docPh.D. Fulltext - Weizmann Institute of Science
download 
Report Transcription
Ph.D. Fulltext - Weizmann Institute of Science
אינטראקציה בין
חומצה
) C DNA
דאוכםיריבונוקלאית
•)("
.ל-ין
י
פולי -4וינילפירידין )PVP
י
י
-י
\
ולבין
יוני
4
:
ו י
י
ן ׳
.
מתכות כבדות )4
!
־
י
י•' .י י
י
.
.
י
•
•
•
.
׳
.
•
V
י
י
י
י
י
י
י
חבור לשם קבלת התדאר
דוקסור לפילוסופיה
פאת
דיאנה בך
הוגש למועצה המדעית של מכון ויצמן למדע רחובות,
תשכ״ז
.
.
אינטראקציה בין
לבין
חומצה
פילי 1-4ינילפירידיך )PVP
דאוכםיריבונוקלאית
ולבין
יוני
) ( DNA
מתכות כבדות )4
חבור לשם קבלת התואר
דוקטור־ לפילוסופיה
מאת
דיאנזז בך
הוגש למועצה המדעית של מכון ויצמן למדע רחובות,
תשכ״ז
פסי
מ ע ו נ ת
*<»-®m.
»
י׳
»
*
*
ו
מגקדש לזכר אבני
עורך הדין אהרון בך ז״ל.
עבודהז זו נעשתה בהדרכתו
של
דייר ישראל םילר במחלקה לחקר
פולימרים ,במכון ויצמן למדע.
רחובות.
העבודה נתמכה בחלקה ע״י
מילגוז של שרותי הבריאות
הציבוריים של ארצות הברית!
מם,
GM-08-519
ובחלקה :ע״י מילגה
על שם
פרופ' י .הירשברג ז״ל.
ברצוני להביע את תודתי העמוקה
לדייר ישראל מילר על ההדרכה
המסורה והמתמדת ועל העזרה הרבה
שהגיש לי בעבודתי.
כמוכן הנני מודה למר חיים גריאת
עבור ציור העקומות
לוםטיג עבור בצוע
ולמר אריאל
הנםיונות
באו לטרהצ נטר י פוגה.
תודתי נתונה גם לאנשי
מחלקת
אולטרםטרו קטורה ביולוגית
אשר
הגישו את עזרתם במיקרוםקופיה
האלקטרו נ ית.
תכד
העינינים
עמוד
הקדמה
1
מסרת העבר דוד
פרק
.1מבוא וסקר ספרות.
.
(2
אינטראקציה בין
4
DNA
7
DNAלבין חלבוניס ,פוליפפסידים
ופוליאלקטרוליטים בסיסיים.
(3
אינטראקציה בין
DNAלבי ן חומרים מרנומרים )לא מתכתיים(.
10
א( אינטראקציה עם חומרי צבע.
10
ב( אינטראקציה עם פחמימנים ארומטים פוליציקלים,
11
ג( אינטראקציה עם פורינים ,פירימידינים,
12
נוקלאוםידים ונוקלאוטידים.
ד( אינטראקציה עם חומרי רפואה שונים.
15
ה( אינטראקציה עם אמינים.
15
(4
אינטראקציה בין DNAלבין יונים מתכתיים.
18
(5
חקירת האינטראקציה בין פולימרים לבין יונים מתכתיים
23
בשיטה הפולרוגרפית.
פרק
26
. 11חקיק הנםיוני.
(1חומרים ושיטות העבודה.
(2קביעת קבועי הקישור של נחשת וקדמיום ל-
26
DNA 33
בשיטה הפולרוגרפית.
(3קביעת הקישור
הפולרוגרפית.
^םפוליויניל פירידין בשיטה
38
עמוד
פרק
תוצאות ו ד י ו ן
.111
40
40
(1תכונוח החומרים הטהורים.
א( טיטרציה םפקטרופוטומטרית של
.
40
.
41
PVP-4
DNA
45
(2תכונות אופטיות של האינטראקטים.
א( מדידות תלות הספקטרום ותלות עוצמת הבליעה
45
ברכוז המרכיבים.
55
ב( עקומות התוך.
(3הידרוליזה אנזימטית.
68
(4תכונות הידרודינמיות של האינטראקטים.
72
72
א( צפיגות.
ב( םדימנטציה.
ן
76
י
ג( הפרדה על ידי צנטריפוגציה במהיריות גדולות.
\ ד ( צנטריפוגציה בגראדינט צפיפות.
81
(5צילום במיקרוסקופ האלקטרוני.
91
ישור של יונים מתכתיים ל-
(7קביעת הקישור
דיון
DNA - P V P
כללי.
79
83
.
בפולרוגרפיה.
CNA
106
111
תקציר.
116
ספרות,
118
תקציר אנגלי.
תרגום תכן הענינים.
I
ה ק ד מ ה
מ ס ר ת
ה ע ב ו ד ה
מתוך מחקר האינטראקציה של פוליו ינ ילפירידי ן
) (PVPו־
'DNA
ניתן ללמד על האינטראקציה בין חומצות גרעיניות לבין פוליבםיסים .האינטר
אקציות ן מסוג זה הנן בעלות תשיבות ראשונית במערכות ביולוגיות כגון
נוקלאופרוטאינים.
הודות למבנה הדומה של הקבוצות הפירידיניות לפירימידינים ניתן
ד פן האינטראקציה
מולקולת
ש
ל
P V P N A 0
עם
על האינטראקציות הספציפיות בתוך
DNAעצמה.
PVPבהיותו פוליאלקטרוליט נושא שייר אורגני גדול יכול להשפיע
בשני אופנים מנוגדים על המבנה המשני של ה-
. DNAהשייר האורגני יכול לגרם
להורדת היציבות של צורת ההליכם ביחס ליציבות צורת הפקעת ,עקב הזיקה ההידרו
פובית הגדולה יותר לצורה הבלתי מסודרת של ה-
,DNAולגרם על ידי כך
להתרופפות נוספת של הקשרים.
מצד השני למטען ,שעל פני ה PVP -אפקט מיצב של צורת ההליכס הודות
להקטנת הדחיה בין המטענים של ה. DNA -
י^\?איננו מםיס במים ב pH -נוטרלי ,כדי להפיסו נעשתה קווטרניזצ
של אטומי החנקן שלו .ע״י קווטרניזציה נתקבל פוליבםיס טעון חיובית גם ב^-ת
נוטרלי וצפיפות מטענו נקבעת על ידי שינוי דרגת הקווטרניזציה .במקרים אלה
אפשר היה להכניס לתפיסה גם שייר בלתי טעון הודות לקישורו עם שיירים טעונים
כדי להכניס! לתפיסה שיירים פירידינים ,כשהם אינם קשורים לשיירים
טעונים חיובית הופנו קופוליפרים של ויניל פירידין וחופצה פתאקריליתp H ^ .
-
2
-
נוטרלי קופוליפרים אלה טעונים מטען שלילי.
לא הצלחנו להכין קופולימרים מסיסים בלתי טעונים של וינילפירידין
כהל וינילי.
עם
האינטראקציה בין
PVPובין הבסיסים של ה-
DNA
צריכה להתבטא
בשינוי בספקטרום של האינטראקטים .על מנת לגלות מצבים אנרגםים חדש.ים אלה
נבדקו הםפקטרה של האינטראקטים אשר הוכנו מ-
DNA
ופ-
PVPבתנאים וביחסי
רכוזים שונים.
השפעת
PVPבתור חומר מיצב התבטאה בעקומות ההיתוך של
האינטראקציה .נמצאה ההשפעה של הPVP -
^סאחרי
הן על האיזורים המכוסים במולקולות
ה־־ DNAוהן על האיזורים המגולים .מגודל האפקט ההיפרכרומי באיזורים המגולים
נתקבלה סטיכיומטרית הקישור.
על מידת הכיסוי של PVP-3 DNAויתסי הקישור ניתן גם ללמד מהפעלת
אנזימים על האינטראקטים ,לכן על האינטראקטים הופעל האנזים
I
deoxyribonuclease
אשר מפרק
DNAבאיזורים בלתי מכוסים.
האינטראקציה גרמה לשינוי מבנה של מולקולות
, DNAכגון :קיפול ,
שבירת הקשרים ,אגרגציה ועל כך למדנו מחקירת התכונות ההידרודינמיות
והסתכלות באינטראקטים בעזרת המיקרוסקופ האלקטרוני.
בחלק השני של העבודה נבדקה האינטראקציה בין
DNAלבין יונים
מתכתיים דו-ערכיים :נחשת ,קדמיום,
למתקר זה היו כמה מטרות :אחת מהן לקבע קבועי הקישור של מתכות הכבדות
ל-
. DNAלידיעת הקבועים האלה חשיבות גדולה ,כי ידועה ההשפעה הגדולה של
יונים מתכתיים דו־־ערביים ורב־ערכיים על יציבות המבנה המשני של
ה
_ , DNA
ידיעת הקבועים הנ״ל מאפשרת לחקר את חזק הקשרים בין השיירים
הבסיסיים ו? י ן•DNAn־ ,7מנםיונות התחרות על מקומות הקישור על פני המקרו- -
פולקולה״ביןן יוני המתכות׳ וב:יןן הזפוליבסיםים כגוןןי^ג? .כפו כן נסיונות
־ - 3
הקישור של יונים מתכתיים ל DNA -בנוכחות
על השפעת הפוטנציאל האלקטרוםטטי של
DNA
PVPנותנים אינפורמציה נוספת
על האינטראקציה ,השפעת המטען
והשפעות הגומלין בין החלקים המכוסים והבלתי מכוסים
ב DNA -אחרי האינטר
אקציה .תוצאות נסיוניות אלה הושוו עם התוצאות אשר התקבלו בחלק הראשון
של העבודה זו.
־ 4־
מ ב ו א .-ו סי ק• ר
(1סקירה כללית על
ספרות.
DNA
חומר המכיל חומצות גרעיניות הופרד לראשונה פתומרי התא ליי
1
• *•Wescherב.1869-
כבר בסוף המאה ה־ 19היה ידוע שחומצות הגרעיניות מכילות חומצה
)(2
זדחתית ,כםיםים פוריניים ופיריסידיניים׳ • בתתילת המאה הנוכתית הפרידו
x
) (RNAמשמרים והחומצה הדיאוכםי-י •
לראשונה את החומצה הריבונוקלאית
)(2
•
ריבוניקלאיוה) (DNAמתימוס של עגלי׳
אולם עיקר מתקרן התתיל בתום מלתמת העולם השניה עם גילוי
טכניקות חדשות של הפרדה ,אשר מנעו דגרדציה ודנסורציה ועם הכרת תפקיד
חומצות הגרעיניות בתהליכי החיים.
היום ידוע ,שחומצות הגרעיניות הן פולימרים גבה מולקולרים
הבנויים מיחידות מונומריות המכילות בסים תנקני )פוריני או פירימידיני(,
סוכר )בDNA-
דאוכסיריבוזו( והופצה זרתתית .בתוך התאים חומצות הגרעיניות
קשורות לחלבונים בסיסיים )פרוטמינים •והיסטונים(.
מודל למבנה של חומצות הגרעיניות הוצע לראשונה ע״י
'Simms
Levene
,andהם טענו ,שהשלד בנוי מאסטרים של חומצה זרתתית וסוכר
והבסיסים קשורים מבפנים לסוברים .מחקר חומצות הגרעיניות צעד צעד גדול
קדימה עם גילוי המבנה המשני של
והוכחתו בקרני xעל ידי
DNAשל ידי
^Watson and Crick
. ^ W i l k i n s et al.הם הוכיחו ,שמולקולת ה-
בצורתה הטבעית בנויה משני הליכסים אנטי-מקבילים הקשורים ביניהם על ידי
קשרי המימן בין הבסיסים המשלימים.
היום רוב הפתקרים של
DNAפתרכזים בכפה שטחים :
DNA
־ 5־
)א( קביעת סדר הבסיסים בשרשרת הפולינ וקליאוטידית והשפעתו של סדר זה על
העברת האינפורמציה הגנטית־
מעבירה את "ההודעה" הגנטית ל-
ידוע שDNA -
משתתפת ישירות בסינטזת אנזימים ותלבונים אחרים ) 2עמ<>
RNA
•(321
,אשר
תוכן
"ההודעה" נקבע על ידי סדר מסוים של הבסיסים בתוך השרשרת הפולינוקלאו-
•סידיח־
DNAעם חלבון בתאים ומידת הקישור שלו עם
)ב( תקירת אופי הקישור של
תומרי צבע שונים ,היכולים לשמש מודלים ומתחרים למבנה של ה-
. DNA
בנושאים אלה נעשו מחקרים רבים מאד ובהן נדון בהמשך הדברים.
מחקר האינטראקציה של
ש-
עם
DNA
PVP
מהווה הלק ממחקרים אלה הודות לכך
PVPהוא פוליבםים ויחד עם זה ישנו דמיון מבנה בינו ובין מולקולות
חומרי הצבע.
)ג( חקירת הכוחות המשפיעים על מבנה ההליכס הכפול .מאחר ,שחומצות הגרעי
ניות הן פוליאלקטרוליטים ,תשובות מאד האינטראקציות האלקסרוםטטיות הן
בתוך ההליכם עצמו ,והן עם יונים נגדיים.
היא פוליאניון אשר מטעניו השליליים נמצאים על פני
DNA
הקבוצות הזרחתיות הקבוצות הזרחתיות וכן המטענים מסודרים על פני המעטפת
0
הגלילית של ה-
הטבעית בצורה הליכםיח כפולה כאשר המרחקים בין
DNA
o
המטענים לאורך ההליכם הם
\A6.8׳׳ ובין המטענים הקרובים על שתי השרשרות של
0
ההליכם הכפול הם
12A
o
ו-
» 14A
צפיפות הגבוהה של מטען השלילי של
DNA
גורמת לשדה חשמלי חזק
על פני המולקולה .השדה החשמלי החזק מושך יונים נגדיים ,אשר ניקשרים
למקרומולקולה־ על ידי כך יורד המטען השלילי האפקטיבי ויורדת אקטיביות היונים
הנגדיים נחפיסה^''^ ,ברכוזי מלח מעל
N^"10
כותות הדתיה מאוזנים על ידי
־ 5א ־
כוחות המיצבים אח ההליכס והמבנה הטבעי נשמר .לעומת זה ברכוזי מלח נמוכים
הדחיה האלקטרוםטטית מתגברת ,גדל המרחק בין שניי המטענים השלילייים תוך פתיחת
ההליכם הכפול^^ .על כל ארבע נוקלאוטידים יש בממצע שלש קבוצות אמיניות
pK
בסביבות 4ושתי קבוצות
0
בעלות
1
H
1
•pK
לכן .כאשר מעלים
pHמעבר ל־־ 9מתחילה דנטורציה עקב הגדלת צפיפות המטען השלילים
את ה-
כאשר מורידים את ה pH -מתחת ליי,5מתחילות הקבוצות האמיניות לקבל מסען
o
חיובי .הקבוצות האמיניות נמצאות בפנים ההליכס והמרחק ביניהם הוא קטן )A3׳׳, (v
לכן עקב הפרוטונציה מתגברת הדחיה האלקטרוםטטית ביניהם הגורמת לשבירת קשרי
המימן ופתיחת ההליכם הכפול למרות הורדת צפיפות.המטען השליילית.הכללית •
כאשר מחממים
הפלח בתפיסה קורת
DNAפעל טמפרטורה מסוימת הנקבעת על ידי רכוז
שבירת קשרי הפימן ,איבוד המבנה ההליכםי וקפול תוך קבלת
פקעת אקרעית .בצורתה הלא טבעית של
השדה החשפלי קטנים יותר פאשר ב-
ליות האלקטרופורטית ואקטיביות
צפיפות המטען השלילי השטחי ועוצפת
DNA
DNAטבעית ,כפי שפתברר פמדידות המובי
י ו 3י
נ ת ר
ן
) , ( ^ 5 ) » ( 1 1 3המוביליות אלקטרו-
פורטית יורדת בהשואה למוביליות אלקםרופורטית של
יוני
+
Na
DNA
טבעית ואקטיביות
עולה.
לפרות הקטנת אורך המולקולה עקב דנטורציה מתקבלת הקטנת צפיפות
פטענה .ההקטנה הזו פקודה בהפרדה בין הםטענים שעל גבי שתי השרשרות של
ההליכם הכפול וכן באפשרות של הגדלת הפרחק בגלל דחיה אלקטרוסטטית בין שני
מטענים עוקבים על גבי אותה השרשרת .הפקעת הפתקבלת היא "שטופה" וצפיפות
המטען האפקטיבית נקבעת ע״י התחלקותו לאורך השרשרת בכל נ?!ת הפקעת.
מתקר של אינטראקציה בין
DNAלבין יונים מתכתיים חשוב מאד
לחקירת האינטראקציות בתוך ההליכם .בחקירת אינטראקציות אלו צריכים לעבוד
ברכוזי מלח נמוכים ,על מנת למנע מםוך הזרחנים .באינטראקציות בין
DNA
־ 6־
לבין יונים מתכתיים נדון בהמשך .בנוסף לכוחות האלקטרוםסטים פועלים בוזוך
ההליכם כוחות אתרים.
הכוחות המיצבים את ההליכס הם קשרי המימן בין הבסיסים המתאימים,
והכוחות ההידרופובים.
)(7
קיום קשרי הםימן הוכח בסיטרציות פוסנציומטריות׳י ,היום ידוע,
שלא רק קשרי המימן אחראיים ליציבות ההליכס ,נוסף לכם פועלים כוחות הידרו-
פובים )כוחות ון דר וולס ,אינטראקציות אלקטרוני זן( .הוכחה לקיום כוחות
הידרופובים היא האפשרות לדנטורציה הפיכה של
DNA
על ידי ממיסים אורגנים,
אשר אינם שוברים קשרי המימן ,אבל משפיעים על הקשרים ההידרופובים ועל
שכבת המים סביב ה־
8
^ .^^DNAאינטראקציה בין
DNA
ו-
PVPיכולה לשמש
מודל לתקירת האינטראקציות ההידרופוביות ,אשר בתוך מולקולת ה-
DNA
.
־ 7־
(2
אינטראקציה בין
DNAלבין חלבונים ,פוליפפסידים ופוליאלקטרוליטים
בסיסיים.
עוד ב ^ G r e e n s t e i n and Hoyer ^ 1950-מצאו ,ש-
D N A
10
מונעת
קואגולציה תרמית של סרום אלבומין .הם הסיקו טכך ,שהקואגולציה נמנעת
בגלל יצירת קומפלכס בין שני המרכיבים וכי הקומפלבם איננו קשור על ידי
כוחות אלקטרוסטטים בלבד.
1
°
1
1
1
• ^ G o l d w a s s e r andPutnamהוכיחו קיוטו של הקומפלכס זה
באלקטרופורזה.
)(12
מאותר יותר
Geiduschek and
- Doty
אלבומין של בקר לבין
חקרו את האינטראקציה בין סרום
DNAבטמפרטורת החדר בשיטת פיזור האור .כאשר שני
המרכיבים טעונים במטען בעל אותו סימן לא היתה כל אינטראקציה ,ואילו
ב
־pH*•5»5
נמצאה אינטראקציה תלשה מאד .קישור תלש זה איננו מספיק
להסביר את מניעת שקוע החלבון
ע
ל »־י
ד
- DNAומכאן הסיקו ,שעקב דנטורציה
של DNAנוצר קישור הזק יותר ,והוא שמונע את שקוע החלבון.
)(13
Zubay and Doty
הבתה זו הוכחה על ידי
באולטרצנטריפוגה אחרי חימום של תערבת
כל הנםיונות האלה נעשו בתנאי
אשר קבלו מרכיב אחד בלבד
DNAומרום אלבומין.
pHאשר בהם לשני המרכיבים מטען שווה סימן
לכן יש להבחין בין קומפלכםים אלה לבין אותם קוטפלכםים ,שנוצרים בין DNA
טבעית .וחלבון טבעי בתנאי ,, pHאשר בהם לשני המרכיבים מטענים הפוכים.
לקופפלכםים אלה חשיבות ראשונית ,כי הם מהווים מודל לקישור
ש
ל DNAבתא החי.
קומפלכםים מסוג זה נחקרו כבר מתחילת שנות החמישים על ידי
־
4
1
14
* ^Alexander .ו־ * • •
5
1
•
,
^ S t e i n e rהכין קומפלכםים של DNA
עם פרוטמין ביחסים שונים וברכוזי מלח שונים .הוא מצא ,שברכוזי מלח גבוהים
הקומפלכם מתפרק למרכיביו ,ומכאן מתבקשת המסקנה שעיקר הקיטור הוא קישור
־ 8־
אלקטרוםטטי•
יש
מטען
על
תופשי
ידי
צביעה
התלוי
במרכיב
אינטראקציה
אמין
)פוליויניל
בצבעים
בסיסיים
שהיה
בין
הומציים
מצא,
בעודף.
^ ס ל ב י ן
ופוליליזין(
או
הוא
שלקומפלכס
היםטון
נחקרה
ובין
סינטטים
פוליאלקטרוליטים
^ ^Crompton e t a l .
על-יזיי
) ( 1 7
'Spitnik e t a l .
נחקרה
במיצוי,
או
אינטראקציה
ופוליויניל
שאם
נמצא,
•י
שנכנסים
בין
א מ י ן ( אשר
מ ע ל י ם את
נמוכים
מ א ד של
גבוהים
הקומפלכס
אלקטרוסטטים
לקבע
מטרת מחקרם ה י ת ה
!?יםטובים י !.
אחראיות
על מנת
המרכיבים
שוקע
חשובים
כאן
שימשו
רכוז
תחילה
התכונות
האופיניים
קומפלכסים
ואח״כ
לחלבון
מסיסים
מתפרק
באינטראקציות
ה מ ס י ס ו ת של
במים.
למרכיבים.
לשם
היםטונים.
הקומפלכם.
לעומת
מכאן
זה
הסיקו,
אלו.
16
על
ראשונה
אשר בה ש מ ו
DNA
מלח
שכוחות:
/
1
לב
ברכוזים
ברכוזי
ל מ ע ש ה ע ב ו ד ת ם של P r o m p t o n et al .ו ־ ^ S p i t n i k et al .
לשמירת
כך
)פוליליזין
עם
DNA
הקומפלכם
עצמו.
בסיסיים
ל א י נ ט ר א ק צ י ה של
יורדת
ל פ ר ק צ י ו נ צ י ה של
ה ח ש מ ל י ו ת של
פוליאלקטרוליטים
המרכיבים
קבלו
טובים
גורמים
מודלים
שני
מאד
ל ב ר ר אם
לבין
DNA
תנאים
ביותר
נוקל**ו-
נשמר
ה ת נ א י ם בהם
המבנה
היא ,ע ב ו ד ה
ה מ ש נ י של
)(18
ה-
בנו
Feughelman et a l . DNA
o^^.DNA
;
שקבוצות
ב ס י ס י ו ת של
מנטרלות
אותן.
של
סוס,
עוצמה
תלות
זו
בין
.DNA
19
מצא
יונית,
ופועלת
של
הוא
ב-
מ ו ד ל של
נוקלאופרוטמין
מפוליארגינין
^^Sokol
ח ק ר את
שהאינטראקציה
יחם
pH
שרשרות
צדדיות
המרכיבים
ובעוצמה
השיירים
נמצאות
ורכוזם
ה ח י ו ב י י ם של
קרוב
האינטראקציה
מושפעת
היונית
בצורה
מאד
מן
לקבוצות
בין
DNA
הגורמים
זרתניות
לבין
הבאים
םרום
:
כזו,
ובחלקן
אלבומין
מה-
, pH
הכללי.
מראה,
םרום
שהאינטראקציה
אלבומין
של
היא
סוס
אלקטרוםטטית
ובין
הקבוצות
בעיקרה,
הזרחניות:
־ 9־
מתחילת שנות הששים נעשו כמה מחקרים מענינים על האינסראקציה
ב
ין
A
DN
20
לבין היםטונים ,פרוטמינים ופוליליזין ^ H u a n g et al^ . ,מצאו
שאינטראקציה בין
DNAלבין היםטון גורמת לעלית קבוע הסדימנטציה
ולעליה טמפרטורת ההתוך
ש
ל
ה
_ DNA
שגלזזז.
)(21
Akinrimisi et a l .
עקבו אחרי אינטראקציה בין
פוליליזין ובין פרוטמין .ברכוזי מלח נמוכים עד
נטיה להתקשר יותר עם ^סטבעיוז מאשר עם
גבוהים )אפילו
(1
DNA
לבין
0.2Mלכל הפוליבסיסים
^םקגקןבדה דנטורציה .ברכוזי מלח
Mא י ן התפרקות שלמה של הקומפלכס -מה שמעיד על קישור
ספציפי ואלקטרוםטטי גם יחד .נטיה קטנה יותר ל-
DNAשעבדה דנטורציה
הוסברה על ידי הקטנת המטען עקב הקיפול ועקב איבוד צורת ההליכם.
השפעתה של אינטראקציה עם פוליליזין על יציבות המבנה המשני של
)(22
•
Tsuboi et al.
ה DNA -והיחס הסטיכיומטרי של המרכיבים נחקרה ::על י י זדי
- DNAפוליליזין שני מעברים בזמן חמום :ראשון בו ־.
הם מצאו בתמיסות
ניתכת -,־n־< DNA-החופשית ,ושני ,יותר גבוה ,של הקופפלכם .שתי הטמפרטורות
האלו בלתי תלויות ברכוז של פוליליזין המוסף ,אבל עם הגדלת רכוזן יורד
האפקט ההיפרכרומי במעבר הראשון ועולה בהתאם ב ש נ י .מן האפקט ההיפרברומי
במעבר ראשון נמצאה םטיכיומטרית הקישור -היחס של ליזין ל DNA -הוא 1ג • 1
10 -־
אינטראקציה בין ) DNA 3לבין חומרים מונומרים )לא מתכתיים(*
)א(
אינטראקציה עם חומרי צבע
^N(CH ).
(CH ) .
3
2
orange
קישור של חומרי צבע בסיסיים ל-
3
Acridine
DNAנחקר רבות .למחקרים אלה
חשיבות בגלל שימוש בצבעים לזיהוי חומצות הגרעיניות בתאים ובגלל האפקט
)(25
המוטגני של אקרידינים מסוימים׳^
.
התכונות האופטיות של תמיסות מרוכזות של חומרי הצבע אינן מתוארות
ע״י חוק באר .תופעה זו נובעת מאגרגציה על ידי
ארומטיות
stackingשל מולקולות
פלנריות ,אחת מעל השניה ואינטראקציה מערכות אלקטרוני
זז
והיא
מתבטאת בשינוי בעוצמת הבליעה באיזור הנראה.
)(24
תופעות דומות מתקבלות בתמיסות מהולות בגלל אינטראקציה עם
האינטראקציה עם
DNA
״
DNAנבדקה ב , pH -אשר בהם החנקנים של תומר הצבע נושאים
מטען חיובי.
נמצא שהגורמים הבאים משפיעים על האינטראקציה של
2
הצבע :העוצמה ה י ו נ י ת ^ /מבנה משני של הDNA -
כמו כן נמצא שאקרידין אורנגי מיצב את ה־ DNA
DNAעם חומרי
והרכב הבסיסיט^^;
28
מפני דנטורציה תרפית^ ^.
־ 11־
24
^Wolf
^ B r a d l e y andבהסתמך על בחונים ספקטרלים הציעו םודל
שבו הצבע ניקשר על פני מולקולות DNAבקשרים אלקטרוסטטים ונוסף לכך בעודף
של צבע המולקולות הסמוכות מגיבות ביניהן על ידי
29
et al^ .
.stacking
^ B o y l eמצאו ,שאקרידין אורנג^ נותן שני קומפלכסים עם
(23).
קיומם תלוי ביתסי רכוז־ של DNAלרכוז תומר הצבע.
Lerman
DNA
-
מצא ,שאינ
טראקציה בין אקרידין אורנג* ובין DNAמלווה בהגדלת הצמיגות והקטנת מקדם
הםדימנטציה .הוא הסיק ,שאקרידין אורנג* ניקשר ל DNA -על ידי
intercalation
בין זוגות הבסיסים תוך סיבוב קטן של ההליכס הכפול .החדירה מתאפשרת הודות
לדימיון בשטחים של אקרידין אורנג' ,פורינים ופירימידינים ומישוריות המולקולה.
(23).
באינטראקציה זו פועלים בעיקר כוחות ון דר וולס .לפי טענותיו של
Lerman
הקומפלכס הראשון אשר בו אקרידין אורנג' ניקשר חזק יותר נוצר על ידי
,intercalationבקומפלכס השני הקישור הוא תלש יותר על;'פני המולקולה של• . DNA
בזמן האחרון פורסמו הוכחות לכך שלכל הפחות תלק של מולקולות אקרידין אורנג'
המגיבות עם DNAאיננו ניקשר על ידי
)(31)(30
ל ז ר ן ז נ י ם
, i n t e r c a l a t i o nאבל נמצא קשור מבחוץ
־
)ב( אינטראקציה עם פחמימךם ארומטיים פוליציקליים.
קבוצה שני?ז של .חומרים ,אשוד מחקר האינטראקציה שלהם עם^\ם תשוב־ מאה־ לבירור
בעיות קר צי נ וגנ יות הם פחמימנ ים י ארו מט י ם ׳פוליציקלים -לדיו גמא
3,4 - benzopyrene
- 12
חומרים
אינם
אלה
אינטראקציה
קבוצות
מכילים
אלקטרוסטטית
או
אטומים
והאינטראקציות
בסיסיים
היחידות
לא ב א ה
לבן
הן
האפשריות
בחשבדן
אינטראקציות!
הידרופוביות.
C
L i q u o r i et
״al
) ( 3 4 :
(33)32
.o
et a l .
)
Ts
Boy land and Green
)(32
מצאו
מ י מ י ו ת של
שתמיסות
טוענים
Green
ממיסות
DNA
ש פ ת מ י מ נ י ם אלה
פחמימנים
ע
מגיבים
ארומטים,
בדומה
DNA
ם
B o y i a n d ana
לאקרידינים
ידי
על
)(34
אינטראקציה
הידרופובית
האינטראקציה
תוך
כניסת
היא
תלך
ורטיקלית
מולקולות
.ל ע ו מ ת ז ה ל פ י L i q u o r i et 8 1 .
intercalation
בין
ב ס י ס י ם של
בחללים,
פחמימנים
DNAו ב י ן
בין
אשר
מ ו ל ק ו ל ו ת של
ה ש ר ש ר ו ת של
DNA
פחמימנים
-
,
)f 35
עקבו
* 'Chikayoshi Nagata e t a lיי
ומצאו
ביחס
אינטראקציה
לציר
ס פ צ י פ י ת עם
אחרי
הבסיסים.
אינטראקציה
בחומרים
זו
השונים
ב ד י כ ר ו י ז ם של
סידור
נוצר
זרימה
שונה
ההליכם.
)ג(
בין
אינטראקציה
לבין
DNA
פורינים,
נוקלאוםידים
פירימידינים,
ונוקלאוטידים.
וקבוצתו
Ts'o
פירימידינים
פורין
ו נ וקלאוםידים.
גורמים
חושבים
שאפקט
הידרופובית
חקר
חזקה
את
זו.
המונומרים
מונומרים
טמפרטורת
ההתוך
חשוב
ידי
מאד
את
ה ב ו נ י ם את
חומצות
הבעיה
תומצות
שפירימידינ ים,
-
Tmשל
נוקלאוםידים
צ ו ר ת הפקעת
ה ה ל י כ ם י של
התקיפו
לבין
על
י ו ת ר עם
זו
מבנה
הם
הם
מצאו,
דנסורציה
אינטראקציה
המיצבות
שאלה
להורדת
חקרו
את
האינטראקציה
לבירור
בכמה
צורת
שלבים
אורידין,
טימידין,
•
והבסיסים
מאשר עם
et a l
אוראה,
DNA
א פ ש ר ו ת של
. DNA
ב
י
ן
לבין
DNA
פורינים,
הנ״ל
נובע
ה ה ל י כ ס של
קיום
'Ts'o
מאינטראקציה
DNA
אינטראקציות
ניסו
י
.
הידרופביות
לענות
:
)א(
ח ק ר ו את
האינטראקציה
בין
הגרעיניות^^
)ב(
את
האינטראקציה
בין
ג ר ע י נ י ו ת ^ ^ .
כדי
חקרו
ל מ נ ע א פ ש ר ו ת של
אינטראקציה
על
־ 13־
אלקטרוסטטית עבדו עם תופרים בלתי טעונים :נוקלאוסידים ובסיסים״ מדדו את
לחץ האדים בתפיסות של פורינים ופיריפידינים לבדם ופצאו שנוקלאוםידים של
פורינים ופיריפידינים פגיבים בתפיסה בפידה גדולה בינם לבין עצפם).(37
נטיוהם של נוקלאוסידים פורינים לאסוציאציה היתה הרבה יותר גדולה פאשר
של נוקלאוםידים פיריפידינים .כפו בן נבדקה האינטראקציה בתערובות של
פורינים עם פיריפידיניס .הם הסיקו ,שנטיה לאסוציאציה של פונופרים בלתי
טעונים בתפיסה עולה לפי הסדר הבא :
< purine - purine > purine - pyrimidine
pyrimidine - pyrimidine
s t a c k i n gעם חיפוי חלקי.
האסוציאציה היא כנראה על ידי
נחקרה גם ההשפעה של מונופרים אלה על יציבוון פבנה פשני שלה־DNA-.
פורינים ,נוקלאוםידים פורינים ,פיריפידינים ,נוקלאוסידים פיריפידינים
DNAבתפיסה בטפפרטורת החדר ,כי לא היו
אינם עוברים אינטראקציה עם
שינויים בספקטרה אבל חופרים אלה פורידים טפפרטורת ההתוך Tm -של • DNA
0
גם כאן הפסקנה היא ,שיעילותם בתור גורפי דנטורציה נובעת פאינטראקציות
הידרופוביות עם צורת פקעת ולא מיכולתם לשבר קשרי פיפן .לחופרים הנ״ל
נטיה גדולה לצורת פקעת יותר פאשר לצורת ההליכס ובתפיסה ביתד עם
DNA
יגרמו בזפן החיפום להקטנת האינטראקציה בין הבסיסים עצפם אשר ב-
DNA
והחלשת ההליכם.
)ד( אינטראקציה בין
DNAלבין חומרי רפואהז שונים .
. ,״)(38
האינטראקציה של DNAעם תרופות שונות נחקרה.
an
al•Eron
et
יביופי
t
.
3
עליה ב-
r
e
l
l
e
G
^
9
3
'Reich
^
* חקרו את האינטראקציה של
actinomycin
) ^ 9 ) ( 3 9שעקב אינטראקציה
מ צ א
DNAעם
חלה;
Tmונפצאו שינויים בצפיגות החפיסה ובספקטרום של חופר הרפואה.
)(36
־ 14־
. intercalation
ממדידות דיכרויזם הזרימה התקבל ,שאין כאן אפשרות של
המסקנה היתה ,שהאינטראקציה תלויה ביחס המרכיבים ובסוג הבסיסים .כמו כן
)(40
actinomycin
מונע את הידרוליזת
DNA
על ידי
deoxyribonuclease
.
גם חומרים אנטיביוסים אתרים גרמו לעלית היציבות התרמית של
4
>< »DNA
4 2
<.
מסקנתם היא ,שהקומפלכסים נוצרים על ידי קשרי מימן וקשרים אלקטרוםטטים
מאחר שרכוזי מלח גבוהים מפרקים את הקומפלכסים.
במקרה של אינטראקציה עם
bromide
eth;Ldidium
ethididium bromide
היות החומר הוא קטיון ישנה אפשרות של אינטראקציה אלקטרוסטטית )הוספת
^MgC
מקטינה את הקישור( ,אבל נוסף לכך יש גם
4
גם חומר זחזמונע הידרוליזה אנזיממית ש ל ^ ם ^ ^ ״
4 3
4 4
^^intercalationי^ ^.
־15
־
)ה( אינטראקציה עם אמינים.
בתור מודל של אינטראקציות במערכות ביולוגיות עקבו אחרי
אינטראקציה בין אמינים לבין חומצות גרעיניות.
., cadaverineפוטרםצין -
ידוע שאמינים כמו ספרמין ,ספרמידין ,קדאורין -
putrescineנמצאים בחומרים ט ב ע י י ם ^ ^ ,האינטראקציה של DNAעם אמינים
אליפטים מסוג
46a),(4
של
2
H N(CH ) NHוטטרה אמינים אליפטים כגון ספרמין גורמת
2
.
Tm
עלית הTm -
n
)
2
A
N
D
(
.
)(45
תלויה ברכוז ובאורך השרשרת של האמין
אופטימלי כאשר
5־ ת ( ,העוצמה היונית משפיעה
ג
ם
)) (46האפקט הוא
על , ( T m (45שינוי
בטמפרטורת ההיתוך יתםי לאחוזי המול של אדנין +טיפין
)(45
) Tm ) (46עולה
עם הגדלת תכולת שני הבסיסים( .האינטראקציה עם אמינים אליפטים דורשת מבנה
של הליכם כפול של - DNAאין אינטראקציה עם
DNAבעלת שרשרת אתת או עם
. ( R N A (45
)(45
Mahler
הסביר את השפעתו של אמין על Tmעל ידי אינטראקציה
של הקבוצות האמיניות הטעונות עם הזרחנים של ה. DNA -
אבל יחד עם זה
לאמינים אלה יש שייר אורגני גדול המאפשר אינטראקציות ספציפיות .אינטראקציות
אלה ב:אמת
התלות ב-
מתקיימות ,מאחר שמעל n = 5יש ירידה של
Tmולא עליתה.׳
A + Tניתנת להסבר על ידי אינטראקציה עם בסיסים ,אבל מצד שני
לא נמצא שום שינוי בספקטרום של , ( D N A (45אשר צריך ללוות אינטראקציה
עם הבסיסים .אינטראקציה עם הזרחנים של DNAמסבירה את השפעתם של המדיום
והעוצמה היונית -מולקולות האמין מגשרות בין שתי השרשרות strands -תלך
ניטרול המטען של הזרחנים ועל ידי כך ההפרדה של שתי השרשרות קשה יותר.
מודל המסביר את האינטראקציה בין
DNAוספרמין נבנה במחלקה לקריםטלוגרפיה
של מכון ויצמן ) ( 4 8־ לפיו אפשר לראות ,שבאמת םפרמין היושב ב-
- groove
־ 16־
שקע אחד מתקשר לזרחנים של שתי השרשרות•
נחקרה גם השפעה של מונואמינים על יציבות של ( D N A(49נמצא ,שהם מקטינים
את יציבות הליכם ה DNA -והקטנה זו גוברת עם הארכת השרשרת• ההסבר הוא,
שמולקולות מונואמין
הנושאות סטען חיובי אחד בלבד אינן יכולות לגשר בין
שתי השרשרות ולעומת זה הגדלת השייר האורגני מאפשרת אינטראקציות הידרו-
פוביות המקטינות את היציבות•
על מנת לבדוק את האפקט של המטען החיובי והשייר האורגני בעת
50
ובעונה אתת ^^ M a h l e r and Dutton
חקרו את האינטראקציה בין DNAלבין
.cyclobuxine
cyclobuxine
cyclobuxineהוא אלקלויד םטרואוידי ,וב-
pH
7
הוא דיקטיון; המרחק
o
מצא שלד אורגני גדול
50
ו
צ
פ
י
ד
•^ ^ M a h l e r and Duttonמצאו שלאחר אינטראקציה בין חומר זה "ובין
A
.
DNA
)בעוצמה יונית נמוכה ובריכוז נמוך של דיאמין( יש יצוב של המבנה הטבעי של
; DNAברכוזים גבוהים של
cyclobuxineמקבלים יצור של הפקעת ,לאינטראקציה
מתלווה שינוי בספקטרום של • DNAלהסבר תופעות אלה הוצע מנגנון המניה
־ 17־
שתחילה מתקשר ה-
cyclobuxineלאתרים מסוימים על פני ההליכס )המרחקים
בין החנקנים הטעונים מתאימים יפה למרחקים שבין שני הזרחנים של שתי
השרשרוח מעל שקע אחד( לכן קשור של החנקנים לזרחנים מיצב את ההליכס,
לעומת זה הורדת היציבות נובעת מאינטראקציה
חלשה יותר עס אתרים מסוימים
על פני הפקעת המופיעים עקב דנטורציה .םטיכיומטריה של הקישור זה איננה
ידועה עדיין.
18 -
אינטראקציה בין DNAלבין יונים מתכתיים,
(4
ידוע ש־ RNA , DNAופולינוקלאוטידים םינטטיים מגיבים עם
קטיונים מתכתיים .נוכחות זרחנים הנושאים מטען שלילי חשובה מאד בקישור
היונים המתכתיים ל . DNA -הכוחות העיקריים האחראים לקישור זה הם כוחות
אלקטרוםטסים ,לכן קישור של קטיונים יושפע על ידי העוצמה היונית של
התמיסה ומידת הקישור תקטן עם הגדלת העוצמה היונית.
+
a
+
M
+
+ +
נ קשרים תזק לC a • Mg
-
עוד ב־1953
51
*•Shack etמדדו את הקישור של
al*- .
»
++
A
C aן-
N
+ +
D
.
M gלDNA -
)במים מזוקקים( על ידי מדידות קונדוקטומטריות.
מן התוצאות שלהם אי אפשר לקבל מסקנות חד משמעיות ,כי בזמן בצוע עבודה זו
לא היה ידוע עדייןDNA^ ,
•'Zubay and Doty
++
Mg
52
עוברת דנטורציה ספונטנית בתמיסות מהולות של מלח^ ^
•י מנסי ו נ ו ת יהם הסיקו ,שמקבלים קישור של פחות מאקוולנט
לאקוולנט DNA
־
ONAשעברה דנטורציה קושרת חזק יותר
++
, Mgמאשר
DNAטבעית .המסקנה שלהם היתה שהקישור הוא לפורינים על ידי יצירת צ*לטים•
'Felsenfeld et a l .
לא אישרו תוצאות הנ״ל ומצאו שגם
Mnו-
אחרי דנטורציה קושרות באותה מידה
DNAטבעית וגם
. Mgהיחס הוא אקוולנט אחד של
המתכת למול זרחן פולימרי .את דרגת הקישור אפשר לשנות על ידי שינוי . ^ ^ p H
5
^Alles
^•Frieden andמצאו ש־
++
C uניקשר לתומצות גרעיניות וטענו שאתרי
הקישור הם הבסיסים ועקב קישווד נוצרים צ*לטים בין המתכת והחנקנים.
++
Mgהביאה
סתימת קבוצות אמיניות על ידי פורמלדהיד והקטנת מידת הקישור של
את
57
^ ^Zubayלידי מסקנה ,ש-
• 'Banderjee and Perkinsי
ל־ DNAו־ . RNAבין
5-7
pH
++
Mgניקשר לא רק לשייר זרחני ,אבל גם לבסיסים.
חקרו קישור של
, Mg , Ca , Mn
, Zn
Co
התקבל קישור קבוע עבור כל היונים הנ״ל גם לגבי
־ 19־
וגם
RNA
- DNA
לגבי
היתה
המסקנה
הוא
שהקישור
זרחניות.
לקבוצות
)59־(
Davidson
שתגובה
זו
שינוי
בספקטרום
מתכת
כל
Yamane and
מורידה
התופעות
המסקנה
פרוטונים
גם
גם
,
DNA
נמצאו
ממדידות
גבוה
הן
שניים
של
)(N0.1
עולה
שני
כספית
)ל
לבסיסים
הסדימנטציה,
מקדם
התלויים
קומפלכסים
על
ידי
אשל
חומר
גואנין(
חל
ביחס
פ ר ו ט ו ׳ נ י ם ו ־ ד י ר י י ד ת ! י Tm
בש״יחרור
הוצאת
ו ב י ן DNA
Ag
יותר
או
פרוטונים
DNAע ם
+
מנגנון
נתקרה
ל
ש
של
, DNA
המקמפלכמ אותה.
שמסביר
מה
רק
קבעו
ש ל
הקישור
+
על
את
של
ידי
שיחדור
^Davidson
הפעם
לא
קומפלכס
חל
and
שינוי
-
שני
*•Yamane
בצמיגות
המסקנה
הקישור
ל D N A
של
נחקר
כסף
בזמן
A
ל-
N
האחרון
D
של
היתה
התקשרותההמתכת׳ילחגקנים
קבועי
- A g
60
ידי
אבל
במקרה
נוצרים
הם
על
קמפלכםים,
היה
Ag
פוטנציומטריות
.
עם
זה
קיום
מלווה
ניקשרת
+
בין
ושיתרור
שקומפלכםים
הפיכות
יחד
על
עם
של
ל DNA -
הם
אינטראקציה.
אינטראקציה
כאן
) DNAה מ צ ב י ע
שכספית
עקב
את
התמיסה
האינטראקציה
אלה
היא,
צמיגות
של
לפולימר(,
חקרו
הקישור
כספית
.
מצאו
של
הבסיסים.
ברכוד
על
מלח
ידי
ן
62
/ ^6
et
al,
בספקטרום
and Davidson
של
DNAנ מ צ א ה
DNAה מ ל ו ו ה
עליה
עבור
השני.
אפקט
קואופרטיבי
אינטראקציה
בטמפרטורת
צמיגות
התמיסה
-
J e n s e nת ^ 3 1 1־
הגדלת
עם
ה ה ת ו ך ^ -
ירדה
מידת
ומקדם
הקישור
כסף.
עבור
בעקומות
הקומפלכם
הםדימנטציה
הגדלת
עם
ההתוך
של
הראשון
עלה.
מספר
1
6
^ מ צ א ו
שינוי
תערובות
והתרחבות
כסף
-
המעבר
נמצא
שבקישור
זה
ישנו
האתרים
התפוסים
על
ידי
1
המתכת.
מטען
המסקנה
חיובי
לתוך
הסדימנטציה.
מהם
זו
הוא
מלווה
היא,
שאתרי
השרשרת
בקומפלכם
.G-C
הפולינ ו קלאוטידית
הראשון
בקומפלכס
בשיחרור
הקישור
אינם
הזרתנים,
הכסף
השני ׳המתכת
פרוטונים
ובשבירה
נלכד
בין
יוצרת
של
ישנה
קשרי
עליה
שני
קשר
כי
אם
בטמפרטור
זוגות
כימי
המימן,
הבסיסים־
עם
ת
הבסיסים
הבסיס
ואילו
עקב
הכנסת
ההיתוך
בתנאי
שאחד
)גואנין(.
המתכת
ובקבוע
המגשרת
תגובה י
בין
־ 20־
שתי השרשרות לא נותנת להן להפרדד ,כי המבנה של ההליכס הכפול נשאר בעינו.
ול( 6
Jensen and Davidson
ספקטרופוטומטריה,
חקרו את האינטראקציה ב י ן ^ ם לבין כסף בעזרת
פוטנציומטריה וצנטריפוגציה בגראדינט של צסיום כלוריד.
הם מצאו שלשה קומפלכםים שונים הנוצרים בתנאים שונים של היחס : DNAמתכת
ושל ה . pH -מידת הקישור היתה תלויה בהרכב הבסיסים ,אשר ב_ . DNAסוגי DNA
העשירים ב G-C -קישרו כסף יותר סוב מאלו העשירים ב . A-T -התגובה היתה
מלווה בשינוי צפיפות של . DNAעל ידי הוספת " CNהתקבל ספקטרום רגיל של DNA
ומכאן שהקישור ל־ DNAהוא הפיר .הצפיפות חזרה לערכה הראשון ואפילו נמצאה
פעילות ביולוגית קודמת ב . XDNA -במודל הקישור הפוצע הכסף מגשר בין שני
בסיסים של שתי השרשרות ,מקבלים
) (N-Ag-Nתוך שמירת המבנה ההליכםי
0
מחקרים רבים נעשו על הקישור של נחשת DNAOבגלל השפעתה השונה של
A
מתכת זו לגבי יציבות התרמית של , DNAנזב(גורם להורדת Tmשל,(63),(64
++
N
D
(
),(65)(66כאשר הוא נמצא ביחסים אקוולנטים או בעודף לגבי הביופולימר ואילו
בעודף גדול מאד של DNAלגבי המתכת מקבלים עליה קטנה ב . ( T m(64-ירידת Tm
++
היא פונקציה של היחס נחשת ^ :ס ו ק ו ר י ת רק כאשר מחממים DNAע ם C uבעוצמה
יונית נמוכה .תהליך הדנטורציה הוא הפיך -הוספת רכוז גבוה של מלח
)(< 0.1N
או הוספת חומר המקמפלכס נחשת מחזירה את Tinלערכה ההתחלתי.
6
^ ^ E i c h h o r n and Clarkהציעו מנגנון ,שלפיו
+ +
C uניקשר לבסיסים
של שתי השרשרות על ידי קשרים קואורדינטיבים תוך שבירת קשרי מימן ושבירת
מבנה משני של ,DNAאבל אפילו במצב בלתי טבעי
)(denatured
++״
Cuמחזיק
את שתי השרשרות ביתד וזה מסביר את הרנטורציה עם הוספת רכוז
גבוה של אלקטרוליט.
,
- 21
67
et al*• .
לכםים
^Coates
מדדו את הספקטרה הנראה והאולטרה סגול של הקומפ-
+ +
במטרה לקבע מה הם אתרי הקישור של
Cu
j DNAהם מצאו שינוי
ל-
++
Cu
בספקטרום של בחשת רק כאשר
ושניהם תוממו ביחד .מסקנתם
הוסף לDNA -
+ +
היתה ^ C u -ניקשר לזרחנים בלבד־ ורק לאחר חמום זדי DNA -בנוכחות נחשת ,הוא
ניקשר
לבסיסים.
68
תוצאות דומות נמצאו על ידי ^ E i c h h o r n et al^• .
בספקטרום האולטרה-םגול של
של DNA
.הם לא מצאו כל שינויים
DNAטבעית לאחר הוספת •י
+ +
־
, C uואילו בספקטרום
שעברה זדנטורציה נקבעה חזוזה ב) - peak -שיא הבליעה( והובחן שינוי בעוצמה,
אבל לא היה שיחדור פרוטונים .מכאן הסיקו שנחשת יכולה להתקשר הן אל הזרחנים והן
אל הבסיסים ,לפי החנאים.
++
69
^Zimmer
^ V e n n e r andחקרו קישור של 0:
של הרכב הבסיסים ב-
גרעיניות עשירות ב-
^
+ +
לDNA -
Cd
כפונקציה
. DNAאפקט הורדת Tmעל ידי נחשה היה גדול יותר אצל חומצוח
G-C
מאשר אצל העשירות ב» A-T -
הם טוענים ,שבעודף גדול של DNAביחס למתכת הקישור הוא רק לזרחנים ,מה שמתבטא
בהעלאה קטנה של
Tm־ כאשר המתכת היא בעודף מקבלים ירידה חזקה של Tmעקב התקשרות
של המתכת לזוג ) G-Cכנראה; ל-
?
Nאו
0של גואנין( והקטנת
קישור של יונים חד ודו־ערכיים שונים אל DNA
יציבות של ההליכס.
נקבע גם על ידי מדידת השפעתם של
נידות האלקטרופורטית של הביופולימר .חזק הקישור של יונים דו-ערכיים )המוביליות
7
> Ca
לפי
+
+
71
+
+
g
M
s
g
g
u
+
+ +
של
ישנן הוכחות נוספוח
(72
(
. DNA
ש-NMR
r
+
> ( t e t r amethylammonium> K^ ^)Li > Na
Ni
c
TMA
++
Co
++
Mg,
^ R o s s and S
.
נקשרים לזרחנים
- 22
־
נראה שאפשר לחלק את היונים המתכתיים לשתי קבוצות ,לפי השפעתם
על המבנה המשני של
:
DNA
)א( המגדילים יציבות תרמית של
), (63),(73
++
, Fe
+ +
, Zn
+ +
,Ni
++
DNAומעלים את
, Co
++
++
, Mn
)ב( המקטינים יציבות תרמית ומורידים את
, Ba
Tmשל
+ + +
)(65), (69
Fe
Tm
++
, Ca
DNA
++
, Pb
ולפי אתרי הקישור המשוערים אפשר לחלקם לשלש קבוצות :
+ + + . . + +״
.י
.
/
Ca
, Na , Mg
א( הניקשרים לזרתנים בלבד
++
++
/
Cd
ב( הניקשרים גם לזרחנים וגם לבסיסים , Cu
ג(
הניקשרים רק לבסיסים
++
, Hg
+
. Ag
++
, Mg
+
Na
++
, Cd
++
Cu
־
23־
(5חקירת האינטראקציה בין פולימרים ובין יונים מתכתיים בשיטה
הפולרוגרפית.
)(74
השיטה הפולרוגרפית מבוססת על עבודתו של
Heyrovsky
.הוא
היה ראשון אשר מצא את הקשר בין זרם ומתח באלקטרוליזה בשימוש באלקטרודת
כספית קטנה.
הזרם המתקבל על פני האלקטרודה פרופורציונלי לשרש מקדם הדיפוזיה של החומר
העובר תגובת האלקטרודה ,לשטח האלקטרודה ולרכוז החומר בתמיסה.
הוספת חומרים פעילי השטה גורמת להקטנת זרם הדיפוזיה .הירידה יכולה לנבוע
) ( 7 5
מםפיתת החומרים על פני האלקטרודה וכיסויה׳•^' יי ,מה שמקשה מעבר היונים
לאלקטרודה ,או מהקטנת מקדם הדיפוזיה של החומר המגיב על האלקטרודהז בגלל
התקשרותו לפולימר בעל מקדם הדיפוזיה קטן יותר משל התומר המתכתי
).(76
השפעת התקשרות עם חלבונים על זרם הדיפוזיה של יונים מתכתיים ונםיונות
לחישוב קבועי אסוציאציה מנתונים אלה נבדקה על ידי כמה חוקרים
),(79
),(77
)»(78
).(80
ההנתה העיקרית של חוקרים אלו היתה ,שהתגובה בין חלבון ובין מתכת איטית
לגבי "זמן־החיים" של טיפת הכספית ולכן כל מרכיב ינוע לפי מקדם הדיפוזיה
שלו והזרם ישווה לסכום זירמי הדיפוזיה.
(
(81
L a p a n j e and Omanחקרו את הקישור של
ו-
82
^ ^l,apanjeחקר את קישור של
++
++
C dל-
polystyrene sulphonate
C dלפפסין .ההנחה העיקרית שלהם היתה,
שרק היונים המתכתיים החופשיים תורמים לזרם הדיפוזיה וזרם המיגרציה .אם
מניחים שקישור המתכת הוא רק אלקטרוםטטי אז ברכוז אלקטרוליט יסודי אפם
הקישור יהיה שלם ובריכוזי מלח גבוהים לא יהיה קישור בכלל .יחס הזרמים
ברכוז מלח
0לרכוז מלח גבוה יתן את שבר היונים החופשיים־ דרגת הקישור
־
תהיה
t
f-1
־ דרגת
J°d
־ זרם
ה ד י פ ו ז י ה
Jd
־ זרם
ה ד י פ ו ז י ה
24־
J
D
°
־ JT־ 1־
1
במקרה
מלח
של
גבוהים
הנחות
כך
כל
בקישור
ללא
קדמיום
ו ב נ ו כ ת ו ת
נ כ ו נ ו ת
נמוך,
עד.
קישור
אם
לא
היא
חקרו
הם
מלח
הניחו
רק
זרם
איטית
על
י ס ו ד י
(»
0
ג ב ו ה ( .
א י נ נ ו
מקבלים
הניתרם
Wall
אלקסרוליט
הקישור
התגובה
הזרם
פולימתאקרילית.
)רבוד־
)רכוז
לפפםין
חלק
and
מלא
הפולימר
רק
כי
Gill
לחומצה
-
הקישור
קישור
אלה
f
F
מאדד
ידי
בשיטה
י ו נ י ,
השווה
כי
לזרם
ומקדם
מבוטל
ה פ ו ל ר ו ג ר פ י ת
שהקישור
הפולימר.
ה ד י פ ו ז י ה
הקומפלכס
הוא
אפילו
בהעדר
את
ב ר ב ו ז י
של
ביחס
קישור
הפולימר
לזרם
של
כללי.
Cu
ק ו ו ל נ ט י .
v״)(84
Kacena
ה ד י פ ו ז י ה
הנחתו
•התגובה
מושג
וחלק
"בזמן
של
ה ד י פ ו ז י ה
משקל של
היה
בנוכחות
ב י ן
ח י י "
הזמן
2
התלבון
חלבון
טיפוד.
t
ראשון
במצב
אשר
ובהעדרו
למתכת
הכספית
הק
ניסה
אל
לגזר
קבוע
נוסתה
הקישור
של
היא
מהירה
מאדד.
ש ו ו י
ולכן
המתכת
תמצא
חלק
שור
והזרם
בכל
ה ד י פ ו ז י ה
ה מ מ צ ע .ה ק ש ר ב י ן ז!דר
ינתן לפי הנוסחה הבאה :
התגובה
רגע
יהיה
0
id
-
זרם
ה ד י פ ו ז י ה
של
^
-
זרם
ה ד י פ ו ז י ה
D
2
בהעדר
-
מקדם
ה ד י פ ו ז י ה
של
ה י ו ן
-
.מקדם
ה ד י פ ו ז י ה
של
הקומפלכם
המוסף.
החופשי.
את
לחלבון.
ב י ן
הזמן
שתי
tj
הצורות
D,
י
l-+ K -
החופשי
למקזלם
•\rr37z־
n
הפולימר
v
לפי
במצב
פ ר ו פ ו ר צ י ו נ ל י
בנוכחות ובהעדר
י ״
הפולימר.
הפולימר
המתכת
משקל
•-
1+K
בנוכחות
המקשרת
יחס
זרמי
וקבוע
ן\
ו
ש ו ו י
^
IT
י
־
טעותו של
- 25
Kacenaהיתה ,שהניח שהתגובה היא מסדר אפס -ז״א אין תלות ברכוז
הפולימר ולכן הקבועים המחושבים לפי נוסחתו תלויים ברכוז התומר המקמפלכם.
תלוח ברכוזז הוכנסה על ידי
85
^ • ^ K o r y t aנוסחתו נכונה כאשר עובדים בעודף
גדול של חומר מקמפלכס ורכוזי המתכת החופשית ומתכת -קומפלכס בגוף התמיסה
הם דומים.
לפי מיטב ידיעתנו לא פורסמו שום נתונים על קביעה פולרוגרפית של
קישור יוני המתכות ל. DNA -
נוסחאות הנ״ל נמצאו בלתי מתאימות לחישוב קבוע הקישור של מתכות ל-
לכן בהחבםם על הנחוח דומוח M i l l e r
J
, DNA
גזר־ נוסחה לחישוב קבוע הקישור של
מתכות ל DNA -אשר פתוחה ניתן בחלק הנסיוני.
־ - 26
! 1חלק 3.סיוני.
(1
חומרים ושיטות העבודה.
)poly-4 v i n y l p y r i d i n e (4-PVP
H
H
־C—C
—
״sCH־־״C
— H
ת _
4-vinyl pyridine
4 v i n y l p y r i d i n e־poly
הוכן במעבדה על ידי פולימריזציה רדיקלית של -4ויניל פירידין
במחנול בשימוש .באיניציסור
. alpha-alpha-azo-diisobutyronitrile
חפולימד שוקע על ידי דיאתיל אתר ,את״כ הומם בתערבת מתנול-בנזן ויובש על
ידי ליאושיליזציח.
חמשקל חמולקולרי שלו נקבע ע״י מדידות צמיגות תוך שימוש בנוסתת Straussיי
וערכו .180.000הספקטרום של
PVP-4
נקבע בתנאי
pHשונים ובעזרתו חושבה
דדגח חדיםוציאציה כפונקציה של , pH
מאחד ,ש-
^\?4-איננו מסים במים מעל
4
pH
חימום עם אחיל ברומיד ,בתמיסה כהלית במשך h24ב-
הפכנו את החנקן שלו לקוטרנרי ע״י
,
5 0 °ה ח ו מ ר שוקע ע״י
־
הוספת
אתר,
טעונים
ויובש
המסיםים
בדסיקטור
גם
pH
ב-
יי?
י
- 27
ם
2°5
.
P
בדרך
זו
חומרים
נתקבלו
נאוטרלי•
H
11
4-polyvinyl pyridonium e t h y l bromide
לקווטרניזציה
רחב
אינטראקציה
הוכנו
,7$
של
וחומרים
בעלי
ידי
80$מחוך א ל ה
ה י ת ה מטרה
ש ו נ ה של
צפיפות
א ל ק ט ר ו ם ט ט י ת עם
תמישה
על
PVP
חומרים
שינוי
היו
שונים
כמות
החומרים
כפולה,
ה-
DNA
בעלי
האתיל
בעלי
מטען
לקבל
אשר
חיובי
נתן
לעקב
בעזרתם
אתרי
.
דרגת
הקווטרניזציה
הברומיד
דרגת
חומרים
מסיסים
במים
בתחום
pH
-
,80$ ,100$
»30$ ,50$
המוסף.
י־30$
הקווטרניזציה
מסומנים
ב־
14
C
14
ונתקבלו
ע
ל
י
ד
י
ת
י
מ
England.
דרגת
הקווטרניזציה
מיקרואנליזה
או
י
ם
ע
ם
C
The Radiochemical Centre, Amersham, Buckinghamshire,
נקבעה על
מתוך
I
2^5
אשר
סופק
ע״י
מדידות
ידי
טיטרציה
הבליעה
ארגנטומטרית
האופטית.
לכל
וקביעת
דוגמאות
ה
־
חנקן
A-PVP
על
ידי
ספקטרום
־
254
ן
או
256
דרגת
)לשם
y
היוניזציה.
בדיקת
,
ע ל מבת
האינטראקציות
הובנו
י־^-אם (
m
אבל
28
עוצמת
לקבל
־
ה ב ל י ע ה מ ש ת נ ה עם
מסים
חומר
ק ו פ ו ל י מ ר י ם של
במים,
דרגת
בעל חבקן
בלתי
טעון
בין
קבוצות
פירידיניות
בלתי
טעונות
-4ו י נ י ל פ י ר י ד י ן
וחומצה
מתאקרילית
)(MA
ה ס פ צ י פ י ו ת אשר
אבל
הקווטרניןציה
על
ידי
)(88
פילמור
שתושב
של
מהבליעה
PVP
רדיקלי
ה א ו פ ט י ת של
ב ת ו ר השואה<>
מיוננות
במערכת
תמיסות
חמצון-חזור׳
פולימר
בסביבות
)למרות
הוכנה
ב-
גם
הכללי
חומצה
על
שיטת
ידי
הנםיונות
1
8
pH
=
pH= 7׳^׳ מ ן
השלילי
כפי
(
על
DNA
עם
שנמצא
ידי
ובחלקו
מ ת י מ ו ס של
מ-
ניקנה
תוך
הקבוצות
דאוכסירובונוקלאית
נעשו
הדטרגנט^ ^
הקופולימרים
פולימתאקרילית
חומצה
כל
,
40%
המטען
.
הכילו
, VP efo-1
שימוש בתמיסה
הפירידיניות
מהישוב
פ ל מ ו ר של
-
50$
מקדם
כפי
ידועה
בקופולימר
הבליעוד״
חומצה
מתאקרילית.
DNA
עגל,
Corp.,
אשד
בחלקו
Biochemical
הופרדה במעבדה
.tforthington,
7
Jersey
המשקל
.
0
1
o F r e e h o l d , New
המולקולרי
2
תושב
וערכם
הספקטרום
בזמן
שלה
ההתוך
תכולת
היו :
נורמלי
היתה
הזרתן
ב-
ה-
DNA
בעזרת
היתה
ב ע ל ת משקל
נוסחת
9 0
^ ^Eigner-Dotyמתוך
היה
ואנו
מולקולרי
N
יודעים
שהיא
היתה
בצורתה
) 10׳*׳(
גבוה
מקדמי
S
הטבעית,
הסדימנטציה
״
שעלית
הבליעה
. 0. 40%
DNA
* 5%
£ / 6 6 0 0
כפי
בשיטת
בקבעה בשיטת
)e(P
King
)(91
וממנה
= mole cm
e ( P ) fc/mole cm = 6200 * 5%
תושבו
עבור
עבור
מקדמי
הבליעה
והם
DNAמ ק ו מ י ת
DNA
ק נ ו יו;
(921
יתה
פחות
מ,1$-
שבקבע
.
0
Lowry et a l
לשם
־29
קבלת
)(denatured DNA
DNAלא טבעית
־
תופפה ב 100° -בפשר '10-15
ב-
N
10
פלח או בלי פלח וקוררה פיר בקרה.
״Cd(N0 ) «4H 0
NaCl ,
2
2
,
3
2
) 0
3
נעשה בהם ניקוי נוסף ,כל החופרים האי-אורגנים האחרים שנצרבנו להם בעבודה
זו היו בעלי נקיון אנליטי.
האינטראקטים הוכנו במרבית הנסיונות על ידי ערבוב
)PVP4-
(DNA
הוסף ל־
PVP-4
DNAעם
ברכוז כללי של ' milieq/ml׳~ , 10""^-10בנפת של ; ml10
-3
'
N10NaClו־ pHשלתפיסותNaOIIהפרכיביםהובא ע״י
לערך ,6.5-7האינטראקטים הושהו שעה לפני בצוע הנס י ו נ ו ת,שהתברר בנסיונות
מוקדמים ,שתוצאות המדידה אינן תלויות בזמן.
תכונות אופטיות של החומרים הטהורים והאינטראקטים נקבעו על ידי
מדידות םפקסרה ועוצמות הבליעה של המרכיבים ביחסים שונים בספקטרופוטוםטרים
Beckman DUו־
Unicam SP 500בתאי קו ורצה בעלי דרך אופטית של
עקומות ההתוך נקבעו בםפקטרופוטופטר
הבליעה האופטית כפונקציה של הטמפרטורה נמדדה באורך גל
1
קוורצה עם פקקי לטש,בעלי אורך אופטי של
cm
1
.
cm
Beckman DUעם פתפם מווסת־
258
= ג ,בתאי
my
,מידת העלאת הטמפרטורה
היתה
5/1°דקות־
מקדמי הסדמנטציה
של
ה
_ DNAושל האינטראקטים נמדדו ב-
Spinco Model E analytical ultracentrifuge
צמיגות בוצעו בויסקוטטרים
*
l
.
248
תה
sec
0
)
1
o
1000
61
°
2
ו-
sec
sec
50
.
1
3
286
Ostwald-Fenske
*-0.1°ו
sec
עם אופטיקת
UV״
ב
־
־, No
t־ הזמן הדרוש
לזרימת
ותוספת המכסימלית ב?1ך אחרי הוספת הפוליפר
בויסקומטרים אלה שעור מאמץ הגזירה rate of shear -
^( ,מה שמקטין את הצמיגות האמיתית פי שנים ,אבל
הוא גבוה
הנםיונות
30 -־
המובאים בעבודה זו הם השואתיים ,לכן הוזנחה השפעת שעור מאמץ הגזירה בכל סידרה־-
עקב אינטראקציה נמדד ב-
שינוי צפיפות של DJMA
analytical ultracentrifuge
יה
molal
2-7
עם אופטיקות
Spinco Model E
UVושלירן .רכוז תמיסת
CsCl
,ותמיסה זו נוקתה על ידי צנטריפוגציה מוקדמת.מהירות סיבוב
הרוטור בנםיונות היתהrpm000*42
שעות .צפיפות
והז pהדרוש להשגת שווי המשקל היה לפחות 12
DNAהתקבלה מחישוב מתמונות שלירן ו-
חקירת האינטראקציה אי אפשר היה להשתמש בDNA -
דוגמא לתישוב הצפיפות מוצאת
, UVכי מובן ,שבמקרה של
בעלת צפיפות ידועה בתור סטנדרד.
להלן :
.הקשר בין המרתקים על תמונת-שלירן ושינוי מקדם השבירה עם המרחק
ניתן על ידי
C93)Ifft
ל Y = a'b'G'tana• $
dx
Y
מרחק על האורדינטה בצילום שלירן2
b«G׳ - aפקטורים גיאומטרים של הצנסריפוגה =
a
-זוית הצילום־
99.7 cm
)(70°
dn
שינוי מקדם השבירה עם מרחק.את
.
•
dn
ד אפשר לפרק ל 1(
3
- 10.75
j
=
י
d7י
d
g / c mמ ת ק ב ל מגרף של מקדם השבירה כפונקציה של צפיפות תמיסת . CsCl
dp
,
משתי הנוסחאוח האחרונות אפשר לקבל
P
, dp .
d l
, dn ,
(
dn
p3
•־־j׳ -שינוי בצפיפות עם מרחק .את הצפיפות
בכל נקודה בתוך התא מחשבים מן הנוסחה הבאה :
p - p + - i l Ax
o
dx
M
פות ההתחלתית .במרבית הנםיונות היתה
0
1.71
g/cc
לאחר הוצררת גרדיאנט
0
!:•:־.
היתה הצפיפות
1.71
g/cc
באמצע התא כפי שנמצא
מ א י נ ט ג ר צ י ה
גרפית
־ 31
וגם על ידי
AX
x
כנגד־
-
p
93
^ Ifft^ ,מרחק החומר
A
מאמצע התא ומתקבל מתמונות uvשל התחלקות החומר בתוך התא )בהתתשב בהגרלות.
המתאימות( .התומר ,המתרכזו באזור בעל הצפיפות המתאימה מצוין בתצלום ע״י השחרה;
ימלית בגלל הבליעה החזקה .במהיריות רוטור של
s
C
7
molal
42.000
rpm
^ ה־גראדינט המתקבל על פני כל התא ) 1 . 2 6
ובז־כוז תמיסת
( c mהוא g/cc0.07721
קביעת יחם המרכיבים המשקע .בנםידנרת קרדמים נמצא ,שכאשר י ח ם
)באקוולנטים( מקבלים שקוע החומר .על מנת לברר
המרכיבים הוא בסביבת -־• =
מהו יחס השקוע האמיתי באותם אינטראקטים אשר בשל עודף גדול באתד המרכיבים
נשארו מסיסים ,הופעל כח צנטריפוגלי חזדק שגרם לשקוע חלקי.
תה במהיריות גדולות -
rpm
15.000
הצנטריפוגציה
" "Sorvall־ ע״י
במשך ' 20בצנטריפוגת
14
שימוש ב־ PVPמסומן ב-
אפשר היה לקבע רכוזו לפני ואחרי הצנטריפוגציה
C
Packard Tricarb Scintilation
לפי פעילותו הרדיואקטיבית )במונה נצנוצים -
( Counterובעזרת מדידות בליעוד אופטית ניתן לקבע את רכוז הDNA -
שנשאר
בנוזל העליון ,שתי המדידות אלה איפשרו קביעת המרכיבים במשקע.
הידרוליזחז אנזימטית של DNAושל האינטראקטים נעשתה על ידי
)I (E C 3.1.4.5
deoxyribonuclease
שני האנזימים ניקנו מ-
94
Corp.
ו. akaline phosphotase (EC 3.1.3.1.) -
. Worthingtonמהלך ההידרוליזחז היה לפי שיטת
^ ^Worthington־ עם הגדלה בזמן האינקובציה ל 18-שעות ב־ 37°עבור כל
והורדת רכוז המלחים ל N -vl0
׳ .לפני הוספת האנזים החומר רוכז על ידי איוד־
בווקום .בכל הנםיונות נעשתה במקביל הידרוליזה של DNAעצמה ושל ה -
ינטראקציה ומכאן אפשר היה
לקבע את מידת העיכוב על ידי
9
א נ ז י ם
אורגני המשתתרר נקבע בשיטת *^.(King
9
ה ז ר ח ן
DNAאתרי
ה א י - P V P
־32
־
מיקרוסקופית אלקטרונית .תמונווז של
ב-
DNAושל האינטראקטימ צולמו
. RCA electron microscope Model EMUהתמימות המהולות של ה-
או של האינטראקטים רוססו על דיםקיות מכוסות
הדיסקיות יובשו בדסיקטור ווקום מעל
?2®5
פורמור formvar -
DNA
ופחם־
.לשם קבלת קונטרסט על הלק
מהדיםקיות אוידה פלטינה ממקור בזוית 1:7לשטת הדיסקית ועל ידי כך נוצר צל
על פני מולקולות ה DNA -־ במקרים אחרים הקונטרסט נוצר על ידי יוני
+
Cs
הכבדים ,אשר שימשו בתור יונים נגדיים.
מדידות
pHוטיטרציות פומנציומטריות נעשו בעזרת
Radiometer pH-meter 22.
pH-meter
־ 35־
קביעת קבועי הקישור של נחשה וקדמיויט ל DNA -בשיטה הפולרוגרפית
(2
0
נסיונות אלה נעשו עם
אלקטרוליט יסודי שימשו
0 NaN
3
•4
או
2
) . H^Cu(N0 ) ; Cd(N0בתור
3
0 KN
3
2
.
++
01רכוזי ג
האם נקבעו על ידי טיטרציה יודומטרית או טיסרצית
ה-
++
C dנמצא גם מזרם הדיפוזיה בתמיסות ללא
++
ו־Cd
1
בתמיסות
) EDTAבהתאם(^־^ .רבוד
DNAהמוםפת^^ .ה-
בנםיונות ^ "* Cdהיה .5.8 * 0.1ה pH -היה
pH
.*;:Q.l־ 5.4עבור DNA/Gu:
ידו4.9 * •0.1,ל ,עבורי DNA/Cu ;,לא טבעית )בופר אצטט
מאד של :
3
סבעית
3
,(N "10
הקטנהH0(Cu) pH
כל כך נמוכים היתה הממיסות
2
ו. H0( - )Cd
2
Shimadzuהמדידות
הפולרוגרפיות בוצעו בפולרוגרפים
ואלקסרודת הכספית המטפטפת
בוצעו בתא
)(DME
261
היתה מסוג קפילרה ברומטרית .המדידות
" "Hעם פקק אגר בין אלקטרודה קלומל ובין חלק המכיל את התמיסה
-3
-1
יי
—
,
הנבדקת .רכוזו של 1KCבאלקטרודת הקלומל שונה מ -N10- .10 -על מנת להתאימו
לרכוז המלח בתמיסה הנבדקת.
9
מקדם הדיפוזיה של DNAטבעית נקבע ממקדם הםדימנסציה ונוםתאות ^^ E i g n e r -Doty
י־
97
"* /Svedbergחיבור נוסחאות אלה נותן את הערך עבור מקדם הדיפוזיה . D -
17
S
עבור
" 10י RT.2.36
1 47
—
ניתן ביתידות םבדברג) - v pנ ל ק ח הערק). 0.471
8
ה D -המחושב הוא
- 2
. 10*1.3" cm /sec
מקדם הדיפוזיה של DNAלא טבעית נקבע ממדידות הצמיגות והםדימנטציה בשימוש
. D = 7«10' cm /sec , *• ^Sheraga - Mandelkern
בנוםתת
98
2
8
־34
־
8
הנוסחה לחישוב קבוע הקישור של יוני המתכות לDNA -
.
ונים לפולי
נ ג ז ר ה ^ ^ בהסתמך
4
^
8
-
מרים מבוססות על ההבדל הגדול בין מקדמי הדיפוזיה של יון מתכתי חופשי
=
1 0
+ +
sec1,38
/
m
2
-5
c
)"(99
יי ,ויון קשור לפולימר בעל מקדם
(
++D
א
י
Cu
דיפוזיה נמוך.
מקדם הדיפוזיה של היון הקשור שוה לזה של הפולימר הקושר ,שכן הוכה
מדיפוזיה עצמית של יונים נגדיים במתליפי יונים שמקדם זה עבור יון דו-
~ 1 0
8
^,
0
0
^ ׳ / s e c
2
c mז ״ א מאותו סדר גודל כמו מקדם הדיפו ז יה
של DNAעצמה.
קבוע שווי משקל של קישור יונים ל-
DNAפתוה הנוסחה ! נניח,
שזמן השגת שווי משקל בין יון מתכתי ובין פולימר הוא קצר מאד )יותר קצר
מזמן "חיי" טיפת הכספית ,כפי שנוכיח הלאה( ,ואז ,זרם הדיפוזיה של יון
מתכתי בנוכחות תומר מקמפלכס יהיה פרופורציונלי לשרש מקדם הדיפו זיזד הממצע.
ממצע על הזמן של מקדם הדיפוזיה ניתן על ידי :
D.t.
) ( 1
I
=
t.
I
Dav
i
הזמן הממצע ,שיון מתכתי נמצא במצב , iבמקרה שלנו קימים רק שני
מצבים של היון המתכתי :המצב הקשור והמצב התופשי.
הזמן הממצע של שהות היון בכל מצב ינתן על ידי מהירות האסוציאציה והדיסו-
ציאציה .מהיריות אלו אפשר לקבל אם מסבירים אסוציאציה ודיסוציאציה של יון
. Langmitf-yלפי
מתכתי למקרומולקולה על ידי מודל םפיתה הדומה לספיתת
מודל זה מהירות המפיחה )קישור( של יון מתכתי לפוליאלקטרוליט בכל נקודה
לאורך ציר xניתנת על ידי :
)
)( 1-0
X
י
2
) V. , = k. c f , c p ,
)l(x
1
)(x) (x
1
י
י
־ 35־
l
קבוע מהירות של אסוציאציה.
k
)(x
Cf
-
רכוז מקומי של יון מתכתי תופשי.
Cp
־
מספר אתרי הספיתה על פני הפולימר )יירכוז" הפולימר(.
־
שבר יחסי של האתרים התפוסים על ידי יון מתכתי או דרגת הכיסוי.
—
שבר יחסי של האתרים החופשיים על פני הפולימר.
)Cx
0
X
(1-0
)
v
'x
מהירות הדיסוציאציה )דםורבציה( תהיה :
0
™
2
-
k
C
=
2(x) 2 P(x) x
קבוע מהירות
ס
ל
ה ד י ם
צ
י י
k
א צ י ה
V
» - cp (x) ^xמספר היונים הקשורים.
הודות לכך ,שפולימר לא תורם לזרם וטפיחת הפולימר על השטת מועטת מאד,
C
=C
P /ן״׳״•P
אין גם גרדיאנט של רכוז הפולימר cp ,לא משתנה עם xז״א
W
)תמיסה(
י
י
ץ
ממהירויות אסוציאציה ודיסוציאציה אפשר לקבל את הזמנים הממצעים ,שיון קיים
במצב התופשי ובמצב הקשור :
1
)
5
אם מציבים
־
נ
4
h
(
־ '2
2
) (4י ־ ) ( 5ל ־ ) ( 1מקבלים ;
)
)k p( l - 0
+
x
C
*
1C
Db
6(Df
^
(
k
- Df
מקדם חדיפודיה של היון החופשי.
- Db
מקדם הדיפוזיה של היון הקשור.
(
k
ו
1
Dav
1
.
+
־(w
n
7
) (1-e
1Cp
x
k
אס מציבים בנוסחה ) (6את הגדרת קבוע שווי המשקל
Dav
מקדם חדיפוזיח חממצע -
l
—^ = Kמקבלים עבור
2
) K«cp (l-0׳Db
x
) C 7
) 1 • K-cp a-0
x
D f
+
)1 + Kcpd-e,
=
D a v
(
־ 36
את הנוםתה
) (7אפשר לקבל גם אם מניתים שווי משקל בכל נקודה בשכבת הדפוזיה
. Dav
ואם מוסיפים את תרומתו של כל מרכיב ל-
) (3ו (2)-מקבלים עבור קבוע; שווי משקל
מנוסתאות
C,
C
_b _2_J.־־ 0
c
c
( 9 ) J
=
יי
P
c
c.
K
p
־ דכוזו התחלתי של היון המתכתי
־ דכוזו היון המתכתי הקשור
K(l-9)• c • c
P o
9)' c־K(l
+T
)(10
)(U
K(l-0)• c • c
f
K(l-0) c + 1
P
־
b
c
־ f־
D. + c. • D,״ c • Dav = c.
b
f
b
אם מציבים את הערכים של
מקבלים את הנוסחה
£
ו-
o
f
cמנוסחאות ) (10ר —) (11בנוסחה האחרונהז
) .(7מנוסחת^ *I l k o v i c
102
׳
/
) (7אפשר
1
id a Dומנוםחה
לקבל אח הביטוי עבור קבוע שווי המשקל כפונקציה של ערכים מדידים^
2
Day
1 -
)(k
)(12
)ז־
i
Q
1
V I
״D
=K
*D
-זרם של יון מתכתי בלבד.
וזח אינו יכול להיות גדול מן היתס
cשל פוליניר.
Davמשתנה
עם
— )מתכת/פולימר( .הנסיונות שלנו
P
C
x0
37
־־•י
נעשו בעודף גדול של DNAביחס למתכת -ילפיכך 0היה קטן אפילו בתמיסה,
ואין צורך להתחשב בשינוי
0
דד ,כי על יד שטח הכספית = 0
בחישובים סופיים נלקח
0
לכן הערך המסצע של
Davעם
»x
2
־
0בשכבת הדיפוזיה הוא
e
x
• j
0=0
cו-
°
DNA
בעזרת הנוסתה ) (8אפשר לבדק נכונות ההנתה שהשגת שווי המשקל בין
ובין יונים מתכתיים היא מהירה מאד .אס לנוסחה ) (8מציבים את הערך עבור 0
מקבלים :
)(13
c
f־ 0
c
בעודף גדול של DNAלגבי המתכת )^ c־ (Cקטן מאד לכן :
Q
)(14
+1
K •c
^
»
!°
f
,,
אם זמן השגת שווי המשקל היה גדול ביחס לזמן "חיי הטיפה )שווי משקל איטי(
i
c
— — aד ־
אזי כל מרכיב היה נע עם מקדם הדיפוזיה שלו ואז ) 14א(1
c
f
במקרה זה היון המתכתי החופשי והקשור היו תורמים בנפרד לזרם הדיפוזיה ואז.
נוסחה 14א היתה מתקיימת .במקרה של קישור נחשת וקדמיום ל DNA-אין הדבר
מתקיים ,כי אם מחשבים את הקבועים לסי נוסחה 14א עבור
שונים של
K
.
שונים מקבלים ערכים
־ 38־_
(3
- DNAפוליויניל פירידין בשיטה הפולרוגרפית.
קביעת הקישור
לקביעה פולרוגרפית של קישור קדמיום בנובתות
מהשואה בין קישור
++
Cd
PVPהיו במה מטרות.
בנוכחות ובהעדר יחסים שונים של
מסקנות על אופן התחלקות מולקולות PVPעל פני ה-
PVPאפשר להוציא
. DNAללמוזד על ההשפעהה
ההדדית בין חלקים מכוסים יוגליים; ועל מבנהדהאינמראקטים בנקודת.שקועם,אפשר גם
לנסווד לקבל קבועהקיעדור שגל
בערבוב
DNAו -י
PVPבא י זוו ר־ המכוסה.
DNAעם PVPלשם קבלת האינטראקטים מתקבל קישור שני המרכיבים
תיו כיסוי חלקים של
DNAעל ידי .PVPמידת הכיסוי־ a
. PVPבעודף של
ובדרגת הקווטרניזציה של
תלויה ביחס המרכיבים
PVP
DNAמתקבלים איזורים מכוסים ב-
ואיזורים מגולים ,באיזורים המכוסים מתקיים שווי משקל הבא :
l
k
N
+
< +PON־(P0(1
כאשר לתמיסת האינטראקטים מוסיפים יוני קדמיום באיזור המכוסה יתקיימו שווי
^
המשקל הנוספים »
PO §i?=^=<£411
Q +
*==N
-־O (2
O
P
P
(
(
1
שווי משקל האחרון יתן את מידת החילוף בין
Kg
דכוז
ו-
Kאפשר לחשב
2
+
-קבוע שווי המשקל בין ו PVP -DNAכפונקציה של
- Nדכוז חחנקנים הטעונים על יד שטח שלDNA
K,לפי הנוסחאות הבאות 1
PVPוקדמיום .בידיעת
• יחס
ו-
נותן
- 39
י
+
] [PO^L] [N
n[PON] [ £ | h
15נ(
K
3
][P0§1
)
)!6
]—| ] [ £־ [
_
0
+
] ] [N־[PO
־־ K
2
P
3
K
l
v
אח שווי המשקל ) (15ו (16)-אפשר לבטא על ידי קבוע שווי המשקל
המציג את הקישור הכולל בחלק המכוסה?
] | [po £
)18C
״
^
K
[ ] + PON־[PO
לקבועי שווי המשקל
Kו
2
-
K
באופן הבא
:
3
' . PON1[PO
]־[PO
++
אם נוסיף אח
A
N
Cdלתמיסת האינטראקטים אשר התקבלו בעודף של , DNAאחרי האינט
D
ובהם יתקיים השווי המשקל בין
^)*>(!-
,
POCd
הר״
2
).(1-0
יוני הקדמיום:
()21
1
K
בשיטה סולרוגרפיח אפשר־ לנסות לקבל^ jו-
1
)^(a-1
-a
ובין
rA*+
־0P
+
K
ומזה האחייז
? י ק ב ? י
3
K
י
2
K
קבוע שווי המשקל באיזור המגולה אשר הוא תלוי ברכוזי המלח יכול להיו
גם מושפע ממידת הכיסוי של DNAב PVP -עקב השפעתו של האחרון על הפוטנציאל
החשמלי של האיזורים החופשיים -במיוחד ברכוז מלת נמוך.
40 -־-
H Iתוצאות ודיון.
(1תכונות החומרים הטהורים.
. 4PVP
א( טיטרציה םפקטרופוטומטרית של
לשם קביעת דרגת הדיסוציאציה של
תמיסות שלו ב -pH-ים השונים ובדכוזי מלח
מראה את הספקטרום
-11?-
ברכוזו המלח
4PVPנמדד־ הם פ קטר ו ם של
N0.01NaCl
- N 0 . 1ו־
4
ב.1
N0.01NaCl
N "10«1.8PVP 4
.אפשר לראות ,שמכסימום הבליעה הוא בין 254-256 my
והשיא נעשה חד יותר עם הגדלת דרגת הדיסוציאציה .עוצמת הבליעה־ .משתנה עם
דדדגת הדיםוציאציה.
לשם חישוב דרגת הדיםוציאציה בכל
כולו מיונן וב-
הנתנו —0 ,pHש
(1NHC1־־ PVP (pH4
ב
-pHים גבוהים )במקרה זה התופר הומס ב 50$-כהל-מים(
החומר איננו מיונן בכלל ,.מקדמי הבליעה המולדים כפי שחושבו ממדיות בליעה
האופטיח הם :
e
מיונן4PVPעכור
V
e
ך
4
$
P
=
3600
=
-
7
A/molecm*5%
1550
E
tymolecm*5%
=
5%tymolecm*1640
=
5%tymolecm*1750
בעל דרגת היוניזציה
שווה בגבול השגיאה לזה בעל
דרגת הקווטרניזציה 7$מה שמצדיק את ההנתות בחישוב דרגת היוניזציה
מטיטרציה םפקטרופוטומטרית.
ציור מם 2 .נותן את דרגת הדיסוציאציה של
של
, pHדרגת הדיםוציאציה חושבה מן הבליעה האופטית ב-
*PVPNH-4
254\1
m
כפונקציה
,אשר
41 -־
0
בחלקה ניתנת בציור מם ,1 .בהנחה שהבליעה ב-
pH
=
נובעת פפוליויניל
פירידזוניום מיונן לגמרי וב<11 :-ן־ים גבוהים מבלתי מיונן ,ההפרש בין שתי
הבליעות האלו נותן את; התרומה שלליאון מלא לבליעה,
את אופן חישוב 6אפשר לסכם בנוסחה הבאה 5
) י ס י 0־) P.P.
0=6
D
) 0־ • ' ( B־ )1־(6׳
כאשר
8
O.D.
O
-
0
D
•
0
־ 8
דרגת היוניזציה -הבליעה האופטית ב-
pHנתון
. ^ gה ב ל י ע ה האופטית של הצורה הבלתי מיוננת
^ !j
-
a
ציור מם* 3מראה ספקטרה של פולימרים בעלי דרגז !1קווטרניזציה של
50$י־ ,7$במקרה הראשון הרכוזו של פולימר היא
ומבקרה השני
N*"10*1.8
-4
N 10*1.5
,אפשר לראות ,שצורת הספקטרום זהה לזו של
254
יור מם ,(1 .גם בכגקרים אלה השיא נמצא בין
-
PVPבעל דרגות דיס׳ו-
256
.
mp
מכאן נסיק ,שעוצמת הבליעה באורך גל זה נקבעת רק על ידי צפיפות המטען החיובי
על החנקן חפידידיני ללא תרומה מן הקבוצוה תצדזדלת,
• .׳ י
ג( חםפקטדום של ה-
•
י
) DNAציור מם• 4עקומה (1היה נורמלי.
<*
י"
.
־ 42־
־43־
3ד
«3
זכ
ני
ט
u
נד
*3
וב
ro
־44
־
־ 45־
(2
תכונות
א(
מדידות
א ו פ ט י ו ת של
תלות
נמדד
שונות.
זציה
הבליעה
האינטראקטים.
ותלות
הספקטרום
ה ס פ ק ט ר ו ם של
שבאיז־ור
נמצא,
גדולה
באינטראקטים
עוצמת
DNA
ושל
אורכי
הגל
מעוצמת
הבליעה
המרכיבים.
ברכוז
ה א י נ ט ר א ק ט י ם עם
PVP-4
my350245-ה ם פ ק ט ר ה
הבליעה
התיאורטית
קווטרני-
בדרגות
ד ו מ י ם אבל
)המתושבת
כסכום
עוצמת
בליעות
המרכיבים(.
-4
בציור
מם־
ניתנים
4
ה ם פ ק ט ר ה של
הקווטרניהציה
)כאשר
4
p
בציור
מלאה
מסמן
)(lO'^N•6.4ושל
ז ר ח ן של
ז ה מ ת א ר ת את
ו-
DNA
הספקטרום
ואילו
א ו ר על
פיזור
יש
ידי
את
ג
-
בנוםתת
לבליעה
עוצמת
s
עוד
האינטראקט
השתמשנו
תרומתו
בליעה
+
א
האינטראקט
את
התיאורטי
ו ב א ו ת ו א ו ר ך ג ל .א פ ש ר ל ר א ו ת ש ב ־ my320ה ן DNA
לאינטראקט
N ) DNA״ , ( 6 . 5של
10
ביחס
אקוולנטים
ה פ י ר י ד י ו נ י ו ם של
המתושב
והן
כסכום
PVP
בליעות
אינם
ש י ו ר י ת של . 0.025
PVP
(.
דרגת
בעל
P:N -1.5:1
+
עקומה
המרכיבים
מס.
באותו
ב ו ל ע י ם , P V P
תופעה
זו
ה ו ס ב ר ה ע ל סמך
הפולימרי.
Rayleigh
לפיזור
אור
)97
עמ.
,(278
על מנת
לתשב
הכללית
האור
על
המפוזר
ידי
התלקיק
.
I
-
ג
-אורך
האור
עוצמת
הפוגע
0
A0.D.
=
גל
~ In
.אם
Q
I
0
-AO.D.
על,סמך
«
S
ת ר ו מ ה של
הבליעה
i
ניתן
לפתת
פיזור
אור
לבליעה
בטור ו א ז מקבלים
i
A O . D .־ Y-
s
האופטית
ה ש י ו ר י ת של 0.025א פ ש ר
הנמדדת.
לתשב את
ה ת ר ו מ ה של
0
פיזור
האור
לבליעה
־-46
הכללית בכל אורך גל לפי :
X4
0
) 'V O ) • (320
1
־ )AO.D.(X
)Ax
)AO.D.(X
עה
האופטית ב
תרומה של פיזור האור לבליעה האופטית באורך גל --
.
D
my320*X
-
י
A
)(0.025
אפשר להראות ,שאם מחשבים בצורה זו את הבליעה האופטית הנובעת מפיזור אור
ומוסיפים אותה לבליעה האופטית התיאורטית )עקומה 4ציור מם»(4
מקבלים
בליעה)עגולים( השוה לבליעה של האינטראקטים )בגבול השגיאה( ז״א שפיזור
«X
עם הקטנת אורך הגל• באורכי הגל עד
בליעת
ה א י נ ט - 2 6 5 m y
ראקטים גבוהה בכל המקרים מן הבליעה האופטית המחושבת ואילו באורכי גל 265my
ומטה ההפך הוא הנכון .ציור מס »4שייך לאינטדאקט של
DNA
עם PVP4בעל
דרגת הקווטרניזציה מלאה ,אבל אותן התופעות נמצאו בדרגות הקווטרניזציה של
50$י) 7$-של
PVP
( .יתכן שנוסף לפיזור האור תרומה לבליעה נובעת מאינס-
ראקציות dipole-dipole
וסידור חדש של מרכזים הבולעים המלווה את האינטראקציה.
נמדדה הבליעה האופטית של האינטראקטים של
DNAטבעית ולא טבעית עם
4־פוליויניל פירידין בעל דרגות קווטרניזציה שונות ועם קופוליסרים בעלי תכולה
שונה של וינילפירידין .המקרה האחרון נועד לברר אפשרות קיוםה של אינטראקציה
ספציפית עם הקבוצות הפירידיניות הלא טעונות.
ציור מס» 4ו
ספקטרה של
, DNAשל
) PVPבעל דדגת קויטרניזציה מלאה(
ושל תערבת של שניהם
)- 1.5:1
(P:N
(1DNA
(2
PVP
PVP
(3
תערבת DNAו-
(4
ספקטרום המחושב פםפקטרה של המרכיבים בתערבת.
$#0הםפקטרום המחושב כולל תרומה של פיזור האור.
־ 48־
בציורים מס• 5ו 6-נתונה הבליעה האוממיח של תמיסות המכילות
DNAו-
PVP
בעל דרגות קווטרניזציה 50$ו 100$-כפונקציה של ה י ח ס —
P +N
מסמן את הזרחן של ^DNAוי־ Nאח החנקן החיובי של.(PVP4
)כאשר
p
+
+
עם
משני ציורים אלה אפשר לראות שחבליעה עולה כמעט באופן לינארי
P
P
ומגיעה למכסימום ב-
היחס
P+N
הקטנת
־־ , 0,5הבליעה יורדת ע ם הגדלת
P+N
כמות המטען החיובי .העליה בבליעה היא פ ו נ ק צ י ה היל המטען על פני תוצר
האינטראקציה והיא גדולה ביותר ,כאשד המטען הוא אפם -ז״א בנקודה האקוו-
לנסיח ,תופעה זו מוסברת יפה אם הבליעה העודפת נובעת מפיזור האור
וידוע ,שפיזור האור הוא מכסימלי כאשר המטען הוא
מינימלי^ ),
0 2
היות
נ ו ס ף
לכך
מתבטא
הקטנת צפיפות המטען על פני תוצרי האינטראקציה גורמת לאגרגציה ,וזה
בעליה נוספת בפיזור האור.
עודף הבליעה עולה ע ם הקטנת דרגת הקווטרניזציה ,כי בדרגות הקווטרניזציה
+
. Nבסביבת
הנמוכות דרוש רכוזז יותר גבוה של החומר הפולימרי עבור אותו
P
DNA0-PVP
היחסי • 0 . 5י לא נעשו מדידות בגלל שקוע החומר ,כאשר לקחנו
P+N
!NaClהמלחברכוזN*~050$היה תחום ה ש ק ו ע ה ר ב ה
בעל דרגת קווםרניזציה
החומר»
לא יכולנו לערוך מדידות בגלל ש ק ו ע
= 0.75
יותר רחב וכבר ב-
P+N
c
| P
+
מאקסטרפולציה של מדידות הבליעה לאיזור השקוע התקבלה הבליעה המכסימלית
ביתם
P:N - 1:1הן במקרה של
+
DNAטבעית המגיבה עם PVPבעל דרגת הקוד-
טרניזציה 50$והן עם זה בעל דרגת הקווטרניזציה ,100$עלית הבליעה המכסימלית;
ביחס p:N - 1:1מצביעה על ניטרול מטען גדול ביותר בנקודה זו.
+
אפשר להסיק שהקישור בין
DNAל PVP -הוא אלקטרוםטטי בעיקרו
י ח ד ע ם ז א ת אי
בגלל
העובדה
הבאה ; רכוד מלח גבוה יותר גורם לאגרגציה גדולה יותר )שקוע( ואיננו
האינטראקטיס ,מה שמצביע על מידה מסוימת של אינטראקציה הידרופובית.
מפרק,
את
הבליעה האופטית ב-
DNAטבעית וPVP -
258
m yש ל תמיסת
P
בעל דרגת קווטרניזציח 50$כפונקציה של היחס -
P
N
,--5״
+״ _ ,
סכום חריכוזיסmeq/cc-P + N10»8
+
• —•—•—
הבליעה האופטית התיאורטית.
- 50-
0.7 0.6 0.5 OA 0.3 0.2 0.1 0
__E
^PVP־־־
P+N
03
10,09
DNA
+
האופטיתמם.
הבליעה־ ציור
ב 6 -ו m yש ל חהיםת
חס
סכום הריכוזים
258
DNAטבעית
ו PVP -בעל דרגת קווטרניזציה 100$כפונקציה של
-5
+
P
610 meq/cco P + N״
•
P + N
••הבליעה האופטית התיאורטית.
־ 51
־
על מנת לודא שהתופעה של פיזור אור עם הקטנת המטען היא כללית באינטראקציווזנ
בין פוליבםיסים לבין פולי-חומצות נבדקה האינטראקציה של
100$וחומצה פולימתאקרילית
קווטרניזציה
)(PMA
p v p
בעל
דרגת
• גם במקרה זדה התקבלו
תופעות!
דומות.
P
בציור מם 7
נתונה הבליעה האופטית כפונקציה של
־ד
עבור
P +N
DNA
לא טבעית המגיבה עם
PVPבעל דרגת קווטרניזציה מלאה .כאן
האור קטנה בהרבה .במקרה של DNAלא טבעית צפיפות*המטען הכללית
מידת פיזור
מפני
קטנה,
שאותו מטען יכול להשתרע על שטח גדול יותר ,לעומת זאת דנטורציה מקטינה את
גודל המולקולה וזה גור,ם להקטנת פיזור האור .הוספת הPVP -
מנטרלת את
וגורמת לקיפול נוסף המלווה בהקטנת פיזור אור .הוספת ה_ PVPאומנם
את מטען ^• PVPאך במקרה של
המטען
מנטרלת
DNAבמצבה הלא טבעי היא גם גורמת לקפול נוסף של
המולקולה וצפיפות המטען יורדת פחות ממידת הניטרול .זאת ועוד האינטראקט
של ^-־DNA
הגמיש.
הלא טבעית יכול לסדר את השירים ההידרופוביים הלא טעונים באיזורים
הפנימיים של .הפקעת המולקולרית ולהתעטף בשיירים ההידרופילים והטעונים .זהז
גורס לכך שפיזור האור באינטראקסים עם DNAלא טבעית קטן מזה אשר־ באינטראקטים
עם
DNAטבעית.
לתוצר של DNAטבעית עם קופולימר בעל תכולת )MA - VP 50$ציוד מם* (8
אין אפקטים של פיזור אור או שקוע הודות למטען הכללי השלילי .ממדידות
האקםטינקציח ב-
7
pH
של קוסולימר זה נמצא ,שאפילו בpH -
זה
מקד ם
40$מן החנקנים
חגם טעונים -למרות המטען הכללי השלילי .יתד עם זאת אין העדר פיזור אור מצביע
על חסד אינטראקציה.
ידוע כי פורמלדהיד מתקשר עם קבוצות אמיניות של DNA
מתאינית -
103
CH־־N־' ^
2
-
אחרי
ומשנה את הספקטרום של
הדנטו-
הDNA
7ולפיכך נבדקה השפעתו של הפורםלדחיד על האינטראקציה .הוספנו פורמלדהיד pH-o
52 -
)רכוזו הסופי בתמיסה היה 1%׳\׳ ( ל־ DNA
לאינטראקט
)
+
1 : 2
ב־
תוכרומי היה
1.5
-
( P : N
־
טבעית,ל DNA -אחרי
והספקטרום נמדד לאחר 20שעות.
DNAטבעית לא היה שום שינוי בספקטרום ,ב־
my
דנטורצ׳יה
; שינוי גדול ביותר
) 4
DNAלא טבעית האפקט
( m yנ מ צ א כאשר DNAחוממזז;
בנוכתות פורמלדהיד.
בשיטה
באינטראקט לא חל שום שינוי בספקטרום ולא הצלחנו לגלות
שיחדור קבוצות אמיניות DNA-oבעקבות האינטראקציה .הסיבה לכך
שבגלל האינטראקציה)בין
לגילוי קבוצות
.-NFL
היא
DNAלבין (PVPאין שבירה של קשרי המימן
זו
כנראה״,
ה מ ב י א ה
־ 55־
ב(
ההתוך.
עקומות
כאשר
המכילים
מתממים
VPמ ק ב ל י ם
עצמה
DNA
עקב
המתקבל
עמ.
)2
א י נ ט ר א ק ט י ם של
התוך
ועליה
.(208
ה ה ת ו ך הם
בבליעה
טמפרטורת
פ ו נ ק צ י ה של
DNA
עם
האופטית
ההתוך
דרגת
PVP
-
ועם
בדומה
Tm
הקופולימרים
לעקומות
וגודל
ה ה ת ו ך של
האופקט
PVP-4
ה ק ו ו ט ר נ י ז צ י ה של
ההיפרכרומי
oN / P
והיחס
-3
מושפעת
Tm
מאד
מתנאי
ולכן
כמו
ההמםה ב ר כ ר ז י
נעשו
כן
הנסיונות
הנתנו
בנםיונות
הבליעה
בכל
כל
במרבית
מסוימים
האופטית
טמפרטורה
תימום.
עקב
ה DNA -
DNA
לגבי
היתם
אשר
_)O
ביותר
רכוזו
scattering
(l i g h tscattering-^)20°O.D.
PVP -
ציור
של
מ
ם
•
,100$
ושניה,
מ ו פ י ע ו ת שתי
כמעט
קבועה,
בסביבת
מה שמאפשר
איננה
החימום.
האופטית
0
מראה שום
נ ת ב י ם מה
הבאים
בטמפרטורה..
ב מ ק ר י ם אלה
ההתחלתית"
איננו
אינם
תלויה
השוואה־
תוספת
שינוי
ש מ צ ד י ק את
הבליעה
נלקחה
האופטית
הבליעה
בבליעה
ה ה נ ח ה שרק
ח ו ש ב ה רק
הנבדק.
הבאות
שווה ל 8
P.P.
0oDO.D.־(
ה ת ו ך של
טמפרטורות
, DNA
האור
ו ־ PVP
הציורים
העקומות
light
עקומות
בכל
של
בתחילת
"הבליעה
היות
באינטראקט
בכל
פיזור
PVP - PMA
בבליעה.
באורדינטה
9מראה
ירדה
בתור
PVP -
י
שמידת
ל DNA -ב ל ב ד ,
לשינוי
כך
א ו ת ה זידגמה
האופטית
ה א י נ ט ר א ק ט י ם של
לפי
צויר
הנסיונות,
הבליעה
יוחסה
גם
ב ס ד ר ה עם
הנמוכה
אחראיח
ה-
מ ל ח ׳:נ מ ו כ י ם כיל
)
0
NaCl
1
N
(
)20°
DNAה מ ג י ב ה עם PVP
התוך:
.95°
אחת אשר
י
בעל
ע ו ל ה עם
דרגת
הגדלת
הקווטרניזציה
היחס
N /P
+
- 56 -
1.4
)O.P.(f
OD20°
131
12
1.1
1.0
S 1 0 00'9
ציור מם* : 9
60 7b
)c־(t
עקומות ההתוך של
50
30
AO
20
PVP
DNAוטל האינמראקטים עם
בעל דרגת קווטרניזציה .100$
־־
47°
=55°
DNA
Tm
Tm
- 12:1
Tmj = 60°
5:1
־
+
P:N
Tmj = 61°
3:1
-
+
Tm. = 69°
-1.9:1
+
1
+
P:N
P:N
P:N
)1
>2
)3
•0
)5
־
מם•
ציור
10
טרניזציה
תלות
האחת
של
N
+
יותר,
מתאימה
ה מ ג י ב ה עם
בציור
של
מם,
, 100°
11
לגבי
מם.
אתת,
וכל
)דרגת
הבלחי
85°ב י ח ס
החנקן
הטעון
הבליעה
יורדת
הקווטרניזציה
מאקםטרפולציה
לעלית
השיירים
על
ציה
50$
המכסימום
תזוזה
המכוסים
מבחינה
(7$
באיזור
טמפרטורות
יותר
O
ע ק ו מ ה מם־
10
PVP
בפולימר,
התוך,
)85°
j
תופעה
השניה,
דומה
אבל
,(5
הגבוהה
DNA
נ מ צ א ה ב-
מ ו פ י ע ה דק
הגיבו
עם
טמפרטורת
PVP
ההתוך
אינם
הראשונה,
נ ת ב י ם מתחת
קופולימר
בעל
עצמה,
אבל
DNA
תכולה
כאן
) VPצ י ו ר
50$
מ ק ב ל י ם רק
Tm
זה.
מ ר א ה את
, 20°
PVPב ד ר ג ו ת
PVP
דרגת
נסויית.
לגבי
Tm
מכוסה
ב-
בעל
הקוו~
ר22־ן
• • ^Tsuboi et al,ו DNA -ה מ ג י ב ה עם C'lupeline
ח ל ק י ם אשר
ב-
15
יחס
הבליעה
כתלות
ביחס
ה א ו פ ט י ת של
; N /P
+
הקווטרניזציה
,100$
היחס
N /P
והיא
הגדלת
+
ה DNA -
כאשר
,50$
ל י נ א ר י עם
+
N
באינסראקטים
ר ק את
מסמן
כאן
רואים
שעלית
ע ו ל ה עם
הגדלת
דרגת
.7$
אותו » N /P
הבליעה 0
הפירידיניים
־־^ =
Tmה ש נ י ה
)ציור
א י נ ט ר א ק צ י ה עם
נתכת
עבור
השניה
שאיננה
ע״י
מכוסים,
באופן
זרחנים
,
DNA
לבליעתה ב-
של
וגם
גם
נמוכה
הקווטרניזציה
מס»
הקווטרני ז ציה(,
ארבעה
DNA
ב מ ק ר ה של
ציור
ב-
ה י א של
ה DNA -
מופיעות
כ א ן שתי
Pנ מ צ א ה רק
ל ח ל ק י ם של
התקבלה
DNA
ה מ ג י ב ה עם
פחותה במקצת
+
שהיה
גם
(12
DNA
poly-lysine
ח ל ק י DNA
ל-
N /P
הראשונה
Tm
עקומות
של , 5 0 $ב ע ו ד ף של
ב-
בעודף
ה-
מראה
ה ה ת ו ך של
56־
+
ל
כ
ו
הטעונים
ב מ ק ר ה של
מפני
מ
'
הדרושים
PVP
ההתוך
85 °
ד
0
בעל
כי
O.73ו ב מ ק ר ה של
להגנה
דרגת
היחס
דרגת
1
D
=
אפשר
Q
על
P
אתד
הקווטרניזציה
+״
~ =
הקווטרנציה
.0,25
100$
ל ק ב ל את
מפני
7$
ההתוך
חנקן
ב מ ק ר ה של
־7ן ־
מספר
טעון
דרגת
17־1־
)בכל
אחד
דרגת
מגן
הקוושרני-
)1#י(
־59־
1.41
)'O.D.(t
O.D.2(f
13
12
1.1
1.0
100
90
ציור מס: 11 .
80
60
70
)1(c
עקומות ההתוך של
50
40
30
DNAושל האינטראקטים עם
דרגת קווטרניזציה •7$
DNA
D
*?:li
)2
)3
)4
46°
Tm
70°
Tnij
19:1
76°
Tmj
9:1
^P:
80°
Tm,
4:1
*"PtN
20
PVPבעל
- 60 -
1.41
)O.Q(f
>0Ex2d
131-
12
1.1
10
160
90
ציור מם: 12 .
80
,60
)tCc
70
50
1
AO
I
2 0 3 0
עקומות ההתוך של DNAושל האינטראקטיס עם קופולימר
MA - VP
46°־Tm(1
2
363°־
72°
=
_ L
= Tm
=
1:1.5
4:1
(
;
DNA
57° (P:N
Tm2.3:1 P:N
Tm1:2.3
- 62 -
המסקנות
מולקולות
היא
PVP
ה -
שמוצאים
באיזורים
תופעה
אלו
לא
ינתכו
תופעה
זו
מקורה
זה
<N
במקרה
הראשון
עקב
או
של
תפיסת
DNAע צ מ ה ,
קצוות
ב-
השינוי
^- Tm
של
א י נ ט ר א ק צ י ה עם
)בו
ה-
כל
תוך
רכוז
DNA
יצירת
המלח
קופולימר
יציבות
נתך(.
מספר
המקומי
לעוצמה
חופשיים
PVP
אבל
,
גם
באינסראקט
+
חופשיות
מ-
0
PVP
היונית״
המכוסים
באיזורים
טמפרטורת
ההוכחה
- DNA
N / Pאשר
באיזורים
ההתוך
ב-
PVP
ובהפרעה
המכוסים״
במעבר
קשרים
מעטים
פני
מולקולת
ה-
העלאת
נובע
מהשפעת
ו ז ה מתבטא
DNA
ההליכם.
ברכוזי
אנרגית
הדתיה
אנרגיה
תרמית
נמוכה
ההליכם.
Tm
על
מקבלים
הראשון
עם
כמובן,
המלת
יותר
שההפך
על
בשינוי
מלח
הזרחנים
הוכיתו
היחס
למסוך
ידי
נמוכים
גדלה
על
הוא
מנת
-
המסוך
ויציבות
להתגבר
נכון
על
בעוצמה
ה מ ט ע ן של ה =
N
D
תיאורטי
של
החופשית
על
המצביעה ע ל
Tm
פוליאמינים
המסוך
האנרגיה
מעבר
כך,
בדומה
DNA
DNA־
באופן
מידת
ב ה ת ו ך ר ק את
ה ע ל א ה של
A(45,28,20
היונית
של
) צ י ו ר מ ם (12 .
גורם
על
ד ו מ י ם של
בין
את
ב-
DNA
י ח ד ־ עם זוז־ ,מ ת ק ב ל ת
^Schildkraut and Lifson
שרשרת
המכוסים
מולקולות
בהתאם
האיזורים
ה מ ו ל ק ו ל ו ת של
ב י ת ם של
החיוביים
ה א י נ ט ר א ק צ י ה ש ל ה ם עם
העוצמה
תלויה
בתמיסה
המטענים
בין
באיזורים
כל
הן s
.
אפקטים
לאתר
ו-
הנםיונות
שווה
זו
Tm
קיימות
בקרבת
מ ס ב י ר את
שהקופולימר
להגדלת
ממנו
Tm
באופן
Tmל א ר ק
ת ת ק ב ל אם
ב־
לדנטורציה
אפקט
ע ל י ה של
הפנויים
זו
המתקבלות
מחולקות
מסידרח
הזו
ב ע ו ד ף של
DNA
ידי
ההליכם
.
ש ש י נ ו י
המטען ע ל
עם
שיינו־ י
הזרחבים
לאורך
Tm
האלקטרוםטטית
יונים
מוקטנת
גבוהה.
המשפיעה
נגדיים ה ו א
האינטראקציות
יונית
וחומרים
(
מונומריים
s
לכן
קטן
על
״
מספיקה
הספציפיות
המיצבות
־ - 65
טמפרטורת ההתוך בנוכחות קופולימר מתאימה לרכוז מקומי של מלח כ-
1 0 4
N05״ ) 0
(
במקרה של אינטראקטים עם pypבעל דרגת קווטרניזציה Tn^ 100$׳ היא כ״ 95°מה
שמתאים ל ר
כ ו ז
של
N5>1
מ
ל
ח
ח ד
_
ח ד
ע ר כ
)(104,
״
אפשר להראות על ידי חשבון פשוט ,ש PVP -הספוח על פני הDNA -
מטען חיובי בסביבות
ר כ ו ז
מהווה
. 2N
o
8-10Aסביב השרשרת
אם ננית אפשרות של סיבוב המטען החיובי ברדיוס של
ידי
הפתמנית ,ואם מנחים לגבי מולקולה זו צורה גלילית הרי הנפח התפוס :על
°3
קולת פירידוניום אחת הוא
-
וב פשוט זה מתאים לעובדה ש-
על ידי
( 1 0 4
Tm
, A 8 0 0 4 0 0מה שמתאים לרכוזו
ל
מתאימה
-
2
N42־
-
,כפי שנמצא
2מלחNTm
(
. Walker
לפי ציור מס• 15מתקבל,
ש ־ 1 . ! 7הנקנים טעונים דרושים לכיסוי קבוצה זוחתית
אחת במקרה של אינטראקציה עם PVPבעל דרגת קווטרניזציה 1 0 0 $־ יחס זה נמצא
מחאים למודל של , DNAאשר עליו הורכב ) PVPציור מם .(22 .המרחק בין שני
o
o
12
זזדחנים על אותה שרשרת הוא 6.5Aועל שרשרות שונוח
a
ו - A
מעל שקע ק ט ן
14A
o
3^ A5המרחק
וגדול ,המרחק בין שתי טבעות פירידיניות במצב מקביל הוא
־
o
ג ד ו ל
אז
המטענים
של
המכסימלי ; A11לכן אם מניחים ש PVP -מסובב את ה -DNAלאורך שקע
75$
DNA
-מה שמתאים
מהחנקנים החיוביים יכולים )בגלל סיבות סטריות( לנטרל את
ליחס
+
N /P
1.17
במקרה של אינטראקטים עם PVP
P
דרגת קווטרניזציה
אשר במקרה הקודם ,יחם ההגנה להתוך היא
•
בעל דרגת קווטרניזציה 50$
V
0.73
P
$
0
/P
0
N+
1
נמצאה
.אבל
.יתכן,
התנהגות
Tm
2
אחד על כל שני שיירים אורגנים על פני
התוצר הסופי נושא מטען שלילי ולכן מורגשח עדיין הדחיה
ב י ן
דומה
נ מ ו כ ה
שבמקרה
איננו מיצב היטב את ההליכם הודות להפרעות סטריות לסידור מולקולות
הנושאוח מטען חיובי
רק
מ ו ל ק ו ל ת
ה ז ר ח נ י ם
זה
יותר
PVP
PVP
DNA־
ו
Tin,, -
־64
־
נמוכה יותר מאשר במקרה הקודם .באינטראקציה של
PVPבעל
DNAעם
דרגת
קווטרניזציה 7$נמצאה רק טמפרטורת ההתוך הראשונה.
מעיד ,שמבנה האינטראקטים הוא יציב מאד .תופעה דומה של העדר
העדר Tnu,
Tm
105
נתגלתה גם על ידי
2
•(and Tsuboi
n i g u c h iב א י נ ט ר א ק צ י ה של^
•. p o l y - L - l y s i n e and Rice Dwarf Virus RNAבמקרה
ש
ל 7$קווסוני־
זציה ישנו חנקן טעון אתד על כל 13השיירים חנקגיימ.למעשה מספר
החנקנים
הטעונים הוא גדול יותר,׳ כי הודות לשדה השלילי החזק של , DNAחל
נ ו ס ף
י א ו ן
של החנקנים .בטיטרציות פוטנציומטריות נמצא ,שאפקט היאון המכסימלי ב י ן pH
7־ 6 . 5הוא .8$אפילו אם לוקחים בחשבון אפקט זה ,עדיין יש על כל חנקן טעון
חלק פולימרי גדול בלתי טעון ,אשר נוטה להחקשר ל DNA -במצבו הנוטרלי כ ד י
9
להמצא בסביבה הנוחה לו יותר מבתינה אנרגטית .הודות לאינטראקציות הידרו־
פוביות אלה בין שטח DNAובין PVPואולי אפילו בין שיירים הפירידינים
הבלתי
טעובים ובין הבסיסים של DNAבמצבם הטבעי מתקבל מצב יציב מאד וההליכס
א י נ נ ו
ניתך מתחת ל-
ר
א
ו
ת
"
0
. 100°
2
=
25
85°
N /P
0
1
D
p
=
+
Q
אם נביח ,שאפילו יכול יחס זה להגיע ל־ 0.4מסיבות המוזכרות לעיל
התוצר נושא מטען שלילי .למרות זה העובדה שטמפרטורת ההתוך ,היא
מעידה על ההשפעה הגדולה של התנקנים הבלתי טעונים.על יציבות
על קיום זיקה הידרופובית בין
DNA
־
ע ד י י ן
הרי
גבוהה
ההליכס
לבין השיירים הבלתי טעונים של
, 0
מאד
ו מ צ ב י ע ה
. PVP
0
עובדות אלה שונות מן התוצאות ,אשר נתקבלו ע״י ^Mahler and Dutton
באינטראקציה של
מורידה את ה־
ההליכם.
DNAעם
, cyclobuxineהם מצאו ,שהגדלת רכוז ה -
Tmועובדה זו יוחסה לאינטראקציות ספציפיות
cyclobuxine
המורידוח יציבות
65-
־
י צ י ב ו ת
על מנת לברר את השפעת הקבוצות הפירידיניות עצמן על
ה -
DNAנערכו עקומות ההיתוך של DNAאחרי אינטראקציה עם
פ י ר י ד י ן
בחקירות אימונולוגיות נ מ צ א ^ ^ ^ ,שפירידין ברכוזים גבוהים
לדנטורציה של ה-
DNA
ם ו נ ו פ ר י ־
ג ו ר ם
)( 0N1
־
DNA
oהנםיונות אלה התבססו על מדידת כמות ה־
הוסברו
אשר עברה דנטורציה בהשפעת רכוז ידוע של תומר הגורם לכך־ תופעות אלו
על ידי זיקה הידרופובית חזקה יותר לצורת פקעת של ה-
DNA־
עקומות
הנסיונות עם פירידין בעבודה זו ,נעשו על ידי מדידת
_2
של DNA
למנע
ב־א .NaCl 10רכוז המלח בנסיונות אלה הוגדל ,כדי
בעוצמה יונית נמוכה במשך הטיפול הארוך ב-
בו בולעתDNA
זדנטודציה
תחום
. DNAפירידין בולע באותו
ולכן היה צורך להוציאו מן המערכת לפני קביעת עקומות
ההתוך־
הפירידין הוצא על ידי ליאופיליזציה או על ידי דיאליזה כנגד 10 N
במשך 24שעות-v».בכל מקרה הפירידין )ב
ההתוך
p H 7׳ ( הוסף לDNA -
NaCl
והאינסראקט
נשמר בחדר הקור לפני המשך הנםיון.
ציור מם־ a 14מראה את עקומות ההתוך של DNAבלבד־ ושל
אשר
DNA
ל י א ו פ י ל י ז צ י ה .
רכוזים שונים של פירידין .בנםיונות אלה הפירידין הוצא על ידי
אפשר לראות ,שביתסי מול 1:2000פירידין DNA :
נתך ,לעומת זה ביחס
000j1820
)
ה -
)עקומה (2
(4עקומהאין כמעט התוך .לא
נםיונות ברכוזים יותר גבוהים של פיוידין ,כי
DNA
שוקעת
ה ו ח ז ק ה
עם
DNA
נ י ת ן
עדייו
לעשות
ב פ י ר י ד י ן
ו א י
2קי
אפשר להמים במים את התוצר אחרי ליאופיליזציה־
על
ציור מס14.נ 1מראה עקומות ההיתוך של DNAאחרי הוצאת פירידין
.NaCl
N
1 0א ע ״ פ שהנסיונות בוצעו בעודף גדול מאד
של
) (1:50^000לא היתה לפירידין כמעט השפעה על עקומות ההיתוך.
מתקבל אותו אפקט
פ י ר י ד י ן
ב כ ל
זדיפרכרומי )בגבול השגיאה הנםיונית(־ מתוצאות
שפירידין גורם לדנטורציה הפיכה של DNAכנראה על ידי הורדת
י ד י
ד י א ל י ז ה
שבבת
המקרים
א ל ו
ה ס ק נ ו ,
המים
המגי2ח
־ 66־
ושינוי בקבוע הדיאלקטרי בסביבת המקרומולקולה־ הרנטורציה היא איטית מ א ד ,
כי רק על ידי התלפת פירידין במלח )על ידי דיאליזה( מקבלים בחזרה
שתי השרשרות והתוך רגיל של
106
al^ .
. DNAתוצאות אלו אינן נוגדות את
, ^ L e y i n e etכי הם מדדו את כמות ה-
בנוכתות פירידין.
, DNAאשר עברה
התחברות
התוצאות
של
דנטורציח;
־ - 67
ציור
מ ס 14 .
:
ע ק ו מ ו ת ה ה ת ו ך של DNA
פירידין
(a
על י ד י
פירידין
5
־><• 10
•8
5
"(nc 10
י
יי
0
10־2
״
~10׳b
״
l
ליאועייליזציה
(bעל
1
0
~10י3) 5.4
י•
־)(!•4) 2.8
״
DNA
5
eq/cc11! ()"l-8
(1
! ( ) " n c q / c c
5
5
ידי
דיאליזה.
פירידין
1) 5 • 1
) י | / c c .
_1
:
UNA
0
' ׳ncq/cc
הוצא
א ח ר י ת ג ו ב ה עם
פירידין.
״
5
") 24-10
1
י'
5
2.5
יי
5
־10י5) 4
")(!•4) 4
- 6'8 -
(3
הידרוליזה
אנזימטית.
מידת
ה כ י ס ו י של
נקבעה
בעזרת
אנזימים:
הידרוליזה
א נ ז י מ ט י ת של ה -
חופשיים מ-
ד א ו כ ם י ר י ב ו נ ו קלאז
הוא
2י> 5־ 5
חלבון
ופעילות
(94
ל
ש
ד
א
ן
התגובה
7
ר
י
u
ב
י
ו
ז
!/
ה
ו
הבסיסי
א מפרק
הוסף
הנםיונות
ה א י נ ט ר א ק ט י ם על י ד י
ופוםפטז
שני
־־
ב ס י ס י
)דאוכסיריבונוקלאז!־( יכל
לפעל
.
,
זה,
חומר
שהופק
נקודה
מפנקראסישל
איזואלקטרית
p Hה ו א מ פ ר ק את הקשר 3־ P
.
נוקלאוסידים
המסתיימים
ב ״
ב DNA -
במונופוםפט
ש1ור
?
pH
עד
במקום
5
״
שהופק
מ מ ע י י ם של ע ו ף
מ ו נ ו א ם ט ר י ם של
> ROH + H P0
חומצה
פעילותו
זרתתית
לאינטראקטים או
המשתחררת
האינטראקטים
אתרי
נקבעה
בשיטת
לפני
הוספת
רוכזו
)(PVP + DNA
לכמות
2
ל DNA -
זמן
אופטימלית
זרחתית
לחומצה
-3
וכהל
לפי
עצמה
3
H P0
2
)באותו
האינקובציה
9 1
ר כ ו ז כמו
הוסף
^) (Kingללא
הפוספטז
שריפת
החומר
באינטראקטים(
הבסיסי
ה א נ ז י ם על י ד י
זיקוק
מכמות
הזרתן
האי-אורגני
הזרחן
חושבה
המתקבלת
מאותו
ר כ ו ז של
והחומצה
האורגני(״
המים
ה כ י ס ו י של DNAע ל י ד י PVP
בהשואה
- OR + H P
3
ד א ו כ ם י ר י ב ו נ ו קלאזו־
הזרחתית
מידת
קווטרניזציה
הבאה s
4
בכל
שהאנזים
endonuclease
(
\ wt/
הפוםפטז!
% pH9
היתה
נ ו ק ל א ו ט י ד י ם א ו תלת
)(107
כ
DNAו ש ל
א ל ב ו מ י נ י ב ע ל משקל מ ו ל ק ו ל ר י ^10״,6
די
ס
PVP
Iהוא
אופטימלית ב-
שנשארים
בעל
deoxyribonuclease - I
ההנתה
a l k a l i n e phosphatase
רק על
DNAע ל י ד י
דאוכסיריבונוקלאז
אתרים
PVP
דרגות
שונות;
תמייסוח
בווקום•
DNA
שהתקבל
פ-
,א ש ר ל א עברה
אינטראקציה״
פיזור
הנקודות
ב נ ס י ו נ ו ת של
"= PVPהנםיוניים ,אשר א י ן
שליטה
הידרוליזה
עליהם־
אנזימטית הוא די
הנסיונות
נעשו
גדול
בגלל
הקשיים
ב א י נ ט ר א ק ט י ם ש ל DNA
»
- 69 -
,100$
בעל דרגות קווטרניזציה
7$ ,50$וקופולימר בעל o MA - VP 50$
) (0של
בציור מם 15 .מוצגת הפרקציה
DNAשלא עברה הידרוליזה כפונקציה של
) (0ובין היחס
+
N :P.היחסבכל מקרה מתקבל יחם לינאךי בין
באינטראקטים .מעל יתס מסוים של
במקרה של אינטראקטים עם
-
0.9
פסקת כאשר
ניזציה 7$מעל
+
0,5
?*:אמעוכבת ההידרוליזה של ה-
DNA
בעל
ובמקרוזז של אינטראקטים עם PVP
+
=
ל ג מ ר י ־
בעל דרגות קווטרניזציה 50$ו־־100$
PVP
N :P
+
»P N
N :P
ה ה י ד ר ו -
דרגת
אין כבד הידרדליזזד .יתכן ,שבמקרה
בגלל
+
היחס האמיתי של
N :Pהוא יותר גבוה הודות ליאון נוסף של החנקנים
האינטראקציה עם הDNA -
האחרון
הטעונה שלילית.
נבדקו גם האינטראקטים של
DNAעם קופולימר של 50$
VP־ MA
במקרה זה אפילו בעודף גדול של ויניל פירידין )לגבי ( DNAצמצום ההידרוליזה.
קטן ואינו עולה מעל
לימר של
לשייר
,15$הערך אשר הוא עדיין בגבול השגיאה הנםיונית־
MA-VPאיננו מפריע לגמרי להידרוליזהזאנזימטית של
MA
ה ו ד ו ת
, DNAכי
הטעון שלילית צפיפות המטען השלילי על פני תוצרי האינטראקציה
איננה משתנה .לעומת זהזבאינטראקטים של DNAעם
50$
ה ק ו פ ו ־
ק ו ו ט ר 3י ז צ י ה
PVPבעל דרגות
ו ־ 1 0 0 $התנקנים הטעונים יעילים בעיקר בהגנה מפני ההידרוליזה־
+
N :P
פעולת דאוכסיריבונ וקלאז נפסקת כאשר היחס
ה
י
א
.009ז״א
על
במקרה
כל
זרתנים נשאר בערך זרחן אחד .בלתי מנוטרל על ידי החנקנים החיוביים־
הובאו נתונים המראים ,שבהגנה נגד התוך תורמים במידה גדולה
גם
צפיפות המטען על פני תוצר האינטראקציה .השפעח המטען שעל פני
עשרה
בחלק
ה ח נ ק נ י ם
טעונים ואילו כאן יעילים ביחוד חחנקנים הטעונים והפסקת ה ה י ד ר ו ל י ז ה ז
ה־־־
ש
ל
מתקרב ל־ -DNA
ו
H
p
7
מ
כ
א
ן
,שהמרכז .הפעיל של
איננו טעון בכלל ,או טעון חיובית ,כי אחרת היתה
הבלתי
עם
על
ההידרוליזה מקורה כנראה בתכונות החשמליות של האנזים עצמו־ דאוכסיריבו
אשר הנקודה האיזואלקטרית שלו היא בסביבת
הקודם
קשורה
DNA
5pllיהיה טעון מטען כללי
זה
נקלאד,
ש ל י ל י
ה א נ ז י ם
מתהווה
אשר
דתיה.
- 70 -
ציור מם: .15
הידרוליזה אנזימטית של אינטראקםים של NA0עם
PVPבעל דרגות קווטרניזציה שונות.
OOO־
P V P
בעל דרגת קווטרניזציה 7$
50$
־
PVP
״
״
יי
••• -
PVP
״
״
״
ל
&NAשלא עברה הידרוליזה.
0
O O
6
-
ר כ ו ז ש
100$
-
71־
לעומת זאת אם מקטינים את המטען השלילי על פני ה-
DNA
ע״י הוספת
PVP־־
החלק של האנזים הטעון שלילית נמשך לתוצר האינטראקציה ומפריע לגישו״ז ש ל
המרכזים הפעילים; לכן ההידרוליזהזשל
PVP
במקרה של אינטראקטים עם
DNAנפסקת.
בעל דרגת קווסרניזציה 7$יתכן ,שגם
הבלתי טעונים משחקים תפקיד במניעת ההידרוליזה על ידי הפרעה סטרית
ה ש י י ר י ם
לגישמז
ש ל האנזים שהנו חלבון די גדול.
תופעות דומות של מניעת פעולת דאוכםיריבונ וקלאז נמצאו גם באיגסר-
אקציות!
של
DNA
4
עם *^ ( a c t i n o m y c i n D, ethididium bromideובאינטראקציה
עם אקרידין א ו ר נ ג ' ^ ^ ^ כנראה שגם במקרים אלה הקטנת צפיפות המטען ע ל פ נ י
ז
ה DNA -גורמת לצמצום מידת ההידרוליזה.
־ 72־
(4
תכונות הידרודינמיות של חאינטראקטים
א(
צמיגות.
צםיגות האינטראקטים השונים של DNAנמדדה כפונקציה של
־—־—
או
P
כאשר סכום הרכוזים הוא קבוע
P + N_4
P +N
ו m e q / c c "10 -״ .(P+N - 1ציור מס 16 .מציג את הצמיגות הסגולית
)
P
0
היחס
+
r a e q / c cי 3־ P+N - 1
1
) ח(
sp
P
עבור האינטראקטים של NA0עם PVP
כפונקציה של היחס•
P +N
קווטרניזציה 50$ו . 1 0 0 $ -בשני המקרים הצמיגות הסגולית
דרגות
בעל
יורדת
עם
sp
הגדלת המטען החיובי ,מגיעה כמעט לאפם בנקודה האקוולנטית ,ועולה שוב
בתוצר האינטראקציה עם pypבעל דרגת הקווטרניזציה 50$העליה היא
מטען החיובי.
P
—
. Nבסביבת r =0<,5־
בגלל הרכוז הממשי־ י הגבוה יותר של פולימר עבור אותי
P +N
בעוזזף
חזקה
י ו ת ר
+
לא ניתן לבצע מדידות בגלל שקוע האינטראקט בנקודה האקוולנטית.
קיימות כמה סיבות לשינויים כאלו ב-
s p
• nהאינטראקציה גורמת
של מטען הזרחנים על ידי החנקנים הטעונים .לפיכך קטנה הדתיה
המטענים הזהים לאורך שרשרת ה-
בה
ל נ י ט ר ו ל
האלקטרוסטטית
, DNAוביחוד באיזורים הגמישים -
ועקב כך הצמיגות יורדת .האינטראקציה עם
+
N
במקרה
DNA
ט ב ע י ת
פ י
ש נ י ט
להגדלת
ב א י ז ו ר י ם
ומקטינה את הצמיגות .הגדלת רכוז תמלח בשלשה סידרי גודל משנה את
גמישים
צ מ י ג ו ת
) , ( ° 9 ) ( 9 0נוסף לכך חל שינוי צורה במולקולה ה -
1
המתבטא בקיפול חלקים של המולקולה כפי שאפשר לראות מתמונות של
אלקטרוני .הצמיגות של האינטראקטים היא צמיגות של כדורים )חלקי
התקפלו( המקושרים בחוטי ה-
. DNA
בין
)(flexibile
זדה א ק ו ו ל נ ש י ו !
רכוז מקומי של יונים נגדיים המקטינה את הדחיה האלקטרוסטטית
תלקי
של
DNA
מ י ק ר ו ס ק ו פ
המולקולה
&שר
־ 74־
אחרי הנקודה האקוולנטית מתקבלות בנראה־; מולקולות ה-
DNA
המכוסות לגמרי
ב ־ • PVP
האינטראקט מתקיים בצורת כדורים קשיחים .כדורים אלה קושרים PVPובנוסף
ישנו בתמיםןהי^\? חופשי .תרומה של כדורים קשיחים אלה לצמיגות תהיוד; קט3מ
מאד.
0
אם מניחים שנוסתת ^^**Einstein
T
מתקיימת :
sp
> -הנפח החלקי הניתן על ידי רכוז הפולימר ביחידת הנפח .כאשר עובדים
j
<
_4
זו המרכיבים
10
meq/cc
צמיגות האינטראקטים עצמם איננה ניתנת־ ,למדידה
והצמיגות הנמדדת נובעת מרכוז ה־י PVP -ההולך וגדל עם הגדלת היחס
+
. N:P
ההנחה של קיום כדורים קשיתים בעודף שלק^קמתאימה לתמונות המתקבלות
במיקרוסקופ האלקטרוני.
P
עבור האינטראקטי
nכפונקציה של היחס
ציור מס 17 .מראוד את
. MA-VP 50%אפשר לראות ש -ה יורדת באופן לינארי עם
של DNAעם קופולימר
sp
p
s
p
הקטנה היחס
.האפקט העיקרי הוא אפקט המהול של מרכיב צמיגי .על ידי מרכיב
בעל צמיגות נמוכה.
- 76 -
ב(
םדימנטציה.
נמדדו
בטבלה
מם.
מקדמי
האינטראקטים
ה ס ד י מ נ ט צ י ה של
השונים.
התוצאות
סו:מי
.1
טבלה
מקדמי
דרגת
מס.
1
האינטראקטים
ה ס ד י מ נ ט צ י ה של
היחס
קווטרניזציה
13
של
S .10 sec
)(2
+
P:N
PVP
50$
681
3.6:1
2.7:1
1:4.4
1:6
1:6.3
1:10
1:21
)(PVP
100$
5:1־9
1־5״4
2.581
1.68 1
1 :8.3
II
II
II
II
ק ו פ ו ל י מר VP-MA 50%
היחס
14
5־14
15.8
2.3
גבוה
2
2.4
2.2 ; 3«2
9״9 ; 4־5
1.9
מאד
7־11
1502
1־17
11
00
1
I
P:N
ו
181.2
הערה8
רכוז
meq/cc
ה DNA -
בנסיונות
-
ורכוז
אלה
המלח
היה
-4
10 meq/ccי; 1 3
־
4
באינטראקטים
ה י ה10 N10*1.4
רבוד
NaCl־
\+
(N)PVP
I
־ 77־
מטבלה מס 1 .אפשר לראות ,שבעודף
במעט באופן לינארי עם היחס
DNAפקדם הסדימנטציה עולה
+
• N :Pאקסטרפולציה עד
+
P:N = 1:1נותנת
. S = 21תופעה זו מקורה באפקטים הבאים :האינטראקציה מגדילה את המשקל
המספחת אח היPVP -
המולקולרי של הDNA -
וכפי שזה מתברר גם מתמונות
במיקרוסקופ האלקטרוני ,ה DNA -נוטה להתקפל במקומות בהם נמצא ה-
PVP
הספות .יתר על כן בעקבות הספוח קטן גם המטען החשמלי החופשי של המולקולה
ובן מספד היונים הנגדיים הקטנים שלו .ריבוי היונים הנגדיים מקטין את מקדם
הסןדימנטציה .כאשר הםדימנטציה של מקרו-יון הנה מהירה יותר מאשר של היונים
הנגדיים ,נוצר שדה אלקטרוםטטי מעכב ,שכוונו הפוך לשדה הצנטריפוגלי ,ברור
איפוא כי הקטנת מספר היונים הנגדיים גורמת להקטנת השדה המעכב ולהגדלת מקדם
הםדימנטציה הנמדד .מסיבות דומות משפיעה גם הגדלת רכוז המלח על הגדלת מקדמי
-3
sעבור
הםדימנטציה :ערכי ה-
DNA
גדלים מ S = 12.4 -ברכוז המלח
10
_1
ל = 21 -ב . N 10 - sתופעה של תלות מקדם הםדימנטציה של DNA
90111
Doty^ •*Ganguli
and Bhattacharyya
^ and Bhattacharyya
111
י נוסף ב־ sמעל רכוז המלח
r
and
(Ganguli
.NaCl
i
g
n
e
טוענים ,כי ברכוזי DNA
N
ברכוז המלח
^
E
נמוכים א
0 . 1 5 Nנ י ט ר ו ל המטען של DNAעל ידי
DNA
pvpהנו שווה ערך להגדלת הרכוזו המקומי של המלח באיזורים אשר בהם
מכוסה ב) . PVP -בחלק הקודם הובא חשבון המראה ,שהרכוז המקומי של המטען
החיובי הנובע מ-י
עליה -3
S
הםפוח הוא בסדר גודל של.(N2pyp
עקב אינטראקציה נמצאה גם עבור
ה מ ג י ב ה
ע
ם
ה י ם ס ו 3ל ט
)(20
־
ידוע כי גם אינטראקציה עם מתכות גורמת לעלית מקדם הסדימנטציה C61)(64)-DNAVw
בשני מקרים אלה הסיבה העיקרית היא ניטרול המטען של
טבלה מם 1 .מראה ,כי בעודף של
אחד .יתכן שS -
o DNA
PVPמתקבלים שני ערכים של Sאו ערך נמוך
הראשון ) 2׳v׳( שייך ל-
PVPעצמו ,אשר בעודף ,וה S -השני
1^Sp p=:
v
מסי מערכת SYSTEM HO.
12.762.2-1
־ - 78
שייך לפרגמנט של האינטראקט אשר נקרע מח^
המטען הקרובה לאפס נותן אגרגטים בעלי
. DNAהאינטראקט בעל צפיפות
גבוה מאד ,כך שהם שוקעים כבר
S
במהיריות נמוכות של הסיבוב ונעלמים מהשדה לפני שמתחילים לצלם במהירות
rpm
ן
+
.במקרה של אינטראקטים
2.000
גבוה
-
1 : 6
20.000
P:N
m
1000יי .האגרגסים בעלי ה-
PVP
r
! שקע חומר בעל
Sהגבוהים נעלמים שוב כאשר היחס
עולה ל 10-ומעלה .נראה שבעודף גדול של
עם פרגמנטים של
p
ו־
1:10הם צולמו
S
+
N /P
PVPמתקיימים רק האינטראקטים של
. DNAמתברר ^DNA-
מאותו מקור נוטה לתת פרמנטים
יותר קטנים אתרי אכסון־
בםדימנטציה של DNA
המתאים למקדם הסדימנטציה של
-קופולימר נמצאו שני ערכים של
j Sאחד
DNAעצמה באותו רכוז מלח ,ושני נמוך ~ שהינו
מקדם הםדימנטציה של הקופולימר.במקרה זה האינטראקציה תלשה כל כך )או אינה
קיימת( עד שהשדה מפרק את ה״תוצריי למרכיביו והם נעים בנפרד־
־ 79־
ג(
הפרדה על ידי צנטריפוגציה בפהיריות גדולות
על מנת לברר אפשרות הפרדת הפזות בעודף של
המרכיבים במשקע ,הכנסנו את התערבת לצנטריפוגת
PVPולקבע יחם
" " S o r v a l lלמשך
'20
14
15.000
.הרכב התערבת היה DNAטבעית ו־ PVPמסומן ב-
rpm
C
בעל דרגות קווטרניזציה 80$ו «30$-יחם המרכיבים במשקע נקבע לפי הבליעה
האופטית ולפי הפעילות הרדיואקטיבית.
טבלה מס 2 .מראה את יחם המרכיבים במשקע אחרי הצנטריפוגציה עבור האינטר-
אקטים השונים.
-4
רכוז המרכיבים בנסיונות אלה הוא meq/cc
DNA
או
+
MO
Nאו
. Pבנסיונות עם
PVPבלבד ,בתנאים שווים ,לא נמצא כל שינוי בבליעה או בפעילות
רדיואקטיבית.
הזדיוק בנסיונות
•־; •..י •• ,׳
אלה הוא
.± 15%
מבלה מם:2 .
DNAעם
האינטראקטים של
עבור
דרגתיתס המרכיבים
קווטרניזציה
המרכיבים
יחס־
ובמשקע של
בתמיסה התחלתי
יתס
של
PVP
במשקע
המרכיבים בתמיםהז
) (P:N
1.01 s i
) (P:N
30$
It
I
II
183.6
II
183.6
II
1:6
הערות
+
+
281־
281
PVP
1.2 8 1
1.04
18
1.0781
״
80$
1.8581
1.2681
II
1.85:1
1.15:1
אין שקוע
It
1:3
-
אין שקוע
it
1:4.7
־״
אין שקוע
־ 80־
מטבלה
בעל
עם
מקרה
יתס
המרכיבים
זה
+
1 : 4
בעל
דרגת
בתומר
גדולות
-
קצת
ההפרדה
מאשר
DNA
בעודף
ה-
DNA
גדול
הגורמים
N
עוד
לפני
שכל
נוטה
והוליכים
DNA
ושקעו.
בעודף
כי
הניתוק
יחם
יתכן,
שראינו
ג
הוא
סטיות
יותר
גדול
במהיריות־ עוד
^\?האינטראקס
לאחר
הכדורים
כנראה־ ב מ ק ו מ ו ת
יותר
שוקע
בגלל
יותר
חזקה
ה ח ו ט י ם של
להנתק
ה ח ל ש י ם אשר
גגבדהוח
הממיט
האינטראקציה
נוטים
מיחםז
מאשר
אינו
ה א ל ק ט ר ו ס ט ט י ת עם
קודם
השרשרת.
הפולימר.
P:N
כי
לקבל
,
המרכיבים
ג ד ו ל של
לאורך
י ו ת ר של
-
האינטראקציה
כפי
כדורים
רכוז־גדול
1 : 1
כאשר
ה י א שעל
מנת
אותו
+
N
מהשרשרת
במולקולה:
היו
מתרתשת
הכדורים
אגרגצית
בכל
ושקועם.
מקרה
תחילה
צריך
לחול
׳"• Aי
נ י ת ו ק ,של
אשר
החומר
הסיבה
הוא
יותר
האינטראקציה.
י >
יתכן
+
לאגרגציה.
p
בעודף קטן:.של .מטען
יי י• •י';(v%
30$
השגיאה.
החופשי;
-
נחוץ,
ל-
יותר.
ונוצרים
לגבי
+
מגבול
החיובי
מתקפלים
קרוב
ה פ ר ד ה של
יהיה
המטען
כוחות
הוא
יותר
אין
נוכחות
קווטרניזציה
השוקע
P:N
תחום
מ ס 2 .אפשר
שתחום
ק ו ו ט ר נ י ז צ י ה 30$מאשר ב ע ל $80$
דרגת
PVP
לראות,
השקוע
גדול
עבור
PVP
המטען
הזמן
החופשי
מתקיים
לאגרגציה
נדרשים
לא
, Spinco
שווי
ושקוע
להוצאת
מספיקים
כדי
העודף
קצר.
האגרגט
הכוחות
לגרם
ואחייב
משקל
שקוע.
בין
עם
מן
המרכיבים.
הגדלת
התמיסה.
הצנטריפוגלים
להפרדה.
היחס
מעבר
הנוצרים
ה ק י ו ם של
זמן
N /Pכ ה ו ת
+
לעודף
במכשיר
ביחס
התוצר
סדימנטציה
מ ס ו י ם של
Sorvall
PVP
גדלים
לגבי
ואפילו
1:1
81 -־
ד(
צנטריפוגציה בגראדינט צפיפות.
בשיטת הצנטריפוגציה בגראדינט של צםיום כלוריד אפשר לעקב אחרי
שינוי צפיפות בחומר הנבדק .שינוי צפיפות! :של
נמצא על ידי
Jensen and Davidson
+
לשינוי גדול בצפיפות ,כי יון
J
.
DNAאחרי אינטראקציה עם כםף
האינטראקציה עם
PVPצריכה לגרם
C sהקטן מוחלף בפירידוניום הפולימרי -מה
שנמביא לשינוי במשקל מולקולרי ובנפח .גם מידת ההידרטציה של DNAעלולה להשתנות,־
ידוע שסביב מולקולות ה DNA -נמצאת שכבה של מים .תגובה עם PVPשהוא הידרופובי
עלולה להקטין את השכבה הזו ,ביחוד אם הPVP-
מים אלו צריך לגרם לשינוי צפיפות ה-
צפיפות האינטראקטים,
תופס חלק גדול של שקע אחד .סלוק
, DNA
DNAו PVP -נמדדודז בתמיסות בעלות צפיפות שונה ורכוזו
CsCl
2-7
molal.
התוצאות מסוכמות בסבלה מם• -3
סבלה מס3 .
צפיפות הDNA -
והאינטראקמים שלה עם
PVP
בעל דר גזת קווטרניזציה 100$
התומר
אינטראקטים
)p g/ccהנמצא(
DNA
1i692
PVP
1.087
+
) (P:N
9.4:1
1.686
2.4:1
1.681
1:3
הערה :
המרכיבים הוכנסו קודם לתמיסת
1.681
CsClואח״כ
עורבבו.
־82
מטבלה
פ ס
־
• 3אפשר לראות ,שבכל המקרים הצפיפות השתנתה ב0.6% -
לכל היותר .הצפיפות המתושבת של האינטראקט - 1:1
+
היא
מתקבל על הדעת ,שהצפיפות המדודה היא של ה־
g / c c 4 6 P : N״ lלבן
DNAעצמה .שינוי של 0.6$שווה
כמעט לשגיאה הנסיונית שהיא די גדולה בגלל העדר סטנדרד של
DNAבעל צפיפות
ידועה.
אה איפוא ,שברוכוזי מלח כל כך גבוהים
)
-
כל כך חזקה ,שלא נוצר האינטראקט הפולימרי.
( m o l a l 7 2האינטראקציה
אתו היא
- 83 -
(5
צילום במיקרוסקופ האלקטרוני.
בעז.רת המיקרוסקופ האלקטרוני ניתן לראות את צורת האינטראקטים
ואת השינויים החלים במבנה של ה •DNA• -נבדקו תוצרי האינטראקציה של
עם
PVPבעל שלשת דרגות קווטרניזציה ביחסים שונים של
קופוליםר בעל תכולת 50$
ות
»2
+
Nהמכילות
+
CsCl
(
DNA
P/Nושל DNAעם
.MA - VP
6
4
)meq/cc 10~«510~ N
נושאות מצופות בפורמור ופחם.
+
Cs
רוססו על דיםקיות
או P
בתור יון נגדי איפשר הסתכלות בדוגמאות
ללא צביעה נוספת הודות לפיזור גדול של אלקטרונים על ידי היון הגדול.
נוסף לכך על חלק מהדוגמאות אוידהזפלטיגה ממקור בזוית
תמונה מס 18 .מראה
DNA
ו-
.1:7
PVPלבד .תמונות מם• 21 ,20 ,19הנן
כמה דוגמאות של תוצרי האינטראקציה של P V P ; ^ DNA
.
צורת האינטראקטים בתמיסה אינה בהכרת כפי שרואים אותה בתמונות המצורפות בגלל
הצורך ליבש את הדוגמא בהכנה לצילום ולכן משווים את צורת האינטראקטים בכל מקרה
לצורתה של DNAשצולמה באותם התנאים .נוסף לכך אף באותה דיסקית מקבלים
סואציות של צורה .התמונות המובאות נבחרו מבין
דגמים רבים מאד ומראות מ צ ב
שכיח .כפי שרואים בצילומים צורת האינטראקטים משתנה לפי היחס
קווטרנידציה של הפולימר .השינויים בצורת
פלוק-
DNAיחסיים ל -
+
N /Pוהם גדולים ביותר
עבור PVPבעל דרגת קווטרניזציה ) 7$כאשר משווים לגבי אותו
תמונה מס 19 .מראה את האינטראקטים של DNAעם
+
N /P
ו ל פ י
דרגת
+
.( N /P
PVPבעל דרגת קווטרני-
זציה .7$
בתמונה
) (aיחם
* P/Nהיא •9*1על פני חוטי ה DNA -מופיעות פקעות והחוטים
הולכים ומתקצרים .הפקעות במקרה :זה מופיעות אפילו בעודף יותר גדול של
+
) 20:1־ (P:Nועם הגדלת רכוז PVPעולה תדירות הופעתן•
DNA
־
תמונה מס: 18 .
84־
DNAו־
תמונות מיקרוסקופ האלקטרוני של
PVP
)(a
DNA
ציפוי Ptהגדלה 0 0 0ן 6 4
(W
DNA
צביעה על ידי יוני C sהגדלה 72»000
)PVP (c
+
בעל דרגת הקווטרניזציה 7$
ציפוי 72 Ptהגדלה • 0 0 0
י
t
85 -־
c
b
אינטראקסים של DNAעם PVPבעל דרגת קווטרניזציה 7$
תמונה מס» : 19
)(a
(bD
+
P:N
+
P:N
a
9:1
ציפוי
צביעה על יני יוני
)(<j
Pt
9:1
+
P:Nוציפוי!Pt 8:1.
הגדלה • 76,000
+
Csהגדלה 76*000
70 000הגדלה
9
־ 86־
)(a
+
P:N
)(b
)P:N* (c
ציפרי
+
P:N
4:1
צביעת יוני 4:1
ציפוי
2:1
Ftהגדלה 74>000
+
000 Csהגדלדה»74
Ptהגדלה 74»000
־ 87־
תמונה מם» : 21
)(a
+
)(b
+
)(c
+
אינטראקטים של
DNAעם
PVPבעל דרגת קווטרניזציה מלאה
P:N
ציפוי
4:1
Ptהגדלה 50»000־
P:N
ציפוי
2:1
Ptהגדלה 50,000
P:N
ציפוי
1:4
Ptהגדלה 50 000
s
- 88
בתפונה (c)19היחס
יותר; בעודף של
+
* P/Nהוא ,1.8:1חדירות הופעת הפקעות עולה עוד
Nהתוטים נעלמים כמעט לגמרי.
בתמונה ) (bהיחס
P/Nהיא 9*1הקונטרסט הושג על ידי יון נגדי
+
, Csגם החוטים וגם הפקעות קושרים
אלה.
Csמה שמעיד על מטען שלילי במקומות
ציור מם 20 .מראה את האינטראקטים של
PVPבעל דרגת קווטרני-
DNAעם
זציה •50$הפקעות הן דומות לפקעות המופיעות בתמונה הקודמת ) 7$קווטרניזציה(,
+
אבל תדירות הופעתן קטנה יותר ,והחוטים אינם נוטים להעלם אפילו ביחס א.2:1 ?/
גם כאן הן האינטראקטים והן החוטים נצבעים על ידי
+
) Csמס.( c 20 .
במקרה של PVPבעל דרגת קווטרניזציה 100$צורת האינטראקטים שונה לגמרי )תמונה
DNAאין פקעות ,לעומת זאת נראות התרחביות ובמקומות
מם .(21 .על פני תוטי
מסוימים הן מקבלות צורה אליפטית .תדירות הופעתן קטנה .גם התוטים וגם ההחרתביות
נצבעים על ידי
+
).(Cs c21
בתמונה מם 18 .מובאים
+
DNAבציפוי Ptובצביעת על ידי 03לשם השוואה:
וכן PVPבעל דרגח קווטרניזציה • 7$
מהתמונות הללו אפשר להוציא כסה מסקנות :
הפקעות הן חלקים של
, DNAאשר התקפלו ללא שבירת שתי השרשרות ,הפקעות אינן
מולקולות PVPעצמן ,כי הן גדולות
בעלת דרגת פולימריזציה של 2000הוא
מדי .נפחה של מולקולת ) PVPמחושב מצפיפות(
10
A״3.5
נוסף לכך הפקעות מספחות
ו
+
Cs
-מה שמעיד על מטען שלילי במקומות אלה .מתמונה ) (a 18אפשר לראות מהעוב
של חוטי
DNAשישנם כאן גם חוטים בודדים וגם אגרגטים .העובדה ,כי הפוליפר בעל
דרגת קווטרניזציה הנמוכה ביותר גורם לשינויים הגדולים ביותר במולקולה ה- DNA -
מרמזת על אינטראקציה של השיירים הבלתי טעונימ של PVPעם שטח ה-
מתמונות המיקרוסקופ האלקטרוני נראה שקטעים של מולקולות
DNA־
DNAהמכוסים בPVP -
- 89 -
הנושאים הרבה קבוצות בלתי טעונות מתקפלים באופן מקומי ודרגת הקיפול
גוברת עם הגזדלת מספר הקבוצות הבלתי טעונות .במקרה :של אינםראציה עם
קופולימר לא חלו שינויים במבנה של • DNA
90 -
תמונה מס: 22 .
מודל של
)(a
DNA
DNAאחרי האינטראקציה עם
PVP
בעל דרגת קווטרניזציה ;100$המשולשים
מסמנים את ה-
זדדרחנ ים.
)(b
DNAבלבד.
+
Nאשר לא הגיבו עם
- 91 -
(6
קביעת קבוע ,הקישור־ של יונים מתכתיים ל-
ניסינו לקבע את קבועי הקישור של
+ +
DNA
+ +
C uו-
Cd
ל-
,
DNA
c DNAלשם
ולמצא את תלות קבועי הקישור ברכוזה המלח ובמבנה המשני של ה-
כך השתמשנו בשיטה הפולרוגרפית.
ידיעת הקבועים הללו חשובה בגלל השפעת המתכות על יציבות המבנה המשני של
ה . DNA -עקב התקשרות עם היונים המתכתיים ,התכונות הפיזיקליות והכימיות
של ה-
DNAמשתנות ולכן יש ענין לידיעת קבועים אלה.
כאשד מוסיפים QNAלתמיסת המתכת
+ +
,
)Cd
+ +
( C uיורה־ זרם הדיפוזיה,
הירידה חלויה ברבוז! המלח האינרטי המוסף וביחס של DNAלמתכת.
בציור מם 23 .מובאות הפולרוגרמות )תלות של זרם
++
במתח ־ ( Vעבור רכוזי
i
-4
קבוע שלCd10*4.4
)
( בנוכתות ובהעדדד DNAהטבעית .האלקטרוליט היסודי
N
-2
•
של
מקטינה את זרם הדיפוזיה לגבי הגל של
++
C dעצמו .ההקטנה שווה בכל המתתים,
מה שמראה שהיא נובעת משינוי מקדם הדיפוזיה של יון מתכתי בגלל הקישור ולא
מםפיחה של
DNAעל פני האלקטרודוה ועקב :כך הקטנת מעבר היונים.
מציור זה אפשר גם לראות ,ששינוי ב־
בנוכחות
-פוטנציאל
DNAהוא קטן מאה־ בהשוואה :ל-
++
C dעצמו,
פולרוגרמות דומות לאלה שבציור מם 23 .התקבלו עבור
N
.
++
C uו־
++
C dהמגיבים
טבעית ולא ־טבעיתגודל הירידה היה חלוי ברכוז המלח ובמבנה המשני
של
ם•
++
מחצית הגל ש ל C d
4
2
0
ה-
ה
• DNA:הגלים שלמראה את
++
ג0או
++
C dבלי
^ץ(ברכוזן
++
DNAהיו שווים בכל רכוזי המלת.
4
C dקבוע ) (N "10•4.4כפונקציה; של רכוז,
DNAהטבעית המוסף ובתלות בדכוזי המלח.
It
־93־
ציור
מס.
:
2 4י ח ס
עם
המלח
זרמי
הדיפוזיה
DNAט ב ע י ת
ורבוז•
של ) Cd ~10»4.4
)(^-
++
ל ז ר ם של
DNA
ה-
־N N
1
+ +
C dלבד
5
0־ 1 0
0
2
"0
3
0־ A A A
' N
© •
•
10
N
3
3
0־ «A A A 5 1 0
MNOj "100 0
3
0 0
5-10N־ 0
2
'N N
כ פ ו נ ק צ י ה של
.
־N
3
N
4
( המגיב
רכוז
־
־94
:
++
2£
ע
ם
N Aל א טבעית ל
0
ירכו ז ה. DNA -
" N0
3
-
4
Cd
++
) Nה מ ג י ב )"10»4.4
C dבלבד כפונקציה של רבו ז המלח
.
N
A
" 0
10
0 0
2
" 10N N0״" • • • 5
3
" N0
3
2
10" N
3
" 10 N N0־«5
3
"NO,
3
10 N־
AAA
AAA
0 0 0
־95־
ו ר מם2 6 .
:
יחם
עם
המלח
זרמי
DNA
הדיפוזיה
טבעית
)— fiשל Cu"10*1.8
לזרם
של
ו ר כ ו ז היDNA -
0
)
++
+ +
C uבלבד
N
כ פ ו נ ק צ י ה של
.
0
0
א ־ 100
ג
־ N
3
• • • "0 N N "3.10
2
3
AA
A
"
0
2
1־ 0 NN
3
3
5.10
' AAA" N N0
3
N0
3
( המגיב
3
OOQ" 10" N
רבוד
96 -־
ציור מס 25 .נותן )—(i
o
האלה אפשר לראות ,שבעוהף גדול )עד היחס \> 1:1׳( של מתכת לגבי ה־
שהמגיב.עם
עבור
DNAלא טבעית .מן הציורים
1
)—(
הירידה ב-
היא חזקה מאד; כמו הן 3ר9ו-זי' המלח
0
חזקה יותר מאשר ברכוז המלחN"10
1
N
10
,שנם שפוע הקו של
DNA
הירידה היא
) rl—.כנגד רבוז •
V
ה DNA -קטן מאד.
ציור מס 26 .מראה :את היחס )— (iכפונקציה; של רכוזי DNAטבעית המוסף ברכוזי
+
המלח השונים עבור* ג N"10)0׳ ( 1 . 8המגיב עם
. DNA
אפשר לראות ,שצורת העקומוח בציור מס 26 .דומה לאלו אשר בציורים מם 24 .י . 2 5 -
בשימוש .בנוסחה ) (12חושבו קבועי שווי משקל של קישור Cdו-
++
ל-
++
Cu
DNAטבעית ולא טבעית.
2
)[(t)-£]-<H
P
בבל מקרה ה-
0
האמיתי חושב מערכי c fהמחקבלים לפי נוסחה ).(8
) ( 8
והתאמת ערכי ה־
בעודף של
Kוערכי ה-
(l-e)cf
=
K
0לפי נוסחאות ) (8ו־) .(12ה_K -ים חושב!
DNAלגבי המתכת .באופן נםיוני נמצא ש-
Kהוא פונקציה של דרגת
הכיסוי .תופעה זו נובעת מהשפעתם של יונים מתכתיים קשורים על הפוטנציאל
האלקטרוסטטי של
. DNA
היונים מתכתי י ם•תיובי ים הניקשרים מקטינים אח צפיפות המטען השלילי על פני
ה־ ,DNAעל ידי כך קטן הפוטנציאל האלקטרוסטםי שלה ,זה מוריד את מידת הקישור
ו־
Kיורד עם הגדלת
. 0
־ - 97
השפעת דרגת הכיסוי על קבועי הקישור דומה להשפעתו של המלח האינרטי המוסף.
ציורים מם• 27ו 28-מציגים את log Kכפונקציה של
) , l o g (1-0כאשד־ )(1-0
הוא השבר היחסי של אתרי הקישור החופשיים .מציורים אלה אפשר לראות יחם
לינארי בין
) l o g (1-0ובין
, l o g Kמאקמסרפולציה של הקווים הישרים קבלנו
log Kב -0 = 0 -דהו הקבוע הקישור האמיתי )באותו רכוז המלח( ללא השפעה
דרגת הכיסוי .בציורים 29ו 3 0 -ניתנים
)(67
Coates et a l .
כפונקציה של רכוז המלח.
log K
Qa
)C °
טוענים שמצאו שינויים בםפקטרה הנראה .של נחשת
כאשר חממו את המתכת ביחד עם ,DNAאבל לא מצאו זאת כאשר הוסיפו את המתכת אחרי
חדגסודציה של , DNA
בשיטה הפולרוגרםיח לא נמצא שום שינוי בK -
חמחכת במשך ' 5ב-
90°
ערכי הי
כאשר ה־ DNAחוממה ביחד עם
Kאשר התקבלו היו זהים ל-!( -ים של
+ +
Cu
שתגיב עם DNAאשר עברה דנטודציה לחוד,
בידענו את הקבועים אפשר להסביר את השינוי הקטן ב-
מלהסגי!זך> •לנוי
2
^ ^ * D e Ford and Humeתזוזה ב -״) E..פוטנציאל מחצית הגל(
2
יי• ••׳ י• •״
עקב חקומפלכםציח ניתנת על ידי ו
אם מציבים בנו&זוח ) (22אח הערכים עבור
לראות
ש
־
^ Eעקב קומ-
2ן & 1מ ש ח נ חב*-
c
mV30עבוד* ערכי
4
'׳v״ • 'י
ו-
K
ברכוזי המלח השונים ,אפשר
0קטנים ובתחום רכודי המלח
10־ , N^"10תזוזח זו חיא קטנה מאד ,בסדר גודל של שינוי בפוטנציאל המגע -
junction potential
את קבועי
הקישור^
סס
l i q u i dעקב הוספת ח , DNA -ולכן במקרה זה בשיטת
90 -
6.0
48
42
3.6
0
Q1־
02־
0.3־
0.4־ 0
)log (1-0
צ י ו ר מס.
27
0.1־
) Jog K ( 4 / n o l eכ פ ו נ ק צ י ה ש ל
רכוז
&
המלח
־
עבור
DNA
**Cd
טבעית
NOj" O O O
10N׳"2.0
&&& 0־ 1 0 N N׳ " 6 . 0
3
3
0־N
2
N־10
"10»2N
2
DNA
b
3
X X X״ NO
)l o g (1-Q
ה מ ג י ב עם
3
0.2־
-
1
0.3־־־
ו כ פ י נ ק צ י ה של
.
ON'A
ל א j^y-ao
1
0.4־
30
- 99 -
logK
6.25.8
5.4 5.04.6
4.2
3.8
a
0.1־ 0
1
ציור
b
1
-Q2
מם.
28
:
3.4
1
0.4־
1
0.3־
)(fc/mole
0
)log (1-6
log
K
1
0.2־
1
-0.1
)log(l-G
כ פ ו נ ק צ י ה של
ו ב פ ו נ ק צ י ה של
•*••י
רכו ז
המלח
a
DNA -
-AAA
Cu
עבור
טבעית
b
3
״NO1> ~10
3
"10׳N 0 ' -OOO
N
3
2
2
• • • N SO "'10
5״X
X
2
N "10«Af
ה מ ג י ב :עם
0N
3
־
DMA
.
DNA
לא
1
-0.3
טבעית
1
-0.4
3D
- 100
ציור
מס»
29
) log K (£/moleכ פ ו נ ק צ י ה של
ן
+ +
)(0-0
Cdה מ ג י ב עם
O O O
•
• •
AAA
DNA -
.
מבעית
DNAלא־ DNA
DNA
) log cר כ ו ז
טבעית
טבעית
בנוכחות
PVP
.
המלח(
עבור
101 -־
6־ CD
.cn
גאו
־r־־
י*
־ד
4
o
מ>
o
102 -־
בציורים 29ו־ 30בולטת החלות החזקה של log Kב-
יחם לינארי בין log Kו log c -עד רכוזי
)(0=0
g
.log cבכל המקרים נמצא
log K
מלח גבוהים .השפועים של
5
עבור
עם
Cuהמגיבים עם
Cdן-
DNAטבעית יותר גדולים מאשר השסועים המתאימים
DNAלא טבעית ,השפועים הנ״ל עבור
++
C dיותר גבוהים מן השפועים של
++
Cu
בכל מקרה־.
את התלות החזקה של קבוע הקישור בריכוזו המלח' אפשר ליתם להשפעת המלת על
הפוטנציאל האלקטרוסטטי של ה DNA -בגלל אפקט המסוך של המטען של ה DNA -על
ידי יוני המלח.
כמו כן ידוע שצפיפות המטען ב-
DNA
בצורתה הלא טבעית קטנה יוחר מאשר בDNA -
בצורתה הטבעית^־^^ ,כי כאשר אותו מטען יכול להשתרע על שטח גדול יותר,
הפוטנציאל האלקטרוםטטי קטן ותלותו ברכוזו המלח יורדת .עובדה זו מסב ירוד את
השפוע הקטן יותר במקרה של קישור המתכות ל-
במערכת נתשת
-
DNAעבדנו ב-
שחל? ,,ב ר •יש י 1*3י יצורה־ ,של
יותר במערכת 3חשת -
DNA
אחרי הדנטורציה.
++
11ק-ים נמוכים יותר מאשר במקרה של Cfiויתכן
DNAבגלל זאת ,זזה עשוי להסביר את השפועים הנמוכים
• DNA
בהנחה שמלח משפיע על קבוע הקישור בגלל השפעתו על הפוטנציאל האלקטרוסטטי של
ה-
3
2
3
DNAאפשר לבטא את תלות
•Ko + 0.434
K
בפוטנציאל בנוסחה הבאה :
£
2
Ko
-
קבוע הקישור ללא השפעת הפוטנציאל החשמלי
e
-
מטען האלקטרון
!J1־
(log
t
הפוטנציאל האלקטרוסטטי של
k
-
קבוע בולצמן
z
-
מספר המטענים של המתכת.
T
-
טמפרטורה.
־־ log K
DNA
־־ 103־
התלות של פוטנציאל האלקטרוסטטי סל פוליאלקטרוליט
ניתנת על ידי נוסחתם התיאורטית של
2
)(24
גלילי ברכוז ,המלח המוסף
Alexandrowi.cz and Katchalsky
2
) 1 - B ] / 2 X־ ( + log { [ ( X
t)/־(
)(114
log־ 0.434 J i
\ 7ra h // c
if
-מטען של הפוליאלקטרוליט־
h
-אורך של הפוליאלקטרוליט.
a
-רדיוס של הפוליאלקטרוליט
ג
-משתנה התלוי במידת הטעינה
D
-קבוע הדיאלקטרי
de
DhkT
X
3 -
=
X
והעוצמה היונית
ברכוזי המלח הנמוכים יותר מ N0.1 -האבר השני במשואה ( ) :24ניתן להזנחה
לגבי הראשון ואז!
0.434יורדי באופן לינארי עם
g
.log c
התנאי ליחס לינארי הוא שרדיום ואורך המולקולה אינם משתנים בכל רכוז המלח.
התלות הלינארית של log Kב -ש logמתאימה יפה לנוסחה זו .אם
5
log Kכנגדי
log cלפי נוסחה
) (24צריך להיות .2השפוע של
log K
s
(0=0
כנגד
z = 2השפוע של
++
g
log cבמקרה :של
++
Cd
המגיב :עם
(
DNAטבעית הוא . 1 . 7הערך הנמוך מן
התיאורטי של השפוע יכול לבא הן משגיאה הנסיונית והן מן העובדה :ש-
במקרה זה קטן יותר מ2-
בגלל המסוך החלקי של המטען החיובי של המתכת ע״י
המטענים השליליים של היונים הנגדיים .נוסחה
log Kב־
).log (1-0
z
אם מסתכלים על
) (24מסבירה גם את התלות של
) (1-0כפרופורציונ י ל־ ־d
אז הקטנה
104 -־
בd" -
) log (1-0והשפוע צריך להיות 02
תביא לירידה לינארית של log Kעם
DNAלא טבעית שינוי של a
במקרה של אינטראקציה עם
גורם לשיפועים קטנים יותר .בנוסף לידיעת תלותו של K
מעונינים לקבל
. Koידיעת
ו־
hעם רבוד המלח
ברכוזז המלח היינו
Koתאפשר ללמח־ משהו על אתרי הםפיתה האחרים
w-Kעבור קומפלכםים של היונים
על פני ^• .. DNAמהשוואת ערכם לערבי
המתכתיים עם ליגנדים שונים.
את 0Kאפשר לקבל או מידיעת
»|י כפונקציה ש.ל רכוז המלת ואזו לפי נוסתה
log Koניתן על ידי הפרש-.של log Kמינוס
מלח גבוהים איפה
()23
• 0.434או מקביעת log Kברכוזדי
^• = 0־ , £בגלל המסוך השלם על ידי היונים הנגדיים הקרובים
. log K = log Ko
מאד לפוליון ואזו
בספרות אין נתונים על שינוי הפוטנציאל האלקטרוסטטי של DNAעם רכוז־ המלח.
מנתוני
),(115
»(70) ,(70
נידוח אלקטרופורטית ברכו ז י.המלח השונ 09המובאים בספרות
) (117) »(116אפשר־ לחשב :את
£
-הפוטנציאל האלקטרופורטי ,אבל הנתונים
בספרות מצביעים על תלות שונה מאד ברכוזז המלח ,מה שמראה כי
באותה נקודה לגבי קישור המתכות .לפי נוסחה )(24
£
ו|» -י אינם זהים
אפשר ל ח ש ב את תלות </י ברכוזו
המלח ,אבל הערכים המתקבלים גבוהים מידי בהשוואה ל , log K -מה שמראה שהפוטנציאל
המחושב מנתונים תיאורטים איננו זהה :לפוטנציאל האלקטרוסטטי הקובע קישור של יונים
ל-
DNA
.
מציורים מס 29 .ו־־ 30אפשר לראות ,שברכוזי מלח גבוהים אין כבר לינאריות בין log K
שאר קבוע )בתחום ה ש ג י א ה ז ״ א כי >ןי ,אשרברכודי-מלת(,
כאלה יורד כמעט לאפם',איננו משפיע יותר על הקישור בין המתכת ל-
ושב מירידת
d
i
מאד גם הדיוק ב. 0K -
K
הוא
, DNAואזזי
. 0בתנאים אלה הירידה בזרם הפולרוגרפי בגלל קישור
•
התוצאות מםוכמוח בטבלה
מם•4
K
־ - 1:05
טבלה
++
ערכים של K0עבור־
Cd
ו-
)יחידות
DNA
מס4».
++
C uהמגיבים עם
&/mole
DNA
(
טבעית
DNAלא טבעית
60 - 100
100 - 300
++
Cd
800 - 2000
1000 - 1500
++
Cu
, Koאבל יחד עם זה אפשר
מתוצאוח אלה אפשר לקבל רק סדר גודל של
++
++
,++
,Koמה שמתאים לנטיה גדולה יותר של Cuליצור קומפ-
> Ko
לראות שי•
u
Cהמגיב .עם
טבעית ולא טבעית כמעט
: .י' יי .ו
.־ יי •V<' • .
יי יי יי יי'
S
י
ז
ה
י
A
ם
N
D
.
״
"י
1הם*בהז היא ,:שב-
) pH = 5.2בו עבנדינד( וה-
DNA
ה״טבעית" הנה כבר בחלקה לא
טבעית ולכן הערכים כה קרובים.
ןזו/ין
Eichhorn et a l .
עם
++
מצאו שינויים בספקטרום
UVשל
DNA
Cuולא מצאו שינוים בספקטרום של DNAטבעית המגיבה עם
לא טבעית המגיבה
++
Cu״
מהתוצאות שלנו אפשר להסיק ,שעיקר הקישור מושפע מפוטנציאל האלקטרוסטטי אשר
על פני ה-
. DNAקבועי הקישור־ כאשר
לקבועי הקישור של יונים אלה ל-
^=0י הם קטנים יחסית ודומים בערכם
^ . NHיחד עם זה לא יכולים להסיק ,שבתנאים
אלה הקישור הוא רק לבסיסים ולא לזרחנים.
הקבועים המובאים בעבודה זו חושבו עבור עודף גדול של פולימר לגבי המתנת־
^^Eichhorn et a l .
מול של
מצאו כי בעודף גדול של פולימר לגבי המתכת ) 0.4ופחות
Cuלגבי מול נוקלאוטיד( יש ל-
Cuהשפעוד מיצבת :על
DNAהמתבטאת
בהעלאה++קטנה של . Tmתופעה זו מוסברת על ידי קישור לזרחנים בלבד .רק כאשר
Cu
> 0.4
Kאשר חושבו
מתחילה תופעה הפוכה של ירידת היציבות .רב :ערכי
DNA
בעבודה זו מתאימים לתחום הראשון.
-
(7
- 106
קביעת הקישור־ DNA-PVPבפולרוגרפיה,
על מנת לקבל את ערכם של קבועי שווי המשקל באיזור המכוסה
14
PVPהמסומן בC -
בוצעה סידרת הנםיונות עם
/
0
0
:
N
P
a
בעל דרגות קווטרניזציה
,
K
<dOf
״
-4
האינטראקטים הובנו ברבוזים גבוהים של המרכיבים * ^ m e q / c c 106׳
+
או
4
++
ובנוכתות ) Cd "10»4.4
N
N
(
0P
.ברכוזים כל כך גבוהים שקע חלק
ביחס מסוים ,אשר אפשר היה לקבעו ממדידות הפעילות הרדיואקטיבית והבליעה
האופטית בנוזל העליון ,כמו כן נקבע ה־
++
ניתנים בטבלה מס .(5 .נמצא ,כי בעודף של
קישור
++
C dבשיטה הפולרוגרפיח )הערכים
+
, Nהן בתמיסה והן במשקע אין
+
C dבכלל ,כנראה בגלל הדחיה האלקטרוםטטית .כאשר היה בתמיסה עודף
הנחנו שרבוז ה-
את רכוז ה-
DNAה-
++
++
C dההתחלתי מינוס רכוז הי־
++
N
C dהנמצא בנוזל העליון נותן
C dהקשור במשקע .במקרים אחרים כאשר מצאנו בנוזל העליון עודף
iהנמדד היה גם פונקציה של קישור לאותו רכוז ה-
. DNAלפי הi -
++
המה־זד וקבועי הקפילרה הידועים חושבו היתםים -ן^-ץ עבוד רכוזי ה-
.
°
השונים .מידיעת רכוז ה DNA -הנותר בתמיסה היה; אפשר לחשב :את היחס
Cd
DNA
— —
Cd
++
i
DNA
־
++
i
— ד כנגד
o
u
המתאים ליחס
1
Cd
2
אותו
/
.
^
DNAץ
— — )עקומות כיול אלה־ התקבלו מנםיונות קודמים .(,קבלנו אח רכוזז
Cd
2
ה Cd -הנשאר בתמיסה ועל ידי חיסור מרכוז ההתחלתי את רכוז ה־
ניקשר למשקע .קישור ה-
++
cdאשר
C dלמשקע יבוטא על ידי קבוע שווי משקל
a
, Kאשר
במשמעותו דנו בפרק הנסיוני .ידוע מנסיונות ההתוך ,שבמקרה :של אינטראקטים
שהתקבלו מ־ PVPבעל דרגת קווטרניזציה גבוהה 00%)vl׳( החלקים של
ב-
PVP
אינם נוטרלים ,אלא נושאים מטען חיובי )עודף
במשקעים של אינטראקטים אשר הוכנו מ-
+
DNAהמכוסים
( N־
PVPבעל דרגת קווטרניזציה ,80$אין קישור
־ - 107
של
++
, Cd
ממדידות
באם יוצאים
מעודף
כ י י ש ע ו ד ף מטען
הבליעה והפעילוח
0P
חיובי.
ה מ ס ק נ ה ה י א שבמקרה־ זה:
הרדיואקטיבית נמצא
בתמיסת ה א ם ( וישנו
Cd
קישור
במשקעים א ל ה ישנם איזורים הנושאים ע ו ד ף
מטען
שלילי ,אשר אליהם נ י ק ש ר ה-
י
על
++
י
ד
) _!(
K
A
PVP
•
מ
ה מ ל ח)N10
3
,אשר ערכו
.
Nואיזורים בלתי
הקישור
קבוע
מכוסים בעלי
לאיזורים אלה ינתן
K
ש ו ו ה א ו קטן מ -
המתקבל בהעדרו
באותו
A
בגלל
השפעת המטען
חושב לפי ח ו ק
על ידי
להיות
טבלה
P0
מ ס . ( 5
) _
(
^
צריך
. Cd
־
שבמשקעים א ל ה י ש ע ו ד ף
)
+
=0
אבל
החיובי
הפשוט
המסות
באיזורים
בהנחה ש-
הסמוכים ע ל
] [P0
מידת
במשקע
רכוז
הקישור.
Cd
הקושר
ניתן
:
] ]- N1.2
+
]P־[0
)כללי
]־[0P
=
במשקע(
או
] ]- N1.1
+
]P־[0
)כללי
שיחם
ז״א הונח
0P
הקישור ש ל
+
ו-
=
במשקע(
1
Nהוא
4
; 1.2א ו
ו
0 1.181ה -
=Kים
3
l/mole10-10
באופן זה הם
]־[0P
מה
המצופה
שמתאים לערכם
מבחינה
הת יאורטית.
במקרה ש ל אינטראקטים עם
שאיזורים ש ל
1:0.8
המטען
DNA
.
ה מ כ ו ס י ם ב-
באינטראקסים עם
השלילי
הפירידיניות.
המכוסה ב-
PVPב ע ל ד ר ג ת
PVP
PVP
באינטראקטים א ל ה
ה ו ד ו ת למטען
« PVP
ב מ ק ר ה זהז
ק ו ו ט ר נ י ז צ י ה 50$
נ ו ש א י ם מטען
ב ע ל דרגת
והיחס
ק ו ו ט ר נ י ז צ י ה 50$
ל
הנחנו
ליאון
השלילי ,א י נ ט ר א ק ט י ם א ל ה יקשרו
גם
/
Q
ליחס זה
K
והוא
הודות
ש
P:N
הנוסף של
0
דומה
שלילי
הסקנו
מ נ ם י ו נ ו ת התוך
+
מבטא את
הקישור
Cd
לאיזור
הוא
שצפיפות
הקבוצות
באיזור
המגולה וגם
- 108 -
תגובת חילוף )תגובות הניתנות על ידי משואות ) (15ו ־ ) . ( 1 6יתכן שכמקרה זה
+
ישנם גם איזורים חופשיים מ-
ב
ק יע
!
Nאשר עבורם מתקיים שווי משקל הניתן על ידי
) _ . ( 1הקבוע המדוד יכלל בתוכו גם קישור לאיזורים החופשיים אלה־
K
A
K
)הערך הממצע המתקבל .מחישוב בדרגח הקווטרניזציה
נניח^mole =Q_ /£10*8
a
+
אם נניח באיזור המכוסה יחס של
-
1 : 0 . 8
האמיתי .נמצא באופן ב:זזד ,כי
q
3
10
הוא
-
10
K
נוכל לחשב את
P:N
עבור אינטראקטים עם
PVP
בעל דרגת
2
. H / m o l eבגלל הקשיים הנםיוניים העצומים דיו
ס
ב
הנםויים האלה הוא קטן מאד־ ולכן אפשר לק ל י?
ד
ר
ג י ד
ל
ש
^
K
a
י
~
התוצאות מסוכמות בטבלוד ,מס• • 5
טבלה מס5 .
—
היחסים של
,,+״
י
,
ושל
N
,
++
:
_ Cd
—r:P Pבמשקע
עבור האינטראקמים השונים
+
P:N
דרגת קווטרניזציה
של
PVP
80%
II
II
II
II
II
II
II
II
30%
II
II
II
הערה :
A
K
התחלתי בזזמיסה
1:1.7
1:1
1:1
1.4:1
1.4:1
1.95:1
1.95:1
1.95:1
1.95:1
1.36:1
1.36:1
2.1:1
2.1:1
*Pמסמן את ה-
+
P:N
2
במשקע
במשקע
1:1.5
1,04:1
1.1:1
1.14:1
1.17:1
1.13:1
1.15:1
1.7:1
1.5:1
1.12:1
1.73:1
2.1:1
2.1:1
Pהעודף במשקע
־
-
1.1:1
1:1.25
1:1.26
1.5:1
1:1.69
2.2:1
3.1:1
2.1:1
1.55:1
1.82:1
1.88:1
)] [N־ ] ל ל - ([P
כ
י
)(l-a
K
־ - 1109
PVPבעל דרגת קווטרניזציה 30$יחס
באינטראקסים אשר הובנו מ-
P:Nיותר
גבוה ,אבל למעשה היחס האמיתי יכול להיות יותר קרוב ל) 1:1 -יותר
הודות ליאון הנוסף של ה PVP -בpH -
הנפיר ) ( 5 « 8אשר בו בוצעו הנםיונות״
בשיטה הפולרוגרפית לא ניתן להפריד־ את המשתנים לקבלת
ולכן אי אפשר לקבל את קבוע שווי המשקל של קישור
על מנת ללמד את השפעת ה-
+
(N
?
PVP
+
Kו
2
«
" - Nל ,0Pז״א את
על קישור של קדמיום ל DNA -ואת
++
השפעת חלקי ה-
PVP
ברכוזי
DNAהמכוסים ב-
שונים וב0 -
דרגת קווטרניזציה של
PVP
על אלה הגלויים נמדדו הזרמים של
קבוע ,וכן ברכוז
PVP
קבוע ובערכי
0
Cd
שונים־
PVPהיתה .80$בשמוש ב PVP -בעל דרגת קווטרניזציה 80$
ניתן להניח ש K = 0 -והמדידות הפולרוגרפיות מתיחםות ישירות לקבוע שווי
) _ . ( 1לכן אפשר לחשב Kלפי נוסחה ) (12בהצבת
המשקל באיזור המגולה ז״א
־>U0־
.
cכאשר ) J
cבמקומו י
י ־
09cN״ * (c -י c
של
־0
ו -י
— =
0לפי
י
P
p
ם
יc
P+
+ P
•
P
. P:N - 1:1.1נמצא ,שכאשרP:N=8:1
בהנחה ,שיחם הקישור באיזור המכוסה הוא
q
K
0
הערכים של
+
T
b
r
PVPעל הקישור והקבועים זהים לאלה המתקבלים בלי ה-
אין השפעה ל-
בנסידנוח אחרים היחס
יותר קטנים של
+
P:N
PVPולכן
הוקטן ל־ ) 4 * 6 : 1אי אפשר היה לעבד ביחסים עוד
+
, P:Nכי ברכדזים הדרושים לנםיונות הפולרוגרפים ביחסים
יותר קרובים ל— 1!1שקע החומר(.
לכן ביחס זה)^ (4*6:1 - ?:בוצעו הנסיונות ב-0-ים
שונים־ רכוז ה־־
DNA
-4
והזרמים נמדדו .בוכוזי המלח השונים .ברכוז
בנםיונוח אלה היה־meq/cc10*4.4
•
יי י
- 3י
תלותו של log Kב log (1-0)-בנוכחוח PVPקטנה הרבה יותר מאשר
N
10
בלעדיו .ברכוזי המלח .גבוהים יותר העקומות לשני המקרים מזדהות־ בציור מס־ 29
• י
מלח של
++
C dבלבד המגיב עם
log Kכפונקציה של log cעבור
נתונות עקומות של
)(0=0
Cdהמגיב עם DNAטבעית בנוכחות . PVP
טבעית ועבור
DNA
+ +
אפשר לראות ש-
log Kבנוכחות
)(0=0
PVP
ברכוזי מלח נמוכים
) 1 0
_3
( Nנמוכים מן
- 110 -
של
הערכים
עבור־
log K
ה מ ג י ב עם
Cd
בנוכתות
DNA
עם
. PVP
הגדלת
רכוז
)(0=0
שתי
המלח
מזדהות.
העקומות
את ה ע ר כ י ם ה נ מ ו כ י ם י ו ת ר של ^ ^ ^ l o g Kה מ ל ח ה נ מ ו כ י ם אפשר ל ה ס ב י ר ע ל ידי
שברכוזי
ההנחה
השלילי
עליה
ועקב
להקטנת
if
במשואה
ידי
כך
התקבלו
גם
כך
קטן
)(24־
המקרים
הנסיונוח
החיובי.
ה ג ל ו י י ם עקב
מזדהות.
DNA
הקטנת
ה ה ת ו ך של
באיזורים
ברכוזי
הפוטנציאל
ה ה ת ק ש ר ו ת עם
מנםיונות
החלקים
ל-
קטנה
הנמוכים
הגלויים.
בשני
המטען
המלח
מלח
הסיבה
השפעתם
ה-
הקטנת
לכך
היא,
כה
חזקה
האלקםרוםטטי
הפוטנציאל
יוני
המתכות־
DNA
בנוכחות
מצביעים
גבוהים
PVP
המתקשר עם
על
כך,
הפוטנציאל
)מעל
10
שברכוזי
מלח
שהיא
מבטלת
של
מורגשת
תוצאות
PVP
באיזורים
ה-
המכוסים
(
.
PVP
ב-
לאורך
אחרים
היונים
על
אקוולנטי
המגולים
ועל
ה נ ת ו נ י ם אשר
גרם
להעלאת
PVPמ ש פ י ע י ם
המולקולה
ה ע ק ו מ ו ת עם
ג ב ו ה י ם כאשר
הדבר
מ ז ד ה ו ת עם
הםפוח־
האלקטרוםטטי
אפקטים
DNA
גם
אלה
שהחלקים
N
מ ק ט י ן את
DNA
צפיפות
המטען
PVP
הנגדיים
הפוטנציאל.
Tm
ע ל ו,
ב ג ל ל הכ2םת
ובלעדיו
קרובים
מאד
־
ד י ו ן
כ ל ל י
במחקר
(1
מהו
(2
מה הם
(3
מהי
על
ידי
סוג
משקל
מולקולרי
)בעל
1800
מטענים
-
שווי
ה-
לשקוע.
תמש
ה-
שינינו
החנקנים
PVP.ע ל
את
שלו
האינטראקציה.
צפיפות
כן
וכמו
ה מ ט ע ן של PVP
קופולי-
הכנו
שלילי.
שיירים
מטען
הנושאים
ויותר
ממספר
השיירים
1800׳י( אשר
בדרגת
הקווטרניזציה
שלילי
ב-
החיוביים
מלאה
על
PVP
נושא
ש ק ו ב ע ת את
הכוחות
הפועלים
-המשקל
לבין
ע ל סמך
ש ה מ ם י ם ו ת של
של
ה-
PVP
הטעונים
מושפע על
מקיימות
ה ש ו נ י ם התאמת
בתמיסה
השונים.
יוצא
) PVPב ה ת א ם
לדרגת
הקווטרני-
DNA
קיימת
התפלגות
שבעורף
מ ו ל ק ו ל ו ת ה DNA-ו כ ת ו צ א ה
בדרגות
DNA
המרכיבים
השקוע
גבי
מ ל א של
. DNA
ניטרול
-המשקל
מצאנו
תמש
מ ו ל ק ו ל ו ת של
שוות
שוויי
הקווטרניזציה
כאשר
ויש
האינטראקציה.
לפחוח ^10
לתמישים
ניטרול
PVPע ל
האינטראקטים
האור(
בין
לקבל
הקווטרניזציה
של
הוא
של
לאינטראקטים
אלה,
ל מ ו ל ק ו ל ה אתת.
מנת
ר ח ב ה של
המרכיבים
הראשונה
הכללי
פי
הפולימריזציה
ד ר ו ש ו ת רק
מולקולות
בשעורים
המתרכבים
ה א ו ר ג נ י של
שונים,
גבוה
דרגת
על
על השאלה
- VP
כל
בין
לענות
ומספר
ויתס
והשייר
, MAאשר
מולקולה,
קיומם
החשמלי
זה
על כמה
שאלות.
ב מ ב נ ה של DNAעקב
מטענם
ל-
די
החלים
קווטרניזציה
DNA
זזציה(
נסינו
המטען
מנת
לענות
באינטראקטים
השינויים
השפעת
של
לפיכך
זה
הקשרים
על
מרים
111
מכך
ביניהן
על
ידי
הבליעה
האינטראקטים
משקל
התלוי
בדרגת
שווי
באינטראקציה.
התוצאות
ה ה ר כ ב :של המשקע אשר
מדידות
גם
התפלגהת
במידת
הניטרול
נקבע
האופטית
י ו ר ד ת עם
הנםיוניות.
מדת
)אשר
על
ידי
נתנו
הנטרול
ללא
צריך
להבדי
מ ס י ם ו ת ם של
ג ם את
הבדל
מדת
פיזו
בדרגת
.
בתמיסה
ידי
מתקרבים
ליחס
ה א י נ ט ר א ק צ י ה אך
של א ח ד
מהווה
לאחד־ ה א י נ ט ר א ק ט י ם
תופעה
השונה
ממנה,
מתתילים
ונקבע
־ - 112
על ידי כוחות האגרגציה הפועלים בין האינטראקטים .השקוע מתמימות המהולות קורה
ברכוזזי מלת נמוכים כאשר צפיפות המטען הכללי על פני תוצר האינטראקציה הנה
נמוכה .כאשר מגדילים את רכוז המלח תחום השקוע גדל .לדוגמא באינטראקטים עם PVP
בעל דרגת קווטרניזציה 50$מתקבל שקוע אפילו כאשר צפיפות המטען העודף )חיובי
או השלילי( שעל האינטראקטים בתמיסה הנו כמחצית הצפיפות של המרכיבים.
עקב
הגדלת רכוז המלת גדלים כוחות ההידרופוביים הפועלים בין התלקיקים המקטינים את
מםיסותם .אך אין ספק שההשפעה הגדולה של המלה המוסף הננה על השכבה התשמלית
הכפולה אשר על פני התלקיקים .הגדלת רכוז המלח גורמת למסוך המטענים של החלקי-
קים ,כוחות הדחיה החשמליים בין התלקיקים קטנים וכל זה מקל על אגרגציה ושקוע.
על מנת לקבל נתונים נוספים על יחסי ההתקשרות ועל שוויי המשקל המתקיימים בתמיסה
ובמשקע הופעלו כוחות צנסריפוגלים תזקים על תמיסות האינטראקטים )ובעודף אחד
המרכיבים( אשר בתנאים רגילים אינן מראות נטיה להפרדת הפזות .הפעלת כוחוח גדולים
גורמת לשקוע של חלק מהחומר המומס .נמצא שיחם המרכיבים השוקעים הוא קרוב
ל1— 1s
9
למרות שבתמיםה היה יחם המרכיבים שונה לגמרי.
כאמור קיים בתמיסה שווי משקל בין אינטראקסים בעלי הרכב שונה .רכוזו של התוצר
ביחס 1:1הוא קטן מאד בעודף אחד המרכיבים ,ורק על ידי הפעלת כוחות חזקים אפשר
להוציאו מן המערכת תוך הזזת שווי המשקל.
בעודף גדול מאד ,של אחד המרכיבים אפילו הכוחות החזקים אינם מספיקים לשקוע ,בגלל
רכוז שווי המשקל הקטן מדי של התוצרים המנוטרלים הנוטים לשקוע.
על הםטיכיומטריה בתמיסה למדנו מעקומות ההתוך .היא תלויה בדרגת הקווטרניזציה של
PVPובאפשרות הסידור הגיאומטרי של מולקולות ה PVP -על פני מולקולת ה DNA -־
בדרך כלל תוצרי האינטראקציה נושאים מטען חשמלי.
בוהים
)
7
-
2
CsCl
( m o l a l
אין כלל אינטראקציה בתמיסה ,כפי שנמצא
מצנטריפוגציה בגראדינט של צםיום כלוריד.
- 113 -
בתמיסה האינטראקציה נקבעת הן על ידי כוחות אלקטרוסטסים .והן על ידי
כוחות הידרופוביים.ברכוזי מלח גבוהים הזיקה של הפולימרים ליוני המלח
חזקה יותר מאשר הזיקה בינם לבין עצמם והכוחות ההידרופוביים אינם מספיקים
על מנת ליצב את האינטראקט ולכן הוא מתפרק .עם הקטנת רכוז המלח גדלה
ההסתברות של האינטראקציה אלקטרוםטטית בין מולקולות הפולימר ואד גם
מורגשת השפעתם של כוחות הידרופוביים על האינטראקציה.
דדגת הקווטרניזציה שהנה שות ערך להגדלת רכוז השיירים הבלתי טעונים
הקטנת
גורמת לחזוק הכוחות ההידדופוביים ולשינויים גדולים יותר במולקולת ה.DNA -
בעודף גדול של
לות
FVPמקבלים כנראה התפלגות שונה של מולקולות
. DNAמולקולת FVPהרבות המסתפתות על פני ה-
PVPעל מולקו
DNAגורמות לקריעתה.
דגרדציה זו מתבטאת הן בתוצאות הצמיגות והסדימנטציה והן בתוצאות המיקרו-
סקופיה האלקטרונית.
שאלה נוספת אשר הצגנו לפנינו היתה מה הם השינויים בנקונפורמציה
של מולקולת DNAעקב האינטראקציה ומהו מבנה האינטראקטים .בתמונות המיקרוסקופ
האלקטרוני ראינו שבמקרה של אינטראקטים בעודף של , DNAהחוטים של
DNAמתקפלים
ועל פני החוטים מופיעות פקעות .מידת הקיפול ותדירות הופעת הפקעות גדלה עם
הקטנת דרגת קווטרניזציה של
, FVPאבל קיפול זה אינו כרוך בדדנטורציה ולא
בשום שינוי ברמות האנרגטיות של האלקטרונים ,בי למרות האינטראקציה לא חל
שינוי בתהום הבליעה האופטית או בעוצמתה )מעל השינוי הנגרם על ידי פיזור
האור( .לא ארעה דנטורציה ,כי תוצרי האינטראקציה עברו התוך בחמום .הקיפולים
הם פשוט חלקים של מולקולת ה־
DNAבעלת שחי שרשרות אשר התקפלו עקב האינט
ראקציה.
שינויי קונפורמציה אלה מוצאים את ביטויים בתכונות ההידרודינמיות של תמיסות
. DNAעם הוספת PVPלעודף של DNAהצמיגות הסגולית יורדת ומקדם הסדימנטציה
114 -־
עולה .תופעות אלו נובעות לא רק משינויים בקונפורמציה מולקולת ה DNA -אלא
גם על ידי ניטרול מטענה על ידי המטען החיוגי של ה־ PVPבמםתפח.
בעודף של PVP
ש-
מצאנו בעזרת מיקרוםקופיה האלקטרונית ומחכונות הידרודינמיות:
PVPגורם לדגרדציה ע״י קריעה .זה יתכן כאשר מולקולות n־PVP
נידחות אחת משניה
המםופתות
בגלל הדחיה האלקטרוםטטית .דחיה זו גורמת לקריעת מולקו
לות ה DNA-לשברים המתעטפים במעסה של מולקולות ה . PVP -שברים אלה נראים
במיקרוסקופ האלקטרוני .מדידות הםדימנטציה מצביעות על משקלם המדלקולרי הנמוך
של פרגמנטים אלה .גודלם ותדירות הופעתם תלויים בדרגת הקווטרניזציה של FVP
ובזמן ההשהיה של דוגמאות
^ DNA-לפני הערבוב.
יש לצפות' מראש ,כי המטען החשמלי של FVPיגרם ליצוב ההליכם הכפול של
DNA
עקב הקטנת האינטראקציות האלקטרוםטטיות בה .מצד שני השייר האורגני עלול
לגרם להורדת היציבות אם תגובתו עם הבסיסים תעודד פתיחת ההליכס.
מהתוצאות הנסיוניות התברר ,כי אמנם יש למטען של PVPהשפעה גדולה על יצוב
ההליכם .השפעתו אף משתרעת על פני קטעי ה-
זה מופיע גם בעקומות ההיתוך כאשר ה-
DNAשאינם מכוסים על ידו .אפקט
PVPהםפוח על פני ה־ DNAמעלה את סמפר
טורת ההיתוך גם באיזורים הלא מכוסים.
השפעה זו על האיזורים הלא מכוסים נגרמת ע״י שנוי הפוטנציאל החשמלי שם וע״י
קשור זוגות הבסיסים בקצוות איזורים הללו .האפקט הראשון מקטין גם את קישור
ה
++
־־ 0>1באותם האיזורים.
מובן שהשפעת הFVP -
של החלקים המכוסים
הספות הנה מכסימלית באיזורים המכוסים וטמפרטורת ההיתוך
Tnu,גדולה מ . Tm^ -בקטעים המכוסים גוברת השפעתם של
כוחות קצרי הטוח ולכן השיירים האורגנים משחקים כאן תפקיד חשוב .בדרך כלל הם
אינם עוזרים ליציבות ה־ , DNAאבל במקרה של PVTבעל 7$קווטרניזציה מתקבל
הרושם שהשיירים האורגנים אף מיצבים את המבנה הטבעי של
^DNA-
־
־ 115־
משחק הכותות כאן מורכב ,מאחר שהשפעה תיובית או שלילית! על היצוב נבלמת
ע״י גורמים סטריים של השיירים המגיבים; בגלל שקולים אלו ,למשל ,היציבות
0
9
5
( הנה קטנה מיציבות
)
+ PVP
.(S1005DNA
היות ו PVP-הוא פולימר והמרתקים המולקולרים דומים מאד למרתקים אשר במול
קולה ה DNA -ממאפשר סידור מרתבי תוך קבלת מבנה תלת מימדי.
- 116 -
ת ק ציי ר׳
העבודה כוללת שני חלקים הקשורים ביניהם ע״י ענין משותף בתכונות
הכימיות של
) DNAבתמיסה(.
א .אינטראקציה בין DNAלבין
)polyvinylpyridine־. (4
PVP
ב .קישור יונים מתכתיים ל־ • DNA
א .האינטראקציה בין
ובין
DNA
ו
)שכודדה מטימוס של עגל( לבין
PVP-4
DNAלבין קופולימר של וינילפירידין -תומצה מתאקרילית נחקרה בשיטות
פיזיקליות וכימיות אחדות .קווטרניזציה בדרגות שונות העניקה לפולימריס
צפיפויות מטען שונות ,מה שמשפיע בהרבה על האינטראקציות הנדונות.
עליה בבליעה האופטית של התמימות ליותה את האינטראקציה.עם . PVP
עליה זו נובעת בעקר מפזור האור ע״י התוצר הפולימרי ,והנה מכסימלית ביתם
המרכיבים שבו
1
—
P
= — ,ותלויה ביחס זה ,בדרגת הקווטרניזציה.
N
+
טמפרטורת ההתוך
) (Tmשל האינטראקטים שונה מTm -
של
, DNAוהאפקט
כאן תלוי שוב ביחס המרכיבים ובצפיפות המטען .בדרגות קווטרניזציה גבוהות
נמצאו שני מעברי התוך :הנמוך מהם יוחס לDNA -
חופשית והגבוה יותר יוחס
לאינטראקט .בקווסרניזציה של 7$נמצא רק מעבר ראשון.
חשבנו את הסטיכיומטריה של הקישור ממדידת האפקט ההיפרכרומי במעבר
הראשון ומצאנו כי בדרגות קווטרניזציה נמוכות ,נושא האינטראקט מטען שלילי
כאשר בכיסוי שלם .מכך הסקנו ,שהשיירים הפירידינים הן טעונים והן בלתי טעונים
הם שמונעים את זהתךך ה-
. DNAהשפעת
השיירים הבלתי טעונים במניעה זו עולה
ככל שדרגת הקווטרניזציה קטנה יותר.
הידרוליזה אנזימטית ע"י
deoxyribonuclease
)אשר איננו פוגע
במקומות המכוסים( הופרעה ע״י השיירים הטעונים של ה. PVP-4-
שינויים בצורת המולקולה של ה-
DNA
בגלל האינטראקציה נחקרו בעזרת
- 117 -
המיקרוסקופ האלקטרוני .שכיחות השינויים נמצאת ביחס הפוך לדרגת הקווטרני-
זציה.
ו
התכונות ההידרודינמיות גם כן משתנות בגלל האינטראקציה .נמדדו
מקדם הםדימנטציה והצמיגות הסגולית , .באינטראקטימ שהוכנו בעודף של
DNA
עולה הראשון ויורדת השניה.
דגרדציה של DNAנמצאה בעזרת שלשת השיטות האחרונות כאשר היה
עודף PVPבתמיסה.
ב .קישור יונים מתכתיים ל-
++
++
קבועי הקישור של יוני
Cuך^Cd-DNA-
. DNA
נמדדו בשיטה פולרוגרפית .עוצמת
הקישור תלויה בחזק היוני ,במבנה המשני של ה , DNA -ב-
pHובדרגת הכיסוי.
ערכי קקועי הקישור יורדים כאשר קטן הפוטנציאל האלקטרוםטטי של DNAוכאשר
קטן מספר אתרי הקישור החופשיים.
הורדה תזקה של קבועי הקישור של המתכות נגרמה.ע״י נובתות PVP-4ברכוזי מלת
נמוכים -בגלל השינוי בפוטנציאל האלקטרוםטטי.
תופעות אלו משלימות את התמונה שהתקבלה בחלק הראשון של העבודה.
התוצאות תורמות להבנה מלאה יותר של האינטראקציה בין פולי-חומצות בעלות
חשיבות ביולוגית ופוליבםיסים.
- 118 -
ס פ דו ת
1.
F ״Miescher, Hoppe-Seyler's Med. Chem. Unters., p.441 (1871).
2.
R.F. Steiner, R.F. Beers, Polynucleotides, Elsevier, Amsterdam,
London, New York 1961, p.2.
3.
P. Levene and H. Simms, J. Biol. Chem. 65^, 519 (1925); 70_ 327 (1926).
t
4. J . Watson and F. Crick, Nature 171, 737 (1953).
5.
M.H.F. Wilkins, A.R. Stokes and H.R. Wilson, Nature 171, 738 (1953).
6. C, Schildkraut and S. Lifson, Biopolymers
7.
195 (1965).
D.O. Jordan in "The Nucleic Acids", Ed. E. Chargaff and J.N. Davidson,
Academic Press, New York, 1955, Vol. I, p.480.
8. Th.T, Herskovits, Archiv. Biochem. Biophys. £7, 474 (1962).
9. K. Hamaguchi and E.P. Geiduschek, J. Am. Chem. Soc. 84, 1329 (1962).
10.
J.P. Greenstein and M.L. Hoyer, J. Biol. Chem. 182, 457 (1950).
11.
E. Goldwasser and F.W. Putnam, J. Phys. & Colloid Chem. 5£, 79 (1950).
12.
E.P. Geiduschek and P. Doty, Biochem, Biophys. Acta
13.
G. Zubay and P. Doty, Biochem. Biophys. Acta 23, 213 (1957).
14
P. Alexander, Biochem. Biophys. Acta 10, 595 (1953),
15.
R.F. Steiner, Archiv. Biochem, Biophys. 46^, 291 (1953).
4
״16
609 (1952).
Ch ״F, Crompton, R, Lipshitz and E, Chargaff, J. Biol. Chem. 211,
125 (1954).
17.
P. Spitnik, R .Lipschitz and E. Chargaff, J. Biol. Chem. 215,
765 (1955).
18,
M. Feughelman, R, Langridge, W.E. Seeds, A.R. Stokes, H.R. Wilson,
C.W. Hooper, M.H.F. Wilkins, R.K. Barclay and L.D. Hamilton,
Nature 175, 834 (1955).
19.
F, Sokol, J. Polymer Sci. 30, 581 (1958).
20,
Ru Chih C. Huang, J. Bonner and K. Murray, J. Mol. Biol. 8, 54 (1964)
-
21,
119 ־
E.O, A k i n r i m i s i , J . Bonner and P.O.P. Ts'o, J . Mol. B i o l . 11_, 128
(1965).
22,
M, Tsuboi, K. Matsuo and P.O.P. Ts'o, J . Mol. B i o l . 1^, 256 C1966),
23,
L.S. Lerman','J. Mol. B i o l . 3, 18 (1961).
24,
D.F. Bradley and M.K. Wolf, PNAS 45, 944 (1959).
25,
A.R. Peacocke and J.N.H. S k e r r e t t , Trans. Farad. Soc. 5£, 261 (1955).
26,
D.F, Bradley and G. F e l s e n f e l d , Nature 184, 1920 (1959).
27,
R,K, Tubbs, W.E, Ditmars and Q. van Winkle, J . Mol. B i o l . 9^, 545 (1964).
28,
V. Kleinwac^iter and J . Koudelka, Biochem. Biophys, Acta-Sa, 539 (1964).
29,
R.E. Boyle, S.S, Nelson, F.R. D o l l i s h and M.J. Olsen, Archiv. Biochem.
Biophys. 96^, 47 (1962).
30,
D.M, N e v i l l e , J r . and D.R. Davies, J . Mol. B i o l . 17, 57 (1966).
31,
D.S. Drummond, V.F.W. Simpson-Gildemeister and A.R. Peacocke,
Biopolymers
135 (1965).
32,
E. Boyland and B. Green, Biochem. J . 84, 54P (1962).
33,
P.O.P. Ts'o and P. Lu, PNAS 51_, 17 (1964).
34,
A,M, L i q u o r i , B, DeLerma, F, A s c o l i , C, Botrd and M, T r a n s i a t t i ,
J , Mol. B i o l ,
35,
521 (1962).
Chikayoshi Nagata, Masahiko Kodama, Yusaku Tagashira and A k i r a
Imamura, Biopolymers 4, 409 (1966).
36,
P,0,P, Ts'o, G.K. Helmkamp and C. Sander, PNAS 48, 686 (1962).
37,
P.O.P. Ts'o, J.S. Melvin and A.C,. Olson, J . Am. Chem. Soc. 85^
1289
(1963).
38,
E. Reich, Science 143, 684 (1964).
39,
M. G e l l e r t , C.E. Smith, D. N e v i l l e and G. F e l s e n f e l d , J . Mol. B i o l .
11^, 445 (1966).
40,
L,J. Erort and B.R. McAuslan, Biochem. Biophys. Acta 114, 633 (1966).
41,
W. Kersten und H. Kersten, Biochem. Z. 541, 174 (1965).
42,
E, C a l e n d i , A. DiMarco, M. Reggiani, B. Scarpinato and L. V a l e n t i n i
Biochem. Biophys. Acta 103, 25 (1965).
- 120 -
״43
M.J, Waring. J. Mol. Biol. L5, 269 (1965).
44,
M.J. Waring, Biochem. Biophys. Acta 114, 234 (1965).
45,
H.R. Mahler and B.D. Mehrotra, Biochem. Biophys. Acta 68, 211 (1963),
46,
H.R. Mahler and B.D. Mehrotra, Biochem. Biophys. Acta 55_, 252 (1962).
46a. M, Mandel, J. Mol. Biol. 5_, 435 (1962).
47,
H. Tabor, Biochemistry 1, 496 (1962).
48,
U, Shmueli (private communication).
49,
II. Venner, Ch. Zimmer and S. Schroder, Biochem. Biophys. Acta 76,
312 (1963).
50,
H.R, Mahler and G. Dutton, J. Mol. Biol. 10, 157 (1964).
51,
J, Shack, R.J, Jenkins and J.M, Thompsett, J. Biol. Chem. 203.
373 (1953).
52,
R.B. Inman and D.O. Jordan, Biochem. Biophys. Acta 37,' 162 (1960).
53,
G. Zubay and P. Doty, Biochem. Biophys. Act 29^, 47 (1958).
54,
G. Felsenfeld and S. Huang, Biochem. Biophys. Acta 3£, 234 (1959).
55,
G. Felsenfeld and S. Lee Huang, Biochem. Biophys. Acta 51, 19 (1961).
56,
E. Frieden and J. Alles, J. Biol. Chem. 230, 797 (1958).
57,
G, Zubay, Biochem. Biophys, Acta 3^, 233 (1959).
58,
K,C, Banderjee and D,J. Perkins, Biochem. Biophys. Acta 61, 1 (1962).
59,
T, Yamane and N. Davidson, J. Am. Chem. Soc. 83, 2599 (1961),
60,
T, Yamane and N. Davidson, Biochem. Biophys. Acta 55, 609 (1962),
61,
M. Daune, C,A, Dekker, H.K. Schachman, Biopolymers 4, 51 (1966).
62,
R.H. Jensen and N. Davidson, Biopolymers 4_, 17 (1966),
63,
G,L, Eichhorn, Nature 194, 474 (1962).
64,
G.L. Eichhorn and P. Clark, PNAS 53, 586 (1965).
65,
V,I. Ivanov and L.E. Minchenkova, Biokhymia 30, 1213 (1965).
66,
S. Hiai, J. Mol. Biol. JU, 672 (1965).
67,
J.H. Coates, D.O. Jordan and V.K. Srivastava, Biochem. Biophys.
Res. Comm. 20, 611 (1965).
68,
G.L. Eichhorn, P. Clark and E.D, Becker, Biochemistry
245 (1966).
121
69,
H, Venner and Ch, Zimmer, Biopolymers 4_, 321 (1966).
70,
P,D. Ross and R.L. Scruggs, Biopolymers 2_, 79 (1964).
71,
P.D, Ross and R.L. Scruggs, Biopolymers 2_, 231 (1964).
72,
R.G. Shulman and H. Sternlicht, J. Mol. Biol. 13, 952 (1965),
73,
W,F. Dove and N. Davidson, J. Mol. Biol. £, 467 (1962).
74,
J, Heyrovsky, Chem. listy J ^ , 256 (1922).
75,
Y,F, Frei and I,R, Miller, J. Phys. Chem. 69, 3018 (1965).
76,
Ch, Tanford, J. Am. Chem. Soc. 73, 2066 (1951).
77,
Ch, Tanford, J. Am. Chem. Soc. 7£, 211 (1952).
78,
H,A. Saroff and H.J, Mark, J, Am. Chem. Soc. -75, 1420 (1953).
79,
M.S. Narsinga Rao and H. Lai, J. Am. Chem. Soc. 80_, 32'22 (1958).
80,
W.U. Malik and Salahuddin, J. Electroanal. Chem.
81,
S, Lapanje and S. Oman, Macromol. Chem. 53, 46 (1962).
82,
S. Lapanje, Biopolymers 2, 585 (1964).
83,
F,T. Wall and S.J. G i l l , J. Phys. Chem, 5J3, 1128 (1954).
84,
V. Katfena and L. Matousek, Coll. Chech. Chem. Comrr. 1^8, 294 (1953).
85,
J, Koryta, Progress in Polarography, Interscience Publ, New York,
147 (1963),
London 1962, Vol. I, p.293.
86,
D, Bach and I.R. Miller, Biopolymers, in press.
87,
A,G, Boyes and U,P. Strauss, J, Polymer Sci. 22, 463 (1956),
88,
I.R, Miller and A. Katchalsky, Proceedings of the 2nd Internl. Congr.
of Surface Activity, Gas/Liquid and Liquid/Liquid Interface,
159 (1957), Butterworths Scientific Publications, London.
89,
E,R,M, Kay, N.S, Simmons and A.L, Dounce, J. Am. Chem. Soc. 7£,
1724 (1952).
90,
J, Eigner and P. Doty, J. Mol. Biol. 12_, 549 (1965).
91,
E,J, King and J.D.P. Wooton, Microanalysis in Medicinal Chemistry,
Grune and Stratton, New York 1956, p.77.
- 122 -
92,
O.H. Lowry, N.J, Rosenbrough, A.L. F a r r and R.J. Randall, J . B i o l ,
Chem. 193, 265 (1951).
93,
J,B, I f f t , D.H, Voet and J . Vinograd, J . Chem. Phys. 65^, 1138 (1961).
94,
Enzymes Worthington Biochem. Corp. Descriptive Manual No.11,
95,
A,I, Vogel, A Textbook o f Quantitative Inorganic A n a l y s i s , Longmans,
Green and Co., London, New York, Toronto, 1961, p.358,444,
96,
L. Meites, Polarographic Techniques, Interscience P u b l i s h e r s , Inc.
New York 1955, p.181.
97,
Ch. Tanford, P h y s i c a l Chemistry of Macromolecules, John Wiley,
New York 1961, p.380.
98,
H ״Sheraga, L. Mandelkern, J . Am. Chem. Soc. 75^, 179 (1953).
99,
Gmelin Handbook o f Inorganic Chemistry, Verlag Chemie, GMBH,
Weinheim/Bergstrasse 1959.
100,
H. H e l f e r i c h , Ion Exchange, McGraw H i l l , New York 1962, p,299-310.
101,
D, Ilkovi&׳, C o l l . Czech. Chem, Comm. 6_, 498 (1934).
102,
A, Katchalsky, Biophysical J . £, 9 (1964).
103,
N.K. Sarkar and A.L. Dounce, Biochem. Biophys. Acta 49, 160 (1961).
104,
J,0, Walker, Biochem. Biophys. Acta JB8, 407 (1964).
105,
S, Higuchi and M. Tsuboi, Biopolymers £, 837 (1966).
106,
L, Levine, J.A. Gordon and W.P. Jencks, Biochemistry 2_, 168 (1963).
107,
M, Laskowski i n The Enzymes, V o l . 5, 2nd ed.,(P.D. Boyer, H. Lardy
and K, Myrback eds,), Academic Press, Inc., New York 1961, p.123.
108,
J.D, L e i t h , Biochem. Biophys. Acta 7^, 643 (1963).
109,
D.O, Jordan, The Chemistry of N u c l e i c A c i d s , Butterworths, London
1960, p.200.
110,
A, E i n s t e i n , Ann. Phys. 19_, 289 (1906).
111,
P״K, Ganguli, A.L. Bhattacharyya, Nature 196, 1201 (1962).
112,
D,D, DeFord and D.N. Hume, J . Am. Chem. Soc. 73, 5321 (1951).
-
״113
F, A s c o l i , C. BotrS and A.M.
123
-
L i q u o r i , J . Mol. B i o l .
202 (1961).
114,
Z, Alexandrowicz and A, Katchalsky, J . Polymer S c i . 1^ 3231 (1963).
115,
L, Costantino, A.M.
L i q u o r i and V. V i t a g l i a n o , Biopolymers
1 (1964).
116,
A.R, Mathieson and S. Matty, J . Polymer S c i . 23^747 (1957).
117,
B,M, O l i v e r a , P, Baine and N. Davidson, Biopolymers 2_, 245 (1964).
118,
Sadako Inoue and Toshio Ando, Biochem. Biophys. Acta 129, 649 (1966),
INTERACTION OF DEOXYRIBONUCLEIC ACID WITH POLY-4-VINYLPYRIDINE
AND WITH HEAVY METAL IONS
Thesis Submitted f o r the Degree
Doctor of Philosophy
by
Diana Bach
Submitted t o the S c i e n t i f i c Council o f the Weizmann I n s t i t u t e o f Scien
Rehovoth, 1967
Dedicated t o the memory of my
f a t h e r , Attorney Aharon Bach
This work has been c a r r i e d out under the
supervision o f Dr. I s r a e l R. M i l l e r at the
Polymer Research Department, The Weizmann
I n s t i t u t e of Science, Rehovoth, I s r a e l .
This t h e s i s was supported by a National
I n s t i t u t e of Health Research Grant GM-08-519
and by a Grant i n memory o f Prof. I . Hirshbe
I wish to express my deep gratitude
to Dr. I.R. Miller for his help and
guidance in carrying out this research.
I wish to express.my gratitude to
Mr. H.Great for drawing the curves
and to Mr. A. Lustig for carrying
out the experiments in the ultracentrifuge and to the Department of Biological
Ultrastructure for their help in thfe
electronmicroscopy experiments.
CONTEN
TS
Page
PREFACE
AIM OF THE WORK
CHAPTER I.
INTRODUCTION AND LITERATURE REVIEW
4
1) General survey on DNA.
4
2) Interaction of DNA with proteins, polypeptides
7
and basic poly-electrolytes.
3) Interaction of DNA with monomeric substances
10
(non metallic).
a) Interaction with dyes.
10
b) Interaction with aromatic polycyclic hydrocarbons.
11
c) Interaction with purines, pyrimidines, nucleosides
12
and nucleotides.
d) Interaction with various drugs.
13
e) Interaction with amines.
15
4) Interaction of DNA with metallic'ions.
18
5) Polarographic
23
study of the interaction of polymers
with metallic ions.
CHAPTER I I .
THE EXPERIMENTAL PAHT.
26
1) Materials and methods.
26
Page
2) Polarographic determination of the binding
33
constants of copper and cadmium to DNA.
3) Polarographic determination of binding EN A - PVP.
38
CHAPTER I I I .
40
RESULTS Ml DISCUSSICN
1) Properties of the pure substances
a) Spectrophotometric titration of
40
־־4PVP.
b) Spectrum of DNA.
2) The optical properties of the interaction
40
41
45
products.
a) Spectra of the mixed solutions of DNA and PVP. 45
b) The melting curves.
55
3) Enzymatic hydrolysis,
68
4)
72
Hydrodynamic properties of the interaction
products.
5)
a) Viscosity.
72
b) Sedimentation.
76
c) Separation by centrifugation at high speed's.
79
d) Centrifugation in density gradient.
81
Electron microscopy of the interaction products.
6) Determination of the binding constants of
83
91
metallic ions to DNA.
7) Determination of binding DNA - PVP by polarography. 106
General Discussion
SUMMARY
REFERENCES
ENGLISH SUMMARY
111
116
118
I
־
E N G L I S H
1.
S U M
M A R Y
I n t e r a c t i o n o f DNA with P01y=״4Vinylpyridine
(4PVP)
The i n t e r a c t i o n of DNA with PVP can be used as a model system t o
provide information on the i n t e r a c t i o n between n u c l e i c acids and poly*•
bases, which i s o f i m p o r t a n t i n b i o l o g i c a l systems, for example j i n
nucleoproteing,
Due t o the s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y o f the p y r i d i n i c groups
to p y r i m i d i n e s , study o f §uch a system can a l s o throw l i g h t on the s p e c i f i c
i n t e r a c t i o n s w i t h i n the DNA molecule i t s e l f .
We have i n v e s t i g a t e d *be i n t e r a c t i o n o f DNA from c a l f thymus with
4 - p o l y v i n y l p y r i d i n e charged t o d i f f e r e n t degrees o f q u a t e r n i z a t i o n o f the
n i t r o g e n , with e t h y l bromide and with copolymers o f VP with MA (methacrylic
acid) (non-charged pyridonium groups).
The spectra o f the i n t e r a c t i o n pro-
ducts.for d i f f e r e n t concentrations o f the reactants were examined.
I t was
found that the wavelength corresponding t o maximum absorption does not
change, but that i t s i n t e n s i t y increases upon i n t e r a c t i o n , and i s maximal
when the charge density o f the i n t e r a c t i o n product i s zero, at the r a t i o
P:N
+
«1:1
־
,
independent o f the degree o f q u a t e r n i z a t i o n (Figs.5,6).
the simple Rayleigh formula, i t was found that the increase i n o p t i c a l dens i t y i s due mainly t o l i g h t s c a t t e r i n g .
I t was p o s s i b l e t o obtain separation
of almost equimolar i n t e r a c t i o n products from s o l u t i o n s containing one o f the
components i n excess by applying Strong c e n t r i f u g a l f o r c e s , even i n cases
where there was no v i s i b l e p r e c i p i t a t i o n .
The near t o equimolar
composition
of the p r e c i p i t a t e i n d i c a t e s that reactants are always i n e q u i l i b r i u m . The
e q u i l i b r i u m concentration o f the i n t e r a c t i o n product at the r a t i o 1:1 i s
very small at an appreciable excess o f e i t h e r component (׳\״4:1) and strong
forces are needed f o r tjie separation (Table 2 ) .
At greater excess o f one o f
Apply
II.
the reactants, the concentration of the product i n the r a t i o 1:1 becomes
so small that no separation i s obtained even i n the u l t r a c e n t r i f u g e .
No change i n the absorption such as might be due t o denaturation
or the i n t e r a c t i o n of PVP with the bases of DNA was found.
In the
DNA
melting experiments, two regions of melting were found f o r the i n t e r a c t i o n
products o f DNA with 50 and 100% quatemized PVP and one melting step f o r
the i n t e r a c t i o n products with 7% quatemized PVP
(Figs. 9,10,11).
In the
case of the i n t e r a c t i o n product with 7% quatemized PVP, only the f i r s t
melting step was found.
Due to hydrophobic i n t e r a c t i o n with the non-
charged p y r i d i n i c groups, a very s t a b l e product i s obtained which does
not melt below 100°.
I t was
concluded that i n the f i r s t region, the
uncovered DNA melts and i n the second, the DNA
creases the melting temperature of DNA
covered by PVP.
PVP i n -
also i n the uncovered region.
From
the value of the hyperchromic r i s e at the f i r s t step, the stochiometry
binding was
of
c a l c u l a t e d . The i n f l u e n c e of covered on uncovered parts of
DNA was a l s o found i n polarographic determination of binding of cadmium
to DNA i n the presence of PVP.
PVP a l s o protects DNA against enzymatic h y d r o l y s i s . The h y d r o l y s i s
proceeds u n t i l there i s a decrease below a c e r t a i n l e v e l i n the net negat i v e charge of the remaining i n t e r a c t i o n product between DNA
and
PVP.
Electron microscopy revealed that the i n t e r a c t i o n products of DNA
with
PVP f o l d , g i v i n g r i s e t o t u b u l a r forms (Pictures 19,20,21).
frequency
The
of appearance of folds and the changes i n the DNA molecule are greatest
for the lowest degree of q u a t e r n i z a t i o n . As no denaturation was
by o p t i c a l methods, i t was
DNA
detected
concluded that double h e l i c a l stretches of
covered by PVP tend to f o l d on each other.
III.
The changes i n the DNA molecules due t o i n t e r a c t i o n a f f e c t e d the
hydrodynamic p r o p e r t i e s of the DNA s o l u t i o n .
The i n t e r a c t i o n causes a
decrease i n s p e c i f i c v i s c o s i t y and increase i n the sedimentation constant
of the products obtained i n the presence of excess of DNA.
When PVP i s i n
excess, a l l the measurements ( v i s c o s i t y , sedimentation, e l e c t r o n microscopy)
showed that DNA i s s t r o n g l y degraded.
In general, one can conclude that the charged and non-charged
p y r i d i n e groups p a r t i c i p a t e i n the i n t e r a c t i o n which i s both i o n i c and
hydrophobic.
The distance between the charge on two adjacent pyridonium
groups i n PVP i s about equal t o the distance between two negative phosphate
groups located on the two strands across the large groove.
This permits
the s t r u c t u r a l arrangement of the i n t e r a c t i o n product given i n Fig.22,
2,
Binding of Heavy Metal Ions t o DNA
In the second part of t h i s research, the b i n d i n g constants o f heavy
metal ions t o DNA were determined p o l a r o g r a p h i c a l l y .
I t was found that
the b i n d i n g i s a function of the s a l t concentration, secondary s t r u c t u r e
o f DNA, pH and degree of coverage of DNA by the heavy metal i o n s , (Figs.27,
28,29,30),
I t decreases with decrease of the e l e c t r o s t a t i c p o t e n t i a l of
the DNA molecule and of the number of a v a i l a b l e binding s i t e s .
The presence of PVP decreases the b i n d i n g of cadmium to DNA i n the
covered and uncovered parts (Fig,29).
