docPh.D. Fulltext - Weizmann Institute of Science
download 
Report Transcription
Ph.D. Fulltext - Weizmann Institute of Science
|"•
riuottri
77
I
פ פ ט י ד י ם o=1״D־״ nו-נד" p n " •MX1״ a
J13.רוביות 1־ n o p
חבור לשם קבלת תואר
דוקטור לפ»לו0ופ*ח
מNת
ד ו ד ו w
הוגש למועצת המדעית של מנון ו**מן למדע ,רחובות
או<ןעובי ג$7ו
תשד».תשל״ד
3o 03L D > T U • • rujoun״p»> •MJ1 *IJLI T׳n
rwanna.ר ד ך כ ו ־ ה
A
חבור ל ש ם קבלת תואר
ד ו ק ט ו ר לפילוסופיה
מ א ת
דו דוקסיו
ה ו ג ש ל מ ו ע צ ה ה מ ד ע י ת ש ל מכוו ויצמו למדע ,ר ח ו ב ו ת
א ו ק ט ו ב ר ג*7ו
תשרי״תשל״ד
עבודה ז ו מוקדשת לזכרם של
אמי -אביבה
ואבי -
שנפטרו
במהלכה
לראותה
מוגמרת .
ולא
נח
זכו
עבודה זו
פר דפ׳
נעשתה בהדרכתם של
אפרים
ופרופ׳ ליאר
קציר )קצ׳לםקי(
זקס
במחלקות לביופיםיקה וגנטיקה
במכון ויצמן למדע,
רחובות
תודתי נתונה לפרופסורים
)קצ׳לםקי(
וליאו
זקם על
אפרים
קציר
הדרכתם
המסורה ,עזרתם המתמדת והעדוד הרב
שנתנו לי
בזמן
בצוע עבודה זו.
תודה
לכל חברי
המחלקות לבי ופיסיקה
וגנטיקה שעזרו לי
כה רבות.
תודה מיוחדת
לנתן ,חביב ,מרדכי ,יצחק,
יעקובסון ,פוגל ולשתי החנות .
ת ו כ ז
מבוא
תמרים ושיטות
ת ו צ א ו ת
דיון
סכום
רשלמת ספרות
סכום באנגלית
ה y
־
מ
ו
ג
1
-
א
האתגרים העומדים כיום בפני חוקרי מחלת הסרסן נחלקים לכמה נושאים:
תפוש אחר תרופה שתהיה ספציפית לתאים הסרטניים ותגרום להדם
-
«.
תרפואטיקה
ב.
מחקר ביולוגי מולקולרי
הגדול הסרטני בלי לפגוע ברקמות הנורמליות;
-
בדיקת התהליכים הביוכימיים-מולקולריים המתרחשים
בתאים הנורמלים בזמן התמרתס לתאים סרטניים כדי
להבין אח מנגנון שינוי תהליכי הבקרה בתאים הסרטניים;
ג.
מחקר חםוני
-
בדיקת האפשרות למצוא ולזרז יצירת נוגדנים ספציפיים בגוף נ ג ד
התאים הסדטניים כדי למנוע יצירת גדול סרטני או להדום גדול
סרטני קיים.
לכן ,קיימת חשיבות רבה לחקר ההבדלים בין התאים הנורמליים והםרטניים .העשרח
ידיעותנו על ההבדלים הקיימים בין התאים ,יכולה לתרום רבות להבנת תהליכים רבים
הקשורים לא רק במחלת הסרטן ,אלא בנושאים חשובי 9בהם רב עדיין הנסתר על הידוע כמו
תהליכי התפתחות ,התמיינות והזדקנות ביצורים רב-תאים.
שיטת תרבית הרקמה נותנת לחוקר אפשרויות רבות לחקור תאים מחד ) (1ולחקר הבדלים
בין תאים נורמליים וסרטניים מאידך ) (2ולכן ,נעשו מחקרים רבים במערכת תרבית רקמה
) (3על ההבדלים בין התאים הנורמליים והסרטניים.
ניתן לקבל התמרה של תאים נורמליים הגדלים בתרבית רקמה בשתי דר^ים עיקריות:
א.
התמרה הנעשית ללא ג ו ר ס חיצוני )התמדה ספונטנית( );(2
ב.
התמרה הנעשית ע״י ג ו ר ם חיצוני:
)(1
ע״י גורמים פיסיקליים למשל קרינת רנטגן );(5,4
)(2
ע״י גורמים כימיים כמו כימיקליים גורמי סרטן ). ;(9,8,7,6
)(3
ע״י גורמים נגיפים ).(10,3
השינויים החלים בתאים הגורמלייס עם החמרתס ע״י גורמים ?;סרטנים )
והפיכתם לתאים מותמרים ^
( Carcinogenic agents
(Transformed cellsהם רבים ומגוונים .התהליך הבסיסי האתראי
להתמדה זו הוא שינוי במנגנון הבקרה של חלוקת התא כפי שמתבטא באפשרות״של תאים מותמרים
להתרבות בתנאים בהם תאים נורמליים אינם מתרבים ) .(11הוכחות נסיוניות להשערה זו ניתן
למצא בתופעות הבאות:
יכולת תאים מותמרים ליצור גדולים ממאירים לאחר הזרקתם לחיות )
א.
^y
e p i c i
S
T u m o r i
(•
תאים נורמליים ,המוזרקים לחיה מתאימה אינם יכולים ליצור גדולים ממאירים ).(12תאים
שהוחמרו בתרבית מסוגלים להתרבות לאחר הזרקתם וליצור גדולים סרטניים ) .(2תאים שהותמרו
בנגיפים מסויימים כמו פוליאומה או SV40תייבים להתתלק מספר פעמים לפני שהם רוכשים את
הכשר ליצור גדולים ממאירים ).(13
צפיפות אוכלוסית התאים )
ב.
( Cell Population Density״
בחנאים רגילים ,בזמן גדול על גבי שטח מוצק מגיעים תאים נורמליים לצפיפות אוכלוםיה
4
ויותר
.
) .(13קיימים מקרים מסויימים בהם תאים נורמליים יכולים להגיע לצפיפות גבוהה יותר ע״י החלפה
תוזרת של מצע הגדול או הוספת גורמי גדול הנמצאים בנסיוב ).(16,15,14
ג.
אורך חיים מוגבל )
.(Limited life span
לתאים נורמלים הגדלים בתרבית רקמה אודך חיים מוגבל .לאחר כ 40 ±10-דורות הם מגיעים
למצב של התנוונות ומוות ) .(17תאים .מותמרים ,וביחוד תאים מותמרים ע״י נגיפים נמצאו כבעלי
אורך חיים בלתי מוגבל ואפשר להעבירם מספר רב מאד של פעמים בתרבית .למשל תאי אוגר מותמרים
ע״י נגיף הפוליאומה ) ;(18תאי אוגד ) /19עכבר ,ארנבת ,חזיר ) (20ותאי בקר ) (21מותמרים
SVע״י נגיף 40
כ
י
יעילות יצירת מושגות)
(Cloning Efficinnnv
יעילות •צידת מושבות ,בזריעה של מספר קטן של תאים מותמרים ,,גבוהה
בהרבה מזו של תאים נורמליים באותם התנאים ,בזריעת 50עד 100תאים נורמליים לםמ״ר מספד
התאים שיתרבה ויצור מושבות מגיע לעתים דחוקות
ה*
ל 1#-ולרוב נמיר יותר ) ( 2 2־
גדול בתנאים קשים
תאים מותמרים מסוגלים לגדול ולהחחלק בתנאים בהם תאים נורמליים אינם מתרבים.
נביא במה דוגמאות:
) (1חאים נורמלים אינם יכולים להתתלק במצע גדול נוזלי אלא דורשים שטח פנים
צפיד אליו הם נצמדים בזמן הגדול .תאים מותמרים יכולים ברוב המקרים להתחלק גם
י
• בתפזורת וללא הצמדה לשטח פנים ).(2
)(2
תאים נורמליים אינם יוצרים מושבות
באגר רך ) 0.3-0.5$אגר( .תאים מותמרים
לעומת זאת יכולים לגדל באגד וליצור מושבות .תבונות התאים המיתמד׳ים ליצור מושבות
באגר משמשת כמבחן התמרה לתאים
)(3
גבוהה יותר
)»(23
תאים מ־תמרים ,ובעיקר תאים שהוחמרו ע״י נגיפים מסוגלים לגדול לטמפרטורה
)41
( cמאשר התאים הנורמליים המתאימים
).(24
) (4תאים מותמרים יכולים להתרבות ברכוזי נסיוב נמוכים ואילו לתאים נורמליים
דרוש נסיוב ברכוז גבוה יותר .תאי אוגר שהותמרו בנגיף הפוליאומה יכולים לגדול
ברכוז נסיוב 2 5 $־ 0ואילו התאים הנורמלים המתאימים אינם מסוגלים לגדול בתנאים
אלה
).(25
)) (5תאי מכרסמים שהותמרו בנגיפים 40SVאו פוליאומה( או שהוחמרו ספונטנית,
מסוגלים לגדול בנוכחות פחמימנים גורמי סרטן )בנז-אנטרצן או מתיל כולנטרן( ברכוזים
הטוקסיים לתאים .הנורמליים המתאימים
) .(26מאוחר יותר התברר שגדול תאים בנוכחות
קרצינוגנים כימיים אינו יכול לשמש כמבתן להחמרה ונמצא שתאים שהותמרו בנגיף הפוליאומה
היו רגישים במידה שווה לתאים נורמליים
).(27
4 -
ו.
מבנה ברומומומלי של התאים )
-
.(Karyotype
שינויים בקריוטיפ הדיפלואידי של תאים נורמלים הם נדירים ביותר ) .(28בתאים
מותמרים לעומת זאת ,ישנם מקרים רבים של שינויים במספר הברומוםומים וסטיות מהמספר
הדיפולואידי ) .(29מחקרים בתאים מותמרים המראים תכונות של תאים נורמלים ) (30הראו
על שינוי בקבוצה מסויימת של כרומוםומים בתאים אלה ).(31
ז.
שינויים בחלוף החמרים בתאים
קיימות שתי דרכים להתמרתם של תאים נורמליים:
ס
) (1התמרת י ק ) Abortive Transformation
( :בה השראת תכונות חדשות בתאים
המותמרים נעשית באופן זמני בלבד );(32
) (2כאשר ההתמדה גורמת לשינוי תורשתי המתבטא כנראה בשינוי החל בחומצות הגרעין
של התא ומועבר לצאצאיו .למשל.בתאים שהותמרו ע״י נגינ5ים הופיעו מולקרלרת ^m-RNA
חדש שהיה ממוצא נגיפי ) .(35,34,33השינוי בחומר התורשתי של התא מביא בעקבותיו
גם שינויים רבים בחלוף החומרים של התאים המותמר-ים .השינויים בחלוף החמרים של
התאים הם רבים ו יקצר המצע מלתאר את כילם־ נ נ ס ה להתרכז בחשובים שבהם:
א .גליקוליזה :מהירות הגליקוליזה בתאים מותמרים נמצאה מהירה יותר מאשר
בתאים נורמליים );(37,36
ב־ םנחיזת חומצות גרעין :התמרת תאים ע״י נגיפים או קרני רנטגן מביאה ליצירה
מוגברת של - DNAתאי ) .(39,38יצירה זו מלווה גם בעליה ברמת האנזימים
המשתתפים ביצירת
DNAכמו למשל תימידין קינז תימידילט סינתתז ,דיהידרופולט
9
רדוקטז ו^ -ס-מולימדז ).(40
ג .מוקופוליסכרידים וגליקולפידים :תאי אוגר שהותמרו בנגיפים הכילו
.כמויות יותר מוגברות של חומצה היאלורינית ימוקויפוליסכרידים אחרים
) .(42^41תאי עכבר ואדם מותמרים בנגיפים נמצא!ל
מבילים-כמויות נמוכות יותר
של חומצה היאלורונית מהתאים הנורמלים ) .(43כן נמצאה תכולה שונה של גליקוליפידים
-
5
־
בתאי אוגר לאחד החסרה בנגיף הפוליאומה
) .(44לאחרונה ,נמצא שתאי אוגר מווזמרים
מכילים גם כמויות שונות של אנזימים הקשורים לחלוף החמרים של הסוכרים
).(45
ד .אנטיגנים אופייניים :תאים המודבקים בנגיפים מכילים אנטיגנים מיוחדים כמו
אנטיגן פורסמן
) (46או טומור אנטיגן ) ( T - antigenגרעיני
) .(47לאחרון
מייחסים תפקיד של חלבון רגולסורי הגורם כנראה לשינויים נוספים בתא המותמר ע״י
פקוח על ה DNA-התאי.
ח;
תופעת עיכוב במגע )
. . ( Contact inhibition
אחת התופעוח החשובות המבדילות בין תאים נורמלים ומותמרים הגדלים בתרביח רקמה היא
תכונת התאים הנורמלים להפסיק את תנועתם כאשר הם מגיעים למגע ביניהם
החיצוני ויצירת פסאודופודיה נפסקת .כן ,נפסקת יצירת חומצות הגרעין
בשלב הפוספטימיטוטי
)
(
)
) .(48תנועת הקדום
) (49וחלוקת התאים
. ( 1 G 5 0לכן יוצרים התאים הנורמלים בתרבית שכבת תאים אתת ואופי
הגדול מאורגן ואילו התאים המותמרים יוצרים תרבית רב-שכבתית ואופי .גדולים אקראי
).(51
מן האמור לעיל:נראה כי בתאים הנורמלים קייס כנראה מנגנון בקרה הגורם לעכוב בגדול
התאים עם יצירת המגע .מנגנון בקרה זה אינו בא לידי ביטוי בתאים מותמרים ולכן התאים המותמרים
ממשיכים להתרבות גם לאחר שנוצר מגע ביניהם .נתן להשוות תופעה זו עם תכונות של תאים נורמלים
ופרטניים . in vivoהתאים
הנורמלים נשמעים למנגנון הפקוח על.חלוקת תאים.בגוף ואינם
מתחלקים לאחר שהגוף הגיע לגודל ולצורה מסויימים .תאים סרטניים ,לעומת זאת ,ממשיכים להתחלק
ולהתפשט בגוף
).(52
בזמן יצירת המגע בין התאים נוצר כנראה קשר בין התאים שבמגע .קשר זה עשוי להיות
ע״י שליחת גרוי מחא אחד ותגובה לגרוי זה בתא השני .קשר זה עשוי להיות מכמה סוגים:
) (1העברה של מולקולות קטנות )כולל יונים( היכולות לשנות פעילוח אנזימטיח או
הפעלה של רפרסודים בתא המקבל .אמנם אפשרות זו מתקבלת פחות על הדעת מאחד ומצע גדול
מתרבית תאים בעלי עכוב במגע לא גורם ,בדרך כלל ,לעכוב בתאים שאינם נשמעים לעכוב
-
6 -
במגע אבל לאחרונה נמצא ששנוי.בדרגת החומציות של התרבית משפיע רבות על גדול
תאים הנמצאים בעכוב במגע ).(54,53
) (2העברה של מולקולות גדולות .למשל חומרים כמו אריחרופואטין ) (55הגורם לחלוקה
והתמיינות תאים משורת תאי הדס.האדומה או MGIהגורם להתמיינות ולחלוקת תאים
משורת תאי הדם הלבנה ) .(56כ ן ,נמצא כי.הוספת נסיוב לתאים הנמצאים בעכוב במגע
יכולה לגרום להתחלת סנתיזת חומצות גרעין מחודשת ולחלוקת תאים ). .(57,14הגברה זו
של סנתיזת חומצות הגרעין•יכולה להיות מוסברת גס ע״י הגדלה בחדירות הנוקליאוטידים
לתוך החאים ) .(58כן ,נתן להסביר אח חוסר-תלותם של התאים המותמרים לעכוב במגע ע״י
חוסר רגישות או אי הפרשת מעכב גדול ).(59
)(3
בזמן המגע בין קרומי התאים יכולים לתול שיניו י• ים בתאים כתגובה להפעילתם של
מנגנוני בקרה המופעלים עם יצירת המגע .הפעלה זו יכולה להעשות או ע״י שינוי
במיקרו-סביבה של מולקולות מפקחות הנמצאות בקרום .דוגמא לכך נתן למצא בעבודה על
השפעת המטען האלקטרוסטטי הנמצא בקרבת אנזים על מהירות וחוזק הקישור בין הסובסטרט
והאנזים ) .(60הפעלת מנגנון ביוכימי של אנטיגן-נוגדן ,אנזים-סובםטרט ,או רצפטור-ליגנט
יכולה גם היא לבוא כתוצאה ממגע בינתאי .השינוי בקרום התא כתוצאה מהמגע בין התאים עשוי
להביא לשינויים שונים במערכות פקוח של התא.
מן האמור.לעיל מובנת החשיבות הרבה המיוחסת להבדלים בקרומי התאים הנורמלים
והסדטניים ולכן הבנת הבדלים אלה יכולה לתרום רבות להבנת תהליכי ההתמדה.
נסקור את ההבדלים בקרומי התאים.הנורמליים והסרטניים .סקירה מפורטת על ההבדלים
בקרומי התאים הנורמליים והסרטניים נתן למצא במאמרי סכום בספרות ) (62,61נסכם בקצרה את
ההבדלים החשובים ביותר.
א .אנטיגנים הנמצאים על גבי קדום התאים
) (1אנטיגן ההשתלה )( TSTA ).
( Tumor Specific Transplantation Antigen
־
אנטיגן זה הוא אנטיגן המופיע על שטח פני התאים ובעזרתו נתן לחסן חיוח בפני
התפתחות של גדולים םרםניים הנגרמים ע״י הזרקת מספר רב של תאים לחיות .אנטיגן
ז
זה נתגלה לראשונה בתאים שהוחמרו ע״י נגיפים ) (65,64,63ונמצא אופייני לנגיף
המתמיד .נתן למצאו גם בתאים מותפרים ע״י קרני רנטגן או כימיקלים קרצינוגנים.
במקרה האחרון יש כמובן לחםן אח החיה בתאים באותה אוכלוםיה של תאים מושתלים -
כימיקל קרצינוגני מסויים יכל לגרום בתאים שונים להופעח אנטיגנים שונים.
חשיבותו של האנטיגן בתהליך ההתמדה אינה ידועה אבל קיימת אפשרוח שיש לו חלק
באבוד פקוח הגדול של התאים הםותמרים ).(66
.( Surface Antigenאנטיגן המופיע בעיקר בחאיס שהוחמרו
) (2אנטיגן שטח )
ע״י נגיפים
כ מ
י
0
4
( S V(67או פוליאומה ) (68והופעתם קשורה להופעת אנטיגן
הטומור ) ag־.( T
ב .מדידות המטען החשמלי על פני התאים
הממצאים המראים על הבדלים במטען האלקטרוסטטי על פני התאים בין תאים נורמלים
ומותמרים מבוססים בעיקר על מדידות בנדידה אלקטרו־יפורטית של תאים ) .(69*51בגלל
חוסר אמינותה של השיטה למדידת נדידה של תאי יונקים שהם גדולים וכבדים מדי ובגלל
השינויים הרבים בין אוכלוסיות שונות של אותם חאים ) (70קשה ליחס חשיבוח רבה לממצאים.
הנדידה האלקטרופורטית המהירה יותר של תאים מותמרים לכוון הקטב החיובי יוחסה לצפיפות
מטענים שליליים גדולה יותר על פני שטח התאים הםותמרים .מטענים אלה נתרמים לתא בעקר
ע"י נוכחותם של 2מרכיבים :פוספוליפידים וחומצה סיאלית ) (72,71התורמים להגדיל את
פוטנציאל הזיתא של הקדום וכך גם את מוביליות התאיס* למרות הסברה שחומצה נאורמיניח
וסוכרים אחרים נמצאים בכמויות גדולות יותר בתאים מותמרים ) (72,71נמצא לאחרונה שתאים
שהותמרו ע״י נגיפי •. DNAמכילים כמויות קטנוחיותר של חומצה נאורמיניח מאשר החאים
הנורמלים ) .(77,76,75,74,73,44גליקופרוטאינים ,נמצאו בכמות גבוהה יותר בתאים מותמדים
ע״י נגיפי^מ!
) .(78הסבר אפשרי להבדל בממצאים הוא המצב הפיסיולוגי השונה של התאים
או שיטוח שונ1ח להורדת התאים מהצלחה ) .(79הפקידה של החומצה הסיאלית על גבי קרום התא
עדין .אינו ידוע די צרכו .נזכח^ה משפיעה על כושר התאים לגרום לגדולים בהזרקה לחיוח
) ,(80על חדירוח חלבונים לתאים ) (81וכן על המגע בין התאים ).(79
-
8
-
נראה ,כי הגישה לחקר הקרומים של התאים הנורמלים והמותמרים ע"ל אנליזה כימית,
אינה הגישה הטובה ביותר .גורמים שונים ,כמו המצב הפיסיולוגי של התאים בתרביח ,השיסה
להפרדת התאים אחד מהשני ,השיטה לבידוד .הקרומים ושיטות המדידה השונות כמו הפעלת אנזימים
פרוטיאוליטיס והידרוליטיס אחרים או אלקטרופורזה של תאים משפיעים על השוני בתוצאות בין
חוקרים שונים .כן נראה כי האנליזה הכימית של הקרום אינה מספקת מידע מספיק על הארכיטקטורה
החיצונית של הממברנה )
(Topochemistryולכן ,אינה מלמדת על המבנה התורם לתופעות כמו
עכוב במגע ,טומורוגניות בחידת והבדלים טופו-כימיים בין תאים נורמלים ומותמרים.
ג־
,
לקטינים
בשנים האחרונות נעשה שמיש חדש בטכניקה ישנה של טפול בתאים שלמים בחלבונים קושרי
סוכרים הנקראים לקטינים ) .(83,82חלבונים אלה המצויירים באתר קשירה של סוכרים שונים
היו ידועים זמן רב ונמצאו בעלי פעילויות ביולוגיות רבות כגון הצמדת כדוריוח דם אדומוח,
זריז מעבר לימפוציםלם ממצב נח למצב פעיל )טרנספורמציה( ,כן נתקרו הלקטינים כמודל
לתגובה אנטיגן-נוגדן וכמודל לחקר אתרי קשור בחלבונים ) .(83פעילות ביולוגית חשובה
אחרת של הלקטינים ,שנחקרה רבוח בשנים האחרונות היא תכונתם לגרום לצימות )אגלוטינציה(
של תאים סרטניים.או מותמרים ולא לצמת תאים נורמלים באותם התנאים .הצימוח נגרם כנראה,
ע״י קשירת הלקטין אל הסוכרים השונים הנמצאים על פני הקרום התאי .בגלל תכונתם זו משמשים
הלקטיניס רבוח בחקר המבנה הארכיטקטוני החיצוני של תאים נורמלים ומותמרים ,לברור השינויים
החלים בקרום החיצוני של התאים הנורמלים בעקבות התמרחם ,וכן לבדוד מרכיבים מיוחדים של
קרום התא האחראים לקשור ללקטיניס השונים.
עד עתה בודדו ואופיינו כחריםר לקטינים וביניהם שלשה בעלי חשיבות מירבית בחקר
קרומים של תאים נורמלים ומותמרים:
.1אגלוטינין מזרעי חיטה ) ( WGA
Wheat germ agglutininהנקשר עם הסוכר
D-glucosamine־ N-acetylע״ג הקרום );(86,85,84,62
.2אגלוטינין מזרעי הצמחConcanavalin - A (Con A)= Canavalia eusiformis
עם הסוכר
glucopyranoside־D־ aעל גבי הקרים );(89,88,87
הנקשר
־
.3
אגלוטינין מזרעי סויה )
9
(SBA
N-acetyl-D-g&lactbsamine
־
Soybean agglutinin
הנקשר עם הסוכד
על גבי הקרום ).(91 ,90
האגלוטינים המצמיחים תאים מותמריס ,מצמיחים גם תאים נורמלים לאחר טפול של
האחרונים באנזימים פרוטיאוליטיס.,לכן הוצע ,שההתמדה גורמת לחשוף של אתרי קשירה
םוכריים בקרוס של התאים המותמרים ,החבויים בדיר כלל בקרומי החאים הנורמלים .נטויים
שנעשו בעזרת לקטינים מסומנים הראו כי תאים נורמלים ,מותמרים או תאים מטופלים באנזימים
פרוטיאוליטיים קושרים כמות שווה של לקטינים מסומנים ) .(95,94,93,92כיום נראה כי
הצומות של תאים מותמרים נובע כנראה מהבדלים .במקום הטופוגרפי של האתר הקושר הסוכרי
על פני קרום התאים .השערה זו קבלה אשור ממחקרים מיקרוסקופיים ואלקטרון־ימיקרוסקופייס
בהם נעשתה המחשה של האתרים הקושרים ע״י טלואודסצאין ) ,(96פריטין ) ,(97המוציאנין
) (98ופרואוקסידז ) (99הממצאים השונים תומכים בהשערה כי הקרום התאי אינו צפיד אלא
בנוי בצורת מוזיאקה נוזליה )( Fluid mosaic model
הקרום ).(100
ואתרים יכולים לנוע על פני שטח
-
10
-
גם בעבודה זו השתמשנו בגישח מחקר הדומה לזו בה השתמשו החוקרים המפעילים
לקטינים על תאים נורמלים ומותמדים .פפטידים בסיסיים המתקשרים לקרומי התאים בגלל
המשיכה האלקטדוסטטית .היו הגורם שהופעל על תאים נורמלים ופרטניים הגדלים בתרבית רקמה.
קשרים אלקטרוסטטיים הנוצרים בין מולקולות טעונות מטען חיובי ובין מולקולוח
הטעונות מסען שלילי מתקיימים רבות בתאים והם בעלי חשיבות רבה בתהליכים ביולוגיים
שונים .הכוחות האלקטרוסטטים הבין מולקולריים הם בעלי טווח פעולה רחוק ,ולכן הם
מאפשרים קשור מולקולות ללא החאפה מרחבית ביניהן ומתקיימת אינטראקציה בלתי ספציפית
בין מולקולות .קשור אלקטרוסטטי בלתי ספציפי בין מולקולות עשוי לעזור גם להשפעה ספציפית
של מולקולות טעונות במערכות ביולוגיות כמו התקשרות בין אנזים וסובסטרט למשל אלםטז
ואלסטין ) (101ליזוזיט ודופן החיידקים ),(162התקשרות בין אנטיגן טעון מטען חיובי
ונוגדן כנגדו הטעון בדרך-כלל מטען שלילי ) (103או התקשרות בין אנטיגנים טעונים והתאים
יוצרי הנוגדנים ) .(104כן משפיעים חלבונים בסיסיים כמו היסטונים ופרוטמינים על ארגון
המבנה של הכרומוםומים.,ועל בקרת פעולתם של הגנים ע״י עכוב יצירת R N Aעל פני תבניח
ה . ( D N A(105-החלבונים הבונים את הריבוזומיס בעלי מטען חשמלי חיובי ומשערים כי
למטען זה חפקיד חשוב בקשור ה R N A -הדיבוזומלי בנוסף לכוחות אחרים הפועלים בקשור זה
כמו קשרי מימן
-
11
-
או קשרים הידדופוביים ) .(106כדי להביז ביתד יסודיות את אופי פעולתם של מולקולות
ת
ביולוגיות,טעונות מטען חשמלי,בהי,פותחו מודלים ביופיסיקליים פשוטים י ך שמוש
בפולי-פפטידים סנתתיים ) .(107נתן לקבל פפטידים אלה בדרגת נקי ו ן גבוהה ביותר ,וכן,
קיימת אפשרות לפקח על הרכבם הכימי מולקולרי ולשנות את תכונותיהם הכימיות-פיסיקליות
וכך גם את תכונותיהם הביולוגיות .מחקרים רבים נעשו על השפעתם של פולי-פפטידיס טעונים
במערכות ביולוגיות >שונות כמו בקטריופאזיים ,נגיפים.חיידקים חאים אנימללים וחיות שלמות
וכן במערכות נםיוניות שונות כגון מערכות אנזימטיות ,קשור לתומצות גרעין וחלבונים
שונים.עבודוח אלה סוכמו בהרחבה ) .(110,109,108נסכם כאן כמה מהעבודות האחרונות בנושא זה.
פפטידים בסיסיים כמו פולי ליזין או פולי אורניתין גורמים לשינויים מורפולוגיים
רבים בתאים מטופלים .הם גורמים להדבקות המיטוכנדריות לממברנות הציטוטלסמטיות בתאי
אסציטיס של אהרליך ),(111בהם מעורער שווי המשקל של האלקטרוליטים בתוך התאים .כן נמצא
שפפטידיס אלה גורמים לירידת הנפח של הגרעינים בתאי אמבה ) (112התכווצות של תאים
אנימלים כתוצאה מטפול בפפטידים בסיסיים נראתה גם .בתאי אוגר בתרבית ) .(113שינויים
אלה נגרמים כנראה ע״י ספיחה של הפפטידי הבסיסי לקרומיס הנושאים מטען חשמלי שלילי.
ספיחה זו מביאה להורדת המטען החשמלי השלילי על גבי החאים ) ,(114,96וכן להרס החאים.
תופעה זו נמצאה בבקטריות ,תאי דם אדומים ותאים אנימליים אחרים ) .(110רעילוח הפפטידים
האלה נוצלה כדי לבדוק פעילות אנטי-סרטנית אפשרית של הפפטידים .פעילות כזו נמצאה כנגד
(
תאי אסציטים ).(155
כאשד משתמשים ברכוזים נמוכים של הפפטידיס הבסיסיים ,כדי להמנע מהרעילות הקיימת
ברכוזים גבוהים ,נתן לבדוק אח השפעח הפפטידים על חדירות של חמרים שונים לתוך התאים.
נמצא כי פולי-ליזין מגביר חדירות של יונים קטנים כמו סולפט לתוך ,תאי אפידדמיס של שושנת
מיס ) (116או חדירות מים ונתרן לתאי שלפוחית השתן של ראשני קרפדוח ) .(117בעבודה זו
הוכח ע״י שמוש בפולי-ליזין מסומן כי הפפטיד נספח בחזקה לקרום החיצוני של החאים .הגדלח
חדירות התאים כתוצאה מטפול בפפטידים בסיסיים נוצלה בעקר להגברת חדירות מקרו־ימולקולות
׳*•״
לתא למשל חלבונים כמו אלבומין ,פריטין ) (118ואינסרפרון ) ,(119חומצות גרעין כפו RNAי
) ,(120ולהגברח ההדבקה ע״י חומצח גרעין של נגיפים בעלי RNA
בחומצת הגהעון שלהם ).(121
12 -
-
מן האמור לעיל נראה,כי מפסידים בסיסיים עשויים לשמש כמכשיר לחקר תאים ,ובעקר
חקר הבדלים בין תאים נורמליים ומותמרים .כן נתן לנסות,לתכנן פפמידים בסיסיים,שיחנו
חגובוח ספציפיות עם סוגים מיוחדים של תאים מוחמרים .וכך לזהוח חאים אלה,
וללמד על המאפיין אותם לעומת תאים נורמליים ותאים מותמרים אחדים.
ממרת העבודה
מסרת עבודה זו לבחון את האינטראקציה בין תאים אנימליים הגדלים בתרבית רקמה
ובין פפטידים בסיסיים .לעמוד על סטיחת המפטידים האלה לתאים ועל חדירתם לתוך התא
לבדוק אח השפעת הפפםידים על מערכות ביוסינתתיות בתוך התאים .לנסות לחכנן פפטידים
בסיסיים שיתנו תגובות *פציפיות עם סוגים בודדים של תאים מותמרים ולעמוד על מנגנון
התגובות האלה.
13 -
חמ ר י ם
-
ו ש י ט ו ת
.1אוליגו ופוליפפסידיס
רשימת הפטטידיס השונים מובאת בטבלה מסי .1המשקל המולקולרי הממוצע של הפפטידים
נקבע בדימתיל פומאמיד ) ( DMFבאולטרה צנטריפוגה אנליטית מטיפוס
בתאים ^לי חתן־ של 12ממ״ר .המחשת נדידת החמר נעשתה בעזרת מנגנון צלום
ג
Spinco-Beckman
. Schliren
המשקל המולקולדי הממוצע נקבע בשיטת הדיפוזיה והנדירה הצנטריפוגלית .הפולי פפטידים
השונים נוקו על פני עמודת - G -25
על נייר קרבוקסימתיל צלולוז CM-82
.Sephadexנקיון הפפטידים נקבע באלקטרופורזה
. Whatmanהאלקטרו פורזה הורצה
מתוצרת
במשך 90דקוח במתח 3000וולט בבופר פירידין -אצטט ברכוז1ג . pH =3.5 ,0.062מקומם
של הפפסידים על גבי הנייד ,אחרי ההרצה ,נקבע בעזרת צביעהיבנינהידרין .במצב יבש ,נשמרו
הפפטידים בתת לחץ ובנוכחוח חומר מייבש .כל הפפטידים הומסו במים מזוקקים פעמים ,עוקרו
0
,
0
. - c
15
ב 120 -בלחץ 1.2אט״מ ונשמרו ב-
.2
תמיסות
א .מצע גדול לפי
.(EM) Eagleהו ל י ( E a g l e(130רכוז חומצות האמינו
כן
פ
והו יסמינים הוגדל פי 4מאשר במקור.
ב .מצע גדול לפי Eagleחסר סידן הוכן כנ״ל ללא הוספה
. CaClg
ג .תמיסת בופר פוספט איזוסוני ) ( PBSהוכנה לפי( D u l b e c c o et al(131
ד^ .מיסת בופר פוספט איזוטוני חסר סידן ומגנזיום ) ( CMFהוכנה כנ״ל ללא
הוספת
2
CaClו-
4
. MgS0
ה .חמיסח טדיפםין בת ) 0.25$טריפסין 1-300תוצרת (Nutritional Biochemicals
הוכנה לפי. ( P u c k(132
14טבלא )(1
-
-
רשימת הפפמידים המובאים בעבודה .דרגת הפולימריזציה ומקורס
דרגת
פולימריזציה
פוליפפטיד
)(DP
הוכן
בשי סח
נ ת ק ב ל
קצור
א .הומו פולימרים
פולי L-
לי זין
30
II
•ו
360
1400
פולי ־ - Dליזין
380
פולי - L -אורניחין
340
פולי ־ L
-חומצה גלוםמית
II
160
620
פולי - L -ח .אספרטית
100
II
400
פולי ־ - Lארגינין
340
)(122
II
II
II
II
II
II
II
II
)(123
מר י .יעקובסון
II
tl
II
it
II
II
II
II
PL
II
II
II
PDL
n
PO
ft
PGlu
II
II
It
PAsp
דיירי זאב ברק
11
II
PArg
ב .קופולימרים לא מסודרים
פולי - L ) -אורניתין,
- Lלאוצין(
פולי -!., ) -אורניחין,
50
(1^-L
פולי ^ ) -א ר ג י נ י ן -!, ,לאוצין(
)(125,124
מר י .יעקובסון
POL
לא נקבע
II II
דייר א .פרנקל
POV
340
)(123
"מיילם-ידע" -רחובות
PAL
ג .קופולימרים מסודרים
"ילי ־ ) -!,ליזיל - Lאלניל
-אלנין (
30
)(126
דייר א ,ירון
)P(LAA
ע
פולי ^ )-ל י א ו צ י ל -
- Lאורניחיל -
- Lליאוצין(
10
)(127
40
II
דייר מ .פרידקין
II
II
ד .אוליגופפטידים
טרי - L -לי זין
טרי _ - Lאור נ יחי ן
-6בוטיריל-טרי
- Lאורניחין
3
)(128
3
)(129
3
דייר ז .בדק
דייר י .לו ין ,ו״מי ילס-ידע"
"מיילס-ידע"
)P(LOL
צ ו
מיסת ורסן )EDTA
0.02$
( תוצרת
Fluka
,
הוכנה בתמיסה.שהכילה אח
הבאיםM0.137
3-
התמרים הבאים ,ברכוזים
4
.
1.47X10 MKH^PO
2
ז.
נסיובים :נסיוב
56
מטופל ב-
c
ע
ג
4
,(csנסיוב עובי עגל ) ( FCSונסיוב סוס
ל
)
) (HS
למשך 30דקות .איכות הנסיובים נבדקה ע״י השוואחם לנסיוב עגל עוברי
במבחן ליעילות גדול מושבות של תאים נורמלים ומוחמרים.
דיאליזה של נסיוב נעשתה בקור )
4°
( + cכנגד נפח גדול פי 10
PBSW
או C M F
למשך 24שעות עם החלפה חוזרת של התמיסה כל 6שעות .תמיסות מצע הגדול ,הבופר והורסן
עוקרו ע״י סנון דרך פילטר מיליפור ונשמרו בטמפרטורה של
עוקרו ע״י סנון דרך פילטר זייץ ונשמרו בטמפ' של
5
פעמיים שהכילו
מ
־
10יחידות פניצילין,
N-Butyl-p-hydroxybenzoate
.3
20°
0.1גייר
C
.+c^4תמיסות הטריפסין והנסיובים
. -כל התמימות הוכנו במים מזוקקים
דהידרו-סטרפטומיצין-סולפט ו 0.2-גייר
שהוא חומד אנטי-מיקוטי ,לכל ליטר המיסה.
כ ל י ם
התרביות הוכנו בצלחות פטרי לשמוש חד-פעמי מפלסטיק בקוטר של 60מ״מ או 100מ״מ
F A L C O N plastics Co. USAאו מתוצרת
מתוצרת
, Denmark
NUNC
כלי הזכוכית
עברו רחיצה מיוחדת :רחיצה בחומצה ,סולפו-כרומית ,שטיפה במי ברז ,השריה בורסן
) 125מגייר
לליטר ) ( (M^33שטיפה במים מזוקקים .ועקור באוטוקלב .כלי הזכוכיח בהם נבדקה ספיחח והשפעת
פפטידים על חאים עברו תהליך של סיליקוניזציה אחת לשבועיים )1:100
.4
תרביות רקמה
א.
מקורות תאים להכנת תרביות רקמה
עוברי אוגר
golden hamsterמסוג
עוברי חולדת אלבינו מסוג
ICR ,
.( Siliclad, Clay-Adams
SWR,עוברי
Manor
Spraque-Dawley
עכבר מסוגים
שורות תאים שונות לפי טבלה מסי 2
e
Bl/
-
16
-
פרםים על מקורות שורות התאים
-
2 "מבלה מס
Designation:
Description
Origin
Ham Normal
Secondary hamster embryo c e l l s
This thesis
Ham PV(1)
Polyoma virus ( s t r a i n L 1 3 4 )
transformed hamster c e l l s .
Dept.Genetics
Ham PV(2)
Polyoma,virus
(strain SP )
2
(135)
transformed hamster c e l l s
Ham SV(1)
()״
- SV40 transformed hamster kidney c e l l s
Dept. Genetics
Dept.Genetics
Ham SV(2)
SV40 transformed hamster c e l l s
Ham Ad 12(1)
Adenovirus 12 (5204) transformed c e l l s
A.E.Freeman(135)
Ham Ad 12(2)
Adenovirus 12 (5209) transformed c e l l s
A.E.Freeman (136)
Ham Ad 12(3)
Adenovirus 12 (HT)transformed c e l l s :
W.Schlesinger (137)
Ham Ad 3(1)
Adenovirus 3 (5727) transformed c e l l s
A.E.Freeman
Ham Ad 3(2)
Adenovirus 3 transformed c e l l s
FLOW Labs.
Ham Raus
Raus sarcoma (Schmidt Ruppin strain)
transformed hamster d e l s
Moloney virus ,(8303) transformed
hamster c e l l s
Ham Mol
Ham DMNA
Ham BP
Ham X-rays
FLOW Labs.
A.E.Freeman
A.E.Freeman
Hamster embryo c e l l s transformed
a f t e r treatment with dimethylnitrosamine
Dept.Genetics
Benzo(a)pyrene-transformed hamster
embryo c e l l s
Dept.Genetics(6)
X-rays-transformed hamster embryo
cells
Dept.Genetics(4)
BHK 21/13
Spontaneous hamster c e l l l i n e
I.Macpherson (139)
BHK PV
Polyoma virus transformed BHK c e l l s '
I.Macpherson (23)
NIL 2
Spontaneous hamster c e l l l i n e
L.Diamond (140)
NIL 2 Ad 7
Adenovirus 7 transformed NIL 2 c e l l s
L.Diamond (140)
המשך
Designation
-
17 -
פרטים על מקורות שורות התאים
-
2 טבלה מס׳
Description
Origin
Rat normal
Secondary r a t embryo c e l l s
This t h e s i s
Rat PV
Polyoma v i r u s (LP s t r a i n ) transformed r a t c e l l s
Dept Genetics (141)
Shope papilloma-transformed
domestic r a b b i t c e l l s
Y.Ito (142)
Secondary mouse (SWR,ICR o r
C57B1/6) embryo c e l l s
This t h e s i s
SWR SV40
SV40-transformed mouse SWR c e l l s
Dept.Genetics
3T3
Spontaneous mouse c e l l l i n e
H.Green.(143)
3T3 PV
Polyoma v i r u s transformed 3T3 c e l l s
H.Green (144)
3T3 SV40
SV40 transformed 3T3 c e l l s
H.Green (144)
3T3 SV40 PV .
SV40 and polyoma v i r u s transformed
3T3 c e l l s
H.Green
Mouse e r y t h r o i d leukaemia c e l l
transformed by F r i e n d v i r u s
C.Friend (145)
Mouse myeloid leukaemia c e l l s
transformed by X-rays (100 r)
J.H.Burchenal
Mouse lymphoid leukaemia c e l l s transformed byRousher v i r u s
I.G.Sincovics (146)
Mouse lymphoid leukaemia c e l l s transformed by methyl-cholantrene
L.W.Law (147)
Human normal
Human f e t a l lung c e l l s (Wi-38)
Wistar I n s t .
Human SV40
SV40 transformed human c e l l s
H.Green.(148)
Spontaneous monkey kidney c e l l l i n e
A.Sabin (149)
B.
C.
Rat Lines
Rabbit !fines
SP8
D.
Mouse Lines
Mouse normal
E.
Mouse Leukemia
CICPR
P1081
MDA
L1210
F.
G.
Human Lines
Monkey Line
BSC-1
-
18 -
ב .מצע' גדול ו הדגרת התרביות
י
כל התאים הודגרו במצע גדול של
Eagle
) ( EMבת'1ספת 10$נסיוב עגל.במקרים
מיוחדים החליף נסיוב עובר עגל את נסיוב העגל*.התאים הלאוקמיים גדלו בתרחיף במצע
גדול שהכיל נסיוב סוס מטופל במקום נסיוב עגל־ התרביוה הודגרו במדגרות בטמפרטורה
c37°
בלחות יחסית 100$ובאו ירה של 90$אויר ו 10$-פחמן דו חמצניבתנאים אלה היתה.
דרגה החומציות בתרבית • pH =7.1 - 7.4
ג .תרביות ראשוניות
תרביות ראשוניות של אוגרי תולדה ועכבר הוכנו לפי שיטת Dulbecco + Vogtעם
שינויים ל
פ י
.. (youngner(133עוברים בגיל 12-14יום הוצאו מרחם אמם ,נשטפו,..,״
פעמים ב PBS -ונחתכו לחלקים קטנים .תלקים אלה עוכלו בתמיסה טריפסין .מדי פרקי זמן
קצובים )כל 20 .דקות( נאסף הנוזל העליון והתאים הושקעו בצנטריפוגה סרולוגית במהירות
g300במשך 5דקות המשקע הורתף בתמיסת מזוןהתאים נספרו בתא ספירה מטפום.
Hemacytometer - Spencer bright line
תוצרת
, American Optical Co.נמהלו
6
ונזרעו בצלחות פטרי בקטר 100מ״מ ב 10-מייל מצע גדול וברכוז של 10תאים למייל .תרביות
אלה שמשו להכנת תרביות משניות.
ד .תרביות משניות 'ושורות תאים
להכנת תרביות משניות טופלו רבדים של תרביות ראשוניות 4 ,ימים לאחר זריעתן,
בתמיסת טריפםין או בתערובת 1:1של תמיסות טריפסין וורםן.במשר כ־י 10דקות בטמפרטורה
של .37*0...הרבדים פורקו בעזרת פיפטה ,סורכזו בצנטריפוגה ,נאסתו,נספרו ונזרעו בכמות
הזריעה הדרושות בצלחות תדשות .שורות התאים העברו כלי 4-5ימים ע״י טפול דומה .שורות
תאים לאוקמיים הגדלים בתרחיף ,העברו כל 5ימים ללא טפול בטריפסין אלא ע״י מהול
התאים במצע גדול חדש ברכו ז ^ 10תאים למייל.
ה .תרבית מושבות תאים
2
4
4
התאים נזרעו לצלחוח ברכו ז הנע בין 10ל 10 -חאים לצלחת בתוך 2מייל מצע גדול.
תוך 24מזמן הזריעה הושלם נפח המצע ל 8-מייל .הצלחות הודגוו• במשך 6עד 10ימים.
תוך פרק זמן זה מתפתחות מושבות תאים בקטר 2-8מ״מ .כל קבוצת נםוי מכילה 8צלחות.
-
19
-
י
ו .ספירת מושבות וקביעת יעילות הגדול
ספירת המושבות בוצעה בעזרת בינוקולר בצלחות מכילות מושבות לאחר צביעה .יעילות
גדול המושבות בצלחת )
( cloning efficiencyמחושבת כאחוז התאים שיצרו מושבות
מתוך מנת התאים שנזרעה בצלתת.
x 100מספר המושבוח לצלחת
־
מספר התאים שנזרעו בצלתת
= יעילות גדול המושבות
ז .צביעת תאים
)(1
צביעה לגימזה :לאחר הרחקת מצע הגדול מהצלחת נשטפת התרבית פעמים בתמיסתPBS
הקביעה נעשית במתנול אבסולוטי במשך 20דקות .הצביעה נעשית בתמיסת גימזה 1:130000
במים מזוקקים למשך 20דקות .לאחר הצביעה נרחץ עודף הצבע במים מזוקקים.
) (2צביעה לתאים חיים :בזמן ספירת התאים בתא ספירה נצבעו התאים בתמיסת טריפז
־ -בלו 0.025$ב PBS -או בתמיסת אאוזין P B S ^ 0.05$
.נספרו תאים שלא נצבעו בצבע.
ח .הקפאת תאים
לשם שמירה לתקופות ארוכות הוקפאו התאים בתרתיף שהכיל מצע גדול מועשר ב 10$-נסיוב
6
-ו10 x2Dimetylsulfoxideתאים למייל .התאים נשמרו בטמפ׳ של
עובר עגל ו10$-
- 90*0במשך חדשים מספר ובטמפ׳ של - c^190לתקופות מעל שנה בתוך אמפולות זכוכית
אטומות.
ט .בדיקות לנוכחות מיקופלסמה בתרביות
כל התרביות נבדקו אחת לחדש לנוכחות מיקופלסמה ) (PPLOבשיטח• ( C h a n o c k et al(150
י .קביעת נפת תאים
קביעת נפח התאים נעשתה במבחנות סרכוז מיוחדת אשר בתחתית כל מבחנה מצוי צנור נימי
ל אחד של
במהירות
300
(
שהכיל 10x2תאים .המבחנה סורכזה
g
במשך 15דקות .התאים התרכזו בצורת משקע בתוך הצנור הנימי .לפי גובה
המשקע חושב נפח התאים בהנחה שהתאים כדוריים ובהתעלמות מהנפח הבינתאי.
-
יא.
20
-
קביעת חלבון
151
חלבון נעשתה לפי שינוי של
( ( O m a y a + E a g l eלשיטת . ( L o w r y (152
Bovine Serum Albumin
עקומת הכיול נעשתה לפי תמיסה בעל רכוז ידוע של
• (Armour Pharm, Co,
)
. 5ה כ נ ת מלאי
נגיף
4
נגיף Simianvirus)0SV40
40SVוקביעה כמותית של הנגיף
)776היה
מזן (
.(153מלאי הנגיף הוכן בתרביות
תאי קוף משורת BSC-1בהתאם לשיטה שתוארה בעבר ) .(154התרביות נוגעו בנגיף מהול ,ביחס
של יחידה יוצרת מוקד ) ( P F Uאחת לתא והודגרו למשך 8-12ימים ,אזי מגיע נמק התאים לשיאו
והתרבית הוקפאה ב-
סטרילי )
.~Pc)2
להמשך הטפול הופשרו התרביות .התאים הוסרו מהצלחוח בעזרח מחק
(Rubber policemanועברו סוניקציה במשך 5דקות ב-
Raytheon 200 Watt 10 kc Magnetostrictive Oscillator
בעצמה של 9000תנודות לשניה לאחר הסוניקציה סורכז החרחיף להרחקת פסולת התאים .ליזט הנגיף
נשמר ב. - c -20°
הקביעה הכמותית של הנגיף נעשתה בשיטת המוקדים ) .(155רובד חאי BSC-1הודבק במיהולים
עשרוניים של ליזט הנגיף בנפח 0.1מייל של E Mבתוספת 2$נסיוב סוס בלחי פעיל .לאחר ספיחה
של 150דקות ב 37°0* -כוסו הצלתות ב 5-מייל של תערובת £]\!1בתוספת 0.75$אגר ו־ 5$נסיוב סום
}
בלתי פעיל לאחר 10ימים הוספו עוד 2מייל של תערובת זו המכילה 0.01$
. Neutral redספירה
סופית של המוקדים נעשתה 7ימים לאחר הוספת התמיסה הצבועה.
.6
שיטה לצביעת גרעיני תאים בנוגדנים פלואורםצנטים
השיטה מבוססת על הווצרות קומפלקס בין אנטיגן ונוגדן הצבוע בפלואורסצאין איזוטיוציאנטי
חופר הזורח בצבע ירוק בהיר באור אולטרה סגול ) .(156בשיטה זו .נתן לזהות את T-antigenשל
תאים המותמרים ע״י . ( 4 0(SV157תאים דבוקים לזכוכיוח מכסה נקבעו באצטון ונצבעו בנסיוב
ארנבת המכיל נוגדנים מתאימים .כל תוצאה נקבעה ע״י ספירה של 500תאים לפחות.
21 -
.7
הקרנת תאים בקרני*-
0.2
דני-א רכות באורך גל
בעובי 1.5מ״מ.
A
r
5000
תרביות תאים בנות .׳יום הוקרנו ב-
8־
-
0
.מכונת ההקרנה היתה R. Seifert DermovoltoiBOio
ו ב 7 . 5מיליאמפר עם פילטר אלומיניום!
-ב - K V 5 0
-ה dose r a t eהיה r100לדקה .לאחר ההקרנה הוחלף מצע הגדול במצע תרש.
בדיקת פרוק פפטידים ע״י נסיוב או תמצית תאים
2
מערכת הבדיקה הכילה בתמיסת בופר פוספט
, M 0 . 0 7 5 ,׳ = 7ו 10$-pHנסיוב עגל לאחד
דיאליזה ו 20-מיקרוגרם למייל •של הפפטיד הנבדק .התערובת הו דגרה 24-48שעות בטמפרטורה
37°0
ודוגמאות בנות 1מייל הוצאו בזמנים שונים הדוגמא הושמה על עמודה של קרובוקסי-מתיל-צלולוז
HC
מהעמודה ע״י תמיסת
1 0.1ת מ י ס ת הפפטידים נודפה
.
,
N
הומםה בנפח קטן והושמה על נייר קרבוקסי מתיל צלולוז לצורך אלקטרופורזה .הרצת האלקטרופורזה
נעשתה כמתואר בסעיף .1
.9
בדיקת רעילות הפפטידים לתאים
5
פטרי בת 60מ״מ בנפח של
.
ג ד ו ל 5ל א ח ר •הדגרה
מייל של מצע
5
של 24שעות-5-6,כאשר רכוז התאים הגיע
ל10x
תאים לצלחת הוספו רכוזים שונים ) 0-100מיקרוגרם
למייל( •של הפפטיד בנפח קטן ) 0.1מייל( לתרבית .ספירות תאים נעשו בזמנים קצובים ,48 ,24 ,8
72ו 96-שעות לאחר הוספת הפפטיד .הספירה נעשתה בנוכחות טריפן בלו ונםפרו תאים שלא נצבעו.
במקרים מיוחדים נבדקה יעילות יצירת המושבות של תאים מטופלים בפפטיד .נתקבלה הקבלה בין
תוצאות הספירה ובין יעילות יצירת המושבות של התאים.
).10שיטה למבחן צמות
Agglutination3B
piri
( של תאים ע״י פפמידים
מבחן הצמות נעשה.לפי שיטה ידועה ) (87עם שינויים .התאים הורדו מהצלחות בעזרת הדגרה
P
פעמים בתמיסת
3
6
או C M Fפוזרו .לתרחיף של 10 x2תאים
למייל בתמיסת הרחיצה .הפפטיד הוסף לחרחיף התאים בנפח קטן ) 10-20מיקרודיטר( וברכוזים של 0-10
מיקרוגרם למייל עצמת הצמות נבדקה בבינוקולר.
22 -
11־
שיטה למבחן התלכדות ס ג ו ל י ת )
-
Specific Aggregationשל תאים
הורדת התאים מהצלחות נעשתה כמתואר בסעיף .10התאים פ ו ז ר ו במצע ג ד ו ל לתרחיף
6
10 x1.5תאים למייל .הפפטיד הוסף ב נ פ ח קטן )10
מיקרוליטר0-50וברכוזים
של
מיקרוגרם
(
למייל .תרחיף התאים נ ז ר ע באחד מהכלים הבאים?
א.
צלחת פטרי בקוטר 60מ״מ
-
נ ז ר ע ו 2מייל תרחיף ת א י ם .
ב.
צלחת פטרי בקוטר 35מ״מ
-
נ ז ר ע 1מ״ל תרחיף ת א י ם .
ג.
בתוך ה״באר" ,בקטר 13מ״מ ,הנמצאת במרכז
(union special slide glassתוצרת
)
ז כ ו כ י ת נושאת של מ י ק ר ו ס ק ו פ
Ashai Instr. Japanנ זר*
0.1מייל
תרחיף תאים וכוסו ב ז כ ו כ י ת נושא .לאחר ה ז ר י ע ה ח ו דגר ו התאים ב 37*0 -במשך 24שעות.
המעקב אחר הופעת ת ל כ י ד י ם )
.12
( aggregatesנעשה ב מ ק ר ו ס ק ו פ ק ו נ ט ר ס ה פ ז ו ת .
השפעת ה פ פ ט י ד י ם על י צ י ר ת ח ל ב ו ן ו DNA -בתא .
השפעת פ פ ט י ד י ם על י ע י ר ת ה ח ל ב ו ן נעשתה ע ״ י בדיקת השפעתם על א י נ ק ו פ ו ר צ י ה של ל א ו צ י ן
14
תוצרת
מסים ב ־
1-C , 62 mci / m mole
10$
TCA
2,5,
ק ר .המשקע נאסף על מםנניס^בקטר 27מ״מ ג ו ד ל ח ו ר י ם 0.45מ י ק ר ו ן . .
ג ר י לליטר
ו 50-מ״ג ל ל י ט ר
.השפעת פ פ ט י ד י ם על יצירתDNA
רת
4
,
(PPO )DiphenylOxazole
POPOP
)oxazolyl))-benzen
ב מ ו נ ה ס י נ ט י ל צ י ה תוצרת . Packard
(
( ל ח ו ך החלק התאי
> 59 mci / m mole
(Dimethyl POPOP - 1,4,-Bis-(2-(4 methyl-5-phenyl
נעשתה בעזרת בדיקת השפעתם על א י נ ו ק ו פ ו ר מ צ י ה של
4
1
Radiochemicals C e n t e r 2 - C
ט פ ו ל נ ו ס ף בתאים ה י ה כמתואר ל ע י ל .
/
-
תרבית של 10x5תאים בצלחת הודגרו במשך
ל מ ש
ר
ש
ע
ה
מ ־ ד י
4
ע )•• ) (0.5
ש
u
תימידין
ש36בגלבחות הפפטיד הנבדק .החומר המסומן
'
14
pulse
ו ת
23
-
מיקרוקיורי לאווצין C -
לצלחת י 1 -מיקרוקיורי
cלצלחת( .התהליך הופסק ע״י 3שטיפות ב PBS-קר ובהוספח מייל אחיIN NaOH.0
קר להמסת התאים .המספרים המובאים בתוצאות הם ממוצעים של 3נסויים לפחות.
.13
C
ב
4
ספיחת פולי )אורניתין.לאוצין( מסומן לתאים
1
-
14
C
על ידי שמוש בלאוצין
.הפפטיד בדרגת פולימריזציה
יות סגולית 10x0.325ספירות לדקה למ״גספיחת הפפטיד נבדקה ב
.
-
2צורות:
בתאים רחוצים ובתאים גדלים.
א .ספיחת פפטיר בתאים רחוצים
תאים הורדו מהצלחת ע״י הדגרה בתמיסה טריפסין או ורסן ,נרחצי
10
20
דקות בנוכחות
ב
״
3
PBS
פעמים.
0-40מי קר ו גרם
תאים הודגרו במשך
פפטיד מסומן )לאחר זמן זה הםפיחה מכסימלית( .לאחר הספיחה נרחצו החאים 3פעמים
ע״י PBS
והומםו במייל אחד של
,0.1 N
NaOH־
0.5מייל נלקחו לספירח רדיואקטיביות
והנותר נבדק לבמות חלבון.
ב .םפיחת פפטיד .בתאים גדלים
5
0-40
שעות במצע גדול בנוכחות
,
24
ודוגמאות נרחצו בזמנים שונים לאחר הוספת הפפטידהרחיצה
נעשתה במצע גדו.ל ) 3פעמים( .התאים הומסו ב NaOH-וטופלו כמחואר בסעיף אי .התוצאות
תוקנו לגבי בקרת•של צלחת ריקה .ספירת תמיסת התאים נעשתה בנוזל סינטילציה שהכיל
700מייל דיאוקםן 175 ,מייל מתנול 40 ,מייל אתילן גליקול 60 ,גרי נפתלן 4 ,גרי
ו
2
־־ «0
1
1
Dimethyl POPOP'" -לכל ליטר תמיסה .המספרים המובאים בתוצאות הם ממוצעים
של 5ניסויים.
24 -
.14
-
בדוד גרעיניים מתאי תרבית
לבדוד גרעינים מתאים הגדלים בתרבית רקמה נלקח הדטרגנם הלא-יוני Nonidet P -40
) .(158לאחר 3רחיצות ^ P B S
טופלו התאים למשך 10רקות בתמיסה ש ל 0.1$דטרגנט
. ( P B S(159-מקטע הגרעינים הופרד ע״י סרכוז )
.15
5-300
דקוח( ונרחץ 3פעמים בPBS -
g
.
קליטת סידן מסומן ע״י תאים
קליטת הסידן ע״י תאים נעשתה לפי שיטת( B o r l e(160
,
היתה ^ ^ §
בתאים רחוצים
ב
־
+ +
45
CaCL 120^ciper (j.gr C aתוצרת
PBS
א
י
ב
בשינויים הבאים; מקור הסידן
Radiochemical Centerהקליטה נעשתה
־ JMF־> הספירה נעשתה בתמיסת דיאוקסן במצויין בסעיף 13ב'
והתאים עברו סוניקציה כמצויין בסעיף 5לפני הערבוב בנוזל הםינטילציה־ כדי לקבל תאים
"ערומים" .התאים עברו הדגרה בתערובת 1:1ש ל חמיסוח טריפסין 5ורסן ,חלבון נקבע לפי
. Lowry
.16
השפעת פולי )אורניתין .לאוציןי( על ספיחתCon-A
רדיואקטיבי לתאים
6
תאי י 3T3
מותמרים בנגיף SV4Q
2x10תאים
נזרעו בצלחות וגודלו עד רכוז ש ל
לצלתת .פולי )אורניתין ,לאוצין( הוסף ברכוזים 0עד 30מיקרוגרם למייל .בזמנים שונים לאחר
הוספת הפפטיד נשטפו התאים היטב בתמיסת
4
אחד ש ל C M F
PBS
שהכיל 100מיקרוגרם ש ל
לאחר הספיחה נרחצו התרביות 4פעמים בתמיסת
ריקה.
והודגרו במשך 30דקוח בטמפ' החדר במייל
n
) C o n - A - N iרדי ואקטיבי ות^^( c p m / m g 10*5.7
PBSאו בתמיסח PBS
ונמנתה הפעילותהרדיואקטיבית.INS
התוצאות המובאות הן ממוצעים ש ל 3נסיונות לפחות.
שהכילה
^-מתיל גלוקוז .2$
.
63
-
־ 25
תוצאות
רעילות
פ ו ל י פ פ ט י ד י ם ב ס י ס י י ם לתאים נ ו ר מ ל י ם ו מ ו ת מ ר י ם בתרבית רקמה
א« יציבות פפטידים בסיסיים לפרוק ע״י אנזימים פרוסיאוליטים
נסיוב הוא אחד המרכיבים החשובים של מצע גדול של תאים הגדלים בתרבית רקמה .כמות
הנסיוב במצע הגדול היא 10$לערך .הנסיובים בהם משתמשים בדרך כלל במצע גדול הם נסיוב
עגל או נסיוב עובר עגל .נםיובים עשירים מאד .באנזימים פרוטיאוליטים שונים שהחשוב בהם
הוא טריפםין .אנזימים אלה מסוגלים לפרק גם פפטידים סינתתיים-וביחוד פפטידים המכילים
חומצות אמיניות בסיסיות כגון .פולילזין .(110) .לפיכך ,נבדקה התפרקותם של הפוליפפסידים
בנוכחות נסיוב־ מערכח הבדיקה הוארה בסעיפים 1ו 8-של פרק חומרים ושיטות .התוצאות
מתארוח בציורים .1-3
מתוך התוצאות נראה כי פולי ^-־ליזין מחפרק במהירוח רבה ע״י אנזימים פרוטיאוליטייס
הנמצאים בנסיוב )ציור מסי (1לעומת זאח פולי פפטידים אחרים כמו פולי - D -ליזין
)ציור מם' (1פולי אורניתין וסריפפטידשל אורניתין )טרי-אורניתין( )ציור מסי (2וכן
קו פולימר של התומצות אורניתין ולאוצין )פולי )אורניתין ,לאוצין( ( )ציור מסי (3
אינם מתפרקים ע״י האנזימים הפרוטיאוליטים ,או מראים התפרקות חלשה מאד לאתר הדגרה
ממושכת
ם -פולי
ליזין -
י ן משתרר מונו ליזין
Hופולי
) 24או 48שעות( .תוצאות דומות נתקבלו.כאשר נבדקה החפדקותם של פפטידים
3
) א ו ר נ י ת י ן ,לאוצין -
-
14
( C
1 4
ב ת נ א י ם דומים.
3
Hכמה דקות לאחר תחילת ההדגרה ,ואילו
פולי )אורניתין ,לאוצין 48( Cלאשחרר חומצות אמיניות מסומנות אפילו
שעות לאחר
תחילת ההדגרה בנוכחות נסיוב.
ב .רעילות פפסידים בסיסיים כנגד תאים נורמלים ומותמרים בתרבית רקמה )הומופולימרים(
בדיקת רעילות הפפטידים כנגד תאים נורמלים ומותמרים נעשתה כמתואר בפרק חמרים ושיטות
סעיף .9ציורים 4ו 5-מראים עקומות גדיול אופייניות של תאי אוגר עוברים )ציור מסי (4
ותאי אוגר מותמדים ע״י הנגיף ) SV 40ציור מם' (5מטופלים ברכוזים שונים של
פולי _ - Lליזין ) .( DP =30רעילות הפפטיד ברכוזים נמוכים 10-20מיקרוגרם למייל היא
-
0
26 -
0
G O
וORN
0
o
0 6 0 00
(יי
fa ay>>4
10
־
s
ffi—ffl g> o—<- ORIGINE
1 1 •!•24k
I ' M !•III !•O •MAKERS
—1.
ו-.A
» t. E4K !•6k !•I* 1-0
INCUBATION
(Ly•),
G MORN).
0
0"
ft
TRI -!.-ORNITHINE
^
P0ly-L-ORNITHINE(0P'34O>
TIME
CM-CELLULOSE PAPER
3000V, 60mm
pH-3.5
מ
-G—9
O ®
!•241! !•an !•Ik !•0
Poly-0-Ly»in (0P>380)
ILyklt"
<Ly.l,
0
I
- ORIGIN
• 24k
! • • k I •Ik )•0 MARKERS
ן
Poly-L-Lytin• (OP •SO I
©
INCUBATION
CM-CELLULOSE PAPER
3000V, 90min
pH-3.5
TIME
2 ציור מסי
פרוק פולי ואוליגו פפטידים
בסיסיים בתמיסת מזון של
תאים אנימליים
־
O
1
ציור מם׳
0
;3-1 ציורים
ORN
10$- בופר ו,מערכת הבדיקה הכילה פפטיד
( ההדגרה8 נסיוב )ראה חמר»ם ושיטות סעיף
דוגמאות. שעות24-48 במשך37°0נעשתה ב־
נוקו על עמודת קרבוקםי,הוצאו בזמנים שונים
מתיל צלולוז והורצו באלקטרופורזה )דאה
.(1 תמרים ושיטות סעיף
0
Leu
©
I
@ Q a
!•2411 t«6M«lh ••0 MARKERS
Poly-(ORN-Ltu)COP*S01
1
ORIGIN
CM-CELLULOSE PAPER
3000V 60min
pH'3.5
INCUBITION TIME
3
איור מם׳
-
27
-
Nor Ham Secondaries
Transformed Cells
<0
Ham S v
־1
PL
PL
PL
PL
PL
T
» Control
o lO/'ml
A 20y/ml
7 30y/ml
• 50y/ml
OIQOy/ml
1
IO
•10
o
a.
«
a.
>*
u
"10
4
4
3
)(Days
ציור
2
Time
מס׳
_L
3
2
)(Days
Time
ציור
4
מס׳
10
5
ציירים ;5 .4עקומות גדול של חאי אוגד נורמליים )ציור (4ותאי אוגר מותמריס
^)«SV40ציור (5בנוכחות רמוזים שונים של פ ו ל י - L -ליזין ) (Q=3DP
ע״י הגגין
ל צ ל ח ת ( X 1 0והודגרו במשך יום .בשלב זה הוםף הפפטיד
) 2תאים
תאים נזרעו בצלחות פטרי
לתרבית והחאיס נספרו 48 ,24 ,8ו 72-שעות לאחד הוספת הפפטיד )ראה חמרים ושיטות םעיף .(9
5
28 -
-
מועטה ביותר .ברכוזי פפטיד של 30-50מיקרוגרם למייל רעילות הפפטיד גבוהה יותר .רכוז
של 30מיקרוגרם למייל גורם להרג של כ 50$-מהתאים הנורמליים ולהרג של כ 30$-מהתאיס
המותמרים .ברכוזיס גבוהים יותר) 50-100מיקרוגרם למייל( נגרם הרג רב יותר לתאים -
A
50מיקרוגרם למייל גורמים להרג של כ 80$-לתאים הנורמלים ו 60$-לתאים הפותמרים .התאים
הנורמלים אינם מתאוששים ואינם מהחלקים הלאה ואילו התאים המותמרים ממשיכים להתחלק בקצב.
רגיל .פולי ליזין המוסף ברכוזים של 100מיקרוגרם למייל גורם להרג של מעל 95$מהתאים
הנורמלים והמוחמרים .לצורר השוואה נבדקה במקביל השפעחם של פולי פפטידים חומציים על
אותם התאים )ציורים 6ו .(7-ציור מסי 6מראה את השפעת פוליפפטידים חומציים למשל פולי
חומצה גלוטמית ) DP=180ו ( DP =620-וכן פולי חומצה אספרטית ) ( DP =109על תאי אוגר
נורמליים בתרבית רקמה 100 .מיקרוגרם למייל הוספו לחרביח חאיס ונבדקה עקומה גדול התאים
בנוכחות הפפטידים הנ״ל .נראה כי הפפטידים אינם .רעילים לתאים ועקומות הגדול של התאים
הנורמליים בנוכחוח הפפטידים החומציים דומות לעקומות הגדול של החאים הלא מטופל'י8י .גם
גדול תאים מותמרים ע״י הנגיף SV 40אינו מושפע מנוכחות הפפטידים החומציים )ציור מם* .(7
בדיקה השוואתית של השפעת סוגים שונים של פוליפפטידים בסיסיים על סוגים של תאים
מובאת בטבלאות 3ו .4-בטבלאות אלה נראית השפעתם הרעילה של הפפסידים פולי - L -ליזין
) ,( DP =30,360,1400פולי- D -ליזין ) ( DP=380ופולי- L -אורניתין ) (DP =380על
ומוחמרים מעכבר ),3SV3T3
,
D
E
X
C
3T40
N
m
ו-
a
3טבלה
H
מסי
,ו4.HamDMNA -סבלה מסי
( ? 3 7 3 -־ , 7ומאוגר
( -
מחוך הטבלאוח נראה כי השפעחם הרעילה של פולי- L -יליזינים שונים נמצאה ביחס
ישר למשקלם המולקולרי -בהחום המשקלים המולקולריים שנבדקו ,כן נמצא כי רעילות
פולי- D -ליזין ופולי- 1«-אורניחין גבוהה בהרבה מרעילוח המוליפפטידים משורה הליזינים.
כל הפוליפפטידים הבסיסיים שנבדקו נמצאו רעילים יוחר לתאים הנורמליים ביחס לחאים המותמדים
שנבדקו .הרעילות כנגד התאים הנורמלים היחה גבוהה ב
בהאים הנורמלים משורת 3T3-10-20$
מאשר לתאים המותמרים בשורה זו וב 20-30$-בתאים הנורמלים משורת האוגר מאשר לתאי אוגר
מותמרים .שורת תאי אוגר המותמרים ע״י קדני-א הראו רגישות גבוהה יותר להמסה ע״י פפטידים
בסיסיים לעומת תאים מותמרים אחרים.
-
•• Horn SseorwJori׳No
J
״
y
0
0
(
וגיור
ציורים
,
m
i
; 7 .6
•Horn 8V40 Transform•* Cell
)T i m • (Oays
T
םס׳
29
-
6
ציור
מס׳
7
עקומות גדול של תאי אוגר נורמליים )ציור (6ותאי אוגר פותםריס
מיקרוגרס של פולי חומצות
בנגיף ) 40V8ציור1007בנוכחות(
.
;
אמינו חומציות
זריעה התאים וספירחם כמתאר בציורים .5 ,4להרביוח הוספו 100מיקרוגרס פהפפטידים
הבאים :פולי- L -חומצה גלוטמיח )= 180־ ,(DPפ ו ל י - L -חומצה גלוםםיח )620־*,(DJ
פולי- L -חומצה אםפרסיח )109־־.( DP
-
'3מבלה סס
;
30
-
רעילות מפסידים בסיסיים לתאים נורמלים ומותמרים משירת
3T3
רעילות הפפםידיס נבדקה כמתואר בפרק המרים ושיטות סעיף 9רכוז הפפטידים הוא
10מיקרוגרס למ׳יל .ההוצאות מובאות באחוזים של חאים מומתים מתוך החאים המטופלים לאחד
8-12שעדח של הדגרה .ההוצאות המובאות הן ממוצעים של 5נסיונות.
$חאים מומחים מחוך כלל.׳התאים לאחר 8-12שעות
הדגרה בנוכחות הפפטיד
סוג
פולי פפטיד
3T3
החאים
T3SV40י
שנבדקו
3T3PV
.3
פולי- L -לי זי ן
=DP30
־־
36
22
18
פולי- L -ליזין
DP =360
42
27
25
73
67
> 99
91
87
> 99
78
80
=
פולי- L -ליזין
DP =1400
פולי- L -ליזין
DP =380
פולי- L -אורנ יתין
DP =340
=
־'.
.
י
65
-
מבלה מס" % 4
31
-
רעילות פפמידים ב ס י ס י י ם לתאים נ ו ר מ ל י ם ומותמרי-״ם של אוגר
פרטי הנסוי כבטבלה מסי 3־
$תאים מומתים מתוך כלל התאים לאחר 8-12שעות
הדגרה בנוכחות הפפטיד
פילי פפטיד.
סוג
HamNOR
פולי- L -ליזין
=
D P =30
פולי- L -ליזין
DP =360
פולי- L -ליזין
DIM 400
פולי- D -ליזין
DP ~=380
פולי- L -אורנ י תק
DP=340
HamSV40
התאים
HamPV
HamDMNA
HamX rays
32
10
8
2
23
43
23
20
21
36
71
40
35
38
63
97
95
95
99
73
71
65
79
99
80
>
>
32 -
-
ג .רעילות קו-פולימרים בסיסיים לתאים נורמלים ומותמרים
נבדקו בעקר הפפסידים פולי )אורניתין ,לאוצין( ופולי )אורניתין ,ולין( .פפמידים
אלה מכילים גם חומצות אמיניות ליפופיליות נוסף על החומצה האמינית הבסיסית -אורניתין.
ההשפעה הרעילה של פפסידים אלה היחה נמוכה בהרבה מרעילוח הומופוליפרים של חומצות
אמיניוח בסיסיות.
ציור מם '8מראה עקומה גדול של תאי
40SV
3T3נורמלים ומותמרים ע״י הנגיף
בנוכחות רכוזי פולי )אורניתין ,לאוצין( שונים .נראה כי רכוזי פפטיד עד 30מיקרוגרם
למייל אינם רעילים לחאים הנורמלים והמוחמרים .ברכוזים גבוהים יוחר נג1ם הרס של תאים.
ברכוז פפטיד 50מיקרוגרם למייל נהרסים 86$מהתאים הנורמלים ו 90$-מהתאים המוהמרים
ע״י 40
. SVרכוז פפטיד של 100מיקרוגרס למייל גורם להרס כל החאים .חוצאוח דומות
נחקבלו גם עם סוגי חאים אחרים למשל האי אוגר נורמליים ומוחמרים ע״י גורמים שונים או
תאי אדם נורמלים.ומותמרלם .גם הפפטיד פולי )אורניחין ,ולין( פועל על התאים בצורה דומה
לפולי )אורניחין ,לאוצין( .נבדקה יעילוח יצירה המושבוח של תאי 3T3ותאי
3T3
מוחמדים
6
ע״י הנגיף SV 40לאחר טפול ברכוזים שונים של פולי )אורניחין ,לאוצין( .חרחיף של 10
תאים במייל מצע גדול טופלו ברכוזים של 50,30,20,10ו 100-מיקרוגרם למייל ונזרעו בצלחוח
פטרי לאחר הדגרה של 24שעוח נספרו החאים החיים ונזרעו ליצירח מושבוח ) 100חאים לצלחח(
יעילוחייצירח המושבוח של החאים הנורמלים והמוחמרים שטופלו ב 10-30-מיקרוגרם למייל היחה
דומה )ראה טבל ה
(5ואילו החאים שטופלו ברכו זים של 50ו 100-מיקרוגרם למייל הראו
יעילות יצירת ממזבות נמוכה יוחר.
33 -
cells
3T3 SV40
— 1־ ז
ו
ו
-
3T3 cells
— ר ־ — T 1
1
Control
lOy/ml
20y/ml
30y/ml
50y/ml
ס ־ 100
y/ml
;/
1
4
8
צייר
o a
r
1
3
•
o
A
A
•
,
7
:
;
IO
o
a.
A/
A/
y
1
1
1
1
1
5 0 1 2
Days in culture
4
V1
1
'10
C
I0
3
ישל תאים אלה מותמרים ב נ ג י ף 4 0ד 8
; 3Tעקומת ג ד ו ל של תאי עכבר משורת 3
בגוכחות ר ב ו ז י ם שוגים של פ ו ל י ) א ו ר נ י ת י ן .ל א ו צ י ז (
5
-
4
2
שעות
5
מייל מצע ג ד ו ל לאחר
הוספו כ מ ו י ו ת ש ו נ ו ת של הפפסיד 100-10מיקרוגרם למייל והתאים נספרו בכל יום
במשך 3ימים) .ספירה נעשתה ב נ ו כ ח ו ת צבע ויטלי ונספרו רק תאים ח י י ם ( .
-
סבלה מסי : 5
-
34
ל ע י ל ו ת יצירת מושבות של תאים מ ט ו פ ל י ם ב ר ב ו ז י ם ש ו נ י ם של
פולי )אורניתיז .לאוציז(.
תאים נורמלים ומותמדים )^ 10תאים למייל( טופלו ע״י רכוזיפפטיד שונים למשך
24שעות ונזרעו לקולונים ) 100תאים לצלחת( הודגרו במשך 7ימים ,נקבעו ,נצבעו ונספרו
מושבות .המספר המובא הוא ממוצע של 8צלחות.
רכוז
פולי )אורניתין,
לאוצין(
מיקרוגרם למייל
מם' מושבות לצלחת
3T3
3T3SV40
0
20
58
10
20
58
20
18
58
30
15
59
50
5
30
100
1 .5
8
-
השפעת קו פ ו ל י מ ר
) - Lא ו ר נ י ת י ן .
לקו פולימר )אורנ-־תין ,לאוצין(
35
-
- Lלאוצין( )
)01Pקי׳
(
( P O Lעל תאים בתרבית
1
ימים כמה יתרונות על פוליפפטידים
בסיסיים אתרים!
1־
.2
6
.רעילותו נמוכה ) 30מיקרוגרם למ״יל אינם גורמים נזק ל~ 10תאים(.
יציבותו לפעילות הפרוטיאוללטית הקיימת בנסיוב גבוהה )הפפטיד אינו מתפרק
גם לאחר ' 48שעות הדגרה(־
.3
הרכבו המולקולרי -תומצה אמינית בסיסית וחומצה אמינית ליפופילית -נותן
יתרונות רבים בבואנו לחקור השפעתו על תאים אנימליים־
פפטיד זה נבחר ,לכן ,להמשך הניסויים־
א.
צמות מהיר
) א ג ל ו ט י נ צ י ה ( של ת א י ם ע״י
POL
בדיקת התאים לצמות נעשתה ע״י הורדתם מהצלחת רחיצתם בתמיםח .ביפר איי־זוטוני,
5
הוספת פולפפטיד ,הדגרה קצרה תוך כדי בתישת התרח־-ף והסתכלות מקרוסקופית לבדיקת
הופעת צמתים־
בנסו י זה נחקבלו הממצאים הבאים:
לקרוגרם למ״ל המכיל
.1
כל התאים שנבדקו )ראה טבלה מסי (2עברו צמות מהיר עם הוספת הטויליפפטיד.
.2
הצמתים הכילו כ 500-100-תאים כל אחד־
1-2רכוז
4־
חפוליפפמיד הדרוש לצמות ה ו א
Q1X
תהליך הצמות ה ו א מהיר ונמשך מספר שניות־
. 5מ ה י ר ו ת הצמות שווה בטמפ' שונות ) C ,4°20°
.6
6
חאים.
C
ו ( C 3 7 ° -־
טפול בתאים בתמיסת ורסן ,טריפםין או נאורמיינידז אינו משנה את בשרם לעבור
צמות בנוכחות הפפטיד .גם הדגרה של 60דקות בנוכחות האנזים טריפסין או
נאורמינידז אינה משנה את כשר התאים לעבור צמות־
36 -
.7
-
מהירות הצמות ועצמתו שוות אם רחיצת התאים ותהליך הצמות נעשים במצע
גדול ) ,(EMבופר פוספט בנוכחות ובחוסר סידן ומגנזיום ) PBSאו ( C M F
או בופר ורונל בנוכחות ובחוסר סידן ומגנזיום.
.8
החומצות האמיניות-!, :לאוצין,
ס-לאוצין,
- Lולין-!! ,אלנין ,נ-1גליצין,
אספרטית ו-
ע-אורניתין,
-Lאיזולאוצין,
- Lפנילאלנין- L ,פרולין,
- Lחומצה
- Lחומצה גלוטמיח ברכוזים עד 4מ״ג למייל אינן מחתרות עם
הפוליפפטיד בתהליך הצמות ואינן מעכבות את יצירת הצמתים.
.9
הסוכרים או הנגזרות הבאות.של סוכרים :גלוקוז ,פוקוז. ,גלקטוז ,גלוקוזאמין
מנוזאמין- a ,מתיל גלוקוז->^ ,מתיל מנוז,
- Nאצטיל גלוקוזאמין,
- Nאצטיל
מנוזאמין ו- N -אצטיל גלקטוזאמין ברכוזים עד 5מ״ג למייל אינם מתחרים עם
הפוליפפטיד בתהליך הצמות ואינם מעכבים את יצירת הצמתים.
.10נתן לעכב את יצירת הצמתים או לפזר צמתים קיימים בשלש דרכים:
א .ע״י הוספת כמויות אקוימולריות של פוליפפטידים בעל מטען חשמלי שלילי
)פולי חומצה גלוטמית או פולי חומצה אספרטית(.
ב .ע " י ./הגדלה החזק היוני של התרתיף )בתמיסת N1נחרן כלורי(.
ג .ע״י הוספת נסיוב למערכת .נוכתות של 0.5-10$נסיוב במערכת מעכבת אח
הופעת הצמתים .בנרכחות נסיוב נתן בכל זאת לגרום לצמות ע״י הגדלת
רכוז הפוליפפטיד בנוכתות 10$נסיוב במערכת דרושים 200מיקרוגרם
פוליפפטיד למייל כדי לגרום לצמות.
-
37
ב .התלכדות )אגרגציה( של תאים ע״ י
-
POL
כאשר זורעים תאים שהותמרו ע״י הנגיף 40
6
ים למייל בנוכחות
S Vא ו ע״י הנגיף אדנו מסי 12
מיקרוגרם למ״ל של P O L־ עוברים החאים
10
תהליך ש ל התלכדות לאהד 24שעו ח הדגרה ב .37°0-התלכידים מחחילים להופיע לאחר
כ 12-שעוח ש ל הדגרה .תופעה ההתלכדוח מסחיימח לאחר כ 24-שעוח הדגרה .בזמן זה
נראים הלבידים גדולים המכילים כמה מאות תאים לתלכיד ודבוקים אל הצלחה בחלק התחחון
ש ל התלכיד .ההליך ההתלכדות וצורת התלכידיס מתוארת בתמונה מסי .1
בחמונה נדאותיתדביות תאים לא מטופלות :א1
מותמרת בנגיף
3
חאי עכבר משורה
=
תרבית תאי אוגר מותמרת בנגיף
)40SV3
=
V
S
0
4
(,
. ( SV). 40SWRSV 40התאים נראים
*
י
בחרביח חד שכבחיח ובצפיפוח רבה יחסית .תמונות א.2ב 2ו-ג 2מראות את התאים הנ״ל
)בהתאם( מטופלים במשך 12שעות ב 20-מיקרוגרם למייל,פולי )אורניתין ,לאוצין( בשלשה .
התרביות נתן לראות את תחילה היווצרות החלכידים .חלק של התלכידים נסתיים תהליך
ההתלכדות והם נראים בתותים המכילים מספר רב ש ל תאים־ בין התלכידים נמצאים מספר רב
ש ל תאים בתהליך התלכדוח וחלקם דבוק עדיין לצלחת .בתמונות א,3ב 3ו-ג 3נתן• לראות את
התרביות 24שעות לאחר הוספת פולי )אורניתין ,לאוצין( בתמונות אלה נמצאים כל התאים
בחלכידים הנראים כחותים .י ש לשים לב כ י התלכידים הנוצרים ע״י תאי אוגר שהותמרו בנגיף
אדנו 12הם קטנים יותר ומכילים מספר קטן יותר של תאים מאשר אלה הנוצרים ע״י תאים
שהו תמר ו בנגיף S V 40
.
ההליך זה חל רק בהאים.שהוחמרו ע״י הנגיפים S V 40.א ו אדנו מסי .12תאים משורת
התאים
3T3
)ממוצא עכבר(,
SWR
)
(,ממוצעע כ ב ר ת א י אוגר ותאי אדם שהוחמרו ע״י
הנגיפים הנ״ל הראו את ההליך ההתלכדות .כל שורוח התאים האחרות -תאים נורמלים ותאים
מותמרים ע״י גורמים שונים )ראה טבלה מסי (1לא .הראו את תופעת ההתלכדות בנוכחוח
שהוחמרו ג ם ע״י הנגיף
ו ג ם ע״י הנגיף פוליאומה
SV40PV
)החמרה כפולה( עברה תהליך התלכדוח בנוכחוח הפפטיד.
הופעה זו המראה על סגוליות בפעולת
בנגיף S V 40
^ P O L ^ ^ Dעל שורות התאים המוחמריס
נחקרה בתשומה לב ונמצאו הממצאים הבאים:
POL
,
תמונה מסי :1תרביות תאים מטופלות ולא מטופלות בפולי )אורגיתיז ,לאוצין(
א .תאי אוגר מותמרים בנגיף אדנו מסי 12
מותמרים בנגיף
.ב3Tתאיעכבר משורת 3
.ג תאי עכבר משורת SWRמותמרים בנגיף
.1תרבית ללא הוספת פפטיד
.2תרבית 12שעות לאחר הוספת 20מיקרוגרם למייל של פולי )אורניתין ,לאוצין(
.3תרבית 24שעוח לאחר הוספת פולי )אורניתין ,לאוצין(.
צולם במיקרוסקופ קונטרס פזות .( 110 )X
40SV
40SV
-
.1
39
-
חיוניות התאים בחלבידים
כדי לבדוק את חיוניוחם של החאים בחלכידים טופלו
ברכוזים שונים של
3T3
חאי
6
40SV10
P O Lוהודגרו במשך 24שעות עד להופעת תלכידים .לאחר הופעת
התלכידים נספרו החאים החיים )בנוכחות הצבע הוייטלי=טריפן בלו( ,נמהלו ,ונזרעו
ליצירת מושבות .לאחר 8ימים נספרו המושבות ונקבעה יעילות יצירת המושבות
מסי התאים החיים בתרביות המטופלות ברכוזים שונים של P O L
היה דומה לזה
שבבקרת הלא מםופלח .כן יעילות יצירת המושבות היתה דומה בתאים המטופלים לעוסח
תאים לא מטופלים )טבלה מסי .(5
כאשר ממשיכים להדגיר אח התלמידים לתקופות ממושכות יותר -מחחלקים התאים
ויוצרים שכבר תאים וגבולות החלכידים הולכים ומטשטשים במשך הזמן ,ולאחר כיומיים
לא נתן לזהותם .כדי לשמור על צורת הגדול האופיינית יש להוסיף מדי 24שעות
מנה חדשה של 20מיקרוגדם למייל
.2
. POL
התלכדות של תאים מותמרים ב SV 40-שאינם מתחלקים
לשם הופעת הלבידים דרושוח כ־י 12עד 16שעוח הדגרה של הפפטיד והחאים .זהו
בערך זמן הדור ש ל וואיס אלה .לכן ,קיימת האפשרות שהתלכידים נוצרים ע״י חאים
שהתחלקו ואינם יכולים להפרד זה מזה ויוצרים תלכיד .כדי לברר אפשדוח זו נבדקה
השפעה הפפטיד על תאים שאינם מתחלקיק.
תאים מוחמדים בנגיף 40
SVהוקרנו בקרני-א )כמפורט בפרק המרים ושי&ות
סעיף (1ונזרעו מיד לאחד ההקרנה .לאחר 24שעות הוסף
P O Lלתאים והתרבית הודגרה
למשך 24שעות נוספות .תלכידים אופייניים נוצרו בתאים אלה במשך אותו זמן ובאוחה
צורה כמו בתרבית הלא מוקרנת.
40 -
.3היווצרות תלמידים בממפרסורה של
בטמפרטורה של
-
הודגרה
24
-
C
תאים שהותמרו בנגיף SV 40נזרעו ^ 10תאיס למייל והודגרו במשך 12שעות
0
יי' 0
. Cלאחר 24שעות
24
. Cאהד הועברו התאים לטמפרטורה של
37
ב 2 4 °
C
הוספו 20מיקרוגרם POLוהתרבית הודגרה הלאה ב.C24° -
לאחר 24שעות הדגרה בC^24-
כעבור 120עד 144שעות הדגרה ב-
.4
לא נתקבלו בל הלבידים' .תלכידים הופיעו רק
C־ תהליך ההתלכדות הואט אבל לא עוכב לחלוטי
24°
התלכדות חאים מוחמריס ע"י SV 40בנוכחות חאים אחרים
^כאשר מטפלים
POLבאוכלוסיה מעורבת של תאים.2חאיס שהוחמרו ע״י
ותאים נורמלים או תאים שהוחמרו ע״י גורמים אחרים נתן לקבל התלכדות של התאים
בנוכחות POLרק כאשר מספר התאים שהותמרו ע״י SV 40
המוחמרים ע״י SV 40
שווה או גדול מ 50$-מכלל אוכלוסיית התאים )ראה טבלה מסי .(6
מבלה מסי ; 6
התלכדות תאים מותמרים ע"י נגיף SV 40
ב נ ו כ ח ו ת תאים אחרים
אוכלוםיה מעורבת של תאים יחלקם תאים שהותמרו בנגיף SV 40ותלקם תאים נורמליים או
תאים שהוחמרו בנגיף פוליאומה) ,מסי כולל 10תאים למ״ל( טופלו ב 20-מיקרוגרם . POL
הופעת תלכידים נבדקה לאחר 24שעוח הדגרה.
6
החלכדוח
_5
מסי חאים למייל שנזרע )
3T3POL
(x10
3T3SV40
-
10
0
-
9
1
-
8
2
7
3
6
4
+
5
5
+
4
6
+
3
7
+
2
8
+
1
9
+
0
10
40SV
-
41
-
הפרדה טובה יותר בין סוגים שונים של תאים נתן לקבל ע"י טפול אוכלוסיות
מושבות ב . P O L -כאשר מטפלים במושבות ) (clonesשל תאים מותמרים ע״י הנגיף
POL-o , SV 40עוברים התאים במושבה תהליך של התלכדות .כ 98$-מהמושבות
המטופלות מראות הופעת תלכידים .במושבות של תאים נורמלים או במושבות של שורות תאים
שהותמרו ע״י גורמים אחרים מלבד 40SVלא מופיעים תלכידים לאתר טפול . -!POL
בצורה זו נתן להבחין אפילו
במושבה אחת של תאים שהותמרו ע״י הנגיף SV40
בין
50-100מושבות של תאים נורמלים או שורות חאים אתרות.
.5חוסר׳ עכוב ההתלכדות ע״י חומצות אמיניות וסוכרים
החומצות האמיניות- !!:לאוצין- D • ,לאוצין • L ,ייא ו ר נ י ת י ן-^ ,איזולאוצין,
!!-ולין-1^ ,אלנין,
״!-גליצין- L ,פנילאלנין-!. ,פרולין,
- Lח־ אספרטיח
ו- L -חומצה גלוטמית ברכוזים עד 4מ ״ ג למ״ל אינן מתחרוח עם פולי )אורניחין,לאוצין(
בתהליך ההתלכדות ואינן מעכבות את הווצרות התלכידים״
הסוכרים או הנגזרות הבאות של הסוכרים :גלוקוז ,פוקוז ,גלקטוז ,גלוקוז-אמין
מנוז-אמין-a ,מתיל גלוקוז,
-0.מתילמנוז,
-Nאצטיל-גלוקו ז-אמין,
-Nאצטיל
מנוז-אמין ו- N -אצטיל גלקטוז אמין ברכוזים עד 5מ״ג למייל אינם מעכבים או מחחרים
בתהליך ההתלכדות .הוספה הסוכרים או החומצוח האמיניוח הנ״ל בשלבים שונים לאחר
הוספת פולי )אורניחין ,לאוצין( לא שנתה את השפעתם.
.6עבוב ההתלכדות ע״י פולי חומצוח אמיניוח חומציות
פוליפפטידים של חומצוח אמיניוח חומציוח כמו פולי חומצה גלוטמיח או פולי
חומצה.אספרטיח שמשו מעכבים חזקים מאד של תהליך הצמות הנגרם ע״י פולי )אורניתין,
לאוצין( בכל סוגי התאים .לכן ,נבדקה.השפעתם של פוליפפטידים אלה על תאים מוחמרים
ב SV 40-לאחר טפול בפולי )אורניתין ,לאוצין(.
כאשר 20מיקרוגרם למייל של פולי חומצה גלוטמיח ) ( DR=620מוסיפים לתאים
שהוחמרו ב40-
SVלפני או יחד עם 20מיקרוגרם למייל פולי )אורניתין ,לאוצין(
42 -
-
לא מחקבלח כל התלכדוח.תאים .כאשר הפוליפפטיד החומצי מוסף בזמנים שונים לאחר
הוספת פולי )אורניתין ,לאוצין( ,נתן לעכב את תהליך ההתלכדוח.של החאים במרה .
ומוסיפים אח הפפטיד החומצי במשך 5שעות הראשונות לאחר הוספת פולי )אורניתין,
לאוצין( .הוספת פולי חומצה .גלוטמית 6או יותר שעות לאחר הוספה ,פולי )אודניחין,
לאוצין( ,לא מעכבת את תהליך ההתלכדות ומופיעים תלכידים בגודל ובצורה זהים לבקרת
שלא טופלה בפולי חומצה גלוטמית) .ראה ציור מסי .(9
.7
תפקיד הנסיוב בתהליך ההתלכדות
נוכחות הנסיוב במערכת בזמן יצירת תלכידי תאים מותמרים בנגיף SV 40
ע״י
פולי )אורניתין ,לאוצין( הכרחית .ללא נסיוב ,או ברכוזי נסיוב הנמוכים מ 1$-לא
מתקבלים תלכידים .הופעת הלבידים נבדקה בנסיובים מעובר עגל ,מעגל ומסוס ונמצאה
דומה .כאשר מדגירים פולי )אורניתין ,לאוצין( במצע .גדול המכיל 10$נסיוב במשך
24שעוח ב 37°0-ואחר מוסיפים .מצע זה לתאים לא מתקבלת התלכדות תאים .אמנם
)אורניתין ,לאוצין( אינו מתפרק בהשפעת האנזימים הפרוטיאוליטיים בנסיוב אך הוא
נספח בנראה לחלבוני הנסיוב ולכן נמנעת פעולתו .כן מראות תוצאות נסוי זה כי גורם
ההתלכדות לא נוצר כתוצאה מתגובה בין הפפטיד הבסיסי והנסיוב אלא התגובה בין החאים
והפפטיד הכרחית להופעה התלכידים .בזמן הדגרת מצע גדול ותאים בנוכחות פולי )אודניתין,
לאוצין( לא מופרש למצע כל גורם הלחכדוח .כאשר אוספים מצע גדול מחרביוח חאים שהוחמרו
ב SV 40-שגדלו בנוכחוח פולי )אורניחין ,לאוצין("ומגדלים חאים חדשים בנוכחות קרקע
מזון זה -לא מחקבלה כל החלכדוח.
.8
תפקיד יוני הסידן
לנוכחות יוני סידן במערכת ההתלכדות חשיבות רבה ביצלרת התלכידים .כאשר מדגירים
תאים שהותמרו ע״י הנגיף 40
1
SVבנוכחות פולי )אורניחין ,לאוצין( במצע גדול חסר
ר׳
יוני סידן לא מתקבלת החלכדוח חאים .נחן לקבע אח הרבוז המינימלי של סידן הדרוש
להופעת תלכידים.
- 43 -
•
Aggregation -
No
Aggregation
12
8
6
4
2
0
Addition time (hours)of poly glutamic acid after POL addition
,
ציור מם ;9עבוב התלכדות של תאים מווזמרים בנגיף SV 40ע״י הוספת
פולי-חומצה גלוטמית
6
תאים למייל( הודגרו בנוכחות 20מיקרוגרם למייל
תאי 3T3 SV(10 40
פולי )אורניחין ,לאוצין( בזמנים שונים לאחר הוספת פולי )אורניתין ,לאוצין( הוספו
20מיקרוגרם למייל של פולי-חוםצה גלוטפיח ) .( DP =620מעקב אחד הופעת תלכידיס
נעדר 24שעות לאחר הוספה פולי )אורגיחין ,לאוצין(.
44 -
תאים שהותמרו ע״י הנגיף 40
10
(
-
תאים למייל( שעברו הדגרה מוקדמת של
SV
48שעות במצע גדול חסר סידן ובנוכחו-ת 10$נסיוב שעבר דיאליזה כנגד תמיסת בו8ר
חסרה סידן ,מוךגרים בנוכחות פולי )אורניתין ,לאוצין( ברכוזים שונים של סידן
mg% Ca 0-10
Ca 0-2.5
או
M
m
( במשך 24שעוח )דאה ציור מס׳ (10
תלכידים קטנים מאד מחחילים להופיע בריכוז סידןשל
m M־ 3 ) °מ״ג אחוז(.
75
התלכדוח רגילה מופיעה רק ברכוז של מעל 4מ״ג אחוז או
.9
1
mM
יוני סידן.
התלכדות של תאים מותמריס בנגיף אדנו מם׳ 12
שלש שורות תאים מאוגר שהוחמרו בנגיף אדנו מם' 12ונתקבלו ממקורות שונים
עברו ההליך התלכדות לאחר הדגרה בנוכחות פולי )אורניתין ,לאוצין( .התלכידים
המחקבלים בחאים מוחמרים ע״י נגיף אדנו מסי 12הם קטנים יוחר ומכילים $חות חאים
לתלכיד )ראה תמונה מסי .(1שורות תאים שהוחמרו ע״י נגיפי אדנו אחרים )מסי ,3
ו (7-לא עברו התלכדוח בנוכחות פולי )אורניהין ,לאוצין( .תאי האוגר שהותמרו בנגיף
סי
נבדקו לנוכתות
א נ ט י ג ן - 1 2ט ו מ ו ר )
( T-antigenהאופייני לנגיף
ונמצאו שליליים .׳.
.10התלכדות חאים מוחמרים בנגיף SV 40בנוכחות פוליפפטידים בסיסיים שונים
כאשר נבדק כשרם של תאים מותמרים בנגיף SV40לעבור התלכדות בנוכחות
פוליפפטידים בסיסיים אחרים מלבד פולי )אורניחין ,לאוצין( נמצא כי גם קופולימידים
בסיסיים אחרים גורמים להתלכדות התאים .בדיקת הפפטידים נעשחה במערכח זהה לזו בה
נבדק פולי )אורניתין ,לאוצין( .חרחיף תאים של
10חאים למייל נזרע במצע גדול
מועשר ב 10$-סרום עגל ובנוכחות רכוזים שונים של הפפטיד הנבדק .והתאים הודגרו
במשך 24שעות עד 48שעות בטמפרטורה של C^37והתרביות נבדקו להופעת תלכידים.
נמצא כי גם פפטיד מסודר :פולי )לאוצין-אורניתין-לאוצין( וכן קופולימרים
אקראיים של אורניתין,ולין ,וארגינין ,לאוצין גורמים להתלכדות תאים מלבד הקופולימר
האקראי של אורניתין ,לאוצין .הפפטידים האלה גרמו להתלכדות תאים רק ברכוזים
גבוהים פי 5-6מהרכוז הדרוש של פולי )אורניתין ,לאוצין( )ראה טבלה מם' .(7
40SV
- 45 -
r
ן——1
1
1
1
1
1
1
ו
וגיורממי ;*10הופעת תלבידים בתאים מוחמרים בנגיף 40SVברכוזים שוגים
של סידז במצע הגדול
6
תאים למייל( הודגרו במצעי גדול המכילים רבו זי סידן
האי 3T3SV40(10
שונים ו 20-מיקרוגרם לם״ל של פולי )אורניחין ,לאוצין( הוספו למצע .לאחר 24שעויז
נבדקה הופעת חלכידים.
-
הומופולימרים של - Lל י Tי ן
?
46
מ־ליזין או
-
-Lאורנ יתלן לא גרמו להתלכדות תאים
בכל הרכוזים שנבדקו.
טבלה מס־־
7ה ת ל כ ד ו ת תאים מותמרים בנגיף 40SVבנוכחות פוליפפטידים בסיסיים שונים
:
דרגת
פולימר י זציה
ממוצעת
כשר לגרום
להתלכדות
תאים
30,360,1400
-
-
פולי- D -ליזין
380
-
-
פולי -אורניהין
340
-
•-
פולי) ליזין-אלנין-ליזין(
30
-
-
פולי )אורניתין ,לאוצין(
50
+
20
+
120
פוליפפסיד
פולי -לי ז י ך
פולי )אורניתין ,ולין(
לא נקבע
פולי )ארגינין ,לאוצין(
50
פולי )לאוצין-אורניתין-לאוצין(
כאשר לא מסומן -
הרכוז הדרוש
ליצירת הלבידים
)מיקרוגרם למייל(
10 ,20
100
120
+
החומצה האמינית היא מסדרה . L
י עכבר נורמלים ) 403T3לאחר התמרת סרק בנגיף
(
SV
התלכדות סגולית הנגרמת ע״י הדגרת תאים בנוכחות פולי )אורניתין ,לאוצין( מופיעה בעיקר
בתאים שהותמרו ע״י הנגיף
. SV
4 0ל כ ן ,נבדק כשדם של תאים נורמלים לרכוש תכונות התלכדות
לאחר הדבקת סרק בנגיף . SV 40בנסוי זה נבדקו הדברים הבאים:
.1הופעת התלכדות סגולית בתאים נורמלים לאתר הדבקה בנגיף . SV 40
.2
הופעת התלכדות סגולית בתאים רק כאשר נתנה להם אפשרות להתחלק לאחר ההדבקה בנגיף.
.3מספר החלוקות שעל התאים לבצע כדי לרכוש את תכונות ההתלכדות.
4־ האם תלוקת תאים נחוצה גם בזמן אבוד תכונת ההתלכדות־
-
47
-
תאים נורמלים ) ( 3T3נזרעו בשתי רמות זריעה שונות
תאים לצלחת):10כדי לאפשר לתאיט
להתחלק לאחר ההדבקה בנגיף( 10x-^1.40תאים לצלחת )כדי לא לאפשר לתאים להתחלק( .התאים
הודבקו בתרחיף של נגיף SV 40מזן
776ביחס של 100יחידות יוצרות מוקדים ) ( P F Vלתא.
הבקורת הודבקה בליזט תאים ללא נגיף .התרביות הודגרו במשך שבעה ימים לאחר ההדבקה בנגיף .בכל
יום נספר מספר התאים בצלחת ,נקבע אחוז החאים שהכיל טומור-אנטיגן מיוחד ל SV 40-והתאים
עברו מבחן התלכדות סגולית טבלאות 8א' ו8-ב' מסכמות את התוצאות שנתקבלו.
מתוך הנסוי נתקבלו התוצאות הבאות :א .בתרבית מחחלקת :חלוקת התאים בתרבית המודבקח
מהירה יותר מזו של תרבית שלא הודבקה בנגיף .בתרבית המודבקת מתהילה להופיע תכונת ההתלכדות
כבר לאחר היום הרביעי אחר ההדבקה -כאשר התאים עברו ב 4-תלוקות־ ביום החמישי לאחר ההדבקה
נראית התלכדות ספציפית חזקה ביותר .בשלב זה מגיע גם מספר התאים מכילי טומור אנטיגן למכסימום.
)טבלה מם' 8א'( .ב־ בתרבית שאינה מחחלקת :בתרבית זו -נזרע מספר גבוה של תאים כדי לא לאפשר
חלוקתם לאחר ההדבקה בנגיף .בתרבית המודבקת נתקבלה 0.5חלוקות תאים לאחר 7ימים .בתרבית זו
הופיעו מספר נמוך מאד של תאים מכילי טומור אנטיגן ולא הופיע התלכדות סגולית בהשפעח
פולי )אורניחין ,לאוצין( גם לאחר 7ימים של הדגרה) .טבלה מסי 8ב'(.
48 -
-
טבלה מם' 8א' :הופעת ההתלכדות הסגולית בהשפעת פ ו ל י ) א ו ר נ י ת י ן .ל א ו צ י ן ( והופעת
א נ ט י ג ן לאחר התמרת סרק של תאי
זריעה התחלתית:
נגיף
חרביח
לא
מודבקת
חרבית
מודבקח
V
T
בנגיף
S
3
0
4
0.1x10תאים לצלחת.
זמן לאחר
ההדבקה
)ימים(
האיס לצלחת
6
10־x
חאים מכילי
סומור אנטיגן
*
-
התלכדות
סגולית
-
1
0.2
2
0.45
3
0.7
4
0.75
5
0.8
6
1 .1
7
1 .15
1
0.3
2
0.75
10
3
1.7
17
4
2.8
17
+
5
2.64
27
+++
6
3.2
30
+++
7
3.1
29
+++
—
-
_
-
-
49
-
טבלה מסי 8ב' ; הופעת התלכדות סגולית בהשפעת פ ו ל י ) א ו ר נ י ת י ן ,לאוצין( והופעת
א נ ט י ג ן לאחר התמרת סרק של תאי
נגיף
חרב י ח
לא
מודבקח
תרבית
מודבקת
V
T
זמן לאחר
הזריעה
)ימים(
S
בנגיף
תאים לצלחת
6
10־x
3
תאים מכילי
טומור-אנטיגן
*
0
4
התלכדות
סגולית
-
1
1 .55
2
1 .5
3
1 .6
4
1 .65
5
1 .84
6
2.0
-
7
1.9
-
-
1
1 .7
-
2
1.78
2
-
3
1 .9
2
-
4
2.0
3
5
2.1
3
6
2.25
3
7
2.1
3
-
—
-
-
-
-
-
50
נבדק האס התאים הנורמלים ,שרכשו אח חכונח ההחלבדות לאחר הדבקה בנגיף ,מאבדים
תכונה זו לאחר העברות נוספות והאם אבוד התכונה תלוי בתלוקת תאים .לצורף נסוי זה נלקחו
תאים נורמלים שרכשו את תכונח ההחלכדוח לאחר הדבקתם בנגיף .. SV 40תאים אלה פוזרו
7ימים לאחר ההדבקה של תרביות דלילות = בזמן זה קיימת התלכדות חזקה ביותר כאשר מדגירים
את התאים בנוכחות פולי )אורניתין ,לאוצין( .התאים נזרעו ב
לא מתתלקים ו
0
— 0 . 1תאים לצלחת
1
ז ר י ע ה 10 X1.5 : - 2תאים
6
רמות
x
= חאים מהחלקים .ברווחים בני יום נלקחו
דוגמאות תאים משתי התרביות לבדיקת התלכדות -התוצאות מובאות בטבלה מסי .9
מתוך התוצאות נראה ,כי כאשר זורעים מתדש תאים נורמלים שה ו תמר ו התמרת סרק ורכשו
תוך כדי התמרה זו כשר לעבור התלכדות סגולית בהשפעת פולי )אורניתין ,לאוצין( ,מאבדים
תאים אלה את הכשר להתלכד לאחר יומיים בחרביח חדשה .אבוד הכשר מוחנה בחלוקת תאים )לפחות
2חלוקות תאים(.
טבלה מס" : 9
א ב ו ד ת כ ו נ ת ההתלכדות ה ס ג ו ל י ת בהשפעת פ ו ל י
נ ו ר מ ל י י ם שנרכשה בהתמדת סרק ע ״ י נ ג י ף
ימים
לאחר
הזריעה
מסי תאים
לצלחת ,
10־x
) א ו ר נ י ת י ן ,ל א ו צ י ן ( בתאים
SV40
לאחר ח ל ו ק ת תאים
מספר תאים
בעלי טומור
אנטיגן )($
6
1
0.2
רמח זריעה
2
0.42
19
0.1x10
חאים לצלחח
3
0.75
19
-
חאים שאינם
מתחלקים
רמת זריעה
1
1 .7
25
+++
2
1.7
24
1.5X10
3
1 .8
23
חאים מהחלקים
6
6
Iתאים לצלתת I
.
התלכדות
סגולית
22
I
ן
51 -
ד.
-
השפעת פ ו ל י ) א ו ר נ י ת י ן ,לאוציז( על םנתיזית חלבון ועל סנתיזת
SVמותמרים ע״י נ ג י ף
DNAבתאים
40
כדי.לבדוק את השפעתו של פולי )אורניתין ,לאוצין( על מערכות ביוסנתתיות כלליות בתא,
נבדק האם נוכחות הפפטיד במצע הגדול של התאים משפיעה על םנתיזת חלבון וסנתיזת ^ D N A
בתאים מותמרים ע״י נגיף . SV 40
הבדיקה נעשתה כמתואר בסעיף שיטות .השפעת פולי )אורניתין ,לאוצין( על סנתיזת החלבון
נעשתה ע״י קביעת השפעתו על אינקורפורציה של החומצה האמינית לאוצין מסומנת בפחמן רדיואקטיבי
לחלבונים הבלתי מסיסים בתומצה - 3כלורו אצטית .השפעתו של פולי )אורניתין ,לאוצין( נבדקה
במקביל להשפעת מעכב אופייני של סנתיזת חלבון בתא -ציקלוהקסמיד .הבדיקות נעשו בתאי עכבר
משורת 3T3שהוחמרו ע״י נגיף 40
,
SV
תאים נורמלים ,תאים שהוחמרו ע״י נגיף הפוליאומה
ותאים שהותמרו.גם ע״י נגיף הפוליאומה וגם ע״י נגיף . SV 40.בציור מסי 11נראית השפעת
14
3Tבתאי
אוצין( על אינקורפורציה של לאוצין -
C
SV403
.מתוך העקומות
נראה כי הפוליפפטיד מעכב חלקית את סנתיזת החלבון בתא .העכוב הנגרם ע״י הפפטיד הוא חלש
מאד ב.12-השעות הראשונות של ההדגרה .לאחר 24שעות הדגרה בנוכחות 20מיקרוגרם למייל פולי
)אורניתין ,לאוצין( -שהוא הרכוז הגורם להתלכדות הסגולית -מתקבל עכוב של כ־20$
באינקורפורציה של החומצה האמינית המסומנת .המעכב האופייני של םנחיזח החלבון -ציקלוהקםמיד -
גורם בחנאים דומים לעכוב של כ 100$-באינקורפורציה .העכוב הנגרם ע״י
ן ההדגרה .נסיונוח דומים בחאים אחרים משורת
3הראו תוצאוח
ציקלוהקסמיד הוא מיידי
ד ו מ ו ח . T 3
פולי )אורניתין ,לאוצין( גורם לעכוב מועט ,של כ 20$-לערך ,באינקורפורציה של לאוצין מסומן
גם בתאי 3T3
נורמלים וגם בתאי
3T3מותמרים ע״י נגיף הפוליאומה או ע״י שני הנגיפים
)פוליאומה ^ ( SV40יחד.
כאשר נבדקה השפעת פולי)אורניחין ,לאוצין( על םנתיזת
בנגיף 40
3
בתאי3TDNAמותמרים
) SVציור מסי (12נמצא כי הדגרח החאים בנוכחות הפפטיד ברכוזים של 5עד 20
מיקרוגרם למייל גורמת להשפעה מועטה מאד על אינקורפורציה של תימידין מסומן ל . DNA -לאחר
כ 4-עד 10שעות הדגרה בנוכחות 20מיקרוגרם למייל פולי )אורניתין ,לאוצין( ישנה עליה של
כ 40$-באינקורפורציה של תימידן מסומן לתלק התאי הבלתי מסיס ^TCA׳ .ההבדל בין התאים
המטופלים והלא מטופלים מטשטש במשך הזמן ולאחר כ 20-שעות הדגרה אין הבדל בין התרביות
המטופלות בפפטיד ואלה שאינן מטופלות.
-
ו !
ו
ו ו
ו
ו ו ו
)•(hour
ו
! ו
52
! !
! !
-
!
ציור מסי
! !9000
:11
השפעת ר כ ו ז י ם שוגים
»Tim
* י ו ר מסי :12השפעת רמוזים שונים
—rו—ו—ו—ו—ו—ו—ו—ז—ו—ו—ו—ו—ן—ן—ן—ן—ן—01ג
״
_|
36
32
ו
28
ו
ו
24
ו
ו
20
ו
ו
ו
16
)(hours
ו
12
ו
ו
B
Time
ו
ו
ו—01—I—I—I
0
4
על פ ו ל י ) א ו ר נ י ת י ז .
-
53
-
בהשוואה בין תגובת תאים שונים להדברה בנוכחות פילי )אורנית׳־ן ,לאוצין( נמצא כי
T3T3
נורמלים או תאים שהותמרו בנגיף הפוליאומה
לתאי
0
1
בתאי
. 3T3SV40אמנם העליה באינקירפורציה בתאים אלה אינה גבוהה כמו בתאי
נורמלים לאחר
5%
( 3 PVמ ג י ב י ם בצורה דומה
PV3
3
3T3SV40
שעות הדגרה בנוכחות פולי )אורניתין,לאוצין(
בתנאים דומים.
מתוך התוצאות המובאות לעיל נראה ,כי לא ניתן להסביר את תופעת ההתלכדות הסגולית של
חאים מותמרים בנגיף . SV 40בהשפעת פולי )אורניתין ,לאוצין( ע״י.השפעת הפפטיד על סנתיזה
של חלבון או
DNAבתא .העכוב הנגרם ע״י פולי )אורניתין ,לאוצין( על האינקורפורציה של
החומצה האמינית לאוצין הוא תלש ובהשוואה לעכוב הנגרם ע״י מעכב סנתיזח חלבון ציקלוהקסמיד
קשה להסביר בעזרתו את קיום ההתלכדות הסגולית .העובדה שעכוב דומה נמצא גם בתאים אחרים שלא
הותמרו ע״י הנגיף SV 40מבטלת את האפשרות שההשפעה על סנתיזת התלבון היא הגורמת להחלבדות
התאים .מצב דומה מתקבל גם ביחס לםנתיזת ה DNA -בתאים־ אמנם נתקבל זרוז מה באינקורפורציה
של תימידין מסומן לתאים אבל הזרוז אינו גדול ביותר )פי 1.5לערך( בהשוואה לזרוז בםנתיזת
הנגרם למשל ע״י הדבקת תאים נורמלים בנגיף גורם סרטן )זרוז של פי 5לערך ) .( (3נתן
להסביר זרוז זה בהשפעת פולי )אורניתין ,לאוצין( על הדירות התימידין לתאים ).(118 ,58
ההתלכדות הסגולית של תאים שהותמרו בנגיף SV 40בהשפעת פולי )אורניתין ,לאוצין( נגרמת
כנראה לא ע״י שינוי בםנתיזח החלבון או ה DNA -בתא אלא ע״י ס י נ ו
י
בחלק
החיצוני של התא
)כנראה בקרום( ע״י ספיחיה של הפפטיד לתאים .כדי לברר את האפשרות הזו נעשו הנסיונות הבאים
בהם נבדקה השפעת פולי )אורניתין ,לאוצין( על ספיחת הלקטין קונקנבלין _
A
לתאים וכן
נבדקה םפיחת פולי )אורניתין ,לאוצין( מסומן לתאים־
^^^?ה .השפעת פולי )אורניתין ,לאוצין( על ספיחת
A-
בתאים מותמרים בנגיף
40SV
כידוע סופחים תאים נורמליים ומותמרים את הלקטי־ן קונקנבלין . A -הספיחה גורמת לצמוח
תאים מותמרים .תאים נורמליים אינם מוצמתים ע״י הלקטין ) (87הלקטין נקשר כנראה לאתר קשור
סוכרי בקרום התא מאתר והוספת תמיסת הסוכר
ג>-מתיל גלוקוז מפזרת אתי הצמתים ומורידה מהקרים
'לקטין קשור ) .(88מערכת זו ,היא אמה מידה טובה לבדיקה שינויים החלים בקרום החאמאחר וחלק
••"׳ מהלקטין נקשר באופן סגולי לאחרי קשירה מיוחדים על גבי הקרום .שנוי בכמות הלקטין הנקשרת לתא
•
...יכולה להראוח על חשוף אתרי קשירה נוספים או על שינוי בחכונוח הקשירה של הקרום ).(161
-
( 3
הראשון הודגרו תאים שהותמרו בנגיף
54
-
SV40
) T 3 S Vב נ ו כ ח ו ת רכוזים שונים של
פולי )אורניתין ,לאוצין( החאים הוצאו בזמנים שונים לאחר הוספת הפפטיד ונבדקה כמות הלקטין
Con Aהרדיואקטיבי שנספת לתאים .נמצא כי תרבית לא מטופלת סופחח כמוח קבועה של קונקנבליןA -
לאחר הדגרה של התאים בנוכחות פולי )אורניתין ,לאוצין( עולה כמות הקונקנבלין.הנספחת לתאים
פי 2לערך אם התאים הודגרו בנוכחות 10מיקרוגרם למייל פ ולי).אורניחין ,לאוצין( ופי 3לערך
אם החאים הודגרו בנוכחות 30מיקרוגרם למייל פולי )אורניתין ,לאוצין() .ציור מסי .(13הגברה
מקסימלית של םפיחח קונקנבלין,מתקבלת כבר לאחר 4שעות של הדגרת התאים בנוכחוח פולי)אורניחי ן,
לאוצין(.
פפטידים בסיסיים ידועים כמגבירי חדירות של חלבונים לתוך תאים אנימליים ) .(118קיימת
אפשרות לכן כי הגברת הםפיחה של קונקנבלין לתאים באה רק בעקבות הגברח תדירותו לתאים .כדי
הדגרו תאי SV3T3ברכוזים עולים של פולישעות4אורניתין,לאוצין( למשך
)
.
לאחר ההדגרה נבדקה ספיתת קונקנבלין לתאים לפני ואחרי טפול בתמיסת מתיל גלוקוז להורדת
הקונקנבלין הספות לאתרי הקשור בקרום .נמצא כי ההגברה בספיחת קונקנבלין לאחר טפול בתאים
בפולי )אורניתין ,לאוצין( נגרמת כנראה בעיקר כתוצאה מעליה בםפיתה הספציפית של הקונקנבלין
לאתרי קשירה םוכריים בקרום התאים .אמנם גם כמות הקונקנבלין הספוחה שאינה רגישה לשטיפה
בתמיסת סוכר עולה ,עם עלית כמות פולי )אורניתין ,לאוצין( )ראה ציור מם' (14אך עליה זו
נמוכה בהרבה מזו של הספיחה.הרגישה למתיל גלוקוז.
נראה כי.פולי )אורניתין ,לאוצין( גורם לשינוי בקרום החא .שנוי זה מביא להגדלה בספיחה
של קונקנבלין לתאים שטופלו בפפטיד בסיסי זה.
ו.
םפיחת פולי )אורניתין,לאוצין( .מסומן לתאים
במטרה לחת בטוי כמותי לעצמת הקשור בין התאים ומולקולות פולי )אורניתין ,לאוצין( וכן
במטרה למצא האם קיים קשור רב יותר של הפפטיד בחאים מםויימים הוכן פולי )אורניחין ,לאוצין(
רדיואקטיבי ע״י שמוש בלאוצין
-C
14
.
55 -
-
o
900
a
E
a
u
קי
2
500
<
ID
oc
U
12
6
4
2
)T i m e of incubation with P O L (hours
ציור מ ם ם פ י ת ת
:
63
Con A-Niלתאי SV3 T3 40לאחר הדגרתם בנוכחות
'13
פולי )אורניתיז .לאוציז(.
התאים הודגרו בנוכחות פולי )אורניתין ,לאוצין( 20 ,10 ,0מיקרוגרם לם״ל
לאחר הדגרה זו נרחצו החאי^זמנים שונים לאחר הוספת פולי )אורניחין ,לאוצין(
Con A-Niנרחצו ונספרו לקביעת כמות הקונקנבלין
והתאים הודגרו בנוכחות
הםפוח לחאים.
«
-
56
-
—rן—1500n
30
25
__1
__l
20
IS
L
10
j
8
L
5
1
3
I
ou
)POL added (/1g/ml
ציור
14
,
: D Oהשפעת פולי )אורגיתיז .לאוציז( על ספיהח קוגקנבליז מסומן - 3
SV
.63
Ni
3T3לתאי
תמאיס הודגרו בנובחוח פולי )אודניחין ,לאוצין( ,נרחצו ואחר חודגרו בנוכחות
Con A-Niלאחר זאח נרחצו התאים בגופר או בבופר המכיל
-0מחיל-גלוקוז
לקביעת ספיחה כללית וםפיחה שאינה רגישה ל- a -מחיל-גלוקוז.
40
־
57
_
תכשירי הפפטיד המסומן נבדקו לפני השמוש בבדיקות הבאות:
1־ כושרם לבצע צמות מהיר של תאים בהשוואה לכושרו של פפטיד לא מסומן;
SV2־ כושרם לבצע התלכדות סגולית של תאים שהוחמרו ע״י נגיף 40
•
.3יציבותו של הפפטיד המסומן לפרוק פרוטיאוליסי במצע הגדול שהכיל נסיוב.
בבדיקות אלה נמצא כי לפפטיד המסומן אותן התכונות כמו לפפטיד שאינו רדיואקטיבי והוא
גורם לצמות תאים ולהתלכדות סגולית של תאים שהותמרו בנגיף SV 40ברכוזים השווים לרכוזי
פפמיד שאינו רדיואקטיבי .הפפטיד נמצא יציב לפעילות פרוטיאוליטית של האנזימים הנמצאים
בנסיוב ולא השתחרר כל לאוצין
C -
4
1
2 4
במשך
השעות הראשונות להדגרתו במצע גדול.
םפיחת פולי )אורניתין ,לאוצין( נבדקה i-2מערכות נסוי מקבילות:
.1ספיחת פפטיד לתאים רחוצים )בחנאי צמות(
.2ספיחת פפטיד לרבדי תאים בתרבית )בתנאי התלכדות סגולית(.
נפרט את הממצאים שנתקבלו בכל אחת מהמערכוח שנבדקו:
.1םפיתת פולי )אורניתין ,לאוצין( לתאים רחוצים )בתנאי צמות(
בציור מסי 15נראית עקומה ספיחת פזלי )אורניתין ,לאוצין( -
u
Cשל תאים שונים
כתלות של רכוז הפפטיד בנוזל הספיחה .מתוך הציור נראה בברור כי כמות הפפטיד הנםפת
לסוגי תאים שונים הוא דומה ואין הבדלים מהותיים בין תאים שהותמרו ע״י הנגיף
SV40
ותאים אחרים .כן יש להוסיף את הממצאים הבאים:
א .טפול בתאים בתמיסת טריפםין או בתמיסת ורסן לא שנה את הספיחה.
ב .כאשר הטפיחה נעשתה בבופר המכיל פוספט )
( PBSאו בבופר שאינו מכיל פוספט
)בופר ורונל( נתקבלו ערכים דומים.
ג .ספיחת הפפטיד בנוכחוח יוני סיךן ) (PBSאו בחוסר יוני סידן ) ( CMFהיתה דומה.
-
58
-
ד״ פולי )אורניתין ,לאוצין( נספח במרה שווה גם לתא-׳ אוגר־ נסיונות שנעשו בוזאיס
,
) (HamNOR, HamSV, HamPV, HamDMNAהראו
נורמלים ומותמרים מאוגר
כי כמות הפפטיד למ״ג חלבון הנספחח לתאים אלה שווה גבל סוגי התאים ודומה לזו
שנספחה לתאי עכבר.
מחוך.תוצאות הספיחה ומחשוב שטח פני התאים נתן היה לחשב אח מספר מולקולות פולי
)אורניתין ,לאוצין( הנספחוח למיקרון מרובע של שטח פני החאים השונים״ החשובים נעשו
לפי הנתונים הבאים:
C
י
א .המשקל המולקולרי של פולי )אורניתין ,לאוצין( נקבע ב.10 -
8
10x
בcpm3.רדי ואקטיבי ות סגולית
לגייר פפטיד.
ג ־ שטח פני התאים נקבע לפי נפחם .הנפח של 10^2xתאים נקבע במבחנה קפילרית לאחר
סרכוז כמתאר בסעיף 4י'
בפרק שיטות.
שטח פני• התאים שנבדקו מובא בטבלה מסי 10־
טבלה מם' : 1 0שמח פני התאים לאחר טפול בטריפםין ו ורסן
שטח פני התא
סוג התאים
-6
)מיקרון X2
/
(10
טפול בורםן
טפול בטריפםין
1134
1216
3T3SV40
981
711
|
3T3 P V
773
726
|
3T3SV40• PV
828
672
3T3
-
59 -
s
10
3T3PV
4
3T3SV40.PV
I0
o
w
C
Z
o
u
0-
<ס
E
*10
o
E
10°
o
w
Cl
>£
E
20
40
)input (/*g/ml
_L
10
5
40
14 C - O L
,
צ י ו ר מ ם :16ת ל ו ת מספר ה מ ו ל ק ו ל ו ת של
C
ל ת א י ם נ ו ר מ ל י ם ו מ ו ת מ ר י ם )בתנאי צמות(
ב ר ב ו ז ה ח י צ ו נ י של הפפטיד
התאים נרחצו 3פעמים בבופר והודגדו במשך
20דקות עם רכוזים שונים של פולי )אורניתין,
.לאחר הספיחה נרתצו התאים
C
וצין(
לאוצ׳
3פעמים וכמות הרדיואקטיביות הספוחה חושבה
בהתאם לכמוח החלבון הכללית.
20
)C - 0 L input (/1g / ml
14
צ י ו ר מ ם ' :15ת ל ו ת ספיחת פ ו ל י ) א ו ר נ י ת י ן ,ל א ו צ י ן (
10
פולי
,14
C
)אורניתין ,לאוצין(
הנספח למיקרון
2
של שםח פ נ י
התא בתאים נ ו ר מ ל י י ם ו מ ו ת מ ר י ם
) ב ת נ א י צמות( ב ר כ ו ז י ם ש ו נ י ם
של פ פ מ י ד
תנאי הנםוי כמתואר בציור מם' .15הספ י וזה
הושבה בהתאם לדדיואקטיביווו^הספציטית של
Cולשטח פני
פולי )אודניחין ,לאוצין(
התאים שנקבע במבחנה קפילריח )ראה סבלה מם' ,(10
-
60
-
t
התוצאות מובאות בציור מסי .16מתוך הציור נראה כי כמות המולקולות הנספחות לסוגי
תאים שונים דומה .לא נמצא הבדל מהותי בספיחח פפטיד ליחידח שטח בין כל סוגי התאים שנבדקו
ולא נמצאה ספיחה רבה יותר בתאים מותמדים ע״י הנגיף . SV 40מחיך ציורים 15ו 16-נראה
כי גם לאתר טפול אוכלוסית תאים ב 40-מיקרוגרם למייל של פולי )אורניתין ,לאוצין( עדיין
אין רוויין בקליטה .חוסר נקודח רוויון נובע כנראה מחופעח ההרג של תאים ברכוזי פפטיד
גבוהים .התאים המתים ,חדירים הרבה יוחד .לפפטיד ויכולים לםפוח כמויוח עולוח של פפטיד בסיסי.
הנסויים בספיחה נעשו ברכוזים עד 40מיקרוגרם למייל ,רכוז שבו ההרג ,הוא נמוך ביותר .תופעה
נוספת התורמת לקליטה גבוהה של הפפטיד ללא נקודח ר ו ו יי ו ן היא חוסר קשירה ספציפיח של פפטיד
באתרי קשירה מוגדרים.
.2
ספיחת פולי )אורניתין .לאוצין( ברבדי תאים מתחלקים )בתנאי התלכדות סגולית(
פולי )אורניתין ,לאוצין( גרם לצמוח מהיר של כל סוגי התאים שנבדקו ,כן.נמצא כי
כמות הפפטיד המסומן הנספחח לסוגי תאים שונים בהם חל צמות ,שווה .מענין לכן ,לבדוק באם
בתנאים בהם גורם הפפטיד להחלכדוח סגוליח של תאים מותמרים ע״י נגיף , 4 0 S V
בלבדקיימת
ספיחה סגולית של פפטיד לחאים אלה .לצורך נםוי זה נבדקה הםפיחה ע״י סוגים שונים של תאים
נסיוב
ו10$
תאים נזרעו לצלחת במצע גדול המכיל
20-מיקרוגרם
למייל פולי )אורניתין ,לאוצין( -בזמנים שונים לאחר הזריעה ) 0עד 24שעות(.כאשר הופיעו
תלכידים ברורים נבדקה.כמוה הפפטיד המסומן הספוח לתאים .מתוך ציור• מם' 17נראה כי כמות
הפפטיד שנספחה לסוגים שונים של תאים שווה ואין הבדל בין תאים שהותמרו ע״י נגיף SV 40
ותאים אחרים .תוצאות• דומות נתקבלו.גם בתאי אוגר נורמליים ומותמרים.
בגלל חשיבוח נוכחות יוני הסידן במצע הגדול בזמן יצירת התלבידים ע״י תאים שהותמרו
בנגיף SV 40כאשר מדגירים אותם יחד עם פולי )אורניתין ,לאוצין( נבדקה השפעח יוני .
סידן על םפיחח פפטיד מסומן גם במערכחשל החלכדוח סגוליח .נמצא כי ספיחת פפטיד מסומן ע״י
תרביות תאים•בנוכחות ובחוסר יוני סידן היחה שווה.
מערכת ספיחה זו משמשח מכשיר טוב לבדיקח ההחחרות בין פולי חומצות אמיניוח חומציות
כמו פולי חומצה גלוטמיח ופולי חומצה אספרטית ובין פולי )אורניתין.,לאוצין( .כידוע נתן
לעכב את תהליך ההתלכדות הסגולית הנגרמת ע״י פולי )אורניתי^ לאוצין( אם מוסיפים כמוה
אקוימולריח של פולי חומצה גלוטמית יחד או עד 5שעוח לאחר הוספת פולי )אורניתין ,לאוצין(.
61 -
-
ציור מס" :17תלות ספיחת פולי)אורניתין,
14
cעל רבדי תאים
לאוצין(
)בתגאי התלכדות( בזמן ההדגרה
התאים השונים הודגרו במצע גדול םלא
המכיל 10$נםיוב ו^|0-מיקרוגדס למייל פולי
. Cבזמנים שונים
)אורניתין ,לאוצין(
נרחצו התאים בבופר ונקבע הפעילות
הרדיואקטיבית הספוחה להם.
24
8
16
)lime lh
Incubating
4
0
62
-.
-
בעזרת המפטיר המסומן נבדקה השפעת הוספה פולי חומצה גלוטמית בזמנים שונים לאחד הוספת
הפפטיד הבסיסי ,על ספיחת P O Lהרדיואקטיבי״
40
T 3ט ו פ ל וב() SV
14
)אורניתין ,לאוצין{־ 0
2 0 - 3 S V 4 0מיקרוגרם למייל פולי
במערכת יוצרה התלכדות )תאים דבוקים לצלחת בנוכחות מצע גדול
ונסיוב( .בזמנים שונים לאחר הוספה המפסיד הבסיסי נשטפה התרבית היסב בבופד והודגדה
למשך 20דקות בחמיסח בופר שהכיל 20מיקרוגרם למ״ל פולי חומצה גלוטמיח )D P =620
(.
לאחר ההדגרה נשטפה התרבית פעם נוספת והפעילות הרדיואקטיבית שלה נמנתה.
נמצא כי עד 4שעוח לאחר הוספת הפפטיד הבסיסי המסומן נתן להוריד את רובו ע״י
רחיצה בתמיסת פולי חומצה גלוטמית )ראה ציור מסי .(18בין 20$ל 30$-מהפפטיד הנספח
נשאר לאחר רחיצה עם פולי חומצה גלוטימית 1-2שעוח לאחר תחילת ההדגרה־ כאשר השטיפה
נעשח 4שעות ויותר לאחר חחילת ההדגרה נתן להוריד כמוה קטנה מאד מהפפסיד הבסיסי הספוח -
ו 70$-809£-מהפפטיד המסומן נשארים ספוחים לתאים .תוצאות אלה מתאימות להוצאות שנתקבלו ^.ל
עכוב ההתלכדות הסגולית ע״י פולי חומצות אמיניות חומציות־
ז.
חלוקת פולי )אורניתין ,לאיצין- (C
14
בתא
מחוך הנסוייס הקודמים נראה כי ההחלכדוח הסגוליח של תאים מותמרים בנגיף SV 40לא נגרמת
כחוצאה מספיחה סגולית של פפטיד לתאים אלה .כל סוגי החאים שנבדקו ,בחנאים השונים שנבדקו ,ספחו
כמויוח דומוח של פפטיד .מתוך הנסוי האחרון נראה כי הפפטיד הבסיסי אינו נשאר על שטח פני החאים
בלבד אלא חודר לתוך התאים• .ולי חומצות אמיניוח חומציוח כמו פולי חומצה גלוטמיח אינן יכולוח
לשטף פפטיד
סםוח לתאים לאחר כ 5-שעוח סמיחה.
כדי להוכיח חדירת המפסיד הבסיסי למוך התא וכדי לנסות למצא את מקום התרכזותו בתא טופלו
מולי )אורניתין ,לאוצין( מסומן בדטרגנט הלא-יוני
P
. Nonidat
4 0ד ט ר ג נ ט זה
ממיס את הקרום החיצוני של התא אבל אינו משמיע על קרום הגרעין .כך נחן להפריד בין המקטע
הגרעיני לבין המקטע הציטופלםמטי .כאשר הדבר נעשה בזמנים שונים לאחר תחילת ההדגרה של התאים עם
פולי )אורניתין ,לאוצין( מסומן נתן להראות אח חדירה.הפפטיד להא.
ציור מסי 19מראה אח אחוז הפטטיד הבסיסי המסומן שנמצא במקטע הציטופלסמטי בתאים שונים
בזמנים שונים לאחר חחילח ההדגרה .מתוך הציור נראה כי בחאים שהוחמרו .ע״י הנגיף SV 40רוב
פפטיד )
לאחר
4 5 5 $שעוח ו 73$-לאחר 24שעות בתאי ( 40SVנמצא במקטע הציטופלסמטי־ בחאים
-
63
-
ציור מם" :18שטיפת פולי )אורניחין,לאוצין( כ>
14
מתאים 3T3 SV40ע״י הוספת
כמות אקוימולרית של פולי חומצה
גלוטמית
י
זמנים שון^ם לאחר הדגרה עט פולי )אורניחין,
לאוצין( ) Cראה ציור פסי (17הורדו
התאים ,נשטפו וטופלו בתמיסת בופר שהכילה
20מיקרוגדס למייל פולי חומצה גלוטמית
למשך 20דקות .לאחר טפול זה נשטפ! החאים
ונמנחה כמות הרדיואקטיביות הםפוחה.
)Time after POL addition (hours
-
64
-
,
ציור מם :19הכמות היחסית של פ ו ל י ) א ו ר נ י ת י ן ,
14
לאוצין( Cשנמצאה במקטע
הציטופלםמטי של תאים שונים
100
80
60
s
החאים הודגרו בנוכחות פולי )אורניתין,
כמחואר בציור מם' .17לאחר שטיפוח
לאוצין(
בבופר טופלו במשך 10דקות בחמיסח 0.1$של
P-40, Nonidatהופרדו המקטעים
הדטרגנט
הציטופלסמטיים והגרעיניים ונמנתח פעילוח
רדיואקטיבית בשני המקטעים.
u
40
o
a
S
o
20
o
L
24
)((hour
12
1 4
8
J
24
Time of incubotion with P O L - C
)
־ 65
-
נורמלים או תאים שהותמדו ע״י נגיף הפוליאומה נמצאת במקטע הציטופלסמטי כמות קטנה בהרבה
)-20$ב לאחר 4שעוח ו 15$-לאחר 24שעות בתאי .( 3T3
כאשר נבדקה הרדיואקטיביות הסגולית ) (cpm/mg proteinשל פולי )אורניתין ,לאוצין(
במקטע הציטופלסמטי של התאים נמצא כי בתאי SV 40היא גבוהה פי 5מזו שבתאים הנורמלים ופי
3מזו שבתאים שהותמרו ע״י נגיף הפוליאומה) .ראה טבלה מסי* (11־ תוצאות אלה מראות על רכוז
של הפפטיד הבסיסי המסומן במקטע הציטופלסמטי של התאים המותמרים בנגיף . SV 40בתאים אחרים
חודר רוב הפפטיד לתוך המקטע הגרעיני של התא ומיעוטו נמצא בציטופלסמה־
,
רדיואקמיביות סגולית של פולי )אורניתין ,לאיצין( במקטעים הצימופלסמטיים
טבלה מם : 11
של תאים שונים לאחר 24שעות מפיחה
תאים
ספ י חח
התא השלם
)(cpm
ספיחת המקטע
הציסופלסמטי
)(cpm
תלבון בתא
השלם )מ״ג(
תלבון במקטע
הציטופלםמטי
)מ״ג(
רדי ואקטיביות
סגולית במקטע
הציטופלסמטי
!;prn/mg protein
3T3
4720
708
0.87
0.68
1050
3T3SV40
4940
3956
1.03
0.71
5600
3T3 PV
5320
1600
1 .2
0.89
1790
יש לציין כי כדי למנע שגיאות של מעבר סמון ממקטע למקטע בזמן ההפרדה הדטרגנטיח נבדקה
כמות הרדיואקטיביות העוברת ממקטע למקטע מאשר מערבבים מקטע גרעינים מסומן עם מקטע ציטופלסמטי
לא מסומן ולהפך )
.,{ reconstruction experimentנמצא כי כמות הרדיואקטיביות הנודדת ממקטע
למקטע היא אפסית )פתות מ (3$-ואין לה כל השפעה על התוצאות שתוארו לעיל.
66 -
-
קליטת 0ידז מסומן לתאים
י ו נ י ס י ד ן במערכת ה ה ח ל כ ד ו ח ה ס ג ו ל י ת של ת א י ם שהיתמרו ב נ ג י ף SV 40ה כ ר ח י ת
נוכחות
ל ק י ו ם ת ה ל י ך ה ה ת ל כ ד ו ת ה נ ג ר ם בהשפעח פ ו ל י
)אורניחין ,לאוצין(.
על ס פ י ח ח ה פ פ ט י ד ל ח א י ם ו נ מ צ א כ י ה ס פ י ח ה ב נ ו כ ח ו ת
קליטת
מסומן )
י ו נ י ס י ד ן לא משפיעים
ו ב ח ו ס ר .י ו נ י סידן דומה - .ל כ ן ,
נבדקה
י ו נ י ה ס י ד ן ל ח א י ם ש ו נ י ם כ ד י לברר האם ק ל י ט ח ה ס י ד ן ד ו מ ה ב ס ו ג י החאים ה ש ו נ י ם .ק ל י ט ה
5
*Ca׳ ( ע ל י ד י ת א י ם ש ו נ י ם מעכבר נראה ב צ י ו ר .מ ם ׳
א ו ג ד • 2 0ש ו נ י ם
וע״י תאי
ב צ י ו ר מ ס י .21מ ת ו ך צ י ו ר י ם א ל ה נ ר א ה כ י ק ל י ט ה ה ס י ד ן ה מ ס ו מ ן ע ״ י ת א י ם שהוחמרו ע ״ י
נ ג י ף SV 40ה י א א י ט י ת ב י ו ת ר מ ב י ן כ ל י ת ר ה ח א י ם ש נ ב ד ק ו . .חאים מעכבר ש ה ו ח מ ר ו ע ״ י נ ג י ף SV 40
טנה פ י
)
פיברובלסטיס
עובריים -
מ כ מ ו ח ה נ ק ל ט ת ע ״ י ת א י ם נ ו ר מ ל י ם 3T32-3א ו
(mouse secondariesא ו ע ״ י ח א י ם שהוחמרו ב נ ג י ף ה פ ו ל י א ו מ ה .מצב
ד ו מ ה ק י י ם ג ם בהאי א ו ג ר ח א י א ו ג ר שהוחמרו ע ״ י נ ג י ף SV 40ק ו ל ט י ם ס י ד ן ב כ מ ו ח ה ק ט נ ה פ י 2
ל פ ח ו ת מתאי א ו ג ר ע ו ב ר י י ם א ו ׳מתאי א ו ג ר ש ה ו ח מ ר ו ע׳יי ה ק ר צ י נ ו ג ן © ^ .ג . 0
ה ק ל י ט ה ה נ מ ו כ ה של ס י ד ן מ ה ס ב י ב ה ע ״ י ח א י ם שהוחמרו ב נ ג י ף SV 40
דרושים בחהליך ההתלכדות הנגרם ע ״ י פ ו ל י
) א ו ר נ י ת י ן ,ל א ו צ י ן ( מראה ע ל קשר ב י ן שתי ה ח ו פ ע ו ח
נ ב ד ק ה ,ל כ ן ,ק ל י ט ה ס י ד ן ע ״ י ח א י ם שהותמרו ב נ ג י ף SV 40בהשפעת פ ו ל י
א י 40
24T3הודגרו
במשך
המכיל
3SV
והעובדה ש י ו נ י סידן
שעות ב ר כ ו ז י ם ש ו נ י ם של פ ו ל י
)אורניתין ,לאוצין(.
) א ו ר נ י ת י ן ,ל א ו צ י ן ( במצע ג ד ו ל
נ ס י ו ב .ב ז מ נ י ם ש ו נ י ם לאחר ת ח י ל ה ה ה ד ג ר ה ה ו צ א ו ה ת א י ם ו נ מ ד ד ה ק ל י ט ת ה ס י ד ן ה מ ס ו מ ן ע ל י ד ם .
צ י ו ר מ ם ' 22מראה אח ע ק ו מ ה ה ק ל י ט ה של ה ס י ד ן ה מ ס ו מ ן ע ״ י החאים ב ז מ נ י ם ש ו נ י ם לאחר ה ד ג ר ה עם
פולי
) א ו ר נ י ת י ן ,ל א ו צ י ן ( .ק ל י ט ח ה ס י ד ן ב ח א י ם ש ה ו ד ג ר ו ז מ ן קצר עם ה פ פ ט י ד ה ב ס י ס י )עד שעתיים(
ד ו מ ה ל ק ל י ט ת ה ס י ד ן ב ת א י הבקרת ש ה ו ד ג ר ו ל ל א ה פ פ ט י ד .לאחר 4שעות ה ד ג ר ה ישנה ע ל י ה של כ70?5-
ב ק ל י ט ת ה ס י ד ן ע ״ י ת א י ם מ ט ו פ ל י ם ב 20-מ י ק ר ו ג ר ם למייל פ ו ל י
) א ו ר נ י ת י ן ,ל א ו צ י ן ( .עליה דומה
נמצאה ג ם ב ת א י ם ש ה ו ד ג ר ו ז מ נ י ם א ר ו כ י ם י ו ת ר ב נ ו כ ח ו ת ה פ פ ט י ד .ל פ י מ מ צ א י ו של( B o r l e(160
נ ח ן ל ה ו ר י ד אח ר ו ב ה ס י ד ן ה מ ס ו מ ן ה נ ס פ ח ל ת א י כ ל י ה לאחר ה ד ג ר ה קצרה ) 10ד ק ו ת ( ב ת מ י ס ה ה מ כ י ל ה
ת ע ר ו ב ת של ט ר י פ ס י ן
ו ו ר ס ן .לאחר ט פ ו ל ז ה נשארים ת א י ם " ע ר ו מ י ם " ה מ כ י ל י ם ר ק כ מ ו ת ק ט נ ה מ ה ם י ד ן
המסומן שנספח לתאים.
נ ס י ו נ ו ת ד ו מ י ם שנעשו ב ש ו ר ו ת ת א י ם נ ו ר מ ל י ם ו מ ו ת מ ר י ם לאחר ס פ י ג ת ס י ד ן
3T3SV 40 . PV
40כ מ ו למשל
T3SV
SV3
א ו 40HamSV
67
—rר
• I
1
Ham N
I
1
1
2ו
/HamDNNA
3T3
10
־
o
a.
Horn PV
/
/
/
^''''"""׳^-
Ham SV40
•.
3T3SV40
6
' /
.
6
3T3SV401PV
_J
60
ו.
40
1
60
ו 20י • 10
5
1
40
... .
20
10
)Time of Ireotment (min
Time 0( treatment (mini
45
צ י ו ר מ ס ׳ :20קליטת Ca
I
I
1
S
^45
על תאי עכבר
45
חאיס נרחצו ו ה ו ד ג ר ו בנוכחות CaCl
במשך 60דקות ב CMF -לאחר ההדגרה
נרחצו התאים ו נ מ נ ו ל פ ע י ל ו ת ר ד י ו א ק ט י ב י ת .
2
,
צ י ו ר מ ס :21קליטת ca
ראה צ י ו ר מם׳ .20
ע״י תאי א ו ג ר
68
-
-
c
'5
o
k.
a
־ o> 2000
e
£
a.
o
)a
-x
o
S.
1000
3
to
O
o
24
10
20
12 4
)Time of incubation with POL (hours
ציור מסי
45
) קליטת סידן
! 2
2
a
C
( 3ע״י תאי 40V3 8Tלאחר טפול
מוקדת בפולי ) א ו ר נ י ת י ן .לאוציז(
התאים סופלו ב 20-מיקדוגרם למייל פולי )אורניחין ,לאוצין( בתנאי יצירת
התלכדות בזמנים שונים לאתר הטפול נבדקו התאים לכשר קליטת הסידן לפי סעיף 15
בפרק חפרים ושיטות.
69 -
-
נחן להוריד מעל 90$מהסידן הנספח ע״י מפול קצר זה .רק 8$מהסידן המסומן הספות נשאר בתאי
40HamSVובחאי .. 3T3SV40בסוגיתאים אחרים נשמר חלק רב יוחר של סידן מסומן סמוח
ו
יפסין
ר
ס
ן
$
5
4
ת
א
י עכבר
וחולדה נורמלים שומרים כ 30$-ותאי אוגר נורמלים כ 40$-מהםידן המסומן .בתאים שהוחמרו ע״י
P V * Ham PV, Ham
מהםידן שנספח לאחר טפול -20$נשאר
כ
.
מנסיונות אלה נראה כי תאים שהוחמרו בנגיף SV 40שונים.מסוגי חאים אחרים לא רק
במהירוח ספיגה הסידן -שהיא נמוכה יוחר בהם אלא חלוקח הסידן הנספג בחוך ההא שונה בתאים
בחאים אלה .בתאים שהוחמרו בנגיף SV40דוב הסידן נמצא בחלק החיצוני של החא ונחן להורדה
בקלוח ע״י טפול אנזימטי קצר.
-
ד
י
י
70
־
ן
פעולתם של פוליפפטידים בסיסיים על קרומי התאים היא דטרגנטיח ביסודה .הפפטיד הבסיסי
נספח לקרום התא המכיל מטענים חשמליים שליליים רבים .ספיחת הפפטיד הנושא מספר רב של מטענים
חיוביים לקרום הנושא מטענים שליליים גורמת כנראה להיווצרוח כוחוח משיכה אלקטרוסטםיים
חזקים המביאים לקריעת הקרום ולהרס התא .הבסיס לפעולה הדטרגנטית של הפפטידים הבסיסיים
היא בנוכחות קבוצות הידרופיליות והידרופוביות על אותה מולקולה־ קרום התא ,הבנוי ממערכח
של ליפידים וחלבונים מכיל פזה מימיה ופזה ליפידית הממיסות את חלקי הפפטיד המתאימים .תגובה
זו גורמת להיווצרות מתח בקרום הגורם להרס הקרום ולתמותת התא־
פעילותם הטוקסית של פוליפפטידים בסיסיים נחקרה בעבר־ החוקרים הראו פעילות ציטוטוקםית
של פולי )אורניתין ,לאוצין( בחיידקים כמו ( S t a p h , aureus(127וטרי-אורניתין בE . coli B -
) (162ובתאים אנימליים שונים למשל השפעת פוליפפטידים בסיסיים שונים כמו פולי ליזין ופולי
אורניתין על תאי סרקומה
.(163) 180-
תופעה דומה נמצאה גם בעבודה זו .תמותת התאים כתוצאה מהמסתם נגרמה זמן קצר )מספר שעות(
לאחר הוספת הפפסיד ,מידת הדס החאיס נמצאה ביחס ישר למשקל המולקולרי של הפפטיד .גם הופעות
אחרות הנגרמות ע״י פפטידים בסיסיים כמו הגדלת חדירות חלבונים מסומנים לתאים
צמות תאי דם אדומים ע״י פולי ליזין
) (164וחהליך
) (165נמצאו תלויות במשקלו המו לק ו לד י של הפפטיד.
הרעילות הגבוהה יותר של פילי-ס-ליזין ופולי- L -אורניתין לעומת פולי-L-ליזין
במשקל מולקולרי דומה נגרמה כנראה בגלל יציבותם של פפטידים אלה לפעולתם של האנזימים
הפרוטיאוליטים הנמצאים בנסיוב שהוא מרכיב חיוני של מצע הגדול .גם חוקרים אחרים מצאו כי
הומופוליפפטידים של - Lליזין מחפרקים בקלות רבה בטריפסין ובאנזימים פרוטיאוליטים אחרים
) (110ואילו הומופוליפפטידים של ס-ליזין
) (166ו - L -אורניחין
) (108לא נעכלים ע״י
טריפסין .לאחר הרם מועט של תאים ע״י פעולת פפטיד בסיסי מסוגלים התאים שנשארו להמשיך ולהתחלק
ו
בקצב רגיל .כאשר נהרסים מעל 90$מאוכלוסיח החאים מסוגלים החאים המיתמרים שנשארו להמשיך
ולהחחלק ואילו התאים הנורמלים לא מתחלקים .נחן ליחס תגפעה זי לבשרם של החאים המותמרים
להחחלק בתנאים קשים.,במהולים גבוהים וליעילות גדול מושבות גדול יוחר־
הקו-פולימריים,למשל.פולי )אורניחין ,לאוצין( ,רעילים במדה פחוחה הרבה יוחר
מההומופולימרים הבסיסיים .נוכחות חומצה אמינית ליפופילית במבנה הפפטיד עוזרח לפפםיד להחמוסם
בחלקים הליפופיליים של קרוס התא .כאשר מדגירים תאים נורמלים או מותמרים בנוכחות
פולי )אורניתין ,לאוצין( ברכוזים של עד 30מיקרוגרם למייל בנוכתות 10$נסיוב במצע הגדול,
אין לפפטיד זה כל:השפעה רעילה )כפי שנראה מעקומת הגדול וכן מיעילוח יצירח המושבות ע״י
התאים המהווה מבחן מצויין לכשר חיות של התאים( .כאשר מטפלים בתאים ברכוזים 50ו 100-מיקרוגרם
למייל של פולי )אורניחין ,לאוצין( ישנו הרג רב של חאים וירידה חדה ביעילות יצירת המושבות ע״י
התאים הנשארים כנראה בגלל םפיחה חזקה של הפפטיד לחאים והשפעה מאוחרח יותר.
בשנים האחרונוח קיימח מחלוקח בין חוקרי קדום החאים לגבי ההבדלים במטען החשמלי על פני
חאים נורמלים וסרטניים ) (62רוב המימצאים שנתקבלו מתבססים על מחקרים במבנה הכימי של הקרום
) (62או בנדידה אלקטרופודטית של תאים שונים ) .(70בשחי שיטוח מחקר אלה נחקבל פזור רב
בתוצאות שהביא .לויכוח בין החוקרים לגבי קיומו של הבדל במטען החשמלי על פני התאים הנורמלים
והםרטניים .הממצאים המובאים בעבודה זו מראים על הרג דומה של תאים נורמליםיומותמרים ע״י
פפטידים בסיסיים,מורים כי ההבדלים במטען החשמלי על פני החאים הנורמלים והמוחמרים אינם גדולים
הראנו כי התאים הנורמליים והמותמרים סופחים כמות דומה של פולי )אורניחין ,לאוצין( -ראה
ציורים 16 ,15ו— .17הרג החאים מחקבל ע״י טפיחה אלקםרוסטטית בין הפפטיד הבסיסי והקדום החיצונ
של התא .ממצאים דומים נחקבלו גס ע״י חוקרים שבדקו עכוב התפתחות עובריה של עובר עוף ע״י
ל האי אוגר נורמליים
(
13C/21)167
ומוחמרים ע״י נגיף הפוליאומה ע״י
םפרמידין ) .(168מולקולוח אלה הן בעלוח מטען חשמלי בסיסי ומנגנון פעולחם דומה למנגנון
פעולת הפפטידים הסינתתיים הבסיסיים ) .(105הפעילות הטוקסית של הפפטידים הבסיסיים היחה
אופיינית לפפטידים בעלי מטען חשמלי חיובי ולא נתקבלה בפעולת פפטידים חומציים כמו פולי
חומצה גלוממיח ופולי חומצה אספרטיח .גם חופעוח אחרות הנגרמות ע״י פפטידים בסיסיים כגון
הגברת פגוציטוזיס בלאוקוציטים מתקבלים באופן בלעדי ע״י פפטידים בסיסיים בלבד ולא ע״י
פפטידים חומציים ).(110
מחוך שורח הפוליפפטידים הבסיסיים נבחר לעבודה פולי )אורניתין ,לאוצין( בגלל חכונוחיו
המיוחדות .פוליפפטיד זה אינו מתפרק ע״י האנזימים הפרוטיאוליטיים במצע הגדול המכיל נסיוב
ונתן להוסיפו לחרביח חאיס בדכוזים גבוהים יחסית בלי לקבל הרג של תאים .כאשר מטפלים ברכוזים
גבוהים ) 250מיקרוגרם למייל במצע גדול המכיל 10$נסיוב( נתן להשתמש בפוליפפטיד זה כדי
לבודד תאים יציבים לפעולת ההרג של החומר ) .(169בעבודה זו נמצא כי ברכוזים נמוכים מאד
72 -
-
) 2מיקרוגרם למייל( גודם הפפטיד לצמות מהיר של חאיס רחוצים מכל סוגי התאים שנבדקו ולא
נמצא הבדל בין תאים נורמלים ומותמרים .הצמות הצהיר נגרם ע״י ספיתת הפפטיד לקרום התאים.
כן נמצא כי סוגים שונים של תאים נורמלים וסרסניים סומתים כמות שווה של פוליפפטיד מסומן.
הצמות המהיר של תאים הנגרם ע״י פולי )אורניחין ,לאוצין( נתן לעכוב ע״י גורמים המתחרים
עם המטענים החשמליים השליליים על פני התאים ומתקשרים ביתר מהירות עם הפפטיד הבסיסי.
צמות מהיר של סוגי תאים אחרים כמו למשל תאי דם אדומים נתקבל ע״י פוליפפטידיס אחרים
כמו פוליליזינים שונים ) .(110הצמוח המהיר הנגרם ע״י פפטידים בסיסיים אינו דומה לזה
הנגרם לתאים מוחמרים ע״י ׳לקטינים׳ ) (83 ,82כמו קונקנבלין ) (89-87לקטין מזרעי סויה )(91-90
או מנבטי חיטה ) .(86-84במקרה של צמות מהיר ע״י לקטינים הוכח כי הצמוח נגרם לאחר קשירה של
הלקטין לאחר םוכרי על גבי הקרום החיצוני של ההא .במקרה של פולי )אורניתין ,לאוצין( נראה
כי הקשירה היא אלקטרוסטטיח בלבד בין מטענים מנוגדים ולא לאחר אופייני.
תופעה מענינת ביותר שנתגלתה לאחר הדגרה של חאים במצע גדול המכיל 10$נסיוב ובנוכחוח
פולי )אורניחין ,לאוצין ( ,ה י ח ה ההתלכדוח הםגוליח המופיעה בתאים מותמרים בנגיפי
40SV
ואדנו מסי .12נראה כי הנגיפים משנים אח חלוף החומרים של התאים ומאפשרוח להם לעבור התלכדות
סגולית בהשפעת פילי )אירניחין ,לאוצין( .הנגיף המסרטן החודר לתא גורם לשינויים רבים בקרום
החיצוני ,בציטופלסמה ובגרעין )ראה הקדמה( .פולי )אודניחין ,לאוצין( נמצא כבוחן.טוב לשינויים
הנגרמים בתאים שהוחמרו ע״י הנגיפים הנ״ל .בעזרת הדגרח החאים בנוכחות הפפטיד נחן לזהות
תאים מסויימים באיליסיה מעורבת.
פילי )אירניחין ,לאוצין( אינו הפטטיד היחיד הגורם להתלכדות סגולית של תאים .גם
פוליפפמידים אחרים הדומים במבנם הכימי לטטטיד זה והמכיליס חימצה אמינית בעלח מטען חשמלי
חיובי.וחומצה אמינית ליפופילית מחקים את השפעח פולי )אורניחין ,לאוצין( כמו פולי )ארגינין,
לאוצין( ופולי )אירניתין ,ילין( .כדי לקבל התלכדות סגולית של תאים אין צורך בסדור מיוחד
של חימציח אמיניית -גם מוליפפטיד מסודר פולי )לאוצין-אורניתין-לאוצין( וגם פוליפפטיד
אקראי מביאים להתלכדית סגוליח .נראה כי הצרוף בין החומצה האמיניח הבסיסיח והליפיפיליח היא
החשוב לגבי תהליך ההחלכדוח הסגוליח.
-
0
2
4
73
-
וגם תאים שהוחמרו ע״י נגיף אדנו מסי
1
עוברים התלכדות סגולית נתנת להסביר ע״י שתי אפשרו יוח:
א.
נ ג י פ י אדנו מסי 12משנים את תכונות התאים ביימן ההתמדה בדומה לנגיף SV 40לגבי
כושר התגובה לפילי )אורניתין ,לאוצין( ולכן גם תאי• אלה עוברי• התלכדות מגולית־
ב .התאים שהוחמרו עי" י נגיף אדנו מם' 12
הוחמרו ע"׳־ נגיף כלאיים המכיל גם את החומר
התורשתי של נגיף S V 4 0או חלק ממנו .נגיף 40SVידוע כנגיף עוזר לנגיפים שונים
ממשפחת־נגיפי האדנו ).(170
כדי לברר איזו משתי האפשרויות היא הנכונה יש לחלץ אח הנגיף אדנו מסי 12מהחאים
שהוחמרו על ידו ולהשוות.את חומצת הגרעין של הנגיף שחולץ לחומצה הגרעים של נגיף SV 40
ל
א נ ת
גלים לגדול
ן עייין לבצע חילוץ של נגיפי אדנו מסי 12מתאים מותמרים .תאי אוגר המותמרים בנגיף
ב
ט
מ
פ
2
1
' גבוהה של
C^41
בדומה לתאים שהותמרו ע״י נגיף
40SV
) (24זוהי תכונה נוספת משותפת לתאים אלה בדומה להתלכדות סגולית.
התלכדות סגולית בהשפעת פולי )אורניתין ,לאוצין( מופיעה לא רק בשורות תאים שהוחמרו
התמרה קבועה ע״י נגיפי . 40SVואדנו מם '12אלא גם בתאים נורמליים שהותמרו התמרת סרק
בנגיף . 40SVתאים נורמלים שהוחמרו התמרת סרק ע״י נגיפים ) (
32מראים תכונות חדשות
אופייניות לנגיף המדביק.כמו הופעת אנטיגן גרעיני )טומור אנטיגן( ) (47הגברת סנתיזה של
DNA
תאי ) .(39 ,38כן מופיעות תכונות חדשות בקרומי התאים בזמן התמרת סרק .תאים נורמלים
שהותמרו התמרת סרק בנגיפים ,עוברים תהליך הצמתה ע״י לקטינים כמו קונקנבלין ) (89או
אגלוטינין מנבטי חיטה ) .(62לשם רכישת התכונה לעבור; הצמתה ,על התאים לעבור מספר חלוקות
) (89או סנתיזה של ,. ( D N A(171בזמן החמרה סרק רק אחוז קטן מאד מהתאים עובר התמרה )כ,(2$-
אתוז התאים בהם מופיע טומור אנטיגן קטן יחסית )כ ,(30$-אך כל התאים עוברים צמות בנוכחות
לקטינים .כאשר תאים ,שרכשו את תכונח הצמוח ע״י לקטינים ממשיכים להחחלק ללא נוכחות נגיף,
הם מאבדים את תכונת הצמות ) .(89תוצאות דומות נתקבלו גם בעבודתנו בתאים נורמלים שהודבקו־
בנגיף . SV 40תאים אלה שאינם עוברים חהליך התלכדות סגולית בהשפעת פילי )אורניתין ,לאוצין(,
רוכשים תכונה זאת לאחר הדבקה בנגיף SV 40במדה ומאפשרים להם לעבור לפחות 2-3חלוקות .תאים .
נורמלים המודבקים בנגיף ואינם מתחלקים לא מראים התלכדות סגולית בהשפעת פילי )אורניתין,לאוצין(־
-
74
-
כאשר מאפשרים לתאים שרכשו את תכונת ההתלכדות הסגולית בהתמדת סרק להמשיך ולהתחלק ללא
נוכתות של נגיף הם מאבדים שוב את התכונה להחלכד .חוצאוח נסויים אלה חומכים בהנחה כי
הנגיף SV 40הוא המעניק לתאים המותמרים על ידו את האפשרות לעבור התלכדות סגולית ע״י
פולי )אורניתין ,לאוצין( .ידועות תכונות נוספות המוענקות.לתאים ע״י הנגיף כמו הצמתה
בלקטינים ) ,(91-86הופעת טומור-אנטיגן
) (47והופעת אנטיגן השתלה ).(65-63
מן האמור לעיל נראה כי יכולתו של פולי )אורניתין ,לאוצין( לגרום להתלכדות סגולית
של תאים שהוחמרו בנגיף SV 40יכולה לשמש כמבחן לזהוי תאים אלה .כדי לברר אפשרות זו נבדקה
התלכדות של אוכלוסיוח מעורבות של חאים .באוכלוסיות אלה נמצאו תאים שהותמרו ע״י נגיף SV40
וגם תאים אחרים .נמצא כי גם באוכלוסיה מעורבת של תאים ,מתלכדים התאים שהותמרו בנגיף SV 40
בהשפעת הפפטיד ,ואילו תאים אחרים אינם מחלכדים .כדי לקבל.התלכדות חייבים התאים שהוחמרו
ע״י נגיף SV 40לחווח לפחוח מחצית.מאוכלוסית התאים .בזמן הפעלת פולי )אורניתין ,לאוצין(
על אוכלוסיה מעורבת של מושבות תאים ,נתן לזהות כל מושבה הבנויה מתאים שהוחמרו בנגיף SV 40
ע״י כושרה לעבור תהליך התלכדות .שיטה זו יכולה לשמש ,לכן ,כאמצעי לזהוי תאים מסויימים
בתרבית .השיטות הקיימות כיום כגון קביעת אנטיגן טומור
) ,(47אנטיגן השתלה ) .(65-63או
קביעת נוכחות m-RNAאופייני לנגיף ) (35-33מחייבות קביעת התאים לפני הבדיקה ולכן לא נתן
להמשיך ולגדלם .בשיטת ההתלכדות הסגולית בהשפעת פולי )אורניחין ,לאוצין( נמצא ,כי התאים
בתלכידים חיוניים במדה שווה לתאים לא מטופלים ולכן ,נתן להמשיך ולגדלם לאחר.מבחן ההתלכדות.
מתוך הנסויים בםפיתת פולי )אורניתין ,לאוצין( מסומן לתאים נמצא כי אין אפשרות להסביר
את ההתלכדות הסגולית של תאים שהותמרו בנגיף SV 40ע״י ספיחה סגולית של הפפםיד .כל התאים
שנבדקו םופחים כמות דומה של פפטיד מסומן .כאשר מבצעים את נסויי הספיחה בתאים רחוצים ,בתנאי
צמות ,וכן ,בתאים גדלים בתנאי התלכדות כמוה הפפטיד הנספחת לסוגים שונים של תאים דומה.
כמו כן נמצא כי הפפטיד אינו נםפת לאתרי קשירה מיוחדים על פני התאים .נםיונות להוריד פפטיד
םפוח ע״י סוכרים או חומצות אמיניות שונות לא הצליח .הממצא על מפיחה דומה של פפטיד.לסוגי
תאים שונים מתאים לכן לממצא הקודם על דמיון בפעולה הציטוטוקסיח של פולי )אורניחין ,לאוצין(
על סוגי חאים שונים .מן,הראוי לציין כי בספיחת פפטיד מסומן'במערכת של תאים רחוצים
)ציורים 15ו— (16לא נחן להגיע למצב של רוויון בספיחח הפפטיד הספוח כפי שנתן במערכה של
־ 75
-
תאים גדלים )ציור .(17הסיבה לכך נעוצה בפעילות הטוקסית של הפפטיד ברכוזים גבוהים
המתבטאים במיוחד במערכת של תאים רתוצים ,ובהעדר של םפיתה לאתר קישור ספציפי.
הגורם הטוב ביותר שנמצא בעבודה זו להורדת פפסיד מסומן לאחר ספיחתו לחאים הן פולי
חומצוח אמיניוח חומציות .הוספח פולי חומצה גלוםמית לתאים שהודגרו בנוכחות פולי )אורניתין ,
לאוצין( מסומן מאפשרת להוריד את רוב הפפטיד הםפוח רק אם הוספת הפולימר החומצי נעשחה בשעוח
הראשונוח לאחד הוספת הפולימר הבסיסי .תוצאות אלה מאשרות תוצאות דומות שנתקבלו כאשר עוכב
תהליך ההתלכדות הסגולית ע״י הוספה פולי חומצה גלוטמיח זמן קצר לאחר הוספת הפפטיד הבסיסי.
מתוך נטויים אלה נראה כי הוספח פולי חומצה גלוטמיח בשלבים מאוחדים ) 6שעות ומעלה( לאחר
הוספת פולי )אורניתין ,לאוצין( אינה מעכבת אח תהליך ההתלכדות הסגולית ואינה מאפשרת הורדח
פפטיד מסומן ספוח .תוצאות אלה יכולוח להורוח על ספיגת פולי )אורניתין ,לאוצין( לתוך התא.
לאחר חדירתו לתוך החא ,חדל הפפטיד הבסיסי להיות זמין למולקולות הפפטיד החומצי ואין אפשרוח
להורידו מהחאים.
..
נםיונות בהם נבדקה מציאות פולי )אורניתין ,לאוצין( מסומן בגרעיני התאים מאשרים
הנחה זו .נמצא כי חלק מהפפטיד המסומן נמצא בגרעיני התאים .נוסף על כך נמצא כי בתאים שהותמרו
ע״י הנגיף SV 40רוב הפפטיד הםפוח נשאר בחלק הציטופלסמטי של התא ואילו בתאים נורמלים או
תאים שהוחמרו ע״י גורמים אחרים למשל נגיף הפוליאומה נמצא רוב הפפטיד הספוח בגרעיני התאים.
היהודיות של תאים שהוחמרו בנגיף SV 40לגבי חלוקת הפפטיד הבסיסי בתוך התא יכולה להצביע
על כושרו של הפפטיד לגרום להתלכדות הסגולית של תאים אלה.
מתוך בדיקת החנאים הדרושים ליצירת ההחלכדוח הסגולית נראה ,כי תהליך ההתלכדות הוא
תהליך מטבולי התלוי בגורמים שונים כגון טמפרטורה וספיגת הפפטיד לתוך התאים .האטת התהליך
בטמפרטורה נמוכה ויכלחן של פולי חומצות אמיניוח .חומציוח לעכב את התהליך רק בשלבים ראשונים
של ההדגרה ,מורים על כך שההליך ההחלכדוח אינו רק הוצאה של םפיחה אלקטרוסטטית בין הפפטיד והתא
אלא מלווה בתהליכים מטובוליים שונים .פולי )אורניתין^ לאוצין( אינו גורם לשינויים מהותיים
במטובוליזם תומצות הגרעין או החלבונים בתא ולכן נבדקו שינויים אפשריים הנגרמים ע״י הפפטיד
בחלקים החיצוניים של התא ובעיקר בקרום התא .נמצא כי.טפול בתאים שונים בפולי )אורניתין,
לאוצין( מגדיל את כושרם של חאים אלה לספוח את הלקטין קונקנבלין . Aהספיחה המוגבח של לקטין
זה לאחר טפול בפולי )אורניתין ,לאוצין( .נובעת גם בגלל הגדלה כספיתה בלתי ספציפית של
76 -
-
קונקנבלין )כנראה הגברת הטפיחה הפגוציטוטית של הלקמין( אבל בעקר ע״י הגדלת םפיתת קונקנבלין
הרגישה לסוכר .ממצא זה מראה על שינויים קונפורמטיביים החלים בקרום התא והגדלת מספר אתרי
הקשירה הםוכריים של קונקנבלין • A
יוני סידן הם בין הגורמים החשובים הנמצאים במצע הגדול המשפיעים על חהליך ההחלכדוח
הסגולית הנגרמת ע״י פולי )אורניחין ,לאוצין( .ברכוז נמוך של יוני סידן אין התלכדות סגולית
של תאים .רכוז יוני הסידן אינו משפיע על הצמות המהיר של התאים הנגרם ע״י פולי )אורניחין,
לאוצין( או על ספיחת פפטיד מסומן לתאים .תפקיד יוני הסידן הוא כנראה ביצירת תנאים המתאימים
בחא המאפשרים אח יצירח החלכידים .יוני הסידן ממלאים חפקיד חשוב בחייהם של חאים והם מרכיב
הכרחי של מצע הגדול .אחד
התפקידים החשובים של יוני הסידן הוא לאפשר הדבקות התאים זה לזה
ולפני השטח עליו הם מתרבים ) .(172כמו כן ,ממלאים יוני סידן תפקיד תשוב בחהליכים תאיים
הנגרמים לאחר הגבה עם מקרומולקולות שונות ,למשל זרוז מיטוזות בחימוציטים ע״י דטרגנטים,
אגמטין ופולי ליזין ) (173והתמדת לימפוציטים ע״י פיטוהמגלוטינין ) .(175,174כאשר מדגירים
תאים שהותמרו ע״י נגיף אדנו מם' 12בנוכחות רכוזים גבוהים של יוני סידן הם עוברים התלכדות.
ספונטנית ) .(176גם ההחלכדות הסגולית של תאים שהותמרו בנגיף SV 40בנוכחות פולי )אורניתין,
לאוצין( הוא תהליך התלוי ברכוז יוני הסידן במערכת .הפפטיד הבסיסי גורם לחדירות מוגברת של
יוני סידן לתוך תאים שהותמרו בנגיף . SV 40פפטידים בסיסיים ,כמו פולי ליזין ,מגבירים
חדירות תאים ליונים כמו נחרן )(116או סולפט ).(117פיטו המגלוטינין גורם להגברה חדירות סידן.
ללימפוציטים ) .(177בדיקה של חדירה סידן מסומן לחאים מראה )ציורים ,(21 ,20כי קליטח הסידן
היא איטית ביותר מבין כל יתר התאים שנבדקוהסידן הנקלט
.
לתאים שהותמרו ע״י נגיף SV40
מרוכז באיזור הקרום של התאים מאחר וניתן להורידו בקלות ע״י
טפול קצר,בתמיסת טריפםין-וורסן .מן האמור לעיל נראה כי קיים קשר הדוק בין חדירת פולי
)אורניתין ,לאוצין( לתוךהחאים שהוחמרו ע״י נגיף SV 40ובין חדירת יוני הסידן לתאים אלה.
בחאים שהוחמרו ע״י נגיף SV 40מחרכזים רוב הפפטיד הבסיסי ורוב יוני הסידן בחלק החיצוני של
התא ז״א במעטפת התא .רכוז זה הוא המאפשר כנראה לתאים אלה לעבור את ההתלכדות הסגולית בהשפעח
הפפטיד הבסיסי.
-
77
־
הממצאים הנסיוניים המובאים כאן מראים כי נתן להשתמש בפוליפפטידים םינחחיים ובעקר
בפוליפפטידים בסיסיים לחקר המבנה של קרומי תאים אנימליים .בעקר,לחקר הבדלים בין סוגים שונים
של תאים אנימלייס למשל ההבדלים בין תאים נורמלים ותאים סרטניים שונים .נתן להכנן ולסנתז
פוליפפטיד היוצר חגובה סגוליח ואופייניח עם סוג מסויים של חאים סרטניים ,ולחקור את המנגנונים
החאיים המביאים לחגובה זו .חכנון של פפטידים אחרים המורכבים מחומצוח אמיניוח אחרוח יחן
בידינו אמצעים לחקר סוגים אחרים של חאים נורמליים וםרטניים ולהעשרה ידיעוחינו בחקר התאים
הסרטנ י ים.
ס
כ
ו
ם
בעבודה זו נחקרה השפעתם של פפטידים בסיסיים על תאי יונקים הגדלים בתרבית רקמה,
נבדקה השפעתם של 2סוגים של פפטידים בסיסיים:
א.
הומופולימרים של חומצות אמיניות בסיסיות בגדלים מולקולריים שונים כמו פולי-ליזין,
פולי-אורניחין ופולי-ארגינין.
ב.
קופולימרים ש ל חומצות אמיניות בסיסיות עם חומצות אמיניות ליפופיליוח כמו פולי
)אורניחין ,לאוצין( ,פולי )אורניתין ,ולין( ופולי )ליזין ,אלנין(.
השפעת הפפטידים האלה נבדקה על שני סיגים עיקריים של תאים:
.1
תאים נורמליים ממקור ש ל אוגר ,חולדה ועכבר .כתאים נורמלים שמשו תאי תרבית ראשוניה
שורות תאים נורמליים כמו
.2
3T3
)ממוצא עכבר( או
ממוצא אוגר
)
תאים נורמליים שהוחמרו לממאירוח ע״י גורמים פיסיקליים למשל קרינת רנטגן ,גורמים
כימיים כמו די מתיל נטרוז אמין ) (DMNAא ו בנז-פירן
ונגיפי אדנו שונים
K
H
B
(
.
,
) ( B Pוגורמים נגיפים -
.
נפרט את הממצאים העיקריים שנתקבלו בעבודה.
א.
השפעת הומיפילימריס ש ל הימצות אמיניות בסיסיות.
השפעה הומופולימריס ש ל חומצות אמיניות בסיסיות נבדקה ברכוזים של
גדול שהרכבו ה י ה
ו10$-
5
חאים בנפח ש ל
0-100מיקרוגרם למייל
90$מצע גדול של איגל
נסיוב עגל .כל הפפטידים שנבדקו נמצאו רעילים לתאים .רעילוח זו נבעה מספיחה אלקטרוסטטי
של הפפטיד לתא והרם התא .הפפטידים שנבדקו היו בדרגת פולימריזציה שונה
DP360
=)30=DP
. (DP=140רעילות הפפטידים לתאים נמצאה ביחס ישר לכמות הפפטיד ולמשקלו המולקולרי בתהומי
המשקלים המולקולרים שנבדקו .פפטידים מורכבים מתומצוח אמיניוח מסדרת
לפחות מפפטידים המורכבים מחומצות אמיניות מסדרת
Dנמצאו רעילים פ י
10
. Lכן ,נמצאו הבדלים קטנים ברעילות הפפטיד
79 -
כלפי
נורמליים
תאים
הנורמליים
בב30$-
ב־
היתה גבוהה
מחומצה
ללא תמותת תאים.
0
המכיל
ב 1 2 -שעות
או
ע״י
4
לאוצין
רעילות
י ו ת ר של ה פ פ ט י ד ה י ו
מודגרים
ו מ ג י ע לשיאו
ליפופיליות
נ מ ו כ ה ב ה ר ב ה מ ז ו של
הומופולימר
ג ד ו ל ב כ מ ו ת של עד 40מ י ק ר ו ג ר ם
ר ע י ל ו ת במדה ש ו ו ה לתאים
24ש ע ו ת ל א ח ר
הנורמליים
ש ו ר ו ת של ת א י ם
ג ו ר מ י סרטן
אחרים כמו
או
פולי
אורניתין,
)אגרגציה(.
לאוצין(
נגיף
S V 40
ז ה .כ ל יתר ש ו ר ו ת התאים ש נ ב ד ק ו :תאי ע ו ב ר
ש ו ר ו ת של ת א י ם מ ו ת מ ר י ם ע"י
נגיף
במצע
ה ת ה ל י ך מ ת ח י ל לאחר
ה ו ס פ ת ה פ פ ט י ד .ר ק ש ו ר ו ת ת א י ם ש ע ב ר ו התמרה ע ״ י
12ע ו ב ר י ם את ת ה ל י ך ה ת ל כ ד ו ת
נגיף
בנוכחות
ע ו ב ר י ם ת ה ל י ך של ה ת ל כ ד ו ת
נורמליים,
ושל ר א ו ם ,
מיאלואידי
הפוליאומה,
אדנו
נגיפי
קרינת רנטגן,
מם' 3
ו,7-
כימיקלים
גורמי
נ ג י פ י ם ר ק ו מ ה של
ה פ פ י ל ו מ ה ע״ש ש ו פ
ו ש ו ר ו ת ש ו נ ו ת של ת א י ם ל א ו ק מ י י ם .מ מ ו צ א א ר י ת ר ו א י ד י ,
התלכדות
פפטיד
ל י מ פ ו א י ד י לא עברו
)אורניתין,
בנוכחות פולי
לאוצין(
גם ב ר כ ו ז י
.
.1
התנאים הדרושים להתלכדות תאים מוחמרים ע״י
תהליך
התהליך
כמויות
גדולות
נ ס י ו ב למשך 24ש ע ו ת
ונגיפים
מולוני
גבוהים
וחומצות
אמיניות
ל מ פ ל ב 10 -ת א י ם ב נ פ ח של מייל ת מ י ס ת
)
נ ג י ף א ד נ ו מם'
נורמליים,
סרטן
ה נ ו ר מ ל י י ם היתה ג ב ו ה ה
המותמרים שנבדקו.
S
גדול
אמיניות בסיסיות
של ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת א ו ד ״ נ י ח י ן
א מ י נ י ת בסיסית -נתן
ולתאים
הסרטן
כ ל פ י התאים המותמרים
ק ו -פ ו ל י מ ר י ם של ח ו מ צ ו ת
לקופולימר
V
יותר מזו
ר ע י ל ו ת ה פ פ ט י ד י ם )למשל פ ו ל י -־ - ! ,ל י ז י ן (
ותמותת התאים
כלפי התאים
מתמותת התאים ה מ ו ת מ ר י ם .
השפעת
פפטיד
ותאים מותמרים,
-
מתבצע גם
יותר
ה ה ת ל כ ד ו ת מתבצע במצע
גדול
ב ט מ פ ר ט ו ר ו ת של
^ C37ו ג ם ב -
ימים.
תאים שהותמרו
ונמשך
ב5-6-
ה ח ל ו ק ה שלהם ע ד י י ן
SV 40
בנוכחות פולי
ו ה נ ס י ו ב הנמצא.במצע הכרחי
24°
C
ב נ ג י ף SV 40
,
י
ל ק י ו מ ו של ה ת ה ל י ך .
ב ט מ פ ר ט ו ר ה של
והוקרנו
)אורניתין לאוצין(
C24°
ה ת ה ל י ך ממושך
ב ק ר נ י x -עד ל א ב ו ד כ ו ש ר
ץ ו ב ר י ם את ת ה ל י ך ה ה ת ל כ ד ו ת ב נ ו כ ח ו ת ה פ פ ט י ד .
-
.2
-
80
השפעת קופולימרים אחרים
קופולימרים אחרים של חומצות אמיניות בסיסיות וליפופיליות כמו למשל פולי
)אורניתין ,ולין( או פולי )ארגינין ,לאוצין( גרמו גם הם להתלכדות תאים מוחמרים
בנגיף . SV 40רכוזי קופולימרים אלה הדרושים לתהליך ההתלכדות היו גבוהים פי 5-6
מהרכוז של פולי )אורניתין ,לאוצין( .גס קופולימר מסודר של אורניתין ולאוצין גרם
להתלכדות תאים מותמרים ב . SV 40-קופולימר של ליזין ואלנין לא גרם להתלכדות של
תאים מותמרים או נורמליים.
3״ עכוב ההתלכדות של .תאים מותמרים ב SV 40-בהשפעת פולי )אורניתין ,לאוצין(
^
ן לעכב את תהליך ההתלכדות של תאים מותמרים
V
S
0
4
בהשפעת פולי
)
אורניתין,
לאוצין( ע״י הוםפח פולימרים של חומצוח אמיניוח חומציות כמו פולי-חומצה גלוטמית או
פולי-חומצה אםפרטית ,כאשר מוסיפים את הפולימר החומצי בכמויות אקוימולריות לקופולימר
הבסיסי עד 6שעות לאחר הוספת הפולימד הבסיסי תהליך ההתלכדות של התאים מעוכב כליל .לא
נמצא כל עכוב בהופעת התלכידים אם הפולימרים החומציים הוספו 6שעות או יותר לאחר הוספת
הקופולימר הבסיסי .לא נתן לעכב את הופעת ההתלכדות ע״י הוספת חומצות אמיניות שונות או
סוכרים שונים לתמיסת הגדול של התאים יתד עם פולי )אורניתין ,לאוצין(.
4 .ה ת ל כ ד ו ת תאים נורמליים בהשפעת פולי )אורניתין ,לאוצין( לאחר התמרה בנגיף
מליים ) ( 3T3בשני רכוזים:
x101
0
1
כ
ד
40SV
י לאפשר לתאים להתתלק) חאים לצלחת
תאים לצלחח )כדי לא לאפשר לחאים להחחלק( הודבקו בנגיף
^(100
•
(,
SV40יחידות
יוצרות מוקדים לחא( לאחר ההדבקה נבדקו התאים כל 24ש' להתלכדות בנוכתות הפפמיד .נמצא
t
שהתאים המודבקים שגדלו בתרבית לא .צפופה החלו להתלכד בהשפעת הפפטיד ארבעה ימים לאחר
ההדבקה בנגיף .תאים מודבקים בנגיף ללא אפשרוח חלוקה )חוסר חלוקה אינו מאפשר קיבוע המצב
המותמר( או תאים שהודבקו ע״י רסק תאים ללא נגיף לא עברו תהליך התלכדות בהשפעת הפפטיד
גם 7ימים לאחר חחילת הנסיון.
-
-
81
.5השפעת פולי )אורניחין .לאוצין( על יצירת חלבון ו-
DNAבתאים
נמצא שהפפטיד ברכוז 20מיקרוגרם למייל מעכב את סינתזת החלבון בכ 20$-לערך לאחר
24שעות הדגרה .הפוליפפטיד אינו משפיע במעט על סנתיזת
^ DNAבתאים שונים ,ברכוזים
שנבדקו.
.6
השפעת פולי )אורניחין .לאוצין( על טפיחת קונקנבלין לתאים י
אורניתין,
הדגרת תאים שהותמרו בנגיף 40SVבנוכחות 30מיקרוגרם פולי
ל א ו צ י ן ) (
למשך 4שעוח גורמה לעליה של פי 3בספיחת קונקנבלין בתאים אלה .עליה זו נגרמת בעיקר
כתוצאה מעליה בספיחה רגישה לסוכר
.7
.ם-מתיל-גלוקוז.
פולי )אורניתין ,לאוצין( כגורם צמות מהיר )אגלוטינציה( של תאים
כל שורוח החאים שנבדקו -חאים נורמליים ומותמרים עברו צמות .תהליך זה מהיר מאד
ונמשך מספר שניוח ,אינו מעוכב ע״י םוכרם או חומצוח אמינו ומעורב ע״י כמויות
אקוי-מולריוח של פולי חומצוח אמיניוח שליליות ,.נראה כי מכל התאים סופתים פולי )אורניחין,
לאוצין( והמיוחד בתאי 40
SVאינו בספיחה סגוליח של הפפטיד לעומת חאים אחרים.
. 8ס פ י ח ת פולי )אורניתין ,לאוצין( -
הוכן פפטיד רדיואקטיבי מסומן ב-
14
C
C
14
ע״י חאים
ע״י שמוש בחומצה אמיניח לאוצין-כ >.
14
נבדקה ספיחחו של הקופולימר המסומן ע״י סוגים שונים של תאים נורמלים ,מותמרים ע״י
הנגיף SV 40ומוחמרים ע״י גורמים אחרים .ספיחת הפפטיד נבדקה בתאים רחוצים ובחאים
גדלים בחוך מצע גדול .נמצא שכמוח הפפטיד הנספח לחאים שונים שווה ואין הבדל בםפיחת
הפפטיד בין אם הספיתה נעשתה בתאים רחוצים או בחאים גדלים במצע גדול בנוכחוח נסיוב.
.9
הורדת פפטיד רדיואקטיבי לאחר ספיחתו לתאים
לאחר שנמצא שכמוה הפפטיד הנספחת לתאים שונים שווה נעשה נסיון למצא אם תאים המותמריס
ב SV 40-סופחים פפטיד באתרים שונים מחאים נורמלים או מוחמרים ע״י גורמים אחרים .לכן
סופח פפטיד מסומן לחאים והתאים הודגרו למשך 20דקות בתמיסת פולי חומצה גלוטמיח
)=620
DP)20מיקרוגרמים למייל .לאחר ההדגרה נמנתה כמות הרדיואקטיביות שנשארה בהאים.
-
82 -
נמצא שתאים מסוגים שונים משחרדיס את הפפטיד הספוח במהירות שווה ואין הבדל בשחרור
הפפטיד בין סוגי התאים השוני 0שנבדקו .במשך 4שעות הראשונות להדגרה עם הפפטיד המסומן
נחן לשחרר מעל 70$ממנו ע"י הדגרה בנוכחוח פולי חומצה גלוטמיח .הוספה פולי חומצה
גלוםמית לחאים 5ש' ומעלה לאחר ספיחת הפפטיד המסומן גורמח לשחרר 25$מהפפטיד הספוח.
.10בדיקת חדירת פולי )אורניתין .לאוצין( מסומן לתוך התאים
חדירת הקופולימר לתוך התאים נבדקה ע״י הדגרח החאים ) 0 . 5חאים
ל מ י י ל
6
( X 1 0בנוכחות
פפטיד מסומן ) 20מי קר ו גדם למייל( במשך 24שעוח .בזמנים שונים הופרדו הגרעינים
והציטופלסמה ע״י דטרגנט P(0.1$-40
Nonidat
למשך 10דקות( .נמצא שבחאים שהוחמרו
מהרדיואקטיביות שנספחה לתאים נמצאת במקטע הגרעיניםואילו
בתאים אחרים ,נורמלים וכאלה שהוחמרו ע״י גורמים אחרים 80$מהרדיואקטיביוח נמצאה במקטע
הגרעינים .הרדיואקטיביות הסגולית של הפפטיד במקטע הציטופלסמטי של תאים שהותמרו ע״י
נגיף ה SV 40-היחה פי חמש פזו שנמצאה במקטע הציטופלסמטי בתאים נורמליים או מוחמרים
ע״י גורמים אחרים.
.11הפקיד הסידן בחהליך ההתלכדוה
ברכוזי סידן של מחחח 3מ״ג אחוז אין התלכדות חאים ,המופיעה רק ברכוזי סידן של
4מ״ג אחוז ומעלה .ספיתת קופולימר מסומן לסוגי תאים שונים אינה חלויה ברכוז הסידן.
קיימים הבדלים בספיחת סידן רדיואקטיבי )
45
( Caע״י חאים שהוחמרו בנגיף SV40לעומח
תאים אחרים .חאים שהוחמרו ע״י הנגיף SV 40סופחים כמוה קטנה פי 3-4של סידן מסוגי
החאיס האחרים .יוני הסידן שנספחו ע״י חאים שהוחמרו ב SV 40-רגישים מאד לשטיפה ,והדגרה
קצרה בתמיסח טריפסין-ורטן גורמה לשטיפה מעל 90$מהסידן הספוח ורק כ 5-7$-נשארים ספוחים
לחאיס .בתאים נורמלים למשל ,מעל 40$מהסידן הםפוח נשאר בחאים לאחר השטיפה .פולי )אורניתין,
לאוצין( מגביר את קליטת הסידן בתאים שהוחמרו ע״י הנגיף SV40
.
V
-
83 -
References
1.
FELL, H.B., J . E x p t l . B i o l . , 57, 1, 1972.
2.
MACPHERSON, I . , Adv.in Cancer Res. 13., 169, 1970.
3.
SACHS, L., Current Topics i n Developmental B i o l o g y , 2_, 129, 1967.
4.
BOREK, C , and SACHS, L., Nature, 210, 276, 1966. ,
5.
BOREK, C., and SACHS, L., Proc.Natl.Acad.Sci., 57, 1522, 1967.
6.
BERWALD, Y., and SACHS, L., J.Natl•Cancer Inst., 35, 641, 1965.
7.
HUBERMAN, E., and SACHS, L., Proc.Natl.Acad.Sci., 56, 1123, 1966.
8.
DIPAOLO, J.A. , NELSON, R.L. , and DONOVAN, P.J., Cancer Res., 31., 1118, 1971.
9.
KUROKI, T., and SATO, H., J.Natl .Cancer Inst. 41., 53, 1968.
10.
GREEN, M. , Annu.Rev.Biochem. , 39., 701, 1970.
11.
SACHS, L., i n MEYERHOF Symp. Molecular Bioenergetics and Macromolecular
Biochemistry, WEBER, H.H., ed., p.118, Springer-Verlag, B e r l i n ,
Heidelberg, N.Y., 1972.
12.
SANFORD, K.K., Cancer Res., 1£, 747, 1958.
13.
DULBECCO, R. , Science, 166, 962, 1969.
14.
TODARO, G.J., LAZAR, G.K. , and GREEN, H.> J.Cell.Comp.Physiol. , 6£,
325, 1965־
15.
HOLLEY, R.W., KIERMAN, J.A., Proc.Natl.Acad.Sci., 60, 300, 1968V
16.
PAUL, D. ,:LIPTON, A., and KLINGER, I., Proc.Natl .Acad. S c i . , 68., 645, 1971.
17.
HAYFLICK, L. , E x p t l . C e l l Res'. , 37., 614, 1965.
18.
DEFENDI, V., and LEHMAN, J.M., J . C e l l Comp.Physiol. 66, 351, 1965.
19.
SHEIN, H.M. , ENDERS, J.F•., LEVINTHAL, J.D., and BURKET, A.E. , P r o c . N a t l .
Acad.Sci., 49, 28, 1963.
-
84
-
20.
BLACK, P.H., and POWE, W.P., Proc.Soc.Exptl.Biol.Med., 114, 721, 1963.
21.
DIDERHOLM, H., STENKVIST, B., PONTEN, J . , and WESSLEN, T., E x p t l . C e l l
Res••• 37, 452, 1965.
22.
PIOUS, D.A., HAMBURGER, R.N. , and MILLS, S.E., E x p t l . C e l l Res., 33, 495,
1964.
23.
MACPHERSON, I . , and MONTAGNIER, L. , V i r o l o g y , 23^, 291, 1964.
24.
OSSOVSKI, L. , and SACHS, L. , Proc.Natl.Acad.Sci., 5(3, 1938, 1967.
25.
BURK, R.R. , Nature, 212, 1261, 1966.
26.
DIAMOND, L., J.Cell.Comp.Physiol., 66, 183, 1965.
27.
HUBERMAN, E., and SACHS, L., J•Natl.Cancer I n s t . , 40., 329, 1968.
28.
HSU, T.C., Inter.Rev.Cytol., 12^, 69, 1961.
29.
VOGT, M., and DULBECCO, R. , Proc.Natl.Acad.Sci. , 49., 171, 1963.
30.
RABINOWITZ, Z., and SACHS, L., Nature, 225, 136, 1970.
31.
HITOTSUMACHI, S., RABINOWITZ, Z., and SACHS, L., Nature, 231, 511, 1971.
32.
STOKER, M., Nature, 218, 234, 1968.
33.
BENJAMIN, T.L., J . M o l . B i o l . , 16, 359, 1966.
34.
FUJINAGA, K. , and GREEN, M. , Proc .Natl .Acad.Sci. , 55_, 1567, 1966.
35.
ALONI, Y., WINCOUR, E. , and SACHS, L., J.Mol.Biol.,. 31, 415, 1968.
36.
PAUL. J . , i n The Biology o f Cancer, AMBROSE, E . J . , and ROE, F.J. , eds.
p.54, D.van Nostrand Comp.Ltd., London, 1966.
37.
TEMIN, H.M. , Inter.J.Cancer, 3., 273, 1968.
38.
GERSHON, D., and SACHS, L., V i r o l o g y , 27, 120, 1965.
39.
GERSHON, D. , and SACHS ,L. , V i r o l o g y , 29., 44, 1966.
40.
KIT,S., MELNICK, J.L., DUBBS, D.R., PIEKARSKI, L . J . , de TORRES, R.A., i n
Perspectives i n V i r o l o g y , POLLARD , M. ed., Vol.5, p.63, Acad.
Press, N.Y., 1967.
-
85
-
41.
TEMIN, H.M., J .Natl. Cancer I n s t . , 37., 167, 1966.
42.
ISHIMOTO, N., TEMIN, H.M., and STROMINGER, J.L., J.Biol.Chem.,241,
2052, 1966.
43.
HAMERMAN, D., TODARO, G.J., and GREEN, H., Biochim.Biophys•Acta, 101,
343, 1965.
44.
HAKAMORI, S., and MURAKAMI, W.T., Proc.Natl.Acad.Sci., 59, 254, 1968.
45.
SELA, B-A., LIS, H., and SACHS, L., J.Biol.Chem., 247, 7585, 1972.
46.
ROBERTSON, H.T., and BLACK, P.H., Proc.Soc.Exptl•Biol.Med., 130, 363,
1968.
47.
SABIN, A.B., and KOCH, M.A. , Proc.Natl.Acad.Sci. , 52., 1131, 1964.
48.
ABERCROMBIE, M., and HEAYSMAN, J.E.M. , Exptl.. C e l l Res., 5_, 111, 1953.
49.
LEVINE, E.M. , BECKER, Y. , BOONE, L.W., and EAGLE, H., Proc•Natl.Acad.
S c i ; , £3, 350, 1965.
50.
NILAUSEN, K., and.GREEN, H., E x p t l . C e l l Res., 40, 166, 1966.
51.
ABERCROMBIE, M. , and AMBROSE, E.J. , Cancer Res., 22., 525, 1962.
52.
EASTY, G.C., i n The Biology o f Cancer,
AMBROSE, E.J., and ROE, F.J.,
eds. p.78, D.van Nostrand Comp.Ltd., London, 1966.
53.
CECCARINI, C. , and EAGLE, H. , Proc. N a t l .Acad. S c i . , 68., 229, 1971.
54.
EAGLE, H., Science, 174, 500, 1971.
55.
GOLDWASSER, E., Current Topics i n Developmental Biology, .L, 173, 1966.
56.
LANDAU, TV, and SACHS, L., Proc.Natl.Acad.Sci., 68, 2540, 1971.
57•••
DULBECCO, R., Nature, 227, 802 , 1970.
58.
CUNNINGHAM, D.D., and PARDEE, A.B., Proc.Natl.Acad.Sci., 64, 1049, 1969;
PARISER, R.J., and CUNNINGHAM, D.D., J . C e l l B i o l . , 49, 525, 1971.
-
86 -
59.
YEH, J . , and FISHER, H.W., J . C e l l B i o l . , 40, 382, 1969.
60.
GOLDSTEIN, L. , LEVIN, Y; , and KATCHALSKI, E., Biochemistry, 3., 1913,
1964.
61.
WALLACH, D.F.H., Proc.Natl.Acad.Sci., 61, 868, 1968.
62.
BURGER, M.M., i n Currient Topics i n C e l l u l a r Regulation,
63.
HABEL, K., and EDDY, B.E., Proc.Soc.Exptl^Biol.Med., 113, 1, 1963.
64.
KOCH, M.A., and SABIN, A.B., Proc.Soc.Exptl.Biol.Med.,113,
65.
DEFENDI, V., Proc,Soc.Exptl.Biol.Med., 113, 12, 1963.
66.
BURGER, M.M., i n CIBA Symposiuia on "Gr9wth c o n t r o l i n C e l l C u l t u r e s " ,
3_, 135, 1971.
4, 1963.
WOLSTENHOLME, G.E.W., and KNIOHT, J . eds. p.45, C h u r c h i l l
L i v i n g s t o n e , Edin.London, 1971.
67.
TEVETHIA, S.S., and RAPP,F., Proc.Soc.Exptl.Biol.Med., 120, 455, 1965.
68.
MALMGREN, R.A., TAKEMOTO, K.K., and CARNEY, P.G., J.Natl.Cancer I n s t . ,
40, 263, 1968.
69.
AMBROSE, E•J., Progress i n Biophysics and Molecular B i o l o g y , 16, 243,
1966.
70.
FORRESTER, J.A., i n " C e l l E l e c t r o p h o r e s i s " ,
AMBROSE, E.J.,ed., p.115
C h u r c h i l l , London, 1965.
71.
CHAUDHURI, S., and LIEBERMAN, I . , Biophys.Biochem.Res.Comm. 20, 303, 1965.
72.
KRAEMER, PwM., J.Cell'.Physiol. , 67_, 23, 1966.
73.
OHTA, N."> PARDEE, A.B. , McAUSLAN, B.R. , and*BURGER, M.M.,
Biochim.Biophys.
Acta, 158, 98, 1968.
74.
WU, H.C., MEEZAN, E., BLACK, P.H., and ROBBINS, P.W., Biochemistry
2509, 1969.
-
75.
87
־
MORA, P.T., BRADY, R.O., BRADLEY, R.M., and McFARLAND, V.W., Proc.Natl.
Acad.Sci., 63, 1290, 1969.
76.
'77.
BRADY, R.O., and MORA, P.T., Biochim.Biophys.Acta,
GRIMES, W.J. ,
218, 308, 1970.
Biochemistry, 9., 5083, 1970.
78.
BUCK, C.A., GLICK, M.C., and WARREN, L., Biochemistry, 9, 4567, 1970.
79.
WEISS, L. "The C e l l Periphery, Metastasis and other Phenomena"
North-
Holland Publ.,Amsterdam, 1967.
80.
BAGSHAVE, K.D., and CURRIE, G.A., Nature, 218, 1254, 1968.
81.
GLICK, J.L., GOLDBERG, A.R. , and PARDEE, A.B., Cancer Res., 26, 1774,
1966.
82.
SHARON, N., and LIS, H., Science, 177, 949, 1972.
83.
LIS, H., and SHARON, N. , Annus Rev. Biochem., 42., 541,-1973.
84.
AUB, J.G., T I E S L A U , C , LANKESTER, A., Proc.Natl.Acad.Sci, 5£, 613, 1963.
85.
BURGER, M.M., and GOLDBERG, A.R., Proc.Natl.Acad.Sci., 57, 359, 1967.
86.
BURGER, M.M., Proc .Natl * Acad. S c i . , 62^, 994, 1969.
87.
INBAR, M., and SACHS,L. , Proc.Natl.Acad.Sci., £3, 1418, 1969.
88.
INBAR, M., and SACHS, L i , Nature, 223, 710, 1969.
89.
BEN BASSAT, H., INBAR, M. , and SACHS, L., V i r o l o g y , 40, 854, 1970.
90.
•LIS, H i , SELA, B T A . , SACHS, L., and SHARON, N., Biochim.Biophys.Acta,
211, 582, 1970.
91.
SELA, B-A. , LIS, H. , SHARON, N. , and SACHS, L., J.Membrane B i o l . , 3_,
267, 1970.
92.
OZANNE, B.> and SAMBROOK, J . , Nature New B i o l . , 232, 156, 1971.
93.
CLINE, M.J., and LIVINGSTONE, D.C., Nature New B i o l . , 232, 155, 1971.
-
94.
88
-
SELA, B-A., L I S , H., SHARON, N., and SACHS, L.,
Biochim.Biophys.Acta,
249, 564, 1971.
95.
INBAR, M. , BEN BASSAT, H. , and SACHS, L. , Proc.Natl.Acad.Sci. , 68., 2748,.
1971.
96.
SHOHAM, J . , and SACHS, L., Proc.Natl.Acad.Sci., 69, 2479, 1972.
97.
NICOLSON, G.L., Nature New B i o l . , 239, 193, 1972.
98.
SMITH, S.B., and REVEL, J.P. , Develop.Biol. , 21_, 434, 1972.
99.
BRET TON, R. , WICKER, R. , and BERNHARD, W. , I n t e r . J . Cancer, 10., 397,
1972.
100.
SINGER, S.J., and NICOLSON, G.L., Science, 175, 720, 1972.
101.
GERTLER, A. , Eur.J.Biochem. , 20., 541, 1971.
102.
DAVIES, R.C., NEUBERGER, A., and WILSON, B.M., Biochim.Biophys.
Acta,
178, 294, 1969.
103.
MOZES, E., and SELA, M. , I s r a e l J.Med.Sci. , 5_, 267, 1969.
104.
SELA, M., MOZES, E., SHEARER, G.M., and KARNIELY, Y., Proc.Natl.Acad.
S c i , 67, 1288, 1970.
f
105.
ALLFREY, V.G., i n "Histones and Nucleohistones,
PHILLIPS, D.M.P. ed.
p.253, Plenum Press, London, New York, 1971.
106.
ARONSON, J . , MEYER, W.L., and BROCK, T.D., Nature, 202, 555, 1964.
107.
KATCHALSKI, E. , and SELA, M. , Adv. i n P r o t e i n Chemistry, 13., 243, 1958.
108.
SELA, M., and KATCHALSKI, E., Adv.in P r o t e i n Chemistry, 14., 391, 1959.
109.
KATCAHLSKI>E'.In"Niew Perspectives i n Biology" , SELA, M., ed. p.51,
E l s e v i e r Pub.Comp., Amsterdam, 1964.
-
110.
89
-
SILMAN, H.I., and SELA, M., i n "Poly-a-Amino Acids", FASMAN, G.D., ed.
Chap.12, p.605, MARCEL DEKKER, Inc. N.Y., 1967.
111.
KORNGUTH, S.E., STAHMANN, M.A., and ANDERSON, J.W., E x p t l . C e l l Res.,
24, 484, 1961.
112.
KOROHODA, W., FORRESTER, J.A., MOREMAN, K.G., and AMBROSE, E . J . ,
Nature, 217, 615, 1968.
113.
AMBROSE, E.J., i n " C e l l D i f f e r e n t i a t i o n " , DeReuck, A.V.S., and Knight,
J . , eds. p.101, C h u r c h i l l , L t d . , London, 1967.
114.
MEHRISHI, J.N., Eur.J.Cancer, 5_, 427, 1969.
115.
RICHARDSON, T., HODGETT, J . , LINDNER, A., and STAHMANN, M.A., Proc.
Soc.Exptl.Biol.Med., 101, 382, 1959.
116.
LUTTGE, U., PALLAGHY, C.K., and VON WILLERT, K.,
J.Membrane B i o l . ,
4, 395, 1971.
117.
MAMELAK, M., WISSIG, S.L., BOGOROCH, R., and EDELMAN, I.S., J.Membrane
B i o l . , 1., 144, 1969.
118.
RYSER, H.J-P., GABATHULER, M-P., and ROBERTS, A.B., Biomembranes, 2_,
197, 1971.
119.
TILLES, J.G., Proc.Soc.Exptl.Biol.Med., 125, 996, 1967.
120.
AMOS, H.,.and KEARNS, K.E. , E x p t l . C e l l Res., 32., 14, 1963.
121.
PAGANO, J.S., i n "Fundamental Techniques i n V i r o l o g y " , HABEL, K., and
SALZMAN, N., eds. Chap. 17, p.184, Acad.Press, N.Y. & London, 1969.
/ • ,
122.
KATCHALSKI, E., SELA, M., SILMAN, H.I., and BERGER, A., i n "The P r o t e i n s "
NEURATH, H., ed., 2nd Ed., V O l . I I , p.405, Acad.Press, N.Y., 1964.
-
90
-
12 3.
ARIELY, S., WILCHEK, M., PATCHORNIK, A., Biopolymers
91, 1966.
124.
KATCAHLSKI, E., BERGER, A., BICHOWSKY-SLOMNICKI, L., and KURTZ, J . ,
Nature,176, 118, 1955.
125.
BICHOWSKY-SLOMNICKI, L., BERGER, A., KURTZ, J . , and KATCHALSKI,E.,
Arch.Biochem.Biophys.,
126.
65, 400, 1956.
YARON, A., TAL •(«TURKELTAUB) , N., and BERGER, A., Biopolymers, 11, 2461
1972.
.
127.
FRIDKIN, M. , FRENKEL, A., and ARIELY, S., Biopolymers, 8., 661, 1969.
128.
YARON, A., OTEY, M.C., SOBER, H.A., KATCHALSKI, E., EHRLICH-ROGOZINSKI, S.
and BERGER, A., Biopolymers, 11_, 607, 1972.
129.
GILVARG, C., and LEVIN, Y; , J.Biol.Chem., 247, 543, 1972.
130.
EAGLE, H., J.Exptl.Med., 102, 595, 1955.
131.
DULBECCO, R. , and VOGT, M. , J.Exptl*Med., 99_, 167, 1954.
132.
PUCK, T.T., CIECIURA, S.J., and FISHER, H.W.,
J.Exptl.Med., 106, 145,
1957.
133.
YOUNGNER, J.S., Proc.Soc.Exptl.Biol.Med., 85, 202, 1954*
134.
WINOCOUR, E., and SACHS, L., Virology, 8, 397, 1959.
135.
WINOCOUR, E. , and SACHS, L. , J.Natl.Cancer Inst., 26_, 737, 1961.
;136.
137.
TRENTIN, J . J . , YABE, Y. , and TAYLOR, G., Science, 137, 835, 1962.
STROHL, W.A. , ROUSE, H.C. , and SCHLESSINGER, R.W., Virology, 21., 513,
1963.
138.
HUBERMAN, E., SALZBERG, S., and SACHS, L., Proc.Natl.Acad.Sci., 59, 77,
1968.
-
91
-
139.
STOKER, M. , and MACPHERSON, I . , Nature, 203, 1355,
1964.
140.
DIAMOND/ L., Inter.J.Cancer, 2_, 143, 1967.
141.
FOGEL, M., and SACHS, L., V i r o l o g y , 37, 327, 1969.
142.
SHIRATORI, O., OSATO, T., UTSUMI, K.R., and ITO, Y., Proc.Soc.Exptl.
Biol.Med., 128, 12, 1968.
143.
TODARO, G.J., and GREEN, H. ,
J . C e l l Bi'ol., 17, 299, 1963.
144.
TODARO, G. J . , GREEN, H., and GOLDBERG, B.D., Proc.Natl.Acad.Sci., 5 1 ,
66, 1964.
145.
FRIEND, C., PATULEIA, M.C., and DEHARVEN, E., Natl.Cancer
Inst.Monograph,
22., 505, 1966.
146.
SINCOVICS, J.G., BERTIN, B.A., and HOWE, C.B., Natl.Cancer I n s t , ponograph,
22, 349; 1966.
147.
LAW, L.W., DUNN, T.B., BOYLE, P.J., and MILLER, J.H., J.Natl.Cancer I n s t .
10, 179, 1949.
148.
TODARO, G.J., GREEN, H., and SWIFT, M.R., Science 1 5 3 / 1 2 5 2 , 1 9 6 6 .
149.
HOPPS, H.E. , BEPNHEIM, B.C., NISALAK, A., TJIO, J.H., and SMADEL, J.E. ,
;
J.Immunol., 91_, 416, 1963.
150.
CHANOCK, R.M.,
HAYFLICK, L., and B A R I L E , M.F.,
Proc.Natl.Acad.Sci., 48,
41, 1962.
151.
OYAMA, V.I., and EAGLE, H., Proc.Soc.Exptl.Biol.Med., 91, 3 0 5 , 1 9 5 6 .
152.
LOWRY, O.H.> ROSEBROUOi, N.J., FAIR, A.L., and RANDALL, R.J., J . B i o l .
Chem., A93, 265, 1951.
153.
•SWEET, B.H., and HILLEMAN, M.R., Proc.Soc.Exptl.Biol.Med., 1 0 5 , 4 2 0 ,
1960.
-
154.
155.
92
-
WINOCOUR, E., V i r o l o g y , 19., 158, 1963.
־UCHIDA, S., WATANABE, S., and IKATO, M., V i r o l o g y , 28, 135, 1966.
156.
SACHS, L., and FOGEL, M., V i r p l b g y , 11, 722, 1960.
157.
GERSHON, D., SACHS, L., and WINOCOUR, E., Proc.Natl.Acad.Sci., 56, 918,
1966.
158.
BORUN> T.W.,
SCHARFF, M.D., and ROBBINS, E., Biochim.Biophys.Acta, 149,
302, 1967.
159.
ROZENBLATT, S., and WINOCOUR, E., V i r o l o g y , 50, 558, 1972.
160.
BORLE, A.B., J . C e l l B i o l . , 36, 567, 1968.
161.
INBAR, M., BEN-BASSAT, H., and SACHS, L., Nature New B i o l o g y , 236, 3,
1972.
162.
BARAK, Z. , SARID, S., and KATCHALSKI, E. , Eur.J.Biochem., 34., 317, 1973.
163.
RYSER, H.J-P., and HANCOCK, R., Science, 150, 501, 1965.
164.
RYSER, H.J-P., Nature, 215, 934, 1967.
165.
RUBINI, J.R., STAHMANN, M.A., RASMUSSEN, A.F., J r . , Pr0C.S0C.Exptl.Bi01.
Med., 76, 659, 1951.
166.
TSUYUKI, E., TSUYUKI, H., and STAHMANN, M.A., J.Biol.Chem., 222, 479,
1956.
167.
SHERBET, G.V., J.Embryol.Exptl.Morphol., 16, 159, 1966.
168.
OTSUKA, H. , J . C e l l S c i . , 9., 71, 1971.
169.
WOLLMAN, Y. , and SACHS, L., J.Membrane B i o l . , 1<), 1, 1972.
170.
RAPP> F., Ann.Rev.Microbiol., 23» 293, 1969.
171.
NOONAN, K.D., REGNER, H.C., BASILICO, C., and BURGER, M.M., Proc.Natl.
Acad.Sci.> 70, 347, 1973.
-
172.
93
-
GINGELL, D., GARROD, D.R., and PALMER, J.F., i n "Calcium and C e l l u l a r
Functions", CUTHBERT, A.W., ed., p.59, MacMillan, London, 1970.
173.
WHITFIELD, J.F., PERRIS, A.D., and YOUDALE, T., E x p t l . C e l l Res., 53,
155, 1968.
174.
ALFORD > R.H. , J.Immunol., 104, 698, 1970.
175.
WHITNEY, R.B. , and SUTHERLAND, R.M., J . C e l l ; P h y s i o l . , 80, 329, 1972.
176.
FREEMAN, A.E., HOLLINGER, S., PRICE, P.J., and CALISHER, C., E x p t l . C e l l
Res., 39, 259, 1965.
177.
WHITNEY, R.B. , and SUTHERLAND, R.M., C e l l Immunol., 5., 137, 1972.
-
viii
״
corresponding normal cell lines. During the first 4 hr after POL addition most
of the radioactivity could be washed by poly glutamic acid. After longer periods,
however, polyglutamic acid could wash out only a small proportion of the labile
POL.
u
16. Differences in the distribution of C -POL in SV40 transformed cells
Experiments were done to test the possibility that the distribution of POL
inside the cells differs between SV40 transformed cells and normal cell lines.
M
The different cell lines were incubated with C -POL as in sectionl4,
the cells were washed and incubated with the detergent P-40 (0. l % _ i n PBS).
The detergent destroys the outer cell membrane without impairing the nuclear
membrane. After treatment with this detergent one can, therefore, separate
cell nuclei from the cytoplasm. The cytoplasmic fraction and the nuclear fraction
were counted separately. In the SV40 transformed cells most of the radioactivity
(80%) was found in the cytoplasmic fraction and a small portion of the label was
found in the nuclear fraction. In a l l the other cell lines tested, most of the
radioactivity (80%) was in the nuclear fraction and a small fraction of label (20%)
remained in the cytoplasm.
From the above results it i s concluded that the SV40 and Adeno 12
viruses cause a specific change in the cells transformed by them. This
change enables the cells to concentrate calc ium ions and poly ornithine,,
leucine copolymer in the outer region of the cells probably the cell membrane
thus causing the specific cell aggregation. This phenomenon can serve as a tool
in recognition of specific transformed cells and enabling us to identify specific
transformed and cancerous cells.
-
vii -
13. Uptake of radioactive POL by washed cells
To measure the uptake of POL by cells a C
u
using C
14
labeled leucine. The uptake of the C
u
labeled POL was synthesized
peptide by washed cells was measured
by the following procedure:
Cells were taken off the plate with trypsin or versen (no difference was found
in the uptake), washed three times with PBS and dispersed to a final concentration
6
of 2 x 10 cells per ml. The suspension was incubated for 20 min with increased
amounts of C
14
POL (5-40 \1g POL/ml), washed three times with PBS, dissolved
in 0.1 N NaOH and counted in the scintillation counter. The amount of C
14
POL
adsorbed by the SV40 transformed 3T3 cells was the same as that of the corresponding
normal 3T3 cells.
14
14. Uptake of C -POL by growing cells
As transformed and non trans formed washed cells were found to bind the
same amount of POL, the uptake of POL by growing cells in the presence of serum
5
was also examined. The different cell lines were seeded (5 x 10 cells/plate) in
5 ml of EM supplemented with 10% calf serum. POL was added to the cells
(5-25 |xg POL/ml) and the cells were incubated for 24 hr. Samples were taken
at 4, 8, 18 and 24 hr, washed three times with PBS, dissolved in 0.1 N NaOH
14
and counted in the liquid scintillation counter. The uptake of C -POL by the
different cell lines was the same and no difference was found between the uptake
of POL by SV40 transformed cells and the uptake by the corresponding normal
cell lines.
15. Removal of adsorbed radioactive POL by different agents
In order to test the ease with which POL can be removed from the various
cell lines they were incubated with the labeled copolymer and then treated with
polyglutamic acid (20 (jig/ml, n = 620). Following this incubation the cells were
washed with PBS solution, and the radioactivity left in the cells was counted.
Removal of POL from the SV40 transformed cells was the same as that from the
״
11.
vi
-
Aggregation of SV40 transformed cells in different concentrations of calcium ions
Calcium ions are known to play an important role in different aggregation
phenomena. Attempts were made, therefore, to see if calcium ions are essential for
the specific aggregation of SV40 transformed cells by the ornithine-leucine copolymer.
The cell suspension (3T3SV40 transformed cells to give a suspension of 10
cells/ml)
was incubated for 24 hr in Eagle Medium (EM) supplemented with 10%
dialyzed calf serum in calcium concentrations varying from 0 to 10 mg C a
100 ml and 20 (xg/ml P O L .
scope.
6
+ +
per
Aggregation was scored in the phase contrast micro-
It was shown that in calcium concentration less than 3 mg per cent, no
aggregation took place. The SV40 transformed cells were fully aggregated in
calcium concentration higher than 4 mg per cent.
12.
45
Radioactive calcium (Ca ) uptake by different cells
It was found that the presence of calcium ions in the aggregation mixture
is essential for the aggregation and therefore the uptake of calcium ions from
the medium by different cell line was measured.
6
Suspension of 3T3 cells (normal or SV40 transformed, 3 x 10 /ml) were
indubated in phosphate buffer solution containing C a
45
for 60 min. At subsequent
time intervals aliquots were withdrawn, the cells were washed three times in the
buffer solution and counted for radioactivity after sonication. The calcium uptake
by the normal cells was found to be 3-4 times greater than by the SV40 transformed
cells. To test if the radioactive calcium ion enters the cells or attaches to its
outer surface, the cells were incubated for 20 min in a mixture of versen and
trypsin.
This treatment remcves about 30% of the total cell protein mainly
from the membrane region. More than 90% of the radioactive calcium taken up
by the SV40 transformed cells was removed by this treatment, whereas only 40-50%
were removed from the normal cells or cells transformed by other means.
It was concluded that SV40 transformed cells differ from the corresponding
normal cells or from cells transformed by other me ans in their C a
+ +
uptake and
in the distribution of the calcium ions within the various regions of the cell.
V
-
7. SV40 transformed cell aggregating ability of other polypeptides
Specific aggregation of SV40 transformed cells in EM with 10% calf serum
was also found with the sequential polypeptide (Leu~Orn-Leu) , as well as with
n
random copolymers of ornithine and valine, and of arginine and leucine. The
random copolymer of 1:1 ornithine and leucine (POL) produced aggregates at
a lower concentration than the other 3 polypeptides. No cell aggregation occurred
in EM with 10% calf serum in the presence of poly-L-ly sine, poly-D-lysine, poly-Lornithine, poly-L-glutamic, poly-L-aspartic acid and a sequential polypeptide
(Lys-Ala-Ala)
n
at concentrations of 10-120 (Jig/ml.
8. Aggregation of normal cells after infection with SV40
A normal mouse cell line (3T3) which does not aggregate in the presence
of POL
was infected with SV40, and the infected cells were daily checked for
appearance of aggregation by addition of POL.
It could be shown that if the normal
cells were left to divide after the virus infection the infected cells became capable
of aggregating 4 days after infection. If, however, the cells were seeded in high
densities and were not, therefore, allowed to divide, no aggregation appeared after
virus infection even 7 days after infection. It is known that after infection of
cells with SV40 cell replication is essential for the fixation of transformed state.
9. Protein and DNA synthesis in cells incubated with POL
Incubation of cells with POL did not affect the synthesis of DNA by these
cells as measured by Thymidine C
14
incorporation into TCA insoluble fraction.
Protein synthesis, however, was slightly inhibited (20% after 20 hr indubation)
as measured by leucine C
14
incorporation.
10. The absorption of labeled Con A by POL treated cells
Pretreatment of SV40 transformed cells by 30 |0.g per ml POL causes
a 3-fold rise in the absorption of labeled Con A by these cells. This rise is due
to the rise in a-methyl-glucopyranoside sensitive Con A absorption, thus
indicating a change in the structure of the cell membrane caused by POL.
-
iv -
less than 50% of the total number of cells, no aggregation occurred after POL
treatment, probably because the SV40 transformed cells were too far from each
other and unable to aggregate. Cloning of mixtures of 3T3 SV40 and 3T3 Polyoma
transformed cells showed that SV40 transformed clones could be differentiated
from the Polyoma transformed clones by. the formation of aggregates after
treatment with POL.
5. Aggregation of SV40 transformed cells at 24° C and after X-irradiation
To test for aggregation in cells incubated at 24°C, 3T3 SV40 transformed
cells were incubated at 37° C for 12 hr after seeding, and the plates were then
transferred to a 24°C incubator. Twentyfour hours after the transfer, 20 fig/ml
POL was added and the cultures again incubated at 24°C. Cell aggregates appeared
at 24°C, but only at 5-6 days after addition of the polymer. In order to test the
effect of inhibiting cell multiplication by X-irradiation, SV40 transformed cells
were X-irradiated with 4,000 r and then seeded. After 24 hr incubation at 37°C,
20 (Jig/ml POL was added and incubation continued for another 24 hr. Cell
aggregates formed at the same time and in the same way as in the non-irradiated
SV40 transformed cells.
6. Inhibition of the aggregation of SV40 transformed cells by acidic polyamino acids.
Polyglutamic acid and polyaspartic acid were found to be strong inhibitors
of the rapid non-specific agglutination. Their ability to inhibit the specific
aggregation of SV40 transformed cells was therefore tested. When 20 !xg/ml
polyglutamic acid (DP = 180) was added to 20 |J.g/ml POL, and the cells seeded
in plates and incubated for 24 or 48 hr, cell aggregation could not be detected.
When the same amount of polyglutamic acid was added to 3T3 SV40 cells pre incubated
with POL for different time intervals, it was found that specific aggregation could
be prevented only when the polyglutamic acid was added within.the first 6 hr after
the addition of POL. If polyglutamic acid was added 6 or more hours after POL,
there were the same aggregates at 24 hr as in the absence of polyglutamic acid.
״
li
1. The toxicity of baalc homo and copolymers
Toxicity of basic polyamino acids was tested in the tissue culture system.
6
The tested polymer was incubated together with the cells (0.5 x 10 cells per
plate and 0-100(1 g per ml of the tested peptide). Cells were counted daily. All
the basic peptides were found to be toxic to the cells. The toxicity of the peptides
is probably due to the electrostatic binding between the positively charged
peptide and the negatively charged surface membrane of the cells. Toxicity
was directly proportional to the molecular weights of the peptides within the
range of molecular weight tested. Poly-D-lysine was at least 10 times more
toxic than poly־L-lysine. This is probably due to the stability to proteolytic
digestion of peptides composed of D-amino acid derivatives.
The toxicity of different basic homopolymers and copolymers towards
normal cells was very similar to the toxicity of the above peptides towards
transformed cells. The toxicity of poly-L-lysine (n= 30), for example, was
only 30% higher on normal cells than on transformed cells.
2. Non-specific rapid agglutination of cells by a random copolymer of ornithine
and leucine (1:1) (POL)
One to two ng/ml of POL in Phosphate Buffer Saline (PBS) agglutinated
6
suspensions of 1-2 x 10 cells/ml of all the cells listed above. The agglutination
occurred at room temperature within 5 minutes. Dissociating the cells with
trypsin or versen solutions did not alter their agglutination ability. The
agglutination characteristics did not change on washing the cells with Eagle
־4״ ״4״
medium (EM),
PBS or Ca
\ ן
and Mg
-free PBS. The agglutination could be
partially reversed by the addition of poly-L־glutamic acid or poly-L-aspartic acid
(5 to 10 !xg/ml) or by the addition of 10% serum. Concentrations up to 100 !xg/ml
POL did not agglutinate cells suspended in EM in the presence of 10% calf serum,
and agglutination under these conditions only appeared at a polypeptide concentration
of 200
\i.g/ml.
SUMMARY
Results obtained with carbohydrate-binding proteins such as concanavalin
A, wheat germ glycoproteins and a soybean glycoprotein have indicated that
binding sites for these proteins are exposed on the surface of transformed cells
but are in a cryptic form on normal cells.
The present studies with a synthetic
amino acid copolymer were undertaken so as to determine whether such polymers
may be useful in further elucidation of the differences between the cell surface
of normal and transformed cells and whether they can be used to detect changes
that may be specific to cells transformed by certain carcinogenic agents.
It has been shown that basic polyamino acids bind to cell membranes of
bacteria, erythrocytes and mammalian cells.
We present here data concerning
the interaction of normal and transformed mammalian cells with basic homopolymers and with copolymers of amino acids.
The basic homopolymers were
poly-L-lysine, poly-D־lysine, poly-L־ornithine and poly־L-arginine. Hie basic
copolymers were composed of basic and hydrophobic amino acid residues such
as ornithine and leucine, ornithine and valine and lysine and alanine. The main
copolymer used was a random copolymer of ornithine and leucine (1:1 molar
ratio) (POL).
The cells used in our studies were normal embryonic fibroblasts (mouse,
rat and hamster, normal cell lines (mouse 3T3, hamster BHK21, NIL2 and
human WI-38, and the above normal cells transformed by different carcinogenic
agents such as viruses (SV40, polyoma, Adenovirus types 3,7 and 12, Moloney
and Rouse sarcoma viruses), carcinogenic chemicals (such as benzpyrene and
dimethylnitroseamine) and X-irradiation transformed cells. T h r e e mouse
leukemic cell lines were also tested. All the cells used were grown in tissue
culture technique and tested in vivo.
This work was carried out in the
Departments of Biophysics and Genetics,
The Weizmann Institute of Science, Rehovot,
under the supervision of Professor
Ephraim Katzir (Katchalski) and Professor
Leo Sachs.
Interactions between Basic Polypeptides and Mammalian Cells
Growing in Tissue Culture
T h e s i s for t h e d e g r e e
Doctor of Philosophy
by
DAN
DUKSIN
S u b m i t t e d t o t h e S c i e n t i f i c C o u n c i l of t h e W e i z m a n n Institute of S c i e n c e
Rehovot
October.1973
נע
