Biochimie Du Sang Unifr Ch

BIOCHIMIE DU SANG
Electrophoresis de Proteines du Plasma
1. Métabolisme de l’erythrocyte
2. Production et élimination d’éléments
cellulaires
3. Metabolisme et Transport du Fe
4. Composants du Plasma (structure &
globulines
fonction): protéines plasmatiques
γ
pI
Electrophorèse des protéines
sériques
+
-
6.0
β
α1 α2
5.6
5.1
albumine
4.7
Albumine
• Principale protéine du plasma.
• rôle important dans le maintien de la pression oncotique du sang
• transporte diverses substances: ions (Ca, Mg), acides gras,
bilirubine, divers médicaments, substances lilpophiles.
• MW 66 000
• Un seul peptide, 580 amino acides, sequence connue
• Dimensions 80°A - forme de cœur
• 50% α helix
•
•
Synthèse
– Foie, puis exportée
– ~ 1-2 min
– t0.5 en circulation - 19 jours
– 14 g perdu par jour
– 0.4 mg synthesisé par heure par g de foie
80 Å
30 Å
Fonctions
– Maintien de la pression oncoctique du sang (pression “Colloidale”): 80%
due à l’albumine
• Faible poids moleculaire/ régule la répartition de H2O
– Transport d’acides gras: Foie vers tissus, liaison
– Source d’acides aminés pour tissus (pinocytose)
• 60% albumine dans fluides tissulaires (interstitial)
1
γ-Globulines
Immunoglobulines
•
•
•
•
•
IgG – identifie les microorganismes - absorption et lyse
IgE – inhibe invasion de parasites; rôle dans reactions allergiques
IgD – inconnu
IgA – base de l’immunité passive - fourni par lait maternel agglutine agents infectieux des secretions extra-corporelles (larmes,
mucus, etc)
IgM – identifie les microorganismes - absorption et lysis
•
•
•
20% des proteines du plasma
“γ” se réfère à la mobilité electrophoretique
Represente un groupe proteines de structure
variable
•
Principal role immunochimique
– immunoglobulines
– =Anticorps - se combinent avec un antigène
specifique
•
Unité structurale de base: 4 chaînes
peptidiques
– PM = 2x55000
+2x27000
= 160000
Une immunoglobulines est formée de
deux chaînes lourdes (µ, γ, α, δ ou ε)
et de deux chaînes légères (κ ou λ)
Organisation en domaines
25.000 kD
50.000 kD
2
Organisation en domaines
Une immunoglobulines est formée de
deux chaînes lourdes (µ, γ, α, δ ou ε)
et de deux chaînes légères (κ ou λ)
25.000 kD
50.000 kD
Organisation en domaines
Organisation en domaines
3
• region variable varie selon les structures primaires, secondaires
et tertiaires
• Base de la specificité de liaison à l’antigène (ca. 106)
• 5 classes d’immunoglobulines
10 sites de fixation
à l’antigène
IgM
– IgG, IgA, IgM, IgD, IgE
– structures differentes des regions constantes des chaînes lourdes
– Certains sont des polymères (multiples de 4 chaines):
– IgA = dimère - MW 350 000,
– IgM = pentamère - MW 900 000
3 sites
de
fixation
au C1q
Chaîne J
IgA
• la forme sérique est monomérique
• la forme sécrétée est polymérique
– 2 IgA
– chaîne J
– pièce sécrétoire
Facteurs de la
coagulation
-a- Fibrinogène
340 kDa
Dimère symétrique Aα2 / Bβ2 / γ2
Protéine soluble, synthétisée dans le foie, présente
dans le plasma et dans
les granules α des plaquettes
460 Å
Ββ C-ter
γ C-ter Αα C-ter
D
Αα C-ter γ C-ter
Domaine central
(extrémités N-ter)
E
Ββ C-ter
D
MCG,
4
-b- Zymogènes de sérine protéases (enzymes protéolytiques)
a) Facteurs II, VII, IX, X:
- synthétisés dans le foie
- présents dans le plasma
- liaison calcium-dépendante aux phospholipides (-) déterminée par
les résidus Gla (modification post-traductionnelle , vitK-dépendante)
- sites de liaison aux protéines (enzymes, co-facteurs)
Membrane
FII = prothrombine
Gla
K1
K2
SP
N-ter
Gla
C-ter
SS
FVII, FIX, FX
EGF1 EGF2
SP
SS
N-ter
C-ter
Gla: ac.γ-carboxyglutamique; K: kringle; SP: sérine protéase; EGF: facteur de croissance
épidermique.
b) Facteur XI (FXII, prékallikréine):
- synthétisés dans le foie, non vitK-dépendants, présents dans le plasma
- domaines de liaison aux phospholipides (ex: domaine Apple A3 du FXI)
et aux protéines (ex: domaines A2, A3 du FXI et FIX)
MCG
-I- Les intervenants
2- Les protéines plasmatiques:
Facteurs de coagulation:
 Fibrinogène = protéine soluble, dimérique, capable de se
transformer en un réseau de fibres (caillot). C’est le substrat final
de la coagulation
 Pro-enzymes de la coagulation =
. 5 zymogènes de sérine protéases (FII, VII, IX , X, XI), dont 4
(FII, VII, IX , X ) dépendent de la vitamine K pour leur synthèse et
ont une affinité élevée pour les phospholipides (-)
. 1 zymogène de transglutaminase, affinité élevée pour le
fibrin(ogèn)e
 Co-facteurs = affinité élevée pour les PL, affinité sélective pour
une enzyme
et son substrat
NB: Les pro-enzymes et co-facteurs doivent subir une
protéolyse pour acquérir leur activité biologique
Inhibiteurs de la coagulation:
3 familles qui ciblent les sérine protéases (AT) , les cofacteurs(système de la PC) ou l’initiateur de la coagulation (TFPI).
Coagulation du sang
-I- Les intervenants
3- Les protéines membranaires
a) Facteur tissulaire (50 kDa)
Membrane
FN-III
FN-III
C-ter
-Initiateur de la coagulation
-Exprimé constitutivement par les fibroblastes, kératinocytes,
cellules épithéliales
N-ter
b) Thrombomoduline: TM , Endothelial Protein C Receptor:
EPCR
C-ter
-Régulateurs négatifs de la coagulation
-Exprimés par les cellules endothéliales
Ser/Thr EGF
6
α2
EGF
5
EGF
4
α1
EGF
3
EGF
2
N-ter
EGF
1
Lectine
TM
(75 kDa)
EPCR (46 kDa)
MCG
5
Hémostase= obstruction d’une brèche vasculaire
Voie endogène
PréKallicréine
Kallicréine
Surface électronégative
collagène sousendothélial
XII
Fibroblaste
Voie exogène
KHPM
FT
VIIa
Facteur Tissulaire
XIIa
KHPM
FT-VIIa
XIa
XI
PL+Ca2+
IX
VII
I
IXaVIIIa
X
Ca2+ + PF3
Xa
X
Va
Ca2+ +
PL
FW
IX
VII + Ca2+
IXa
VIIIa
X
Prothrombine II
V
Adventice
Media
XIII
Va II
Xa
Fibrine
IIa
Thrombine IIa
Fibrinogène
Fibrinogène
Fibrine
soluble
Voie exogène: voie principale in vivo
Voie endogène: voie de consolidation
Fibroblaste
FT
VII VIIa
Adventice
1. Protéolyse du fibrinogène par la thrombine
IXa
VIIIa
X
IXa
VIIIa
X
V
XIIa XII KHPM
KHPM
XIa
PK
XI
K
IX
IX
Xa
Conversion du fibrinogène en fibrine
Sous-endothelium
F.Willebrand
VIII
XIIIa
Fibrine
Xa
Va
II
Va
II
Aα
Bβ
XIa
Fibrine
XIIIa
R
Fibrine
Aα
Bβ
γ
XI
Thrombine
Fibrinogène
XIII
Fibrinogène
γ
α
Thrombine
α
β
β
γ
γ
Plaquette
Fibrine stabilisée
La thrombine amplifie sa formation
+
fibrinopeptides A et B
6
Conversion du fibrinogène en fibrine
Conversion du fibrinogène en fibrine
3. Stabilisation de la fibrine
2. Polymérisation des monomères de fibrine
α
β
GPR
GHR
GPR
GHR
γ
RPG
RHG
γ
γ
α
β
γ
β
α
Liaison hydrogène
γ
β
α
XIII
Ca++
Thrombine
XIIIa
γ
Liaison covalente
LA FIBRINOLYSE
•Fibrinoformation : Fibrinogène: 6 chaînes polypeptidiques Aα Bβ γγ, identiques 2
à2
Ca++
β
α
-clivage extrémités N-Terminales des chaînes Aα Bβ : formation de monomères de
fibrine
Processus physiologique permettant destruction du caillot de fibrinoplaquettaire qui se déclenche dès que la cicatrisation de la brèche vasculaire
est amorcée.
-polymérisation des monomères de fibrine par liaisons H: formation de fibrine
instable et soluble
1-Mécanisme
Fibrine
-stabilisation de la fibrine
par liaisons covalentes de
transamidation grâce au
XIIIa, entre les domaines
appelés D (région Cterminales) des
monomères: formation de
fibrine insoluble
Produits de Dégradation de la Fibrine
PDF
PLASMINE
Plasminogène
-Plasminogène: glycoprotéine plasmatique, synthétisée par foie
-Activation plasminogène libère plasmine, qui reste localisée au niveau
de la fibrine
-dégradation progressive de la fibrine en PDF, de plus en plus courts
-tous les PDFibrine contiennent structure domaines D-D appelée
D-Dimères (car les liaisons covalentes entre monomères de fibrine ne
sont pas rompues par la plasmine)
-existence de D-Dimères: preuve de la formation de fibrine stabilisée
donc d’une coagulation, puis de sa lyse par plasmine
7
5.2-Test indirects
•Recherche et Dosage des PDF (Fibrine et Fibrinogène)
-tech. Immuno. par agglutination latex sensibilisé
-PDF sériques > 10 mg/L: témoin hyper-fibrino ou fibrigèno-lyse
Le système plasminogène-plasmine
Digestion de la fibrine
PAI-1
•Dosage des D-Dimères
tPA
-tech. ELISA et tech. Immunoturbidimétrique
-D-Dimères sont spécifiques de l’activité de fibrinolyse, donc leur
concentration augmentent dans sérum après thrombose, mais aussi
lors de circonstances variées (âge, grossesse, cancers, infections,
inflammation, post-opératoire…)
Plasmine
PAI-1
PAI-1
tPA
tPA
-utilisation du dosage: dosage à valeur prédictive négative, proche de
100%, d’une thrombose
Fibrine
si D-Dimères sériques < 500 µg/L, exclusion du diagnostic
d’un événement thrombotique chez un patient
PDF solubles
Permet d’éviter investigations (angiographies, scintigraphies)
difficiles, invasives et coûteuses
Le système plasminogène-plasmine
Pg
Cytokines
Digestion de la fibrine
tPA
Pg
Fibrine
P
n
PDF solubles
Contrôle:
PAI-1
α2-antiplasmine (Foie)
TAFI ( Foie)
(pro-carboxypeptidase
B)
La régulation se fait au niveau : de la sécrétion et de la synthèse
de récepteurs.
8
La réponse immune : primaire puis secondaire
Première rencontre
Deuxième rencontre
Constitué d'un ensemble de protéines (~30) : système complément.
Notion d’activation des composants par protéolyse en chaîne
-> peptides actifs
3 types de fonctions : - ligand (C1), action sur cellules réceptives (MP)
- activateurs (rôle dans l’inflammation)
- complexe cytolytiques
Les composants du complément sont des protéines glycosylées,
parfois multimériques
Réponse secondaire
Réponse primaire
100,000
Titre anticorps
Le complément
IgG
10,000
1000
100
IgM
10
1
0
0
7
14
21
28
35
42
Jours


Réponse primaire : latence. IgM puis IGG
Réponse secondaire : pas de latence. Taux élevé d’IgG
Rôle du complément
Certains composants de la cascade du complément fixent la surface de l’Ag.
Puis :
-Active la phagocytose par des cellules réceptives
- Enclenche une cascade par la voie alterne. Phase finale : complexe d’attaque
membranes et destruction microorganisme
Microorganismes
Voie alterne
lyse
Complexe d’attaque C6 C5b
C7
cytoplasme
C3b
Complexe Ag/Ac
phagocytose
Voie classique
C9
membrane C8
C3a
C3
Voie classique
Fixation du complément
Récepteurs du
complément
Liaison à l’antigène
Fragment Fc,
liaison aux récepteurs
9
Voie alterne
Carbohydrates sont surtout présents à la surface
externe de la membrane de l’erythrocyte
Associés aux antigènes spécifiques de groupes
sanguins: ABH & Lewis.
Groupes sanguins
Donor nucleotide
(UDP-GalNAc)
Acceptor sugar
A gene product
(Galactose)
(A transferase)
Gal
Gal
GlcNAc
GalNAc
1
4
3
2
Specific 1→3
linkage
1
4
3
2
Glc
band 3
Type 2 precursor
Note: 1→4 linkage
Red cell membrane
Fuc
Antigène du groupe A
10
11
Reactive Oxygen Species
1e-
1eO2
O-2
1eH2 O2
1eOH- + ·OH
H2 O
.. .
.. . .• .. ..
..
.. - ..
•• O : H H : O :H
:
:
:
:
:
:
:O
:
:
:
O
O
O
H
O
O
H
H
O
••..
. ..
. ..
..•• ..
.. : + ..
Superoxide Hydrogen
anion
peroxide
(radical)
Hydroxyl
radical
12
Metabolic generation of ROS
Formation of superoxide, O2Electron
Donor
Electron
Acceptor
Metabolic generation of ROS
Formation of hydrogen peroxide and hydroxyl radicals
Electrons
transferred
Electron
Donor
Electron
Acceptor
Electrons
transferred
ROS
CoQH2
(E.T.C. of
mitochondria)
O2
1
FADH2
(peroxisomes)
O2
2
H2O2
Hb Fe2+
(Red blood cells)
O2
1
Fe2+
(all cells)
H2O2
1
OH•
Elimination of ROS
Vitamin E is an important
antioxidant
ANTIOXIDANTS
Vitamin E
Vitamin C
Vitamin A
ANTIOXIDANT ENZYMES
Partitions in membrane bilayers to protect lipids
from peroxidation
13
Elimination of ROS
Superoxide Dismutasedetoxification of superoxide radicals
ANTIOXIDANTS
Vitamin E
Vitamin C
Vitamin A
-
-
2 H+ + O-O• + O-O•
ANTIOXIDANT ENZYMES
HOOH + O2
Superoxide dismutase
Catalase
Glutathione peroxidase
Catalase-detoxification of
hydrogen peroxide
HOO:H + HO:OH
O2 + 2 HOH
Glutathione peroxidase-detoxification of
hydrogen peroxide and other peroxides
GS:H + GS:H + HO:OH
GS-SG + 2 HOH
GS:H + GS:H + ROOH
GS-SG + HOH + ROH
Glutathione (GSH)
HO2 C CH
NH2
CH2
O
CH2
C NH
O
CH C
NH CH2
CO2 H
CH2
SH
"business end"
14