OWMG G15 E30(0874)SD

Enzygnost® TAT micro
Enzyme immunoassay for the determination of human thrombin/
antithrombin III complex
Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Human-Thrombin/
Antithrombin III-Komplex
Test immunoenzymatique pour le dosage du complexe thrombine/
antithrombine III humain
English:
Page
12
to
16
Deutsch:
Seite
17
bis
11
Francais:
Page
12
à
16
Reference Interval
Page
16
Referenzbereich
Seite
11
Domaine de reference
Page
16
Bibliography/Literatur/Littérature:
Page/Seite/Página 17
OWMG G15 E30 (0874) H
1
Edition June 1998
Enzygnost® TAT micro
Enzyme immunoassay for the determination of human thrombin/
antithrombin III complex
Intended Use and Application
Enzygnost TAT micro is an enzyme immunoassay for the quantitative determination of thrombin/
antithrombin III complex (TAT) in human plasma and is used for the diagnosis of disturbances in
blood coagulation, which are associated with changes in the activity of the coagulation system.
Summary and Explanation
The conversion of prothrombin into active thrombin is a key event within the coagulation cascade.
Thrombin acts on various physiological substrates (fibrinogen, protein C, platelets, etc.) and is
inhibited by antithrombin III; this results in an inactive proteinase/inhibitor complex, the
concentrations of which can be measured quantitatively by enzyme immunoassay (1).
The clinical significance of the determination of thrombin/antithrombin III complex is in the
diagnosis of thrombotic events. Persons predisposed to thrombosis, and disseminated
intravascular Coagulation (DIC) patients, are found to have elevated concentrations of TAT (2, 3).
The determination of TAT is also of importance in the following groups of patients: patients with
multiple trauma, liver dysfunction, septicaemia (4), and preeclampsia (5). In patients with malignant
diseases, levels of TAT have been found to be raised in relation to the stage of the disease. Rises
in TAT concentrations have been observed in the course of heparin and fibrinolysis therapy (6, 7).
Principle of the Method
Enzygnost TAT micro is a sandwich enzyme immunoassay for the in vitro determination of human
thrombin/antithrombin III complex (TAT).
During the first incubation step the TAT present in the sample binds to the antibodies against
thrombin which are attached to the surface of the microtitration plate. Unbound constituents are
then removed by washing and, in a second reaction, peroxidase-conjugated antibodies to human
ATIII are bound to the free ATIII determinants. The excess enzyme-conjugated antibodies are
removed by washing; the bound enzyme activity is then determined. The enzymatic reaction
between hydrogen peroxide and chromogen is terminated by the addition of dilute sulphuric acid.
The resulting colour intensity, which is proportional to the concentration of TAT, is determined
photometrically. The concentration range of 2 to 60 µg/l is covered by the standards contained in
the kit. For higher concentrations the sample must be diluted with TAT Dilution Plasma.
Reagents
Materials provided
Test kit for 2 x 96 determinations, Code No. OWMG, containing
Enzygnost TAT (microtitration plates)
Anti-ATIII/POD Conjugate
Conjugate Buffer (coag.)
TAT Standard Plasmas S1 to S4
TAT Control Plasma
Sample Buffer (TAT)
Washing Solution POD (concentrate)
Buffer/Substrate POD
Chromogen POD
Stopping Solution POD
Adhesive foils
OWMG G15 E30 (0874) H
2
Edition June 1998
Composition
Enzygnost TAT micro: Microtitration plates coated with rabbit antibodies against human thrombin
Anti-human ATIII/POD Conjugate: Rabbit anti-human ATIII, peroxidase conjugated;
Preservative: Phenol (< 1 g/l)
Conjugate Buffer (coag.): Tris buffer solution (50 mmol/l), bovine serum albumin;
Preservative: Phenol (< 0.3 g/l)
TAT Standard Plasmas S1 to S4 (human): Concentration range 2 to 60 µg/l;
Preservative: 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazole-3-one (max. 38 mg/l)
2-methyl-4-isothiazole-3-one (max. 12.5 mg/l)
TAT Control Plasma (human): See vial label for assigned value;
Preservative: 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazole-3-one (max. 38 mg/l)
2-methyl-4-isothiazole-3-one (max. 12.5 mg/l)
Sample Buffer (TAT): Tris buffer solution (100 mmol/l), Tween (10 ml/l), EDTA (37 g/l);
Preservative: Sodium azide (< 1 g/l)
Washing Solution POD (Concentrate): Phosphate buffer solution (90 mmol/l) containing Tween
(18 g/l);
Preservative: Phenol (max. 1 g/l)
Buffer/Substrate POD: Hydrogen peroxide (0.3 g/l) in citrate buffer solution;
Preservative: n-butanol (max. 0.1 g/l)
Chromogen POD: o-phenylenediamine dihydrochloride
Stopping Solution POD: 0.5 N sulphuric acid
Adhesive foils
Materials required but not provided: TAT Dilution Plasma, Code No. NCEP
Warnings and Precautions
1. For In Vitro Diagnostic Use.
2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution:
Do not ingest or allow to contact skin or mucous membranes! Sodium azide can form explosive
azides when contacting heavy metals such as copper or lead!
3. Each individual blood donation for use in manufacture of standard and control plasma is tested
for hepatitis B surface antigen, anti-HCV, anti-HIV1 and anti-HIV2 by FDA-required test. Only
donations with negative findings are used for manufacture.
Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from
human blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended
for biohazardous material(8).
4. Skin contact with Chromogen POD, Working Chromogen Solution and Stopping Solution POD
is to be avoided.
Preparation of the Reagents
Satisfactory performance of the test is assured only if the reagents used have the required lot no.;
the required lot nos. are listed on the pack.
Washing Solution POD (Concentrate): Dilute 15 ml to 300 ml with distilled or demineralized
water (sufficient for 2 test plates). If fewer than 2 test plates are required, a corresponding portion of
the Washing Solution POD (Concentrate) is to be diluted with water.
Working Conjugate Solution: Pipette 200 µl of Anti-human ATIII/POD Conjugate into a vial of
Conjugate Buffer (coag.) (11 ml) and shake gently to mix (sufficient for 1 test plate):
TAT Standard Plasmas S1 to S4 and TAT Control Plasma (human): Reconstitute each in 1 ml of
distilled water or demineralized water. Standards S1 to S4 then contain 2, 6, 20 and 60 µg/l TAT
respectively and the control contains the value given on the label (e. g. 10 ± 2 µg/l).
Bring all the reagents and samples to +20 to +25°C before the start of the test.
OWMG G15 E30 (0874) H
3
Buffer/Substrate POD, Working Chromogen Solution and Stopping Solution POD must not be
allowed to contact heavy metal ions or oxidizing substances (do not use pipettes with metal parts).
If laboratory glassware is employed to prepare comparatively large amounts of the Working
Chromogen Solution, it should be rinsed well beforehand and dried at +120°C.
Storage and Stability
At +2 to +8 °C: All the unopened components of the test kit can be used up to the date given on the
label. After opening (first use), unused strips of the test plates can be used within 4 weeks if stored
in the tightly closed aluminium bag together with the desiccant capsules. Remainders of the
conjugate, conjugate buffer, working conjugate (conjugate diluted with conjugate buffer) and
sample buffer can be used within a maximum of 4 weeks. Diluted washing solution can be used
within 1 week.
At +15 to +25 °C: The standard plasmas and control plasma can be used within a maximum of 8
hours after reconstitution. After opening, the washing solution (concentrate), buffer/substrate and
stopping solution can still be used by the labelled expiry date. The working chromogen solution
(solution of chromogen in buffer/substrate) must be protected from light and used within one hour.
At –20 °C: The conjugate, conjugate buffer, standard plasma, control plasma and sample buffer
can be used within 3 months. Remaining amounts of the working chromogen solution must be
frozen within 30 min after reconstitution and then used within 2 weeks.
Materials required but not provided
Equipment required
Piston-type pipettes: 50 µl, 100 µl, 200 µl
For automatic dispensing of reagent, washing and evaluation: Behring ELISA Processor II, water
bath (+37 °C, circulating).
If the Behring ELISA Processor II is not used, the following will also be required:
Washing device: Behring ELISA Washer M or washing device for microtitration plates or dispenser
for approx. 0.3 ml with an aspiration system
Photometer:
Photometer suitable for reading microtitration plates, wavelength 492 nm
(490 – 500 nm)
Specimens
To obtain the plasma, carefully mix 1 part citrate buffer solution or sodium citrate solution 0.11 mol/l
with 9 parts venous blood, avoiding the formation of foam. Centrifuge immediately at no less than
1500 x g for at least 10 min and remove the supernatant plasma.
Stability of the sample:
+12 to +28 °C 4 hours
+15 to +25 °C 4 hours
- 20 °C
1 month
Method
Procedure
Note: All the determinations (standards, control, patient samples) are to be performed in
duplicate. The reference curve must be established for each series of measurements using the
standards. In order to assure the accuracy and precision of Enzygnost TAT micro, the samples
should be pipetted within 5 minutes, e.g. by using a sample processor station or with the aid of
a multi-channel pipette and the Micronix®-System. Alternatively, use a second standard series
after 5 minutes for the remainder of the microtiter plate. The incubation period begins when
the plate is placed in the water bath!
OWMG G15 E30 (0874) H
4
During the pipetting steps care should be taken to avoid the formation of comparatively large
bubbles. The incubation times can be freely selected from within the given ranges but must be the
same for all the assay mixtures within a series.
11. Ascertain the number of strips required (each strip contains 8 wells, 2 wells each are required
for standards, control, and sample). Remove from the holder strips which are not required and
store well-closed with the desiccant in the plastic bag at +2 to +8 °C.
12. Into each well pipette a receiving volume of 50 µl Sample Buffer (TAT). To each well then add
50 µl standard, control or sample. After filling the test plates shake briefly to ensure thorough
mixing.
13. Cover with self-adhesive foil and incubate for 15 min (± 2 min) +37 °C.
14. Remove the self-adhesive foil, aspirate all the wells, fill with approx. 0.3 ml diluted washing
solution and aspirate again. Repeat this washing step two more times, then remove any
remaining washing solution by knocking the test plate on a cellulose tissue.
15. Pipette 100 µl of Working Conjugate Solution into each well (starting at tube 1), taking care not
to wet the edges of the wells if possible.
16. Cover with fresh self-adhesive foil and incubate for 15 min (± 2 min) at +37 °C.
17. Prepare the Working Chromogen Solution: shortly before the end of the incubation period,
transfer 10 ml Buffer/Substrate POD (temperature +20 to +25 °C) into a vial of Chromogen
POD and shake to dissolve.
18. Remove the foil, aspirate all the wells and wash three times as described above, then remove
any remaining liquid by knocking the test plate on a cellulose tissue.
19. To each well add 100 µl of the freshly prepared Working Chromogen Solution.
10. Cover with fresh foil, incubate for 30 min (± 2 min) at +20 to +25 °C protected from light (e. g.
in a dark drawer).
11. Remove the foil and add 100 µl of Stopping Solution POD, keeping to the same timing as for
the dispensing of the Working Chromogen Solution (Step 9).
12. Within one hour read against distilled water; measurement wavelength 492 nm (490–500 nm).
Evaluation
After calculating the mean absorbance values of the standards plot the reference curve on log-log
graph paper (abscissa: concentration 2 to 60 µg/l, ordinate: absorbance 0 to 2).
Typical reference curve
Abs. 492 nm
2.0
1.0
0.5
0.1
2
OWMG G15 E30 (0874) H
6
20
TAT conc. in the sample (µg/l)
5
60
The TAT concentrations can be read directly from the reference curve via their respective
absorbance values. Alternatively, the evaluation can be performed via computer using polygonal
interpolation. As the reference curve in the upper region (between Standard S3 and S4) is actually
slightly curved, the TAT concentrations determined by this method can deviate marginally from
those obtained by the graphic evaluation method. Samples which yield absorbances above the
uppermost standard must be retested in other dilutions (e.g. 1:10). Sample dilutions must be
prepared using TAT Dilution Plasma or using a normal plasma with a TAT content of < 4 µg/l. The
TAT content of the dilution plasma must be taken into account in the calculation of the TAT
concentration of the sample.
Internal quality control
Quality control is accomplished for each series of measurements using the TAT Control Plasma
supplied in the kit. The measurement values for the samples can only be used if the value for the
control is within the confidence interval.
Limitations and Interferences
Note: Incorrect blood collection technique, e. g. inadequate mixing of the sample and citrate
solution, can lead to falsely elevated TAT values.
Haemolytic, lipaemic and rheumatoid-factor-containing plasmas do not interfere with the
determination. EDTA plasmas can also be used.
Reference Interval
Citrated plasma of
healthy adults (n = 196): Median = 1.5 µg/l
Reference range (2.5th – 97.5th percentile)
= 1.0 – 4.1 µg/l
Specific Performance Characteristics
Measurement Range and Sensitivity
The measurement range of Enzygnost TAT micro extends from 2 to 60 µg/l.
Specificity
The test is specific for human thrombin/antithrombin III complex.
Precision and Reproducibility
In the range between 2 and 60 µg/l the coefficient of variation in the series (intra-assay CV) was
found to fall between 4 and 6% whereas the coefficient of variation from day to day (inter-assay CV)
was found to fall between 6 and 9%. The recovery of TAT in the plasma was 95 to 105%.
Note:
The values cited for specific performance characteristics of the assay represent typical results and
are not to be regarded as specifications for the Enzygnost TAT micro test kit.
Manufacturer:
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg/Germany
USA Distributor:
Dade Behring Inc.
Newark, DE 19714 U.S.A.
OWMG G15 E30 (0874) H
6
Enzygnost® TAT micro
Enzymimmunoassay zur
Antithrombin III-Komplex
Bestimmung
von
Human-Thrombin/
Anwendungsbereich und -zweck
Enzygnost TAT micro ist ein Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Thrombin/
Antithrombin III-Komplex (TAT) in Human-Plasma zur Diagnose von Störungen der Blutgerinnung,
die Veränderungen in der Aktivität des Gerinnungssystems mit sich bringen.
Diagnostische Bedeutung
Die Umwandlung von Prothrombin zum aktiven Thrombin stellt ein zentrales Ereignis im Ablauf der
Gerinnungskaskade dar. Thrombin wirkt auf verschiedene physiologische Substrate ein
(Fibrinogen, Protein C, Plättchen etc.) und wird durch Antithrombin III gehemmt; hierbei wird ein
inaktiver Proteinase/Inhibitor-Komplex gebildet, der quantitativ durch einen Enzymimmunoassay
erfaßt werden kann (1).
Die Bedeutung der Bestimmung von Thrombin/Antithrombin III-Komplex liegt in der Diagnose
thrombotischer Ereignisse. Bei Personen mit Neigung zu Thrombosen oder DIC-Patienten werden
erhöhte Konzentrationen von TAT gemessen (2, 3). Darüber hinaus ist die Bestimmung von TAT
bei folgenden Patientengruppen von Bedeutung: Polytrauma-Patienten, Patienten mit Leberfunktionsstörungen, Sepsis-Patienten (4) und Patientinnen mit Präeklampsie (5). Bei Patienten mit
malignen Erkrankungen wurden in Abhängigkeit vom Tumorstadium erhöhte TAT-Spiegel festgestellt. Im Verlauf von Heparin- und Fibrinolyse-Therapie wurden Anstiege der TAT-Konzentration
beobachtet (6, 7).
Prinzip der Methode
Enzygnost TAT micro ist ein Enzymimmunoassay nach dem Sandwich-Prinzip zur in-vitro-Bestimmung des Human-Thrombin/Antithrombin III-Komplexes (TAT).
Während der ersten Inkubation bindet sich das in der Probe vorhandene TAT an die Antikörper
gegen Thrombin, die an der Oberfläche der Mikrotitrationsplatte fixiert sind. Nach Auswaschen
werden in einer 2. Reaktion Peroxidase-konjugierte Antikörper gegen Human-ATIII an die freien
ATIII-Determinanten gebunden. Die überschüssigen Enzym-konjugierten Antikörper werden ausgewaschen; anschließend wird die gebundene Enzymaktivität bestimmt. Die enzymatische Umsetzung von Wasserstoffperoxid und Chromogen wird durch Zusatz von verdünnter Schwefelsäure
unterbrochen. Die der Konzentration von TAT proportionale Farbintensität wird photometrisch bestimmt. Der Konzentrationsbereich von 2 bis 60 µg/l wird durch die in der Packung enthaltenen
Standards abgedeckt. Bei höheren Konzentrationen muß die Probe mit TAT-Verdünnungsplasma
verdünnt werden.
Reagenzien
Handelspackungen und Bestellnummern
Testkit für 2 x 96 Bestimmungen, Bestell-Nr. OWMG, mit
Enzygnost TAT (Mikrotitrationsplatten)
Anti-ATIII/POD-Konjugat
Konjugat-Puffer (coag.)
TAT-Standard-Plasmen S1 bis S4
TAT-Kontroll-Plasma
Proben-Puffer (TAT)
Waschlösung POD (Konzentrat)
Puffer/Substrat POD
Chromogen POD
Stopplösung POD
Abklebefolien
OWMG G15 E30 (0874) H
7
Ausgabe Juni1998
Zusammensetzung
Enzygnost TAT micro: Mit Kaninchen-Antikörpern gegen Human-Thrombin beschichtete Mikrotitrationsplatten
Anti-Human-ATIII/POD-Konjugat: Anti-Human-ATIII, Peroxidase-konjugiert, vom Kaninchen.
Konservierungsmittel: Phenol (< 1 g/l)
Konjugat-Puffer (coag.): Tris-Pufferlösung (50 mmol/l), Serumalbumin vom Rind;
Konservierungsmittel: Phenol (< 0,3 g/l)
TAT-Standard-Plasmen S1 bis S4 (human): Konzentrationsbereich 2 bis 60 µg/l;
Konservierungsmittel: 5-Chlor-2-methyl-4-isothiazol-3-on (max. 38 mg/l)
2-Methyl-4-isothiazol-3-on (max. 12,5 mg/l)
TAT-Kontrollplasma (human): Sollwert siehe Flaschenetikett;
Konservierungsmittel: 5-Chlor-2-methyl-4-isothiazol-3-on (max. 38 mg/l)
2-Methyl-4-isothiazol-3-on (max. 12,5 mg/l)
Proben-Puffer (TAT): Tris-Pufferlösung (100 mmol/l), Tween (10 ml/l), EDTA (37 g/l);
Konservierungsmittel: Natriumazid (< 1 g/l)
Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige (18 g/l) Phosphat-Pufferlösung (90 mmol/l);
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Puffer/Substrat POD: Wasserstoffperoxid (0,3 g/l) in Citrat-Pufferlösung;
Konservierungsmittel: n-Butanol (max. 0,1 g/l)
Chromogen POD: o-Phenylendiamin-dihydrochlorid
Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure
Abklebefolien
Zusätzliche benötigte Materialien: TAT-Verdünnungsplasma, Bestell-Nr. NCEP
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung
2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen In-vitro-Diagnostica ist zu beachten:
Verschlucken und Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Natriumazid kann mit
Schwermetallen, wie Kupfer oder Blei, explosive Azide bilden.
3. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Standard- und Kontrollplasmen vorgesehen war, wurde auf Hepatitis Bs-Antigen, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet.
Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden(8).
4. Der Kontakt von Chromogen, Chromogen-Puffer/Substrat-Lösung und Stopplösung mit der
Haut ist zu vermeiden.
Vorbereitung der Reagenzien
Die einwandfreie Durchführung des Tests ist nur bei Verwendung von Reagenzien mit vorgegebener Chargenbezeichnung (Ch. B.) gewährleistet; die zulässige Kombination ist der Zusammenstellung auf der Kombinationspackung zu entnehmen.
15 ml Waschlösung POD (Konzentrat) mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 300 ml
verdünnen (ausreichend für 2 Testplatten). Werden weniger als 2 Testplatten benötigt, ist ein entsprechender Anteil der Waschlösung (Konzentrat) mit Wasser zu verdünnen.
200 µl Anti-Human-ATIII/POD-Konjugat zu einer Abfüllung Konjugat-Puffer (coag.) (11 ml) geben
und unter leichtem Schütteln vermischen (ausreichend für 1 Testplatte): Konjugat-Lösung.
Standard-Plasmen S1 bis S4 und Kontroll-Plasma (human) werden in jeweils 1 ml destilliertem
oder entionisiertem Wasser gelöst. Die Standards S1 bis S4 enthalten dann 2, 6, 20 und 60 µg/l
TAT, die Kontrolle den auf dem Etikett angegebenen Wert (z. B. 10 ± 2 µg/l).
OWMG G15 E30 (0874) H
8
Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +20 bis +25 °C erwärmen. Puffer/Substrat, die
Lösung von Chromogen in Puffer/Substrat und die Stopplösung dürfen nicht mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen zusammengebracht werden (keine Pipetten mit Metallteilen
verwenden). Werden zur Herstellung größerer Mengen an Chromogen-Puffer/Substrat-Lösung
Laborgefäße verwendet, so sind diese zuvor gut zu spülen und bei +120 °C zu trocknen.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Bei +2 bis +8 °C: Ungeöffnet sind alle Bestandteile des Testkits bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Datum verwendbar. Geöffnet bzw. nach erstmaligem Vebrauch sind nicht verbrauchte Riegel der Testplatten im gut verschlossenen Alu-Beutel mit Trockenkapseln 4 Wochen verwendbar.
Reste von Konjugat, Konjugat-Puffer, mit Konjugatpuffer verdünntem Konjugat und Proben-Puffer
sind maximal 4 Wochen verwendbar. Verdünnte Waschlösung ist eine Woche verwendbar.
Bei +15 bis +25 °C: Standard-Plasmen und Kontroll-Plasma sind nach Rekonstitution maximal 8
Stunden verwendbar. Waschlösung (Konzentrat), Puffer/Substrat und Stopplösung sind nach dem
Öffnen auch bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Datum verwendbar. Die Lösung von
Chromogen in Puffer/Substrat ist lichtgeschützt aufzubewahren und innerhalb einer Stunde zu
verwenden.
Bei –20 °C: Konjugat, Konjugat-Puffer, Standard-Plasma, Kontroll-Plasma und Proben-Puffer sind
3 Monate verwendbar. Reste der Lösung von Chromogen in Puffer/Substrat müssen innerhalb von
30 min nach Rekonstitution eingefroren werden und sind 2 Wochen verwendbar.
Zusätzlich benötigte Materialien
Zusätzlich benötigte Geräte
Kolbenhubpipetten: 50 µl, 100 µl, 200 µl
Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung, der Waschschritte sowie der Auswertung: Behring ELISA Processor II, Wasserbad (37 °C, zirkulierend)
Ohne Einsatz des Behring ELISA Processor II werden zusätzlich benötigt:
Waschvorrichtung: Behring ELISA Washer M oder Waschgerät für Mikrotitrationsplatten oder
Dispenser für ca. 0,3 ml mit Absaugsystem
Photometer:
Photometer geeignet für Mikrotitrationsplatten, Meßwellenlänge 492 nm
(490 – 500 nm)
Untersuchungsmaterial
Zur Plasmagewinnung 1 Teil Citrat-Pufferlösung oder Natriumcitrat-Lösung 0,11 mol/l mit 9 Teilen
Venenblut sorgfältig unter Vermeidung von Schaumbildung mischen. Sofort mindestens10 min bei
mindestens 1500 x g zentrifugieren, Überstehendes Plasma abhebern.
Stabilität der Probe:
+ 2 bis + 8 °C
4 Stunden
+15 bis +25 °C 4 Stunden
–20 °C
1 Monat
Methodik
Testdurchführung
Hinweis: Alle Bestimmungen (Standards, Kontrolle, Patientenproben) sind als Doppelbestimmungen durchzuführen. Die Bezugskurve muß mit Hilfe der Standards für jede Meßreihe
erstellt werden. Um Richtigkeit und Präzision von Enzygnost TAT micro zu gewährleisten, sollten
die Proben innerhalb von 5 Minuten pipettiert werden, z. B. durch Einsatz von Probenvorbereitungsstationen oder durch Benutzung von Mehrkanalpipetten und dem Micronix®-System. Als
Alternative kann nach 5 Minuten eine zweite Standardreihe für den verbleibenden Teil der Mikrotitrationsplatte angesetzt werden. Die Inkubationszeit beginnt mit Einbringen der Testplatte in
das Wasserbad!
OWMG G15 E30 (0874) H
9
Beim Pipettieren sollen möglichst keine größeren Luftblasen erzeugt werden. Die Inkubationszeiten sind innerhalb der angegebenen Bereiche frei wählbar, müssen jedoch für alle Ansätze einer
Serie gleich sein.
11. Benötigte Anzahl von Riegeln (8 zusammenhängende Vertiefungen) feststellen (je 2 Vertiefungen für Standards, Kontrolle und Probe). Nicht benötigte Riegel aus der Halterung entnehmen
und im Kunststoffbeutel mit Trockenmittel bei +2 bis +8°C gut verschlossen lagern.
12. In jede Vertiefung werden 50 µl Probenpuffer TAT vorgelegt. Anschließend werden in jede
Vertiefung 50 µl Standard, Kontrolle oder Probe pipettiert. Nach dem Füllen der Testplatte wird
diese kurz geschüttelt, um vollständiges Durchmischen zu gewährleisten.
13. Mit selbstklebender Folie abdecken und 15 min (± 2 min) bei +37°C inkubieren.
14. Selbstklebende Folie abziehen, alle Vertiefungen absaugen, ca. 0,3 ml verdünnte Waschlösung einfüllen, nochmals absaugen, Waschvorgang zweimal wiederholen, danach die Testplatte auf Zellstoff ausklopfen, um Reste der Waschlösung zu entfernen.
15. 100 µl Konjugat-Lösung in jede Vertiefung einfüllen (bei Vertiefung 1 beginnen), Rand der
Vertiefung möglichst nicht benetzen.
16. Mit neuer Selbstklebefolie abdecken und 15 min (± 2 min) bei +37°C inkubieren.
17. Kurz vor Ende der Inkubationszeit 10 ml Puffer/Substrat-Lösung (Temperatur +20 bis +25°C)
in eine Chromogen-Abfüllung geben, unter Schütteln lösen.
18. Folie entfernen, alle Vertiefungen leersaugen und wie oben beschrieben dreimal waschen,
danach die Testplatte noch einmal ausklopfen.
19. 100 µl der frisch angesetzten Chromogen-Puffer/Substrat-Lösung einfüllen.
10. Mit neuer Folie abdecken, 30 min (± 2 min) bei +20 bis +25°C lichtgeschützt inkubieren (z.B.
in dunkles Schubfach stellen).
11. Folie entfernen, 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei gleichen Zeittakt wie beim Dosieren
der Chromogen-Puffer/Substrat-Lösung (Schritt 9) einhalten.
12. Innerhalb einer Stunde gegen dest. Wasser photometrieren; Meßwellenlänge 492 nm (490 – 500 nm).
Auswertung
Nach Berechnung der Extinktionsmittelwerte der Standards die Bezugskurve auf doppel-logarithmischem Netzpapier erstellen (Abszisse: Konzentration 2 bis 60 µg/l, Ordinate: Extinktion 0 bis 2).
Typische Bezugskurve
Ext. 492 nm
2,0
1,0
0,5
0,1
2
6
20
TAT-Konz. in der Probe (µg/l)
OWMG G15 E30 (0874) H
10
60
Aus der Bezugskurve können anhand der Extinktionswerte direkt die TAT-Konzentrationen abgelesen werden. Alternativ kann die Auswertung auch computergestützt mittels polygonaler Interpolation erfolgen. Da die Bezugskurve im oberen Bereich (zwischen Standard S3 und S4) tatsächlich
leicht gekrümmt verläuft, können die nach dieser Methode ermittelten TAT Konzentrationen von
denen der graphischen Auswertemethode geringfügig abweichen. Bei Extinktionen, die oberhalb
des obersten Standards liegen, müssen die Proben nach Verdünnung nochmals getestet werden.
Probenverdünnungen (z. B. 1:10) müssen mit TAT-Verdünnungsplasma erfolgen bzw. mit einem
Normalplasma, dessen TAT-Gehalt < 4 µg/l beträgt. Zur Berechnung der TAT-Konzentration der
Probe muß der TAT-Gehalt des Verdünnungsplasmas berücksichtigt werden.
Interne Qualitätskontrolle
Die Kontrolle erfolgt für jede Meßserie mit dem beigepackten Kontroll-Plasma. Die Meßwerte für
die Proben können nur verwendet werden, wenn der Wert für die Kontrolle im Vertrauensbereich
liegt.
Einschränkungen und Fehlerquellen
Zur Beachtung: Unsachgemäße Blutentnahme, z. B. schlechtes Durchmischen von Probe und
Citrat-Lösung, kann zu fälschlich erhöhten TAT-Werten führen.
Hämolytische, lipämische und Rheumafaktoren-haltige Plasmen stören die Bestimmung nicht.
EDTA-Plasmen können ebenfalls verwendet werden.
Referenzbereich
Citrat-Plasma von
gesunden Erwachsenen (n = 196): Median = 1,5 µg/l
Referenzbereich (2,5–97,5. Perzentile)
= 1,0–4,1 µg/l
Leistungsmerkmale des Tests
Meßbereich und Empfindlichkeit
Der Meßbereich von Enzygnost TAT micro liegt zwischen 2 und 60 µg/l.
Spezifität
Der Test ist spezifisch für Human-Thrombin/Antithrombin III-Komplex.
Präzision und Reproduzierbarkeit
Im Bereich zwischen 2 und 60 µg/l lag der Variationskoeffizient in der Serie (Intraassay-VK) zwischen 4 und 6%, während für den Variationskoeffizienten von Tag zu Tag (Interassay-VK) Werte
zwischen 6 und 9% erhalten wurden. Die Wiederfindungsrate von TAT im Plasma betrug 95 bis
105%.
Anmerkung:
Die angegebenen Werte für die Leistungsmerkmale des Testes stellen typische Ergebnisse dar
und sind nicht als Spezifikationen für den Enzygnost TAT micro Testkit anzusehen.
Hersteller: Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
OWMG G15 E30 (0874) H
11
Enzygnost® TAT micro
Test immunoenzymatique pour le dosage du complexe antithrombine
III/thrombine humain
Domaine d’utilisation et indication
Enzygnost TAT micro est un test immunoenzymatique qui réalise le dosage quantitatif du complexe
antithrombine III/thrombine (TAT) dans le plasma humain, et permet le diagnostic des troubles de
la coagulation qui entraînent des modifications de l’activité du système de la coagulation.
Intérêt diagnostique
La transformation de la prothrombine en thrombine active représente un événement central dans
la cascade de la coagulation. La thrombine agit sur différents substrats physiologiques (comme le
fibrinogène, la protéine C, les plaquettes, etc.) et est inhibée par l’antithrombine III, entraînant la
formation d’un complexe inhibiteur/protéinase inactivé, qui peut être évalué quantitativement par
un test immunoenzymatique (1).
L’intérêt du dosage du complexe antithrombine III/thrombine réside dans la possibilité de
diagnostiquer les événements thrombotiques. Des valeurs augmentées de TAT sont observées
chez les personnes ayant une prédisposition à la thrombose, ainsi que chez les patients souffrant
de CIVD (2, 3). Le dosage du TAT est également indiqué chez les groupes de patients suivants:
patients polytraumatisés, souffrant de dysfonctionnements hépatiques, en cas de septicémie (4) et
chez les patients atteintes de prééclampsie (5). Chez les patients souffrant de maladies malignes,
on a pu mettre en corrélation l’augmentation du taux de TAT avec le stade de la tumeur. Des
augmentations du taux de TAT ont été observées au cours des traitements à l’héparine et de
fibrinolyse (6, 7).
Principe de la méthode
L’Enzygnost TAT micro est un test immunoenzymatique permettant le dosage in vitro du complexe
antithrombine III/thrombine (TAT) humain selon le principe sandwich.
Au cours de la première incubation, le TAT présent dans l’échantillon se lie aux anticorps antithrombine fixés à la surface de la plaque de microtitration. Après lavage, une deuxième réaction
permet aux anticorps anti-AT III humaine conjugués à la peroxydase de se fixer sur les
déterminants AT III libres. L’excès d’anticorps enzymatiquement conjugués est éliminé par lavage,
puis l’activité enzymatique liée est mesurée. La transformation enzymatique du peroxyde
d’hydrogène et du chromogène est stoppée par l’addition d’acidé sulfurique dilué. L’intensité de la
coloration qui est proportionnelle à la concentration de TAT est ensuite mesurée photométriquement. Les standards du coffret permettent de couvrir un domaine de concentrations de 2 à 60 µg/l.
Pour des concentrations plus élevées, l’échantillon doit être dilué avec le Plasma de dilution TAT.
Réactifs
Conditionnement et code
Coffret pour 2 x 96 dosages, code OWMG, contenant
Enzygnost TAT (plaques de microtitration)
Conjugué anti-AT III/POD
Tampon conjugué (coag.)
Plasmas standard TAT S1 à S4
Plasma de contrôle TAT
Tampon échantillons (TAT)
Solution de lavage POD (concentrée)
Tampon/substrat POD
Chromogène POD
Solution d’arrêt POD
Feuilles adhésives
OWMG G15 E30 (0874) H
12
Edition Juin 1998
Composition
Enzygnost TAT micro: plaque de microtitration recouverte d’anticorps de lapin anti-thrombine
humaine
Conjugué anti-AT III humain/POD: anti-AT III humaine de lapin, conjugué à la peroxydase.
Agent de conservation: phénol (< 1 g/l)
Tampon conjugué (coag.): solution tampon Tris (50 mmol/l), albumine sérique bovine
Agent de conservation: phénol (< 0,3 g/l)
Plasmas standards TAT S1 à S4 (humains): domaine de concentrations de 2 à 60 µg/l;
Agents de conservation: 5-chloro-2-méthyl-4-isothiazol-3-on (max. 38 mg/l)
2-méthyl-4-isothiazol-3-on (max. 12,5 mg/l)
Plasma de contrôle TAT (humain): le titre est indiqué sur l’étiquette du flacon
Agents de conservation: 5-chloro-2-méthyl-4-isothiazol-3-on (max. 38 mg/l)
2-méthyl-4-isothiazol-3-on (max. 12,5 mg/l)
Tampon échantillons (TAT): solution tampon Tris (100 mmol/l), Tween (10 ml/l), EDTA (37 g/l);
Agent de conservation: azide de sodium (< 1 g/l)
Solution de lavage POD (concentrée): solution tampon phosphate (90 mmol/l) additionnée de
Tween (18 g/l);
Agent de conservation: phénol (max. 1 g/l)
Tampon/substrat POD: peroxyde d’hydrogène (0,3 g/l) en solution tampon citrate
Agent de conservation: n-butanol (max. 0,1 g/l)
Chromogène POD: o-phénylène-diamine-dihydrochlorure
Solution d’arrêt POD: acide sulfurique 0,5 N
Feuilles adhésives
Autre réactif nécessaire: Plasma de dilution TAT, code NCEP
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro
2. Les réactifs contenant de l’azide de sodium doivent être manipulés avec précaution :
ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L’azide de sodium peut
devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb.
3. Tout don de sang prévu pour la préparation des plasmas standard et du plasma de contrôle est
soumis à des tests de dépistage d’AgHBs, d’anti-HCV, d’anti-HIV1 et d’anti-HIV2. Seuls les
dons trouvés négatifs sont utilisés.
Indépendamment de cela, tout produit obtenu à partir de sang humain doit être manipulé avec
les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où on ne peut exclure
totalement tout risque d’infection (8).
4. Eviter tout contact du chromogène, de la solution chromogène-tampon/substrat et de la solution
d’arrêt avec la peau.
Préparation des réactifs
La bonne réalisation du test n’est garantie que si on utilise des réactifs provenant de coffrets
portant le même numéro de lot; la combinaison des lots est indiquée sur l’étiquette du coffret.
Diluer 15 ml de solution de lavage POD (concentrée) avec de l’eau distillée ou désionisée en
complétant à 300 ml (quantité pour 2 plaques). Si on utilise moins de 2 plaques, ne diluer que la
quantité nécessaire de solution de lavage. Ajouter 200 µl de conjugué anti-AT III humain/POD au
contenu d’un flacon de tampon conjugué (coag.) (11 ml) et mélanger en agitant légèrement
(quantité pour 1 plaque): solution conjugué.
Reconstituer chacun des plasmas standard S1 à S4 ainsi que le plasma de contrôle (humains)
avec 1 ml d’eau distillée ou désionisée. Les standards S1 à S4 ont alors des concentrations
respectives de 2, 6, 20 et 60 µg/l de TAT, et le plasma de contrôle a la valeur indiquée sur l’étiquette
(par ex. 10 ± 2 µg/l).
OWMG G15 E30 (0874) H
13
Porter tous les réactifs et échantillons à +20/+25 °C avant le début du test. Le tampon/substrat, la
solution de chromogène-tampon/substrat et la solution d’arrêt ne doivent pas entrer en contact
avec des ions de métaux lourds ni des substances oxydantes (ne pas utiliser de pipettes à parties
métalliques). Si on utilise des récipients de laboratoire pour préparer de grandes quantités de
solution chromogène-tampon/substrat, bien les rincer auparavant et les sécher à +120 °C.
Stabilités et conditions de conservation
A +2/+8°C : tous les éléments du coffret non ouverts se conservent jusqu'à la date indiquée sur
l'étiquette. Après ouverture ou première utilisation d'une plaque, replacer les barrettes restantes
dans le sachet d'aluminium avec les capsules dessivatives et bien refermer le sachet ; les barrettes
se conservent alors 4 semaines. Les excédents de conjugué, de tampon-conjugué, de conjugué
dilué avec le tampon-conjugué et de tampon échantillons se conservent 4 semaines maximum.
Une fois diluée, la solution de lavage se conserve 1 semaine.
A +15/+25°C : les plasmas standard et de contrôle reconstitués se conservent 8 heures maximum.
La solution de lavage (concentrée), le tampon/substrat et la solution d'arrêt se conservent, même
après ouverture des flacons, jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette. La solution de chromogène en
tampon/substrat se conserve à l'abri de la lumière et doit être utilisée dans l'heure qui suit sa
préparation.
A -20°C : le conjugué, le tampon-conjugué, le(s) plasma(s) standard, le(s) plasma(s) de contrôle et
le tampon échantillons se conservent 3 mois. Un excédent de solution de chromogène en tampon/
substrat peut se congeler à condition de le faire dans les 30 min qui suivent sa préparation ; elle se
conserve alors 2 semaines.
Autres réactifs et matériel nécessaires
Matériel nécessaire
Pipettes à embouts: 50 µl, 100 µl, 200 µl
Pour l’automatisation de la distribution des réactifs, des étapes de lavage et de l’exploitation des
résultats: Behring ELISA Processor II, bain-marie
(+37 °C, eau circulante)
En l’absence d’un Behring ELISA Processor II, matériel également nécessaire:
Dispositif de lavage: Behring ELISA Washer M, ou appareil de lavage pour plaques de microtitration, ou Dispenser d’env. 0,3 ml avec système d’aspiration
Photomètre:
photomètre adapté pour la lecture des plaques de microtitration, longueur
d’onde de mesure à 492 nm (490–500 nm)
Echantillons à tester
Pour obtenir le plasma, prélever 1 volume de solution tampon citrate ou de solution de citrate de
sodium (0,11 mol/l) puis 9 volumes de sang veineux, et bien mélanger en évitant la formation de
mousse. Centrifuger aussitôt pendant au moins 10 min à au moins 1500 g et prélever le plasma
surnageant.
Stabilité de l’échantillon:
4 heures à +12/+18 °C
4 heures à +15/+25 °C
1 mois à
–20 °C
Méthode
Réalisation du test
Remarques: tous les dosages (standards, contrôle et échantillons de patients) doivent être
réalisés en double. Une nouvelle courbe d’étalonnage doit être établie à l’aide des standards pour
chaque série de mesures. Afin de garantir l’exactitude et la précision du test Enzygnost TAT micro,
les échantillons doivent être distribués en 5 minutes. Utiliser pour cela un préparateur
d’échantillons, une pipette multi-canaux ou le système Micronix®. En l’absence d’un tel matériel,
introduire après 5 minutes une deuxième série standard pour la partie restante de la plaque de
microtitration. Le temps d’incubation commence au moment où on pose la plaque dans le
bain-marie!
OWMG G15 E30 (0874) H
14
Lors du pipetage, éviter la formation de grosses bulles d’air. Les temps et températures
d’incubation peuvent être choisis librement à l’intérieur des limites indiquées, mais il faut respecter
les mêmes pour toutes les incubations d’un même test.
11. Déterminer le nombre de barrettes nécessaires (comprenant chacune 8 cupules) (2 pour
chacun des standards, du contrôle, et des plasmas de patients). Sortir les barrettes non
utilisées du cadre et les replacer dans l’emballage plastique avec les capsules dessicatives.
Bien refermer le sachet et le replacer à +2/+8°C.
12. Prédistribuer dans chaque cupule 50 µl de Tampon échantillons TAT. Distribuer ensuite 50 µl
des standards, du contrôle et des échantillons. Lorsque tous les échantillons sont distribués,
agiter légèrement la plaque afin d’assurer une parfaite homogénéisation.
13. Couvrir d’une feuille adhésive, et laisser incuber 15 min (± 2 min) à +37°C au bain-marie.
14. Retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, distribuer env. 0,3 ml de
solution de lavage diluée dans chaque cupule, aspirer de nouveau, et répéter deux fois le
processus de lavage. Renverser ensuite la plaque et la taper sur du papier absorbant afin que
la solution de lavage s’égoutte totalement.
15. Distribuer dans chaque cupule 100 µl de solution conjugué (en commençant par la cupule 1).
Eviter de mouiller les parois des cupules.
16. Couvrir d’une nouvelle feuille adhésive, et laisser incuber 15 min (± 2 min) à +37°C au bain-marie.
17. Peu de temps avant la fin du temps d’incubation, ajouter 10 ml de solution tampon/substrat (à une
température de +20/+25°C) au contenu d’un flacon de chromogène, et agiter pour dissoudre.
18. Retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, laver 3 fois comme indiqué
ci-dessus, puis retourner la plaque en la tapant sur un papier absorbant.
19. Distribuer dans chaque cupule 100 µl de solution chromogène-tampon/substrat préparée
extemporanément.
10. Couvrir d’une nouvelle feuille adhésive, et laisser incuber à l’abri de la lumière (dans un tiroir
obscur par ex.) 30 min (± 2 min) à +20/+25°C.
11. Retirer la feuille adhésive et ajouter 100 µl de Solution d’arrêt POD dans toutes les cupules, en
respectant le même rythme que pour la distribution de la solution chromogène-tampon/substrat
(point 9).
12. Procéder à la lecture photométrique dans l’heure qui suit contre de l’eau distillée; longueur
d’onde de mesure à 492 nm (490–500 nm).
Exploitation des résultats
Calculer la valeur moyenne des densités optiques des standards, et tracer la courbe d’étalonnage
sur papier bi-logarithmique (abscisse: concentrations de 2 à 60 µg/l; ordonnée: D.O. de 0 à 2).
courbe d’étalonnage type
D.O. (492 nm)
2,0
1,0
0,5
0,1
2
6
20
concentration de TAT dans l’échantillon (µg/l)
OWMG G15 E30 (0874) H
15
60
La courbe d’étalonnage permet de lire directement les concentrations de TAT à partir des densités
optiques obtenues. L’exploitation peut également se faire sur ordinateur par interpolation polygonale. Dans la mesure cependant où la courbe d’étalonnage s’arrondit légèrement dans le domaine
supérieur (entre le standard S3 et le standard S4), les concentrations de TAT obtenues par cette
méthode peuvent diverger légèrement de celles obtenues par la méthode graphique. Si la densité
optique d’un échantillon est supérieure à celle du standard le plus élevé, l’échantillon doit être
retesté après dilution (par ex. au 1/10). La dilution de l’échantillon doit être effectuée avec le Plasma de dilution TAT ou un plasma normal dont le taux de TAT est < 4 µg/l. Pour le calcul de la
concentration de TAT de l’échantillon, tenir compte ensuite de la dilution.
Contrôle de qualité interne
Effectuer un contrôle pour chaque série de mesures à l’aide du Plasma de contrôle joint au coffret.
Les valeurs obtenues pour les échantillons ne peuvent être exploitées que si le contrôle est trouvé
à l’intérieur du domaine de confiance indiqué.
Limite du test et source d’erreurs
Attention: un prélèvement défectueux, par ex. un mauvais mélange de l’échantillon et de la solution
citrate, peut entraîner des valeurs de TAT augmentées à tort.
Les échantillons hémolytiques, lipémiques ou contenant des facteurs rhumatoïdes ne perturbent
pas le dosage.
On peut également utiliser des plasmas prélevés sur EDTA.
Domaine de référence
Plasma citrate de
sujets adultes sains (n = 196): médiane = 1,5 µg/l
domaine de référence (2,5ème au 97,5ème
percentile):
= 1,0–4,1 µg/l
Caractéristiques du test
Domaine de mesure et sensibilité
Le domaine de mesure du test Enzygnost TAT micro couvre 2 à 60 µg/l.
Spécificité
Le test est spécifique du complexe antithrombine III/thrombine humain.
Précision et reproductibilité
Pour un domaine de concentrations de 2 à 60 µg/l, le coefficient de variation dans la série (CV
intra-essai) a été trouvé entre 4 et 6%, et le coefficient de variation de jour à jour (CV inter-essais)
entre 6 et 9%. Le taux de restitution du TAT dans le plasma a été trouvé entre 95 et 105%.
Remarque:
les valeurs indiquées comme caractéristiques du test représentent des résultats types, et ne
doivent pas être considérées comme des spécifications du test Enzygnost TAT micro.
France: Fabriqué par Dade Behring Marburg GmbH, Marburg (Allemagne), et commercialisé en
France par Dade Behring S.A., Immeuble Berkeley, 19/29 rue du Capitaine Guynemer,
92081 Paris-La Défense
Ce test est enregistré auprès de l'Agence du Médicament
OWMG G15 E30 (0874) H
16
Bibliography/Literatur/Littérature
1. Pelzer, H. et al.: Determination of Human Thrombin-Antithrombin III Complex in Plasma with an
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Thromb. Haemostasis 59, 101 (1988)
2. Blanke, H. et al.: Die Bedeutung des Thrombin-Antithrombin III Komplexes in der Diagnostik der
Lungenembolie und der tiefen Venenthrombose – Vergleich mit Fibrinopeptid A, Plättchenfaktor
4 und β-Thromboglobulin, Klin. Wschr. 65, 757 (1987)
3. Hoek, J. A. et al.: Laboratory and Clinical Evaluation of an Assay of Thrombin-Antithrombin III
Complexes, Clin. Chem. 34 (10), 2058 (1988)
4. Seitz, R. et al.: The Disturbance of Haemostasis in Septic Shock: Role of Neutrophil Elastase
and Thrombin, Effects of Antithrombin III and Plasma Substitution, Eur. J. Haematol. 43, 22
(1989)
5. Kobayashi, T. et al.: Preeclampsia as chronic Disseminated Intravascular Coagulation,
Gynecol.
6. Gulba, D. et al: Thrombin-Antithrombin III Complex Level as Early Predictor of Reocclusion after
Successful Thrombolysis, Lancet II, 97 (1988)
7. Seitz, R. et al.: Increased Thrombin Activity during Thrombolysis, Thromb. Haemostasis 59, 541
(1988)
8. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U.S. Department of Health
and Human Services, Washington 1993 (HHS Publication No. (CDC) 93-8395).
OWMG G15 E30 (0874) H
17
Dade Behring Marburg GmbH,
D-35041 Marburg/Germany