Effet d`un supplément d`huile de lin avec différents niveaux d`amidon

Transcription

EFFET D’UN SUPPLÉMENT D’HUILE DE LIN AVEC DIFFÉRENTS
NIVEAUX D’AMIDON DANS LA RATION SUR LE PROFIL EN
LACTONES ET LES PROPORTIONS DE DIFFÉRENTS
INTERMÉDIAIRES DU PROCESSUS DE BIOHYDROGÉNATION DE
L’ACIDE -LINOLÉNIQUE DANS LE LAIT CHEZ LA VACHE
Mémoire
LEA CADI SALIBA
Maîtrise en sciences animales
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Lea Cadi Saliba, 2014
Résumé
Vingt-quatre
vaches
ont
été
utilisées
afin
d’évaluer
les
effets
du
rapport
fourrages:concentrés et de l’ajout d’huile de lin dans la ration sur les profils en acides gras et en
lactones du lait. L’huile de lin a fait augmenter les concentrations de 18:3 cis-9, cis-12, cis-15
dans le gras du lait, et ces augmentations ont été plus importantes avec les rations riches en
concentrés. L’huile a également fait augmenter les teneurs en 18:1 trans-13 et en
18:2 cis-9, trans-13, tandis que le 18:3 cis-9, trans-13, cis-15 n’a pas été détecté. La teneur en
γ-12:0 a été plus élevée dans le lait avec la ration riche en concentrés et contenant de l’huile, mais
aucun effet n’était apparent lorsque l’huile était ajoutée à la ration faible en concentrés.
Finalement, la teneur en γ-12:1 a été plus élevée avec les rations riches en concentrés, tandis que
la γ-12:2 n’a pas été détectée.
iii
Table des matières
Résumé ............................................................................................................................................... iii
Table des matières .............................................................................................................................. iii
Liste des tableaux ...............................................................................................................................vii
Liste des figures ................................................................................................................................. ix
Liste des abréviations et des sigles ..................................................................................................... xi
Remerciements .................................................................................................................................. xiii
Avant-propos .................................................................................................................................... xvii
CHAPITRE 1: INTRODUCTION ...................................................................................................... 1
CHAPITRE 2: REVUE DES TRAVAUX ANTÉRIEURS ................................................................ 5
2.1 Effet de l’alimentation de la vache sur la composition du lait ..................................................... 6
2.1.1 Effet de l’alimentation sur les constituants majeurs du lait et leur profil en acides gras....... 6
2.2 Caractéristiques de l’acide -linolénique ..................................................................................... 8
2.2.1 Structure chimique et sources alimentaires ........................................................................... 8
2.2.2 Bénéfices sur la santé humaine............................................................................................ 10
2.2.3 Biohydrogénation ruminale de l’acide -linolénique ......................................................... 12
2.2.3.1 Effets des sources d’acide -linolénique sur les performances zootechniques chez la vache
laitière ........................................................................................................................................ 15
2.2.3.2 Effet de l’ajout de l’huile de lin sur le profil en acides gras .......................................... 16
2.2.3.3 Interaction de l’acide -linolénique avec différents rapport fourrages : concentrés ..... 17
2.3 Les lactones ................................................................................................................................. 19
2.3.1 Nature et composition .......................................................................................................... 19
2.3.2 Voies de synthèse des lactones du lait .................................................................................. 19
2.3.3 Propriétés sensorielles des lactones ...................................................................................... 22
2.3.3.1 Effet de l’alimentation des vaches laitières sur les qualités sensorielles des produits laitiers
................................................................................................................................................... 24
2.3.4 Méthodes d’extraction et d’identification des lactones ........................................................ 26
2.3.4.1 Méthodes d’extraction ................................................................................................... 26
2.3.4.2 Méthodes d’identification.............................................................................................. 30
2.3.4.2.1 La chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie .............................. 31
v
2.3.4.2.2 La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse ............. 33
2.4 Objectif et hypothèse de l’étude .................................................................................................. 35
2.5 Liste des ouvrages cités ............................................................................................................... 36
CHAPITRE 3: EFFECT OF FEEDING LINSEED OIL IN DIETS DIFFERING IN FORAGE TO
CONCENTRATE RATIO: 1. PRODUCTION PERFORMANCE AND MILK FAT CONTENT OF
BIOHYDROGENATION INTERMEDIATES OF α-LINOLENIC ACID ...................................... 47
3.1 Résumé ........................................................................................................................................ 49
3.2 Abstract ....................................................................................................................................... 50
3.3 Introduction ................................................................................................................................. 51
3.4 Materials and methods................................................................................................................. 53
3.4.1 Animals and diets ................................................................................................................. 53
3.4.2 Sampling, measurements and analyses................................................................................. 55
3.4.3 Statistical analysis ................................................................................................................ 57
3.5 Results ......................................................................................................................................... 57
3.6 Discussion ................................................................................................................................... 67
3.7 Acknowledgements ..................................................................................................................... 71
3.8 References ................................................................................................................................... 72
CHAPITRE 4: EFFECT OF FEEDING LINSEED OIL IN DIETS DIFFERING IN FORAGE TO
CONCENTRATE RATIO: 2. MILK LACTONE PROFILE ........................................................... 75
4.1 Résumé ........................................................................................................................................ 77
4.2 Abstract ....................................................................................................................................... 78
4.3 Introduction ................................................................................................................................. 79
4.4 Materials and methods................................................................................................................. 81
4.4.1 Animals and diets ................................................................................................................. 81
4.4.2 Sampling, measurements and analyses................................................................................. 82
4.4.3 Sensory evaluation ............................................................................................................... 83
4.4.4 Statistical analysis ................................................................................................................ 84
4.5 Results ......................................................................................................................................... 85
4.6 Discussion ................................................................................................................................... 87
4.7 Acknowledgements ..................................................................................................................... 93
4.8 References ................................................................................................................................... 94
CHAPITRE 5: CONCLUSION......................................................................................................... 97
vi
Liste des tableaux
Tableau 2.1:
Besoin en acides gras polyinsaturés pour un adulte consommant 2000 kcal/jour
(en pourcentage des apports énergétiques) (Adapté de Legrand, 2010) .... 10
Tableau 2.2: Propriétés sensorielles des γ- et δ-lactones (Adapté de Dufossé et al. 1994 et
Bendall, 2001) ............................................................................................ 23
Tableau 2.3: Type de fibre utilisé en microextraction en phase solide (Adapté de Falcó &
Mayo, 2007) ............................................................................................... 29
Table 3.1:
Ingredients and chemical composition of experimental diets (g /100 g dry matter)
.................................................................................................................... 53
Table 3.2:
Body weight, dry matter intake (DMI), milk yield, and milk composition in cows
fed high (HC) or low (LC) concentrate diets without supplemental oil (NLO), or
supplemented at 3% of dry matter with linseed oil (LO) ........................... 59
Table 3.3:
Fatty acid intake in cows fed high (HC) or low (LC) concentrate diets without
supplemental oil (NLO), or supplemented at 3% of dry matter with linseed oil
(LO) ............................................................................................................ 60
Table 3.4:
Milk fat composition in cows fed high (HC) or low (LC) concentrate diets
without supplemental oil (NLO), or supplemented at 3% of dry matter with
linseed oil (LO) .......................................................................................... 62
Table 4.1:
Milk lactone profile in cows fed low (LC) or high (HC) concentrate diets
without supplemental oil (NLO), or supplemented with linseed oil (LO) . 86
vii
Liste des figures
Figure 2.1: Conversion de l'acide -linolénique en acides gras polyinsaturés à longue chaîne
(Adaptée de Williams, 2000) ...................................................................................... 9
Figure 2.2: Biohydrogénation ruminale et métabolisme endogène de l'acide α- linolénique
(Adaptée de Destaillats et al. 2005) .......................................................................... 14
Figure 2.3: Mécanisme de formation des lactones γ-12:0 et γ-12:1 pendant la lactation (Urbach,
1990) ......................................................................................................................... 21
Figure 4.1: Lactone profile of processed milk samples from cow fed low (LC) or high (HC)
concentrate diets without supplemental oil (NLO), or supplemented with linseed oil
(LO). Values represent the average of 3 replicates, with standard deviations shown
as error bars ............................................................................................................... 91
Figure 5.1: Devenir de l'acide linolénique chez la vache laitière ................................................. 98
Figure 5.2: Sentiers de biohydrogénation de l'acide -linolénique et métabolisme mammaire des
intermédiaires produits. Les flèches () indiquent les isomères pour lesquels une
augmentation a été observée dans le lait des vaches ayant reçu de l'huile de lin dans
leur alimentation (voir chapitre 3) .......................................................................... 100
Figure 5.3: Voie suggérée de production de la lactone γ-12:0 à partir de l'acide -linolénique
débutant par la biohydrogénation partielle de l'acide gras par les microorganismes
du rumen et se poursuivant avec la lactonisation des intermédiaires monoénoïques
(18:1) ....................................................................................................................... 101
ix
Liste des abréviations et des sigles
ADF: acid detergent fiber (fibre au détergent acide)
ADH: acide docosahexaénoïque
AEP: acide éicosapentaénoïque
AG: acides gras
AGPI : acides gras polyinsaturés
a.m.: before midday (avant-midi)
cm: centimetre (centimètre)
d: day (jour)
DMI: dry matter intake (matière sèche ingérée)
eV: electron volt (électronvolt)
FA: fatty acid (acide gras)
F:C: rapport fourrages:concentrés
g: gramme
h: hour
HC: high in concentrate (riche en concentré)
i.d.: internal diameter (diamètre interne)
kg: kilogramme
l : liter (litre)
LC: low in concentrate (pauvre en concentré)
LO: linseed oil (huile de lin)
μg: microgram (microgramme)
μl: microliter (microlitre)
μm: micrometer
m: meter
M: molar
Mcal: megacalorie (mégacalorie)
min: minutes
ml: milliliter (millilitre)
mm: millimeter (millimètre)
MS: mass spectrometry (spectromètre de masse)
m/z : mass-to-charge ratio (rapport masse/charge)
n: number of evaluator (nombre d’évaluateurs)
NDF: neutral detergent fiber (fibre au détergent neutre)
NEL: net energy of lactation (énergie nette de lactation)
NLO: without linseed oil (sans huile de lin)
Pd: probability distribution (distribution probable)
p.m.: after midday (après-midi)
ppm: part per million (partie par million)
RPM: rotation per minute (rotation par minute)
s: second (seconde)
SPME: solid phase microextraction (microextraction en phase solide)
v/v: volume-volume
wk: week
xi
α: alpha
ß: beta
δ: delta
γ: gamma
°C: degré Celsius
xii
Remerciements
Ces travaux ont été financés par le programme de Chaire Industrielle du Conseil de
Recherches en Sciences Naturelles et en Génie du Canada (Ottawa, ON, Canada) avec la
contribution des Producteurs laitiers du Canada (Ottawa, ON, Canada), de Novalait Inc. (Québec,
QC, Canada), de Valacta (Ste-Anne-de-Bellevue, QC, Canada), de la Fédération des Producteurs
de Lait du Québec (Longueuil, QC, Canada), et du Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de
l'Alimentation du Québec (Québec, QC, Canada). Les auteurs remercient également André
Perreault et Philippe Cantin ainsi que le personnel administratif du Centre de Recherche en
Sciences Animales de Deschambault (Québec, Canada) pour leur collaboration durant la phase
expérimentale. Les auteurs sont également reconnaissants à Gabrielle St-Pierre et Micheline
Gingras du département des Sciences animales de l’Université Laval pour leur aide dans les
analyses de laboratoire.
xiii
Au Bienheureux
Estephan Nehmé
xv
Avant-propos
C’est durant ma 4ème année d’Agronomie à l’Université Saint Esprit de Kaslik au Liban,
que j’ai décidé de poursuivre mes études à l’étranger pour me spécialiser en production animale.
Ainsi ai-je commencé ma recherche sur les universités proposant ce cursus et sur la possibilité
d’obtenir une bourse. Lors de ma visite à l’UNESCO à Beyrouth, j’ai appris l'existence du PCBF
(Programme Canadien des bourses de la Francophonie) et j’ai décidé de déposer une demande
auprès de cet organisme. Deux mois plus tard, j’ai obtenu la bourse.
La direction de ce programme m’a mis en contact avec la direction du département des
sciences animales à l’Université Laval. Ainsi, ai-je pris contact avec le Dr. Yvan Chouinard qui
m’a proposé un sujet de Maîtrise sur l’effet d’un supplément d’huile de lin avec différents
niveaux d’amidon dans la ration sur le profil en lactones et les proportions de différents
intermédiaires du processus de biohydrogénation de l’acide α-linolénique dans le lait chez la
vache. Malgré les distances, j’ai été immédiatement convaincue par ce sujet et par les propos du
Dr. Chouinard, à qui je tiens à exprimer ma gratitude et mon plus profond respect. Dr Chouinard
a fait preuve de confiance en ma personne et m'a fait intégrer son équipe de recherche. Je le
remercie pour la qualité de son encadrement, la solide formation qu'il m'a donnée, et surtout pour
sa disponibilité et ses nombreux et précieux conseils qui m’ont guidée tout au long de ce projet.
Durant ces années j’ai eu la chance de travailler avec une équipe magnifique, notamment
avec ma co-directrice Dr. Rachel Gervais que je remercie pour son soutien tout au long de ces
années, pour sa patience, son aide dans les analyses statistiques, dans l’intégration des
chromatogrammes de même que dans la rédaction. Ce mémoire contient
notamment deux
articles qui ont été réalisés avec la collaboration de Dr. Rachel Gervais, Dr. Yvan Chouinard, Dr.
Jean-Christophe Vuillemard, Yolaine Lebeuf et Jacinthe Fortin. Ces articles ont été publiés dans
le Journal of Dairy Research sous les références suivantes:

Saliba L, Gervais R, Lebeuf Y & Chouinard PY 2014 Effect of feeding linseed oil in
diets differing in forage to concentrate ratio: 1. Production performance and milk fat
content of biohydrogenation intermediates of α-linolenic acid Journal of Dairy Research
81 82-90
xvii

Saliba L, Gervais R, Lebeuf Y, Vuillemard JC, Fortin J & Chouinard PY 2014
Effect of feeding linseed oil in diets differing in forage to concentrate ratio: 2. Milk
lactone profile Journal of Dairy Research 81 91-97
Je remercie également Yolaine Lebeuf pour son aide lors des analyses de laboratoires.
Je suis également très reconnaissante envers l'Université Laval, la Faculté des Sciences de
l'agriculture et de l'alimentation, et en particulier le Département des Sciences animales pour les
ressources humaines et matérielles mises à ma disposition. Merci à Juan Pablo Sarramone, MariePier Villeneuve et Marie-Pier Dallaire.
Ce projet n’aurait pas pu voir le jour sans la contribution financière du PCBF. Ma
profonde gratitude va vers le Canada, ce grand pays que j'ai appris à connaître et à aimer et que je
respecte énormément. Le Canada est devenu et restera ma deuxième patrie. Et dans ce sens, je
tiens à remercier également la communauté Libanaise de Québec, ma 2ème famille.
Finalement, les derniers, mais loin d'être les moindres, mes proches qui ont cru en moi et
soutenue. Je tiens à mentionner les membres de ma famille: Georges, Antoinette, Miriana,
Jennifer, Pierre, Georges, Cetrile, Kai et Luka; et aussi mes amis, surtout Nada et Zeina. Merci en
particulier à mes parents d’avoir toujours été à mes côtés et d'avoir guidé mes pas tout au long
des mes 28 ans. Ce document, c'est aussi le produit de leurs efforts.
Mon dernier remerciement s'adresse à celui qui, par son grand amour, m'apporte soutien et
bonheur, Roy. Je suis très chanceuse d’avoir ce grand homme dans ma vie !
C’est avec le cœur rempli de fierté que je termine ce chapitre de ma vie. J'espère que le
contenu de ce document sera un point, un mot, une phrase ... un chapitre dans la vie des autres.
xviii
CHAPITRE 1: INTRODUCTION
1
CHAPITRE 1
Introduction
L’acide -linolénique (18:3 cis-9, cis-12, cis-15) est un acide gras essentiel
(Legrand, 2010). Il a été identifié pour la première fois en Allemagne en 1887 à partir
d’huile de lin, un an après la découverte de l’acide linoléique (Schmitt, 2010). Son
caractère indispensable ne fut cependant établi que 40 ans plus tard à l'Université du
Minnesota (Burr et Burr, 1929; 1930). À cette époque, une étude sur les rats a montré qu’un
régime alimentaire dépourvu de gras induisait un retard de croissance, une chute de poils et
une desquamation de la peau (Burr et Burr, 1930).
On estime aujourd’hui que 0,5 à 0,6 % de l’apport énergétique quotidien de
l’homme doit être composé d’acide -linolénique afin d’éviter les symptômes de carence
(FAO, 2010). Les graines et les huiles de certaines plantes (lin, chia, sacha inchi) sont
reconnues pour leur richesse en acide -linolénique. Aussi, plusieurs études ont démontré
l’efficacité de ces sources d’acide -linolénique à prévenir des maladies cardiovasculaires,
des maladies artérielles périphériques, le cancer du sein, la polyarthrite rhumatoïde et les
maladies coronariennes. (Simopoulos, 2002; Berbert et al. 2005; Harris et al. 2008; Maurer
et al. 2012; Rodriguez-Leyva et al. 2013).
Étant donné les effets positifs des huiles riches en acide -linolénique, plusieurs
chercheurs ont tenté d’enrichir le lait en cet acide gras polyinsaturé par la supplémentation
des rations des vaches laitières (Donovan et al. 2000; Nelson et Martini, 2009).
L’incorporation d’huile de lin, source d’acide -linolénique, dans la ration des vaches
laitières permet de modifier le profil en acides gras du lait et ainsi de moduler sa qualité
nutritionnelle (Brunschwig et al. 2010).
2
Cependant, après son ingestion par la vache, l’acide -linolénique est soumis au
processus de biohydrogénation dans le rumen de l’animal. Selon les conditions de
fermentation, différents intermédiaires sont générés par l’action des microorganismes. Si le
sentier principal de biohydrogénation a déjà été identifié, plusieurs intermédiaires d’acides
gras apparaissent dans le rumen des vaches et sont incorporés dans la matière grasse
laitière. L’analyse de ces intermédiaires dans le lait peut donc nous permettre d’identifier
les sentiers alternatifs de biohydrogénation.
Outre les effets reconnus aux acides gras polyinsaturés sur la santé du
consommateur, de récentes études ont aussi démontré que l’augmentation des teneurs en
ces acides gras dans la ration des animaux pouvait influencer le profil aromatique du lait.
Les principaux composés aromatiques dans le lait et les produits laitiers proviennent
de deux sources: i) soit des protéines, de la matière grasse ou de composés dérivés du
lactose lors du traitement thermique; ii) soit de la ration de base, du rumen et du
métabolisme des tissus animaux durant la synthèse et la sécrétion du lait (Keen, 1998).
Parmi ces composés aromatiques, un des groupes les plus importants et qui
contribuent grandement à la flaveur caractéristique du beurre est celui des lactones
(Urbach, 1990). Dans ce groupe de composés aromatiques, deux séries sont plus
abondantes dans les produits issus des ruminants, soit les gamma-lactones (γ -lactone à 4
atomes de carbone) et les delta-lactones (δ -lactones à 5 atomes de carbone) (Shahidi et al.
1986; Hettinga, 2005). L’acide oléique et l’acide linoléique sont les précurseurs respectifs
de la γ-dodécalactone (γ-12:0) et de la γ-dodécaenolactone (γ-12:1) (Urbach, 1990).
Plus précisément, chez la vache, la synthèse du γ-12:0 et du γ-12:1 est un processus
en deux étapes où les acides gras insaturés dont la chaîne comporte 18 atomes de carbone
sont d’abord hydratés en hydroxy-acides. Suite à l’absorption par la paroi intestinale de
l’animal, ces molécules sont ensuite raccourcies par trois cycles de β-oxydation. En dernier
3
lieu, la molécule est cyclisée pour donner des γ-lactones (Joblin et Hudson, 1997). S’il était
soumis à une série semblable de réactions, l’acide α-linolénique retrouvé dans la ration de
la vache laitière pourrait potentiellement être le précurseur de la γ-dodec-cis-6,cis-9dienolactone (γ-12:2), tel qu’il a été antérieurement observé lors de la lactonisation
microbienne des acides gras de l’huile de lin (Kim, 2005).
D’autres facteurs alimentaires, outre la teneur en acides gras polyinsaturés de la
ration, influencent les concentrations en lactones du lait chez la vache. À ce sujet, Urbach et
Stark (1978) ont observé une augmentation des teneurs en γ-12:0 du lait lorsque des vaches
laitières recevaient une ration totale mélangée contenant de l’avoine comme source
d’amidon comparativement à des vaches recevant exclusivement un foin de luzerne. À la
lumière de ces résultats, il est permis de croire que, chez la vache, des variations dans la
teneur en amidon et en acides gras polyinsaturés de la ration pourraient influencer le profil
aromatique
4
du
lait.
CHAPITRE 2: REVUE DES TRAVAUX ANTÉRIEURS
5
CHAPITRE 2
Revue des travaux antérieurs
2.1 Effet de l’alimentation de la vache sur la composition du lait
La composition des produits dérivés des animaux varie d'une espèce à l'autre, mais
aussi à l'intérieur d'une même espèce, voire à l'intérieur des races d'espèces identiques.
Cette variabilité dépend de plusieurs facteurs dont le stade de lactation, l'âge, la saison, la
nutrition et plusieurs autres.
L’alimentation agit d’une façon marquée sur les produits dérivés des ruminants. Le
lait et la viande des bovins contiennent des acides gras (AG) qui résultent de la
transformation par la flore ruminale des AG polyinsaturés (AGPI) présents dans les rations.
2.1.1 Effet de l’alimentation sur les constituants majeurs du lait et leur
profil en acides gras
L’ajout à la ration d’aliments concentrés et d’huile de lin augmente les proportions
d’AG et d’amidon et, par le fait même, la densité énergétique des régimes alimentaires. En
revanche, cet ajout diminue la digestibilité ruminale du contenu fibreux des fourrages
(fibres aux détergents acide et neutre) (Ueda et al. 2003).
6
Sterk et al. (2011) ont montré qu’un passage d’un régime riche en fourrages
(rapport fourrages:concentrés (F:C) 65:35) vers un régime riche en concentrés (F:C 35:65)
augmente la prise alimentaire ainsi que la production laitière chez les vaches laitières. Or, il
est reconnu que l’ingestion d’une ration riche en amidon induit une réduction marquée du
taux butyreux chez les ruminants. Ce phénomène est connu sous le nom de syndrome dit du
lait pauvre en matières grasses (Milk Fat Depression) et implique une interrelation entre les
processus microbiens du rumen et le métabolisme tissulaire (Bauman et Griinari, 2003).
Une sous-alimentation provoque quant à elle une baisse de la production laitière en
plus d’une chute du taux protéique du lait (Araba, 2006). Au contraire, une ration riche en
énergie augmente le taux protéique (Araba, 2006). Il existe une corrélation positive entre le
pourcentage d’amidon dans la ration et la concentration du lait en protéines (Sterk et al.
2011).
Les taux butyreux et protéique du lait sont influencés par la production des
différents AG volatils dans le rumen. D’une part, l’acide acétique provient d’une
fermentation adéquate de fourrage et induit une augmentation du taux butyreux. Au
contraire, un excès de concentrés entraine une fermentation de type propionique favorable
au taux protéique. Selon Gonthier et al. (2004), l’ajout de 12,5 % de graines de lin crues ou
extrudées dans la ration est responsable d’une diminution de rapport acétate/propionate de
3,1 à 2,5. Ueda et al. (2003) ont mis en évidence qu'un supplément d’huile de lin à raison
de 3 % de la matière sèche de la ration de vaches laitières n’a pas d’effet négatif important
sur la digestion ruminale, à condition que la proportion de fourrages soit élevée (65:35
F:C). En revanche, l’ajout de 3 % d’huile à une ration riche en concentrés provoque une
diminution du rapport acétate/propionate et de la quantité d’AG volatils produite.
Selon Lerch et al. (2012), le profil d’AG du lait peut être modulé par des facteurs
intrinsèques (race, génotype, et stade de lactation) ou extrinsèques (alimentation
principalement). L’alimentation joue un rôle très important sur le profil en AG du lait et son
effet est rapide et réversible (Chilliard et al. 2000, Dewhurst et al. 2006). Le profil en AG
7
du lait est principalement relié à la composition en AG des fourrages et des concentrés
consommés, ainsi qu’aux interactions entre les différents constituants de la ration.
2.2 Caractéristiques de l’acide -linolénique
2.2.1 Structure chimique et sources alimentaires
L’acide -linolénique est un AGPI dont la chaîne carbonée contient 18 atomes de
carbone avec trois doubles liaisons de configuration cis. Par biotransformation dans
l’organisme animal, l’acide -linolénique donne une quantité modérée d’Acide
éicosapentaénoïque (AEP; 20:5 cis-5, cis-8, cis-11, cis-14, cis-17), qui a son tour est
transformé, mais en des quantités plus faibles, en Acide docosapentaénoïque (ADP; 22:5
cis-7, cis-10, cis-13, cis-16, cis-19), puis en Acide docosahexaénoïque (ADH; 22:6 cis-4,
cis-7, cis-10, cis-13, cis-16, cis-19) (Lecerf 2008) (Figure 2.1).
L’acide -linolénique est un AG essentiel qui compose les membranes
thylacoïdales des feuilles vertes. Il constitue entre 55 et 65 % des AG de l’herbe et 17 %
des AG du foin (Bauchart et al. 1985; Harfoot et Hazlewood 1988; Doreau et Poncet 2000).
Certaines graines, et par la suite les huiles tirées de ces graines, sont riches en acide linolénique et en particulier le colza, le soja et spécialement le lin, où il représente de 54 à
57 % des AG totaux (Palmquist et Jenkins 1980; Morand-Fehr et Tran 2001).
8
Acide Octadécatriénoïque
(Acide -linolénique)
18:3 cis-9, cis-12, cis-15
↓ ∆6-désaturase
Acide Octadécatétraénoïque
18:4 cis-6, cis-9, cis-12, cis-15
↓ Élongase
Acide Éicosatétraénoïque
20:4 cis-8, cis-11, cis-14, cis-17
Acide Éicosapentaénoïque
(AEP)
20:5 cis-5, cis-8, cis-11, cis-14, cis-17
↓ Élongase
Acide Docosapentaénoïque
(ADP)
↓ Élongase
Acide Tétracosapentaénoïque
Acide Tétracosahexaénoïque
24:6 cis-6, cis-9, cis-12, cis-15, cis-18, cis-21
↓ β-oxydation
Acide Docosahexaénoïque
(ADH)
22:6 cis-4, cis-7, cis-10, cis-13, cis-16, cis-19
Figure 2.1: Conversion de l'acide -linolénique en acides gras
polyinsaturés à longue chaîne (Adaptée de Williams, 2000)
9
2.2.2 Bénéfices sur la santé humaine
Les AG indispensables chez l’humain se limitent à trois: l’acide linoléique (18:2
cis-9, cis-12), l’acide -linolénique et un de ses dérivés, l’ADH (Legrand, 2010) (Tableau
2.1). Un déséquilibre entre les deux familles d’AGPI (les oméga-6 et les oméga-3) est
préjudiciable à la synthèse et à la disponibilité des AEP et ADH et à leur incorporation dans
les tissus. Ce déséquilibre pourrait accentuer des perturbations physiologiques et contribuer
à l’apparition de pathologies telles que les affections neuropsychiatriques, les maladies
cardiovasculaires, les pathologies inflammatoires, le diabète et l’obésité (Legrand, 2010).
La dose journalière bénéfique en acide -linolénique a été fixée à 2,0 g/j chez
l’homme adulte et de 1,6 g/j chez la femme adulte (Agence française de sécurité sanitaire
des aliments, 2003).
Tableau 2.1: Besoin en acides gras polyinsaturés pour un adulte consommant 2000
kcal/jour (en pourcentage des apports énergétiques) (Adapté de
Legrand, 2010)
Lipides totaux
Acides gras
indispensables
Acides gras
non
indispensables
10
Acide linoléique
(18:2 cis-9, cis-12)
Acide -linolénique
(18:3 cis-9, cis-12, cis-15)
Acide docosahexaénoïque
(22:6 cis-4, cis-7, cis-10, cis-13, cis-16, cis-19)
Acide éicosapentaénoïque
(20:5 cis-5, cis-8, cis-11, cis-14, cis-17)
Acide laurique (12:0)
+ Acide myristique (14:0)
+ Acide palmitique (16:0)
Acides gras saturés totaux
Acide oléique
(18:1 cis-9)
Autres acides gras non indispensables
Besoin journalier
(35-40%)
4%
1%
250 mg
250 mg
≤8%
≤ 12 %
15 – 20 %
-
Selon Klein et al. (2000), il y a une relation inverse entre l’incidence du cancer et le
profil des AG dans le tissu adipeux du sein. En effet, la concentration en acide linolénique dans le tissu adipeux du sein est inversement proportionnelle à la présence de
tumeurs cancéreuses. L’acide -linolénique est aussi capable de prévenir le développement
du diabète induit chimiquement chez l’animal (Suresh et Das, 2003).
Certains isomères conjugués de l’acide -linolénique comme l’acide punicique
(18:3 cis-9, trans-11, cis-13) sont présents naturellement dans les graines de certaines
plantes (Pereira de Melo et al. 2014) et ont un effet important contre la leucémie (Suzuki et
al, 2001) et contre le cancer du côlon (Kohno et al. 2004). Ces isomères sont toutefois
différents de ceux présents dans le lait bovin tels que le 18:3 cis-9, trans-11, cis-15 et le
18:3 trans-9, trans-11, cis-15 (Kohno et al. 2004).
Plusieurs études ont montré les effets de l’acide α-linolénique dans la prévention
des maladies cardiovasculaires. Les acides oméga-3 en général et l’AEP plus
spécifiquement exercent un effet hypotriglycéridémiant quel que soit le niveau des
triglycérides dans le sang (De Lorgeril et Salen, 2004). La consommation d’un breuvage
laitier enrichi en AEP et ADH abaisse significativement les concentrations sanguines en
cholestérol total et en cholestérol-LDL (lipoprotéines de faible densité), ayant ainsi un effet
protecteur contre le risque de maladies cardiovasculaires (Baró et al. 2003). Presque la
totalité des études sur la consommation d’aliments riches en AGPI oméga-3 tels que les
poissons montrent une réduction des maladies cardiovasculaires, et coronariennes, et de la
mortalité par cardiopathie ischémique (Lecerf, 2004). Cette réduction est beaucoup plus
importante quand l’apport provient de l’acide -linolénique (Mozafarian et al. 2005)
malgré son faible taux de conversion vers les AG oméga-3 à plus longue chaîne (Pawlosky
et al. 2001).
D’autres études ont également montré une association entre l’apport d’AGPI
oméga-3 (Albert et al. 1998, 2002) et des acides -linolénique (Albert et al. 2005) et la
11
diminution du risque de mort subite. Un effet antihypertenseur de l’acide -linolénique a
aussi été documenté (Lecerf, 2008).
L’ADH présente quant à lui des propriétés antidépressives (Sublette et al. 2006) et a
un rôle primordial dans le développement neuronal chez le fœtus et le nouveau-né
(Williams, 2000). Certaines maladies neurodégénératives telles que le Parkinson et
l’Alzheimer sont associées à une perte d’AGPI dans les membranes des cellules cérébrales.
Ainsi un régime riche en AG oméga-3 sans excès d’AG oméga-6 pourrait retarder le
développement de ces maladies (Youdim et al. 2000).
2.2.3 Biohydrogénation ruminale de l’acide -linolénique
Dans l’estomac des ruminants, les matières grasses des rations ingérées subissent
deux processus majeurs: l’hydrolyse des lipides complexes aussi appelée lipolyse, et la
biohydrogénation des AG insaturés. L’hydrolyse a pour effet de libérer les AG,
principalement de leur lien avec le glycérol. Après cette réaction, les AG libérés et insaturés
subissent une biohydrogénation conduisant à la saturation totale ou partielle de leur(s)
double(s) liaison(s).
Dans des conditions normales, la biohydrogénation de l’acide -linolénique débute
par une isomérisation de la double liaison cis-12 en double liaison trans-11. Cette première
étape aboutit à la formation du 18:3 cis-9, trans-11, cis-15 (Kepler et Tove, 1967).
S’ensuivent des étapes de réduction des doubles liaisons cis-9 puis cis-15 qui conduisent à
la formation de l’acide vaccénique, le 18:1 trans-11. À son tour le 18:1 trans-11 subit une
dernière réduction pour former l’acide stéarique, le 18:0. Les AG intermédiaires formés au
cours du métabolisme ruminal sont absorbés et passent dans le sang puis dans le tissu
mammaire où sous l’action de la ∆9-désaturase, le 18:1 trans-11 et le 18:0 sont transformés
respectivement en 18:2 cis-9, trans-11 et 18:1 cis-9 (Griinari et al. 2000). Destaillats et al.
(2005) ont également proposé un schéma alternatif de la biohydrogénation et du
métabolisme endogène de l’acide -linolénique où la double liaison cis-12 est initialement
12
isomérisée en double liaison trans-13 pour donner le 18:3 cis-9, trans-13, cis-15 qui, à son
tour, va être réduit pour donner le 18:2 cis-9, trans-13 ou le 18:2 trans-13, cis-15 (Figure
2.2).
Selon plusieurs essais, la biohydrogénation de l’acide α-linolénique est presque
complète tandis que celle de l’acide linoléique est comprise entre 60 et 95% (Akraim et al.
2007). Malgré cette biohydrogénation intense qui a lieu normalement dans le réticulorumen, la teneur de la ration en AGPI a une certaine influence sur la composition en AGPI
des lipides du plasma chez les vaches (Akraim et al. 2007). Cela peut être dû à une
biohydrogénation ruminale incomplète, une partie des AGPI échappe à ce phénomène et
serait absorbée par l’intestin. Ainsi, une ration riche en AGPI entraine une augmentation de
la quantité de ces acides qui parviennent au niveau du duodénum et une augmentation de
leur taux plasmatiques. Il en résulte un enrichissement des produits dérivés tels que le lait et
la viande de tous les AG produits par ces voies métaboliques (Ledoux, 2006).
13
Acide α-linolénique
18:3 cis-9, cis-12, cis-15
Isomérisation
18:3 cis-9, trans-11, cis-15
18:3 cis-9, trans-13, cis-15
Réduction
18:2 trans-11, cis-15
18:2 cis-9, trans13
18:2 trans-13, cis-15
Réduction
18:1 trans-11
Biohydrogénation
ruminale
18:1 trans-11
Métabolisme
endogène
Réduction
18:1 trans-13
18:0
18:0
18:1 trans-13
∆9-Désaturase
18:2 cis-9, trans-11
18:1 cis-9
18:2 cis-9, trans-13
Figure 2.2: Biohydrogénation ruminale et métabolisme endogène de l'acide αlinolénique (Adaptée de Destaillats et al. 2005)
14
2.2.3.1 Effets des sources d’acide -linolénique sur les performances
zootechniques chez la vache laitière
L’incorporation de lin dans les rations a un double objectif; diminuer la teneur en
matières grasses (dans les marchés où le mode de paiement favorise la production d’un lait
moins gras) et modifier la composition en AG dans le lait. Les supplémentations en graines
et produits oléagineux ont aussi des effets importants sur les performances zootechniques
des vaches laitières.
Selon Chilliard (1993), les graines et produits oléagineux peuvent diminuer
l’ingestion due à une réduction de la digestibilité des nutriments dans le rumen
spécialement lorsque cette supplémentation est sous forme d’huile avec un taux supérieur à
5 % de la matière sèche. Cette diminution d’ingestion peut affecter le poids vif de l’animal,
notamment en début de lactation. Shingfield et al. (2010) ont montré que les AG,
notamment les polyinsaturés, pourraient aussi avoir des effets post-absorptifs ce qui
explique dans certains cas la diminution d’ingestion observée.
Plusieurs études ont montré des résultats contradictoires reliés aux effets de l’huile
de lin sur la production laitière. Chilliard et Ferlay (2004) indiquent que l’apport de l’huile
de lin augmente la production laitière tandis que Brunschwig et al. (2010) estiment que
l’huile de lin n’a pas d’effet sur ce paramètre.
L’ajout du lin dans les rations réduit les émissions de méthane. Une réduction de
64 % a été observée en supplémentant l’huile de lin au taux de 5 % dans une ration à base
d’ensilage de maïs (Martin et al. 2008). Avec de la graine de lin extrudée apportée au taux
de 5, 10 et 15 % de la matière sèche, les réductions de production de méthane étaient
proportionnelles aux quantités ajoutées, soit respectivement -10, -16 et -41 %. (Martin et al.
2009). Ces réductions semblent se maintenir après 18 mois de supplémentation continue en
graines de lin extrudées (Martin et al. 2010).
15
Des résultats contradictoires concernant l’effet de l’huile de lin sur les performances
reproductives ont été présentés: Petit et al. (2001; 2002) ont montré que l’ajout de graines
de lin dans la ration réduit la sécrétion de prostaglandine F2α et augmente la taille du corps
jaune et le taux de conception. La concentration en progestérone dans le sang a tendance à
être plus élevée pour les vaches recevant des graines de lin notamment du jour 17 au jour
21 du cycle ovarien (Petit et Twagiramungu, 2006) ce qui peut améliorer la fertilité (Moris
et Diskin, 2008).
Selon Lessard et al. (2003), la supplémentation d’AG de type oméga-3 contribue à
améliorer la reproduction en diminuant la prolifération des cellules mononucléaires initiées
lors de l’implantation des embryons chez les vaches laitières ce qui diminue la mortalité
embryonnaire (Petit et Twagiramungu 2006). Cependant, l’ajout de lipides cristallisés
(Carroll et al. 1990), de sels de calcium d’AGPI (Scott et al. 1995) ou de graines
oléagineuses (Schingoethe et Casper, 1991) n’a pas eu d’effet sur les performances
reproductives des vaches laitières et l’ajout de sels de calcium d’AGPI dans l’expérience
réalisée par Sklan et al. (1994) a même diminué la fécondité des vaches.
2.2.3.2 Effet de l’ajout de l’huile de lin sur le profil en acides gras
L’ajout de lin dans les rations entraîne une baisse des AG courts et moyens, de 4 à
16 atomes de carbone, et une augmentation des AG longs à 18 atomes de carbone de la
matière grasse du lait (Brunschwig et al. 2010). La teneur du lait en 18:0 est généralement
aussi augmentée provenant de la biohydrogénation complète du 18:1 cis-9, de l’acide
linoléique et de l’acide -linolénique. C’est le même cas pour le 18:1 cis-9 et le 18:2 cis-9,
trans-11 provenant respectivement de l’action de la ∆9-désaturase mammaire sur le 18:0 et
le 18:1 trans-11 (Glasser et al. 2008, Bernard et al. 2008).
16
Les AG oméga-6 et oméga-3 présents dans le lait proviennent uniquement des
quantités ingérées puisqu’ils ne peuvent pas être synthétisés par les ruminants (Chilliard et
al. 2007). Enfin, l’apport de l’acide -linolénique augmente les 18:1 (cis-15 et trans-13 à
trans-16), les 18:2 (cis-9, trans-12; cis-9, trans-13 et trans-11, cis-15), et les acides
linoléiques conjugués (cis-11, trans-13; cis-12, trans-14; trans-11, cis-13; trans-12, cis-14;
trans-9, trans-11; trans11, trans-13 et trans-12, trans-14) (Chilliard et al. 2007). L’apport
de lin permet aussi d’augmenter la teneur du lait en 18:3 cis-9, trans-11, cis-15 chez la
vache laitière (Akraim et al. 2007, Rego et al. 2009).
2.2.3.3
Interaction
de
l’acide
-linolénique
avec
différents
rapport
fourrages:concentrés
Plusieurs facteurs affectent le processus de biohydrogénation dont le pH ruminal, le
type de fourrage, le pourcentage de concentrés ainsi que beaucoup d’autres facteurs. L’effet
de ces facteurs est complexe car il dépend de la nature de l’AG, ainsi que des interactions
de cet AG avec les autres composants de la ration.
Une étude effectuée par Loor et al. (2004) a montré que pour un même pH ruminal
(6,38 ± 0,12), l’ajout d’huile de lin à des rations avec un rapport F:C faible (35:65) ou élevé
(65:35) conduit à une diminution de la biohydrogénation des AGPI. Les acides gras de 4
atomes de carbones à 16 atomes de carbones, ainsi que les 18:0, 18:1 cis-9, 18:1 trans-11 et
18:2 cis-9, trans-11 ont augmenté de manière plus importante avec une ration pauvre en
concentrés supplémentée en huile de lin tandis que le 18:1 trans-10 et l’acide -linolénique
ont eu tendance à moins augmenter qu’avec une ration riche en concentrés (Loor et al.
2005). Ces résultats indiquent une déviation des voies de biohydrogénation vers le 18:1
trans-10 aux dépens du 18:1 trans-11 (Griinari et Bauman, 1999) dans le cas de
supplémentations en oléagineux de rations riches en amidon (Chilliard et al. 2007,
Shingfield et al. 2010).
17
Le type de fourrage peut aussi affecter le processus de biohydrogénation.
Brunschwig et al. (2010) ont montré que le rapport trans10/trans11 des isomères du 18:1
augmente plus fortement avec un supplément de lin dans une ration à base d’ensilage de
maïs qu’une ration à base de foin. Les teneurs du lait en acide linoléique, en acide linolénique et en AG trans ont augmenté de manière plus importante lors d’un apport
d’huile de lin dans un régime à base d’ensilage de maïs, en comparaison avec un régime à
base d’ensilage d’herbe. Par contre, les augmentations des teneurs en 18:0 et en 18:1 cis-9
ont été plus marquées dans les matières grasses du lait dans le cas de l’ensilage d’herbe
(Chilliard et al. 2007).
18
2.3 Les lactones
2.3.1 Nature et composition
Les lactones sont des molécules présentes dans une grande variété d’aliments et de
boissons. Les γ- et δ-lactones sont les plus abondantes. Elles sont reconnues pour leur
contribution à la saveur unique du beurre qui contient 26 lactones différentes dont 15 γlactones et 11 δ-lactones (Urbach, 1990; Dufossé et al. 1994). Elles sont présentes dans
certains fruits comme l’abricot, la fraise, la papaye, la pêche, la mangue, la nectarine et le
fruit de la passion (Dufossé et al.1994) ainsi que dans plusieurs boissons comme le thé, le
café et le vin (Maga, 1976). Les lactones sont des esters particuliers contenant un cycle bioxygéné qui se synthétisent dans le rumen et les tissus des animaux (Dufossé et al. 1994;
Walker et al. 1968; Joblin et Hudson, 1997).
Selon la taille de leur hétérocycle, différentes formes de lactones ont été identifiées
dans le lait bovin. Le nombre d’atomes de carbone pour les lactones volatiles est compris
entre 4 (butyrolactone) et 12 (dodécalactone) (Dufossé et al. 1994). Les γ-lactones ont un
pouvoir aromatisant plus élevé que les δ-lactones (Engel et al. 1988) et leur pourcentage
dans les aliments s’élève à 63% contre seulement 23% pour les δ-lactones (Dufossé et al.
1994). Par contre ces dernières sont plus abondantes dans le lait bovin (Hettinga, 2005).
2.3.2 Voies de synthèse des lactones du lait
Les précurseurs des δ- et γ-lactones sont les AG hydroxylés et plus spécifiquement
les 5- et 4-hydroxy acides respectivement (Singh et al. 2003). Ces AG hydroxylés peuvent
avoir plusieurs origines: ils peuvent être présents sous forme de triglycérides dans le lait
(Urbach et al. 1972), peuvent provenir du catabolisme normal des AG ou être générés à
partir des AG insaturés par l'action des lipoxygénases ou des hydratases (Dufossé et al.
19
1994) et peuvent être libérés par hydrolyse lors du traitement thermique du lait (Dimick et
al. 1969).
Selon Urbach et Stark (1978) « le potentiel lactone » est défini par la quantité
de lactones libérées après chauffage de la matière grasse à 180°C en présence d’eau et
absence d’air. Après ce traitement thermique, les acides hydroxylés estérifiés au glycérol
seront hydrolysés pour donner les acides hydroxylés libres, qui à leur tour seront
spontanément lactonisés (Mattick et al. 1959).
Les hydroxy-acides libres provenant des AG à longues chaines seront raccourcis par
3 cycles de ß-oxydation. Les acides hydroxylés en position 4 et 5 se cyclisent
respectivement sous forme de γ- et δ-lactones (Joblin et Hudson, 1997).
Les acides oléique et linoléique sont les précurseurs des lactones γ-12:0 et γ-12:1,
via la production des acides 10-hydroxy-stéarique et 10-hydroxy-oléique, respectivement
(Urbach, 1990) (Figure 2.3).
20
Acide oléique
Acide linolénique
CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH
CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7-COOH
+ H2O
Acide 10-hydroxy-stéarique
Acide 10-hydroxy-oléique
CH3-(CH2)7-CH-CH (CH2)7-COOH
CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH-CH-(CH2)7-COOH
OH H
OH H
3 cycles de ß-oxydation
Lactonisation
γ-12:0
γ-12:1
CH3-(CH2)7-CH-(CH2)2-CO
O
H
OH
CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH-(CH2)2–CO
O
OH
H
Figure 2.3: Mécanisme de formation des lactones γ-12:0 et γ-12:1 pendant la lactation (Urbach, 1990)
21
2.3.3 Propriétés sensorielles des lactones
Les lactones sont des contributrices importantes à la saveur et à l'arôme du lait et
des produits laitiers. Elles se caractérisent généralement par une odeur à caractère fruité et
de framboise (Urbach et Stark, 1978).
Selon Dufossé et al. (1994), les caractéristiques aromatiques des lactones sont
influencées par de nombreux facteurs:
-La longueur de la chaîne latérale: l’allongement de la chaîne latérale est capable de
modifier les propriétés organoleptiques des γ-lactones sans avoir une influence remarquable
sur les δ-lactones. On passe d’un arome doux herbacé pour la γ-pentalactone (γ-5:0) à une
odeur forte, fruitée, ou de pêche pour la γ-undécalactone (γ-11:0).
-La position de la double liaison: Nobuhara, en 1969, a étudié l’effet de la position
de la double liaison sur les perceptions sensorielles des δ-lactones synthétisées. La δlactone à 10 atomes de carbone sans double liaison était décrite par les attributs crémeux,
doux, de noix de coco, de pêche ou de lait. À l’inverse, la δ-lactone à 10 atomes de carbone
avec une double liaison en position 6 était qualifiée de rance.
-La présence de substituant sur le cycle ou sur la chaîne: La δ-nonalactone (δ-9:0)
était décrite comme huileuse, de chèvre et chimique avec l’addition d’un groupement
méthyle en position 3 contre les attributs de beurre, de lait et crémeux en absence de ce
groupement.
-La chiralité: Elle joue un rôle dans l’intensité de l’odeur. Les formes R sont
responsables d’odeurs plus intenses que leurs homologues de la forme S chez les δ et les γlactones.
22
Tableau 2.2: Propriétés sensorielles des γ- et δ-lactones (Adapté de Dufossé et al. 1994 et Bendall, 2001)
Nom
Formule
Arôme
δ-hexalactone
δ-6:0
Fruité, avoine
δ-octalactone
δ-8:0
Noix de coco, foin, animal
δ-nonalactone
δ-9:0
Crème, lait, huile, beurre
δ-décalactone
δ-10:0
Fruité, pêche, noix de coco
δ-undécalactone
δ-11:0
Crème, gras, pêche
δ-dodécalactone
δ-12:0
Fruité, poire, pêche
δ-tétradécalactone
δ-14:0
Foin sec
γ-butyrolactone
γ-4:0
Beurre, caoutchouc
γ-pentalactone
γ-5:0
Herbacé, grasse, noix de coco
γ-hexalactone
γ-6:0
Herbacé, caramel
γ-heptalactone
γ-7:0
Herbacé, caramel, noisette
γ-octalactone
γ-8:0
Fruité, Noix de coco
γ-nonalactone
γ-9:0
Noix de coco, anis, réglisse, amande
γ-décalactone
γ-10:0
Laiteux
γ-undécalactone
γ-11:0
Pêche, âcre, terreux
γ-dodécalactone
γ-12:0
Pêche, musqué, floral
γ-dodécaenolactone
γ-12:1
Sucre brûlé, fruité
γ-dodec-cis-6,cis-9-dienolactone
γ-12:2
Muesli avec du miel, poudre de bébé
γ-tétradécalactone
γ-14:0
Lait chaud
23
Selon Siek et al. (1971), les seuils de perception « en bouche » des lactones sont
plus bas dans l’eau que dans l’huile. En présence de matière grasse, les seuils olfactifs de
perception sont considérablement augmentés (Guyot et al.1996). Les lactones à longue
chaîne sont relativement hydrophobes, ainsi elles sont largement retenues par la matière
grasse (Siek et al. 1971).
À poids moléculaire égal, les seuils de détection des γ-lactones sont plus bas que
ceux des δ-lactones. Dans l’eau par exemple, les seuils de perception de la γ-octalactone (γ8:0) et de la γ-décalactone (γ-10:0) sont respectivement 50 et 9 fois plus faibles que ceux de
la δ-octalactone (δ-8:0) et de la δ-décalactone (δ-10:0). Finalement, les seuils olfactifs des
γ-lactones s’élèvent avec le raccourcissement de la chaine latérale (Engel et al. 1988).
2.3.3.1 Effet de l’alimentation des vaches laitières sur les qualités sensorielles
des produits laitiers
L’alimentation, tel qu’il a été mentionné précédemment, agit d’une façon marquée
sur les composés majeurs du lait. Elle influe sur la composition chimique du lait, soit par le
transfert direct des composés de la ration, soit par la modification du métabolisme des
vaches (Urbach, 1990). Par exemple, des ensilages de mauvaise qualité ou divers produits
végétaux (oignon, ail, crucifères) produisent des goûts indésirables dans les produits laitiers
(Urbach, 1990).
Le pâturage joue également un rôle primordial sur la flaveur du lait. Les herbes
broutées contiennent des marqueurs tels que les terpènes, les caroténoïdes et les
polyphénols (Cornu et al. 2009) qui sont transférés dans les sécrétions lactées. En évaluant
les qualités sensorielles, Dubroeucq et al. (2002) ont montré une différence significative
entre le lait provenant de vaches mises au pâturage et le lait provenant de vaches alimentées
d’une ration riche en concentrés. Dans le même ordre d’idée, Drake et al. (2005) ont signalé
que le fromage Cheddar provenant de la Nouvelle-Zélande avait un goût herbeux en
24
comparaison à celui des États-Unis et de l’Irlande. Ils ont estimé que cette différence
pouvait être due aux systèmes de pâturage utilisés en Nouvelle-Zélande.
La teneur totale en lactones de la matière grasse du lait comprenant principalement
des δ-lactones est également influencée par la ration de base des vaches laitières. Dans une
étude portant sur 276 animaux, le lait provenant des vaches au pâturage avait une teneur
totale en lactones inférieure à celui provenant des vaches alimentées de ration
conventionnelle à base de fourrages conservés et de grains (Dimick et Harner, 1968).
Urbach et Starck (1978) ont quant à eux effectué une étude approfondie sur les
effets de différents régimes alimentaires sur les niveaux de lactones dans le lait. En ajoutant
à la ration de l’huile de tournesol, le niveau des AGPI augmentait dans la matière grasse
laitière. Le lait provenant des animaux nourris de ce régime a été caractérisé par une saveur
sucrée et de framboise.
Bendall (2001) a comparé le profil aromatique de deux types de lait provenant de
vaches laitières alimentées par différents types de régimes. Seule la γ-12:2 était présente
dans le lait provenant des vaches alimentées par une ration totale mixte et absente chez les
vaches au pâturage. Tous les autres composés étaient présents dans les deux types de lait
avec différents niveaux de détection. Malgré cette similarité de composés volatils, il y avait
une grande différence de flaveur entre les deux échantillons de lait. Bendall (2001) a
suggéré que cette différence de flaveur était due à des concentrations différentes d’un
ensemble commun de composés aromatiques plutôt qu’à un composé associé uniquement à
un type de ration particulière.
Selon Urbach (1990), pour parvenir à augmenter le niveau de la γ-12:0 dans le lait,
il faut une source d’amidon facilement disponible ainsi qu’une source d’AG précurseurs: de
l’acide oléique pour la γ-12:0 et de l’acide linoléique pour la γ-12:1.
25
2.3.4 Méthodes d’extraction et d’identification des lactones
2.3.4.1 Méthodes d’extraction
Au fil des années, des équipes de recherche ont fait de grands efforts pour
développer des méthodes fiables et efficaces pour extraire les composés volatils à partir de
plusieurs types de substrats. Diverses méthodes d'extraction existent. Chacune de ces
techniques a ses avantages et ses inconvénients.
Les composés volatils dans les produits laitiers sont distribués d’une façon très
hétérogène et se trouvent à l’état de traces (Mariaca & Bosset, 1997). Afin de pouvoir
détecter les changements des profils aromatiques, des méthodes d'analyse très sophistiquées
sont appliquées en plus des tests sensoriels (Imhof & Bosset, 1994). D’un autre côté, il est
très important que les techniques d’extraction utilisées ne créent ni n’introduisent de
composés volatils contaminants (Marsili, 2000).
Plusieurs méthodes d’extractions des composés volatils des produits laitiers ont été
développées telles que: la distillation à la vapeur (en anglais: steam distillation),
l’extraction à l’aide d’un solvant (en anglais: solvent extraction), la distillation-extraction
simultanée (en anglais: simultaneous distillation-extraction), l’évaporation de flaveurs
assistée par solvant (en anglais: solvent-assisted flavor evaporation), l’analyse statique et
dynamique d’espace de tête ou d’effluve (en anglais: headspace) et la microextraction en
phase solide (en anglais: solid-phase microextraction).
Le choix d'une technique dépend de plusieurs facteurs, notamment du nombre
d'échantillons à tester, du type de l’échantillon, des limites de détection souhaitées et de la
précision requise (Marsili, 2000).
26
-La distillation à la vapeur est l’une des plus anciennes techniques utilisées pour
séparer les composés volatils à partir de la matière non volatile. Malgré la rapidité et la
simplicité de cette méthode, la température élevée appliquée durant la distillation peut
conduire à la formation d’artefact (Reineccius, 2006).
-La méthode d’extraction à l’aide d’un solvant utilise le plus couramment l’éther diéthylique bien qu’il ait été montré qu’il est moins efficace que d’autres solvants (Alewijn et
al. 2003). Prosoki et al. (2007) ont montré que l’éther di-éthylique est capable de récupérer
seulement 35 composés de la poudre de lactosérum comparativement à 37 et 42 composés
récupérés en utilisant respectivement le formiate de méthyle et le chlorure de méthylène.
Selon Alewijn et al. (2003), l’acétonitrile est capable de dissoudre la quasi-totalité des
composés dérivés de lipides et ainsi est considéré comme un solvant de qualité pour
l’extraction des composés volatils des fromages. Cependant, sa toxicité le rend dangereux à
manipuler et à utiliser en chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie.
Malgré ces résultats, l’éther di-éthylique est utilisé dans de nombreuses recherches
concernant les saveurs des produits laitiers (Drake et al. 2010).
-La méthode de distillation et extraction simultanée de Nickerson et Likens (1966)
permet, tel que son nom l’indique, une distillation et une extraction simultanées à l’aide
d’un solvant (Chaintreau, 2001). Elle consiste à chauffer séparément le solvant et
l’échantillon mélangé avec de l’eau. Les vapeurs obtenues se mélangent et se condensent
ensuite selon leur densité (Mariaca et Bosset, 1997). La température élevée utilisée lors de
l’extraction peut conduire à la formation d’artefacts (Majcher et Jelen, 2009). Pour éviter ce
problème, Maignial et al. (1992) cité par Mariaca et Bosset (1997) ont proposé un système
de travail sous une pression réduite et une basse température (20 à 40°C).
-La méthode d’analyse d’espace de tête est simple et rapide. Elle implique
l’établissement d’un équilibre entre l’échantillon et la phase gazeuse, puis l’injection des
molécules présentes dans l’espace de tête dans un chromatographe en phase gazeuse
(Friedrich et Acree, 1998). Cette technique présente plusieurs avantages. Il est possible
d’analyser des molécules de faible poids moléculaire sans la présence d'un solvant. Elle
peut être aussi automatisée (Wampler, 2001). Cependant, elle est limitée par le niveau
auquel les composés volatils sont présents. Pour que ces derniers soient détectés par la
27
chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, ils doivent avoir
une concentration égale ou supérieure à 10-5 g/L. Or la concentration des composés volatils
dans un aliment varie entre 10-11 et 10-4 g/L. Par conséquent, seuls les produits abondants
seront détectés (Friedrich et Acree, 1998).
- La méthode d’évaporation de flaveurs assistée par solvants permet l’extraction de
composés volatils à partir de liquides (lait, bière, etc.) et de suspensions aqueuses
d’aliments (pulpes de fruits etc.) ou de matrices très huileuses (Engel et al. 1999). Par
comparaison avec d’autres techniques d’extraction, la méthode d’évaporation de flaveurs
assistée par solvants peut donner des rendements plus élevés en substances volatiles et
aromatiques polaires. Elle permet la quantification et la récupération de composés volatils
polaires et labiles se trouvant sous forme de traces dans des échantillons complexes (Engel
et al. 1999).
- La microextraction en phase solide a été développée par le professeur Janusz
Pawliszyn de l’Université de Waterloo au début des années 90 comme méthode de
préparation des échantillons pour l'analyse chromatographique sans utilisation de solvants
(Arthur et Pawliszyn, 1990; Zhang et al. 1994). Le principe de cette technique consiste à
exposer un échantillon (liquide ou gazeux) à une petite fibre de silice fondue recouverte
d’une phase solide appropriée au produit à analyser (Quach et al. 1999). Si l’échantillon est
formé de liquides complexes, la fibre sera exposée à l’espace de tête afin d’éviter son
endommagement. Ainsi, elle adsorbera les composés d’intérêts dans la phase gazeuse située
au-dessus de la matrice liquide ou solide (Lee et al. 2003).
28
Tel que montré au Tableau 2.3, plusieurs types de fibres existent selon les caractéristiques des composés à extraire. Elles
différent par la nature de la phase polymérique qui les enveloppe (Falcó & Moya, 2007).
Tableau 2.3: Type de fibre utilisée en microextraction en phase solide (Adapté de Falcó & Moya, 2007)
Type de revêtement
Polydiméthylsiloxane
Polyacrylate
Épaisseur du revêtement
Température maximale (°C)
(µm)
Fibres non polaires
100
280
30
280
7
340
Fibres polaires
85
320
Application
Composés non polaires
Composés polaires
Carbowax-divinylbenzene
65
265
Composés organiques polaires
Résine Carbowax matricée
50
--
Agent tensio-actif anionique
Fibres bipolaires
Polydiméthylsiloxanedivinylbenzene (PDMS-DVB)
60
--
Hydrocarbures aromatiques,
solvants, etc.
CarboxenPolydiméthylsiloxane
75
320
Hydrocarbures et composés
organiques volatils
Divinylbenzene-CarboxenPolydiméthylsiloxane
30
55
300
--
29
Les composés volatils ainsi concentrés sur la fibre seront désorbés dans l’injecteur
d’un chromatographe en phase gazeuse couplé à un détecteur spécifique. Une
combinaison de la microextraction en phase solide et de la chromatographie en phase
gazeuse couplée à la spectrométrie de masse a été utilisée pour caractériser la saveur du
lait et du fromage (Chin et al. 1996; Marsili, 1999).
Selon Marsili (2000) et Marshall (2003), la méthode d’extraction par
microextraction en phase solide présente plusieurs avantages qui soutiennent son
utilisation:
-
Elle permet d’analyser des échantillons de tailles variables;
-
Ses limites de détection sont très basses;
-
Elle peut être automatisée;
-
Le temps de préparation de l’échantillon est court;
-
Le matériel requis n’est pas coûteux;
-
Sa précision par comparaison avec d’autres techniques d’échantillonnage
est plus élevée;
-
Elle ne requiert pas l’utilisation de solvant.
2.3.4.2 Méthodes d’identification
Plusieurs méthodes d'analyses ont été utilisées pour identifier les arômes des
produits laitiers. La chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie et la
chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse sont les plus
couramment utilisées.
30
2.3.4.2.1 La chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie
La chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie est une méthode
qui est utilisée pour détecter et caractériser les arômes obtenues par la séparation des
composés volatils à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse (Friedrich et Acree,
1998).
Elle consiste à injecter l’échantillon à analyser dans un chromatographe en phase
gazeuse muni d’un détecteur olfactomètre. Le renifleur ou la personne détectrice
enregistrera par un mot ou groupe de mots ce qu’il sent du flux d’air humide à la sortie de
l’olfactomètre (Friedrich et Acree, 1998). Pour de meilleurs résultats, les renifleurs
recrutés doivent être entrainés par la détection de standards pour au moins une courte
période (Friedrich et Acree, 1998).
La chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie peut être utilisée
en tant que méthode uniquement descriptive mais peut également fournir des
informations sur l'impact olfactif des constituants lorsqu'on suit une méthodologie
adaptée (Van Ruth, 2001; Zellner et al. 2008). Ces méthodologies sont généralement
divisées en quatre catégories: la méthode de dilution, la méthode de fréquence de
détection, la méthode temps-intensité et la méthode d’intensité postérieure (Van Ruth,
2001; Zellner et al. 2008).
-La méthode de dilution: C’est la méthode la plus appliquée. Elle est basée sur des
dilutions successives d'un extrait d'arôme jusqu'au point où l’odeur n’est plus perçue par
les renifleurs (Zellner et al. 2008).
-La méthode de fréquence de détection: Le nombre des renifleurs capable de
détecter l’odeur est utilisé comme une estimation de l’intensité de l’odeur (Van Ruth,
2001).
31
- La méthode temps-intensité: Elle est basée sur l'enregistrement immédiat de
l'intensité perçue en même temps que l’élution de son pic chromatographique (Van Ruth,
2001; Zellner et al. 2008).
- La méthode d’intensité postérieure: Elle est basée sur la mesure de l’intensité de
l’odeur d’un composé après l’élution de son pic chromatographique (Van Ruth, 2001).
Le choix de la méthode dépend des informations que l'on souhaite obtenir mais
également des ressources, surtout humaines, dont le laboratoire dispose (Zellner et al.
2008). Certaines méthodologies nécessitent un panel d'évaluateurs de huit à douze
personnes (la méthode de fréquence de détection) alors que pour d'autres (la méthode de
dilution) deux peuvent suffire (Zellner et al. 2008).
La chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie a été utilisée dans
l’analyse des produits laitiers depuis 1993 (Friedrich et Acree, 1998). Dans son étude,
Bendall (2001) a utilisé cette méthode pour identifier la différence entre deux types de
lait. Le panel, consistant de 4 femmes et 6 hommes, était capable de reconnaître 71
composés aromatiques dont 66 ont été identifiés. Bendall s’est basé sur la méthode de
fréquence de détection nasale (en anglais: Nasal Impact Frequency) pour montrer la
différence entre les deux types de lait.
L’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse couplée à l’olfactométrie
requiert beaucoup de concentration. L’élution rapide des composés aromatiques peut être
problématique pour les renifleurs afin de trouver le mot qui décrit mieux l’odeur sentie
(Naudé et al. 2009). Un panel formé de huit renifleurs ou plus peut causer des difficultés
et des problèmes lors de l’analyse statistique des résultats obtenus (obtention d’un
aromagramme) ainsi que dans les conditions de travail (Berdagué et al. 2007). Pour
pallier à cet inconvénient, des olfactomètres avec ports multiples ont été développés. Ce
système permet la distribution uniforme des composants volatils séparés par
chromatographie à différent ports (Berdagué et al. 2007). Ainsi, les renifleurs pourront
32
détecter les substances éluées en une seule séparation chromatographique et dans des
conditions identiques (même échantillon, même heure, mêmes conditions ambiantes,
etc.), améliorant ainsi la qualité des données obtenues et rendant plus facile l’étude des
échantillons frais et périssables (Berdagué et al. 2007).
Dans le but d’étudier les effets de l’alimentation, de la pasteurisation et de
l’affinage sur le profil aromatique du fromage de type Cantal, Cornu et al. (2009) ont
utilisé un olfactomètre à huit ports pour l’analyse des fromages provenant de huit
traitements (pâturage ou concentrés × lait cru ou pasteurisé × 3 ou 6 mois d’affinage). Le
panel était capable d’identifier 42 composés aromatiques et de détecter des différences
significatives sur l’effet de l’alimentation et du traitement thermique sur le Cantal.
Parallèlement à ces développements dans l'instrumentation, un logiciel
d'acquisition et de traitement du signal appelé AcquiSniff a été mis au point. Ce logiciel
permet l'enregistrement complet de la perception sensorielle des renifleurs lors de
l'analyse, le traitement immédiat du vocabulaire utilisé pour la description de l’odeur
sentie, et l'exploitation synthétique de l'information fournie par le panel (vocabulaire,
nombre de détections, intensité et durée de perception de l'odeur), ce qui facilite le
traitement des données (Berdagué et al. 2007).
2.3.4.2.2 La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de
masse
La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse permet
la séparation et l’identification quantitative et qualitative des composés organiques
volatils et semi-volatils dans des mélanges complexes (Hites, 1997).
33
Selon Akande (2012), la quantification peut être obtenue par l’utilisation d’un
standard interne. Comme tous les autres composés inconnus sur le chromatogramme, les
standards internes ont aussi leurs pics qui constituent la base des interprétations
quantitatives. La concentration inconnue d’un composé peut être connue par l’application
de la formule suivante:
Cc = Ai / Ac × Ci
Soit:
Cc: Concentration du composé inconnu
Ai: Aire du pic du standard interne
Ac: Aire du pic du composé inconnu
Ci: Concentration du standard interne
Une librairie spectrale sera utilisée pour identifier les composés chimiques dans le
mélange inconnu de l’échantillon (Akande, 2012). Le spectre de masse d’un composé de
l’échantillon est alors comparé aux spectres de masses de la librairie afin d’émettre une
liste de composés possibles (y compris les noms, les formules et les structures
moléculaires) avec la probabilité statistique de l’appariement (Akande, 2012).
La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse a été
largement utilisée dans l’analyse des arômes des produits laitiers (Imhof et Bosset, 1994;
Verzera et al. 2004). La principale limite de cette technique est reliée à la complexité de
détection des composés présents en faibles concentrations.
Pour être détectés en spectrométrie de masse, les composés volatils doivent être
présents à des concentrations égales ou supérieures à 10-5 g/L. Or, la concentration de la
plupart des composés volatils d’un produit alimentaire varie entre 10-11 et 10-4 g/L. Ainsi,
seuls les composés volatils abondants seront détectés (Friedrich et Acree, 1998).
34
Malgré l'utilité de la spectrométrie de masse, la perception olfactive humaine est
le détecteur d'odeur le plus sensible. Ainsi, l'évaluation sensorielle d’un composé volatil
par un panel d’évaluateurs à l’aide d’un olfactomètre représente une approche souhaitable
(Lo et al. 2008).
Une amélioration notable de l'identification des composés volatils est obtenue par
couplage d’un chromatographe en phase gazeuse à un spectromètre de masse et à un
olfactomètre. Une combinaison de la spectrométrie de masse et de l’olfactométrie permet
ainsi une meilleure caractérisation de la composition odorante par l'identification et la
quantification de ces composés, tout en offrant une corrélation partielle entre la nature
chimique d’un composé volatil et son odeur perçue (Lo et al. 2008).
2.4 Objectif et hypothèse de l’étude
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’un supplément d’huile de lin avec
différents niveaux d’amidon dans la ration sur le profil en lactones et les proportions de
différents intermédiaires du processus de biohydrogénation de l’acide -linolénique dans
le lait.
La biohydrogénation ruminale de l’acide -linolénique, tels qu’il a été expliqué
précédemment, est soumis à plusieurs étapes qui aboutit à la formation d’un sentier initial
trans-11. L’isomérisation initiale où le lien cis-12 est converti en lien trans-13 supporte
l’existence d’un sentier alternatif de biohydrogénation de l’acide -linolénique qui reste à
être élucider.
Étant donné que l’acide oléique et l’acide linoléique sont les précurseurs
respectifs de la γ-dodécalactone (γ-12:0) et de la γ-dodécaenolactone (γ-12:1), l’acide αlinolénique retrouvé dans les mêmes conditions pourrait potentiellement être le
précurseur de la γ-dodec-cis-6,cis-9-dienolactone (γ-12:2).
35
2.5 Liste des ouvrages cités
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45
CHAPITRE 3: EFFECT OF FEEDING LINSEED OIL IN
DIETS DIFFERING IN FORAGE TO CONCENTRATE
RATIO: 1. PRODUCTION PERFORMANCE AND MILK
FAT CONTENT OF BIOHYDROGENATION
INTERMEDIATES OF α-LINOLENIC ACID
47
CHAPITRE 3
Effect of feeding linseed oil in diets differing in forage to concentrate
ratio: 1. Production performance and milk fat content of
biohydrogenation intermediates of α-linolenic acid
Ce chapitre a été publié dans la revue « Journal of Dairy Research » sous la référence
suivante:
diets differing in forage to concentrate ratio: 1. Production performance and milk fat
content of biohydrogenation intermediates of α-linolenic acid Journal of Dairy Research
81 82-90
48
CHAPITRE 3
ratio: 1. Production performance and milk fat content of
biohydrogenation intermediates of α-linolenic acid
3.1 Résumé
Afin d’évaluer l’interaction entre les niveaux d’aliments concentrés et l’ajout
d’huile de lin dans la ration sur le profil en acides gras du lait, vingt-quatre vaches
Holstein ont été utilisées selon un dispositif en blocs complets aléatoires basés sur les
jours en lactation, avec attribution des rations selon un arrangement factoriel 2 × 2. Pour
chaque bloc, les vaches ont reçu une des quatre rations contenant 30 % ou 70 %
d’aliments concentrés, sans huile de lin, ou avec huile de lin ajoutée au taux de 3 % de la
matière sèche. Le profil en acides gras a été analysé en mettant l’accent sur les
intermédiaires de la voie prédominante trans-11, et sur une voie hypothétique trans-13 de
la biohydrogénation ruminale de l’acide -linolénique. L’ajout d’huile de lin a fait
augmenter les concentrations de 18:3 cis-9, cis-12, cis-15 et de 18:2 trans-11, cis-15 dans
la matière grasse du lait, et ces augmentations ont été plus importantes avec les rations
élevées en concentrés par comparaison aux rations faibles en concentrés (interaction huile
de lin par niveau de concentrés). Une interaction entre les traitements a été également
observée pour le 18:1 trans-11 dont le niveau a été plus élevé avec l’huile de lin,
l’augmentation étant plus importante avec les rations faibles par comparaison aux rations
élevées en concentrés. Les teneurs en 18:1 cis-15 et 18:3 cis-9, trans-11, cis-15 étaient
plus importantes dans le lait des vaches alimentées de rations supplémentées en huile de
lin. Par contre, l’alimentation de rations élevées en concentrés a fait diminuer la teneur en
18:1 cis-15 et tendait à réduire la teneur en 18:3 cis-9, trans-11, cis-15 dans les matières
grasses du lait. La supplémentation en huile de lin a fait augmenter les niveaux de 18:1
trans-13 et de 18:2 cis-9, trans-13, tandis que leur concentration n’a pas été affectée par
49
le niveau de concentrés de la ration. L’isomère 18:3 cis-9, trans-13, cis-15 n’a été détecté
dans aucun de nos échantillons de lait. En conclusion, des interactions ont été observées
entre l’huile de lin et le niveau d’aliments concentrés dans la ration pour quelques
intermédiaires de la voie de biohydrogénation trans-11. La présence des isomères 18:1
trans-13 et 18:2 cis-9, trans-13 supporte l’existence d’une voie trans-13, mais un
intermédiaire 18:3 avec une double liaison trans-13 n’a pas été identifié.
3.2 Abstract
To evaluate the interaction between the levels of dietary concentrate and linseed
oil (LO) on milk fatty acid (FA) profile, 24 Holstein cows were used in a randomised
complete block design based on days in milk, with a 2×2 factorial arrangement of
treatments. Within each block, cows were fed one of four experimental diets containing
30% concentrate (LC) or 70% concentrate (HC), without LO (NLO) or with LO
supplemented at 3% of dietary dry matter. Milk FA profiles were analysed with a special
emphasis on the intermediates of the predominant trans-11, and a putative trans-13
pathways of ruminal biohydrogenation of cis-9, cis-12, cis-15 18:3. Feeding LO
increased the concentrations of cis-9, cis-12, cis-15 18:3 and trans-11, cis-15 18:2 in milk
fat, and these increases were of a higher magnitude when LO was added in HC as
compared with LC diet (interaction of LO by concentrate). A treatment interaction was
also observed for the level of trans-11 18:1 which was higher when feeding LO, but for
which the increase was more pronounced with the LC as compared with HC diet. The
concentrations of cis-15 18:1 and cis-9, trans-11, cis-15 18:3 were higher in cows fed
LO, but feeding HC diets decreased milk fat content of cis-15 18:1 and a tendency for a
decrease in cis-9, trans-11, cis-15 18:3 was apparent. Feeding LO increased milk fat
content of trans-13 18:1 and cis-9, trans-13 18:2, while the concentrations of these two
isomers were not affected by the level of dietary concentrates. The isomer cis-9, trans-13,
cis-15 18:3 has not been detected in any of the milk samples. In conclusion, interactions
were observed between LO and dietary concentrates on the proportions of some
50
intermediates of the trans-11 biohydrogenation pathway. The presence of trans-13 18:1
and cis-9, trans-13 18:2 supports the existence of a trans-13 pathway, but an 18:3
intermediate with a trans-13 double bond has not been identified.
3.3 Introduction
Full-fat linseed and linseed oil, which are sources of α-linolenic acid (cis-9, cis12, cis-15 18:3), have been investigated for their effects on lactation (Petit, 2010) and
reproductive (Petit et al. 2002) performance, FA profile and physical properties of milk
fat (Hurtaud et al. 2010), and enteric methane emission (Martin et al. 2008) in dairy cows.
When cows receive full-fat linseed or linseed oil, the ruminal biohydrogenation of cis-9,
cis-12, cis-15 18:3 produces a large number of FA isomers (Loor et al. 2004; Flachowsky
et al. 2006). These biohydrogenation intermediates can be absorbed and incorporated in
milk fat of lactating animals, either directly, or following their metabolic transformation
in body tissues (e.g. desaturation and elongation).
Dietary factors affecting ruminal biohydrogénation of linoleic acid (cis-9, cis-12
18:2) have been extensively evaluated (Bauman & Griinari, 2001). More specifically,
increased production of trans-10 18:1 is observed when feeding high doses of unsaturated
FA with low-fibre diets. However, less is known about the effects of diet on different
pathways of ruminal biohydrogenation of cis-9, cis-12, cis-15 18:3.
The predominant pathway in the biohydrogenation of cis-9, cis-12, cis 15 18:3
involves an initial isomerisation where the cis-12 bond is converted to a trans-11 bond to
produce cis-9, trans-11, cis-15 18:3 (Harfoot, 1981). The second and third steps consist
of the hydrogenation of cis-9 and cis-15 bonds to produce trans-11, cis-15 18:2 and trans11 18:1, respectively. After absorption, trans-11 18:1 can be desaturated to cis-9, trans11 18:2 by the action of the Δ9-desaturase (Griinari et al. 2000). Destaillats et al. (2005)
51
proposed an alternative pathway in the biohydrogenation of cis-9, cis-12, cis-15 18:3
involving an initial isomerisation where the cis-12 bond is converted to a trans-13 bond,
leading to the sequential production of cis-9, trans-13, cis-15 18:3, cis-9, trans-13 18:2 or
trans-13, cis-15 18:2, and trans-13 18:1. As for several octadecenoic acids, trans-13 18:1
could be desaturated after absorption to produce cis-9, trans-13 18:2 (Destaillats et al.
2005). In support of the pathway proposed by Destaillats et al. (2005), few experiments
have shown the presence of trace amounts of cis-9, trans-13, cis-15 18:3 in meat and milk
fat from ruminants (Plourde et al. 2007; Rego et al. 2009). As opposed to cis-9, cis-12
18:2, the effects of diet on the different biohydrogénation pathways of cis-9, cis-12, cis15 18:3 are not well documented.
The objective of this experiment was therefore to evaluate the effect of feeding
linseed oil in diets differing in forage to concentrate ratio (F:C) on milk yield and
composition, and on milk FA profile. It was hypothesised that supplying linseed oil in
different basal diets affects the relative importance of different pathways involved in
ruminal biohydrogenation of cis-9, cis-12, cis-15 18:3, resulting in varying concentrations
of specific FA intermediates in milk fat.
52
3.4 Materials and methods
3.4.1 Animals and diets
The experiment was conducted at the Centre de Recherche en Sciences Animales
de Deschambault (Deschambault, QC, Canada). All procedures involving dairy cows
followed the regulations of the Canadian Council on Animal Care (1993), and were
approved by the Université Laval animal care committee. Twenty-four lactating Holstein
cows (637±68 kg body weight; 168±53 d in milk; 9 primiparous and 15 multiparous)
housed in a tie-stall barn were fed a pretreatment total mixed ration based on
grass/legume silage and corn silage (Table 3.1). Cows were then assigned to a
randomised complete block design based on days in milk with a 2×2 factorial
arrangement of treatments. Within each block, cows were fed one of four experimental
diets containing 30% concentrate (LC) or 70% concentrate (HC), without linseed oil
(NLO) or with linseed oil (LO) supplemented at 3% of dietary dry matter (Table 3.1).
The treatment period lasted 4 weeks. Throughout the experiment, diets were offered to
the cows once daily as a total mixed ration, and the amount of feed offered was adjusted
to ensure 10% refusals. Free access to water was provided at all time.
53
Table 3.1: Ingredients and chemical composition of experimental diets (g/100g dry
matter)
Treatment†
Pretreatment
LC
NLO
HC
LC
LO
HC
Ingredient, g/100 g of dry matter
Corn silage
Grass/Legume
silage‡
Grass hay
Rolled barley
Cracked corn
Soybean meal
Corn gluten meal
Linseed oil
Vitamins and
minerals
28.6
23.4
60.0
25.0
60.0
25.0
6.9
11.9
11.5
11.0
4.5
2.2
10.0
9.0
9.0
6.7
3.3
2.0
5.0
28.6
28.6
7.5
3.3
2.0
10.0
9.0
5.4
7.3
3.3
3.0
2.0
5.0
28.6
25.0
8.1
3.3
3.0
2.0
Dry matter,
g/100 g
Crude protein
Starch
ADF
NDF
NEL, Mcal/kg
dry matter
47.8
14:0
16:0
cis-9 16:1
18:0
cis-9 18:1
cis-11 18:1
cis-9, cis-12 18:2
cis-9, cis-12, cis15 18:3
20:0
Total fatty acids
†
15.0
30.1
20.1
33.1
1.61
Chemical composition, g/100 g of dry matter
45.8
62.9
45.9
64.5
15.4
13.2
29.0
45.3
1.43
15.3
37.5
16.3
27.3
1.56
14.9
10.5
29.1
45.9
1.54
15.6
35.6
18.4
25.8
1.65
Fatty acid profile, g/100 g of dry matter
0.12
0.11
0.11
4.18
4.48
5.00
0.07
0.07
0.08
0.50
0.50
1.52
2.34
4.25
7.72
0.20
0.20
0.42
8.29
12.26
11.84
7.31
4.89
19.56
0.15
23.16
0.14
26.89
0.16
46.43
NLO = no linseed oil; LO = with linseed oil, LC = low concentrate; HC = high concentrate
‡Grass/legume silage was constituted of 11% ladino clover, 34% timothy, and 55% bromegrass.
54
0.09
5.46
0.07
1.55
9.86
0.46
16.55
16.98
0.15
51.15
3.4.2 Sampling, measurements and analyses
A first sampling and measurement phase was conducted during the last week of
the pretreatment period (week 0), and a second during the last week of the treatment
period (week 4). At each of those phases, cows were weighed for 3 consecutive days
following the a.m. milking. Dry matter intake was recorded and feed samples were
collected for 3 consecutive days and pooled by treatment. A first subsample was dried at
55°C for 3 days to determine dry matter intake. All rations were analysed by
wetchemistry (DairyOne Laboratory, Ithaca, NY, USA) according to the following
methods: dry matter (method 2.2.1.1; National Forage Testing Association; Undersander
et al. 1993), residual moisture (method 991.01; AOAC International, 2012), ADF
(ANKOM Technology method 5: ADF in feeds – filter bag technique for A200; solutions
as in method 973.18; AOAC International, 2012), NDF (ANKOM Technology method 6:
NDF in feeds – filter bag technique for A200; solutions as in Van Soest et al. 1991), and
starch (application note number 319; YSI Inc. Life Sciences, Yellow Springs, Ohio).
After freeze drying and grinding through a 1-mm screen, FA profile of total
mixed rations was determined. Fatty acids were directly transesterified, and FA methyl
esters were extracted following the method described by Sukhija & Palmquist (1988)
with modifications. In the modified procedure, benzene was replaced by toluene and
incubation in 3ml HCl 5% (v/v) was performed at 50°C for 30 min and followed a prior
incubation in 3ml sodium methoxide (0.5M in methanol) at 70°C for 60 min.
Cows were milked at 0700 and 1700 h. Milk was sampled, and milk yield was
recorded for 3 consecutive days. Daily milk composites were made from p.m. and a.m.
milk samples proportionally to milk yield. A first subsample was preserved with bronopol
and kept at 4°C before analyses of fat, protein, and lactose using a Foss Milkoscan 4000
(Foss Electric, Hillerød, Denmark) combined with a Bentley 2000 (Bentley Instruments,
Chaska, MN) at Valacta (Dairy Production Centre of Expertise, Ste-Anne-de-Bellevue,
55
Québec, Canada). A second subsample was stored at 20°C without preservative for FA
analysis.
Before lipid extraction for FA analysis, milk samples were thawed in water at
36°C for 30 min. Milk fat was then extracted and FA were methylated according to
Chouinard et al. (1997). Milk FA profile was determined using a gas chromatograph
(Agilent 7890A; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) equipped with a 100-m
CP-Sil-88 capillary column (0.25 μm i.d., 0.20 μm film thickness; Agilent Technologies
Canada Inc., Mississauga, Canada), and a flame ionisation detector. In order to screen
milk FA composition, a first temperature programme was used where, at the time of
injection, the column temperature was 80°C for 1 min., then ramped at 2°C/min. to 215°C
and maintained for 21.5 min. Two additional isothermal temperature programmes (150
and 175°C; Kramer et al. 2008) were used to separate isomers that were co-eluting in the
first programme. For the separation and quantification of cis-9, trans-11, cis-15 18:3 and
cis-9, trans-13, cis-15 18:3, a fourth temperature programme was used where at the time
of sample injection, the column temperature was 120°C for 180 min., then increased at
10°C/min. to 220°C and maintained isothermal for 20 min (Plourde et al. 2007). For the
separation and quantification of trans-13 18:1 and trans-14 18:1, trans FA methyl esters
were first isolated using silver ion-thin layer chromatography followed by a GC analysis
of this fraction with a fifth programme at a low isothermal temperature of 120°C (Kramer
et al. 2008).
56
Most FA peaks were identified and quantified using either a quantitative mixture
or pure methyl ester standards (Larodan Fine Chemicals, Malmö, Sweden; Sigma-Aldrich
Canada Ltd, Oakville, Ontario, Canada; Matreya LLC, Pleasant Gap, PA, USA; Nu Chek
Prep, Elysian, MN, USA; Naturia, Sherbrooke, QC, Canada). Standards for isomers that
were not available commercially were identified by order of elution according to Precht
et al. (2001) and Kramer et al. (2008).
3.4.3 Statistical analysis
Data were analysed using the MIXED procedure of SAS (SAS Institute Inc.,
Cary, NC) with two models depending on type of data collected. The first model was
used for body weight, dry matter intake, milk yield, and milk composition. This model
included data collected during the last week of the pre-trial period as covariates, and also
level of concentrate, oil supplementation, and their interaction as fixed effects. Block was
included as a random effect. Because data on milk FA profile from the pre-trial period
were no available, a second model was used to determine treatment effects on milk FA
composition which included the fixed effects of level of concentrate, oil supplementation,
and their interaction, and block as a random effect. Results are reported as least square
means and standard errors of the means. Differences between treatments were declared at
P ≤ 0.05, and tendencies from P > 0.05 to P < 0.10.
3.5 Results
Dietary concentrations of crude protein were similar between treatments (Table
3.1). Both HC diets (NLO and LO) contained about 40% more dry matter, three times
more starch, and 40% less ADF and NDF than both LC diets (NLO and LO). The HC
diets which contained higher concentration of cracked corn and rolled barley had 40%
more cis-9 18:1 and cis-9, cis-12 18:2, and 19% less cis-9, cis-12, cis-15 18:3 compared
57
with LC diets. The addition of LO doubled the concentration of total FA in the diet
compared with NLO treatments. Moreover, adding LO to diets increased the proportions
of 18:0, cis-9 18:1, and cis-9, cis-12, cis-15 18:3 by about 3-fold as compared with NLO.
No interaction of oil by concentrate has been observed for animal performance
and concentration of major milk constituents (Table 3.2). Final body weight after the 4wk experimental period was similar among treatments. Feeding HC diets increased dry
matter intake, milk yield, as well as protein and lactose content and yield (P < 0.01).
Adding LO decreased dry matter intake and milk protein content, but increased intake of
cis-9, cis-12 18:2 and cis-9, cis-12, cis-15 18:3 (Table 3.3). Fat content decreased with
LO supplementation, as well as with high concentrate diets (P < 0.01), while fat yield
tended to be higher with HC compared with LC (P = 0.07).
58
Table 3.2: Body weight, dry matter intake (DMI), milk yield, and milk composition in cows fed high (HC) or low
(LC) concentrate diets without supplemental oil (NLO), or supplemented at 3% of dry matter with
linseed oil (LO)
Treatment
NLO
P-value†
LO
Item
Body weight, kg
LC
648
HC
663
LC
654
HC
653
SEM
6
LO
0.75
C
0.22
DMI, kg/d
21.5
25.6
19.6
23.9
0.8
0.03
< 0.01
0.90
Milk yield, kg/d
25.4
32.2
26.9
34.1
1.2
0.12
< 0.01
0.87
LO×C
0.21
Composition, g/100 g
Fat
4.22
3.76
4.07
3.37
0.09
< 0.01
< 0.01
0.18
Protein
3.33
3.59
3.12
3.42
0.03
< 0.01
< 0.01
0.50
Lactose
4.60
4.72
4.58
4.80
0.04
0.40
< 0.01
0.18
Fat
1,046
Yield, kg/d
1,165
1,106
1,160
48
0.54
0.07
0.46
Protein
836
1,136
829
1,160
40
0.82
< 0.01
0.68
Lactose
1,174
1,525
1,236
1,640
58
0.11
< 0.01
0.64
†
P-value
for
the
effects
of
linseed
oil
(LO),
concentrates
(C),
and
the
interaction
of
linseed
oil
by concentrates
(LO×C).
59
Table 3.3: Fatty acid intake in cows fed high (HC) or low (LC) concentrate diets without supplemental oil (NLO), or
supplemented at 3% of dry matter with linseed oil (LO)
Treatment
NLO
P-value†
LO
Fatty acid, g/day
LC
HC
14:0
2.6
2.8
16:0
90.0
cis-9 16:1
HC
SEM
C
LO×C
2.2
2.2
0.1
< 0.01
0.13
0.11
114.3
97.6
130.0
4.6
0.01
< 0.01
0.35
1.5
1.8
1.6
1.7
0.1
0.65
< 0.01
0.12
18:0
10.9
12.4
29.8
36.8
1.4
< 0.01
< 0.01
0.04
cis-9 18:1
51.0
106.7
150.0
233.8
8.4
< 0.01
< 0.01
0.09
cis-11 18:1
4.3
5.0
8.2
10.9
0.4
< 0.01
< 0.01
0.01
cis-9, cis-12 18:2
179.0
312.4
228.6
393.1
13.8
< 0.01
< 0.01
0.24
cis-9, cis-12, cis-15 18:3
158.1
120.0
385.8
403.7
15.1
< 0.01
0.46
0.06
20:0
3.2
3.6
3.1
3.6
0.1
0.73
< 0.01
0.71
< 0.01
0.12
Total fatty acids
†
P-value
60
for
the
500.5
effects
of
linseed
678.6
oil
(LO),
LC
907.2
concentrates
(C),
1215.3
and
the
43.4
interaction
of
LO
< 0.01
linseed
oil
by concentrates
(LO×C).
Feeding LO increased the concentration of cis-9, cis-12, cis-15 18:3 in milk fat
(Table 3.4), and this increase was of a higher magnitude when LO was added in HC as
compared with LC diet (interaction of LO by concentrate P < 0.01). The concentration of
cis-9, cis-12 18:2 was not affected by LO, but was increased when feeding HC as
compared with LC diets.
A treatment interaction was observed for the level of trans-11 18:1 which was
increased by feeding LO, but for which the increase was more pronounced with the LC as
compared with HC diets. Milk fat concentrations of trans-15 18:1 and trans-11, cis-15
18:2 were also higher in milk of cows fed LO, but the increase was of a lower magnitude
when LO was added in LC compared with HC diets.
Feeding LO increased milk fat content of trans-13 18:1 and cis-9, trans-13 18:2,
while their concentrations were not affected by dietary concentrates (Table 3.4). The
isomer cis-9, trans-13, cis-15 18:3 has not been detected in any of the milk samples.
The concentrations of cis-15 18:1, cis-9, trans-11 18:2 and cis-9, trans-11, cis-15
18:3 were higher in milk of cows fed LO, but feeding HC diets decreased milk fat content
of these three FA without interaction between dietary treatments. Dietary LO increased
the concentrations of trans-10 18:1 and trans-10, cis-12 18:2 in milk fat; and the
proportion of trans-10 18:1 was further increased by feeding HC as compared with LC.
Finally, the level of milk 18:0 was increased by feeding LO, but was not affected by
dietary concentrates.
61
Table 3.4: Milk fat composition in cows fed high (HC) or low (LC) concentrate diets without supplemental oil
(NLO), or supplemented at 3% of dry matter with linseed oil (LO)
Treatment
NLO
Item, g/100 g
Saturated
4:0
5:0
6:0
7:0
8:0
9:0
10:0
11:0
12:0
iso 13:0
anteiso 13:0
13:0
iso 14:0
14:0
iso 15:0
anteiso 15:0
15:0
iso 16:0
16:0
iso 17:0‡
anteiso 17:0§
17:0
iso 18:0
62
LO
LC
HC
LC
HC
SEM
LO
2.935
0.024
1.818
0.028
1.074
0.030
2.627
0.049
3.132
0.024
0.007
0.082
0.090
10.662
0.219
0.401
1.129
0.197
30.540
0.258
0.354
0.484
0.046
2.355
0.033
1.540
0.042
1.028
0.057
3.048
0.130
3.967
0.024
0.005
0.177
0.054
11.615
0.173
0.379
1.418
0.162
27.473
0.286
0.362
0.491
0.032
2.908
0.016
1.502
0.015
0.756
0.014
1.572
0.015
1.721
0.023
0.007
0.043
0.074
7.715
0.172
0.328
0.785
0.143
19.555
0.258
0.303
0.400
0.046
2.352
0.021
1.338
0.021
0.827
0.021
2.074
0.044
2.496
0.027
0.006
0.081
0.045
9.586
0.150
0.339
0.846
0.210
19.951
0.301
0.342
0.364
0.029
0.157
0.002
0.090
0.004
0.061
0.006
0.150
0.013
0.150
0.003
0.001
0.015
0.006
0.293
0.012
0.021
0.082
0.023
1.019
0.012
0.018
0.017
0.003
0.93
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.71
0.63
< 0.01
0.05
< 0.01
< 0.01
0.02
< 0.01
0.86
< 0.01
0.50
0.04
< 0.01
0.61
P-value†
C
< 0.01
< 0.01
0.02
0.02
0.84
0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.50
0.03
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.01
0.78
< 0.05
0.37
0.12
< 0.01
0.15
0.38
< 0.01
LO×C
0.94
0.39
0.53
0.30
0.35
0.12
0.79
< 0.05
0.84
0.53
0.81
0.06
0.57
0.12
0.32
0.45
0.18
0.01
< 0.05
0.51
0.33
0.21
0.58
Treatment
NLO
Item, g/100 g
18:0
19:0
20:0
22:0
24:0
Monounsaturated
cis-9 10:1
trans 12:1¶
cis-9 12:1
cis-9 14:1
cis-11 14:1
trans 15:1¶
cis-9 15:1
trans-4 16:1
trans-5 16:1
trans-6-7 16:1
trans-8 16:1
trans-9 16:1
cis-7 16:1 + trans-11-12
16:1
cis-9 16:1 + trans-13
16:1
cis-11 16:1
cis-12 16:1 + trans-14
16:1
cis-13 16:1
cis-14 16:1
LO
LC
HC
7.398
0.038
0.147
0.060
0.039
P-value†
C
LC
HC
SEM
LO
LO×C
7.366
0.052
0.121
0.037
0.025
12.380
0.010
0.197
0.055
0.032
11.625
0.013
0.170
0.039
0.021
0.607
0.004
0.008
0.004
0.003
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.58
0.02
0.52
0.08
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.56
0.21
0.90
0.38
0.41
0.261
0.068
0.078
1.025
0.044
0.024
0.013
0.005
0.006
0.012
0.023
0.055
0.230
0.077
0.103
1.008
0.070
0.016
0.011
0.005
0.008
0.010
0.021
0.030
0.146
0.029
0.035
0.628
0.019
0.020
0.012
0.006
0.007
0.006
0.025
0.098
0.171
0.042
0.053
0.782
0.035
0.013
0.009
0.004
0.006
0.007
0.021
0.044
0.012
0.004
0.004
0.053
0.003
0.002
0.001
0.001
0.001
0.001
0.002
0.006
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.03
0.11
0.48
0.88
< 0.01
0.35
< 0.01
0.80
< 0.01
< 0.01
0.17
< 0.01
< 0.01
0.03
0.11
0.77
0.74
0.04
< 0.01
0.02
0.55
0.44
0.09
0.09
0.91
0.37
0.16
0.08
0.10
0.38
0.02
0.133
0.160
0.189
0.182
0.008
< 0.01
0.18
0.04
1.229
1.202
0.863
0.802
0.094
< 0.01
0.64
0.85
0.027
0.029
0.018
0.020
0.002
< 0.01
0.36
0.74
0.073
0.040
0.110
0.064
0.007
< 0.01
< 0.01
0.39
0.205
0.016
0.228
0.014
0.093
0.008
0.114
0.008
0.009
0.001
< 0.01
< 0.01
0.02
0.44
0.92
0.53
63
Treatment
NLO
Item, g/100 g
cis-7 17:1
cis-8 17:1
cis-9 17:1
trans-4 18:1
trans-5 18:1
trans-6-8 18:1
trans-9 18:1
trans-10 18:1
trans-11 18:1
trans-12 18:1
trans-13 18:1
trans-14 18:1
trans-15 18:1
trans-16 18:1
cis-6-8 18:1
cis-9 18:1††
cis-11 18:1
cis-12 18:1
cis-13 18:1
cis-14 18:1
cis-15 18:1
cis-9 20:1
cis-11 20:1
Nonconjugated 18:2
trans-9, trans-12 18:2
trans-8, cis-12 18:2
64
LO
P-value†
LO
C
LC
HC
LC
HC
SEM
LO×C
0.030
0.043
0.161
0.006
0.007
0.140
0.117
0.123
1.130
0.122
0.074
0.116
0.212
0.192
0.151
13.183
0.352
0.169
0.079
0.036
0.036
0.096
0.018
0.028
0.019
0.161
0.007
0.009
0.161
0.127
0.182
0.637
0.177
0.110
0.170
0.166
0.216
0.116
14.271
0.741
0.230
0.086
0.033
0.023
0.094
0.021
0.023
0.035
0.144
0.025
0.019
0.336
0.288
0.306
2.176
0.563
0.526
0.879
0.456
0.719
0.164
19.283
0.849
0.634
0.129
0.100
0.085
0.131
0.027
0.020
0.016
0.118
0.012
0.014
0.307
0.236
0.562
1.002
0.498
0.464
0.741
0.556
0.634
0.082
19.711
0.804
0.410
0.116
0.066
0.064
0.141
0.027
0.001
0.001
0.013
0.001
0.001
0.019
0.016
0.066
0.106
0.032
0.035
0.058
0.036
0.034
0.012
0.755
0.048
0.025
0.012
0.007
0.007
0.007
0.003
< 0.01
< 0.01
0.03
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.34
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.31
< 0.01
0.07
0.82
0.20
0.03
< 0.01
0.89
0.71
0.48
0.39
0.38
< 0.01
0.28
< 0.01
< 0.01
0.77
0.01
< 0.01
0.56
0.62
0.48
< 0.01
0.32
< 0.01
< 0.01
0.20
0.07
0.15
< 0.01
0.07
0.18
0.11
0.03
0.13
0.06
0.63
< 0.01
< 0.01
0.33
0.03
0.42
0.42
0.55
0.047
0.105
0.052
0.025
0.162
0.063
0.157
0.299
0.212
0.063
0.300
0.233
0.011
0.023
0.017
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.22
0.37
< 0.01
0.25
0.76
Treatment
NLO
Item, g/100 g
trans-11, cis-15 18:2
cis-9, trans-12 18:2
cis-9, trans-13 18:2
cis-9, cis-12 18:2
Conjugated 18:2
cis-9, trans-11 18:2‡‡
trans-10, cis-12 18:2
Other unsaturated
cis-6, cis-9, cis-12 18:3
cis-9, cis-12, cis-15 18:3
cis-9, trans-13, cis-15
18:3
cis-9, trans-11, cis-15
18:3
cis-11, cis-14 20:2
cis-8, cis-11, cis-14 20:3
cis-11, cis-14, cis-17
20:3
cis-5, cis-8, cis-11, cis-14
20:4
cis-8, cis-11, cis-14, cis17 20:4
cis-5, cis-8, cis-11, cis14, cis-17 20:5
cis-13, cis-16 22:2
cis-7, cis-10, cis-13, cis16 22:4
LO
LC
HC
0.019
0.164
0.017
0.094
1.181
P-value†
LO
C
LC
HC
SEM
0.019
0.049
0.023
0.122
1.921
0.069
0.880
0.060
0.261
1.240
0.035
0.359
0.056
0.235
1.670
0.006
0.048
0.006
0.019
0.097
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.25
0.01
< 0.01
0.94
0.93
< 0.01
0.01
< 0.01
0.43
0.16
0.07
0.515
0.002
0.359
0.003
0.879
0.004
0.510
0.004
0.063
0.0005
< 0.01
0.04
< 0.01
0.23
0.11
0.17
0.026
0.377
0.031
0.298
0.019
0.463
0.017
0.550
0.001
0.030
< 0.01
< 0.01
0.35
0.91
0.03
0.01
nd
nd
nd
nd
-
-
-
0.025
0.021
0.050
0.037
0.004
< 0.01
0.06
0.31
0.028
0.080
0.027
0.109
0.022
0.058
0.019
0.063
0.002
0.005
< 0.01
< 0.01
0.25
< 0.01
0.38
0.02
0.008
0.007
0.013
0.010
0.001
< 0.01
0.20
0.35
0.108
0.146
0.084
0.084
0.008
< 0.01
0.01
0.02
0.006
0.007
0.007
0.008
0.001
0.08
0.03
0.45
0.045
0.034
0.036
0.037
0.002
0.08
0.02
< 0.01
0.041
0.021
0.033
0.020
0.002
< 0.01
< 0.01
0.06
0.020
0.029
0.019
0.019
0.003
0.02
0.03
0.04
-
LO×C
65
Treatment
NLO
Item, g/100 g
cis-4, cis-7, cis-10, cis-13,
cis-16 22 :5
cis-7, cis-10, cis-13, cis16, cis-19 22:5
cis-4, cis-7, cis-10, cis13, cis-16, cis-19 22:6
Other fatty acids
Glycerol
†
LO
LC
HC
0.015
LC
HC
SEM
LO
0.016
0.011
0.017
0.002
0.43
0.12
0.21
0.051
0.055
0.056
0.060
0.004
0.18
0.32
0.97
0.007
0.009
0.009
0.008
0.002
0.75
0.77
0.41
0.825
12.360
0.718
12.224
1.913
11.891
1.419
11.851
0.113
0.073
< 0.01
< 0.01
0.02
0.24
0.10
0.52
P- value for the effects of linseed oil (LO), concentrates (C), and the interaction of linseed oil by concentrates (LO×C)
Coelution with minor concentration of trans-10 16:1
§
Coelution with minor concentration of cis-10 16:1
¶
Position of the double bound was not confirmed
††
Coelution with minor concentration of cis-10 18:1
‡‡
Coelution with trans-7, cis-9 18:2.
‡
66
P-value†
C
LO×C
3.6 Discussion
Feeding LO, and supplying more concentrate, increased the dietary proportions of
FA and starch, and therefore improved the energy density of the diets (Table 3.1). As
observed in the current trial, Sterk et al. (2011) also reported that shifting from a high
forage (65:35 F:C) to a high concentrate (35:65 F:C) diet increased dry matter intake and
milk yield in dairy cows. The higher dry matter intake with HC diets is in agreement with
a lower dietary NDF content as suggested by Allen (2000). The observed increase in milk
yield with HC could then be explained by a greater intake of dry matter, with a higher
nutrient density.
Supplementing dairy diets with LO, at similar or lower concentrations than the
3% level used in the current trial, has been shown to have no effect on dry matter intake
(Loor et al. 2005; Flachowsky et al. 2006; Benchaar et al. 2012). However, Chilliard et al.
(2009) reported a lower dry matter intake with higher levels of LO supplementation
(5·7%of dry matter) using corn silage based diets.
Feeding HC diets, with higher starch content, increased milk protein
concentration and yield. Sterk et al. (2011) observed similar results when supplying a
greater amount of starch, a glucogenic precursor which has been shown by these authors
to be correlated with milk protein synthesis. Also, in a review by Emery (1978), a
positive correlation was established between milk protein concentration and energy
intake when concentrate was substituted for forage.
67
The effects observed in the current trial on milk composition are consistent with
previously published results showing lower milk fat content when feeding high
concentrate diets (Griinari et al. 1998; Sterk et al. 2011). However, the decrease in milk
fat content was more than compensated by an increase in milk production, so that a
tendency for a higher fat yield was observed with HC diets in the present experiment.
Dietary addition of LO increased the intake of cis-9, cis-12, cis-15 18:3, and this
increase tended to be of a higher magnitude with HC as compared with LC (P = 0.06).
These variations were reflected in milk fat, where concentrations of cis-9, cis-12, cis-15
18:3 were increased when cows received LO diets with the highest concentration being
observed with HC/LO. Similarly, feeding HC diets increased the intake of cis-9, cis-12
18:2 which explained the higher concentration of this essential FA in milk fat as
compared with LC diets.
Among the intermediates of ruminal biohydrogenation, the treatment interaction
observed on the level of trans-11, cis-15 18:2, that was increased by feeding LO, but for
which the increase was more pronounced with the HC as compared with LC, is consistent
with a similar interaction observed in the supply of its precursor e.g., dietary cis-9, cis-12,
cis-15 18:3. An inverse interaction was observed on the concentration of trans-11 18:1
for which the increase obtained with LO was of a lower magnitude with HC as compared
with LC. This FA is an intermediate in the biohydrogenation process of both cis-9, cis-12
18:2 and cis-9, cis-12, cis-15 18:3. A shift from the trans-11 to the trans-10 pathway of
biohydrogenation has been observed with the HC in the current trial as well as in
previous experiments (Griinari & Bauman, 1999). The production of FA intermediates of
the trans-10 pathway has also been reported during the biohydrogénation of cis-9, cis-12,
cis-15 18:3 (Lee & Jenkins, 2011).
68
Destaillats et al. (2005) proposed a putative biohydrogenation pathway for cis-9,
cis-12, cis-15 18:3 in which the hydrogenation process begins with a cis-12/trans-13
isomerisation. In the current study, despite chromatographic conditions that allowed
identification of this specific isomer, cis-9, trans-13, cis-15 18:3 was not detected in milk
fat. Consistent with the present study, Zened et al. (2011) showed no detectable
concentration of cis-9, trans-13, cis-15 18:3 in ruminal content incubated in vitro with
cis-9, cis-12, cis-15 18:3 supplement. However, these conclusions are in contradiction
with previous reports showing the presence of cis-9, trans-13, cis-15 18:3 in ruminant
meat (Plourde et al. 2007) and milk (Rego et al. 2009). Discrepancies between studies
remain to be elucidated and could potentially be related to experimental models,
interactions with basal diets, and methodological and/or chromatographic conditions.
Nevertheless, the presence of trans-13 18:1 and cis-9, trans-13 18:2, which both
increased following LO supplementation, confirm the existence of a trans-13 pathway of
hydrogenation. Also, cis-9, trans-13 18:2 might have been produced endogenously in
tissues by the Δ9-desaturation of trans-13 18:1 (Bichi et al. 2012). Other isomers of 18:2
with a trans-13 double bond are increased when cis-9, cis-12, cis-15 18:3 is provided in
the diet. Lerch et al. (2012) observed higher concentrations of cis-11, trans-13 18:2 and
trans-11, trans-13 18:2 in milk fat when feeding lactating dairy cows with extruded
linseed. The isomer trans-13, cis-15 18:2 is another potential intermediate in a trans-13
pathway of biohydrogenation (Destaillats et al. 2005). However, this conjugated 18:2
isomer remains to be identified in milk fat.
Among other 18:3 isomers, which could be intermediate in a trans-13 pathway,
Lerch et al. (2012) identified cis-9, trans-11, trans-13 18:3 in bovine milk fat. However,
the hydrogenation of this fully conjugated 18:3 isomer is more likely to produce trans-11,
trans-13 18:2 which has been reported in ruminal content (Loor et al. 2004) and milk
(Lerch et al. 2012) in dairy cows.
69
The level of trans-14 18:1 in milk fat was about 60% higher than the level of
trans-13 18:1, and the ratio of these two FA was affected neither by LO supplementation
nor by level of concentrate (P > 0.10; data not shown). Unlike the ratio of trans-11 18:1
to trans-10 18:1, which was significantly reduced when changing from LC to HC diets (P
< 0.01; data not shown), the ratio of trans-13 to trans-14 does not appear to be modified
by the conditions of ruminal environment.
Shingfield et al. (2010) integrated the data available in the literature on the
biohydrogenation of cis-9, cis-12, cis-15 18:3, and suggested cis-12, trans-14 18:2 and
trans-12, trans-14 18:2 as putative intermediates in the production of trans-14 18:1. In
particular, results from other studies have shown an increase in trans-12, trans-14 18:2
(Gómes-Cortés et al. 2009; Lerch et al. 2012), cis-9, trans-14 18:2, and cis-12, trans-14
18:2 (Lerch et al. 2012) when diets of lactating ruminants were supplemented with
extruded linseed. In the current trial, the high concentration of trans-14 18:1 observed
when feeding LO (7·5 fold increase compared with NLO with the LC diets) also supports
the existence of a trans-14 pathway of biohydrogenation of cis-9, cis-12, cis-15 18:3.
The increase in milk fat content of trans-10, cis-12 18:2 and trans-10 18:1 when
feeding LO in diets with a similar level of concentrate (LC or HC), or the higher trans-10
18:1 when increasing level of concentrate in diets with similar LO supplementation (NLO
or LO) is in line with the lower milk fat content observed with these two treatments as
reported previously under similar situations (Shingfield et al. 2010). However, higher
milk yield compensated for the lower fat concentration so that total fat yield was not
affected by LO, and even tended to be higher with HC diets. Lack of effect of LO on milk
fat yield has been observed previously with similar levels of supplementation (Loor et al.
2005; Benchaar et al. 2012), but a decrease in milk fat content and yield has been
observed with higher dietary supplies of linseed oil (Chilliard et al. 2009), and raw or
extruded linseed (Akraim et al. 2007).
70
In conclusion, results of the current experiment confirmed that biohydrogenation
of cis-9, cis-12, cis-15 18:3 is dominated by the trans-11 pathway; for which the highest
concentrations of intermediates have been found in milk fat (i.e. cis-9, trans-11, cis-15
18:3, trans-11, cis-15 18:2, cis-15 18:1, and trans-11 18:1). Moreover, the extent of
production of these intermediates has been affected by the levels of concentrate in the
diet, as shown by the interactions observed between treatments for milk fat content of
trans-11, cis-15 18:2 and trans-11 18:1.
The identification and quantification of trans-13 18:1 and cis-9, trans-13 18:2 still
offers some support to a trans-13 pathway of ruminal biohydrogenation. However,
adding linseed oil, high levels of concentrate, or both did not result in a shift toward a
trans-13 biohydrogenation pathway. Finally, cis-9, trans-13, cis-15 18:3 has not been
identified in our milk samples, which suggests that this specific biohydrogenation
pathway is not initiated by a cis-12 to trans-13 isomerisation.
3.7 Acknowledgements
This experiment was funded through Industrial Research Chair programme of
Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Ottawa, ON, Canada),
with industry contributions from Dairy Farmers of Canada (Ottawa, ON, Canada),
Novalait Inc. (Québec, QC, Canada), Valacta (Ste-Anne-de-Bellevue, QC, Canada),
Fédération des Producteurs de Lait du Québec (Longueuil, QC, Canada), and Ministère
de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du Québec (Québec, QC, Canada).
The authors thank André Perreault and Philippe Cantin as well as the administrative staff
of the Centre de Recherche en Sciences Animales de Deschambault (Québec, Canada) for
the care provided to cows during the trial. The authors are also grateful to Gabrielle StPierre and Micheline Gingras from the Département des Sciences Animales, Université
Laval for their assistance in samplings and laboratory analyses.
71
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acids
Journal
of
Dairy
Science
94
5634–5645
74
CHAPITRE 4: EFFECT OF FEEDING LINSEED OIL IN
DIETS DIFFERING IN FORAGE TO CONCENTRATE
RATIO: 2. MILK LACTONE PROFILE
75
CHAPITRE 4
ratio: 2. Milk lactone profile
Ce chapitre a été publié dans la revue « Journal of Dairy Research » sous la référence
suivante:
Saliba L, Gervais R, Lebeuf Y, Vuillemard JC, Fortin J & Chouinard PY 2014
Effect of feeding linseed oil in diets differing in forage to concentrate ratio: 2. Milk
lactone profile Journal of Dairy Research 81 91-97
76
CHAPITRE 4
ratio: 2. Milk lactone profile
4.1 Résumé
Les lactones contribuent de manière importante à la saveur et à l’arôme du lait et
des produits laitiers. Cette étude a été réalisée afin d’évaluer les effets d’un ajout d’huile
de lin à la ration et du rapport fourrage:concentrés de cette ration sur le profil en lactones
du lait. Vingt-quatre vaches Holstein ont été réparties dans un dispositif en blocs
complets aléatoires, selon la date de vêlage, et les traitements distribués selon un
arrangement factoriel 2 × 2. À l’intérieur de chaque bloc, les vaches recevaient une des
quatre rations contenant 30 ou 70 % d’aliments concentrés, auxquelles on ajoutait ou non
de l’huile de lin, à raison de 3 % de la ration sur une base de matière sèche. Le profil en
lactones du lait a été déterminé en utilisant la technique de microextraction en phase
solide. Après quatre semaines de traitement, les niveaux de δ-lactones (δ-6:0, δ-8:0, δ10:0, and δ-12:0) les plus élevés ont été observés avec la ration à faible teneur en
concentrés sans huile de lin. Ces concentrations ont ensuite diminué lorsque les vaches
recevaient soit une ration riche en concentrés ou une supplémentation en huile de lin,
mais ces effets n’étaient pas additifs (interaction concentrés × huile de lin, P < 0,01).
Une interaction entre les niveaux de concentrés et d’huile de lin dans la ration (P < 0,01)
a également été notée pour la γ-12:0, la teneur en cette γ-lactone étant plus élevée dans le
lait des vaches recevant la ration riche en concentrés et contenant de l’huile de lin, tandis
qu’aucun effet n’était apparent lorsque l’huile de lin était ajoutée à la ration faible en
concentrés. Par ailleurs, augmenter la teneur en concentrés de la ration de la vache a
augmenté les niveaux de γ-12:1 dans le lait, tandis que l’ajout d’huile de lin n’a eu aucun
effet sur les teneurs de cette γ-lactone. Finalement, la γ-12:2 n’a été détectée dans aucun
des échantillons de lait étudiés. Un test triangulaire a permis de démontrer qu’un nombre
significatif d’évaluateurs ont pu percevoir une différence entre le lait provenant des
77
vaches alimentées avec la ration à faible teneur en concentrés et sans huile de lin et celui
des vaches recevant la ration riche en concentrés et contenant de l’huile de lin.
L’évaluation sensorielle a été complétée par un test de classement démontrant qu’aucun
effet de traitement n’était perceptible sur l’intensité des attributs « lactique frais »,
« étranger » ou « flaveur globale » du lait. En conclusion, le profil en lactones du lait a
été modifié par la teneur en concentrés et en huile de lin de la ration des vaches laitières.
Comparativement au lait des vaches recevant une ration faible en concentrés sans huile de
lin, le lait des vaches recevant une ration riche en concentrés supplémentée en huile de lin
présentait des teneurs plus élevées en γ-lactones et plus faibles en δ-lactones. Suite à un
test triangulaire, une différence a été perçue entre les laits issus de ces deux traitements,
mais les attributs sensoriels responsables de cette différence demeurent inconnus.
4.2 Abstract
Lactones are important contributors to the flavour and aroma of milk and dairy
products. This study was conducted to evaluate the effects of dietary linseed oil (LO) and
forage to concentrate ratio on milk lactone profile. Twenty four Holstein cows were used
during a 4-week feeding trial in a randomised complete block design. Cows were fed
diets containing 30% (LC) or 70% (HC) concentrate, and 0% (NLO) or 3% LO in a 2×2
factorial arrangement of treatments. Milk lactone profile was evaluated using the solid
phase microextraction technique. The highest levels of δ-lactones (δ-6:0, δ-8:0, δ-10:0,
and δ-12:0) were found with the LC/NLO diet. These concentrations were then decreased
when cows received either a high level of concentrate or supplemental LO, but these
effects were not additive (interaction of LO by concentrate, P < 0.01). An interaction of
LO by concentrate (P < 0.01) was also noted on milk γ-12:0 for which the highest
concentration was observed when supplementing LO in HC diet, while no effect was
apparent when LO was added in LC diet. Moreover, feeding HC increased the level of γ12:1 in milk as compared with LC, while LO had no effect on this γ-lactone. Finally, γ12:2 was not detected in any of the milk samples studied. Organoleptic properties of milk
were evaluated in a triangle test showing that a significant number of assessors perceived
78
a difference between milk from cows fed LC/NLO as compared with milk from cows fed
HC/LO. The sensory evaluation was completed by a ranking test where the intensities of
fresh lactic, foreign and global flavours were not different between treatments. In
conclusion, feeding LO in HC diet modified milk lactone profile with a shift toward more
γ- and less δ-lactones as compared with LC diet not supplemented with LO. A difference
was perceived in a triangle test between milk from these two treatments, but the sensory
attributes responsible for this difference have not been identified in the current trial.
4.3 Introduction
Lactones are among the most important groups of aromatic compounds found in
milk (Urbach, 1990), where they are recognised to contribute to the unique flavour of
butter. Different forms of lactones, which differ by the size of their heterocycle, have
been identified. Among them, γ-lactone (4 carbons) and δ-lactone (5 carbons) are the
most abundant series reported in ruminant products (Shahidi et al. 1986; Hettinga, 2005).
In bovine milk, δ-lactones were found in higher concentrations compared with γ-lactones
(Hettinga, 2005).
Although lactones are synthesised by the animal, a part could also be produced
during heat treatment of milk fat (Stark et al. 1978; Urbach & Stark, 1978). The
precursors of δ- and γ-lactones are 5- and 4-hydroxy acids, respectively (Singh et al.
2003). Triglycerides of freshly produced milk contain low concentrations of hydroxy
acids which are released by hydrolysis, and converted to lactones during milk processing.
Ruminant milk fat has therefore been studied for its ‘lactone potential’ e.g., the
qualitative and quantitative lactone profiles generated following heat treatments in
absence of oxygen (Stark et al. 1978; Urbach & Stark, 1978).
Dimick & Harner (1968) evaluated the effects of different dietary, environmental
and animal factors affecting the lactone potential of milk fat, and reported the following
79
observations on the concentration of δ-decalactone (δ-10:0), δ-dodecalactone (δ-12:0)
and δ-tetradecalactone (δ-14:0): (i) a seasonal trend, with higher concentrations of
lactones during winter when cows received indoor diets compared with summer and
pasture feeding; (ii) a shift in lactone content in milk which increased from 25–30 ppm
following parturition to 170–180 ppm at about 150 d of lactation; (iii) a negative
correlation between lactone concentration and milk fat content and yield throughout
lactation; (iv) a positive correlation between lactone content and the proportion of fatty
acids with chain length between 4 and 14 carbon atoms; and (v) a slightly higher lactone
potential in milk fat of Holstein compared with Brown Swiss or Jersey/Guernsey cows.
Moreover, Urbach & Stark (1978) observed an increase in the γ-dodecalactone (γ12:0) potential when cows were moved from pasture to a ration based on alfalfa hay
supplemented with oats (source of starch), but not when they were transferred to alfalfa
hay only. The same authors also observed that feeding full-fat sunflower seeds (source of
unsaturated fatty acids), but not feeding sunflower meal (defatted), increased the γdodecaenolactone (γ-12:1), and decreased the saturated δ-lactone potential of milk fat. In
light of these results, it can be concluded that variations in the supply of starch and
unsaturated fatty acids modified the γ-lactone potential of milk fat.
More recently, Bendall (2001) compared milk from cows fed pastures and total
mixed rations in New Zealand. A total of 12 different lactones were evaluated using
Solvent-Assisted Flavour Evaporation, followed by the Nasal Impact Factor procedure.
No difference between treatments was observed on the frequency of detection of γ-12:0
and γ-12:1. In contrast, γ-12:2 had a frequency of detection of 50% in milk of cows fed
total mixed rations, while it has not been detected in milk of cows on pasture.
According to Joblin & Hudson (1997), in dairy cows, synthesis of γ-12:0 and γ12:1 is a two-step process where 18-carbon unsaturated FA are first transformed in the
rumen by hydration into hydroxy acid intermediates. After absorption, hydroxy acids are
shortened by three rounds of β-oxidation, followed by cyclisation to γ-lactones. Dietary
80
oleic and linoleic acids are precursors of γ-12:0 and γ-12:1, through the production of 10hydroxy-stearic acid and 10-hydroxy-oleic acid, respectively (Urbach, 1990). Following
the same series of reactions, α-linolenic acid could potentially be the precursor of γ-12:2,
with 10-hydroxy-linoleic acid as intermediate, as it has been shown in the microbial
lactonisation of fatty acids of linseed oil (Kim, 2005).
It appears, from this series of observations, that the impacts of dietary factors on
milk lactone profile are not fully understood. The objective of this study was to evaluate
the effect of feeding linseed oil in diets providing different levels of grains as a source of
starch on milk lactone profile.
4.4 Materials and methods
4.4.1 Animals and diets
The experimental design is described in detail in a companion paper (Saliba et al.
2014). Briefly, 24 Holstein cows were used in a randomised complete block design based
on days in milk, with a 2×2 factorial arrangement of treatments. Within each block, cows
were fed one of four experimental diets containing LC (30% of dry matter) or HC (70%
of dry matter), without LO (NLO), or with LO supplemented at 3% of dry matter. The
experimental period was 4 weeks in length. Body weight, dry matter intake and milk
yield were recorded, and samples of feed and milk were harvested during the last week of
the experimental period. Data on production performance and milk fatty acids profiles
were reported by Saliba et al. (2014).
81
4.4.2 Sampling, measurements and analyses
On day 26 of the experimental period, composite milk samples from individual
cows were obtained by mixing samples from a.m. and p.m. milkings in proportion to milk
yield. These samples were used for the determination of milk lactone profile. This
analysis was performed in triplicate using the solid phase microextraction (SPME)
technique. Results from triplicate analysis were averaged for statistical analyses. A milk
sample of 9 g and 200 μl of the internal standard solution containing 4 μg/ml of γundecalactone (γ-11:0) were placed in a 20-ml glass vials which was sealed with
silicon/Teflon septa and magnetic caps. Milk lactones were extracted from the headspace
with a 2-cm, 50/30 μm divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane SPME fibre
(Supelco, Bellefonte, PA). The analysis of lactones was carried out by using a CombiPal
autosampler (CTC Analytics, Zwingen, Switzerland) attached to an Agilent 6890N gas
chromatograph with 5973 inert mass spectrometry (MS) detection (Agilent Technologies
Inc., Santa Clara, CA). The sample was pre-equilibrated at 55°C for 5 min with agitation
at 250 RPM. The fibre was then exposed to the headspace at the same temperature and
agitation for 60 min. Once the adsorption time was finished, the volatile compounds
extracted with the SPME fibre were thermally desorbed into the gas chromatograph
injector in splitless mode at 255°C during 3 min. Between each use, the fibre was cleaned
at 270°C for 20 min. in the CompilPal fibre conditioning station. Lactone compounds
were separated with a DB-FFAP column (30m×0.25 mm, film thickness 0.25 μm; Agilent
Technologies Inc.). The oven temperature was held at 40°C for 5 min., and then ramped
up at a rate of 5°C/min. up to 245°C. At that point, the temperature was held at 245°C for
25 min. Helium was used as carrier gas at a flow rate of 0.7 ml/min.
The mass spectrometer was operated in the electron impact ionisation mode at 70
eV; the mass range used was m/z 35–350. Scan was used as data acquisition mode. The
MS transfer line and the ion source temperatures were 255 and 230°C, respectively.
Compounds were identified by comparison with mass spectra from a library database
(NIST 08 Mass Spectral Library, version 2.0, Gaithersburg, MD, USA), and confirmation
of the identification of the lactones was achieved by comparing the GC retention times
82
with those of authentic standards spiked into milk. These volatile compounds were then
quantified using selective ions extracted from the scan data.
Standards of lactones (except γ-12:2) were a provided courtesy of Soda Aromatic
Co. Ltd. (Tokyo, Japan). Standard of γ-12:2 was kindly donated by Dr Justin Bendall,
Fonterra Research Centre, New Zealand. The relative abundance of each lactone was
obtained as the ratio of its peak to the area of γ-11:0 peak used as internal standard from
selective ion monitoring MS.
Also on day 26 of the experimental period, milk from the two consecutive
milkings was collected separately from each group of cows and pooled by treatment in
250-l bulk tanks. Once refrigerated at 4°C, milk was transported in stainless steel milk
cans to the Université Laval pilot plant. Each milk batch was standardised to 3.25% fat,
homogenised, and pasteurised at 75°C for 16 s. A sample from each treatment was frozen
at 20°C for further analysis of lactones. Additional samples of each type of milk were
collected and stored at 4°C to be used for sensory evaluation.
4.4.3 Sensory evaluation
Processed milk samples from d 26 of the experiment were first evaluated by a
panel of 30 untrained assessors recruited among laboratory staff and students to perform a
triangle test (Meilgaard et al. 2007). Panellists compared the flavour of milk from cows
fed LC/NLO with the milk from cows fed HC/ LO. This comparison was conducted after
the storage of pasteurised milk for 7 d at 4°C. Milks were served at 7°C in 3-digit-coded
100-ml amber glass cup. A red light was used in polling booths to hide any information
about the colour of milk.
83
While performing the triangle test, assessors were asked to characterise the nature
of the difference between samples using a checklist of twelve attributes. The rating
frequencies were as follow: grass (5), hazelnut (2), coconut (1), peach (1), butter (1),
vanilla (5), sweet (4), cream (12), foreign flavour (5), oil (2), fat (4), and others (6). These
frequencies were used to identify sensory attributes to be evaluated in a subsequent
ranking test by a similar panel of 15 instructed assessors. The test was performed with the
same sample presentations and environmental conditions. Panellists were asked to rank
LC/NLO, LC/LO and HC/LO milk samples in a complete block design for the intensity
of fresh lactic flavour (fresh milk, fresh cream, fresh butter), foreign flavour (herbaceous,
cardboard, oil, rancidity), and global flavour (fruit, nuts, roasted, vanilla, caramel) on a
scale of 1 to 3 (from less to more intense).
4.4.4 Statistical analysis
Data for milk lactone composition were analysed using the MIXED procedure of
SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). The model included the fixed effects of level of
concentrate, oil supplementation, and their interaction, and block as a random effect.
Results are reported as least square means and standard errors of the means. Differences
between treatments were declared at P < 0.05, and tendencies at 0.05 < P < 0.10.
Statistical analyses for data regarding sensory evaluation were performed with Fizz
(Sensory Analysis and Consumer Test Management Software, version 2.0a, Biosystemes,
Couternon, France). For the triangle test for difference, data were analysed by counting
the number of correct responses (correctly identified ‘different’ sample) and the number
of total responses. These numbers were compared with critical values as described by
Meilgaard et al. (2007) to determine significant differences. For the difference test,
parameters were defined at n = 30, α = 0.05, β = 0.10, and Pd = 30%. For the ranking test,
sums of ranks were calculated for the three selected sensory attributes and were tested
using a nonparametric 2-way analysis on ranks (Friedman test, significance level α =
0.05).
84
4.5 Results
The chemical composition of experimental diets was reported by Saliba et al.
(2014). The HC diets contained higher proportions of cracked corn and rolled barley,
which increased the proportion of starch by 3-fold, and decreased the proportion of ADF
and NDF by about 40% compared with LC diets. Supplementing diets with LO doubled
the concentration of total FA in the diet compared with NLO treatments. Moreover, LO
diets contained about 3 times more oleic and α-linolenic acids as compared with NLO
diets.
Regarding the concentrations of individual δ-lactones in milk, interactions were
observed between LO and the level of grains in the diet (Table 4.1). The highest
concentrations of δ-lactones were found with the LC diet not supplemented with LO.
These concentrations were then decreased when cows received either a high level of
concentrate or supplemental LO, but these effects were not additive. The only exception
was observed with milk concentrations of δ-14:0, which decreased when diets were
supplemented with LO but was not affected by level of concentrate.
An interaction of LO by concentrate was also noted on milk γ-12:0 for which a
significant increase was observed when supplementing LO in HC diet, while no effect
was apparent when LO was added in LC diet (Table 4.1). Moreover, feeding HC
increased the level of γ-12:1 in milk as compared with LC, while LO had no effect on this
parameter. Finally, γ-12:2 was not detected in any of the milk samples studied.
85
Table 4.1: Milk lactone profile in cows fed low (LC) or high (HC) concentrate diets without supplemental oil
(NLO), or supplemented with linseed oil (LO)
Treatment†
Item
δ-hexalactone (δ-6:0)
δ-octalactone (δ-8:0)
δ-decalactone (δ-10:0)
δ-dodecalactone (δ-12:0)
δ-tetradecalactone (δ-14:0)
γ-octalactone (γ-8:0)
γ-decalactone (γ-10:0)
γ-dodecalactone (γ-12:0)
γ-dodecaenolactone (γ-12:1)
γ-dodecadienolactone (γ12:2)
Sums
Total δ-lactones
Total γ-lactones
Total lactones
†
NLO
LC
HC
16.60
35.94
254.57
91.44
6.24
3.76
4.74
3.19
1.59
P-value‡
C
LO×C
LO
LC
HC
Relative abundance§
5.93
6.81
11.45
12.80
92.03
77.23
56.34
25.06
7.62
2.42
3.33
3.06
4.31
5.14
2.92
3.07
3.10
1.10
SEM
LO
4.54
7.43
81.28
40.03
4.11
3.46
6.35
14.81
2.51
2.12
4.58
18.84
10.07
2.02
0.73
1.08
1.87
0.60
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.05
0.44
0.06
< 0.01
0.33
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.28
0.37
0.97
0.51
< 0.01
0.02
0.01
0.02
< 0.01
0.02
0.93
0.25
0.18
< 0.01
0.93
nd¶
nd
nd
nd
-
-
-
-
402.06
13.47
413.09
170.49
13.58
182.71
124.31
12.37
136.68
137.39
27.13
164.52
31.67
3.51
33.85
< 0.01
0.03
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
< 0.01
0.01
< 0.01
n = 6 per treatment
P- value for the effect of linseed oil (LO), concentrates (C), and the interaction of linseed oil by concentrates (LO×C)
§
The relative abundance of each lactone was obtained as the ratio of its peak to the area of γ-undecalactone peak used as internal standard
¶
Not detected.
‡
86
When expressed as relative proportions, δ- and γ-lactones represented 93.5 and
6.5% of total lactones, respectively, in milk from cows fed the LC diets. A shift toward a
higher proportion of γ-lactones was observed when cows were fed with HC diets (88.4
and 11.6%; effect of concentrates: P < 0.01). Adding LO to the diet also resulted in a
shift towards a higher proportion of γ-lactones (NLO: 95.0 and 5.0% for δ- and γlactones, respectively, LO: 86.9 and 13.1%; P < 0.01). Similar variations in the
proportions of δ- and γ-lactones were observed in processed milk samples used for
sensory evaluation (Figure 4.1).
Results of the triangle test show that a significant number of assessors (15 correct
observations; n = 30; P = 0.04) perceived a difference between milk from cows fed
LC/NLO when compared with milk from cows fed HC/LO. The sensory analysis was
completed by a sensory ranking test (n = 15). The results indicate that the intensity of
fresh lactic (P = 0.55), foreign (P = 0.28) and global (P = 0.42) flavours were considered
not different between LC/NLO, LC/LO and HC/LO milk samples.
4.6 Discussion
Freshly secreted milk is known to contain varying concentrations of lactones
which are synthesised in the rumen or in animal tissues (Walker et al. 1968; Joblin &
Hudson, 1997), and are identified as ‘free lactones’. In several experiments, lactone
potential (e.g. free lactones, plus lactones produced from hydroxy acids by heat
treatment) was analysed using cold-finger molecular distillation, followed by silicic acid
column chromatography, and then gas chromatography of the fractions (Stark et al.
1978). The SPME technique used in the current trial provides a quantification of lactones
in headspace over milk samples while heating at 55°C for 60 min. with agitation. This
method estimated the free lactone content, but it cannot be excluded that the release of 4and 5-hydroxy acids from milk triglycerides, and their respective conversion to γ- and δlactones, could have been quantitatively significant during this extraction procedure. In
87
this regards, Stark et al. (1976) have shown that breakdown of lactone precursors of milk
fat and their conversion to free lactones occur at temperature as low as 35°C. It should be
noted, however, that the complete generation of lactone potential requires much higher
temperature (e.g. 180°C; Stark et al. 1978).
The interaction between LO and level of concentrate on the level of δ-lactones is
consistent with the data reported by Urbach & Stark (1978) showing numerically lower δlactone potential in cows fed crushed oats (source of starch), or sunflower seeds (sources
of unsaturated fatty acids). However, Bendall (2001) reported no difference in the
frequency of detection of δ lactones (δ-6:0, δ-8:0, δ-10:0, δ-12:0 and δ-14:0) in milk from
cows on pasture or fed total mixed rations containing grain supplements. On the contrary,
Dimick & Harner (1968) observed higher potential for δ-10:0, δ-12:0 and δ-14:0 when
cows received indoor diets as compared with pasture feeding.
According to Walker et al. (1968), even carbon-numbered saturated δ-lactones
could be synthesised from acetate in the mammary gland. Diets containing high levels of
concentrates are known to produce a lower proportion of acetate in the rumen (Griinari et
al. 1998). Moreover, Loor et al. (2005) have shown that shifting from a high forage
(65:35 F:C) to a high concentrate (35:65 F:C) diet decreased plasma concentration and
the jugular/mammary venous difference of acetate. Less acetate is then available, in the
mammary gland, which may explained the lower level of δ-lactones in milk of cows fed
high concentrate diets in the current trial. The negative impact of vegetable oil on milk δlactone content could also be explained by the same mechanism, as dietary unsaturated
fatty acids have also been shown to reduce ruminal production of acetate (Griinari et al.
1998) through the inhibition of fibre digestion.
The interaction observed in the current study on the levels of γ-12:0 for which a
substantial increase has been obtained with the combined effects of LO and HC diets is
also in line with the experiment conducted by Urbach & Stark (1978). In this latter study,
88
the concentrations of γ-12:0 were increased by both supplemental concentrates (crushed
oats) and unsaturated fatty acids (full-fat sunflower seeds).
The γ-12:0 is formed by the hydration and β-oxidation of oleic acid which was
found in higher concentrations in diets supplemented with LO (Saliba et al. 2014). In
particular, Jenkins et al. (2006) have shown that oleic acid is the ruminal precursor of 10hydroxy stearic acid whose accumulation in ruminal contents is directly related to the
supply of oleic acid. Moreover, Hudson et al. (1995, 2000) have shown that Selenomonas
ruminantium and Streptococcus bovis are among major bacteria capable of hydrating
unsaturated fatty acids in the rumen. Khafipour et al. (2009) have shown that the
proportion of these latter bacteria increased during mild grain-induced subacute ruminal
acidosis; which may explain the higher level of γ-12:0 observed with HC diet
supplemented with LO in the current experiment. In contrast with this series of
observations, Bendall (2001) reported no difference in the frequency of detection of γ10:0, γ-12:0, and γ-12:1 in milk of cows on pasture or fed total mixed rations.
No γ-12:2 has been detected using the SPME technique in the current trial, even if
dietary supply of α-linolenic acid was increased by feeding LO (Saliba et al. 2014). In
contrast, 50% of the sniffers were able to identify the presence γ-12:2 in milk of cows fed
total mixed rations in a study conducted by Bendall (2001) when milk volatile
compounds were concentrated by the Solvent-Assisted Flavour Evaporation technique
(Engel et al. 1999). As described by Kim (2005), γ-12:2 could be produced during
themicrobial lactonisation of α-linolenic acid, with 10-hydroxy-linoleic acid as
intermediate. According to results from the current trial, this reaction does not appear to
be significant in dairy cows. We therefore hypothesised that dietary α-linolenic initially
undergoes partial biohydrogenation by ruminal microorganisms to produce transoctadecenoic intermediates. This is supported by an increase in trans octadecenoic acid
content of milk fat when feeding LO, as reported in a companion paper (Saliba et al.
2014). Trans-octadecenoic acids produced in the rumen could be hydrated to yield 10hydroxy-stearic acid, as it has been shown by McKain et al. (2010). Subsequently, 10-
89
hydroxy-stearic acid is converted to γ-12:0, which was found at higher concentration in
milk of cows fed LO in HC diet.
When expressed as relative proportions, δ- and γ-lactones represented 96.7 and
3.3% of total milk lactones, respectively, when cows received LC diet without
supplemental oil. The relative proportion of δ- and γ-lactones observed with this
treatment is similar to the data reported by Hettinga (2005) when summarising the
literature with saturated δ- and γ-lactones constituting 94 and 6% of total milk lactones,
respectively. The shift toward higher proportions of γ-lactones (16.4% of total lactones)
at the expense of δ-lactones (83.6% of total lactones) observed when LO was added in
HC diet is in line with the potentially reduced acetate production (substrate for δ-lactone
synthesis) and higher hydration of unsaturated fatty acids (initial step in the production of
γ-lactones). Processed milk samples from day 26 of the experimental period, which were
used for sensory evaluation, showed similar variations with a change for more γ-lactones
and less δ-lactones when feeding LO in HC diet (Figure 4.1).
90
Figure 4.1: Lactone profile of processed milk samples from cow fed low (LC) or
high (HC) concentrate diets without supplemental oil (NLO), or
supplemented with linseed oil (LO). Values represent the average of 3
replicates, with standard deviations shown as error bars
Results of the ranking test show that the three samples were classified an equal
number of times in the first, second or third position for each sensory attribute.
Consequently, there is no difference between treatments in the intensity of fresh lactic
flavour with sensory descriptors ‘cream’ and ‘butter’, or in the intensity of global flavour
with sensory descriptors ‘fruit’ and ‘roasted’. These descriptive sensory characteristics
were all previously attributed to lactones (Moio et al. 1993; Bendall, 2001). However, the
variations in lactone profile between treatments were not related to any perceived
differences in the sensory attributes evaluated by the panel. One may speculate that
untrained assessors did not have the expertise to detect subtle changes in the aroma
descriptors related to lactones, even if they were able to perceive a difference between
samples during the triangle test. It is also possible that the differences between samples
91
detected during the triangle test were related to sensory characteristics different from
those proposed in the ranking test. Indeed, sensory properties of fluid milk are affected by
the concentrations of highly diversified classes of compounds, some of them presenting
lower flavour threshold than lactones (Belitz et al. 2009). It is possible that dietary
treatments might have impacted the concentrations of other volatile compounds, the latter
being associated with different sensory attributes.
In conclusion, the SPME technique used in the current trial allows for the
determination of milk lactone profile which was affected by dietary supply of LO or the
level of grains in the ration. An interaction of LO by concentrate was observed for the
levels of most δ-lactones for which the highest concentrations were found with the
LC/NLO diet. These concentrations were then decreased when cows received either a HC
diets or supplemental LO, while these effects were not additive. An interaction of LO by
concentrate was also apparent on milk γ-12:0 for which no effect was apparent when LO
was added in LC diet, while a higher concentration was observed when supplementing
LO in HC diet. Finally, LO had no effect on γ-12:1, while feeding HC diets increased the
level of this γ-lactone in milk compared with LC diets. Assessors were able to perceive a
difference in a triangle test between milk from these two treatments, but the attributes
responsible for this sensory perception have not been identified in the current trial.
92
4.7 Acknowledgements
This experiment was funded through Industrial Research Chair programme of
Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Ottawa, ON, Canada),
with industry contributions from Dairy Farmers of Canada (Ottawa, ON, Canada),
Novalait Inc. (Québec, QC, Canada), Valacta (Ste-Anne-de-Bellevue, QC, Canada),
Fédération des Producteurs de Lait du Québec (Longueuil, QC, Canada), and Ministère
de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du Québec (Québec, QC, Canada).
The authors thank André Perreault and Philippe Cantin as well as the administrative staff
of the Centre de Recherche en Sciences Animales de Deschambault (Québec, Canada) for
the care provided to cows during the trial. The authors are also grateful to Gabrielle StPierre and Micheline Gingras from the Département des Sciences Animales, Université
Laval for their assistance in samplings and laboratory analyses.
93
4.8 References
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95
CHAPITRE 5: CONCLUSION
97
CHAPITRE 5
Conclusion
Au cours de travaux antérieurs, la graine de lin entière et l'huile de lin, qui sont
des sources de l’acide -linolénique, ont été étudiées chez la vache laitière pour leurs
effets sur les performances de production et de reproduction, le profil en acides gras et les
propriétés physiques de la matière grasse du lait, ainsi que sur la production entérique de
méthane. Lorsque les vaches reçoivent la graine de lin entière ou l'huile de lin, l’acide linolénique peut être soumis aux processus de biohydrogénation ou de lactonisation
(Figure 5.1).
Figure 5.1: Devenir de l'acide linolénique chez la vache laitière
98
Le sentier principal de biohydrogénation ruminale de l’acide -linolénique
implique une isomérisation initiale où le lien cis-12 est converti en lien trans-11 (Figure
5.2). La biohydrogénation se poursuit avec la production de différents isomères ayant un
lien trans-11 jusqu’à la production du 18:0. Dans la présente étude, une augmentation de
chacun de ces isomères a été observée dans le lait des vaches recevant l’huile de lin
(Figure 5.2).
Un sentier alternatif de biohydrogénation de l’acide -linolénique, impliquant une
isomérisation initiale où le lien cis-12 est converti en lien trans-13, a également été
proposé (Figure 5.2). Une augmentation de chacun des isomères de ce sentier a aussi été
observée dans le lait chez les vaches recevant l’huile de lin, à l’exception du
18:3 cis-9, trans-13, cis-15 qui n’a pas été détecté dans nos échantillons de lait. Les
résultats de la présente étude supportent donc l’existence d’un sentier trans-13 de
biohydrogénation de l’acide -linolénique et ce, même si le premier intermédiaire
triénoïque de ce processus n’a pu être identifié.
99
Figure 5.2: Sentiers de biohydrogénation de l'acide -linolénique et métabolisme
mammaire des intermédiaires produits. Les flèches () indiquent les
isomères pour lesquels une augmentation a été observée dans le lait
des vaches ayant reçu de l'huile de lin dans leur alimentation (voir
chapitre 3)
100
Le processus de lactonisation quant à lui s’effectue en deux étapes chez le
ruminant. Il débute par l’hydroxylation des acides gras insaturés dans le rumen (Figure
5.3). La conversion se poursuit dans les tissus de l’animal par une série de réaction de βoxydation suivie d’une cyclisation pour produire les γ-lactones. Selon ce processus, les
acides oléiques, linoléiques et -linolénique sont respectivement les précurseurs des
lactones γ-12:0, γ-12:1 et γ-12:2 (Figure 5.3).
Figure 5.3: Voie suggérée de production de la lactone γ-12:0 à partir de l'acide linolénique débutant par la biohydrogénation partielle de l'acide gras
par les microorganismes du rumen et se poursuivant avec la
lactonisation des intermédiaires monoénoïques (18:1)
101
Cependant, la γ-12:2 n’a pas été détectée dans le lait des vaches et ce, même chez
celles recevant l’huile de lin comme source d’acide -linolénique dans leur ration. Par
contre, le supplément d’huile de lin, lorsqu’ajouté à une ration riche en aliments
concentrés, a entraîné une augmentation de la proportion de γ-12:0 dans le lait. Pour
expliquer cet effet, nous émettons l’hypothèse que l’acide -linolénique a subi d’abord
une biohydrogénation partielle conduisant à la production de différents isomères
monoénoïques (18:1). Ces derniers sont ensuite soumis successivement à des réactions
d’hydroxylation et de lactonisation pour produire la γ-12:0 sécrétée dans le lait.
Les travaux présentés dans ce mémoire apportent donc de nouvelles
connaissances quant aux réactions métaboliques impliquées dans l’utilisation de l’acide
-linolénique par la vache laitière. L’impact des changements observés aux profils en
acides gras et en lactones du lait sur sa valeur nutritive et ses propriétés organoleptiques
reste toutefois à déterminer.
102

Effet d`un supplément d`huile de lin avec différents niveaux d`amidon

Transcription

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