2. Opbygning og funktion af en HPLC

Opbygning og funktion af en HPLC
High Performance Liquid Chromatography
Kromatografi udføres under højt tryk gennem en søjle. Derved adskilles stoffer efter polaritet eller chiralitet.
●
●
●
●
●
Det valgte solvent pumpes løbende gennem søjlen med den valgte
flow rate.
Ved injektionsventilen sprøjtes prøven ind i et kort prøve loop. Dette
loop har et volumen på 2-1000 mikroliter.
Når injektionshåndtaget drejes føres solvent-flowet gennem
prøveloopet og prøven føres på søjlen.
På søjlen adskilles prøvens forskellige komponenter.
Disse komponenter detekteres for enden af søjlen - ofte vha. en UVeller MS-detektor.
Solventer:
● De skal være meget rene!
○ De skal være triple destilleret.
○ Intet ilt i solventet - eller gas generelt.
○ Køres først igennem en guard-column med det samme
søjlemateriale som søjlen. Denne kan skiftes oftere end selve søjlen.
● Solventer af forskellig polaritet benyttes til at ændre elueringen af forskellige analytter.
● Der kan køres isokratisk, gradient eller med en kombination af forskellige solventer:
○ Isokratisk: Samme koncentration af ét solvent under hele analysen
○ Gradient: En langsomt skiftende solventsammensætning. f.eks. lav eluntstyrke ⇒
høj eluentstyrke.
○ Kombination af solventer: Ved at køre en fast kombination af solventer opnår en
meget specifik eluentstyrke, som benyttes til hele analysen.
Pumpen:
● Pumpen sørger for et uniformt tryk og flow.
○ Normalt arbejdes der med et tryk på 70-400 bar, men det kan nå op på 1000 bar
i nogle apparater.
○ Den normale flow rate er på 0,5-5 mL/min.
Injektion:
● Ved injektionsventilen sprøjtes prøven ind i et kort prøve loop. Dette loop har et volumen
på 2-1000 mikroliter.
● Når håndtaget drejes føres flowet gennem prøveloopet og prøven indføres på søjlen.
● Ved injektion er det yderst vigtigt at prøven er ren og filtreret på en lille søjle.
● Der må ikke være luft i injektionen. Dette medfører at søjlen kan udtørre.
Søjlen:
●
●
●
HPLC-søjler er 5-30 cm lange og 1-5 mm i diameter.
Søjlerne er pakket med en stationær fase.
○ Enten polær (normal fase)
○ eller apolær (omvendt fase)
I nogle apparater er søjlen i en ovn, som varmer søjlen til 10 grader over
stuetemperatur. Dette øger reproducibiliteten af analyserne.
○ Hvis der benyttes en ovn, skal solvent forvarmes før det går ind på søjlen.
Søjlemateriale:
Almindelige polære faser
Almindelige apolære faser
Amino
Cyano
Diol
Octadecyl (alkan) C18
Octyl (alkan)
Phenyl
F5-phenyl
Søjlen er loaded med partikler som består af silica. Jo mindre partikler jo bedre opløsning
(mindre pladehøjde!)
Silica er ikke brugbart ved pH > 8. I stedet kan polymer-materialer benyttes.
Det mest basale søjlemateriale består af Si-OH-enheder og benyttes ofte i
adsorbtionskromatografi.
Ofte er disse enheder dog blevet påsat en R-gruppe (se ovenfor).
Disse R-grupper har forskellig polaritet, hvilket giver mulighed for mere specifik separation.
Oftest anvendes C18-kæder (omvendt fase).
Omvendt fase:
● Upolært søjlemateriale
● Upolære analytter har længere retentionstider end polære ⇒ større affinitet for søjlen.
● Upolære solventer har større eluentstyrke end polære.
○ Methanol har lavest eluentstyrke
○ pentane har højest eluentstyrke
● Omvendt fase kromatografi har mindre tendens til tailing, fordi der ikke er så stærk
adsorbtion i det upolære søjlemateriale.
Normal fase
● Polært søjlemateriale
● polære analytter har længere retentionstider
● polære solventer har højere eluentstyrke end uploære
○ Pentane har lavest eluentstyrke
○ Methanol har højest eluentstyrke
● Polære søjlematerialer er meget følsomme overfor vand!
Detektor:
●
●
●
●
●
UV-detektor (ofte en ”Flow cell” - fig. 24-19 s. 612)
○ Meget sensitiv til lave koncentrationer.
○ Påvirkes ikke af temperatur og solventsammensætning.
■ Dog skal bølgelængde vælges så solventer ikke absorberer.
○ God til gradient eluering .
○ Detektionsgrænse: ca. 0.1-1 ng
Flourosens detektor
○ Analyt derivatiseres - enten før eller efter søjlen.
○ Efter “derivatisering” måles flourosensen
○ God til gradient eluering.
○ Detektionsgrænse: ca. 0.1-1 ng
Evaporative light-scattering detektor
○ Analyt fordampes og fast stof bliver tilbage.
○ Spredningen af lys fra det faste stof måles.
○ Stor spredning af lys betyder meget stof.
○ God til gradient eluering.
○ Detektionsgrænse: ca. 0.1-1 ng
APCI og ES
APCI (ladning induceres af corona) og ES (ladning induceres af spænding på nebulizer)
Talepapir
Generel opbygning: Solvent, pumpe, injektionsventil, søjle (evt. i ovn) og detektor.
Solventer:
● Rene/filtrerede
● Polaritet
● Isokratisk vs. gradient
Pumpe:
● Tryk (70 - 400 bar)
● Flow rate (0,5 - 5 mL/min)
Injektion:
● Meget rene prøver
● Prøveloop (2 - 1000 mikroliter)
Søjle:
● HPLC-søjler er 5-30 cm lange og 1-5 mm i diameter.
● Søjler kan holdes stabile i temperatur i en ovn (10 grader over stuetemp!)
● Søjlemateriale er små silica-partikler coated med forskellige R-grupper
○ Omvendt fase
■ Upolært søjle materiale (ofte C18)
■ Polære solventer
○ Normal fase
■ Polært søjlemateriale (ofte Si-OH)
■ Upolære solventer
Detektor:
● UV
● MS
● Flourosens detektor
● Evaporative light-scattering detektor