Lokalisation von mRNA-Transkripten auf Gewebeschnitten des

Transcription

Lokalisation von mRNA-Transkripten auf
Gewebeschnitten des Riechepithels der Ratte
durch in situ Hybridisierung
Diplomarbeit
vorgelegt der Fakultät für Biowissenschaften
der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
Thomas Hengl
Heidelberg, Dezember 2006
Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Zoologie der Universität Heidelberg in
der Zeit vom 13. März bis 13. Dezember 2006 unter Anleitung von Prof. Dr. Stephan
Frings und Dr. Frank Möhrlen ausgeführt.
Referent:
Prof. Dr. Stephan Frings
Korreferent:
Prof. Dr. Gabriele Petersen
Institut für Zoologie
Im Neuenheimer Feld 230
69120 Heidelberg
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Diplomarbeit selbstständig unter
Anleitung verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel
benutzt habe.
Heidelberg, den 13. Dezember 2005
Thomas Hengl
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Arbeitsgruppe Molekulare Physiologie am Institut
für Zoologie der Universität Heidelberg angefertigt. An dieser Stelle möchte ich mich
bei allen recht herzlich für die Unterstützung bei der Anfertigung der Arbeit
bedanken.
Mein besonderer Dank gilt:
•
Prof. Dr. Stephan Frings für die Überlassung des interessanten Themas, die
Bereitstellung des Arbeitsplatzes und der Betreuung meiner Arbeit.
•
Apl. Prof. Dr. Gabriele Petersen für die Übernahme des Korreferats.
•
Dr. Frank Möhrlen für die ausgezeichnete Betreuung, für seine Anregungen
und Hilfestellungen, seine Geduld und seinen Rat bei der Fertigstellung dieser
Arbeit.
•
Dipl.-Biol. Nicole Ungerer, Dipl.-Biol. Ulrich Mayer, Dipl.-Biol. Clemens Prinz
zu Waldeck, Dipl.-Biol. Daniel Klimmeck und Dipl.-Biol. Katharina Funk, für
ihre
ständige
Diskussionsbereitschaft,
Hilfestellungen
und
Korrektur-
lesearbeiten.
•
Tanja
Keller
und
Gabriele
Günther
für
die
Unterstützung
bei
molekularbiologischen und histologischen Fragestellungen.
•
Dipl.-Biol. Kerstin Vocke, Dipl.-Biol. Christina Franjic-Würtz, Jochen Schlabing,
Inge Neudorf und Maren Stavermann für die familiäre Atmosphäre im Labor
403 und Zimmer 416. Semir, Philipp, Tilmann und Christine für ihre
Unterstützung im Studentenlabor.
•
Meinen Eltern, Verwandten und Freunde, ohne deren Unterstützung dieses
Studium nicht möglich gewesen wäre.
•
Meiner Freundin Isabel, die immer für mich da war und an mich geglaubt hat.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ........................................................................................................... 1
1.1
2
Die Nasenhöhle der Landwirbeltiere ............................................................ 1
1.1.1
Aufbau des respiratorischen Epithels.................................................... 2
1.1.2
Aufbau des olfaktorischen Epithels ....................................................... 3
1.2
Die olfaktorische Signaltransduktion ............................................................ 5
1.3
Ziel der Arbeit ............................................................................................... 7
Material und Methoden ..................................................................................... 8
2.1
Geräte .......................................................................................................... 8
2.2
Verbrauchsmaterialien ................................................................................. 9
2.3
Reaktionskomplettausstattungen ................................................................. 9
2.4
Chemikalien ................................................................................................. 9
2.5
Puffer, Lösungen und Medien .................................................................... 10
2.5.1
Puffer und Lösungen für die Histologie ............................................... 10
2.5.2
Puffer und Lösungen für die Molekularbiologie ................................... 11
2.5.3
Bakterien-Medien ................................................................................ 13
2.6
Bakterien Stämme...................................................................................... 14
2.7
Bakterien Vektoren..................................................................................... 14
2.8
Primer......................................................................................................... 15
2.9
Tiere ........................................................................................................... 18
2.10
Präparation des olfaktorischen Epithels für Nasengewebeschnitte ............ 18
2.10.1
Herstellung beschichteter Objektträger ............................................... 18
2.10.2
Fixierung für Paraffinschnitte............................................................... 19
2.10.3
Entwässerung des Gewebes............................................................... 19
2.10.4
Paraffineinbettung ............................................................................... 19
2.10.5
Schneiden der Paraffinblöcke ............................................................. 20
2.10.6
Fixierung für Kryoschnitte ................................................................... 20
2.10.7
Anfertigung der Kryostatschnitte ......................................................... 20
2.11
Molekularbiologische Methoden ................................................................. 21
2.11.1
Arbeiten mit RNA ................................................................................ 21
2.11.2
RNA-Isolierung.................................................................................... 21
2.11.3
Konzentrationsbestimmung und RNA-Spektrum................................. 22
Inhaltsverzeichnis
3
2.11.4
Denaturierende RNA-Agarosegel-Elektrophorese .............................. 22
2.11.5
Die cDNA-Synthese ............................................................................ 23
2.11.6
Polymerasekettenreaktion (PCR)........................................................ 23
2.11.7
DNA-Extraktion aus Agarosegelen...................................................... 24
2.11.8
Klonierung ........................................................................................... 25
2.11.9
Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli .............................................. 26
2.11.10
DNA-Sequenzierung........................................................................ 27
2.11.11
Lagerung von Klonen (Glycerinstock).............................................. 27
2.11.12
In vitro Transkription ........................................................................ 27
2.11.13
In situ Hybridisierung (ISH).............................................................. 29
2.11.14
DAPI-Färbung.................................................................................. 30
2.11.15
Bilddokumentation ........................................................................... 31
Ergebnisse ....................................................................................................... 32
3.1
Etablierung der ISH auf Gewebeschnitten der Rattennase ........................ 32
3.1.1
OMP als Marker für reife olfaktorische Rezeptorneurone ................... 35
3.1.2
CNG-A2 als Marker für reife olfaktorische Rezeptorneurone .............. 37
3.1.3
Das Golf-Protein als Marker für olfaktorische Rezeptorneurone .......... 39
3.1.4
Crb-2 als Marker für Stützzellen.......................................................... 41
3.2
Bestrophin-2 als möglicher Kandidat für den Ca2+-aktivierten Cl--Kanal .... 43
3.3
Negativkontrollen zu den in situ Hybridisierungen...................................... 47
4
Diskussion ....................................................................................................... 48
5
Zusammenfassung.......................................................................................... 53
6
Literaturverzeichnis ........................................................................................ 54
7
Abkürzungsverzeichnis .................................................................................. 64
Einleitung
1 Einleitung
1.1
Die Nasenhöhle der Landwirbeltiere
Die Nasenhöhle der Landwirbeltiere wird im anterioren Bereich vom respiratorischen
und
im
posterioren
Bereich
vom
olfaktorischen
Epithel
ausgekleidet.
Die
Einstülpungen (Abb.1) in das Lumen der Nasenhöhle werden als Conchien
bezeichnet (Cole P., 2003) und dienen der Oberflächenvergrößerung der Epithelien.
Die dorsalen Conchien nennt man Nasoturbinaten, die ventralen Conchien
Maxilloturbinaten (Uraih und Maronpot, 1990). Das median gelegene Septum (Abb.1)
trennt die Nasenhöhle in zwei Bereiche, die von den lateralen Wänden nach außen
hin begrenzt werden.
N
OE
L
S
M
RE
W
. die mit Richardson-Blau angefärbt
Abb.1: Koronalschnitt einer Rattennase,
wurde. Das blaugefärbte OE (olfaktorische Epithel) und RE (respiratorische Epithel)
grenzen die Gewebe vom Lumen ab. L: Lumen M: Maxilloturbinate, N:
Nasoturbinate, S: Septum, W: laterale Wand
1
Einleitung
1.1.1 Aufbau des respiratorischen Epithels
Das in der Nasenhöhle anterior gelegene respiratorische Epithel dient der
Erwärmung, Befeuchtung und Filtration der eingeatmeten Luft (Adams, 1972; Negus,
1956 und 58). Es besteht aus sechs morphologisch unterschiedlichen Zelltypen
(Abb.2): Cuboidal-, Bürsten-, Basal-, Becher-, ciliären und nichtciliären Säulenzellen
(Uraih und Maronpot, 1990).
Abb.2: Schematische Darstellung der Zelltypen des respiratorischen Epithels. (Uraih und
Maronpot, 1990) Die sechs Zelltypen: Cuboidalzelle, Bürstenzelle, Basalzelle auf der linken und
Becherzelle, ciliäre und nichtciliäre Säulenzelle auf der rechten Seite. Zusätzlich ist die Basallamina,
die das Epithel basal begrenzt und die darunterliegende Lamina propria mit Fibroblasten und
Axonbündeln dargestellt.
Becherzellen produzieren den Mukus, eine dünne wässrige Schleimschicht, die das
Epithel feucht hält und schützt. Sie erstrecken sich von der Basallamina bis zum
nasalen Lumen und befinden sich hauptsächlich am Septum wo sie sich mit ciliären
Säulenzellen vermischen (Leeson, 1981; Bloom, 1975). Der Nukleus der
Becherzellen liegt basal, so dass apikal Raum für sekretorische Vesikel bleibt. Die
ciliären Säulenzellen sind ähnlich aufgebaut, besitzen jedoch Cilien (4 µm) und
Mikrovilli (1,2 µm) und dienen der Filtration der Atemluft. Sie befinden sich sowohl
am Septum als auch medial der Nasoturbinaten und Maxilloturbinaten (MonteiroRiviere und Popp, 1984).
2
Einleitung
Die Basalzellen sind kleine flache Zellen mit großem Nukleus. Sie liegen der
Basallamina direkt auf und treten nicht mit dem nasalen Lumen in Kontakt. Die
Basalzellen gelten als Vorläuferzellen des respiratorischen Epithels und besitzen das
Potential zur Proliferation und zur Differenzierung in Becher- und ciliäre Säulenzellen
(Puchelle und Peault, 2000; Inayama et al., 1989).
Die drei weiteren Zelltypen, Cuboidal-, Bürsten- und nichtciliäre Säulenzellen
besitzen alle Mikrovilli in unterschiedlichen Längen und sind fast ausschließlich auf
der Oberfläche der Conchien und der lateralen nasalen Wand zu finden (MonteiroRiviere und Popp, 1984). Die Funktionen dieser Zellen sind noch nicht genau geklärt.
1.1.2 Aufbau des olfaktorischen Epithels
Das olfaktorische Epithel liegt als Verbund einzelner Zellschichten in der Nasenhöhle
und
besteht
aus
vier
Zelltypen
(Abb.3):
Basalzellen,
olfaktorischen
Rezeptorneuronen (ORN), Stützzellen und in geringem Umfang aus Phospholipase
C-β2 positiven Zellen (Mikrovillizellen; Anholt, 1993; Elsässer et al., 2005).
Abb.3: Schematische Darstellung des olfaktorischen Epithels.
OE: Olfaktorisches Epithel; LP: Lamina propria; C: Cilien der
Riechsinneszellen; MV: Mikrovilli der Stützzellen und PLC-β2
positiven Zellen; SZ: Stützzellen; RZ: Riechsinneszellen; BZ:
Basalzellen; BD: Bowman-Drüsen (verändert nach Anholt,
1993).
3
Einleitung
Dem Epithel liegt der Mukus auf, eine Schleimschicht (Menco and Farbman, 1992)
die für den Riechvorgang notwendige Elektrolyte und auch hydrophile olfaktorische
Bindeproteine enthält (Pelosi, 1994), welche die Diffusion der hydrophoben
Duftmoleküle zu den olfaktorischen Rezeptorneuronen erleichtern (Ache und
Restrepo, 2000). Er wird von unterhalb des Epithels liegenden flaschenförmigen
Drüsenzellen, den Bowman-Drüsen, sezerniert.
Oberhalb der Basallamina befinden sich die Basalzellen, welche neuronale
Stammzellen darstellen. Aus diesen gehen die darüber liegenden ORNs (Breipohl et
al., 1986; Carr und Farbman, 1993) hervor.
Riechsinneszellen haben eine ungewöhnlich kurze Lebensdauer von etwa vier
Wochen (Farbman, 1990). Da sie zeitlebens von den Basalzellen erneuert werden,
entsteht eine Mischung aus Riechsinneszellen verschiedener Reifegrade (Verhaagen
et al., 1989). Die unreifen ORNs befinden sich nahe der Basallamina und wandern
mit dem Grad ihrer Reifung in Richtung Stützzellen (Graziadei und Monti Graziadei,
1979; Caggiano et al., 1994; Weiler und Farbman, 1997). Deshalb befinden sich reife
Neurone direkt unterhalb der Stützzellen (Verhaagen et al., 1989). Riechzellen sind
primäre, bipolare Sinneszellen. Basal besitzen sie lange Axonfortsätze (Abb.4), die
sich zum Tractus olfactorius bündeln und durch das Siebbein direkt in den Bulbus
Abb. 4 Riechsinneszelle aus Rana pipiens
isoliert und eine vergrößerte Darstellung
eines Knopfes mit Dendriten
Differential-Interferenz Kontrastbild 1:100; c:
Cilien, d: Dendrit, s: Soma, a: Axon (S.J.
Kleene,. R.C. Gesteland, 1981)
4
Einleitung
olfaktorius projizieren. Hier werden die Informationen verarbeitet und an höhere
Gehirnareale gesendet. Apikal entspringt ein Dendrit, der sich bis zur Oberfläche des
Epithels erstreckt und in einem Dendritenknopf endet. Aus dem Dendritenknopf
reichen bis zu 20 Cilien (Abb.4), in denen die Signaltransduktion stattfindet, in den
Mukus. Die Cilien der Säuger besitzen eine Länge von ungefähr 50 µm (Finger et al.,
2000).
Den Abschluss des Epithels zur Nasenhöhle bildet eine palisadenartig angeordnete
Stützzellschicht (Menco and Jackson, 1997b; Pixley et al, 1997; Moran et al 1982b).
Die Stützzellen phagozytieren abgestorbene olfaktorische Neurone und puffern das
extrazelluläre Milieu (Trotier, 1998; Getchell und Mellert, 1991; Getchell und Getchell,
1982). Die PLC-β2-Zellen ähneln morphologisch den Stützzellen tragen aber nur
etwa 5 % zum Riechepithel bei. Es handelt sich wahrscheinlich neben den ORNs um
einen zweiten Typ chemosensorischer Zellen. Sie besitzen an ihrem anterioren Ende
Mikrovilli mit Rezeptoren für Geruchsstoffe, die einen zu den ORNs alternativen
Signalweg in Gang setzen (Sklar et al., 1986; Boekhoff et al., 1990; Ronnett et al.,
1993; Elsässer et al., 2005).
1.2
Die olfaktorische Signaltransduktion
Die olfaktorischen Rezeptorneurone sind für die Detektion der Duftstoffe in der
Atemluft und deren Umwandlung in elektrische Signale verantwortlich. Bindet ein
Duftstoff an einen Rezeptor wird die olfaktorische Signaltransduktion in Gang gesetzt
(Buck & Axel, 1991; Breer et al., 1994; Zufall et al., 1994; Freitag et al., 1998; Schild
& Restrepo, 1998). Die Interaktion eines Duftstoffes mit dem Rezeptor bewirkt eine
Konformationsänderung des Rezeptors, die zur Aktivierung der α-Untereinheit des
membranständigen G-Proteins, Golf (Jones & Reed, 1989; Firestein et al., 1991;
Menco et al., 1992; Zigman et al., 1993) führt. Diese stimuliert die Adenylatzyklase
Typ III (ACIII; Pace et al., 1985; Pfeuffer et al., 1989, Bakalyar & Reed, 1990), die
aus ATP cAMP synthetisiert, was für einen schnellen intrazellulären cAMP Anstieg
sorgt (Sklar et al., 1986; Breer et al., 1990; Lowe & Gold, 1993). Die hohe
Konzentration des sekundäreren Botenstoffes cAMP sorgt für das Öffnen zyklischNukleotid gesteuerter Kationenkanäle (CNG-Kanäle) in der Plasmamembran
(Nakamura & Gold, 1987; Firestein et al., 1991; Frings et al., 1992).
5
Einleitung
Abb.5:
Modell
der
Signaltransduktion
in
den
Cilien
der
olfaktorischen
Rezeptorneurone von Landwirbeltieren:
Schematische
Darstellung
des
olfaktorischen
Epithels
(links)
und
der
Transduktionsmoleküle in der Cilienmembran der Ratte (rechts). Bei Stimulation wird die
cAMP-Synthese aktiviert und führt zur Öffnung von Kationenkanälen. Ca2+-Einstrom durch
diese Kanäle öffnet Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle, die den größten Teil des Rezeptorstroms
leiten. Die roten Linien bezeichnen Ca2+- abhängige Wege der Rückkopplungshemmung:
Aktivierung der Phosphodiesterase (PDE) und Hemmung der Kationenkanäle. Beide
Rückkopplungsprozesse werden durch Calmodulin vermittelt. R: Duftstoffrezeptor; Golf: GProtein; AC: Adenylatzyklase III; PDE: Phosphodiesterase, CaM: CaM-Kinase II.
Verändert nach: Frings (2001).
Aus dem Mukus können Na+- und Ca2+-Ionen durch die CNG-Kanäle ins ciliäre
Lumen strömen, wodurch die ORNs schwach depolarisieren. Aufgrund des erhöhten
Ca2+-Spiegels (Firestein & Werblin, 1989; Frings et al., 1995; Leinders-Zufall et al.,
1997; Leinders-Zufall, 1998) werden Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle geöffnet (Kleene &
Gesteland, 1991; Kleene, 1993; Kurahashi & Yau, 1993; Hallani et al., 1998) und es
kommt zu einem Cl--Einstrom, der etwa 80 % des Rezeptorstroms trägt (Lowe &
Gold, 1993; Kleene, 1997; Reuter D. et al., 1998; Reisert J. et al., 2003). Diese
Depolarisation führt schließlich zur Entstehung von Aktionspotentialen (Hedlund et
al., 1987; Lynch & Barry, 1989; Kawai et al., 1997; Duchamp-Viret et al., 1999).
6
Einleitung
Der Ca2+-gesteuerte Cl--Kanal ist bisher auf molekularer Ebene nicht charakterisiert.
Mit
elektrophysiologischen
Methoden
konnten
jedoch
die
biophysikalischen
Eigenschaften sehr genau untersucht werden (Reuter et al., 1998; Reisert et al.,
2003; Kaneko et al., 2006). Bestrophin-2 wurde nun kürzlich als möglicher Kandidat
für den Ca2+-aktivierten Cl--Kanal ins Spiel gebracht (Pfifferi et al., 2006). Jedoch
weichen die elektrophysiologischen Eigenschaften des Bestrophin-2 deutlich von den
Eigenschaften des Ca2+-aktivierten Cl--Kanals ab.
Um eine höhere Auflösung von Duftstoffimpulsen zu erzielen, besitzt die
Riechsinneszelle mehrere Adaptionsmechanismen. Zum einen bildet Ca2+ mit
Calmodulin einen Komplex, der an die Calmodulin-Bindestellen der CNG-Kanäle
bindet und deren Affinität für cAMP drastisch sinken lässt (Chen und Yau, 1994; Liu
et al., 1994; Balasubramanian et al., 1996; Frings et al., 1999; Bradley et al., 2004).
Dies wird als schnelle Adaption bezeichnet. Zum anderen wird die Adenylatzyklase
Typ III durch die Ca2+-Calmodulin abhängige CaM-Kinase II phosphoryliert und somit
inaktiviert (Wayman et al., 1995; Wei et al., 1998). Zusätzlich aktiviert der Ca2+Calmodulin-Komplex eine Phosphodiesterase (PDE), die den sekundären Botenstoff
cAMP abbaut (Borisy et al., 1992; Yan et al., 1995). Durch Phosphorylierung der
Adenylatzyklase wird vorübergehend kein cAMP mehr gebildet und bestehendes wird
durch die PDE abgebaut.
1.3
Ziel der Arbeit
Das Ziel dieser Diplomarbeit ist es einen Beitrag zur molekularen Identifizierung des
Ca2+-aktivierten Cl--Kanals zu leisten.
Hierzu wurde die Methode der in situ Hybridisierung mit Hilfe von Markerproteinen
der ORNs und der Stützzellen etabliert um weiterführend Proteine auf ihre
zellspezifische Expression im olfaktorischen Epithel analysieren zu können.
Während dem Verlauf der Arbeit erschien eine Publikation (Pfifferi et al., 2006), die
Bestrophin-2 als Ca2+-aktivierten Cl--Kanal beschreibt. Deshalb wurde zusätzlich die
Expression von Bestrophin-2 im olfatoktorischen und respiratorischen Epithel
untersucht um diese Behauptung zu untermauern oder entkräften.
7
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1
Geräte
Binocular
SMZ800, Nikon
Fluoreszenzbinocular
MZFL3, Leica
Fluoreszenzlampen
ebq100, Nikon
EXFO, Nikon
Fluoreszenzmikroskop
Eclipse 90i, Nikon
Hybridisierungsofen
SI 20 H, Stuart Sientific
Kamera
DXM1200F, Nikon
DS-1QM, Nikon
Kryostat
CM 3050 S, Leica
Kühlzentrifuge
Z 323 K, Hermle
Lichtmikroskop
Axivert 200, Zeiss
Mikrotom
Ultramikrotom, Leica
PCR Maschine
T personal, Biometra
T gradient, Biometra
Photometer
Lambda 25, Perkin-Elmer
Ultraspec Plus, LKB Biochrom
8
2.2
Verbrauchsmaterialien
Deckgläser
Roth, Menzel
Mikrotommesser
Leica
Kryostatmesser
Leica
Objektträger
SuperFrost Plus, Menzel-Gläser
SuperFrost Plus Gold, Menzel-Gläser
SuperFrost Excell, Erie Scientific
Company
Adhäsiv-Objektträger, Menzel-Gläser
SuperFrost, gelatinisiert
SuperFrost, Poly-L-Lysin
PAP-Pen
2.3
Super HT, Polysiences
Reaktionskomplettausstattungen
NucleoSpin® Extract II
Macherey-Nagel
pGEM®-T and pGEM®-T Promega
Easy Vector Systems
NucleoSpin® Plasmid
Macherey-Nagel
RevertAid™
First Strand cDNA Synthesis Kits
MBI Fermentas
GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit
MBI Fermentas
Plasmid Midi Kit
Qiagen
2.4
Chemikalien
Alle laborüblichen Chemikalien wurden in p.A.-Qualität von den Firmen Merck KGaA
(Darmstadt), Carl Roth GmbH (Darmstadt), Serva Feinbiochemika GmbH
(Heidelberg), Sigma Aldrich Chemikalien GmbH (Deisenhofen), Boehringer
Mannheim GmbH oder J.T Baker bezogen. Alle eingesetzten Zweit-Antikörper
wurden von der Firma Sigma Aldrich Chemikalien GmbH (Deisenhofen) erworben.
9
Wasser wurde stets aus einer MilliQ-UV-Plus-Anlage der Firma Millipore (APS Water
Services Inc., Van Nuys, CA, USA) verwendet, die mit VE-Wasser gespeist und bei
einem ohm`schen Widerstand von 18,2 MΩ entnommen wurde.
2.5
Puffer, Lösungen und Medien
2.5.1 Puffer und Lösungen für die Histologie
Paraformaldehydlösung
4 % (w/v) Paraformaldehyd
1 x PBS
10 x PBS
1370 mM NaCl
27 mM KCl
15 mM KH2PO4
81 mM Na2HPO4
pH 7,4
10 % Saccharose-Lösung
10 % (w/v) Saccharose
0,5 % (w/v) NaN3
1 x PBS
30 % Saccharose-Lösung
30 % (w/v) Saccharose
0,5 % (w/v) NaN3
1 x PBS
DAPI-Lösung
90 µM 4,6-Diamidino-2-phenylindol
1 x PBS
10
2.5.2 Puffer und Lösungen für die Molekularbiologie
Antibiotika-Stocklösungen
Ampicillin, 50 mg/ml
Carbenicillin, 50 mg/ml
10 x PBS
1370 mM NaCl
27 mM KCl
15 mM KH2PO4
81 mM Na2HPO4
pH 7,4
50 x TAE
40 mM Tris-Acetat
1 mM EDTA, pH 8,0
5 x MOPS-Laufpuffer
0,1 M 3-[N-Morpholino-]propansulfonsäure
40 mM Na-Acetat
5 mM EDTA pH 8,0
20 x SSPE
3 M NaCl
0,2 M NaH2PO4-H2O
0,5 M EDTA
pH 7,4
20 x SSC
3 M NaCl
0,3 M tri-Na-citrat
pH 7,0
11
RNA-Isolationslösung
4 M Guanidiumthiocyanat
(Solution D)
25 mM NaCitrat
0,5 % N-Lauroylsarcosine (w/v)
0,1 M ß-Mercaptoethanol
Farbentwickler (NBT/BCIP)
0,1M Tris/HCl
0,1M NaCl
5 mM MgCl2
0,1 % Tween-20 (v/v)
1 mM Levamisole
pH 9,5
5 x Ladepuffer
50 % Glycin (v/v)
1 mM EDTA pH 8,0
0,1 % (w/v) Bromphenolblau
0,1 % (w/v) Xylencyanol
50 x Denhardts
1 % (w/v) BSA
1 % (w/v) Ficoll-400
1 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon
Prähybridisierungslösung
25 % 5 x SSC (v/v)
10 % 1 x Denhardts (v/v)
50 % Formamid (deionisiert) (v/v)
0,1 % Tween-20 (v/v)
5 µg Heringssperma-DNA
12
Hybridisierungspuffer
25 % 5 x SSC (v/v)
10 % 1 x Denhardts (v/v)
50 % Formamid (deionisiert) (v/v)
5 µg Heringssperma-DNA
RNA-Sonde (siehe in situ Hybridisierung)
PBT
1 x PBS
0,5 % (w/v) BSA
0,1 % (w/v) Triton X-100
Proteinase K Puffer
50 mM Tris/HCl
5 mM EDTA
pH 8,3
Blocklösung
5 % BSA (w/v) in PBT
2.5.3 Bakterien-Medien
LB- Medium (Luria Bertani)
10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
pH 7,5
Für LB-Agar 15 g/l Agar hinzufügen.
TY–Medium
2 % Trypton (w/v)
0,5 % Hefeextrakt (w/v)
0,51 % MgSO4 (w/v) * 7 H2O
0,058 % NaCl (w/v)
pH 7,0
13
SOB–Medium
2 % Bactotrypton (w/v)
0,5 % Hefe (w/v)
0,58 g/l NaCl (w/v)
0,19 g/l KCl (w/v)
ad 1000 ml H2O
SOC–Medium
SOB
+ 1 % 1 M MgCl2 (sterilfiltriert) (w/v)
+ 1 % 1 M MgSO4 (sterilfiltriert) (w/v)
+ 1 % 2 M Glucose (sterilfiltriert) (w/v)
2.6
Bakterien Stämme
XL1–blue (Stratagene)
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44
relA1 lac[F´proAB laclqZ∆M15Tn10(Tetr)]
2.7
Bakterien Vektoren
pGEM®-T
Promega
Abb. 6: pGEM-T Vektor
14
pGEM®-T Easy
Promega
Abb. 7: pGEM-T Easy Vektor
2.8
Primer
Die Primer (Tab.1-3) wurden mit dem der Oligo® Primer Analysis Software 5.0 der
Firma Molecular Biology Insights generiert und von der Firma Thermo in Heidelberg
synthetisiert.
Tab. 1: Die Bestrophin-Genfamilie:
Kandidat
Best 1
Best 2
Sequenz
Sequenz
Primer forward
Primer reverse
5' GGA GGG CAA GGA
5' AGC CCA TGA AGG
CGA GCA AG 3´
ATT GTC GGT 3'
5' CCG CCT ATC GCT
5' CAG CAA GGT GAA
TCT TAC TGG 3'
GAT CGG AAT G 3'
Produktlänge
743 bp
695 bp
15
Tab. 2: Marker für ORNs und Stützzellen:
Kandidat
Sequenz
Sequenz
Produktläng
Primer forward
Primer reverse
e
5' GGC CAA CAA GAA
5' GTA GTC CAG CAC
332 bp
TTT CCG TGA A 3'
CAG CCA TAC CA 3'
CNGA2
5' AAT GAA GTC GCA
5' ATG CCT TGG GAG
long
GCT AGT ATG G 3'
ACA GTT TAG 3'
Crb-2
5' CGT GAC GCG AAC
5' GCG GGG TCT GGA
CAA TGC 3'
GAT CAG TT 3'
5' ATG ACA ACT TTG
5' GGT TTC TCC AGG
GCA TCG TGG AA 3'
CGG CAT GT 3'
5' ACC CTG AGA ACC
5' TCT GGC CTC CAA
AGT TTC GGT CA 3'
CGT CAA ACA 3'
5' TGG TGA TCC GGG
5' CCA GAG GGT GAT
AAG ATA ACA A 3'
ACG GGG ATA C 3'
5' AGT GGT GGC AGT
5' ACA CCA CAG AGG
GGC AAC A 3'
CCT TTA GGT T 3'
CNG-A2
GAPDH
Golf
Golf long
OMP long
717 bp
709 bp
262 bp
321 bp
711 bp
514
Tab. 3: Kandidatenprimer aus dem Proteomprojekt:
Kandidat
K1
K5
K6
K8
K11
Sequenz
Sequenz
Produktläng
Primer forward
Primer reverse
e
5' AAC CAA AGG TCT
5' ACT TCC CAA CCA
319 bp
TCC CCA TAA A 3'
TCT TGA ACA G 3'
5' GGT CTC TTG GCT
5' GTG ATG GAA AGG
GAC AGA TAT GG 3
CTT AGT CGT CT 3'
5' CAC AGT TTA TTG
5' GGA CCC CTA TCC
CTC CGC TTT GT 3'
GAA TTA CCA G 3'
5' TTG GCT ACT TTG
5' GCC ACA AGG ACA
AAG GTG CAA G 3'
ATG TCA TAG AA 3'
5’ TTG GCT ACT TTG
5’ GCC ACA AGG ACA
AAG GTG CAA G 3’
ATG TCA TAG AA 3’
824 bp
712 bp
716 bp
716 bp
16
K13
K16
K20
K22
K23
K24
K25C
K25N
K26
K27C
K27N
K28
K29
K30
K31
5’ CCA GTT CAC ACT
5’ TGA TTG TAT TTC
CAA GCC TAT 3’
TCT AGG TCG AA 3’
5’ GCT GAG GTT TAC
5’ CAG CTT TGG CAC
TTC GCA CAG T 3'
ATC GTC TAC 3'
5’ CCT CTA CTC TGA
5’ CAG CGT AGG AAG
CCG CTA CAC CA 3’
AAG GGT AGG A 3’
5' TGT TGG CAT TAA
5' CGG GTA TCA GTG
CAT GGG CAT AT 3'
GGA GTT ATG GT 3'
5' TGA TTT GAA AAC
5' CAC CCG CAT TGA
GAA GTC CGA GA 3'
CGT TCT T 3'
5' GGC ACG AGG AGT
5' TGA TGT GAA GCT
CGC AAG T 3'
TGG GTA AGA GG 3'
5' AAC TGA AGA CCT
5' CCT CAT TAA TCT
TCG CAC CT 3'
CTG GAG AGT TTG 3'
5' GTA TTA CCA CCT
5' TCT CTG AAT TTT
ACC CGT GAA GC 3'
GAG GCG TCT C 3'
5' ATT ATG CAT CTA
5' TGT CTC CAA CAT
AGC TTG GGG ACG A 3'
GTC TTC AAC TGC C 3'
5’ GGT GGA GAA GGA
5’ GTG TGG AGA GGA
GGC GGA AAC 3’
GGA GCA CTC TG 3’
5' AGA GGA CAC TAC
5' TTG AAG ATG AGG
TGC TGC TCG GT 3'
GCC TTG TCA TAG 3'
5' CGT TTT CTA GCG
5' GCT CTT CTA TCT
AAG TCC CAC 3'
GGC GCT CC 3'
5' GCT CTG CAC CAG
5' GAT GCG CAC GTT
CTG TAC CTC 3'
CTT GAG TT 3'
5' GGA CAG TGT GCA
5' TGT GTG GGA TGC
GAG GAA CGG 3'
TCA GGG TAC T 3'
5' GGA CAA CGA CGA
5' GGC CAG TTT GTG
CGA CGA GC 3'
GAT AAC CCA A 3'
666 bp
282 bp
743 bp
652 bp
728 bp
681 bp
749 bp
746 bp
746 bp
504 bp
408 bp
732 bp
630 bp
767 bp
747 bp
17
2.9
Tiere
Als Versuchstiere wurden weibliche Wistar-Ratten verwendet. Die Ratten stammten
vom Zentralen Tierlabor (ZTL) der Universität Heidelberg und wurden dort unter
standardisierten Bedingungen in einem vollklimatisierten Raum bei künstlichem TagNacht-Rhythmus gehalten.
Es wurden drei Wochen alte Wistar-Ratten für die Präparation von Nasen und ein
Jahr alte für die Präparation der Conchien verwendet. Die Nasen dienten für
Gewebeschnitte, die Conchien für die RNA-Isolierung.
OMP-GFP-Mäuse
des
M55/Cre7-Stammes
(Potter
et
al.,
2001)
wurden
freundlicherweise von Priv.-Doz. Dr. Jörg Strotmann (Universität Hohenheim) zur
Verfügung gestellt.
2.10 Präparation des olfaktorischen Epithels für Nasengewebeschnitte
Vor der Gewebepräparation wurden die Tiere durch eine CO2-Begasung getötet und
dekapitiert. Daraufhin wurden das Fell und der Unterkiefer vom Kopf entfernt, sowie
der posteriore Teil des Oberschädels durch einen koronalen Schnitt hinter dem
Siebbein abgetrennt. Die Nasenspitze wurde posterior der Schneidezähne koronal
abgetrennt, um das Abstumpfen der Stahlmesser am harten Dentin der
Schneidezähne zu vermeiden. Weiterhin wurde durch einen Sagitalschnitt des
Schädeldachs von posterior nach anterior über das Siebbein hinweg ein Zugang zur
Nasenhöhle geschaffen. Dies ist nötig um der Luft das Entweichen und dem Fixativ
das Eindringen in die Nasenhöhle zu ermöglichen. Die gesamte Präparation erfolgte
bei Raumtemperatur.
2.10.1 Herstellung beschichteter Objektträger
•
Gelatine beschichtete Objektträger
SuperFrost Objektträger (Menzel) wurden über Nacht in 100 % Ethanol gelagert. Am
nächsten Tag wurden diese in destilliertem Wasser gewaschen und in 0,5 % Gelatine
(w/v) bei 40-50°C gegeben. Nach 2-3 h wurden die Objektträger aus dem
18
Gelatinebad genommen und für mindestens 5 h bei 60°C getrocknet. Die
Objektträger wurden in Aluminiumfolie eingepackt um sie vor Staub zu schützen.
•
Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger
Die Objektträger SuperFrost (Menzel) wurden ebenfalls in 100 % Ethanol gelagert,
im Inkubator bei 60°C getrocknet und dann in eine 0,1 mg/ml Poly – L – Lysinlösung
überführt. Am nächsten Tag wurden die Objektträger für 1-2 h bei 40°C im Inkubator
getrocknet.
2.10.2 Fixierung für Paraffinschnitte
Die Fixierung dient dem Erhalt der Gewebestruktur und sorgt dafür, dass die mRNATranskripte an Ort und Stelle verbleiben. Als Fixationsmittel wurde Paraformaldehyd
benutzt. Die präparierten Nasenhöhlen der Tiere wurden für 2 Tage bei 4 °C in 4 %
Paraformaldehyd fixiert.
2.10.3 Entwässerung des Gewebes
Zur Entwässerung wurde eine aufsteigende Alkoholreihe (3 x 20 min. 70 % Ethanol,
je 2 x 30 min. 80 %, 90 %, 96 % Ethanol und 100 % Isopropanol) benzutzt. Es folgte
eine 8-, 16- und 3 stündige Behandlung mit dem Intermedium Methylbenzoat um
Wasser vollständig zu entfernen.
2.10.4 Paraffineinbettung
Die entwässerten Objekte wurden in das wasserunlösliche Medium Paraffin
eingebettet, welches ein Gemisch aus aliphatischen Kohlenwasserstoffen ist. Die
präparierten Tiere wurden zuerst 3,5 Std., dann nochmals über Nacht in flüssigem,
57 °C warmem Paraplast (Tyco Healthcare Group LP, Mansfield) getränkt. Die
Einbettung erfolgte in geschmolzenem Paraplast in vorgewärmten Gießformen. Nach
Abkühlung auf einer 4°C Platte erstarrt das Paraplast und das Präparat ist zum
Schneiden bereit.
19
2.10.5 Schneiden der Paraffinblöcke
Die eingebetteten Präparate wurden mit einem Schlittenmikrotom geschnitten. Ein
Stahlmesser wurde hierbei über das jeweilige Präparat hinweggeführt. Es wurden
bei Raumtemperatur Schnitte mit einer Dicke von 8 - 16 µm angefertigt. Diese
wurden im Wasserbad GFL 1052 bei 40 °C gestreckt und anschließend auf
Objektträger aufgezogen. Die Objektträger wurden in einem Wärmeschrank
(Heraeus) 5 h bei 50°C getrocknet und bis zur weiteren Verarbeitung staubfrei bei
Raumtemperatur gelagert.
2.10.6 Fixierung für Kryoschnitte
Der Schädel des jeweiligen Präparates wurde zunächst in 1 x PBS gewaschen, um
Blutreste und Verunreinigungen zu entfernen. Danach wurde durch Inkubation in 4 %
Paraformaldehyd für 40 min fixiert. Die verbleibende Luft in der Nasenhöhle wurde
durch Anlegen eines Unterdrucks mittels Exsikkator entfernt. Nach Auswaschen des
Paraformaldehyds mit 1 x PBS (3 x 5 min.) wurde das Gewebe in einem
ansteigenden Saccharose-Gradienten entwässert: Zunächst 2 - 3 h Inkubation in
10 % Saccharose-Lösung bei Raumtemperatur und schließlich über Nacht in 30 %
Saccharose-Lösung bei 4°C. Die Präparate wurden mit einer 30 % Saccharose:
TissueTek Lösung (Sakura, Gießen) im Verhältnis 1:2 übergossen und bei -20°C in
TissueTek eingebettet, bevor sie dann bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert wurden.
2.10.7 Anfertigung der Kryostatschnitte
Die Kryostatschnitte wurden am Kryostat CM3050 S (Leica) mit einem Stahlmesser
bei -20°C angefertigt. Die Schnittdicke betrug 8 - 20 µm.
20
2.11 Molekularbiologische Methoden
2.11.1 Arbeiten mit RNA
Beim Arbeiten mit RNA dürfen die Gebrauchsgegenstände nicht mit aktiven RNasen
kontaminiert sein. Zur Inaktivierung von RNasen wurden deshalb folgende
Vorkehrungen getroffen:
Glaswaren oder andere hitzebeständige Materialien wurden in einem Wärmeschrank
(Heraeus) für mindestens 4 h bei 180°C inkubiert.
Lösungen und Puffern wurde Diethylpyrocarbonat (DEPC) im Verhältnis 1:1000
zugesetzt, anschließend über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und danach 30
min autoklaviert. DEPC zerfällt dabei zu Kohlenstoffdioxid und Ethanol. Lösungen,
die Substanzen mit Aminogruppen wie TRIS oder MOPS enthalten, dürfen nicht mit
DEPC behandelt werden. Diese wurden mit RNase-freien Chemikalien, mit DEPC–
vorbehandeltem Wasser und ausgeglühtem Spatel angesetzt.
Hitzeempfindliche Gegenstände wurden mit 0,1 M NaOH oder RNase AWAY
(Molecular BioProducts) behandelt. Die Inkubationsdauer lag bei 30 min. Danach
wurde das Material mit DEPC behandeltem Wasser abgespült.
2.11.2 RNA-Isolierung
Zur Isolierung von RNA aus dem Riechepithel der Ratte wurde die „single step“
Methode (Chomczynski und Sacchi, 1987) durchgeführt. Das Gewebe wurde in
einem Glashomogenisator aufgebrochen, die RNasen mit Guanidiumthiocyanat
inaktiviert und mittels Phenol/Chloroform- und Alkoholfällung wurde die RNA aus
dem Lysat ausgefällt.
100 mg Riechgewebe wurde mit 1 ml Solution D versetzt und mit einem
Homogenisators für 5 min auf Eis lysiert. Nach Zugabe von 100 µl/ml 2 M
Natriumacetat
pH
4,
500
µl/ml
Phenol
pH
4,5–5
und
200
µl/ml
Chloroform/Isoamylalkohol wurde gründlich homogenisiert und 15 min auf Eis
inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 14000 g für 15 min bei 4°C. Die wässrige
Phase wurde in ein RNasefreies Gefäß überführt. Dieser Schritt wurde einmal ohne
Zusatz von Natriumacetat wiederholt. Zur RNA-Fällung wurde der wässrigen Phase
Isopropanol im Verhältnis 1:2 zugegeben und für 60 min bei -70°C inkubiert. Nach
21
einer 20 minütigen Zentrifugation bei 13000 g und 4°C wurde das Pellet in 100 µl
Solution D gelöst. Es folgte eine weitere Isopropanolfällung. Das Pellet wurde mit
75 % Ethanol gewaschen, nochmals abzentrifugiert und schließlich luftgetrocknet.
Der Niederschlag wurde in 20-50 µl DEPC-H2O resuspendiert. Die Reinheit und
Konzentration der so gewonnenen RNA wurde photometrisch bestimmt.
2.11.3 Konzentrationsbestimmung und RNA-Spektrum
RNA hat sein Absorbtionsmaximum bei 260 nm. Mit einem Spektrometer (Perkin
Elmer, Lamda 25 UV/VIS Spektrometer) wurde die Absorbtion der Lösung bei 260
nm gemessen und die RNA-Konzentration berechnet. Eine OD260 = 1 hat eine RNAKonzentration von 40 µg/ml. Des Weiteren war eine Aussage über die Reinheit der
Probe mit einem Spektrum von 220-320 nm möglich, da das Absorbtionsmaximum
von Phenol bei 220 nm und das von Proteinen bei 280 nm liegt.
2.11.4 Denaturierende RNA-Agarosegel-Elektrophorese
Für ein 1 %-iges Gel wurde 1 g Agarose in 62,1 ml DEPC-H2O aufgekocht, auf 60°C
abgekühlt, 20 ml 5 x Laufpuffer (0,1 M MOPS ( 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure )
pH 7,0, 40 mM Natriumacetat, 5 mM EDTA pH 8,0) und 17,9 ml 37 % Formaldehyd
zugegeben und in einen Agarosegelschlitten gegossen. Zur Probenvorbereitung
wurden je 6 μl RNA Probe, die zuvor für 15 min bei 65°C denaturiert wurde und 6µl 2
x RNA-Ladepuffer (2 x Loading Dye Solution, Fermentas) in die Taschen des Gels
pipettiert. Die Gelelektrophorese erfolgte in 1 x Laufpuffer bei 5 V/cm und wurde
gestoppt, sobald der Farbmarker 2/3 des Gels durchlaufen hatte. Abschließend
wurde 30 min mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid in 0,1 M Ammoniumacetat gefärbt und
die RNA auf einem UV-Transluminator überprüft.
22
2.11.5 Die cDNA-Synthese
Um aus RNA cDNA zu synthetisieren wurde der RevertAid™ H Minus First Strand
cDNA Synthesis Kit (Fermentas) verwendet. Es wurden 5 µg RNA und 0,2 µg eines
random Hexamer-Primers eingesetzt und auf 12 µl mit DEPC-H2O aufgefüllt. Der
Ansatz wurde 5 min bei 70°C inkubiert und dann auf Eis abgekühlt. 4 µl 5 x
Reaktionspuffer, 20 Units RiboLock™ Ribonuclease Inhibitor und 10 mM dNTPs
wurden zugegeben. Nach einer Inkubation von 5 min bei 25°C wurden 200 Units der
RevertAid™ H Minus M-MuLV Reverse Transkriptase hinzugefügt und nochmals 10
min bei 25°C und 60 Minuten bei 42 °C inkubiert. Dieses Enzym ist in der Lage die
RNA-Stränge revers zu transkribieren und aufgrund der geringen RNase H Aktivität
den RNA-Strang nicht abzubauen. Die Reaktion wurde bei 70°C für 10 min gestoppt.
2.11.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Zur Amplifikation von DNA wurde die Polymerasekettenreaktion benutzt. Ein
Reaktionsansatz setzte sich folgendermasen zusammen (Tab.4)
Tab. 4: Reaktionsansatz einer PCR
1 µg
Template DNA
0,75 µl
dNTPs 10 mM
1 µl
Primer 1 (vorwärts) 10 pmol
1 µl
Primer 2 (rückwärts) 10 pmol
5 µl
Taq-Puffer (10x)
0,5 µl
Taq Polymerase 2,5 U (Axon)
2 µl
MgCl2 25 mM
Ad 50 µl H2O
23
Die PCR fand unter folgenden Bedingungen statt:
Standard PCR-Programm
94°C
2’
94°C
30’’
58°C
30’’
72°C
90’’
72°C
8’
4°C
bis damit weitergearbeitet wurde.
30 Zyklen
2.11.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen
Nach Auftrennung der DNA-Fragmente mittels Agarosegelelektrophorese kann die
gewünschte DNA aus dem Gel extrahiert werden. Der NucleoSpin® Extract II Kit von
Macherey-Nagel wurde hierzu verwendet.
Das
DNA-Fragment
wurde
mit
einem
sauberen
Skalpell
aus
dem
Gel
ausgeschnitten. Zu 100 mg Agarose wurde 200 µl Puffer NT gegeben, 10 min bei
50°C inkubiert und in 3 minütigen Abständen gevortext bis die Agarose verflüssigt
war. Die Probe wurde auf die Säule gegeben und 1 min bei 11000 g zentrifugiert. Der
Überstand wurde abgenommen und die Säule mit 600 µl NT3 gewaschen. Nach
einer einminütigen Zentrifugation bei 11000g wurde der Überstand wiederum
abgenommen und 2 min bei 11000 g zentrifugiert um letzte Flüssigkeitsreste zu
entfernen. Da im Puffer NT3 Ethanol enthalten ist, wurde die Probe für 2-5 min auf 70
°C erwärmt um mögliche Ethanolverunreinigungen zu entfernen. Die DNA wurde
daraufhin in 15-50µl Elutionspuffer NE eluiert.
24
2.11.8 Klonierung
•
Klonieren von PCR-Produkten mit AT-Überhängen
Clark (1988) konnte zeigen, dass die Taq-Polymerase während einer PCR keine
Fragmente mit glatten Enden produziert, sondern einen Überhang von Adenin
schafft. Die von der Taq-Polymerase amplifizierten PCR-Fragmente lassen sich
deshalb in einen offenen Vektors mit Thymin-Überhängen klonieren. Diese Methode
wird auch als TA-Klonierung bezeichnet. Zur Herstellung von Klonen wurde der
pGEM®-T beziehungsweise pGEM®-T Easy Vector (Abb.1 + 2) der Firma Promega
verwendet.
•
Ligation
Als Ligation bezeichnet man die Verknüpfung des Inserts mit einem Vektor. Es wird
ein offener Vektor, ein Insert (mit kompatiblen Enden) und eine Ligase, die die
Veresterungsreaktion katalysiert, benötigt. Die Reaktion wurde mit der pGEM®-T
beziehungsweise pGEM®-T Easy Vector Reaktionskomplettausstattung, nach
Angaben des Herstellers, durchgeführt (Tab.5).
Tab. 5 Reaktionsansatz der Ligation
5µl
2xRapid Ligation Buffer
1µl (50 ng)
pGEM®-T (Easy) Vector
3µl
PCR-Produkt (Konzentration
war immer unterschiedlich)
1 µl
T4 Ligase (3 Units)
Die Inkubationszeit betrug 1 h bei Raumtemperatur.
•
Transformation
Nach der Ligation wurde der Vektor mit Insert zur Vermehrung in E.coli-Bakterien
überführt. Dieser Vorgang wird als Transformation bezeichnet.
Es wurden elektrokompetente XL1–blue Zellen mittels Elektroporation (EasyjecT
Plus von EquiBio) transformiert. Die XL1–blue Zellen wurden auf Eis aufgetaut, SOCMedium auf 37°C erwärmt und Küvetten auf Eis bereitgestellt. 1-2 µl des
Ligationsansatzes wurden zu 50 µl XL1–blue Zellen gegeben und bei 2500 Volt,
einem ohmschen Widerstand von 201 Ω, einer Kapazität von 25 µF und einer
25
Pulsdauer von 5 µs elektroporiert (V=2500, R=0201, C=0025, T=0005). Die
Bakterien wurden daraufhin schnellstmöglich in 1 ml SOC-Medium aufgenommen
und für 1 h bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert.
Anschließend wurde ein Teil des Bakterienansatzes auf Agarplatten gegeben, die
sowohl mit einem selektiven Antibiotikum (Carbenicillin) als auch mit IPTG und X-Gal
(Blau-Weiß-Selektion) versetzt waren. Aufgrund dieser Selektionen war es möglich
die Bakterien zu identifizieren, die den Vektor aufgenommen haben.
•
Kolonie-PCR
Die Kolonie-PCR wurde zur Detektion von Insert-Fragmenten benutzt. Dabei wird ein
Bakterienklon von einer Plattenkolonie zum PCR-Ansatz gegeben, um das gesuchte
Fragment mit Hilfe geeigneter Primer zu amplifizieren.
Zur Durchführung der PCR wurde Zellmaterial von Einzelkolonien mit einem sterilen
Zahnstocher direkt in das vorbereitete PCR-Reaktionsgemisch (Tab. 4) gegeben. Die
PCR fand unter den oben beschriebenen Standartbedingungen statt.
2.11.9 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli
•
Minipräparation (Plasmid-Isolation aus E.coli-Bakterien)
Die Plasmid-Isolation im kleinen Maßstab (5 ml Übernachtkultur) wurde mit dem
NucleospinTM Plasmid Purification Kit von Machery-Nagel nach Angaben des
Herstellers durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde in 50 µl TE eluiert
•
Midipräparation (Plasmid-Isolation aus E.coli-Bakterien)
Die Plasmid-Isolation im großen Maßstab (50 ml Übernachtkultur) wurde mit dem
QIAGEN Plasmid Midi Kit, laut Angaben des Herstellers durchgeführt. Die PlasmidDNA wurde in 500 µl TE eluiert.
26
2.11.10
DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzierungen wurden von der Firma Seqlab Göttingen durchgeführt. Es
wurden 20 pmol des Sequenzierprimers mit 600 ng der zu sequenzierenden DNA in
ein 0,2 ml Reaktionsgefäß gegeben und auf 7 µl mit H2O aufgefüllt.
2.11.11
Lagerung von Klonen (Glycerinstock)
Für die Lagerung von Klonen wurden 600 µl Flüssigkultur des jeweiligen Klons
verwendet und mit 200 µl Glycerin (80%) versetzt. Nach gutem Durchmischen wurde
die Probe in flüssigem N2 schockgefroren und bei -70°C aufbewahrt.
2.11.12
In vitro Transkription
RNA-Sonden (Tab. 7) werden durch in vitro Transkription klonierter DNA-Fragmente
hergestellt. Hierfür wurden die Transkriptionsvektoren pGEM®-T und pGEM®-T Easy
der Firma Promega verwendet.
Die Vektoren pGEM®-T beziehungsweise pGEM®-T Easy (Abb. 6 + 7) wurden einmal
stromaufwärts des Inserts mit den Restriktionsenzymen NotI oder SacI und in einem
anderen Ansatz stromabwärts mit ApaI, SphI oder NcoI verdaut. Der aufgereinigte
linearisierte Vektor wurde als Template in einer Konzentration von 1 µg dem
Reaktionsansatz zugegeben (Tab. 6) und mit dem Enzym SP6 oder T7 (Abb. 6 + 7),
je nach Schnittstelle, versetzt. So entstehen sense (Negativkontrolle) und antisense
(Sonde)
Strang.
Der
DIG-RNA-Labeling
Mix
(Roche)
lieferte
die
Nukleotidtriphosphate, wobei etwa 1/3 der UTPs ein Digoxygeninmolekül, ein
Glycosid aus dem Roten Fingerhut (Digitalis purpurea), gebunden hat. Der RNaseInhibitor RiboLock™, die Polymerasen SP6 beziehungsweise T7 und der 5 x
Reaktionspuffer wurden von MBI Fermentas bezogen.
27
Tab. 6: Reaktionsansatz für die in vitro Synthese von RNA-Sonden
Volumen
Konzentration
Geschnittener Vektor
X µl
1 µg
5 x Puffer
10 µl
RiboLock™
2 µl
DIG-RNA-Labeling Mix
2 µl
Polymerase SP6/T7
2 µl
DEPC-H2O
Ad 50 µl
80 Units
10 mM/Nukleotidart
40 Units
Die Substanzen des Reaktionsansatzes wurden in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß
gegeben und für 2 h bei 37°C inkubiert. 2 Units DNase 1, RNase-frei (MBI
Fermentas), verdaute in 15 Minuten bei 37°C die eingesetzte Plasmid-DNA. Die
Enzymreaktion wurde mit 5 µl 0,2 M EDTA-Lösung pH 8, welche die für die
Polymerasen nötige Mg2+ Ionen bindet, gestoppt.
112,5 µl einer alkalischen Hydrolyse-Lösung (5µl 1 M DTT, 40µl 1 M NaHCO3, 60µl 1
M Na2CO3, 395µl DEPC-H2O) sorgte für eine Hydrolyse der RNA-Sonden in etwa
200 Basen lange Fragmente. Die Inkubationszeit betrug 45 min bei 60°C. Die
Reaktion wurde durch Abkühlen auf 4°C gestoppt und mit 112,5 µl eines
Neutralisationspuffers (5µl 1 M DTT, 5 µl CH3COOH, 100 µl Na(CH3COO), 390 µl
DEPC-H2O) neutralisiert.
Die RNA-Sonden wurden mindestens 1 h lang durch Zugabe von 28,4 µl
Lithiumchlorid und 750 µl Ethanol bei -80°C ausgefällt. Nach Zentrifugation bei
13000g für 20 min bei 4°C wurde das RNA-Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen,
abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet luftgetrocknet. Die RNASonden wurden in 30 µl Formamid (deionisiert) und 5 x SSC (im Verhältnis 3:1)
aufgenommen und bei -70°C gelagert. Die Sonden, die aus dem Antisense-Strang
der DNA entstanden sind, wurden als Negativkontrolle benutzt.
28
Tab. 7: Hergestellte RNA-Sonden als Marker für ORNs und Stützzellen
Sondenname
Beschreibung
OMP (olfaktorisches Markerprotein)
Lösliches Protein in ORNs, Aufgaben
unbekannt
CNG-A2
Membranprotein, Untereinheit des
olfaktorischen CNG-Kanals
Golf
Membranständiges Protein, olfaktorisches G-Protein
Crb-2 (Carbonyl reductase 2)
Lösliches Protein in den Stützzellen
Sowohl die Negativkontrollen als auch weitere hergestellte RNA-Sonden der Bestfamilie sind nicht aufgeführt.
2.11.13
In situ Hybridisierung (ISH)
Die Methode der in situ Hybridisierung wurde 1969 entdeckt (Das NK, Alfert M.,
1969) und seit den 90ern in vielen Fachgebieten angewendet. Es handelt sich dabei
um die Hybridisierung von Nukleinsäuresonden an zelluläre komplementäre
Nukleinsäuren zur Identifizierung bestimmter Chromosomen, Genloci oder auch von
RNA-Molekülen, die auf bestimmte Expressionsmuster einer Zelle hinweisten.
Es existieren diverse Standardprotokolle (Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser,
1993; Bradley 1997). Diese Standardprotokolle haben sich bei der Anwendung auf
Gewebeschnitten der Rattennase als nicht geeignet erwiesen, deshalb wurde in der
vorliegenden Arbeit das folgende Protokoll ausgearbeitet.
Es wurden coronale Gewebeschnitte von Rattennasen angefertigt (siehe 1.10). Die
Schnitte wurden 20 min getrocknet bevor sie erneut 10 min mit 4 % Paraformaldehyd
fixiert wurden. Nach zweimaligem waschen in 1 x PBS (5 min) wurde das Gewebe
mit Proteinase K (50 µg/ml) für 5 min bei 37°C verdaut. Danach wurde erneut in 1 x
PBS (2 x 5 min) gewaschen. Die Schnitte wurden für 10 min in 0,1 M Triethanolamin
pH 8 mit einer Endkonzentration von 0,25 % Essigsäureanhydrid inkubiert.
Anschließend wurde wiederum zweimal in PBS gewaschen. Es folgte die
Prähybridisierung mit dem Prähybridisierungspuffer um mit Heringssperma DNA
unspezifische Bindestellen zu belegen. Die Inkubationsdauer betrug zwischen 4 und
6
h
bei
Raumtemperatur.
Der
Hybridisierungspuffer
mit
verschiedenen
Sondenkonzentrationen (30 ng-1 µg) wurde auf die Schnitte gegeben, die daraufhin
29
über Nacht in einem Hybridisierungsofen (SI 20 H, Stuart Sientific) bei 55°C inkubiert
wurden.
Am nächsten Tag wurden die Objektträger zuerst für 30 min bei 60°C in 5 x SSC,
anschließend 30 min bei 60°C in 0,2 x SSC und 5 min bei Raumtemperatur in 0,2 x
SSC gewaschen. Es folgte eine Inkubation in PBT für 5 min mit anschließendem
Blocken in 5 % BSA proteinasefrei (Roth) in PBT für 1 h. Daraufhin wurde der
Antikörper Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments (Roche) im Verhältnis 1: 5000 in PBT
mit 5 % BSA proteinasefrei (Roth) für 2 h bei Raumtemperatur auf die Schnitte
gegeben. Danach wurde 2 Mal für 30 min in PBT gewaschen. Die Schnitte wurden in
die Färbelösung, die NBT und BCIP enthielt, gegeben. Die Farbreaktion dauerte
zwischen 30 min und 6 h. Anschließend wurden die Schnitte nochmals gewaschen,
zum Teil mit DAPI gefärbt (siehe 2.11.14), mit Aqua PolyMount Medium benetzt und
mit Deckgläsern bedeckt.
2.11.14
DAPI-Färbung
4,6-Diamidino-2-phenylindol, auch kurz DAPI genannt, färbt Zellkerne, genauer ATreiche Bereiche der DNA, an. Die Gefrierschnitte wurden 3 x 10 min mit 1 x PBS
gewaschen und die Flüssigkeitsreste mit Papier am Rand des Objektträgers
abgesaugt. Danach wurde mit einer 1:300 Verdünnung einer 90 µM DAPIStammlösung für 45 s inkubiert. Nach weiteren Waschschritten (3 x 10 min in PBS)
wurden die Schnitte erneut getrocknet, mit Aqua PolyMount benetzt und mit
Deckgläsern bedeckt.
30
2.11.15
Bilddokumentation
Zur Dokumentation der mit NBT und BCIP gefärbten Gewebeschnitte diente die
Hellfeld-Mikroskopie. Für diese Technik
wurde das Nikon Eclipse 90i Mikroskop
mit der Farbkamera Nikon DXM1200C
im Nikon Imaging Center verwendet.
Zur Nachbearbeitung der Bilder diente
das Programme Adobe® Photoshop®
7.0.
Abb. 8: Nikon Eclipse 90i Mikroskop mit der
Farb-kamera
Nikon
DXM1200C
im
Nikon
Imaging Center
31
Ergebnisse
3 Ergebnisse
Das Ziel dieser Arbeit ist es einen Beitrag zur molekularen Identifizierung des Ca2+aktivierten Cl--Kanals in olfaktorischen Rezeptorneuronen zu leisten. Deshalb wurde
die in situ Hybridisierung mit Markerproteinen für ORNs und Stützzellen etabliert und
die zellspezifische Expression von Bestrophin-2 im olfaktorischen wie auch im
respiratorischen Epithel veranschaulicht.
3.1
Etablierung der ISH auf Gewebeschnitten der Rattennase
Im Rahmen der Etablierung der Methode der in situ Hybridisierung an
Gewebeschnitten der Rattennase dienten das Standardwerk „In Situ Hybridization“
von D.G.Wilkinson sowie Veröffentlichungen zu in situ Hybridisierungen an Neuronen
von Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser 1993 und Bradley 1997., als Leitfaden.
Die exakte Durchführung der in situ Hybridisierung an Gewebeschnitten der
Rattennase mit den oben genannten Protokollen erwies sich jedoch zunächst als
unzureichend und musste deshalb optimiert werden.
Die Objektträgerwahl spielte dabei eine entscheidende Rolle, da das aufliegende
Gewebe etwa 36 h lang verschiedenen Agenzien ausgesetzt ist und sich nicht
ablösen darf. Bradley empfiehlt Superfrost Plus, Schaeren-Wiemers und GerfinMoser
Poly-L-Lysin-beschichtete
Objektträger.
Allerdings
zeigten
beide
Objektträgerarten (mit Paraffinschnitten) nur geringen Erfolg, da etwa 80 % der
Gewebeschnitte sich schon nach einigen Stunden bzw. spätestens nach dem
Hybridisierungsschritt ablösten. Daraufhin wurden folgende Objektträger getestet:
•
SuperFrost Plus, Menzel-Gläser
•
SuperFrost Plus Gold, Menzel-Gläser
•
SuperFrost Excell, Erie Scientific Company
•
Adhäsiv-Objektträger, Menzel-Gläser
•
SuperFrost gelatinisiert
•
SuperFrost mit Poly-L-Lysin
Anfangs wurden die Präparate in Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom
geschnitten. Es konnten Schnitte mit einer Dicke von 6-8 µm hergestellt werden.
32
Ergebnisse
Dem gegenüber stehen Gewebeschnitte mit dem Kryostaten, die zwar dicker (10-16
µm) sind, aber eine wesentlich kürzere Präparationsdauer und damit einhergehend
eine kürzere Fixierungszeit haben. Deshalb wurde sowohl das Haften von Paraffinals auch von Kryostatschnitten auf den genannten Objektträgern getestet.
SuperFrost Excell-Objektträger konnten 50-80 % der Paraffinschnitte und SuperFrost
Plus bzw. SuperFrost Plus Gold 50-80 % der Kryostatschnitte bis zum Ende der in
situ Hybridisierung binden. Von allen anderen lösten sich die Gewebeschnitte schon
nach wenigen Stunden komplett ab.
Die Parafifinschnitte weisen im Gegensatz zu den Kryostatschnitten nach der in situ
Hybridisierung unter dem Mikroskop eine wesentlich schlechtere Qualität auf. Sie
sind grau, verwaschen und kontrastarm im Vergleich zu den Kryostatschnitten. Aus
diesen Gründen wurde mit Kryostatschnitten weitergearbeitet.
Die Kryostatschnitte hafteten zwar größtenteils auf den SuperFrost Plus bzw.
SuperFrost Plus Gold Objekträgern, aber die Anzahl an auswertbaren Schnitten nach
der in situ Hybridisierung war zu gering. Es lösten sich einige Bereiche, wie z.B. das
Septum, vom Objektträger ab und legten sich über die Schnitte, so dass weitere
Areale des Gewebes verdeckt und somit unbrauchbar wurden. Zusätzlich lösten sich
regelmäßig große Bereiche des apikalen Epithels vom Objektträger ab. Dies ließ sich
auf
die
lange
Beanspruchung
des
Gewebes
während
des
Experimentes
zurückführen. Die Dauer der Versuche, besonders vor der Hybridisierung der Sonde,
wurde
deshalb
verschiedenen
stark
reduziert.
Das
dreimalige
Versuchsschritten
vor
der
Waschen
Hybridisierung,
zwischen
den
wie
den
in
Standardprotokollen beschrieben, wurde auf zweimal reduziert. Alle späteren
Waschschritte mussten erhalten werden um Hintergrundsignale durch nicht
spezifisch
gebundene
Sonde
beziehungsweise
Antikörper
zu
vermeiden.
Rehydrationen bzw. Dehydrationen des Gewebes in Form von absteigenden bzw.
aufsteigenden Ethanolreihen, wie sie in vielen Protokollen erwähnt sind, wurden um
die Versuchsdauer weiter zu verkürzen vermieden. Der Proteinase K Verdau wurde
von 30 min (Schaeren-Wiemers und Gerfin-Moser 1993) auf 5 min verkürzt, aber
gleichzeitig wurde die Proteinase K Konzentration von 10 µg/ml auf 50 µg/ml erhöht.
Auf weitere Schritte wie Ansäuerung des Gewebes mit HCl oder eine zweimalige
Triethanolbehandlung wurde ebenfalls verzichtet. Dies führte zu eindeutigeren und
besseren Signalen, sowie zu einer größeren Zahl auswertbarer Schnitte.
33
Ergebnisse
Der Prähybridisierungs- bzw. der Hybridisierungspuffer mit Dextransulfat und
Heparin, wie sie ebenfalls in vielen Protokollen beschrieben sind, erwiesen sich als
ungeeignet, da die Schnitte nach der Hybridisierung mit beiden Chemikalien bedeckt
waren und selbst nach den folgenden Waschschritten sich nicht von den
Gewebeschnitten lösten. Dies führte schließlich zu einem Ablösen des Schnittes
aufgrund erhöhter Beanspruchung durch gebundene Chemikalien oder zu einem
Blockieren der Bindestellen der RNA-Sonden und somit zu keinem Signal. Ohne
Dextransulfat und Heparin blieben die Gewebeschnitte an den Objektträgern haften
und Ablagerungen auf dem Gewebe werden vermieden.
Ein weiterer entscheidender Schritt ist die Herstellung qualitativ hochwertiger
Sonden, welche nach der alkalischen Hydrolyse die die optimale Länge von ca. 200
Basen haben. Die Dig-markierten RNA-Sonden wurden sowohl nach der in vitro
Transkription als auch nach der alkalischen Hydrolyse mittels denaturierender RNAGelelektrophorese
auf
ihre
Größe
und
Qualität
überprüft.
Hierbei
wurde
ausschließlich mit Sonden, welche die richtige Größe haben und kaum weitere
Degradationen auf dem Gel zeigten, weiter gearbeitet. Die RNA-Sonden wurden
nach der alkalischen Hydrolyse in Formamid und 5 x SSC aufgenommen. Aus
diesem Grund konnte, wie in den oben genannten Standardwerken bzw.
Veröffentlichungen
beschrieben,
keine
exakt
bestimmte
Konzentration
pro
Gewebeschnitt eingesetzt werden. Es erwies sich als geeignet von den Sonden
verschiedene Mengen zwischen 30 ng und 1 µg pro Gewebeschnitt zu verwenden.
Zusammengefasst sind bei der Durchführung der in situ Hybridisierung 4 Parameter
ausschlaggebend.
Die
Qualität
und
Größe
der
RNA-Sonde,
welche
die
Hybridisierung dieser an spezifische mRNA-Transkripte ermöglicht, sowie die
Adhäsionskraft des Objektträgers, welche das Gewebe über den gesamten
Versuchsverlauf ausreichend bindet. Weiterhin das Verkürzen bzw. Streichen einiger
Arbeitsschritte bis zur Hybridisierungsreaktion um das Gewebe zu schonen und
schlussendlich
das
Vermeiden
von
Dextransulfat
und
Heparin
im
Hybridisierungspuffer um Ablagerungen auf den Schnitten zu vermeiden.
34
Ergebnisse
3.1.1 OMP als Marker für reife olfaktorische Rezeptorneurone
Das cytosolische olfaktorische Markerprotein (OMP) wird spezifisch in ORNs
exprimiert und deshalb als Markerprotein verwendet.
In Abb. 8 sind Aufnahmen von coronalen Nasengewebeschnitten nach in situ
Hybridisierung und anschließender BCIP/NBT-Färbung zu sehen. Als Sonde wurde
eine
zur
OMP-mRNA
komplementäre
RNA
hergestellt.
(A)
zeigt
eine
Maxilloturbinate, die sich ins Lumen der Nasenhöhle erstreckt. Es ist eine
rotlich/violette Färbung im Bereich des olfaktorischen Epithels zu erkennen. In (B) ist
eine Vergrößerung des Septums mit aufliegendem olfaktorischem Epithel zu sehen.
Hier kann man eindeutig die Basallamina erkennen, die das OE von der darunter
liegenden Lamina propria abgrenzt. Die darauf folgenden Zellschichten, Basalzellen
und unreife Neuronen, zeigen keine OMP-Färbung. Nur die Somata der reifen ORNs
sind rot-violett gefärbt und lassen sich von der folgenden Stützzellschicht klar
abgrenzen. In (C) ist ein Teil des Septums mit aufliegendem OE und der Übergang
zum respiratorischen Epithel (RE) gezeigt. Zusätzlich zur Abgrenzung der ORNs zu
den Stützzellen ist auch die Scheidelinie zum beginnenden RE durch die deutliche
OMP-Färbung zu sehen. (D) zeigt einen Bereich des dorsal gelegenen Bogens der
Nasenhöhle, in dem wiederum eine spezifische Färbung der ORNs sichtbar ist. Die
Bilder (E) und (F) repräsentieren den in (D) dargestellten Ausschnitt in einer höheren
Vergrößerung, die nochmals die durch das OMP-Signal abgrenzbaren Bereiche der
ORNs und der Stützzellen hervorhebt.
35
Ergebnisse
Abb. 8: Nachweis von mRNA-Transkripten des olfaktorischen Markerproteins in reifen
olfaktorischen Rezeptorneuronen durch ISH: BCIP/NBT-Färbung coronaler Nasengewebeschnitte.
ORN: olfaktorische Rezeptorneuron, SZ: Stützzelle, OE: olfaktorisches Epithel, RE: respiratorisches
Epithel, BL: Basallamina, BG: Blutgefäß, S: Septum, M: Maxilloturbinate, (Sondenmenge: ca. 30
ng/Schnitt)
36
Ergebnisse
3.1.2 CNG-A2 als Marker für reife olfaktorische Rezeptorneurone
CNG-A2 ist die Hauptuntereinheit des olfaktorischen CNG-Kanals und ist in den
Cilien der ORNs lokalisiert.
Abb. 9 zeigt die Ergebnisse der in situ Hybridisierung mit der CNG-A2-Sonde. In (A)
ist ein ventraler Ausschnitt der Nasoturbinate mit aufliegendem olfaktorischen Epithel
abgebildet. Es ist eine starke rot-violette Färbung im Bereich des OE erkennbar,
wobei bei dieser mikroskopischen Auflösung nicht eindeutig geklärt werden kann
welcher Zelltyp markiert ist. In Bild (B) ist dieser Ausschnitt vergrößert dargestellt. Im
äußersten Bereich des OE ist vermutlich die ungefärbte Stützzellschicht aber
aufgrund der prominenten Färbung in den ORNs nicht eindeutig erkennbar. Gleiches
gilt für (C), einem dorsalen Ausschnitt einer Maxilloturbinate. Die ORNs sind
eindeutig gefärbt, jedoch ist der Übergang sowohl zu den Stützzellen als auch hin zur
Basallamina nicht eindeutig von der Färbung abgrenzbar. Jedoch kann in der
Vergrößerung (D) dieser Übergang klar gezeigt werden. Sowohl die Stützzellschicht
als auch der basale Bereich des olfaktorischen Epithels sind ungefärbt. Die
nochmalige Vergrößerung dieses Bereiches in (E) und (F) veranschaulicht dies
zusätzlich. Im Bereich der ORNs ist die rote Färbung sehr prominent, wohingegen
die basalen und die apikale Zellschicht(en) weiß erscheinen.
Somit wurde die mRNA der CNG-A2 Untereinheit nachgewiesen. Wie erwartet
korreliert die Färbung stark mit der in Abb. 8 dargestellten OMP-Färbung, da CNGA2-Proteine immer in OMP-positiven Zellen exprimiert werden.
37
Ergebnisse
Abb.9: Nachweis von mRNA-Transkripten der CNG-A2 Untereinheit in reifen olfaktorischen
Rezeptorneuronen durch ISH: BCIP/NBT-Färbung
coronaler Nasengewebeschnitte. ORN:
olfaktorische Rezeptorneuron, SZ: Stützzelle, OE: olfaktorisches Epithel, , BL: Basallamina, , M:
Maxilloturbinate, N: Nasoturbinate, (Sondenmenge: ca. 300 ng/Schnitt)
38
Ergebnisse
3.1.3 Das Golf-Protein als Marker für olfaktorische Rezeptorneurone
Das G-Protein Golf ist ebenfalls Bestandteil der olfaktorischen Signaltransduktion und
deshalb nur in ORNs exprimiert.
In Abb. 10 sind Ausschnitte von coronalen Nasengewebeschnitten mit aufliegendem
olfaktorischem Epithel zu sehen. Die Hybridisierung wurde mit der Golf-Sonde
durchgeführt. (A) zeigt den Ausschnitt einer Turbinate. Die rot-violette Färbung ist vor
allem im apikalen Bereich des OE erkennbar. Somit sind die Basalzellen, sowie
unreife Neurone, die sich basal des OEs befinden, nicht gefärbt. Die darüber
liegenden ORNs sind deutlich gefärbt, aber die das Epithel abschließende
Stützzellschicht kann mit dieser Auflösung nicht von den ORNs abgegrenzt werden.
(B) zeigt diesen Bereich in einer stärkeren Vergrößerung, so dass die Trennung der
verschieden Schichten nun möglich ist. Die Stützzellschicht erweist sich als farblos
und die ORNs zeigen deutliche Signale in den Somata. Weitere Vergrößerungen
dieses Ausschnittes in (C) und (D) untermauern dies nochmals. Stützzellen im
rechten Bildrand zeigen keine Signale, der Basale Bereich des OE ist weitestgehend
farblos und die sich nahe den Stützzellen befindenden ORNs weisen eine deutliche
Färbung
auf.
Nochmalige
Vergrößerungen
von
weiteren
Ausschnitten
des
olfaktorischen Epithels in (E) und (F) heben abermals die farblosen Stützzellen von
den roten ORNs ab.
Zusammenfassend zeigen damit drei Marker für olfaktorische Rezeptorneurone,
OMP, CNGA-2 und Golf, eine spezifische Färbung der ORNs.
39
Ergebnisse
Abb.10: Nachweis von mRNA-Transkripten des Golf-Proteins in reifen olfaktorischen
Rezeptorneuronen
durch
ISH:
BCIP/NBT-Färbung
coronaler
Nasengewebeschnitte.
ORN:
olfaktorische Rezeptorneuron, SZ: Stützzelle, OE: olfaktorisches Epithel, BL: Basallamina,
(Sondenmenge: ca. 300 ng/Schnitt)
40
Ergebnisse
3.1.4 Crb-2 als Marker für Stützzellen
Die Carbonyl-Reductase 2 ist ein Protein, das spezifisch in Stützzellen exprimiert
(Yu, 2005) und am xenobiotischen Stoffwechsel beteiligt ist.
In Abb. 11 ist der dorsal gelegene Bogen eines Nasengewebeschnitts mit
olfaktorischem Epithel in verschiedenen Vergrößerungen dargestellt. Im Vergleich zu
den vorherigen Markern sind hier keine neuronalen Zellen, sondern die Stützzellen,
die das Epithel zum Lumen hin abgrenzen mit BCIP/NBT gefärbt. In (A) ist die
Basallamina, die das OE zur Lamina propria hin abgrenzt, dargestellt. Es ist eine
schwache rote Färbung im apikalen Bereich des OE erkennbar, doch kann sie in
dieser Vergrößerung noch keinem spezifischen Zelltyp zugewiesen werden. Im
Ausschnitt (B) ist die Färbung bedeutend stärker und eindeutig der äußeren
Zellschicht, also den Stützzellen, zu zuordnen. Die darunter liegenden Zellschichten
des OEs zeigen keine Färbung. Dieses Bild spiegelt sich auch bei höherer
Vergrößerung in(C) und (D) wieder. Die Somata der Stützzellen weisen eine
deutliche violette Färbung auf und die restlichen Zelltypen des olfaktorischen Epithels
sind farblos. In (E) und (F) sind die einzelnen Somata der Stützzellen und der lila
Farbniederschlag aufgrund der höheren Vergrößerung deutlicher zu erkennen und
gegenüber den darunter liegenden Schichten leichter abzugrenzen. Wie erwartet ist
auch hier eine spezifische Färbung in den Stützzellen zu detektieren.
41
Ergebnisse
Abb.11: Nachweis von mRNA-Transkripten des Crb-2-Proteins in den Stützzellendurch ISH:
BCIP/NBT-Färbung coronaler Nasengewebeschnitte. ORN: olfaktorische Rezeptorneuron, SZ:
Stützzelle, OE: olfaktorisches Epithel, BL: Basallamina, (Sondenmenge: ca. 300 ng/Schnitt)
42
Ergebnisse
3.2
Bestrophin-2 als möglicher Kandidat für den Ca2+-aktivierten Cl--Kanal
Durch den aktuellen Bericht von Pifferi et al., 2006 sollte Bestrophin-2 mittels in situ
Hybridisierung auf Gewebeschnitten von Rattennasen zellspezifisch nachgewiesen
werden, um die Indizien für Bestrophin-2 als potentiellen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal zu
bestätigen oder zu entkräften.
In Abb.12 sind die mit BCIP/NBT angefärbten mRNA-Transkripte im olfaktorischen
Epithel und in Abb.13 die im respiratorischen Epithel der Nasenhöhle zu sehen. In
Abb.12 (A) ist das mit Pfeilen gekennzeichnete OE dargestellt. Schon bei geringer
Vergrößerung ist zu erkennen, dass die apikale Zellschicht, also die Stützzellen, nicht
gefärbt, die darunter liegenden reifen ORNs allerdings stark gefärbt sind. Ob die
basal gelegenen Basalzellen und die unreifen ORNs gefärbt sind, ist nicht eindeutig
zu erkennen. In (B) ist ein Ausschnitt des Septums mit aufliegendem OE zu sehen.
Auch hier ist die Stützzellschicht nicht gefärbt, die darunter liegenden Schichten
zeigen jedoch ein deutliches Bestrophin-2-Signal. Erst mit einer stärkeren
Vergrößerung in (C) zeigt sich, dass die Basalzellen und die unreifen Neuronen keine
Färbung aufweisen. Zusätzlich ist eine Bowman´sche Drüse, die auch farblos bleibt
zu sehen. Die gefärbten reifen ORNs grenzen sich apikal von der Stützzellschicht ab.
Die Aufnahmen mit der höchstmöglichen Vergrößerung (D-F) bestätigen nochmals
die spezifische Färbung in den ORNs.
43
Ergebnisse
Abb.12: Nachweis von mRNA-Transkripten des Best-2-Proteins im olfaktorischen Epithel durch
ISH: BCIP/NBT-Färbung coronaler Nasengewebeschnitte. ORN: olfaktorische Rezeptorneuron, SZ:
Stützzelle, OE: olfaktorisches Epithel, BL: Basallamina, BD: Bowman´sche Drüse, (Sondenmenge: ca.
300 ng/Schnitt)
44
Ergebnisse
Zusätzlich zu den Signalen in den ORNs sind aber auch Färbungen im
respiratorischen Epithel nachweisbar (Abb.13). (A) zeigt den Übergang des
olfaktorischen in das respiratorische Epithel bei schwacher Vergrößerung. Rechts der
Trennlinie kann man die gefärbten Neurone des olfaktorischen Epithels von den
farblosen Stützzellen unterscheiden, links sind basal und apikal im respiratorischen
Epithel Färbungen sichtbar. In (B) ist ebenfalls das respiratorische Epithel zu sehen,
allerdings ist die rote Färbung etwas diffuser im Epithel verteilt, so dass keine
Aussage über zellspezifische Färbungen im RE möglich ist. In (C) ist die Färbung
wieder spezifischer in Zellen oberhalb der Basallamina beziehungsweise im apikalen
Bereich des Epithels zu erkennen. Allerdings kann auch hier kein Zelltyp der Färbung
zugeordnet werden. Bei hohen Vergrößerungen (D)-(F) sind wieder deutliche
Färbungen sowohl basal als auch apikal des Epithels, aber nicht median, zu
erkennen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Färbung im olfaktorischen
Epithel eindeutig ORNs und im respiratorischen Epithel keinem speziellen Zelltypen
zugeordnet werden kann, allerdings sind die Zellen knapp über der Basallamina, bei
denen es sich um Basalzellen handelt, farblos.
45
Ergebnisse
Abb.13: Nachweis von mRNA-Transkripten des Best-2-Proteins im respiratorischen Epithel
nach ISH: BCIP/NBT-Färbung coronaler Nasengewebeschnitte: RE: respiratorisches Epithel, OE:
olfaktorisches Epithel, BG: Blutgefäß, BL: Basallamina, ORN: olfaktorische Rezeptorneuron, CSZ:
ciliäre Säulenzelle, BZ: Basalzelle, BüZ: Bürstenzelle, die Pfeile ohne Beschriftung zeigen auf
Färbungen im respiratorischen Epithel, (Sondenmenge: ca. 300 ng/Schnitt)
46
Ergebnisse
3.3
Negativkontrollen zu den in situ Hybridisierungen
Es wurden zwei verschiedene Negativkontrollen durchgeführt (Abb. 14). Zum einen
wurden Schnitte mit Hybridisierungspuffer ohne Sonde und zum anderen wurden
Schnitte mit der Antisense-Sonde behandelt. Die Antisense-Sonde (Negativkontrolle)
ist komplementär zur Sense-Sonde (Positivkontrolle) und entspricht einem Teil der
zellulären mRNA.
Abb. 14: Negativkontrollen: A: ISH mit BCIP/NBT-Färbung ohne Sonde, B: ISH mit BCIP/NBTFärbung mit Antisense-Sonde (Sondenmenge: ca. 300 ng/Schnitt) der OMP-Sonde. BL: Basallamina,
OE: olfaktorisches Epithel
In Abb. 14 (A) ist ein Ausschnitt eines coronalen Nasengewebeschnitts mit
olfaktorischem Epithel gezeigt. Es handelt sich um die Negativkontrolle einer in situ
Hybridisierung bei der im Hybridisierungsschritt keine Sonde eingesetzt wurde. Es ist
weder
eine
Färbung
im
olfaktorischen
Epithel
noch
im
basal
liegenden
Knorpelgewebe erkennbar. In (B) ist ein Bereich eines Nasengewebeschnitts mit
olfaktorischem
Epithel
nach
in
situ
Hybridisierung
und
BCIP/NBT-Färbung
dargestellt. Als Sonde wurde die Antisense-Sonde von OMP benutzt. Auch hier sind
keine spezifischen Färbungen sichtbar. Sowohl die Zellen des olfaktorischen Epithels
als auch das Knorpelgewebe sind nicht gefärbt.
Die Negativkontrollen zu CNG-A2, Golf, Crb-2 und Best-2 zeigen auch keine Färbung,
deshalb wurde nur die Negativkontrolle zu OMP dargestellt.
47
Diskussion
4 Diskussion
Im Rahmen der Diplomarbeit wurde ein Beitrag zur molekularen Identifizierung des
Ca2+-aktivierten Cl--Kanals geleistet. Als Werkzeug hierzu wurde die in situ
Hybridisierung auf Gewebeschnitten der Rattennase mit Markerproteinen etabliert
und die Bestrophin-2 Expression im olfaktorischen und respiratorischen Epithel
dargestellt.
Die in situ Hybridisierung ist eine Methode zur zellspezifischen Lokalisation von
mRNA-Molekülen, die alternativ für das zu untersuchende Gewebe jeweils empirisch
optimiert werden muss. Bei in situ Hybridisierungen an Gewebeschnitten ist dabei
der wichtigste Schritt einen Objektträger zu finden, der in der Lage ist das Gewebe
während der Dauer des Versuchs zu binden. Dies erwies sich im Rahmen dieser
Arbeit als Herausforderung, da selbst Objektträger, die in Vorversuchen das
olfaktorische Gewebe fest binden konnten, im eigentlichen Versuchsablauf dann
aber nur Bruchstücke des Gewebes erhalten konnten.
Ein weiterer wichtiger Versuchsparameter bei der Etablierung der in situ
Hybridisierung auf Nasengewebeschnitten ist die Länge der Behandlung mit
Proteinase-K. Zu lange Inkubationszeiten zerstörten das Gewebe in solchem
Umfang, dass die RNA-Sonden zwar mit komplementären mRNAs hybridisieren
konnten, aber die Zellen soweit zerstört wurden, dass die Färbungen keinem Zelltyp
mehr zugeordnet werden konnte. Andererseits führte eine zu kurze Inkubationszeit
zu keiner Färbung, da die Sonde vermutlich nicht durch das Gewebe zur mRNA
„vordringen“ und hybridisieren konnte. Eine Inkubation für 5 min bei 37°C mit einer
Proteinase-K Konzentration von 50 µg/ml erwies sich hier als geeignet.
Weiterhin stellte sich bei den Versuchen heraus, dass vor der Hybridisierung
möglichst kurze Inkubationszeiten einzuhalten waren. Dies erwies sich für die
Gewebeerhaltung als auch gegen mögliche Degradation der mRNA durch RNasen
als unbedingt notwendig.
Weiterhin zeigte sich, dass die Qualität der eingesetzten Sonden und deren Länge
eine entscheidende Rolle für die Qualität der Färbung spielte. Nur RNA-Sonden, die
nach der in vitro Transkription und alkalischer Hydrolyse eine Länge von ungefähr
200 Basen zeigten, ergaben auf Gewebeschnitten der Nase zufrieden stellende
48
Diskussion
Färbungen. Sonden, die zusätzliche Fragmente oder Degradationen auf dem RNAGel zeigten, ergaben in keinem Fall eine spezifische Färbung.
Mit den Hybridisierungsbedingungen wie Temperatur und Formamidkonzentration im
Hybridisierungspuffer musste darüber hinaus solange variiert werden bis ein
eindeutiges Signal erhalten wurde und kein unspezifisches Hintergrundsignal auftrat.
Eindeutige quantitative Aussagen über die Anzahl der im jeweiligen Gewebeschnitt
vorhandenen mRNA-Transkripte und damit die Expressionsstärke des jeweiligen
Gens waren mit der hier durchgeführten in situ Hybridisierung nur schwer möglich, da
sowohl die jeweilig eingesetzte RNA-Sonden-Konzentration variierte als auch die
Färbedauer mit BCIP/NBT verschieden war. Dies war nötig, um eine möglichst
optimale Färbung des zu untersuchenden Gens zu erhalten und war nicht für den
quantitativen Vergleich der Expressionsstärke vorgesehen.
Die in situ Hybridisierung auf Nasengewebeschnitten erwies sich so als geeignete
Methode um eine zellspezifische Lokalisation von mRNA-Molekülen nachzuweisen.
Dies unterstreichen die in Abb. 8-11 gezeigten Markerproteine OMP, CNG-A2, Golf
und Crb-2. Während die OMP-, CNG-A2-, und Golf-Sonden eindeutig ORNs
detektierten, konnte die Crb-2-Sonde die Stützzellen anfärben und diese somit klar
von den ORNs abgrenzen. Nach der Etablierung war es aufgrund der Vergleiche mit
den Markerproteinen möglich auch ein Protein, dessen zelluläre Expression nicht
bekannt war, den verschieden Zelltypen zuzuordnen.
Die Bestrophine sind eine relativ neue Genfamilie, die Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle
ausbilden können. Das erste identifizierte Gen war Bestrophin-1, welches nach der
Krankheit Morbus best benannt ist. Kurz darauf wurden in Säugetieren auch die
Bestrophine 2, 3 und 4 im Genom identifiziert.
Bestrophin-2 wurde nun kürzlich als möglicher Kandidat des Ca2+-aktivierten Cl-Kanals beschrieben (Pfifferi et al., 2006). Als Indiz dafür spricht eine spezifische
Expression von Bestrophin-2 im OE der Maus, die Bestrophine-1, 3 und 4 wurden
nach Pfifferi et al. nicht gefunden. Eine Einzellzell-PCR zeigte darüber hinaus, dass
Bestrophin-2 in den ORNs aber nicht in den Stützzellen exprimiert ist.
Demgegenüber stehen allerdings PCR-Analysen anderer Autoren die eindeutig alle 4
Bestrophine sowohl im olfaktorischen Epithel der Ratte als auch in der ODORAZelllinie, eine primär Zelllinie von olfaktorischen Neuronen, nachweisen (Christina
49
Diskussion
Franjic-Würtz, Diplomarbeit 2006; Anja Brühl, Dissertation 2005). Zusätzlich konnte
Barro Soria et al. Bestrophin-1, 2 und 4 im Riechepithel nachweisen (Barro Soria et
al., 2006). Damit ist die von Pfifferi et al. nachgewiesene spezifische Expression von
Bestrophin-2 im olfaktorischen Epithel alleine mehr als fragwürdig.
Ein weiteres Argument von Pfifferi et al. Bestophin-2 als möglichen Ca2+-aktivierten
Cl--Kanal zu nennen, war die immunhistochemische Lokalisation von Bestrophin-2 in
einer Cilienanreicherung. Auch diese Tatsache ist nicht eindeutig, da auf dem
gezeigten Immuno-Blot eine Kreuzreaktion des Antikörpers mit einem weiteren
Protein zu sehen ist.
Noch
klarer
sind
die
Widersprüche
beim
2+
Vergleich
der
biophysikalischen
-
Eigenschaften des nativen olfaktorischen Ca -aktivierten Cl -Kanals (Kaneko et al.,
2006; Reisert et al., 2003; Reuter et al.; 1998) mit dem in HEK-293 Zellen heterolog
exprimierten Bestrophin-2 (Pfifferi et al., 2006). Es konnte nur im whole cell Modus
ein messbarer Ca2+-induzierter Cl--Strom in diesen HEK-293 Zellen gemessen
werden, nicht aber in excised patches (Pfifferi et al., 2006). Die Einzelkanalleitfähigkeit wurde daher im whole cell Modus bestimmt und war um mehr als das
Fünffache niedriger als die des nativen Ca2+-aktivierten Cl--Kanals (Pfifferi et al.,
2006). Des Weiteren liegt die Öffnungsgeschwindigkeit des Ca2+-aktivierten Cl-Kanals im Millisekundenbereich, die von heterolog exprimiertem Bestrophin-2 im
Sekunden- bis Minutenbereich. Zusammenfassend stellen diese Befunde damit
Bestrophin-2 als möglichen olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal mehr als in
Frage. Pfifferi et al. versuchen diese Unstimmigkeiten mit dem Hilfsargument des
Fehlens von Regulationsproteinen oder weiteren Kanaluntereinheiten in der HEK293 Zelle zu erklären.
Aufgrund dieser Widersprüche wurde im Rahmen der Arbeit deshalb die
zellspezifische Lokalisation von Bestrophin-2 auf Gewebeschnitte mittels in situ
Hybridisierung überprüft. Dabei zeigte sich zunächst, dass Bestrophin-2 tatsächlich
spezifisch ORNs anfärbt. Im Vergleich mit den ORN-Markern OMP, CNG-A2 und Golf
zeigt Bestrophin-2 allerdings bedeutend weniger gefärbte ORNs. Daraus lässt sich
schließen, dass Bestrophin-2 möglicherweise nicht in allen OMP- bzw. CNG-A2- und
Golf -positiven Zellen exprimiert wird. Vielleicht handelt es sich hierbei um eine
Subpopulation von ORNs, die einen anderen Rezeptor nutzen. Hierbei könnte es
sich beispielsweise um die von Liberles und Buck, 2006 identifizierten TAARs (trace
50
Diskussion
amine-associated receptors) handeln, die flüchtige Amine detektieren können.
Bestrophin-2 zeigt nach den in situ Hybridisierungen nicht nur im olfaktorischen
sondern auch im respiratorischen Epithel sehr starke Signale. Dies ist ein weiteres
starkes Indiz dafür, dass es sich bei Bestrophin-2 nicht um den olfaktorischen Ca2+aktivierten Cl--Kanal handeln kann. Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten
nämlich, dass der Ca2+-aktivierte Cl--Kanal nur in ORNs, sowie glatten Muskelzellen
und DRG-Neuronen exprimiert wird. Welche Rolle Bestrophin-2 im respiratorischen
Epithel erfüllen kann, muss hier zunächst zurückgehalten werden. Die in situ
Hybridisierung stellt somit ein weiteres Argument gegen Bestrophin-2 als
Transduktionskanal in ORNs dar, weil die Expression auf weniger ORNs beschränkt
ist und auch verschiedene Zelltypen des respiratorischen Epithels gefärbt sind.
Anhand der biophsikalischen Eigenschaften von Bestrophin-2 in HEK-293 Zellen
(Pfifferi et al, 2006) und den Ergebnissen der in situ Hybridisierung könnte man daher
vermuten, dass es sich eher um ein Transporter handelt, der für die AnionenHomöostase des Mukus, sowohl im respiratorischen als auch im olfaktorischen
Epithel, verantwortlich sein könnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in situ Hybridisierung mit den
Markerproteinen etabliert wurde und ein zellspezifischer Expressionsnachweis auf
Gewebeschnitten der Rattennase möglich ist. Bestrophin-2 kann aufgrund der
Ergebnisse von Pfifferi et al. und dem mittels in situ Hybridisierung erbrachten
Nachweis, dass Bestrophin-2 auch in Zellen des respiratorischen Epithels exprimiert
ist, als Kandidat für den olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal weiter bezweifelt
werden.
Im Rahmen der Suche nach dem olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal wurden
über die Analyse von Bestrophin-2 hinaus auch ca. 300 Membranproteine aus einer
Cilienpräparation der Ratte isoliert und massenspektrometrisch identifiziert. Diese
Proteinsequenzen
wurden
bioinformatisch
analysiert
und
konnten
daraufhin
bekannten Proteinen der olfaktorischen Signaltransduktion, des xenobiotischen
Stoffwechsels, des Cytoskelets und weiteren physiologischen Funktionen zugeordnet
werden. Allerdings fanden sich auch 32 Proteine unbekannter Funktion, unter denen
sich möglicherweise der nach wie vor unbekannte Ca2+-aktivierte Cl--Kanal befinden
könnte.
51
Diskussion
Nachdem die Methode der in situ Hybridisierung nun etabliert ist, können diese
Proteine unbekannter Funktion auf Nasengewebeschnitten der Ratte nachgewiesen
werden. Die Proteine, die auf mRNA-Ebene nicht in ORNs oder in ORNs und
weiteren Zelltypen des olfaktorischen beziehungsweise respiratorischen Epithels
detektiert werden, können nicht der gesuchte Ca2+-aktivierte Cl--Kanal sein.
Alle Proteine, die ausschließlich in den ORNs nachgewiesen werden, müssen mit
weiteren Versuchen wie z. B der siRNA-Technik und der patch clamp-Methode weiter
untersucht werden bis ein Protein gefunden ist, das in transfizierten HEK-293 Zellen
einen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal mit den richtigen biophysikalischen Eigenschaften
ausbildet.
Die Suche nach dem Ca2+-aktivierten Cl--Kanal dient nicht nur der weiteren
Erforschung der olfaktorischen Signaltransduktion, sondern erlaubt auch einen
Einblick in die Schmerzsignaltransduktion. Die Reizweiterleitung des Schmerzes wird
ebenfalls durch das öffnen eines Ca2+-aktivierten Cl--Kanals verstärkt (Ault and
Hildebrand, 1994; Carlton et al., 1999). Hierbei wird vermutet, dass es sich um einen
dem
olfaktorischen
Mechanismus
ähnlichen
Weg
handelt,
da
eine
aktive
Chloridakkumulation (Alvarez-Leefmans et al., 2001; Kaneko et al., 2006) in der
Schmerzzelle und die Expression eines Ca2+-aktivierte Cl--Kanals (Currie et al., 1995;
Kenyon and Goff, 1998; Lee et al., 2005) nachgewiesen ist. Weiterhin zeigen die
Ca2+-aktivierten Cl--Kanäle sowohl des olfaktorischen als auch des SchmerzSignaltransduktionsweges die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften, z.B.
besitzen sie ähnliche Leitfähigkeit, Ionenselektivität und die Aktivierbarkeit durch
Ca2+-Ionen (Frings, 1999). Aus diesen Gründen ist die molekulare Identifizierung
auch für pharmakologische Zwecke interessant, da eine Unterdrückung der aktiven
Chloridakkumulation zum Abklingen der Schmerzempfindung führt (Willis et al.,
2004) und gleichzeitig ein Schmerztherapeutika gegen den Ca2+-aktivierten Cl--Kanal
synthetisiert werden kann, welches den Kanal blockiert und somit die Verstärkung
des Rezeptorstroms verhindert
52
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Die olfaktorische Signaltransdukion bei Landwirbeltieren ist in ihren Grundzügen
bereits gut verstanden. Der Ca2+-aktivierte Cl--Kanal, der für den größten Teil der
Erregungsbildung verantwortlich ist, ist jedoch auf molekularer Ebene noch nicht
identifiziert. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb zunächst die in situ Hybridisierung
auf Gewebeschnitten der Rattennase mit Markerproteinen für olfaktorische
Rezeptorneurone und Stützzellen zu etablieren. Bei der Etablierung waren vier
Arbeitsschritte entscheidend. Die richtige Wahl des Objektträgers, der das Gewebe
bis zum Versuchsende binden muss, die Synthese von RNA-Sonden optimaler
Länge und Qualität, die Verringerung der Inkubationszeiten vor der wesentlichen
Hybridisierungsreaktion, um eine optimale Gewebeerhaltung zu garantieren und eine
mögliche Degradation der RNA zu verhindern sowie der Ausschluss von
Dextransulfat
und
Heparin
im
Hybridisierungspuffer,
da
dieses
auf
den
Gewebeschnitten präzipitiert und dadurch das Eindringen der Sonden in das
Gewebe verhindert.
Die in situ Hybridisierung wurde mit OMP, CNG-A2 und Golf als Marker für reife
olfaktorische Rezeptorneurone und mit Crb-2 als Stützzellmarker etabliert. Die
Marker für reife Neuronen zeigten deutliche Färbungen in den ORNs und keine
unspezifischen Signale in anderen Zellen. Mit Hilfe des Stützzellmarkers konnten die
gefärbten Stützzellen klar von den Neuronen unterschieden werden.
Ein Bericht von Pfifferi et al. beschrieb Bestrophin-2 als Kandidat für den
olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanal. Diese Behauptung sollte mit einer
zellspezifischen Expression von Bestrophin-2 auf Nasengewebeschnitten untersucht
werden. Bestrophin-2 konnte zwar eindeutig in ORNs des olfaktorischen Epithels
nachgewiesen aber auch deutlich in Zellen des respiratorischen Epithels detektiert
werden. Da die Existenz des olfaktorischen Ca2+-aktivierten Cl--Kanals aber nur in
ORNs und nicht in Zellen des respiratorischen Epithels nachgewiesen ist, muss diese
Aussage von Pfifferi et al., in Frage gestellt werden.
Weitere 32 Kandidaten, die aus dem ciliären Proteomprojekt unserer Arbeitsgruppe
stammen und denen keine physiologischen Funktionen und eindeutige zelluläre
Lokalisation zugewiesen werden können, sollen zukünftig mit der in situ
Hybridisierung auf ihre zellspezifische Expression auf Nasengewebeschnitten
untersucht werden.
53
Literaturverzeichnis
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63
Abkürzungsverzeichnis
7 Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung
Erklärung
α
anti-
Abb.
Abbildung
AC III
Adenylatcyclase Typ III
ATP
Adenosin-5'-Triphosphat
BCIP
5-Bromo-4-Chloro-3-Indoylphosphat
BG
Blutgefäß
BL
Basallamina
BSA
Bovines Serumalbumin
ca.
circa
bzw.
beziehungsweise
cAMP
3´,5´-zyklisches Adenosinmonophosphat
cm
Zentimeter
CNG-Kanal
cyclic nucleotide gated channel
DAPI
4,6-Diamidino-2-phenylindol
DRG
(dorsal root ganglion)
EDTA
Ethylendinitrilotetraessigsäure
GFP
green fluorescent protein
Golf
olfaktorisches G-Protein
h
Stunde
ISH
in situ Hybridisierung
LP
Lamina propria
M
Molar
mA
Milliampère
ml
Milliliter
mm
Millimeter
mM
milli-Molar
ms
milli-Sekunde
NBT
Nitro Blue Tetrazolium
OD
Optische Dichte
OE
Olfaktorisches Epithel
OMP
olfaktorisches Markerprotein
64
Abkürzungsverzeichnis
ORN
Olfaktorische Rezeptor-Neurone
p.a
pro analysi
PBS
phosphate buffered saline
PDE
Phosphodiesterase
RE
respiratorisches Epithel
rpm
rounds per minute
s
Sekunde
S
Septum
SDS
Sodium-Dodecylsulfat
SZ
Stützzelle
Tab.
Tabelle
TRIS
2-Amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
U
Unit
µg
Microgramm
µl
Microliter
µm
Micrometer
v/ v
volume per volume
w/ v
weight per volume
z.B.
zum Beispiel
65

Lokalisation von mRNA-Transkripten auf Gewebeschnitten des

Transcription

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