docגנטיקה - מעבדה
download 
Report Transcription
גנטיקה - מעבדה
שיעור :01מבוא למוטציות בחיידקים 1 שיעור :01מבוא למוטציות בחיידקים ספרות ורקע על המעבדה קריאת חובהMolecular Genetics of Bacteria, Mutations in Bacteria, Capter 3 pages 75- : .102בקורס אנחנו נגיע למסקנות כאלו ואחרות אך יש מי שחושב אחרת ולכן יש גם קריאה מומלצת לראות ולהכיר גישות אחרות. העבודה בחלק זה תבוצע בחיידקי .E.coliחיידקים אלו היו מקור בסיסי למחקר מנגנונים בסיסיים רבים בביולוגיה וגנטיקה ונחקר מזה כ 100-שנה .החיידק מכיל גנום של כ 4.5-מיליון זוגות בסיסים וכ4000- גנים ,כאשר אחוז מאוד גבוה מתוכם מוכר היום למדע. יתרונות בעבודה עם חיידקים • קטנים מאוד – ניתן להגיע לאוכלוסיות מאוד גדולות בנפח מאוד קטן .במבחנה קטנה ניתן לגדל תרבית של מיליוני חיידקים .גודל האוכלוסיה חשוב משום שבמחקר גנטי אנחנו מחפשים פרטים שהתכונות שלהם נדירות – מוטנטים – ולכן אוכלוסיות גדולות מגדילות את הסיכוי למצוא פרטים נדירים אלו. • זמן דור – הזמן שדרוש לאוכלוסיה להכפיל את עצמה .לחיידק E.coliזמן דור של כ 20-דקות. הגדילה היא אקספוננציאלית כך שביום אחד אפשר להגיע לאוכלוסיות של מילארדים. • הפלואידים – הפנוטיפ הוא הגנוטיפ ולכן קל יותר לראות אותו ,אין מיסוך על ידי אלל שני. • רבייה א-מינית – חיידק אחד משכפל את הגנום בדיוק יוצא דופן ומתחלק לשני תאים בעלי אותו מטען גנטי .חיידק אחד שמתרבה כמה שעות יוצר שבט ) (cloneשלכולם אותו מטען גנטי .אם למשל מבקשים להפיק חלבון ,יעיל יותר להפיק אותו משבט מסויים מאשר מחיידק בודד. • קל לעשות מניפולציות גנטיות – אפשר להוריד גנים ,להשתיק אותם ,להוסיף גנים ולהעביר גנים בין חיידקים ,בניגוד למערכות של תאים הומניים .בעזרת החיידקים ניתן להתעסק בגנטיקה בלי מכשולים טכניים של המערכת. מוטציות מוטציה היא כל שינוי ברצף ה DNA-שעובר בתורשה לצאצאים הבאים .מוטציות יכולות להיות ממגוון סוגים :חסרים ,הוספות ,החלפות וכדומה .מוטציות יכולות להשפיע על גנים באופנים שונים – הן יכולות למנוע תוצר גני ,לשנות את אורכו ולהשפיע על התכונות שלו כמו אינטראקציה עם סובסטרטים או חלבונים אחרים. מוטציות יכולות להתרחש כתוצאה מגורם חיצוני – קרינה או חומר כימי שמשנים את ה ,DNA-או על ידי מנגנונים טבעיים ,למשל טעויות שיכפול של DNA-Polymeraseשאינן מאותרות במנגנון ההגהה. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב גנטיקה -מעבדה 2 מקור העניין במוטציות נניח שיש אוכלוסיית חיידקים ובתוכה חיידקים שפיתחו עמידות לאנטיביוטיקה; בעזרת האנטיביוטיקה ניתן לבצע סלקציה ולברור את הפרטים העמידים .היכולת הזו מכונה סמן או .marker מרקרים אינם רק מוטציות של עמידות. חיידקים יודעים לסנטז את כל חומצות האמינו שלהם; חיידק מסוג זה מכונה פרוטוטרופ .יחד עם זאת ישנם מוטנטים הפגועים במסלול הביוסינטטי של הפקת חומצות אמינו כזו או אחרת .חיידק כזה יהיה מכונה אוקסוטרופ של אותה חומצת אמינו. חיידק שלא יודע לסנטז אלמנט מסויים מכונה אוקסוטרופ ביוסינטטי .אולם יש עוד סוג אוקסוטרופיה, אוקסוטרופיה קטאבולית :חיידק כזה אינו מסוגל לנצל מקור פחמן מסויים בתור מקור פחמן לגידול .כך למשל חיידק שלא יכול לנצל לקטוז לגידול מכונה אוקסוטרופ ללקטוז .מרקרים אחרים יכולים להיות גודל המושבה ,צורתה ,הצבע שלה וכן רגישות לטמפרטורה. מוטציות יכולות לעזור לנו לא רק לבודד פרטים אלא גם ללמוד על תהליכים שונים. שיעור מוטציה ,סלקציות והעשרות מוטציות הן אירועים נדירים ,ולכן נקבע מושג שיעור המוטציה – הסבירות שנמצא חיידק בעל מוטציה מסויימת באוכלוסיה .שיעור המוטציה משתנה והוא תלוי פנוטיפ לחלוטין. נניח שיש תרבית המכילה מיליארד חיידקים ומתוכם בערך 10הם המעניינים אותנו .כיצד נוכל לחלץ אותם מהתמיסה? אנחנו יכולים לקחת את התמיסה הנוזלית ולגדל את הפרטים בתור מושבות על צלחות .ואולם ,עדיין יש לנו בעיה כי יש גבול לכמות המושבות המבודדות שניתן לזרוע על צלחת. אם החיידקים עמידים לחומר כלשהו ,למשל אנטיביוטיקה ,ניתן לגדל אותם על מצע עם אנטיביוטיקה ואז המוטנטים יהיו היחידים שייגדלו; זוהי סלקציה חיובית – יצירת תנאים שבהם אך ורק המוטנטים גדלים .אולם מה קורה עם חיידקים שפגועים במסלולים מסויימים ,למשל סינטזת היסטידין? במקרה הזה אנחנו עושים סלקציה שלילית :זורעים את החיידקים על מצע עשיר ,שמאפשר לכל החיידקים לגדול ,רק כדי להפריד בין פרטים בודדים; חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :01מבוא למוטציות בחיידקים 3 אז דוגמים כל מושבה פעם אחת על פלטה ללא היסטידין ופעם אחת לפלטה עם היסטידין .האוקסוטרופים להיסטידין לא ייגדלו בצלחת הראשונה ולכן נדע שהם האוקסוטרופים .שימו לב שצריך לשמור את המושבה המקורית כדי לחזור אליה .לשיטה זו יש חיסרון גדול מאוד כי אנחנו עדיין צריכים לסרוק צלחות גידול שלמות כדי למצוא מוטנט בודד. על מנת לשפר את התהליך עושים העשרה .ההעשרה נעשית במערכת של סלקציה נגדית .נניח שרוצים לחפש חיידק שאינו עמיד לעקת חום .עקת חום מתרחשת כאשר מגדלים את החיידקים בטמפרטורה של .42°Cמגדלים תרבית של חיידקי WTב- ;42°Cאם יש מוטנט לא עמיד הוא פשוט יפסיק את הגידול שלו .כאשר חיידק לא יכול להתמודד עם התנאים הוא מפסיק את הגידול ,אך לאו דווקא מת .אם בשלב הזה נוסיף חומר שפוגע בחיידקים שמתחלקים ,המוטנט יהיה בסדר אבל החיידקים האחרים ,WT ,ימותו )אנטיביוטיקת אמפצילין( .בסוף התהליך נשארים עם הרבה יותר חיידקים מוטנטים )ועדיין עם חלק מה WT-שפשוט לא התחלקו בזמן מתן האנטיביוטיקה מסיבות כאלה ואחרות( ועכשיו אפשר לבודד את החיידקים המוטנטים על ידי השיטה שציינו קודם. שימו לב :בפועל בכל אוכלוסיית WTיש תת-אוכלוסיה שאינה מתחלקת ולכן תהליכי סלקציה נגדית אינם מוחקים טוטאלית לא-מוטנטים ,להבדיל מסלקציה חיובית. למארקיזם ודארוויניזם במעבדה נבצע סלקציה חיובית ונבודד מוטנטים בסלקציה נגדית ,ובסוף נבחן את המקור למוטציות – שאלה שטרדה חוקרים כבר לפני כ 60-שנה .הגישה הדארוויניסטית אומרת ששינויים גנטיים אקראיים קורים כל הזמן ,ואלו מביניהם שנותנים יתרון – שורדים .הגישה הלמארקיסטית אומרת שהסביבה גורמת לשינויים באופן ישיר בחיידק והשינויים האלה משפיעים על הגנום. • היפותזת המוטציה האקראית – מוטציות מתרחשות כל הזמן. • היפותזת השינוי הישיר – מוטציות מתרחשות רק כתוצאה מחשיפה לגורם סלקטיבי. סלוואדור לוריה ומקס דלברוק היו שני חוקרים שבדקו איזו היא הגישה הצודקת .הם פיתחו מערכת פשוטה לבדיקה זו ,שזיכתה אותם בפרס נובל :המערכת הייתה עם חיידקים שרגישים לפאג' .T1בכל תרבית יש מספר חיידקים שווה והם זורעים את החיידקים מתרבית עשירה למצע עם .T1 החוקרים ציפו שלפי התפלגות המושבות המוטנטיות על הפלטות השונות הם יוכלו לקבוע האם זהו מצב אקראי או מכוון :אם השונות בין המושבות תהיה נמוכה ,המודל יהיה למארקיסטי ואם שונות תהיה גבוהה המודל יהיה דארוויניסטי. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב 4 גנטיקה -מעבדה לפי למארק ,רק ברגע הפגישה עם הגורם הסלקטיבי אפשר ליצור מוטנט .כתוצאה מכך כל חיידק שיתיישב על הפלאטה ויהיה לו אירוע מוטציה ייתן מושבה אחת .כמו כן מכיוון שמוטציה היא אירוע נדיר אנחנו יכולים לצפות שמכל מבחנה נקבל מושבות ספורות בלבד – אם בכלל .אם נצייר גרף של אירועי המוטציה הגרף יהיה צר מאוד ,בעל שונות מאוד נמוכה. לעומת זאת לפי דארווין ,המוטציות יכולות להתרחש בכל שלב – ואפילו עוד במבחנה .אם המוטציה התרחשה מוקדם בנוזל החיידק המוטנט ממשיך להתרבות ואז יש תת-אוכלוסיה של מוטנטים .כל חיידק מתת-אוכלוסיה זו ייגע בצלחת וייצור מושבה, ולכן במקרים כאלה של מוטציה עוד בנוזל אנחנו נקבל צלחת מלאה מושבות עמידות ,לעומת מקרים בהם לא הייתה מוטציה מראש ואז מספר המושבות יהיה קטן מאוד אם בכלל .קיומה של פלטה כזו שמייצגת אירוע מוטציה מוקדם בנוזל מרחיבה את השונות ,מפזרת את התוצאות והופכת את הגרף לשמן יותר .כמו כן אנחנו יכולים לומר שאירוע חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :01מבוא למוטציות בחיידקים 5 מוטציה אחד אינו שווה למושבה אחת – הוא יכול להיות גם מקור למושבות רבות. אירועי מוטציה ,בכל אחת מהתיאוריות ,מתפלגים לפי התפלגות פואסון ,הקרובה להתפלגות נורמלית אבל מתייחסת למקרים בהם ההסתברות שמשהו יקרה היא נמוכה מאוד. כאמור, בגישה הלמארקיסטית אירוע מוטציה אחד שווה למושבה אחת ולכן אם נצייר גרף פואסון של ההתפלגות נראה הרבה צלחות ללא מושבות ,מעט צלחות עם מושבה אחת ,פחות מכך עם שתי מושבות וכן הלאה .בגישה הדארוויניסטית לעומת זאת ,מוטציה אחת שווה מספר רב של מושבות ולכן יכול להיות שתהיה התפלגות דומה לפואסון בהתחלה אבל יהיה גם פיק מסויים באיזור של כמה עשרות או מאות מושבות – תלוי כמה מוקדם היה אירוע המוטציה בנוזל. לפי ניסוי זה לוריה ודלברוק הצליחו לענות על שאלת המקור הגנטי – והם הצליחו בעוד משהו: לחשב את שיעור המוטציה .הם הגדירו את שיעור המוטציה ) (aבתור היחס בין מספר אירועי המוטציה ) (mלמספר החיידקים בתרבית ).(N כמות החיידקים שהיו בתרבית לא בעיה לדעת ,אבל כמות אירועי המוטציות יותר מורכבת משום שאם ספרנו חמש מושבות של מוטנטים אין משמעות הדבר שהיו לנו חמישה אירועי מוטציה :אם הגישה של דארווין היא הנכונה הרי שיכול להיות שהיו כל מספר של אירועי מוטציה בין 1ל 5-בנוזל ,והם פשוט התחלקו ולכן הגיעו בסופו של דבר לחמש מושבות .לכן לוריה ודלברוק חיפשו דרך לדעת בכל זאת כמה אירועי מוטציה היו .אנחנו יודעים שאם יש צלחת עם אפס מושבות או מושבה אחת מספר אירועי המוטציות ידוע בוודאות – 0או ,1בהתאמה. לכן לוריה ודלברוק ספרו צלחות עם אפס אירועי מוטציה ,הציבו את הנתון הזה במשוואה של חישוב ההסתברות הפואסונית ,ומתוך זה חילצו את ,m שיעור המוטציות. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב גנטיקה -מעבדה 6 שיעור :02קוניוגציה בחיידקים בשיעור שעבר ,איה הזכירה את יתרונות חיידקים למחקר גנטי ואחד מהם היה העובדה שכאשר הם מתרבים הם נוקטים בשיטה א-מינית כך שהמושבה תהיה אחידה מבחינת שונות הגנומים בפרטים .היום נבדוק האם באמת זו שיטת הרבייה היחידה העומדת לרשותם. רבייה מינית בחיידקים? מגדלים בשתי מבחנות שונות שני אוקסוטרופים שונים. כאשר מאחדים דגימות מכל אחת מהמבחנות ,מדגירים וזורעים את החיידקים על צלחת שלא מכילה את החומר הדרוש לכל אוקסוטרופ על מנת שייגדל ,רואים שיש גידול במושבות בודדות. יכול להיות שהיו במבחנות המוצא רברטנטים אשר היו מסוגלים לגדול על מצע עני ,והצאצאים שאנו רואים במבחנה המשותפת הם מוטנטים; על מנת לבטל אפשרות זו שהצאצאים הם מוטנטים ,החוקרים לדרברג וטאטום ) (Lederberg & Tatumחזרו על הניסוי באוקסוטרופים שהיו מוטנטים לשלושה מסלולים שונים .הסיכוי שתהיה רברסיה בשלוש מוטציות הוא נמוך מאוד ,ואכן אין גידול ממבחנות המוצא אך עדיין יש גידול במבחנה המשולבת. החוקרים חשדו שקרה תהליך שזכה לכינוי קוניוגציה, והצאצאים הם קוניוגנטים .אולם ,יכול להיות שזה לא מעבר של חומר גנטי בין החיידקים כי אם הזנה – האוקסוטרופ האחד מספק את צורכי האחר וההיפך .לשם כך החוקר דייויס ) (Davisערך אותו הניסוי במבחנה בצורת Uעם ממברנה באמצע שמונעת מעבר חיידקים אך לא מונעת מעבר מומסים; כך דייויס הוכיח שלא חומרים מומסים הם העוברים. ב 1953-טבע החוקר הייס ) (Hayesאת המונח Donorו- ,Recipientכאשר החיידק ה"זכר" – התורם – מכיל יחידת פלסמיד עם גנים המאפשרים העברת הפלסמיד חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :02קוניוגציה בחיידקים 7 מהתורם אל המקבל .בסדרת ניסויים זו נעסוק בחיידקים בעלי הפלסמיד הקוניוגטיבי הראשון שגילו – .F-plasmid כיצד מבוצעת קוניוגציה? חיידק תורם מסומן בתור F+ומסוגל להעביר את הפלסמיד F-שלו לחיידק מקבל ,שהוא בהכרח ) F-לא ניתן לתרום לחיידק שכבר יש לו את הפלסמיד הקוניוגטיבי(. בשלב הראשון החיידק התורם בונה ,Pillusהנשלח אל החיידק המקבל .כאשר נוצר מגע הפילוס מתחיל להתקצר עד שהחיידקים נצמדים .לאחר שהם נצמדים מתחיל שכפול של הפלסמיד תוך כדי הכנסת הגדיל הנגדי לגדיל המשוכפל אל תוך לתא המקבל ,במנגנון של .rolling circleבצורה זו התא התורם משכפל את הגדיל האחד ומשאיר איתו פלסמיד דו גדילי והגדיל השני נכנס לתא המקבל ,שם הוא משוכפל על ידי מקטעי אוקאזאקי. בסופו של דבר לשני התאים יש פלסמיד דו-גדילי שלם. F-Plasmid המערכת של הפלסמיד חייב להכיל מספר אלמנטים: • – Origin of Replicationמקור תחילת ההכפלה, המגובה על ידי מערך גנים הקשורים בשכפול של הפלסמיד – .Replication Genesזה איזור שקיים בכל פלסמיד שהינו בעל היכולת לשכפל את עצמו לדורות הבאים. • – Origin of Transferמקור תחילת ההעברה במנגנון ה Rolling Circle-על ידי מערך הגנים .Genes of Transfer באיור שבעמוד הבא מופיע תהליך ה.Rolling Circle- נראה שהגנים של ההעברה ) (Transfer Genesנמצאים בסופו של המעגל שנכנס לתא המקבל; משמעות הדבר היא שרק אם התא המקבל ייקלוט את כל הפלסמיד השלם הוא יוכל להמשיך להעביר את הפלסמיד הלאה )יהפוך לחיידק .(F+כמו כן ,במהלך ההעברה הגדיל הנותר בתורם החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב גנטיקה -מעבדה 8 משמש כתבנית לשיכפול. רכישת תכונות בסיסיות על פי רוב ,תכונות בסיסיות – כרומוזומליות – אינן נמצאות על גבי פלסמיד .אולם ,בניסויים ראו שבעזרת קוניוגציה עברו תכונות של יכולות בסיסיות .הכיצד? החוקר קאבאלי ) (Cavalli-Sforzaבודד קבוצה של חיידקים שנמצאו כמעבירים את התכונות הבסיסיות בשכיחות די גבוהה, וכינה אותם .Hfr – High Frequency Recombinationמה שקאבאלי גילה היה שהפלסמיד עבר ריקומבינציה עם הכרומוזום של החיידק ,כך שכעת הכרומוזום מכיל את הGenes of - Transferולכן מסוגל לעבור בין חיידק תורם למקבל. הגן הקרוב ביותר לנקודת התחלת ההעברה יהיה הראשון שייכנס לחיידק המקבל .אולם ,הכרומוזום משמעותית גדול מפלסמידF- ולכן ברוב המקרים הקוניוגציה נפסקת לפני מעבר שלם של הכרומוזום .בצורה זו החיידק המקבל רוכש לעצמו רק מקטע של כרומוזום התורם ולא את כולו. אם המקטע הלינארי של החיידק המקבל הכיל אלל תקין לאיזושהי מוטציה של החיידק המקבל ,על המקטע הלינארי הזה לעבור ריקומבינציה לתוך הגנום של החיידק המקבל – רק כך האלל התקין ייכנס לתוך הכרומוזום. שימו לב :כיווניות ההעברה נשמרת! הגנים של Traנמצאים באותו המקום על הכרומוזום כמו בפלסמיד ,כלומר בסוף ,ולכן חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :02קוניוגציה בחיידקים 9 הכיווניות של הכרומוזום – מבחינת הגנים ,המיקום שלהם ,מרחקי המפה – נשמרים .מסיבה זו חיידק מקבל גם לא יהפוך לחיידק תורם של כרומוזומים אלא אם הכרומוזום כולו יעבור. ריקומבינציה הומולוגית בין שני מקטעים קומפלמנטציה שיש יכולה ביניהם להתרחש ריקומבינציה הומולוגית .אם המקור הוא למשל שני מקטעים לינארים, אדום וכחול, ומתרחש אירוע ריקומבינציה אחד ,מתקבלים שני מקטעים לינארים עם חתיכות כחולות ואדומות משולבות; בשני אירועים עדיין נקבל מקטעים לינארים. לעומת זאת ,בין שני מקטעים מעגליים ריקומבינציה יחידה תוביל ליצירה של מקטע מעגלי אחד וגדול. ריקומבינציה כפולה תביא להחלפה של מקטעים ושמירה על שני הכרומוזומים המעגליים. בריקומבינציה הומולוגית בין מקטע לינארי למעגלי תתקבל בריקומבינציה בודדת לינאריזציה של המקטע המעגלי ,אבל בריקומבינציה כפולה נקבל שמירה על המעגליות/לינאריות של כל דו-גדיל והחלפת מקטעים בין המקטע הלינארי למעגלי. כיצד מתבצעת הכניסה של Hfrהפלסמיד לגנום? F-plasmidמכיל הרבה מאוד קטעי .IS elementsהקטעים האלה קיימים גם בכרומוזום ונוטים לעודד ריקומבינציה ,כך שיש סבירות גבוהה שתהיה ריקומבינציה יחידה שתכניס את Fפלסמיד לתוך הכרומוזום. לעומת זאת ,החיידק המקבל מכיל את המקטע הלינארי שקיבל בקוניוגציה ,ואם תהיה ריקומבינציה בודדת הכרומוזום של החיידק יהפוך לינארי – מצב לא תקין .לעומת זאת אם המקטע A+ייכנס בריקומבינציה כפולה המעגליות של הכרומוזום תישמר ,האלל a- יעבור למקטע הלינארי )אשר יעבור דגרדציה בגוף החיידק(, והתוצאה תהיה החלפה של אלל אחד באלל אחר. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב גנטיקה -מעבדה 10 במעבדה אנחנו נעשה ניסוי של ,interrupted matingשבו ננסה לגרום לחיידקים לעבור קוניוגציה ונעצור אותה לאחר פרקי זמן שונים .מכיוון שהכיווניות נשמרת ,ניתן לחפש סמנים מוכרים על הכרומוזום ,לראות באיזה סדר הם עוברים ולהחליט מהו הסדר הלינארי של הסמנים. בשיטה הזו בעבר מיפו את כל הכרומוזום של ה ;E.coli-אולם ,על הכרומוזום יש כמה אתרי IS elementsכלומר שבין זני Hfrשונים נקודת תחילת ההעברה עשויה להיות שונה – כל פלסמיד נכנס למקום אחר בגנום ולכן סדר המארקרים יהיה שונה לינארית )גם אם יהיה זהה מעגלית( .כמו כן הכיווניות של כניסת הפלסמיד יכולה להיות שונה. יצירה של זן Hfrמזן F+ויצירה של 'F הפלסמיד נכנס בעזרת אתר .IS elements ריקומבינציה נוספת בין שני האתרים האלה יכולה לפלוט החוצה את הפלסמיד .אולם ,אין חובה שהריקומבינציה תתרחש בין אותם IS elements שהכניסו את הפלסמיד; היא יכולה באותה מידה להתרחש רק בין אחד מה IS elements-האלה ועוד IS elementשאינו תוחם את הפלסמיד .כתוצאה מכך הפלסמיד החדש שנפלט מתוך הכרומוזום מכיל פלסמיד F-ועוד קצת – עוד גנים מתוך הכרומוזום החיידקים. הפלסמיד הזה מכונה פלסמיד ' ,Fואם הפלסמיד הזה עובר בין חיידקים ,מכיוון שהוא מספיק קטן כדי לעבור בשלמות כמו פלסמיד ,F+הוא יישמור על צורתו המעגלית בגופו של החיידק המקבל וכך החיידק המקבל יהפוך דיפלואידי לגנים הספורים שהועברו על ידי פלסמיד ' .Fחיידק זה יהיה מכונה מרופלואידי או מרוזיגוט. בשיטה זו למדו בעבר על תכונות של דומיננטיות ורצסיביות – על ידי יצירת מרופלואידים יכלו לבדוק מיהו האלל הדומיננטי ,זה שעל הכרומוזום או זה שעל הפלסמיד. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :02קוניוגציה בחיידקים 11 סיכום • חיידק F-הוא חיידק ללא פלסמיד קוניוגטיבי ויכול להיות מקבל פלסמיד. • חיידק F+הוא חיידק המכיל פלסמיד קוניוגטיבי ויכול להיות תורם לחיידק .F- • חיידק Hfrהוא חיידק שבו הפלסמיד עבר ריקומבינציה יחידה ונכנס לתוך הכרומוזום .כעת החיידק יכול להעביר מקטעים לינארים של הכרומוזום לחיידקים אחרים. • חיידק ' Fהוא חיידק שהיה Hfrואז ,עקב ריקומבינציה פנימית בכרומוזום ,הפלסמיד יצא החוצה באופן יותר ממלא – וכעת הוא מכיל גנים כרומוזומליים .החיידק יכול להעביר את הפלסמיד לחיידקים אחרים ולהפכם למרופלואידים ובעלי .Genes of Transfer החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב גנטיקה -מעבדה 12 מעבדה :03גנטיקה בשמרים השמרים הם חלק ממערכת הפטריות ,המכילה גם את העובש והפטריות .השמר מתקיים באיזורים מגוונים ,בעיקר איזורים עשירים בסוכר – דוגמת קליפות ענבים. מאפייני השמר: • חד-תא אאוקריוט בעל 16כרומוזומים. • עובר חילוף דורות ויכול להיות הפלואידי ודיפלוחאידי. • יכול לשמש מודל ליצורים מורכבים יותר )כי הוא אאוקריוט(. • הגנום שלו היה הראשון שרוצף ,כאשר הוא מכיל 12מיליון זוגות בסיסים וכ 6000-גנים שאנו מכירים את הפונקציה של רובם )בניגוד לאדם בו מוכרת הפונקציה של פחות מרבע מהגנים(. מניפולציות גנטיות ,במיוחד חוסרים של גנים ,הן קלות יחסית בשמר ,ונעשות בעיקר על ידי טרנספורמציות וריאקומבינציות .ניתן להכניס לשמר מקטע לינארי המכיל גן סימון כלשהו – עמידות לקאנאמיצין למשל .משני צידי הגן יש מקטעים שיכולים לבוא בריקומבינציה עם קטע מסויים בגנום. הריקומבינציה מכניסה את העמידות לגנום במקום הגן שאנחנו מבקשים לעשות לו חסר ,ואז אנחנו יכולים לבודד את השמרים שהכניסו את המקטע על ידי האנטיביוטיקה מחד ,ולדעת שהם בעלי חסר בגן המעניין אותנו מאידך. מיטוזה השמר יכול להתקיים בשני מופעים :הפלואידי ודי- פלואידי ,המתרבים בחלוקות מיטוטיות .בחלוקות מיטוטיות יש הכפלה של ה DNA-המחולק לאחר מכן באופן שווה ,בעיקרון ,בין שני תאי הבת .מכיוון שזוהי מיטוזה ,תאי הבת לרוב יהיו זהים לחלוטין לתא האם )אלא אם תתרחש ריקומבינציה מיטוטית, שהיא אירוע נדיר בתהליך זה(. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , מעבדה :03גנטיקה בשמרים 13 באיור הבא מופיע מחזור החיים של השמר .ניתן לעקוב אחר שלב החיים של התא לפי גודל התא המנץ ,עד שהוא משתחרר מתא האם והופך לתא בפני עצמו .המחזור הזה קורה בתאים דיפלואידים והפלואידים כאחד .תא האם יכול להיות מזוויג מסויים – כאשר בשמרים הזוויגים הם aאו .α דיפלואידים מכילים אללים של aושל αיחד. סקס בשמרים כאשר שני תאים הפלואידים משני זוויגים שונים נפגשים הם יכולים, בתנאים מתאימים ,לעבור .mating בתהליך זה כל תא מפריש פרומונים, שהתא השני חש ואז שולח שלוחות ומתקרב .בתהליך ה mating-שני התאים מתאחים לאחד. ספורולציה ספורולציה היא תהליך המתרחש במצבי עקה שאינם מאפשרים לשמר להתחלק מיטוטית .כתוצאה מתנאי העקה התא הדיפלואיד יעבור מיוזה ליצירת ספורות ,שהן גוף עמיד יותר מהתא החי ויכולות לשרוד את תנאי העקה .בתהליך הספורולציה ארבעת תאי הבת של המיוזה אינם נפרדים אלא נותרים יחד בשק אסקוס וכל ספורה בתוך השק הינה בעלת מעטפת קשיחה היכולה לעמוד בתנאי העקה .ישנן שתי ספורות מכל זוויג בתוך אסקוס ספציפי. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב גנטיקה -מעבדה 14 לאחר שיעברו תנאי העקה יכולות הספורות לצאת מהאסקוס ולנבוט; מרגע שנבטו הם תאים הפלואידים חיים ,לא עוד ספורות ,שיכולים לעבור זיווג עם שמר אחר מהזוויג ההפוך להם .האיור הבא מציג שוב את מחזור החיים של השמר ,עם הידע החדש שלנו אודות תהליכי הזיווג והספורולציה שלהם. שינוי זוויג Mating Type Switchingהוא תהליך שבו שמר הפלואידי יכול לעבור מזוויג אחד לאחר .מצב זה מגן על ההפלואיד ממוטציות מזיקות שיכולות להתבטא כשהוא במצב ההפלואיד; במידה ולא זמינים בסביבתו בני זוויג הפוך ממנו ,הוא יכול להחליף זוויג ,להזדווג עם שמר סמוך ולהגיע למצב דיפלואידי – מצב בו הגנים שלו מוגנים יותר מפני מוטציות באללים מכיוון שכעת יש גיבוי על ידי שני אללים ולא אלל יחיד לכל גן .כמו כן במצבי עקה הדיפלואיד יכול לעבור ספורולציה ,להבדיל מההפלואיד. יש לציין כי במעבדה הזנים אינם יכולים לשנות את הזוויג. הגדרת הריקומבינציה ריקומבינציה )הומולוגית( היא שיחלוף בין שני מקטעי DNAהומולוגים .התהליך הזה יכול לשמש למשל לתיקון שברים בגנום ,כאשר הכרומוזום השבור יכול לעבור ריקומבינציה עם גדיל תקין ,ועל בסיסו לבנות את החלק החסר בו .השבירה של הכרומוזום גורמת לאותו איזור להיות מאוד פעיל ולכן הוא נוטה לעבור את הריקומבינציה. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , מעבדה :03גנטיקה בשמרים 15 דרך אחת לריקומבינציה היא תהליך הקרוס-אובר ,שבה מקטע מכרומוזום אחד עובר לכרומוזום השני; בתהליך המרת הגנים ) (Gene Conversionהסיב השבור פשוט מעתיק את המידע מהסיב התקין וכך משלים את הפער שנוצר בו. כאשר הגנום תקין ,ריקומבינציה תתרחש בתהליך המיוזה בין שני כרומוזומים הומולוגים פרנטאליים .התהליך מתרחש על ידי בניית כיאזמות בין שני הכרומוזומים שבהן מתרחש שיחלוף חומר גנטי .התוצר של הריקומבינציה מביא לשונות גנטית בין הורים לצאצאים .התהליך מתוכנת, מחייב ושכיח. הריקומבינציה יכולה לשמש אותנו לדעת האם גנים נמצאים בתאחיזה או מרוחקים :אם גנים מרוחקים או נמצאים על כרומוזומים שונים ,אנחנו מצפים שיהיה סיכוי שווה לקבל בצאצאים הפרדה בין הגנים לעומת המצב הפרנטאלי .לעומת זאת ,אם הגנים סמוכים זה לזה על אותו הכרומוזום אנחנו מצפים שהיכולת שלהם להיפרד בצאצאים נמוכה יותר כי יש פחות סיכוי לריקומבינציה במרחק המצומצם שביניהם. מורגן הגדיר כי התפלגות הצאצאים מעידה על המרחק בין שני סמנים הגנטיים ולמעשה הגדיר את המונח סנטי-מורגן ,יחידה אחת של מרחק בין הגנים 1% .של ריקומביננטים שווה למרחק של 1 סנטימורגן ולכן איננו יכולים להגדיר יותר מ 50-סנטימורגן בין גנים – שכן לא ניתן לקבל התפלגות של יותר מ.50:50- החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב גנטיקה -מעבדה 16 מטרת הניסוי במעבדה ניקח זן דיפלואידי בעל גנוטיפ הורים ידוע ,נגרום לשמר לספורולציה ולפי התפלגות הצאצאים ההפלואדים נלמד על הגנוטיפים של ההורים ועל תכונות נוספות של הגנום .למשל ,אם ההורה היה הטרוזיגוט ליכולת לסנטז אדנין אנחנו מצפים שמחצית מההפלואידים יהיו תקינים ומחצית לא-תקינים. אולם ,מכיוון שהתרבית שלנו מקורה בהרבה תאים דיפלואידים, נתקשה לשייך צאצאים להורים ספציפיים; אפשר במקום זאת להפריד אסקוסים ,לפרק אותם ולזרוע אותם לצלחת – תהליך המכונה אנאליזת טטראדות .זאת לעומת השיטה השנייה ,שבה הצאצאים מפוזרים בצלחת באופן אקראי ואיננו יודעים מהו המקור של הצאצאים. בעזרת אנאליזת הטטראדות ניתן לאתר גם רביעיות ספורות חריגות ,למשל מצב שבו מוצאים שלושה מסוג אחד וצאצא אחד מהסוג השני; דבר כזה יכול לקרות למשל בריקומבינציה הומולוגית בעת המיוזה ,שיכולה הייתה לגרום לקרוס-אובר או המרת גנים, שיביאו לשינוי המצב הצפוי. יחסים בין אללים וגנים המוטציה פנוטיפ הדיפלואיד פנוטיפ הספורות ההפלואידיות )(% מוטציה רצסיבית a-/A+ A+ 50:50 A+ B+ (prototroph) = 25% מוטציות רצסיביות בגנים שונים לא אחוזים באותו מסלול ביוסינטטי A+ B+ B+/b- A+/aמוטציה רצסיבית a/a 2אללים מוטנטים רצסיביים שונים a/a חמוטל בן דב A+ b- (oxotroph) = 25% a- B+ (oxotroph) = 25% a- b- (oxotroph) = 25% a a a a = 50% a = 50% החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :04גנטיקה של האדם 17 שיעור :04גנטיקה של האדם כל הדברים שציינו קודם בתור יתרונות של מערכות המודל הופכים במחקר הגנטי באדם לקשיים – שנות הדור ,הגנום הגדול והדיפלואידי ,מעורבות של גנים רבים בתכונות ,מערכות מודל מוגבלות ,קושי במניצפולציות גנטיות ושאלות אתיות .מכאן שאנחנו מוגבלים לשאלות שאנחנו יכולים לענות עליהן כמעט רק בעזרת המצב הקיים. פולימורפיזם באוכלוסיה לתחום זה נכנס הפולימורפיזם – גיוון תכונות .עולה השאלה מה ההבדל בעצם בין פולימורפיזם לבין אללים שונים הנובעים ממוטציות? שהרי אלו אללים ואלו אללים .התשובה היא השכיחות – ישנו ערך סף באוכלוסיה ואלל נחשב פולימורפי אם הוא נפוץ ב 1%-מהאוכלוסיה ואם בפחות מכך – ייחשב כמוטציה. כמובן שיש יוצאי דופן אך זו ההגדרה השרירותית בה נשתמש בקורס זה. אם כן ,מה זה ?WTהאם זה שיער שחור ,עור בהיר? המושג הזה בתכונות פולימורפיות בטל בשישים, אבל מה שלרוב עושים הוא להגדיר את WTבתור האלל הפולימורפי הנפוץ ביותר. יש גם פולימורפיזם שנובע משינויים סביבתיים אבל אנחנו לא נתייחס אליהם במחקר במעבדה זו. חקר פולימורפיזם • חקר מחלות תורשתיות • מחקר אבולוציוני • סדר חברתי – זיהוי פרטים לצרכים שונים ,כמו זיהוי פלילי או בדיקת אבהות. עד כה הסתכלנו על סמנים גנטיים שונים של אורגניזם מודל – כמו עמידות לאנטיביוטיקה או אוקסוטרופיות – ועל ידי גידול או אי גידול יכולנו לבדוק את הנוכחות של הסמן .אם היינו יכולים לרצף את כל הפרטים היינו יכולים לדעת את הנתונים כבר ברמה הגנטית ,ולמצוא סמנים גנטיים הרבה לפני הגידול .ה DNA-מהווה עבורנו סמן גנטי כי כאשר הוא ידוע אין צורך לבצע את הניסוי ולבדוק גידול /אי גידול. סמן גנטי הוא כל שינוי ברצף ה DNA-אשר יש לו פנוטיפ שניתן לזהות .אם היינו יכולים לראות את הרצף היינו יכולים לחסוך גילוי הפנוטיפ ברמות מאוחרות יותר ,כמו רמת האורגניזם .לשם כך התפתחה שיטת הסניפים – .SNP = Single Nucleotide Polymorphismהשיטה משתמשת בריצוף של מספר מקטעים וזיהוי סניפים – אתרים שבהם יש הבדלים בין פרטים מסויימים )בחלק מהאנשים למשל יש Cובאחרים יש .(Aהאתרים האלה לא חייבים להיות מקודדים לחלבון. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב גנטיקה -מעבדה 18 מאפייני סמנים גנטיים • הסניפים הם אירועי החלפת נוקליאוטיד שהם יציבים גנטית – יש להם שכיחות מסויימת באוכלוסיה והשכיחות הזו יציבה גנטית. • הסניפים מורשים מהורים לילדים בתורשה קלאסית ,ואפשר להסתכל עליה כ"גן" תורשתי לכל דבר – יכולים להיות עד ארבעה אללים שונים לכל אתר סניפ ,מכיוון שיש ארבעה נוקליאוטידים אפשריים לאותה עמדה .אולם ,לא בהכרח תמיד יהיו כל האללים האפשריים. • שכיחות הופעת האללים – לכל אלל של סניפ יש שכיחות מסויימת באוכלוסיה ,ואין חוקיות שמגדירה שכיחויות של אללים מסויימים. ריצוף הריצוף היא שיטה טובה למציאת סמנים גנטיים ,אולם זו בעקרון שיטה יקרה )למרות שהמחקר והטכנולוגיה מוזילים אותה מרגע לדודלי( .לפיכך יש לנו סמנים גנטיים נוספים נפוצים ,יותר קלים או זולים לאיתור. RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism שינויים באתרי DNAמסויימים משפיעים על קיום או אי קיום אתר רסטריקציה מסויים .אם ניקח למשל מקטע מסויים מכרומוזום ,IIIנגביר אותו בעזרת PCRונחתוך את הגנום הזה בעזרת אנזימי רסטריקציה, נראה שבאלל Aיש שני אתרי חיתוך לאנזים ולכן מתקבלים שלושה פרגמנטים מחיתוך ה ,PCR-בעוד שבאלל Bיש קיבוע של נוקליאוטיד ששינה את אתר החיתוך של האנזים, כך שמתקבלים רק שני בנדים בתבנית של אלל .B הדוגמה הקלאסית היא אנמיה חרמשית )איך לא( :בגן שיוצר את חלבון הheme- יש מוטציה המביאה לשינוי בצורת כדורית הדם האדומה .היות וזו מחלה הנובעת ממוטציה בנוקליאוטיד יחיד בגן יחיד ,אנחנו יכולים לעשות PCRלגן ולראות מהם האללים .השינוי הנוקליאוטידי גורם לתבנית בנדים שונה בין אלל תקין לאלל חולה .כך ניתן לזהות אדם הנושא את המחלה גם ללא ריצוף. רצפי Alu רצפים אלו הם בגודל 300נוקליאוטידים בערך ,שמקורם ברטרו-טרנספוזון עתיק .הרצפים פזורים בגנום בכמעט מיליון עותקים ,ובאמצע הרצף יש אתר רסטריקציה לאנזים .AluIכל אתר ) Aluאתר של 300 נוקליאוטידים( בגנום יכול להכיל את אתר החיתוך ויכול שלא. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :04גנטיקה של האדם 19 נניח שיש אתר Aluשנמצא באוכלוסיה בתאחיזה לאלל מחלה .אם רואים שאין תאחיזה כזו לאלל הבריא ,ניתן להניח כי באמת קיימת תאחיזה לגן המוטנטי ואז ניתן להשתמש בנוכחות האתר כמרקר לגנום המוטנטי. השימוש נעשה באופן הבא :מגבירים אתר שבו אנו חושדים שיש אתר Alu בעזרת פריימרים ימני ושמאלי סביב האתר .אם אתר Aluאינו נמצא באתר ,אנחנו נקבל גודל מסויים של תוצר PCRואם הוא נוכח הגודל של התוצר ייגדל ב 300-נוקליאוטידים .כעת אם נריץ את התוצרים בג'ל נראה הבדל בריצה של כל אלל – האלל ללא Aluירוץ מהר יותר מזה עם ,Aluכי הוא קצר יותר. בהנחה שידועה תאחיזה ,אנחנו יכולים לדעת האם יש אלל חולה או לא; אם לא יודעים ,אפשר לעשות זאת לאנשים חולים ובריאים ולבדוק במי האלל מופיע ובמי לא. VNTR = Variable Number of Tandem Repeats בניגוד לאתרי Aluשפזורים בגנום לחוד ,כאן יש יחידת ליבה חוזרנית .בדוגמה יחידת הליבה מכילה 5 בסיסים )אבל יכולה להכיל גם יותר( והפולימורפיזם מתבטא במספר הפעמים שהיחידה חוזרת על עצמה. גם צורת התורשה של התכונה הזו היא תורשה קלאסית ,כאשר כל אלל מכיל מספר חזרות שונה .כאן מספר האללים האפשריים הוא לכאורה בלתי מוגבל – כיוון שכל מספר חזרות אפשרי .זהו פולימורפיזם מאוד משמעותי .עם זאת ,חשוב לזכור שלא כל מספר חזרות אפשרי בהכרח קיים באוכלוסיה. כעת ניתן לתכנן פריימרים שיושבים משני צידי אתר ה- VNTRואורך מספר תוצר ה PCR-יהיה תלוי במספר החזרות .הג'ל בדוגמה מציג שישה פרטים באוכלוסיה שבהם הוגבר אתר VNTRמסויים .אפשר לראות את הפולימורפיות הרבה בין הפרטים שמתקבלת כאן ,מה שלא יכולנו להשיג בשיטות הקודמות בהן מספר האללים היה מאוד מוגבל. יחד עם זאת ,למרות הפולימורפיות הרבה ראו שיש אוכלוסיות מסויימות שבהן יש שכיחות גבוהה של אללים ספציפיים .בצורה זו העץ )שקופית 16במצגת (4מנסה למפות אוכלוסיות שונות בעולם לפי אתר VNTRמסויים .בצורה זו ניתן להשתמש באתרים אלו למחקרים אבולוציוניים. החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב גנטיקה -מעבדה 20 פרופיל גנטי אם רוצים באמת להבדיל בין פרטים באוכלוסייה צריך ליצור פרופיל גנטי; סביר להניח שהשימוש בשיטה אחת עם אתר אחד לא יצליח להפריד באוכלוסיות; שימוש באתר Aluהרבה פחות יעיל מ VNTR-אבל ככל שאוספים יותר סמנים גנטיים במקביל ההבחנה הופכת יותר דקה וניתן ליצור פרופיל גנטי שונה עבור כל אחד .ככל שלוקחים יותר נתונים ,הסיכוי שנמצא עוד פרט עם אותו פרופיל גנטי הולך וקטן .פרופיל זה משמש למשל בזיהוי פלילי ובדיקות אבהות. קבוצות הדם במאה ה 18-התחילו לעשות עירויי דם ,וראו שבחלק מהמקרים זה מצליח ובאחרים זה נגמר באסון; כאשר בדקו עירויים שונים ,כדוריות לחוד ופלזמות לחוד מאנשים שונים והצליבו את הנתונים; ראו מאפיינים שונים של אגרגציה של התאים ומתוך זה חילקו את ארבע קבוצות הדם. הקבוצות האלו נובעות מביטוי אנטיגנים מסויימים – Aאו B – על גבי כדורית הדם .ארבע הקבוצות נובעות מהשילובים השונים AB ,B ,A :או אף נוגדן ) .(Oבפלזמות נמצאים נוגדנים נגד האנטיגנים שאינם קיימים על הכדורית. כיצד אדם שמעולם לא קיבל תרומת דם נחשף לאנטיגנים שלא שלו? האנטיגנים של כדוריות הדם נישאים גם על ידי חיידקים מסויימים; אדם עם דם Aיש לו נוגדנים לדם Bכי הוא נחשף לחיידקים בעלי האנטיגן .B חיידקים בעלי אותו אנטיגן כמו כדוריות הדם ,כתוצאה מכך, זוכים להתעלמות מצד המערכת החיסונית שכן היא מתייחסת אליהם כאל כדוריות דם. האנטיגן עשו עץ סוכרי ,הנבנה על ידי אנזים ספציפי .העצים הסוכריים נבדלים אלו מאלו בשל אללים שונים של האנזים היוצרים כל אחד מודיפיקציות שונות; הטרוזיגוט ABמכיל את שני האנזימים ולכן הכדורית שלו מציגה את שני הסוכרים. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , שיעור :04גנטיקה של האדם 21 מבחינה גנטית ,יחסי האללים Aו B-הם קו-דומיננטים כי הם לא מפריעים אחד לשני .בין Aאו B ל O-יש יחסים של דומיננטיות נגד .O מכיוון שהדם מכיל נוגדנים לאללים שאין לאדם ,כדוריות דם מסוג Oהן תורמות אוניברסליות כי הנוגדנים לא מזהים אותן )הן לא מציגות אנטיגנים( ואדם בעל דם מסוג ABהוא הנתרם האוניברסלי כי הפלזמה שלו אינה מכילה נוגדנים כלל. בניסוי מ 2008-לקחו סוג דם מסויים והגיבו אותו עם נוגדנים מתאימים .הטיפול הנחקר ניסה ליצור אנזים שיוריד את האנטיגנים מכדוריות הדם האדומות ,כך שהם לא יגיבו עם הנוגדנים .בצורה כזו כל תרומת דם תהיה כמו תרומת ,Oתרומת דם אוניברסלית .ניתן לראות שכאשר מגיבים עם הטיפול אין קישור בין הנוגדן לאנטיגן. בטבלה הבאה רואים שכיחות של סוגי הדם באוכלוסיות שונות. כמה מילים על הארדי-וויינברג שיווי משקל הארדי וויינברג מתקיים בתנאים מסויימים ומקיים תנאים מתמטיים לגבי שכיחות הגנוטיפים השונים )מודגם על שני אללים( .נניח ויש מחלה הומוזיגוטית רצסיבית ) .(aaמכאן שרק להומוזיגוט הרצסיבי יש פנוטיפ .אם aaמבקש שלא יהיו לו צאצאים בעלי פנוטיפ ,הוא יכול ללכת עם .AAעל מנת לדעת כמה AAיש באמת באוכלוסיה, אפשר לחשב את השכיחות של ,aaמתוך זה לחלץ את השכיחות של ,aמתוך זה לחשב את השכיחות של החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 , חמוטל בן דב גנטיקה -מעבדה 22 Aואז את השכיחות של .AAכך ניתן למצוא את הסיכוי למצוא בן זוג מתאים שהוא גם ) AAזאת בהנחה שאין תאחיזה למין ,אז הסיכוי יורד פי 2כי מחפשים מין מסויים(. יחד עם זאת ,אפשר לעשות דבר אחר – אפשר להראות שיש סטיות שמלמדות כי לא מתקיים הארדי ויינברג ,ואז להעמיק את המחקר כדי לראות מה קורה שם. חמוטל בן דב החוג לביולוגיה ,אוניברסיטת תל אביב2011 ,
