Einsatz neuer DC-Techniken (VideoStore) zur

Transcription

19.07.2000
Diplomarbeit in pharmazeutischer Biologie
Einsatz neuer DC-Techniken (VideoStore)
zur Dokumentation von Phytopharmaka
am Beispiel Baldrian
in Muttenz
bei der Firma
eingereicht von:
Andreas Schmid
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Betreuung der Arbeit durch:
Prof. Dr. Beat Meier; Zeller, Romanshorn / Universität Basel
Dr. Eike Reich; CAMAG, Muttenz
Regina Bruggisser; Universität Basel
Basel, den 19.Juli 2000
Andreas Schmid
Titelbild: CAMAG Videosystem mit Reprostar, Videokamera und Computer mit Software
2
A. Schmid
HPTLC Baldrian
Inhaltsverzeichnis
1.
Zusammenfassung ........................................................................................................................... 5
2.
Aufgabenstellung............................................................................................................................. 5
3.
Einleitung............................................................................................................................................ 6
3.1. Baldrian ....................................................................................................................................... 6
3.2. Bekannte (HP)TLC Verfahren für Baldrian ............................................................................. 7
3.2.1. Ph.Helv. 8 ............................................................................................................................. 7
3.2.2. Ph.Eur. 3................................................................................................................................ 8
3.2.3. NF 19 (valerian und powdered valerian)....................................................................... 8
3.4.4. NF 19 (powdered valerian extract)................................................................................. 8
4.
Methode ............................................................................................................................................ 9
4.1. Chromatographie..................................................................................................................... 9
4.2. Dünnschichtchromatographie (DC) ..................................................................................... 9
4.3. HPTLC......................................................................................................................................... 10
4.4. Einflussfaktoren in der HPTLC ................................................................................................. 11
4.4.1. Stationäre Phase .............................................................................................................. 11
4.4.2. Mobile Phase..................................................................................................................... 11
4.4.3. Gasphase .......................................................................................................................... 11
4.4.4. Luftfeuchtigkeit ................................................................................................................. 12
4.4.5. Kammertyp........................................................................................................................ 12
4.4.6. Probenaufbereitung und Probenauftragung ............................................................. 12
5.
Material und Methoden................................................................................................................ 13
5.1. verwendete Geräte ............................................................................................................... 13
5.1.1. Extraktion ........................................................................................................................... 13
5.1.2. Auftragen .......................................................................................................................... 13
5.1.2. Entwickeln.......................................................................................................................... 13
5.1.3. Derivatisieren..................................................................................................................... 14
5.1.4. Auswertung ....................................................................................................................... 15
5.2. HPTLC-Platten........................................................................................................................... 16
5.3. Reagenzien .............................................................................................................................. 17
5.3.1. Lösungsmittel..................................................................................................................... 17
5.3.2. Reagenzien zur Detektion............................................................................................... 17
5.3.3. Referenzsubstanzen ......................................................................................................... 18
5.3.4. Untersuchungsmaterial ................................................................................................... 19
5.4. Extraktion .................................................................................................................................. 19
5.5. optimierte SOP zur Entwicklung der HPTLC-Platten für Fingerprint-Auswertung........... 21
3
HPTLC Baldrian
6.
A. Schmid
Resultate...........................................................................................................................................23
6.1. Laufmittel ..................................................................................................................................23
6.1.1. Vorversuche.......................................................................................................................23
6.1.2. Optimierung.......................................................................................................................26
6.2. Kammertyp ...............................................................................................................................29
6.3. Derivatisierung..........................................................................................................................30
6.3.1. Für Aufnahmen im sichtbaren Licht...............................................................................30
6.3.2. Für Aufnahmen im UV-Bereich .......................................................................................32
6.4. Aufnahme.................................................................................................................................34
6.4.1. Plattenposition...................................................................................................................34
6.4.2. Bildfarbe .............................................................................................................................34
6.5. Auswertung...............................................................................................................................35
6.5.1. Videosystem: Test auf Reproduzierbarkeit ...................................................................35
6.5.2. Reproduzierbarkeit des DC-Systems..............................................................................37
6.5.3. Konsistenz des Fingerprintbereiches über die Zeit ......................................................39
7.
Diskussion..........................................................................................................................................42
8.
Referenzen .......................................................................................................................................43
9.
Dank..................................................................................................................................................43
10. Anhang .............................................................................................................................................43
Anhang 1..........................................................................................................................................44
Anhang 2..........................................................................................................................................45
Anhang 3..........................................................................................................................................46
Anhang 4..........................................................................................................................................47
Anhang 5..........................................................................................................................................48
4
A. Schmid
HPTLC Baldrian
1. Zusammenfassung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war herauszufinden, ob mittels HPTLC-Fingerprintanalyse die
Stabilität von Baldrian-Trockenextrakten überprüft werden kann. Zu diesem Zweck musste ein
stabiles und robustes DC-System basierend auf instrumenteller HPTLC entwickelt werden.
Da sich die Methoden der Pharmakopöen als nicht robust erwiesen, wurde ein eigenes
Laufmittelsystem
bestehend
aus
Chloroform
und
Ethylacetat
entwickelt.
Um
die
Detektierbarkeit der polaren Hydroxyvalerensäure zu garantieren wurde dem Laufmittel
Propanol beigefügt. Für optimale Trennung der Substanzen wurden die eingesetzten Extrakte
bandenförmig auf die HPTLC-Platten (Silicagel 60 F254; Merck) gesprüht. Diese wurden in
Doppeltrogkammern mit Kammersättigung entwickelt. Als Referenz- bzw. Markersubstanzen
wurden drei Valerensäuren eingesetzt.
Die Stabilitätsprüfungen wurde mit Chloroform-Ethylacetat-Propanol (6:4:0,4) als Laufmittel
durchgeführt. Die Chromatogramme wurden durch Tauchen in Schwefelsäure (15% in
Methanol) derivatisiert. Dieses System ist in Bezug auf Rf-Werte und Farbe der Fingerprints
reproduzierbar.
Die Chromatogramme wurden mit Videotechnologie (CAMAG VidoeStore) dokumentiert.
Die entstandenen Bilder wurde mittels Video-Densitometrie gescannt (CAMAG VideoScanSoftware) und die resultierenden Fingerprintkurven verglichen.
Die chromatographischen Resultate für drei Baldrian-Trockenextrakte auf 16 HPTLC-Platten
wurden verglichen. Die mit Video-Densitometrie ermittelten Rf-Werte wichen um weniger als
5% von einander ab. Die Fingerprints waren von Platte zu Platte reproduzierbar. Diese
Resultate lassen den Schluss zu, dass sich das System zur qualitativen Stabilitätsprüfung von
Baldrian-Trockenextrakte voraussichtlich eignet.
2. Aufgabenstellung
Die Dünnschichtchromatographie hat ihren festen Platz in der Analytik pflanzlicher
Arzneimittel, insbesondere in der qualitativen Prüfung. Bisher war jedoch die Dokumentation
ein grosser Schwachpunkt des Verfahrens, da es mit photographischen Techniken sehr
schwierig ist, über die Zeit konstante Bilder zu erhalten, auch wenn solche von Auge
wahrgenommen werden. Mit der Video-Technologie besteht die Voraussetzung, dass dies
geändert
werden
kann.
Dazu
fehlen
allerdings
die
Belege.
Am
Beispiel
von
Baldrianextrakten soll geprüft werden, ob das vorliegende System (CAMAG VideoStore)
benützt werden kann, um anhand von Fingerprintchromatogrammen die Qualität von
Extrakten über die Zeit zu dokumentieren. Dazu sind stabile und reproduzierbare DCMethoden unerlässlich. Die meisten Methoden insbesondere jene der Arzneibücher sind
diesbezüglich nicht optimiert. Gelingt dies, könnte in Zukunft die DC vermehrt für
Stabilitätsprüfungen eingesetzt werden. Regelmässige Messungen sind miteinander zu
vergleichen und die Aussagen zu bewerten.
5
HPTLC Baldrian
A. Schmid
3. Einleitung
3.1. Baldrian
Die heute wohl bekannteste Wirkung von Baldrian (Valeriana officinalis L., s.l.; Abbildung 1) –
die Sedation – ist noch gar nicht so lange etabliert (seit dem 18. Jahrhundert). Früher wurden
der Baldrianwurzel (d.h. eigentlich allen unterirdischen Organen der Pflanze) vor allem
spasmolytische, diuretische und analgetische Eigenschaften nachgesagt (Bodesheim 1996).
Baldrian
ist
von
der
ehemaligen
Kommission
E
mit
den
Anwendungsgebieten
Unruhezustände, sowie nervös bedingte Einschlafstörungen positiv monographiert worden.
Ebenso existiert eine Monographie der ESCOP (therapeutic indications: tenseness,
restlessness and irritability and difficulty in falling asleep).
Bis heute ist, trotz intensiver Forschung nicht klar, welches der aktive Inhaltsstoff ist bzw.
welches die aktiven Inhaltsstoffe sind. Es liegt mit der Baldrianwurzel also ein eigentliches
Phytopharmakon vor, bei welchem die ganze Mischung der Inhaltsstoffe für die Wirkung
verantwortlich ist. (Upton 1999)
Die Pflanze gehört zu der Familie der Valerianaceae, welche einige Unterfamilien und
diverse Species beinhaltet.
Abbildung 1: historische Abbildungen von Baldrian
In der europäischen Pharmakopöe (Ph. Eur. 3) wird die Wurzel von V. officinalis
monographiert. Die schweizerische Pharmakopöe (Ph. Helv. 8) kennt dazu noch die
6
A. Schmid
HPTLC Baldrian
Baldriantinktur, welche durch Perkolation der pulverisierten Baldrianwurzel mit etwa 70%
Ethanol (750 g EtOH 96% + 250 g H2O) erhalten wird.
Im NF 19 (National Formulary, USA) wird Baldrian als „Valerian“ (unterirdische Teile der
Pflanze) und „Powdered valerian“ monographiert. Überdies existiert eine Monographie für
„Powdered valerian extract“.
Inhaltsstoffe sind eine ganze Anzahl bekannt:
•
Valerensäuren
H
O
H
O
COOH
HO
H
COOH
COOH
Acetoxyvalerensäure
Valerensäure
H
•
Valepotriate (0,5 – 2 %) wie Valtrat, Didrovaltrat
•
Ätherisches Öl (hauptsächlich Ester des Borneol)
•
Alkaloide, Lignane
Hydroxyvalerensäure
Die Valerensäuren sind spezifisch für Valeriana officinalis (Hänsel und Schulz 1982) und in der
Wurzel in adäquaten Mengen (0,05 – 0,9%; Bos 1997) vorhanden, so dass sie
chromatographischen Verfahren zugänglich sind. Aus
Markersubstanzen
beliebt;
sie
werden
deshalb
diesem Grund sind sie als
auch
zur
Standardisierung
von
Baldrianzubereitungen herangezogen.
3.2. Bekannte (HP)TLC Verfahren für Baldrian
3.2.1. Ph.Helv. 8
Die Tinktur wird eingeengt und mit Kaliumhydroxid-Lösung versetzt. Diese Mischung wird mit
Dichlormethan extrahiert. Die wässrige Phase wird erwärmt, wieder abgekühlt, anschliessend
angesäuert und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat
getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in wenig
Dichlormethan aufgenommen.
Die Chromatographie erfolgt über eine Strecke von 10 cm mit einer Mischung aus 30 Teilen
Ethylacetat und 70 Teilen Hexan. Nach dem Verdunsten der mobilen Phase wird mit
Anisaldehyd–Reagenz besprüht und im Tageslicht ausgewertet.
Als Referenzsubstanzen werden Juglon R50 und Fluorescein R50 eingesetzt. Das Juglon ergibt
nach der Derivatisierung eine dunkelviolette Bande, welche etwas oberhalb der violetten
Bande der Valerensäure liegt; das Fluorescein wird bei der Derivatisierung gelb und ist etwa
auf der selben Höhe wie die blaue Bande der Hydroxyvalerensäure.
7
HPTLC Baldrian
A. Schmid
3.2.2. Ph.Eur. 3
Die Droge wird pulverisiert und in Methanol aufgeschlämmt. Während 15 Minuten wird die
Mischung geschüttelt und anschliessend filtriert. Das Filtrat wird eingeengt und mit
Kaliumhydroxid-Lösung versetzt. Mit Dichlormethan wird extrahiert, die wässrige Phase kurz
erwärmt und mit verdünnter Salzsäure angesäuert. Die wässrige Phase wird nochmals mit
Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden anschliessend vereinigt,
getrocknet, eingedampft und der Rückstand in wenig Dichlormethan aufgenommen.
Die Chromatographie erfolgt über eine Strecke von 10 cm mit einer Mischung aus 0,5 Teilen
Essigsäure, 35 Teilen Ethylacetat und 65 Teilen Hexan.
Zur Detektion wird mit Anisaldehyd-Reagens besprüht. Die Flecken entwickeln sich während
5 bis 10 Minuten beim Heizen auf etwa 105° C.
Als Referenzsubstanzen werden Sudanrot G R und Fluorescein R eingesetzt. Nach der
Derivatisierung ergibt das Sudanrot auf der Höhe der Valerensäure (violett) eine rote Bande
und das Fluorescein ergibt auf der Höhe der Hydroxyvalerensäure (violettblau) eine gelbe
Zone.
3.2.3. NF 19 (valerian und powdered valerian)
Die Droge wird pulverisiert – die pulverisierte Droge kann direkt eingesetzt werden - und in
Dichlormethan aufgeschlämmt. Während 5 Minuten wird immer wieder umgeschüttelt und
anschliessend filtriert. Das Filter wird mit Dichlormethan gewaschen und die Waschflüssigkeit
mit dem Filtrat vereinigt. Die Lösung wird eingedampft und der Rückstand erneut in wenig
Dichlormethan aufgenommen.
Die Chromatographie erfolgt zweimal über eine Laufstrecke von 10 cm mit einer Mischung
aus 75 Teilen Toluol und 25 Teilen Ethylacetat. Die Platte wird an der Luft getrocknet und
anschliessend mit einer Mischung aus 8 Teilen Salzsäure und 2 Teilen Essigsäure besprüht.
Nach dem Heizen während 10 Minuten bei 110° C wird die Platte im sichtbaren Licht
ausgewertet.
Als Referenzsubstanz wird USP powdered valerian RS eingesetzt; diese wird gleich vorbereitet
wie die Wurzel.
Es entsteht eine blaue bis schwarzblaue Zone von Valtrat und Isovaltrat bei einem Rf-Wert
von etwa 0,75, eine hell- bis dunkelbraune Zone von Didrovaltrat (Rf ∼ 0,65) und eine blaue
bis schwarzblaue Zone von Acevaltrat (Rf ∼ 0,55).
3.4.4. NF 19 (powdered valerian extract)
Wenig Extrakt wird in Wasser gelöst, mit Kaliumhydroxid-Lösung versetzt und mit
Dichlormethan extrahiert. Die wässrige Phase wird erwärmt, abgekühlt, mit Salzsäure
angesäuert und wieder mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird über
Natriumsulfat
getrocknet
Dichlormethan aufgelöst.
8
und
zur
Trockne
eingedampft.
Der
Rückstand
wird
in
A. Schmid
HPTLC Baldrian
Die Chromatographie erfolgt mit einer Mischung aus 65 Teilen Hexan, 35 Teilen Ethylacetat
und 0,5 Teilen Essigsäure. Das lufttrockene Chromatogramm wird mit Anisaldehyd-Lösung
besprüht und im Ofen bei 105° C geheizt.
Als Referenzsubstanzen werden USP Fluorescein RS und USP Valerenic Acid RS eingesetzt.
Die Valerensäure ergibt einen violetten Fleck bei einem Rf-Wert von etwa 0,4; die
Hydroxyvalerensäure ergibt einen blauvioletten Fleck bei Rf 0,12, welcher nahe dem gelben
Fleck von Fluorescein bei Rf 0,10 sein muss.
4. Methode
4.1. Chromatographie
Die Chromatographie wurde zu Beginn des 20. Jahrhunderts entwickelt. Wie es schon der
Name (χρωµα = Farbe; γραφειν = (be)schreiben) sagt, hatte sie ihren Ursprung bei der
Trennung von Farbstoffgemischen. Eine Trennung ist eigentlich eine Verteilung zwischen zwei
Phasen.
Als Beispiel könnte die Trennung eines Gemischs aus Eisenspänen, Holzspänen und Sand
dienen. Die Eisenspäne lassen sich beispielsweise mit einem Magneten entfernen; bei
Zugabe von Wasser können die Holzspäne, welche schwimmen, vom Sand getrennt
werden. Grundsätzlich lassen sich alle Gemische unter Ausnutzung der unterschiedlichen
Eigenschaften ihrer Komponenten trennen. In der Chromatographie wird zwischen einer
mobilen und einer stationären Phase verteilt.
Zu Beginn wurde vor allem über Säulen, welche mit der stationären Phase, z.B. Kieselgel,
gefüllt waren, getrennt. Mit unterschiedlichen Laufmitteln wurden die Substanzgemische
nach und nach in ihre Komponenten aufgetrennt. Dabei spielt das Gleichgewicht der
Verteilung zwischen der festen, stationären und der mobilen, flüssigen Phase die wesentliche
Rolle. Je nach Affinität einer Komponente zur einen oder anderen Phase (stationär / mobil)
wird sie schneller, oder langsamer die Säule wieder verlassen.
Die Technik der Trennung wurde sukzessive verbessert und führte zu effizienteren Systemen.
Einerseits führte das zur heute vielfältig eingesetzten HPLC (High Performance Liquid
Chromatography), und anderseits entwickelte sich daraus auch die Dünnschichtchromatographie; heute wird in diesem Zusammenhang auch von Planarchromatographie
gesprochen.
4.2. Dünnschichtchromatographie (DC)
Die einfachste Form der Planarchromatographie ist die Papierchromatographie, welche als
Trägermaterial für die stationäre Phase (Wasser) ein Fliesspapier benötigt und als mobile
Phase, in den meisten Fällen, wässrige Lösungen. Die Papierchromatographie hat aber keine
praktische Bedeutung mehr.
9
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Eine wesentlich konstantere und bessere Trennung ergibt sich, wenn Kieselgel in einer
dünnen Schicht auf eine Platte aus Aluminium oder Glas aufgebracht wird. Mit solchen
Platten lassen sich Substanzen ebenso gut trennen wie mit einer Säule.
Ein grosser Vorteil der DC ist die Möglichkeit Proben und Standards gleichzeitig und unter
den selben Bedingungen trennen zu können; man erhält dabei „mehrdimensionale“
Ergebnisse (z.B.: Platten lassen sich mehrfach detektieren; Konzentrationen können optisch
über die „Dicke“ der Banden abgeschätzt werden; nach der Detektion können Farben
helfen die Substanzen zu identifizieren). DC-Systeme lassen sich sehr gezielt auf einzelne
Komponenten optimieren. Ein Nachteil der DC ist ihre Empfindlichkeit auf Umwelteinflüsse,
da es sich um ein offenes System handelt.
Die Dünnschichtchromatographie wird eher in der qualitativen Analytik eingesetzt, während
die Säulen eher bei präparativen Ansätzen verwendet werden. Bestrebungen die
Dünnschichtchromatographie auch in der quantitativen Analytik einzusetzen, führten zu
verbesserten Schichten, welche eine bessere Reproduzierbarkeit der Resultate erlauben.
4.3. HPTLC
Die
HPTLC
(High
Performance
Dünnschichtchromatographie)
ist
Thin
eine
Layer
Chromatography;
Weiterentwicklung
der
Hochleistungsherkömmlichen
Dünnschichtchromatographie.
Der Hauptunterschied ist eine verbesserte stationäre Phase. Während in der konventionellen
Dünnschichtchromatographie Kieselgel mit Korngrössen im Bereich von 10 – 15 µm
verwendet wird, sind die Korngrössen in der HPTLC kleiner (5 – 7 µm) und die
Korngrössenverteilung ist wesentlich enger (vergleiche Tabelle 1). Das hat zur Folge, dass die
Trennleistung verbessert wird und die Trennstrecke verkürzt werden kann.
Tabelle 1: Unterschiede zwischen DC und HPTLC (CAMAG-Methodenentwicklung)
Mittlere Korngrösse:
Korngrössenverteilung:
Schichtdicke:
Probenzahl:
Laufstrecke:
Entwicklungsdauer:
LM-Verbrauch:
Detektionsgrenze, Abs.:
Fluor.:
10
DC
HPTLC
10 - 15 µm
weit
250 µm
max. 12
100 - 150 mm
30 - 200 min
50 ml
100 - 1000 ng
1 - 100 ng
5 - 7 µm
eng
100, 200 µm
36 - 72
30 - 50 mm
3 - 20 min
5 - 10 ml
10 - 100 ng
0,1 - 10 ng
A. Schmid
HPTLC Baldrian
4.4. Einflussfaktoren in der HPTLC
Stationäre Phase
Laufmittel ≠ mobile Phase
Gasphase
Luftfeuchtigkeit
Kammertyp
Probenaufbereitung und Probenauftragung
4.4.1. Stationäre Phase
In 90 % der Fälle wird Kieselgel als Trennmaterial eingesetzt. Mit Kieselgel hat man am
meisten Erfahrung und der grösste Teil der Anwendungen lässt sich damit zufriedenstellend
bearbeiten.
Auch andere Materialien, insbesondere chemisch gebundene Phasen (RP, Diol, CN, NH2)
sowie seltener Cellulose und Aluminiumoxid
werden zur Beschichtung der Platten
verwendet.
4.4.2. Mobile Phase
Die mobile Phase dient dazu die zu trennenden Substanzen über die stationäre Phase zu
transportieren. Sie entsteht aus dem Laufmittel zu Beginn der Chromatographie. Die
Bestandteile
des
Laufmittels
haben
je
andere
Dampfdrucke
und
können
selbst
chromatographischen Effekten unterliegen und sich auf der Schicht auftrennen (z.B. βFronten). Zudem kann die Kammersättigung das Laufmittel verändern.
Laufmittel können, ja müssen für jedes Trennproblem neu entwickelt und optimiert werden.
Es ist sehr darauf zu achten, dass die Zusammensetzung nicht zu komplex ist und die
benötigten Volumina – wenn nur kleine Mengen von mobiler Phase hergestellt werden nicht zu klein sind (→ Reproduzierbarkeit).
4.4.3. Gasphase
Die Gasphase, zusätzlich zu stationärer und mobiler Phase, ist eine Spezialität der
Dünnschichtchromatographie. In der DC-Kammer befindet sich um das System aus
stationärer und mobiler Phase ein Gasraum. Dieser Raum ist natürlicherweise mit Gas gefüllt.
Ein Teil davon stammt aus der mobilen Phase. Die so entstehende Gasphase kann die
Trennung stark beeinflussen.
Mittels
Kammersättigung
oder
anderer
Kammergeometrie
(ausgehend
von
der
herkömmlichen Flachbodenkammer) kann die Gasphase einigermassen in den Griff
bekommen werden. Steuerbar ist die Gasphase aber nie!
11
HPTLC Baldrian
A. Schmid
4.4.4. Luftfeuchtigkeit
Diese wetterabhängige Komponente beeinflusst die Gasphase sehr und auch die Aktivität
der stationären Phase wird durch sie verändert. Die Effekte sind zum Teil sehr ausgeprägt.
(Abbildung 2)
Die Abbildung bezieht sich auf eine Entwicklung in einer ungesättigten Sandwichkammer als Vergleich. Es ist als
Referenz eine eher lipophile Substanz mit einem Rf-Wert von etwa 0.5, bei 50% Luftfeuchtigkeit und 20° C,
angenommen.
In der Normalkammer sinken bei Konditionierung der Platte die Rf-Werte sehr stark, sind aber höher wenn die
Kammer völlig ungesättigt ist.
Bei hoher Luftfeuchtigkeit ist der Wasseranteil in der Luft hoch und entsprechend ist auch der Anteil an
Wasserdampf in der Gasphase hoch. Da das Wasser extrem polar ist, werden die Rf-Werte stark erhöht. Der Effekt
ist bei sinkender Luftfeuchtigkeit weit weniger stark ausgeprägt (die Werte sinken).
Temperaturunterschiede haben bei der Entwicklung keine grossen Auswirkungen auf das Chromatogramm.
Auch der Wechsel zwischen verschiedenen Kieselgelqualitäten ist nicht von grosser Bedeutung.
1
gesättigte
0.9
80% r.F.
N-Kammer
ungesättigte
0.8
Normalkammer
normale
0.7
Entwicklung
Durchlauf35o
0.6
S-Kammer
C
entwicklung
Vorbedampfung
50% r.F.
0.5
0.4
Vergleich
Andere Kieselgel-
0.3
o
10 C
marken
20% r.F.
0.2
Abbildung 2: Einflussfaktoren auf die Rf-Werte in der HPTLC (CAMAG-Methodenentwicklung; nach Geiss)
4.4.5. Kammertyp
Die
unterschiedlichen
Entwicklungskammern
(Flachboden,
Doppeltrog,
Horizontal,
automatisch) ergeben - je nach Anwendung - unterschiedliche Resultate. Das Laufmittel
muss gegebenenfalls an die andere Kammergeometrie angepasst werden, wenn gleiche
Resultate erwartet werden.
4.4.6. Probenaufbereitung und Probenauftragung
Die Probenaufbereitung ist in der HPTLC im Allgemeinen nicht sehr anspruchsvoll, da die
Proben meist direkt oder aber verdünnt aufgetragen werden können.
12
A. Schmid
HPTLC Baldrian
Für die Auftragung wird zwischen punktförmiger Kontaktauftragung und strichförmigem
Aufsprühen unterschieden.
Die punktförmige Auftragung eignet sich nicht für grössere Substanzmengen. Die
strichförmige Auftragung ergibt schmalere Banden, da das Lösungsmittel im Vergleich zur
punktförmigen Auftragung schneller verdunstet.
5. Material und Methoden
5.1. verwendete Geräte
5.1.1. Extraktion
Retsch Zentrifugenmühle
Schüttelmaschine (Vortex Genie)
Polytron PT 10-35 Kinematica, Littau mit PCU (power control unit)
Gartenschere, Faltenfilter, Pasteurpipetten, Falcon Tubes, Trichter, Spatel
5.1.2. Auftragen
CAMAG Nanomat (manuelles Probenauftragen mit Festvolumenkapillare)
CAMAG Linomat (strichförmiges Probenauftragen durch Aufsprüh-Technik)
CAMAG
ATS
4
(DC-Probenautomat;
vollautomatisches
Probenauftragen
rechnergesteuert, wahlweise punktförmig oder strichförmig) (Abbildung 3)
Abbildung 3: ATS 4
5.1.2. Entwickeln
CAMAG
Entwicklungstanks
(konventionelle
Chromatogramm-Entwicklung
in
Flachboden- oder Doppeltrogkammer) (Abbildung 4)
13
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Abbildung 4: Doppeltrog-Entwicklungstanks
CAMAG Horizontal-Entwicklungskammer (horizontale Entwicklung von HPTLC-Platten)
(Abbildung 5)
Abbildung 5: Horizontal-Entwicklungskammer
Automatische Entwicklungskammer (ADC) (vollautomatische ChromatogrammEntwicklung; Mikroprozessor gesteuert)
5.1.3. Derivatisieren
CAMAG Chromatogramm-Tauchvorrichtung (Abbildung 6)
Abbildung 6: Tauchvorrichtung für DC-Platten
CAMAG Laborsprüher
CAMAG Sprühkabinett
14
A. Schmid
HPTLC Baldrian
5.1.4. Auswertung
CAMAG UV-Lampen (Inspektion der Chromatogramme unter kurzwelligem oder
langwelligem UV-Licht)
CAMAG Reprostar und CAMAG VideoStore (Bilderfassung, Dokumentation und
Archivierung, gleichzeitig Vorstufe zu Video-Densitometrie) (s. Abbildung 7)
Abbildung 7: Videosystem
CAMAG VideoScan Software
5.1.4.1. Reprostar
Der Reprostar ist das Photoatelier. Dort sind die Beleuchtungseinheiten angeordnet und
dorthinein kommt die entwickelte Platte bei der Aufnahme zu liegen.
Auf Grund der zentralen Positionierung der Kamera über der Bildfläche ist es möglich,
Platten bis zu einer Grösse von 20 × 20 cm ins Bild zu bekommen.
Da aber die Beleuchtungseinheiten paarig angelegt sind und nicht alle Röhren am
selben Ort sein können ist die Ausleuchtung der Platten, je nach Lichttyp, nicht ganz
gleichmässig. Dazu trägt auch die hell lackierte Rückfläche an der Innenseite des
Reprostar bei: sie verursacht Reflexionen bei weissem Auflicht.
Damit die Platten reproduzierbar am selben Ort liegen muss mit einer Anschlagsschiene
gearbeitet
werden;
die
mitgelieferten
Plastikschablonen
eignen
sich
nicht
für
reproduzierbare Positionierung der Platten im Reprostar, weil sie sich nicht exakt auf der
Grundplatte positionieren lassen und weil sie beim Auswechseln der Platten zwischen
den Aufnahmen leicht verrutschen.
5.1.4.2. Kamera
Bei der Kamera handelt es sich um eine Hitachi HV C20A 3CCD Videokamera. Diese hat
für die Aufnahme 3 Kanäle, je einen für Rot, Blau und Grün. Die Kamera ist an einem
Stativ fest mit dem Reprostar verbunden. Einmal eingestellt, sollte die Schärfe (Distanz
Kamera-Platte) nicht mehr verändert werden. Die Aufnahme lässt sich manuell über das
Zoom (Bildausschnitt) und die Blende (Lichtmenge) beeinflussen.
Sehr praktisch wäre, wenn diese beiden Parameter elektronisch mittels Motor eingestellt
werden könnten, damit ihre Positionen wiederholt gleich eingestellt werden könnten.
15
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Eine eigene Beschriftung der Einstellringe mit Strichen für die erforderlichen Aufnahmepositionen, lässt keine hohe Reproduzierbarkeit zu.
5.1.4.3. Digitalisierkarte & Kameraeinstellungen
Mittels dieser Einstellungen lassen sich sämtliche elektronischen Kameraparameter
beeinflussen. Zu den Kameraeinstellungen gehören insbesondere der Weissabgleich, der
Schattenabgleich, die Belichtungszeit und die elektronische Schärfe.
Auch die Einstellungen der Digitalisierkarte, welche die analogen Signale der einzelnen
Farbkanäle der Kamera in ein digitales Bild umwandeln, gehören dazu. Jeder der Kanäle
kann einzeln oder alle gemeinsam den Bedürfnissen angepasst werden.
Um ein Bild aufnehmen zu können müssen der Computer und die Kamera zusammen
„kommunizieren“ können. Dazu muss erst eine Konfiguration erstellt werden. In der
VideoStore-Software sind von Beginn an Konfigurationen für UV- und VIS-Licht vorhanden.
Für die meisten Anwendungen sind diese gut. Die Bilder für diese Arbeit wurden alle mit
Standardkonfigurationen aufgenommen. Andere Einstellungen sind auch ausprobiert
worden; sie waren aber nicht wesentlich besser und wurden deshalb wieder verworfen.
5.1.4.4. VideoScan
Die Video-Densitometrie basiert auf der Analyse der einzelnen Bild-Pixel auf Farbe und
Intensität. Die Bereiche welche analysiert, bzw. gescannt werden, können im Programm
vorgegeben werden.
Das Programm erstellt auf Grund des Scanvorgangs Kurven der einzelnen Bahnen. Die
vom Programm erkannten Peaks können mit Substanznamen versehen werden.
Zusätzliche Informationen können ins Chromatogramm eingetragen werden (Raster). Das
Raster kann als Bestandteil der Methode auf weitere Platten übertragen werden und für
das Scannen weiterer gleicher Platten verwendet werden.
5.2. HPTLC-Platten
Merck HPTLC-Platten 10 × 10 cm; Kieselgel 60 F254 (Lagernummer 1.05629.)
Merck HPTLC Platten 20 × 10 cm; Kieselgel 60 F254 (Lagernummer 1.05642.)
Sämtliche HPTLC-Platten wurden uns freundlicherweise von der Firma Merck Darmstadt zu
Verfügung gestellt.
Ab Platte 130 wurden alle verwendeten Platten vorgewaschen, d.h. sie wurden mit
Methanol über eine Distanz von 9 cm entwickelt und anschliessend im Trockenschrank bei
120° C während 2 Stunden getrocknet. Dieser Schritt wurde durchgeführt, um Störungen
durch Verunreinigungen auf der Platte auszuschliessen.
16
A. Schmid
HPTLC Baldrian
5.3. Reagenzien
5.3.1. Lösungsmittel
Für die Arbeiten wurden folgende Lösungsmittel verwendet (Tabelle 2)
Tabelle 2: verwendete Lösungsmittel
Substanz
Qualität
Hersteller
Bestellnummer verwendete Charge
Chloroform
p.A.
Merck
1.02445.
K24946745 811
Ethylacetat
p.A.
Merck
1.09623.
K 26110623 905
1-Propanol
p.A.
Merck
1.00997.
I 979697
Schwefelsäure 95 – 97% p.A.
Merck
1.00731.
K 24629731 749
Toluol
p.A.
Merck
1.08325.
K 27394425 005
Hexan
p.A.
Merck
1.04367.
I 915267 002
Essigsäure 100%
p.A.
Merck
1.00063.
034 K 12661085
Dichlormethan
p.A.
Merck
1.06050.
K 27311550 003
Methanol
p.A.
Merck
1.60009.
K 27611109 012
Ameisensäure
p.A.
Merck
1.00264.
641 K3008264
Anisaldehyd
purum
Fluka
10440
379932/1 51798
Salzsäure 37%
reinst Ph.Eur.
Riedel-de Haën
07102
92300
2-Propanol
p.A.
Merck
1.09634.
K12855634
5.3.2. Reagenzien zur Detektion
Anisaldehyd-Sprühlösung (nach Jork et al 1989)
Eine Mischung aus 85 ml Methanol und 10 ml Essigsäure wird unter Eiskühlung vorsichtig mit 8
ml konzentrierter Schwefelsäure und 0.5 ml Anisaldehyd versetzt. Diese eigentlich zum
Sprühen vorgesehene Mischung wurde zum Tauchen der Platten verwendet.
Die Reagenzlösung ist nicht stabil; das Anisaldehyd zersetzt sich unter Lichteinfluss und die
Lösung wird rot.
Anisaldehyd-Sprühlösung (verändert; nach Jork)
Das Methanol wurde durch Isopropanol ersetzt; 85 ml davon werden mit 10 ml Essigsäure
gemischt, im Kühlschrank abgekühlt (1 Stunde) und mit 8,5 ml konzentrierter Schwefelsäure
und 0,5 ml Anisaldehyd versetzt. Diese Mischung wurde zum Tauchen der Platten verwendet.
Das Reagens ist auch im Kühlschrank nicht stabil.
Salzsäure-Essigsäure-Sprühlösung (nach NF)
Zu 8 Teilen rauchender (konzentrierter) Salzsäure werden 2 Teile Essigsäure zugegeben. Diese
Lösung wurde zum Sprühen und Tauchen der Platten eingesetzt.
Die Reagenzlösung wurde im Kühlschrank aufbewahrt.
17
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Schwefelsäure 10% in Wasser zum Tauchen
90 ml Wasser wurden im Kühlschrank 1 Stunde gekühlt und anschliessend mit 10 ml
konzentrierter Schwefelsäure versetzt.
Die Lösung ist stabil.
Schwefelsäure 10% bzw. 15% in Methanol zum Tauchen
90 ml Methanol werden im Kühlschrank gekühlt und mit 10 ml konzentrierter Schwefelsäure
versetzt (bzw. 85:15 für 15%). Diese Lösung wurde zum Tauchen der Platten verwendet.
Die Lösung ist stabil, sie wurde aber trotzdem im Kühlschrank aufbewahrt.
5.3.3. Referenzsubstanzen
für Platten 021 – 059
ICC Indofine Chemical Company Inc.
Valerenic Acid w/HPLC pure; Lot. 98042913
Wurde in einer Konzentration von 0,05 mg/ml in Dichlormethan gelöst.
Valerensäure
Phytochem; Ch. 21.001-301
1,044 mg / 20 ml Dichlormethan
Analyticon; Ch. 29852
Valerensäure
Valerensäure
18
A. Schmid
HPTLC Baldrian
5.3.4. Untersuchungsmaterial
5.3.4.1. Drogen
Valerianae radix aus Anbau; Firma Vitaplant, Witterswil
Chargen:
VO 1
VO 2
VO 3
VO 4
Valerianae radix aus Anbau; Firma Zeller Söhne AG, Romanshorn
5.3.4.2. Trockenextrakte
Baldrian-Trockenextrakt (Artikelnummer 21920); Firma Zeller Söhne AG, Romanshorn
Extraktion mit 50% Methanol; DEV 4–6:1
Chargen:
011850
011930
013090
107536
800360
5.4. Extraktion
Die Wurzeln wurden zuerst von noch anhaftender Erde gereinigt und mit einer Gartenschere
in kleine Stücke geschnitten. Anschliessend wurden die Wurzelproben mit einer Retsch
Zentrifugenmühle in zwei Stufen gemahlen. Zuerst wurde ein Siebeinsatz mit einer Lochgrösse
von 2 mm verwendet; für den zweiten Zerkleinerungsschritt wurde ein solcher mit einer
Lochgrösse von 0,75 mm eingesetzt.
Die Wurzeln wurden mit Methanol in einem Verhältnis 0,1 g/ml mit einem Polytron PT 10-35
während 2 Minuten extrahiert.
Die Trockenextrakte wurden in Methanol aufgelöst. Auch hier war das Verhältnis von Extrakt
zu Lösungsmittel 0,1 g/ml. Die aufgeschlämmten Trockenextrakte wurden 2 Minuten lang mit
einem Vortex auf Stufe 10 geschüttelt.
Alle Lösungen wurden anschliessend über Faltenfilter filtriert und in dieser Form direkt für die
Analysen auf den HPTLC-Platten verwendet.
Für die Vorversuche wurde zudem eine Reihe von Lösungen mit Dichlormethan hergestellt.
Hier wurde ein Verhältnis von Wurzel bzw. Trockenextrakt zu Lösungsmittel von 0,04 g/ml
gewählt.
Für die Vorversuche standen vier verschiedene Wurzelproben und zwei verschiedene
Trockenextrakte zu Verfügung.
19
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Die Details zu den Extraktionen für die Vorversuche sind der folgenden Tabelle (Tab. 3) zu
entnehmen.
Tabelle 3: Extraktion für die Vorversuche; Chromatogramm Typ A (VO = Wurzel, Vitaplant; 107536 / 800360 =
Trockenextrakte; Zeller)
Bezeichnung
Menge [g] pro Volumen [ml]
Extraktionsmittel
Eigener Extraktname
VO 1
3,0073
30
Methanol
VO 1 M 1-3
VO 2
3,0010
30
Methanol
VO 2 M 1-3
VO 3
3,0023
30
Methanol
VO 3 M 1-3
VO 4
3,0019
30
Methanol
VO 4 M 1-3
VO 1
1,1994
30
Dichlormethan
VO 1 D 1-3
VO 2
1,1995
30
Dichlormethan
VO 2 D 1-3
VO 3
1,2018
30
Dichlormethan
VO 3 D 1-3
VO 4
1,1998
30
Dichlormethan
VO 4 D 1-3
107536
2,5031
25
Methanol
VT 1 M 1-3
800360
2,5003
25
Methanol
VT 2 M 1-3
107536
0,9997
25
Dichlormethan
VT 1 D 1-3
800360
1,0016
25
Dichlormethan
VT 2 D 1-3
Für die weiteren Versuche und die Stabilitätsuntersuchungen wurden 3 BaldrianTrockenextrakte der Firma Zeller und eine Baldrian-Wurzel als Referenz verglichen.
Die Extraktion erfolgte nach dem gleichen Prinzip wie für die Vorversuche, jedoch wurde die
Wurzel - ausser für die zweite Probenreihe - nicht mit dem Polytron extrahiert, sondern mit
dem Vortex während 5 Minuten geschüttelt.
Die eingesetzten Mengen sind der nachfolgenden Tabelle (Tab. 4) zu entnehmen.
Tabelle 4: Extraktionen für die Hauptversuche; Chromatogramm Typ B; (011850 / 011930 / 013090 =
Trockenextrakte; * = Extraktion mit Polytron (5 min.))
Bezeichnung
Menge [g] pro Volumen [ml]
Extraktionsmittel
Eigener Extraktname
011850
3,03
30
Methanol
011850-1
011930
3,03
30
Methanol
011930-1
013090
2,99
30
Methanol
013090-1
Wurzel
3,02
30
Methanol
Wurzel-1
011850
2,53
25
Methanol
011850-2
011930
2,50
25
Methanol
011930-2
013090
2,54
25
Methanol
013090-2
Wurzel
2,50
25
Methanol
Wurzel-2 *
011850
2,51
25
Methanol
011850-3
011930
2,50
25
Methanol
011930-3
013090
2,51
25
Methanol
013090-3
Wurzel
2,54
25
Methanol
Wurzel-3
011850
2,51
25
Methanol
011850-4
011930
2,52
25
Methanol
011930-4
013090
2,50
25
Methanol
013090-4
Wurzel
2,53
25
Methanol
Wurzel-4
20
A. Schmid
HPTLC Baldrian
5.5. optimierte SOP zur Entwicklung der HPTLC-Platten für FingerprintAuswertung
Platte vorwaschen:
Die HPTLC-Platte wurde mit Methanol über eine Distanz von mindestens 9 cm in einer
Doppeltrogkammer entwickelt. Anschliessend wurde sie im Trockenschrank bei 120° C
während 2 h getrocknet, in Aluminiumfolie eingewickelt und in einem leeren Exsiccator
(ohne Trocknungsmittel) abgekühlt.
Proben auftragen:
Die Proben wurden mit dem ATS 4 bandenförmig auf die vorgewaschene HPTLC-Platte
gesprüht. Von den Trockenextrakten wurden je 1500 nl, vom Wurzelextrakt 1000 nl und
von der Mischung der Referenzen 5000 nl aufgesprüht. (Typ B; Methode stabVOEa;
Anhang 1)
Platte entwickeln:
In den einen Trog der Doppeltrogkammer wurde ein zugeschnittenes Fliesspapier (∼ 10
× 10 cm) gestellt und mit 10 ml Laufmittel (Chloroform:Ethylacetat:Propanol 6:4:0.4)
befeuchtet. Durch Kippen der Kammer wurden die Laufmittelvolumina in den beiden
Trögen ausgeglichen und die Kammer für 10’ geschlossen stehen gelassen.
Anschliessend wurde die beladene HPTLC-Platte mit der Schicht zum Fliesspapier im
gegenüberliegenden Trog positioniert und nach 5,5 cm Laufsstrecke (gekennzeichnet)
wieder herausgenommen. Die entwickelte Platte wurden mit dem Föhn getrocknet bis
das Laufmittel verdampft war.
UV-Bilder aufnehmen:
Die entwickelte HPTLC-Platte wurde mit dem CAMAG VideoStore im UV bei 254 nm
und bei 366 nm „fotografiert“ (Einstellungen UV 254 nm: Anhang 2; Einstellungen UV 366
nm: Anhang 3).
Platte derivatisieren:
Die Derivatisierung wurde durch Tauchen der entwickelten HPTLC-Platte in 15%
Schwefelsäure in Methanol erreicht. Mit dem CAMAG Chromatogram Immersion
Device III wurde, bei einer Geschwindigkeit 1 und einer Verweilzeit von 0, die Platte
getaucht. Die Platte wurde anschliessend unten mit Haushaltpapier abgewischt – um
das Aufsteigen der methanolischen Lösung zu vermeiden - und auch die Rückseite
wurde gereinigt. Nach dem Verdampfen des Methanol an der Luft wurde die Platte in
einem auf 120° C vorgeheizten Trockenschrank während 10’ geheizt und vor den
Aufnahmen etwa 10’ abgekühlt.
VIS-Bilder aufnehmen:
Die Platte wurden auf einer Opalglasplatte mit Anschlagsschiene positioniert; das
Zoom wurde so eingestellt, dass die ganze Platte (10 × 10 cm) das Bild ausfüllte. Die
Blende wurde jeweils auf die, an der Kamera angezeichneten, Positionen für das
entsprechende Bild gedreht. Mit der Bildakkumulationsfunktion (10’’) wurde das
elektronische Rauschen eliminiert.
21
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Die derivatisierte HPTLC-Platte wurde in sichtbarem Auf-, Durch- und kombiniertem Aufund Durchlicht mit dem CAMAG VideoStore aufgenommen. (Einstellungen Anhang 4)
Auswertung:
Mit der CAMAG VideoScan® Software wurden anschliessend die Bilder der Platte
ausgewertet und verglichen. (Einstellungen: Anhang 5)
22
A. Schmid
HPTLC Baldrian
6. Resultate
Die Auftragung für die im folgenden abgebildeten Chromatogramme erfolgte auf zwei
Arten (von links nach rechts):
Typ A:
Wurzel VO 1
Wurzel VO 2
Wurzel VO 3
Wurzel VO 4
Referenzen
Trockenextrakt 107536
Typ B:
Referenzen
Wurzel Zeller
6.1. Laufmittel
6.1.1. Vorversuche
Die ersten Platten wurden zur Ermittlung der benötigten Auftragemenge (Wurzelextrakt und
aufgelöster Trockenextrakt) mit den Pharmakopöe-Laufmitteln durchgeführt, wobei die
Extraktion nicht nach den Methoden der einzelnen Pharmakopöen durchgeführt wurde,
sondern wie im Kapitel Extraktion (5.4.) beschrieben. Von den methanolischen Extrakten
wurden für die Vorversuche jeweils 2 µl aufgetragen, von den Dichlormethan-Extrakten 5 µl.
Die in den Pharmakopöen vorgesehenen Referenzsubstanzen wurden nicht mitaufgetragen;
an ihrer Stelle standen jedoch Referenzsubstanzen der einzelnen Valerensäuren zur
Verfügung.
Abbildung 8: Resultat nach NF (Typ B)
Abbildung 9: Resultat nach Ph.Helv. 8 (Typ B)
23
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Abbildung 10: Resultat nach Ph.Eur. 3 (Typ B)
Da die ersten Resultate nicht befriedigten – der Rf-Wert der Hydroxyvalerensäure ist zu klein
bei den Methoden nach NF (Abb. 8) und Ph.Helv. (Abb. 9); das Laufmittel bildet eine β-Front
auf der Höhe der Acetoxyvalerensäure bei der Methode nach Ph.Eur. (Abb. 10) - wurde
nach dem Schema zur Laufmittelentwicklung der Firma CAMAG (Abbildung 11) ein eigenes
Laufmittelsystem entwickelt.
Abbildung 11: Schema zur Laufmittelentwicklung (CAMAG-Methodenentwicklung)
In der Abbildung 11 sind bei den reinen Fliesmitteln die Selektivitätsklassen mit angegeben.
Diese sind auf Basis einiger physiko-chemischen Eigenschaften der Lösungsmittel ermittelt
worden und lassen sich in einem Dreieck anschaulich darstellen (Abbildung 12)
24
A. Schmid
HPTLC Baldrian
Abbildung 12: Selektivitätsdreieck für Fliessmittel (nach Snyder 1978)
Beispiele für Substanzen in den einzelnen Selektivitätsklassen finden sich in der folgenden
Tabelle (Tab. 5):
Tabelle 5: Beispiele für Substanzen in den einzelnen Selektivitätsklassen (nach Snyder 1978)
I
aliphastische Ether, Trialkylamine, Trialkylphosphate
II
aliphatische Alkohole
III
Tetrahydrofuran, Pyridin und Derivate, Amide (≠ Formamid)
IV
Benzylakohol, Formamid, Essigsäure
V
Dichlormethan, Ethylenchlorid
VI
aliphatische Ketone und Ester, Acetonitril
VII
aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte aromatische Kohlenwasserstoffe, Nitrobenzol, Toluol
VIII
Wasser, Chloroform, Fluoralkohole
Von den reinen Laufmitteln zeigten Dichlormethan, Ethylacetat, Toluol und Chloroform
spontan eine Trennung (Abbildung 13)
Abbildung 13: reine Laufmittel (v.l.n.r.: Dichlormethan, Ethylacetat, Toluol, Chloroform)
25
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Mit Methanol wurde die Lösungsmittelstärke der auf Chloroform, Dichlormethan und Toluol
basierenden mobilen Phase erhöht; desgleichen wurde mit Hexan die Lösungsmittelstärke
von der auf Ethylacetat basierenden mobilen Phase herabgesetzt. Da die Resultate mit
Methanol nicht überzeugend waren, wurde versucht, den gleichen Effekt mit Ethylacetat –
welches selbst eine zu hohe Lösungsmittelstärke hat - zu erreichen. (Abbildung 14)
Abbildung 14: modifizierte Laufmittel (v.l.n.r.: CH2Cl2:EtOAc 8:2; EtOAc:Hex 8:2; Toluol:EtOAc 8:2; CHCl3:EtOAc 9:1;
mit dem grünen Pfeil ist jeweils die Valerensäure markiert)
6.1.2. Optimierung
Die oben gezeigten Mischungen wurden in ihren Verhältnissen weiter verändert.
Dichlormethan erwies sich als ungeeignet, da es als Laufmittel aufgrund seiner
Leichflüchtigkeit (Siedepunkt 35° C) selten waagerechte Fronten erzeugte.
Die Verhältnisse von Toluol zu Ethylacetat, Chloroform zu Ethylacetat und Ethylacetat zu
Hexan wurden weiter verändert und ausgetestet. Auch die Zugabe von Säure (zweimal
Ameisensäure; dann nur noch Essigsäure) wurde in die Evaluierung einbezogen, was dem
Schema entsprechend bereits die dritte Stufe darstellt. Immer wieder wurde, vor allem bei
auf Toluol basierenden Laufmitteln, ein „fronting“ (Dächerbildung) beobachtet. Dies konnte
durch Reduktion der aufgesprühten Extraktmenge einerseits und anderseits durch Sprühen
längerer Banden vermindert werden.
Ziel war es zudem, ein möglichst einfaches Laufmittel, welches reproduzierbar hergestellt
werden kann, zu finden.
26
A. Schmid
HPTLC Baldrian
Zum Schluss resultierte eine Mischung aus 6 Teilen Chloroform und 4 Teilen Ethylacetat als
Laufmittel der Wahl. (Abbildung 15)
Abbildung 15: Musterplatte (Typ A); entwickelt mit CHCl3:EtOAc 6:4 in einer gesättigten Doppeltrogkammer;
Hydroxyvalerensäure Rf-Wert um 0,05; Acetoxyvalerensäure Rf-Wert um 0,30; Valerensäure Rf-Wert um 0,42
Die Extrakte und Referenzsubstanzen sind gegenüber dem Laufmittel unempfindlich (d.h. es
findet keine Zersetzung statt), wie mit 2-D Entwicklung von Platten gezeigt werden konnte
(Abbildung 16).
Abbildung 16: 2-D Entwicklung von Platten zur Stabilitätsprüfung der zu trennenden Substanzen im Laufmittel am
Beispiel des Trockenextrakts 107536
27
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Beim Auswerten der Bilder mit VideoScan wurde entdeckt, dass die Hydroxyvalerensäure
nach der Derivatisierung häufig von den Startflecken überdeckt wurde. Mit einer Zugabe
von 4% 1-Propanol zum Laufmittel konnte das Problem reproduzierbar behoben werden.
(Abbildung 17)
Abbildung 17: Endversion des Laufmittels(CHCl3:EtOAc:PrOH 6:4:0,4); Typ B
Hydroxyvalerensäure Rf-Wert um 0,16; Acetoxyvalerensäure Rf-Wert um 0,41; Valerensäure Rf-Wert um 0,50;
Mitte: Referenzsubstanzen; rechts davon: Wurzelextrakt; andere Banden: Trockenextrakte
Auch gegenüber dem definitiven Laufmittel waren Proben und Standard inert. (Abb. 18)
Abbildung18: 2-D Entwicklung von Platten zur Stabilitätsprüfung der zu trennenden Substanzen im definitiven
Laufmittel; Trockenextrakt 011850
28
A. Schmid
HPTLC Baldrian
6.2. Kammertyp
Die Kammern, mit oder ohne Sättigung, haben Ihren Einfluss auf die Entwicklung der
Chromatogramme, wie an Hand eines Beispiels zu sehen ist.
a)
b)
c)
d)
Abbildung 19: Einfluss der Kammer auf die Trennung; Typ A (Bahnen 3 – 5)
Die verschiedenen Probelösungen in Abbildung 19 wurden alle mit dem ATS 4 aufgesprüht,
das Laufmittel war immer Chloroform:Ethylacetat 6:4, die Laufstrecke betrug 5,5 cm. Die
Entwicklung wurde wie folgt durchgeführt (v.l.n.r.):
a) Horizontalkammer; 20’ Konditionierung (auch die Kammersättigung stellt sich so ein) mit
10 ml Laufmittel; 2 ml Laufmittel für die Entwicklung
b) Doppeltrogkammer; Kammersättigung mit Fliesspapier und 5 ml Laufmittel je Trog
während 10’; kein Konditionieren der Platte;
c) Horizontalkammer in Sandwichkonfiguration (mit einer Gegenplatte); kein Konditionieren,
keine Kammersättigung; 2 ml Laufmittel.
d) Horizontalkammer, kein Konditionieren; ohne Kammersättigung; ohne Gegenplatte; mit 2
ml Laufmittel.
Es ist ersichtlich, dass Kammersättigung oder Konditionieren die Platte beeinflusst indem die
Rf-Werte kleiner ausfallen.
Leider ist die eigentlich optimale Form (Abb. 19c; man beachte die Rf-Werte und die
Trennung oberhalb der Valerensäure!) der Entwicklung – die Sandwichkonfiguration – für das
verwendete Laufmittel nicht anwendbar (die Fronten werden schräg, die Bahnen sind zu oft
verzogen), so dass auf eine andere Methode gewechselt werden musste. Die „offene“
Konfiguration (keine Sandwichplatte, keine Kammersättigung, kein Konditionieren) war von
den Rf-Werten her nicht reproduzierbar. Die gesättigte Horizontalkammer hatte vor allem
das Problem, dass die Banden sehr kleine Rf-Werte hatten, und dass daher die
Chromatogramme nicht ausgewertet werden konnten. Die unbekannte Substanz zwischen
29
HPTLC Baldrian
der
A. Schmid
und
der
Valerensäure
liess
sich
nicht
sauber
von
der
Acetoxyvalerensäure abtrennen.
Die Doppeltrogkammer ergab reproduzierbare Rf-Werte, immer gerade Fronten, selten
verzogene Banden und reproduzierbare Trennung der Substanzen. Sie wurde deshalb zur
Kammer der Wahl.
Um die Reproduzierbarkeit der Chromatogrammentwicklung zu optimieren können die
HPTLC-Platten auch mit der CAMAG ADC (Automatic developing chamber) entwickelt
werden. Ihr grösster Vorteil ist die absolut konstante Laufstrecke. Diese wird während der
Entwicklung des Chromatogramms laufend über eine Photodiode gemessen. Bei Erreichen
der gewünschten Entwicklungsdistanz wird das Laufmittel sofort entfernt.
Das erarbeitete Laufmittel eignete sich in seiner Zusammensetzung nicht für den Einsatz in
der ADC; eine Optimierung für diese Kammer wäre unerlässlich. Auf diese weitere
Möglichkeit zur Entwicklung wurde deshalb aus Kapazitätsgründen verzichtet.
6.3. Derivatisierung
6.3.1. Für Aufnahmen im sichtbaren Licht
Die Derivatisierung der Valerensäuren nach Pharmakopöe (Ph.Helv. 8; Ph.Eur. 3) wird mit
einer Anisaldehyd-Schwefelsäure-Lösung durchgeführt. Die Chromatogramme werden
dabei gefärbt, so dass sie anschliessend im sichtbaren Licht ausgewertet werden können.
Die
Substanzen
werden
oft
unterschiedlich
angefärbt
(z.B.
Valerensäure
rosa,
Hydroxyvalerensäure blauviolett) was bei ihrer Identifikation helfen kann. (Abbildung 20)
Abbildung 20: Derivatisierung nach Tauchen in der Anisaldehyd-Schwefelsäure-Sprühlösung (Typ A)
Das Verfahren ist problematisch, weil sich der Anisaldehyd an Luft und Licht zersetzt und die
Lösung somit nur für kurze Zeit im Kühlschrank haltbar ist. Ein weiterer Punkt, der gegen den
Einsatz dieses Reagens spricht, ist auch die Instabilität der Farben auf der derivatisierten
Platte. Wenn, wie das während der Arbeit im Labor oft der Fall war, die Platten nicht exakt 5
Minuten nach dem Herausnehmen aus dem Trockenschrank fotografiert werden konnten,
waren die Bilder einerseits weniger scharf und anderseits unterschiedlich gefärbt. (Abbildung
21)
30
A. Schmid
HPTLC Baldrian
Abbildung 21: Veränderung der Farbe am Licht; diese Platte wurde nach 5 und 10 Minuten photographiert,
dazwischen lag sie bei Auflicht im Reprostar. (Typ A)
Die einheitliche Färbung der Platten ist sowohl für die Aufnahme und die Auswertung
wichtig.
Da
auch
mit
allwöchentlichem
Erneuern
der
Anisaldehydlösung
keine
reproduzierbare Einheitlichkeit der Färbung erzielt werden konnte, wurde nach einer
Alternative gesucht.
In der Sprühlösung wurde Methanol durch Isopropanol ersetzt. Die kalte, frische Lösung
ergab erfolgsversprechende Resultate. Leider war aber der Anisaldehyd in der raumwarmen
Lösung sehr aktiv, so dass die ganze Platte angefärbt wurde und von den Substanzen fast
nichts mehr zu sehen war.
10% Schwefelsäure in Methanol wurde in Vereinfachung des Reagens ausprobiert
(Anisaldehyd-Reagens ohne Anisaldehyd). Die Substanzen wurden sichtbar, das Reagens
war jedoch dem Anisaldehyd-Reagens unterlegen.
Mit 10%-iger wässriger Schwefelsäure wurden die Substanzen viel besser sichtbar – im
Vergleich mit der methanolischen Lösung – jedoch wurden die Startflecken beim Tauchen in
Richtung Laufmittelfront verschoben, ein Effekt, welcher mit der methanolischen Lösung
wesentlich weniger beobachtet wurde.
Mit der Erhöhung der Konzentration an Schwefelsäure in Methanol auf 15% wurde dann eine
sehr befriedigende Lösung gefunden.
Dieses Reagens ist stabil, kann mit dem Tauchverfahren reproduzierbar auf die Platte
gebracht werden, ergibt nach 10 Minuten Heizen auf 120° C gut sichtbare Substanz-Flecken,
welche sich zwischen 2 und 20 Minuten nach dem Heizen kaum verändern, und der
Chromatogramm-Hintergrund wird immer gleich gefärbt. Zudem unterliegen die Startflecken
keinem chromatographischen Effekt. (Abbildung 22)
31
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Abbildung 22: Derivatisierung durch Tauchen in 15% Schwefelsäure in Methanol (Typ B)
6.3.2. Für Aufnahmen im UV-Bereich
Eine weitere Methode zum Sichtbarmachen der Chromatogramme stammt aus dem NF 19.
Die entwickelten Platten werden mit einer Mischung aus Salzsäure und Essigsäure (8:2)
besprüht, getrocknet, bei 120° C während 10 Minuten erhitzt und bei 366 nm betrachtet.
(Abbildung 23)
Abbildung 23: Platte nach Besprühen mit Salzsäure-Essigsäure-Reagens (Typ A)
Die Valerensäuren waren im UV (366 nm) selten so gut zu sehen, wie in Abbildung 23.
32
A. Schmid
HPTLC Baldrian
Das NF 19 schreibt im Weitern vor die Bilder auch im Weisslicht aufzunehmen; die
entstandenen Bilder waren aber weit weniger gut interpretierbar, als nach der
Derivatisierung
mit
Anisaldehyd-Reagens
oder
mit
methanolischer
Schwefelsäure.
(Abbildung 24)
Abbildung 24: Aufnahme im Weisslicht nach der Derivatisierung mit Salzsäure-Essigsäure; rechts daneben, als
Vergleich, die Platte nach Anisaldehyd-Derivatisierung. Bahnen v.l.n.r.: 1 & 6 VO 1; 2 & 5 Referenzen; 3 & 4 107536
Da das Besprühen weniger gut reproduzierbar ist, als das Tauchverfahren, wurde versucht
das Sprühen des Salzsäure-Essigsäure-Reagens durch Tauchen in demselben zu ersetzen.
Dieser Versuch misslang, weil das Reagens eine hohe Viskosität hat, und man die Säuren
durch Trocknen kaum mehr von der Platte wegbekommt; es gibt auch hier zusätzliche
chromatographische Effekte, wie das unten abgebildete Beispiel (Abbildung 25) zeigt.
Abbildung 25: chromatographischer Effekt beim Tauchen in Salzsäure-Essigsäure Reagens; die Startflecken in den
Ecken werden verschoben. (Typ A)
Ausserdem ist das Reagens extrem reizend für die Atemwege auch wenn im Abzug
gearbeitet wird.
Da die Derivatisierung mit Salzsäure-Essigsäure-Reagens nicht reproduzierbar gelang, und
keine zusätzliche Information über die Valerensäuren gewonnen werden konnte, wurde das
Verfahren nach NF nicht weiter verfolgt.
33
HPTLC Baldrian
A. Schmid
6.4. Aufnahme
6.4.1. Plattenposition
Für die reproduzierbare Position der Platte bei den UV-Lichteinstellungen und bei weissem
Auflicht existiert von der CAMAG bereits eine Metallplatte mit Anschlagswinkel. Das Problem
für die vorliegende Arbeit bestand darin, dass auch mit Durchlicht gearbeitet werden
musste und dass in Folge dessen eine Opalglasplatte mit einem Anschlagswinkel versehen
werden musste.
Dazu wurde eine Plastikschablone für das Format 10 × 10 cm
auf eine Opalglasplatte
geklebt, und auf die Schablone ein Winkelstück. Diese Grundplatte konnte im Reprostar
nicht festgeklebt werden, da andere Benutzer das Gerat auch für andere Formate
verwendeten. Das sich dadurch ergebende Spiel von etwa 2 mm in allen Richtungen
reichte aus, um die Bildposition konstant zu halten.
6.4.2. Bildfarbe
Die Einheitlichkeit der Bilder war vor allem im sichtbaren Bereich ein Problem. Für das Auge
wirkten alle Platten - nach Derivatisierung mit 15% Schwefelsäure in Methanol – gleich. Die
Kamera erkannte aber nicht immer die gleiche Farbe und Helligkeit, weil für die
unterschiedlichen Lichtverhältnisse (nur Auflicht, nur Durchlicht, kombiniertes Auf- und
Durchlicht) die Blendeneinstellungen angepasst werden mussten und diese nicht exakt
wiederholbar waren. Die Bilder wurden eher rot beim Verkleinern der Blendenöffnung, eher
blau, wenn diese vergrössert wurde.
Dass auch der Bildschirm bei der Farbausgabe mit Fehlern behaftet ist, macht die Arbeit
nicht einfacher. Es war möglich alle Bilder mit dem selben System aufzunehmen, so dass
dieser letztgenannte Faktor keine zusätzliche Fehlerquelle darstellte.
Der Einfluss unterschiedlicher Blendeneinstellung auf ein und dieselbe Platte soll an Hand der
folgenden Abbildung 26 gezeigt werden.
Abbildung 26: überbelichtetes, normales und stark unterbelichtetes Bild; Unterschiede resultierten durch
Verstellen der Blende. (Typ A)
34
A. Schmid
HPTLC Baldrian
6.5. Auswertung
6.5.1. Videosystem: Test auf Reproduzierbarkeit
Mit dem CAMAG VideoStore steht ein gutes System zur Dokumentation von DC-Platten zur
Verfügung. Bilder werden – sofern die Einstellungen unverändert sind – wirklich gleich
aufgenommen, was in einem Versuch mit dem VideoScan überprüft und bestätigt wurde.
Eine fertig entwickelte und mit Anisaldehyd-Reagens derivatisierte HPTLC-Platte, welche
schon etwas ausgebleicht war, wurde im Abstand von je 2 Minuten im Reprostar neu an der
Anschlagsschiene positioniert und mit weissem Auflicht aufgenommen. Die Bilder wurden je
vier mal unter unterschiedlichen Namen gespeichert. 4 solcher Zyklen wurden durchlaufen,
was 16 Bilder zur Folge hatte.
Erwartungsgemäss sahen die Bilder, welche nur Kopien voneinander sind, gleich aus; aber
auch die, welche nacheinander aufgenommen wurden, waren für das Auge nicht
unterscheidbar. (Abbildung 27)
Mit der CAMAG VideoScan Software wurde eine Methode zur Auswertung der ersten Platte
erstellt. Diese wurde dann für alle 16 Bilder verwendet. Die Bilder wurden gescannt und
verglichen.
Kopierte Bilder sind auch für das VideoScan Programm identisch (Abbildung 28)
Nacheinander aufgenommene Bilder unterscheiden sich durch statistisches Rauschen
(Abbildung 29)
a)
b)
c)
d)
Abbildung 27: Platte 112 aufgenommen mit weissem Auflicht, Aufnahmeabstand 2 Minuten; (a) Zeit = 0 Minuten,
b) 2 Minuten, c) 4 Minuten, d) 6 Minuten); Typ A
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HPTLC Baldrian
A. Schmid
Abbildung 28: Kurvenvergleich von 4 Bildern (Platte 112), von welchen das eine das Original, die andern nur
Kopien waren am Beispiel der 1. Bahn (Wurzel VO 1)
Abbildung 29: Kurvenvergleich der nacheinander aufgenommenen Platte 112 (Aufnahmeabstand 2 Minuten)
am Beispiel der 1. Bahn (Wurzel VO 1); alle Bahnen liefern entsprechende Ergebnisse
Nach diesem Experiment stand fest, dass die beiden Programme CAMAG VideoStore und
CAMAG VideoScan für die Reproduzierbarkeitsuntersuchungen am Baldrian-Extrakt ohne
Bedenken eingesetzt werden können.
36
A. Schmid
HPTLC Baldrian
6.5.2. Reproduzierbarkeit des DC-Systems
Das System mit dem ersten Laufmittel (Chloroform : Ethylacetat 6:4; ohne Propanol) war
hinsichtlich der Fingerprints stabil, wie sich an einem ausgewählten Beispiel zeigt.
(Abbildung 30 a-c).
a)
b)
c)
Abbildung 30: Kurvenvergleich von vier an aufeinander folgenden Tagen aufgenommenen Platten:
a)Wurzelextrakt VO 2, b) Standards, c) Trockenextrakt 800360
Das verbesserte System (mit Propanol) war ebenso reproduzierbar. Um das zu zeigen wurden
die Bilder mit dem VideoScan-Programm gescannt und verglichen. Die Abweichungen der
Rf-Werte gleicher Substanzen waren klein.
Die Abweichungen der Rf-Werte (Standardabweichung in %) über 30 Platten (in fünf
Wochen) waren für die Valerensäure und die Acetoxyvalerensäure bei 3%, diejenigen der
Hydroxyvalerensäure bei 9%. (Abbildung 31)
0,600
0,500
Rf-Wert
0,400
0,300
Valerenssäure
0,200
0,100
0,000
1
5
9
13
17
21
25
29
Plattennummer
Abbildung 31: Vergleich der Rf-Werte von Trockenextrakt 011930 über 30 Platten und 5 Wochen; die Rf-Werte
haben prozentuale Standardabweichungen von 9% (HVS), 3% (AVS) und 3% (VS).
37
HPTLC Baldrian
A. Schmid
Ein Kurvenvergleich aller 30 Bahnen konnte nicht durchgeführt und aufgenommen werden,
da mit dem VideoScan Programm nur 12 Bahnen gleichzeitig verglichen werden können.
(Abbildung 32)
Abbildung 32: Kurvenüberlagerung der ersten 12 Bahnen aus 14 Tagen (Extrakt 011930) der Platten aus Abb. 31
Wettereinflüsse wurden vor allem vor Gewittern sichtbar. Gemessen wurden Werte für
Luftfeuchtigkeit (LF) > 60% und Temperatur (T) > 28° C, gegenüber Werten von LF 52% und
T 24° C.
Der tatsächliche Einfluss der Luftfeuchtigkeit (und der Temperatur) auf die Entwicklung des
untersuchten DC-Systems kann nicht bestimmt werden; bei allen entwickelten Platten
wurden zehn unterschiedliche Temperaturen und acht verschiedene Werte für die
Luftfeuchtigkeit gemessen. Um zu statistisch vertretbaren Aussagen zu kommen, müssten für
jedes der somit 80 verschiedenen Wertepaare mindestens 10 Platten entwickelt sein... Im
Laufe der ganzen Arbeit (inklusive Entwicklung) wurden gegen 350 Platten entwickelt.
38
A. Schmid
HPTLC Baldrian
6.5.3. Konsistenz des Fingerprintbereiches über die Zeit
Kurvenvergleiche eignen sich besser als nackte Zahlen zur qualitativen Prüfung der
Beständigkeit von Extrakten. Es handelt sich dabei um sogenannte Fingerprint-Analysen, bei
der auch unbekannte Substanzen miterfasst werden (z.B. die von Auge schlecht sichtbare
Bande zwischen Valerensäure und Acetoxyvalerensäure)(Abbildung 33)
Abbildung 33: Vergleich von 5 „gleichen“ Platten über 6 Wochen; Kurvenvergleich von Trockenextrakt 013090
(Typ B)
Diese Platten wurden über einen Zeitraum von sechs Wochen mit vier verschiedenen
Extraktionen der Wurzel bzw. Auflösungen der Trockenextrakte aufgetragen und entwickelt.
Die Kurvenmaxima sind alle etwa gleich hoch und am selben Ort.
Die Extrakte sind – über diesen kurzen Zeitraum sowieso – stabil, was den Umkehrschluss
erlaubt, dass auch das DC-System stabil ist.
Von den oben gezeigten Platten sind in der folgenden Abbildung der Reihe nach die
Fingerprints der Bahnen 1 bis 4 verglichen (Abbildung 34)
Bei der hier aufgeführten Baldrianwurzel fehlt interessanterweise die Acetoxyvalerensäure.
39
HPTLC Baldrian
A. Schmid
a)
b)
c)
d)
Abbildung 34: Kurvenvergleiche von 5 „gleichen“ Platten (aus Abbildung 33); die Farben der Bildrahmen
entsprechen denjenigen der Kurven;
a) Trockenextrakt 011850, b) Trockenextrakt 011930, c) Referenzsubstanzen (Valerensäuren), d) Wurzelextrakt
Alle Extrakte zeigen über die Zeit einen qualitativ vergleichbare Fingerprint; von Auge sind
kaum Unterschiede zu beobachten, mit VideoScan zeigen sich Unterschiede vor allem in
den Peakhöhen.
Derzeit nicht interpretierbar sind die auf drei Platten festgestellten Abweichungen von der
Grundlinie nach dem Hydroxyvalerensäure-Peak.
40
A. Schmid
HPTLC Baldrian
Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit des Extraktionsverfahrens und der Stabilität der
entstehenden
Extrakte
wurden
alle
hergestellten
Proben
zusammen
mit
den
Referenzsubstanzen auf grosse (20×10 cm) HPTLC Platten aufgesprüht und nach der
Entwicklung verglichen. (Abbildung 35)
Von Auge lassen sich die verschiedenen Proben nicht unterscheiden; das VideoScan zeigt
einen weitgehend konstanten Fingerprint. Dabei fällt auf, dass sich die Bahnen in den
Randbereichen (rot, orange und schwarz, braun) von denen in der Mitte (hellblau, blau und
hellgrün, grün) unterscheiden. Dies ist möglicherweise auf die innerhalb der Platte
unterschiedliche Ausleuchtung zurückzuführen.(Abbildung 36)
Abbildung 35: Vergleich der verschiedenen Extraktionen von Trockenextrakt 011850; Bahnen (von links) 2, 5, 8
und 11 Standards; 1, 3 (16.05.00); 4, 6 (26.05.00); 7, 9 (08.06.00); 10, 12 (16.06.00)
Abbildung 36: Kurvenvergleich der Trockenextrakte aus Abbildung 35; die rote und braune Kurve stammen von
den äussersten Bahnen
Die anderen Trockenextrakte (011930 und 013090), sowie der Wurzelextrakt ergeben ein
vergleichbares Resultat.
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HPTLC Baldrian
A. Schmid
7. Diskussion
Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die in der Pflanzenanalytik oft
verwendete Dünnschichtchromatographie alle Voraussetzungen erfüllt, um auch in Zukunft
eine Bedeutung zu haben.
Mit
dem
CAMAG-Videosystem
stehen
gute
Geräte
zur
Dokumentation
der
Chromatogramme zur Verfügung. Viel einfacher als die herkömmliche Aufnahme der Bilder
mit Polaroid- oder Spiegelreflexkamera, ist ihre Aufnahme mit der Videokamera.
Die Bilder werden sofort und elektronisch verfügbar, bleichen nicht aus, lassen sich über
Datenbankfunktionen schnell wiederfinden und füllen nicht im Nu Archivschränke. Auch die
Beleuchtung ist gut steuerbar, wenn auch die Ausleuchtung der Platte nicht für alle
Lichtarten
optimal
ist.
Ein
Nachteil
ist
die
schwierige
Reproduzierbarkeit
der
Blendeneinstellung an der Kamera, so wie des Zooms. Die behelfsmässige Markierung der
gewünschten Einstellungen am Objektiv ist unerlässlich, aber nicht sehr genau.
Die erhaltenen Bilder sind GLP konform: das Original lässt sich nicht verändern. Die Bilder
können aber einfach und rasch mit Kommentaren versehen werden, das Original bleibt
vorhanden und der Datei wird ein „Child-Image“ angehängt. Jedes Bild hat etwa eine
Grösse von 2 MB, was bei der Speicherung der Bilder auf ein (kleines) Netzwerk rasch zu
dessen Überlastung führen kann.
Die Dateien haben ein sehr spezielles Format, welches von keinem anderen Programm
gelesen werden kann. Die Bilder lassen sich (für Dokumentationen) aber einfach exportieren.
Die Bilder aus dem VideoStore können, so wie sie sind, mit der VideoScan-Software
ausgewertet werden. Für die Arbeit wurde vor allem dem Vergleich der erhaltenen Kurven
grosse Aufmerksamkeit geschenkt.
Voraussetzungen zum erfolgreichen Einsatz des Systems sind stabile chromatographische
Verfahren.
Im
Allgemeinen
sind
die
in
den
zur
Verfügung
stehenden
Arzneibuchmonographien beschriebenen Verfahren, insbesondere mobile Phase und
Detektion, nicht genügend stabil. Dies hat sich am Beispiel von Baldrian ganz eindeutig
gezeigt. Mit dem hier entwickelten Verfahren konnte ein stabiles System etabliert werden. Es
basiert auf der Trennung der Valerensäuren die optisch als gleichmässig violette Banden
detektiert werden können. Im Unterschied zur HPLC entsteht bei der Auswertung der
Chromatogramme mit VideoScan ein Fingerprint, der auch andere Substanzen als die
Valerensäuren berücksichtigt. Dieser Fingerprint erwies sich in der zu Verfügung stehenden
Zeit als einigermassen stabil, so dass sich das System voraussichtlich für eine gegenüber der
HPLC erweiterte Stabilitätsprüfung von Baldrianextrakten einsetzen lässt.
42
A. Schmid
HPTLC Baldrian
8. Referenzen

Bodesheim U, 1996: Isolierung Strukturaufklärung, Analytik und Radiorezptorassays von
Alkaloiden und Lignanen aus Valeriana officinalis L. Dissertation Universität Marburg /
Lahn

Bos R, 1997: Analytical and phytochemical studies on valerian an valerian based
preparations, Dissertation Universität Groningen

CAMAG Planar Chromatographie, Katalog 2000,(TLC2000-D), CAMAG, Muttenz

CAMAG Probenautomat 4, neue Massstäbe in der Planar-Chromatographie, (ATS4-99-D),
CAMAG, Muttenz

CAMAG VideoStore/VideoScan; das CAMAG System für Dokumentation und VideoDensitometrie, (Video99-D), CAMAG, Muttenz

Hänsel R, Schulz J, 1982: Valerensäure und Valerenal als Leitstoffe das offizinellen
Baldrians: Bestimmung mittels HPTLC. Dtsch Apoth Ztg 122:215-219

Jork H, 1989 Dünnschicht-Chromatographie; Band 1a (Reagenzien und Nachweismethoden),VCH Weinheim, Basel, Cambridge, New York

Snyder LR, 1978: Classification of the Solvent Properties of Common Liquids. J Chromatogr
Sci, 16; 223-234

Upton
R,
1999:
Monograph
Valerian,
American
Herbal
Pharmacopoeia
and
Therapeutical Compendium, Santa Cruz, USA
9. Dank
Firma CAMAG Muttenz für die zur Verfügung Stellung von Arbeitsplatz und Material
Firma Zeller Söhne AG Romanshorn für Trockenextrakte, Wurzeln und Referenzsubstanzen.
Firma Merck Darmstadt (Dr. Joachim Becker) für das Sponsoring der HPTLC-Platten.
Hr. Dr. E. Reich und Hr. D. Handloser für die Betreuung in der CAMAG während der Arbeit
Hr. Prof. Dr. B. Meier (Uni Basel / Zeller, Romanshorn) für die Betreuung, Beratung und das
Korrekturlesen der Arbeit
Fr. R. Bruggisser (Uni Basel) für die Betreuung und Beratung bei Problemen
Fr. U. Dold (Uni Basel), Fr. S. Bacher (CAMAG) und Fr. E. Ledermann (CAMAG) für die gute
Zusammenarbeit
10. Anhang
1. ATS 4-Einstellung zum Besprühen der HPTLC-Platten (Reproduzierbarkeit)
2. Einstellungen VideoStore für Bilder im UV (254 nm)
3. Einstellungen VideoStore für Bilder im UV (366 nm)
4. Einstellungen VideoStore für Bilder im sichtbaren Licht (VIS)
5. Einstellungen für VideoScan
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Anhang 1
ATS 4-Einstellung zum Besprühen der HPTLC-Platten (Reproduzierbarkeit)
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Anhang 2
Einstellungen VideoStore für Bilder im UV (254 nm)
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Anhang 3
Einstellungen VideoStore für Bilder im UV (366 nm)
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HPTLC Baldrian
Anhang 4
Einstellungen VideoStore für Bilder im sichtbaren Licht (VIS)
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Anhang 5
Einstellungen für VideoScan
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