docביולוגיה של התא - שיעורים 16-20
download 
Report Transcription
ביולוגיה של התא - שיעורים 16-20
ביולוגיה של התא -הרצאות1 164 03.05.2010 שיעור :16הרשתית האנדופלזמטית ER - מרצה :חררדו לדרקרמר משמאל :סכמה של תא .ניתן לראות אברונים שונים. אנו מזהים את הממברנה הפלזמטית והגרעין; הציטוזול הוא התווך הנוזלי שבו נמצאים האברונים ,שיחד איתם הוא מכונה ציטופלזמה. התרשים מפרט את שאר האברונים של התא ,אשר על רובם נעבור בשיעורים נפרדים בשבועות הקרובים .בשיעור זה נעסוק ב Endoplasmatic Reticulum-או .ERה ER-נראים כמורכב מצינורות נפרדים )ירוק כהה( אולם הם למעשה קשורים כולם ,רשת ממברנלית ענפה שמתקשרת לממברנה הגרעינית )ירוק בהיר( והיא המשכיות ישירה שלה. אברונים שלא נעבור עליהם הם הכלורופלאסט שעושה פוטוסינטזה בתאים צמחיים והפרוקסיזום בו נעשים תהליכים של פירוק. הדבר החשוב בנוגע לאברונים הוא המידור :לכל אברון יש ממברנה מקיפה אשר מפרידה בין החלל של האברון לחלל הציטוזולי. סרטון :ניתן לראות צביעה של ה .ER-ניתן לראות שהרשתית מגיעה כמעט עד הממברנה הפלזמטית. הבציעה החזקה היא בממברנת הגרעין ,שהיא המשך של הרשתית .היא מתנשאת על גבי רשת המיקרוטובולי ומונעת על ידי חלבוני מנוע. הניסוי הוא ,in-vivoכלומר בתא חי .ניתן לראות את הדינמיות של הממברנות תודות לדינמיות של המיקרוטובולי .הרשתית נעה מאיזור ממברנת הגרעין לכיוון הממברנה הפלזמטית ונישאת כאמור על ידי קינזינים ,שנעים על גבי המיקרוטובולי הרחק מהגרעין. מבנה ותפקוד האברונים אנחנו ניכנס למחקרו של ג'ורג' פאלאדה ,אשר גילה את מבנה ה ER-וזכה בפרס נובל ב- .1974 פאלאדה ערך מיקרוסקופיה אלקטרונית של תאים מסוג ,(B-cells) Bאחד מסוגי תאי הדם הלבנים באדם .התמונה השמאלית מציגה חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :16הרשתית האנדופלזמטית- ER 165 תא Bבמנוחה .ניתן לראות את הגרעין ,תא עגול ,אינו מכיל ציטופלזמה רבה .תא ה B-הוא רכיב במערכת התגובה החיסונית ,שעובר אקטיבציה כאשר מגיע פתוגן ,דוגמת חיידק. במצב אקטיבציה ,התא מתחיל להפריש חלבונים מסוג נוגדנים .הנוגדנים הם חלבונים חשובים המזהים את הפתוגן ולכן חשובים למערכת החיסונית .כאשר מסתכלים על תא Bלאחר אקטיבציה ,ניתן לראות שינוי משמעותי .השינוי אינו מתחולל בגרעין כמו שהוא מתחוללה בציטופלזמה :הציטופלזמה גדלה וישנה גם גדילה של רשת ה ER-הענפה .תהליך זה מכונה .ER Proliferation בתמונה משמאל רואים הגדלה של הציטופלזמה של התא; האיזורים הבהירים הם חללי צינורות הER- ) (lumenוהאיזורים הכהים יותר הם הציטוזול .כמו כן רואים נקודות על גבי ממברנת ה ,ER-בצד הפונה כלפי הציטוזול. פאלאדה גילה שהנקודות הללו הן למעשה ריבוזומים היושבים על ממברנת ה ,ER-כלפי הציטוזול .על מנת להבין את הפונקציה של ה ER-היה צריך פאלאדה לבודד אותו .לשם כך הוא פיתח שיטות לבידוד הER- תוך כדי שמירה על הפונקציה שלו במבחנה. שיטות להפרדת אברונים הוצאת האברונים מהתאים פאלאדה לקח תאים ושבר אותם לשחרור האברונים .יש כמה שיטות לשבירה של תאים: • – Detergent lysisבעזרת סבון התאים נפגעים בממברנה שלהם ,שכן הסבון גורם להתמוססות של הליפידים .בצורה כזו החלבונים יוצאים לתמיסה אולם האברונים מתמוססים גם הם ולכן השיטה לא יעילה במקרה זה. • – Sonicationבעזרת גלי קול בתדר המתאים, כמו שניתן לשבור כוס זכוכית ,ניתן לפוצץ את התאים .תהליך זה קשה לבקרה ושליטה ,ולרוב יש שבירה גם של האברונים .שוב ,שיטה לא יעילה למקרה שלנו. • – Homogenizationהתאים מוכנסים למבחנה עם בוכנה בפנים .הבוכנה מסתובבת והתאים מתפוצצים כתוצאה מכך אבל האברונים נשארים שלמים למדיי .זוהי השיטה הנבחרת לבידוד אברונים .שיטה זו מכונה cell homogenateומתקבלת ממנה תערובת של אברונים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 166 בידוד ה ER-מבין סך החלבונים והאברונים שהיו בתאים עם ה ER-זה קצת יותר בעייתי ,כי היא רשת ענפה ושבירה מאוד .בשיטה זו שוברים מעט את הרשת ,וכך מתקבלים נתחים של הרשת אבל הם עדיין פונקציונאלים .כעת צריך להפריד בין האברונים שבתערובת. תהליך זה נעשה על ידי .subcellular fractionation לוקחים את התערובת ומכניסים למבחנה; את המבחנה שמים בצנטריפוגה )סירקוז( ומקבלים הפרדה בין נוזל עליון ומשקע ) .(pelletהמשקע מכיל את האברונים ,אבל הוא מכיל את כולם ,ולכן איננו מצליחים לבודד כך את האברון המבוקש לנו. ניתן לשנות מעט את השיטה ל .differential centrifugation-בשיטה זו לוקחים את התערובת ומריצים בצנטריפוגה איטית יותר .המשקע כעת הוא של אברונים גדולים יחסית ,והפלט מסומן בתור .P1ניתן להוציא את האברונים מהפלט הגדול הראשון ואז להריץ במהירות מעט גבוהה יותר .כעת מקבלים אברונים מעט קטנים יותר .ככל שממשיכים להוציא משקעים ולהריץ מעט מהר יותר, מקבלים פרקציות שונות שמכילות את האברונים השונים. ה ,ER-שהוא קל מאוד ובעל צפיפות נמוכה ,מתקבל במהירות גבוהה למדי – .100,000G הפרדה בין חלקי ה :ER-הרשתית החלקה ) (SERוהרשתית המחוספסת )(RER פאלאדה בודד את ה ER-וראה שבמשקע ,כאשר מסתכלים עליו במיקרוסקופ אלקטרוני ,עדיין אין ממש הומוגניות ויש שונות בין החתכים שהוא קיבל .לפיכך הוא הכניס את המשקע לשיטה אחרת ,טובה יותר: השיטה הזו היא .Density Gradient Centrifugation חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :16הרשתית האנדופלזמטית- ER 167 בונים במבחנה מפל של צפיפות .זאת נעשה על ידי סוכרוז למשל ,שיוצר תמיסה מרוכזת של סוכרוז וכאשר מכניסים אותה למבחנה מתחילים למהול את הסוכרוז .בצורה כזו מקבלים מפל ריכוזים של סוכרוז :מרוכז למטה ודליל למעלה ,וגם הצפיפות של התמיסה משתנה בגרדיינט בהתאם .לתמיסה זו מכניסים את הדגימה עם האברונים ואז מסרקזים על מנת להפריד אותם. העקרון הוא כמו העקרון של ים המלח :ים המלח הוא בעל צפיפות גבוהה בשל המלחים המוכלים בו. הסוכרים בתמיסה שלנו מקבילים למלחים .כאשר אדם נכנס לים המלח הוא צף ,משום שהצפיפות של ים המלח גבוהה יותר מהצפיפות שלנו .אם מכניסים אבן ,לעומת זאת ,היא תישקע כי היא צפופה יותר מהמים. אם נכניס גוףשצפיפותו שווה לצפיפות של ים המלח ,הוא יישאר בעומק שאליו הוכנס ,לא יעלה ולא יירד. לאחר הצנטריפוגה ,אם האברון צפוף יותר הוא יישקע ואם פחות הוא יצוף; אולם מכיוון שיש מפל של צפיפות ,ככל שנסרקז האברונים יישקעו עד שיגיעו לאיזור מפל הצפיפות שמתאים לצפיפות שלהם )הערה :מפל הצפיפות לא ניזוק מהסירקוז( ,ושם יישארו .בשל כך השיטה מכונה גם Equilibrium ,Sedimentationכיוון שמסרקזים רק עד שיווי משקל בין צפיפויות המשקע למקום המתאים לו בגרדיינט .בצורה זו אנחנו מקבלים הפרדה טובה בין המרכיבים לפי צפיפותם. כעת פאלאדה לקח את המשקע P4שהתקבל לו; והוא קיבל שתי פרקציות במפל הצפיפות .בכל פס, כאשר הסתכל במיקרוסקופ אלקטרוני ,הוא ראה כל מיני ממברנות בפס העליון ובפס התחתון ממברנות עם הנקודות שהן הריבוזומים ,שהם דומים יותר ל- ERשרואים בתא שלם ומאוקטב. תחילה פאלאדה כינה את הגופיפים מיקרוזומים מחוספסים ) (rough microsomesכשיש עליהם ריבוזומים ומיקרוזומים חלקים ) smooth (microsomesכשאין להם את הריבוזומים )לפני שידע בדיוק מה הם(. בניסויים נוספים פאלאדה גילה שאלו למעשה שני איזורים שונים של ה :ER-האיזור המחוספס מכיל ריבוזומים ולכן היום הוא מכונה RER והשני מכונה SERעקב היותו חלקה.41 אם נסתכל שוב על מיקרוסקופיית התא לפני השבירה ,כששוברים את התאים מקבלים נתחים של .ERבאופן ספונטני יש סגירה מחדש ) (reclosureשל צינורות ה .ER-בשל כך נוצרות חתיכות שהן RER לאחר הסגירה מחדש ,וחתיכות שהן .SER Rough Endoplasmic Reticulum & Smooth Endoplasmic Reticulum 41 החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 168 איור מסכם היפותזת האותות – גנתר בלובל הסטודנט של פאלאדה ,גונתר בלובל ,המשיך את עבודתו של פאלאדה וזכה בפרס נובל ב 1999-תודות לתיאוריה Signal Hypothesisשפיתח .בלובל הבחין בשתי אוכלוסיות של ריבוזומים: • ריבוזומים חופשיים – חופשיים בציטופלזמה ,הם אלו שמנטזים mRNAבאופן חופשי עבור חלבונים ציטוזוליים או חלבונים גרעיניים. • ריבוזומים קשורים – קשורים על גבי ממברנת ה .ER-ריבוזומים המסנטזים חלבוני הפרשה.42 הריבוזומים עוברים כל העת הרכבה וופירוק לתת היחידות שמרכיבות אותם; בריבוזומים חופשיים, כאשר תת היחידה הקטנה נקשרת ל mRNA-היא רצה עד שמוצאת AUGואז מתחברת עם התת יחידה הגודלה .בהמשך נוצרים פוליזומים ,אשר יכולים לעבור פירוק לתת היחידות .ישנה מחזוריות של פירוק והרכבה. אותו התהליך קורה בריבוזומים הקשורים לממברנת ה .ER-תת היחידות מרכיבות ריבוזומים והם יוצרים פוליזומים על גבי הממברנה של ה .ER-זה למעשה מה שפאלאדה ראה ב .RER-חשיבות קיומם של פוליזומים משמעותו שיש תרגום של .mRNAכלומר ,ככל הנראה על הממברנה של ה ER-גם כן יש תרגום של mRNAלחלבונים. 42בהמשך נכיר כי חלבוני הפרשה הם כל החלבונים שיוצאים מתוך התא לחלל החוץ תאי ,לממברנות השונות ,או לתוך האברונים – בעקרון כל חלבון שצריך לעבור דרך תווך ממברנה במקום להישאר בציטוזול או בגרעין. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :16הרשתית האנדופלזמטית- ER 169 מציאת פפטיד האותות )(Signal Peptide/ Leader Peptide בלובל לקח פוליזומים חופשיים וביצע In-vitro ,translationכלומר תרגום במבחנה ,ללא תאים. הוא השווה בין התרגום בחלבון In-vitroואותו החלבון שמוציאים מתא חי .הוא ראה שהחלבון מהתא החי הוא מעט יותר קצר. המסקנה :תרגום במבחנה על ידי פוליזומים חופשיים מפיק חלבונים יותר ארוכים מאשר בתאים חיים. הוא עשה את הניסוי עם חלבונים שונים ,ובחלקם התוצאה הזו לא התקבלה .הוא הגיע למסקנה שהתהליך נכון רק לחלבונים מופרשים ) ,(secreted typeאולם חלבונים ציטוזוליים או כאלה שנשארים מסיבה אחרת בתא ,אינם עוברים קיצור .כמו כן הוא מצא שהחלק העודף היה תמיד בקצה האמינו של החלבון ,ולכן הוא כינה אותו פפטיד מוביל ) ,(Leader Peptideשכן זה החלק שיוצא ראשון מהריבוזום. הפפטיד המוביל של חלבונים שונים הוא די דומה :הוא מכיל 20-25חומצות אמינו ,הידרופוביות בעיקר. זה לא אותו הרצף בכל חלבון אבל אופיו של הרצף דומה. סיכום הידע עד כה: • אנו יודעים שלאחר אקטיבציה ,תא יוצר כמויות גדולות של ERשמתפשט בציטופלזמה. • ישנם פוליזומים שקשורים ל ER-כלומר נעשה תרגום על ה.ER- • בתרגום במבחנה ,מקבלים חלבונים ארוכים יותר מאשר בתאים חיים אבל רק אם החלבונים הם מהסוג המופרש ).(secreted בלובל הסיק מכל הידע הזה כמה דברים: • ככל הנראה ההפרשה העודפת קשורה לגדילה ב ,ER-כלומר יש קשר בין ההפרשה לבין ה.ER- • חל תהליך עיבוד או שינוי בתאים המקצר את הפפטיד המוביל ,דבר שקורה בתאים חיים ולא במבחנה .יכול להיות שהדבר קשור לתרגום על גבי ה.ER- גיבוש היפוטזת האותות )(Signal Hypothesis על מנת לבדוק האם הדבר אכן קשור ל ,ER-ניתן לערוך ניסוי :כעת נערוך תרגום ,in-vitroכלומר במבחנה ,אולם הפעם הוא לא השתמש בפוליזומים חופשיים אלא על ידי פוליזומים מה .RER-הדבר נעשה לפי שיטתו של פאלאדה להפריד את חלקי ה- ERל SER-ול .RER-בעזרת פוליזומים הקשורים למיקרוזומים ,מקבלים למעשה חלבונים טבעיים – בצורתם כפי שמקבלים אותם בתאים .אם עושים את התרגום במבחנה עם פוליזומים מהRER- מקבלים חלבוים בדיוק כפי שהם נראים בתא .משמעות הדבר היא שככל הנראה העיבוד שנעשה על החלבונים האלה נעשה באופן כלשהו על ידי ה.ER- החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב 170 ביולוגיה של התא -הרצאות1 בעקבות כך הגיע מחקר שהוביל לתיאוריית ה .Signal Hypothesis-המודל הסופי שהובילה התיאוריה הוא כדלקמן: • • • • • גדיל mRNAמגיע ומתחיל תרגום של חלבון מופרש )מזוהה תודות לפפטיד המוביל(. קומפלקס של חלבונים המכונה ) signal recognition particleאו (SRPנקשר לחלבון המסונטז .הדבר משמש זיהוי לכך שהחלבון הזה הוא חלבון הפרשה .הקישרה ל SRP-גורמת לעצירה של התרגום. על הממברנה של ה ER-יש חלבון ממברנלי שהוא רצפטור של .SRPבעזרת הקשר בין SRP והרצפטור ,הריבוזום מצליח להיקשר לממברנה במיקום מדוייק בו קיימת גם תעלה המכונה תעלת טרנסלוקציה ).(translocation channel לאחר הקישור ה SRP-משתחרר מהרצפטור ומהריבוזום ,אולם כעת הריבוזום כבר מעוגן לתעלת הטרנסלוקציה. התרגום של החלבון נמשך אולם כעת הוא נעשה פנימה לתוך ה ER-דרך התעלה )תהליך ההכנסה של החלבון מכונה טרנסלוקציה ,מכאן שמה של התעלה(. בתחילה הריבוזום לא מזהה האם החלבון הוא חלבון הפרשה או לא; פפטיד הסיגנל ,כלומר הפפטיד המוביל ,הוא זה שנקשר ל SRP-הגורם למעשה לקשירה שלו ל .ER-למעשה הריבוזומים הקשורים הם ריבוזומים חופשיים אשר מעצם העובדה שהם מתרגמים חלבון מופרש נקשרו לממברנת ה.ER- התהליך הזה לא דורש אנרגיה למעט לצורך פירוק ה SRP-הצורך מולקולת .GTPללא ירידה של SRPלא ניתן להמשיך בתרגום. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :16הרשתית האנדופלזמטית- ER 171 טרנסלוקציה של חלבונים לתוך הER- בציור הבא הורידו את הריבוזום; אנחנו רואים את החלבון המתורגם בעודו נכנס לתעלת הטרנסלוקציה ב .ER-פפטיד הסיגנל נקשר לאיזור מסויים ייעודי בתעלה. כאשר התרגום ממשיך ,אנזים בממברנת ה ER-המכונה Signal Peptidaseאחראי על חיתוך החלבון בסמוך לפפטיד הסיגנל ,וכך למעשה משחרר את החלבון מהפפטיד סיגנל הכלוא בממברנה .כעת החלבון לא קשור יותר לממברנה .הפפטיד סיגנל עובר דגרדציה בממברנה. התרגום נמשך ,הטרנסלוקציה לתוך ה ER-נמשך ,ובסופו של דבר מתקבל חלבון מסיס בחלל ה.ER- החלבון הזה יהיה חלבון הפרשה .את אופן ההפרשה נכיר בשיעור הבא. חלקיק זיהוי הסיגנל )(SRP ה SRP-הוא קומפלקס של מספר חלבונים יחד עם מולקולה של RNAקצר ומיוחד שקיים רק בSRP- והוא RNAמבני המחבר בין החלבונים שבונים את .SRP ל SRP-יש כמה אתרים פונקציונאליים :האחד עוצר את התרגום ,אחר שנקשר לפפטיד-סיגנל ,ועוד איזור של ,GTPaseהאחראי על הידרוליזת ה GTP-בזמן שצריך לנתק את ה SRP-מהריבוזום. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 172 חלבון ממברנלי מטיפוס I מה קורה אם לאחר הטרנסלוקציה של החלבון ל ER-יופיע עוד איזור הידרופובי? האיזור הזה ייכנס לתעלת הטרנסלוקון ,ואז ייעצר שם .הפפטיד סיגנל ינותק על ידי האנזים, הריבוזום ימשיך בתרגום ,והתוצאה היא למעשה חלבון ממברנלי – חלבון שתקוע בממברנה ובולט משני קצותיה. שימו לב שיש כיווניות לחלבון מטיפוס זה :קצה אמיני פונה לתוך ה ER-וקצה קרבוקסילי פונה לציטופלזמה .הכיווניות הזו תישמר גם כשהחלבון יגיע לממברנה הייעודית שלו – קצה אמיני ייפנה לחוץ התא או תוך האברון הייעודי וקצה קרבוקסילי ייפנה לציטופלזמה. חלבון ממברנלי החוצה-פעמיים )(Double-Pass ומה אם הרצף ההידרופובי הראשון ,פפטיד הסיגנל ,הוא יותר downstreamמקצה האמינו של החלבון? רצף זה איננו פפטיד סיגנל אלא .start-transfer sequenceרצף זה אינו עובר חיתוך על ידי סיגנל-פפטידאז. בצורה זו החלבון נשאר עם שני איזורים שחוצים את הממברנה .התוצאה היא חלבונים ממברנלי עם שני איזורים חוצי-ממברנה. חלבוני ממברנה מטיפוס II במקרה שלישי ,החלבון שמכיל start ,transfer sequenceאולם אין לו רצף הידרופובי שני .כתוצאה מכך התרגום יכול להמשיך פנימה לתוך ה ,ER-כך שבסופו של דבר הקצה הקרבוקסי יהיה זה שייפנה לתוך ה ;lumen-זאת לעומת המקרה הראשון שראינו של חלבון ממברנלי מסוג ,Iאשר בו נמצא קצה האמינו בתוך ה.lumen- חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :16הרשתית האנדופלזמטית- ER 173 חלבון טרנס-ממברנלי שחוצה מספר פעמים )(Multi-Pass במקרה זה ,יש לנו start transferוstop - ,transferאולם בהמשך של הרצף יש עוד איזורים הידרופוביים – עוד איזורי .start/stop transferכתוצאה מקבלים עוד איזור טרנסלוקציה ובסופו של דבר מקבלים חלבון שחוצה את הממברנה כמה פעמים – בדוגמה הוא חוצה ארבע פעמים ,אבל זה יכול להמשיך עוד ועוד .כתוצאה מכך מקבלים חלבון שחוצה את הממברנה מספר פעמים ) = multipathלמעלה מ 3-פעמים ,עד 12פעמים זה די נפוץ(. חלבונים ממברנליים וחלבונים הפרשה עוברים תחילה טרנסלוקציה לתוך ה ER-לפניש יגיעו ליעדם הסופי ,כמו הממברנה הפלזמטית או הפרשה לנוזל החוץ-תאי .כל החלבונים האלו יחד מכונים .secretary proteins השליחה ליעד – Vesicular Transport משמאל סכמה כללית של חתך תא .אנו רואים את ה ER-שהיא המשכית לממברנה הגרעינית ,ובהמשך הדרך מופיע הגולג'י .החלבונים שהיו ב – ER-בין שהם מסיסים מופרשים או ממברנליים – יוצאים בווזיקולות מתוך ה ER-ונישאים הלאה ,בין שישירות אל הממברנה התאית ובין שעוברים בדרך אברונים אחרים. המעבר הוא אינו ישיר לחלוטין ,שכן תחנה חשובה של כל החלבונים הוא קומפלקס הגולג'י ,עליו נדבר בשיעור הבא. השינויים שמתרחשים בחלבונים במשך ולאחר התרגום • – Proper Folding/ Quality Controlאחד מהשינויים שנעשים הוא קיבול של החלבון; החלבון מסונטז ונכנס ל ER-ברצף ראשוני אבל הוא לא מקופל .קיימת מערכת שלמה של בקרת איכות לקיפול של החלבון ,כי צורתו השלישונית של החלבון חשובה לשם פעילותו. • יצירת קשרי – SSתהליכים אלו מתרחשים ב ER-במשך התרגום ,אפילו לפני שהוא מסתיים. קשרים אלו משמשים שוב לייצוב הקיפול של החלבון. • גליקוזילאציה – רוב החלבונים שהם חלבוני הפרשה – ממברנלים או מופרשים לחוץ התא – הם גליקופרוטאינים ,כלומר מכילים סוכרים. • הרכבה של חלבונים מולטימרים – חלבונים שבנויים מכמה תת יחידות. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 174 הקיפול נעשה על ידי שאפרונים בקיפול מעורבים חלבוני השפרון ) .(chaperonsבאיור משמאל ניתן לראות ERעם חלבון בתהליך טרנסלוקציה .בתחילת דרכו ,החלבון כאמור אינו מקופל .מצב זה הוא בעייתי :לכל חלבון יש איזורים הידרופוביים שאינם ארוכים מספיק כדי לחצות את הממברנה ולכן הם יוצאים החוצה אבל הם בעייתי ,כי הם אינם יכולים להישאר חשופים לציטוזול. כתוצאה מהחשיפה הזו הם עשויים להיפגש עם חלבון אחר שיש לו איזורים הידרופובים חשופים ועקב כך הם מתחברים אחד לשני – שלא בכוונה! – וכך נוצרים אגרגטים ,תוצר מאוד רע לתא .על מנת להגן מתופעת האגרגציה מגיעים השאפרונים :השאפרונים נקשרים לאיזורים ההידרופובים ומונעים אגרגציה ,קשירתו לחלבונים מסונטזים אחרים .כמו כן הם משמשים לעזרה בקיפול האיזורים האחרים של החלבון. לאחר שהחלבון מקופל השאפרון משתחרר והחלבון יכול לצאת בוזיקולה לכיוון יעדו הסופי. מה קורה עם חלבונים ציטוזוליים או גרעיניים ,שאינם עוברים תהליך עיבוד ב ?ER-חלבונים שכאלה נוצרים על ידי פוליזומים חופשיים ,כלומר הם מסונטזים בציטוזול ללא קישור ל .ER-גם בציטוזול יש שאפרונים מסוג אחר המיועדים לקיפול חלבונים ציטוזולים או גרעיניים שנוצרים על ידי פוליזומים חופשיים. בקרת איכות על ידי שפרונים לפעמים מתרחש תהליך של שגיאה בקיפול של החלבון ) .(misfoldingבמצבים כאלה שוב באים השאפרונים לעזרה. השאפרונים נקשרים לחלבון שאינו מקופל נכון תודות לעובדה שלחלבון כזה לרוב יש איזורים הידרופוביים חשופים. השאפרון מונע מהחלבון הזה מלצאת בוזיקולה ,על מנת שיוכל להישאר ולעבור תיקון; השאפרון עוזר גם לתהליך של קיפול מחדש .אם התהליך מצליח מתקבל חלבון בקיפול נכון ,ואז ניתן לשחררו בוזיקולה; אם לא צריך לשלוח את החלבון לפירוק בתהליך שנכיר בשיעור הבא. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :16הרשתית האנדופלזמטית- ER 175 יצירת קשרי SS בתהליך זה מעורב אנזים ,(protein disulfide isomerase) PDIשהוא איסומראז .באיור ניתן לראות בכחול חלבון עם שני ציסטאינים במצב מחוזר ,ללא קשר .SSחלבון PDIמכיל קשר SSבתוך האנזים עצמו. קשר ה SS-של ה PDI-נפתח ,ונוצר קשר זמני עם אחד הציסטאינים של החלבון .בהמשך הקשר הזה נפתח ונוצר קשר SSבין הציסטאינים של החלבון המעובד עצמו .כעת מתקבל אנזים PDIמחוזר ,שאין בו קשר ,SSוחלבון מעובד שיש לו קשר SSבמקום הציסטאינים המחוזרים .זוהי תגובת – RedOx חימצון חיזור. שמו של החלבון ,איסומראז ,נובע מכך שלעיתים קשרי SSלא נכונים נוצרים בחלבונים ,דבר הנגרם עקב או גורם לקיפול לא נכון של החלבון .כאשר PDIחצי-מחוזר מגיע לחלבון שכזה הוא פותח את קשרי ה- SSומאפשר קשירה בין ציסטאינים אחרים ,מתאימים יותר .תהליך זה מאפשר שוב בקרת איכות לקיפול של החלבון. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 176 06.05.2010 שיעור :17הגולג'י כפי שציינו ב ,ER-לפני שהחלבונים מגיעים ליעדם הם עוברים דרך הגולג'י .אולם כדי לצאת מהER- ולהגיע בכלל לגולג'י ,החלבונים עוברים ביקורות איכות וקיפול נכון; ישנם תהליכים נוספים – כמו יצירת קשרי סולפיד ,הוספת סוכרים והרכבת חלבונים מולטימריים – בהם ניגע מעט בשיעור זה. הוספת סוכרים לרוב חלבוני ההפרשה יש קבוצות סוכרים. האפשרות לקשור סוכרים נעשית דרך חומצות ספציפיות מסויימות .ביניהן נמצאת האספרגין, שיש לה קבוצה של אמינו וקרבוניל ,והיא נקשרת לסוכר מסוג N-acetylglucos- ,amineסוכר שיש לו אמין ) (NHבמקום קבוצת OHשמחובר לאצטיל ).(CH3CO הקשר נוצר בין סוכר לשייר של האספרגין, לאטום החנקן של קבוצת האמין שלו ,ולכן זה נקרא .N-link קשר נוסף הוא בין סרין או טריאונין, להיקשר שיכולים גם acetylglucosammine לסוכרים אחרים )זאת לN-- אבל גם להבדיל מהאספרגין( דרך הסוכר ).(O-link הריאקציה שבין הסוכר לחומצת אמינו ריאקצית היא דחיסה ) .(condensationהקשירה של סרין וטריאונין לN-acetylglucosamine- נעשית בציטוזול; קשירה לסוכרים אחרים נעשית רק בתוך הגולג'י. • • • הקשירה של הסוכר לאספרגין מכונה N-Glycosylationכי הקשירה היא לחנקן .צורה זו יכולה להיעשות רק לחלבוני הפרשה. הקשירה של הסוכר לסרין/טריונין מכונה ,O-Glycosylationכי נקשר לחמצן .צורה זו נעשית לכל החלבונים – הפרשה וציטוזוליים/גרעיניים. רוב חלבוני ההפרשה הם גליקופרוטאינים ,והם לרוב מסוג Nמבחינת קשירת הסוכר שלהם. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :17הגולג'י 177 גליקופרוטאין עם קשר N-Linked הסוכר יכול להתחבר לאספרגין רק אם האספרגין מופיע ברצף מסויים ,כמופיע באיור .הסוכר הוא אוליגוסאכאריד ,שרשרת של מספר סוכרים .לאחר ההוספה לחלבון יש קשר קוולנטי ,ולכן הסוכר למעשה מהווה חלק בלתי נפרד מהמולקולה; לפיכך חלק זה מכונה האיזור הגליקו-מוייטי ).(Glyco-moiety הרכיב הפרוטאיני מכונה כאמור גליאו- פרוטאין ).(Glycoprotein הדגמה :הכנת חלבון חוצה ממברנה עם N-glycosylation הפפטיד מסונטז לתוך ה ,ER-כפי שכבר למדנו; הסוכר קשור לליפיד שנמצא בתוך הממברנה בקשר דו-פוספטי .הרצף N X S/T של החלבוןמתחיל להיסנטז ,ונמצא בתוך התעלה; כשהוא יוצ tהוא מזוהה על ידי אנזים שקיים בתוך ה lumen-של ה ;ER-עם הזיהוי האנזים הזה יוצר קשר בין הסוכר לחלבון המסונטז. לואיס ללואר – גילה את הנוקליאוטידים הקשורים לסוכר ומעורבותם במנגנון בשביל להוסיף סוכר למולקולה אחרת ,בין שהיא חלבון או מסוגים אחרים ,צריך לאקטב את מולקולת הסוכר .האקטיבציה נעשית על ידי קישור למולקולת נוקליאוטיד .במקרה של N-acetylglucosamine הנוקליאוטיד יהיה אורציל מסוג .UTP לכל סוג סוכר יש נוקליאוטיד משלו האחראי על האקטיבציה. תוך שחרור של פוספט אחד ,נוצר קשר קוולנטי בית הסוכר ל UTP-כך שמתקבלת מולקולה UDP-N- acetylglucosamineאו בקיצור UDP-GlcNAc )מבוטא :-יו-די-פי-גלוק-נאק(. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 178 גליקוליזה של סוכרים לאחר הקשירה מגיע אנזים אחר שמוסיף את הסוכר לסוכר חופשי שכבר קיים; עם הוספה משתחרר ה- .UDPריאקציה זו היא למעשה הגליקוזילציה ,שבה אנו מקבלים פולימריזציה של סוכרים – ממונומר אחד קיבלנו דימר ,מדימר טרימר וכן הלאה .אנזימים אלו ,שמעבירים סוכרים ,מכונים גליקוזיל-טראנספראז .התוצר שלהם הוא אוליגוסאכארידים ופוליסאכארידים .גליקוזיל-טראנספראז יכולים לפלמר מונומרים של סוכרים שונים או את אותו הסוכר שוב ושוב. שימו לב :מאותו רצף סוכרים ניתן להרכיב אוליגונוקליאוטידים רבים ושונים ,ראשית מכיון שיש אלפא -או בטא-סוכר ,ושנית מכיוון שהם יכולים להיבדל ביניהם בהסתעפויות )זיכרו כי זוהי המאקרומולקולה היחידה שלמדנו עליה שהיא מסועפת ולא בהכרח לינארית(. כמו שגליקוזילציה יכולה להיעשות למולקולות שונות ניתן לעשות גליקוזילציה לליפיד; במקרה כזה מתקבל הגליקוליפיד .הסוכר עם ה UDP-מגיע לליפיד, יוצר קשר ומתקבל גליקוליפיד .האנזים היוצר את הקשר הוא מאותה משפחה – גליקוזיל-טראנספראז. גליקוליזה של סוכרים לגליקופרוטאינים בER- בחיבור הסוכר לגליקופרוטאינים ,הסוכר הממתין מחובר לליפיד בצד ה lumen-של הממברנה .הליפיד הקושר מכונה dolicholוהוא קשור לסוכר דרך שני פוספטים – ולכן מכונה .dolichol disphosphateעל גבי הסוכר הזה נבנית שרשרת האוליגוסאכאריד. האוליגוסאכאריד הזה מיוחד ,כי הוא זהה במרבית האאוקריוטיים – בין שהם שמרים או בני אדם – מבחינת המבנה שלו .השמירה הגבוהה מעידה על חשיבות הרצף .המבנה הוא שני אצטיל-גלוקוזאמינים ,תשעה מאנוזים ושלושה גלוקוזים. הסוכר הזה שמור מאוד כי המנגנון שמור; אחר כך יהיו מודיפיקציות לסוכר הזה והוא יקבל צורות שונות בהמשך ,במהלך עיבודו בגולג'י. לאחר שיוצא אתר הקישור מהתעלה ,האנזים המתאים מעביר את הסוכר מהדוליכול דיפוספט לאספרגין .בצורה זו מקבלים N-linked .glycoprotein האיור בעמוד הבא מראה אילוסטרציה של תהליכי העיבוד שעובר החלבון בתוך ה ,ER-החל מהסינטזה ועד שיוצא בוזיקולה אל הגולג'י. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :17הגולג'י 179 תגובת ה ER-לחלבונים בקיפול שגוי בעיות בקיפול יכולות להיות ענייני דינאטורציה אבל על אלו ניתן להתגבר בעזרת השאפרונים; לעומת זאת ,אם היה שינוי ברצף הלינארי של החלבון עקב מוטציה בגנום שמונעת ממנו להתקפל כראוי ,החלבון ישלח מתוך ה ER-לדגרדציה בפרוטאוזום כי בעיית הקיפול תהיה בלתי-פתירה .43מכיוון שהפרוטאוזום נמצא בציטוזול ,היציאה של החלבון נעשית דרך תעלות – לא בעזרת וזיקולות – ואם ההכנסה של החלבון בסינטזה שלו מכונה טרנסלוקציה ,היציאה של חלבון לא מקופל כראוי תיעשה על ידי רטרו- טרנסלוקציה .ישנה שרשרת של אנזימים וחלבונים שאחראים על שליחת החלבון לדגרדציה. במחלות גנטיות רבות ,החלבון הלא-מקופל המוטנט עשוי להצטבר – כי התרגום שלו ממשיך ,למרות שהמערכת מנסה להיפטר ממנו ב .ER-כל עוד השאפרונים לא "איבדו תקווה" ועדיין מנסים לקפל את החלבון המוטנט ,החלבונים המוטנטים מצטברים בתא ויכולים ליצור אגרגטים. 43שימו לב :כאשר ה ER-מזהה חלבון שאינו מקופל כראוי הוא אינו "יודע" שהחלבון הוא מוטנט :השאפרונים ינסו במשך זמן מה לתקן את החלבון ורק אם לא יצליחו אז תופעל התגובה המוסברת בהמשך .משום כך יכולים להצטבר ב ER-חלבונים בקיפול שגוי ,כפי שנראה בהמשך. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 180 במצב זה חלבונים יש ממברנליים ב ER-שחשים מצב של חלבונים לא מקופלים, ומגיבים בתגובת unfolded- .protein responseבתגובה זו החלבון הלא-מקופל מתחבר לחלבון הממברנלי וגורם לאקטיבציה החלבון של הממברנלי. בצידו החלבון הציטוזולי, הממברנלי עושה אקטיבציה של פקטור שיעתוק. השיעתוק מגיע פקטור מהציטוזול לגרעין ,שם הוא נקשר לגנים מסויימים וגורם לשיעתוק .הגנים האלה הם גנים שמקודדים לשאפרונים ותרגום של mRNAשלהם, וכך מקבלים מולקולות שאפרונים חדשות .מולקולות אלו הן כוח עזר לשאפרונים של ה ER-כנגד החלבונים הלא מקופלים המצטברים בתוך ה.ER- דבר נוסף שקיים ב ER-הם יוני סידן; הסידן הוא חשוב מאוד לתהליכים שונים בתא והוא נשמר בריכוז אפסי בתוך הציטוזול .על מנת לוודא הפרשה מהירה של סידן במידת הצורך ,ישנם מאגרים עצומים של סידן בתא. הולכה וזיקולארית החלבונים יוצאים מתוך ה ER-בוזיקולות; התחנה הראשונה שלהם היא הגולג'י .מתוכו יוצאות וזיקולות מלאות שחלבונים שהולכות לממברנה הפלזמטית להפרשה ,או לאברונים וממברנה בתור חלבונים ממברנליים. קמילו גולג'י – שיטה לצביעת תאי עצב בשיטה של גולג'י לצביעת נוירונים ,הוא ראה רשת חוץ תאית של נוירונים וראה גם רשת תוך-תאית. כשחקרו את הרשת הזו ואת תפקידיה הם גילו למעשה את מה שמוכר כיום כאברון הגולג'י. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :17הגולג'י 181 השוואה לעומת ER • הגולג'י מתרכז הצנטרוזום, באיזור ומוחזר למיקרוטובולי על ידי דינאינים. זאת לעומת ה ER-שנעה על ידי קינזינים הרחק מהגרעין. • בעוד שה ER-מחוברת כולה ,הגולג'י מורכב ממדורים נפרדים ,כמו צלחות המונחות אחת על השנייה .משום כך הגולג'י מכונה .Golgi Stack הגולג'י מעבד סוכרים של גליקופרוטאינים ושולח אותם ליעדם הסופי פירוק שרשרת הסוכרים הבסיסית והרכבת שרשרת חדשה באיור אנו רואים גליקופרוטאין שעבר .n-glycosylation לאחר שקיבלנו חלבון ממברנלי )בדוגמה( שיש לו סוכר בחלל ה- ,ERהחלבון עובר לגולג'י. בגולג'י ,בצד הלומינלי )איפה שהסוכרים( יש הסרה של רוב סוכרי השרשרת ,ונשארים רק כמה סוכרים בודדים הקשורים לאספרגין. לאחר הסרה זו יש הוספה-מחדש של סוכרים אחרים ,שהם פחות שמורים בין היצורים האאוקריוטיים. הסוכרים הנוספים הם עוד גלוק-נאק, גלאקטוז ו ,NANA-חומצה סיאלית. היה המקורי האוליגוסאכאריד הפריקורסור והוא יחיד ואחיד; אולם השינויים האלו שנעשים בגולג'י משתנים – אפשר להוסיף מספרים שונים של מונומרים מכל סוג ,אפשר מספר ענפים שונה וכדומה .השינויים האלה הם לא רק בין גליאופרוטאינים שונים אלא גם מולקולות החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 182 שונות של אותו הגליקופרוטאין יכולות לעבור שינויים קלים .השינויים האלו מכונים ההטרוגניות של הסוכרים .השינויים במבני הסוכרים חשובים כי הם מהווים סיגנלים לשליחת הגליקופרוטאין למטרות סופיות שונות – סוכרים מסויימים שולחים אותו לממברנה פלזמטית ואחרים יישלחו אותו לליזוזום, למשל. לפני השינויים הסוכר היה ;high-mannose type oligosaccharideלאחר השינויים הוא משתנה לסוכר מסוג .complex type oligosaccharide תהליך הגליקוזילציה של הוספת סוכרים בגולג'י התהליך זהה לחלוטין ל – ER-בעזרת סוכר המחובר ל- UDPיש הוספה של הסוכר תוך שחרור .UDPשימו לב שסוכרים שאינםפ גלוק-נאק יכולים להגיע עם מטבע אנרגטי שונה ,נוקליאוטיד שונה שמאקטב אותו .גם בER- יש הבדלים ,אולם לכל סוכר יש נוקליאוטיד שלו – לא משנה היכן הוא נמצא. חלבונים ציטוזוליים או גרעיניים לא עוברים שינויים אלו כי הם לא נכנסים ל ER-מלכתחילה. צד ציס וצד טראנס צד ציס של הגולג'י הוא הצד שפונה ל ;ER-הוזיקולות הנכנסות מה ER-נכנסות לצד זה .הצד הנגדי הוא צד transשהוא הצד ממנו יוצאות וזיקולות הלאה .מספר הצלחות של הגולג'י יכול להשתנות ,אבל הקצוות האלו לא משתנים. בצד cisיש איזור עם צינורות במקום צלחות – איזור זה מכונה במספר שמות: • )cis-Golgi Network (CGN • )Vesicular-Tubular Clusters (VTC • ERGIC – ER to Golgi Intermediate .Compantment לקצה הטראנס יש רק שם יחיד – trans-Golgi ) .Network (TGNהוזיקולות היוצאות מקצה זה הן וזיקולות הפרשה. המדורים של הגולג'י • המדור הראשון הוא מדור של זירחון .אם החלבון מיועד לקבל זירחון ,הוא יעבור טיפול במדור זה. • הסרה של המאנוז – הסוכרים הראשוניים חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :17הגולג'י 183 שהוספו ב.ER- • הוספה של גלוק-נאק. • הוספה של גאלאקטוז. • הוספה של NANA אנחנו יכולים לראות שתודות לסדר המדורים ,ההוספה של הסוכרים יוצרת סדר מסויים של אוליגוסאכארידים – אומנם כמויות המונומרים המתווספות וצורתן יכולות להשתנות ,אולם הסדר של גלוק-נאק, גלאקטוז ורק בסוף NANAהוא קבוע. מעבר בוזיקולות – Vesicular Transportמה ER-לגולג'י ברצף התמונות משמאל אנחנו רואים חתך של ה ;ER-הנקודות האדומות מסמלות חלבונים .ה ER-מנץ מתוכו וזיקולה ,אשר עוברת בתוך הציטוזול ומכילה חלבונים מה ,ER-מגיעה עד הגולג'י שם היא עוברת איחוי עם ממברנת הגולג'י ומכניסה לתוכו את החלבונים שנשאה. הציפוי של הוזיקולות אנחנו רואים שיש חלבונים ממברנליים שונים שמהווים את הציפוי של הוזיקולה; ישנם חלבונים שונים בין החלבונים שיוצרים וזיקולות ב,ER- וזיקולות מה CGN-או וזיקולות מה.TGN- פעולת חלבוני הציפוי והנצת וזיקולות הנצה של וזיקולות נעשית אך ורק תודות לציפוי החלבוני שקיים בממברנה שתיצור את הוזיקולה .התהליך הזה מורכ במאוד ,אנחנו נזכיר חלק מהחלבוני החשובים. הראשון ביניהם הוא Sar1שהוא חלבון שנקשר לחלבון ממברנלי .בקשירה Sar1 ,עובר אקטיבציה על ידי קישור ל- .GTPעם הקשירה הזו הוא מגייס תת-יחידות של COP-II החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 184 )במקרה של ה (ER-לאיזור הצד הציטוזולי של ה .ERתת היחידות נקשרות לרצפטורים שפונים לצד הציטוזולי. הרצפטורים האלה קשורים מצד אחד לתוך הצד הלומינלי של ERוכך הם מזהים ותופסים את חלבוני ההפרשה המיועדים להיות בוזיקולה; בסופו של דבר יש ניתוק של הוזיקולה ככל שתת היחידות נצברות סביב וצובטות מתוכה טיפות. הוזיקולה נעה על גבי המיקרוטובולי בעזרת חלבון מנוע מסוג דינאין ,אל הגולג'י שבצנטרוזום .בשלב הבא יש – uncoatingהסרה של הציפור בעזרת הידרוליזה של ה- GTPשקשור ל .Sar1-ההידרוליזה גורמת להסרה של הציפוי ,וכעת הן פנויות לשימוש מחדש .הוזיקולה המתקבלת מכונה וזיקולה עירומה. הוזיקולה העירומה יכולה לעבור איחוי עם ממברנת הגולג'י. האיחוי נעשה על ידי שני חלבוני v-SNARE :SNAREאו .t-SNAREהללו מעגנים את הוזיקולה לגולג'י על מנת לאפשר איחוי .בסופו של דבר יש ,כאמור ,איחוי של הממברנה עם הוזיקולה .לאחר האיחוי ,החלבונים האחוזים ברצפטורים שלהם משתחרים לתוך הגולג'י ומתפנים לטיפולים של הגולג'י. יצירה של שומנים בתא נעשית ב .SER-כך נוצרות אבני היסוד של הממברנות .בצורה זו הממברנה של הER- משחזרת את עצמה ,ויכולה להעביר ליפידים וחומרים אחרים לממברנות האחרות בתא .חלבונים אינם בעלי אותו הרכב אבל הם יודעים לחזור למקום שבו הם צריכים להיות. לכל וזיקולה יש v-SNAREשונה. כל v-SNAREשונה מזוהה על ידי t-SNAREשונה ,על אברון שונה, וכך וזיקולות מסויימות מאוד יהיו אלו שיעוגנו לאברון מסויים .מנגנון זה הוא אחד החשובים במתן ספציפיות למטרות של הוזיקולות. התנועה חזרה מהגולג'י לER- למעט הולכה מה ER-לגולג'י והלאה ממנו בעזרת ,COP IIישנה גם חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :17הגולג'י 185 תנועה חזרה מהגולג'י ל ER-של וזיקולות .הדבר נעשה על מנת להחזיר חומרים אל ה – ER-ממברנה )למרות שהיא מייצרת אותה אז היא פחות צריכה אותה( ויותר מכך חלבונים ממברנליים השייכים לER- וחלבונים אחרים – כמו שאפרונים – שייתכן שחמקו פנימה לתוך הוזיקולה. חלבונים השייכים ל ER-מכילים רצף המכונה .KDELהרצף הזה מזוהה על ידי רצפטורים של הגולג'י ,אשר מצידם הציטוזולי מסוגלים להיקשר לחלבונים ה- ,COP-I Coatשהם אלו שיוצרים וזיקולה שתגיע מהגולג'י ל.ER- העברה של חלבונים ממברנליים חלבונים ממברנליים עוברים באותו האופן אולם בעוד שחלבוני הפרשה עוברים בתוך הממברנה שיוצרת את הוזיקולה ,החלבונים הממברנליים עוברים על גבי אותה ממברנה. לאחר העריכה בגולג'י שוב נשלחת הוזיקולה אל הממברנה הפלזמטית .שימו לב שלאורך כל הדרך הסוכירם פונים לחלל הלומינלי ,וגם כעת הם א עוברים לפנות לציטוזול – כלומר הם פונים לצד החוץ-תאי .משום כך גליקופרוטאינים תמיד מפנים את הסוכרים לצד החוץ-תאי .המקרה היחיד יוצא מהכלל הוא הוספה n-glycosylationלסרין או טריונין בלבד של חלבונים ציטוזוליים או גרעיניים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב 186 חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :18אנדוציטוזיס וליזוזומים 187 10.05.2010 שיעור :18אנדוציטוזיס וליזוזומים • אנדוציטוזיס – המילה נובעת מ"הולכה" ו"פנימה" – הולכה וזיקולארית לתוך התא. • הליזוזום – זהו אברון המשמש איבר העיכול של התא .מקור השם מהמילה "ליזו" – "שבירה". הליזוזום מכיל סביבה חומצית מאוד בה פעילים אנזימים מפרקים המפרקים חומרים שונים המובלים לתוכו בתהליך של אנדוציטוזה – על ידי הובלה וזיקולארית. בסכמה אנו רואים את ההולכה של הוזיקולות – מהרשתית האנדו- פלזמטית ,דרך הגולג'י ואל הממברנה הפלזמטית. חלבונים ממברנליים או מסיסים נוצרים ב ER-ומגיעים בסופו של דבר לממברנה הפלזמטית להפרשה או לשמש כחלבוני ממברנה .ההולכה הוזיקולארית משמשת להעברת חלבונים לאברונים אחרים. בריבוע אנו רואים חיצים ירוקים בכיוון ההפוך – וזיקולות הנכנסות מהממברנה הפלזמטית לאברון האנדוזום ,המשמש כשער הכניסה לתא של חלבונים ממברנליים ורכיבים חוץ-תאיים. אנדוציטוזה בממברנה הפלסמטית יש הנצה של וזיקולה – כמו שראינו בהולכה וזיקולארית מה ER-לגולג'י – בתהליך המכונה .invaginationההנצה הופכת לוזיקולה המגיעה לאברון מטרה ,עימו היא עוברת איחוי. זהו התיאור הכללי תהליך האנדוציטוזה .הוא אינו ספציפי לחומרים מסויימים .ישנו תהליך ספציפי בתוך תהליך כללי זה המכונה פינוציטוזה ) .(Pinocytosisזהו תהליך ה"שתייה" של התא – הכנסה של נוזל חוץ תאי .המטרה העיקרית של תהליך זה היא להחזיר ממברנות לתוך התא. מדוע צריך להחזיר ממברנות? הסיבה היא שכל הזמן יש יציאה של ממברנה בתהליכי ההפרשה – הממברנה הפלזמטית גדלה כל הזמן באופן זה וצריך להחזיר חתיכות פנימה על מנת לשמור על גודל התא ועל הממברנה של האברונים .מדי חצי שעה כל הממברנה הפלזמטית מתחלפת. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 188 פאגוציטוזה )סוג אחר של אנדוציטוזה( פאגוציטוזה היא תהליך של אכילה – התא אוכל חומרים שונים ,בין שהם חומרי הזנה כמו חומצות אמינו ,סוכרים וחומצות גרעין ובין שהם חומרים המיועדים לפירוק – כמו תאי הדם הלבנים האוכלים חיידקים .חיידקים מוקפים בממברנה של התא הבולען ומובלים בוזיקולה לתוך ליזוזום ,שם הפתוגן יפורק. משמאל :תא דם לבן המזהה פתוגן יכול לקשור את החיידק ולבלוע אותו בתהליך הפגוציטוזה. ניתן לראות כמה צמודה ממברנת התא לממברנת החיידק – ואכן יש רצפטורים בממברנה של תא הדם הלבן שמזהים חלבונים ממברנלים המצויים על פני החיידק. למטה :פאגוציטוזה של תא לבן על ידי מיקרוסקופ אלקטרוני .התא בולע כדורי לייטקס – הוא נקשר לגוף הזר ובולע את החלקיק .במקרה זה הוא לא יכול לפרק את הגומי ,אבל אי אפשר להאשים אותו בכך שלא ניסה. אנדוציטוזה מתווכת על ידי רצפטורים בסוג זה של אנדוציטוזה יש צורך ברצפטורים ,על מנת לזהות את המטרה .באיור בעמוד הבא ,התמונה השמאלית מראה רצפטורים על גבי ממברנה – החלק השחור מופיע כך עקב צפיפות החלבונים. בתמונה הבאה רואים המשך ההנצה – האינווגינציה .הרצפטורים נקשרים לחלבונים שבאי מן החוץ ויוצרים ציפוי-פנימי של הוזיקולה .בחלקה החיצוני של הוזיקולה )שפונה לציטוזול( יש ציפוי קלאטרין ) ,(clathrinשהוא חלבון הציפוי המשמש לתהליך האנדוציטוזה. בהמשך הוזיקולה נסגרת אך עדיין קשורה לממברנה ,ובסופו של דבר היא מתנתקת מהממברנה ואנחנו מקבלים וזיקולה מצופת-קלאטרין .הוזיקולה מכיל חומר חוץ תאי ומוקפת בציטוזול. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :18אנדוציטוזיס וליזוזומים 189 מבנה הקלאטרין הקלאטרין בונה מעין .clathrin-cageחלבון בודד הוא בעל מבנה של שלוש זרועות ,צורה ייחודית המכונה .triskelionהצורה בנויה למעשה מטרימר – שלוש מולקולות של קלאטרין. הטרימרים נכנסים למבנה הכלוב על ידי קשירה בין טרימרים שונים ,עד שהם יוצרים בסופו של דבר את הכלוב )התמונה משמאל בנויה על בסיס קריסטלוגרפיה של החלבון(. בתמונה של מיקרוסקופ אלקטרוני סורק, ניתן לראות את כלובי הקלאטרין על גבי הממברנה .כל כלוב שכזה הוא למעשה ציפוי של וזיקולה בודדת – הממברנה של הזויקולה "כלואה" בתוך כלוב הקלאטרין. תהליך הנצה בעזרת קלאטרין מטען מהתווך החוץ תאי נקלט על ידי רצפטורים הפונים לתווך .חלבוני adaptinנקשרים לזנב הציטוזולי של אותם רצפטורים .לאחר מכן אדאפטין מגייס את ציפוי הקלאטרין .הטרימר של קלאטרין מסומן באיור בירוק. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 190 בכל קצה של טרימר יש איזור גלובולארי )כפי שניתן לראות באיור משמאל( אשר הוא זה שנקשר לאדאפטין .על כל אדאפטין נקשר גם רצפטור ממברנלי ,יחד עם המטען שהוא נושא מהתווך החוץ-תאי .כל טרימר נקשר לשלושה אדאפטינים ולכן מחזיק שלושה רצפטורים. ככל שנצטברים יותר קלאטרינים ,הם יוצרים יחד את מבנה הכלוב )כפי שניתן לראות באיור התלת מימדי( וככל שהכלוב מתגבש מתחילה ההנצה של הממברנה. לאחר יצירת הכלוב מגיע חלבון בשם דינאמין ,אשר חונק את הממברנה המחברת את הוזיקולה ,ובעזרת הידרוליזה יש חניקה סופית וניתוק לש הוזיקולה מהממברנה הציטופלסטית .תהליך זה מכונה ") "pinching offצביטה( .לאחר מכן הוזיקולה עוברת תהליך uncoatingאשר מופעל על ידי הידרוליזה של ) ATPסדר האיורים מימין לשמאל(. כעת הוזיקולה ממשיכה לכיוון אברון המטרה ,במקרה זה האנדוזום .היא מעוגנת על ידי חלבון ה SNARE-ומתחילה באיחוי והפרשה של החלבונים שנלכדו לתוך התווך של האנדוזום. לרצפטורים בתהליך אנדוציטוזה מסוג זה יש תפקיד מאוד חשוב – בלעדיהם לא הייתה יכולה להיות הנצה .פגיעה ביכולת הקליטה שלהם או ביכולת הקשירה שלהם לאדאפטין תיפגע שיכולת הנצת הוזיקולה ועל ידי כך בתהליך האנדוציטוזה במסלול זה. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :18אנדוציטוזיס וליזוזומים 191 מה קורה אחרי האנדוציטוזה הוזיקולה מגיעה ,כאמור ,לאנדוזום המוקדם; ישנם כמה תהליכים שיכולים לקרות: • – Recyclingחזרה של וזיקולות מהאנדוזום המוקדם לממברנה הפלזמטית. • – Degredationוזיקולה מהאנדוזום תישלח לליזוזום ,שם כל תכולתה תפורק על ידי אנזימי הפירוק. • – Transcytosisהעברה של חומרים מקצה אחד של התא לקצה שני ,חשוב מאוד בתאים פולאריים דוגמת תאי האפיתל .הסיבה להעברה כזו נובעת מאיזושהי חסימה בממברנה שמונעת ספיחה של חומרים מאיזורים אחרים בממברנה )דבר שנעשה כחלק מקיטוב התא(. בקרה של מטאבוליזם הכולסטרול באיור משמאל ניתן לראות את מולקולת הכולסטרול – מולקולה הידרופובית ברובה למעט הידרוקסיל הנמצא בראשה .מכיוון שכולסטרול הוא הידרופיל בעיקרו ,הוא לא יכול לנוע בזרם הדם באופן חופשי .משום כך ,יש חלקיקים הקושרים את הכולסטרול ומקיפים אותו – חלבונים שמפנים צד הידרופילי כלפי חוץ וצד הידרופובי כלפי הכולסטרול. באופן זה מתאפשרת הולכה של כולסטרול או מולקולות דומות )במנגנונים דומים( בזרם הדם. החלקיק הזה מכונה – LDLליפופרוטאין מצפיפות נמוכה .צפיפות החלקיק היא נמוכה כי לשומנים יש צפיפות נמוכה ,באופן כללי .לחלקיק השלם של ה LDL-יש רצפטור .LDL-Receptor ,הוא קיים בכל התאים ונקשר לחלקיקי LDLשמגיעים מזרם הדם בצד החוץ-תאי. הרצפטורים מכניסים את ה LDL-בעזרת מנגנון האנדוציטוזה המתווך על ידי רצפטורים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 192 וזיקולות של LDLמגיעות לאנדוזום .מהאנדוזום יש הולכה וזיקולארית לליזוזומים כדי לפרק את ה- ,LDLאולם אנו לא רוצים לפרק את הרצפטורים; ולכן הרצפטורים חוזרים בתהליך של מיחזור אל הממברנה הפלזמטית. כיצד ניתן לעשות את ההפרדה הזו? באנדוזום יש ערך גבה נמוך ,5.5 ,אשר גורם לשינוי קונפורמטיבי של הרצפטור – כך שיש הפרדה בין LDLוהרצפטור שלנו .ה LDL-הולך לאיזור מסויים באנדוזום ממנו יש הנצת וזיקולות לכיוון הליזוזום ,והרצפטור הולך לכיוון השני – למיחזור. בליזוזום יש פירוק של החלבון לחומצות אמינו ואז הכולסטרול משתחרר .כעת הכולסטרול נשלח אל הממברנה ,שם הוא משמש בבניית הממברנה .חומצות האמינו יוצאות גם הן ומשמשות במחזור בניית החלבונים בתא. ישנם רצפטורים רבים ושונים שעוברים תהליך זה ,אך זוהי דוגמה חשובה. קיימת מחלה שבה מוטציה בגן לרצפטור LDL-משנה את הזנב שלו ,כך שהם אינם יכולים לקשור את האדאפטין .הרצפטורים יכולים עדיין לקשור את ה LDL-אולם הם לא נכנסים לאנדוזום בהעברה וזיקולארית, וכך הLDL- אינו עובר פאגוציטוזה. במקרה זה תהיה לאט לאט רוויה של הרצפטורים בחלקיקים שמגיעים מזרם הדם. בסופו של דבר LDLיישאר בזרם הדם, ייצטבר ,ובגלל שהוא לא יציב במיוחד כמה חלבוני LDLעשויים להיקשר אחד לשני וליצור משקע בכלי הדם .משקע זה חוסם את כלי הדם – וזוהי הסכנה בעודף כולסטרול בזרם הדם. הערה HDL :הוא חלבון נשא-כולסטרול אחר ,אשר פחות נוטה ליצור משקעים ולכן מוכר ככולסטרול"טוב". חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :18אנדוציטוזיס וליזוזומים • היפרוגולסטרולמיה – השקעה מוגברת של LDLבזרם הדם. • אתרודקלרוזיס – חסימה של כלי הדם" ,טרשת העורקים". 193 שימו לב :רוב בעיות הכולסטרול הגבוה אינן נובעות ממוטציה גנטית כי אם עקב ירידה ביעילות המנגנון של הכנסת ה ,LDL-הנגרמת עם הזדקנות התאים והגוף. תפקוד הליזוזומים בעוד שלמדנו על הפרוטאוזום ,המבצע דגרדציה של חלבונים ציטוזוליים, הליזוזום הוא האחראי על דגרדציה של מאקרו-מולקולות חוץ-תאיות. בתחילה ראינו ת תהליך הפאגוציטוזה ,שם התא בולע פאתוגן שלם כמו חיידק. התהליך זה נוצרת וזיקולה ענקית סביב החיידק .הוזיקולה הזו ,המכונה פאגוזום ) ,(phagosomeיכולה לעבור איחוי עם ליזוזומים ולשלוח את כל החיידק לפירוק בליזוזום. במקרה של אנדוציטוזה המתווכת על ייד רצפטורים גם ראינו שליחה של וזיקולות מהאנדוזום לליזוזום או איחוי של האנדוזום עצמו )האנזודום המאוחר ,לא המוקדם( עם הליזוזום המפרק את כל תכולתו. למרות שאמרנו שהפרוטאוזום אחראי לפירוק חלקים תוך-תאיים ,ישנו מסלול נוסף לליזוזום שהוא האנדופאגוציטוזה – וזיקולה הנוצרת סביב חלבונים או אפילו אברונים שלמים נשלחים אל הליזוזום באנדופאגוזום .מסלולים אלו ננקטים בתנאים קיצוניים כמו הרעבה – מכיוון שאין לתא מספיק מזון מן החוץ הוא מתחיל לפרק איברים פנימיים מהם הוא יפיק שומנים ,סוכרים ,ומצות אמינו וחומצות גרעין, אשר יחזיקו אותו בחיים זמן מה נוסף. • • • אנדוציטוזה – אכילה תאית ,הכנסת חומרי הזנה דרך האנזודום לליזוזום לפירוק לאבני בניין. פאגוציטוזה – בליעה תאית של פתוגנים ,בעיקר ,על ידי פאגוציטים או מאקרופאגים. אוטוציטוזה – אכילה עצמית .במצבי הרעבה ,התא שולח אברונים ורכיבים אחרים לפירוק. תכולת הליזוזום הליזוזום מכיל הידרולאזות חומציות – אנזימים שעובדים בסביבה חומצית אפילו יותר מזו שיש באנדוזום ,והרבה יותר נמוכה מזו של הציטופלזמה – הליזוזום מכיל פי 100יותר פרוטונים מאשר הציטוזול. ההידרולאזות יכולות להיות נוקליאזות )פירוק חומצות גרעין לנוקליאוטידים( ,פרוטאזות )חלבונים לחומצות אמינו(, גליקוסידאזות )פוליסאכארידים למונוסאכארידים( ,ליפאזות, החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב 194 ביולוגיה של התא -הרצאות1 פוספאטאזות ,סולפאטאזות וכן הלאה .כל האנזימים האלו הם הידרולאזות הפעילות בסביבה חומצית. כיצד ניתן להכניס כל כך הרבה פרוטונים? במממברנה של הליזוזום יש משאבה של פרוטונים המכניסה פרוטונים מן החוץ בכיוון אחד לתוך הליזוזום .מכיוון שזו פעולה כנגד ריכוז הפרוטונים, המשאבה הינה אקטיבית ומופעלת בכוח הידרוליזה של .ATP הערה :זוהי למעשה אותה המשאבה שפועלת בכלורופלאסט ומוציאה מתוכו פרוטונים; בעת ההוצאה היא דווקא מייצרת .ATPזוהי גם המשאבה העובדת במיטוכונדריה לייצור .ATP אופן הגעת אנזימים ליזוזומליים לליזוזום אנזימי הליזוזום ,בתור אנזימי אברון, מסונטזים בציטוזול אך מועברים לתוך ה- .ERמשם הם עוברים לגולג'י ומשם לליזוזום .אולם כיצד הגולג'י יודע שהם מיועדים להגיע לשם? אנזימי הליזוזום מכילים סטרוקטורה מיוחדת של סוכרים :סוכרים מסוג Nנקשרים למאנוז ,אשר עובר מודיפיקציה של זירחון הידרוקסיל היושב על פחמן .6סימון זה מכונה – M6P .Mannose 6-Phosphateמאנוז זה מסמן שהגליקופרוטאין הזה אמור להישלח לליזוזום ולא לממברנה הציטופלזמטית. החלבון הליזוזומלי מגיע לגולג'י מה .ER-הגולג'י ,כפי שלמדנו ,מחולק למדורים בעלי תפקידים שונים. בקצה Cisשל הגולג'י יש הוספה של פוספט למאנוז .האנזים עם המאנוז המזורחן מגיע עד לקצה ה- ,Transשם יש רצפטורים שמזהים את ,M6Pשהם .M6P receptorsהקולטנים האלה נקשרים לאדאפטין ,המקושר לציפוי קלאטרין. מקצה ה trans-יש יציאה של וזיקולות בציפוי קלאטרין ,המגיעות תחילה לאנדוזומים ושם יש הסרה של הפוספט מהמאנוז .ערך הגבה הנמוך של האנדוזום מאפשר ניתוק מהרצפטור .האנזים כעת פעיל ,ויכול להישלח לאנדוזום המאוחר וממנו לליזוזום .הרצפטורים שהביאו את החלבונים הליזוזומליים עוברים מיחזור חזרה לגולג'י. המנגנון מיועד לשלוח אנזימים לליזוזום .כמו כן האנזימים הם הידרולאזות – פועלים בסביבות חומציות ולכן לפני שהגיעו לאנדוזום הם אנזימים לא פעילים ,וזה חשוב על מנת שלא יפרקו חלבונים אחרים שמצויים בסביבתם ב ER-ובגולג'י .אולם איך הם לא מפרקים את החלבונים האחרים שבאנדוזום ,כמו הרצפטורים שהביאו אותם ,או אחד את השני? החלבונים באנדוזום לרוב נשלחים מהר מאוד הלאה ,ולכן הימצאותם שם אינה בעייתית; אבל בליזוזום יש בעיה .זו נפתרת על ידי העובדה שהליזוזיימים ) (lysozymesעצמם הם עמידים מאוד לפירוק ויש חלבונים שפועלים כמגן מפני פירוק הליזוזום. יחד עם זאת ,ככל חלבון ,גם אנזימים ליזוזומליים עוברים פירוק בשלב כזה או אחר. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :18אנדוציטוזיס וליזוזומים החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , 195 חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 196 17.05.2010 שיעור :19מיטוכונדריה מרצה :מרסלו ארליך בשיעור זה נלמד על המיטכונדריה וגם נשתמש בלימוד זה על מנת לחדד כמה מהעקרונות הבסיסיים שיש להעביר בקורס – למשל היחס בין מבנה לתפקוד .בשיעור נדון בזרם האנרגטי של החיים בכלל – המטאבוליזם הקטאבולי .אמרנו שהחיים הם תהליך שצורך אנרגיה ,והיום נראה איך זה מתבצע ,כאשר ננסה להבדיל בין שתי צורות של הפקת אנרגיה :גליקוליזה ונשימה. מה שמבדיל בין שתי הצורות הוא המיקום – הנשימה נעשית על ידי המיטוכונדריות ,ולכן נעסוק גם בתיאוריה האנדוסימביונטית ומתי הן הוכנסו לתאים .אנחנו נראה אלמנטים שונים של מיטוכונדריה, כאשר אנחנו מנסים לייחס אלמנטים לפונקציות שמבוצעות על ידיהם. הדברים כפי שהם היום עוברים תהליך של אבולוציה – תהליך של שינוי והתאמה .חלבון מסויים שנמצא במיטוכונדריה ,במקום לשנן את שם החלבון אם נבין את הפונקציה שלו נוכל לזכור אותו טוב יותר. החלק המורכב יותר של השיעור יגיע בחלק שעוסק בכימיה של הנשימה ,תהליכי חימצון חיזור ,החשובים להבנה של התהליכים שקורים במיטוכונדריה .בסוף נעסוק גם בתפקידים של מיטוכונדריות בבריאות או במחלות. החיים הם תהליך צורך חיים משפט זה הוא נכון אבל לא מסביר הרבה; אם נסתכל על עצמנו מאוד קל להבין מנין מגיע האנרגיה שלנו – מהמזון שאנו צורכים .האוכל מתפרק בתהליכים קטאבוליים בתאים .התוצרים של התהליכים האלו מאפשרים קיום החיים. האנרגיה מתחלקת לצורות שימושיות ) Useful ,(Forms of Energyדוגמת ה ,ATP-ואנרגית חום. ה ATP-הוא זה שמניע תהליכים כימיים רבים )אבל לא לבדו( המאפשרים תפקוד של התא; עקב כך אנו מצפים שפירוק מזון יוביל ליצירה של .ATPכמו כן האנרגיה אובדת בתור חום ) ,(Lost Heatאך גם אנרגיה זו לא חסרת תועלת :החום הזה בעל תפקיד לשימור טמפרטורה אחידה שתאפשר קיום של התהליכים הקורים בתאים .כמו כן המזון מפורק לאבני הבניין החשובות לתהליכי הסינטזה של מאקרומולקולות .פולימרים שמגיעים מהמזון מפורקים בתהליכים קטאבוליים למונומרים ,אשר מהם בונים מאקרומולקולות החיוניות לתא עצמו בתהליכים אנאבוליים. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :19מיטוכונדריה 197 קיבוע פחמן בפוטוסינטזה טרם ענינו על השאלה – מנין באים בכלל המטבעות האנרגטיים הנדרשים לבניית מאקרומולקולות שאנחנו צורכים? מהו המקור הראשוני של האנרגיה? מקור זה הוא אנרגיית השמש והתהליך הפוטוסינטטי המונע על ידיו. בתהליך הפוטוסינטטי יש חיזור של פחמן :אנחנו מכניסים לתא פחמן מחומצן במצב CO2ובתהליך הפוטוסינטטי הוא מחוזר לתרכובות אורגניות של סוכרים ,ליפידים וחלבונים שאותם אנחנו צורכים. כאשר מנצלים את התרכובות האלו ,את האנרגיה ההאגורה בקשרים הכימיים של הפחמן המחוזר ,אנחנו עוסקים בחימצון שהוא התהליך שיפיק את האנרגיה. מולקולות נושאות האנרגיה הפוטנציאלית היא אנרגיה שאצורה בחומר במצב מסויים .אם יש לנו אבנים שנופלות ללא הפרעה ,כאשר הן נופלות מצוק ההאנרגיה הפוטנציאלית שהייתה בהחזקן בגובה מסויימת מיתרגמת בתחתית המצוק למהירות וחום ,בסופו של דבר. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 198 אם בדרך נפילתן של האבנים אנחנו נשים משהו – מכונה כלשהי – שתשתמש באנרגיית הנפילה על מנת להרים משהו אחר – למשל דלי מלא מים ,אנחנו מנצלים חלק מאנרגיית הנפילה לשם ההרמה של הדלי ויכולים עכשיו להשתמש באנרגיה של הדלי המורם לביצוע עבודה אחרת .למרות שעדיין יש שיחרור חום בסופו של דבר ,למרות שאין ניצול ב 100%-של האנרגיה ,האנרגיה לא אבודה לחלוטין. אותו הדבר קורה בתהלכים קטאבוליים :יש אנרגיה הקשורה בקשרים הכימיים של פחמן מחוזר ,שאתה אנו שואפים לנצל .אפשרות ניצול אחת היא לנצל את האנרגיה בבת אחת – למשל בתגובת שריפה, שתביא לחימצון ושחרור אנרגיה רבה בצורת חום – אך לא ניתן לעשות ניצול ביולוגי של שחרור האנרגיה הזה. האפשרות השנייה היא שבמקום לשחרר את האנרגיה בבת אחת בצורת חום ,יתקיים שחרור מדורג בהרבה שלבים ,והשחרור אינו רק בצורת חום אלא שחרור אנרגטי שניתן לאגור ולהשתמש בו בצורה ביולוגית .השימוש הזה הוא ליצירה של .activated carrier molecules אנחנו ננסה להבין בשיעור זה מהן המולקולות הזה ,מה קורה להן כשהן מופעלות ,איך הן מעבירות את האקטיבציה ממקום למקום; אנחנו למעשה מדברים על מעבר של אלקטרונים שהוא הליבה של תהליך החימצון חיזור. שימו לב :הקפיצה שאנו רואים באיור היא אנרגיית אקטיבציה .בתהליך שריפה יש אנרגיית אקטיבציה אחת גדולה; בתהליכים הביולוגיים לכל שלב יש אנרגיית אקטיבציה משלו והיא קטנה יותר .האנרגיה הזו היא מכשול שאנו עוברים ראשית על ידי טמפרטורת הגוף הגבוהה יחסית וכן בעזרת האנזימים – הקטליזטורים של התאים .אנזימים עושים למעשה בקרה ביולוגית של התהליכים הביוכימיים בתא. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :19מיטוכונדריה 199 עקרון המידור על מנת שהחיים יתקיימו כמו שאנו מכירים אותם כיום נדרש מידור שיאפשר פונקציונאלית ייחודיות למרחבים שונים .אם אנחנו מדברים על התהליך הקטאבולי ,העקרון הזה גם בא לידי ביטוי: • הראשון, בשלב פירוק של המאקרומולקולות של המזון שלנו למונומרים; אולם אם העיכול של מאקרומולקולות הזה העיכול יהיה יעכל כללי, גם את המאקרומולקולות שמהן בנוי התא עצמו .לשם כך יש מידור :או שהוא מתבצע מחוץ לתאים במערכת העיכול של האורגניזם או שהוא נעשה באופן פנימי ,על ידי אברון הליזוזום. • בשלב שני ,הכנסה של המונומרים לתאים במרחב הציטוזולי הגורם לתחילת תהליך הגליקוליזה. תהליך זה יפורט בהמשך .הגליקוליזה היא שבירה של סוכרים )ליזיס=שבירה(. • בשלב השלישי אנחנו מפעילים את התהליך היעיל ביותר שמתבצע במיטוכונדריות ,הוא התהליך הנשימתי. יש הפרדה מרחבית של כל אחד מהתהליכים .ההפרדה המרחבית היא על בסיס מבנה-תפקוד :המבנה של התא ושל המידור מאפשר תפקוד וקיום של התהליכים הביולוגיים המרכזיים. גליקוליזה תהליך זה מתרחש בציטוזול )תהליך ציטוזולי( .התהליך הוא לא-תלוי חמצן ) Oxigen .(Independantאמרנו שהתהליכים של הניצול הם חלקיים ,מדורגים; ולכן בתהליך זה יש חימצון חלקי של המולקולה אבל שימו לב שהחימצון ,כאמור ,אינו תלוי חמצן. מתחילים ממולקולה אחת של סוכר ,למשל גלוקוז )ראו איור בעמוד הבא( .לפני שמפיקים אנרגיה מהתהליך נדרשת לנו השקעה של אנרגיה ואנחנו רואים את זה לפי העובדה שיש השקעה של שתי מולקולות ,ATPכלומר הידרוליזה של הפוספט משחררת אנרגיה הניתרמת לתהליך ,על מנת לעבור למצב של פרוקטוז -1,6ביפוספט. משם ממשיכים לפעולות אנזימטיות נוספות כך שבסופו של דבר המולקולה מתחלקת לשתי מולקלות קטנות יותר ,חומצות פירובאטיות .התהליך הוא תהליך חימצון שבו שוב מושקעת אנרגיה של .ATP בסופו של דבר אנחנו יכולים להשתמש באנרגיה הנאגרת בקשרי הפחמן המחוזר לתהליכים אחרים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 200 החימצון הוא חלקי כי משישה פחמנים מחוזרים מקבלים שתי מולקולות תלת-פחמניות .בחימצון מלא היינו מקבלים שש מולקולות .CO2 בשלב השני יש הפקה של ארבע מולקולות ATPשמתקבלות חזרה; משמעות הדבר שמתקיימת היא ריאקציה שבה מולקולת ADPמקבל עוד פוספט ונוצרת .ATPהרווח נטו שלנו הוא 2מולקולות .ATP בתהליך זה אנחנו מקבלים גם ,NADHמולקולה של כוח מחזר הנושאת אלקטרונים שנבעו מהחימצון. אם התא מסוגל לבצע נשימה ,ניתן לנצל את הפירובאטים להמשך תהליך הנשימה האירובית; אם התא חי מתסיסה ) ,(fermentationכלומר ללא צריכה של חמצן ,מולקולות ה- NADHינוצלו על מנת להיפטר מהפירובאט ,על ידי הפיכתו לכהל )למשל בשמרים שמתסיסים יין או בירה( ,ויכול להיות על ידי יצירת חומצות לאקטיות ,המצטברות למשל בשרירים עקב מאמץ יתר. • • • • מתחילים ממולקולה שש-פחמנית. משקיעים שתי מולקולות ATPעל מנת לזרחן אותה. בתהליך הפירוק של המולקולה לפירובאטים יש הפקה של 4מולקולות ATPו 2-מולקולות .NADH אורגניזם אירובי ממשיך עם הפירובאטים לתהליכי נשימה .אורגניזם אנאירובי משתמש בכוח המחזר לפירוק של הפירובאטים והיפטרות מהם בתהליכי תסיסה. נשימה תהליך זה ,של גליקוליזה ,מתרחש בציטוזול כפי שציינו בהתחלה; במקרה והאורגניזם הוא אירובי ויש המשך לתהליך ,התהליכים הבאים מתרחשים במיטוכונדריה – הפירובאטים מיובאים אל המיטוכונדריות. שימו לב :לא רק סוכרים יכולים לשמש כמקור אנרגיה .שומנים למשל יכולים להתפרק לחומצות שומן, המובאות לתוך המיטוכונדריה ,בה מתנקזים שני מסלולי ההפקה של הסוכרים ושל השומנים היוצרים שניהם אותו הסובסטרט – ,Acetyl CoAאצטיל שהוא קו-אנזים ,מולקולה שפועלת בסמוך לאנזימים על מנת לעזור לתפקוד הזירוז של האנזים בריאקציה הכימית. באיור בעמוד הבא רואים אילוסטרציה של התהליך ומבנה המולקולה של ה.CoA- חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :19מיטוכונדריה 201 מחזור החומצה הציטרית סידרה של ריאקציות כימיות, המכונות מחזור החומצה הציטרית ,מהוות את ההמשך של תהליך הפקת האנרגיה. במהלך מחזור זה נקבל חימצון סופי של הפחמן. התהליך הוא גם רב שלבי וגם מעגלי .כאשר נכנסת למעגל קבוצת האצטיל של הAcetyl - ,CoAיש שלבים שונים של ניצול האנרגיה המשתחררת עקב חימצון המולקולה. העובדה שמתרחש חימצון מודגמת על ידי זה שאנחנו רואים במעגל נקודות יציאה של פחמנים מחומצנים – .CO2נקודות הניצול האנרגטי הן נקודות ההיווצרות של הactivated carrier molecules- )מסומנות בירוק( ,שהן NADHו .FADH2-המולקולות מאוקטבות על ידי אלקטרונים בעלי אנרגיה גבוהה ,שהן רוכשות עקב חימצון הפחמנים. רכישה של אלקטרונים היא חיזור של מולקולות נושאות פעילות .משום כך הן גם מכונות "כוח מחזר". שלב יצירת האנרגיה יהיה ניצול האנרגיה הזו שבכוח המחזר ,ואנחנו נראה מהו המנגנון שמאפשר ניצול של האנרגיה האגורה עד שלב זה במולקולות הכוח המחזר בצורת אלקטרונים עם אנרגיה גבוהה. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 202 אלקטרונים עם אנרגיה גבוהה הם אלקטרנים שנוטים לעבור בין מולקולות שיש ביניהן הפרש חימצון-חיזור, מעבר המשחרר אנרגיה. רכישת האלקטרונים – יצירת כוח מחזר • – NADHנוצר במקורו מ NAD+-שהופך ל NADH-על ידי רכישה של יון ההידריד ) ,(H-מימן עם שני אלקטרונים .כתוצאה מכך NAD+מחוזר ל.NADH- • – FADH2נוצר במקור מ ,FAD-מחוזר על ידי שני יוני הידריד. אלו תהליכי היווצרות של .activated carrier molecules תחילת דרכה של הנשימה האירובית עד כה לא הייתה פעולה ישירה של חמצן; אולם כולנו יודעים שאנחנו ,כיצורים אירוביים ,זקוקים לחמצן על מנת לנצל אנרגיה ולחיות .האנרגיה שהכנסנו עם הסוכרים או שומנים נמצאת כרגע במולקולות נושאות מופעלות ,בכוח המחזר. מבחינה אבולוציונית ,התסיסה והנשימה האנאירובית קדמו לנשימה האירובית; אולם הניצול של התסיסה הוא חלקי בלבד ולא יעיל מספיק .עם היווצרות היצורים הפוטוסינטטיים הראשונים מתקבלת כניסה של חמצן לאטמוספירה .ככל שהחמצן מצטבר באטמוספרה ,ישנה אפשרות להיווצרות מערך ניצול אנרגטי יעיל יותר ,הוא תהליך הנשימה האירובית. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :19מיטוכונדריה 203 הנשימה האירובית מאפשרת לנו ניצול גדול יותר ויעיל יותר אנרגיה .ניצול יעיל זה מאפשר גדילה מפותחת יותר ולמעשה הקנייה של מורכבות ביולוגית .המערכות יכולות להפיק יותר אנרגיה ,ולכן יכולות להיות מורכבות יותר ולצרוך יותר אנרגיה. המיטוכונדריה בתא אאוקריוטי יש מיטוכונדריות שמפיקות את הנשימה האירובית; התיאוריה המסבירה את כניסת המיטוכונדריה לתאים האאוקריוטיים היא התיאוריה האנדוסימביונטית, הגורסת שתא קדום אנאירובי ,שהצליח להפוך לתא אאוקריוטי – כלומר בעל גרעין – הצליח לבלוע חיידק אירובי פרוקריוטי. בליעה זו הביאה להיווצרות יחסים סימביונטיים אובליגטוריים )מחייבים( בין התאים .הסימביוזה היא מחייבת עקב מעבר של גנים מהפרוקריוטי האירובי לגרעין המוגן של האאוקריוטי האנאירובי .כעת לתא הזה יש יכולות אירוביות שנובעות מקיום החיידק שנבלע. התמיכות לתיאוריה נובעות בעיקר מתכונות המיטוכונדריה של היום ,הדומות לחיידקים מבחינות רבות: גודל ,הרכב ,ריבוזומים פרוקריוטיים ,גנום שמקודד לחלבונים המתבטאים ייחודית במיטוכונדריה. המיטוכונדריה היא יצור חצי-עצמאי ,אולם חלק מעצמאותה נדדה בצורת גנום ל DNA-של התא האאוקריוטי. תכונות המיטוכונדריה המיטוכונדריה נמצאת בעיקר באיזורים של התא שבהם נדרשת אנרגיה ,למשל תחילת השוטון של תא הזרע ,אשר צורך ATPעל מנת לנוע. תהליך הנשימה במיטוכונדריה תהליך זה מכונה .Oxidative Phosphorilationתהליך זה כורך ניצול חמצן ) (oxidativeבמהלכו יש הוספה של פוספט ) (Phosphorilationמ ADP-על מנת ליצור .ATP מולקולות הכוח המחזר מגיעות אל המיטוכונדריה מחד, החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 204 ומולקולת ADPופוספט מגיעים מאידך .קבלת אנרגיה מהכוח המחזר של התא מאפשר פירוק של חמצן והכוח המחזר ל NAD+-ומים מחד ואיחוי של ADPופוספט ל ATP-מאידך. מפלי ריכוזים כשמדברים על הפרשי ריכוזים של חומר הנמצא משני צידי הממברנה ,גם כאן יש אנרגיה אגורה .האנרגיה הפוטנציאלית הזו ניתנת לניצול ,וגם היא משמשת במיטוכונדריה )על ידי משאבות פרוטונים ,למשל(. מבנה ותפקוד של המיטוכונדריה במיטוכונדריה יש מספר מרחבים ,והם ממודרים על ידי ממברנות .במיטוכונדריה יש ממברנה חיצונית ,ממברנה פנימית שהיא המגדירה של המרחב הפנימי ביותר של המיטוכונדריה – המטריקס .כמו כן בין הממברנות קיים מרחב נוסף – החלל הבין- ממברנלי. הממברנה החיצונית מאופיינת בהיותה בעלת חדירות גבוהה. משמעות הדבר היא שנעוצים בה חלבונים רבים כמו חלבון ,porinהמחוררים אותה בצורה כזו שכל חומר הקטן מ 5,000-דלתון יכול לעבור באופן חופשי בין שני צידי הממברנה. הממברנה החיצונית של מאופיינת בחדירות הגבוהה. מה ההשלכות מכך? המיטוכונדריה • הריכוז של החומרים הקטנים האלו יהיה שווה בין החלק הפנימי והחיצוני של הממברנה. • חומרים גדולים יוצרים מפל ריכוזים. • גם יונים יכולים לעבור באופן חופשי בהנחה שהם קטנים מספיק. החלל הבין-ממברנלי איזור זה עשיר באנזימים שעוזרים לו לבצע את תפקידו. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :19מיטוכונדריה 205 הממברנה הפנימית מאופיינת באופן הפוך לממברנה החיצונית :הממברנה הזו היא מאוד לא חדירה .כמו כן יש קיפולים רבים של הממברנה הפנימית ,המשמשים להגדלת שטח פנים – דבר המרמז לקיום תהליך חשוב על גבי הממברנה ,כאשר הגדלת שטח הפנים מבקשת לייעל ולהגביר את התהליך. המבנה של הממברנה הפנימית מיועד לביצוע שלושה סוגי פונקציות: • ריאקציות חימצון המאפיינות את ה – electron transport chain-ניצול האנרגיה של אלקטרונית מרמה אנרגטית גבוהה. • מכונה מולקולרית לסינטזה של .ATPייעשה צימוד בין תהליך זה לקודם. • יכולת הכנסת חלבונים שונים ופקטורים הנחוצים לקיום התהליכים המתרחשים במיטוכונדריה אך מקורם מן החוץ )למשל חלבונים מיטוכונדריאליים המסונטזים על ידי גנים מה DNA-של התא(. בממברנה הפנימית יש מרכיבים ייחודים ,כמו הפורינים בממברנה החיצוני .אחד ממרכיבים אלו הוא הקרדיוליפין – מולקולה של גליצרול המחוברת לשני ליפידים ,וכל שני גליצרולים מחוברים לאותה הליבה – כך שנוצר דימר של פוספוליפיד. פגיעה בשימוש בקרדיוליפין יכולה לגרום לפגיעה גנטית בגוף, ופגיעה בפעילות של המיטוכונדריות. המטריקס המטריקס הוא תווך תוך-תאי המכיל את הגנום המיטוכונדריאלי ,האנזימים הפעילים ,הריבוזומים וכדומה. תהליך החימצון במיטוכונדריה פוטנציאל חימצון חיזור חימצון של קרבו-הידראט יוצר .ATPעל מנת להבין תהליך זה אנחנו צריכים להבין את פוטנציאל החימצון-חיזור ) .(RedOx Potentialפוטנציאל זה מבטא את הזיקה של חומרים לאלקטרונים. בדומה לחומצות ובסיסים שניתן לזווג בהם בין חומצה ובסיס ,ניתן לזווג – RedOx Pairזוגות של מוסר ומקבל אלקטרונים .ניתן לזווג בין חומרים שונים כל עוד יש מישהו שיתרום אלקטרונים ומישהו שייקלוט את אותם האלקטרונים. המעבר הכיווני נוצר מחומר התחלתי בעל נטייה נמוכה להחזקה של אלקטרונים )נטייה גבוהה למסירה של אלקטרונים( ,כלומר פוטנציאל חימצון חיזור נמוך ,המעביר אלקטרונים לחומר בעל פוטנציאל חימצון-חיזור גבוה. פוטנציאל חימצון-חיזור נמדד כיכולת למסור או לקבל אלקטרונים מול חומר סטנדרט כלשהו. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 206 מה קורה במיטוכונדריה? בטבלה הבאה אנחנו רואים את פוטנציאל החימצון-חיזור של חומרים שונים .ל NADH-יש פוטנציאל של - ;-320 mVלחמצן יש פוטנציאל של ;+820 mVיש כאן הפרש די גדול והמעבר בין ההפרשים האלו יניב אנרגיה רבה. המעבר הביולוגי הוא ,כפי שציינו ,דרך שלבי ביניים שכל אחד מהם כדאי מבחינה אנרגטית ומתרחש על מנת לאפשר ניצול אנרגטי של תהליכים ביולוגיים. התהליך נעשה במסגרת שרשרת מעבר האלקטרונים בתא. בתהליך זה אנחנו מתחילים עם חומר שיש לו פוטנציאל חמצון-חיזור נמוך .יש שלוש תחנות למעבר ,כאשר לכל תחנה פוטנציאל מעט גבוה יותר ולכן המעבר הוא חד-כיווני .בסופו של דבר יש הפיכה של חמצן למים. יש צימוד של האנרגיה שמרוויחים ברכישת האלקטרונים בכל תחנת ביניים לתהליך נוסף :תהליך זה הוא הוצאת פרוטונים מהמטריקס את המרחב הבין-ממברנלי. כתוצאה מכך יש יצירה של גרדיינט של פרוטונים .הפרוטונים לא יכולים לעבור באופן חופשי דרך הממברנה הפנימית ,והכוח של הגרדיינט מנוצל על ידי המיטוכונדריה ליצירת .ATP דוגמה למעבר אלקטרונים :ציטוכרום C סוג של מעבר אלקטרונים ניתן לראות כשמסתכלים על המולקולה ציטוכרום-סי ,המהווה דוגמה למנגנון העברת אלקטרונים. המולקולה מכילה קבוצת Hemeשבמרכזה אטום של ברזל ,שיכול להיות בשני מצבים F+2 :או ,F+3 בתלות בשאלה האם הוא מקבל אלקטרון .מצב אחד ,+3 ,מקבל אלקטרון מתורם עם פוטנציאל חימצון- חיזור נמוך יותר; מצב +2תורם אלקטרון לקולט עם פוטנציאל גבוה יותר .כך נעשה מעבר האלקטרונים. כתוצאה ממעבר האלקטרון נוצר כוח מחזר .NADH ,האנרגיה של זרם האלקטרונים מנוצלת על מנת ליצור גרדיינט פרוטונים. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :19מיטוכונדריה 207 באיור משמאל ניתן לראות את המסירה ההדרגתית של האלקטרונים .שלושת הקומפלקסים מפורטים באיור עם שמותיהם .הקומפלקס האחרון מוסר אלקטרונים לחמצן ומייצר מולקולת מים. באיור משמאל למטה אנו רואים סכמה מהספר המתארת כיצד חומר שמקבל מצד המטריקס שלו אלקטרון יכול אחר כך ,בשינוי קונפורמציה שנובע מקבלת ומסירת האלקטרון, לשחרר את האלקטרון במרחב אחר .הסכמה בעמוד הבא מראה את אותו הדבר :יש חלבון שפונה גם למטריקה וגם לתווך הבין-ממברנלי .הוא יכול לקשור פרוטון מצד אחד .עקב קליטת האנרגיה מקבלת האלקטרון יהיה שינוי קונפורמציה שיביא לשחרור הפרוטון במרחב מיטוכונדריאלי אחר – התווך הבין- ממברנלי. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 208 ממה נובעת נטיית הפרוטון להיכנס חזרה? • הפרש ריכוזים – במילים אחרות, הפרשי .pHההפרשים האלה קיימים בין מרחב המטריקס למרחב הבין- ממברנלי. • הפרש מטענים – הנובע מהמטען שנושאים יוני הפרוטון .כתוצאה מכך גדלה הנטייה של הפרוטונים לחזור אל המטריקס. אם בודקים ,pHהיכן יהיה הגבוה יותר? ה pH-הגבוה יהיה במטריקס ,כי שם יש ריכוז נמוך של פרוטונים. לעומת זאת לא יהיו הפרשי pHבין התווך הבין-ממברנלי לציטוזול ,כי שם יש מעבר חופשי דרך הפורינים. ההפרשים האלה מנוצלים על ידי משאבה המכונה .ATP Synthaseהפרוטונים לא יכולים לעבור בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה ,ולכן הם חייבים לעבור מהמשאבה .האנרגיה המשתחררת בכניסה חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :19מיטוכונדריה 209 למשאבה מנוצלת על מנת לחבר בין ADPלפוספט ,ליצירת .ATP הפרוטונים נכנסים למרחב מסויים במשאבה ,דבר המניע אותה לזוז במעגל .לאחר השלמה של סיבוב שלם ,פרוטון יכול להשתחרר ,אך בינתיים האנרגיה הפוטנציאלית שלו תורגמה לאנרגיה מכאנית שהניעה את המשאבה .עם סיבובה היא מייצרת את ה .ATP-הליבה של המשאבה מושכת מולקולות ADPופוספט ובאנרגיה המכאנית מחברת אותם. שימו לב שאם ריכוז הפרוטונים נמוך ,כיוון המשאבה יכול להתהפך :אז היא תכניס פרוטונים ותפרק ATP ל ADP-ופוספט .כך למשל עובדת משאבת הפרוטונים של הליזוזום ,שמכניסה פרוטונים תוך ניצול .ATP החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 210 20.05.2010 שיעור :20העברת אותות בתחילת הקורס קבענו שהתא הוא היחידה הארגונית הבסיסית של החיים; חלק מקביעה זו היה שהתהליכים הכימיים המאפיינים את החיים מתרחשים בתוך התאים או בסמוך להם. אנו יודעים שישנה הפרדה בין העולמות החוץ תאי והתוך תאי ,הנחצצים על ידי הממברנה הפלזמטית .יחד עם זאת ,אנחנו גם יכולים להבין שתא מסויים בגוף אינו פועל באופן בלתי תלוי ,ללא הקשר; התא פועל מתוך ההקשר של הגוף .אבל מה זה אומר? הפעולה בהקשר הגוף קובעת שצריכה להיות התאמה בין תהליכים בתוך תא אחד בגוף לתהליכים המתרחשים בתא במקום אחר בגוף; תא שנמצא בבלוטה מסויימת ישפיע בתהליכים שלו על תא שריר מרוחק מאוד מאותו התא .יש תיאום בין העולמות הכימיים האלה ,ושיעור זה יעסוק באופן הביצוע של תיאום זה ,בעיקר לנוכח החוצץ הכימי – הממברנה – שלא מאפשר מעבר חופשי בין החוץ לפנים. עקרון העברת האותות האיור הבא מציג את עקרון העברת האותות: ישנם שני אלמנטים למעבר: • מעבר האות – יש אות שנשלח ) (OUTואות שנקלט ) .(INזה מה שמאפשר להעביר מסר. • המרה של הסיגנל – סיגנל בעל טבע מסויים ,למשל סיגנל רדיו בטלפון ,מומר במכשיר לשפה אחרת שאנו יודעים לקלוט – שהיא השמע שיוצא מהאפרכסת. בהקשר של התאים ,גם כן קיימים שני האלמנטים :יש מולקולה נושאת-מסר שמתקיימת במדיום החוץ תאי; המולקולה נקלטת על ידי רצפטור ,אשר מתחיל את פעולת ה .transduction-זוהי ההמרה שנעשית ,שינוי בשפה הכימית שמאפשרת שינוי התנהגותי של התאים אליהם הגיע המסר. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :20העברת אותות 211 שימוש העברת האותות מהי השכיחות של אירוע קליטת המסרים? המסרים נשלחים לתאים כל הזמן .אם נסתכל על תא בשני רגעים שונים ,ובשניהם נראה שיש לנו את אותו התא ללא שום שינוי ,האם הוא נמצא בשיווי משקל סטטי, שבו אין שינוי ,או שיווי משקל דינמי ,במהלכו יש שינויים רבים כל הזמן ופעילות אקטיבית על מנת לשמר את שיווי המשקל? התשובה היא שהשיווי משקל הוא דינמי – שכן כבר ציינו שהתאים מוציאים אנרגיה כל הזמן על מנת לשמר את הסדר שהוא מקור החיים .באיור אנו יכולים לראות שתאים קולטים פקטורים שונים על מנת שיוכלו לבצע פעולות שונות :בין אם אלו פקטורים להשרדות ,גדילה והתחלקות ,התמיינות או אפופטוזיס )שמתרחש בהיעדר פקטורי השרדות(, התא קולט אותות כל הזמן ומתרגם אותם לפעולות אקטיביות )כמו הפעלת משאבות בהשרדות ,הפעלת תהליכי מיוזה ומיטוזה בחלוקה ,ביטוי גנים מסויימים בהתמיינות( על מנת לשמור על חיותו או לבצע פעולות שונות. סוגי מסלולי העברת אותות העברה אנדוקרינית תא במקום מסויים בגוף ,תא בלוטה למשל ,מפריש הורמון לזרם הדם .תא המטרה של הסיגנל יכול להיות מאוד מרוחק מתא המקור .הסיגנל שעובר בזרם הדם מגיע לתא המטרה שם נקלט על ידי הרצפטורים המתאימים הקיימים בתא המטרה. ההורמון נמצא כל הזמן בסביבה הידרופילית; הורמון שכזה לא מסוגל לעבור את מחסום הממברנה כי הוא הידרופילי בטבעו ולכן הרצפטור הוא רצפטור ממברנלי שפונה כלפי חוץ ,קולט את ההורמון מהתווך החוץ תאי ,ומתחיל מסלול אותות לתגובה. ביולוגיה היא לא רק תאים אלא גם אורגניזמים; בעת שניצב מול איום, אורגניזם נוקט בשיטת – fight or flightהילחם או ברח .הפעולה הזו היא בסיסית עוד מהתאים :גירוי של בלוטת יותרת הכליה )אדרנל( היא הבלוטה המפרישה אדרנלין לזרם הדם .כתוצאה מכך הוא יגיע לתאים שונים והתגובה התאית של תאי המטרה תאפשר את תגובת האורגניזם בשיטת החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב 212 ביולוגיה של התא -הרצאות1 .fight or flightאנחנו גם מבחינים בכך שהתנאי לתגובה תאית לחומר ההורמונלי מחייבת קיומם של רצפטורים. אולם ,בעוד שרצפטורים הם תנאי לקיום במסלול ,הם לא קובעים בהכרח איך ייראה המסלול :תאים שונים יכולים להגיב באופן שונה לאותו הליגנד ,בשל הבדלים בגנים המתבטאים כתוצאה מקליטת אותו הסיגנל. הולכה פאראקרינית במנגנון זה התא שולח אות על ידי הפרשת חומר מסויים ,אולם החומר הזה הוא לא חומר סיסטמטי, שעובר בזרם הדם לכל הגוף ומגיע לתאים מרוחקים, אלא הוא מופרש לתווך החוץ תאי ולכן משפיע בעיקר על תאים הקרובים לתא המפריש. גם כאן החומר המופרש נקלט על ידי קולטנים מסויימים וגורם לשינוי בתאים שנמצאים בסביבתו של התא ששלח את הסגנל. נניח שיש פציעה ברקמת האפיתל ,רקמת העור .כעת צריך לתקן את הפציעה .על אף שפציעה יכולה להביא לתגובות סיסטמטיות ,ישנן גם פעולות מקומיות :יצירת צלקת ,ניקוי ממזהמים ,בניית הרקמה מחדש וכדומה – כל אלו הכרחיים באיזור הפציעה בלבד והאורגניזם לא "מעוניין" להשקיע אנרגיה זו בכל רחבי הגוף. באיור אנחנו רואים רשימה ארוכה של סיגנלים, שאנו רואים שמשותפים לסיומת – GFפקטור גדילה ) .(Growth Factorאותות אלו גורמים לגדילה והתפתחות של תאים על מנת ליצור מחדש את הרקמה הפצועה. במחלות כמו מחלת הסרטן ,התאים למעשה מפרשים שלא כראוי את אותות הגדילה ) (GFולכן הם גדלים באופן לא מבוקר ולא מתאים ,שלא לצורך. העברה נוירונית כאן יש מבנה ייחודי של תאי נוירון הגורם לשני תאים שגופיהם מרוחקים מאוד אחד מהשני לקרב את מעבר האותות בעזרת קיום סינפסה .הסינפסה גורמת חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :20העברת אותות 213 ליעילות גבוהה של הסיגנל המשוחרר – המופרש לתוך חלל הסינפסה ,ונקלט במהירות על ידי תא היעד )פוסט-סינפטי(. סיגנל חשמלי נישא על גבי הנוירון מגיע לקצה האקסון – הקצה הפרה-סינפטי .כתוצאה ממעבר האות החשמלי נפתחות תעלות סידן ,הגורמות לסידן להיכנס לתא )לפי מפל הריכוזים שלו( .כניסה של סידן מפעילה מסלול אותות המביא לאיחוי של וזיקולות מלאות בפקטורים המכונים נוירוטרנסמיטורים – פקטורי אותות עצביים – עם הממברנה של התא הפרה-סינפטי ,כך שהנוירוטרנסמיטורים משוחררים לחלל הסינפטי, שם הם יכולים להיקלט על ידי רצפטורים של התא הפוסט-סינפטי .קליטה זו גורמת למסלול אותות בתא הפוסט-סינפטי הגורם לפתיחת תעלות יונים בתא ,דבר היוצר סיגנל חשמלי )במידה וזהו נוירון( והעברה הלאה של האות החשמלי. העברה תלויית-מגע אם במרחקי סיגנל עסקנו ,השיא של הקירבה הוא שיטה זו :המולקולה הנקלטת היא למעשה רכיב הנמצא על גבי הממברנה של תא מסויים; אותו רכיב מהווה ליגנד הנקשר לרצפטור בממברנה של תא שכן. סיגנל מסוג זה חשוב למשל במנגנון התפתחות תאי עצבים והתמיינותם – רק אחוז קטן מתאים טוטיפוטנטיים להתפתח צריכים למערכת העצבים ,והשמירה על היחס הזה נעשית על ידי סיגנל שתא מרכזי כלשהו שולח לתאים הלא-ממויינים שסביבו, מהתאים המונע האלו להתמיין לתאי נוירון וגורם להם להתמיין למשהו אחר. בתוך התא ,בציטוזול ,נמצא החלק הציטוזולי של הרצפטור .הליגנד הממברנלי נקשר של תא שכן לרצפטור ,ובעקבות כך יש שינוי קונפורמציה וביקוע של הרצפטור המפרק אותו לשני חלקים )במקרה זה(. החלק הציטוזולי משוחרר לציטוזול ומעביר את האות אל הגרעין, שם הוא גורם לשינוי בביטוי הגנים על ידי פקטורי שיעתוק. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב 214 ביולוגיה של התא -הרצאות1 האיור הבא מראה עד כמה המערכת של העברת האותות מורכבת :אם אנו בוחנים את החומר אצטילכולין, נוירוטרנסמיטור ,הוא יכול להיות מוכר על ידי רצפטורים בתאים שונים אך בכל תא יש שינוי התנהגותי שונה :בשריר הלב תהיה ירידה בקצב ועוצמץ ההתכווצות ,בבלוטות רוק זה ייגורם להפרשה ,ובתאי שריר שלד תהיה התכווצות של השריר. רצפטורים שונים הם בעלי צורה שונה ,הם יכירו ליגנדים שונים ויביאו לתוצאות שונות בתאים שונים מאותו הליגנד. ליגנדים הידרופובים עד כה דיברנו על ליגנדים הידרופילים שלא יכולים לחצות את הממברנה; ישנם גם ליגנדים הידרופובים שהם מולקולות קטנות שיכולות לחדור דרך הממברנה ולהגיע ישירות לציטוזול .גם במרחב התוך-תאי קיימים רצפטורים של הפקטורים האלה, אשר גורמים לתגובה מתאימה. דוגמה לכך היא הקורטיזול)בתמונה הימנית בעמוד הבא( – אחד מההורמונים הסטרואידים ,המאופיינים בטבעות משושות ומחומשות שמקנות להם אופי הידרופובי שמאפשר להן מעבר בממברנה והגעה לקולטן .גם לאחר שנקשרו לקולטן תוך-תאי חייבת להיות המרה של האות באופן כזה שיביא לתגובה הרצויה. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :20העברת אותות 215 שלבי תהליך העברת האותות נחזור לעסוק במולקולות שנקלטות ברצפטור ממברנלי .ניתן לחלק את תהליך העברת האותות לכמה שלבים ותהליכים: • – Primary Transductionהמרה ראשונית ,הקליטה או היווצרות הקשר בין הליגנד לרצפטור. • – Relayהעברה דרך תחנות ממסר שונות. התא הוא מבנה תלת-מימדי ,והאירוע של ההולכה הראשונית מתרחש בממברנה החיצונית; התוצאה צריכה להיות לרוב שינוי של ביטוי גנים. לפיכך אנחנו צריכים לגשר בין שני המרחבים התוך-תאיים האלה; הדבר נעשה על ידי העברה של המסר במנגנונים מולקולאריים של חלבונים, המאפשרים את הקשירה והמעבר של המרחק מהממברנה הפלזמטית ועד מקום היעד בו ייתרחשו התהליכים בפועל. • – Transduce and Amplifyכחלק מתהליך ה ,relay-באחת מתחנות הממסר אנחנו מקבלים גם הגברה של המסר :ישנה יצירה של מסרים שניוניים ) small החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 216 ,(intracellular nessenger moleculesהמתוּוכת לרוב על ידי אנזים – שכן אנזים חוזר על פעולתו עם סובסטרטים רבים ,וכך אנזים יחיד משפעל מולקולות רבות ומגביר את היקף האות המתקבל. • – Integrateהתא לא מקבל סיגנל אחד אלא כמה וכמה סיגנלים; ישנם שלבים שעושים אינטגרציה בין הסיגנלים השונים על מנת לגורם לשילוב של פקטורים מסויימים שגורם לתגובה אחת בעוד ששילוב של פקטורים אחרים ודומים ייגרום לתגובה שנייה. • – Distributeתהליך העברת האות מביא לשינוי בהתנהגות התאים .השינוי בהתנהגות יכול להיות מגוון :בין שיהיה שינוי בביטוי הגנים ,שינוי בצורה או תנועת התא או שינוי במטאבוליזם שלו. לא מולקולה בודדת יוצרת את השינוי הזה ,ולכן לאחר האינטגרציה נדרש מנגנון להפעלת מולקלות שונות שיפעילו את השינויים – בשינוי הביטוי השל הגנים יופעלו פקטורי שיעתוק; בשינוי הצורה יופעלו חלבוני השלד; בשינוי המטאבוליזם יופעלו חלבונים אחרים. סוגי רצפטורים אנחנו יכולים לסווג מספר סוגי רצפטורים. • קולטנים מצומדי תעלות יוניות – ראינו כאלה בתאים הפוסט- סינפטיים שקולטים את הנוירו- טרנסמיטורים רצפטורים פנימה על ובעקבות ידי קליטת הנוירוטרנסמיטור הייתה פתיחה של תעלות יוניות. • Coupled G-Protein – אלו Receptor מנגנונים מערבים קומפלקס של קולטן וחלבונים שיכולים לפרק GTPל- .GDPנרחיב עליהם רבות בהמשך. • קולטנים המצומדים לאנזימים – כאשר הקולטנים קולטים ליגנד )אם הוא מביא שני רצפטורים למגע יחד זה מכונה דימריזציה ,אם יותר משני חלבונים זה אוליגומריזציה( .כתוצאה מהדימריזציה יש שינוי קומפורמטיבי ואקטיבציה של החלק הציטוזולי של הרצפטור. האקטיבציה יכול לערב פעילות אנזימטית – למשל פעילות של קינאזה שתזרחן חלבונים אחרים .כמו כן יכול להיות שהקולטן עצמו לא יכול לזרחן אבל הוא מצומד לקינאזה ,שהיא האחראית על העברת האות בזירחון. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :20העברת אותות 217 חלבוני – Gהרחבה חלבונים אלו מקבלים את שמם תודות להיותם חלבונים שיכולים לקשור GTPאו .GDPחלבונים אלו משתמשים בקשירה זו של נוקליאוטיד על מנת לשמש כמתג מולקולארי .הם יכולים להימצא במצב פעיל ) (ONאו מנוטרל ).(OFF החלבונים כבויים כאשר הם קשורים ל GDP-והם דלוקים כשהם קשורים ל .GTP-אנחנו נכיר שני סוגים של חלבונים כאלה :האחד הוא חלבוני ה- Gהטרימרים ,כלומר הם מורכבים משלוש תת יחידות ,ובסוף ההרצאה נראה דוגמת לחלבון G שהוא מונומרים –מורכב מתת יחידה אחת – אבל עקרון הפעולה שלו דומה – דלוק עם GTPוכבוי עם .GDPהשינוי בפעילות נובע כמובן משינוי קונפורמטיבי. שינוי הקונפורמציה ,או מצב הפעילות ,מתבטא בשינוי אפיניות לחלבונים שונים – ומשפיע לפיכך על החלבונים שיושפעו או על אופן ההשפעה עליהם בתלות במצב הפעילות של חלבון .G הקולטנים של הקומפלקס הטרימרי הם משפחה של חלבונים חוצי- ממברנה שחוצים אותה שבע פעמים .בעקבות קשירת ליגנד ,הקצה הציטוזולי של הרצפטור משתנה והוא יכול לקשור חלבון Gכבוי שמחובר ל .GDP-כאשר חלבון ה G-נקשר לרצפטור הוא מחליף את GDPב GTP-ומופעל. בעקבות השינוי הקונפורמטיבי הנובע מקשירה ל ,GTP-יש )בחלק מהמקרים( הפרדה בין תת היחידה אלפא לבין הקומפלקס של שתי תת היחידות בטא-גמא .שני החלקים משופעלים עקב הקשירה .כל אחד משני החלקים יכול להביא לשינוי פעילות של חלבונים אחרים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 218 כשם שיש מנגנון הפעלה של חלבוני ,Gיש גם מנגנון כיבוי .מנגנון זה הוא על ידי הידרוליזה של הפוספט שנמצא על ה .GTP-מרגע שיש הידרוליזה, ה GTP-הופך ל GDP-ולכן החלבון מנוטרל .לאחר הניטרול החלבון לא יכול לקשור את החלבון האינדוקטיבי שמוליך את הסיגנל פנימה אלא חוזר לקשור את תת היחידה בטא-גמא. לאחר החלפה זו ניתן לחזור לרצפטור המשופעל ולהחליף ל ;GTP-אולם גם רצפטורים הקשורים לליגנד אינם נותרים משופעלים לנצח .בשלב כזה או אחר קינאזה מגיעה ומזרחנת את האתרים הקושרים של הרצפטור, ובצורה זו גורמת לאפיניות של הרצפטור לחלבון המכונה ,arrestin המונע המשך קשירה של חלבוני Gעל ידי הרצפטור. • חלבון Gמופעל מקשירה GTPומכובה מקשירת .GDP • חלבון האותות )חום( מופעל על ידי קשירה לחלבון Gומנוטרל עקב ניתוק ממנו. • הרצפטור מופעל על ידי קשירה של ליגנד ומנוטרל על ידי זירחון ,הגורם לקשירה של .arrestinכמו כן ישנה אנדוציטוזה של הליגנד – בליעה של הליגנד פנימה כך שאינו יכול להיתקל ותהפעיל רצפטורים נוספים. עד לשלב הקשירה של חלבון G לחלבון האותות ,אנחנו עדיין נמצאים בתחום הממברנה; אנחנו זקוקים לשלב של ה relay-על מנת לשלוח את האות פנימה לתא .נוצרות ללמעשה מולקולות איתות קטנות הנעות בציטוזול ומחפשות חלבונים שיוציאו לפועל את הסיגנל. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :20העברת אותות 219 )Cyclic AMP (cAMP אחת מהמולקולות האלו היא ה ,cyclic-AMP-או בקיצור .cAMPמולקולה זו מקורה ממולקולה של ,ATPכאשר cAMP נוצר על ידי פעולת האנזים .Adenilin Cylaseהמולקולה הזו היא בעלת פוספט יחיד היוצר צורת מעגל במולקולה – ולכן היא מכונה .CYCLIC amp היווצרות ה cAMP-היא פעולה שמשפעלת למעשה את הATP- לפעילות כמערך אות משני,והכיבוי של המולקולה נעשה על ידי אנזים המכונה .cAMP Phosphodiesterase סיכום חזרה על כל המסלול: • רצפטור קושר אדרנלין – ליגנד .בעקבות כך יש שינוי קונפורמציה ושיפעול של הרצפטור. • שיפעול הרצפטור גורם לשיפעול של חלבון ,Gהקושר GTPבמקום .GDP • חלבון Gהמופעל מפעיל חלבון אדנלין ציקלאז המתחיל בייצור .cAMP • מולקולות cAMPמפעילות קינאזה שיכול הלהיכנס לגרעין ולשפעל פקטור שיעתוק. • הפקטור מתיישב על ה DNA-ומתחיל בשיעתוק של גן שלא בוטא קודם. לכל אחד ואחד מהשלבים האלה חובה שיהיו מנגנוני ניטרול! החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב ביולוגיה של התא -הרצאות1 220 המסלול האיטי והמסלול המהיר אנחנו ראינו את המסלול הזה ,שהוא המסלול הארוך לשינוי בתא – המערב מנגנון לשינוי גנים .אולם יש גם מסלול מהיר – אשר גורם לשינוי בפונקציה של חלבונים קיימים בתא, ולכן מנגנון זה מהיר מאוד .לרוב אות אחד גורם להתרחשות של שני התהליכים :האחד אחראי לתגובה מיידת והשני אחראי לתגובה לטווח הרחוק. גם במסלול המקוצר יש ,signal transduction אולם מסלול האותות אינו מוביל פנימה לגרעין אלא הסיגנל פועל במהירות לשינוי הפעולה של חלבונים קיימים בתא. משמאל :רשימה של מעבירי מסר שניוניים. באיור משמאל למטה אנחנו רואים מסלול אותות של חיישן לאור .ניתן לראות כיצד האות מועצם – מפוטון אחד מקבלים 105מוקלולות שעוברות את ההידרוליזה. קולטנים משופעלי GTPוATP- במנגנון פעילות אחד )מימין( חלבון שקשור ל ,GDP-יופעל על ידי החלפה של נוקליאוטידים )ל .(GTP-הכיבוי נובע מההידרוליזה. במנגנון אחר )משמאל( ההפעלה יכולה להיות מבוססת על פוספורילציה ודה-פוספורילציה .הזירחון משתמש באנרגיה של הפיכה ATPו ADP-והדבקה של פוספט לאחת מחומצות האמינו של החלבון )סרין ,טריאונין או טירוזין( .הכיבוי נעשה על ידי פוספאטאז שתסיר את הזרחן. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , שיעור :20העברת אותות 221 קולטנים מצומדי אנזימים הסוג השלישי של קולטנים הם קולטנים מצומדי אנזימים .אנחנו יכולים לראות באיור דוגמה לפעולה של קולטן ה – RTK-רצפטור טירוזין-קינאז ,כלומר קולטן שקושר ליגאנד ואז עושה זירחון של טירוזין. הקשירה של הליגנד גורמת לשני דברים :תחילה הפעלה של פעילות הקינאז ושנית הבאה למצב דימריזציה .הקצה של כל רצפטור יודעים לזרחן את הקצה של הרצפטור השני בדימר ,כך שמקבלים שני קצוות מזורחנים במקומות שונים .על אותו זירחונים נקשרים חלבונים מתאמים שיודעים להעביר את הסיגנל לתוך התאים במסלולים שונים. במצב הדימרי המזורחן והמאוקטב ,הרצפטור קושר חלבון מתאם והלה קושר חלבון Ras-activatiing .proteinחלבון ה Ras-הוא חלבון ,Gאשר עקב החלפת נוקליאוטידים הוא מופעל ובמצב זה הוא יכול להמשיך להעברת האותות .שימו לב ש Ras-עדיין קשור לממברנה. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 , חמוטל בן דב 222 ביולוגיה של התא -הרצאות1 המעבר של הסיגנל לתוך התא נעשה על ידי קאסקאדה של קינאזות – ראס יודע לאקטב קינאז – כאשר כל קינאז מאקטב קינאז אחר .כל אקטיבציה נעשית על ידי זירחון שמאקטבת את הקינאז הבאה. הקינאז האחרון יודע לזרחן חלבונים שונים שגורמים לשינוי בביטוי הגנים או שינוי בפעילות החבונים. קאסקאדה כזו היא הזדמנות לעשות אמפליפיציה מאוד גדולה של האות; אולם אם דיברנו על כיבוי כאן יש חשיבות רבה ליכולת לכבות כל קינאז – כיבוי על ידי פוספאטאז של הקינאזות וכיבוי על ידי הידרוליזה מ GTP-ל GDP-בחבון .Ras המנגנונים האלה חשובים מאוד בהיווצרות תאים סרטניים – הפעילות של החלבונים האלה חייבת להיות מבוקרת ואם למשל Rasהוא מוטנט ולא יכול לעשות הידרוליזה הוא פעיל באופן קונסטיטוטיבי ,מבטא באופן קבוע את הגנים ,גורם לפרוליפרציה )גידול( מתמיד של התאים וכך מביא לגידול סרטני. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2010 ,
