Sample cradle prevents pre-analytic error on platelet counts but is... for hemoglobin measurement and prothrombin time

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi
Biomedicinska analytikerprogrammet
Examensarbete 15 hp 2012
Sample cradle prevents pre-analytic error on platelet counts but is not essential
for hemoglobin measurement and prothrombin time
Jessica Karlsson
Handledare: Anders Larsson, Klinisk kemi, Akademiska sjukhuset, Uppsala.
Anna-Lena Mattsson och Maria Groblewska, Laboratoriet, Östhammars vårdcentrum.
ABSTRACT
Introduction: It is recommended to place all the vacuum tubes directly on a sample cradle
after vein puncture to prevent analytic error. This recommendation is not always easy to
follow because the samples are taken by different professionals under different situations.
The three most common analyses, platelets count, haemoglobin and prothrombin time were
tested. Therefore, it was interesting to compare results from the three most common analyses
with or without sample cradle, to evaluate the influence of this step on the result.
Methods: Three analyses were preformed, using blood from 50 different persons. Each
person gave two vacuum tubes, each contained 4.5mL of venous blood for the study. Tubes
containing EDTA were used for platelet counts and measurement of haemoglobin and tubes
containing citrate were used for prothrombin time-analysis. One of the tubes was placed, as
recommended, directly on the sample cradle while the other tube was placed flat on a bench
for 10 minutes before it was placed on the sample cradle.
Results: There was a clear difference in platelet counts with and without immediate cradling
but only minor difference between the results for haemoglobin and International Normalized
Ratio.
Conclusion: Some analyses seem to be more sensitive for variation in cradling than others.
For platelet count it was important to immediately rock the tubes but for determination of
prothrombine time and hemoglobin it had a small impact. The small impact on the results is
probably due to the efficiency of the anticoagulant in the vacuum tubes.
KEYWORDS
vein puncture, coagulation, International Normalized Ratio, citrate, EDTA
2
INTRODUKTION
Venprovtagning är den mest vanliga provtagningen inom sjukvården. Provet används för att
ställa en diagnos, följa ett sjukdomsförlopp och är en kontroll vid viss medicinering. Tre av de
mest frekventa analyser som utförs är trombocyträkning, protrombinkomplex (PK) och
hemoglobinbestämning.
Enligt Bonini et al sker de flesta analytiska fel före själva analysen. Denna fas kallas för preanalys [1]. Provvaggan är ett viktigt redskap i pre-analysen. Den vaggar provet för att undvika
att aggregat bildas in vitro och aktiverar gelen i rör som har gel som tillsats. Bildas koagel i
provröret kan provsvaret bli missvisande och den finkänsliga apparatur som används vid
analysering kan bli igensatt eller gå sönder. När blodproverna blivit tagna ska provrören
läggas direkt på en provvagga och vaggas minst 10 gånger. Noggrannheten av användningen
av provvaggan varierar, eftersom förutsättningarna för vaggning ser olika ut vid olika
provtagningstillfällen. Även utbildning och kunskap om vaggningens betydelse varierar
mellan provtagarna. I Norden utförs venprovtagningen av många olika professioner i jämfört
med resten av världen där provtagaren är mer utbildad inom laboratorievetenskap och har mer
kunskap om hur de olika proven ska hanteras, däribland vaggning av rör. Provvaggan används
bara i de Nordiska länderna, Norden har ackrediterade laboratorier och provvaggan är en del i
att kvalitetssäkra provröret eftersom den största felkällan vid analysen uppstår vid preanalysen[1]. Ordningen som rören tas i vid venprovtagningen är bestämd och denna ordning
skall följas. Ett koagulationsprov tas inledningsvis (efter eventuell blododling) eftersom
nålsticket skadar blodkärlet och sätter igång det inre aktiveringssystemet i kroppen och kan ge
ett felaktigt värde om koagulationsröret tas i en annan ordning. Dessutom kan tillsatserna i
andra rör som tas innan koagulationsprovet överföras via nålen och störa analysen.
Koagulationsrören innehåller citrat och blodstatusrören innehåller EDTA. Dessa tillsatser
kallas för antikoagulantia och binder Ca 2+ och förhindrar därmed att koagulationen aktiveras.
När cellräkning ska utföras används EDTA som antikoagulantia, som motverkar
aggregatbildning och håller cellerna levande så cellbildningen kan fortgå in vitro [2].
Koagulationssystemet består av många olika delar, inklusive koagulationsfaktorer,
trombocyter och olika aktiveringssystem. Hemostas är blodets förmåga att koagulera vilket
behövs vid en skada av ett blodkärl som ger en blödning, men blodet måste också kunna lösa
upp koagel allt eftersom blödningen stillat så att inte tromboser bildas. Detta system sköts
automatiskt av alla inblandade faktorer som har en inverkan på koagulation samt
3
upplösningen av koagel.
Det finns ungefär 50 olika faktorer som ingår i koagulationsprocessen, ungefär hälften
arbetar för koagulation och den andra hälften mot koagulation (hämmare). I en frisk kropp
finns en jämvikt mellan dessa. Vid vissa sjukdomar fallerar denna jämvikt och
svårighetsgraden av symtomen beror på vilken faktor eller vilket ämne som avviker från det
normala. Koagulationsfaktorerna är enzymer och de är namngivna med romerska siffror i den
ordning som de upptäcktes [3]. Alla aktiveringsfaktorer som ingår i den inre aktiveringsvägen
finns i blodet i inaktiv form och aktiveras då ett blodkärl kommer till skada. De faktorerna är
X (Stuart-faktor), VII (prokonvertin), VIIa, II (protrombin), IIa (trombin), I (fibrinogen), Ia
(fibrin). Den yttre aktiveringsvägen aktiveras då celler som skadats i en kärlvägg frisätter en
vävnadsfaktor. Dessa båda aktiveringsvägar går samman till en gemensam väg från faktor X.
Dessa reaktionsvägar tillsammans med resten av koagulationsaktiveringen kallas för en
kaskadreaktion eftersom reaktionen förstärks i flera steg. Aktiveringen av en faktor påverkar
nästa steg i aktiveringen och så fortsätter reaktionen och vid varje nytt steg av aktivering
förstärks reaktionen ytterligare.
K-vitamin är viktigt för att levern ska kunna producera koagulationsfaktorer t.ex. II,VII,IX
och X, vilka är de faktorer man säger är K-vitaminberoende. Vitamin K finns i många
livsmedel men främst i grönsaker. K-vitaminbrist är ovanligt då endast 1µg/kg kroppsvikt är
det dagliga behovet.
Kalciumjoner (Ca2+) är viktigt för att koagulationen ska fungera normalt. Det är mycket
ovanligt att kroppen lider brist på Ca2+ i plasma. Då trombocyter har aktiverats vid en
kärlskada ska faktorer binda in till negativt laddade fosfolipider på trombocyterna och för att
det ska ske måste Ca2+ finnas närvarande.
Trombocyter bildas av megakaryocyter. Av en megakaryocyt bildas 1500-3000
trombocyter genom avknoppning från megakaryocyten. Trombopoetin reglerar nybildningen.
Trombocyterna har en livslängd på 9-10 dygn och elimineringen sker huvudsakligen i mjälten
och levern. Trombocyterna innehåller olika slags granula som frisätts vid en
trombocytaktivering och som behövs för att åstadkomma en hemostas. Täta granula innehåller
ämnen såsom Ca2+ medan α-granula innehåller bland annat von Willebrand-faktorn, faktor V
och fibrinogen. Denna del av hemostasen kallas för den primära hemostasen. De två olika
aktiveringsvägarna, den inre och den yttre kallas för den sekundära hemostasen. Normalt antal
trombocyter är 145-348x109/L och en ökad blödningsrisk finns vid <50x109/L [4].
Trombocytopeni kan förekomma i samband med medicinering av vissa sorters läkemedel,
vid hög alkoholkonsumtion och vid brist på folsyra och kobalamin och vid ökad destruktion
4
som orsakas av blodtransfusion, virus, benmärgssjukdomar och efter kirurgi. En ändrad
fördelning av trombocyter finns vid splenomegali. Vid aggregatbildning minskar antalet
trombocyter. Aggregat delas upp i små och stora aggregat. Små aggregat innehåller två eller
tre trombocyter och stora aggregat innehåller fyra eller fler trombocyter.
Pseudotrombocytopeni är en ovanlig men förekommande orsak till aggregatbildning som ofta
orsakas av EDTA. Denna sällsynta företeelse är inte relaterad till någon speciell sjukdom utan
beror på att antikroppar agglutinerar och som i sin tur leder till att trombocyterna bildar
aggregat in vitro. Denna reaktion är ofta temperaturberoende [2].
Trombocytos förekommer vid trauma, splenektomi, kroniska sjukdomar, maligna
blodsjukdomar och efter en dryg veckas avgiftning av alkohol. Koagulationssjukdomar
orsakas av störningar i hemostasen och kommer oftast som en sekundär sjukdom. Orsakerna
kan vara genetiska förändringar i trombocytfunktionen eller rubbningar i trombocytantalet.
Trombocytopeni ökar risken för blödning och trombocytos ökar risken för trombos.
Intorkning ger sämre blodcirkulation vilket i sin tur ökar risken för en trombos.
Leversjukdomar kan ge K-vitaminbrist som leder till en ökad blödningsrisk.
Warfarin är den aktiva substansen i Waran och är ett av flera namn på preparatet. I Sverige
är Waran det vanligast förekommande namnet. Warfarin är den vanligaste ordinerade
antikoagulantian i hela världen, 0,5-1,5% av världens befolkning använder warfarin.
Läkemedlet började användas på 50-talet [5]. Warfarin är även känt för att vara råttgift. När
råttorna ätit det så blir deras International Normalised Ratio (INR) högt och de blöder till
döds. Warfarin hämmar K-vitaminberoende koagulationsfaktorer och kallas därför för en Kvitaminantagonist. Warfarin ordineras till patienter då det finns en ökad risk för trombos [6].
Warfarin är svårt att dosera och det är individuellt hur patienten håller sig inom det smala
terapeutiska intervallet. Veckodoseringen kan skilja mer än tio gånger mellan olika patienter
[5]. Är dosen >70mg/vecka så kallas det warfarinresistens [7]. Svårigheten att hålla sig inom
det terapeutiska intervallet gör att det utförs täta kontroller på blodets koagulation, detta görs
med ett Protrombinkomplex (PK-prov). PK-provet mäter de fyra K-vitaminberoende
koagulationsfaktorerna II, VII, IX och X. PK kan mätas i plasma (PK-P) eller i kapillärprov
(PK-B). Gemensamt för dessa fyra koagulationsfaktorer är att de binder till Ca 2+. Med PKprovet får man fram ett International Normalized Ratio (INR) och referensintervallet är 0,91,2 INR.
PK-analysen utförs alltid som dubbelprov när analysen utförs manuellt. Då provet tillsätts
till kuvetterna som innehåller reagens och stålkula startar en motor som snurrar med en
magnet som gör att kulan rör sig. Samtidigt startar en tidräknare till varje prov. En infraröd
5
stråle lyser på kulan och en detektor känner av reflektionen men när provet koagulerat stannar
kulan och strålen bryts. Samtidigt som strålen bryts stannar klockorna och medelvärdet av
antalet sekunder i de två kuvetterna räknas om till koagulationstiden INR.
Låga INR-värden betyder en ökad trombosrisk och högt värde ger en ökad blödningsrisk.
Hos en patient som behandlas med warfarin ska det terapeutiska intervallet ligga mellan 2,0 3,0. Men vissa variationer förekommer i olika delar av världen [5]. Det har visat sig finnas en
etnisk skillnad så de ligger på en lite lägre dos warfarin i Asien än i resten av världen [6].
Andra variabler som påverkar doseringen av warfarin är kön, ålder och BMI [7]. Viktigt att
tänka på då en person är behandlad med warfarin är att vissa faktorer och tillstånd kan
förändra INR-värdet såsom kost, alkohol, feber, kräkningar, diarré och vissa smärtstillande
och antibiotikapreparat. Genetiska variationer för VKORC1 och CYP2C9 har studerats och
visat sig ge warfarinresistans som därför bedöms vara ärftlig och utbredningen är olika
fördelad i världen [7].
Warfarinbehandlade patienter får lämna blodprov med täta intervaller och patienterna är
ofta äldre och har svårt att ta sig till provtagningen. Det undersöks nu alternativa metoder för
att mäta PK för att underlätta för patienterna. Patientnära analyser och icke invasiva analyser
som kan utföras i hemmet eller på sjukhem är under utveckling [8].
I några län i Sverige har warfarinbehandlade patienter utbildats och fått låna en CoaguChek
XS, som är ett instrument för att mäta INR som patienten själv kan använda i hemmet. Man
kan utföra analysen med hjälp av ett kapillärprov. Metoden kräver 10µL blod och man får
analyssvar inom 1minut [9].
Thrombo Monitor mäter viskositet i blodet i kapillärer genom huden på fingret med ett
infrarött ljus. Mättekniken som används är en spektrometer och liknar oximetern [8].
Hemoglobin har flera viktiga uppgifter såsom syretransport och koldioxidtransport och
fungerar därmed också som ett buffertsystem. Syret är livsviktigt men är också skadligt för
kroppen. Syret bildar fria radikaler vilket innebär att syret förlorat en elektron och då blir
reaktiv och tar en elektron från närliggande vävnad. Denna oxidativa stress ger upphov till
åldrandet och eventuell sjukdom beroende på var på cellen syret reduceras.
Hemoglobinmolekylen är uppbyggd av två dimerer som bildar en tetramer som är rörlig
och kan bilda två konformationer, T- och en R-form. T står för tense då syremolekylen binder
starkare till hemoglobinmolekylen och R för relaxed då syremolekylen binder mindre starkt
till hemoglobinmolekylen. Alla globiner binder till en hemgrupp som har en järnatom i
mitten. Varje järnatom kan binda en syremolekyl och ju fler syre som är bundna till en
hemoglobinmolekyl ju starkare affinitet blir det till att binda fler. I varje erytrocyt kan det
6
finnas tre miljoner hemoglobinmolekyler.
Proteinkedjorna i hemoglobinet ser olika ut hos nyfödda och vuxna. Vuxna har ca 95% av
hemoglobin A (α2 β2) och 5% av hemoglobin A2 (α2 δ2) och en nyfödd har 70% hemoglobin F
(α2γ2) och 30% hemoglobin A som sedan ändras under de första 3 levnadsmånaderna.
Referensintervallen för hemoglobin är uträknat från prover tagna på friska människor som
inte är sängliggande och inte gravida. Kroppsläget påverkar hemoglobinvärdet med 5-10%
och är lägre hos sängliggande. Referensintervallet varierar också mellan män, kvinnor och
små barn. Män har högre värden eftersom testosteron stimulerar syntesen av erytrocyter
medan menstruerande kvinnor ofta har lite låga järnvärden och därigenom lite lägre
hemoglobinnivåer. Nyfödda ligger högst med 150-240g/L, barn 10-16år 110-160g/L, män
130-163g/L och kvinnor 115-146g/L. Ju äldre man blir desto lägre bli referensintervallet.
Sjunker hemoglobinvärdet under referensintervallet anses det föreligga en anemi.
Anemi kan orsakas av många olika tillstånd då erytronet är känsligt för förändringar och
sjukdomar vilket kan ge störningar av erytropoesen som i sin tur kan leda till anemi. Anemi
betyder att blodet har nedsatt förmåga att transportera syre. Orsakerna till anemi är många och
anemierna ser ut på olika sätt och har olika namn. En anemi upptäcks genom att man mäter
hemoglobinvärdet. Av kroppens järn är 70% bundet i hemoglobinmolekylerna. En viktig
orsak till sänkt hemoglobinvärde är blödningar. Hemoglobin mäts ofta på mycket sjuka
patienter som vanligen blir anemiska och är på gränsen till att få blodtransfusion t.ex. vid
ökad celldestruktion och blödningar och vid benmärgssjukdomar [10].
HemoCueHb 201+ är ett litet instrument som kan användas med eller utan batterier. Den
är enkel att använda och svaret kommer inom 60 sekunder [10-11]. I mikrokuvetten finns tre
olika reagens; natriumdeoxykolat, natriumnitrit och natriumazid. Då blodet tillförs till
kuvetten lyserar natriumdeoxykolat erytrocyterna så hemoglobinet frigörs. När det fria
hemoglobinet kommer i kontakt med natriumnitrit bildas methemoglobin genom att järnet i
hemoglobinmolekylen oxiderar. Den oxiderade hemoglobinmolekylen, methemoglobin
reagerar med natriumazid och bildar en färgad produkt, azidhemoglobin som är den produkt
som mäts i fotometern. HemoCue mäter vid två våglängder för att kompensera för eventuell
grumlighet [12].
Syftet med studien var att jämföra tre av de vanligaste analyserna inom sjukvården,
trombocyträkning, PK-värdet och hemoglobinvärdet för att studera hur viktigt det är att vagga
provet på ett korrekt sätt.
7
MATERIAL OCH METOD
Provmaterial
Försökspersonerna i studierna var kvinnor och män i åldern 21-90 år. Det var 50 personer som
lämnade blodprov till varje analys. Försökspersonerna blev informerade om studiens syfte och
uppbyggnad i samband med att de blev tillfrågade att samtycka till att delta. För de tre
analyserna togs dubbelprover, totalt 9mL fördelat på två rör som kallades prov A och prov B.
Prov A placerades direkt på provvaggan Triomix (Triolab AB, Sweden) och prov B
placerades plant på bänk eller bord utan blandning under 10min och placerades sedan på
provvaggan under minst 10 vaggningar. Ingen etikprövning har gjorts eftersom proverna
markerades 1-50 och endast kön och födelseår noterades. Prov B markerades därutöver med
ett X.
Manuell trombocyträkning och aggregatkontroll
De 50 försökspersonerna lämnade venöst blodprov i två Vacuette K2EDTA, 3mL (Greinerbio-one, Austria). Med en microcap tillfördes 25L välblandat helblod till 475L Leucoplate
i ett ellermanrör och blandades direkt. Röret vaggades i 3-15min innan provet lades upp med
en microcap till Bürkerkammaren. Direkt efter uppläggningen placerades Bürkerkammaren i
en petriskål med fuktat filtrerpapper med lock under 20min. Trombocyterna räknades i 16CDrutor med 40x förstoring. Svaret räknades ut genom att ta antalet räknade trombocyter x109/L.
I samma CD-rutor där trombocyterna räknades kontrollerades även antal och storlek av
aggregat. För att kontrollera den manuella trombocyträkningen utfördes en automatisk
cellräkning av trombocyter på prov A i Cell-dyn 1700 System.
PK-analys
De 50 försökspersonerna lämnade två fulla rör med venöst blod i BD Vacutainer® 9NC
0,129M, 3mL (Beliver Industrial Estete, United Kingdom). Proverna centrifugerades i 10min i
2000g.
Reagens SPA+1 (Stago, France) som är frystorkat och Reagens SPA+2 (Stago, France) en
spädningslösning togs fram ur kylskåpet minst 1tim innan provanalys för att det skulle bli
rumstempererade före analysen. Efter 30min fylldes reagens 2 till reagens 1 och blandades väl
och fick stå i ytterligare 30min innan användning.
Provmaterialet förbereddes genom att 50µL av plasman pipetterades till ett ellermanrör
innehållande 300µL citratbuffert SPA+ (Stago France) och blandades väl. I plastkuvetterna
8
tillsattes en stålkula och 200µL välblandat reagens. Reagenset värmdes upp vid placering i
apparatens värmeblocksposition. När kuvetterna blivit varma fördes de över till mätpositionen
och 100µL provmaterial pipetterades ner mot kanten i kuvetterna (dubbelprov) och
räkneverken startade. INR avlästes efter att räkneverken i båda kuvetterna hade stannat och
INR automatiskt blivit uträknat. Kontroller körs dagligen och vid byte av reagens för att följa
om kontrollerna har hållit sig inom gränsvärdena. En extern kontroll från Equalis analyseras
10 gånger per år.
Hemoglobinmätning
De 50 försökspersonerna lämnade venöst blodprov i två EDTA vacutainerrör.
Blod från EDTA-rören pipetterades till en glasskiva och därifrån sög engångskuvetten
HemoCueHb 201 Microcuvettes upp10L helblod varefter kuvetten placerades i mätaren
HemoCueHb 201+Analyzer. Efter 15-60sek visades resultatet i fönstret. När instrumentet
startas sker en automatisk instrumentkontroll.
Statistik
För att kunna jämföra de olika analyserna räknades resultatet om till procent. Skillnad mellan
analyserna beräknades med icke parametrisk statistik enligt Kruskal-Wallis och Dunns post
hoc test.
9
RESULTAT
För att kunna bestämma vikten av att använda provvaggan i direkt anslutning till
venprovtagningen gjordes en studie på 3 av de vanligaste analyserna, trombocyträkning, PK
och hemoglobinbestämning.
Resultat av manuell trombocyträkning och aggregatkontroll
Vid trombocyträkningen hittades ett minskat antal trombocyter i 36 prover i prov B (72%)
jämfört med prov A. Medelskillnaden räknades ut till -18,24x109/L trombocyter och den
största avvikelsen mellan prov A och prov B noterades till -73x109/L i B-provet. I dessa 36 Bprov fanns en ökad mängd aggregat i 31prov (86%). Fördelningen mellan antal aggregat och
storleken på aggregat skiljde sig mellan A-prover och B-prover, se Figur 1.
Figur 1. Resultat efter räkning av trombocytaggregat. Skillnaden i antal och storlek av aggregat
uträknad i procent, A-prov (blå) och B-prov (röd) visas i figuren. Fler prov med aggregat och fler antal
aggregat hittades i B-prov än i A-prov. A-prov och B-prov hanterades olika. A-prov som efter
provtagningen hanterades korrekt, placerades direkt på provvaggan. B-prov placerades på en bänk
utan att vaggas, efter 10min placerades de på vaggan och vaggades minst 10 gånger.
10
Resultat av PK-analys
Referensvärdet i INR hos en frisk person som inte behandlas med Waran är 0,9-1,2 och värdet
för de som äter Waran ska vanligen ligga mellan 2,0-3,0. PK-proverna A och B visade samma
INR i 34 prov (68%). En differens fanns i 16 prover; 9 fick ett högre INR och 7 fick ett lägre
INR. Differensen i INR-värde varierade mellan
-0,13 och +0,1. Medelavvikelsen räknades till -0,0064INR och den största avvikelsen
analyserades till -0,13INR.
Resultat av hemoglobinmätning
Hemoglobinvärdet i prov A och B skiljde sig i 36 prover. I 11prover var A>B och i 25 prover
var A<B, resterande 14 prov hade samma resultat. Medelskillnaden i resultat blev 0,78g/L.
Referensvärdet hos en man är 130-163g/L och hos en kvinna 115-146g/L. Skillnaden i
resultat av hemoglobinvärdet varierade mellan +4 och -2.
Jämförelse mellan de olika analyserna
Användning av provvagga är speciellt viktigt för Trombocyträkningen medan användning av
provvaggan inte påverkade PK och Hemoglobinvärdet (p<0,05), se Figur 2.
11
Figur 2. Procentuell skillnad mellan prov A och prov B i de olika analyserna. Variationen i
trombocytantalet mellan prov A och prov B var signifikant större än variationen i PK och
Hemoglobinvärdet, p<0,05. Boxarna visar medianen och 25% -75% spridning. Statistisk analys enligt
Kruskal-Wallis och Dunns post hoc test.
12
DISKUSSION
Tidigare har det inte gjorts någon studie på hur viktig del provvaggan har i att undvika preanalytiska fel vid venös provtagning. I denna studie valdes 3 av de vanligaste analyserna att
studera hur användning av provvagga påverkar analysresultatet. B-proverna som inte placerats
på provvaggan direkt hade i de flesta fall ett lägre antal trombocyter vilket troligen beror på
att det finns fler och/eller större aggregat i det provet, se Figur1. Detta sågs i flertalet B-prov.
I vissa prov sågs ingen skillnad mellan A och B och i några prov var antal trombocyter i Bprovet högre än i A-provet. Det kan kanske förklaras med att några försökspersoner var
ordinerade ett läkemedel som motverkar aggregatbildning. Eftersom försökspersonerna inte
blev tillfrågade om medicinering så kan detta inte undersökas och utvärderas. Läkemedlet kan
vara Waran, acetylsalicylsyra och/eller heparin och dessa påverkar trombocyterna på olika
sätt. Acetylsalicylsyra påverkar bildningen av tromboxan A2 i trombocyterna negativt och
irreversibelt [13]. Heparin hämmar koagulationen genom att hjälpa antitrombin att inaktivera
trombin [14]. En mycket snabbare och enklare metod för att räkna trombocyterna är att
använda automatisk cellräknare, men eftersom en ökad aggregatrisk antogs i B-proven valdes
manuell cellräkning eftersom ett prov med aggregat utgör en större risk för den finkänsliga
tekniken i cellräknaren som då kan gå sönder. En ökad aggregatrisk i B-proven förutsattes
bero på att tillsatsen EDTA inte blandats ordentligt med blodet och då inte kunde binda Ca 2+
och därigenom inte stoppa koagulationen i hela provet. För att proven skulle få samma
förutsättningar i räkning räknades både prov A och prov B manuellt. För att se och räkna
aggregat var manuell trombocyträkning ett bra val av metod. Av samma orsak som
trombocyträkningen räknades inte heller aggregat maskinellt och det fanns inte på
laboratoriet. Manuell cellräkning krävde lite övning men efter några prov som test så gick det
fort och lätt så provet inte torkade. Inom 20 minuter ska rutorna räknas så inte provet torkar. I
alla prov räknades samma rutor på klacken för att proven skulle få samma förutsättningar.
När en patient ligger i nedre delen av referensintervallet i trombocytantalet kan ett felaktigt
lågt värde vara ett allvarligt preanalytiskt fel. Om patienten ligger nära den kritiska gränsen
<50x109/L kan det bli en fortsatt utredning om ökad blödningsrisk helt i onödan.
Natriumcitratet och EDTA är effektivta antikoagulantia. Den volym citrat som finns i
vacutainerröret blandas så effektivt med blodet när röret fylls att provvaggan inte behövs i
samma utsträckning som man trott tidigare. Natriumcitratet och EDTA skelatbinder Ca2+ som
krävs vid aktiveringen av de fyra K-vitaminberoende koagulationsfaktorerna.
Thrombotrack select 2 var den enda metoden för PK-analys som fanns att tillgå på
laboratoriet men även om en automatisk PK-metod hade funnits är dessa så känsliga för
13
aggregat att den inte hade valts som metod i denna studie. Den lilla skillnaden mellan prov A
och prov B i INR har ingen diagnostisk betydelse. Inga skillnader i nya ordinationer av Waran
på fel grunder kan ske av denna lilla skillnad. Den lilla skillnaden i INR kan ändå inträffa
eftersom metoden är manuell, därför utförs alltid den manuella analysen i dubbelprover som
säkerhet. Dubbelprover fungerar så att koagulationstiden syns i båda kuvetterna och skiljer de
sig mycket görs ett omprov.
Skillnaden i hemoglobin var liten och det är inte troligt att detta orsakats av
provhanteringen. Instrumentet är enkelt att hantera och risken för att göra fel vid analysen
liten. Det råder skilda meningar om hur hög säkerhet HemoCue har i sitt provsvar. Nkrumha
et al. föredrar att använda Hemo Cue efter en studie där olika instrument som mäter
hemoglobin jämförts därför att HemoCue upplevdes ge säkrare värden, främst på venöst prov
[15]. Zhou et al. och Braskaram et al. visar andra resultat från liknande studier. De anser att
det finns bättre instrument att mäta hemoglobin med än Hemo Cue [12-16]. Enligt Morris et
al., Chen et al. och Mimoz et al. som alla gjort studier på mätningar på hemoglobin med en
HemoCue är det de analyser som gjorts på kapillärblod som har en variation i resultaten
[10,17-18]. I denna studie gjordes hemoglobinmätningarna på venöst blod så säkerheten på
resultaten är höga, då risken för preanalytiska fel minskar. Vid kapillärprovtagning kan
vävnadsvätska späda ut provet och spritningen av huden kan störa om den inte utförs korrekt
och vid olika kapillära analyser ska olika många droppar blod torkas bort innan analysen kan
utföras. Venprovtagningen är inte lika känslig för preanalytiska fel. Mätmetoden mäter
hemoglobinet i de lyserade erytrocyterna och absorbansen är direkt proportionell mot
hemoglobinkoncentrationen påverkar inte hanteringen av proverna resultatet nämnvärt. Skulle
ett eller flera större aggregat komma in i kyvetten tar inte de så stor plats då trombocyterna är
så mycket mindre än erytrocyterna. Har det bildats ett koagel i provröret går inte det att lösas
genom vaggning, provet måste tas om för att ge ett korrekt värde. Det gäller alla analyser och
provrör. Innan EDTA började användas användes citratlösning i provrören vid
blodstatusanalys. Citrat används fortfarande vid speciella fall, t.ex. vid
pseudotrombocytopeni, då patientens blod reagerar mot EDTA genom att bilda koagel i
provröret trots att provet vaggats enligt rekommendationer. Svårigheten med att använda
citrat är att resultatet måste räknas om eftersom det då finns en spädning av blodet. Dessutom
behöver man ibland inför mikroskopering av blodet, göra ett blodutstryk och då används ett
outspätt blod. Det går inte att säga vilken antikoagulantia som är mest effektiv, citrat eller
EDTA, eftersom dessa två inte användes till samma analyser. Största skillnaden sågs på
trombocyträkningen men det kan bero på att det är en känsligare analys än PK och
14
hemoglobinanalysen.
Hemoglobin kan även analyseras i en automatisk cellräknare som är mycket snabbare och
enklare. Av samma orsak, d.v.s. risk för aggregat, som för trombocyträkningen analyserades
inte dessa prover i ett automatiskt instrument.
Variansanalys användes för att se om det fanns någon skillnad i preanalytisk påverkan
mellan de olika analyserna. Kruskal-Wallis test är en icke parametriskt statistisk metod och
används på oberoende parametrar, minst 3 stycken. Med Dunns post hoc test utförs en parvis
jämförelse mellan analyserna.
I Norden är laboratorier ackrediterade och proven kvalitetssäkras. En del av den
kvalitetssäkringen är att en rekommendation finns för att använda provvaggan. Provvaggan
används troligen flitigt på vårdcentraler och mottagningar där arbetsplatsen är speciellt
anpassad för provtagning. Då finns provvaggan i direkt anslutning till provtagningsplatsen.
Där vaggningen av prover kan brista är på platser då provtagaren är ensam med patienten och
ingen vagga finns i närheten. Det kan inträffa på en sal på en avdelning om många rör ska tas
att provtagaren själv inte hinner blanda proverna.
Det finns inga liknande studier där man kontrollerat provvaggans funktion i preanalytiskt
syfte. Dessutom har jag inte funnit några studier om hur provvaggan använts efter
provtagningen. Kanske är det en självklarhet och nämns inte eller så används den inte.
Endast tre analyser gjordes i denna studie så det skulle behövas fler studier som
kontrollerar fler analyser och fler sorters vacutainerrör. Vacutainerrören med gel innehåller
kiselpartiklar för att främja koagulationen och dessa rör behöver därför vaggas för att
kiselpartiklarna ska blandas med blodet för att aktivera koagulationen effektivt. Det skulle
vara av intresse att studera om analyser som utförs från dessa rör skiljer sig åt under olika
vaggningsförutsättningar. Fler koagulationsanalyser kan också utredas vidare. En studie som
visar hur resultatet i blodstatus skiljer sig åt vid dubbelprov då EDTA och citrat jämförs under
olika vaggningsförutsättningar skulle vara av stort intresse.
Slutsatsen av studien är att trombocyträkningen är mer beroende av att provet blandas direkt
efter provtagningen än vad hemoglobinmätning och PK-analys är. Eftersom endast tre
analyser kontrollerats bör rekommendationen att vagga provrören i direkt anslutning till
provtagningen att kvarstå.
15
REFERENSER
[1]Bonini P, Plebani M, Ceriotti F, Rubboli F. Errors in laboratory medicine. Clin Chem.
2002;48:691-8.
[2]Zhou X, Wu X, Deng W, Li J, Luo W. Amikacin can be added to blood to reduce the fall
in platelet count. Am J Clin Pathol. 2011;136:646-52.
[3]Wheeler AP, Rice TW. Coagulopathy in critically ill patients: part 2-soluble clotting
factors and hemostatic testing. Chest. 2010;137:185-94.
[4]Rice TW, Wheeler AP. Coagulopathy in critically ill patients: part 1: platelet disorders.
Chest. 2009;136:1622-30.
[5]Eriksson N, Wadelius M. Prediction of warfarin dose: why, when and how?
Pharmacogenomics. 2012;13:429-40.
[6]Rhie S, Choi JY, Jang IS, Kim JW, Lee CE, Park HO. Relationship between the occurrence
of thromboembolism and INR measurement interval in low intensity anticoagulation after
aorticmechanical valve replacement. Korean J Thorac Cardiovasc Surg. 2011;44:220-4.
[7]Sinxadi P, Blockman M. Warfarin resistance. Cardiovasc J Afr. 2008;19:215-217.
[8]Lerman Y, Werber MM, Fine I, Kemelman P. Preliminary clinical evaluation of a
noninvasive device for the measurement of coagulability in the elderly. J Blood Med.
2011;2:113-8.
[9]Karon BS, McBane RD, Chaudhry R, Beyer LK, Santrach PJ. Accuracy of capiiary whole
blood international normalized ratio on the CoaguChek S, CoaguChekXS, and i-STAT 1
point-of-care analyzers. Am J Clin Pathol. 2008;130:88-92.
[10]Mimoz O, Frasca D, Medard A, Soubiron L, Debaene B, Dahyot-Fizelier C. Reliability of
the HemoCue® hemoglobinometer in critically ill patients: a prospective observational study.
Minerva Anestesiol. 2011;77:979-85.
[11]Sari M, de Pee S, Martini E, Herman S, Sugiatmi, Bloem MW, Yip R. Estimating the
prevalence of anaemia: a comparison of three methods. Bull World Health Organ.
2001;79:506-11.
16
[12]Zhou X, Yan H, Xing Y, Dang S, Zhuoma B, Wang D. Evaluation of a portable
hemoglobin photometer in pregnant women in a high altitude area: a pilot study. BMC Public
Health. 2009;9: 228.
[13]Zavodnik IB, Lapshina E, Sudnikovich E, Bonclear M, Luzak B, Rozalski M, Helinska
M, Watala C. Structure, stability, and antiplatelet activity of O-acyl derivatives of salicylic
acid and lipophilic esters of acetylsalicylate. Pharmacol Rep. 2009;61:476-89.
[14]Xia B, Han H, Zhang KJ, Li J, Guo GS, Gong LL, Zeng XC, Liu JY. Effects of low
molecular weight heparin on platelet surface P-selectin expression and serum interleukin-8
production in rats with trinitrobenzene sulphonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol.
2004;10:729-32.
[15]Nkrumha B, Nguah SB, Sarpong N, Dekker D, Idriss A, May J, Adu-Sarkodie Y.
Hemoglobin estimation by the HemoCue® portable hemoglobin photometer in a resource
poor setting. BMC Clin Patol. 2011;11:5:1-6.
[16]Bhaskaram P, Balakrishna N, Radhakrishna KV, Krishnaswamy K. Validation of
hemoglobin estimation using HemoCue. Indian J Pediatr. 2003;70:25-8.
[17]Morris SS], Ruel MT, Cohen RJ, Dewey KG, de la Brière B, Hassan MN. Precision,
accuracy, and reliability of hemoglobin assessment with use of capillary blood. Am J Clin
Nutr. 1999;69:1243-8.
[18]Chen PP], Short TG, Leung DH, Oh TE. A clinical evaluation of the Hemocue
haemoglobinometer using capillary, venous and arterial samples. Anaesth Intensive Care.
1992;20:497-500.
17