Auswirkungen einer protrahierten Geburtseinleitung beim Rind auf

Tierärztliche Hochschule Hannover
Auswirkungen einer protrahierten Geburtseinleitung
beim Rind auf die Plazentareife, den uterinen
Blutfluss sowie Steroidhormone im Plasma
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Desiree Hartmann
Nagold
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung:
1. Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein
Klinik für Rinder
2. Univ.-Prof. Dr. Christiane Pfarrer
Anatomisches Institut
1. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein
2. Gutachter:
Apl. Prof. Dr. Dr. Sabine Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung: 20.09.2011
Meiner Familie
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... 5
Abkürzungsverzeichnis............................................................................................... 8
1. Einleitung................................................................................................................ 9
2. Literaturübersicht.................................................................................................. 11
3. Material und Methoden ......................................................................................... 18
3.1 Tiere................................................................................................................ 18
3.2 Versuchsaufbau .............................................................................................. 18
3.3 Probennahme und -fixation ............................................................................. 19
3.4 Histologie und Immunhistochemie .................................................................. 19
3.5 Auswertung mittels Lichtmikroskopie .............................................................. 21
3.6 Ultrasonographische Untersuchungen ............................................................ 22
3.7 Plasmagewinnung und hormonanalytische Untersuchung.............................. 23
3.8 Statistische Auswertungen.............................................................................. 24
4. Chapter 1:............................................................................................................. 25
Protracted induction of parturition enhances placental maturation, but does not
influence incidence of placental retention in cows .................................................... 25
4.1 Abstract........................................................................................................... 25
4.2 Introduction ..................................................................................................... 26
4.3 Material and Methods...................................................................................... 28
4.3.1 Experimental Design ................................................................................ 28
4.3.2 Tissue sampling and fixation .................................................................... 29
4.3.3 Histology and Immunohistochemistry ....................................................... 29
4.3.4 Light Microscopy....................................................................................... 30
4.3.5 Statistical analysis .................................................................................... 31
4.4 Results ............................................................................................................ 31
4.4.1 Clinical findings......................................................................................... 31
4.4.2 Placental Histology (Masson´s Trichrome staining).................................. 32
4.4.3 Height of Maternal Epithelium (Pan-Cytokeratin Immunohistochemistry). 33
4.4.4 Apoptosis (Caspase-3 Immunohistochemistry) ........................................ 33
4.4.5 iNOS and eNOS in placental tissue.......................................................... 33
4.4.6 Endothelin-1 (ET-1) in placental tissue..................................................... 34
4.5 Discussion....................................................................................................... 34
4.6 Figures and Tables ......................................................................................... 39
5. Chapter 2:............................................................................................................. 42
Effects of a protracted induction of parturition on the incidence of retained placentae
and uterine blood flow in cattle ................................................................................. 42
5.1 Abstract........................................................................................................... 42
5.2 Introduction ..................................................................................................... 43
5.3 Materials and Methods.................................................................................... 45
5.3.1 Cattle ........................................................................................................ 45
5.3.2 Study design............................................................................................. 46
5.3.3 Measurement of uterine blood flow........................................................... 46
5.3.4 Determination of steroid hormones........................................................... 47
5.3.5 Statistical analyses ................................................................................... 48
5.4 Results ............................................................................................................ 49
5.4.1 Clinical findings......................................................................................... 49
5.4.2 Uterine blood flow..................................................................................... 50
5.4.3 Steroid hormones ..................................................................................... 50
5.4.3.1 Progesterone ......................................................................................... 50
5.4.3.2 Total estrogens...................................................................................... 51
5.4.3.3 Cortisol .................................................................................................. 51
5.5 Discussion....................................................................................................... 51
5.6 Figures and Tables ......................................................................................... 57
6. Übergreifende Diskussion..................................................................................... 67
Schlussfolgerungen .............................................................................................. 70
7. Zusammenfassung ............................................................................................... 71
8. Summary .............................................................................................................. 74
9. Literaturverzeichnis .............................................................................................. 77
10. Abbildungsverzeichnis ........................................................................................ 85
11. Tabellenverzeichnis ............................................................................................ 87
12. Histologische und Immunhistochemische Färbungen ........................................ 88
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abkürzungsverzeichnis
a.m.
ante meridiem
Az.
reference number (33.9-42502-04-07/1394)
BFV
blood flow volume
bzw.
beziehungsweise
c
contralateral
ºC
degree Celsius
cm
centimeter
CV
coefficient of variation
D
vessel diameter
EDF
end-diastolic frequency shift
EDTA
ethylenediaminetetraacetic acid
EIA
enzyme-immunoassay
eNOS
endothelial nitritoxid-synthase
ET-1
endothelin-1
Etot
total estrogens
f
female
fe
fetal chorionic epithelium
Fig.
figure
H2O2
hydrogen peroxid
i
ipsilateral
IgG
immungloblulin G
i.m.
intramuscular
iNOS
inducible nitritoxidsynthase
kg
kilogram
L
liter
m
male
M
mol
me
maternal crypt epithelium
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
mg
milligram
MHz
megahertz
min
minutes
mL
milliliter
n
number
ng
nanogram
nmol
nanomolar
NO
nitritoxid
NOS
nitritoxid-synthase
P4
progesterone
PBS
phosphate buffered saline
pg
picogram
PIP
protracted induction of parturition
p.m.
post meridiem
PSF
peak systolic frequency shift
r
correlation coefficient
REL
release placenta
RET
retained placenta
RI
resistance index
s.c.
subcutaneous
SD
standard deviation
s
second
SIP
singular induction of parturition
SPON
spontaneous parturition
Tab.
table
TAMV
time average maximum velocity
tBFV
total blood flow volume
TE
total estrogene
µL
mycroliter
EINLEITUNG
1. Einleitung
Die gezielte, medikamentöse Geburtseinleitung bei der Kuh kann aus medizinischen
und/oder ökonomischen Gründen indiziert sein. Medizinische Indikationen für einen
vorzeitigen Trächtigkeitsabbruch stellen zum Beispiel eine verlängerte Graviditätsdauer, Eihautwassersucht, mumifizierte Früchte oder eine zu frühe, ungewollte Belegung von Jungrindern dar (GRUNERT 1995). Aus ökonomischer Sicht kann es zudem gewünscht sein, Abkalbungen und damit die Laktation saisonal zu konzentrieren, um eine optimale Weideausnutzung im Frühjahr zu erzielen. Dieses Vorgehen
wird überwiegend in Neuseeland und Australien praktiziert (WELCH et al. 1977;
MACDIARMID and COOPER 1983; MACMILLAN 2002).
Konventionell wird die Geburt bei Kühen mit einer hohen Dosis eines Glukokortikoids
und/oder eines Prostaglandinpräparates eingeleitet. Dies führt jedoch, abhängig vom
Zeitpunkt der Einleitung während der Gravidität, zu einer hohen Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen mit Werten zwischen 60 % und 100 % (GRUNERT et al. 1976;
PELISSIER 1976; WELCH et al. 1977; WILHELM 1989; SCHULZ 1990). In Folge
einer Retentio secundinarum kommt es vielfach zu einer reduzierten Milch- und
Fruchtbarkeitsleistung und damit zu hohen wirtschaftlichen Verlusten (WILHELM
1989; LAVEN and PETERS 1996; BEAGLEY et al. 2010). Aus diesem Grund wurden
in den letzten Jahrzehnten zahlreiche Studien zur Ätiologie und Pathogenese der
Retentio secundinarum durchgeführt (WILLMS 1986; LAVEN and PETERS 1996;
MCNAUGHTON and MURRAY 2009; BEAGLEY et al. 2010), jedoch konnten diese
bis heute nicht vollständig geklärt werden. Es hat sich jedoch gezeigt, dass der
graduelle Anstieg des fetalen Kortisols im letzten Trächtigkeitsmonat und vor allem in
den letzten Tagen vor der Geburt (HUNTER et al. 1977) für den Abgang der
Nachgeburt von entscheidender Bedeutung zu sein scheint (BO et al. 1992). Diese
Hypothese wird gestützt durch die signifikante Abnahme von Nachgeburtsverhaltungen, wenn langwirkende Kortikosteroidpräparate zur Geburtseinleitung bei
der Kuh verwendet werden (WELCH et al. 1973; WELCH et al. 1977; DISKIN et al.
1982; BO et al. 1992). In der EU sind jedoch aufgrund der Gefahr systemischer
Nebenwirkungen langzeitwirkende Kortikosteroide bei lebensmittelliefernden Tieren
9
EINLEITUNG
nicht zugelassen. Eine mögliche Alternative könnte jedoch die Anwendung
kurzwirksamer Kortikosteroide darstellen, welche über mehrere Tage vor der
geplanten Geburtseinleitung verabreicht werden (im Folgenden als protrahierte
Geburtseinleitung bezeichnet).
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Auswirkungen einer konventionellen und einer protrahierten Geburtseinleitung auf die Plazentareifung und den Abgang der Nachgeburt zu untersuchen. Hierfür wurde in den letzten sieben Tage der
Gravidität ein Hormonprofil für Kühe mit verschieden Geburtseinleitungschemata
erstellt. Der Ausprägungsgrad der Plazentareifung sollte zudem anhand histologischer und immunhistochemischer Methoden untersucht werden. Ein weiteres Ziel
dieser Arbeit war zudem die Analyse des uterinen Blutflusses in den letzten Tagen
vor der Geburt mithilfe der transrektalen Dopplersonographie, um Veränderungen
der uteroplazentaren Perfusion zu evaluieren und die Möglichkeit zu testen, die
transrektale Dopplersonographie als nicht-invasive Methode für die Beurteilung der
Plazentareife zu etablieren.
10
LITERATURÜBERSICHT
2. Literaturübersicht
Die Plazenta des Rindes sorgt für die fortlaufende Bereitstellung von Nährstoffen für
den Fetus, für den Abtransport von Abfallprodukten über die Mutter und für den
fetomaternalen Gasaustausch (FERRELL 1991; REYNOLDS and REDMER 1995).
Beim Rind ist die Plazenta aus 80 - 150 kissenförmigen Plazentomen aufgebaut, die
sich aus den mütterlichen Krypten, die auch als Karunkel bezeichnet werden und den
fetalen Chorionzotten, den Kotyledonen, zusammensetzen. Das Rind besitzt mit
einer Placenta synepitheliochorialis eine Sonderform der Placenta epitheliochorialis
(SCHNORR 2006), da schwach invasive Trophoblastriesenzellen mit einzelnen
Karunkelepithelzellen zu fetomaternalen Hybridzellen fusionieren (WOODING 1992).
Die Plazenta ist im Laufe der Trächtigkeit zahlreichen Auf- und Abbauvorgängen
unterworfen (REYNOLDS et al. 1990; FERRELL 1991). Die maternalen Karunkel
wachsen
während
der
Gravidität
kontinuierlich,
wobei
dieses
Wachstum
hauptsächlich auf Zellproliferation beruht, während sich das interplazentare Gewebe
vor allem durch Hypertrophie vergrößert (REYNOLDS et al. 1990). Im Gegensatz
dazu stagniert das Wachstum der Kotyledonen ab dem 7. Monat der Trächtigkeit und
scheint sogar an Masse abzunehmen (REYNOLDS et al. 1990; FERRELL 1991).
Die physiologische Ablösung der Plazenta nach der Geburt unterliegt einem
Reifungsprozess, welcher bereits einige Wochen vor der Geburt beginnt und in den
letzten Tagen der Gravidität seine volle Ausprägung erfährt (SCHULZ 1956;
SCHOON 1989). Dieser Prozess ist durch eine Vielzahl an morphologischen
Veränderungen charakterisiert. Auf zellulärer Ebene kommt es zu Umbauprozessen
an den feto-maternalen Grenzflächen, was sich in einer Abflachung des maternalen
Kryptenepithels manifestiert und zu einer numerischen Reduktion der maternalen
Epithelzellen führt (SCHULZ 1956; BJORKMAN 1969; WILLMS 1986). Die
Abflachung des maternalen Kryptenepithels führt zum Kontakt mit einer zunehmenden Anzahl sowohl von Chorionepithel, als auch mit dem sich anschließenden
maternalen
Gewebe.
SCHOON
(1989)
11
spricht
hier
von
einer
Placenta
LITERATURÜBERSICHT
syndesmochorialis. Auch der Bindegewebsanteil steigt zur Geburt hin deutlich an
(WILLMS 1986). Es handelt sich hierbei um eine zunehmende Kollagenisierung des
Gewebes, gefolgt von einer Lockerung des maternalen Bindegewebes im Zuge der
geburtsvorbereitenden
Maßnahmen
mit
einer
hochgradigen
Ödematisierung
(SCHOON 1989). Zeitnah zur Geburt sinkt die zelluläre Proliferation, während die
Apoptoserate, sowohl im Chorionepithel, als auch in den maternalen Krypten steigt,
was den Ablösungsprozess der fetalen Membranen begünstigt (BJORKMAN 1954;
WOICKE et al. 1986; WILLIAMS et al. 1987; BOOS et al. 2003). Es wird vermutet,
dass die Phagozytose der apoptotischen maternalen Kryptenepithelzellen dem Feten
zur histiotrophen Ernährung dient (BOOS et al. 2003). Ein weiteres morphologisches
Reifekriterium der Plazenta sind die binukleären Trophoblastriesenzellen, auch
Diplokaryozyten genannt, die im Laufe der Trächtigkeit kontinuierlich vom
Chorionepithel in das maternale Epithel wandern und dort mit den uterinen
Epithelzellen
verschmelzen,
wodurch
die
oben
erwähnten
feto-maternalen
Hybridzellen gebildet werden. Mit fortschreitender Trächtigkeit nimmt die Zahl der
fetalen binukleären Riesenzellen deutlich ab (WILLMS 1986; TOLHUYSEN 1990).
Für eine mangelhafte oder ungenügende Plazentareifung konnten bislang mehrere
allgemeine Ursachen ermittelt werden: Einerseits eine Insuffizienz und/oder
Unausgewogenheit der Hormone im Zeitraum um den Geburtstermin (GRUNERT et
al. 1989; ZHANG et al. 1999; WISCHRAL et al. 2001; KINDAHL et al. 2004) sowie
peripartale Faktoren, wie Sectio caesaria oder Torsio uteri, welche den Blutdruck in
den Chorionzotten aufrechterhalten (GRUNERT 1986). Weiterhin wird eine
Dysfunktion auf zellulärer Ebene diskutiert (BJORKMAN 1969; WOICKE et al. 1986).
So zeigten sich, je nach Gestationsstadium, ein weitgehend intakter maternaler
Kryptenepithelverband
unterschiedlichem
(SCHOON
1989)
Degenerationsgrad
oder
(WILLMS
Zotten
1986).
und
Dadurch
Krypten
mit
bildet
das
Chorionepithel weiterhin eine feste Verbindung mit dem maternalen Kryptenepithel
und der physiologische Lösungsprozess zur Geburt hin entfällt. Auch die
Diplokaryozyten bleiben vorwiegend intakt (SCHOON 1989).
12
LITERATURÜBERSICHT
Einige Autoren sehen die Ursache für eine Retentio secundinarum vor allem in einer
Imbalanz oder einer Insuffizienz der hormonellen Veränderungen zur Geburt hin
(GARVERICK et al. 1974; GRUNERT et al. 1989; WISCHRAL et al. 2001).
Physiologisch wird die Geburt eingeleitet, indem das Adrenokortikotrope Hormon
(ACTH) aus der fetalen Hypophyse die Freisetzung von Kortisol aus der fetalen
Nebennierenrinde initiiert. Bei Schweinen und Schafen wurde festgestellt, dass sich
die Rezeptorendichte für Glukokortikoide im fetalen Kortex zur Geburt hin stark
erhöht. Damit nimmt auch die positive Feedback - Sensitivität zu, was die
exponentielle Zunahme von ACTH und Kortisol im fetalen Plasma erleichtert
(KAPOOR et al. 2006). Das fetale Kortisol induziert in der Plazenta ein Enzym, das
aus einem Progesteronmetaboliten Östrogen synthetisiert. Dies reduziert das
maternale Progesteron und steigert die Östrogenproduktion. Dadurch wird der
Progesteronblock des Myometriums aufgehoben, das Myometrium wird für Oxytocin
sensibilisiert und im Endometrium wird die Freisetzung von Prostaglandin F2α
induziert. Durch letzteres nimmt die Uteruskontraktilität zu, das Corpus luteum bildet
sich zurück und die Geburt wird eingeleitet (LINDELL et al. 1977; KINDAHL et al.
2004). Die Bedeutung der Kortikosteroide liegt somit in der Induktion einer Vielzahl
von Enzymen in der Spätträchtigkeit, wodurch es zu dem typischen Verlauf der
Hormonprofile ante partum kommt (KRAWCZYNSKI 1999).
Als Schlüsselhormone für die Plazentareifung scheinen in dieser Hormonkaskade
neben den Kortikosteroiden die Östrogene eine wichtige Rolle zu spielen. So wird
vermutet, dass der zelluläre Umbau der feto-maternalen Kontaktzone an den sich
erhöhenden Plasmaöstrogenspiegel des Muttertieres gebunden ist (GARVERICK et
al. 1974; GRUNERT et al. 1989; BOOS et al. 2000). Aus diesem Grund wurde in
mehreren Studien versucht, die Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen zu senken,
indem bei mit Kortikosteroiden eingeleiteten Kühen zusätzlich Östrogene verabreicht
wurden (LAVOIE and MOODY 1973; BEARDSLEY et al. 1974; GARVERICK et al.
1974; SCHMITT et al. 1975). Die Ergebnisse sind jedoch widersprüchlich. So konnten einige Autoren eine Abnahme der Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen feststellen (BEARDSLEY et al. 1974; GARVERICK et al. 1974), andere fanden jedoch kei-
13
LITERATURÜBERSICHT
nen Einfluss auf den Abgang der Eihäute (LAVOIE and MOODY 1973; SCHMITT et
al. 1975).
Ein weiterer entscheidender Faktor für den plazentären Lösungsprozess scheint die
Kontraktilität des Uterus und die Austreibung des Fetus zu sein. Dies führt zu
Blutdruckschwankungen im uterinen Gewebe und damit zu alternierenden hyperämischen und ischämischen Bedingungen innerhalb der Chorionzotten (GRUNERT
1986). Folge des reduzierten uterinen und plazentaren Blutflusses sind apoptotische
zelluläre Veränderungen, welche wiederum essentiell für die Plazentareifung und
den Abgang der fetalen Membranen sind (JOOSTEN and HENSEN 1992; BOOS et
al. 2003). Es konnte gezeigt werden, dass der uterine und der umbilikale Blutfluss
Indikatoren für die Perfusion der Plazenta sind und damit ein Maß für die Perfusion
des uteroplazentaren Gewebes (FERRELL 1991). Im Laufe der Gravidität steigt der
uterine Blutfluss kontinuierlich an und erreicht vor allem im letzten Drittel der
Trächtigkeit seine volle Ausprägung (FERRELL 1991; REYNOLDS and REDMER
1995; PANARACE et al. 2006). Diese Beobachtung deckt sich mit der
Vaskularisation des maternalen plazentaren Gewebes, welche langsam und
kontinuierlich während der Gravidität zunimmt, während sie in den fetalen
Kotyledonen bis zur Mitte der Trächtigkeit relativ konstant und im letzten Drittel
exponentiell an Wachstum zunimmt (PFARRER et al. 2001; REYNOLDS and
REDMER 2001; SCHULER et al. 2002).
Die Plazenta bildet
somit ein
hochkompliziertes fetomaternales Zotten – Krypten Austauschsystem, um den
wachsenden Ansprüchen des Feten gerecht zu werden (REYNOLDS and REDMER
1995; PFARRER et al. 2001).
Der Einfluss von Kortikosteroiden auf die Durchblutung der Plazenta ist bislang vor
allem an Schafen untersucht worden. So wurde der maternale Blutfluss an dieser
Spezies mithilfe von implantierten elektromagnetischen Strömungssonden, die um
die uterinen Arterien angebracht wurden, gemessen (BURD et al. 1976). Bei allen
Tieren gab es eine signifikante Erhöhung des maternalen Blutflusses (97 ml/min zu
365 ml/min) in der letzten Woche der Trächtigkeit. Die Geburt wurde mit einer Dexa-
14
LITERATURÜBERSICHT
methason - Infusion (1mg/24 h) direkt in eine fetale Vene und bei einer zweiten
Gruppe in eine maternale Vene eingeleitet. Nach der Dexamethason - Infusion in die
fetale Vene nahm der maternale Blutfluss signifikant zu, während die Infusion in die
maternale Vene zu keiner signifikanten Erhöhung des Blutflusses führte. In einer
anderen Studie sank bei einer Behandlung der Mutterschafe mit Dexamethason die
Durchblutung der umbilikalen Gefäße und der Fetus war in der Folge nicht mehr in
der Lage auf eine akute Hypoxämie mit einer Erhöhung des Blutflusses zu reagieren
(JELLYMAN et al. 2004). Weiterhin sollen chronische Veränderungen im maternalen
Kortikosteroidspiegel sowohl den uterinen Blutfluss als auch das plazentare und fetale Wachstum beeinflussen (JENSEN et al. 2005). So war der Blutfluss bei den mit
Dexamethason (1 mg/kg/Tag von Tag 120 bis 130 der Gravidität) behandelten
Mutterschafen am Tag 130 der Trächtigkeit höher als in der unbehandelten Kontrollgruppe (2000 ml/min vs. 1750 ml/min). Die Autoren vermuten hier eine positive
Korrelation zwischen der Konzentration von Kortikosteroiden und der endothelialen
Nitritoxid-Synthase, welche die Vasodilatation im uterinen Gefäßsystem bestimmt
(BURD et al. 1976; JENSEN et al. 2005).
Stickstoffmonoxid (NO), welches aus L-Arginin durch die Stickstoffmonoxid-Synthase
(NOS) synthetisiert wird, ist als Schlüsselregulator der plazentaren Angiogenese
während der Gravidität bekannt (FARINA et al. 2001; KWON et al. 2004). Es
existieren drei Isoformen der Stickstoffmonoxid-Synthase: die neuronale NOS (nNOS
oder Typ I), die induzierbare NOS (iNOS oder Typ II) und die endotheliale NOS
(eNOS oder Typ III) (KWON et al. 2004). An Ratten konnte gezeigt werden, dass vor
allem iNOS und eNOS im tragenden Uterus präsent sind, während nNOS nicht
nachgewiesen werden konnte (FARINA et al. 2001). Die höchste Syntheserate von
Stickstoffmonoxid in der Plazenta und im Endometrium konnte bei Schafen in der
ersten Hälfte der Gravidität festgestellt werden (KWON et al. 2004). Ein zweiter
Gipfel erfolgte zeitgleich mit dem Ansteigen des feto-plazentaren Blutflusses in der
späten Trächtigkeit und spielt daher vermutlich eine wichtige Rolle in der Zunahme
des Nährstoff- und Sauerstoffaustausches zwischen fetalem und maternalen Blut.
NO ist somit bei Schafen ein Hauptmediator im plazento-fetalen Blutfluss während
15
LITERATURÜBERSICHT
der Trächtigkeit (ROSENFELD et al. 1996). Allerdings vermuten die Autoren, dass
Estradiol-17ß, ebenfalls ein potenter Vasodilatator, hauptsächlich für das Ansteigen
des uterinen Blutflusses im Laufe der Gravidität verantwortlich ist bzw., dass beide
Mediatoren bei der Regulation des feto-maternalen Blutflusses eng zusammenspielen. Dies deckt sich mit Studien, die zeigen konnten, dass plazentare Blutgefäße
auch direkt von Steroidhormonen beeinflusst werden können, was vermuten lässt,
dass sowohl Östrogene, als auch Glukokortikoide an der Regulation des Blutflusses
beteiligt sind (WELCH et al. 1977; DERKS et al. 1997; BOOS et al. 2000).
Der graduelle Anstieg des fetalen Kortisols im letzten Trächtigkeitsmonat und vor
allem in den letzten Tagen vor der Geburt scheint somit für die Plazentareifung und
den Abgang der Nachgeburt von entscheidender Bedeutung zu sein. So wird vermutet, dass die vor allem im letzten Drittel der Trächtigkeit ansteigende Expression von
Glukokortikoidrezeptoren in den Kryptenepithelzellen, in den maternalen Diplokaryozyten und im interplazentaren uterinen Gewebe, den Beginn der Geburt und
den sich anschließenden physiologischen Abgang der Nachgeburt anzeigen (Boos
2000). Diese Hypothese wird zudem gestützt durch die signifikante Abnahme von
Nachgeburtsverhaltungen, wenn langwirkende Kortikosteroidpräparate zur Geburtseinleitung bei der Kuh verwendet werden (WELCH et al. 1973; DISKIN et al.
1982; BO et al. 1992). So wurden in einer Studie 85 Tiere am Tag 270 der Gravidität
mit einem Langzeitkortikosteroid (Dexamethason Trimethylacetat, 1 mg/25 bzw.
50 kg KGW) prämediziert und erhielten sieben Tage später eine hohe Dosis
Dexamethason (25 mg/kg i.m), mit der die eigentliche Geburt eingeleitet wurde. Die
Studie ergab eine deutliche Senkung an Nachgeburtsverhaltungen (13 % vs. 79 %)
(BO et al. 1992). Der Vorteil einer Kombination eines langwirkenden Kortikosteroids
mit einem einige Tage später applizierten hoch dosierten kurzwirkenden Kortikosteroids liegt in der Nachahmung der natürlichen geburtsvorbereitenden Maßnahmen
der Kuh, einschließlich der Relaxation der Beckenbänder und der Dilatation der
Zervix und des Geburtskanals (DISKIN et al. 1982). Zudem konnte gezeigt werden,
dass mithilfe dieser Einleitungsmethode eine bessere Vorhersagbarkeit des Geburtszeitraumes möglich ist (BO et al. 1992). Die Inzidenz von Nachgeburtsverhaltungen
16
LITERATURÜBERSICHT
war in den Studien umso niedriger, je länger das Intervall zwischen Prämedikation
mit einem Langzeitkortikosteroid und der eigentlichen Geburtseinleitung war
(4 bzw. 6 Tage). Erklärt wurde dies mit einer besseren endokrinologischen Vorbereitung der Kühe (BO et al. 1992).
Da in der EU aufgrund der Gefahr systemischer Nebenwirkungen langzeitwirkende
Kortikosteroide bei lebensmittelliefernden Tieren nicht zugelassen sind, muss man
auf
ein
Alternativschema
zurückgreifen. Eine mögliche
Variante
stellt die
Frühgeburtseinleitung nach ZERBE (2008) dar. Sie wurde entwickelt, um die
Lungenreife des Kalbes bei indikationsbezogener Geburtseinleitung zu stimulieren.
Das Prinzip der Methode beruht in der ersten Phase auf wiederholten Gaben von
Dexamethason über mehrere Tage in vergleichsweise niedriger Dosierung, die zur
Reifung der fetalen Lunge beitragen, jedoch in der Regel nicht zur Geburtsinduktion
führen. In der zweiten Phase wird die Dexamethason Dosierung gesteigert, um die
Geburt einzuleiten (ZERBE 2008). Untersuchungen zur Plazentareifung und den
Abgang der Nachgeburt bei dieser Form der protrahierten Geburtseinleitung, sind
beim Rind bislang nicht durchgeführt worden.
17
MATERIAL UND METHODEN
3. Material und Methoden
3.1 Tiere
Die Untersuchungen wurden an primi- und pluriparen klinisch gesunden Kühen der
Rasse Holstein Friesian (n = 24), Deutsche Schwarzbunte (n = 8), Deutsche
Rotbunte (n = 1) und Deutsches Fleckvieh (n = 1) auf dem Versuchsgut des
Friedrich-Löffler-Institutes in Mariensee, Niedersachsen, zwischen Juni 2007 and
Dezember 2008 durchgeführt. Die Tiere waren 3,2 ± 1,2 (xmin - xmax 2,0 - 8,0) Jahre
alt und hatten eine Abkalbungsrate von 1,7 ± 1,0 (xmin - xmax 1.0 - 5.0). Zwölf Tage vor
dem errechneten Abkalbetermin (280. Tag der Gravidität) wurden die Tiere in
Tiefstreuställe verbracht und mit einer gemischten Ration aus Getreide, Gras- und
Maissilage und einem Mineralfutter gefüttert. Zugang zu frischem Wasser war
unbegrenzt möglich.
3.2 Versuchsaufbau
Nach dem Zufallsprinzip wurden die Kühe in drei Gruppen eingeteilt: Tiere, bei welchen eine protrahierte Geburtseinleitung durchgeführt wurde (PIP, n = 13), Tiere mit
konventioneller Geburtseinleitung (SIP, n = 10) und eine nicht behandelte Kontrollgruppe (SPON, n = 11). Der Gruppe PIP wurden ab Tag 268 der Trächtigkeit zweimal täglich über sechs Tage 1,3 mg Dexamethason (Dexamethason-Lösung®, cppharma, Burgdorf, Germany) i.m. verabreicht. Am Tag 274 erhielten sie 40 mg Dexamethason i.m. zur Geburtseinleitung. Die Gruppe SIP erhielt am Tag 274 der
Trächtigkeit eine einmalige Dosis von 40 mg Dexamethason i.m. zur Einleitung der
Geburt. Die Kontrollgruppe kalbte spontan ohne Behandlung (Figure 4).
Alle vier Stunden wurden die Tiere auf Anzeichen der bevorstehenden Geburt
kontrolliert. Sofern zwei Stunden nach den ersten Geburtsanzeichen kein
Voranschreiten des Geburtsverlaufes zu erkennen war, wurde eine vaginale
Untersuchung durchgeführt, um die Lage, Stellung und Haltung sowie die Größe des
18
MATERIAL UND METHODEN
Kalbes zu überprüfen. Abhängig von der vaginalen Befunderhebung wurde daraufhin
Geburtshilfe geleistet. Die neugeborenen Kälber wurden als vital eingestuft, wenn sie
in der Lage waren, in den ersten zwei Lebensstunden zu Stehen und zu Trinken. Von
23 Kälbern konnte das Geschlecht und das Gewicht festgehalten werden.
Abhängig vom Nachgeburtsabgang, welcher festgelegt innerhalb von 12 Stunden
post partum erfolgen sollte, wurden die Tiere als Kühe mit Nachgeburtsabgang (REL)
oder Kühe mit Nachgeburtsverhaltung (RET) bezeichnet. Bei allen Tieren mit
Nachgeburtsverhaltung entwickelte sich in den Folgetagen eine Metritis, welche nach
den von SHELDON et al. (2009) erstellten Kriterien in die Grade I, II oder III
eingestuft wurden. Die betroffenen Tiere wurden über fünf Tage mit 1,0 mg/kg KG
Ceftiofur (Excenel® RTU, Pfizer AG, Zürich, Swiss) s.c. behandelt und täglich
hinsichtlich des Abgangs der Eihäute kontrolliert.
3.3 Probennahme und -fixation
Von insgesamt 26 Tieren wurden innerhalb von zwei Stunden post partum zwei
Plazentome mit dem Effeminator nach Reisinger, modifiziert nach Richter (Fa.
Hauptner, Solingen, Germany), transvaginal aus dem Uterus entnommen. Die
gewonnenen
Plazentome
wurden
senkrecht
in
schmale
Scheiben
von
1,0 x 1,0 x 0,5 cm geschnitten, in neutralem, phosohatgepufferten 4 %igen Formaldehyd nach LILLIE (1976) für 24 Stunden fixiert und anschließend mithilfe eines
Einbettautomaten (Tissue-Tek III, Shandon, Pittsburgh, PA, USA) in Paraplast Plus ®
(Shandon, Pittsburgh, PA, USA) eingebettet.
3.4 Histologie und Immunhistochemie
Von 26 Tieren (SPON, n = 8; SIP, n = 8; PIP, n = 10) konnten für die histologischen
und immunhistologischen Untersuchungen im Institut der Pathologie der Stiftung
Tierärztlichen Hochschule Hannover je zwei Paraffinblöcke (n = 52) angefertigt
werden. Mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms wurden anschließend im Anatomischen
Institut der Stiftung Tierärztlichen Hochschule Hannover 5 µm dicke Serienschnitte
19
MATERIAL UND METHODEN
angefertigt, von denen mit einer Trichromfärbung nach Masson (Anhang 1) zunächst
histologische Übersichtsfärbungen angefertigt wurden.
Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden die Paraffinschnitte bei
37 ºC über Nacht getrocknet, in Xylol entparaffiniert und in einer Alkoholreihe bei
Zimmertemperatur rehydratisiert. Alle Inkubationsschritte erfolgten in einer feuchten
Kammer. Die Verdünnungen der Erstantikörper erfolgte mit PBS (0.1 M, pH 7.2) und
1 %igem bovinen Serumalbumin. Nach Hemmung der endogenen Peroxidase mit
4 %igem Wasserstoffperoxid in 80 %igem Alkohol wurden die Schnitte mit PBS gespült und für 20 Minuten mit inaktiviertem Ziegen-Normalserum überschichtet, um
unspezifische Bindungen zu blockieren. Anschließend wurde der verdünnte
Erstantikörper aufgetragen und die Schnitte bei 4°C über Nacht im Kühlschrank inkubiert.
Zur Visualisierung der immunhistochemischen Färbungen wurden die Schnitte für 45
Minuten mit dem Zweitantikörper EnVision-Kaninchen (Dako REAL EnVision Detection System, Glostrup, Denmark) bei Zimmertemperatur inkubiert, mit PBS gespült (3
x 5 min) und mit Diaminobenzidin (DAB) Chromogensubstrat (Dako REAL EnVision
Detection System, Glostrup, Denmark) gefärbt. Nach anschließender Spülung mit
PBS (5 min) und Leitungswasser (10 min) wurden die Schnittpräparate zur
Gegenfärbung für 30 Sekunden in Hämatoxylin getaucht. Abschließend wurden die
Schnitte mit Eukitt® (Kindler GmbH & Co., Freiburg, Germany) eingedeckelt.
Für eine eindeutige Identifizierung des maternalen Kryptenepithels und des
Chorionepithels wurde der Erstantikörper Pan-Cytokeratin Antikörper CK102 mit den
Klonen AE1 und AE3 (Bioprime, DNA Labeling System, Gibco BRL Grand Island,
NY, USA, CK102) in einer Verdünnung von 1:100 verwendet (Anhang 2). AE1 und
AE3 sind Maus IgG1-Antikörper, welche immunogen gegen humane epitheliale
Keratine wirken.
Apoptotische Zellen wurden mit Hilfe eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen ein Peptid des p17-Fragmentes der humanen Caspase-3 (Abcam, Cambridge,
MA, USA, ab4051) ermittelt. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:50 bei
Zimmertemperatur verwendet (Anhang 3).
20
MATERIAL UND METHODEN
Zum Nachweis der induzierten Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) wurde ein
polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen den N-terminus von iNOS (Millipore,
Billerica, MA, USA, 06-573) in einer Verdünnung von 1:500 verwendet (Anhang 4).
Für die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) diente ebenfalls ein
polyklonaler Kaninchen-Antikörper (Alpha Diagnostic, San Antonio, TX, USA,
ENOS32-A), der gegen das bovine eNOS32-P-Peptid gerichtet war und in einer
Verdünnung von 1:2000 bei Zimmertemperatur aufgetragen wurde (Anhang 4).
Für das vasokonstriktorische Peptid Endothelin-1 (ET-1) wurde ein polyklonaler
Kaninchen-Antikörper
(Biologo,
Kronshagen,
Germany,
EDN001)
in
einer
Verdünnung von 1:300 gegen das bovine ET-1 verwendet (Anhang 5).
Um die Existenz unspezifischer Bindungen beurteilen zu können, wurden
Negativkontrollen durchgeführt. Statt des Erstantikörpers wurde hierfür inaktiviertes
Ziegen-Normalserum verdünnt mit PBS und 1%igem bovinen Serumalbumin eingesetzt.
3.5 Auswertung mittels Lichtmikroskopie
Insgesamt
konnten
pro
histologische
und
immunhistologische
Färbung
49
Plazentomschnitte angefertigt und ausgewertet werden. Die Übersichtsfärbung mit
Masson’s Trichrom und die immunhistochemisch gefärbten Präparate wurden mit
einem Olympus Lichtmikroskop BX51, ausgestattet mit einer Olympus DP72
Digitalkamera (Olympus Europa GmbH, Hamburg, Germany) untersucht. Nach ihrer
Morphologie wurden die Schnitte anhand der von SCHOON (1989) beschriebenen
Kriterien in drei Klassen eingeteilt: reife Plazenta, unreife Plazenta und eine
Mischform mit reifen und unreifen Anteilen in einem Präparat. Die Klassifizierung
erfolgte durch eine Person (D.H.), die gegenüber der Gruppeneinteilung geblindet
war.
Um den Anteil an Caspase-3 positiven Zellen pro Präparat zu bestimmen, wurde in
zwölf definierten Schnittlokalisationen pro Objektträger in 200facher Vergrößerung
die immunopositive braune Färbung mithilfe eines speziellen Bildanalyseprogramms
21
MATERIAL UND METHODEN
(Olympus, analySIS® Soft Imaging System 3.2, Hamburg, Germany) quantifiziert.
Aus der ermittelten Gesamtzahl positiver Zellen wurde der Median gebildet.
3.6 Ultrasonographische Untersuchungen
Für die transrektalen farbdopplersonographischen Untersuchungen erhielten die
Tiere 10 Minuten vor der Untersuchung 70 mg Procainhydochlorid (Procasel 2%®;
Selectavet, Weyarn-Holzolling, Germany) epidural, um rektale Kontraktionen zu
minimieren. Die Untersuchungen erfolgen an den contra- und ipsilateral zum Fetus
gelegenen Arteriae uterinae mit Hilfe eines Ultraschallgerätes (Toshiba SSH 370A,
Toshiba Co., Tokyo, Japan), welches mit einer 7,5 MHz Mikrokonvexsonde
ausgestattet war. Die Untersuchungen dauerten im Durchschnitt 30 Minuten pro Tier
und wurden immer von derselben Person (D.H.) zur gleichen Tageszeit (zwischen 8
und 11 Uhr) durchgeführt.
Die Blutflussmessungen wurden nach der von BAUMGARTNER (1998) beschriebenen Methode durchgeführt. Die Arteria uterina wurde so angeschnitten, dass die
Ultraschallwellen in einem Winkel zwischen 20° und 60° zum Blutstrom auftrafen.
Aufgezeichnet wurden die Videosequenzen mit Hilfe eines DVD-Rekorders (DVRW260S; Sharp Electronics, Hamburg, Germany) und zur weiteren Bearbeitung auf
einen Computer übertragen. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Software Pixelflux
(Chameleon-Software, Leipzig, Germany). Dafür wurden zwei aufeinanderfolgende,
möglichst ähnliche Dopplerwellen herangezogen mit maximalem Verhältnis der Diastole zur Systole. Es wurde jeweils der Mittelwert aus den Werten beider Dopplerwellen berechnet. Nach jeder Blutflussmessung wurde der Durchmesser des Gefäßes
bestimmt, indem der Mittelwert aus drei hintereinender durchgeführten Messungen
berechnet wurde. Das Blutflussvolumen (blood flow volume = BFV) wurde aus der
mittleren maximalen Frequenzverschiebung über den Herzzyklus (time averaged
maximum frequency shift = TAMF) und dem Gefäßdurchmesser (D) nach folgender
Formel bestimmt: BFV (mL/min) = TAMV (cm/min) x (D/2 (cm))² x π. Der Resistance
Index (RI) wurde aus dem Quotienten der Differenz zwischen maximaler systolischer
22
MATERIAL UND METHODEN
Frequenz-verschiebung (PSF) und enddiastolischer Frequenz-verschiebung (EDF)
zu PSF bestimmt: RI = (PSF - EDF) / PSF (Figure 5).
3.7 Plasmagewinnung und hormonanalytische Untersuchung
Zur Bestimmung des Gehaltes an Progesteron (P4), Gesamtestrogen (Etot) und
Kortisol im Blutplasma wurde den Kühen nach jeder Ultraschalluntersuchung eine
Blutprobe aus der A./V. sacralis mediana entnommen. Zur Plasmagewinnung wurde
die Probe innerhalb von 20 Minuten nach der Entnahme für 10 Minuten bei 4000 x g
zentrifugiert und bis zur Analyse bei -20 ºC gelagert.
Die Hormonanalytischen Untersuchungen wurden im Endokrinologischen Labor der
Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt.
Die Progesteronkonzentration im Blutplasma wurde mittels eines sequenziellen
kompetitiven Immunoassays (IMMULITE® 1000; Siemens, Los Angeles, USA)
bestimmt. Dieser wies eine Sensitivität von 0,6 nmol/L auf. Es wurden Intra- und
Interassay-Varianzen von 16,0 %, 8,1 % und 6,3 % für Kontrollsera mit niedrigen
(< 1 ng/mL), mittleren (4 ng/mL), und hohen (8 ng/mL) Progesteronkonzentrationen
ermittelt.
Die
Bestimmung
des
Gesamtestrogengehalts
im
Blutplasma
erfolgte
in
Doppelbestimmungen nach der von MEYER et al. (1990) beschriebenen Methode
mittels Enzym-Immoassay. Für die Analyse wurde ein Antikörper (Antigen: Estradiol17β-Hemisuccinat bovines Serumalbumin) verwendet, welcher mit Estradiol-17β
(100%), Estron (100%) und Estradiol-17α (66%) reagiert und mit Estradiol-17βHemisuccinat Meerrettichperoxidase kombiniert wurde. Die Nachweisgrenze lag bei
8,0 pg/mL und die Intra- und Interassay-Varianzen bei < 10 % bzw. < 12 %.
Die
Kortisolkonzentration
im
Blutplasma
wurde
mittels
eines
kompetitiven
Festphasen Chemilumineszenz-Immunoassays (IMMULITE® 1000; Siemens, Los
Angeles, USA) mit einer Nachweisgrenze von 5,5 nmol/L bestimmt. Es wurden Intraund Interassay-Varianzen von < 8,8 % und < 10 % ermittelt. Laut Herstellerangaben
gibt es keine Kreuzreaktionen zwischen dem Kortisol im Blutplasma und
Dexamethason.
23
MATERIAL UND METHODEN
3.8 Statistische Auswertungen
Die statistische Auswertung wurde mit Hilfe der Programme SAS 9.1 (SAS Institute
Inc., Cary/North Carolina, USA, 1988) und StatView Version 5.0 (SAS Institute Inc.,
Cary, North Carolina, USA) durchgeführt. Die Daten wurden mit dem Shapiro-WilkTest positiv auf Normalverteilung getestet und als Mittelwerte ± Standardabweichung
dargestellt. Die Werte für BFV, RI und die Hormonkonzentrationen wurden mit Hilfe
des Student’s
t-Test sowohl zwischen den Gruppen als auch zwischen den
einzelnen Tagen miteinander verglichen. Auch Unterschiede hinsichtlich der Anzahl
an Caspase-3 positiven Zellen und Unterschiede in den BFV - und RI - Werten
zwischen den uterinen Arterien ipsi- und contralateral zum Fetus und zwischen
Tieren mit bzw. ohne Nachgeburtsverhaltung wurden mittels Student’s t-Test auf
Signifikanz untersucht. Die Beziehung zwischen BFV und RI, und zwischen BFV, RI
und dem Geburtsgewicht der Kälber wurde mittels Pearson Korrelation ermittelt.
Ergebnisse mit Korrelationskoeffizienten (r) von ≤ 0,20 wurden als sehr geringe
Zusammenhänge zwischen zwei Parametern gewertet, jene von 0,21 bis 0,50
wurden als geringe Beziehungen interpretiert, jene von 0,51 bis 0,80 indizierten
mittelgradige Zusammenhänge und jene über 0,81 gute Zusammenhänge. Es waren
nur die Korrelationskoeffizienten von Interesse, die statistisch signifikant waren.
Ergebnisse mit P ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
24
CHAPTER 1
4. Chapter 1:
Protracted induction of parturition enhances placental
maturation, but does not influence incidence of placental
retention in cows
D. Hartmann¹*, H. Bollwein¹, Ä. Honnens¹, D. Rath³, H. Niemann³, C. Pfarrer²
¹Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany
²Department of Anatomy, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany
³Institute of Farm Animal Genetics, Friedrich-Loeffler-Institute, Mariensee, Germany
4.1 Abstract
As the etiopathology of retained placenta is still not resolved in cattle, we compared
the effects of protracted and conventional induction of parturition on placental
maturation and the occurrence of retained placenta. Protracted induction of labor
(PIP) was precipitated in 13 cows by administration of 1.3 mg dexamethasone i.m.
twice daily between Days 268 and 273 of gestation, and 40 mg dexamethasone i.m.
on Day 274 of gestation. For conventional induction of labor (SIP), 10 cows received
40 mg dexamethasone on Day 274 of gestation. A third group (SPON, n = 11) served
as a non treated control group. Within two hours after birth, two placentomes were
extracted from the uterus and used for assessment of placental maturation by histology and immunohistochemistry. Incidence of retained placenta was lower (P < 0.05)
in group SPON (9 %) compared to group PIP (54 %) and SIP (70 %). Staining with
Masson-trichrome and pan-cytokeratin indicated a higher degree of atrophy and
flatness of the maternal crypt epithelium in cows without retained placentae (REL)
compared to cows with retained placentae (RET). Staining with anti-caspase-3
ratified the observations as more apoptotic cells were detected in group SPON and
25
CHAPTER 1
PIP compared with group SIP, however data were not statistically significant. To test
the hypothesis of ‘functional’ placenta maturation, the expressions of the potent
vasodilators endothelial (eNOS) and inducible (iNOS) nitric oxide synthase were
evaluated. Both, eNOS and iNOS, were only expressed in chorionic tissue.
Endothelin-1 (ET-1) as main vasoconstrictor showed a positive staining in maternal
crypt epithelium as well as in chorionic epithelium. No differences (P > 0.05) were
found for both NOS as well as ET-1 neither among the experimental groups nor
between RET and REL cows. These findings indicate that a protracted induction of
parturition results in a better placental maturation, but does not influence the
incidence of placental retention.
Key Words: placental retention; placental maturation, induction of parturition, dexamethasone; cattle
*Address for Correspondence: [email protected]
4.2 Introduction
Retention of fetal membranes is still a common problem in dairy cattle which negatively affects fertility and reproduction (GRUNERT et al. 1976; PELISSIER 1976;
WILLIAMS et al. 1987; LAVEN and PETERS 1996; PETERS and LAVEN 1996;
MCNAUGHTON and MURRAY 2009). Approximately five to ten per cent of dairy
cows suffer from placental retention (PELISSIER 1976; MCNAUGHTON and
MURRAY 2009). If induction of parturition is indicated for medical and/or economical
reasons, the incidence of retained placenta increases even further to 80 - 95 per cent
(GRUNERT et al. 1976; PELISSIER 1976).
Although there are many studies concerning retained placentae in cows, the etiology
and pathogenesis of this problem are not fully understood. Many factors have been
implicated in the development of placental retention, all of them leading to/involving
an incomplete placental maturation (WOICKE et al. 1986; BOOS et al. 2003). The
26
CHAPTER 1
maturation of the bovine placenta is usually completed three to five days before
parturition (WOICKE et al. 1986). Histologically, it is characterised by flattening of the
maternal crypt epithelium and a decrease in height and number of these cells
(BJORKMAN 1969; WOICKE et al. 1986). Furthermore, an increase in the number of
apoptotic cells in maternal and fetal epithelial cells is found during the maturation process (BJORKMAN 1954; WOICKE et al. 1986; WILLIAMS et al. 1987; BOOS et al.
2003). Additionally, placental separation might be facilitated by alternating ischemic
and hyperaemic conditions within the placentomes based on impaired attachment of
fetal and maternal adherence (GRUNERT 1986). Glucocorticoids have been identified to play a central role in the placental maturation process (BO et al. 1992; BOOS
et al. 2000). As fetal cortisol levels gradually increase in the course of pregnancy,
placental maturation seems to require exposure to elevated cortisol levels prior to
calving (BO et al. 1992). Conventional methods of induction of parturition, involving a
single application of corticosteroids in the attempt to mimic the natural endocrine
events, result in an incomplete placental maturation and therefore in a high incidence
of retained placentae (BEARDSLEY et al. 1974; WELCH et al. 1977; WILHELM
1989; SCHULZ 1990). Several attempts to modify the induction schedule had no
significant effect on placental maturation (BEARDSLEY et al. 1974; BARTH et al.
1978; DISKIN et al. 1982; CLAYDON 1984). The first promising results in relation to
reduce the incidence of retained placentae came from New Zealand (WELCH et al.
1973). These authors demonstrated that a pretreatment with long-acting corticosteroids had a positive effect on placental release. However, the laws in the
European Union prohibit the exogenous application of long-acting corticosteroids in
food animals. As an alternative, the injection of low dosages of short-acting corticosteroids for several days followed by a single application of a high dosage of this hormone has been proposed (ZERBE 2008).
In the present study a conventional (single high dose of glucocorticoids) and a protracted (repeated applications of low doses of glucocorticoids followed by a single
high dose of glucocorticoids) induction of parturition were compared to determine
whether or not repeated applications of low dosages of short-acting corticosteroids
for several days result in an improved placental maturation and therefore in a
27
CHAPTER 1
reduced incidence of retained placentae in cows. Placental maturation was assessed
histologically and by immunohistochemistry with markers for epithelial cells,
apoptosis, vasodilators and vasoconstrictors.
4.3 Material and Methods
4.3.1 Experimental Design
Twenty-four Holstein Friesian, eight German Black Pied, one German Fleckvieh and
one Red Holstein cow were used in this study between June 2007 and December
2008. Cows were 3.2 ± 1.2 years old (range, 2 to 8), with a parity of 1.7 ± 1.0 (range,
1 to 5). These 34 animals with known breeding dates (Day 0 = day of insemination)
were randomly selected for a protracted induction of parturition (PIP, n = 13) and a
conventional induction of parturition (SIP, n = 10), while the remaining 11 cows
served as the non treated controls (SPON). On Day 268 of gestation group PIP
received 1.3 mg dexamethasone (Dexamethason®, cp-pharma, Burgdorf, Germany)
i.m. twice a day for six days. On Day 274, 40 mg dexamethasone i.m. for induction of
labor was administered. Group SIP received only a single injection of 40 mg dexamethasone i.m. on Day 274 for birth induction. The control group calved spontaneously without any treatments.
Within two hours after birth, two placentomes were extracted from the uterus and
used for assessment of placental maturation by histology and immunohistochemistry.
The end point variables recorded were the date of parturition, interval from calving to
placental release and incidence of placental retention. Cows that expelled the placenta within the first 12 hours were defined as cows with released placentae (REL).
Cows that had not expelled their placenta within the first 12 hours after calving were
defined as cows with a retained placenta (RET) and were treated every 24 hours with
1.0 mg Ceftiofur per kg body weight s.c. (Excenel® RTU, Pfizer AG, Zürich, Swiss)
for five days. In the following days time of separation of the placenta in RET cows
was controlled daily and recorded.
28
CHAPTER 1
Treatment of the cows and removal of placentomes after birth was approved by the
local authority (LAVES Az: 33.9-42502-04-07/1394).
4.3.2 Tissue sampling and fixation
Within two hours after birth two placentomes were collected per vaginam by an
effeminator according to Richter, modified by Reisinger (Hauptner, Solingen,
Germany). The collected placentomes were cut into radial slices, which were further
cut into small pieces of about 1.0 x 1.0 x 0.5 cm. The specimens were immersed in
4 % neutral phosphate-buffered formaldehyde solution according to LILLIE (1976) for
24 hours and afterwards embedded in Paraplast Plus ® (Shandon, Pittsburgh, PA,
USA) using a tissue embedding machine (Tissue-Tek III, from Shandon, Pittsburgh,
PA, USA).
4.3.3 Histology and Immunohistochemistry
For histology and immunohistochemistry, sections with a thickness of about 5 µm
were produced from a total of 26 cows (CON, n = 8; SIP, n = 8; PIP, n = 10). The
sections were stained with Masson´s trichrome.
For immunohistochemical examinations paraffin sections were dried at 37 º C overnight, deparaffinized in xylene and rehydrated in a series of graded alcohols at room
temperature. All incubation steps were performed in a moist chamber and all dilutions
were carried out with self-made PBS (0.1 M, pH 7.2). After quenching the activity of
endogenous peroxidase with 4 % H2O2 in 80 % alcohol for 30 min the sections were
rinsed and incubated with normal goat serum for 20 min at room temperature in order
to block unspecific binding sites. After draining of the blocking serum the slides were
incubated with the primary antibody at 4 º C overnight.
For visualisation of the immunostaining, the sections were incubated with EnVision
rabbit (Dako REAL EnVision Detection System, Glostrup, Denmark) at room
temperature for 45 min, rinsed with PBS (3 x 5 min) and stained with
diaminobenzidine (DAB) chromogenic substrate (Dako REAL EnVision Detection
29
CHAPTER 1
System, Glostrup, Denmark). Finally, the sections were rinsed in PBS and tap water
and counterstained with hematoxylin for 30 seconds.
For Cytokeratin detection a Pan-Cytokeratin antibody, consisting of clones AE1 and
AE3 (Bioprime, DNA Labeling System, Gibco BRL Grand Island, NY, USA, CK102)
were used as primary antibody in a dilution of 1:100 to identify maternal crypt
epithelium and chorionic epithelium respectively. AE1 and AE3 are murine IgG1
antibodies elicited against human epithelial keratins.
Apoptotic cells were identified by a rabbit polyclonal antibody in a dilution of 1:50
against Caspase 3, elicited against recombinant full length of human protein (Abcam,
Cambridge, MA, USA, ab4051).
To localise inducible nitric oxide synthase (iNOS) a polyclonal rabbit antibody against
the N-terminus of murine iNOS in a dilution of 1:500 (Millipore, Billerica, MA, USA,
06-573) was used. Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was localised by a rabbit
anti-bovine eNOS IgG antibody in a dilution of 1:2000 (Alpha diagnostic, San
Antonio, TX, USA, ENOS 32-A).
The vasoconstrictor Endothelin-1 (ET-1) was detected in placental tissue, using a
primary polyclonal rabbit antibody in a dilution of 1:300 (Biologo, Kronshagen,
Germany, EDN001).
Negative controls were set up with the antibody diluent instead of the primary antibodies.
4.3.4 Light Microscopy
Massons´s trichrome stained sections and all immunohistochemistry stainings were
evaluated using an Olympus light microscope BX51 equipped with Olympus DP72
Digital Camera (Olympus Europa GmbH, Hamburg, Germany). They were assigned
into three classes according to SCHOON (1989): mature placenta, immature
placenta and a hybrid form with mature and immature parts in one section. The
classification was done by one person (D. H.) who was blinded to the animals.
For Caspase-3 in each section (n = 52) the immunopositive brown staining of 12 defined images was quantified for particle size (200x magnification), using analySIS®
Soft Imaging System 3.2 (Build 635, Olympus Europa GmbH, Hamburg, Germany).
30
CHAPTER 1
4.3.5 Statistical analysis
Statistical analysis for immunopositive brown staining of Caspase-3 was carried out
using SAS® computer program (SAS Inst. Inc., Version 9.1, Cary, NC). Means ± SD
were calculated for all measurements (PROC MEANS). For comparison between the
experimental groups and between RET and REL data were subjected to Student´s
t - test. Incidence of retained placentae was compared between groups using Chi square distribution. Differences were considered statistically significant when P
values were ≤ 0.05.
4.4 Results
4.4.1 Clinical findings
Cows of group SPON showed a gestation length of 282 ± 4.1 days (range 278 to 289
days, n = 11). Group SIP had a gestation length of 276 ± 0.4 days (range 276 to 277
days; n = 10) and calved 30 to 70 (46.2 ± 6.9) hours after the injection of 40 mg
dexamethasone. Cows of group PIP showed a gestation length of 275 ± 0.95 days
(range 272 to 276 days, n = 13). Out of these, nine cows calved between 24 and 36
(27.9 ± 4.8) hours after the last injection of 40 mg dexamethasone. Three cows
calved before the last injection of 40 mg dexamethasone was given between Day
272 and 274 and one cow calved on Day 276.
Obstetrical assistance was required in two cows of groups SPON, SIP, and PIP,
respectively. Four cows (SPON: 1, SIP: 2, PIP: 1) needed slight (traction force of one
person) and one cow (SPON) tight assistance (traction force of two people). In one
cow (PIP), the position of the calf with the head tucked back had to be corrected.
One out of 11 cows in group SPON (9 %), seven out of 10 (70 %) in group SIP and
seven out of 13 cows (54 %) in group PIP had retained placentae. Incidence of
retained placenta was significantly lower in group SPON compared with group PIP
and SIP (P < 0.05). No differences (P > 0.05) were found between group PIP and
31
CHAPTER 1
SIP. Separation of the placenta in RET cows occurred 3 to 8 days after parturition. All
cows with RET showed a metritis of grade I as defined by SHELDON et al. (2009).
In group SPON two calves died, one during the calving process because of a
prolonged and difficult labor (traction force of two people for more than 30 minutes)
and one was already dead, when the cow was examined to check the presentation of
the calf in the birth canal. In groups SIP and PIP no calf died, but two and one,
respectively, needed nursing assistance.
At birth, ten of the weighted calves were male (m) and 13 female (f). The average
birth weight was 42.5 ± 3.9 kg, while the male calves were heavier than females
(range 36 to 52 kg; m: 44.5 ± 3.8, f: 41.1 ± 3.4, P < 0.05). Birth weight of calves in
group SPON (39.1 ± 1.0; m = 1, f = 4) was lower (P < 0.05) compared with calves in
groups SIP (42.7 ± 3.3; m = 6, f = 2) and PIP (44.2 ± 4.3; m = 3, f = 7), respectively.
4.4.2 Placental Histology (Masson´s Trichrome staining)
Eighteen of 49 analyzable sections were assigned to/identified as a mature placenta
form, with obvious signs of loosening of the fetomaternal adherence. In addition,
most of the maternal crypt epithelium appeared flattened or was partly inconsistent
(Fig.1 A). In 18 of 49 sections, the placentae were clearly immature as the
cotyledonary villous trophoblast cells were in intimate contact with an intact maternal
caruncular epithelium (Fig.1 B). Thirteen of 49 sections had a hybrid placenta form,
where both forms appeared aside each other.
Decoding of the assigned sections revealed that most of the sections (68 %) from
animals of group SPON were classified into the mature form, whereas most of the
SIP cows had an immature placental structure (71 %). Cows of group PIP predominantly had a hybrid form (42 %) (Fig. 3).
Sixty-seven percent of cows with RET had an immature placenta, eight percent a
mature placenta and 25 % showed a hybrid form. In REL cows, 66 % had a mature
placenta, 21 % an immature and 14 % a hybrid placenta form.
32
CHAPTER 1
4.4.3 Height of Maternal Epithelium (Pan-Cytokeratin Immunohistochemistry)
In tissue sections the intensity of the immunopositive brown staining differed between
the chorionic and the maternal crypt epithelium, thus a clear identification of the
maternal epithelium was possible (Fig.1 C and D). The assignment to mature and
immature placentae coincided with the classification of the Masson trichrome
sections.
Sections, which were classified as mature in Masson trichrome staining, showed an
almost flat and broad maternal crypt epithelium with partly atrophic areas (Fig. 1 C).
Cows with an immature placenta showed an almost cuboidal maternal epithelium
(Fig. 1 D).
4.4.4 Apoptosis (Caspase-3 Immunohistochemistry)
In tissue sections Caspase-3 positive cells were found in the fetal and the maternal
compartment and showed a brown staining which was mostly localised to the
cytoplasm (Fig.1 E and F). In sections, which were classified as mature in Masson’s
trichrome, a greater number of apoptotic cells was detected (Fig.1 E), whereas cows
with an immature placenta showed only a few apoptotic areas (Fig.1 F).
The quantification revealed that cows of the control group had a drift to higher
numbers of apoptotic cells (2.31 ± 0.45 %) compared to the conventional induction
group (1.68 ± 1.13 %), whereas cows with a protracted induction of birth showed
numbers between the controls and the conventional induction group (1.93 ± 0.67 %).
However, the differences were not statistically significant. No differences (P > 0.05)
were seen in the number of apoptotic cells between REL and RET cows.
4.4.5 iNOS and eNOS in placental tissue
Positive staining for iNOS and eNOS was detected in all three groups, but exclusively
in fetal placental tissue (Fig. 2 A and B). No positive staining was present in maternal
crypt epithelium and maternal stroma cells. Endothelial cells of blood vessels were
33
CHAPTER 1
also positive for eNOS, whereas they were negative for iNOS. No differences
(P > 0.05) were found between the experimental groups and RET and REL cows.
4.4.6 Endothelin-1 (ET-1) in placental tissue
In tissue sections a positive staining for ET-1 was found in maternal crypt epithelium
as well as in chorionic epithelium (Fig. 2 C). No differences (P > 0.05) were found for
ET-1 among the experimental groups nor between RET and REL cows.
4.5 Discussion
For the first time we have shown that a protracted induction of parturition leads to an
accelerated placental maturation if short acting corticosteroids are administered in
short intervals over a period of six days.
In our study 54 % of the group with protracted induction of parturition had a retained
placenta compared to the group with conventional induction of birth with 70 % of
retained fetal membranes. Parturition is normally induced by the release of cortisol
from the fetus in the last month of gestation, particularly in the last week
(GARVERICK et al. 1974; HUNTER et al. 1977). Cortisol stimulates the enzyme 17αhydroxylase in the fetal membranes to catalyze the conversion of progesterone to
estrogens (MCDIARMID 1983; KINDAHL et al. 2004). It is recognized that the
magnitude of the prepartum surge in estrogens greatly influences the placental
maturation process (GRUNERT et al. 1989). Conventional induction of parturition by
dexamethasone injection is thought to mimic the physiological mechanisms by which
the fetus induces parturition. But it seems to have no effect on the incidence of
retained placentae in cows (LAVOIE and MOODY 1973; SCHMITT et al. 1975). To
obtain an improved placental separation fractionate doses of corticosteroids over
three days followed by an injection of prostaglandin have been tested (WILHELM
1989). However, previous studies determined a minimum pretreatment time of five
days with corticosteroids to obtain a positive effect on the seperation process
34
CHAPTER 1
(HUNTER et al. 1977; WELCH et al. 1977; DAVIS et al. 1979; CLAYDON 1984; BO
et al. 1992).
The delivery of the placenta post partum is a physiological process, involving the loss
of fetomaternal adherence (BJORKMAN and SOLLEN 1960). This loss of adherence
occurs only after the placentome has undergone a process of maturation, which is
initiated several weeks before parturition and not completed until the last days before
term (WOICKE et al. 1986).
In the present study, the degree of bovine placental maturation, assessed by general
histology and immunohistochemistry for pan-cytokeratin and caspase-3, was obvious
by separation of fetal and maternal tissues, flattening and disappearance of maternal
crypt epithelium, and abundance of apoptosis. Masson´s trichrome staining showed
that most of the SPON and the PIP cows had a mature placenta with a flattened and
discontinuous maternal crypt epithelium. This observation concurred to most of REL
cows. In contrast most of the animals of the SIP and RET group showed an
incomplete maturation.
These observations were confirmed by an immunohistochemical staining with PanCytokeratin, which not only stained epithelial cells, but allowed also a clear
differentiation between maternal crypt epithelium and chorionic epithelium. Maternal
and fetal epithelial cells differed clearly in their staining intensity permitting an
assessment of the cell height. Cytokeratins are a group of water soluble filament
proteins, which are components of the cytoskeleton of epithelial cells and can be
used to define different cell phenotypes (MOLL et al. 1982). Obviously, bovine
maternal crypt epithelium and chorionic epithelium are characterized by a different
composition of cytokeratins. It has been suggested before that the maturation
process involves the flattening of the maternal crypt epithelium and a decrease in the
number of maternal epithelial cells (HOLM et al. 1964; WOICKE et al. 1986).
In the present study the extent of apoptosis between the experimental groups was
evaluated semiquantitatively in caspase-3 immunohistochemically stained sections.
No differences between REL and RET cows were found, but animals of Group SPON
35
CHAPTER 1
had an increased occurrence of apoptotic cells compared to Group PIP. Fewest
apoptotic cell areas were found in cows of Group SIP.
Normal pre-term maturation of the bovine placenta has also been associated with
apoptosis within the maternal crypt as well as in the chorionic epithelium
(BJORKMAN 1969; WILLIAMS et al. 1987; AL-SADI et al. 1994; BOOS et al. 2003).
However earlier studies are partly contradictory in the occurrence of apoptotic and
necrotic cells in placental tissues. Some studies found that placental necrosis was
not directly related to normal placental separation of the fetal membranes from the
maternal caruncle (WILLIAMS et al. 1987; AL-SADI et al. 1994). Others detected an
increase in the number of apoptotic cells in maternal and fetal epithelium immediately
after the expulsion of the fetus and correlated these observation with the placental
maturation process (BJORKMAN 1969). Whereas BOOS et al. (2003) found more
apoptotic cells in animals retaining their fetal membranes than in cows with placental
release.
Another cause of fetal membranes retainment is assumed to be the maintenance of
blood pressure within the chorionic villi. Contractions of the uterine muscle leads to
alternating hyperaemic and ischaemic conditions within the fetal villi (GRUNERT
1986). Thus the constantly changing uterine pressure after maturation impairs the
feto-maternal junctions and seems to be of great importance for separation of the
bovine placenta (LAVEN and PETERS 1996). For this reason we examined the
presence of a vasoconstrictor as well as vasodilatators on the basis of
immunohistochemistry investigations.
In the present study antibodies against iNOS and eNOS were used to detect NO
production in the bovine placenta in the last days of pregnancy. We found that iNOS
and eNOS are expressed in all bovine placental tissue sections. But differences were
found neither in the exhibition of iNOS and iNOS among the experimental groups nor
between REL and RET cows. As expected eNOS staining was observed in the
endothelium of any blood vessels, whereas iNOS was not expressed. Surprisingly,
unlike in sheep where iNOS was localized in intercotyledonary chorioallantoic
membrane and intercaruncular maternal endometrium and eNOS was present in
36
CHAPTER 1
cotyledonaryl and caruncular of the placentome as well as in intercotyledonary and
intercaruncular placental tissue (ZHENG et al. 2000), positive staining for iNOS and
eNOS was only detected in fetal placental tissue. This finding implicates that the fetal
chorionic tissue of the bovine placenta has a more active part in placental
vasodilatation than previously thought. Nitric oxide (NO) is a potent vasodilator and
plays an active role in regulating placental function including reducing vascular tone
during human (MONCADA et al. 1991) and ovine (ROSENFELD et al. 1996)
pregnancy. Close to term NO-production was found to decrease in humans
promoting effective contractions resulting in labor (MAUL et al. 2003).
In the present study the localization of ET-1 peptide in bovine placentomes was
described for the first time. ET-1 was found in maternal crypt epithelium as well as in
chorionic epithelium. Like for iNOS and eNOS no differences in the expression of ET1 were found between the experimental groups or between REL and RET cows.
Therefore ET-1 and NOS could not be correlated with placental maturation and
placental retention, which is in accordance with previous studies (TAKAGI et al.
2002; TAKAGI et al. 2008). Endothelins are the counterparts to the vasodilatation
system and belong to a family of vasoconstrictor peptides, mainly produced by
endothelial cells of mammalian species (YANAGISAWA et al. 1988). ET-1 has been
shown to be involved in the regulation of uterine and placental perfusion (THAETE et
al. 2004) and in the stimulation of the uterine contraction during labor and delivery in
rats (MCGOVERN et al. 1992). In bovine caruncles and cotyledons ET-1 mRNA is
expressed during the entire pregnancy. However the authors found no correlation
between ET-1 expression in placental tissues and placental retention (TAKAGI et al.
2008).
The finding that vasoconstrictive ET-1 and vasodilatory iNOS and eNOS did not differ
between the groups examined is corroborated/supported by results of parallel uterine
blood flow studies, which showed no differences in blood flow volume and resistance
index in the last days before parturition (Hartmann et al., unpublished data).
37
CHAPTER 1
In conclusion a protracted induction of parturition with repeated applications of low
dosages of dexamethasone over six days as a pretreatment for a conventional
induction treatment might mimic the physiological mechanisms by which the fetus
induces parturition in cattle. This leads to a better cellular placental maturation, but
does not influence incidence of retained placenta.
Acknowledgements
The authors wish to thank H.-G. Sander and his team in Mariensee for the help in
handling and observation of the cows. Further thanks to M. Gähle and D. Walter from
the Department of Anatomy and B. Buck and V. Herder from the Institute of Pathology
for the excellent technical assistance.
38
CHAPTER 1
4.6 Figures and Tables
Figure 1: Illustration of mature (REL) and immature (RET) bovine placentomes.
A, B Masson trichrome staining in mature (A) and immature (B) placental formation.
A Asterisks (*) illustrate the loosening of the feto-maternal adherence. B In immature
placentae the fetal and maternal part are tightly adhered to each other. C, D
Immunohistochemical staining with Pan-Cytokeratin. C The maternal crypt epithelium
appears flattened or is partly inconsistent (arrows). D Illustration of an almost
cuboidal maternal crypt epithelium in RET cows (arrowheads). E, F
Immunohistochemical staining with Caspase-3 evidenced a greater number of
39
CHAPTER 1
immunopositive brown staining cells in mature (E) and only scattered positive cells in
immature (F) placental tissue sections. fe: fetal chorionic epithelium, me: maternal
crypt epithelium. Bars 100 µm.
Fig. 2: Formation of nitric oxide synthase (NOS) and Endothelin-1 (ET-1) in bovine
placentomes. A, B Immunohistochemistry staining with eNOS (A) and iNOS (B)
showed a clear appearance of positive staining only in fetal chorionic tissue. C
Positive staining for ET-1 is present in fetal chorionic tissue as well as in maternal
crypt epithelium in bovine placental tissue. D Negative immunohistochemistry control.
fe: fetal chorionic epithelium, me: maternal crypt epithelium. A-C Bars 50µm, D Bars
100µm.
40
CHAPTER 1
80
mature
hybrid-form
70
immature
placentomes in %
60
50
40
30
20
10
0
SPON
SIP
PIP
Fig. 3: Classification of placental formation in the experimental groups at delivery:
control (SPON, n = 8), conventional induction of parturition (SIP, n = 8) and
protracted induction of parturition (PIP, n = 10).
41
CHAPTER 2
5. Chapter 2:
Effects of a protracted induction of parturition on the incidence
of retained placentae and uterine blood flow in cattle
D. Hartmann¹, Ä. Honnens¹, J. Lüttgenau¹, M. Piechotta¹, D. Rath², H. Niemann², H.
Bollwein¹
¹ Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany
² Institute of Farm Animal Genetics, Friedrich-Loeffler-Institute, Mariensee, Germany
5.1 Abstract
The objectives of the present study were to compare the effects of a protracted and a
conventional induction of parturition on the incidence of retained placentae, and to
evaluate the suitability of transrectal Doppler sonography of the uterine arteries as a
non-invasive method for the assessment of placental maturation. Protracted induction of labor (PIP) was precipitated in 13 cows by the administration of 1.3 mg dexamethasone i.m. twice daily between Days 268 and 273 of gestation, and 40 mg dexamethasone i.m. on Day 274 of gestation. For conventional induction of labor (SIP), 10
cows received 40 mg dexamethasone on Day 274 of gestation. A third group (SPON,
n = 11) was not treated and served as control. Blood flow volume (BFV) and
resistance index (RI) in the uterine arteries were measured with Doppler sonography
once a day from Day 268 of gestation until labor (= Day 0). After each
ultrasonographic examination, blood samples for determination of steroid hormones
were taken. Incidence of retained placenta was lower (P < 0.05) in group SPON
(9 %) compared to group PIP (54 %) and SIP (70 %). In the last seven days before
parturition uterine BFV and RI did not change (P > 0.05) and did not differ between
groups SPON, PIP and SIP (P > 0.05). Resistance index was higher (P < 0.001) in
42
CHAPTER 2
RET compared to REL cows, whereas BFV did not differ (P > 0.05) between them.
Total estrogen (Etot) concentrations increased by 283 % (P < 0.001) in group PIP and
by 60 % (P < 0.05) in group SPON between Days -7 and -1. They stayed constant
(P > 0.05) until Day -2 in group SIP, but increased after the high dosage of
dexamethasone within one day by 140 %. Total estrogen levels were higher (P <
0.05) in REL than in RET cows. In conclusion, a protracted compared to a short
induction of labor results in higher estrogen levels before term, but does not affect
incidence of placental retention. Neither alterations in placental maturation nor
changes in steroid hormones influenced uterine blood supply. Therefore, Doppler
sonography of uterine arteries is unsuitable to investigate the process of placental
maturation induced by glucocorticoids in cows. Nevertheless, disturbances in the
placental maturation process in cows with retained fetal membranes after parturition
can already be detected before parturition by a higher uterine blood flow resistance in
the uterine arteries.
5.2 Introduction
On large dairy farms, there is an increasing incidence of stillbirths due to difficulties
with calving management (GUNDELACH et al. 2009; KAUSCH 2009). One method
to reduce this problem is to terminate labor via hormonal induction of parturition.
Conventionally used methods for the induction of parturition are single treatments
with short-acting corticosteroids and prostaglandins, respectively, to mimic the naturally occurring endocrine events that trigger the onset of parturition in cattle
(MCDIARMID 1983; BO et al. 1992).
Spontaneous parturition is induced by the release of cortisol from the fetus. Cortisol
stimulates the enzyme 17α-hydroxylase in the fetal membranes to catalyze the
conversion of progesterone (P4) to estrogens. The increasing concentrations of estrogens lead to a higher expression of oxytocin receptors, followed by a release of
prostaglandins, which in turn induce luteolysis and parturition (MCDIARMID 1983;
KINDAHL et al. 2004). It is also well documented that sexual steroid hormones play
43
CHAPTER 2
an important role in placental development (AGTHE and KOLM 1975; BOOS et al.
2000; WISCHRAL et al. 2001; TAKAGI et al. 2002; KINDAHL et al. 2004). The
maturation process of the placentomes is very important for normal placental separation, and it is suggested that a disturbance of the placental maturation is caused by a
multifactorial
event
including
morphological,
functional
and
endocrinological
processes (SCHOON 1989).
Exogenous induction of parturition by using a single treatment with either dexamethasone or prostaglandin causes a high incidence of retained fetal membranes
(MACDIARMID and COOPER 1983; WILHELM 1989; KORNMATITSUK et al. 2000),
which relies on the failure to raise estrogens to concentrations similar to those
measured during spontaneously occurring parturitions in cows (BEARDSLEY et al.
1974). This perinatal imbalance or deficiency of hormones results in an incomplete
placental maturation (AGTHE and KOLM 1975; GRUNERT et al. 1989; SCHULZ
1990).
Several attempts to modify the induction schedule achieved no effect on placental
maturation (BEARDSLEY et al. 1974; BARTH et al. 1978; DISKIN et al. 1982;
CLAYDON 1984). The first auspicious results in reducing the incidence of retained
fetal membranes in cows were observed in New Zealand (WELCH et al. 1973). It
was demonstrated that a pretreatment with long-acting corticosteroids had a positive
effect on placental release. By using this method, a lower incidence of retained fetal
membranes was observed (WELCH et al. 1973; DAVIS et al. 1979; DISKIN et al.
1982; BO et al. 1992; NASSER et al. 1994). Treatment with long-acting
corticosteroids gained wide acceptance in New Zealand, where dairy farming is
highly seasonal and lactation needs to coincide with the maximum availability of
pasture (HUNTER et al. 1977). In Germany and other European countries, this
procedure is not popular because, according to European law, the exogenous
application of long - acting corticosteroids is not allowed in food animals. An
alternative in these countries is the treatment with low doses of short-acting
corticosteroids twice daily for six days, followed by a single treatment with a high
dose of this hormone (ZERBE 2008).
44
CHAPTER 2
However, in previous studies it was noticed that the repeated application of corticosteroids during late pregnancy decreased ovine uterine and umbilical blood flow and
consequently placental and fetal growth (JELLYMAN et al. 2004; JENSEN et al.
2005). Although there were some studies measuring uterine blood flow in the last
period of pregnancy in cattle (LEIDL 2000; NISHIDA et al. 2006; PANARACE et al.
2006), until now there are no data about uterine blood flow in the last few days of
pregnancy. It has been shown that the large increase in transplacental exchange
during the second half of gestation depends primarily on uterine blood flow
(REYNOLDS and REDMER 2001; SCHULER et al. 2002). Placental maturation in
the last term of pregnancy is characterised by the formation of new vessels via angiogenesis (BOROWICZ et al. 2007) mainly by new fetal villious trees in the centre of
the placentomes (SCHULER et al. 2002).
The objectives of the present study were to examine the effects of a short and a
protracted induction of parturition with exogenous corticosteroids during the end of
pregnancy on the release of the placenta and on uterine blood supply.
5.3 Materials and Methods
5.3.1 Cattle
Thirty-four primi- and pluriparous (n = 17 each), clinically healthy Holstein Friesian
(n = 24), German Black Pied (n = 8), Simmenthal (n = 1), and Red Holstein (n = 1)
cows with known breeding dates were examined at a research farm in Lower
Saxony, Germany, between June 2007 and December 2008. These cows were 3.2 ±
1.2 years old (range, 2 to 8), with a parity of 1.7 ± 1.0 (range, 1 to 5). Twelve days
before their expected calving date, cows were brought into stables with deep-straw
bedding and fed a mixed ration (corn, grass silage, ground corn, vitamins and
minerals), with ad libitum access to water.
45
CHAPTER 2
5.3.2 Study design
Cows were randomly allocated into three groups with spontaneously occurring
parturition (SPON, n=11), serving as control group, or short (SIP, n=10) and
protracted (PIP, n=13) inductions of parturition, respectively. Cows in group SIP
received a single treatment with 40 mg dexamethasone (Dexamethason-Lösung®,
cp-pharma, Burgdorf, Germany) on Day 274 (Day 0 = day of insemination), whereas
cows in PIP received 1.3 mg dexamethasone twice daily on Days 268 to 273,
followed by a single treatment with 40 mg dexamethasone on Day 274 (all treatments
were given i.m.; Figure 4).
In group SPON, ultrasonographic examinations were performed every second day
from Days 268 to 276, and starting on Day 276, once daily until the day of parturition
(Day 0). Cows of groups SIP and PIP were examined once daily between Day 268
and parturition.
All cows were controlled every 4 h for signs of an imminent parturition. If cows did not
deliver the fetus within 2 h after the first visible signs of labor, the position and size of
the fetus was examined by transvaginal manual exploration of the birth canal. If
indicated due to the obstetric findings, assistance of parturition was provided. Calves
were judged as vital if they were able to stand and drink within the first 2 h after
parturition. The birth weight of 23 calves was determined.
Depending on if cows expelled the fetal membranes within the first 12 h after calving
or not, they were defined as cows with released (REL) and retained (RET) placenta,
respectively. During the first 5 d, the latter were treated once daily with 1.0 mg
Ceftiofur per kg body weight s.c. (Excenel® RTU, Pfizer AG, Zürich, Swiss) and were
examined once daily to record the time of placental separation.
5.3.3 Measurement of uterine blood flow
Ten minutes before each ultrasonographic examination, cows were treated epidurally
with 70 mg procaine hydrochloride (Procasel 2%®; Selectavet, Weyarn-Holzolling,
Germany) to reduce rectal contractions. Transrectal ultrasonographic examinations
of blood flow in the main uterine arteries ipsi- and contralateral to the localization of
46
CHAPTER 2
the fetus were performed using an ultrasound device (Toshiba SSH 370A, Toshiba
Co., Tokyo, Japan), equipped with a 7.5 MHz microconvex transducer. All examinations lasted approximately 30 min per cow and were performed always by the same
person (DH) at the same time of the day (between 8 and 11 a.m.).
Uterine blood flow was investigated as described earlier (BOLLWEIN et al. 2002). All
blood flow velocity waveforms were obtained at an interrogation angle between
Doppler ultrasonic beam and blood flow direction of 20 to 60 degrees. The
observations were displayed on-line and recorded on a DVD recorder (DV-RW260S;
Sharp Electronics, Hamburg, Germany). For the off-line evaluation of blood flow
parameters an image analysis software (Pixelflux; Chameleon-Software, Leipzig,
Germany) was used. Two uniform consecutive waveforms with a maximum ratio between diastolic and systolic frequency shift were selected for each investigation.
Immediately after the Doppler measurements the vessel diameters were calculated
as the mean of three diameters measured on frozen two-dimensional grey scale
images. Blood flow volume (BFV) was calculated by using the time-averaged
maximum velocity over the cardiac cycle (TAMV) and the vessel diameter (D),
according to the following equation: BFV (mL / min) = TAMV (cm / min) x (D / 2 (cm))²
x π. The resistance index (RI) was calculated as the ratio of the difference between
peak systolic frequency shift (PSF) and end-diastolic frequency shift (EDF) to PSF:
RI = (PSF – EDF) / PSF (Figure 5).
5.3.4 Determination of steroid hormones
Blood samples were collected from the coccygeal blood vessels into tubes containing
potassium-EDTA (S-Monovette®; Sarstedt, Nümbrecht, Germany). Plasma was
separated by centrifugation (4000 x g, 10 min) of blood samples within 20 min after
collection. Samples were stored frozen at -20 °C un til analyses of endocrine
parameters.
Plasma progesterone concentrations were measured using a sequential competitive
chemiluminescence enzyme immunoassay (IMMULITE® 1000; Siemens, Los
Angeles, USA), with a lower detection limit of 0.6 nmol/L. The intra- and interassay
47
CHAPTER 2
coefficients of variation (CV) were 16.0%, 8.1%, and 6.3% for control sera with low
(<1 ng/mL), medium (4 ng/mL), and high (8 ng/mL) progesterone levels.
Total estrogens (Etot) were determined in duplicates using an enzyme immunoassay
as published earlier (MEYER et al. 1990). For analysis of Etot, an antibody (antigen:
estradiol-17β-hemisuccinate bovine serum albumin) reacting with estradiol-17β
(100 %), estrone (100 %) and estradiol-17α (66 %), was combined with estradiol-17β
-hemisuccinate horseradish peroxidase. The suitability of using total estrogens for
reliable monitoring of estradiol-17β activity was documented previously (MEYER et
al. 1990). The lower detection limit was 8.0 pg/mL, and the intra- and interassay CVs
were < 10 % and < 12 %, respectively.
Plasma cortisol concentrations were measured using a competitive chemiluminescent enzyme immunoassay (IMMULITE® 1000 Cortisol, Siemens, Los Angeles,
USA) with a lower detection limit of 5.5 nmol/L and intra- and interassay CVs of
< 8.8 % and < 10 %, respectively. According to the information of the manufacturer,
there is no cross - reaction between plasma cortisol and dexamethasone.
5.3.5 Statistical analyses
All statistical analyses were done with the Statistical Analysis System V9.1 (SAS
Institute Inc., Cary, NC, USA). Since data of BFV, RI and hormone concentrations
were normally distributed (Shapiro-Wilk test), they were presented as means ± SD.
Blood flow volume, RI and hormone concentrations as well as changes in timeinterval of progesterone were compared between groups and days and between RET
and REL cows using the Student´s t-test. Also differences in BFV and RI in uterine
arteries ipsi- and contralateral to the fetus and between cows with retained and
released fetal membranes, respectively, were evaluated by Student’s t-test.
Furthermore, the relationships between BFV and RI, BFV and birth weight of the
calves, as well as RI and birth weight were investigated by calculating Pearson´s
correlation coefficients (r). Results with positive or negative correlation coefficients of
≤ 0.20 were interpreted as low or no correlation, between 0.21 and 0.50 as weak
correlation, between 0.51 and 0.80 as moderate correlation and correlations of ≥ 0.81
48
CHAPTER 2
as good correlations. The variability of plasma progesterone and cortisol
concentrations between groups was expressed as the coefficient of variation (CV).
Incidence of retained placentae was compared between groups using Chi-square
distribution. Differences and relationships with P ≤ 0.05 were considered significant.
5.4 Results
5.4.1 Clinical findings
Gestation length in cows of group SPON was 282 ± 4.1 d (range 278 to 289 d,
n = 11). In group SIP, eight cows calved on Day 276 and two cows on Day 277 (30 to
70 hours after treatment with 40 mg dexamethasone). In group PIP, nine cows
calved on Day 275 (24 to 36 hours after treatment with 40 mg dexamethasone), three
cows between Days 272 and 274, and one cow on Day 276.
Parturition of all cows in group PIP that calved on Day 275 was during daytime (6
a.m. to 8 p.m.), whereas cows in groups SPON and SIP calved during daytime
(n = 9) or nighttime (8 p.m. to 6 a.m.; n = 12).
Obstetrical assistance was required in two cows of groups SPON, SIP, and PIP,
respectively. Four cows (SPON: 1, SIP: 2, PIP: 1) needed slight (traction force of one
person) and one cow (SPON) tight assistance (traction force of two people). In one
cow (PIP), the position of the calf with the head tucked back had to be corrected.
Retained fetal membranes were observed in 1 of 11 (9 %) cows of group SPON, 7 of
10 (70 %) of group SIP and 7 of 13 (54 %) of group PIP. Incidence of retained
placenta was lower (P < 0.05) in group SPON compared with group PIP and SIP. No
differences (P > 0.05) were found between group PIP and SIP. All cows with RET
showed within two days after parturition a metritis of grade I according to SHELDON
et al. (2009). The abruption of placenta occurred 3 to 8 d after parturition.
In group SPON two calves died, one during the calving process because of a
prolonged and difficult labor (traction force of two people for more than 30 minutes)
and one was already dead, when the cow was examined to check the presentation of
49
CHAPTER 2
the calf in the birth canal. In groups SIP and PIP no calf died, but two and one,
respectively, needed nursing assistance.
At birth, ten of the weighted calves were male (m) and 13 female (f). The average
birth weight was 42.5 ± 3.9 kg, while the male calves were heavier than females
(range 36 to 52 kg; m: 44.5 ± 3.8, f: 41.1 ± 3.4, P < 0.05). Birth weight of calves in
group SPON (39.1 ± 1.0; m=1, f=4) was lower (P < 0.05) compared with calves in
groups SIP (42.7 ± 3.3; m=6, f=2) and PIP (44.2 ± 4.3; m=3, f=7), respectively.
5.4.2 Uterine blood flow
Blood flow volume and RI during the last seven days before parturition did not
change (P > 0.05), neither in group SPON, nor in groups SIP and PIP. In all groups,
BFV was lower (P < 0.001) and RI was higher (P < 0.003) in the ipsi- compared to
the contralateral uterine arteries. There were no differences (P > 0.05) in BFV and RI
between groups SPON, SIP, and PIP (Table 2).
Resistance index was higher (P < 0.05) in RET compared to REL cows, whereas
BFV did not differ (P > 0.05) between RET and REL cows (Table 3).
There were moderate negative correlations between BFV and RI (r = -0.54;
P < 0.001) between Days -7 and -1. No correlation (P > 0.05) was observed between
BFV and the birth weight of the calves (Fig. 6a), but there was a weak positive
correlation (r = 0.46, P < 0.05) between RI and birth weight (Fig. 6b).
5.4.3 Steroid hormones
5.4.3.1 Progesterone
Plasma P4 concentrations decreased between Days -7 and -1 (P < 0.05) in cows of
groups SPON, SIP, and PIP by 46, 20 and 59 %, respectively (Figure 7). During this
time period P4 concentrations were higher (P < 0.05) in PIP than in SPON and SIP.
The relative changes between Days -7 and -1 did not differ between groups
50
CHAPTER 2
(P < 0.05). The CV for P4 concentrations ranged between Days -7 and -1 from 17 to
64 %.
5.4.3.2 Total estrogens
Concentrations of Etot in group SPON increased (P < 0.05) between Days -7 and -1
by 60 %. In group SIP, Etot did not change (P > 0.05) between Days -7 and -2, but
increased (P < 0.05) after treatment with dexamethasone by 140 % between Days -2
and -1. In group PIP, Etot increased (P < 0.001) continuously between Days -7 and -1
by 283 % (Figure 8). Between Days -4 and -2, Etot was higher (P < 0.05) in SPON
than in SIP cows. Concentrations of Etot in PIP were higher (P < 0.05) than in SIP
between Days -3 and -1 and higher (P < 0.05) than in SPON on Day -1. Etot
concentrations were higher (P < 0.05) in REL than in RET cows.
5.4.3.3 Cortisol
There were high variabilities of cortisol concentrations in between groups ranged
between Days -7 and -1 from 7 to 83 %. Plasma cortisol concentrations in cows of
group SIP decreased (P < 0.05) between Days -2 and -1 (following treatment with
dexamethasone) by 22 %. In cows of group PIP it decreased (P < 0.05) by 21 %
between Days -7 and -6 and stayed on a low level during dexamethasone treatment
(Figure 9). Between Days -6 and -1 cortisol concentrations were lower (P < 0.05) in
PIP cows compared to SPON and SIP cows. On Day -1, cortisol was lower (P < 0.05)
in SIP than in SPON cows.
5.5 Discussion
In group PIP, 70 % of cows calved 24 to 36 h after the last treatment with dexamethasone on daytime between 6 am and 8 pm. Similarly, in a previous study, the use
of a long-acting corticosteroid 4 to 6 days before the induction of parturition by a
51
CHAPTER 2
short-acting glucocorticoid resulted in a more predictable calving time compared to
the induction of parturition by a single treatment using one shot of a high dosage of a
glucocorticoid (BO et al. 1992). Therefore, a protracted induction of parturition allows
a better calving management and may therefore lead to a lower stillbirth rate of
calves.
In the control group, the incidence of stillbirth was 5.8 %, being within the normal
range in dairy cows (KAUSCH 2009). Furthermore, the average birth weight of the
calves in the present study was consistent with results in untreated cows (KAUSCH
2009), probably due to the temporal coincidence of the day of birth induction (Day
274 of parturition) and to the normal ending of the gestation period. However, calves
of group SPON had a significant lower birth weight than calves of groups SIP and
PIP. This was probably due to the fact that there were predominantly female calves
in group SPON, which weighed less than the male calves.
In the present study, 54 % of cows in group PIP had a retained placenta compared to
70 % in group SIP. Previous studies found that a conventional induction of parturition
with a single application of corticosteroids or prostaglandin resulted in a high
incidence of retained placenta up to 93 % (BEARDSLEY et al. 1974; WELCH et al.
1977; WILHELM 1989; SCHULZ 1990), which has detrimental effects on postpartum
fertility (GRUNERT et al. 1976; BO et al. 1992) and milk yield (SIMERL et al. 1992).
Therefore, subsequent studies aimed to reduce the high incidence of retained
placenta in induced animals. It was found that in late pregnancy the application of a
long acting corticosteroid formulation followed by the administration of short acting
corticosteroid several days later resulted in a lower incidence of retained fetal
membranes (WELCH et al. 1973; DISKIN et al. 1982; CLAYDON 1984; BO et al.
1992; NASSER et al. 1994). The decisive factor for placental separation seems to be
the variable interval from application of a long acting corticosteroid and the
subsequently administered short acting corticosteroid. Some studies have shown that
a minimum pre-treatment period of six days with corticosteroids is necessary to
obtain a significant effect on placental maturation and therefore on placental release
52
CHAPTER 2
(WELCH et al. 1973; HUNTER et al. 1977; CLAYDON 1984; BO et al. 1992). In this
period of time the placenta required exposure to exogenous corticosteroids to ensure
the physiological maturation process that would allow induction of parturition without
retention of the fetal membranes (NASSER et al. 1994). Therefore, a pre-treatment
interval of six days was chosen in the present study. The results obtained by this
study showed only numerical differences between groups PIP and SIP, but data were
not significant, which may be caused by the temporal coincidence of the normal
ending of the gestation period and therefore to a beginning of the physiological
placental maturation process in group SIP.
Blood flow volume and RI did not change in the last seven days of pregnancy. In
previous studies, significant increases in blood flow of both uterine arteries
throughout
gestation
(FERRELL
1991;
REYNOLDS
and
REDMER
1995;
PANARACE et al. 2006), steeping mainly during the last two-thirds of pregnancy
(PANARACE et al. 2006), as well as no differences in uterine blood flow during the
last third of pregnancy (NISHIDA et al. 2006) were observed. The large increases in
uterine blood flow during the last half of gestation were explained by the continuously
increasing demands of the fetus (REYNOLDS and REDMER 1995). We hypothesize
that the constant uterine blood flow during the last days of pregnancy in the present
study was due to a maximum blood flow capacity of uterine arteries. Therefore, it
seems that the considerable increase in transplacental exchange at the end of
pregnancy is not maintained by an increase in uterine blood flow, but by an increase
in placental function associated with a vast growth of placental vascularity
(REYNOLDS and REDMER 1995; REYNOLDS and REDMER 2001). In addition, a
limitation of blood flow capacity and therefore of the fetal supply could be a possible
stress factor that may be jointly responsible for the induction of birth.
Mean BFV values in the last days before parturition were consistently higher and RI
values lower in the uterine artery located ipsilateral to the pregnant uterus horn
compared to values measured in the uterine artery contralateral to the fetus. These
results are in agreement with findings of previous studies (BAUMGARTNER 1998;
NISHIDA et al. 2006; PANARACE et al. 2006). They may be associated with the
53
CHAPTER 2
increasing demands of the fetus during the last two-thirds of pregnancy (REYNOLDS
and REDMER 1995). Another study attributed these observations to the fact that the
pregnant horn contains more and larger placentomes than the non-pregnant horn
(LAVEN and PETERS 2001).
Resistance index was significantly higher in the last days of pregnancy in RET
compared to REL cows. This is probably due to the fact that the physiological
ablation process of the fetomaternal adherence in cows with retained placentae
failed. Physiologically, this loss of adherence occurs only after the placentome has
undergone a process of maturation (BJORKMAN and SOLLEN 1960; WOICKE et al.
1986). During this maturation process, vasculo-syncytial configurations are formed
(SCHOON 1989), which may result in a lower resistance index, and consequentially
lead to a reduced incidence of retained fetal membranes.
In a previous study, a good correlation between BFV and birth weight of the calves
was noticed in the last third of pregnancy (HERZOG et al. 2011). In the present
study, however, no correlation between BFV and birth weight, which is probably due
to the fact that there was no increase in uterine blood flow in the last seven days of
gestation. Surprisingly, a positive correlation was detected between RI and birth
weight in the last days before parturition. In contrast, studies in women found a high
negative relationship between resistance index in the uterine arteries and birth weight
of babies during the first trimester and during 19 to 23 weeks of pregnancy,
respectively (HOLLIS et al. 2003; BROWNE et al. 2011). This finding may be
associated with the size of the uterus in the last stage of pregnancy; a heavier and
therefore larger calf may lead to stretching of uterine vessels and thus create a
higher resistance to blood flow.
In the present study, progesterone levels in group PIP declined during the
glucocorticoid treatment by 59 % until parturition. The fact, that progesterone
concentrations between Days -7 and -1 were higher in PIP than in SPON and SIP
could not be clarified. A possible explanation might be the high inter-individual
variability between animals. Nevertheless, the relative changes in this time interval
did not differ between groups. During the normal cascade of parturition, two distinct
54
CHAPTER 2
phases of a decrease in plasma P4 concentrations could be observed. The first
gradual and continuous decrease was seen during the last 60 days of parturition and
was due to the utilization of P4 in the fetal-placental unit, most likely due to the
conversion of progesterone to estrogens, which is catalyzed by the inducible enzyme
17α-hydroxylase. This gradual decrease was followed by a second phase with a
more abrupt decline of P4 occurring 24 to 48 hours prior to parturition (EDQVIST et
al. 1978). Dexamethasone treatment during protracted induction of parturition
probably induces 17α-hydroxylase, initiating the processes that lead to normal
placental maturation and parturition (KINDAHL et al. 2004).
Total estrogen concentrations in group SPON increased by 60 % between Days -7
and -1. Physiologically, estrogen concentrations in the maternal peripheral circulation
start to increase in the last few days before parturition and decline rapidly to zero
level post partum (KINDAHL et al. 2004). Total estrogens in group PIP increased by
283 % between Days -7 and -1, whereas Etot in group SIP increased by 140 % within
one day (Day -2 to -1). It was noticed that estrogens play an important role in the
maturation of placentomes (GRUNERT et al. 1989; ZHANG et al. 1999; WISCHRAL
et al. 2001; KINDAHL et al. 2004). In agreement with previous studies we found that
estrogen concentrations were lower in RET compared to REL cows (ZHANG et al.
1999; WISCHRAL et al. 2001).
Plasma cortisol concentrations showed a high variability in group SPON and SIP,
which may be due to handling stress, since cortisol is recognized as a stress
hormone (KINDAHL et al. 2004). In group PIP plasma cortisol concentrations
decreased after the first application of dexamethasone and remained on a low level
during dexamethasone treatment. This phenomenon is based on the negative
feedback on hypothalamo-pituitary-adrenal function (KAPOOR et al. 2006).
Moreover, maternal exposure to exogenous glucocorticoids can lead to permanent
modification of fetal hypothalamo-pituitary-adrenal function (KAPOOR et al. 2006).
Other studies have shown that the exogenous administration of glucocorticoids has
been associated with increased susceptibility to infectious diseases in cattle (ROTH
55
CHAPTER 2
and KAEBERLE 1982; BURTON and ERSKINE 2003). However, the immunosuppressive effect is dependent upon the dose of dexamethasone administered.
Thus, the authors found little variations in haematological parameters when a dose of
0.3 mg/kg for three days was applied (PRUETT et al. 1987). In the present study
0.004 mg/kg over six days followed by a single dose of 0.07 mg/g was given. Further
investigations are necessary to evaluate the effects of a protracted administration of
glucocorticoids on the immune system and on the hypothalamo-pituitary-adrenal
function in cattle.
In conclusion, a protracted induction of parturition with the use of repeated
treatments with low doses of short-acting corticosteroids for six days followed by one
single treatment with a high dose of this hormone will result in higher estrogen levels
before term, but does not affect uterine blood flow and the incidence of retained
placentas.
56
CHAPTER 2
5.6 Figures and Tables
Table 1. Blood flow volume (BFV in L/min) in the uterine arteries ipsi- (i) and
contralateral (c) to the location of the fetus of cows with spontaneous parturition (SPON;
n = 11), as well as short (SIP; n = 10) and protracted induction of parturition (PIP;
n = 11), respectively, on Days -7 to -1 (Day 0 = parturition). Values are means ± SD.
Group Side
Day
-7
-5
-4
-3
-2
-1
Mean
i
9.72 ± 10.62 ±
3.36
4.00
9.77 ± 10.15 ± 10.33 ± 10.57 ± 10.63 ± 10.30 ±
2.90
3.00
3.73
4.16
4.07
3.52
c
5.74 ±
2.60
4.64 ±
0.76
4.77 ±
1.78
i
9.83 ±
2.90
9.74 ±
2.55
9.64 ± 10.35 ± 10.19 ± 10.49 ± 10.30 ± 10.07 ±
2.41
2.97
2.44
2.17
2.67
2.50
c
3.54 ±
1.44
3.59 ±
1.31
3.79 ±
1.19
SPON
SIP
i
PIP
c
5.05 ±
2.97
4.00 ±
2.06
5.07 ±
2.20
3.72 ±
1.12
5.26 ±
3.10
3.69 ±
1.43
4.50 ±
2.71
3.90 ±
1.22
4.99 ±
2.38
3.74 ±
1.38
12.89 ± 12.84 ± 13.72 ± 12.42 ± 12.86 ± 12.85 ± 13.02 ± 12.92 ±
2.89
3.45
4.78
3.44
4.25
4.41
3.94
4.83
2.88 ±
2.22
2.58 ±
1.83
2.67 ±
1.78
2.78 ±
1.47
2.69 ±
1.67
2.66 ±
1.63
2.96 ±
1.94
2.74 ±
1.71
i
10.78 ± 11.04 ± 11.09 ± 11.05 ± 11.13 ± 11.35 ± 11.36 ± 11.12 ±
3.26
3.76
3.73
3.93
3.60
3.95
3.42
3.38
c
3.95 ±
2.30
i/c
14.72 ± 14.46 ± 14.73 ± 14.91 ± 14.91 ± 15.36 ± 15.15 ± 14.90 ±
3.87
4.13
4.61
3.80
3.80
3.26
3.74
3.28
Mean
Sum
-6
3.52 ±
1.58
3.67 ±
1.73
3.87 ±
3.32
57
3.78 ±
1.91
3.78 ±
2.31
3.78 ±
2.13
3.77 ±
2.04
CHAPTER 2
Table 2. Resistance index (RI) of the uterine arteries ipsi- (i) and contralateral (c) to the
location of the fetus of cows with spontaneous parturition (SPON; n = 11), as well as
short (SIP; n = 10) and protracted induction of parturition (PIP; n = 11), respectively, on
Days -7 to -1 (Day 0 = parturition). Values are means ± SD.
Group Side
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
Mean
i
0.45 ±
0.04
0.44 ±
0.08
0.46 ±
0.03
0.43 ±
0.06
0.44 ±
0.05
0.43 ±
0.05
0.44 ±
0.06
0.44 ±
0.05
c
0.46 ±
0.06
0.51 ±
0.07
0.48 ±
0.03
0.47 ±
0.06
0.50 ±
0.05
0.50 ±
0.06
0.52 ±
0.09
0.49 ±
0.07
i
0.46 ±
0.06
0.45 ±
0.07
0.46 ±
0.06
0.46 ±
0.04
0.45 ±
0.05
0.43 ±
0.07
0.41 ±
0.07
0.45 ±
0.06
c
0.51 ±
0.09
0.52 ±
0.08
0.50 ±
0.08
0.50 ±
0.04
0.49 ±
0.05
0.49 ±
0.07
0.45 ±
0.05
0.49 ±
0.07
i
0.49 ±
0.05
0.47 ±
0.04
0.50 ±
0.04
0.45 ±
0.06
0.48 ±
0.04
0.47 ±
0.07
0.45 ±
0.05
0.47 ±
0.05
c
0.58 ±
0.14
0.58 ±
0.10
0.59 ±
0.09
0.61 ±
0.11
0.63 ±
0.11
0.59 ±
0.10
0.60 ±
0.07
0.60 ±
0.10
i
0.47 ±
0.05
0.45 ±
0.07
0.47 ±
0.05
0.45 ±
0.06
0.45 ±
0.05
0.44 ±
0.07
0.43 ±
0.06
0.45 ±
0.06
c
0.52 ±
0.11
0.53 ±
0.09
0.53 ±
0.09
0.53 ±
0.10
0.54 ±
0.10
0.53 ±
0.09
0.53 ±
0.09
0.53 ±
0.09
i/c
0.49 ±
0.09
0.49 ±
0.09
0.50 ±
0.07
0.49 ±
0.09
0.50 ±
0.09
0.49 ±
0.09
0.48 ±
0.09
0.49 ±
0.09
SPON
SIP
PIP
Mean
Mean
Day
58
CHAPTER 2
Table 3. Blood flow volume (BFV) and resistance index (RI) of the uterine arteries ipsi(i) and contralateral (c) to the location of the fetus during the last 7 d before parturition
of cows with released (REL, n = 19) and retained placentae (RET, n = 14), respectively.
On Days -7 to -1 (Day 0 = parturition). Values with different small (a,b) and capital (A,B)
letters differ (P < 0.05) and are means ± SD.
Para- Plameter centa
Day
Side
-6
-5
-4
-3
-2
-1
Mean
REL
i/c
14.72
± 4.39
14.62 14.68 ± 14.77 15.36 15.90
± 3.62
3.32 ± 3.09 ± 3.22 ± 4.41
14.75
± 4.78
14.99 ±
3.81
RET
i/c
14.73
± 3.31
14.25
± 4.17
14.78 15.10 14.37 14.66
± 3.34 ± 4.58 ± 3.41 ± 3.78
15.76
± 4.51
14.79 ±
3.80
REL
i
REL
c
RET
i
RET
c
0.46 a 0.44 a 0.44 a
± 0.05 ± 0.05 ± 0.04
0.50 A 0.51 A 0.52 ±
± 0.08 ± 0.08 0.09
0.49 b 0.46 b 0.47 b
± 0.04 ± 0.06 ± 0.05
0.56 B 0.56 B 0.56 ±
± 0.08 ± 0.11 0.11
0.44 ±
0.05
0.52 ±
0.10
0.43 ±
0.07
0.54 ±
0.10
0.44 ±
0.05
0.51 ±
0.08
0.47 ±
0.06
0.56 ±
0.10
RI
RI
BFV [L/min]
-7
0.45 a
± 0.06
0.47 A
± 0.09
0.50 b
± 0.04
0.44 a
± 0.07
0.49 A
± 0.07
0.47 b
± 0.06
B
0.58 B
0.58
<± 0.11 ± 0.08
59
0.44 ±
0.05
0.51 ±
0.07
0.45 ±
0.08
0.56 ±
0.10
CHAPTER 2
Days of pregnancy
SPON
268
269
270
271
272
273
274
275
276
277 ...
parturition
277 - 289
40 mg dexamethasone
SIP
268
269
270
271
272
273
274
parturition
276 - 277
1.3mg
mgdexamethasone
dexamethasone twice
daily
1.3
twice
daily
PIP
268
269
270
271
272
273
40 mg
274
parturition
275
Figure 4. Treatment schedule of cows with spontaneous parturition (SPON, n = 11),
as well as short (SIP, n = 10) and protracted (PIP, n = 13) induction of parturition.
60
CHAPTER 2
Figure 5. Doppler flow mapping of blood flow in the uterine artery ipsilateral to the
conceptus in a cow of group PIP on Day 272 of pregnancy; left: spectral Mode
showing pulse waves; right: blood flow shown in colour Mode.
61
CHAPTER 2
24
sum of BFV (L/min)
22
20
18
SPON (n=11)
SIP (n=10)
16
PIP (n=13)
14
12
10
8
0
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
54
Birth weight (kg)
Figure 6 a: Relationship between birth weight of calves (n = 24) and BFV (L/min) of
uterine blood flow in 24 cows with spontaneous parturition (SPON), short (SIP) and
protracted (PIP) induction of parturition. The sum of BFV values of the uterine
arteries ipsi- and contralateral to the conceptus are used.
62
CHAPTER 2
,63
,6
,57
SPON (n=11)
mean RI
,55
SIP (n=10)
,52
PIP (n=13)
,5
,47
,45
,43
,4
,38
0
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
54
Birth weight (kg)
Figure 6 b: Relationship between birth weight of calves (n = 24) and RI of uterine blood
flow in 24 cows with spontaneous parturition (SPON), short (SIP) and protracted (PIP)
induction of parturition. Mean RI values of the uterine arteries ipsi- and contralateral to
the conceptus are used.
63
CHAPTER 2
9
Progesterone (ng/mL)
8
7
6
SPON (n=11)
SIP (n=10)
PIP (n=13)
5
4
3
2
1
0
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
Days ante partum
Figure 7. Plasma progesterone concentrations in cows with spontaneous parturition
(SPON), as well as short (SIP) and protracted (PIP) induction of parturition. Between
Days -7 and -1, P4 concentrations were higher (P < 0.05) in PIP than in SPON and
SIP.
64
CHAPTER 2
25
*
Total estrogens
estrogen (ng/mL)
*
20
*
#
15
SPON (n=11)
#
SIP (n=10)
#
PIP (n=13)
10
5
0
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
Days ante partum
Figure 8. Plasma concentrations of total estrogens in cows with spontaneous
parturition (SPON), as well as short (SIP) and protracted (PIP) induction of
parturition.
* Difference between group PIP (P < 0.05) and SPON (Day -1) and SIP (Day -3 to -1)
on the day indicated.
#
Difference between group SPON (P < 0.05) and SIP on the day indicated.
65
CHAPTER 2
20
Cortisol (ng/L)
16
12
SPON (n=11)
SIP (n=10)
8
PIP (n=13)
*
4
*
*
*
*
*
#
0
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-6
-5
-4
-3
-2
-1
Days ante partum
Figure 9. Plasma cortisol concentrations in cows with spontaneous parturition (SPON),
as well as short (SIP) and protracted (PIP) induction of parturition.
* Difference between group PIP (P < 0.05) compared with SPON (Day -6 to -1) and
SIP (Day -6 to -2) on the day indicated.
#
Difference between group SIP (P < 0.05) and SPON on the day indicated.
66
DISKUSSION
6. Übergreifende Diskussion
Eine vorzeitige medikamentelle Geburtseinleitung beim Rind ist mit einer hohen
Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen verbunden (BEARDSLEY et al. 1974; WELCH
et al. 1977; WILHELM 1989; SCHULZ 1990). Die wirtschaftlichen Verluste durch eine
reduzierte Milchleistung und Fertilitätseinbußen belaufen sich dabei auf mehrere
hundert Euro pro Tier (ESSLEMONT and PEELER 1993). Aus diesem Grund hatten
zahlreiche Studien in den letzten Jahrzehnten zum Ziel, durch verschiedene
medikamentelle Einleitungsmethoden die physiologischen Bedingungen der Geburt
zu imitieren und damit den Abgang der Nachgeburt zu beeinflussen. Am
erfolgversprechendsten hat sich dabei die Gabe von Glukokortikoiden über einen
längeren Zeitraum erwiesen (WELCH et al. 1973; WELCH et al. 1977; BO et al.
1992). In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden daher eine konventionelle und
eine protrahierte Geburtseinleitung bei der Kuh im Hinblick auf die Plazentareifung
und die Nachgeburtsverhaltung untersucht.
In der vorliegenden Studie entwickelten 54 % der Tiere mit einer protrahierten
Geburtseinleitung eine Retenio secundinarum verglichen mit 70 % der Tiere, die
konventionell mit einer einmaligen hohen Dosis Dexamethason eingeleitet wurden.
Obgleich bei numerischer Betrachtung die Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen bei
Tieren mit protrahierter Geburtseinleitung niedriger zu sein scheint, sind die
Unterschiede nicht signifikant verschieden. Grund hierfür könnte der nah am Ende
der physiologischen Tragezeit gewählte Zeitpunkt der Geburtseinleitung sein, so
dass der physiologische Reifungsprozess der Plazenta auch bei konventionell
eingeleiteten Tieren bereits eingesetzt hat.
Im letzten Trächtigkeitsstadium kommt es beim Rind zu einer Reifung der Plazenta,
die zur Auflösung der feto-maternalen Kontaktzone und damit zur Lösung der fetalen
Membranen post partum führt (BJORKMAN and SOLLEN 1960; WOICKE et al.
1986). Der Ausprägungsgrad der plazentaren Reifungsprozesse wurde in der
vorliegenden
Arbeit
anhand
von
histologischen
67
und
immunhistologischen
DISKUSSION
Untersuchungen beurteilt. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Großteil der Tiere
aus der Gruppe SPON eine reife Plazenta aufwies. Die Mehrzahl der Kühe aus der
SIP Gruppe zeigte dagegen eine unreife Plazenta mit einer nahezu intakten fetomaternalen Verbindung. Diese Beobachtungen stimmten weitgehend mit dem
Auftreten von Nachgeburtsverhaltungen der Tiere überein. Die Gruppe PIP zeigte
sowohl reife als auch unreife Plazenten und mehrfach konnten in einem Plazentom
sowohl reife als auch unreife Areale nebeneinander dargestellt werden.
Für das Ausbleiben der plazentaren Reifungsvorgänge ante partum und der damit
verbundenen Entstehung einer Nachgeburtsverhaltung wird ein multifaktorielles
Geschehen vermutet, das neben den morphologischen Veränderungen, endokrinologische und funktionelle Prozesse mit einschließt. Vor allem der peripartale Östrogenanstieg scheint für die zellulären Umbauprozesse von entscheidender Bedeutung
zu sein (GRUNERT et al. 1989; ZHANG et al. 1999; WISCHRAL et al. 2001;
KINDAHL et al. 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die
Östrogenkonzentration in der Gruppe PIP während der sechstägigen Glukokortikoidgabe deutlich ansteigt. In der SIP Gruppe dagegen war der Östrogenanstieg erst nach der einmalig hohen Dexamethasongabe zu beobachten. Dieser
kurze Zeitraum zwischen konventioneller Einleitung und Geburt ist jedoch für eine
Ausreifung der Plazenta zu kurz (WOICKE et al. 1986). Dies bestätigen auch andere
Studien, die zeigten, dass die Östrogenkonzentration bei Kühen mit Nachgeburtsverhaltung niedriger ist als bei Kühen mit zeitgerechtem Nachgeburtsabgang
(ZHANG et al. 1999; WISCHRAL et al. 2001).
Ein bislang nur wenig untersuchter funktioneller Aspekt der Plazentareifung ist die
Veränderung des Blutdruckes im Bereich der Chorionzotten. So führen die
Kontraktilität des Uterus und die Austreibung der Frucht zu alternierenden
hyperämischen und ischämischen Bedingungen in den Chorionzotten (GRUNERT
1986) und beeinflussen damit die plazentare feto-maternale Verbindung und somit
den Abgang der Nachgeburt (LAVEN and PETERS 1996). Aus diesem Grund wurde
in der vorliegenden Dissertation erstmals mittels Immunhistologie die Präsenz von
Vasodilatatoren und -konstriktoren in der bovinen Plazenta untersucht. Zusätzlich
wurde täglich der uterine Blutfluss mittels transrektaler Dopplersonographie in den
68
DISKUSSION
letzten sieben Tagen vor der Geburt gemessen. Die Vasodilatatoren iNOS und
eNOS konnten in allen plazentären Gewebsproben nachgewiesen werden. Dabei
wurden keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen oder zwischen RET und
REL Kühen festgestellt. Überraschend war der Befund, dass iNOS und eNOS anders
als bei Schafen in der vorliegenden Arbeit nur im Choriongewebe nachzuweisen
waren. Bei Schafen sind diese sowohl im fetalen als auch im maternalen Gewebe
lokalisiert (ZHENG et al. 2000). Dies lässt vermuten, dass der fetale Anteil in der
Plazenta
eine
aktivere
Rolle
bei
der
Vasodilatation
und
damit
dem
Blutdruckgeschehen einnimmt, als bislang angenommen. Der Vasokonstriktor ET-1
konnte sowohl im fetalen als auch im maternalen Plazentagewebe nachgewiesen
werden. Auch hier waren keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen und
zwischen REL und RET Kühen nachzuweisen. Jedoch war ein signifikanter
Unterschied zwischen RET und REL Kühen im RI zu finden. So hatten Tiere mit
Nachgeburtsverhaltung in den letzten Tagen vor der Geburt einen deutlich höheren
RI als Tiere mit physiologischem Abgang der Secundinae. Grund hierfür könnten die
interepitelialen Änderungen der fetalen Kapillaren sein, welche sich mit zunehmender
Reduktion des maternalen Epithels der Placenta maternalis annähern und dadurch
vaskulo-synzytiale Konfigurationen bilden (SCHOON 1989). Ein Ausbleiben der
plazentaren Reifungsvorgänge hat möglicherweise bei Kühen, die von einer Retentio
secundinarum betroffen waren, zu einem höheren Blutflusswiderstand geführt als bei
Tieren mit physiologischem Abgang der Secundinae.
Frühere Studien an Schafen haben ergeben, dass wiederholte Gaben von
Glukokortikoiden den uterinen und umbilikalen Blutfluss direkt beeinflussen können
(BURD et al. 1976; JENSEN et al. 2005). In der vorliegen Arbeit konnten in den
letzten sieben Tage vor der Geburt jedoch keine Veränderungen des Blutflussvolumens innerhalb und zwischen den Tieren der verschiedenen Gruppen
festgestellt werden. Dieses Ergebnis deckt sich mit einer früheren Studie, die bereits
ab dem 225. Tag der Gravidität keine signifikante Erhöhung des Blutflusses in den
uterinen Arterien mehr nachweisen konnte (NISHIDA et al. 2006). Andere Studien
sprechen jedoch von einem kontinuierlichen Anstieg des uterinen Blutflusses
während der gesamten Gravidität (FERRELL 1991; REYNOLDS and REDMER
69
DISKUSSION
1995; PANARACE et al. 2006) und von einer deutlichen Erhöhung im letzten
Trächtigkeitsdrittel (PANARACE et al. 2006).
Eine protrahierte Geburtseinleitung mit wiederholten Gaben kurz wirksamer
Kortikosteroide über sechs Tage als Prämedikation einer konventionellen Einleitung
führt somit zu einem verbessertem Östrogenanstieg und dadurch zu einer
verbesserten Plazentareifung, was sich jedoch nicht anhand einer reduzierten
Inzidenz
an
Nachgeburtsverhaltungen
belegen
ließ.
Aufgrund
des
hohen
Arbeitsaufwandes wird diese Einleitungsmethode zudem auf Einzeltiere beschränkt
bleiben, sollte jedoch bei geplanten Einleitungen auch im Hinblick auf die verbesserte
Lungenreifung des Kalbes (ZERBE 2008) immer der konventionellen Geburtseinleitung vorgezogen werden.
Schlussfolgerungen
In den vorliegenden Studien konnte gezeigt werden, dass eine protrahierte
Geburtseinleitung bei der Kuh die Reifung der Plazenta stimuliert. So steigt durch
eine mehrtägige, niedrig dosierte Gabe von Glukokortikoiden vor der eigentlichen
konventionellen Geburtseinleitung die Östrogenkonzentration deutlich an und
stimuliert somit die morphologischen Umbauprozesse in der Plazenta. Die funktionelle Plazentareifung spiegelt sich aber nicht am uterinen Blutfluss wieder. Folglich
eignet sich die transrektale Doppler-Sonographie der Arteria uterina nicht als
Untersuchungsmethode zur Beurteilung der mittels Glucuorticoiden induzierten
Plazentareifung beim Rind. Jedoch scheint letztgenannte Methode Störungen in der
Plazentareifung, die zu einer Retentio secundinarum führen, bereits präpartal
anzuzeigen.
70
ZUSAMMENFASSUNG
7. Zusammenfassung
Desiree Hartmann (2011)
Einfluss einer protrahierten Geburtseinleitung beim Rind auf die
Plazentareifung, den uterinen Blutfluss sowie Steroidhormone im Blutplasma
Ziel der Dissertation war es, die Auswirkungen einer protrahierten und einer
konventionellen Geburtseinleitung bei der Kuh in Bezug auf das Vorkommen von
Nachgeburtsverhaltungen zu vergleichen. Dabei wurden an postpartal gewonnenen
Plazentomen vergleichende histologische und immunhistologische Untersuchungen
hinsichtlich der Merkmale der Plazentareifung durchgeführt. Weiterhin wurden die
Änderungen in der Steroidhormonkonzentration bei Anwendung verschiedener
Methoden zur Geburtseinleitung untersucht. Ferner wurde zusätzlich die transrektale
Dopplersonographie der Arteriae uterinae daraufhin überprüft, ob sie sich als nichtinvasive Methode zur Beurteilung der Plazentareife eignet.
Dreizehn Kühe erhielten eine protrahierte Geburtseinleitung (PIP), indem ihnen
zwischen dem 268. und 273. Tag der Gravidität zweimal täglich 1,3 mg Dexamethason i.m. verabreicht wurden. Am 274. Tag der Gravidität wurde abschließend eine
hohe Dosis von 40 mg Dexamethason i.m. injiziert. Für eine konventionelle Geburtseinleitung (SIP) erhielten 10 Kühe einmalig 40 mg Dexamethason i.m. am Tag 274
der Gravidität. Eine dritte Gruppe (SPON, n = 11) diente als unbehandelte Kontrollgruppe.
Die Inzidenz von Nachgeburtsverhaltungen unterschied sich nicht (P > 0.05)
zwischen den Gruppen PIP (54 %) und SIP (70 %). Kühe der Gruppe SPON lagen
mit einer Inzidenz von 9 % Nachgeburtsverhaltungen im erwarteten Bereich und
damit deutlich niedriger (P < 0,05) als die Gruppen PIP und SIP. Die Gruppe SPON
hatte eine durchschnittliche Tragezeit von 282 ± 4,1 Tagen (278 bis 289 Tage, n =
71
ZUSAMMENFASSUNG
11). In der Gruppe SIP kalbten acht Tiere am Tag 276 und zwei an Tag 277 der
Gravidität (30 bis 70 Stunden nach Applikation von 40 mg Dexamethason). Neun
Tiere aus der Gruppe PIP kamen zwischen 24 und 36 Stunden nach der letzten
Applikation von 40 mg Dexamethason an Tag 275 der Gravidität in Geburt. Drei
Kühe kalbten während der protrahierten Einleitung zwischen Tag 272 und 274 und
ein Tier an Tag 276 der Trächtigkeit. Alle Tiere der Gruppe PIP, welche am Tag 275
der Gravidität kalbten, kamen tagsüber zwischen 6 und 20 Uhr in die Geburt. Im
Gegensatz dazu kamen neun Tiere aus der Gruppe SPON und SIP tagsüber (6 bis
20 Uhr) und 12 Tiere während der Nacht (20 bis 6 Uhr) zum Kalben.
In der ersten Studie zeigten die Färbungen mit Masson Trichrom und Pan-Zytokeratin einen höheren Grad an reduzierten und abgeflachten Arealen im maternalen
Kryptenepithel bei Tieren mit (REL) im Vergleich zu Tieren ohne Nachgeburtsabgang
(RET) innerhalb von 12 Stunden post partum. Eine immunhistologische Färbung mit
Caspase-3 bestätigte die Vermutung von mehr apoptotischen Zellen in der Gruppe
SPON und PIP, verglichen mit Tieren der Gruppe SIP. Um die Hypothese einer
„funktionellen“ Plazentareifung zu verifizieren, wurden die endotheliale (eNOS) und
die induzierte (iNOS) Nitritoxid-Synthase, beides potente Vasodilatatoren, auf ihr
Vorkommen in der bovinen Plazenta untersucht. Sowohl eNOS als auch iNOS
konnten ausschließlich im Choriongewebe, nicht jedoch im maternalen Gewebe,
nachgewiesen werden. Endothelin-1 (ET-1), als Vasokonstriktor, war dagegen
sowohl im Choriongewebe, als auch im maternalen Kryptenepithel nachzuweisen.
Keine Unterschiede waren in den Lokalisationen von NOS und ET-1 zwischen den
Gruppen SPON, SIP und PIP noch zwischen den Gruppen RET und REL
festzustellen.
Ferner wurde das Hormonprofil von in den letzten sieben Tag vor der Geburt gewonnenen Blutproben bestimmt. In der Gruppe SPON fiel die Konzentration von
Progesteron (P4) zwischen den Tag -7 und -1 vor der Geburt um 46 % (P < 0,05). In
der Gruppe SIP sank diese nur um 20 %, während bei den PIP Tieren eine Abnahme
von P4 von 59 % zu verzeichnen war (P < 0,05). Der Östrogen-Level in der Gruppe
72
ZUSAMMENFASSUNG
PIP stieg während der kontinuierlichen Glukokortikoidgabe deutlich um 283 % an
(P < 0,05), während er bei den SIP Tieren in den letzten sieben Tagen vor der
Geburtseinleitung konstant
blieb
(P > 0,05) und
sich erst mit der hohen
Einleitungsdosis sprunghaft innerhalb eines Tages um 140 % erhöhte (P < 0,05). Die
Plasma Kortisolkonzentration fiel in der Gruppe PIP während der niedrig dosierten
Dexamethason Applikation um 21 % ab und war geringer (P < 0,05) als bei den
SPON und SIP Kühen. Die beiden letztgenannten Tiergruppen zeigten eine hohe
Variabilität im Kortisolspiegel.
Der uterine Blutfluss, beurteilt anhand des Blutflussvolumens (BFV) und des
Resistance Index (RI), änderte sich in den letzten sieben Tagen vor der Geburt bei
keiner der drei Tiergruppen (P > 0,05) und differierte auch nicht zwischen den
Gruppen (P > 0,05). Der RI-Wert war jedoch bei den RET-Kühen höher (P < 0,001)
als bei den REL Kühen.
Die Ergebnisse beider Studien zeigen, dass eine protrahierte Geburtseinleitung mit
wiederholten, niedrig dosierten Glucocorticoidgaben zu einem erhöhten Östrogenspiegel und damit zu einer Stimulation der Plazentareifung führt. Kein signifikanter
Unterschied konnte in der Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen zwischen
protrahierter und konventioneller Geburtseinleitung festgestellt werden. Die Durchblutung der Aa. uterinae änderte sich in den letzten sieben Tagen vor der Geburt
nicht. Somit eignet sich die transrektale Dopplersonographie dieser Gefäße nicht, um
glucocorticoidbedingte Änderungen in der Plazentareife zu erfassen. Es sind jedoch
bereits präpartal Unterschiede im uterinen Blutflusswiderstand in Abhängigkeit vom
zeitgerechten Abgang der Nachgeburt post partum festzustellen.
73
SUMMARY
8. Summary
Desiree Hartmann (2011)
Effects of a protracted induction of parturition on placental maturation, uterine
blood flow and plasma steroid hormones in cattle
The objectives of this study were to compare the effects of a protracted and a
conventional induction of parturition on the incidence of retained fetal memebranes in
cattle. For comparison of placental maturation between experimental groups,
histological and immunohistochemical studies on placentomes obtained after
parturition were performed. Furthermore, analysis of steroid hormone levels prior to
parturition were carried out to compare the hormone profiles among the groups.
Another aim of the present study was to test the usefulness of transrectal Doppler
sonography of the Arteriae uterinae as a non-invasive method for the evaluation of
placental maturation.
Protracted induction of labor (PIP) was precipitated in 13 cows by administration of
1.3 mg dexamethasone i.m. twice daily between Days 268 and 273 of gestation, and
40 mg dexamethasone i.m. on Day 274 of gestation. For conventional induction of
labor (SIP), 10 cows received 40 mg dexamethasone on Day 274 of gestation. A
third group (SPON, n=11) served as a non treated control group.
There was no difference (P > 0.05) in incidence of retained placenta between groups
PIP (54%) and SIP (70%). As expected 9 % of cows of group SPON showed a
retained placenta, distinctly lower (P < 0.05) compared to groups PIP and SIP.
Gestation length of cows of group SPON was 282 ± 4.1 days (range 278 to 289 days,
n = 11). In group SIP eight cows gave birth on Day 276 and two cows on Day 277 (30
to 70 hours after the injection of 40 mg dexamethasone). Nine cows of group PIP
calved between 24 and 36 hours after the last injection of 40 mg dexamethasone on
74
SUMMARY
Day 275, three cows between Day 272 and 274 and one cow on Day 276. All cows of
group PIP, which calved on Day 275, gave birth during daytime between 6 a.m. and
8 p.m., whereas nine cows of group SIP and SPON calved during daytime (n = 9, 6
a.m. to 8 p.m.) and 12 cows during nighttime (n = 12, 8 p.m. to 6 a.m.).
In the first study, staining with Masson-trichrome and pan-cytokeratin indicated a
higher degree of atrophy and flatness of the maternal crypt epithelium in cows
without retained placenta (REL) compared to cows with retained placentae (RET).
After staining with anti-caspase-3 ratified more apoptotic cells were detected in the
SPON and PIP group compared with group SIP. To test the hypothesis of a
‘functional’ placenta maturation, the expression of the potent vasodilators endothelial
(eNOS) and inducible (iNOS) nitric oxide synthase was evaluated. Both eNOS and
iNOS are only expressed in chorionic tissue. Endothelin-1, one of the main
vasoconstrictors, was detected in maternal crypt epithelium as well as in chorionic
epithelium. No differences were noticed for NOS and ET-1 among the experimental
groups nor between RET and REL cows.
In the second study blood samples for hormone analyses were taken in the last
seven days prior to parturition. Progesterone concentrations (P4) in group SPON
declined between Days -7 and -1 by 46 %, in group SIP by 20 % and in group PIP by
59 % (P < 0.05). The levels of total estrogens raised consistently during
glucocorticoid applications by 283 % in group PIP (P < 0.05), whereas in group SIP
they remained constant (P > 0.05) and increased within one day by 140 % (P < 0.05)
after the high dosage of dexamethasone. In group PIP cortisol concentrations decreased during glucocorticoid applications by 21 % (P < 0.05) and were lower
(P < 0.05) compared to groups SPON and SIP. Cortisol concentrations in group
SPON and SIP showed a high variabilitiy.
Examinations of uterine perfusion in the last seven days prior to parturition by using
transrectal Doppler sonography showed no differences (P > 0.05) in uterine blood
flow voume (BFV) and resistance index (RI) between the three groups. Furthermore,
75
SUMMARY
BFV did not differ (P > 0.05) between RET and REL cows. However, RI was higher
(P < 0.05) in RET compared to REL cows.
Results of both studies indicate that a protracted induction of parturition by using
repeated slow doses of glucocorticoids induces higher estrogen levels before term
and consequently stimulates placental maturation. No differences were found on the
incidence of retained placenta between a protracted and a conventional induction of
parturition. Blood flow in the main uterine arteries remains constant in the last seven
days of pregnancy. Therefore, alterations in placental maturation induced by
glucocorticoids cannot be detected by transrectal Doppler sonography of these
vessels. However, already before parturition differences in uterine blood flow
resistance can be observed depending on the release of the fetal membranes in due
time after parturition.
76
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84
ANHANG
10. Abbildungsverzeichnis
Figure 1:
Illustration of mature (REL) and immature (RET) bovine
placentomes……………………………………………………………….38
Figure 2:
Formation of nitric oxide synthase (NOS) and Endothelin-1
(ET-1) in bovine placentomes……………………………………………39
Figure 3:
Classification of placental formation between the experimental
groups: control (SPON, n = 8), conventional induction of
parturition (SIP, n = 8) and protracted induction of parturition
(PIP, n = 10)……………………………………………………………….40
Figure 4:
Treatment schedule of cows with spontaneous parturition
(SPON, n = 11), as well as short (SIP, n = 10) and protracted
(PIP, n = 13) induction of parturition…………………………………….58
Figure 5:
Doppler flow mapping of blood flow in the uterine artery
ipsilateral to the conceptus on Day 272 of pregnancy………………..59
Figure 6a:
Relationship between birth weight of calves (n = 24) and BFV
(L/min) of uterine blood flow in 24 cows………………………………..60
Figure 6b:
Relationship between birth weight of calves (n = 24) and RI
of uterine blood flow in 24 cows…………………………………………61
Figure 7:
Plasma progesterone concentrations in cows with
spontaneous parturition (SPON, n = 11), as well as short
(SIP, n = 10) and protracted (PIP, n = 13) induction of parturition…..62
85
ANHANG
Figure 8:
Plasma concentrations of total estrogen in cows with
spontaneous parturition (SPON, n = 10) as well as short
(SIP, n = 10) and protracted (PIP, n = 13) induction of parturition…..63
Figure 9:
Plasma cortisol concentrations in cows with spontaneous
parturition (SPON, n = 11), as well as short (SIP, n = 10) and
protracted (PIP, n = 13) induction of parturition………………………..64
86
ANHANG
11. Tabellenverzeichnis
Table 1:
Blood flow volume (BFV) in the uterine arteries ipsi- (i) and
contralateral (c) to the location of the fetus of cows with
spontaneous parturition (SPON; n = 11), as well as short
(SIP; n = 10) and protracted induction of parturition (PIP; n = 11),
respectively, on Days -7 to -1 (Day 0 =
parturition).………………………………………………………………..55
Table 2:
Resistance index (RI) of the uterine arteries ipsi- (i) and
contralateral (c) to the location of the fetus (means ± SD) of
cows with spontaneous parturition (SPON; n = 11), as well as
short (SIP; n = 10) and protracted induction of parturition
(PIP; n = 11), respectively………………………………………………56
Table 3:
Blood flow volume (BFV; sums ± SD) and resistance index
(RI; means ± SD) of the uterine arteries ipsi- (i) and
contralateral (c) to the location of the fetus during the last 7 d
before parturition of cows with released (REL, n = 19) and
retained placentae (RET, n = 14),
respectively……………………….......................................................57
87
ANHANG
12. Histologische und Immunhistochemische Färbungen
Anhang 1: Trichrom - Färbung nach Masson-Goldner
1.
Entparaffinisierung mit 2 x 10 Min. Xylol und je 2 min. Isopropanol, 96 %
Alkohol, 80 % Alkohol und 70 % Alkohol.
2.
Spülen mit Aqua dest.
3.
Färbung mit 8 min. filtriertem Hämalaun nach DELAFIELD.
4.
Kurz tauchen in 0,1 % HCl in Aqua dest.
5.
15 min. unter fließendem Leitungswasser spülen.
6.
5 min. Säurefuchsin-Ponceau (0,2 g Ponceau de Xyline + 0,1 g
Säurefuchsin + 300 mL Aqua dest. + 0,6 mL Eisessig),
7.
5 min. 0,1 % Essigsäure und
8.
10 min. Phosphorwolframsäure-Orange G (10 g Phosphorwolframsäure +
5 g Orange G + 250 mL Aqua dest.).
9.
5 min. 1 % Essigsäure.
10.
5 min. Lichtgrün (0,5 g Lichtgrün + 250 mL Aqua dest. + 0,5 mL Eisessig).
11.
5 min. 0,1 % Essigsäure.
12.
Entwässerung mit je 3 min. 80 % Alkohol, 96 % Alkohol, Isopropanol und 2
x 5 min. Xylol.
13.
Eindecken mit Eukitt ohne vorheriges Abtrocken direkt aus dem Xylol
88
ANHANG
Anhang 2: Immunhistochemische Färbung mit Pan-Cytokeratin
Antikörper:
Pan-Cytokeratin Antikörper CK102 mit den Klonen AE1 und AE3 (Bioprime, DNA
Labeling System, Gibco BRL Grand Island, NY, USA)
1. Tag
1.
Entparaffinierung mit 2 x 10 min. Xylol, 3 Min. Isopropanol und 3 min.
absoluter Alkohol.
2.
30 min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 80 % Alkohol (196 mL)
mit H2O2 (4 mL).
3.
3 min. 70 % Alkohol.
4.
3 x 5 min. spülen in PBS.
5.
30 min. Vorbehandlung mit TEC (Tris-EDTA-Citrat-Puffer, pH = 7,8) Puffer
bei 96 - 99 °C.
6.
20
min.
Überschichten
mit
1:5
verdünntem
inaktivierten
Ziegen-
Normalserum in PBS bei Raumtemperatur.
7.
Erstantikörper: 1:100 in PBS mit 1 % bovinem Serumalbumin. Inkubation
über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank.
2. Tag
8.
3 x 5 min. spülen in PBS.
9.
Zweitantikörper: Anti-Kaninchen-IgG (Envision Rabbit), 45 min. bei
Raumtemperatur in Feuchtkammer.
10.
3 x 5 min. Spülen in PBS.
11.
Detektion mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Envision (1 ml DAB-Puffer + 1
Tropfen DAB Chromogen), 5 min.
12.
5 min. spülen in PBS und 10 min. unter fließendem Leitungswasser.
13.
Gegenfärbung: 30 s. in Hämalaun nach DELAFIELD.
14.
15 min. spülen mit fließendem Leitungswasser.
89
ANHANG
15.
Entwässerung mit je 3 min. in 70 % Alkohol, 80 % Alkohol, absolutem
Alkohol und Isopropanol.
16.
2 x 5 min. Xylol und Eindecken mit Eukitt.
Anhang 3: Immunhistochemische Färbung mit Caspase-3
Antikörper:
Polyklonaler Kaninchen - Antikörper gegen ein Peptid des p17 Fragmentes der
humanen Caspase - 3 (Abcam, Cambridge, MA, USA)
1. Tag
1.
Entparaffinierung mit 2 x 10 min. Xylol, 3 min. Isopropanol und 3 min.
absoluter Alkohol.
2.
30 min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 80 % Alkohol (196 mL)
mit H2O2 (4 mL).
3.
3 min. 70 % Alkohol.
4.
3 x 5 min. spülen in PBS.
5.
20
min.
Überschichten
mit
1:5
verdünntem
inaktivierten
Ziegen-
Normalserum in PBS bei Raumtemperatur.
6.
Erstantikörper: 1:50 in PBS mit 1 % bovinem Serumalbumin. Inkubation
über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank.
2. Tag
7.
3 x 5 min. spülen in PBS.
8.
Zweitantikörper: Anti-Kaninchen-IgG (Envision Rabbit), 45 Min. bei
Raumtemperatur in Feuchtkammer.
9.
3 x 5 min. Spülen in PBS.
10.
Detektion mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Envision (1 ml DAB-Puffer + 1
Tropfen DAB Chromogen), 5 min.
11.
5 min. spülen in PBS und 10 min. unter fließendem Leitungswasser.
12.
Gegenfärbung: 30 s. in Hämalaun nach DELAFIELD.
90
ANHANG
13.
15 min. spülen mit fließendem Leitungswasser.
14.
Entwässerung mit je 3 min. in 70 % Alkohol, 80 % Alkohol, absolutem
Alkohol und Isopropanol.
15.
2 x 5 min. Xylol und Eindecken mit Eukitt.
Anhang 4: Immunhistochemische Färbung mit iNOS/eNOS
Antikörper iNOS:
Polyklonaler Kaninchen - Antikörper gegen den N-terminus von iNOS (Millipore,
Billerica, MA, USA).
Antikörper eNOS:
Polyklonaler Kaninchen - Antikörper (Alpha diagnostic, San Antonio, TX, USA) gegen
das bovine eNOS32-P Peptid.
1. Tag
1.
Entparaffinierung mit 2 x 10 min. Xylol, 3 min. Isopropanol und 3 min.
absoluter Alkohol.
2.
30 min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 80 % Alkohol (196 mL)
mit H2O2 (4 mL).
3.
3 min. 70 % Alkohol.
4.
3 x 5 min. spülen in PBS.
5.
30 min. Vorbehandlung mit TEC (Tris-EDTA-Citrat-Puffer, pH = 7,8) Puffer
bei 96 - 99 °C.
6.
20
min.
Überschichten
mit
1:5
verdünntem
inaktivierten
Ziegen-
Normalserum in PBS bei Raumtemperatur.
7.
Erstantikörper iNOS: 1:500 in PBS mit 1 % bovinem Serumalbumin.
Erstantikörper eNOS: 1: 2000 in PBS mit 1 % bovinem Serumalbumin.
Inkubation über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank.
91
ANHANG
2. Tag
8.
3 x 5 min. spülen in PBS.
9.
Zweitantikörper: Anti-Kaninchen-IgG (Envision Rabbit), 45 min. bei
Raumtemperatur in Feuchtkammer.
10.
3 x 5 min. Spülen in PBS.
11.
Detektion mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Envision (1 ml DAB-Puffer + 1
Tropfen DAB Chromogen), 5 min.
12.
5 min. spülen in PBS und 10 min. unter fließendem Leitungswasser.
13.
Gegenfärbung: 30 s. in Hämalaun nach DELAFIELD.
14.
15 min. spülen mit fließendem Leitungswasser.
15.
Entwässerung mit je 3 min. in 70 % Alkohol, 80 % Alkohol, absolutem
Alkohol und Isopropanol.
16.
2 x 5 min. Xylol und Eindecken mit Eukitt.
Anhang 5: Immunhistochemische Färbung mit Endothelin-1
Antikörper:
Polyklonaler
Kaninchen - Antikörper
gegen
das
bovine
ET-1
(Fa.
Biologo,
Kronshagen, Germany).
1. Tag
1.
Entparaffinierung mit 2 x 10 min. Xylol, 3 min. Isopropanol und 3 min.
absoluter Alkohol.
2.
30 min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 80 % Alkohol (196 mL)
mit H2O2 (4 mL).
3.
3 min. 70 % Alkohol.
4.
3 x 5 min. spülen in PBS.
5.
20
min.
Überschichten
mit
1:5
verdünntem
Normalserum in PBS bei Raumtemperatur.
92
inaktivierten
Ziegen-
ANHANG
6.
Erstantikörper: 1:50 in PBS mit 1 % bovinem Serumalbumin. Inkubation
über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank.
2. Tag
7.
3 x 5 min. spülen in PBS.
8.
Zweitantikörper: Anti-Kaninchen-IgG (Envision Rabbit), 45 min. bei
Raumtemperatur in Feuchtkammer.
9.
3 x 5 min. Spülen in PBS.
10.
Detektion mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Envision (1 ml DAB-Puffer + 1
Tropfen DAB Chromogen), 5 min.
11.
5 min. spülen in PBS und 10 min. unter fließendem Leitungswasser.
12.
Gegenfärbung: 30 s. in Hämalaun nach DELAFIELD.
13.
15 min. spülen mit fließendem Leitungswasser.
14.
Entwässerung mit je 3 min. in 70 % Alkohol, 80 % Alkohol, absolutem
Alkohol und Isopropanol.
15.
2 x 5 min. Xylol und Eindecken mit Eukitt.
93
Aus dieser Arbeit sind bisher folgende Veröffentlichungen hervorgegangen:
Vorträge
D. HARTMANN, Ä. HONNENS, C. PFARRER, D. RATH, H. NIEMANN, H.
BOLLWEIN (2010):
Effects of a protracted induction of parturition on placental maturation in cattle.
In: 43. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung, München,
Februar 2010
D. HARTMANN, H. BOLLWEIN, Ä. HONNENS, C. PFARRER, D. RATH, H.
NIEMANN, C. PFARRER (2010):
Effects of a protracted induction of parturition on placental maturation in cattle.
In: XXVIIIth Congress of the European Association of Veterinary Anatomists, Paris,
Juli 2010
94
Danksagung
An erster Stelle möchte ich meinem Doktorvater Herrn Prof. Bollwein für die Vergabe
des Themas und das in mich gesetzte Vertrauen bedanken, aber auch für die Geduld
und den Raum, den er mir bei der Anfertigung dieser Arbeit gelassen hat.
Ein großer Dank geht zudem an Frau Prof. Pfarrer, die spontan und mit großer
Begeisterung in das Thema eingestiegen ist, als es fast schon zu kippen drohte.
Die Versuche zu dieser Arbeit wurden im Rinderstall des Friedrich-Löffler-Institutes in
Mariensee durchgeführt. Ohne den unermüdlichen Einsatz und die Begeisterung der
dortigen Mitarbeiter wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Tee und Kuchen hat
uns Doktoranden so manches Mal den Tag versüßt und werden unvergessliche
Stunden bleiben. Stellvertretend für alle möchte ich hier besonders Hans-Georg
Sander, Rolf Poppinga, Grit Möller, „Jonny“ und Uwe danken.
Ein großes Dankeschön geht an Dr. Änne Honnens für die Einführung in das
wissenschaftliche Arbeiten und die Dopplersonographie und die Betreuung meiner
Arbeit.
Bettina Buck aus dem Institut für Pathologie danke ich für die Einbettung meiner
Proben.
Großer Dank geht an Marion Gähle und Doris Walter vom Institut für Anatomie für
die Anleitung und Beratung bei der Anfertigung der histologischen und
immunhistologischen Schnitte. Anfangs war nur ein kurzer Aufenthalt bei euch
geplant, am Ende war ich über ein Jahr bei euch, welches mir Dank eurer
Herzlichkeit nicht schwer gefallen ist.
Ein herzliches Danke geht an alle Korrekturleser: Dr. Johannes Lüttgenau, Dr. Jenny
Offinger, Hannah Ruhm und Kathrin Müller.
95
Dr. Johannes Lüttgenau ein zusätzliches großes Dankeschön für die Hilfe bei der
Statistik und die spontane Übernahme der wissenschaftlichen Betreuung.
Auch Kathrin Müller gilt ein extra und herzliches Dankeschön für das unermüdliche
Zuhören meiner Vorträge, Sorgen und Nöte und das Lesen dieser Arbeit. Als NichtTiermedizinerin ist sie inzwischen eine Expertin auf dem Gebiet der Nachgeburtsverhaltung beim Rind.
Zuletzt geht mein größter Dank an meine Familie. Ihr Vertrauen und ihre
Anerkennung sind mit ein stetiger Auf- und Antrieb. Vor allem meiner Mutter, Christel
Hartmann, danke ich für den stetigen Ansporn und die Aufmunterung. Meinem Vater,
Karl-Heinz Hartmann verdanke ich die Liebe zur Wissenschaft, die er mir schon als
Kind mit Begeisterung und leuchtenden Augen anschaulich vermittelte. Wo immer du
auch sein magst, in meinem Herzen bleibst du immer lebendig.
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