal horses………… 65
Tabela 2 - The minimal inhibitory concentrations (MIC) of amphotericin B,
itraconazole and fluconazole effective in vitro against 56 isolates of Candida
spp. isolated from two anatomical sites of clinically normal horses. Data in
brackets represents the number of isolates for the indicated MIC value…………. 66
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LISTA DE ABREVIADURAS E SIGLAS
AIDS – Acquired immunodeficiency syndrome
BHI – Brain Heart Infusion
CFU – Colony-forming unit
CIM – Concentração Inibitória Mínima
CLSI – Clinical Laboratory Standards Institute
GMS – Grocott prata metenamina
HE – Hematoxilina Eosina
HIV – Human immunodeficiency virus
ID – Imunodifusão dupla em gel de agarose
KOH – Hidróxido de Potássio
NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards
PAS – Ácido periódico de Schiff
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................
2. REVISÃO DE LITERATURA ...........................................................................
2.1 Infecções respiratórias vs. Equinocultura .....................................................
2.2 Candida spp. .................................................................................................
2.2.1 Aspectos Históricos ..............................................................................
2.2.2 Ecoepidemiologia gênero Candida.......................................................
2.2.3 Aspectos Clínicos .................................................................................
2.2.4 Diagnóstico ...........................................................................................
2.2.5 Avaliação da sensibilidade antifúngica in vitro....................................
2.3 Histoplasmose ..............................................................................................
2.3.2 Aspectos Epidemiológicos ...................................................................
2.3.3 Biologia do fungo Histoplasma capsulatum ........................................
2.3.4 Patogenia e Aspectos Clínicos .............................................................
2.3.5 Diagnóstico ...........................................................................................
2.4 Coccidioidomicose .......................................................................................
2.4.2 Aspectos Epidemiológicos ...................................................................
2.4.3 Biologia do fungo Coccidioides sp.......................................................
2.4.4 Patogenia e Aspectos Clínicos .............................................................
2.4.5 Diagnóstico ...........................................................................................
2.5 Diagnóstico sorológico da Histoplasmose e Coccidioidomicose ..............
3. JUSTIFICATIVA ................................................................................................
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS...............................................................................
5. OBJETIVOS ........................................................................................................
5.1 Objetivo Geral ..............................................................................................
5.2 Objetivos Específicos ...................................................................................
6. CAPÍTULO 1.....................................................................................................
7. CONCLUSÕES....................................................................................................
8. PERSPECTIVAS.................................................................................................
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................
10. ANEXOS ...........................................................................................................
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1. INTRODUÇÃO
A equinocultura aumentou nos últimos anos devido, em virtude da mudança na
utilidade dos equinos, de animais de lida no campo para animais atletas. Diversas
modalidades de esportes equestres estão presentes no Estado, como vaquejada, prova de três
tambores, corrida e hipismo. Por conseguinte, com o aumento do investimento nesses
animais, cresceu também a preocupação com a sua saúde, além de um maior convívio entre
humanos e equinos. No tocante a saúde, várias enfermidades causam diminuição de
performance e tornam os animais inaptos a desenvolver atividades atléticas, entre as quais, as
infecções respiratórias.
As infecções fúngicas no trato respiratório são pouco estudadas em equinos, quando
comparadas a agentes bacterianos e virais, o que ocasiona, muitas vezes, agravamento de
quadros clínicos em decorrência de tratamentos indevidos. Assim, torna-se cada vez mais
importante o conhecimento sobre os fungos que podem causar doenças em equinos, como,
por exemplo, Candida spp., Coccidioides spp. e Histoplasma capsulatum var. capsulatum.
O gênero Candida é composto por leveduras que vivem como comensais na
microbiota de homens e animais. Normalmente, não causam dano aos seus hospedeiros,
entretanto, quando expostos a fatores de risco, que causam desequilíbrio em suas barreiras
física, química ou imunológica, ocorre a infecção chamada de candidíase.
O fungo dimórfico Histoplasma capsulatum var. capsulatum é o agente causador da
histoplasmose clássica, a qual já foi descrita em diversos países. A doença acomete
principalmente o homem e algumas espécies animais como cães, gatos, equídeos, roedores,
marsupiais. Exibe, como forma infectante, microconídeos presentes no solo, os quais são
inalados pelo hospedeiro, que pode ou não mostrar sintomas. A sintomatologia varia desde
pacientes assintomáticos, presença de uma simples tosse a quadros respiratórios graves e,
ainda, desenvolvimento da forma disseminada da doença.
Os fungos dimórficos Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii são causadores
da coccidioidomicose, micose sistêmica exclusiva do Continente Americano. A primeira
espécie é comumente isolada de Vale de São Joaquim, na Califórnia, Estados Unidos, sendo
exclusivo daquela região. Enquanto isso, o C. posadasii se estende às outras regiões
endêmicas do Continente Americano, do sul dos Estados Unidos até a Argentina. Atualmente,
no Brasil, a coccidioidomicose é considerada endêmica nos Estados da Bahia, Ceará,
Maranhão e Piauí. No Ceará, já foram relatados casos humanos em diversos municípios,
como Aiuaba, Arneiroz, Boa Viagem, Catunda, Independência, Jaguaribe, Parambu, Santa
15
Quitéria, Sobral e Solonópole. O homem e diversas espécies animais são suscetíveis à
infecção, a qual ocorre por inalação de artroconídeos presentes no solo contaminado. A
sintomatologia clinica é variável desde pacientes assintomáticos a quadros respiratórios
severos, além da forma disseminada.
Por fim, considerando o crescimento da equinocultura como prática esportiva e lazer e,
consequentemente, o maior contato do homem com esta espécie animal, aliado à escassez de
dados acerca dos fungos que podem ser encontrados nestes animais, com este estudo, buscouse contribuir com esta temática, particularmente identificando as espécies de Candida isoladas
da cavidade nasal de equinos, bem como realizando inquérito sorológico para as micoses
endêmicas histoplasmose e coccidioidomicose, nas quais o pulmão é o sítio primário de
infecção.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Infecções Respiratórias versus Equinocultura
O elevado número de animais, associado à necessidade de produção crescente, leva a
um aumento na ocorrência de enfermidades. Dentre as que afetam os equinos, o segundo
grupo com maior prevalência são as associadas ao trato respiratório (SILVA, VARGAS,
2006). Doenças respiratórias e anormalidades das vias áreas são uma das principais razões
para queda de desempenho no cavalo atleta ou até mesmo afastamento das suas atividades
esportivas, resultando em perdas econômicas (RICHARD et al., 2010). De acordo com
Davidson e Martin (2003), de 40 a 42% dos cavalos de corrida com baixo desempenho
demonstraram alguma forma de infecção respiratória.
A mucosa do trato respiratório superior é muitas vezes o principal ponto de entrada de
agentes patogênicos e desempenha importante papel na patogênese de várias infecções
respiratórias (VANDEKERCKHOVE et al., 2009). Diversos patógenos podem ocasionar
quadros clínicos respiratórios em equinos, sendo infecções virais e bacterianas as mais
comuns na clínica médica (AINSWORTH, BILLER, 2000). No tocante a infecções virais, os
patógenos mais comumente envolvidos são herpes vírus equino do tipo 1 (EHV1), herpes
vírus equino do tipo 4 (EHV4) e o vírus influenza (HARLESS, PUSTERLA, 2006). Já nas
infecções bacterianas, as espécies Streptococcus equi e Streptococcus zooepidemicus são
comumente encontradas (VANDEKERCKHOVE et al., 2009). O S. zooepidemicus é
frequentemente isolado em casos clínicos de pneumonia e pleuropneumonia, sendo uma das
bactérias mais importantes, associada com doença inflamatória das vias aéreas em cavalos
jovens (BARQUERO et al., 2010).
Os patógenos fúngicos, por sua vez, são negligenciados no diagnóstico dessas
enfermidades. A pneumonia fúngica como entidade primária não é comum, porém, quando
presente, os microrganismos Candida spp., Histoplasma capsulatum e Coccidioides spp.,
devem ser investigados. O diagnóstico precoce de problemas respiratórios é essencial para o
rápido retorno dos animais aos treinos, como também para prevenção de complicações
secundárias que, por fim, podem encerrar prematuramente a carreira do animal ou levar ao
óbito (AINSWORTH, BILLER, 2000).
17
2.2. Gênero Candida
2.2.1 Aspectos Históricos
O gênero Candida foi descrito pela primeira vez por Langenbeck, em 1839, ao
observar lesões orais em pacientes com tifo, contudo, ele erroneamente descreveu o
microrganismo como agente etiológico da doença. Em 1842, David Gruby definiu a patogenia
da candidíase oral, classificando seu agente etiológico como pertencente ao gênero
Sporotrichum. Após detalhado estudo sobre o microrganismo, Berg, em 1846, estabeleceu
definitivamente sua relação com a ocorrência de candidíase oral. Em 1853, Charles Robin
denominou esse microrganismo de Oidium albicans (SIDRIM, ROCHA, 2004; ODDS, 1998).
Em 1861, Zenker relatou o primeiro caso de infecção cerebral por disseminação hematógena
associada a Candida. Em 1862 e 1875, Mayer e Haussmann, respectivamente, descreveram
casos de candidíase vaginal (ODDS, 1998).
Anos mais tarde, em 1890, Zopf renomeou o agente para Monilia albicans. Somente
em 1923, entretanto, o microrganismo passou a ter a denominação utilizada até os dias atuais,
quando Berkhout transferiu a espécie para o gênero Candida e criou a espécie Candida
albicans (SIDRIM, ROCHA, 2004). Em 1954, durante o VIII Congresso Europeu de
Botânica, o gênero foi definitivamente descrito e aceito como Candida, baseado nos estudos
realizados por Robin (1853), Zopf (1890) e Berkhout (1923) (ODDS, 1988).
2.2.2 Ecoepidemiologia do gênero Candida
Taxonomicamente, as leveduras do gênero Candida pertencem ao reino Fungi, filo
Ascomycota, subfilo Saccharomycotina, classe Saccharomycetes e ordem Saccharomycetales
(NCBI Taxonomy, 2011).
Segundo De Hoog et al. (2000), levedura é um termo descritivo para qualquer fungo
capaz de se reproduzir por brotamento, tendo como unidade funcional o blastoconídio. Alguns
representantes do gênero são pleomórficos, os quais possuem a capacidade de se apresentarem
sob diferentes formas morfológicas como pseudo-hifas, hifas verdadeiras, blastoconídios e
clamidoconídios, de acordo com as condições às quais estão submetidos (OLIVEIRA, 2006).
Candida sp. são consideradas comensais da microbiota associada à pele e mucosas do
trato urogenital, gastrointestinal e respiratório superior do homem e de várias espécies
animais (SKORIC et al., 2011; BENTUBO et al., 2010; CLEFF et al., 2005), havendo estudos
visando à identificação da microbiota em diversos taxa animais, como aves (BRILHANTE et
al., 2010), répteis (NARDONI et al., 2008), crustáceos (BRILHANTE et al., 2011),
18
mamíferos (SKORIC et al., 2011; BENTUBO et al., 2010; CARREGARO et al., 2010;
BRITO et al., 2009b; KECK et al., 2009; COSTA et al., 2008), incluindo equinos (PIRRONE
et al., 2011; BATISTA et al., 2008; REILLY, PALMER, 1994; PUGH et al., 1986).
Entre as 25 espécies de leveduras patogênicas consideradas emergentes, 20 são do
gênero Candida. Em humanos, as espécies mais frequentemente encontradas são C. albicans,
C. parapsilosis, C. tropicalis e C. glabrata (PALACIO et al., 2009). Já em animais, além
dessas espécies, são isoladas com frequência as espécies C. guilliermondii, C. famata, C.
krusei, C. kefir (BRILHANTE et al., 2011; CARREGARO et al., 2010; BRILHANTE et al.,
2010; BRITO et al., 2009b; CLEFF et al., 2005).
Os estudos da microbiota fúngica direcionada às espécies de Candida pouco
descrevem a cerca de mamíferos saudáveis quando comparados com relatos em humanos
(WROBEL et al., 2008). Cleff et al. (2005) analisaram a microbiota vaginal de 14 cadelas
sadias durante dez meses e encontraram influência pela fase do ciclo reprodutivo. As espécies
isoladas foram C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. kefyr, C. albicans, C. glabrata e C.
krusei. Brito et al. (2009b) relataram uma incidência maior de C. tropicalis e C. parapsilosis
em relação a C. albicans, em 23 isolados proveniente de 203 cães saudáveis onde foram
estudados a mucosa oral e vaginal bem como a região perianal e prepúcio. Bentubo et al.
(2010) relataram elevada taxa de isolamento de C. albicans no pelame de 21 cães sadios que
viviam em regime domiciliar.
Além de cães, existem trabalhos relatando o isolamento de Candida spp. como parte
da microbiota de outras espécies animais. Costa et al. (2008) evidenciaram elevada taxa de
isolamento de C. albicans em bovinos leiteiros. Em um estudo de microbiota de pele em
suínos saudáveis, Carregaro et al. (2010) também encontraram alta prevalência de C.
albicans.
Em equinos, Pirrone et al. (2011) analisaram microbiota das mucosas orofaríngeas e
retal de 21 potros sadios e 39 potros doentes. Não houve diferença estatística entre os grupos,
sendo a espécie C. albicans a mais isolada. A prevalência de C. albicans em populações
animais, todavia, ainda não é bem conhecida (WROBEL et al., 2008).
Nas aves, o isolamento de leveduras do gênero Candida é mais comum, quando
comparado às outras classes animais. Diferentemente dos mamíferos, os relatos de isolamento
de Candida spp. em aves sadias são frequentes, principalmente, com origem em espécimes
obtidos do trato gastrintestinal (MANCIANTI et al., 2001). Brilhante et al. (2010) obtiveram
92 isolados de Candida spp. provenientes da cavidade oral, inglúvio e cloaca de calopsitas,
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sendo encontradas seis espécies: Candida albicans, C. famata, C. glabrata, C. krusei, C.
parapsilosis, C. tropicalis.
Infecções por Candida spp. em mamíferos são pouco frequentes. Nos últimos anos,
contudo, foi observado aumento considerável de relatos com diferentes manifestações clínicas
e acometendo diversas espécies (BRITO et al., 2009a). De acordo com a literatura, a Candida
albicans é a espécie mais frequentemente envolvida em casos de candidíases em animais
(BENTUBO et al., 2010; COSTA et al., 2008). Outras espécies, contudo, são citadas como
agentes dessas infecções como C. tropicalis e C. parapsilosis (CARREGARO et al., 2010;
BRITO et al., 2009a; KOBAYASHI, 2008) além de C. guilliermondii (MUELLER et al.,
2002).
2.2.3 Aspectos clínicos
Em geral, esses microrganismos não causam nenhum dano aos seus hospedeiros,
entretanto, podem se tornar patogênicos quando ocorrem alterações nas barreiras físicas,
químicas e imunológicas culminando em enfermidade denominada de candidíase. Os fatores
predisponentes a infecções em animais incluem: idade, doenças autoimunes, Diabetes
Mellitus, uso prolongado de antibióticos e animais imunocomprometidos em razão da terapia
prolongada com corticocosteróides (SKORIC et al., 2011; BRITO et al., 2009b).
Nos mamíferos, os sítios anatômicos mais acometidos são pele e anexos, ouvido, trato
urinário, trato gastrointestinal e sistema reprodutor (SKORIC et al., 2011; WROBEL et al.,
2008; JADHAV; PAL, 2006;).
Cães podem apresentar diversas manifestações clínicas de candidíase tais como
dermatomicose com alopecia, eritema, crostas e úlceras (MORETTI et al., 2004; MUELLER
et al., 2002), estomatite (JADHAV, PAL, 2006) além de candidemia (SKORIC et al., 2011).
Santos e Marin, (2005), informaram que a candidíase é a terceira maior causa de mastite em
bovinos no Brasil.
Em equinos, mais especificamente em potros, as espécies de Candida são patógenos
oportunistas que podem ocasionar ulcerações gastroesofágicas, diarreias, meningites,
onfaloflebites e, menos frequentemente, infecções sistêmicas (PIRRONE et al., 2011;
REILLY, PALMER, 1994). Em cavalos adultos, C. famata foi associada a um quadro de
artrite séptica, enquanto C. albicans foi isolada de quadros de ceratites e de endometrite em
éguas (RILEY et al., 1992; PUGH et al., 1986). De acordo com Aguiar et al. (2005), a espécie
C. albicans permanece como microrganismo mais preocupante da endometrite equina.
20
2.2.4 Diagnóstico Laboratorial
A identificação das espécies de Candida baseia-se nas suas características fenotípicas,
tais como macro e micromorfologia, além das características bioquímicas, como assimilação e
fermentação de carboidratos, assimilação de nitrogênio e prova da enzima urease (BRITO,
2005).
O exame direto consiste na confecção de lâminas oriundas de amostras clínicas, com
hidróxido de potássio, um clarificante que permite melhor visualização das estruturas
fúngicas. A seguir realiza-se o processamento das amostras em meios de cultura clássicos,
como ágar Sabouraud, ágar Sabouraud com cloranfenicol e ágar Sabouraud acrescido de
cloranfenicol e cicloeximida (SIDRIM, ROCHA, 2004).
Em meios de cultivo, as colônias crescem bem dentro de 48 horas, com temperatura
entre 25º e 37ºC (KOEHLER et al., 1999). As culturas de Candida demonstraram
características macroscópicas semelhantes para todas as espécies, como colônias lisas, úmidas
ou secas, de coloração branca ou creme (DE HOOG et al., 2000) (Figura 1a e 1b). Dessa
forma, são necessárias técnicas que permitam melhor visualização das estruturas fúngicas,
prova do microcultivo, como também testes bioquímicos, para, assim, realizar a diferenciação
das espécies (KOEHLER et al., 1999). A utilização de meio cromogênico é a próxima etapa
na identificação de Candida spp., o qual tem como objetivo identificar colônias mistas, além
de realizar um diagnóstico presuntivo rápido (ARAÚJO et al., 2005; QUINDÓS et al., 2001).
(Figura 1c).
As características micromorfológicas são observadas após realização de microcultivo
em placas de Petri com ágar fubá ou ágar arroz acrescido de Tween 80 (Figura 1d). Para
muitas espécies de Candida, este teste permite a identificação definitiva, uma vez que são
formadas estruturas específicas, como hifas e pseudo-hifas, dispostas em padrões
característicos para cada espécie (MILAN, ZAROR, 2004; DE HOOG et al., 2000).
Em muitos casos, a identificação pode não ser determinada por meio das
características macro e micromorfológicas, sendo necessária a realização de testes
bioquímicos, como a assimilação e fermentação de carboidratos, a assimilação de nitrogênio e
a prova da enzima urease (BRITO et al., 2009b, KOEHLER et al., 1999).
Os métodos automatizados de identificação de microrganismos
têm sido
desenvolvidos nos últimos anos e, atualmente, estão sendo usados em diversos laboratórios de
microbiologia médica. Estes sistemas permitem uma identificação precisa e mais rápida de
leveduras clinicamente relevantes, melhorando a qualidade e a eficácia do cuidado ao
paciente. O VITEK 2 (BioMérieux Vitek, Hazelwood, France) tem demonstrado ser um
21
instrumento confiável para a identificação de leveduras e, por isso, é o método automatizado
mais comumente utilizados nos laboratórios de todo o mundo (ALBERTINE et al., 2006).
Fonte: CEMM 2012
Fonte: CEMM 2011
a
b
c
d
Fonte: CEMM 2009
Fonte: CEMM 2010
Figura 1: a) Placa contendo ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol, demonstrando o
crescimento de colônias de Candida spp.
b) Tubo contendo ágar batata, mostrando crescimento de colônias de Candida spp.
c) Placa contendo ágar cromogênico, permitindo a identificação presuntiva de Candida
albicans (seta verde), C. krusei (seta preta) C. parapsilosis (seta rosa) e C. tropicalis (seta
azul).
d) Microcultivo de C. albicans em ágar fubá acrescido de Tween 80. Observa-se a presença
de clamidoconídio (seta).
22
2.2.5 Avaliação da sensibilidade antifúngica in vitro
Com a emergência da epidemia de AIDS na década de 1980, surgiu a necessidade do
desenvolvimento de testes precisos de sensibilidade a antifúngicos in vitro, principalmente em
razão do aumento no número de casos de candidíase nos indivíduos portadores dessa
síndrome, os quais, muitas vezes, não eram responsivos ao tratamento antifúngico instituído
(JOHNSON, 2008).
Nas últimas décadas, a incidência de micoses sistêmicas cresceu drasticamente. Isto
decorre do aumento no número de indivíduos em risco, principalmente pacientes
transplantados, com câncer e pacientes infectados com o vírus da imunodeficiência humana. É
observado ainda um aumento no número de cepas resistentes aos derivados azólicos
(SABATELLI et al., 2006). Com base nesses fatos, fica claro que o conhecimento do perfil de
sensibilidade a drogas antifúngicas de determinada região é de grande importância para o
estabelecimento de condutas terapêuticas e profiláticas adequadas.
Em 1985, o comitê da Área de Micologia do Clinical Laboratory Standards Institute
(CLSI), então conhecido como National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS), publicou o seu primeiro relatório, no qual foram exibidos os resultados de um
pequeno estudo colaborativo. Constatou-se que 20% dos laboratórios membros da instituição
realizavam testes de sensibilidade a agentes antifúngicos, na maioria das vezes, com Candida
spp., empregando o método de diluição em caldo, e obtinham resultados de concentração
inibitória mínima (CIM) discrepantes. Assim, decidiu-se desenvolver e padronizar uma
metodologia reprodutível e exequível para laboratórios de rotina. Em 1997, após extenso
trabalho de padronização, foi aprovada a utilização dos métodos de microdiluição (documento
M27-A) para a determinação da sensibilidade de Candida spp. a antifúngicos, especificando
seus pontos de corte. Em 2002, a Norma M27-A2 padronizou as faixas de referência de CIM
24 e 48 horas, para drogas previamente estabelecidas (NCCLS, 2002). Em 2009, foi
publicado o documento M27-A3, que traz como principal mudança a alteração na
percentagem de leitura em relação aos derivados azólicos, onde a leitura para concentração
inibitória mínima mudou de 80% de inibição para 50% em relação ao crescimento fúngico
(CLSI, 2008).
O teste de microdiluição em caldo é realizado em placas acrílicas estéreis, com 96
poços em formato de U, e consiste na exposição de um inóculo definido de um determinado
microorganismo a concentrações conhecidas das drogas testadas, sendo possível observar o
efeito destas sobre o crescimento fúngico. A leitura final determina a menor concentração da
23
droga, capaz de inibir o crescimento do microorganismo, denominada de concentração
inibitória mínima (CIM) (CLSI, 2008). (Figura 2).
Fonte: CEMM 2007
Figura 2: Microdiluição em placas de 96 poços em formato de U.
O teste de sensibilidade tem como objetivo prever uma resposta in vivo próxima
daquela expressa in vitro. Vale salientar, todavia, que nas infecções fúngicas muitos fatores,
além do perfil de sensibilidade in vitro, influenciam a resposta clínica, como sítio de infecção,
imunidade do hospedeiro, farmacocinética da droga e tratamento correto realizado pelo
paciente (HOSPENTHAL et al., 2004). Relatos na literatura, porém, indicam que os
microrganismos que se mostram sensíveis na técnica de microdiluição respondem ao
tratamento em 90% dos casos, e que infecções por microrganismo resistentes à resposta são
de 60% (REX, PFALLER, 2002).
O grupo do qual se participa, no Ceará, com frequência, tem avaliado a sensibilidade
in vitro de cepas de Candida spp. isoladas de animais. Brito et al. (2007) desenvolveram teste
em cepas isoladas de cães e identificaram resistência a cetoconazol, fluconazol e itraconazol
em dois isolados de C. albicans e três de C. tropicalis. Sidrim et al. (2010), em estudo com
calopsitas, observaram fenômeno de resistência a fluconazol e itraconazol em isolados de C.
albicans. Brilhante et al. (2011) constataram o mesmo fenômeno em cepas de C. albicans
isoladas de camarões.
24
2.3 Histoplasmose
2.31 Aspectos Históricos
Em 1906, o patologista norte americano Samuel Taylor Darling descobriu a
histoplasmose, quando estudava material de necropsia de um adulto nativo da Martinica,
trabalhador da obra do canal do Panamá, que veio a óbito em decorrência de um quadro febril
desconhecido. É por isso, também, denominada doença de Darling. Ao estudar o
microrganismo, pensou tratar-se de um novo protozoário encapsulado que parasitava
histiócitos e nomeou-o de Histoplasma capsulatum. Em 1908, Darling observou mais dois
casos fatais da doença (DANIEL, BAUL,2002).
O agente etiológico, inicialmente designado como protozoário, foi considerado fungo
pelo patologista brasileiro Henrique da Rocha Lima, ao examinar o material de Darling no
ano de 1912. A comprovação definitiva desse fato ocorreu em 1934, quando o patologista
Willian De Monbreau obteve cultura, em sua fase saprofítica, de material de paciente do
primeiro caso diagnosticado em vida. Além de caracterizar o agente definitivamente como
fungo, ainda determinou seu caráter dimórfico (WANKE, LAZÉRA, 2004).
Até 1945, a histoplasmose era considerada doença rara, fatal e de transmissão
desconhecida. Esse conceito foi modificado depois dos trabalhos de Palmer (1945) e Christie
e Peterson (1945), que demonstraram, mediante testes com histoplasmina, que a
histoplasmose era uma doença benigna, cosmopolita e de transmissão respiratória (WANKE,
LAZÉRA, 2004; TORRES-RODRÍGUEZ et al., 1993)
O primeiro isolamento de H. capsulatum do solo foi realizado por Emmons em 1949.
Em 1951, Ajello e Zeidberg associaram o fungo a solos enriquecidos com fezes de morcegos
e aves (AINSWORTH, 1986).
Em 1939, Almeida e Lacaz diagnosticaram a histoplasmose no Brasil pela primeira
vez. O fungo foi isolado com base em fragmento de biopsia de uma lesão de
cromoblastomicose. Dois anos depois, os mesmos autores isolaram pela segunda vez H.
capsulatum, sendo este isolado do escarro de um paciente de um sanatório para tuberculose
(WANKE, LAZÉRA, 2004).
2.3.2 Aspectos Epidemiológicos
A histoplasmose é uma micose sistêmica cosmopolita ocasionada pelo fungo
dimórfico Histoplasma capsulatum var. capsulatum (FERREIRA, BORGES, 2009). A doença
é endêmica em varias regiões de clima tropical e temperado, sobretudo no Continente
25
Americano (SAHEKI et al., 2008). Nos Estados Unidos, é considerada endêmica nas regiões
de Ohio e Mississipi (QUIST et al., 2011). Na América do Sul, é prevalente na Venezuela,
Equador, Paraguai, Uruguai, Argentina (GUIMARÃES et al., 2006), Peru (FERREIRA,
BORGES, 2009) e Colômbia (MUÑOZ et a., 2010). Microfocos de infecções em humanos e
animais são relatados em países com pouca ou nenhuma casuística anteriormente descrita,
como Canadá, Espanha, Itália e Japão (NAVASQUÉS et al., 2011; MAVRAPOLOU et al.,
2010, KOBAYASHI et al., 2009; TYRE et al., 2007).
Apesar de a doença ser predominante no Continente Americano, numerosos casos
esporádicos são relatados em outras partes do mundo, provavelmente em razão do trânsito
internacional entre áreas endêmicas e não endêmicas (QUIST et al., 2011).
No Brasil, antes do surgimento da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), a
histoplasmose era raramente diagnosticada. Do final da década de 1980 em diante, com o
advento da AIDS, foram diagnosticados centenas de casos, principalmente na forma
disseminada da doença, fazendo com que essa micose passasse a ter lugar de destaque nas
doenças fúngicas em humanos (FERREIRA, BORGES, 2009). Já foram relatados surtos e/ou
microepidemias nos Estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo, Minas Gerais,
Mato Grosso (FERREIRA, BORGES, 2009), Rio Grande do Sul (SEVERO et al., 2001),
Santa Catarina, Distrito Federal, Paraíba, Amazonas, Bahia (OLIVEIRA et al., 2006) e Ceará
(PONTES et al., 2010; DAHER et al., 2007) (Figura 5). A taxa de prevalência, em humanos,
foi avaliada, em diversas regiões do País, por intermédio do teste de reação dérmica com
histoplasmina e revelou variações entre 2,6 a 93,2% (LEIMANN et al., 2005), sendo o Estado
do Rio de Janeiro o responsável pelo maior número de microepidemias relatadas (AIDÉ,
2009). No Ceará, Daher et al.(2007) realizaram um estudo com 378 pacientes HIV positivos,
no qual 164 dos pacientes (43%) apresentava histoplasmose disseminada associada a AIDS.
A histoplasmose pode afetar humanos de qualquer idade, sexo e raça. Pacientes com
extremos de idade, no entanto, portam maior risco de desenvolver a forma aguda da doença
(OLIVEIRA et al., 2011; KNOX, HAGE, 2010). Nas últimas décadas, apareceu como um
patógeno oportunista em pacientes com distúrbios de imunidade celular, tais como
transplantados, doentes imunodeprimidos, pacientes em corticoterapia prolongada e,
principalmente, pacientes acometidos com a síndrome da imunodeficiência adquirida (CURY
et al., 2001)
Além do homem, vários animais, domésticos e silvestres, podem ser acometidos pela
histoplasmose. Já foram relatados casos em cães (CORDEIRO et al., 2011a; TYRE et al.,
2007; FERNANDES et al., 2003), gatos (BRILHANTE et al., 2012; MAVRAPOLOU et al.,
26
2010; CARNEIRO et al., 2005), roedores e marsupiais (NAIFF et al., 1996; SILVAVERGARA et al., 2001), equídeos (NUNES et al., 2006; RICHTER et al., 2003; JOHNSTON
et al., 1995; REZABEK et al., 1993), gazelas (FARIÑAS et al., 2009), bovinos, suínos
(OLIVEIRA et al., 2011) e aves (QUIST et al., 2011). Os quirópteros, além de contribuírem
para criar um ambiente favorável à proliferação do fungo, também são suscetíveis à infecção
(OLIVEIRA et al., 2011; WANKE & LAZÉRA, 2004). Dias et al. (2010) isolaram o fungo
em morcegos da área urbana de São Paulo. As aves, normalmente, não se infectam em razão
da sua alta temperatura corporal (WANKE & LAZÉRA, 2004).
Mesmo com o aparecimento de novos casos em animais no Brasil, dados
epidemiológicos são escassos e sua prevalência é desconhecida. Já foram isolados, entretanto,
H. capsulatum de espécies diversas, como em animais silvestres na Amazônia (NAIFF et al.,
1996), roedores e marsupiais no Rio de Janeiro (ZANCOPÉ-OLIVEIRA, WANKE, 1986),
marsupiais em Minas Gerais (SILVA-VERGARA et al., 2001), gatos em Minas Gerais
(CARNEIRO et al., 2005) e no Ceará (BRILHANTE et al., 2012). (Figura 3).
Figura 3: Distribuição geográfica do Histoplasma capsulatum no Brasil. Estados marcados em
vermelho demonstraram isolamento do fungo em animais e os Estados realçados em preto
relatam casos clínicos em humanos. Fonte: Bittencourt 2012.
A identificação da doença em animais domésticos e silvestres, naturalmente
infectados, é uma ferramenta importante para monitorar a ocorrência do H. capsulatum em
um determinado ambiente, já que os animais podem atuar como marcadores epidemiológicos
(animais sentinelas) para a presença do microrganismo naquela região e indicar a existência
27
de fontes comuns de infecção aos homens e animais (CANTEROS et al., 2010; ZANCOPÉOLIVEIRA, WANKE, 1986).
2.3.3 Biologia do fungo Histoplasma capsulatum
Histoplasma capsulatum é a forma anamórfica do Ajellomyces capsulatum que
pertence ao reino Fungi, filo Ascomycota, classe Eurotiomycetes, ordem Onygenales e
família Ajellomycetaceae (NCBI, Taxonomy, 2011).
O H. capsulatum é um fungo dimórfico, pois apresenta duas formas morfológicas que,
para sua modificação, dependem de fatores nutricionais e da temperatura (OLIVEIRA et al.,
2011). No ambiente, o fungo cresce na sua forma filamentosa e, uma vez no hospedeiro,
ocorre a conversão para a forma de levedura (MUÑOZ et al., 2010).
A forma filamentosa cresce em temperaturas abaixo de 35ºC, em meios de cultura
adequados, ou no solo (GUIMARÃES et al., 2006). Macroscopicamente se caracterizam por
colônias de coloração branco-algodonosa, e microscopicamente são observadas hifas hialinas
septadas com 1-2 µm de diâmetro, além das suas estruturas de reprodução assexuada, os
microconídios e macroconídios tuberculados. Estes são largos com parede espessa, cobertos
por projeções espiculadas, com 7 a 15 µm de diâmetro. Os microconídios são ovais e
pequenos, com 2 a 5 µm de diâmetro, e se caracterizam por ser a forma infectante do fungo
(OLIVEIRA et al., 2011; FERREIRA, BORGES, 2009) (Figura 6). No hospedeiro ou em
meios de cultura adequados a 37 ºC, o H. capsulatum exibe-se como pequenas leveduras
ovaladas com 3 a 5 µm de diâmetro e podem ser visualizadas no interior dos macrófagos
(FERREIRA, BORGES, 2009).
O H. capsulatum é um saprófito de solos com alto teor de nitrogênio, encontrado em
áreas contaminadas com fezes de morcegos e aves (KNOX, HAGE, 2010; CURY et al.,
2001), onde é encontrado na forma de micélio. Geralmente, o microrganismo pode ser isolado
em amostras de solos de ambiente abrigados, como cavernas, construções abandonadas,
galinheiros e árvores (KAUFFMAN, 2009; WANKE, LAZÉRA, 2004). Andreu & Machin
(1992) conseguiram, entretanto, isolar o microorganismo do solo em Cuba, em áreas abertas
com incidência direta do sol, sítio considerado improvável por vários autores. Tais dados
suscitam importantes questionamentos epidemiológicos sobre a procedência de casos ligados
a origens desconhecidas, como os provenientes de grandes cidades. A profundidade em que o
H. capsulatum se encontra no solo é variável, mas foi demonstrado que a camada mais
28
superficial, até 30 cm, favorece o crescimento do fungo, possivelmente devido à maior
aeração (KAUFFMAN, 2009).
a
Fonte: CEMM 2011
b
a
Figura 4: a) Macromorfologia de Histoplasma capsulatum em sua forma micelial – cultivo em
ágar batata dextrose a 28ºC (20 dias), mostrando colônias brancas e algodonosas. b)
Micromorfologia de H. capsulatum em sua forma micelial a 28ºC, apresentando hifas
hialinas, finas e septadas com macroconídios tuberculados, característicos do fungo (seta).
Exame direto da colônia com lactofenol azul algodão.
2.3.4 Patogenia e Aspectos clínicos
A infecção ocorre por meio da inalação de microconídios presentes no solo
contaminado. Estes, ao atingirem os alvéolos pulmonares, são fagocitados pelos macrófagos
alveolares e em seu interior convertem para a forma parasitária leveduriforme, ocasionando
pneumonite focal. Mediante a circulação linfática, chegam aos linfonodos mediastinais
formando o complexo pulmonar ganglionário semelhante ao complexo de Ghon na
tuberculose. Desde esse estágio, o fungo pode se disseminar por via hematógena para diversos
órgãos (KNOX, HAGE, 2010; AIDÉ, 2009; GUIMARÃES et al., 2006; WANKE, LAZÉRA,
2004). Essa fase acontece antes da imunidade específica se desenvolver. Após duas a três
semanas, ocorre resposta celular mediada por células T que, por meio de várias citocinas, irão
ativar os macrófagos, os quais adquirem capacidade de lisar as leveduras. Se o indivíduo for
imunocompetente, esse tipo de resposta imune ocasiona a cura da infecção primária;
entretanto, se a imunidade celular do individuo for deficiente, os microrganismos continuam
viáveis no interior dos macrófagos e causam infecção progressiva (KNOX, HAGE, 2010;
FERREIRA, BORGES, 2009; KAUFFMAN, 2009).
29
Apesar de a transmissão por via respiratória ser a mais frequente, existem relatos que
sugerem infecção oral em animais. Kerl (2003) fez essa observação em virtude de muitos cães
portarem somente sintomatologia gastrointestinal, sem nenhum envolvimento no trato
respiratório. Nunes et al. (2006) examinaram uma égua com quadro clínico de desconforto
abdominal com perda de peso progressiva durante duas semanas. Após diversos exames e
tratamento, o animal veio a óbito. Com base nos achados de necropsia e nos exames
realizados no material coletado, diagnosticaram histoplasmose. A égua não revelou nenhum
sinal de comprometimento de outros órgãos como pulmões ou rins. Baseados em relatos de
outros autores, Johnston et al. (1995) e Rezabek et al. (1993), e nos seus achados clínicos e
laboratoriais, os autores sugeriram que a infecção ocorreu pela via oral.
Em humanos o quadro clínico pode variar desde infecções assintomáticas até quadros
graves disseminados (FERREIRA, BORGES 2009). A intensidade dessas manifestações
clínicas está relacionada com a quantidade de microconídeos inalados, virulência da cepa e a
imunidade prévia do indivíduo (MUÑOS et al., 2010; KAUFFMAN, 2009; AIDÉ, 2009;
CURY et al., 2001).
A sintomatologia clínica em animais é variável de acordo com a espécie acometida.
Em cães e gatos, espécies mais comumente infectadas, os sinais clínicos variam de
inaparentes à doença, aguda ou crônica, com resposta granulomatosa no trato respiratório e a
forma disseminada (CORDEIRO et al., 2011a; BRÖMEL, SYKES, 2005), como também
lesões granulomatosas cutâneas (CARNEIRO et al., 2005). A forma disseminada afeta fígado,
baço, trato gastrointestinal, ossos e medula óssea, olhos e pele (BRÖMEL, SYKES, 2005). Os
sintomas incluem inapetência, perda de peso, diarreia, tosse, dispneia, febre e claudicação
(QUIST et al., 2011).
Os relatos de casos em equinos são escassos na literatura, entretanto, os sinais
descritos incluem dispneia, perda de peso, diarreia, colite granulomatosa, placentite, aborto e
ceratite. O fungo foi identificado em diversos órgãos e tecidos como pulmão, fígado, baço,
rim, nódulos linfáticos, intestino delgado, ceco, cólon, medula óssea, cérebro, olhos, placenta
e tecidos fetais (NUNES et al., 2006; RICHTER et al., 2003; JOHNSTON et al., 1995;
REZABEK et al., 1993). Johnston et al. (1995) relataram o único caso de histoplasmose
disseminada em equino até o momento.
30
2.3.5 Diagnóstico
O diagnóstico clínico da histoplasmose é baseado na sintomatologia clínica, exames
radiológicos e aspectos epidemiológicos. O diagnóstico micológico se baseia na identificação
do agente em materiais biológicos, cultura do fungo em meios específicos e exame
histopatológico (AIDÉ, 2009; LEIMANN et al., 2005).
Para o exame direto em lâmina, pode-se utilizar diversas amostras clínicas como
esfregaço de medula óssea, sangue periférico, exsudato de lesões cutâneas ou mucosas,
escarro, fluido de lavado broncoalveolar e líquor, as quais são tratadas a fresco com hidróxido
de potássio (KOH) a 10% para melhor visualização (MUÑOZ et al., 2010; FERREIRA,
BORGES, 2009). Essa técnica, entretanto, tem baixo valor diagnóstico em decorrência da
localização intracelular do microrganismo e seu tamanho pequeno, o que dificulta sua
visualização (MUÑOZ et al., 2010; AIDÉ, 2009).
A utilização de corantes nas amostras propicia um aumento na qualidade da
visualização. Para tanto, podem ser empregados corantes especiais, como prata metenamina
Grocott (GMS), ácido periódico de Schiff (PAS), além do corante hematológico Giemsa
(OLIVEIRA et al., 2011; GUIMARÃES et al., 2006). A coloração permite a visualização das
leveduras localizadas ao redor e no interior dos macrófagos (AIDÉ, 2009). Utilizando o GMS,
o H. capsulatum é visualizado como pequenas leveduras de coloração marrom-escura em
virtude da precipitação dos íons de prata (MUÑOZ et al., 2010); com PAS, apresentam-se
com a coloração vermelha; e com Giemsa, aparecem como massa cromática polar azul em
forma de meia lua (FERREIRA, BORGES, 2009) (Figura 7). Leimann et al. (2005)
consideram a coloração com GMS a melhor técnica, pois permite um melhor contraste, além
de corar células fúngicas refratárias ao PAS.
Os métodos baseados em colorações contêm sensibilidade inferior a 50% e ampla
variabilidade, o que depende da forma clínica da doença, bem como da experiência do
patologista. Portanto, para visualização do fungo na fase de levedura com base em material
biológico, é necessária atenção na identificação em virtude da similaridade da levedura de H.
capsulatum com outros patógenos, como Candida glabrata, Penicillium marneffei,
Pneumocystis (carinii) jiroveci, Toxoplasma gondii, Leishmania sp. e Cryptococcus
neoformans (GUIMARÃES et al., 2006), Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides
brasiliensis (LEIMANN et al., 2005).
Exames histopatológicos são usados frequentemente para o diagnóstico de
histoplasmose. Amostras de sangue periférico podem demonstrar microrganismos
intracelulares em macrófagos e monócitos. Biopsias de medula óssea, contudo, podem ser o
31
método mais rápido de definir um diagnóstico (OLIVEIRA et al., 2011). Aidé (2009) relata
diferenças histológicas encontradas entre pacientes imunocompetentes e imunodeprimidos. O
estudo histopatológico de várias espécies de tecidos, como pulmão, gânglios, fígado e medula
óssea, mostra a presença de granulomas, em organismos imunologicamente competentes ao
passo que, nos imunodeprimidos, é frequente a presença de granuloma frouxo, agregados
linfo-histiocitários ou apenas infiltrado mononuclear.
a
Fonte: Kauffman, 2009.
b
Fonte: Marques, 2009.
Figura 5: a) Biopsia de tecido pulmonar corado com prata metenamina Grocott, demonstrando
leveduras ovais típicas do Histoplasma capsulatum. b) Aspecto microscópico de H.
capsulatum corado pelo Giemsa com base em creme leucocitário: visualização de células
leveduriformes intracelulares (seta).
A cultura é considerada padrão ouro no diagnóstico da histoplasmose (OLIVEIRA et
al., 2011). Para tanto, é necessário que o laboratório esteja equipado com cabine de
biossegurança de nível 3, além de equipe especializada, visto que a manipulação do fungo
pode liberar os microconídios no ambiente (MUÑOZ et al., 2010).
Podem ser utilizados vários meio de cultura para o cultivo do H. capsulatum como
ágar Sabouraud e ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol e cicloeximida (Mycosel®)
(AIDÉ, 2009). A identificação do fungo baseia-se nas características macro e microscópicas
das colônias. Após um período de incubação de seis a 12 semanas, a 25ºC, as colônias
fúngicas se mostram, inicialmente, glabras de coloração branca a bege e, com o tempo,
tornam-se filamentosas, algodoadas e amarronzadas. Microscopicamente, caracterizam-se por
hifas hialinas delgadas e septadas com micro e macroconídios em diferentes fases de
desenvolvimento (OLIVEIRA et al., 2011; GUIMARÃES et al., 2006). Os macroconídios são
32
estruturas características do H. capsulatum, sendo a base da identificação de gênero e espécie
(MUÑOZ et al., 2010).
Para a confirmação do diagnóstico da cultura, é necessária a conversão do H.
capsulatum para sua forma leveduriforme (LEIMANN et al., 2005). Podem ser utilizados
vários meios, como ágar sangue, ágar infusão-cérebro-coração (BHI), acrescido de cisteína
(OLIVEIRA et al., 2011; GUIMARÃES et al., 2006), e também ágar batata acrescido de
cloranfenicol (BURTELOW et al., 2009). A cultura deve ser incubada a temperatura entre 3537ºC. Após a conversão, observam-se colônias glabras de coloração branco-amareladas que
microscopicamente se mostam como leveduras ovais de paredes espessas (OLIVEIRA et al.,
2011). O H. capsulatum, porém, não se converte facilmente e depende de condições
nutricionais especiais, temperatura adequada, além das características fisiológicas da própria
cepa (GUIMARÃES et al., 2006).
A cultura traz limitações relacionadas à forma clínica da doença, especificamente em
casos subagudos, agudos e de sintomatologia clínica leve; e também relacionada ao tempo
necessário para identificação do agente etiológico, fato que pode ocasionar atraso na
introdução da medida terapêutica específica e piorar o quadro clínico (OLIVEIRA et al.,
2011; MUÑOZ et al., 2010; GUIMARÃES et al., 2006).
Trabalhos de revisão recentes relatam muitos casos de histoplasmose em diferentes
regiões no Brasil, verificando-se o aumento do número de casos humanos da doença. Isso
decorre do maior conhecimento dos médicos em relação aos aspectos clínicos e
epidemiológicos da micose e também dos últimos avanços no diagnóstico laboratorial
(WANKE, LAZÉRA, 2004). Apesar disso, o esforço em elucidar aspectos epidemiológicos
desta doença tem sua importância no aumento do número de pacientes imunodeprimidos que
contraem a enfermidade a cada dia no Brasil.
2.4 Coccidioidomicose
2.4.1 Aspectos históricos
O primeiro caso de coccidioidomicose foi descrito na Argentina, em 1892, por
Alejandro Posadas, residente de Medicina, ao examinar Domingo Escurra, de 36 anos, o qual
portava lesões cutâneas crônicas. Ao examinar biopsias das lesões, observou estruturas
semelhantes a protozoários (NEGRONI 2008). Em 1894, Thome e Rixford relataram os dois
primeiros casos nos Estados Unidos em emigrantes dos Açores que trabalhavam no Vale de
33
São Joaquim. Em 1896, Rixford e Gilchrist, após exame das biopsias desses pacientes,
detectaram semelhança com o agente encontrado por Posadas e o identificaram como um
protozoário da ordem Coccidia, Classe Sporozoa denominado Coccidioides immitis
(HIRSHMANN, 2007).
Em 1900, Ophüls e Moffitt descobriram a natureza fúngica do agente, quando
examinaram biopsias das lesões e pus, procedente do terceiro paciente norte-americano. Após
observarem a regularidade do aparecimento do “mofo branco” nos cultivos, realizaram
inoculação experimental desses cultivos em cobaias e, assim, demonstraram que o agente era
um fungo, e ainda descreveram seu caráter dimórfico. Cinco anos depois, Ophüls definiu a via
de infecção da doença como sendo a via respiratória (DEUS FILHO, 2009; NEGRONI 2008).
Até 1929, a doença era conhecida somente na forma disseminada, com caráter raro e
fatal (COX, MAGEE, 2004). Este fato mudou quando o estudante de Medicina Harold Chope,
em experimentos no laboratório de Ernest Dickson, contaminou-se acidentalmente com o
fungo, desenvolvendo um quadro de pneumonia com eritema nodoso, do qual de recuperou
plenamente mudando o status da doença para benigna e autolimitada (AMPEL, 2009;
HIRSHMANN, 2007).
Em 1932, Steward e Meyer, isolaram o Coccidioides immitis de amostras de solo
coletadas próximo a uma fazenda em que haviam morrido quatro filipinos acometidos de
coccidioidomicose grave caracterizando sua natureza geofílica (NEGRONI, 2008).
Em 1937, Dickson revelou outros casos da forma benigna da doença, caracterizada por
sintomas pulmonares agudos e eritema nodoso, semelhantes ao quadro de Chope, denominado
Febre do Vale. O termo coccidioidomicose foi então proposto por Dickson para todas as
formas infecciosas causadas por Coccidioides immitis (AMPEL, 2009; COX, MAGEE, 2004).
Por volta de 1940, Smith et al. realizaram estudo sistemático sobre a epidemiologia da
coccidioidomicose no Vale do São Joaquim, mediante testes intradérmicos com coccidioidina
e observação dos pacientes, no qual estabeleceram o período de incubação da infecção, sua
incidência estacional e comprovaram a técnica de prova cutânea. Continuaram seus estudos
durante a Segunda Guerra Mundial, demonstrando o valor prognóstico da intradermorreação,
como também características clínicas da enfermidade e a predisposição racial dos
descendentes de africanos e filipinos a apresentarem formas mais graves da doença
(NEGRONI, 2008).
Em meados da década de 1940, foram relatados casos da doença também em animais
domésticos e silvestres, principalmente em cães (SMITH et al., 1948). Na década de 1950, foi
observado o primeiro caso de coccidioidomicose cutânea em um embalsamador. Estudos
34
sobre a evolução clínica e os aspectos sobre a aquisição da doença permitiram que
pesquisadores afirmassem que a forma cutânea da doença seria rara (ESPINEL-INGROFF,
1996).
Até o final da década de 1970, o Brasil era considerado área indene para a
coccidioidomicose. O primeiro caso da doença no País foi descrito por Gomes et al. (1978)
em paciente natural de Pirapiranga, região do semiárido do Estado da Bahia. Um ano depois,
Vianna et al. (1979) descreveram o segundo caso autóctone da doença em paciente originário
da cidade de Floriano, no Estado do Piauí (NEGRONI, 2008).
O primeiro surto epidêmico de coccidioidomicose ocorreu em 1991, no Município de
Oeiras, Estado do Piauí, onde três indivíduos e oito cães demonstraram quadro respiratório
agudo após participarem de uma caçada a tatus (WANKE et al., 1999). Os autores
descreveram o primeiro relato do acometimento de cães por essa enfermidade no País, além
da primeira investigação sorológica em animais, bem como o primeiro isolamento de C.
immitis de amostras de solo no Brasil. Em 1995, foi relatado o segundo surto de
coccidioidomicose, ocorrido no Município de Aiuaba, região sudoeste do Estado do Ceará, e
acometeu quatro homens e dois cães após caça a tatus (SILVA et al., 1997; SIDRIM et al.,
1997). Apenas em 1998, após descrição destes surtos, o Brasil foi incluído no mapa de
distribuição geográfica da coccidioidomicose (PAPPAGIANIS, 1998).
No Estado do Ceará, o primeiro caso da doença foi descrito em 1995, em um paciente
natural de Jaguaribara (KUHL et al., 1995). Cordeiro et al. (2010) afirmaram que, até o ano de
2010, foram diagnosticados 19 casos da doença no Estado, além do caso descrito por Kuhl et
al. (1995).
Em 2000, foi publicado estudo em tatus, realizado no Estado do Piauí, identificando-se
a contaminação dos mesmos por C. immitis, hoje denominado C. posadasii nesta região
(EULÁLIO et al., 2000). Em 2012, Cordeiro et al. relataram infecção natural em morcegos
por C. posadasii, no Estado do Ceará.
2.4.2 Aspectos epidemiológicos
A coccidioidomicose é uma infecção sistêmica exclusiva do Continente Americano,
entre as latitudes 40ºN e 40ºS, ocasionada por dois fungos dimórficos do gênero Coccidioides:
C. immitis e C. posadasii (AMPEL, 2009). O C. immitis é isolado no Vale do São Joaquim na
Califórnia, Estados Unidos enquanto o C. posadasii prevalece nas outras áreas endêmicas do
Continente Americano, desde o sul dos Estados Unidos até a Argentina (DEUS FILHO, 2009,
35
PARISH & BLAIR, 2008), incluindo Honduras, Guatemala, Colômbia, Venezuela, Bolívia,
Paraguai e Brasil (CORDEIRO et al., 2011b; NEGRONI, 2008).
Embora os primeiros casos brasileiros tenham sido descobertos no final da década de
1970, o Brasil só foi incluído no mapa da distribuição geográfica da doença em 1998, após
relato dos primeiros surtos da forma pulmonar aguda nos Estados do Piauí e Ceará
(PAPPAGIANIS, 1998). Atualmente, a coccidioidomicose é considerada endêmica nos
Estados da Bahia, Piauí, Maranhão e Ceará (TOGASHI et al., 2009). No Estado do Ceará já
foram relatados casos em diversas cidades, como Aiuaba, Arneiroz, Parambu, Jaguaribe,
Solonópole, Independência, Boa Viagem, Catunda, Santa Quitéria e Sobral (CORDEIRO et
al., 2010). (Figura 8).
Legenda:
Jaguaribe
Sonolópole
Aiuaba
Arneiroz
Parambu
Independência
Boa viagem
Catunda
Santa Quitéria
Sobral
Figura 6: Distribuição geográfica do Coccidioides posadasii no Nordeste do Brasil. Estados
marcados em vermelho são endêmicos para coccidioidomicose. Áreas coloridas
correspondem a municípios do Estado do Ceará com casos confirmados da doença. Fonte:
Bittencourt 2012.
No Nordeste do Brasil, a caça a tatus (Dasypus novemcinctus) é uma importante
atividade de risco associada à doença, já que nessa região essa é uma atividade recreativa. Em
razão da perseguição dos caçadores, o tatu penetra na sua toca levando a escavação do solo
até a sua captura. Com isso, os humanos e os cães ficam suscetíveis a inalação maciça dos
artroconídeos (COSTA et al., 2001). Eulálio et al. (2000) relataram a infecção natural de tatus
36
no Piauí, sendo esse o único relato cientifico do gênero. Os estudos, contudo, não revelam
claramente a importância do tatu na história natural da doença, definindo se ele realmente
serve de reservatório ou é apenas mais um dos animais suscetíveis à infecção (CORDEIRO et
al., 2011b).
A coccidioidomicose acomete o homem e uma grande variedade de animais, como
bovinos, ovinos, equinos, caninos, felinos, roedores, suínos, antas, lhamas, primatas, golfinho,
leão-marinho (AJITHDOSS et al., 2011; GAIDICI, SAUBOLLE, 2009; SHUBITZ, 2007),
tatu (EULÁLIO et al., 2000) e morcegos (CORDEIRO et al., 2012). Embora seja largo o
espectro de animais que podem ser infectados, o cão parece ser o hospedeiro preferencial após
os humanos (GRAUPMANN-KUZMA et al., 2008). Apesar da faltas de dados
epidemiológicos precisos sobre a incidência da doença em cães, estima-se, que em áreas
endêmicas, esta incidência seja similar à dos humanos (CORDEIRO et al., 2011b).
Por não ser uma doença de notificação obrigatória suas reais prevalência e incidência
não podem ser estabelecidas com precisão. É muito provável que seja subdiagnosticada e que
a sua distribuição geográfica no Brasil se estenda a outros estados nordestinos (DEUS
FILHO, 2009).
As duas espécies são consideradas agentes de bioterrorismo, assim agentes de
biossegurança nível 3, sendo o único grupo fúngico pertencente a Select Agent List of the
Departament of Health and Human Service (DICAUDO, 2006).
2.4.2 Biologia do fungo Coccidioides sp.
Taxonomicamente, as espécies do gênero Coccidioides pertencem ao reino Fungi, filo
Ascomycota, classe Eurotiomycetes, ordem Onygenales, família Onygenaceae, sendo
representado por duas espécies, Coccidioides immitis e C. posadasii. As espécies guardam
características morfológicas muito semelhantes, contudo exibem polimorfismos moleculares e
preferências ecológicas distintas (FISHER et al., 2002). Apesar das diferenças genéticas entre
as espécies, ambas causam infecção, em humanos e animais, e não revelam diferença quanto
às manifestações clínicas e resposta imune do hospedeiro (AMPEL, 2009).
O gênero Coccidioides pode apresentar-se em duas fases - saprofítica e parasitária. Em
condição saprofítica, encontra-se sob a forma filamentosa no solo à temperatura de 25-30°C
ou cultivado em meio de cultura em baixa temperatura, sendo esta a forma infectante do ciclo
biológico dos fungos (SABOULLE et al., 2007; COX, MAGEE, 2004). Na macromorfologia,
as espécies são caracterizadas por um micélio vegetativo com colônias esbranquiçadas de
37
aspecto algodonoso (DEUS FILHO, 2009). Microscopicamente, se mostram como hifas finas,
hialinas, septadas e ramificadas, que originam artroconídios intercalados por células
desprovidas de material citoplasmático, denominadas células disjuntoras (DE HOOG et al.,
2001) (Figura 9). Os artroconídios trazem em suas extremidades restos de parede celular de
células disjuntoras, responsáveis por sua fácil veiculação aérea (SABOULLE, 2007).
Na fase parasitária, nos tecidos do hospedeiro à temperatura de 37°C, os artroconídios
passam por mudanças morfológicas, adquirindo a fase leveduriforme do ciclo biológico do
fungo, caracterizada pela formação de grandes estruturas arredondadas de paredes espessas,
denominadas esférulas, as quais são divididas internamente dando origem a centenas de
endósporos uninucleados (SAUBOLLE, 2007). (Figura 10).
b
a
Fonte: CEMM 2011
Figura 7: a) Macromorfologia de Coccidioides spp. em agar batata dextrose, mostrando
colônias brancas com textura algodonosa. b) Micromorfologia de Coccidioides spp. revelando
hifas maduras contendo artroconídios (seta), espaçados por células disjuntoras. Montagens
tipo lâmina-lamínula com lactofenol azul algodão.
Coccidioides spp. são fungos geofílicos cujo habitat corresponde a ambientes
semiáridos e desérticos, com temperatura média acima de 30ºC e com precipitações escassas
em período limitado (PARISH, BLAIR, 2008; COX, MAGEE, 2004). Estão associados a
solos com pH alcalino (SAUBOLLE et al., 2007; DICAUDO, 2006), com salinidade elevada
(COX, MAGEE, 2004) e com a presença de vegetação xerófita (Figura 10). Estudos
demonstraram isolamento dos fungos entre 10 e 30 cm abaixo da superfície do solo
(LANIADO-LABORIN, 2007).
O crescimento dos fungos no solo é influenciado por diversos fatores, sendo a
umidade um dos mais importantes. O período de chuva aumenta a umidade no ambiente,
38
propiciando o crescimento dos microrganismos competidores e diminuindo o crescimento de
Coccidioides spp. Após o período chuvoso, a evaporação do solo e o aumento da salinidade
inibem o desenvolvimento dos fungos competidores e Coccidioides spp. crescem rapidamente
na sua forma filamentosa. Durante o período da seca, ocorrem a dessecação das hifas e a
formação dos artroconídios infectantes. Estes podem ser liberados no ambiente mediante
distúrbios físicos como ventanias ou outros aspectos climáticos, como também por fatores
antropogênicos, tornando essas estruturas acessíveis à inalação pelos hospedeiros
(KOLIVRAS et al., 2001).
Por esse motivo, a doença tem distribuição geográfica limitada e sua transmissão é
restrita a alguns meses do ano (MORAES, 1998). Cordeiro et al. (2010) demonstraram,
contudo, que a ocorrência de casos humanos de coccidioidomicose no Estado do Ceará é
semelhante durante as estações chuvosas e secas.
Fonte: Bittencourt, 2011.
Figura 8: Vegetação característica de caatinga, em Jaguaribe, cidade com caso de
coccidioidomicose humana confirmado.
2.4.3 Patogenia e Aspectos clínicos
A coccidioidomicose é adquirida pela inalação de artroconídeos infectantes presentes
no solo, onde o fungo cresce saprofiticamente sob a forma filamentosa (DEUS FILHO, 2009).
Após a inalação, os artroconídios conseguem escapar das defesas do organismo do
hospedeiro, em razão do seu tamanho reduzido e alcançam os brônquios terminais (COX,
MAGEE, 2004). Nas 72 horas após a inalação, os artroconídios passam por mudanças
morfológicas, através de invaginações da parede celular e originam as esférulas, as quais,
durante o amadurecimento, também passam por invaginações e múltiplas divisões celulares,
39
originando endósporos em seu interior. Ao atingir a maturidade celular, cada esférula pode
liberar mais de 800 endósporos e, cada endósporo iniciará o desenvolvimento de uma nova
esférula aumentando a população fúngica (PARISH, BLAIR, 2008). Quando atingem o solo,
em condições adequadas, os endósporos crescem na forma filamentosa, garantindo com isso,
a continuidade do ciclo biológico. O ciclo parasítico completo dura entre quatro e seis dias,
dependendo das características de cada cepa (CORDEIRO et al., 2011b).
Embora a infecção por via inalatória seja a via mais comum, infecção por via
percutânea traumática pode ocorrer (SAUBOLLE et al., 2007). Além dessa forma, foi relatada
transmissão da doença por meio de órgão transplantado e um caso de transmissão intrauterina
(GAIDICI, SAUBOLLE, 2009).
A coccidioidomicose não é uma zoonose, entretanto existem dois relatos de
transmissão de animais para humanos: inalação de formas parasitárias do fungo durante a
necropsia de um equino com doença disseminada (KOHN et al, 1992) e por uma mordida de
gato também com a forma disseminada (GAIDICI & SAUBOLLE, 2009).
A severidade da infecção depende da virulência do fungo, espécie envolvida: animal
ou humana, e condição de saúde do hospedeiro (EULÁLIO et al., 2000). Aproximadamente
65% dos humanos que adquirem essa infecção permanecem assintomáticos. Já com relação
aos sintomáticos, a maioria denota manifestações pulmonares, desde um quadro gripal
simples até pneumonia grave e síndrome séptica (TOGASHI, et al. 2009). Os sinais clínicos
normalmente aparecem entre 7 e 21 dias após inalação, e os pacientes apresentam febre, tosse,
desconforto torácico, mal-estar e fadiga (SAUBOLLE et al., 2007). A forma disseminada
pode ocorrer em 5% dos pacientes sintomáticos. Pacientes negros, filipinos, mulheres no
último trimestre de gestação e pacientes imunocomprometidos parecem ter um risco maior de
desenvolver a forma disseminada da doença (SAUBOLLE et al., 2007; DICAUDO, 2006).
Em animais, os cães são mais comumente acometidos e aproximadamente 70% dos
casos são assintomáticos ou subclínicos; contudo a doença pode se mostrar de dois tipos pulmonar ou disseminada, sendo a primeira mais comum e se caracteriza por tosse. Na forma
disseminada, ocorre envolvimento dos ossos, articulações, coração, cérebro, olhos, testículos,
pele, baço, fígado, rim (AJITHDOSS et al., 2011).
Os casos notificados em equinos, tradicionalmente, são graves e, muitas vezes, fatais
(HIGGINS, PUSTERLA, 2006). Geralmente, quando os sintomas clínicos estão presentes,
manifestam-se de forma severa. Os animais podem ter febre, perda de peso crônica, tosse,
taquipneia e o resultado do leucograma demonstra características inflamatórias (HIGGINS et
al., 2007). As formas de apresentação clínica incluem mastite e aborto (STOLTZ et al., 1994;
40
WALKER et al., 1993), pneumonia intersticial com ou sem efusão pleural ou pericardial,
osteomielite, forma cutânea e disseminada. O prognóstico e a efetividade do tratamento
podem variar de acordo com forma e a severidade da infecção (HIGGINS et al., 2007).
Aparentemente, os cavalos têm maiores riscos de desenvolver a forma disseminada da doença
com prognóstico desfavorável (CORDEIRO et al., 2011b).
2.4.4 Diagnóstico
O diagnóstico clínico da coccidioidomicose é difícil, em virtude da frequente
apresentação de sinais e sintomas variados e sem característica definida (AMPEL, 2010). Por
conseguinte, o diagnóstico definitivo de coccidioidomicose ocorre por via do diagnóstico
laboratorial.
O diagnóstico micológico inclui a visualização das esférulas contendo os endósporos
em material infectado (AMPEL, 2010; PARISH, BLAIR, 2008) como escarro, líquido
cefalorraquidiano, exsudato de lesões tegumentares, lavado brônquico, aspirado de lesões
ósseas e linfonodos, entre outros, além da cultura do fungo em meio específico (DEUS
FILHO, 2009). O exame direto pode ser feito como rotina, por meio de material biológico
com preparações do tipo lâmina-lamínula adicionado a hidróxido de potássio (KOH) a 10%,
em que a visualização das esférulas com endósporos confirma o diagnóstico de
coccidioidomicose (Figura 11). A presença de endósporos livres da esférula podem confundir
o examinador, visto que são semelhantes a leveduras das espécies Histoplasma, Cryptococcus
e Candida (SAUBOLLE, 2007). Embora seja de baixo custo e permita o diagnóstico por
micologistas experientes, essa técnica possui baixa sensibilidade (CORDEIRO et al., 2011b).
Exames histopatológicos podem ser utilizados por meio de biopsias de lesões
tegumentares, pulmonares, osteoarticulares, cerebrais ou outros materiais suspeitos. Pode-se
usar diversos corantes, tais como ácido periódico de Schiff (PAS), Grocott prata metenamina
(GMS) e hematoxilina-eosina (HE) (SAUBOLLE et al., 2007) (Figura 11).
A cultura continua sendo padrão ouro para o diagnóstico definitivo da
coccidioidomicose, porém é uma pratica evitada, quando se trata de Coccidioides, em razão
do risco inerente à manipulação de culturas do fungo (SUTTON, 2007; COX, MAGEE,
2004). Se realizada, contudo, deve ser em cabines de biossegurança nível 3 (SAUBOLLE et
al., 2007).
41
Fonte: CEMM 2011
a
b
c
Fonte: CEMM 2011
Figura 9: a) Aspecto micromorfológico da forma parasitária de Coccidioides spp. em tecido
pulmonar de camundongos, visualizado em exame direto com KOH 10%. Histopatológico
corado por PAS (b) e Grocott prata metenamina (c), com observação de endosporos liberados
de esférula rompida.
Para realização do cultivo pode ser utilizada uma variedade de meios, pois
Coccidioides spp. não solicitam exigências nutricionais in vitro: ágar Brain Heart Infusion
(BHI), ágar Sabouraud dextrose, ágar batata dextrose, ágar Sabouraud dextrose com
cicloheximida, ágar Sabouraud dextrose com cicloheximida e cloranfenicol (MURTHY,
BLAIR, 2009). As colônias se desenvolvem entre três a cinco dias, quando incubadas em
temperatura entre 25ºC e 30ºC, mostrando textura algodonosa e coloração branca, com
reverso variando entre branco e marrom (SUTTON, 2007). A visualização microscópica da
colônia é realizada em montagens com lactofenol azul algodão, onde são observadas hifas
finas, hialinas e septadas, contendo artroconídios intercalados por células disjuntoras
(AMPEL, 2010).
2.5 Diagnóstico Sorológico da Histoplasmose e Coccidioidomicose
Em virtude das limitações dos exames micológicos no que se refere a tempo de
identificação do agente etiológico e de sensibilidade em algumas apresentações clínicas,
utilizam-se métodos sorológicos para aprimorar o diagnóstico final (GUIMARÃES, et al.,
2006). Ademais, também são empregadas para acompanhar os títulos séricos dos pacientes
(BLAIR et al., 2006) relacionando esses valores à efetividade do tratamento e prognóstico
(HIGGINS et al., 2007).
42
Para o diagnóstico imunológico da histoplasmose e coccidioidomicose, são utilizados
vários testes, tais como: reação de fixação de complemento, imunodifusão em gel de agarose
(ID) e ELISA (OLIVEIRA et al., 2011; AMPEL, 2010; FERREIRA & BORGES 2009). A
imunodifusão em gel de agarose (ID), todavia, é um dos mais importantes métodos para
detecção de anticorpos para as duas micoses, em decorrência da sua execução fácil e rápida,
baixo custo, rapidez nos resultados, além de sua alta especificidade (SAUBOLLE et al., 2007;
GUIMARÃES et al., 2006; WANKE, LAZÉRA, 2004).
O teste de imunodifusão em gel de agarose é um teste qualitativo e semiquantitativo
com base no princípio da dupla difusão descrito por Ouchterlony. Um anticorpo e o antígeno
homólogo solúvel são colocados em poços separados cortados em um meio de difusão
apropriado (agarose) e difundem pelo mesmo em diversas direções. Uma linha visível da
reação de precipitação antígeno-anticorpo forma-se no ponto de equivalência entre os poços
(SANCHEZ,2001; ROITT et al., 1998). (Figura 12).
Fonte: Adaptado de SANHEZ, 2001
Figura 10: Padrão da reação positiva no teste de imunodifusão em gel de agarose. Poço 1 –
antígeno; 2 e 5 – soros controles positivos; 3,4,6 e 7 – soros para teste
Por meio do teste de ID, obtém-se uma resposta sorológica para dois importantes
antígenos para H. capsulatum: M e H. A banda de precipitação M pode ser detectada em
pacientes que foram expostos ao fungo ou após teste intradérmico de histoplasmina e também
na fase aguda da enfermidade. Pode ser considerada assinatura imunológica da doença. A
banda H aparece após a banda M e pode ser detectada em soro de pacientes com doença
aguda e/ou progressiva. Essa banda, entretanto, aparece somente em 7% dos pacientes na fase
aguda. A presença de ambas as bandas é considerada diagnóstico conclusivo para
histoplasmose (GUIMARÃES et al., 2006). (Figura 13).
43
Banda M
Banda H
Fonte: CEMM 2010
Figura 11: Reação de imunodifusão para detecção de anticorpos contra Histoplasma
capsulatum. Poço central – antígeno; nos poços 1 e 4 – soros controle positivos: onde são
visualizadas linhas de precipitação M e H.
Para a coccidioidomicose, o teste detecta anticorpos específicos IgM anti-Coccidioides
e IgG anti-Coccidioides. Os anticorpos IgM e IgG são direcionados com dois grupos de
antígenos distintos: TP (tube precipitin) e CF (complement fixation), respectivamente
(GALGIANI, 1993). A detecção precoce de IgM pode ser realizada entre uma a três semanas
após o aparecimento dos sintomas, com uma positividade de 50% a 90%, respectivamente.
Enquanto isso, aproximadamente 90% dos indivíduos demonstram positividade na detecção
de IgG em torno da quarta semana após surgirem os sintomas (CORDEIRO et al., 2011).
Resultados negativos não excluem a possibilidade da infecção por H. capsulatum e C.
posadasii (MUÑOZ et al., 2010; GALCIANI, 1993), visto que a técnica de ID possui
limitações quando relacionada a pacientes imunocomprometidos e com infecções na fase
inicial (PAPPAGIANIS, 2001).
44
3. JUSTIFICATIVA
No tocante aos aspectos microbiológicos de equinos, há vários trabalhos na literatura,
abordando diferentes patógenos bacterianos e virais que afetam o trato respiratório superior
desta espécie animal. No tocante aos fungos, porém, há uma escassez de estudos que abordem
esses microrganismos. Por conseguinte, visando a suprir, pelo menos em parte, essa carência,
foi realizada uma busca ativa por espécies de Candida na cavidade nasal de cavalos,
permitindo a identificação e o perfil de sensibilidades dessas leveduras. Ademais, foi
realizada uma investigação sorológica para as micoses endêmicas histoplasmose e
coccidioidomicose, nas quais o pulmão é o sítio primário de infecção.
45
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS
1. Leveduras do gênero Candida são isoladas do trato respiratório superior de equinos
saudáveis e apresentam resistência primária a antifúngicos de uso terapêutico.
2. Os equinos são bons animais sentinela para histoplasmose e coccidioidomicose no
Estado do Ceará.
46
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo geral
Com este estudo, buscou-se contribuir com a temática acerca dos fungos do trato
respiratório de equinos, particularmente identificando as espécies de Candida isoladas da
cavidade nasal, bem como realizando inquérito sorológico para histoplasmose e
coccidioidomicose nesta espécie animal.
5.2 Objetivos específicos

Identificar espécies de Candida isoladas do trato respiratório superior de equinos.

Avaliar a sensibilidade antifúngica in vitro destas leveduras.

Investigar a presença de IgG anti-C. posadasii e IgG anti-H. capsulatum em amostras
de soro obtidas de equinos do Estado do Ceará.
47
6. CAPÍTULO 1
Fungos do trato respiratório de equinos: destaque para o isolamento de espécies de Candida
não-albicans
Equine respiratory fungi: an outline for the isolation of Candida non-albicans species
Periódico: Medical Mycology (Submetido em Maio de 2012).
48
RESUMO
As infecções respiratórias são um problema comum em equinos e demonstram morbidade e
mortalidade variáveis. Embora algumas espécies de fungos sejam consideradas os principais
agentes de infecção respiratória em diversas mamíferos, a sua relevância nas doenças
respiratórias de equinos é frequentemente negligenciada. Neste estudo, foi realizada uma
busca ativa de Candida spp. na cavidade nasal de equinos, bem como uma pesquisa
imunológica para coccidioidomicose e histoplasmose nesses animais. A presença de Candida
spp. foi investigada por meio de swabs nasais e posterior semeadura em meios de cultura.
Estas leveduras foram identificadas por testes fisiológicos e caracterizados quanto ao perfil de
sensibilidade a antifúngicos in vitro. A pesquisa sorológica foi realizada por meio do teste de
imunodifusão dupla para detecção de anticorpos IgG específicos. A análise do material da
cavidade nasal de 97 equinos, escolhidos aleatoriamente, permitiu o isolamento de 56
Candida spp. em 35 animais (36,08%), sendo 18 (32,14%) C. famata, 14 (25%) C.
parapsilosis, 12 (21,42%) C. guilliermondii, 11 (19,64%) C. tropicalis e 1 (1,78%) C.
pelliculosa. Os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) variaram de 0,03125 a
1µg/mL para anfotericina B; de 0,03125 a >16µg/mL e 0,125 a >64µg/mL para itraconazol e
fluconazol. Resistência ao fluconazol e itraconazol foi observada em C. tropicalis (n=3) e C.
guilliermondii (n=1). Não foi detectada reatividade aos antígenos de Coccidioides spp. e
Histoplasma capsulatum em 177 animais investigados. Os dados demonstram um predomínio
de espécies de Candida não-albicans na microbiota da cavidade nasal de equinos, inclusive
com isolados resistentes a antifúngicos, e reforçam a importância do monitoramento de
patógenos fúngicos nesses animais.
Palavras-chave:
Cavalos,
Candida
spp.,
sensibilidade
antifúngica,
histoplasmose,
coccidioidomicose
49
Medical Mycology – Original Paper
Equine respiratory fungi: an outline for the isolation of antifungal resistant Candida
non-albicans strains
Rossana de Aguiar Cordeiro1, Paula Vago Bittencourt2, Raimunda Sâmia Nogueira
Brilhante1, Carlos Eduardo Cordeiro Teixeira1, Débora de Souza Collares Maia CasteloBranco1, Sabrina Tainah da Cruz Silva², André Jalles Monteiro3, José Júlio Costa Sidrim1,
Marcos Fábio Gadelha Rocha1,2
1
Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Specialized Medical
Mycology Center, Postgraduate Program in Medical Microbiology, Federal University of
Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
2
School of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Science, State University of
Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
3
Department of Statistics and Applied Mathematics, Federal University of Ceará, Fortaleza-
CE, Brazil.
Corresponding Author. R. S. N. Brilhante. Rua Barão de Canindé, 210; Montese. CEP:
60.425-540. Fortaleza, CE, Brazil. Fax: 55 85 3295-1736 E-mail: [email protected]
50
Abstract
Respiratory infections are a common problem among equines and occur with variable rates of
morbidity and mortality. Although some fungal species are considered primary agents of
respiratory tract infections in several mammals, their relevance in respiratory diseases of
equines is frequently neglected. In the present study, we performed an active search for
Candida spp. in the nasal cavity of horses and also conducted an immunological survey for
coccidioidomycosis and histoplasmosis on these animals. The presence of Candida spp. was
investigated through the use of nasal swabs that were streaked on culture media. These yeasts
were identified through physiological testing and the in vitro antifungal susceptibility was
also characterized. The serological survey was carried out through double immunodiffusion
testing for the detection of specific IgG antibodies. The analysis of the material from the nasal
cavity of 97 randomly chosen horses resulted in the isolation of Candida spp. in 35 animals
(36.08%), out of which 18 (32.14%) were C. famata, 14 (25%) C. parapsilosis, 12 (21.42%)
C. guilliermondii, 11 (19.64%) C. tropicalis and 1 (1.78%) C. pelliculosa. The minimum
inhibitory concentration (MIC) values ranged from 0.03125 to 1µg/mL for amphotericin B;
and from 0.03125 to >16µg/mL and 0.125 to >64 µg/mL for itraconazole and fluconazole,
respectively. Resistance to fluconazole and itraconazole was observed in C. tropicalis (n = 3)
and C. guilliermondii (n = 1). Reactivity to Histoplasma capsulatum and Coccidioides spp.
antigens was not detected in the 177 investigated animals. The data show a predominance of
non-albicans Candida species in the microbiota of the nasal cavity of equines including
antifungal resistant isolates, reiterating the importance of monitoring fungal pathogens in
these animals.
Keywords:
Horse,
Candida
spp.,
antifungal
susceptibility,
histoplasmosis,
coccidioidomycosis
51
Introduction
Yeasts of the Candida genus are considered commensal microorganisms associated with
skin and mucosae of the urogenital, respiratory and gastrointestinal tracts of humans and
various animal species [1,2,3,4,5]. Among the 25 species of yeasts that are considered
emerging pathogens, 20 are Candida spp. [6]. Generally, these microorganisms do not cause
any harm to their hosts, but they can become pathogenic when changes occur in physical,
chemical and immunological barriers, culminating in an illness called candidiasis [2,5].
In horses, more specifically in foals, the Candida species are opportunistic pathogens
that can cause gastroesophageal ulcerations, diarrhea, meningitis, omphalophlebitis and less
often systemic infections [7,8]. In adult horses, C. famata has been associated with septic
arthritis, while C. albicans has been isolated from mares suffering from keratitis and
endometritis [9,10].
The dimorphic fungi Histoplasma capsulatum var. capsulatum and Coccidioides
posadasii are the causative agents of histoplasmosis and coccidioidomycosis, respectively,
both of which can affect several species of animals including horses. In Brazil, histoplasmosis
is an endemic disease that occurs mainly in patients with AIDS and it is highly prevalent in
the state of Ceará [11]. More recently, we described clinical and epidemiological aspects of
three cases of feline histoplasmosis isolated in this state [12]. Despite the lack of reports of
this disease in horses in Brazil, histoplasmosis has been diagnosed in these animals in the
United States [13,14,15]. Concerning coccidioidomycosis, this disease is considered endemic
to Northeastern Brazil, as evidenced by the occurrence of autochthonous cases in humans
[16,17] and dogs [16]. Unlike Brazil, in the United States, coccidioidomycosis has been
diagnosed in horses [18,19,20,21].
Because of the small number of studies investigating fungi from the equine respiratory
tract, we performed an active search for Candida spp. in the nasal cavity of horses and also
52
conducted an immunological survey in these animals for coccidioidomycosis and
histoplasmosis, which are endemic mycoses that primarily infect the lungs.
Materials and Methods
Animals
One hundred and seventy-seven clinically healthy horses, from farms in the
municipalities of Fortaleza (3° S-40° 41 ' 20 ' W), Eusébio (3 º 38° 53 ' S – 28 ' W), Caucaia
(3° 43 ' S 38° 39 ' W), Jaguaribe (5 º 38° 53 ' S – 37 ' W), Sobral (3° 41 ' S – 40° 29 ' W) and
Santa Quitéria (04° 19 ' S-40° 09 ' W), Ceará, Northeastern Brazil, were included in this
survey, during the period from March to November 2011. These animals were used for the
serological investigation and 97 of them were randomly chosen for the detection of Candida
spp. Samples were collected from females and males (castrated and stallions), both juveniles
(≤4 years) and adults (>5 years), of seven different breeds (Quarter horses, Arabian horses,
Brazilian Jumper horses, Lusitano, Breton, British Thoroughbred and mixed breed horses).
For each animal, a clinical-epidemiological form was completed, including information on the
origin, age, sex, breed and clinical features. This study was approved by the animal research
ethics committee of State University of Ceará (protocol number 10610172-2/55).
Sample collection, isolation and identification procedures
Microbiological samples were collected from the nasal cavity through the use of sterile
cotton swabs. The first swab was inserted in the rostral region, approximately 10 cm from the
nostril orifice, and the second in its caudal portion, approximately 30 cm from the entrance.
After collection, the swabs were stored in glass slants with sterile saline supplemented with
chloramphenicol (50 mg/L), stored and transported in isothermal trays to the Specialized
Medical Mycology Center of Federal University of Ceará. Blood samples (5 mL) were
53
obtained through venipuncture of the jugular vein, with sterile Vacutainer® tubes, without
anticoagulant. These were stored in isothermal trays and transported to the laboratory.
The swabs were inoculated in Petri dishes containing 2% Sabouraud dextrose agar (SGA,
Difco Laboratories) with chloramphenicol and incubated for up to 5 days at room temperature
(28 oC), with daily reading for evaluation of the presence of fungal colonies. Then colonies
suggestive of Candida spp. were streaked on chromogenic medium (CHROMagar
CandidaTM), on which the colonies were incubated for 48 hours. The isolated colonies were
inoculated in Petri dishes containing corn meal agar supplemented with Tween 80 and
incubated for up to 5 days at 28 ºC, and later were observed with an optical microscope.
Biochemical analyses with each isolate were also performed, such as carbohydrate
assimilation tests, and the results were interpreted according to standards [22]. In inconclusive
situations, the strains were identiﬁed through VITEK 2 automated system (BioMérieux Vitek,
Hazelwood, France), according to the manufacturer’s instructions. Data concerning the
collection site and the isolated species were analyzed through Pearson’s Chi-Square test,
considering P< 0.05 as the smallest significance level.
Antifungal susceptibility testing
The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by the broth microdilution
method, standardized by the Clinical and Laboratory Standards Institute [23], for all the
isolates of Candida spp. An isolate of Candida parapsilosis ATCC 22019 was included as
quality control. The fungal inoculum was prepared from 24-hour old colonies grown on
potato dextrose agar at 28 °C for 24 hours.
For this purpose, 5 mL of saline solution (NaCl 0.9%) was added in sterile glass slants,
after which a sample of the colony was added and the concentration was adjusted to 0.5 on the
MacFarland scale. For the test, the suspensions were diluted at a ratio of 1:100 and then 1:20
54
with RPMI 1640 medium, buffered to pH 7 with MOPS (acid 2-[N-morfolin]propanesulfonic) at 0.165 M, to obtain inocula varying from 1 to 2.5 103 CFU/mL [23].
The final concentration of antifungal drugs (amphotericin B, fluconazole and
itraconazole) was obtained as recommended by CLSI [23]. All drugs were diluted and
resuspended in RPMI 1640 medium. The range of concentration tested was from 0.125 to 64
µg/mL for fluconazole and from 0.03125 µg/mL to 16 µg/mL for amphotericin B and
itraconazole [2,4].
The samples were analyzed in duplicate. The trays were incubated at 35 ºC for 48 hours.
The MIC for the azole derivatives (fluconazole and itraconazole) was considered to be the
lowest concentration able to inhibit 50% growth when compared to the growth control well.
For amphotericin B, the MIC was considered to be the lowest concentration capable of
inhibiting growth completely. MIC values of >1, > 64 and ≥ 1 µg/mL indicated in vitro
resistance to amphotericin, fluconazole and itraconazole, respectively [23]. For the species C.
parapsilosis and C. tropicalis, MIC values of ≥ 8 µg/mL indicated resistance to fluconazole
[24].
Immunodiffusion test
The serum samples were obtained by centrifuging the blood samples at a speed of
1,500 rpm for 15 minutes at a temperature of 28 °C, after which they were stored at -20 °C.
The double immunodiffusion technique in agarose gel was used to detect anti-C. posadasii
IgG and anti-H. capsulatum IgG. The antigens Histoplasma ID (H&M) and Coccidioides
IDCF
were
used
according
to
the
manufacturer's
recommendations
(Immy
Immunodiagnostics, Inc., USA). Positive human sera for coccidioidomycosis and
histoplasmosis
(Immy
Imunodiagnostics,
USA)
were
used
as
controls
for
the
immunodiffusion reactions. The results were initially read after 24 hours of incubation in a
55
moist chamber, and the final reading was made after 48 hours. The quality control of the test
was assured by the presence of the precipitation line obtained between the antigen and the
positive control serum.
Results
From the total of 97 horses assessed, 35 (36.08%) were positive for Candida spp. Out of
these positive animals, 19 were females (18 adults and 1 juvenile), while 16 were males (14
adults and 2 juveniles). A total of 56 isolates of Candida spp. were recovered. The rostral
nasal cavity was the anatomical site with the highest isolation rate, with 36 isolates (64.29%),
belonging to five species (10 C. tropicalis, 10 C. famata, 9 C. guilliermondii and 7 C.
parapsilosis). From the caudal nasal cavity, 20 (35.71%) isolates were obtained, belonging to
the species C. famata (n = 8), C. parapsilosis (n = 7), C. guilliermondii (n = 3), C. tropicalis
(n = 1) and C. pelliculosa (n=1) (Table 1).
As for the antifungal susceptibility assays, the MIC values for Candida isolates are
detailed in Table 2. The MIC for amphotericin B ranged from 0.03125 to 1 µg/mL for all
isolates. The MIC for itraconazole ranged from 0.03125 to >16 µg/mL and for fluconazole
from 0.125 to >64 µg/mL. Three isolates of C. tropicalis were resistant to itraconazole and
fluconazole (MIC ≥1 µg/mL and ≥8 µg/mL, respectively). Also, two isolates of C.
guilliermondii were resistant to fluconazole (MIC >64 µg/mL). There was no statistically
significant difference between the analyzed anatomical sites, sex, age, breeds and cities.
Finally, all 177 serum samples were negative for anti-Histoplasma and anti-Coccidioides
antibodies.
56
Discussion
Despite the clinical reports identifying Candida species as a cause of infection in
animals, the number is still considered small when compared to human infections [25].
Because of this lower number of cases, there are still some questions about which species are
part of the microbiota, how they become pathogenic and their prevalence.
This study suggests that the species found (C. parapsilosis, C. guilliermondii, C.
tropicalis, C. famata, C. pelliculosa) are commensal of the equine nasal cavity. Although the
literature reports C. albicans as an important component of the microbiota of animals [3,25],
it was not isolated from any sampled horse. The most frequently isolated species in our study
was C. famata (n = 18), similar to what was found by another author [8], who studied the
microbiota of the oropharynx and rectum of healthy and debilitated foals. The second most
isolated species was C. parapsilosis, which has gained importance in recent years as a
pathogen of humans and animals [1,2,26].
The species C. pelliculosa is commonly isolated from fruit, vegetables, tree exsudate and
soil, being considered an environmental yeast. However, in recent years it has been
occasionally reported as a causative agent of fungemia in pediatric patients, mainly newborns
in intensive care [27,28]. Despite the lack of case reports concerning the occurrence of
clinical cases in animals, this species has been isolated from birds [29] and feces of bats [30].
In our study, a single sample of this species was recovered, but its phenotypical identification
through manual methods was not conclusive. Therefore, the confirmation of its identity was
performed via the VITEK 2 automated system.
The rostral portion of the nasal cavity showed a higher rate of isolation (64.29%), with
the species C. tropicalis, C. famata and C. guilliermondii as the most prevalent ones. On the
other hand, the recovery rate from the caudal portion of the nasal cavity was lower and C.
famata and C. parapsilosis were the most isolated species. This difference between the
57
isolation rates of the two anatomical sites may be related to environmental factors.
Furthermore, even though it is not the focus of this survey, it is important to highlight that
other yeasts, e.g., Rhodotorula spp. and Trichosporon spp., were found. However, the
isolation of these microorganisms was hampered by the excessive growth of filamentous
fungi, which are commonly found in the nasal cavity, considering the anatomical,
physiological and biological characteristics of equines.
In our study, three strains of C. tropicalis were resistant to fluconazole and itraconazole
and two strains of C. guilliermondii were resistant to fluconazole. These findings are relevant
since the animals were healthy and had no history of previous antifungal treatment. The
phenomenon of in vitro antifungal resistance in Candida spp. isolated from animals has been
frequently reported by our research group [2,4,12,31]. This phenomenon is possibly
associated with the use of azole derivatives in agriculture [32].
In our survey, all animals were negative for the presence of anti-H. capsulatum and antiC. posadasii antibodies. Several serological techniques can be used to diagnose these
mycoses, such as complement fixation, latex agglutination, ELISA and agarose gel
immunodiffusion (ID). ID is the most commonly used technique due to its quick and easy
implementation, low cost, fast results and high specificity [33].
Histoplasmosis in the state of Ceará has high incidence in humans [11]. However, the
epidemiological data regarding animal infections are scarce and the prevalence of the disease
is unclear in this region [12,34]. There are no reports of histoplasmosis in horses in Brazil, in
spite of having been described in other countries [13,14,15,35]. As for coccidioidomycosis, it
is considered endemic in some Northeastern states, including Ceará [16,36], with reports in
humans and animals [16,37]. In Brazil, there are no reports of this mycosis in horses, but
cases of this disease in these animals have been reported in the USA [21]. Despite this
evidence, found that only 4% of healthy horses, in endemic areas, had positive serology
58
according to the agarose gel immunodiffusion test and the authors observed that serological
titers tended to decrease within 2 to 6 months [38]. Even though all animals presented
negative serological results for histoplasmosis and coccidioidomycosis, this study is relevant
because it was the first to investigate the role of horses in the epidemiology of these systemic
mycoses in Brazil.
Conclusion
The data show a predominance of non-albicans Candida species in the nasal cavity of
equines, including antifungal resistant strains, and that horses are not good sentinel animals
for histoplasmosis and coccidioidomycosis in this geographical region, when tested through
double immunodiffusion.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the National Council for Scientific and
Technological Development (CNPq; Brazil; Processes 302574/2009-3 and 562296/2010-7)
and the Coordination Office for the Improvement of Higher Education Personnel
(CAPES/PNPD 2103/2009).
Transparency Declaration
Nothing to declare.
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Table 1: Candida species isolated from the nasal cavity of 97 clinically healthy horses
Anatomical Sites
Candida spp.
Total
Rostral Nasal
Cavity
Caudal Nasal
Cavity
C. famata
10
8
18
C. guilliermondii
9
3
12
C. parapsilosis
7
7
14
C. pelliculosa
0
1
1
C. tropicalis
10
1
11
Total
36
20
56
65
Table 2: Minimum inhibitory concentrations (MIC) of amphotericin B, itraconazole and
fluconazole against 56 isolates of Candida spp. from two anatomical sites of clinically healthy
horses. Data in brackets represent the number of isolates for the indicated MIC value.
MIC (µg/mL)
Candida spp.
C. parapsilosis
C. famata
C. guilliermondii
C. tropicalis
n
14
18
12
11
Amphotericin B
Itraconazole
Fluconazole
0.03125 (1)ᵃ
0.0625 (3)
0.125 (4)
0.25 (3)
0.5 (3)
0.03125 (8)
0.0625(1)
0.125 (2)
0.25 (3)
0.0625 (2)
0.125 (6)
0.25 (6)
0.5 (4)
0.03125 (5)
0.0625 (5)
0.125 (3)
0.25(2)
4 (1)
8 (2)
0.03125 (5)
0.0625 (2)
0.25 (3)
8 (2)
0.125 (2)
0.25 (3)
0.5 (1)
1 (2)
2 (5)
4 (1)
0.5 (2)
1 (5)
2 (4)
4 (4)
8 (2)
32 (1)
0.25(2)
0.5 (1)
1 (1)
2 (2)
4 (3)
8 (1)
>64 (2)
0.0125(1)
0.25(1)
0.5 (3)
2 (1)
4 (2)
>64 (3)
1
0.125 (4)
0.25 (2)
0.5 (4)
1 (2)
0.0625(2)
0.25 (4)
0.5 (5)
0.03125 (2)
0.125 (4)
0.25 (2)
8 (2)
>16 (1)
C. pelliculosa
01
0.125
0.25
C. parapsilosis ATCC
0.03125
01
1
22019
a
Represents the number of isolates that presented the indicated MIC
2
66
7. CONCLUSÕES
1. O sítio anatômico cavidade nasal rostral apresentou a maior taxa de isolamento de Candida
spp., sendo isoladas somente espécies de Candida não-albicans.
2. Há resistência primária a derivados azólicos em Candida spp. isoladas da cavidade nasal de
equinos, especificamente em C. tropicalis diante ao itraconazol e fluconazol e C.
guilliermondii ante o fluconazol.
3. Os equinos, investigados pela técnica de imunodifusão dupla, não são bons animais
sentinela para histoplasmose e coccidioidomicose nesta região geográfica.
67
8. PERSPECTIVAS
1. O conhecimento sobre as leveduras do gênero Candida presentes no trato respiratório
superior de equinos é importante por auxiliar a compreensão da dinâmica microbiana, visto
que os patógenos fúngicos ainda são pouco implicados em afecções respiratórias em equinos.
O monitoramento do perfil de sensibilidade de cepas de Candida spp. de origem animal é
escasso, sendo limitado o número de pesquisas nessa área. Este trabalho constatou a
ocorrência do fenômeno de resistência primária a derivados azólicos em cepas de C. tropicalis
e C. guilliermondii. Considerando que os animais representam possíveis fontes de infecção
para os seres humanos, é necessário investigar os possíveis fatores envolvidos neste
fenômeno. Este estudo foi pioneiro para a espécie estudada e forneceu dados importantes
sobre a composição da microbiota direcionada ao gênero Candida.
2. Apesar dos equinos analisados nesta pesquisa exibirem resultados sorológicos negativos
para histoplasmose e coccidioidomicose, é necessária a realização de mais estudos a respeito
do envolvimento desses animais na ecoepidemiologia dessas enfermidades no Ceará,
mediante técnicas sorológicas mais sensíveis, bem como uma possível utilização de testes de
intradermorreação com a histoplasmina e coccidioidina.
68
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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83
ANEXOS
84
FICHA EPIDEMIOLÓGICA
Nome do Proprietário:
___________________________________________________________________________
Endereço:
___________________________________________________________________________
Nome do Animal:
___________________________________________________________________________
Espécie:
Equina ( )
Asinino ( )
Muar ( )
Raça:
___________________________________________________________________________
Sexo:
Macho ( )
Fêmea ( )
Idade:
___________________________________________________________________________
Pelagem:
___________________________________________________________________________
Histórico:
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
Anamnese:
Local de estadia:
Baia ( ) Piquete ( )
Especificar qual período e duração do tempo que fica solto:
___________________________________________________________________________
Alimentação:
Pasto ( ) Ração ( ) Feno ( )
Se for no pasto especificar se tem contato com outros animais da mesma espécies e de outras:
___________________________________________________________________________
85
Atividade:
Esporte ( ) Trabalho ( ) Passeio ( )
Especificar qual tipo de esporte ou trabalho:
___________________________________________________________________________
Convívio com outros animais:
Sim ( ) Não ( )
Outras espécies, especificar:
___________________________________________________________________________
Origem:
Nasceu na propriedade: Sim ( ) Não ( )
Se não, proveniente de onde (qual região):
___________________________________________________________________________
86

Fungos no trato respiratório de equinos

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