docמיקרוביולוגיה - שיעורים 18-23
download 
Report Transcription
מיקרוביולוגיה - שיעורים 18-23
שיעור :18יחסי הגומלין בין תזונה ,מטבוליזם וגדילה 131 שיעור :18יחסי הגומלין בין תזונה ,מטבוליזם וגדילה בעולם החיידקים ישנה דרך נשימה הייחודית לעולם הפרוקריוטי – נשימה אנאירובית ,בה מקבל האלקטרונים במערכת הנשימה אינו מולקולת חמצן אלא אטום במצב מחומצן גבוה אחר – דוגמת ניטראט ) (NO3שהוא המצב המחומצן ביותר של חנקן או סולפאט ) (SO4שהוא המצב המחומצן ביותר של גופרית. בתהליכי קבלת אנרגיה קיימות וריאציות לנושא האלקטרונים – כאשר גידול ליתותרופי מאפיין מצבי תורם אלקטרונים שאינו חמצן; גם הפוטוסינטזה של החיידקים אינה בהכרח זהה לפוטוסינטזה האוקסיגנית הנעשית בצמחים וציאנובקטריה ,המשתמשת בביקוע מולקולת מים לצורך חיזור פחמן דו- חמצני לסוכרים. בעולם הפרוקריוטי קיימת פוטוסינטזה מעגלית )עם מרכז ריאקציה אחד ולא שניים( ,הנסמכת על כוח מחזר של תרכובות אנאורגניות מחוזרות – דוגמת סולפיד ) .(H2Sגם הפרמנטציה ,אשר מתקיימת באורגניזמים מתקדמים בצורת תהליך לייצור לקטאט ,מתקיימת באופן אלטרנטיבי בחיידקים. תהליכים תאיים האיור הבא מציג תא בעל ממברנה; על מנת שהתא יתקיים חייבות להתקיים פונקציות ממברנליות ,כמו טרנספורט ,הצורכות .ATPהמטאבוליזם בתא נועד למטרה אחת ויחידה :הובלת מקרומולקולות לפירוק לצורך בנייה של מקרומולקולות חדשות. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 132 בתא תקין ,הזרימה של כל חומרי המזון נועדה ליצירת מקרומולקולות – חומצות שומן וגרעין ,סוכרים וחלבונים ,המתאחדים בסופו של דבר למבנים מורכבים יותר בתא .כל המקורות המטבוליים מצטלבים יחד ליצירת סטרוקטורות תאיות .לשם כך יש ליצור ATPוכוח מחזר בעזרת תורמי ומקבלי אלקטרונים בתוך המערכת .התורמים והמקבלים נקלטים מן החוץ ולאחר שהם מחומצנים/מחוזרים הם מופרשים החוצה. על מנת שחיידק יוכל לגדול בסביבה מסויימת חובה שיהיו לו המקורות החיצוניים המופיעים באיור. אם אחד מהגורמים חסר ,או לחילופין אם יש חסימה פנימית לייצור ,ATPכוח מחזר או פליטה של החומרים המחומצנים/מחוזרים ,החיידק לא יוכל לגדול. פרמנטציה )תסיסה( אנרגיה המתקבלת מחימצון חלקי של חומר אורגני ,כאשר תוצרים מחומצנים של אותו חומר אורגני הם קולטי האלקטרונים .בסולם חימצון-חיזור ,בהתאם להפרש הקיים בין התורם הסופי למקבל הסופי, נערך מעבר האנרגיה; ככל שההפרש הזה גדול יותר ,כך כמות האנרגיה המופקת גדולה יותר. בפרמנטציה ,ההפרש בין תרכובת לתוצר מחומצן-חלקית הוא קטן מאוד ,דבר המוביל לניצולת הנמוכה של התהליך 2 :מול ATPבתסיסה לעומת 32מול ATPבנשימה אירובית. • נשימה אירובית מובילה להפקת הביומסה המירבית האפשרית. • נשימה אנאירובית לעולם לא תעבור נשימה אירובית אך גם היא גבוה יחסית. • תסיסה הינה בעלת ניצולת נמוכה מאוד ולכן הביומסה המתקבלת נמוכה מאוד. המעברים בין התפקודים השונים ניתנים בהתאם למערך הגנים העומדים לרשות החיידק מחד והתנאים הסביבתיים מאידך; חיידק E.coliהינו בעל מערכי הגנים המתאימים לכל שלושת המצבים ,ולכן בהתאם לתנאים ייבחר בשיטה המתאימה .במעי הגס ,שם החיידק הזה חי ,יש מעט חמצן ומעט מזון )כי המזון נספג במעי הדק( ולכן החיידק יפתח יכולות ויבטא מערכי גנים המתאימים למצבו. עקרונות הפרמנטציה חומר אורגני מתחמצן ומשחרר כוח מחזר .NADH ,התרכובת המתקבלת מעט יותר עשירה באנרגיה ,עוברת זירחון ויכולה לשחרר את הזרחן לצורך יצירת ATPמ .ADP-לאחר תהליך זה מתקבלת תרכובת בדרגת חימצון גבוהה יותר מהתרכובת העשירה-אנרגטית ,היכולת לקלוט את האלקטרונים של הכוח המחזר ,ולהפוך לתוצר הפרמנטציה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :18יחסי הגומלין בין תזונה ,מטבוליזם וגדילה 133 התוצר הסופי של תהליך הגליקוליזה הוא הפירובט – חומר מחומצן מגלוקוז .כאשר פירובט מקבל אלקטרונים מהכוח המחזר ,הוא יוצר חומצה לקטית; במקרים של יצירת כהל במקום חומצה לקטית ,הפירובט עובר פירוק לאצטאלדהיד והחיזור של האצטאלדהיד יוצר את האתנול – הכהל .תסיסה מסוג זה היא תסיסה כהלית ,לעומת תסיסה לקטית. שימושי הפירובאט פירובאט יכול לקבל אלקטרונים ישירות )תסיסה לקטית( או להתפרק לאצטלדהיד ולתת אתנול )תסיסה כהלית( .עם זאת הוא יכול גם לספק תרכובות נוספות :לא הכל נגמר בלקטאט או אתנול ,ישנן הצטברויות תוצרי תסיסה שאינם לקטאט או אתנול .תוצרים אלו מתקבלים רק בתסיסה של חיידקים. משמאל :המסלולים הרבים והמגוונים הזמינים לפירובאט בעולם החיידקי :מגוון סוגי כהלים וחומצות אורגניות. המגוון נובע מהוריאביליות של החיידקים :חיידקים מתפתחים ונפוצים ) (ubiquityבסביבות אקולוגיות מגוונות .לא בכל סביבה יש את אותם תנאים כימיים-פיזיקליים ,ולכן אבולוציונית לא נוצרו בהכרח בסביבה אחת אותם תהליכים שנוצרו בסביבה אחרת. חלב למשל הוא סביבה העשירה בחומרים אורגנים; אולם הוא מכיל הרבה חומצות אמינו וסוכרים .חומצות האמינו ,בגלל היותן צביטריונים ,יוצרים סביבה מבופרת השומרת היטב על רמת .pHזוהי סביבה שונה לחלוטין מזו של מיץ ענבים – העשירה מאוד בסוכרים וענייה בנוטריינטים אחרים .ברגע שהסוכר במיץ יותסס ה pH-יירד במהירות כי אין סביבה שמבפרת את השינוי. מסיבה זו מוצאים בסביבות מסויימות חיידקים שתוצרי התסיסה שלהם הם מסוג אחד )חומצות( או מסוג אחר )כהלים ,המונעים ירידה ב pH-בסביבה לא מבופרת(. תסיסה הומופרמנטטיבית והטרופרמנטטיבית • תסיסה הומופרמנטטיבית :תסיסה עם תוצר יחיד מסויים .התסיסה תיקרא על שם התוצר ,למשל תסיסה לקטית. • תסיסה הטרופרמנטטיבית :התסיסה עם שני תוצרים שונים תכונה הטרו]אחד התוצרים[ או שתציין את שני התוצרים )למשל אתנו-בוטירית(. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 134 חיידקי מעיים ,כמו Coliוסלמונלה ,מסוגלים לבצע הטרופרמנטציה כה מגוונת כך שאם ייקחו ממוצרי התסיסה דגימה ניתן יהיה למצוא לקטאט ,סוקצינאט ,אתנול ,חומצה אצטיט ופורמית – תערובת של מגוון תוצרי תסיסה ,חלקם כהלים ואחרים חומצות אורגניות שונות. קרבוקסילציה של הפירובאט תביא לקבלת סוקצינאט; הוצאת פחמן תיתן חומצת אצטית שמתפרקת ליצירת אתנול או חומצה לקטיט .להבדיל מתהליך תסיסה רגיל ,בו מתקבל 2מול ,ATPה- E.coliיכול להרווילח עוד ATPתודות לזירחון ADPעל ידי אצטיל .CoAבצורה זו הוא מקבל מעט יותר אנרגיה ,מעט יותר ביומסה וכושר תחרותי טוב יותר לעומת החיידקים האחרים בסביבתו. חומצה פורמית מחמיצה מאוד את סביבתה אבל לחיידקי E.coliיש אנזים בשם formate .dehydrogenase/ formic hydrogen lyase האנזים הזה מפרק את החומצה הפורמית לCO2- ומימן בסביבות עם חומציות נמוכה .ה CO2-מתמוסס במים אבל מימן משתחרר מהמערכת החוצה .עובדה זו מאפשרת לבדוק האם תרבית חיידקים מבצעת פרמנטציה לפי שחרור המימן :בדיקה זו חשובה במיוחד באיבחון חיידקי שיגלה וחיידקי קולי ,שניהם חיידקי מעיים שנראים דומים על צלחות פטרי במעבדה מיקרוביולוגית וההבדל ביניהם הוא היכולת של קולי לשחרר מימן וחוסר יכולת כזו אצל שיגלה .בדיקה של ייצור הגז נעשית על ידי מבחן דוראם.47 47שמים מבחנה גדולה המכילה חיידקים ובתוכה מבחנה הפוכה מלאה בנוזל .אם החיידקים משחררים מימן ,בועת מימן תתחיל להיווצר במבחנה ההפוכה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :18יחסי הגומלין בין תזונה ,מטבוליזם וגדילה 135 תוצרים סופיים של תסיסות התוצרים הסופיים החשובים בתסיסה הם אצטון ובוטנול .אצטון נדרש בתעשייה בכמויות גדולות ותהליכים רבים כי הוא ממס אורגני יעיל ונדיף – האצטון משמש למיצוי ואז מונדף לצורך טיהור התערובת. בתחילת המאה הקודמת ,תעשיית הגומי השתמשה באצטון שעד אז הופק מחומרי גלם מאירופה – בעיקר מלחים של חומצה אצטית .עבודותיהם של פסטר וקודמיו זיהו שחיידקים מעורבים בייצור חומרים שונים וזיהו חיידקים שמסוגלים לצבור חומצות אורגניות – ביניהם גם הצטברות של אצטון ובוטאנול )ממס אורגני חשוב נוסף(. היום משתמשים בתהליכים כימיים ממינרלים ונפט; בראשית המאה הקודמת ניסו להשתמש בחיידקים לשם כך ,אך התהליכים היו תלויים במקור הפחמן ,שלא היה אחיד לכלל חיידקים הפעילים .בסביבות 1908- 1910הופיע חיים וויצמן בבריטניה והתגייס לשיפור תהליכי הפקת האצטון .הוא עבר לאוניברסיטת מנצ'סטר ,ולמרות שהיו כימאי ולא מיקרוביולוג )תחום שלא היה מפותח גם כך באותה תקופה( ,חקר ולמד את התחום עד שהבין מספיק את המערכת והבין שעליו ליצור מצב בו יוכל לזהות חיידק שיוצר הרבה תוצרים מבוקשים בתנאים מוגדרים ובמיכלים גדולים )פרמנטורים( תוך שמירה על תרבית אחת נקייה של החיידק. החיידק המזוהה היה קלוסטרידיום אצטובוטאיריקום שיצר תערובת עשירה באצטון ובוטאנול ,אשר ניתן היה להפיק בזיקוק .וייצמן פיתח את השיטות לסטריליזציה ,הכנת הסובסטרטים ,קרקעות המזון, מבנה הפרמנטור וכו' .לצד עבודתו ) (1913-1914מתחילה מלחמת העולם הראשונה ,אשר דרשה יצירה של חומרי נפץ .על מנת להמס את הניטרוגליצרין הדרוש להכנת אבקת שריפה היה צריך הרבה אתנול ובוטאנול ,וכך התהליכים שפיתח ווייצמן סייעו רבות לבריטים במלח"ע .I לקראת סוף המלחמה השלטון הבריטי החליט לתגמל את וויצמן בדרכים שונות ,אך בהקשר ההיסטורי שלנו חשובה הצהרת בלפור – הקובעת שלעם היהודי יש זכות שיבה והקמת בית לאומי במדינת ישראל – אשר ניתנה כתמורה לפעילותו בתקופת המלחמה. תוצרי הפרמנטציה משמאל :דגימה של תוצרי הפרמנטציה השונים. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב 136 מיקרוביולוגיה -שיעור1 חימצון אתנול לחומצה אצטית אם חיידקים נמצאים בכל מקום ,מסוגלים לבצע כמעט כל תהליך מטבולי ויש להם מגוון רחב של חומרים אורגניים המסוגלים להוות מקור פחמן – כלומר החומר מספיק מחוזר כדי שניתן יהיה לחמצן אותו ולפרק את שלדו הפחמני – מדוע שמולקולת האתנול ,שני פחמנים עם ,OHלא תשמש גם היא כמקור פחמן? תהליך זה הוא תהליך ההחמצה – אשר משתמש באתנול כמקור אלקטרונים. בתסיסה ,הסביבה האנאירובית משתמשת בסוכר כמקור תורם אלקטרונים ליצירת אתנול; בהחמצה, סביבה אירובית משתמשת באתנול בתור תורם אלקטרונים להפקת תוצר מחומצן של אתנול – חומצה אצטית )חומץ(. מכאן שאם במקום לשמור את היין במיכלים קטנים וסגורים יישפכו אותו לקערה בעלת שטח פנים חשוף גדול מאוד בהשוואה לעומק הנוזל ,חיידקים מהאוויר "יזהמו" את היין .ביניהם יהיו חיידקים שיכולים לנצל את הכהל כמקור פחמן בסביבה אירובית .חומצת חומץ תצטבר במערכת והיין יהפוך לחומץ בן יין. תעשיית היין הענבים צריכים להיבצר רק כאשר ידוע שכמות הסוכר והחומציות שבענבים תואמת את התהליך שמבקשים להעביר ביקב .כל שינוי ביחס בין שני הגורמים משפיע על איכות היין המתקבל. הענבים מובלים לחצר היקב ומוכנסים לאתר הדריכה )ידנית או מכנית( .מתקבלת תערובת של נוזל ,זגים, ציפות פרי וכדומה .יש לסלק את המוצקים ולהמשיך לעבד את הנוזל; אם רוצים לקבל יין אדום ,חובה לבצע את התסיסה הראשונית בנוכחות קליפות הענבים – כי שם נמצא הפיגמנט .עומק ,עוצמת וגוון הצבע תלוי מאוד בכמות הקליפות ,משך ההשרייה איתן וכדומה .אם קו הייצור פונה ליין לבן מרחיקים את המוצקים כמה שיותר מהר מהמערכת. התערובת מועברת למיכלי נירוסטה; תהליכי הכתישה הכניסו הרבה מאוד חמצן לתערובת ,ולכן הסביבה אירובית מאוד ומכילה הרבה מאוד סוכרים ומעט חומצות אמינו .המערכת אינה מערכת בופר ולכן יש גידול אינטנסיבי של מיקרואורגניזמים שונים – גועש עד כדי הקצפה ממשית .האינטנסיביות מעלימה במהירות את החמצן ,הסביבה הופכת אנאירובית ,פירוק הסוכרים גרם לירידה ב pH-עקב יצירת חומצות ,וכאשר הוא מגיעה ל pH=5-וסביבה אנאירובית מגיעים למצב אידיאלי לגידול שמרים. כעת מעבירים את הנוזל החומצי המכיל שמרים למיכלים חדשים – נירוסטה בקווים מודרנים – היוצרים עמודי נוזל גבוהים מאוד כדי למנוע חלחול חמצן .תהליכי התסיסה משחררים הרבה מאוד CO2והאתנול מתחיל להצטבר .התערובת עכורה משמרים ,אבל התסיסה הולכת ויורדת עם הזמן עד שאין יותר שחרור של .CO2 חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :18יחסי הגומלין בין תזונה ,מטבוליזם וגדילה 137 בשלב זה מועברות התערובות לכלים חדשים שם מניחים ליין לשבת – לא להתייישן – במשך שבועות או חודשים .בזמן הזה שוקעים גבישים של חומצה טרטרית ,גבישים גדולים עד גודל כף יד .כמו כן יש שקיעה של טאנינים )חומרים הגורמים לתחושת עפיצות( .ההשקעה עוזרת להצליל את היין. כעבור 4-5חודשים ,בתקופת האביב בערך ,מעבירים יין אדום לחביות עץ אלון – כאשר סוג העץ ,גיל החבית וכדומה ישפיעו על היין – ומיישנים אותו במשך כמה שנים עד שהוא עובר ביקבוק. עוד בתסיסה הראשונית מוסיפים לנוזל תרכובות גופרית ,לרוב סולפידים ,שמטרתן לתת העדפה לגידול שמרים והיעלמות חיידקים מהתרכובת ,כמו גם שימור היין באופן שיבקר טוב יותר את היין .בביקבוק ,לרוב מבצעים פיסטור על ידי כך שמעבירים את היין בחום של 60-70מעלות כדי להשמיד גורמים שיכולים להחמיץ את היין. תעשיית ייצור היין יצרה לדורותיה זני שמרים המסוגלים ליצור ריכוזי כהל של .12-13%ישנם יינות עם אחוזים נמוכים יותר, הנובעים ממחסור בסוכר בענבים עצמם שיאפשר להגיע לריכוז הכהל המירבי; מכאן שטיב היין נגזר מהתנאים האקלימיים ,המאפשרים ייצור הסוכר ,וגם מהקרקעות וטיב הענבים עצמם .במדינות אירופה יש הרבה יותר דינמיות אקלימית ,לעומת הקיץ הישראלי המואר והחם שבונה רמת סוכר מסויימת וקבועה. אם השמרים מנצלים את מרבית הסוכר ומגבירים את הכהל עד לרמה מירבית ,היין המתקבל יבש; אם התסיסה נעצרת באחוז נמוך יותר או שבענבים היה יותר סוכר כך שהגיעו למקסימום אתנול ועדיין נותרו סוכרים ,היין חצי-יבש .זהו לא יין חמוץ אלא יין מתוק שנותרו בו סוכרים. ריכוזים גבוהים אף יותר של כהל ,כמו ביין פורט ,מתקבלים על ידי יין מחוזק – לא על ידי הוספת כהל מזוקק ,אלא על ידי זיקוק היין עצמו – נידוף חלק מהכהל שקיים ביין תוך נידוף חומרים ארומטיים נוספים שהתפתחו ביין; את התזקיק צוברים ולאחר מכן מוסיפים אותו בצורה מבוקרת ליין חדש .בצורה זו שולטים ברמת הכהל שרוצים להגיע אליה .את התערובת מכניסים לחביות אלון ומיישנים 3-10שנים המביאות לטעמים ארומטיים מאוד ,מכיוון שהכהל הנוסף מקורו ביין זהה .במדינות שונות מתקבלים יינות עם שמות המתאימים לתהליך ההעשרה הדומה המתנהל באותו מקום )כך למשל עבור הפורט ,השרי, הטוקאי וכדומה(. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 138 שיעור :19מבוא למיקרוביולוגיה רפואית מחלות זיהומיות כגורמות מוות משמאל :חלקן של מחלות זיהומיות כגורם מוות. למרות האנטיביוטיקה עדיין קיימים מחלות מקרי מוות רבים מגורמים זיהומיים – בין אם שלשולים ,מחלות בדרכי הנשימה ,AIDS ,הפטיטיס, שחפת וכדומה. המספרים הולכים וגדלים כתוצאה מרכישת עמידויות לאנטיביוטיקות בקצב המהיר מייצור אנטיביוטיקות חדשות. קבוצות המיקרובים מחלות זיהומיות יכולות להיגרם על ידי פרזיטים ,פטריות ,בקטריות ,נגיפים ואפילו חלבונים – כמו מחלת הפרה המשוגעת המכילה חלבון פתוגני שעובר באכילת בשר הפרה הנגועה .הרצאות אלו יעסקו בזיהומים הנגרמים על ידי חיידקים ונגיפים – דוגמת מחלת הליגיונרים ) (1977הפוגעת בדרכי הנשימה ונישאת באוויר; חיידקים טורפים ) ;(1983) HIV ;(1982מחלת הכולרה ) (1992וכדומה. מושגים • פתוגן – מיקרואורגניזם שיכול לגרום לפתוגנזה – נזק במאחסן .הנזק יכול להיות ישיר מהפתוגן עצמו או עקיף כתוצאה מתגובת המערכת החיסונית – המערכת החיסונית מכירה את הפתוגן ומגיבה באלימות כה רבה עד שהיא גורמת לנזק יותר מאשר לתועלת .בחלק מהמחלות הפתוגן עצמו לא היה פתוגני אלמלא הייתה תגובה חיסונית; הכשל המערכתי נובע מתגובה מוגזמת של המערכת החיסונית. • פתוגנים חיידקיים קלאסיים – חיידקים שמאז ומעולם גרמו לנזק ,דוגמת חיידק הVibrio - ,choleraהמייצר טוקסין פתוגני בגוף או Mycobacterium tuberculosisהמזוהה עם מחלת השחפת. • פתוגנים פקולטטיבים/אופורטוניסטים – חיידקים המצויים בטבע ואפילו בפלורה הטבעית בגוף ,אולם בתנאים מיוחדים – למשל בתנאי כשל חיסוני הנגרם מ ,HIV-החלשת המערכת החיסונית לקראת השתלה או בזיקנה/תינוקות ,אותו חיידק הופך לפתוגן. Pseudomonas aeruginosaהוא חיידק נפוץ מאוד ,אולם בחולי CFמופרש מוקוס סמיך בריאות המהווה מצע לחיידק היוצר ביופילם וגורם למחלה .קשה להתמודד עם החיידק במערכת הגוף של החולה, שהמערכת החיסונית שלו פגועה ,ובצורת הביופילם החיידק פחות רגיש לאנטיביוטיקה .באותה המידה, Staphylococcus epidermidisהוא חיידק הנמצא על גבי העור אך אם הוא חודר לתוך הגוף – למשל במקרה של מנתח שהעביר למטופליו זן עמיד לאנטיביוטיקה – הוא מעורר מחלה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :19מבוא למיקרוביולוגיה רפואית • 139 אלימות/וירולנטיות – מושג כמותי המודד עד כמה החיידק אלים .מהווה מדד להשוואה בין מידת האלימות של חיידקים שונים .אלימות חיידקים נמדדת על ידי הזרקת מיהולים עשרוניים של חיידק הניסוי לחיות מעבדה; המדד בודק באיזה מיהול 50%מחיות הניסוי מתו .ככל שהחיידק אלים יותר, המיהול יהיה נמוך יותר .מד המיהול מכונה .LD50שימו לב שזהו מדד השוואתי בחיית מודל והמספר אינו תקף ישירות לבני אדם. הגרף מציג את מדד הוירולנטיות של פנימיאוקוקוס ושל סלמונלה .ניתן לראות שמהפנימיאוקוקוס מספיקים 50חיידקים שחודרים לעכבר על מנת להמיתו ,בעוד שבסלמונלה נדרשים כ5000- חיידקים. • פקטורי אלימות – מרכיבי הפתוגן שמאפשרים לו את יכולת הפתוגנזה .ניתן להבחין בין כמה פקטורי אלימות ,דוגמת פקטורים המאפשרים התנחלות במאחסן )באיזורים הפנימיים והסטריליים יחסית( ,פקטורים שגורמים נזק לרקמות ופקטורים המעכבים את תגובת המערכת החיסון המנסה להיפטר מהחיידק.48 הפוסטולציות של קוך קוך ) ,(Kochמיקרוביולוג מתקופתו של פסטר ,עסק ביחס בין החיידקים למחלות .הפוסטולציות של קוך מתוות ניסוי בן ארבעה שלבים לדיאגנוזה כאשר מבקשים לזהות את גורם המחלה של חולה נתון. • בידוד חיידקים מחיה חולה ובידוד חיידקים מחיה בריאה .זיהוי החיידקים מהחיה החולה שאינם נמצאים בחיה הבריאה. • בידוד החיידקים לתרביות נקיות. • הדבקת חיה בריאה בתרבית הנקייה ובדיקה האם היא חולה באותם תסמינים מחיית המקור. • בידוד אותו חיידק שוב מהחיה שהודבקה. פעמים רבות מבודדים חיידקים מחולים ,מבלי שהם יהיו החיידקים הפתוגנים .במחלות רבות קשה מאוד למצוא את גורם המחלה .בעיה אחת היא בחירת חיית המעבדה שניתן להדביק ,שכן אין זה אתי להדביק בני אדם מחד ומאידך יש פתוגנים ספציפיים מאוד שקשה להדביק בהם מודל שאינו הומני. חוקר אוסטרלי ניסה לטעון שהאולקוס בקיבה אינו נגרם ממתח אלא מחיידק .כדי לבדוק זאת הוא בודד את החיידק מחולי אולקוס והדביק את עצמו באולקוס ,ואז נתן לעצמו אנטיביוטיקה וריפא את עצמו. 48למשל ,במקרה של פנמיאוקוקוס ,החיידק מהניסוי של אייבורי ,הקפסולה עצמה – או היכולת ליצור אותה – היא פקטור האלימות כי היא מונעת מהלויקוציטים לפרק את החיידק. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב 140 מיקרוביולוגיה -שיעור1 הפלורה החיידקית הטבעית הפלורה הטבעית היא גורם חשוב ביכולת גרימת המחלות .כמות החיידקים הטבעית על פני הגוף היא עצומה :בקרקפת לבדה יש מיליון חיידקים בסמ"ר; בפה מיליארד חיידקים בסמ"ר; וכן הלאה. בחתך דרך העור ניתן לראות את שכבות העור, אפידרמיס ,דרמיס ורקמת חיבור .העור אינו מכיל הרבה חיידקים בשל שלושה גורמים – האחד הוא היובש הטבעי שלו )ולכן יש יותר חיידקים באיזורים שצוברים זיעה כמו בתי השחי וקפלי עור או שהם נכנסים לנקבים בעור ולא מתיישבים על פני השטח(. כמו כן ה pH-של העור נמוך – בין – 4-6ומהווה גורם נוסף לעיכוב הגדילה והחלוקה של החיידקים הקיימים על העור .גורם שלישי הוא העובדה שהעור נשטף לעיתים קרובות ולכן נמנעת הצטברות מסוכנת של חיידקים. משמאל :חתך דרך שן .המקום היחיד בו חיידקים נמצאים בשיניים בריאות הוא על גבי האמייל. החיידקים מגיעים לאמייל משום שהרוק ,המכיל פוליסכרידים ,מצפה את האמייל בסוכרים אליהם נקשרים החיידקים. כל עוד החיידקים נמצאים על גבי האמייל ,הם אינם יכולים לחדור את השן; אולם בצריכת סוכר ,החיידקים הפרמנטטיבים מפרקים את הסוכר ויוצרים חומצה לקטית ,המפרקת את האמייל ומאפשרת להם לפרוץ דרך האמייל אל הרקמות הרכות והפנימיות .מקום בעייתי נוסף הוא הגבול בין האמייל לחך ,אשר אם חיידקים יחדרו אותו הם יאכלו את העצם ויהרסו את התמוכה המחזיקה את השן במקומה עד שתנשור. החיידקים נמצאים תמיד על השן ,יוצרים מעטפות פוליסכרידיות התלויות בסוכרי המזון ובעזרתן יוצרים ביופילם – חיידקים הנמצאים בבסיס מכילים רצפטורים המזהים את הפוליסכריד על גבי השן ועל גבי החיידקים האלה מתחילים להתיישב חיידקים אחרים המכילים רצפטורים שמזהים את חיידקי הבסיס. למרות שהשן חשופה לאוויר ,חלק מהחיידקים האלה הם אנאירוביים ומסוגלים להתקיים בתחתית הביופילם, אשר עוביו הרב מונע כניסת חמצן. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :19מבוא למיקרוביולוגיה רפואית 141 מערכת העיכול היא מערכת פתוחה המכילה את מספר החיידקים הגדול ביותר בגוף .כל אחד מאיזוריה השונים של מערכת העיכול מאופיין בחיידקים שונים ,היות וכל איזור מכיל תנאים שונים :הקיבה היא בעלת pHחומצי מאוד ,וחיידקי הקיבה צריכים להתמודד עם כך )למשל על ידי הפרשת ureaהמטטרת את המיקרוסביבה של ;(Helicobacter piloriלא כן חיידקי המעי הדק ,בו ה pH-יותר נייטרלי אבל מופרשים אליו מוקוס מתאי אפיתל השוטף את החיידקים שאינם יכולים להתקבע לאפיתל; במעי הגס גדלות כמויות גדולות של חיידקים אשר הגוף נפטר מרובן. דרכי הנשימה פתוחות לאוויר ,ובעוד שבחלק העליון – אף ופה – עדיין יכולים להיות חיידקים ,קנה הנשימה והריאות סטרילים תודות לתאים מפרישי ריר באיזור האף וריסים המסלקים את חלקי האבק, החיידקים והמוקוס החוצה מהריאות .מערכת הנשימה מכילה גם תאים חיסוניים רבים היוצאים אל קנה הנשימה ומאכלים כל חיידק החודר לריריות בקנה הנשימה .מחלות במערכת הנשימה עשויות להיגרם באנשים מבוגרים אשר יש להם בעיה בהפרדה בין קנה לושט – אם יש refluxמהושט יש עודף עצום של חיידקים הנכנסים למערכת הנשימה במידה כזו שהמערכת החיסונית אינה יכולה להתמודד איתם. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 142 המאזן של הפתוגנזה היכולת לגרום לנזק מתקיימת עקב שיווי משקל בין הגורמים האלימים של החיידק לבין גורמי ההגנה של המארח. • בשלב הראשון נדרשת חשיפה לפתוגן – כאשר הימנעות מחשיפה היא הדרך להתגונן. • לאחר החשיפה החיידק צריך הידבקות לרקמה, אחרת הוא יישטף ממנה :הוא עושה זאת על ידי הידבקות לעור או לשכבת המוקוזה במעי או בדרכי הנשימה. • בשלב הבא החיידק צריך לחדור – כל עוד הרקמה רציפה הוא אינו יכול לחדור אותה .על מנת שחיידק יהיה פתוגני הוא צריך לעבור את הרקמה )למעט מקרים בהם טוקסין מופרש הוא החודר לגוף וגורם לפתוגנזה(. • בשלב הבא יש יצירת מושבה – במקום החדירה או באופן מערכתי .לאחר שהחיידק מתחיל להתנחל מצב המאחסן מחמיר ,משתי סיבות :בין אם בשל טוקסיות מוגברת ובין אם בשל פולשנות לאתרים מרוחקים יותר המעוררים תגובות חיסוניות קיצוניות .בסופו של דבר נגרמים נזק לרקמה ומחלה. מחסומים לחדירת פתוגנים • תחרות עם הפלורה הטבעית – הפלורה הנמצאת על פני העור ובמעי מורכבת לרוב מחיידקים טבעיים המצפים את הרקמה ומונעים התנחלות של חיידקים אופורטוניסטים .דוגמה לחשיבות המחסום הזה היא הפגיעה בפלורה הטבעית על ידי שימוש ממושך באנטיביוטיקה. מעבר לכך ,לפלורה הטבעית יש תפקיד חשוב בתזונה – הרבה מאוד מחיידקי המעיים מייצרים חומרים תזונה חשובים ,כמו B12וויטמינים נוספים שונים .חיות מעלות גרה מבססות את יכולת עיכול הצלולוז על פירוק של חיידקים בלבד. • מחסומים פיזיים כגון ריר ,תנועה ריסית ,תנועה פריסטאליטית וזרימת נוזלים בדרכי השתן )שהן לרוב סטריליות(. • מחסומים כימיים כגון מלחי מרה ,pH ,ליזוזים ופרוטאזות ,פפטידים טוקסיים. • מחסומים פיזיים על ידי שכבת האפיתל. החיבור בין תאי אפיתל צמתי tight junctionהמחברים בין רקמת האפיתל של המעי מונעים חדירה של חיידקים בין התאים. ריר המוקוס המופרש על ידי תאי גביע ) (goblet cellsהמצויים בין תאי האפיתל מצפה כל הזמן את המעי בריר הסמיך המונע התנחלות של חיידקים. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :19מבוא למיקרוביולוגיה רפואית 143 למעט תאי האפיתל ,שכבת המוקוזה מכילה גם תאים של המערכת החיסונית .התאים האלו מצויים באיזורי ,Paneth Cellsהיוצרים נוגדני IgAוכן תאי M הנמצאים באסוציאציה עם תאים בולעניים )מקרופגים( .סוג שלישי של תאים חיסוניים יכולים לחדור את האפיתל אל חלל המעי ולהגיע לחיידקים הנמצאים במוקוזה. תמונת חתך של האפיתל מראה את בועיות המוקוזה המשוחררות על ידי תאי הגביע ואת גרעיני התאים החיסוניים .התרשים מראה סכמה של התאים הנמצאים במערכת המוקוזה. פקטורי אלימות חיוניים • אדהזינים – מונעים שטיפה של החיידקים. • אינבסינים – חלבונים המאפשרים חדירה לרקמה. • טוקסינים – גורמים לנזק ברקמה. • פקטורים המאפשרים התנחלות ברקמה – משמשים להשגת חומרי תשמורת שונים דוגמת ברזל .חיידק שנכנס לגוף ואינו מכיל מערכת מיוחדת להשגת ברזל לא יתקיים ,שכן הברזל אינו חופשי בגוף .חיידקים וירולנטים הינם בעלי מערכת לקליטת ברזל הקשור לחלבוני התאים של הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב 144 מיקרוביולוגיה -שיעור1 הגוף .החיידקים מפרישים אנזימים לפירוק החלבונים או סידרופורים – מולקולות קטנות עם אפיניות גבוהה לברזל המתחרות עם חלבוני הפריטין האנדוגנים של הגוף ההומני. אדהזינים על מנת להידבק למשטח ,החיידקים צריכים מולקולות ממברנליות שיזהו אלמנטים ברקמה .המולקולות האלה בעלות ספציפיות למארח )עובדה המאפשרת לחיידק להדביק אורגניזם אחד ולא אחר( וגם ספציפיות לרקמה – חיידק התוקף את המעי ) (entropathogenלא יהיה בהכרח טוקסי למערכת השתן ).(uropathogen קפסולה מכילה סוכרים שיכולים להיות מזוהים על ידי חלבונים של הרקמה; יכול להיות מקרה הפוך בו הפוליסכרידים של הרקמה עצמה מזוהים על ידי חלבונים ממברנלים של החיידק. האיורים הבאים מציגים הידבקות ויצירת ביופילם. הכולרה )שמאל( מכיל ריסים עדינים המכירים את הסוכרים על גבי תאי הרקמה; מנגד הקולי )ימין( מכיל קפסולה שמזוהה על ידי הרקמה ונאחזת על ידה. לקולי יש ריסים המכירים את סוכר המנוז ,המהווה חלק מהסוכרים של הרקמה; קולי עם ריסים אחרים המכירים את סוכר הגלקטוז ייספח לרקמות אחרות, המציגות גלקטוז .חיידקי גרם חיובי עם חומצה ליפו- טיכואית קושר את הפיברונקטין. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :20מבוא למיקרוביולוגיה רפואית – המשך 145 שיעור :20מבוא למיקרוביולוגיה רפואית – המשך רקמות ההגנה של הגוף מפריעות למיקרואורגניזמים בדרכם אל תוך הגוף; לחדירה יש כמה שלבים, המתחילים בחדירה ,הידבקות ,וכדומה. החדירה מתאפשרת על ידי גורמים וירולנטים ,על פי רוב ,בין אם זו החדירה שנעשית על ידי חלבון/מעטפת פוליסכרידית הנצמדים לרקמה עקב זיהוי בין המעטפת של החיידק ורצפטורים/סוכרים על הרקמה. מנגנוני חדירה • השראת אנדוציטוזה על ידי אפיתל – לתאי אפיתל אין יכולת פגוציטית ,אולם על מנת שהחיידקים יוכלו לחדור לתאים הם יכולים להשרות אנדוציטוזה על ידי תאי אפיתל כדי שאלו יוכלו לבלוע אותם. • הריסה של צמתים צמודים ) – (tight junctionsתאי אפיתל צמודים בחלבוני אדהזיה ליצירת צמתי היצמדות .הפרשות חיידקיות יכולות להרוס את הצמתים על ידי הרס החלבונים המקשרים בין התאים. • שימוש בתאי Mאו מקרופגים כ"סוסים טרויאנים" – תאי Mומקרופגים הם תאים של המערכת החיסונית בעלי יכולת פגוציטית ,המסוגלים לבלוע תאים חיצוניים ולהציג אנטיגנים של התאים למערכת החיסונית .תאים פתוגנים מסויימים יכולים לחדור לתאים האלה בצורת "סוסים טרויאנים" – הם מעכבים את יכולת ההצגה של תאי ה M-ואז יוצאים מתוכם החוצה לתוך רקמת החיבור במקום לעבור איכול בתוך תאי ה.M- • הרס של הרקמה – הרס טוטלי של תאי אפיתל היוצר פצע או כיב דרכו ניתן לחדור לרקמות הבאות. השראה של אנדוציטוזה חיידקים שונים נספחים על גבי תאי האפיתל .בקצה ,באתר הספיחה ,יש להם אתר מיוחד – .Type III Secretion Systemמערכת ההפרשה הינה מבנה חלבוני דמוי-מזרק החוצה את הממברנות )באיור מופיע חיידק גרם חיובי(. דרך המערכת הוא מפריש חומרים אפקטורים. האפקטורים מופרשים לתאי האפיתל ומשרים יצירה של פסודופודה – "רגליים" העוטפות את החיידק ומכניסות אותו לתוך התא במעין בועית ממברנלית .כך ,על ידי הזרקת האפקטורים החיידקים ,מתאפשרת יכולת בליעה לתא האפיתל. על פי רוב ,חיידקים המשרים אנדוציטוזה יכולים לפנות למספר דרכי פעילות בתא: הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 146 • לאחר הבליעה בפגוזום )גוף הבליעה( ,החיידקים מתקיימים בתוכו – מקבלים מהתא את חומרי המזון וממשיכים לגדול בפגוזום .עם ההגעה לצפיפות מסוימת הם מתפרצים החוצה ,מזיקים לתא עד שהוא מת ומשחרר אותם החוצה )ליגיונלה(. • החיידקים מפרישים חלבון טוקסי המחורר את ממברנת הפגוזום כך שיוכלו לחיות בציטופלזמה של התא – להנות מחומרי ההזנה שלו ולהתרבות .החיידק יכול לנוע על ידי היקשרות למולקולות אקטין ודחיפה מתא לתא )ליסטריה(. פגוציטוזה התא נקשר לפגוציט ,מסופח ונבלע בפגוזום .פגוציטים ייעודיים )כמו מקרופגים( לרוב נועדו להשמיד את התאים .ליזוזומים – וזיקולות המכילות חומרים טוקסיים – מתאחים עם הפגוזום ויוצרים פגוליזוזום. החומרים הטוקסיים של הליזוזום נשפכים לפגוזום ומסייעים בפירוק החיידק. הרס הרקמה על ידי אקסוטוקסינים חיידקים פתוגנים בעלי אקסוטוקסינים מפרישים אותם על מנת להרוס את הרקמה .אקסוטוקסינים הם חלבונים – לרוב אנזימים – שהורסים את המבנה התאי של רקמת האפיתל והרקמות התחתונות ,עד שהחיידקים יגיעו לזרם הדם וינועו בו )זיהום סיסטמי(. אקסוטוקסינים AB אקסוטוקסינים המכילים שני איזורים A ,ו .B-איזור Bנקשר לרצפטור על פני הרקמה .עם הקישור ,איזור Aחודר את הממברנה לתוך התא .על פי רוב A ,הוא בעל פעילות אנזימטית. חיידק הדיפטריה גורם למחלת נשימה מסוכנת ,בעיקר בילדים ותינוקות ,כאשר הוא מתרבה ברקמות האפיתל של מערכת הנשימה .הדפטין ,טוקסין הדיפטריה, קושר את – EF2פקטור האלונגציה של תאי המארח. הפקטור EF2אחראי להבאת הtRNA- המתאים לריבוזום; אינאקטיבציה של הפקטור מעכבת את תהליך התרגום .הטוקסין יוצר מודיפיקציה ב- EF2על ידי הוספת שייר ,ADPהגורמת לאינאקטיבציה .בצורה זו נפסק התרגום והתא מת .מכיוון שפעילות האנזים היא קטליטית ,כמות קטנה מאוד ממנו יכולה לנטרל כמות גדולה של פקטורי אלונגציה כך שהטוקסין רעיל מאוד גם בכמויות נמוכות מאוד .פקטור האלונגציה החיידקי בנוי באופן שונה מהפקטור האאוקריוטי ולכן אינו נפגע מהטוקסין. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :20מבוא למיקרוביולוגיה רפואית – המשך 147 טוקסין הדיפטריה מיוצר גנטית על ידי גנום ויראלי של פאג' ליזוגני .חיידק דיפטריה שמעולם לא נחשף לפאג' לא יהיה אלים; המעניין הוא שברגע שפותח חיסון כנגד הטוקסין – הפסיקו למצוא את החיידק עם הגנום הליזוגני של הפאג' .ייתכן שהיתרון האבולוציוני שנוצר לחיידקים הנושאים את הפאג' נעלם ברגע שפותח החיסון ולכן האוכלוסיה שלהם הצטמצמה. טוקסין הכולרה גם הוא עושה ADP-Ribosylation על אדנילאז-ציקלאז הגורמת בכמות הcAMP- לעלייה )אקטיבציה של האנזים(. עלייה זו ברקמת האפיתל של המעי גורמת לשינוי במעבר המים והיונים – במקום שהתא ייקלוט יונים מחלל המעי לרקמה וכלי הדם ,העלייה בכמות cAMPהופכת את הזרימה כך שמים ויונים יוצאים מהרקמה אל המעי .הביטוי הוא שלשולים והרס של הרקמה .אובדן הנוזלים פוגע בגוף השלם ושתייה אינה עוזרת כל עוד מצוי הטוקסין בגוף; הטיפול היחיד הינו אינפוזיות של נוזלים ומלחים עד אשר בסופו של דבר הגוף ייפטר מהחיידק ומהטוקסין. טוקסין השיגלה )המצוי לעיתים גם בקולי( הינו בעל פעילות אנדונוקלאז המבקעת קשר פוספודיאסטרי ספציפי ב 28S-של הריבוזום .הטוקסין מאוד אלים – מספיקה מולקולת טוקסין אחת על מנת להרוס כמעט את כל הריבוזומים בתא. טוקסיני הבוטולין והטטנוס פוגעים ברקמות העצבים – הבוטולין מעכב הפרשת אצטילכולין ולכן מעכב סיגנלים מתאי העצבים השולחים אותות לשרירים; הנדבקים סובלים מרפיון שרירים – גם בשרירי שלד וגם ,וחשוב יותר ,בשרירי הנשימה .הטטנוס עובד בצורה ההפוכה – הוא גורם להתכווצות שרירים על ידי עיכוב שחרור של גליצין ונוירונים מעכבים ,וכך גורם לשיתוק מכווץ. אקסוטוקסינים שאינם ABציטוליטיים הורסים את המטריקס החוץ תאי של רקמת החיבור .חיידק הקלוסטרידיום מפריש אנזים ההורס קולגן; סטפילוקוקס אאורוס הורס רקמות תחתונות. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 148 אקסוטוקסינים מזיקים לממברנה על ידי פרוטאזות ופוספוליפאזות או הפרשת דטרגנטים .כל האקסוטוקסינים האלה מחוררים את ממברנות הרקמות עד שתוכן התאים נשפך החוצה. אנזים ההמוליזין של סטרפטוקוקס ביוגנז גורם לליזיס של כדוריות דם אדומות ,כפי שניתן לראות בפלטה עם אגר דם ,המבוטא בהצללה סביב מושבת החיידקים. אלפא-טוקסין סטפילוקוקי הוא חלבון הנכנס לממברנה במספר תת יחידות ויוצר תעלה/חור בממברנה .החור גורם ליציאה/כניסה לא מבוקרת של חומרים לתא כך שנפגעת יכולת ההומיאוסטאזיס של התא. פקטורי פתוגניות הרבה מאוד מגורמי האלימות מקודדים על ידי אלמנטים חוץ-כרומוזומלים .ויבריו כולרה או דיפטריה יכולים להיות לא פתוגנים כחיידקים; אולם הוירולנטיות שלהם ניתנת על ידי פלסמידים ,פרופאג'ים או שיירי פתוגניות שהיו על גבי פלסמידים ועברו אינוקרפורציה כגוש אחד לכרומוזום. חיידק טבעי ) (Commensalעשוי להיפגש עם אלמנטים גנטיים שונים – פאג'ים המקודדים לפקטור אלימות; פלסמידים המועברים בהעברה הוריזונטלית דוגמת קוניוגציה ומקודדים לפקטורי אלימות ,או אינקורפורציה של צברי גנים לפקטורי אלימות שהועברו במקור על ידי פלסמיד. בטבע קיימים פלסמידים רבים בעלי יכולת קוניוגטיבית לא-ספציפית העוברים בין מינים שונים .אותם פלסמידים לרוב מקודדים לפקטורי אלימות – כי זו הדרך של הנשא שלהם לשרוד .עם המעבר ,החיידק המקבל הופך לחיידק אלים. מחקרי אבולוציה של חיידקים היום מנסים לחקור גם את מקור הוירולנטיות שלהם. אנדוטוקסינים כאשר חיידקים גרם שליליים מושמדים על ידי המערכת החיסונית ,מופרשות מולקולות ,LPSהמאפיינות את הממברנה שלהם ,לתוך הדם .אנדוטוקסינים הם פקטורים המופרשים מתאים מתים ,שכן הם פקטורים הנמצאים בתוך התאים ומופרשים רק כאשר התאים מתפרקים. אם בגוף יש הרבה LPSעקב מוות מסיבי של חיידקים ,ישנה גם הפעלה מסיבית של לויקוציטים )תאי דם לבנים( .הלויקוציטים מפרישים ציטוקינים המגיעים בזרם הדם אל המוח ,הגורם להעלאת הטמפרטורה של הגוף .בצורה זו LPSהוא פקטור פירוגני :הוא גורם לעלייה בחום הגוף בעת מחלה .אם יש יותר מדי תאים והמערכת החיסונית מתחילה לפעול באופן בלתי מבוקר היא יכולה להוביל לדלקת כרונית שעשויה להוביל לנזקים וקריסת מערכות. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :20מנגנוני ההגנה של הגוף 149 שיעור :20מנגנוני ההגנה של הגוף חיידקים פולשים לגוף ,בין אם על ידי גורמים וירולנטים מורכבים ובין אם באמצעים פשוטים יותר – כמו עקיצות חרקים או פציעות .במרבית המקרים מערכות החיסון מתמודדות עם החדירות האלה .לגוף שתי מערכות הגנה: • המערכת החיסונית המולדת – מערכת עתיקה הקיימת אפילו בחרקים ובה תאים המזהים פלישה של תאים זרים – למרות שהם לא נפגשו איתם קודם לכן. • המערכת החיסונית הנרכשת – הפגישה הראשונה עם הפתוגן או הגוף הזר גורמת לתגובה איטית המתבטאת בעיקר ביצירה או אדפטציה כך שבפגישה הבאה המערכת החיסונית תהיה מוכנה להתמודד איתו במהירות וביעילות רבה יותר. מושגים • מערכת הדם – כוללת את תאי הדם )לויקוציטים ואריטרוציטים( ואת נוזל הדם .סירכוז של דם מלא ישקיע את התאים ותתקבל הפלזמה. • פלזמה – מכילה חלבונים רבים שהינם ספציפיים לדם ,דוגמת אלבומין ,חלבונים חיסוניים וגורמי קרישה .עירור של הקרישה וסירכוז הקרישים ייתן את הסרום. • סרום – מכיל רק את החלבונים של הפלזמה ללא פקטורי הקרישה ,בעיקר אלבומין וחלבוני מערכת החיסון )נוגדנים(. הטבלה מתארת את המרכיבים התאיים של מערכת הדם :האריטרוציטים ,כדוריות הדם האדומות; והלויקוציטים )תאי דם לבנים(, הנחלקים לשני סוגים – לימפוציטים ותאים מיאלואידים .כמותם נמוכה משמעותית מכמות האריטרוציטים. תאי המערכת החיסונית מקור תאי הדם – הלבנים והאדומים – הינו בתאי גזע ממח העצם ,העוברים התמיינות לשני סוגי תאי אב – הפריקורסור המיאלואידי והפריקורסור הלימפואידי .הקו המיאלואידי עובר התמיינות לכמה סוגי תאים – תאי ) MASTהקשורים בתגובות אלרגיות( ,נויטרופילים )תאים פולימורפונוקליארים( ,תאים דנדריטים ומונוציטים )המתמיינים עוד למקרופגים(. בקו התאים הלימפואידי ההתמיינות מובילה לתאי Bהמתמיינים לתאי פלזמה מייצרי נוגדנים ותאי Tשמבשילים לתאי Tמסייעים הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 150 ) (THותאים ציטוטוקסיים ) .(TCכמו כן גם קו זה מייצר סוג מסויים של תאים דנדריטים. במשטח הדם ניתן לזהות כדוריות דם אדומות רבות ומעט לויקוציטים .תאים לויקוציטים פולימורפונוקליארים מכילים גרעין משונץ וגרנולות רבות המכילות גורמי תקיפה של חיידקים; מונוציטים הם תאים גדולים הניחנים בגרעין מאוד גדול .לימפוציטים הם תאים גדולים עם גרעין גדול התופס את רוב שטחם כך שהם כמעט ולא מכילים ציטופלזמה. המערכות הלימפטיות • המערכת הלימפטית הראשונית היא מח העצם )בו נמצאים תאי הגזע( והטימוס – בו מבשילים תאי ה T-ועוברים סינון וחינוך. • המערכת הלימפטית השניונית כוללת את הטחול ,קשריות הלימפה ) (lymph nodesומערכת ),MALT (mucosal-associated lymphatic tissue המפוזרת בכל הגוף לאחראית לטיפול באיזורים ספציפיים דוגמת מערכת הנשימה ,הרבייה והעיכול. המערכת הזו נמצאת בכל איזורי המוקוזה שם נמצאים הרבה מאוד תאי דם לבנים שייפגשו עם חיידקים העוברים את מחסומי המוקוזה – החדירים יותר ,באופן יחסי ,לחיידקים ,בשל היות המערכות פתוחות וחשופות אל החוץ. לויקוציטים יכולים לחדור דרך האנדותל – אפיתל היוצר את כלי הדם – באופן שאינו מזיק לרקמה כך שיוכלו לחדור לרקמת החיבור ולחפש גורמים זרים .במפגש עם אותם גורמים ,התאים עוברים למערכת הלימפה ומגיעים דרכה לקשרי הלימפה .בקשריות הלימפה הם נפגשים עם תאי Tומעוררים הפעלה שלהם ותחילת התגובה החיסונית. המערכת המולדת פגוציטים קיימים מספר סוגים של תאים בעלי יכולת פגוציטית – מקרופגים ,מונוציטים ,ניוטרופילים ותאים דנדריטים .49יש להם יכולת אמבואידית – יכולת תנועה חופשית ברקמה ובכלי הדם .קיימת תנועה מתמדת של לויקוציטים מכלי הדם לרקמה ,אל צינורות מערכת הלימפה וחזרה אל מערכת הדם. הפגוציטים בולעים את החיידקים בפגוזום ,המתאחה עם ליזוזומים ליצירת פגוליזוזום. 49לפחות לפי ההרצאות באימונולוגיה ,תאים דנדריטים מתמחים בהצגת אנטיגנים אבל אינם בעלי יכולת פגוציטוזה ,אלא יכולת אנדוציטוזה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :20מנגנוני ההגנה של הגוף 151 יש חיידקים המסוגלים לחיות בתוך הפגוזום – המתקיימים גם במים עומדים בתוך אמבות ,שגם הן אינן מאכלות אותו .הליגיונלה מפריש חלבון מיוחד שמונע איחוי של הליזוזום עם הפגוזום על מנת שיוכל לחיות בפגוזום .גם חיידק השחפת חי בתוך פגוציטים; הוא אינו מעכב את איחוי הליזוזום אולם הדופן שלו עמידה לחומרי הליזוזום ולכן לא נפגעת .חיידקים אחרים יכולים להפריש לויקוצידינים – כאשר הם נבלעים על ידי הלויקוציט הם מפרישים את החומרים שהורסים את הלויקוציט ,דבר המתבטא בהיווצרות מוגלה. נויטרופילים :לויקוציטים פולימורפונוקליארים נמצאים בעיקר בדם ובמח העצם .אלו תאים ניידים המכילים ליזוזומים רבים ,ובהפעלה נודדים במהירות למקום הדלקת .המשיכה למקום הדלקת נעשית על ידי גרדיינט של ציטוקינים – חומרים המופרשים על ידי הרקמה הפגועה .ריכוז הציטוקינים יורד ככל שמתרחקים ממקום הפגיעה והלויקוציטים חשים בגרדיינט ועוקבים אחריו על מנת לאתר את מקום הדלקת. מונוציטים ומקרופגים מונוציטים הם פריקורסורים למקרופגים ונעים בזרם הדם; הכניסה לרקמה גורמת להם להתמיין למקרופגים .המקרופגים הורגים ומאכלים תאים פולשים .הרג התאים הפולשים משרה הצגה של אנטיגנים של התאים הפולשים. תאים דנדריטים תאים דנדריטים הם תאים מומחים להצגת אנטיגנים ) .(APCהתאים נמצאים בכל רקמות הגוף .עם הבליעה של חיידק ,התא הדנדריטי נודד לקשריות הלימפה על מנת להציג את האנטיגנים של החיידק לתאי ה T-הלימפוציטיים. אנטיגנים ותאים מציגי אנטיגנים באיור מופיע חלבון .על החלבון יש אפיטופים – אתרים המזוהים על ידי נוגדנים ספציפיים .כל נוגדן בעל אתר זיהוי לאפיטופ אחר – איזור אחר על גבי החלבון. אפיטופים יכולים להיות רציפים – הרצף של חומצות האמינו המרכיב אותם הוא רציף במבנה הלינארי של החלבון; או בלתי רציפים – חומצות האמינו אינן רציפות במבנה הלינארי אולם יוצרות מבנה רציף במבנה השלישוני של החלבון. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 152 זיהוי תאים פולשים על ידי הפגוציטים המערכת החיסונית המולדת היא תכונה הקיימת עם הלידה; הזיהוי של החיידקים נעשה למרות שהגוף מעולם לא נפגש איתם בעבר .התאים של המערכת מכילים רצפטורים בשם TLR ) (toll-like receptorsהמכירים מולקולות שיש להן מבנה המשותף לפתוגנים שונים; מולקולות אלו מכונות PAMPs (pathogen- ) .associated molecular patternדוגמה ל- PAMP הם הליפופוליסכרידים )(LPS המצויים על חיידקי גרם שליליים )המזוהים על ידי ;(TLR4חומצות ליפוטכואיות על חיידקי גרם חיוביים; וכדומה. הקפסולה של תאי smoothמהניסוי של אייבורי מכסה את החומצה הליפוטכואית של החיידקים ומונעת זיהוי שלהם על ידי המערכת החיסונית המולדת. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :21התגובה החיסונית – המשך 153 שיעור :21התגובה החיסונית – המשך אימונוגלובולינים הם משפחה רחבה של חלבונים בעלי תכונות דומות של איזורים קבועים ומשתנים, אשר על פי רוב קושרים אנטיגנים בזכות האתרים המשתנים .ביניהם נמנים הנוגדנים וה,MHC- הנחלקים לשני סוגים MHC class I (MHCI) :ו. MHC class II (MCHII)- • – MHCIבנוי משתי שרשרות ,שרשרת אלפא ארוכה יחסית ושרשרת בטא קצרה וקבועה. • – MHCIIבנוי משתי שרשרות אלפא ובטא באורכים דומים. לכל אדם יש שלושה גנים ,ולכן שישה אללים ,ל .MHC-בהתאמת רקמות מקפידים להתאים כמה שיותר מבין ששת האללים האלה על מנת למנוע דחייה של השתל על ידי המערכת החיסונית. כמו כן ,באותה המשפחה נמצאים ) TCRמשמאל( – רצפטורים של תאי – Tהמורכבים משתי שרשרות ,אלפא ובטא ,ותפקידם לזהות אנטיגן המוצג בקונטקסט של – MHCכלומר רצף חומצות אמינו מהחיידק או הוירוס המוצג על גבי MHCIאו .MHCII ה (a) MHCI-מבוטא כמעט בכל התאים של הגוף – בין אם הם שייכים למערכת החיסונית ובין אם לא .הוא מציג רצפי פפטידים בני 9חומצות אמינו שמקורם אנדוגני – כלומר מחלבונים שפורקו בתוך התא לפפטידים קצרים ואז הפפטידים מוצגים על גבי ה- .MHCIבתא בריא ,הפפטידים המוצגים יהיו פפטידים עצמיים, אשר יוכרו בתור עצמיים ולכן לא תופעל תגובה חיסונית )על פי רוב(; אם הייתה חדירה של וירוס המשרה סינטזת חלבונים ויראליים בתא MHCI ,יציג פפטידים של החלבון הויראלי והזיהוי של הפפטיד הזר על MHCIישרה הפעלה של המערכת החיסונית. ה (b) MHCII-מופיעים על גבי תאים מציגי אנטיגנים )(APC בלבד – מקרופגים ,תאים דנדריטים ותאי .Bתפקידם להציג פפטידים של פקטורים חיצוניים לתא – שנבלעו ועברו פירוק ליזוזומלי ולא פירוק בפרוטאוזום – כמו חיידקים ,פקטורים וירולנטיים וכדומה .ההצגה על MHCII מאפשרת הפעלה של מנגנונים האחראים להתמודדות עם וירולנטים חיצוניים לתאים. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 154 לימפוציטים מסוג T ישנם שלושה סוגי לימפוציטים: • תאי Tציטוטוקסיים ) – (TCמכילים על פני השטח קו- רצפטור המכונה .CD8חלבון זה הינו בעל אפיניות לאיזור הקבוע של ) MHCIשרשרת בטא( .לאחר השפעול ,תאי TC הורגים תאים המציגים אנטיגנים זרים בקונטקסט של .MHCI • תאים הורגים ) – (NKתאים אלו גם הם הורגים תאים ,אולם מסוג אחר :תאים שאינם מציגים כלל .MHCIמצב זה קורה למשל בפלישה ויראלית שבה הוירוס מעכב את הצגת MHCכדי להסתתר מהמערכת החיסונית; כמו כן יכול להיות מצב של תאים סרטניים שמורידים את ביטוי MHCמסיבות שונות. • תאי Tמסייעים – תאים אלו מכילים קו-רצפטור .CD4הם נחלקים לשני סוגים: • – TH1מזהים MHCIIעל גבי APCשמציג אנטיגן זר .ה TH1-מפרישים ציטוקינים – פקטורים המשפיעים על הרקמה ובמיוחד על תאי המערכת החיסונית – המשפעלים את האלמנטים במערכת החיסונית אשר תפקידם בפגוציטוזה )כמו מקרופגים(. • – TH2מזהים MHCIIעל גבי APCעם אנטיגן זר אולם משחררים ציטוקינים שונים המעוררים דווקא לימפוציטים מסוג ,Bשתפקידם בייצור נוגדנים ותאי זיכרון שיכינו את הגוף למתקפה הבאה. באיור ניתן לראות אינטראקציה בין תא המכיל אנטיגן זר על גבי MHCIובין תא .TCהאינטראקציה בין ,TCRהרצפטור של תא ,Tחלשה פיזיקלית ולכן ,CD8בעל האפיניות לשרשרת הקבועה של ,MHCIמחזק את הקשר פיזית ומונע מהתאים להיפרד. הקישור מפעיל מסלול תוך תאי המשרה שחרור גרנולות מלאות פקטורים שמחוררים את ממברנת התא המותקף וגורמות לכניסת רעלנים המשרים בתא המותקף אפופטוזיס .תא ה T-מתרחק לפני שהוא ניזוק מהדבר בעצמו. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :21התגובה החיסונית – המשך 155 באיור ניתן לראות אינטראקציה בין APCלבין תא .THכאן יש זיהוי אנטיגן על גבי ,MHCIIהקשור תחילה ב ER-לפסודו-פפטיד שמונע קישור לפפטידים לא מתאימים; רק כאשר הMHCII- מתאחים עם הליזוזום )בוזיקולה שיוצאת מה (ER-הם קולטים לתוכם את האנטיגן ואז יוצאים ומוצגים על גבי הממברנה .כעת TCRשל THבליווי CD4מזהה את MHCIIוכך התא עובר שיפעול .בהתאם לסוג התא – – TH1 or TH2ייקבע המשך המסלול של התגובה החיסונית. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 156 שיעור :21מערכת החיסונית הנרכשת מערכת זו עוברת אקטיבציה – בניגוד למערכת החיסונית המולדת – על מנת להגיב לפתוגן. אימונוגלובולינים )נוגדנים( אלו חלבונים הקשורים אליהם שיירים סוכריים )גליקופרוטאין( הנוצרים על ידי תאי פלזמה והם מגיבים לאימונוגנים – חומרים המשרים יצירת נוגדנים .הקישור של נוגדנים לאנטיגנים או לאפיטופים היא בספציפיות ובזיקה גבוהות מאוד – עד כדי כך זיהוי בין חלבונים השונים בחומצת אמינו בודדת. לעיתים ,לא הקישור של הנוגדן לאנטיגן הוא הגורם לתגובה החיסונית אלא שהתגובה החיסונית היא משנית לקישור לנוגדן .מצב זה מתרחש כאשר מופעלת מערכת המשלים ).(Complement מבנה האימונוגלובולינים הנוגדן מורכב מארבע שרשרות – שתיים קלות ושתיים כבדות ,כשבכל אחת יש איזורים קבועים ואיזורים משתנים המהווים את אתר הקישור לאנטיגן .ישנם קשרים דיסולפידים רבים המקבעים את המבנה. כאשר מאכלים נוגדן בעזרת האנזים הפרוטאוליטי ,papainמתגלה מבנה הנוגדן הנחלק לשניים: • – Fabצורת ה .V-אלמנט בעל ערכיות 1 )בעוד שהנוגדן השלם בעל ערכיות ,2כיוון שיש לו שני קצוות .(Fabהחלק הזה הוא החלק המזהה את האנטיגן .כל Fabיכול לזהות אפיטופ על חיידק אחד ולכן הם יכולים ליצור צבירים של חיידקים. • – Fcצורת ה .I-איזור זה בעל הפעילות הביולוגית והוא זה שתפקידו בהפעלת המערכת החיסונית על ידי כך שרצפטורים של תאי (BCR) Bאו אלמנטים של מערכת המשלים יזהו אותו. יש גם אתר המכונה ,Placental transferהאחראי על העברת נוגדנים מזרם הדם של האם אל העובר ברחמה דרך השליה .בצורה זו התינוק הנולד מחוסן עבור חלק מהאלמנטים השגורים בסביבתו ושהנוגדנים להם נפוצים בדם האם. איזוטיפים של אימונוגלובולינים אימונוגלובולינים מתחלקים לחמישה איזוטיפים ,הנבדלים בשרשרת הכבדה IgD .מצוי מעט מאוד בזרם הדם; IgEמעורב בעיקר בתגובות אלרגיה .לעומת זאת שלושת האחרים רלוונטים לתגובות החיסוניות נגד פתוגנים. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :21מערכת החיסונית הנרכשת 157 IgG IgGעצמם נחלקים לארבעה איזוטיפים נוספים, כאשר IgG3נבדל כנוגדן שמכיל איזור ציר ) (hingeיותר גדול .זהו הנוגדן השכיח ביותר ברקמות ,במערכות החוץ-וסקולריות .הוא מכיל את איזור ה Placental transfer-והוא גם מפעיל את מערכת המשלים. כמו כן IgG ,יכול להיקשר לתאי המערכת החיסונית דרך – Fcכאשר הנוגדן קשור לחיידק באיזור ,Fab איזור Fcשלו חשוף; כעת רצפטורים ל Fc-על תאי המערכת החיסונית – כמו מקרופגים – יכולים לזהות את הקישור לחיידק ולבלוע אותו בפגוציטוזה. IgM קבוצה שנייה זו של נוגדנים מורכבת למעשה מפנטמר – ולכן הערכיות שלו היא ) 10יש לו 10 .(Fabבמרכז נמצאת שרשרת J-chainהקושרת את כל המונומרים יחד .הנוגדן מופרש אל הסרום בתגובה ראשונית. האפיניות של IgMלאנטיגן על פי רוב יותר חלשה מאשר זו של .IgGאלו הנוגדנים הראשונים שנוצרים כתוצאה מחשיפה לאנטיגן זר ,הנוצרים בלי שהספיקו לעבור תהליך סלקציה לטובת הסלקטיביות המקסימלית של הנוגדן; היתרון שלהם הוא בערכיות הגבוהה – למרות הזיקה )אפיניות( הנמוכה יש להם אבידיות )דביקות( גבוהה – הם קושרים באפיניות נמוכה כמה וכמה אפיטופים על גבי החיידק או על גבי מספר חיידקים ,ולכן ההידבקות מתחזקת תודות לאבידיות. זהו הנוגדן המצוי שלישי הכי הרבה בסרום; הוא הראשון שנוצר – גם על ידי העובר וגם על ידי תאי B נאיבים שרק עתה עברו אקטיבציה .הוא קושר את מערכת המשלים בצורה היעילה ביותר מכיוון שהוא פנטמר .הערכיות הגבוהה שלו גם עוזרת לו ליצור אגרגציה של התאים החיידקיים. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 158 IgMממברנלי סוג זה מצוי רק על ממברנות של תאי .Bהשרשרת הכבדה µ מאופיינת בפפטיד ארוך יותר ,בעל תכונות הידרופוביות ,הגורם לקישור של החלבון לממברנה במקום לאפשר שחרור והפרשה שלו לסרום .זהו ה ,BCR-הרצפטור של תאי Bהמזהה אנטיגן ומטמיע אותו לתוך התאים .הוא קושר שני דימרים תוך-ממברנלים המאפשרים מעבר אותות לתוך התא )הזנבות הציטוזוליים שלו קצרים מכדי לאפשר מעבר אותות(. IgA זהו דימר של שני נוגדנים המחוברים ב.J-chain- הנוגדנים יכולים להיות מסיסים .שרשרת נוספת, ,Secretory Pieceמאפשרת הפרשה ומעבר של IgAדרך תאי אפיתל – מהדם אל הרקמה ,או חלל המעי וכדומה .רק ל IgA-יש את היכולת לאינטראקציה עם ה secretory piece-ולכן רק הוא מגיב עם אנטיגנים במערכות המוקוטיות וההפרשה. שכיחותו היא השנייה בגודלה בסרום ,הוא מצוי בעיקר במערכות הפרשה ובהפרשות )רוק ,דמעות, מוקוס( ומגיע אליהן בזכות יכולתו לעבור דרך האפיתל .על פי רוב ,הוא אינו עושה פיקסציה של מערכת המשלים אלא אם הוא יוצר אגרגציה מסיבית. כמו כן הוא יכול להידבק למספר תאים ,כמו פולימורפונוקליארים. מאפיינים כלליים של תגובת נוגדנים • יכולת הבחנה בין זר ועצמי – המערכת צריכה להימנע מהכרה של העצמי על מנת שלא לגרום למחלות אוטואימוניות. • יכולת זיכרון – המערכת של תאי הפלזמה היא קצרת חיים; צריכה להיות מערכת שתיזכור את האנטיגן שהיה בחשיפה הראשונית כדי שהאינדוקציה בתגובה השניונית תהיה מהירה מאוד .לשם כך קיימים תאי זיכרון. • ספציפיות – המערכת מכירה כל אנטיגן בצורה מאוד ספציפית. התפתחות המערכת החיסונית האיור מציג את סוגי התאים השונים המעורבים במערכת החיסונית ,המקורות שלהם והרקמות בהן הם מתפתחים. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :21מערכת החיסונית הנרכשת 159 מה גורם להשראת יצירת הנוגדנים? תא גזע מתמיין לתא לימפואידי היוצר תא ;Bכל אחד מתאי האב עובר ריקומבינציה סומטית היוצרת רפרטואר שלם של תאי Bשכל אחד מהם נבדל מהאחר באיזור הגן המקודד לפפטיד הוריאבילי של הנוגדן .תודות לעובדה זו תאי Bשונים מזהים באפיניות שונה אפיטופים שונים. בעת המפגש עם אנטיגן זר כלשהו – פפטיד כלשהו ,חופשי או מחובר בחיידק – אשר ייקשר לאחד מתאי ה – B-לזה בעל האפיניות הגבוהה ביותר אל האפיטופ .ההיקשרות היא אקראית כשם שהריקומבינציה הסומטית היא אקראית .הנוגדן על גבי תא Bהמזהה את האטניגן הוא IgMממברנלי. חשוב לזכור IgM :קושר אנטיגן באפיניות נמוכה ,מכאן שהספציפיות שלו יותר נמוכה משל .IgGמסיבה זו יש לו סיכויים גדולים יותר לפגוש אנטיגן מתאים. עם המפגש ,תא Bהופך לתא פלזמה ולתא זיכרון .תאי הפלזמה יפיקו את הנוגדן ויפרישו אותו לזרם הדם ותאי הזיכרון ימתינו עד לחשיפה השנייה. בעת הקישור לאנטיגן ,חלה אינטרנליזציה של הרצפטור עם האנטיגן; לאחר מכן השניים מתפרקים אחד מהשני .הרצפטור ממוחזר והאנטיגן נקשר אל ,MHCIIמוצג על פני השטח ,מזהה את TCRשל תא T נאיבי וגורם לו להתמיינות של תא .TH2כמו כן תא ה B-מתחיל להתמיין לתאי זיכרון ולתאי פלזמה .תאי הפלזמה הראשונים המיוצרים מהחשיפה הראשונית מפרישים את איזוטיפ הנוגדן .IgM להבדיל מתאי Bפלזמה ,תאי זיכרון משופעלים אינם מייצרים תאי IgMאלא .IgGתהליך זה מכונה – Class Switchמצב שבו התא עובר מייצור של איזוטיפ נוגדן אחד לאיזוטיפ אחר .במצב זה השרשרת הכבדה מתחלפת מבחינת האיזוטיפ – במקום שתהיה מסוג µהיא הופכת לסוג .γכמו כן ,גם בתאים אלו יש ריקומבינציה סומטית – כאשר תא זיכרון מתחלק הוא עובר עוד ריקומבינציה סומטית על מנת לקשור האנטיגנים בספציפיות יותר גבוהה מאשר נקשרו תאי .IgM סלקציה על תאי T מדוע תאי Bלא מייצרים נוגדנים המזהים עצמי? תאי Bמופעלים על ידי תאי ;Tתאי Tעוברים סלקציה חיובית ושלילית עוד בטימוס על מנת להשמיד או לנטרל פעילות של כל תאי ה T-שמכירים אנטיגן עצמי. תאי Tנוצרים במוח העצם ונודדים בשלב מוקדם יחסית לטימוס .שם הם עוברים את הריקומבינציה הסומטית ועוברים סלקציה חיובית ושלילית: • תאי Tיוצרים TCRשאינו מכיר כלל MHCIIעצמי – התאים האלה מתים כי תאי Tמכירים אנטיגן זר בקונטקסט של MHCעצמי .מכאן שללא זיהוי ה MHC-העצמי הם אינם יעילים. • תאי Tיוצרים TCRהמזהה MHCIIעם אנטיגן עצמי – התאים האלה מתים כי אם יופרשו למערכת ,הם יפעילו תאי Bהמזהים אנטיגן עצמי ויגרמו למחלה אוטואימונית. • תאי Tהיוצרים TCRשמכיר את MHCIIבזיקה חלשה – התאים האלה יוצאים מהטימוס כתאים תקינים ,משום שההנחה היא שכל עוד ה MHCII-עם האנטיגן העצמי מוכר בזיקה חלשה אזי בקישור לאנטיגן זר כלשהו תהיה זיקה חזקה – ולכן זהו תא Tתקין שמותר לשחרר מהטימוס. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב 1 שיעור- מיקרוביולוגיה 160 Lesson 22: Viruses Lecturer: Gerald Cohen Introduction to Viruses Few facts: • Viruses are probably the most successful organisms on the planet. There are about 1031 viruses on the planet. The calculation of this number was reached by an estimation of the number of bacteria, most of which living in the ocean, so if there are 1030 bacteria than there should be at least ten times more viruses. • Viruses infect everything – no organism was found as of yet that could not be infected by a virus. There are even viruses in us – there are more bacteria in our body than cells and there are also viruses involved – such as in Herpes, where a dormant virus becomes active and cause the illness symptoms. • Viruses cross species boundaries – it used to be thought that viruses infect specific cells or orgaisms; today we know that viruses that infect one organism can jump between organisms – such an example is the chicken influenza. This fact has an enourmous effect on evolution. • Viruses affect evolution – they can transfer genetic information between organisms and so cause lateral genetic transfer. Thus they play a critical role in evolution and transfer of genetic information. • Viruses are important for molecular biology – most discoveries from 1940 onwards used viruses, since they are small organisms with relatively small genome, and so used for research of cellular procedures such as DNA replication, transcription, translation and so on. • Used as tools – to transfer genes between organisms, materials like antibiotics or even metals put inside virus capsids – nanotechnology is exploiting viruses to carry out many manipulations. One of which is repairing genes by transferring the fixed gene into the diseased cell. What is a virus? A virus can live outside cells as a non-replicating particle or live inside the cell as a replicating unit. However, there are parasitic bacteria that also have replicative 2011 אוניברסיטת תל אביב,הפקולטה למדעי החיים חמוטל בן דב 161 Lesson 22: Viruses existence within a host; yet, unlike viruses, they can produce proteins outside of their host. That is the differentiating parameter between them and true viruses – viruses do not have the replicative and translational mechanisms as cells. Why study viruses • Disease cause – viruses cause disease in humans, animals, and plants, and their research will allow better understanding of the illness. • Model systems – a virus may contain one gene and up to several thousands. They are very simple organisms that can be used for research. • Used as delivery tool to transfer materials and information. • Used for genetic therapy – to exchange defected genes with fixed ones. • Alternative to the classic use of antibiotics – due to antibiotic resistance, the idea of using viruses is coming back in order to create a new method of dealing with antibiotic-resistant bacteria. History log Jenner found out that one can pass the essence of the blood sample of milkmaids who were exposed and infected with cow-pox in order to vaccinate others against smallpox. Since cowpox is only similar to smallpox, the milkmaids did not die but still developed antibodies that were effective against smallpox. After Jenner there was a line of experiments in the vaccination field performed by Pasteur, Ivanowski and Beijernick (TMV, infected tobacco plants' extract could infect healthy plant and the infecting particle was very small because it passed through filters that could hold back most bacteria), Loeffler and Frisch (food and mouth disease), Ellerman and Bang (avian leukemia). Twort and d'Herelle were the ones who found viruses that infect bacteria, and named them bacteria-phages, “eaters of bacteria”. Soon afterwards the viruses were pured and crystallied – cells cannot be crystallized because they do not have a specific structure, but virus capsids do have such a structure as they are composed mostly, if not solely, from proteins. Afterwards, Luria and Delbruck began to research what actually happens when a cell is infected by a virus; they found the T4 life cycle and what happens from infection to cell lysis. חמוטל בן דב 2011 אוניברסיטת תל אביב,הפקולטה למדעי החיים 1 שיעור- מיקרוביולוגיה 162 Lwoff discovered the lysogeny, the tendency for dormant status of the viral genome within the host's genome. Hershey showed, using viruses, that indeed nucleic acids were the genetic material and not proteins – a question that was not determined at the time. Lederberg showed how phages can transfer information from one cell to another by transduction. Afterwards, a long line of scientists showed genetic procedures such as splicing, reverse transcription and sequencing of the virus genome. Today we can even synthesize the genome of a virus. Sanger also found the phenomenon of overlapping genes. Viruses and diseases There have been several epidemics and pandemics which have viral sources that affected humanity and other kingdoms: whether it was the Spanish influenza in the 20th century, the pox virus that killed a 1/3 of the European population, foot and mouth disease that came back not a few years ago, and the HIV virus which we still cannot eliminate or vaccine against. There is plenty of information about viral infections even in much earlier times. Viruses and the marine ecosystem Most viruses live in the ocean – and most of them are phages, because most of the marine population is bacteria. Deep in the ocean, their population is 108, closer to shore it is even higher. Every day, 40% of bacteria in the ocean are killed by viruses and release their nutrients to the environment. These nutrients are available for other organisms to feed and grow on. They clear the carbon effect and amount that is free to release to the atmosphere. Hence, the phages are critical to the amount of carbon, both in the ocean and in the atmosphere. How viruses originated The origin of viruses is unknown, just as the origin of life is unknown; one question might answer the other. However, there are several hypothesis: • Evolution from bits of DNA and RNA that escaped cells – the nucleic acids are protected by random proteins and eventually contract a virus. This complies with the theory that life began in an RNA world. 2011 אוניברסיטת תל אביב,הפקולטה למדעי החיים חמוטל בן דב 163 • Lesson 22: Viruses Regressive or degeneracy hypothesis – they could have been smaller cells that were parasitic to larger cells and over time lost unnecessary genes and made into what they are today. • Co-evolution theory – complex molecules of protein and nucleic acids were created and joint at the same time to create the first cell and virus. • Extraterrestrial hypothesis – viruses came to earth on meteorites from outer space. This theory came to explain how can a disease can occur at the same time in two separate points in the world, even before the time of fast travelling such as with airplanes. Structure of viruses Viruses come in all shapes and sizes; though in general their size spectrum is very small – the largest virus is only nearly seen with the strongest light microscope. On a single pinhead one can put 500 million rhinoviruses. STMV is the smallest virus known. It is called satellite to TMV because it cannot grow within a cell that is not alsp infected with TMV. Its size fits to a genome containing a single gene, which codes to the protein of its capsid. 60 units of this protein create the isocohedron shape of the capsid – and this is the minimal amount of proteins that may allow a single viral particle. The largest virus is the Minivirus – named after the fact it mimics a bacteria. Its genome holds 1,000 genes, which is more than the smallest bacteria (and is also larger than it). Viruses, as mentioned, cannot be seen in a light microscope; this changed with the introduction of electron microscopy. In order to view the particles, one must increase the contrast between them and the surface – which is done by staining the background (negative staining) or the particle (positive staining). Electrons go through the particle in negative staining, not through the stained surface, and produce the image. This allows not only seeing the particles but also to count them – not only in general, but also to differentiate live from defective particles. In virus imaging, one can notice two general shapes: helical rod-like shape and icosohedral spherical shape. חמוטל בן דב 2011 אוניברסיטת תל אביב,הפקולטה למדעי החיים 1 שיעור- מיקרוביולוגיה 164 Measurement of viruses by plaque assay Infective particles, when put on a surface rich in bacteria, will infect the bacteria and multiply; each particle will infect another bacteria and so on and so forth until a plaque can be seen on the plate. If the phages were put in a very low concentration, where every drop contains a single particle, each plaque is assumed to be created by a single virus. This is calculated by the result of virus dilution/plaque number ratio. If this creates a 45 degree linear graph, this is a 1:1 relation. If the degree is any different it would have meant that more than one particle is required to create a plaque. • Electron microscopy sees everything. • Plaque assays allow counting of the infective particles. It appears that the number of infective particles and available particles are not similar, whether due to defective particles which have defective or no genetic material, or for any other cause. Some viruses have a membrane envelope All viruses have capsids; however, some have a membrane lipid envelope. This envelope is usually taken from the host cell upon eruption from the cell – whether it is the cytoplasmic membrane or the nuclear membrane (in case of Herpes). This lipid structure may contain proteins, whether ones that originated from the cells or synthesized by it according to the viral genome. The proteins usually help the virus infect the cells more effectively and quickly. How does the virus increase the amount of genetic information? There are two ways of increasing genetic information: • Increase the size of the capsid proteins • Increase the number of the capsid proteins The latter is usually the effective method, since the first option would also drag an increase in genetic information – larger proteins require larger genes, but a larger amount of copies can maintain the small size of the gene. And so larger particles usually have more proteins, not larger ones; also, the proteins need to fit together so that they can create weak, non-covalent bonds that are easily put together and are easy to separate. 2011 אוניברסיטת תל אביב,הפקולטה למדעי החיים חמוטל בן דב 165 Lesson 22: Viruses Helical Shape The TMV, a fairly large particle, is made of a single protein – 2000 units of it – organized in a symmetric rod-like shape. The symmetry is important: it creates the ease of construction and disassembly. M13, a bacteriophage common in research, is of a helical shape; it is made mainly by one protein but its two ends contain different proteins that allow its entry and exit from the membrane of the infected host. Influenza is enveloped in membrane, which presents certain proteins that allow the distinction between Influenza species and allow for the vaccination. Influenza does not have a single thread of genome, but actually 8 threads, which raises a complexity in collecting them all into the capsid. Icosohedral Shape The icosohedral or spherical shape is created by a number of capsid sides – where the minimal number is 12 sides per particle. More complex – poxvirus This virus not only has an envelope with proteins of the cell and the virus, but it also contains proteins inside to enhance its virulence: enzymes for DNA ligation, transcription and so on – this makes the virus less dependant of the cell. T4 bacteriophage has a symmetrical head and fibers – legs – that attach to the E.coli and allow the virus to contract its tail and force its DNA into the cell. This mechanism is used by a lot of viruses – using a motor-tail to insert their DNA. Other viruses may use endocytosis and other procedures to get inside the cells. Genetic matter Unlike cells, viruses have EITHER DNA or RNA, and these are EITHER single- or double-stranded. They can also be retroviruses, which have RNA that is transcripted into DNA. David Boltimor said that the information is not enough for classification and that the way information gets to become a message – mRNA – should be an important differentiating factor. If the RNA is of the antisense sequence, meaning it can be translated directly to protein, than it is a +RNA; if it is sense it needs to go through transcription, and so they are –RNA. These viruses usually carry an RNA-based חמוטל בן דב 2011 אוניברסיטת תל אביב,הפקולטה למדעי החיים 1 שיעור- מיקרוביולוגיה 166 RNA-Polymerase in the capsid, since this mechanism is not available in other organisms. The ssDNA is divided in a similar fashion. Replication Once a virus infects a cell, it can work in one of two ways: • Infect, multiply and erupt by lysis – this is the lytic response where a few tens to hundreds of particles emerge from the cell. The gene expression is very organized to prevent premature lysis. • Lysogenic response – some viruses can infect without killing the cell. They can integrate their genetic matter into the chromosome and so they also multiply with the cell. Under certain stress conditions inflicted on the cell, which cause this stable situation to become unstable, the lytic pathway is triggered. In the lytic pathway, the genes are organized in order to be expressed in a highly organized order to allow the construction of the capsid, transcription of the nucleic acid, and so on – until the late genes' expression which causes the lytic response. In fact, the particle itself is taken apart once it gets inside the cell – which is reffered to as the eclipse, when no particles are found, and it is constructed inside the cell in multitude numbers until eventually there is a high peak of population at eruption. Eruption and multiplication can be very virulent, fast and damaging, or slower and more at ease. 2011 אוניברסיטת תל אביב,הפקולטה למדעי החיים חמוטל בן דב שיעור :23טיפול בעזרת פאג'ים 167 שיעור :23טיפול בעזרת פאג'ים הרעיון הזה משלים את תחום האנטיביוטיקה כשיטה להתגברות על מחלות מדבקות. במלחמת העולם הראשונה ,טוורט באנגליה וד'הרל בצרפת גילו את הבקטריופג'ים שתוקפים חיידקים והורסים אותם .ד'הרל חשב שאולי ניתן לנצל אותם לטיפול בבני אדם במחלות מדבקות. הרעיון היה פשוט :אם מגלים מחלה הנגרמת על ידי חיידק ,ניתן לטפל בה בוירוס התוקף את החיידק ולמנוע את התפתחות המחלה .בתחילה השתמשו בשיטה והיא זכתה להצלחות רבות :טיפלו בתכשיר פאג'ים שגודלו על אותו גורם למחלה ,במקרה זה היה זה חיידק השיגלה ,והמטופלים קבלו את התכשיר הגס ולא סבלו מהמחלה כמו גם לא מהטיפול. עם זאת ,די מהר התברר שהיו תופעות לוואי קשות מאוד – התכשירים היו גסים ולא מנוקים והכילו מרכיבים – טוקסינים ואחרים – שגרמו לתופעות לוואי קשות ואפילו למוות .התברר גם שמהר מאוד החיידקים שגרמו למחלה מפתחים עמידות לתכשיר הפאג'ים .משתי סיבות אלו הפסיקו להשתמש בשיטה הזו במערב אירופה וארה"ב. במערב גילו כבר ב 1930-תכשירים אנטיביוטיים וב 1940-התגלה הפניצילין ופטריות וחיידקים אחרים המייצרים אנטיביוטיקות נוספות; במזרח לא היו היכולות לרכוש אנטיביוטיקות ולכן הם פיתחו בצורה יותר מתוחכמת את הרעיון של טיפול בעזרת פאג'ים – עד לפני 20שנה היו משתמשים בפאג'ים לטיפול במחלות מדבקות; במלחמת העולם השנייה חיילים רוסים היו נושאים תכשירים המכילים פאג'ים שיכלו להשתמש בהם ל"חיטוי" פצעים למניעת זיהומים בעזרת ריסוס .גם בבתי חולים השתמשו בתכשירים על מנת לשמור על סטריליות של פצעי הניתוח. מאוחר יותר 20-30 ,שנה האחרונות ,כשהמצב במזרח השתפר והם יכלו לרכוש אנטיביוטיקות ,התחילו לרכוש אותן ועזבו את הטיפול בפאג'ים .אולם עד היום יש מקומות במזרח אירופה בהם משתמשים בנגיפים לטיפול כנגד חיידקים .בימים אלו ,בהם ידוע שאנטיביוטיקה לא מספקת את כל הפתרונות למחלות מדבקות ,מחזירים את הרעיון – במיוחד במערב – שאולי יש לפתח את השימוש בפאג'ים להרג חיידקים מדבקים שגורמים למחלות קשות .השיטה צפוייה לשמש כליווי לשיטות הקיימות. יש לזכור כי אנשים היום מתים בבתי חולים מעצם הכניסה אליהם ,כיוון שחיידקים נוזוקומלים עמידים למגוון רחב של אנטיביוטיקות וקצב פיתוח האנטיביוטיקות אינו עומד בקצב פיתוח העמידויות ,בעיקר משום שהתעשייה התרופתית אינה עוסקת ב 30-השנים האחרונות בפיתוח אנטיביוטיקות חדשות אלא רק בפיתוח אנטיביוטיקות קיימות – דבר שאינו מבטיח מניעת העמידות כנגד התכשירים. בטיפול בעזרת פאג'ים לא מדובר רק בטיפול בבני אדם אלא גם במחלות של בעלי חיים וחקלאות .היום כבר רואים דוגמאות לשימוש בשיטה הזו – מותר לרסס תכשירים של חלב העומדים במקרר בפאג'ים על מנת למנוע התפתחות של מחלת הליסטריה ,הפוגעת במיוחד באנשים שמערכת החיסונית שלהם מוחלשת – כמו נשים בהריון או מטופלי שתלים .החלב מטופל בתערובת פאג'ים המכוונים כנגד ליסטריה ומונעים את התפתחות הליסטריה בתכשיר החלבי העומד במקרר. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב 168 מיקרוביולוגיה -שיעור1 בארץ יש חברה שעוסקת בזה ויש חברות נוספות ,במיוחד בארה"ב ובקנדה ,המפתחות את הרעיון לשימוש והיתרים על ידי סמכויות כמו .FDAהחברה הישראלית PhageBioTech ,עוסקת ברעיון כטיפול בדגים – שאסור לשפוך אנטיביוטיקה בבריכות שלהם כיוון שהן מועברות במזון ,ולכן שוקלים להשתמש בפאג'ים. היתרונות של הטיפול בעזרת פאג'ים הם שהוא מאוד ספציפי ליעד שלו – לחיידק שמבקשים להרוג .שלא כמו אנטיביוטיקה ההורגת מגוון חיידקים ,כולל חיידקים החיוניים לתפקוד התקין של הגוף ,הפאג'ים ספציפיים לגורם הפתוגני ואינם פוגעים בחיידקים אחרים .כמו כן הפאג' משכפל את עצמו – הוא ימשיך להדביק את הפתוגן ולייצר את עצמו עד שייעלמו הפתוגנים .ניתן להתגבר על העמידות של החיידקים בעזרת שימוש בקוקטייל פאג'ים המכוונים להיכנס לחיידק בדרכים שונות ,דבר המבטיח שהחיידק לא יצליח לפתח עמידות כנגד כולם. הבעיה הראשונה עם הטיפול היא העובדה שיש להזריק במטופל – חיה או אדם – תכשירים היכולים לגרום לתגובות חיסוניות .יכולות להיות גם בעיות של פרמקוקינטיקה – אם הפאג' נעלם מהר מדי מהמערכת ,עקב ניטרול על ידי הגוף המארח. יחד עם זאת יש לזכור כי זוהי שיטה חלופית לאנטיביוטיקה שיכולה לטפל במצבים שאין בהם ברירה עקב עמידות החיידקים לאנטיביוטיקה .כאשר אין אפשרות להשתמש בשיטות קונבנציונליות ,ניתן להשתמש בשיטות האלו. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011
