EP 09

Der Mittelwert der Licht-Retardance du rch die Spindel menschlicher Eizellen korreliert positiv mit
dem Pronuclear Score nach ICSI
EP 09
Shen Y 1,2, Stalf T 1, Mehnert C1, Tinneberg H-R1 and Eichenlaub-Ritter U2
1
Centre für In-Vitro-Ferti lisation (CIF) in der Justus-Liebig-Universität Giessen, 35392Giessen. 2 Universität Bie lefeld, Fakultät für Biologie, Gent echnologie/Mikrobiologie, 33501 Bielefeld
Einleit ung:
Material & Methoden:
Der Spindel-Apparat ist für die geregelte Verteilung der Chromosomen wä hrend der Ooge nese
verantwortl ich. Stör ungen i n Spi ndela ufba u und -funkti on könne n zu Fehler n in der
Chromosomenverteil ung und zu Aneuploi die führe n. Deme ntsprechend scheine n Oozyten, die ei ne
doppelbrec hende Spi ndel besitzen, ein besseres Entwicklungspote nzial im Vergleich zu solchen ohne
Spindel zu besitzen[1 ]. Die Doppe lbrechung (Retardance) des Lichtes im Polarisationsmikroskop korre liert
linear mit der Anza hl und Anor dnung von Mi krotubul i[2]. Deshalb könnte eine hohe Retardance und die
relative Länge der Spindel prädi ktiven Wert für die chromosomale Konstitution und Qualität und
Entwickl ungsfähigke it einer Eizelle habe n. Eine r elativ niedri ge Doppelbrec hung k önnte dage gen auf Gr und
weniger, unge ordneter Spindelfasern e her das Risik o für Fe hlverteil ung v on Chr omosomen i n Eizelle n
erhöhen und zu vermi nderter Entwickl ungskapazität des Embryos beitra gen. Zur Prüfung di eser These
wurde n Spi ndel n i n le benden menschliche n Eizellen nic ht-invasiv und qua ntitativ mittels PolScope
Mikroskopie i n der a ktuell en Studie im IVF-Ze ntrum der Universität Giessen analysiert, bevor sie durc h
intrazytoplasmische Spermie ninjekti on (ICSI) befruc htet wurde n. Die Befruchtung und di e Qual ität der
Pre-Embryone n (PN-Score ) wur den retr ospektiv mit dem Vorhandensei n, der L age und der Lä nge der
Spindel und der durchschnittlichen Doppelbr echung des Spi ndel apparats vergliche n.
Punktion der Eizellen
An alysierte Parameter:
An w esen h eitu nd Lokal isation
d er S p ind el;
En tw icklu n g d er Pre-Emb ryon en
au s Eize llen mit u n d oh n e Sp in d el;
Pol-zu -Pol-Län g e d er S p in d el;
Die M ittelw erte d er Retard an ce
von S p in d eln en tlang ein es Lin eS can s von Pol-Zu -Pol [4]
A
PB
n = 8 97
ICSI
PolScope
18 Std. nac h
Insem in ati on
B
C
D
1PN
3PN
PN-Kontr oll e
E
PN-S core of Pre-Emb ryon en
Ab n o rma le Fertil.
[4,8]
Nach 2 -3
Woche n
Analyse der biochemischen
8 9 7 Oozyten wu rd en in 10 3 ICS I Zyklen mit in f ormierter Zu stimmu ng d er Schwangerschaftsrate
Patienten (Alter: 3 2 ,5 ± 4 ,4 J) un d Zu stimmu ng d er
Eth ikkommissi on au sg ew ertet. S timu lation u n d Hand h abu ng d er Eizel len sow i e An alys e mittels PolS cop e w aren w i e b ereits
f rüh er b esch rieb en [4 ,8 ].
I. Qualitative Analyse der Entwicklu ng von Eizellen mit u nd oh ne doppel brechende Spindel
70
91,5%
100.0 %
Entwicklung der Eizellen mit Spindel : Lokalisation der Spindel
Entwicklung der Eizellen mit und ohne Spindel:
PN-Score der Pre-Embryone n
Fertilizationsrate der Eizellen mit und ohne Spindel
%
90
%
73,4%
Die 676 Eizellen mit Spi nde l
( grün)
wur den
für
die
quanti tativ Bewe rt ung de r
Spindel- Morp hologie und de r
Textu r analysie rt.
P < 0 .0 01
*
S pi n del ≤
40 ° zu PB,
n =6 20
45
35
50.0%
Pol kör per
M I I Sp
indel
0.0%
0
(n= 739)
(n= 158)
8 9 7 Eizellen von 1 0 3 Zyklen
Spi ndel
2P N
0
S core A -C
Exp ression e in er d op p elb rech en d en M II Sp ind el in leb en d en Eizell en korrel iert mit
ein er h oh en Fertilizati on srate (9 1 ,5 % in d en Eizell en mit S p in d el vs. 7 3 ,4 % in d en
Eize llen oh n e S p in d el, P < 0 ,0 00 1 )
S c ore D& E
A bn or. F ert il.
Oozyten , d ie ein e d op p elb rech en d e Sp ind el b esitzen (grün , n = 6 76 ), entw ickeln sich sign if ikan t
h äu f ig er zu Pre-Emb ryon en mitg u tem PN-S core als solch e oh n e S p in d el (rot, n = 1 16 ) (P < 0 ,0 01 ).
1PN oder >
2PN
Nicht
f ertilisi
e rte
S pin del > 40° zu PB,
n =1 11
Oozyten , d ie e in e S p in d el in d er Näh e zu m 1 .PB b esitzen (g rün ), en tw ickeln sich sig n if ikan t
h äu f ig er zu Pre-Embryon en mit 2 PN als sol ch e mit S p in d eln > 4 0 ° en tf ern t vom 1 .PB (rot) (* P <
0 ,0 1 ).
II. Quanti tative Analyse der doppelbrechen den Spindel in leben den
den Eizellen (n = 676) und PNPN-Score der PrePre-Embryonen
Ch arakteristisch e Lin e-S can s d er Dop p elb rechu ng d er Sp in d el (M essun g alle
0 ,5 
m)evon
Pol-zu
-Polce
in Oozyten
ie
sichSp
zuinPre-Emb
gu
nd
Di
Ret
ardan
Kurv e, dd
er
del in ryon
Ei zen
ellmit
e m
it temu
S co
re
(Grü n), Dsch
(Gelb)
lech terem
oder
PN-S
abn
core
ormaler
en tw ickeln
F ertili tät (Ro t)
Polar
bo dy
Der d u rch sch n ittlich e Wert d er Dop p elb rech un g d er Sp in d el korreliert p ositiv mit d em Pron u clear S core d er PreEmb ryon en .
A
Oozyten mit ku rzen S p in d eln entw ickeln sich h äu f ig zu Emb ryon en mit n iedrig em PN-S core.
n
Mittelwert des Maternalen
Alters / Eizelle (Jahr)
Mittelwert der
Retardance
(nm)
Mittelwert der Pole-zu- Pole
Länge der Spindel (µm )
Gruppe 1: Score A,B
180
31,9 ± 4,2
1,72 ± 0,43
12,7 ± 1,8
Gruppe 2: Score C
51
32,0 ± 3,8
1,53 ± 0,40a
12,5 ± 1,6
Gruppe 3: Score D
Gruppe 4: Score E und
Abnormales
324
32,2 ± 4,0
1,52 ± 0,44a
12,6 ± 1,7
121
31,2 ± 4,3
1,39 ± 0,46b
11,7 ± 1,7c,d
Trans ferierteEizellen
254
Nicht trans ferierte Eizellen
422
3
2,5
10 m
Scor e A
40 m
40 m
40 m
Re
ta
rda
nc
e(nm
)
Spindl e
2
1,5
1
0,5
Pol-zu- Pol Läng e de r Spi ndel
0
Scor e D
Abnor mal Fer tiliz ation
0
2, 7
5,4
8,0
10, 7
13,4
PN S co r e D
1,66 ± 0,43
16,1
µm
PN S co r e A
Ab
n o r m.
Fe
r til.
T-Test: S tatistisch e S ig n if ikan z zu Gru pp e 1 :
P=0 ,0 05 .
1,49 ± 0,44
a
P
< 0 ,0 5 ; b
P
< 0 ,00 1 ; c
P=0 ,0 01 ; S ign if ikan z zu Grup p e 3 : d
Schlussfolgerung:
Die Daten von 676 quantitativ ausgewerteten Eizellen aus 103 ICSI Zyklen im IVF-Zentrum in Giessen zeigen, dass sich Eizellen, die eine hohe durchschnittliche Doppelbrechung der
Spindel besitzen, signifikant häufiger zu Pre-Embryonen mit einem guten PN-Score entwickeln, als Eizellen ohne Spindel oder solche mit Spindeln von niedriger Doppelbrechung. Diese
Beobachtung konnte durch eine prospektive Studie mit einer kleinen Kohorte von Eizellen in einem IVF-Zentrum in Milano bestätigt werden[4 ]. Niedrige PN-Scores wurden in
mehreren Studien mit dem gehäuftem Auftreten von Aneuploidie korreliert [5-7 ]. Da weitere Studien darauf hinweisen, dass besonders Transfers von Embryonen, die von Oozyten mit
hoher Spindeldoppelbrechung nach ISCI resultieren, hohe Wahrscheinlichkeit von Implantation haben [4 ], scheint die Analyse der durchschnittlichen Retardance der Spindel in
Oozyten von ähnlichem prädikativem Wert für die Beurteilung und Selektion von Oozyten in ART vor ICSI wie das PN-Scoring der Pre-Embryonen nach ICSI.
Vor allem, wenn die Beurteilung des PN-Scores für die Embryoselektion wegen ethischer Bedenken und gesetzlicher Vorschriften nicht verwendet werden kann, sollte die quantitative
Analyse der Doppelbrechung der Spindel neue Möglichkeiten eröffnen, Eizellen mit einem hohen Entwicklungspotential zu identifizieren und in Verbindung mit anderen
morphologischen und quantitativen, nicht-invasiven Analysen (z.B. der Untersuchung der doppelbrechenden Eigenschaft der Zona Pellucida) zu einer Optimierung der Selektion von
Oozyten aus einer Kohorte, aber auch der Abschätzung der Wahrscheinlichkeit für erfolgreiche ART innerhalb eines Zyklus und optimierter individueller Beratung und Behandlung von
Patienten beitragen.
Ref eren zen :
1 . Wan g WH et al. (2 0 0 1 ) Hu m Rep rod .
1 6 ,14 64 -14 68 .
2 . Old en b ou rg R (1 99 6) Natu re 38 1 ,81 1812.
3 . S cott LA, S mith S . (1 99 8) Hu m. Rep rod .
1 3 ,10 03 -10 13
4 . S h en Y et al. (2 00 6 ) RBM On lin e
1 2 (6 ),7 37 -7 51 .
5 . Balab an B et al. (2 0 0 4 ) RBM On lin e
8 ,6 95 -70 0 .
6 . Ed irisin g h e WR et al. (2 0 0 5 ) Rep rod .
Fertil.1 7 ,5 2 9-53 4 .
7 . Gian aroli L et a l. (2 0 0 3 ) Fertil. S teril.
8 0 ,34 1 -3 49 .
8 . S h en Y et al. (2 00 5 ) Hu m. Rep rod .
2 0 ,15 96 -16 06 .