determi nação do poli morfi smo de sei ss do cromossomo x

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P r o g r a m a d e P ó s- Gr a d u a çã o e m Ge n é t i ca
U n i v e r si d a d e Fe d e r a l d e P e r n a m b u co
Ce n t r o d e Ci ê n c i a s
Depart am ent o de
Bi o l ó g i ca s
Ge n é t i ca
D E T E R M I N A ÇÃ O D O
P O L I M O R F I S M O D E S EI S S T R S
D O CR O M O S S O M O X H U M A N O N A
P O P U L A ÇÃ O D O E S T A D O D E
P ER N A M B U CO , B R A S I L
Vanessa Cavalcante da Silva
Recife, PE
Abril, 2007
Silva, V.C.
Polimorfismo de seis X-STRs no Estado de Pernambuco, Brasil
Vanessa Cavalcante da Silva
D E T E R M I N A ÇÃ O D O
P O L I M O R F I S M O D E S EI S S T R S
D O CR O M O S S O M O X H U M A N O N A
P O P U L A ÇÃ O D O E S T A D O D E
P ER N A M B U CO , B R A S I L
Dissertação apresentada ao Programa de PósGr a duçã o e m Ge né t ica da Unive r sida de
Fe de r a l de Pe r n a m bu co, como parte dos
requisitos necessários para obtenção do grau de
Mestre em Genética.
Orientador: Profa. Dra. Rosilda dos Santos
Silva, Dpto. Genética, Centro de Ciências
Biológicas, UFPE
Recife, PE
Abril, 2007
1
Silva, V.C.
Silva, Vanessa Cavalcante da.
Determinação do Polimorfismo de Seis STRs do Cromossomo X
humano na população do Estado de Pernambuco, Brasil / Vanessa
Cavalcante da Silva. – Recife: O Autor, 2007.
74 folhas: il., fig., tab.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB.
Programa de Pós-Graduação em Genética. 2007.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Cromossomo X. 2. STRs. 3. Pernambuco – População. 4. Polimorfismo
Genético. I. Título.
576.316
576.5
CDU (2.ed.)
CDD (22.ed.)
UFPE
CCB – 2008-187
2
Silva, V.C.
3
Silva, V.C.
Dedicatória
A DEUS,
O maior geneticista de todos os tempos.
4
Silva, V.C.
Agradecimentos
Aos meus pais Vicente Ferreira da Silva Filho e Veralúcia Cavalcanti
Aliança, pelo amor, carinho, incentivo e dedicação.
A minha orientadora Profa. Dra. Rosilda dos Santos Silva, pela
orientação, confiança e dedicação.
A Adri (Adriana Vieira), pela amizade, coleguismo e por estar
pronta a ajudar e a ensinar sempre que “impossível”.
A Glorinha (Maria da Glória Raposo), pelo apoio técnico-científico e
principalmente por sua amizade e descontração que me fizeram sorrir
mesmo quando essa não era a minha intenção.
A Mima (Jemima Eline), pelo apoio fundamental dado no início do
mestrado.
A Paulinha (Paula Braga), minha escravinha e mão direita, pelo
suporte dado a fase laboratorial.
A Simone, pelas extrações de DNA.
A Douglas, pelo suporte técnico.
A Carlos e a Alexandre, pela ajuda na estatística.
A Janaína e a Dona Luzinete, pela amizade.
A Daniel Benevides, pelo amor, amizade e presença especial.
A Profa. Elizabete Malaquias Freitas, pelas sugestões pertinentes e
pelo carinho.
A todos que constituem o Programa de Pós Graduação em
Genética, pela colaboração direta e indireta na minha formação.
A Lobo, secretário do mestrado em Genética, por sua atenção.
Ao Prof. Dr. Luiz Maurício da Silva, chefe do Laboratório de
Genética Molecular Humana, pela utilização da infra-estrutura e apoio
financeiro.
A todos vocês, meu sincero agradecimento!
“Todas as coisas passam, mas o amor permanece para sempre”. I
Cor. 13.13.
5
Silva, V.C.
SU M ÁRI O
LISTA DE FIGURAS
7
LISTA DE TABELAS
8
LISTA DE ABREVIAÇÕES
10
RESUMO
11
1. INTRODUÇÃO
12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
14
2.1. Breve história da origem da população brasileira
2.2. Microssatélites: dinâmica evolutiva e aplicações
2.3. O cromossomo X humano e suas STRs
14
17
21
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
27
4. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO
35
Polimorfismo das X- STRs DXS7132, DXS8377, DXS6789, DXS101,
DXS10011 e ARA na população de Pernambuco, Brasil
36
5 . ABSTRACT
50
6 . INFORMAÇÕES COMPLEMENTARES
51
7 . ANEXO
62
Instruções para autores: Journal of Forensic Science
61
6
Silva, V.C.
LI S T A D E F I GU R A S
R E V I S Ã O B I B L I O G R Á F I CA
Figura 1 - Ideograma da localização de X- STRs
24
usadas em práticas forenses.
M A N U S CR I T O
Figura 1. Dendrograma construído de acordo com o
método UPGMA usando a distancia genética obtida das
freqüências
DXS6789,
alélicas
DXS101
observadas
e
DXS8377
nos
de
locos
DXS7132,
pernambucanos,
portugueses, espanhóis e afro-americanos.
45
7
Silva, V.C.
L I S T A D E T A B EL A S
R E V I S Ã O B I B L I O G R Á F I CA
Tabela 1. Distribuição dos contingentes imigratórios por
período de entrada no Brasil.
15
Ta be la 2 . Freqüências alélicas do loco DXS8377 em oito
populações.
19
Ta be la 3 . Principais informações referentes as X-STRs
mais utilizadas em estudos populacionais e análises
forenses.
22
Ta be la 4 . Principais informações referentes as DXS7132,
DXS6789, DXS8377, DXS101, DXS10011 e ARA.
25
M A N U S CR I T O
Ta be la 1 . Freqüências alélicas e parâmetros forenses das
DXS7132, DXS6789, DXS101, ARA, DXS10011 e DXS8377
em amostra feminina da população de Pernambuco.
43
Ta be la 2 . Freqüências alélicas e parâmetros forenses das
DXS7132, DXS6789, DXS101, ARA, DXS10011 e DXS8377
em amostra masculina da população de Pernambuco.
44
8
Silva, V.C.
I N F O R M A ÇÕ E S CO M P L E M E N T A R E S
Tabela 1. Seqüências dos pares de primers utilizados para
amplificação por PCR dos locos de STR do cromossomo X.
52
Ta be la 2 . Freqüências genotípicas observadas no loco
DXS7132 em amostra de 300 indivíduos do sexo feminino
do estado de Pernambuco.
53
54
55
Tabela 5. Freqüências genotípicas observadas no loco ARA
em amostra de 300 indivíduos do sexo feminino do estado
de Pernambuco.
56
57
do Estado de Pernambuco.
60
9
Silva, V.C.
L I S T A D E A B R E V I A ÇÕ E S
STRs - Short Tandem Repeats- Repetições Curtas em Tandem;
PCR - Polymerase Chain Reaction- Reação em Cadeia da Polimerase;
Pb - Pares de base;
Y- STRs - Repetições Curtas em Tandem do Cromossomo Y;
X- STRs - Repetições Curtas em Tandem do Cromossomo X;
10
Silva, V.C.
R ES U M O
As Seqüências Repetidas em Tandem (STRs) presentes nos
cromossomos sexuais são ferramentas importantes na genética forense.
As X-STRs são especialmente úteis em casos complexos de testes de
paternidade e naqueles de identificação de sexo. Com o objetivo de
caracterizar a população pernambucana quanto ao polimorfismo de seis
X-STRs (DXS7132, DXS6789, DXS8377, DXS101, DXS10011 e ARA), foi
analisado um total de 300 homens e 300 mulheres não aparentados. O
teste para o desequilíbrio de ligação entre os locos na subamostra
feminina não revelou evidência consistente de associação entre os
marcadores (p>0,214) e a verificação da diversidade haplotípica, na
subamostra masculina, revelou que todos os haplótipos foram únicos. A
heterozigosidade variou de 0,743 (DXS7132) a 0,937 (DXS8377) e o
poder de discriminação (PD) de 0,906 (DXS7132) a 0,993 (DXS10011).
Com base no cálculo da distância genética a partir dos dados dos
marcadores DXS7132, DXS8377, DXS6789 e DXS101, concluiu-se que a
população
pernambucana
está
geneticamente
mais
próxima
da
portuguesa (0.022) e da espanhola (0.029) do que da afro-americana
(0.036). O presente trabalho demonstra que estes marcadores genéticos
são altamente discriminantes, e portanto, úteis em propósitos forenses e
estudos populacionais.
Palavras- chave: Cromossomo X; STRs; População de Pernambuco,
Polimorfismo Genético.
11
Silva, V.C.
1 . I N T R O D U ÇÃ O
A síntese de DNA in vit ro foi realizada pela primeira vez por Arthur
Kornberg e colaboradores em 1957. Entretanto, apenas em 1985 foi
apresentada ao mundo científico a técnica de Reação em Cadeia da
Polimerase-PCR, que amplifica trechos pré-determinados do DNA. Com o
advento desta tecnologia, os microssatélites ou STRs (Short Tandem
tornaram-se
Repeats)
os
mais
populares
marcadores
genéticos
estudados nos últimos anos.
Os microssatélites são repetições de seqüências de DNA em
tandem com unidades de repetição constituídas por dois a seis pares de
nucleotídeos. São designados dinucleotídicos quando a unidade repetitiva
tem apenas 2 pares de nucleotídeos, trinucleotídicos quando tem três
pares e assim por diante.
As STRs estão amplamente distribuídas em todo o genoma
humano e são polimórficas em todas as populações estudadas. Estas
características das STRs, aliadas ao fato de serem fragmentos de DNA de
pequeno comprimento (<300pb) passíveis de amplificação mesmo
quando
o
DNA
está
degradado
mendeliana tornaram-nas
e
marcadores
de
apresentarem
genéticos
muito
segregação
úteis
em
diferentes áreas da biologia como: antropologia física, na elaboração de
mapas gênicos, na análise da
estrutura genética de populações e em
genética forense (teste de paternidade, maternidade,
identificação de
indivíduos, etc.).
A
grande
maioria
das
publicações
referentes
à
análise
do
polimorfismo de microssatélites envolve locos autossômicos. No entanto,
em alguns casos em que é necessária a identificação do sexo ou em
casos complexos de determinação de paternidade/maternidade, a análise
de STRs de cromossomos sexuais (Y-STRs e X-STRs) é indispensável,
principalmente pelo fato de serem transmitidos de pai para filhos e filhas
12
Silva, V.C.
como haplótipos, uma vez que nos homens quase não há recombinação
meiótica entre estes cromossomos. Estas situações são relativamente
comuns nas áreas de genética forense e antropologia física.
De uma maneira geral, a literatura especializada tem relatado
muito mais dados sobre o polimorfismo de Y-STRs do que de X-STRs. No
entanto, nos últimos anos, as X-STRs têm sido estudadas e reconhecidas
como ferramentas importantes em genética forense, especialmente em
casos complexos de testes de paternidade onde a criança disputada é do
sexo feminino. A utilização destes marcadores pode identificar se
presumidas meias-irmãs têm o mesmo pai biológico ou confirmar a
relação paterna avó-neta, sem que seja necessária a análise de seus
pais pois, meias-irmãs partilham entre si e com suas avós paternas no
mínimo um alelo em cada X-STR.
O presente trabalho teve como objetivo geral analisar a estrutura
genética da população do Estado de Pernambuco em relação ao
polimorfismo de seis locos X-STRs e como objetivos específicos:
a) Caracterizar a população do Estado de Pernambuco quanto ao
grau
de
variabilidade
genética
das
X-STRs
DXS7132,
DXS6789,
DXS8377, DXS101, DXS10011 e ARA;
b) Comparar a variabilidade dessas X-STRs encontrada em
Pernambuco com a de outras populações, principalmente com a daquelas
que contribuíram para a formação dessa população;
c) Fornecer dados para validação dos testes de investigação de
paternidade e identificação de indivíduos na população do Estado de
Pernambuco.
13
Silva, V.C.
2 . R E V I S Ã O B I B L I O G R Á F I CA
2.1. Breve história da origem da população brasileira
Os primeiros povos a se propagarem pelo território, que mais tarde
recebeu o nome de Brasil, foram os ameríndios (Couto, 1981). Os índios
brasileiros pertencem aos grupos chamados paleoameríndios, que
provavelmente descenderam de antigas raças da Ásia e da Oceania e
teriam chegado às Américas pelo estreito de Behring ou pela navegação
no Oceano Pacífico.
A colonização do Brasil (processo de povoamento, exploração e
dominação) realizada pelos portugueses se deu a partir do século XVI,
após sua “descoberta” por Pedro Álvares Cabral. Até 1530, o movimento
de portugueses para o Brasil foi relativamente pequeno, em torno de 25
mil, mas cresceu durante os cem anos seguintes devido, principalmente,
ao rentável negócio do açúcar, atingindo número considerável no século
XVIII (Silva, 2001).
No Brasil, na Capitania de São Vicente, São Paulo, se comprova a
existência de escravos negros oriundos do continente africano a partir de
1531.
Registros
históricos
estimam
que
no
país
haviam
aproximadamente 4 milhões de negros entre 1551 e 1850. Os negros
africanos espalharam-se por todo o território brasileiro, em engenhos de
açúcar, fazendas de criação, arraias de mineração, sítios extrativos,
plantações de algodão, fazendas de café e áreas urbanas (Cavignac,
2003).
Entre 1580 e 1640, durante a união de Portugal com a Espanha, a
imigração caucasóide para o Brasil era limitada aos ibéricos. Porém, no
final deste período, vieram os ingleses e os holandeses, dos quais um
certo número se estabeleceu em terras brasileiras, após o término da
invasão holandesa (Conceição, 1987).
Do século XVI ao século XVIII, em aproximadamente 15 gerações,
consolidou-se a estrutura genética da população brasileira, com o
14
Silva, V.C.
intercruzamento de africanos, portugueses e índios (Ribeiro, 1995).
Ainda no período colonial, franceses, holandeses e ingleses tentaram se
estabelecer em território brasileiro e deixaram alguma contribuição
étnica, embora restrita.
As nacionalidades que mais contribuíram para a composição das
correntes imigratórias a partir de 1850 foram, além da portuguesa, em
ordem decrescente, a italiana, a espanhola, a alemã e a japonesa
(Tabela 1). A maioria dos europeus não-portugueses se estabeleceu nas
regiões Sul e Sudeste do país (Pena, 2000).
Ta be la 1 . Distribuição dos contingentes imigratórios por período de
entrada no Brasil.
Período
Portugueses
Italianos
Espanhóis
Japoneses
Alemães
Totais
1851-1885
237.000
128.000
17.000
-
59.000
441.000
1886-1900
278.000
911.000
187.000
-
23.000
1.398.000
1901-1915
462.000
323.000
258.000
14.000
39.000
1.096.000
1916-1930
365.000
128.000
118.000
85.000
81.000
777.000
1931-1945
105.000
19.000
10.000
88.000
25.000
247.000
1946-1960
285.000
110.000
104.000
42.000
23.000
564.000
Totais
1.732.000
1.619.000
694.000
229.000
250.000
4.523.000
Fonte: Ribeiro, 1995
Em 1534, o Brasil foi dividido em quinze capitanias hereditárias,
das quais apenas duas prosperaram: Pernambuco, doada a Duarte
Coelho Pereira, e São Vicente (São Paulo), doada a Martim Afonso de
Souza (Siebert, 1998).
A prosperidade de Pernambuco, que teve início em 1535 com o
cultivo da cana-de-açúcar e do algodão, atraiu grande número de
europeus para a região. Quatro anos mais tarde, em 1539, chegaram os
primeiros escravos africanos para suprir as necessidades de mão-de-obra
da crescente produção açucareira, até então exercida apenas pelos
nativos (Patriota, 2000).
15
Silva, V.C.
Em virtude das riquezas e da partilha da América entre Portugal e
Espanha, o Brasil foi alvo de contrabandistas, ataques e invasões. Em
Pernambuco, os franceses destruíram a Feitoria Régia, erguida por
Cristóvão Jacques junto ao porto, e construíram uma fortificação na Ilha
de Itamaracá. O assentamento francês permaneceu de 1561 até 1567
(Souza, 1998).
Entre 1630 e 1654, a região foi ocupada também pelos holandeses,
que fizeram de Recife a capital de seu domínio brasileiro, durante 24
anos. A forte resistência dos portugueses e brasileiros de origem
lusitana, africana e indígena, acabou resultando na expulsão dos
holandeses (Andrade, 1987).
Segundo os historiadores, durante o tempo de permanência dos
portugueses, espanhóis e franceses em terras pernambucanas, houve
intercruzamento desses colonizadores europeus com indígenas nativos e
também com os negros de origem africana trazidos para esse território.
Pesquisas realizadas com o polimorfismo apresentado por Y-STRs e do
DNA mitocondrial com a população atual brasileira de diversas regiões
indicam que esse intercruzamento ocorreu, em maior proporção, entre
homens europeus e mulheres indígenas e/ou mulheres negras africanas
(Pena, 2000)
16
Silva, V.C.
2.2. Microssatélites: dinâmica evolutiva e aplicações
Os microssatélites ou STRs (Short Tandem Repeat s) apresentam
repetições em tandem de seqüências curtas de DNA com apenas dois a
seis pares de nucleotídeos. Estas seqüências por serem inativas, no
aspecto transcricional, foram consideradas, por muito tempo, não
funcionais e tratadas como DNA lixo. Hoje, sabe-se de seu envolvimento
em diversas funções incluindo regulação gênica (Garcia et al., 2001),
sinais para recombinação (Hiroshi et al., 2000) e replicação de telômeros
(Blackburn, 2005).
As STRs são altamente polimórficas e oferecem um significante grau
de
discriminação
entre
os
indivíduos.
Esse
polimorfismo
é
predominantemente devido a mudanças no número de cópias da
repetição principal que se acumularam em sucessivas gerações ao longo
do processo evolutivo, provavelmente devido a elevadas taxas de
mutação durante a replicação (Eisen, 2000).
A taxa de mutação dos microssatélites varia de 10-6a 10-2 por
geração e esse valor é significativamente mais alto que a taxa de
mutação pontual que é da ordem 10-9 a 10-10. O mecanismo proposto
para esta maior variabilidade dos microssatélites foi o slippage de DNA
(Kruglyak et al, 1998). Nessa proposta, assume-se, que durante a
replicação ocorra um deslizamento
a
molde.
Se
entre
a
fita
DNA
nascente
e
este pareamento errôneo não for corrigido, uma das
moléculas do DNA apresentará alterações no número de repetições do
microssatélite.
Experimentos in vit ro têm demonstrado que o slippage de DNA
ocorre com uma freqüência de uma mutação a cada cem eventos de
replicação (Streisinger e Owen, 1985; Schloterer et
al, 1998). A
diferença entre a elevada taxa de mutação esperada, com base em
experimentos in vit ro, e a taxa de mutação de microssatélites de 10-6 a
10-2, observada in vivo, pode ser explicada pela existência de sistema de
17
Silva, V.C.
reparo. Estudos revelam que sistemas funcionais de reparo reduzem a
taxa de mutação entre 100 e 1000 vezes (Strand et al, 1993).
A estimativa precisa da taxa de mutação é um pré-requisito para a
confiabilidade de teste de paternidade e identificação humana que
utilizam marcadores moleculares genéticos. Diversos fatores potenciais
podem contribuir para as diferenças observadas na dinâmica evolutiva
dos microssatélites: número de
repetições
(Wierdl
et
al.,
1997)
seqüência repetida (Weber e Wong, 1993; Chakraborty et al., 1997),
seqüência flanqueadora (Glenn et al., 1996) e taxa de recombinação
(Begun e Aquadro, 1992).
O alto nível de variabilidade e a ampla dispersão no genoma
humano, fazem das STRs uma fonte profícua de marcadores genéticos
para estudos evolutivos e antropológicos (Drmic et al., 1998; Mauricioda-Silva et al., 2000; Cainé et al., 2005; Rodrigues et al., 2007), bem
como úteis para identificação de indivíduos em ciência forense, teste de
paternidade, predição de parentesco evolutivo e grau de diversidade
genética das diferentes populações do mundo (Frégeau et al., 1998;;
Bydlowski et al., 2003; Pereira et al., 2007). Recentemente, as STRs têm
sido aplicadas também no monitoramento de transplante de medula
óssea (Santana et al, 2004).
A eficácia das STRs na caracterização genética de diversas
populações se dá pela variabilidade das freqüências alélicas e pela
presença ou ausência de determinados alelos nas diferentes populações.
Por exemplo, o alelo 8 do loco TPOX (autossômico) e os alelos 23 e 24
do loco DYS390 são freqüentes em populações da Europa, Ásia, África,
Oceania e América (Huang et al., 1995; Budowle et al., 1997; Pu et al.,
1999; Pablo
et al.,2004; Alves et al., 2005; Rosa
et al., 2006). Por
outro lado, o alelo 6 do loco TPOX, o 7 do CSF1PO, o 20 do DYS390 e os
alelos 14 e 15 do DYS392 são encontrados em populações africanas e
estão ausentes em populações européias, ameríndias e asiáticas (
Garofano et al., 1998; Lins et al.,1998; Pu et al., 1999; Pérez-Lezaun et
al.,2000). Em relação as X-STRs, a distribuição das freqüências alélicas
18
Silva, V.C.
do loco DXS8377, observada em oito populações diferentes (Tabela 2),
mostra que doze alelos estão presentes nas oito populações (do alelo 43
ao 54), no entanto, o alelo 33 foi encontrado apenas na população da
China e o alelo 59 só foi detectado na população da África (Toni et al.,
2003; Chen et al., 2004; Tabbada et al., 2005; Poetch et al., 2005;
Pereira et al., 2007; Gomes et al., 2007).
Tabela 2. Freqüências alélicas do loco DXS8377 em oito populações
Alelo
Alemã
Italiana
Espanhola
Portuguesa
Africana
33
Japonesa
Filipina
0.003
37
0.004
38
0.004
39
Chinesa
0.007
40
0.008
0.012
0.003
0.002
0.003
0.004
0.003
0.012
0.017
0.021
0.012
0.023
0.009
41
0.016
0.042
0.017
0.020
0.008
0.019
42
0.020
0.071
0.041
0.040
0.046
0.031
0.011
43
0.043
0.071
0.045
0.029
0.062
0.082
0.032
0.029
44
0.075
0.067
0.055
0.058
0.069
0.070
0.032
0.052
45
0.049
0.088
0.083
0.043
0.085
0.135
0.074
0.064
46
0.089
0.125
0.107
0.075
0.085
0.123
0.137
0.121
47
0.095
0.133
0.072
0.098
0.054
0.126
0.095
0.104
48
0.098
0.108
0.086
0.101
0.085
0.120
0.116
0.133
49
0.105
0.096
0.100
0.124
0.131
0.089
0.168
0.104
50
0.108
0.075
0.121
0.121
0.046
0.063
0.126
0.121
51
0.138
0.046
0.086
0.115
0.046
0.065
0.074
0.064
52
0.062
0.017
0.045
0.032
0.054
0.041
0.042
0.081
53
0.043
0.017
0.052
0.052
0.085
0.012
0.042
0.041
54
0.016
0.008
0.031
0.023
0.039
0.007
0.021
0.041
55
0.020
0.004
0.017
0.014
0.031
0.021
0.017
56
0.016
0.004
0.014
0.017
0.031
0.003
0.012
0.008
57
58
59
0.006
0.011
0.012
0.008
Fonte: Poetch et al., 2005; Pereira et al., 2007; Gomes et al., 2007; Chen et al., 2004;
Tabbada et al., 2005; Toni et al., 2003
19
Silva, V.C.
Atualmente, as STRs autossômicas são os marcadores moleculares
mais utilizados em identificação humana e teste de paternidade, devido
ao seu alto poder de discriminação e fácil análise. Entretanto, em casos
especiais, onde é necessária a identificação do sexo ou em casos
complexos de investigação de paternidade/maternidade, a investigação
de marcadores localizados nos cromossomos sexuais é indispensável
(Quintana-Murci et al, 2001). As STRs do cromossomo X e Y são úteis
porque são transmitidas de pai para filho (Y) ou para filha (X) como
haplótipos
(conjunto
de
alelos
situados
no
mesmo
segmento
cromossômico que tendem a ser transmitidos em bloco na genealogia).
A aplicação das Y-STRs e X-STRs como ferramentas é apropriada
principalmente em genética forense porque todos os homens em uma
linhagem parental compartilham o mesmo Y haplotípico e, por outro
lado, os homens também transmitem o mesmo cromossomo X sem
recombinação para todas as suas filhas. Desta forma, pode-se obter um
maior poder de exclusão ou maior probabilidade de inclusão em casos de
testes de paternidade por exemplo, pois dependendo do grau de
polimorfismo dos
diferentes locos, os haplótipos têm freqüências tão
baixas que torna cada indivíduo quase único (Strachan e Read, 2002;
Edelmann et al., 1999).
20
Silva, V.C.
2.3. O cromossomo X humano e suas STRs
As propriedades únicas do cromossomo X são conseqüências da
evolução dos cromossomos sexuais nos mamíferos. Os cromossomos
sexuais evoluíram de um par de autossomos nos últimos 300 milhões de
anos (myr) (Ohno, 1967). Os elementos originais e funcionais foram
conservados no cromossomo X, todavia, o cromossomo Y perdeu quase
todos os traços do autossomo ancestral, incluindo os genes que foram
outrora compartilhados com o cromossomo X. A hemizigosidade dos
machos para quase todos os genes do cromossomo X expõe fenótipos
recessivos, o que contribuiu para o conhecimento do grande número de
doenças que têm sido associadas ao cromossomo X (OMIN).
A conseqüência biológica da evolução dos cromossomos sexuais
(nos seres humanos) é a principal razão do intenso interesse nos
cromossomos X e Y humanos nas últimas décadas. O processo evolutivo
dos
alossomos
resultou
em
modificações
da
estrutura
e
do
comportamento desses cromossomos que se refletem em diferenças de
características como volume de repetições, taxa de mutação, quantidade
de genes e estrutura haplotípica (Ross et al., 2005).
O cromossomo X tem aproximadamente 155 Mb de comprimento e
56% de sua região eucromática é constituída por seqüências repetitivas,
sendo este percentual maior do que a média do genoma que é de 45%.
Até o momento, 153.146 SNPs (Single- nucleot ide polym orphism s) e 269
STRs foram descritas para o cromossomo X (Ross et al., 2005).
Das 269 STRs para o cromossomo X apenas 26 X-STRs são
utilizadas em estudos populacionais e análises forenses (Tabela 3). Os
critérios
utilizados
para
a
seleção
das
26
X-STRs
são:
a)
alto
polimorfismo; b) alto poder de discriminação; c) apresentarem unidades
de
repetição
aumentam
a
partir
de
três
nucleotídeos
(essas
características
as chances de sucesso na PCR) e d) a possibilidade de
constituírem sistemas de amplificação multiplex.
21
Silva, V.C.
Tabela 3. Principais informações referentes as X-STRs mais utilizadas
em estudos populacionais e análises forenses.
Loco
N0
Tamanho
Unidade de
Localização
Alelo
(pb)
Repetição
Citogenética
Referência
DXS 101
17
181-238
(CTT) n (ATT) n
Xq21
Szibor et
al., 2003
DXS 981
14
209-238
(AGAT)n
Xq11.2 – 13.1
DXS 6789
12
154-198
(TATG)n (TATC)n
Xq22.3
DXS 6797
8
245-281
(ATCT) n
DXS 6800
7
194-218
(TAGA) n (GATA)n
DXS 6801
8
109-141
(ATCT) n
Xq21
DXS 6803
7
109-128
(TCTA) n
Xq12-Xq21.33
DXS 6804
7
173-201
DXS 6807
8
251-275
(GATA) n
Xpter-Xp22.2
DXS 6809
12
235-279
Xq21.33
DXS 6810
7
219-243
(CTAT) n (ATCT) n
(TATC) n
(CTGT) n (CTAT) n
DXS 7132
9
272-304
(TCTA) n
X Cenq11
Shin et al.,
2005
Hering et
al., 2001
Shin et al.,
2005
Edelmann
et al., 2002
Szibor et
al., 2005
Son et
al.,2002
Kang e Li,
2006
Poetsch et
al., 2005
Szibor et
al., 2005
Shin et al.,
2005
DXS 7133
8
104-128
(ATAG) n
DXS 7423
5
181-197
(TCTA) n
Xq27-28
DXS 7424
12
147-180
(TAA) n
Xq21
DXS 8377
25
204-276
Xq28
DXS 8378
7
110-134
(AGA)x-(GGA-AGA)y(AGA)2-GGA-(AGA)6
(CTAT) n
DXS 9895
19
139-163
(AGAT) n
Xpter-Xp22.2
DXS 9898
7
188-215
DXS 9902
7
152-176
DXS 10011
39
131-287
Xq21.33
A: (GAAA)n GAAG GAAA
(GGAA)4(AGAA)3
B: GAAA GA (GAAA)k GAGA
GAAA)m GAAG GAAA (GGAA)4
(AGAA)3
Xq28
Szibor et
al., 2003
Edelmann
et al., 2002
Edelmann
et al., 2002
Poetsch et
al., 2005
Edelmann
et al., 2002
Edelmann
et al., 2002
Edelmann
et al., 2002
Poetsch et
al., 2005
Edelmann
et al., 2001
Matsuki,
1999
22
Silva, V.C.
Tabela 3. (continuação)
Loco
N0
Tamanho
Unidade de
Localização
Alelo
(pb)
Repetição
Citogenética
GATA172D05
7
108-132
(AGAT) n
GATA165B12
6
117-141
(AGAT) n
GATA31E08
9
240-260
ARA
22
260-366
(CAG) n
X Cenq13
HPRTB
10
279-307
(AGAT) n
Xq26
Referência
Edelmann
et al., 2002
Asamura et
al., 2006
Shin et al.,
2005
Edwards et
al., 1992
Poetsch et
al., 2005
A análise simultânea de STRs localizadas no mesmo cromossomo
requer o conhecimento dos locos ligados e a ocorrência de desequilíbrio
de ligação entre os mesmos. Alelos de locos ligados formam haplótipos
que recombinam durante a meiose a uma freqüência correspondente a
distância entre eles (distância genética), e o desequilíbrio de ligação
refere-se a combinação não aleatória dos alelos de locos diferentes no
cromossomo. No cromossomo X, em decorrência da recombinação
ocorrer quase que exclusivamente na linhagem germinativa feminina, o
desequilíbrio
de
ligação
entre
os
marcadores
diminui
mais
vagarosamente ao longo das gerações se comparado aos autossomos
(Pereira et al, 2007).
Foram descritos grupos de ligação para 17 locos de X-STRs
utilizados
em
prática
forenses
(Figura1).
A
ordem
e
a
posição
aproximada das X-STRs no ideograma foram baseadas em informações
do mapa do NCBI e suas distâncias em centi-Morgam (cM) foram
calculadas dois a dois (pair-wise). Considerando os locos de STRs
presentes
no
ideograma
apenas
os
locos
DXS101
e
DXS7424
apresentaram desequilíbrio de ligação (p<0.001). As seis STRs do
cromossomo X, analisadas no presente trabalho, estão localizadas em
dois grupos de ligação: grupo 2- DXS7132, ARA, DXS6789 e DXS101 e
grupo 4- DXS8377 e DXS10011, ambos no braço longo do cromossomo
X. As DXS7132 e ARA situam-se na região Peri-centromérica, as
23
Silva, V.C.
DXS8377 e DXS10011 na Xq28 e as DXS6789 e DXS101na região Xq21
(Szibor, et al., 2003).
Figur a 1 -
DXS6807
DXS9895
DXS8378
DXS9902
5.9 cM
6.7 cM
10.0 cM
10.0 cM
DXS7132
ARA
DXS6800
DXS9898
DXS6789
DXS101
DXS7424
DXS7133
GATA172D05
4.5 cM
4.5 cM
10.9 cM
3.6cM
9.3 cM
6.7 cM
4.8 cM
3.9 cM
11.4 cM
HPRTB
14.0 cM
DXS7423
DXS8377
DXS10011
8.2 cM
8.2 cM
Grupo de ligação 1
Ideograma da localização de X- STRs usadas em práticas forenses
(Szibor, et al., 2003)
As principais informações relativas as seis X-STRs selecionadas
para caracterizar a população de Pernambuco são descritas a seguir.
As DXS8377, DXS101 e ARA apresentam a unidade de repetição
trinucleotídica, entretanto, a composição do trinucletídeo varia na
DXS8377 e DXS101 (unidade de repetição complexa). Das X-STRs com
repetição tetranucleotídica apenas a DXS7132 não apresenta variação ao
longo
das
unidades
de
repetição.
As
X-STRs
selecionadas
para
caracterizar a população pernambucana estão entre as 15 mais
polimórficas utilizadas em estudos populacionais, sendo a DXS10011 a
mais polimórfica com 39 alelos descritos e a DXS7132 a menos
polimórfica com 9 alelos descritos (Tabela 4) (Edelmann et al., 2002;
Poetsch et al., 2005; Hering et al., 2001; Allen e Belmont, 1993; Szibor
et al., 2003; Edwards et al., 1992; Tilley et al., 1989; Hering et al.,
2004; Matsuki, 1999).
24
Silva, V.C.
Tabela 4. Principais informações referentes as DXS7132, DXS6789,
DXS8377, DXS101, DXS10011 e ARA.
Loco
DXS7132
DXS8377
DXS6789
DXS101
ARA
DXS1001
Localização
X Cenq11
Xq28
Xq21
Xq21
X Cenq13
Xq28
Unidade repetitiva
(TCTA) n
(AGA)x-(GGA-AGA)y-(AGA)2-GGA-(AGA)6
(TATC) (TATG)n (TATC)n
(CTT) n (ATT) n
(CAG) n
A: (GAAA)n GAAG GAAA (GGAA)4(AGAA)3
B: GAAA GA (GAAA)k GAGA (GAAA)m
GAAG GAAA (GGAA)4 (AGAA)3
N-o de
alelos
9
25
12
15
22
39
pb
272-304
204-276
154-198
181-232
260-326
131-287
x,y,m e n correspondem ao número de vezes em que as estruturas entre parênteses se repetem.
Fonte: Edelmann et al., 2002; Poetsch et al., 2005; Hering et al., 2001; Allen e
Belmont, 1993; Szibor et al., 2003; Edwards et al., 1992; Tilley et al., 1989; Hering et
al., 2004; Matsuki, 1999.
Embora as freqüências alélicas das seis X-STRs variem de
população para população, os alelos 13 e 14 do loco DXS7132, por
exemplo, são os mais freqüentes em populações etnicamente tão
diferentes quanto a tailandesa, coreana, africana, portuguesa e hispânica
(Chen e Pu, 2004; Shin et al., 2005; Pereira et al, 2007). Esta variação
também leva a discrepâncias entre as freqüências de um mesmo alelo
em diferentes populações, como pode ser observado para o alelo 20 do
loco DXS6789, cuja freqüência é de 0.0379 na população da China e
0.4352 na de Portugal. Um outro exemplo é dado pelo loco DXS101: os
alelos
14-18
encontrados
nas
populações
germânica,
italiana
e
portuguesa (Toni et al., 2003; Pereira et al., 2007) estão ausentes em
populações asiática (Tabbada et al., 2004) .
Em geral as STRs encontram-se dispersas por todo o genoma e se
localizam fora dos genes expressos (Strachan e Read, 2002). No
entanto, a X-STR ARA localiza-se no exon 1 do gene para o receptor de
androgênio humano, X cenq13 e consiste em repetições do trinucleotídeo
CAG (Edwards et al., 1992; Tilley et al., 1989). A redução das repetições
CAG tem sido associada ao aumento do risco de câncer de próstata e de
tumores dependentes de androgênio (Chamberlain et al., 1994; Choong
25
Silva, V.C.
et al., 1996). Os androgênios são os principais hormônios sexuais
masculinos,
responsáveis
pela
diferenciação
sexual
secundária,
espermatogênese, crescimento dos órgãos sexuais acessórios, incluindo
a proliferação e diferenciação de células prostáticas. Os efeitos dos
androgênios são mediados através da proteína receptora de androgênio,
uma ligante ativadora do fator de transcrição nuclear. Baseados nestes
fatos, Coetzee e Ross (1994) supõem que a variação na atividade
transcricional do ARA, relacionada a repetições polimórficas CAG,
influencie a carcinogênese prostática. Um estudo realizado por Mishra et
al (2005) encontrou que indivíduos com repetições = 22 tem 2.9 vezes
mais chance de desenvolver o câncer de próstata que indivíduos com
repetições CAG maior que 22. Um risco 3.7 vezes maior foi descrito
quando se compararam repetições CAG = 17 com repetições > 17. Esta
associação é biologicamente plausível porque as repetições curtas
impõem uma alta atividade de trans ativação no receptor e aumenta a
afinidade de ligação a androgênios. Dezenove alelos foram descritos na
população italiana para a XSTR ARA e estudos realizados nesta e em
outras populações européias mostram que alelo o 21 é o mais freqüente
(Pelotti et al., 2001).
26
Silva, V.C.
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34
Silva, V.C.
4. Manuscrito de Artigo Científico
35
Silva, V.C.
P o l i m o r f i sm o d a s X - S T R s D X S7 1 3 2 , D X S8 3 7 7 ,
D X S6 7 8 9 , D X S1 0 1 , D X S1 0 0 1 1 e A R A n a p o p u l a çã o d e
P e r n a m b u co , B r a si l
Manuscrito a ser
encaminhado à revista
Journal of Forensic
Science
ISSN 0022-1198
PA, U.S.A
36
Silva, V.C.
Polimorfismo das X- STRs DXS7132, DXS8377,
DXS6789, DXS101, DXS10011 e ARA na população de
Pernambuco, Brasil
Vanessa Cavalcante da Silva, Adriana Vieira Gomes, Maria da Gloria
Raposo, Paula Braga Ferreira, Luiz Maurício-da-Silva, Rosilda dos Santos
Silva.
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
Endereço:
Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Genética.
Avenida Professor Morais Rego, s/n, Laboratório de Genética Molecular Humana, Cidade
Universitária
50670-420-Recife, PE-Brasil.
Telefone: (81) 21268512 Fax: (81) 21268512
37
Silva, V.C.
Resumo
As Seqüências Repetidas em Tandem (STRs) presentes nos
cromossomos sexuais são ferramentas importantes na genética
forense. As X-STRs são especialmente úteis em casos complexos de
testes de paternidade e naqueles de identificação de sexo. Com o
objetivo de caracterizar a população pernambucana quanto ao
polimorfismo
de
seis
X-STRs
(DXS7132,
DXS6789,
DXS8377,
DXS101, DXS10011 e ARA), foi analisado um total de 300 homens e
300 mulheres não aparentados. O teste para o desequilíbrio de
ligação entre os locos na subamostra feminina não revelou evidência
consistente de associação entre os marcadores (p>0,214) e a
verificação da diversidade haplotípica, na subamostra masculina,
revelou que todos os haplótipos foram únicos. A heterozigosidade
variou de 0,743 (DXS7132) a 0,937 (DXS8377) e o poder de
discriminação (PD) de 0,906 (DXS7132) a 0,993 (DXS10011). Com
base no cálculo da distância genética a partir dos dados dos
marcadores DXS7132, DXS8377, DXS6789 e DXS101, concluiu-se
que a população pernambucana está geneticamente mais próxima da
(0.036). O presente trabalho demonstra que estes marcadores
genéticos
são
altamente
discriminantes
e,
portanto,
úteis
em
propósitos forenses e estudos populacionais.
Palavras- chave: Cromossomo X; STRs; População de Pernambuco,
Polimorfismo Genético.
38
Silva, V.C.
Introdução
As STRs (Short tandem repeats) ou microssatélites contêm
unidades de repetição que variam de 2-6 pb de comprimento, estão
amplamente
distribuídos
no
genoma
humano,
apresentam
segregação mendeliana e geralmente mostram um alto grau de
polimorfismo (grande número de alelos por loco, a maioria deles com
freqüências inferiores a 1%) [1,2].
A grande maioria das publicações referentes à análise do
polimorfismo de microssatélites envolve locos autossômicos, e estes
são amplamente aplicados em análises de manchas presentes em
cena de crimes, identificação molecular post m ort em e teste de
paternidade [3,4]. Entretanto, em alguns casos especiais, por
exemplo, onde o pai alegado não pode ser tipado, mas seus parentes
podem ser investigados, ou quando se quer identificar se presumidas
meias-irmãs têm o mesmo pai biológico, mas os pais não podem ser
testados, a investigação de marcadores alossômicos pode ser mais
informativa que a investigação de polimorfismos autossômicos [5, 6,
7] pois as fêmeas de uma mesma linhagem paterna compartilham o
mesmo X.
De uma maneira geral, a literatura especializada tem relatado
muito mais dados sobre o polimorfismo de STRs do cromossomo Y do
que do X. Dados de genética de populações para STRs do
cromossomo X (X-STRs) são disponíveis em poucos grupos étnicos,
embora o polimorfismo de muitos locos tenha sido publicado [7, 8].
Considerando o potencial das X-STRs em casos específicos de
testes de paternidade e de análises forenses, e também o fato de que
a distribuição alélica dos marcadores de DNA frequentemente diferem
em populações separadas geograficamente, o objetivo do presente
trabalho é criar um banco de dados referente às freqüências alélicas
dos
locos
de
STRs
DXS7132,
DXS8377,
DXS6789,
DXS101,
DXS10011 e ARA, na população de Pernambuco, para validação dos
39
Silva, V.C.
testes de paternidade e propiciar estudos antropológicos uma vez que
estamos analisando uma população miscigenada.
Materiais e métodos
Amostras e extração do DNA
Amostras
sangüíneas
para
o
estudo
populacional
foram
coletadas de 300 homens e 300 mulheres não aparentados da
população do Estado de Pernambuco. A extração de DNA das
amostras de sangue total foi realizada pelo método m ini salt ing out
com posterior digestão por proteinase K [9].
Amplificação por PCR e genotipagem
A PCR foi realizada em 25µ L de reação contendo 30ng de DNA
genômico, 1x PCR buffer, 1.5 mM de MgCl2, 200µ M de cada dNTP, 1U
t aq polym erase (Invitrogen Life Techologies, Carlsbad, CA,USA) e 10
pmoles de cada primer para as DXS7132, DXS8377, DXS101,
DXS10011, ARA e 6 pmoles para a DXS6789. A seqüência dos
primers utilizados foram publicadas em estudos anteriores [10, 11,
12, 13, 14]. Das seis X-STRs investigadas, três (DXS7132, DXS8377,
DXS6789) foram analisadas em sistema multiplex e as demais em
sistemas monoplex. Foi usado o seguinte protocolo de PCR: uma
desnaturação inicial de 12 min a 95 oC seguida por 30 ciclos de 1 min
a 95 oC, 1 min a 62 oC para os sistemas monoplex e 62.5 oC para o
triplex, 3 min a 72 oC, e uma extensão final de 30 min a 72 oC no
termociclador MJ Research. Os produtos da PCR foram separados por
eletroforese, em gel de poliacrilamida 5% desnaturante contendo
uréia 7M e tampão TBE 1x, após serem submetidos a uma voltagem
constante de 2000 V no seqüenciador manual Hoefer SQ3 Sequencer
(Hoefer Pharmacia Biotech, São Francisco, CA). A revelação foi feita
pelo método de impregnação com nitrato de prata [15] e a tipagem
alélica foi baseada na comparação dos alelos com o controle K562
40
Silva, V.C.
(Promega, USA) como recomendado por Szibor et al [16], aliado ao
uso de marcadores de tamanho de fragmento.
Análise estatística
As freqüências alélicas, o PIC (Índice de informação do
polimorfismo), a H
obs
(heterozigosidade observada), o PE (poder de
exclusão), e o PD (poder de discriminação) foram calculados pelo
programa PowerStats V12 (http://www.promega.com/geneticidtools).
O teste Markov para verificação do equilíbrio de Hardy-Weinberg
(dados femininos), as freqüências haplotípicas e o desequilíbrio de
ligação entre os locos estudados foram calculados usando o programa
ARLEQUIN ver 3.1 [17], considerando significativo o valor de p menor
que 0,05. A distância genética entre diferentes populações foi
examinada usando o programa Dispan [18].
Resultados e discussão
As freqüências alélicas e parâmetros forenses calculados para
as
seis
X-STRs
analisadas
na
amostra
feminina
e
masculina
encontram-se nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. O teste do quiquadrado mostrou que não houve diferença significante entre as
freqüências alélicas de machos e fêmeas (p>0.9 em todos os locos) e
a verificação do equilíbrio de Hardy-Weinberg realizado na amostra
feminina indicou que a distribuição genotípica não desviou do
equilíbrio em nenhum dos locos.
Para cada loco, foram encontrados de nove a trinta e oito
alelos, totalizando 114 alelos reunindo os seis marcadores estudados.
Os locos DXS10011, DXS8377, DXS101 e ARA foram os mais
polimórficos, apresentando 38, 20, 19 e 17 alelos, respectivamente.
41
Silva, V.C.
Observamos que os alelos 18 (DXS10011), 58 (DXS8377), 10
(DXS7132) e 31 (DXS101) foram encontrados apenas na subamostra
feminina. Embora o número de machos e fêmeas analisados tenha
sido o mesmo, devemos considerar que, além do fato dos citados
alelos serem raros (freqüências de 0,007, 0,002, 0,002 e 0,003,
respectivamente, inferiores a 1%), a amostra feminina tem o dobro
do número de alelos quando comparada a masculina que é
hemizigota com relação ao cromossomo X, o que pode explicar o
achado.
O teste para o desequilíbrio de ligação entre os locos na
subamostra feminina não revelou evidência consistente de associação
entre os marcadores (p>0,214) e entre os 300 homens tipados, todos
os haplótipos foram únicos (não compartilhados). Com base nos
dados da subamostra feminina, a heterozigosidade observada nos
locos (Hobs) variou de 0,743 (DXS7132) a 0,937 (DXS8377), o índice
de informação do polimorfismo (PIC) de 0,73 (DXS7132) a 0,95
(DXS10011) e o poder de discriminação (PD) de 0,906 (DXS7132) a
0,993 (DXS10011). Esses dados atestam que os seis marcadores (PD
conjunto= 0,999) são muito úteis na resolução de casos complexos
de testes de paternidade.
A partir dos dados disponíveis para os marcadores DXS7132,
DXS8377, DXS6789 e DXS101 foi calculada a distância genética de
Ney comparando pernambucanos, portugueses, espanhóis e afroamericanos [19, 20]. Analisando o dendrograma gerado com
base
nas freqüências alélicas desses quatro locos (Figura 1) concluímos
que a população pernambucana está geneticamente mais próxima da
(0.036). Esses resultados corroboram outros estudos realizados na
mesma
população
confirmam
a
com
marcadores
contribuição
genética
autossômicos
da
população
[21,
22]
européia
e
na
miscigenada população pernambucana que apresenta, com base em
inferências históricas, contribuições européia, africana e indígena.
42
Silva, V.C.
Tabela 1. Freqüências alélicas e parâmetros forenses das DXS7132,
DXS6789, DXS101, ARA, DXS10011 e DXS8377 em amostra feminina
da população de Pernambuco.
ALELOS DXS7132 DXS8377 DXS6789 DXS101 DXSARA ALELOS DXS10011
(n=600) (n=600) (n=600) (n=600) (n=600)
(n=600)
10
0,002
17
0,002
11
0,012
18
0,007
12
0,117
22
0,003
13
0,275
0,007
23
0,007
14
0,319
0,003
0,008
0,015
24
0,005
15
0,198
0,102
0,018
0,012
25
0,012
16
0,055
0,062
0,007
0,028
26
0,010
17
0,015
0,007
0,008
0,052
27
0,020
18
0,007
0,005
0,048
0,087
28
0,022
19
0,065
0,048
0,108
29
0,028
20
0,322
0,047
0,110
29.2
0,022
21
0,258
0,062
0,152
30
0,007
22
0,128
0,045
0,100
30.2
0,010
23
0,043
0,053
0,090
31
0,017
24
0,005
0,174
0,100
31.2
0,023
25
0,138
0,067
32
0,030
26
0,132
0,035
32.2
0,028
27
0,122
0,017
33
0,042
28
0,050
0,012
33.2
0,030
29
0,025
0,008
34
0,015
30
0,012
34.2
0,022
31
0,003
35
0,028
37
0,008
35.2
0,018
40
0,015
36
0,070
41
0,028
37
0,065
42
0,033
38
0,073
43
0,060
39
0,063
44
0,055
40
0,060
45
0,062
41
0,077
46
0,095
42
0,062
47
0,110
43
0,040
48
0,122
44
0,032
49
0,100
45
0,017
50
0,117
46
0,013
51
0,070
47
0,012
52
0,040
48
0,002
53
0,023
49
0,003
54
0,023
50
0,003
55
0,022
56
0,008
57
0,007
58
0,002
P
0,053
0,952
0,240
0,727
0,520
0,050
H obs
0,743
0,937
0,770
0,857
0,897
0,850
PIC
0,73
0,91
0,77
0,89
0,90
0,95
PE
0,498
0,871
0,545
0,708
0,789
0,695
PD
0,906
0,986
0,929
0,980
0,981
0,993
p: Equilíbrio de Hardy-Weinberg para os dados femininos.
43
Silva, V.C.
Tabela 2. Freqüências alélicas e parâmetros forenses das DXS7132,
DXS6789, DXS101, ARA, DXS10011 e DXS8377 em amostra
masculina da população de Pernambuco
ALELOS
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
37
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
PIC
PD
DXS7132 DXS8377 DXS6789 DXS101 DXSARA ALELOS DXS10011
(n=300) (n=300) (n=300) (n=300) (n=300)
(n=300)
0,010
17
0,003
0,083
22
0,007
0,273
0,003
0,010
23
0,010
0,384
0,003
0,007
0,023
24
0,007
0,183
0,070
0,010
0,003
25
0,013
0,050
0,057
0,010
0,017
26
0,017
0,010
0,003
0,007
0,037
27
0,017
0,007
0,017
0,023
0,090
28
0,013
0,030
0,040
0,123
29
0,040
0,357
0,053
0,110
29.2
0,013
0,273
0,067
0,144
30
0,013
0,123
0,030
0,107
30.2
0,017
0,060
0,073
0,077
31
0,023
0,007
0,178
0,120
31.2
0,027
0,163
0,083
32
0,033
0,173
0,033
32.2
0,027
0,093
0,013
33
0,027
0,030
0,007
33.2
0,043
0,037
0,003
34
0,020
0,003
34.2
0,020
0,003
35
0,023
0,003
35.2
0,020
0,020
36
0,080
0,047
37
0,057
0,043
38
0,033
0,060
39
0,084
0,083
40
0,088
0,100
41
0,053
0,119
42
0,067
0,116
43
0,033
0,087
44
0,013
0,070
45
0,023
0,067
46
0,010
0,067
47
0,013
0,057
48
0,003
0,027
49
0,003
0,017
50
0,007
0,007
0,007
0,69
0,92
0,74
0,87
0,89
0,95
0,735
0,921
0,770
0,885
0,902
0,955
44
Silva, V.C.
Figura 1 . Dendrograma construído de acordo com o método UPGMA
usando a distância genética obtida a partir das freqüências
alélicas observadas nos locos DXS7132, DXS6789, DXS101 e
DXS8377 em pernambucanos, portugueses, espanhóis e em
afro-americanos.
45
Silva, V.C.
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variation and
DXS9895,
allele
nomenclature
DXS8378,
DXS7132,
for
the
X-linked
DXS6800,
STRs
DXS7133,
47
Silva, V.C.
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49
Silva, V.C.
5 . A B S T R A CT
The short tandem repeats (STRs) in sex chromosomes are important
tools in forensic genetics. The STRs on the X chromosome (X-STRs)
are particularly useful in complex cases of paternity tests and in those
involving sex identification. The present study set out to genetically
characterize
X-STRs
(DXS7132,
DXS6789,
DXS8377,
DXS101,
DXS10011 and ARA) in a population of 600 unrelated people in
Pernambuco. Half this population was male and half female. The
test for the linkage disequilibrium between the loci in the female
subsample showed no consistent evidence of association between the
markers (p> 0.214), while that for haplotypical diversity in the male
subsample
showed
that
all
haplotypes
were
unique.
The
heterozygosity ranged from 0.743 (DXS7132) to 0.937 (DXS8377)
and the power of discrimination (DP) from 0.906 (DXS7132) to 0.993
(DXS10011). Based on the calculation of the genetic distance of
markers
DXS7132,
DXS8377,
DXS6789
and
DXS101,
it
was
concluded that the population of Pernambuco is genetically closer to
the Portuguese (0.022) and Spanish (0.029) populations than to
those of Afro-Americans (0.036). This study demonstrates that these
genetic markers are highly discriminating and therefore useful for
forensic
purposes
and
population
studies.
Keywords: X chromosome; STRs; Pernambuco population, Genetic
Polymorphism.
50
Silva, V.C.
6 . Informações Complementares
51
Silva, V.C.
Ta be la
1.
Seqüências
dos
pares
de
primers
utilizados
para
amplificação por PCR dos locos de STR do cromossomo X.
Loco de STR
DXS101
DXS10011
DXS8377
DXS6789
Seqüência dos Primers
Referência
Primer 1:5´-ACTCTAAATCAgTCCAAATATCT
Edelmann
Primer2: 5´- AAATCACTCCATggCACATgTAT
Szibor, 2001
Primer 1: 5´-CTgAgATTgCACCATTgCAC
Hering
Primer 2: 5´-TgggAgAACCgTTTgAAgTT
2004
Primer 1: 5´- CACTTCATggCTTACCACAg
Edelmann et al.,
Primer 2: 5´-gACCTTTggAAAgCTAgTgT
2002
Primer1: 5´-gTTggTACTTAATAAACCCTCTTT
Hering
Primer 2: 5´-AgAAgTTATTTgATgTCCTATTgT
2001
et
e
al.,
et
al.,
Primer.2:5´-AATCAgTgCTTTCTgTACTATTCC
GDB
Primer 1: 5´-TCCAgAATCTgTTCCAgAgCgTgC
Desmarais
et
Primer 2: 5´-gCTgTgAAggTTgCTgTTCCTCAT
al., 1998
Primer 1: 5´- AgCCCATTTTCATAATAAATCC
DXS7132
ARA
52
Silva, V.C.
Ta be la 2 . Freqüências genotípicas observadas no loco DXS7132 em
amostra
de
300
indivíduos
do
sexo
feminino
do
estado
de
Pernambuco.
ALELO
10
11
12
13
14
15
16
17
18
10
0
0
0
0
0
0
0
0
0
11
0
0
0
0
0
0
0
0
0
12
0
0
5
0
0
0
0
0
0
13
0
2
14
28
0
0
0
0
0
14
1
2
23
54
30
0
0
0
0
15
0
0
13
35
34
14
0
0
0
16
0
3
7
3
14
6
0
0
0
17
0
0
1
1
4
2
0
0
0
18
0
0
2
0
0
1
0
0
1
53
Silva, V.C.
Ta be la 3 . Freqüências genotípicas observadas no loco DXS6789 em
amostra
de
300
indivíduos
do
sexo
feminino
do
estado
de
Pernambuco.
ALELO
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
14
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
15
0
7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
16
0
5
1
0
0
0
0
0
0
0
0
17
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
18
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
19
0
2
1
0
0
2
0
0
0
0
0
20
0
17
10
3
1
22
30
0
0
0
0
21
2
13
13
0
1
6
49
20
0
0
0
22
0
7
2
0
1
2
26
21
8
0
0
23
0
2
2
0
0
2
5
10
5
1
0
24
0
1
1
0
0
0
0
0
0
1
0
54
Silva, V.C.
Tabela 4 . Freqüências genotípicas observadas no loco DXS101 em
amostra
de
300
indivíduos
do
sexo
feminino
do
estado
de
Pernambuco.
ALELO 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
18
0
0
1
1
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
19
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20
0
2
0
0
1
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
21
0
1
1
0
5
2
2
1
0
0
0
0
0
0
0
22
1
0
0
0
2
0
1
2
0
0
0
0
0
0
0
23
0
1
0
0
0
3
2
1
3
0
0
0
0
0
0
24
0
1
0
2
4
5
7
7
2
4
13
0
0
0
0
25
1
3
0
1
2
5
4
3
2
4
13
12
0
0
0
26
3
1
0
0
3
2
3
6
4
5
13
6
7
0
0
27
0
0
0
1
4
5
4
3
7
2
12
7
10
7
0
28
0
1
0
0
0
1
0
1
1
5
5
1
7
2
1
29
0
0
0
0
0
1
0
1
1
2
1
4
1
2
2
30
0
0
0
0
1
1
0
0
1
0
2
1
0
0
1
31
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
55
Silva, V.C.
Tabela 5 . Freqüências genotípicas observadas no loco ARA em
amostra
de
300
indivíduos
do
sexo
feminino
do
estado
de
Pernambuco.
ALELO 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
15
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
16
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
17
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
18
1
2
0
1
3
1
0
0
0
0
0
0
0
0
19
0
0
1
0
4
7
5
0
0
0
0
0
0
0
20
2
1
1
2
2
7
12
6
0
0
0
0
0
0
21
0
1
0
2
8
5
9
9
7
0
0
0
0
0
22
0
1
0
1
4
4
5
5
12
2
0
0
0
0
23
0
1
2
3
2
6
5
7
3
8
2
0
0
0
24
0
1
1
2
2
6
3
4
12
7
7
3
0
0
25
0
0
0
1
2
5
2
0
10
4
5
4
2
0
26
0
0
0
3
1
1
5
1
2
0
2
1
1
1
27
0
0
0
0
0
0
1
1
2
1
2
2
0
1
28
0
0
0
0
0
0
2
0
1
1
0
1
1
1
29
0
0
0
0
0
1
0
0
2
0
0
1
1
0
56
Silva, V.C.
amostra
de
300
indivíduos
do
sexo
feminino
do
estado
de
Pernambuco.
ALELO
17
18
22
23
24
25
26
27
28
29
29.2
30
30.2
31
31.2
32
32.2
33
33.2
34
34.2
35
35.2
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
17
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
18
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
1
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0
1
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0
0
0
0
0
0
0
22
0
0
0
0
0
0
0
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0
1
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0
0
0
0
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
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0
0
0
23
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
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1
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0
0
0
1
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1
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0
0
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0
0
0
0
24
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
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0
0
0
0
0
0
0
1
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1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
25
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0
0
0
0
1
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0
0
0
0
0
0
1
1
1
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0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
26
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
27
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
1
0
0
0
1
2
0
1
0
0
1
0
0
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
28
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
2
2
0
1
0
0
0
2
0
0
0
0
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amostra
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do
sexo
feminino
do
Estado
de
Pernambuco.
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Silva, V.C.
7 . Anexos
61
Silva, V.C.
Instruções para Autores
Revista
Journal of Forensic Science
ISSN 0022-1198
PA, U.S.A
62
Silva, V.C.
INFORMATION FOR AUTHORS
The Journal of Forensic Sciences publishes original material in the following
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Paper --- full-length research report
Te ch n ica l N ot e --- description of a technical aspect of a field or issue, report on a
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shorter than papers.
Br ie f Com m u n ica t ion --- very brief technical communication, shorter than a
typical Technical Note. Brief Communications should generally be no more than 4-5
manuscript pages, including references, figures and tables.
Ca se Re por t --- usually brief description or analysis of an unusual case or a small
series or cases
Review --- full-length paper reviewing the state of the art or the published
literature in a particular area of sufficiently broad interest to the readership
Letter --- usually a discussion of a previously published item, or commentary on
the Journal or an issue of interest to the Academy. Publication of letters is at the
sole discretion of the Editor. Letters commenting on previously published items are
ordinarily shared with the original authors to afford them an opportunity to respond
to the commentary.
Re sponse t o Let t e r --- usually author(s) response to a Letter commenting on
their published work
Editorial or Invited Commentary --- commentary, invited by the Editor
Book Re vie w --- review of a book or other publication of interest to the forensic
sciences or closely related fields.
Spe cia l Com m u n ica t ion --- occasional communication of an editorial or
newsworthy nature
For t h e Re cor d --- a summary of population genetic data published under the
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63
Silva, V.C.
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1998;43(1-6), and in selected issues thereafter; and see below].
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Forensic Sci 1995 Mar-Nov;40(2-6), 1996 41, 1997; 42, 1998;43 and selected
issues thereafter; (2) JAMA 1993 May 5;269:2282-6; (3) N Engl J Med 1991 Feb
7;324(6):424-8; (4) Can Med Assoc J 1991;144(6):673-80; (5) BMJ 1991 Feb
9;302(6772):338-41; or (6) Med J Aust 1991;155(3):197-200.
The following integrates the Uniform Requirem ent s for Manuscript s Subm it t ed t o
Biom edical Journals as they apply to the Journal of Forensic Sciences with the
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tables (each table complete with title and footnotes on a separate page), and
legends for illustrations.
Illustrations must be good-quality, unmounted glossy prints, usually 127 x 173 mm
(5 x 7 in.), but no larger than 203 x 254 mm (8 x 10 in.). Submit an original and
three complete copies of manuscripts and illustrations in a heavy-paper envelope.
The submitted manuscript should be accompanied by a cover letter, as described
below, and permissions to reproduce previously published material or to use
illustrations that may identify human subjects. Authors should keep copies of
everything submitted.
Manuscript submissions should be accompanied by a cover letter specifying the
name, full mailing address and telephone/fax numbers and e-mail of the person
who will act as corresponding author, and the category (paper, technical note, etc.)
under which the item is submitted. The editor reserves the right to publish the
manuscript in a category different from the one specified by the author(s) at
submission.
The cover letter should also specify, if applicable, information about possible
duplicate publication problems, financial or other relationships that could give rise
to conflicts of interest, and any other information the editor may need to make an
informed decision in accordance with established policies and practices. The
manuscript must be accompanied by copies of any permissions to reproduce
64
Silva, V.C.
published material, to reproduce illustrations or report sensitive personal
information about identifiable persons, or to name persons for their contributions.
If color artwork is submitted, and if the authors believe color art is necessary to the
presentation of their work, the cover letter should indicate that one or more authors
or their institutions are prepared to pay the substantial costs associated with color
art reproduction.
Only the corresponding author need sign the cover letter. The corresponding
author's signature on the submission cover letter signifies: a) that all required
approvals and/or reviews have been obtained from authorized principals in the
laboratory and/or organization in which the work was performed The cover letter
can also explicitly state that such approvals have been obtained. The editor
reserves the right to request explicit, written approval of authorized laboratory
and/or organization principals before the work is accepted by the journal for peer
review. and b) that all authors have read the manuscript, concur in its contents, are
qualified for authorship by the criteria stated in these requirements, and believe the
submission to represent honest work.
The editor reserves the right to request explicit, written clarification of individual
author’s roles, their concurrence in the manuscript content, or any other issue that
must be resolved prior to accepting the manuscript for peer review.
The Journal does not accept submissions of manuscripts from third parties without
the explicit, written permission of the author(s).
PRIOR AND DUPLICATE PUBLICATION
As noted, this journal does not consider for publication a paper on work that has
already been reported in a published paper or that is described in a paper
submitted or accepted for publication elsewhere in print or in electronic media. This
policy does not preclude consideration of a paper that has been rejected by another
journal or of a complete report that follows publication of a preliminary report,
usually in the form of an abstract. Nor does it prevent consideration of a paper that
has been presented at a scientific meeting if not published in full in a proceedings
or similar publication.
Press reports of the meeting will not usually be considered as breaches of this rule,
but such reports should not be amplified by additional data or copies of tables and
illustrations.
When submitting a paper, an author should always make a full statement to the
editor about all submissions and previous reports might be regarded as prior or
duplicate publication of the same or very similar work. Copies of such material
should be included with the submitted paper to help the editor decide how to deal
with the matter.
Multiple publication-that is, the publication more than once of the same study,
irrespective of whether the wording is the same-is rarely justified. Secondary
publication in another language is one possible justification, providing the following
conditions are met: (1) the editors of both journals concerned are fully informed;
the editor concerned with secondary publication should have a photocopy, reprint,
or manuscript of the primary version; (2) The priority of the primary publication is
by a publication interval of at least 2 weeks; (3) The paper for secondary
publication is written for a different group of readers and is not simply a translated
version of the primary paper; an abbreviated version will often be sufficient; (4)
The secondary version reflects faithfully the data and interpretations of the primary
version; (5) A footnote on the title page of the secondary version informs readers,
peers, and documenting agencies that the paper was edited, and is being
published, for a national audience in parallel with a primary version based on the
same data and interpretations. A suitable footnote might read as follows: "This
article is based on a study first reported in the [title of journal, with full reference]."
Multiple publication other than as defined above is unacceptable. If authors violate
this rule, they may expect appropriate editorial action to be taken.
PREPARATION OF MANUSCRIPT
65
Silva, V.C.
Type or print out the manuscript on white bond paper, 216 x 279 mm (8 1/2 X 11
in.), or ISO A4 (212 X 297 mm), with margins of at least 25 mm (1 in.). Type or
print on only one side of the paper. Use double-spacing throughout, including title
page, abstract, text, acknowledgments, references, individual tables, and legends.
Number pages consecutively, beginning with the title page. Put the page number in
the upper right-hand corner of each page.
Title Page
The title page should carry: (a) the title of the article, which should be concise but
informative; (b) first name, middle initial, and last name of each author, with
highest academic degree(s); (c) institutional affiliation, name of department(s)
and/or institution(s) to which the work should be attributed; (d) official disclaimers,
if any; (e) name and address of author responsible for correspondence about the
manuscript; (f) source(s) of support in the form of grants, equipment, drugs, or all
of these; (g) a statement of where the work has been presented orally or in poster
form at professional meetings; and (h) a short running header of no more than 40
characters (count letters and spaces) placed near the bottom of the title page and
identified.
Institutional affiliations of authors should be numbered footnotes to the individual’s
name and highest academic degree.
If an author’s present address differs from the institution in which the work was
done, and is attributed, indicate a “Present address” for that author.
A footnote to the title of the manuscript (generally designated by a superscript *)
should give statements about where the work has been presented at professional
meetings, and should identify any sources of support.
Authorship
All persons designated as authors should qualify for authorship. The order of
authorship should be a joint decision of the coauthors. Each author should have
participated sufficiently in the work to take public responsibility for the content.
Authorship credit should be based only on substantial contributions to a) conception
and design, or analysis interpretation of data; and to b) drafting the article or
revising it critically for important intellectual content; and on c) final approval of the
version to be published. Conditions a), b), and c) must all be met. Participation
solely in the acquisition of funding or the collection of data does not justify
authorship. General supervision of the research group is not sufficient for
authorship. Any part of an article critical to its main conclusions must be the
responsibility of at least one author.
Editors may require authors to justify the assignment of authorship. Increasingly,
multi-center trials or work are attributed to a corporate author. All members of the
group who are named as authors, either in the authorship position below the title or
in a footnote, should fully meet the criteria for authorship as defined in the Uniform
Requirements. Group members who do not meet these criteria should be listed,
with their permission, under Acknowledgments or in an appendix (see
Acknowledgments).
Abstract and Key Words
The second page should carry an abstract of no more than 150 words. This journal
uses unstructured abstracts. The abstract should briefly state the purposes of the
study or investigation, basic procedures (selection of study subjects or laboratory
animals; observational and analytical methods), main findings (give specific data
and their statistical significance, if possible), and the principal conclusions.
Emphasize new and important aspects of the study or observations.
Below the abstract provide, and identify as such, 3 to 10 key words or short
phrases that will assist indexers in cross-indexing the article and may be published
with the abstract. Use terms from the medical subject headings (MeSH) list of
Index Medicus; if suitable MeSH terms are not yet available for recently introduced
terms, present terms may be used. The first key word is forensic science; the
second and subsequent words should assist abstracters in properly categorizing the
work so that it will be found in journal article data bases by interested researchers.
66
Silva, V.C.
Frequently, the second key word represents a subfield of forensic science, e.g.
forensic anthropology, forensic pathology, or DNA typing. In manuscripts on DNA
typing, every locus involved in the study should be listed as a separate key word.
Do not use abbreviations for key words, e.g., polymerase chain reaction, not PCR;
gas chromatography-mass spectrometry, not GC-MS.
Text
The text of observational and experimental articles is usually-but not necessarilydivided into sections with headings. This journal does not use an “Introduction”
heading. The introductory text begins on the first text page. Other typical headings
include Methods (or Materials and Methods), Results, and Discussion. Long articles
may need subheadings within the sections to clarify their content, especially the
Results and Discussion sections. Other types of articles such as case reports or
reviews are likely to need different headings and subheadings. Generally, avoid
overuse of subheadings, especially in the Methods section.
Introduction
In this journal, the text component of the manuscript begins with an introduction,
but we do not use the “Introduction” heading. State the purpose of the article.
Summarize the rationale for the study or observation. Give only strictly pertinent
references, and do not review referenced articles extensively. Do not include data
or conclusions from the work being reported.
Methods
Describe your selection of the observational or experimental subjects (patients or
laboratory animals, including controls) clearly. Identify the methods, apparatus
(manufacturer's name and address in parentheses), and procedures in sufficient
detail to allow other workers to reproduce the results. Give references to
established methods, including statistical methods (see below); provide references
and brief descriptions for methods, that have been published but are not well
known; describe new or substantially modified methods, give reasons for using
them, and evaluate their limitations. Identify precisely all drugs and chemicals
used, including generic name(s), dose(s), and route(s) of administration. Generally
avoid the overuse of subheadings in the Methods section. Describe the methods
and materials in narrative style, not in the style of a laboratory procedure handout.
Ethics
When reporting experiments on human subjects, indicate whether the procedures
followed were in accordance with the ethical standards of the responsible
committee on human experimentation (institutional or regional) or with the Helsinki
Declaration of 1975, as revised in 1983. Do not use patient's names, initials, or
hospital numbers, especially in illustrative material. When reporting experiments on
animals, indicate whether the institution's or the National Research Council's guide
for, or any national law on, the care and use of laboratory animals was followed.
Statistics
Describe statistical methods with enough detail to enable a knowledgeable reader
with access to the original data to verify the reported results. When possible,
quantify findings and present them with appropriate indicators of measurement
error or uncertainty (such as confidence intervals).
Avoid sole reliance on statistical hypothesis testing, such as the use of P values,
which fails to convey important quantitative information. Discuss eligibility of
experimental subjects. Give details about randomization. Describe the methods for
and success of any blinding of observations. Report treatment complications. Give
numbers of observations. Report losses to observation (such as dropouts from a
clinical trial). References for study design and statistical methods should be to
standard works (with pages stated) when possible rather than to papers in which
the designs or methods were originally reported. Specify any general-use computer
programs used.
Put a general description of methods in the Methods section. When data are
summarized in the Results section, specify the statistical methods used to analyze
67
Silva, V.C.
them. Restrict tables and figures to those needed to explain the argument of the
paper and to assess its support. Use graphs as an alternative to tables with many
entries; do not duplicate data in graphs and tables.
Avoid non-technical uses of technical terms in statistics, such as "random" (which
implies a randomizing device), "normal," "significant," "correlations," and "sample."
Define statistical terms, abbreviations, and most symbols.
Results
Present your results in logical sequence in the text, tables, and illustrations. Do not
repeat in the text all the data in the tables or illustrations; emphasize or summarize
only important observations.
Discussion
Emphasize the new and important aspects of the study and the conclusions that
follow from them. Do not repeat in detail data or other material given in the
Introduction or the Results section. Include in the Discussion section the
implications of the findings and their limitations, including implications for future
research. Relate the observations to other relevant studies. Link the conclusions
with the goals of the study but avoid unqualified statements and conclusions not
completely supported by your data. Avoid claiming priority and alluding to work
that has not been completed. State new hypotheses when warranted, but clearly
label them as such. Recommendations, when appropriate, may be included.
In shorter manuscripts, such as those intended to be Technical Notes or Brief
Communications, the Results and Discussion sections should be combined.
Acknowledgments
The Acknowledgements section immediately precedes the Reference list. Here,
specify contributions that need acknowledging but do not justify authorship, such
as general support by a department chair or acknowledgments of technical help.
Persons who have contributed intellectually to the paper but whose contributions do
not justify authorship may be named and their function or contribution described--for example, "scientific adviser," "critical review of study proposal," "data
collection," or "participation in clinical trial." Such persons must have given their
permission to be named.
Authors are responsible for obtaining written permission from persons
acknowledged by name, because readers may infer their endorsement of the data
and conclusions. Technical help should be acknowledged in a paragraph separate
from those acknowledging other contributions.
Acknowledgements of financial support should appear as footnotes to the title of
the paper on the Title Page.
References
The heading of the reference list should be "References," and it should contain only
published or in-press references cited by number in the test. Published abstracts
(duly noted as being abstracts), printed manufacturers' protocols or instructions,
and world wide web site URLs may be validly cited as references. Personal
communications and submitted manuscripts are not valid references. Personal
communications should be cited in the text, in parentheses, at the appropriate
location.
Number references consecutively in the order in which they are first mentioned in
the text. Identify references in tables, and legends by Arabic numerals. References
cited only in tables or legends should be numbered in accordance with a sequence
established by the first identification in the text of the particular table or figure.
Within the text, tables, or figures, cite references by Arabic numeral in parentheses.
Within the reference list, number the references 1., 2., 3., etc.
References in the reference list should be in accord with Uniform Requirements …
style of the examples given below. This style is based with slight modifications on
the formats used by the U.S. National Library of Medicine in Index Medicus. The
titles of journals should be abbreviated according to the style used in Index
Medicus. Consult List of Journals Indexed in Index Medicus, published annually as a
68
Silva, V.C.
separate publication by the library and as a list in the January issue of Index
Medicus.
The references must be verified by the author(s) against the original documents.
Examples of correct forms of references are given below.
Articles in Journals
1) St a nda r d j ou r n a l a r t icle (List all authors, but if the number exceeds six, give
six followed by et al.)
You CH, Lee KY, Chey RY, Menguy R. Electrogastrographic study of patients with
unexplained nausea, bloating and vomiting. Gastroenterology 1980 Aug;79(2):3114.
As an option, if a journal carries continuous pagination throughout a volume, the
month and issue number may be omitted.
You CH, Lee KY, Chey RY, Menguy R. Electrogastrographic study of patients with
unexplained nausea, bloating and vomiting. Gastroenterology 1980;79:311-4.
Goate AM, Haynes AR, Owen MJ, Farrall M, James LA, Lai LY et al. Predisposing
locus for Alzheimer's disease on chromosome 21. Lancet 1989;1:352-5.
2) Organization as author
The Royal Marsden Hospital Bone-Marrow Transplantation Team. Failure of
syngeneic bone-marrow graft without preconditioning in post-hepatitis marrow
aplasia. Lancet 1977;2:742-4.
3) No author given
Coffee drinking and cancer of the pancreas [editorial]. BMJ 1981;283:628.
4) Article not in English
Massone L, Borghi S, Pestarino A, Piccini R, Gambini G. Localisations palmaires
purpuriques de la dermatite herpetiforme. Ann Dermatol Venereol 1987;114:15457.
5) Volume with supplement
Magni F, Rossoni G, Berti F. BN-52021 protects guinea-pig from heart anaphylaxis.
Pharmacol Res Commun 1988;20 Suppl 5:75-8.
6) Issue with supplement
Gardos G, Cole JO, Haskell D, Marby D, Paine SS, Moore R. The natural history of
tardive dyskinesia. J Clin Psychopharmacol 1988;8(4 Suppl):31S-37S.
7) Volume with part
Hanly C. Metaphysics and innateness: a psychoanalytic perspective. Int J
Psychoanal 1988;69(Pt 3):389-99.
8) Issue with part
Edwards L, Meyskens F, Levine N. Effect of oral isotretinoin on dysplastic nevi. J Am
Acad Dermatol 1989;20(2 Pt 1):257-60. 9) Issue with no volume Baumeister AA.
Origins and control of stereotyped movements. Monogr Am Assoc Ment Defic
1978;(3):353-84. 10) N o issu e or volu m e Danoek K. Skiing in and through the
history of medicine. Nord Medicinhist Arsb 1982;86-100. 11) Pagination in roman
numerals Ronne Y. Ansvarsfallen Blodtransfusion till fel patient. Vardfacket
1989;13:XXXVI-XXVII. 12) Type of a r t icle in dica t e d a s n e ede d Spargo PM,
Manners JM. DDAVP and open heart surgery [letter]. Anaesthesia 1989;44:363-4.
13) Article containing retraction Shishido A. Retraction notice. Effect of platinum
compounds on murine lymphocyte mitogenesis [Retraction of Alsabti EA, Ghalib
ON, Salem MN. In: Jpn J Med Sci Biol 1979;32:53-65]. Jpn J Med Sci Biol
1980;33:235-7. 14) Article r et r a ct e d Alsabti EA, Ghalib ON, Sale MN. Effect of
platinum compounds on murine lymphocyte mitogenesis [Retracted by Shishido A.
In: Jpn J Med Sci Biol 1980;33:235-7]. Jpn J Med Sci Biol 1979;32:53-65. 15)
Ar t icle con t a in in g com m e nt Piccoli A, Bossatti A. Early steroid therapy in IgA
neuropathy: still an open question [comment] Nephron 1989;51:289-91. Comment
on: Nephron 1988;48:12-7. 16) Ar t icle com m e n t e d on Kobayashi Y, Fujii K, Hiki
Y, Tateno S, Kurokawa A, Kamiyama M. Steroid therapy in IgA neuropathy: a
retrospective study in heavy proteinuric cases [see comments]. Nephron
1988;48:12-7. Comment in: Nephron 1989;51:289-91. 17) Ar t icle w it h
pu blish e d e r r a t u m Schofield A. The CAGE questionnaire and psychological health
69
Silva, V.C.
[published erratum appears in Br J Addict 1989;84:701]. Br J Addict 1988;83;7614. Book s a n d Ot he r M on ogr a ph s 18) Pe r sona l a ut hor ( s) Colson JH, Armour
WJ. Sports injuries and their treatment. 2nd rev. ed. London: S. Paul, 1986 19)
Edit or ( s) , com pile r a s a ut h or Diener HC, Wilkinson M, editors. Drug-induced
headache. New York: Springer-Verlag, 1988 20) Or ga n iza t ion a s a u t hor a nd
publisher Virginia Law Foundation. The medical and legal implications of AIDS.
Charlottesville: The Foundation, 1987. 21) Ch a pt e r s in a book Weinstein L,
Swartz MN. Pathologic properties of invading microorganisms. In: Sodeman WA Jr,
Sodeman WA, editors. Pathologic physiology: mechanisms of disease. Philadelphia:
Saunders, 1974;457-72. 22) Confe r e n ce pr oce edin gs Vivian VL, editor. Child
abuse and neglect: a medical community response. Proceedings of the First AMA
National Conference on Child Abuse and Neglect; 1984 Mar 30-31; Chicago.
Chicago: American Medical Association, 1985. 23) Con fe r e n ce pa pe r Harley NH.
Comparing radon daughter dosimetric and risk models. In: Gammage RB, Kaye SV,
editors. Indoor air and human health. Proceedings of the Seventh Life Sciences
Symposium; 1984 Oct 29-31; Knoxville (TN). Chelsea (Ml): Lewis, 1985;69-78. 24)
Scientific or technical report Akutsu T. Total heart replacement device. Bethesda
(MD): National Institutes of Health, National Heart and Lung Institute; 1974 Apr.
Report No.: NIH-NHLI-691 218514. 25) Dissertation Youssef NM. School
adjustment of children with congenital heart disease [dissertation]. Pittsburgh (PA):
Univ. of Pittsburgh, 1988. 26) Patent Harred JF, Knight AR, McIntyre JS, inventors.
Dow Chemical Company, assignee. Epoxidation process. US patent 3,654,317. 972
Apr 4. Ot he r Pu blishe d M a t e r ia l 27) N e w spa pe r a r t icle Rensberger B, Specter
B. CFCs may be destroyed by natural process. The Washington Post 1989 Aug 7;
Sect. A:2 (col. 5). 28) Audiovisual AIDS epidemic: the physician's role
[videorecording]. Cleveland (OH): Academy of Medicine of Cleveland, 1987. 98
29) Computer file
Renal system [computer program]. MS-DOS version. Edwardsville (KS): MediSim,
1988.
30) World Wide Web address or URL
http://www.uocf.edu/pharmacy/depts/drugdose/barbitutuates/index.html
31) Legal material
Toxic Substances Control Act: Hearing on S. 776 Before the Subcomm. on the
Environment of the Senate Comm. on Commerce. 94th Cong., 1st Sess. 343
(1975).
32) Map
Scotland [topographic map]. Washington: National Geographic Society (US), 1981.
33) Book of the Bible
Ruth 3:1-18. The Holy Bible. Authorized King James version. New York: Oxford
Univ. Press, 1972.
34) Dictionary and similar references
Ectasia. Dorland's illustrated medical dictionary. 27th ed. Philadelphia: Saunders,
1988;527.
35) Classical material
The Winter's Tale: act 5, scene 1, lines 13-16. The complete works of William
Shakespeare. London: Rex, 1973.
Unpublished Material
36) In press
Lillywhite HD, Donald JA. Pulmonary blood flow regulation aquatic snake. Science.
In press.
Additional Information and Reprint Requests
A section of the manuscript, immediately following the reference list, entitled
Addition information and reprint requests:, should include the full name, title, and
mailing address of the corresponding author. If reprints will not be available from
the author(s), entitle this section: Additional Information - Reprints Not Available
from Author.
70
Silva, V.C.
Tables Type or print out each table double-spaced on a separate sheet. Do not
submit tables as photographs. Number tables with Arabic numerals consecutively in
the order of their first citation in the text and supply a brief title for each. Give each
column a short or abbreviated heading. Place explanatory matter in footnotes, not
in the heading. Explain in footnotes all nonstandard abbreviations that are used in
each table. For footnotes use the following symbols, in this sequence:
*,†,‡,§,((,¶,**,††,‡‡.
Identify statistical measures of variations such as standard deviation and standard
error of the mean. Do not use internal horizontal and vertical rules. Be sure each
table is cited in the text.
If you use data from another published or unpublished source, obtain permission
and acknowledge fully.
The use of too many tables in relation to the length of the text may produce
difficulties in the layout of pages.
The editor, upon accepting a paper, may recommend or even require as a condition
of acceptance, that additional tables containing important backup data too
extensive to publish be deposited with an archival service, such as the National
Auxiliary Publication Service in the United States, or be made available by the
authors, or be available at a web site. In that event an appropriate statement will
be added to the text. Submit such tables for consideration with the paper.
Illustrations (Figures)
Submit an original and three complete sets of figures. Figures should be
professionally drawn and photographed; freehand or typewritten lettering is
unacceptable. Instead of original drawings, roentgenograms, and other material,
send sharp, glossy, black-and-white photographic prints, usually 127 x 173 mm (5
x 7 in.), but no larger than 203 x 254 mm (8 x 10 in.). Letters, numbers, and
symbols should be clear and even throughout, and of sufficient size that when
reduced for publication each item will still be legible. Xerox copies of photographs
and dot-matrix printer generated figures (including spectra, chromatograms, etc.)
are not acceptable. Titles and detailed explanations belong in the legends for
illustrations, not on the illustrations themselves.
Each figure should have a label pasted on its back indicating the number of the
figure, author's name, and top of the figure. Do not write on the back of figures or
scratch or mar them by using paper clips. Do not bend figures or mount them on
cardboard. Photomicrographs must have internal scale markers. Symbols, arrows,
or letters used in the photomicrographs should contrast with the background. If
photographs of persons are used, either the subjects must not be identifiable or
their pictures must be accompanied by written permission to use the photograph.
Figures should be numbered consecutively (in Arabic numerals) according to the
order in which they have been first cited in the text. If a figure has been published,
acknowledge the original source and submit written permission from the copyright
holder to reproduce the material. Permission is required irrespective of authorship
or publisher, except for documents in the public domain.
This journal does not routinely publish color photographs or other color artwork. If
a color photograph (or other color artwork) is considered absolutely essential to the
published presentation of the work, authors must be prepared to pay the
substantial costs associated with color art reproduction and printing. The editor can
provide authors with estimates of these costs in advance upon request. As a
general rule, the editor will keep original figures and photographs in the manuscript
file during revision(s). Artwork is typically sent back to authors only if it requires
modification. If figures are added or deleted during the review / revision cycle(s),
authors should clearly indicate to the editor what changes were made, and any
changes to the figure numbering scheme. It is never a good idea to supply the
editor with only one publication-quality set of figures and/or photographs. There is
always a chance that these items can be lost in the mail.
Legends for Illustrations
71
Silva, V.C.
Type or print out legends for illustrations double-spaced, starting on a separate
page, with Arabic numerals corresponding to the illustrations. When symbols,
arrows, numbers, or letters are used to identify parts of the illustrations, identify
and explain each one clearly in the legend. Explain the internal scale and identify
the method of staining in photomicrographs.
UNITS OF MEASUREMENT
Measurements of length, height, weight, and volume should be reported in metric
units (meter, kilogram, or liter or their decimal multiples. Temperatures should be
given in degrees Celsius. Blood pressures should be given in millimeters of
mercury. All hematologic and clinical chemistry measurements should be reported
in the metric system in terms of the International System of Units (SI). In some
types of manuscripts (e.g. engineering), the use of non-metric units is permitted if
they are the norm in that field or professional area.
ABBREVIATIONS AND SYMBOLS
Terms and nomenclature in all disciplines should be in accordance with the current
standards and lists approved or adopted by appropriate national or international
committees or organizations, such as the International Anatomical Nomenclature
Committee, I.U.P.A.C., I.U.B., the Enzyme Commission, the Committee on
International Standardization of Gene Nomenclature (ISGN), etc.
Use only standard abbreviations. Generally, avoid abbreviations in the title, abstract
and key words. The full term for which an abbreviation stands should precede its
first use in text unless it is a standard unit of measurement. Liter(s) is abbreviated
L, not l. Micro should be abbreviated with (, not u.
LETTERS TO THE EDITOR
Submit Letters to the Editor in three copies. Letters concerning a previously
published item should be entitled "Commentary On ... full title of published item ...
J Forensic Sci ... citation ..." The citation should follow Uniform Requirements …
style. Letters concerning other matters should begin with a brief descriptive title.
The salutation "Sir:" should follow the title and precede the body of the letter.
Responses to Letters should be entitled “Author’s Response.” The salutation "Sir:"
should follow the title and precede the body of the letter.
The name(s) and affiliation(s) of the writer(s) should appear at the end of Letters
and Replies.
SUBMISSION OF MANUSCRIPT COPY ON DISKETTE
Do not submit manuscripts on diskettes initially. At a subsequent stage of the
editorial and peer-review process, or following final acceptance, corresponding
authors will be instructed to supply a disk (at their option) to the journal editor or
to the ASTM editor. Manuscripts on disk are helpful to the copy editors, and we
encourage authors to submit them at the appropriate time. The electronic version
of the manuscript must correspond exactly with the finally accepted version of the
paper manuscript. Diskette versions of Letters, Replies, or other items that are
unlikely to require changes, may be submitted with the initial hard copy.
REPRINTS
Authors will have the opportunity to order reprints of their published work directly
from ASTM, the publisher, after notification of full acceptance. The order form is
generally included with the final page proofs that are sent to authors for approval
prior to actual publication. Corresponding authors should attend to this matter
during the publication process if they want reprints. It is generally difficult to supply
reprints at a later time.
POLICIES OF THE JOURNAL OF FORENSIC SCIENCES
Confidentiality (adapted from the ICMJE Statement on Confidentiality)
Manuscripts should be reviewed with due respect for authors' confidentiality. In
submitting their manuscripts for review, authors entrust editors with the results of
their scientific labor and creative effort, upon which their reputation and career may
depend. Authors' rights may be violated by disclosure or by revelation of the
confidential details of the review of their manuscript.
72
Silva, V.C.
Reviewers also have rights to confidentiality, which must be respected by the
editor. Confidentiality may have to be breached if there are allegations of fraud or
dishonesty but otherwise must be honored.
The editor should not disclose information about manuscripts, including their
receipt, their content, their status in the review process, their criticism by
reviewers, or their ultimate fate. Such information should be provided only to
authors themselves and reviewers.
The editor makes clear to reviewers that manuscripts sent for review are privileged
communications and are the private property of the authors. Therefore, reviewers
and other people involved in the editorial process should respect the authors' rights
by not publicly discussing the authors' work or appropriating their ideas before the
manuscript is published. Reviewers are not allowed to make copies of the
manuscript for their files and are prohibited from sharing it with others, except with
the permission of the editor. The editor will not keep copies of rejected
manuscripts.
Reviewers’ identities are confidential, and will not be revealed to authors or to
anyone else. Reviewers' comments may be shared with other reviewers of the same
manuscript.
Con flict s of I nt e r e st ( a da pt e d fr om t he I CM JE St a t e m e nt on Con flict of
I nterest)
A conflict of interest for a given manuscript exists when a participant in the peerreview and publication process--author, reviewer, or editor--has ties to activities
that could inappropriately influence his/her judgment, whether or not judgment is
in fact affected. Financial relationships with industry (such as employment,
consultancies, stock ownership, honoraria or expert testimony), either directly or
through immediate family, are generally considered the most important conflicts of
interest. However, conflicts can occur for other reasons, such as personal
relationships, academic or research competition, and intellectual passion.
Public trust in the peer-review process and the credibility of published work depend
in part on how well conflict of interest is handled during writing, peer review, and
editorial decision making. Bias can often be identified and eliminated by careful
attention to the scientific methods and conclusions of the work. Financial
relationships and their effects are less easily detected than other types of conflicts
of interest. Participants in peer review should disclose their conflicting interests,
and the information should be made available so that others can judge their effects
for themselves.
Authors are responsible for recognizing and disclosing financial or other conflicts of
interest that might bias their work when they submit a manuscript or letter. They
should acknowledge in the manuscript all financial support for the work and other
financial or personal connections to the work.
Submission of manuscripts or commentary primarily for the purpose of bolstering
an author’s position as an expert witness in legal proceedings is not acceptable.
Reviewers should disclose to the editor any conflicts of interest that could bias their
opinions of the manuscript, and they should disqualify themselves from specific
manuscripts if they believe it to appropriate. The editor must be made aware of
conflicts of interest to interpret the reviews and judge whether the reviewer should
be disqualified. Reviewers must not use knowledge of the work gained during the
review process, before publication of the work, to further their own interests.
The editor should have no personal financial involvement in any of the issues that
he/she may be called upon to judge. Published manuscripts and letters should
include a description of all financial support and any conflict of interest that, in the
editor's judgment, readers should know about.
Protection of the Anonymity of Patients / Victims
Detailed descriptions or photographs of individual patients or victims are sometimes
central to documentation in a published item. Every effort must be made to protect
the anonymity of such patients or victims and their families. Masking of the eyes in
73
Silva, V.C.
photographs may not be adequate protection. Changing data about a patient or
victim is never an acceptable method of protecting anonymity.
It is recognized that cases or situations forming the basis of items submitted to the
Journal may be matters of public record as a result of public court proceedings,
news reports, etc. For purposes of publication in the journal, however, emphasis
should be placed on medical and/or scientific aspects and information that should
form the basis for publication. No information that might violate the privacy of
people should be included unless it can be justified as absolutely necessary to the
medical and/or scientific presentation.
Release of Full Text of Accepted Manuscripts Prior to Publication
Requests for the release of accepted papers, technical notes, brief communications,
or case reports prior to their actual publication are occasionally made by the media
or by attorneys involved in courtroom proceedings. The full release of accepted, but
as yet unpublished, peer-reviewed items by authors is not permitted, except by
permission of the editor and the publisher. "Full release" means a complete copy of
the manuscript, or any other type of reproduction of the complete work including all
data. This prohibition does not, and is not intended to, apply to short summaries
(even in the form or brief news releases), or brief abstracts for or from meeting
presentations.
Requests for the pre-publication release of accepted items will be carefully
considered, and generally honored for legitimate reasons in accordance with the
procedure specified below. Authors must obtain the permission of the editor and of
ASTM, and must provide the editor with a legitimate reason for early release.
Requests should be made in writing to the editor, and provide the reasons for the
request. If the approvals of the editor and of ASTM are forthcoming, ASTM will
produce, for a one-time fee (approximately the same as the cost of reprints), the
copies that are to be released. Because many manuscripts go through several
iterations of modification, correction, and revision, this procedure helps insure that
the actually accepted version of the work, as it will appear in print, is released.
74
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determi nação do poli morfi smo de sei ss do cromossomo x

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